FLAGELLINALAPÚ MOLEKULÁRIS OBJEKTUMOK LÉTREHOZÁSA

Pannon Egyetem Műszaki Informatikai Kar Nanotechnológia Tanszék

FLAGELLINALAPÚ MOLEKULÁRIS OBJEKTUMOK LÉTREHOZÁSA

Doktori (PhD) értekezés

A Környezettudományok Doktori Iskola keretében készítette: Sebestyén Anett

Témavezető: Dr. Vonderviszt Ferenc egyetemi tanár

Veszprém 2008. 2

FLAGELLINALAPÚ MOLEKULÁRIS OBJEKTUMOK LÉTREHOZÁSA Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében Írta: Sebestyén Anett Készült a Pannon Egyetem Környezettudományok Doktori Iskolája keretében Témavezető: Dr. Vonderviszt Ferenc Elfogadásra javaslom

(igen / nem)

……………………… (aláírás)

A jelölt a doktori szigorlaton …......... % -ot ért el,

Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: Dr. Gál Péter

(igen /nem) ……………………… (aláírás)

Bíráló neve: ifj. Dr. Kellermayer Miklós

(igen /nem) ………………………. (aláírás)

A jelölt az értekezés nyilvános vitáján …..........% - ot ért el. Veszprém,

…………………………. a Bíráló Bizottság elnöke

A doktori (PhD) oklevél minősítése…................................. ………………………… Az EDT elnöke

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása

TARTALOMJEGYZÉK

KIVONAT-ABSTRACT-AUSZUG 1. BEVEZETÉS, CÉLKITŰZÉS

9. OLDAL

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A baktériumok flagelláris filamentumai

11. OLDAL

2.2. A flagellin monomer

16. OLDAL

2.3. Flagellinalapú filamentáris receptorok

19. OLDAL

3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. A klónozás és a génamplifikációs eljárások

22. OLDAL

3.2. Irányított mutagenezis

29. OLDAL

3.3. Gélelektroforézis

31. OLDAL

3.4. Ioncserélő és affinitás kromatográfia

32. OLDAL

3.5. Izotermális Titrációs Mikrokalorimetria (ITC)

36. OLDAL

3.6. Felületi Plazmon Rezonancia Spektroszkópia (SPR)

38. OLDAL

3.7. Differenciális Pásztázó Mikrokalorimetria (DSC)

39. OLDAL

3.8. Cirkuláris Dikroizmus Spektroszkópia (CD)

41. OLDAL

4. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK 4.1. Nehézfém-kötő flagellinvariánsok létrehozása

44. OLDAL

4.2. Mutánsok termeltetése, tisztítása

49. OLDAL

4.3. A Ni- és As-kötő flagellin fémkötő képességének vizsgálata

52. OLDAL

4.4. Rekonstruált filamentumok előállítása és felületi rögzítése

56. OLDAL

4.5. A Ni-kötő filamentum fémkötő képességének vizsgálata

63. OLDAL

4.6. D3 domén vázfehérje klónozása és vizsgálata

65. OLDAL

4.6.1. Klónozás, fehérjeexpresszió és tisztítás

65. OLDAL

4.6.2. A D3 domén vizsgálata DSC-vel, CD-vel és proteolízissel

66. OLDAL

5. ÖSSZEFOGLALÁS

70. OLDAL 4


ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK / TÉZISEK

72. OLDAL

NEW SCIENTIFIC RESULTS / THESES

74. OLDAL

KÖZLEMÉNYEK

76. OLDAL

IRODALOMJEGYZÉK

79. OLDAL

KÖSZÖNET

84. OLDAL

5


KIVONAT Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása

A hagyományos bioszenzorok illetve fehérje chipek antitesteket, vagy azok alkalmas részegységeit alkalmazzák érzékelő elemként. Ezek előállítása költséges, preparálásuk bonyolult, stabilitásuk sokszor elégtelen, a hordozó felülethez kötve könnyen elveszítik natív térszerkezetüket,

működőképességüket.

Az

antitestek

kiváltása

más

fehérje

alapú

receptorokkal mindenképpen kívánatos. A bakteriális flagellumok helikális filamentumai polimerizálódásra képes flagellin fehérje több tízezer kópiájából épülnek fel. A flagelláris filamentumok önszerveződő rendszerek, azaz a flagellin monomerek spontán módon képesek összeállni a natívval megegyező szerkezetű filamentumokká megfelelő körülmények között. A flagellin polimerizációja könnyen kontrollálható, a kialakuló filamentumok a fizikai-kémiai behatásokkal szemben stabilisak, szerkezetük atomi precizitással ismert. A különböző fajokból származó flagellin fehérjék szekvenciáinak összehasonlításából adódóan ismeretes az is, hogy a molekula centrális szegmensei nagymértékben variábilisak, nem vesznek részt a szerkezetépítésben, éppen ezért különféle kötőhelyek alakíthatók ki ebben a régióban a polimerizáció megzavarása nélkül. Ennek tudatában a szerző, egyfelől számítógépes molekulatervezés és génsebészeti eszközök segítségével, Ni- és As-kötő flagellinvariánsokat állított elő, amelyek az adott nehézfémion felismerésére és erős megkötésére képesek. A flagellin alapú receptorok számos előnyt hordoznak, miszerint baktériumokkal nagy mennyiségben olcsón termeltethetők, a sejtek feltárása nélkül könnyen tisztíthatók, emellett még a flagellin polimerizációs képességénél fogva rendkívül nagy felületi kötőhely sűrűségű filamentáris objektumok építésére is alkalmazhatók. Másfelől megmutatta, hogy a flagellin variábilis D3 doménjét kifejezve, a domén stabil önálló fehérjeként működik, amely lehetővé teszi, hogy mesterséges kötő fehérjék vázelemeként alkalmazható legyen. Későbbiekben, ezek a módosított filamentáris receptorok, vagy a módosított D3 domén önmagában, ivóvizek nehézfémekkel való szennyezettségének mérésére szolgáló optikai szenzorok alapeleméül szolgálhatnak.

6


ABSTRACT Creating of flagellin-based molecular objects Biosensors and protein-chips usually apply antibodies as recognition elements. However, these proteins are expensive, poorly stable and hard to prepare. It is highly desirable to replace antibodies with other kind of sensing molecules. Flagellin, the subunit protein of bacterial flagellar filaments, is a protein polymerizable to form long filaments. The helical filaments of bacterial flagella are made of several tens of thousands copies of the flagellin protein. Flagellar filaments are self-assembling systems, i.e. under suitable conditions flagellin monomers can spontaneously assemble into filaments with a structure identical to that of the native filaments. Polymerization of flagellin subunits can be controlled easily, and the obtained filaments are resistant to physical and chemical effects, resistant to proteases and their structure is well known at the atomic level. The central portion of the amino acid sequence of flagellin, which forms the outer part of the filament, is highly variable, and can be modified by genetic engineering or chemical treatment without affecting polymerization ability. The author has created Ni- and As-binding flagellin mutants by molecular graphics and genetic engineering. These modified flagellins can be used capable of recognizing and binding desired heavy metal ions. Flagellin-based receptors can be produced easily and inexpensively by bacteria, and purified with an ease without lysing the cells, and flagellins, due to their polymerization ability, can be used to build filamentous structures with a very high binding site density on their surface. Moreover she has presented, that the variable D3 domain of flagellin has small size and stable structure makes it a promising protein scaffold for the development of artificial binding proteins. Further these filamentous receptors or the D3 domain alone may serve as basic recognition units of optical sensors to measure heavy metal contamination of fresh waters.

7


AUSZUG Das Zustandebringen von auf Flagell basierenden Molekülobjekten

Die Autorin hat aus Flagellineiweissen, die für ben Aufbau des Flagellfilamentums von Bakterien zuständig sind, mit Hilfe von Mitteln der Computermolekülplanung und Genchirurgie Ni-und As bindende Flagellvarianten hergestellt, die fähig sind das gegebene Schwermetallion zu erkennen und binden. other kind of sensing molecules. Weiterhin hat sie gezeigt, indem der variabel D3 Domen des Flagellins zum Ausdruck gebracht wurde, dass der Domen als stabiles, selbstständiges Eiweiss funktioniert, welches ermöglicht, dieses als Skelettelement der künstlichen Bindeiweissen anzuwenden. Der Vorteil der auf Flagellin basierenden Rezeptoren ist es, dass sie mit Bakterien in grösseren Menge günstig zu produzieren sind und können ohne Eröffnung der Zellen leicht gereinigt werden. Wegen der Polymerisationsfähigkeit des Flagellins ist die Dichtheit ihres grossen Oberflächenbindeplatzes auch für den Bau von filamentaren Objekten verwendbar. Ausserdem können diese als Grundelement optischer Sensoren dienen, die zur Messung der nachfolgend, in der Dissertation dargelegten modifizierten filamentaren Rezeptoren oder des modifizierten D3 Domen selber, bzw. vom Trinkwasser mit Verschmutzung von Schwermetallionen zu gebrauchen sind.

8


1. BEVEZETÉS, CÉLKITŰZÉS A technológiai fejlődés eredményeként egyre inkább a nanoméretű objektumok előállítása felé indult el a világ. Ebben a nanométeres mérettartományban lehetővé válik az a megközelítés, hogy atomokból és molekulákból irányítottan építhetők fel a kívánt objektumok. Az élő szervezetekben fehérjékből felépülő nanoméretű önszerveződésre képes molekuláris gépezetek működnek, szerteágazó feladatokat ellátva. Ezeknek a molekuláris gépezeteknek a működését felderítve, majd tulajdonságaiknak génsebészeti eszközökkel történő célzott módosításával egy olyan úton indulhatunk el, amely végül a fehérjékből álló szupramolekuláris rendszerek tudatos tervezésén alapuló technológia megjelenéséhez vezet. Mindez várhatóan a mérnöki tudományok szinte valamennyi ágára hatással lesz majd, a vegyipartól az elektronikáig, a környezetvédelemtől az energetikáig. A szenzorok (érzékelők) fejlesztése az analitikai kémia egyik legdinamikusabban fejlődő, legvirágzóbb és legváltozatosabb tudományterülete. Az élő szervezetekben számtalan példát láthatunk arra, hogy a fehérjék rendkívül specifikus molekulafelismerési sajátságokat mutatnak. Számos mikroorganizmusban találhatók olyan fehérjék, amelyek átmeneti és nehézfém ionok erős és szelektív megkötésére, azok közegbeli koncentrációjának precíz érzékelésére képesek. Sok fémkötő fehérje esetében ismertek azok a szerkezeti motívumok, amik meghatározó szerepet játszanak az adott célmolekula felismerésében és megkötésében. Doktori munkám célja, hogy ezeket az ismereteket felhasználva, a flagellin fehérjét számítógépes molekulatervezés, majd génsebészeti eljárások segítségével megfelelően módosítva olyan mesterséges receptorokat hozzak létre, amelyek Ni- és As-ionok felismerésére és erős megkötésére képesek. A későbbiekben, a Ni- és As- kötő flagellinekből, azok könnyen kontrollálható polimerizációját kihasználva, megfelelő méretű filamentáris receptorok építhetők, felületükön több ezer példányban megjelenő az adott célmolekulára specifikus kötőhellyel, annak hatékony megkötését eredményezve. Emellett egy másik irányvonalon elindulva, célom, hogy a flagellin molekula centrális D3 doménjét klónozzam és vizsgálatokat végezzek rajta, arra keresve választ, hogy önmagában a domén feltekeredett, stabil szerkezettel bír-e. A flagellinből kiragadott D3 domén kis mérete és reményeim szerint stabil szerkezete lehetőséget teremt, hogy mesterséges kötő fehérjék vázelemeként alkalmazható legyen.

9

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása A flagellinalapú receptorok előnye, hogy baktériumokkal nagy mennyiségben olcsón termeltethetők, a sejtek feltárása nélkül könnyen tisztíthatók, és emellett még a flagellin polimerizációs képességénél fogva rendkívül nagy felületi kötőhelysűrűségű filamentáris objektumok építésére is alkalmazhatók. A D3 domén alapú receptorok előnye pedig kis méretükben rejlik, olyan esetekben kaphatnak szerepet, ahol a felületi rögzítés során a filamentáris struktúra mérete nem felel meg a hordozónak (pl. pórusus szilícium). A jövőben a módosított filamentáris receptorok, vagy a módosított D3 domén magában, ivóvizek nehézfémekkel való szennyezettségének mérésére szolgáló optikai szenzorok alapeleméül szolgálhatnak.

10


2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1 A baktériumok flagelláris filamentumai A flagellumok a baktériumok mozgásszervei, olyan kis molekuláris gépezetek, amelyek számos figyelemre méltó tulajdonsággal rendelkeznek. A bakteriális flagellumok sejtmembránba ágyazott része magában foglal egy 50 nm átmérőjű, protonok által hajtott motort. Minden egyes motorhoz egy-egy 5-10 μm hosszúságú helikális filamentum (2. ábra) csatlakozik, amely flagellinfehérjék tízezreiből épül fel. Ezek a helikális filamentumok a baktérium úszása (1. ábra) során egyetlen nagy helikális köteggé állnak össze, és összehangolt forgásukkal mintegy propellerként hajtják előre a baktériumot 20-30 μm/s-os sebességgel [MACNAB, 1995; NAMBA & VONDERVISZT, 1997].

1. ábra: A baktériumok mozgása [NAMBA & VONDERVISZT, 1997].

A motor egy álló és egy forgó részből áll. Az álló részt a MotA és MotB fehérjék alkotják, ezek rögzítik szerkezetet a belső sejtmembránban, illetve a peptidoglükán rétegben [DEAN ÉS MTS., 1984; SHARP ÉS MTS., 1995; ZHOU ÉS MTS., 1995]. A MotA fehérje egy protoncsatornát

alkot

a

sejtmembránon

keresztül,

amelynek

a

motor

forgási

mechanizmusában van fontos szerepe [BLAIR & BERG, 1990]. A motor forgó részét (rotor) szintén gyűrű alakú komplexek alkotják. Részei a FliF fehérjékből álló MS gyűrű, [JONES ÉS MTS., 1990; SOSINSKY ÉS MTS., 1992; UENO ÉS MTS., 1992] amihez erősen kapcsolódik FliG

fehérjékből álló másik gyűrű is [FRANCIS ÉS MTS., 1992]. A FliG, FliM és FliN fehérjék a Cgyűrű részei, amely az MS gyűrű citoplazmatikus oldalán helyezkedik el, és együttesen az 11

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása úgynevezett kapcsoló komplexet alkotják [D RIKS & DEROSIER, 1990; KHAN ÉS MTS., 1992; FRANCIS ÉS MTS., 1992; 1994], amely a motor forgásának irányát határozza meg. A rotorhoz kapcsolódik a flagellum axiális része, elsőként a tengely vagy rúd (rod), amelyet öt fehérje alkot, a FliE, FlgB, FlgC, FlgF, FlgG [HOMMA ÉS MTS., 1990, SAIJOHAMANO ÉS MTS., 2004]. Ezt az L és P gyűrűk veszik körül (FlgH és FlgI fehérjék), amelyek csapágyként rögzítik a rudat a külső membránban, és a peptidoglükán rétegben [DEPAMPHILIS & ADLER, 1971; JONES ÉS MTS., 1990; SOSINSKY ÉS MTS., 1992].

A motor tengelyét a külső helikális filamentumokkal az erősen görbült szerkezetű kampó (hook) köti össze, ez képes a forgástengely irányának megváltoztatására. A filamentumok ugyanis nem a motor tengelye körül, hanem arra közel merőleges irányban elhelyezkedő saját hossztengelyük körül forognak. A kampót a FlgE fehérje mintegy 130 példánya alkotja, amelyek 55±6 nm hosszú [HIRANO ÉS MTS., 1994] helikális struktúrát képeznek [KAGAWA ÉS MTS., 1979]. A kampó felépülése kezdetén in vivo, egy FlgD alegységekből álló sapkaszerű segédfehérje kerül a rúd végére, amely a központi csatornán át újonnan érkező kampófehérje monomerek beépülését segíti [OHNISHI ÉS MTS.,1994]. Amikor a kampó elkészült, az FlgD alegységek leválnak a filamentum végéről, hogy helyet adjanak a további komponensek ráépülésének. A kampó érdekes tulajdonsága, hogy nagyfokú polimorfizmusra képes -a filamentumokhoz hasonlóan- a környezeti körülmények megváltozása esetén egymástól lényegesen eltérő helikális formákat vesz fel [KATO ÉS MTS., 1984].

A kampó és a filamentum között egy rövid összekötő szakasz található, amit két kampó asszociált fehérje alkot: a HAP1 (FlgK) és a HAP3 (FlgL) [IKEDA ÉS MTS., 1987]. Ehhez kapcsolódik a flagelláris filamentum, amely a kampóhoz hasonlóan szintén helikális polimer és amelyet flagellin (FliC) molekulák alkotnak. A filamentum külső átmérője 20 nm körüli, hossza pedig átlagosan 10 mm, amelynek felépítéséhez mintegy 30000 flagellin alegységre van szükség. A filamentumok in vitro is képesek a spontán önszerveződésre, in vivo szerkezetkialakításuk azonban csak a HAP2 (FliD) fehérje jelenlétében megy végbe. Ez az „intelligens” kötődésre képes sapka teszi lehetővé, hogy a citoplazmából a filamentumok belsejében lévő csatornán keresztül szállítódó flagellinalegységek beépülhessenek a filamentumok végére, és ne diffundáljanak szét az extracelluláris közegben. A HAP2 sapka esetében az „intelligens” kötődés azt jelenti, hogy nagyon erősen kötődik a filamentumok

12

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása végéhez, de emellett képes arra is, hogy megfelelő pillanatban lokálisan elengedje a filamentumok végét, hogy lehetővé tegye az újonnan odaérkező flagellinalegységek beépülését [NAMBA & VONDERVISZT, 1997]. A motor tengelyét felépítő fehérjéket, a kampó fehérjét, a flagellint és a HAP fehérjéket együttesen axiális fehérjéknek nevezik. Az axiális fehérjék a citoplazmában szintetizálódnak, majd egy speciális exportmechanizmus segítségével, a filamentum belsejében található csatornán keresztül jutnak el beépülési helyükre [NAMBA & VONDERVISZT, 1997; VONDERVISZT ÉS MTS., 1992; MACNAB ÉS MTS., 2004; BLOCKER ÉS MTS., 2003; VÉGH ÉS MTS., 2006]. A baktérium számára létfontosságú, hogy a flagelláris fehérjék

csak a megfelelő helyen és ne a sejten belül polimerizálódjanak. Ebben úgynevezett dajkafehérjék segédkeznek; a flagelláris exportban a FliS dajkafehérjék akadályozzák meg a nagy mennyiségben szintetizálódó, a bakteriális flagellumok helikális filamentumait alkotó flagellinmolekulák sejten belüli összekapcsolódását [MUSKOTÁL ÉS MTS., 2006].

13


2. ábra: A flagellumok keresztmetszeti rajza. A filamentumok vastagsága 23 nm, hosszúságuk akár 10-20 mm is lehet [NAMBA & VONDERVISZT, 1997].

A flagelláris filamentumok érdekes tulajdonsága, hogy önszerveződő rendszerek, azaz a flagellin monomerek megfelelő körülmények között spontán módon össze tudnak állni a natívval megegyező szerkezetű filamentumokká. A filamentumok 60 oC-on hőkezelve, vagy sav (pH=2.5) hatására monomerjeikre esnek szét, de ezekből a monomerekből, rövid filamentumok (magok) vagy precipitálószerek (pl. ammónium-szulfát) hozzáadásával újra felépülnek a filamentumok [ASAKURA, 1970]. Másik figyelemre méltó sajátosságuk pedig, hogy a környezeti körülményektől függően, reverzibilis módon különféle, egymástól jól megkülönböztethető helikális formákba, stabil állapotokba képesek átrendeződni. Ez a jelenség a polimorfizmus. Ilyen helikális 14

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása szerkezeti átrendeződések előidézhetők a hőmérséklet, az ionerősség vagy a pH változtatásával, de mechanikai erőhatás is kiválthatja őket [NAMBA & VONDERVISZT, 1997].

A

flagelláris

filamentumok

röntgendiffrakciós

és

elektronmikroszkópiás

szerkezetanalízisével megmutatták, hogy az alegységek közötti kölcsönhatások a filamentum centrális részére korlátozódnak, ezek eredményeként a filamentumok magját két koncentrikus gyűrű alakú struktúra építi fel [YAMASHITA ÉS MTS., 1995; YAMASHITA ÉS MTS., 1998]. A filamentumok radiális tömegeloszlását tekintve és más predikciós eredményeket felhasználva, megállapították, hogy a flagellinmolekula monomer állapotban rendezetlen terminális régiói elsősorban a belső gyűrű felépítésében vesznek részt (3. ábra).

3. ábra: A filamentum szerkezete [YONEKURA ÉS MTS., 2003].

15

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása A Salmonella typhimurium flagelláris filamentumai térszerkezetének felderítése során ismertté vált, hogy a filamentumok flagellin alegységei 11 protofilamentumba rendeződnek [NAMBA ÉS MTS., 1989; HOMMA ÉS MTS., 1990; NAMBA & VONDERVISZT, 1997; YONEKURA ÉS MTS., 2003], amelyek egymással szoros kölcsönhatásban alakítják ki a filamentumok

szerkezetét.

2.2 A flagellin monomer A Salmonella typhimurium baktérium flagellinje 494 aminosavból áll [KANTO ÉS MTS., 1991]. Az aminosavszekvenciák összehasonlító vizsgálata felfedte (4. ábra), hogy a közel

180 N-terminális és 100 C-terminális aminosavat magukba foglaló terminális régiók erős szekvenciális homológiát mutatnak, míg a centrális szegmensek nagymértékben variábilisak [WILSON, 1993; BEATSON ÉS MTS., 2006]. A különböző eredetű flagellinek molekulatömege széles határok között változik (28-65 kDa), a különbségek a centrális régió eltérő méretéből adódnak. Mostanra számos fajhoz, és azokon belül esetenként több változathoz tartozó flagellin aminosav szekvenciáját meghatározták, a fehérjét kódoló fliC gén szekvenciájával együtt. Ismert flagellin szekvenciákkal történő összerendezés után az új szekvenciák esetében is jellemzően megkülönböztethetők voltak a nagyobb mértékű homológiát mutató konzervatív, terminális régiók és a centrális elhelyezkedésű variábilis régió [JOYS 1985; WEI & JOYS, 1985; SCHOENHALS & WHITEFIELD, 1993].

4. ábra: A különböző baktériumokból származó flagellinek szekvenciális hasonlósága

[WILSON, 1993]. 16

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása A terminális régiók konzerválódottsága fontos szerkezeti és funkcionális szerepükre utal. A flagellinmolekula polimerizációs tulajdonságait vizsgálva többen felfigyeltek arra, hogy a filamentáris szerkezet kialakulása során a molekula nagymértékű konformációs átrendeződésen megy keresztül. A polimerizáció eredményeképpen rendeződő régiók után kutatva limitált proteolízis, spektroszkópiás és kalorimetriás módszerek kombinált alkalmazásával megmutatták, hogy a Salmonella typhimuriumból származó, 494 aminosavból álló flagellinmolekula terminális régiói, 66 N-terminális és 44 C-terminális aminosavnyi rész, oldatban nem rendelkeznek kompakt, stabilis térszerkezettel [VONDERVISZT ÉS MTS., 1990; VONDERVISZT ÉS MTS., 1989; AIZAWA ÉS MTS., 1990]. A feltételezések szerint, ezek a rendezetlen terminális régiók (a korábban említett FliS chaperonok) akadályozzák meg a sejten belüli polimerizációt, mivel a rendezetlen végű alegységek nem képesek egymáshoz kötődni, a régiók nem képesek egymást rendezni, ezért nem is indul meg in vitro körülmények között a filamentumok kialakulása precipitálószerek nélkül [NAMBA & VONDERVISZT, 1997; VONDERVISZT ÉS MTS., 1992]. Ma már ismeretes, hogy a flagellinmolekulának van egy stabil, kompakt magja, amely a rendezetlen terminális régiók teljes eltávolításával állítható elő tripszin segítségével, ez az F40-es fragmentum (40 kDa), amely lassan továbbemészthető egy 27 kDa-os fragmentummá [VONDERVISZT ÉS MTS., 1991; VONDERVISZT ÉS MTS.,1990]. A legújabb kutatások egy mindkét terminálisán csonkított 41 kDa-os (F41) fragmentum kristályosítása és röntgendiffrakciós vizsgálata révén meghatározták a filamentum szerkezetét (5.ábra) [SAMATEY ÉS MTS., 2001].

5.ábra: 41 kDa-os fragmentum [SAMATEY ÉS MTS., 2001].

17

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása Az F41 fragmentum három fő részből a D1, D2 és D3 doménből áll. A D1 domént három a-hélix alkotja, melyek a filamentum külső gyűrűjét építik fel. A D2 domén főleg blemezekből áll, de található benne két rövid hélix is. Két aldoménre osztható, a D2a-ra, amely az N-terminálist foglalja magába és a D2b-re, amely a C-terminálist tartalmazza. A D3 domén pedig, egy rövid helikális rész kivételével b-lemezekből áll. A D2 és D3 domén a filamentum felszínén található, míg a D0 domén a filamentum szerkezetének belső gyűrűjét alkotja (6. ábra).

6. ábra: A flagellin alegységek elhelyezkedése a flagelláris filamentumokban

[SAMATEY ÉS MTS., 2001]. Felfedezték, hogy a flagellinmolekulák (a többi axiális fehérjével megegyezően) terminális régiói hidrofób aminosavak hetes ismétlődéseit tartalmazzák, ami arra utal, hogy a térszerkezet kialakítása során ezek a régiók α-helikális kötegeket képeznek. [HOMMA ÉS MTS., 1990]. Továbbá a távoli UV-ban felvett CD spektrum is ezt igazolta, miszerint a

flagellinmolekulák polimerizációja során a rendezetlen régiók α-helikális szerkezetet vesznek fel. Ilyen hidrofób aminosav ismétlődéseket más fehérje-kölcsönhatásokban is megfigyeltek. Ezért azt feltételezték, hogy a flagelláris filamentumok képződése során a szomszédos alegységek N- és C-terminális régiói egymással helikális kötegeket formálnak, és a helikális kötegek egymásba fonódó láncolata eredményezi a folytonos filamentáris szerkezet kialakulását. Úgy hogy a filamentum felépülése olyan egyirányú folyamat, amelyben a

18

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása filamentum végén lévő szabad N-terminálishoz kötődik a következő alegység C-terminálisa [IINO ÉS MTS., 1969; URATANI ÉS MTS., 1972; MIMORI-KIYOSUE ÉS MTS., 1997].

2.3 Flagellinalapú filamentáris receptorok Korábbi vizsgálatok megmutatták, hogy csupán a flagellinalegységek konzerválódott terminális régiói vesznek részt a filamentum építésben [VONDERVISZT ÉS MTS., 1991; MIMORI-KIYOSUE ÉS MTS., 1997]. Ugyanakkor centrális részük a filamentumok felszínén található, kívülről könnyen hozzáférhető D3 domént alkotja. A D3 domén a szomszédos alegységekkel nincs kontaktusban [SAMATEY ÉS MTS., 2001; YONEKURA ÉS MTS., 2003], a filamentáris szerkezet kialakításában nem játszik szerepet. A D3 domén jó célpontot nyújt a génsebészeti beavatkozások számára, az önszerveződés megzavarása nélkül könnyen módosítható. A D3 domén felépítésében a Salmonella typhimurium flagellinjének 190-284 aminosav szekvencia szegmense vesz részt. Ez egy szokatlan β-hordó szerkezetű domén, amely négy β- láncból és egy rövid α-helikális szegmensből épül fel [SAMATEY ÉS MTS., 2001; YONEKURA ÉS MTS., 2003]. A külső közeg felé néző- a filamentum tengelyével legtávolabbra eső- felszínét három hurokrégió alakítja ki, nevezetesen a 205-213 (L1), a 236-244 (L2) és a 261-270

(L3)

szegmensek

(7.

ábra).

Ezen

hurokrégióknak

aminosavszekvenciáit

megváltoztatva, a D3 domén felületi tulajdonságai módosíthatók, ezáltal ott specifikus kötőhelyek (töltésmintázatok, topográfia) kialakítására nyílik lehetőség.

7. ábra: A D3 domén polipeptidvázának szerkezete a flagellin fehérjében. A domén külső közeg felé néző felszínét a 205–213 (L1), a 236–244 (L2) és a 261–270 (L3) hurokrégiók alakítják ki.

19

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása A flagellin polimerizációs képességét megőrizve, a D3 domén módosításával kívánunk létrehozni flagellinalapú mesterséges receptorokat. A D3 domént vázszerkezetként alkalmazva mesterséges receptorok többféle módon is előállíthatók: 1. az L1, L2, L3 hurokrégiók aminosavszekvenciáit módosítva mesterséges evolúciós eljárások (18–21) alkalmazásával; 2. a L1, L2, L3 hurokrégiók kötési tulajdonságainak célzott megváltoztatásával, fehérjetervezés alkalmazásával, más fehérjékben megfigyelt kötőszegmensek, illetve kívánt tulajdonságú oldalláncok beépítésével; 3. specifikus kötési tulajdonságú molekulák, fehérjék D3 domén felületére való rögzítésével. A gyógyszeriparban,

az

orvosi diagnosztikában,

vagy a

környezetvédelmi

vizsgálatokban gyakori feladat komplex elegyek egyes komponenseinek megbízható kimutatása. A kutatások egyre inkább a bioszenzorok irányába mutatnak, amelyek egy molekuláris felismerést biztosító biológiai eredetű felismerő részből és egy fizikai-kémiai jelátvivő egységből állnak. A fehérjék rendkívül specifikus molekula felismerésre képesek, amelynek fontos szerepe van az élő szervezetek környezettel való kommunikációjában és az idegen anyagok elleni védekezésben is. Számos mikroorganizmusban találhatók olyan fehérjék, amelyek átmeneti és nehézfém ionok erős és szelektív megkötésére, azok közegbeli koncentrációjának precíz érzékelésére képesek. Sok fémkötő fehérje esetében ismertek azok a szerkezeti motívumok, amik meghatározó szerepet játszanak az adott célmolekula felismerésében és megkötésében. [BUSENLEHNER, PENELLA & GIEDROC, 2003; ROMERO-ISART & VASÁK, 2002]. A magasabb rendűek immunrendszerének működése pedig azon alapul, hogy az antitestek, közöttük az immunglobulin G (IgG) molekulák nagyon sokféle idegen anyagot képesek megbízhatóan felismerni, ugyanis a természet több millió IgG variánst generál, amelyek csak a kötőrégiójuk szerkezetében térnek el egymástól [METZGER, 1990]. A tapasztalat azt mutatja, hogy a sok variáns között mindig van olyan, amely specifikusan tud kötődni a szervezetbe kerülő idegen anyag valamelyik felületi régiójához. A

hagyományos

bioszenzorok

illetve

fehérje

chipek

általában antitesteket

(immunglobulin molekulákat) vagy azok alkalmas részegységeit alkalmazzák érzékelő elemként [ZHU & SNYDER, 2003]. Ezek előállítása költséges, preparálásuk bonyolult, stabilitásuk sokszor elégtelen, a hordozó felülethez kötve könnyen elveszítik natív

20

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása térszerkezetüket,

működőképességüket.

Az

antitestek

kiváltása

más

fehérje

alapú

receptorokkal mindenképpen kívánatos. Ismeretesek már sikeres próbálkozások, hogy az IgG-doméneknél megfigyelt alapelveket alkalmazva más, eredetileg receptor tulajdonságokkal nem rendelkező fehérjék felületén alakítsanak ki adott célmolekulára specifikus kötőhelyeket [XU ÉS MTS., 2002; SKERRA, 2001; NYGREN & UHLEN, 1997]. Xu és munkatársai a 3-as típusú fibronektin domén felületi hurokrégiói aminosavszekvenciáinak variálása révén nagyszámú mutánst létrehozva, irányított evolúciós eljárások alkalmazásával állítottak elő TNF-α fehérje specifikus megkötésére alkalmas receptorokat [XU ÉS MTS., 2002] Hasonlóképpen Skerra és munkatársai a lipocalin fehérjéből kiindulva hoztak létre különféle receptorokat [SKERRA, 2001]. Viszont az eddig ismert fehérjealapú receptorok előállítása továbbra is költséges és munkaigényes. Kívánatos lenne egy, az eddig ismerteknél egyszerűbben és olcsóbban előállítható, nagymértékű variábilitást biztosító receptorcsalád megalkotása. Különösen előnyös volna olyan receptorok előállítása, amelyekkel különféle szupramolekuláris szerkezetek építése is lehetővé válik. A baktériumok flagelláris filamentumai, mint ilyen szupramolekuláris rendszerek megoldást kínálnának erre a problémára. Egy új megközelítésben tekintve, ha a flagellinen megfelelő kötőrégiót alakítanak ki, akár maguk a flagellinek, de akár csak a D3 doménjük izolált formában különféle célmolekulák felismerésére és megkötésére képes receptorként filamentumok

alkalmazhatók. építhetők,

flagellinreceptorok

nagy

és

Sőt

a

módosított

hordozóhoz

előnye,

hogy

kötve az

flagellinalegységekből fehérjechipként

antitesteknél

és

rekonstruált

használhatók.

más

eddig

A

ismert

fehérjereceptoroknál lényegesen egyszerűbben és olcsóbban a baktérium sejtek feltárása nélkül előállíthatók. Mindemellett a flagellin polimerizációja könnyen kontrollálható [ASAKURA, 1970; ASAKURA ÉS MTS., 1964], a kialakuló filamentumok a fizikai-kémiai behatásokkal szemben stabilisak, a proteázokkal szemben ellenállóak, és szerkezetük atomi precizitással ismert. Fontos megemlíteni, hogy a flagellinreceptor megjelölés, itt nem a hagyományos értelemben vett receptornak felel meg, ugyanis a biológiai receptorok olyan biomolekulák specifikus megkötésére alkalmas peptidek, fehérjék, melyeknél a receptor-ligandum közötti kölcsönhatás konformációs átalakulásokat eredményez a receptor szerkezetében. Ezek a konformációváltozások pedig bizonyos sejtválaszt indukálnak, mint például egy ioncsatorna megnyitását vagy egy bizonyos enzim aktiválását. A mi értelmezésünkben a receptor olyan fehérjét jelöl, amely egy vagy több célvegyület specifikus felismerésére és megkötésére képes. 21


3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK A következő fejezetekben azokat a kísérleti módszereket foglalom össze és ismertetem, amelyeket munkám során alkalmaztam. Az egyes módszereket követően röviden írok a felhasznált anyagokról, de a részletes kísérleti körülményeket a 4. Eredmények és értékelésük c. fejezetben tárgyalom.

3.1. A klónozás és a génamplifikációs eljárások Bármilyen klónozási eljárás célja, hogy egy ún. klónt, azaz tökéletesen egyforma szervezetek csoportját állítsa elő. A génklónozási kísérletekben rendszerint baktériumsejtbe viszik be az idegen gént, majd a módosított baktériumok szaporításával klónt hoznak létre. A klónozott sejtek mindegyike tartalmazza a bevitt idegen gént, és amíg biztosított a gén replikációja, a gazdasejt klónozásával klónozzák a gént is [WEAVER & HEDRICK 2000]. A génsebészetben használt klónozó vektorok sokfélék lehetnek, bakteriofágok, mesterséges kromoszómák, plazmidok és ezek hibrid származékai, a kozmidok. A baktérium gazdasejt esetében a vektorok általában 3-6 kilobázis nagyságú extrakromoszómális, gyűrű alakú DNS-molekulák (plazmidok) lehetnek. A plazmidok a kromoszómától függetlenül, önállóan replikálódni képes cirkuláris DNS molekulák, amelyek nagyon sok baktériumfajban természetes módon előfordulnak. Általában olyan különleges tulajdonságokat

kódoló

géneket

hordoznak,

amelyek

a

környezethez

való

jobb

alkalmazkodást segítik, de nem szükségesek minden körülmények között a gazdaszervezet életben maradásához (nehézfém rezisztencia, toxintermelés, antibiotikum rezisztencia, speciális anyagcsere utak, restrikciós-modifikációs rendszerek, patogenitás). Kis méretük miatt viszonylag könnyű a sejtekből láncszakadás, összetöredezés nélkül kinyerni őket. Egy sejtben a plazmidból általában több példány, akár több száz kópia is lehet, ettől függően nevezik őket kis vagy nagy kópiaszámú plazmidoknak. Napjainkban számtalan, in vitro rekombináns DNS technikával mesterségesen "összeállított" plazmid létezik, amelyek a génizolálás, a DNS szekvenálás, a génexpresszió vizsgálata vagy fehérjék termeltetése terén egyaránt hasznos eszközök.

22

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása A géntechnológia másik legfontosabb eszközei a restrikciós endonukleázok, amelyek specifikus, úgynevezett palindrom (elölről és hátulról olvasva azonos) szekvenciákat hasítanak. A restrikciós endonukleázok felfedezéséért W. Arber, H. Smith és D. Nathans részesült Nobel-díjban (1978). E. coliban figyelték meg őket, nevüket arról kapták, hogy megakadályozzák az idegen DNS invázióját, a molekula feldarabolásával. A restrikciós enzimek legfőbb előnye, hogy reprodukálhatóan, mindig ugyanott vágják el a DNS-t és a restrikciós fragmensek jellegzetes ujjlenyomatot alkotnak, ráadásul sokuk nem egymással szemben vágja el a DNS-szálat, hanem kissé eltolódva, tehát egyfonalas túlnyúló szálakat képez ún. ragadós végeket, így ezek könnyen összekapcsolódnak egymással [BÁLINT 2000]. A plazmid vektorba is ezeknek a ragadós végeknek a segítségével építik be az idegen DNS-darabot, mégpedig úgy, hogy a plazmidot adott helyen megfelelő restrikciós endonukleázokkal elhasítják, ilyenkor a plazmid egy helyen hasad, és komplementer ragadós végek keletkeznek. Ha a beillesztendő DNS-darabot is ilyen restrikciós enzimmel kezelik, akkor annak is ugyanilyen ragadós végei lesznek, majd a hasadási helyeken elvágott láncok a DNS ligázok segítségével újra egyesíthetők. A DNS-ligáz enzim feladata, hogy létrehozza a foszfodiészterkötést, és kialakítsa a folyamatos DNS szálat. Így a két enzim együttes alkalmazása lehetőséget teremt a gének „szabására-varrására”, sőt mi több, új, tetszőleges DNS-szakaszok beépítésére is. Berg (Nobel-díj, 1980), Boyer és Cohen úttörő munkássága a hetvenes évek elején a rekombináns DNS technika kifejlesztéséhez vezetett. Ennek lényege az, hogy új génszakaszok és gének állíthatók elő laboratóriumi körülmények között. Az új génkombinációk klónozhatók –vagyis megsokszorozhatók– megfelelő sejtekben a gazdasejt saját DNS-szintetizáló mechanizmusa révén, az új gének átírhatók és a transzlációt követően új fehérjék állíthatók elő.

23


8. ábra: A pGFP-fliC vektor térképe a NebCutter programmal tervezve, a fliC HindIII-BamHI helyen az a jelű 495 aminosavnyi részt kódoló szegmens.

A kísérleteimben használt egyik plazmid a pGFP, egy pUC alapú vektor volt, melyben a fliC gén a HindIII- BamHI (New England Biolabs) helyre van beligálva (8. ábra). A D3 domén génjét pedig egy pET21c nevű (Novagen) vektorba klónoztam NheI-NotI (Fermentas) restrikciós enzimek segítségével.

Ahhoz, hogy a genom egy, kitüntetett szakaszát vizsgálni tudják (pl. szekvenálni), a megfelelő DNS-szakasznak nagy kópiaszámban kell rendelkezésre állnia. Kismennyiségű DNS felszaporítása kétféle stratégiával történhet. Az egyik in vivo módszer, melyben a vizsgálandó DNS vektorba építhető, majd baktériumban megsokszorozható. A másik módszer a polimeráz láncreakció (PCR), amelyben egy kívánt DNS-szakasz rendkívüli hatékonysággal in vitro rendszerben szaporítható fel. A transzformáció (9. ábra) a genetikai rekombinációnak az a formája, melynek során a sejt a környezetéből idegen DNS-t vesz fel és a rajta elhelyezkedő géneket, beépíti saját genetikai anyagába. A sejt az így szerzett új jelleget tovább örökíti. Transzformáció során a baktériumok aktív, energiaigényes mechanizmussal veszik fel környezetükből a DNS-t.

24

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása Kiderült, hogy nem minden sejt képes felvenni DNS-t csak az ún. kompetens sejtek, a kompetenciaállapot a sejtnek azt a fizikai állapotát jelöli, melyben fel tudja venni a DNS-t.

9. ábra: A transzformáció folyamatábrája.

A génsebészeti technikák kifejlesztésében nagy szerepe volt az E. coli transzformáció kidolgozásának. Ca2+ ionok hatására az E. coli sejtfelszín lipopoliszacharid rétege változásokat szenved, de hogy milyen módon jut a DNS a gazdasejtbe, még ma sem igen ismert mechanizmus. A Salmonella esetében a lipopoliszacharid réteg viszont a nem Ca2+ ionok, hanem elektroporáció hatására válik átjárhatóvá. A transzformánsok szelekciója azon alapul, hogy a plazmid DNS-t felvett sejtek szelektálható markert, pl. antibiotikum 25

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása rezisztenciagént tartalmaznak, ezért képesek növekedni antibiotikum tartalmú táptalajon is, ahol a nem transzformált sejtek elpusztulnak. Kísérleteim során a transzformációhoz E. coli TOP10 (Invitrogen), XL1-Blue (Stratagene), BL21 (DE3) pLysS és Salmonella SJW2536 flagellin deficiens törzseket használtam. A transzformációt az E. Coli törzsek esetén CaCl2-os kezeléssel [SAMBROOK & RUSSEL, 2000], a Salmonella esetében elektroporációval végeztem elektroporátor készülék

segítségével (BioRad Gene Pulser). Egy kívánt génszakasz homogén formában történő szaporítása klónozás útján hosszú, munkaigényes folyamat. De létezik egy olyan módszer, amely nagyon gyorsan automatizálva is képes egy kívánt DNS-szakasz akár milliószoros mennyiségre történő sokszorosítására (10.ábra), ha annak szekvenciája legalább az elején és a végén ismert, ez a polimeráz láncreakció (PCR), melynek módszerét 1984-ben Kary Mullis fedezte fel [BÁLINT, 2000]. A szekvencia ismeretében DNS-szintetizátorban két olyan 20-25 tagú egyszálú oligonukleotidot (primer) készítenek, amelyek komplementerek a kérdéses DNS-darab egyik illetve másik láncának 3’-végével, ezek töltik be a primer szerepét. A reakcióelegy tartalmazza a sokszorosítani kívánt DNS-mintát, a nagy moláris feleslegben levő primereket és a négy dezoxi-ribonukleozid-trifoszfátot (dNTP) és egy olyan DNS-polimerázt, amely igen nagy hőmérsékletű hőforrásokban élő baktériumból származik (Taq polimeráz, Pfu polimeráz) és ezért nagy a hőtűrése. Aktivitását megőrzi olyan hőmérsékleten is, amikor a DNS denaturálódik. A DNS-polimeráz a primereket képes folytatni, ehhez a DNS egy-egy szálát használja mintaként, aminek irányítása alatt elkészülnek az új DNS-szálak. Az egymás után beépülő nukleotidok kiválogatása a templát szál segítségével a Watson-Crick bázispárosodás törvényei alapján történik. Így az újonnan képződő DNS-szál a templát DNSsel kettős hélixet alkot. Minden ismert DNS-polimeráz a 3’OH-hoz tud dNTP-t hozzákapcsolni (a dNTP-ből pirofoszfát kihasadása mellett), ezért a láncnövekedés mindig 5’→3’ irányú [BÁLINT, 2000]. A reakcióelegy hőmérsékletét körülbelül 95 oC-ra emelve a DNS denaturálódik, két lánca elválik egymástól. A reakcióelegyet alacsony hőfokra hűtve a nagy moláris feleslegben levő szintetikus primer molekulák hibridizálnak a megfelelő lánccal. A reakcióelegyet a polimeráz aktivitásának megfelelő hőmérsékleten tartva az enzim megszintetizálja a primerek folytatását képező láncokat, és így az eredeti DNS megkétszereződik.

26

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása Egy újabb ciklus elindítható a reakcióelegy ismételt felmelegítésével. Ekkor az újonnan szintetizált DNS-molekulák ismét denaturálódnak és így az eredetinél már kétszer több mintát (templát) szolgáltatnak a reakcióhoz. Hűtés után a nagy feleslegben jelen levő primer ismét hibridizál a megfelelő láncokkal és a polimeráz láncreakció végbemegy, ennek végén a DNS mennyisége ismét megkétszereződik. A ciklus 20-25-ször ismételhető meg, a folyamat végén a DNS mennyisége 2n-szeresére növekszik (n a ciklusok száma).

27


10. ábra: A PCR folyamatábrája.

A polimeráz láncreakciót ma már rutinszerűen használják a diagnosztikában és az igazságügyi orvosi gyakorlatban. Esetemben a reakciót a D3 domént és a flagellint kódoló DNS amplifikálására, illetve az irányított mutagenezishez használtam, a részletes körülményeket a kísérletek leírásánál ismertetem.

28


3.2. Irányított mutagenezis Ha egy fehérje génjének klónja már rendelkezésre áll, tetszőlegesen lehet mutációkat, deléciót (törlés), inzerciót (beépítés), szubsztitúciót (helyettesítést) végezni rajta. Ezzel bármilyen klónozott DNS-darabot bármilyen kívánt szakaszra ki lehet cserélni. A mesterségesen irányított mutagenezis módszer lényege, hogy egyesszálú rövid DNS-darabot szintetizálnak (primert), amely tartalmazza a kívánt mutációt, egyébként teljesen komplementer a fehérjét kódoló génszakasszal ( 11. ábra). Ezt a primert hibridizáltatják a klónozott kettősszálú DNS-sel, a primerek folytatását a DNS-polimeráz végzi, a dNTP-k felhasználásával, az új láncon keletkező rést pedig a transzformálás során az XL1-Blue sejtek szüntetik meg. A lemezen kinőtt telepek nagy arányban a mutáns plazmidokat tartalmazzák, de szekvenálással pontosan meghatározható, hogy ott van-e a kívánt mutáció. Munkám során a pGFP vektorba illesztett fliC génben helyettesítettem -megfelelő távolságban elhelyezkedő- aminosavakat hisztidinekkel, ehhez használtam az irányított mutagenezis módszert. A kísérletekben QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kitet (Stratagene) használtam, benne a PfuTurbo polimerázt, DpnI enzimet, E. coli XL1-Blue törzset, az oligonukleotidokat pedig az MTA SZBK munkatársai készítették. A mutagenezis pontos körülményeiről a kísérletek leírásakor írok.

29


11. ábra: A QuikChange mutagenezis folyamatábrája.

Nem csupán irányított, de véletlen (random) mutációk is indukálhatók. A mai legmodernebb sejtmentes fehérjeszintetizáló és szelekciós módszerekkel, mint a riboszóma display vagy mRNS display óriási számú, 1012 – 1015 variáns előállítására és szelektálására (tesztelésére) nyílik lehetőség [AMSTUTZ ÉS MTS., 2001]. Ez az úgynevezett in vitro (irányított) molekuláris evolúció ma már széles körben, szinte rutinszerűen alkalmazott laboratóriumi technikává vált. A módszer három lényeges lépése a következő (1.) véletlenszerű pontmutációk generálása, (2.) véletlenszerű rekombináció előidézése a mutáns DNSmolekulák között (shuffling) és (3.) kívánt tulajdonságú fehérjét kódoló génvariánsok szelekciója (vagy szűrése). Az irányított evolúció módszerét, olyan génkönyvtár létrehozásában kívánjuk alkalmazni, amely nagyszámú,

felületi tulajdonságaiban véletlenszerűen módosított

30

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása flagellinvariáns génjét tartalmazza, és amelyből a későbbiekben ki tudjuk választani az előállított

variánsok

közül azokat,

amelyek

egy-egy célmolekula

megkötésére

a

legalkalmasabbak. Addig azonban, míg a könyvtár elkészül, természetben megfigyelt kötőszegmensek

beépítésével

kívántunk

létrehozni

flagellinalapú

receptorelemeket,

amelyekkel a felületi rögzítés és a későbbiekben alkalmazandó mérési módszer fejlesztése elkezdhető [AQUANAL PROJECT]. A génmutáció pontos tervezéséhez fontos, hogy a fehérje szerkezete harmad-, illetve negyedleges struktúrája minél részletesebben ismert legyen. Röntgendiffrakciós és elektronmikroszkópiás szerkezetanalízis segítségével egyértelmű információk kaphatók erről, és szekvencia-homológia keresésével is jó eredmény érhető el. Emellett ha ismert a fehérje térszerkezete és az aminosavak sorrendje,

számítógépes grafikával,

modellezéssel

megkereshetők a mutagén beavatkozásra legmegfelelőbb helyek. Esetemben az irodalomból ismeretes szekvencia homológia vizsgálat alapján látható, hogy a kialakítandó mutációk legmegfelelőbb helye a flagellinmolekula hipervariábilis régiójában, a D3 doménben lenne. Így a flagellin atomi koordinációinak ismeretében a Protein Explorer program segítségével választottam ki a D3 doménben megfelelő távolságban elhelyezkedő aminosavakat.

3.3. Gélelektroforézis A gélelektroforézis alapelve az, hogy a töltéssel rendelkező molekulák az össztöltésüknek megfelelően elektromos térben az ellentétes töltéssel rendelkező elektród felé vándorolnak. Az agaróz gélelektroforézis a DNS azonosítására használható, a DNS molekula foszfátcsoportjai miatt negatív össztöltéssel rendelkezik, feszültség hatására a pozitív pólus felé vándorol. A gélközeg ellenállása miatt a kisebb méretű DNS gyorsabban a nagyobb méretű lassabban fog vándorolni a gélben, így lehetővé válik a méret szerinti elkülönítés. A gélelektroforézis során az azonos molekulatömegű DNS-darabok sávokba rendeződnek. Ezek láthatóvá tétele úgy történik, hogy a géllapot planáris aromás kationok oldatába merítik (pl. etídiumbromid-oldatba). Ezek a festékek az egymás után következő bázisok síkja közé rétegződnek, ezáltal megnő az ultraibolyafényben mutatott fluoreszcenciájuk a szabad

31

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása festékhez képest [BÁLINT, 2000]. Általánosan alkalmazott agaróz koncentráció 1 %, ez a legtöbb plazmid és PCR-termék számára is megfelelő. Kísérleteimben a PCR termékek izolálásához, emésztések ellenőrzéséhez használtam az agaróz gélelektroforézist. A hozzá felhasznált vegyszerek a következők voltak: Agarose (Sigma, Seakem), TAE (40 mM Tris/acetát, 1 mM EDTA, pH = 8,5) puffer, 1 kb DNALadder (Fermentas), stopoldat (Sigma), festékként etídium-bromid (Merck). A DNS-nél lényegesen nagyobb méretű fehérjék elválasztásákor nem agaróz, hanem poliakrilamid gélt alkalmaznak. A fehérjéknek nátrium-dodecil-szulfát (SDS) maszkírozás hatására lesz nagy negatív össztöltése, és a módszerrel a fehérje minták tisztasága megállapítható. Kísérleteimben, a módszert flagellinmolekula és a D3 domén azonosításához, és tisztaságának ellenőrzéséhez használtam. Az alkalmazott vegyszerek a következők voltak: poliakrilamid, nátrium-dodecil-szulfát (SDS), ammónium-perszulfát (APS, Biorad), NNN’N’tetra-metil-etilén-diamin (TEMED, Bio-Rad) mintapuffer (Fluka), trisz-(hidroximetil)-aminometán (Tris), glicin, ecetsav és etanol (Reanal), Coomassie Stain festék (Biorad), kis molekulatömegű markerek (Biorad, Sigma).

3.4. Ioncserélő és affinitás kromatográfia Kromatográfia néven foglalhatók össze mindazok az elválasztás technikai módszerek, amelyekben két fázis közötti megoszlás eredményeként válik szét valamilyen elegy komponenseire. kölcsönhatáson,

A

két

fázis

diffúzión,

közötti

anyagátadás

affinitás-kromatográfia

alapulhat esetén

adszorpción, pedig

ionos

különleges

kölcsönhatásokon. Minden kromatográfiás eljárásnak közös vonása, hogy az egyik fázis folyamatosan áramlik a másik, ún. álló fázissal szemben. Az álló fázis halmazállapota lehet szilárd vagy folyadék, a mozgó fázis pedig folyadék vagy gáz. A folyadék mozgófázisú kromatográfiás módszereket a kivitelezés módjától függően feloszthatjuk oszlop és réteg kromatográfiás módszerekre. A kromatográfiás módszereknek nagy jelenőségük van a biológiai eredetű molekulák elválasztása során. A fehérjék tisztítására töltésük (ami a közeg pH-jának változtatásával szabályozható)

alapján,

jól

alkalmazható

az

ioncserélő

kromatográfia.

Affinitás

kromatográfia segítségével pedig valamilyen biológiai specifitás (pl. enzim-szubsztrát,

32

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása enzim-inhibitor, receptor-ligandum, antigén-antitest) használható fel úgy, hogy a specifikusan kölcsönható pár egyik komponense a szilárd fázishoz van rögzítve, és képes kikötni egy oldatból a kölcsönható partnert. Az oldat egyéb komponensei ezután mosással eltávolíthatók, majd a mozgó fázis paramétereinek változtatásával a specifikus kölcsönhatást megszűntetve az elválasztandó anyag tisztán lemosható az oszlopról. A fehérjék ioncserélő kromatográfiával történő szétválasztása a molekulák felületi töltéseinek különbözőségén alapul. Az ioncserélő kromatográfia széles körben elterjedt a fehérjék tisztításánál, izolálásánál, ugyanis a mérsékelt kötő- és leoldási feltételek mellett sértetlen, biológiailag aktív fehérjék választhatók szét egymástól nagy hatásfokkal. Az ioncserélő töltet kötött fázisa vagy pozitív (anioncserélő), vagy negatív töltésű (kationcserélő) funkciós-csoportokat tartalmaz. Az elektrosztatikus kölcsönhatás a különböző töltésű csoportok között a kromatográfiás töltet felszínén jön létre, ahol a kötőmolekulák viszonylag szorosan egymás mellett helyezkednek el. Az ionos kötés olyankor következik be, amikor a mozgó fázis ionerőssége egy bizonyos pont alá csökken, ilyenkor az oszlop töltetén levő töltött csoportokhoz hozzákötődnek az ellentétesen töltött molekulák. Az elúció akkor következik be, amikor a mozgó fázis ionerőssége elegendően nagyra nő, amit nagyobb ionkoncentrációjú oldattal érnek el (12.ábra). A sóionok a kötött molekulákkal helyet cserélnek, amelyek így visszakerülnek a mozgó fázisba [BIOMOLECULE CHROMATOGRAPHY PERSEPTIVE BIOSYSTEM, 1996]. A fehérjék töltéseit figyelembe véve az izoelektromos pont (pI) egy fontos tulajdonságuk, ami az a pH- érték, amelynél a negatív töltések száma megegyezik a pozitív töltésekével, vagyis amikor a nettó töltés egyenlő nullával. Ha egy molekula magas izoelektromos ponttal jellemezhető, akkor semleges pH mellett pozitív töltésűvé válik és az alacsony izoelektromos pontú pedig negatív töltésűvé.

33


12. ábra: Az ioncserélő oszlop működése.

Mivel a flagellinmolekula pI értéke 5,5, kísérleteimben a mutáns flagellinek tisztítását ioncserélő kromatográfiás rendszer (Biorad) segítségével végeztem XK16 (Pharmacia Biotech) 25 ml-es anioncserélő oszlopon, a minták beinjektálása automatikus mintaadagoló (Biorad) segítségével történt. Vivőpufferként 20mM-os Tris (A) puffert, elúciós pufferként 20 mM Tris 150mM NaCl (B) puffert alkalmaztam. Az affinitás kromatográfia kiválóan alkalmas biomolekulák, többek között fehérjék, antitestek elválasztására (13. ábra). Az elválasztás alapja az állófázison megkötött ligandum, és a mozgófázisban lévő minta között létrejövő specifikus kötés. Az állófázison való rögzítéshez különböző technikákat alkalmaznak, mivel fontos, hogy a ligandum kellő távolságra legyen az állófázistól, ami biztosítja a ligandum jó hozzáférhetőségét a mintamolekula számára. Az állófázisra kötött ligandum változtatásával sokféle szelektív rendszert tudnak kialakítani. Így létrehozható egy olyan rendszer, amelyben az állófázis csak a számunkra fontos fehérjemolekulát köti meg. A specifikus elválasztáshoz fontos, hogy a hordozó ne kösse meg az oldatban lévő molekulákat. Ezért hordozónak olyan anyagokat használnak, amelyek hidrofóbok, és nincs ionos töltésük.

34


13. ábra: Kötési, és elúciós mechanizmus az affinitás kromatográfiában.

Munkám során megkötött fémet alkalmazó (IMAC) módszert használtam, itt a fémkelátképző csoport van rögzítve az állófázison (általában imido-diacetát), és ehhez koordinálódik a fémion (Cu2+, Zn2+, Ni2+, Co2+, vagy Fe2+) úgy, hogy egy, vagy több koordinációs hely alakul ki a fehérje számára. Az imidodiacetát a fémionokat három helyen köti meg, a többi koordinációs hely szabad marad az izolálandó molekula számára. Az elválasztás elve minden fémnél azonos ugyan, de a koordinációs hely geometriája és a kötés erőssége fémenként változik. Így a fémion hatással lesz az elválasztás szelektivitására. A kötéserősség alapján a következő sort állítható fel:

Cu2+>Ni2+>Zn2+~Co2+ Néhány, a fehérje felszínén elhelyezkedő aminosav különösen a hisztidin specifikusan kötődik a szabad koordinációs helyekhez. Így a hisztidinek számától függően elválaszthatók az egyes fehérje molekulák. Az elúció alapja bármely olyan folyamat, amely megszünteti a ligandum-ligandum kölcsönhatást, a legelterjedtebb az imidazol koncentráció gradiens alkalmazása. Az imidazol kötődik az állófázishoz, így leszorítja a molekulát onnan, annál később

eluálódik

egy

molekula,

minél

erősebben

koordinálódik

az

állófázishoz

[BIOMOLECULE CHROMATOGRAPHY PERSEPTIVE BIOSYSTEM, 1996]. Ezt a módszert használtam a D3 domén tisztításakor, ahol a D3 doménhez csatolt His6tag, egy 6 hisztidint tartalmazó peptidlánc a hatékony alapja az elválasztásnak. A munkához 5ml-es HisTrap HP (Amersham Pharmacia Biotech) oszlopot használtam, az állófázisra kötött fémion Ni2+ion volt, amit gyakran alkalmaznak His6-tages fehérjék tisztításakor. A felkötésnél alkalmazott puffer 20mM PB, 150mM NaCl pH=7.4 az elúciós puffer pedig növekvő (50, 100, 150, 200mM) imidazol koncentrációval 20mM PB, 150mM NaCl pH=7.4.

35


3.5. Izotermális Titrációs Mikrokalorimetria (ITC) Az izotermális titrációs mikrokalorimetria egy olyan módszer, amely segítségével két molekula kölcsönhatásakor felszabaduló vagy elnyelődő hőmennyiség tanulmányozható, és ebből olyan paraméterekre lehet következtetni, mint a kötési állandó (Ka), a kötési sztöchiometria (n), entalpia (DH), és hőkapacitás (DCp) [www.microcalorimetry.com]. A műszer állandó hőmérsékleten működik, miközben lehetőség van a mérőcellában levő mintához adott mennyiségekben valamilyen reaktánst injektálni. Ha az injektált anyag reakcióba lép a mérőcellában levő oldat valamely összetevőjével, akkor a folyamat során fellépő hőcserét a készülékkel regisztrálni lehet. A műszer a két cella fűtőköre közötti teljesítménykülönbséget (DP, differential power) méri az idő függvényében. Így ha a mintában exoterm (hőtermelő) reakció történik, a DP jel lecsökken, endoterm (hőelnyelő) reakció esetén pedig megnövekszik. Az ITC mérések hagyományos alkalmazása ligandum-receptor kötések vizsgálata, a kötőhelyek számának és a kötés termodinamikai paramétereinek meghatározása. Ehhez egy titrációs görbét vesznek fel, vagyis a receptor kötőhelyeit ligandumok befecskendezésével fokozatosan betöltik. Az injektálások során kapott egyes csúcs alatti területek egyenlők lesznek az injektálások során mért teljes hőfelszabadulással. Ezt ábrázolva a hozzáadott ligandum moláris arányának a függvényében, a kölcsönhatásra jellemző kötődési izoterma kapható meg, amelyből a kötési állandó (Ka), a kötési sztöchiometria (n), entalpia (DH), és hőkapacitás (DCp) egy kiértékelő program segítségével könnyen meghatározhatók. Ha n darab ligandum hozzákötődik egy makromolekulához, az a következőképpen írható le: M + X = MX MX + X = MX2 . . MXn-1 + X = MXn Ahol X ligandum kötődik az n azonos kötőhellyel rendelkező M makromolekulához. A folyamatra jellemző egyensúlyi állandó: K=

[ Betöltött - kötöhelyek ] [ Üres - kötöhelyek ][ X ]

36


és DG0 = -RTlnK = DH0-TDS0 ahol, DG0, DH0 és DS0 a szabadenergia, entalpia és entrópiaváltozás egykötőhelyes reakciónál. ITC-vel tehát a termodinamikai paraméterek viszonylag egyszerűen meghatározhatók. Számolható a hőkapacitás változás is különböző hőmérsékleteken végzett kísérletek alapján, ami jól jelzi a kötéskor bekövetkező hidrofób kölcsönhatások megváltozását. Negatív az értéke, ha hidrofób kötések alakultak ki, és pozitív, ha ezek felbomlanak.

DCp

=

DH T0 2 - DH T01 T2 -T1

A készülék két részből, egy termosztált, adiabatikus cellapárból, és egy injektorból áll, amellyel megadott mennyiségű ligandum injektálható a cellában lévő reaktánshoz. A készülék az injektálás eredményeként kialakuló, temperáláshoz szükséges fűtési teljesítményt méri. A hőmérséklet állandó értéken tartásához a mérő- és a referenciacella között a fellépő hőmérséklet különbséget ki kell egyenlíteni. [VP-ITC MICROCALORIMETER USER’S MANUAL, 1998]. A módszert, az előállított Ni- és As-kötő flagellinvariánsok kvantitatív kötési jellemzőinek mérésére használtam. A műszer egy nagyon érzékeny Microcal VP-ITC készülék volt. A Ni-kötő flagellinvaránsnál 10mM HEPES 150mM NaCl pH=7.0 puffert alkalmaztam, hozzá 0.2mM NiSO4, 10mM HEPES 150mM NaCl pH=7.0 oldatot injektáltam. Az As-kötő flagellin esetében szintén 10mM HEPES 150mM NaCl pH=7.0 puffert alkalmaztam, hozzá 0.2mM PAO, 10mM HEPES 150mM NaCl pH=7.0 oldatot injektáltam, illetve a molekulán belüli diszulfid-hidak megakadályozása érdekében 1mM TCEP-t (Trisz(2karboxi-etil)foszfin) adtam hozzá.

37


3.6. Felületi Plazmon Rezonancia Spektroszkópia (SPR) A felületi plazmon rezonancia spektroszkópia (SPR) olyan detektálási módszer, amellyel egy fémfelület közelében bekövetkező törésmutató változást lehet nagyon pontosan nyomon követni [VAN DER MERWE, 2000; MYSZKA, 2000]. A módszer elve, hogy ha a felületre valamilyen anyag felkötődik, vagy arról leválik, a törésmutató megváltozik, így a módszer a felületi koncentráció vizsgálatára alkalmas. A szenzorchip felületén levő fémben úgynevezett felületi plazmonok (kollektív elektrongerjesztések) vannak jelen, amelyek optikai úton gerjeszthetők. Ha a fémfelületet egy monokromatikus fénynyalábbal világítják meg, valamilyen q

beesési szöggel, és amikor a nyaláb hullámszámának felület irányú

komponense (k*sin(q)) megegyezik a felületi plazmonok hullámszámával (adott frekvencia mellett), létrejöhet a gerjesztés. A csatolás során a fény energiát és impulzust adhat át a fémnek, és így a visszavert fény intenzitása lecsökken. Ezt mérve megkereshető az a szög, amelynél a visszavert fény intenzitása minimális, ez lesz a rezonanciához tartozó beesési szög (qspr). Az SPR bioszenzorok ezt a rezonancia szöget mérik az idő függvényében. Visszaverődéskor a fény kis mértékben behatol a fém belsejébe, és ott a távolsággal exponenciálisan lecsengő amplitúdójú elektromos teret hoz létre. Ennek a tartománynak a vastagsága (a behatolás mélysége) tipikusan a fény hullámhosszának nagyságrendjébe esik. Az SPR szenzorokban a fémfelület olyan vékony (tipikusan 50 Å), hogy a lecsengő elektromágneses tér túlnyúlik a fém másik oldalára, ide helyezik a vizsgálandó oldatot. A detektálási módszer lényege az, hogy a lecsengő elektromágneses tér tartományában levő oldat törésmutatója befolyásolja a plazmon rezonanciához tartozó hullámszámot, illetve a rezonancia szöget (qspr). Ha a felületre az oldatból anyag kötődik, akkor a felület mentén a törésmutató megnövekszik, ami a rezonancia szögben is növekedést okoz. A rezonancia szög mérésével, a koncentrációval arányos jel mérhető, 1 kRU (response unit) jelemelkedés nagyjából 1 ng/mm2 koncentrációemelkedésnek felel meg [PHARMACIA BIOSENSOR AB, 1994]. Az SPR bioszenzorokat kétmolekulás ligandum-receptor, vagy antigén-antitest kölcsönhatások reakciókinetikájának és termodinamikájának feltérképezésére alkalmazzák, a két komponens közül az egyiket a felületre kötik fel (immobilizálják), a másik komponenst pedig oldat formájában áramoltatják a felkötött anyag felett. Ha a két anyag stabil komplexet képez egymással, akkor a felületen a tömegkoncentráció megnövekszik, és detektálható. A

38

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása módszer előnye, hogy rendkívül érzékeny, a mérésekhez kevés anyag (1-50 mg) elegendő, és kis molekulatömegű összetevők is közvetlenül detektálhatók. A mérés egy 1 nl-es folyadékcellában történik, amelynek egyik falát egy speciálisan felületkezelt, kb. 1 mm2-es aranylemez (szenzorchip) képezi. Az aranylapka másik oldala egy prizmával érintkezik. A fényt az optikai rendszer ék alakban fókuszálja az aranyfelületre, egy detektorsor pedig a visszavert fény intenzitását méri a visszaverődési szög függvényében. A műszer meghatározza azt a szöget, amelyből minimális a visszavert fény intenzitása, és ez a szög érték lesz a rezonancia (SPR) jel, amely az idő függvényében regisztrálható. A módszert a Ni-kötő mutáns filamentumok Ni-kötő képességének optikai úton való detektálásához használtam. Az immobilizáció filamentum formában, aminocsoportokon keresztül, egy dextránmátrix nélküli szenzorchip (Pioneer C1) karboxilcsoportjaihoz történt kovalensen. Az injektálások alkalmával különböző koncentrációjú NiSO4 oldatot áramoltatva vizsgáltam a rezonancia szög változását. A mérésnél alkalmazott puffer 10 mM HEPES, 150 mM NaCl pH=7.0 volt.

3.7. Differenciális Pásztázó Mikrokalorimetria (DSC) Fehérjék térszerkezetének változásait termodinamikai paraméterek, entrópia (S), entalpia (H), hőkapacitás (Cp) változása kíséri. Ezek mérésére szolgál a differenciális pásztázó mikrokalorimetria (DSC), melynek segítségével tanulmányozható különböző fehérjék hőstabilitása, valamint a natív háromdimenziós térszerkezetükből való letekeredésük. Ezáltal a molekulán belüli (intramolekuláris) kölcsönhatások erősségére (van der Waals erők, Hhidak, stb.), a molekula kompaktságára, a kooperatív egységek (domének) számára lehet következtetni. Egy termodinamikai rendszert véve: dH=TdS+Vdp+mdN (entalpia alakot használva), ahol T a hőmérséklet, V a térfogat, p a nyomás, m a kémiai potenciál, N a részecskeszám. Ha a nyomás és a részecskeszám állandó (p=áll.,N=áll.), akkor a hőkapacitás a æ dS ö definíció alapján: Cp = Tç ÷ è dT ø p , N

39


æ dH ö Cp = ç ÷ è dT ø p Az entalpiafüggvény pedig: T

H (T ) = H (T0 ) + ò C p (T )dT T0

A kalorimetriás mérések során a minta (adott fehérje pufferben oldva) és a referenciaként használt puffer hőkapacitás-különbsége mérhető a hőmérséklet függvényében, egy adott hőmérséklettartományban „pásztázva”. Fehérjék esetében a külön-külön gyenge intramolekuláris kötőerők között együttműködés van (kooperatív kölcsönhatás), így a fehérjék sokáig megőrzik intakt szerkezetüket emelkedő hőmérséklet mellett. Azonban egy jól definiált hőmérsékletnél hirtelen elveszítik, és másodfajú fázisátalakuláson mennek át. A hőkapacitás görbéje Gauss-görbéhez hasonló, egy vagy több éles csúcsból áll. A hőkapacitás görbék maximumhelyei, az átalakulási hőmérséklet a molekulára jellemző. A hőindukált folyamat entalpiaváltozása a hőkapacitás görbe alatti területtel (Qt) egyenlő. Meghatározásánál figyelembe kell venni, hogy a natív és a denaturált fehérje hőkapacitásai eltérnek egymástól, amelynek oka nagyrészt a natív állapotban eltemetett hidrofób csoportok felszínre kerülése. Az úgynevezett kalorimetrikus entalpiaváltozás:

DH cal = Qt M

(M: a molekulasúly)

Az átalakulás lehet egylépcsős, ekkor kétállapotú rendszerről van szó, amely például kisméretű globuláris fehérjékre jellemző, és lehet többlépcsős, amely nagyméretű globuláris (multidomén) fehérjéknél fordul elő, és ekkor a denaturáció több intermedieren keresztül valósul meg. Az előbbi esetben

DHVant ' Hoff DH cal

= 1 , vagyis a Van't Hoff entalpia megegyezik a

kalorimetrikus entalpiával, az utóbbiban pedig jelentős eltérések tapasztalhatók a két entalpia érték között (5-10 %-os eltérés már többlépcsősnek tekinthető).

40

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása Méréskor a kaloriméter két cellája közül az egyikbe a mérendő minta, a másikba a referencia anyag kerül, majd a cellákat állandó sebességgel kell fűteni úgy, hogy a hőmérsékletük ne térjen el egymástól. A cellák közötti hőmérséklet-különbségeket érzékelve a műszer kompenzálja a különbséget, és a rendszer teljesítményén keresztül mérhetők a hőkapacitás különbségek, ahogy az ITC esetében is. A fehérje jelenlétéből adódóan, a minta hőkapacitása kisebb a tiszta pufferéhez képest, így a molekula hőabszorpciós görbéje általában az alapvonal alatt húzódik. Az alapvonal a minta előtt mérendő úgy, hogy mindkét cellába puffer kerül és így történik a felfűtés. A minta hőabszorpciós görbéjéből kivonva az alapvonalat kiküszöbölhető a két cella közötti különbség, és megkapható a fehérje Cp(T) függvénye. A módszert a D3 domén denaturációs vizsgálatához alkalmaztam, a méréseket VPDSC MicroCal készülékkel végeztem 10 mM PB pH=7.0 pufferben.

3.8. Cirkuláris Dikroizmus Spektroszkópia (CD) A cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópiával egyszerűen és gyorsan nyerhetők információk a fehérjék szerkezetéről, illetve szerkezetváltozásáról (pl. szubsztrátkötés, oligomerizáció, denaturáció). A távoli ultraibolya (UV) tartományban (180-260nm) felvett CD spektrumból, a másodlagos szerkezeti elemek (α-hélix, β-szerkezet, rendezetlen/random coil láncok) meglétére és arányára lehet következtetni a fehérje térszerkezetében. A közeli UV tartomány (260-320 nm) az aromás oldalláncokról, azok egymáshoz viszonyított térbeli orientációjáról, azaz a harmadlagos szerkezetről ad információt. A CD spektroszkópia egyike azoknak a spektroszkópiai módszereknek, amelyek a polarizált fény és egy optikailag aktív anyag kölcsönhatásán alapulnak. Az élő szervezetek által szintetizált molekulák döntő többsége, így a fehérjék is optikailag aktívak, ami azt jelenti, hogy az oldatukon keresztülbocsátott polarizált fény síkját elforgatják. Két cirkulárisan polarizált fénysugár különböző mértékben nyelődik el az optikailag aktív közegben, azon áthaladva az amplitúdójuk különbözni fog. Ez a cirkuláris dikroizmus jelensége. Az amplitúdókban való különbség elliptikus polarizációhoz vezet, vagyis a jobbra és balra forgó komponensek vektorösszege egy ellipszist fog leírni az egyenes helyett. Az ellipszis alakja egyértelműen jellemezhető az ellipticitással:

q = arctan

b , (ahol a az ellipszis nagy, míg b a kis tengelye). a

Amiből az alábbi módon számítható a moláris ellipticitás :

41


[q ] =

100q C×l

ahol C a koncentráció mol/ dm3-ben literben, l pedig az úthossz (küvetta vastagság) cm-ben. A CD spektrumnak (14. ábra) szerkezetvizsgálat szempontjából két tartománya különböztethető meg. Az amid kromofórok elnyelési tartománya, a távoli ultraibolya (UV) tartomány (180nm - 260nm), az amid csoportok egymáshoz képesti orientációjára jellemző, ezért a másodlagos szerkezetre vonatkozóan ad információt. Mivel a kromofórok párhuzamos beállása eredményezi a CD jelben a legnagyobb erősítési effektust, ezért a másodlagos szerkezeti elemek közül az α-hélixnek a legnagyobb a CD jele, a β-lemezes szerkezetek esetén kisebb és a rendezetlen láncoknál a legkisebb. A távoli UV tartomány (180nm 260nm) CD jelét az amid kötések n π* illetve a π π* átmenetei adják. Az aromás oldalláncok elnyelési tartománya, a közeli UV tartomány (260nm - 320nm) azok egymáshoz képesti orientációjára jellemző, ezért a harmadlagos szerkezetre vonatkozóan ad információt. Az aromás oldalláncok (triptofán, tirozin, fenilalanin) egymáshoz képest vett térbeli elhelyezkedése nagymértékben befolyásolja a spektrumot, azaz a spektrum megváltozása a fehérje harmadlagos-, azaz térszerkezetének megváltozására utal. A távoli UV tartomány CD spektrumának intenzitása három nagyságrenddel nagyobb, mint a közeli UV CD spektrum intenzitásánál. A közeli és a távoli UV tartományban felvett CD spektrumok a harmadlagos illetve a másodlagos szerkezetre jellemzőek, mindkettő kitűnően alkalmas a szerkezet megváltozásának (pl. denaturáció, “unfolding”) nyomon követésére.

42


14. ábra: A másodlagos szerkezetek jellegzetes CD-görbéi (a: a-hélix, b: b-lemez, random coil: véletlen spirál).

A méréshez használt műszerben, a spektropolariméterben található egy UV fényforrás, amelynek a fényét kvarc prizmák lineárisan polarizálják. A monokromatikus, lineárisan polarizált fény a modulátorba jut, amely felváltva állít elő belőle jobbra illetve balra cirkulárisan polarizált fényt. A vizsgálandó fehérje oldat egy speciális kvarc küvettában helyezkedik el, amely az UV fényt teljesen átengedi és nincs optikai aktivitása. A mintán áthaladt cirkulárisan poláros fény a detektorba jut, ami detektálja a CD jelet. A módszert munkám során a D3 domén másodlagos szerkezetének vizsgálatához használtam a távoli UV tartományban, a készülék Jasco J-720 spektropolariméter volt, a D3 domént 10 mM PB pH=7.0 pufferben oldottam.

43


4. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK 4.1. Nehézfém-kötő flagellinvariánsok létrehozása A flagellinben létrehozott kötőszegmensek kialakítása kétféle módon történt. A molekula ismert térszerkezetét felhasználva tudatos tervezéssel, Ni-kötő helyeket hoztam benne létre hisztidin aminosavak beillesztésével, illetve egy természetben előforduló az arzénkötő fehérjéből (ArsR) ismert kötőrégiót illesztettem be a molekula alkalmas helyére. A természetes Ni-kötő fehérjékben a Ni-ionok koordinálását általában több (2-4) hisztidin oldallánc imidazol csoportja végzi. Ezt az ismeretet felhasználva a flagellinmolekula ismert

térszerkezetéből

kiindulva,

számítógépes

grafika

és

molekulamodellezés

alkalmazásával megvizsgáltam, hogy a flagellin variábilis D3 régiójában mely aminosavak oldalláncai vannak megfelelő orientációban és távolságban ahhoz, hogy helyspecifikus mutagenezissel hisztidinre cserélve őket, fémkötő centrumot alakíthassak ki. A flagellin Protein Data Base (.pdb) file-ját felhasználva, melyben az atomi koordinációk adottak, a Protein Explorer segítségével meghatározható, hogy mely pozíciókban megfelelő az elhelyezkedés a cseréhez. A MODELLER program segítségével a modellezni lehet a molekula várható szerkezetét a cserét követően. Az alábbi oldallánc-kombinációk hisztidinre való cserélése mellett döntöttem:

1. Leu 209, Val 235, Lys 241 2. Leu 209, Gly 211 és Lys 241 3. Leu 209, Val 235, Lys 241, Ser 264 (15. ábra) Ezeken kívül a D3 domén külső felszínén található Thr239 és Gly240 aminosavak közé egy (His)6 hexapeptid beépítését is terveztem. (15. ábra)

44


15. ábra: A Thr239-(His)6-Gly240 mutáns flagellin (balra), a Leu 209, Val 235, Lys 241, Ser 264 aminosavak His cseréjével kialakított flagellin D3 doménje (jobbra).

A tervezett Ni-kötő flagellinvariánsokat, a QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit segítségével állítottam elő. Kiindulva a már korábban elkészített pGFP-FliC plazmidból a következő a mutációkat tartalmazó primerekkel készítettem el a mutáns plazmidokat. BackwardFliC His209: 5’ GTC AGT ACC ATG ACC AGT AGC CG ForwardFliC His209: 5’ CG GCT ACT GGT CAT GGT GGT ACT GAC BackwardFliCHis209,211: 5’ CTG GTC AGT ATG ACC ATG ACC AGT AGC CG ForwardFliCHis209,211: 5’ CG GCT ACT GGT CAT GGT CAT ACT GAC CAG BackwardFliCHis235: 5’ CCA GTT CCC CCC GTA TGG GTA ACT TTG G ForwardFliCHis235: 5’ CC AAA GTT ACC CAT ACG GGG GGA ACT GG BackwardFliCHis241: 5’ CAT AAT AGC CAT CAT GAC CAG TTC CCC CCG ForwardFliCHis241: 5’ CGG GGG GAA CTG GTC ATG ATG GCT ATT ATG BackwardFliCHis264: 5’ CCT GTA AGC GGG TGA GTC GCA CCG CC ForwardFliCHis264: 5’ GGC GGT GCG ACT CAC CCG CTT ACA GG Ezekből a primerekből ~125 ng-nyit (1,6 μl-t a 10 pmol/μl törzsoldatból) hibridizáltattam a klónozott kettősszálú ~25 ng-nyi (2 μl-t a 10 ng/ μl-es plazmidból) pGFPfliC templáttal, a primerek folytatását 1 μl (2.5 U/μl) PfuTurbo DNS-polimeráz végezte amely nagyfokú hibajavító aktivitással rendelkezik- az 1μl-nyi dezoxi-ribonukleozidtrifoszfátok (dNTP) felhasználásával, PCR segítségével. A reakcióhoz kellett még 5 μl 10x-es reakciópuffer (amely tartalmazott 100mM KCl-t, 100mM (NH4)2SO4-t, 200mM Tris-HCl 45

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása (trisz-(hidroximetil)-amino-metán) (pH=8,8), 20mM MgSO4-t, 1% Tritont, és 1mg/ml BSAt,), és steril desztillált víz (az egész reakcióoldatot 50μl-re kiegészítve). A kit egy aminosav cseréjéhez a következő programot ajánlotta: 1. 95 °C 30 másodperc 2. 95 °C 30 másodperc 3. 55 °C 1 perc 4. 68 °C 5 perc (1 perc/ a plazmid mérete kb-ban) a 2-4 lépést 16 cikluson keresztül ismételni 5. 4°C 10 perc A reakciót követően a PCR-termékeket megvizsgáltam agaróz gélen, egy éles sávot tapasztalva megfelelőnek találtam a transzformációhoz. A transzformáció előtt a PCRterméket DpnI (10U/μl-ből 1μl) enzimmel emésztettem 1 órát, erre azért volt szükség, hogy a metilált nem mutáns DNS-t elemésszem, ugyanis az in vitro módon előállított mutáns DNS nem metilált. Ezt követte a transzformáció, azaz a mutáns DNS bejuttatása XL1-Blue szuperkompetens sejtekbe, az előre elkészített kompetens sejtek tárolásánál fontos, hogy -80 o

C-on kell tárolni őket, különben elveszítik aktivitásukat. A sejteket óvatosan felolvasztottam

jégen, majd 50μl-es adagokra osztottam szét, amelyekhez hozzámértem a DpnI-el emésztett PCR-terméket (1μl). Ezt a transzformációs reakcióelegyet összekeverve 30 percet inkubáltam jégen, majd 45 másodpercig 42 oC-os hősokk következett, amely a rezisztencia gén kifejeződését segíti elő. Ezután 2 percre visszatettem jégre, és 0,5 ml folyadék táptalajt adtam minden elegyhez, ezt követte 1 órás inkubálás 37 oC-on, majd ampicillin-tartalmú (100 μg/ml, Sigma) lemezre kentem ki az egyes klónokat, és 37oC-on növesztettem őket. A kinőtt telepekből, plazmid preparálás és tisztítás következett plazmid tisztító kit segítségével. A plazmidot alkalikus lízis módszerrel nyertem ki a sejtekből, a preparálás során a nagyméretű bakteriális DNS kicsapódik, míg a kisméretű plazmid DNS oldatban marad, így elválaszthatók egymástól. A mutáns klónokat szekvenáltatással (Biomi Kft. Gödöllő) ellenőriztem, majd a hibátlan mutáns részt PasI és AarI enzimek (Fermentas) segítségével, amelyek a flagellin génjét a D3 domént kódoló részen túl hasítják, átültettem a pKOT-1 (pBR322-fliC+flagellin saját promótere, ~8 kb) plazmidba, amit ugyanezzel a két enzimmel nyitottam fel. Erre azért volt szükség, mert a pGFP-fliC (~4,8 kb) plazmidban a flagellin N-terminális részén

46

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása kifejeződő aminosavak egyrészt zavarnák a polimerizációt, így filamentumok nem építhetők belőlük, másrészt a mutagenezist minél kisebb bázisszámú vektoron érdemes véghezvinni az egyéb mutációk elkerülése érdekében. Újabb szekvenáltatást követően a jó klónokat elektroporációs technikával flagellintermelésre képtelen mutáns S. typhimurium SJW2536 baktériumokba juttattam. Specifikus arzénkötő fehérjék számos mikroorganizmusban találhatók, ezek a fehérjék az arzén szervezetből való eltávolításában játszanak fontos szerepet. A bakteriális ArsR fehérje az arzén rendkívül erős (az arzént már jóval alacsonyabb koncentrációban köti, mint a környezetvédelmi határérték) és specifikus megkötésére képes. Térszerkezete ismert, az arzénkötő helyet három térbelileg egymáshoz közel elhelyezkedő cisztein oldallánc (thiol csoport)

alakítja

ki,

a

specifikus

megkötéséért

felelős

polipeptidszegmens

aminosavszekvencia a következő: SerGlyGluLeuCysValCysAspLeuCysThrAlaLeuAspGln. A rendelkezésre álló adatok szerint ez a szegmens erősen nyújtott konformációjú, végeinek távolsága közel 20Å, ezt kívántam a flagellin D3 doménjébe beépíteni. Számítógépes molekulamodellezés segítségével megállapítottuk, hogy a D3 domén Ala262-Thr273 öblös felületi hurokrégiója megfelelő vázként szolgálhat az arzénkötő motívum befogadására. Ennek megfelelően az Ala262-Thr273 szegmenst a D3 doménből kivágtam, majd ennek helyére ültettem be az arzénkötő motívumot (16. ábra).

16. ábra: A flagellinmolekula a beépített As-kötő motívummal.

A Ni-kötő mutánsokhoz hasonlóan a korábban elkészített pGFP-FliC plazmidból kiindulva PCR segítségével olyan plazmidokat állítottam elő, ahol a FliC D3 doménjének 47

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása megfelelő szakaszai hiányoztak. A PCR során beépítettem egy KasI hasítóhelyet (GGC GCC/ Gly Ala), melynek segítségével összeligáltam a plazmidot. A felhasznált primerek a következők voltak: Ala262 KasI helyre: 5¢ GCG GGC GCC AGC AAG AGT CAC CTC ACC Thr273 KasI helyre: 5¢ GCG GGC GCC GCA ACT GAG GAT GTG AAA AAT GT Az esetleges mutációk elkerülése miatt hibajavító aktivitással rendelkező DNS polimeráz enzimet használtam, mint a mutagenezisnél (PfuTurbo polimeráz, Stratagene), és igyekeztem a ciklusszámot a lehető legalacsonyabb értéken tartani (18 ciklus). A megfelelő méretű PCR terméket (kb. 4800kb) gélből való izolálás után ligáltam. A ligálás 10 μl végtérfogaton történt 1μl T4 DNS ligázzal (New England Biolabs). A pGFP plazmid nagy kópiaszámú és nagy hatásfokkal transzformálja a CaCl2-dal kezelt kompetens TOP10 E. coli (Invitrogen) gazdasejteket. A rekombináns klónokat restrikciós térképezéssel ellenőriztem, a jó klónokból DNS-t preparálva templátként használtam a következő kísérleteim során. Az As-kötő motívum beépítését többlépcsős PCR-rel végeztem. Első lépcsőben a fliC gént két darabban amplifikáltam átfedő primerek segítségével, majd ezt követően egy összeépítő PCR-t alkalmaztam. Az összeépítő PCR termékét templátként használva a KasI restrikciós helyeket tartalmazó oligók segítségével sokszoroztam az arzénkötő motívumot már tartalmazó fliC gént. Primerek: Forward primer Ala262Thr273: GTTTGCGATCTGTGCACCGCCCTGGATCAGGCAACTGAGGATGTGAAAAATG Forward primer FliC: 5’ GCGA AGC TTG GCA CAA GTC ATT AAT ACA AAC AGC CTG Backward primer FliC: 5’ CG GGA TCC TTA CAT AGG GCG TGC GCG GTT AAA A PCR reakciót optimalizáltam (hibridizációs hőmérséklet, ciklusszám) és a megfelelő méretű PCR termékeket gélből való izolálás és restrikciós emésztés után a pGFP vektorba ligáltam. A PCR termék vektorba ültetése után nyert klónokat szekvenáltatással ellenőriztem (Biomi Kft., Gödöllő), a jó klónokat elektroporációval szintén flagellintermelésre képtelen a mutáns S. typhimurium SJW2536 baktériumokba juttattam.

48


4.2. Mutánsok termeltetése, tisztítása Az elektroporációt követően, a Ni- és As-kötő mutáns flagellinek nagy mennyiségben termelődtek, és hatékonyan exportálódtak a baktériumsejtekből. A mutáns flagellinek megtartották

polimerizációs

képességüket,

ammóniumszulfát

hatására

a

natívakkal

megegyező morfológiájú filamentumokat képeztek. A Ni-kötő flagellin termeltetése a vad típusú SJW 1103-ból származó flagellinhez hasonlóan történt. A SJW 2536 telepekről, beoltottam 2x100 ml 3 m/m%-os ampicillin tartalmú (100μg/ml, Sigma) YE (élesztő) oldatot. Ezt az oldatot 37 oC–on rázattam 200 rpm sebességgel 4-5 órán keresztül, majd átöntöttem 2x1000 ml 5 m/m%-os ampicillin tartalmú (100μg/ml, Sigma) YE-oldatba és egész éjszaka rázattam. A baktériumsejtekről csak a flagellumokra volt szükség, ahhoz, hogy ezeket centrifugálással ki tudjam ülepíteni 2 m/m%nyi PEG6000-et (polietilén-glikol) és 1 m/m%-nyi NaCl-ot adtam az oldathoz és további 1 órán át rázattam. A PEG6000 és a só jelenlétében a helikális kötegek összetapadtak, sötétlátóterű mikroszkóp segítségével láthatóvá váltak. Ezt követően centrifugáltam az oldatokat 4500 rpm 20 percig 4 oC-on.(Heraeus multifuge 3 R-S) Majd a keletkezett csapadékról leöntve a felülúszót, a csapadékot 10-10 ml 20mM Tris, 150mM NaCl pH=7,8 szuszpendáltam. Ezután turmixban homogenizáltam 3 percen keresztül, így a helikális kötegek leszakadtak a baktériumokról, majd ezt a szuszpenziót centrifugáltam 8000 rpm 20 percig 4 o

C-on (Heraeus biofuge primo). Ekkor a baktériumsejtek, és a számomra értéktelen részek a

csapadékban maradtak, a felülúszóban pedig ott vannak a filamentumok, ezt a felülúszót centrifugáltam 80000 rpm 15 percig 4

o

C-on ultracentrifugán (Optima MAX-E

Ultracentrifuga), majd az itt képződött csapadékot oldottam 3-3 ml 20mM-os Tris pH=7,8 oldatban. Bár a filamentum évekig stabil, a monomer flagellin emésztődésre hajlamos, így azért, hogy a további tisztítás során ne emésztődjön el, proteázgátló Complete-tablettát (Roche) használtam, 30-40ml pufferhez ½ tablettát. Az oldatot hőkezeltem 70 oC-on 10 percig, a filamentum monomerjeire esett, majd egy további centrifugálást követően, 70000 rpm 20percig 4oC-on (Optima MAX-E Ultracentrifuga), az oldatban már csak a monomer flagellinmolekulák voltak jelen, ezeket polimerizáltattam 0,8-1 M-os végkoncentrációjú ammónium-szulfáttal egy éjszakán át. Másnap újabb centrifugálással 70000 rpm 20percig 4oC-on az ultracentrifugán (Optima MAX-E Ultracentrifuga), kaptam újra rekonstruált

49

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása filamentum formában csapadékként. Ezt a csapadékot mostam 2-3 ml 20mM Tris 150mM NaCl pH=7,8 oldattal, hogy eltávolítsam az oldatból a felesleges ammónium-szulfátot, majd az oldatot újra centrifugáltam 70000 rpm 20 percig 4 oC-on. A preparálást követően a flagellinmolekulák polimerizálva, filamentumok formájában, lecentrifugálva,

csapadékként

álltak

rendelkezésemre.

Ilyen

többször

ismételt

polimerizációval is tisztítható a filamentum, mert az emésztett fragmentumok nem tudnak tökéletesen polimerizálódni, de igazán tiszta formában kromatográfiás tisztítás után áll elő. A

flagellin

fehérje

tisztítása

számítógép-vezérelésű

FPLC

(Fast

Protein

Liquid

Chromatography) ioncserélő kromatográfia (BioRad) segítségével történt, 20mM Tris-HCl pH=7,8 puffert használtam a minta oszlopra kötéséhez és 20 mM Tris-HCl, 500mM NaCl pH=7,8 puffert a minta lemosásához. A megtisztítandó flagellint monomer formában automatikus mintaadagolón keresztül juttattam az oszlopra. A tisztítást XK16 anioncserélő oszlopon végeztem az alábbi program segítségével (17. ábra): ·

2ml-es frakciók gyűjtése 0,01 abszorbancia-érték felett

·

Alapvonal nullára állítása

·

Az oszlop mosása: 5 ml 20mM Tris pufferrel pH=7,8 , 5 ml/perc átfolyási sebességgel

·

Lineáris gradiens: 0%→17%-ra 10ml 20mM Tris, 500mM NaCl pufferrel, 5 ml/perc átfolyási sebességgel

·


·


·

Az oszlop mosása: 15ml 20mM Tris, 500mM NaCl pufferrel, 5 ml/perc átfolyási sebességgel

·

Lineáris gradiens: 100%→0%-ra 5 ml 20 mM Tris, 500 mM NaCl pufferrel, 5 ml/perc átfolyási sebességgel

·

Az oszlop mosása: 50 ml 20 mM Tris pufferrel, 5 ml/perc átfolyási sebességgel

·

A program vége.

50


1 3

1. 00

5

7

9

Fra cti on s 11 1 3 15 1 7 19

21

1 00. 0

10 0. 0% Bu ffe r B 0. 90

9 0.0

0. 80

0. 70

8 0.0 75 .0

7 0.0

0. 60

0. 50

6 0.0

5 0.0

50 .0

0. 40

4 0.0

0. 30

3 0.0 25 .0

0. 20

2 0.0

0. 10

1 0.0

0. 00

0. 0

0 .0

-0 .10

00 :00 :00 AU

- 10. 0

0 0:1 0: 00

00 :20 :0 0 Hr: Min :S ec

mS /c m

17. ábra: A flagellintisztítás kromatogramja, a kék csúccsal mosódik le az oszlopról a flagellin.

51


4.3. A Ni- és As-kötő flagellin fémkötő képességének vizsgálata Az előállított flagellinvariánsok Ni-kötő képességét első megközelítésben Ni-NTA affinitás kromatográfia alkalmazásával vizsgáltam. HisTrap HP (Amersham Pharmacia Biotech) 0,1M NiSO4-el töltött oszlopot használtam, ami szelektíven köti meg azokat a fehérjéket, amelyek felületén hisztidin oldalláncok megfelelő orientációjú klaszterei találhatók. A megkötött fehérjét imidazollal eluáltam, majd SDS gélen analizáltam. Azt tapasztaltam, hogy a Thr239-(His)6-Gly240 variáns erősen kötődött az oszlophoz, míg a többi esetében nem találtam számottevő kötődést. Mindez várakozásaimnak megfelelt, hiszen a Thr239-(His)6-Gly240 variáns esetében felületi Ni-kötőhely kialakítása történt, lényegében ennek megfelelően tisztítják a His6-tages fehérjéket is. A többi mutáns esetében a D3 domén belsejében eltemetett, kívülről csak szabad Ni-ionok számára (diffúzió révén) hozzáférhető kötőhelyet tartalmazott. Ezért izotermális titrációs mikrokalorimetria módszer segítségével kívántam elvégezni a mutánsok Ni- és As-kötő képességének kvantitatív jellemzését, a kötési állandó és sztöchiometria pontos meghatározását. Mégpedig úgy, hogy a cellában a mutáns flagellinmonomer található megfelelő pufferben, amelyhez 20 μl-ként injektáltam az affinitás kromatográfiában is használatos NiSO4 – illetve a PAO (fenil-arzenid-oxid) oldatot. A puffer kiválasztásában az volt a döntő, hogy a háttér, azaz a pufferbe injektált NiSO4 – és PAOoldatnál, milyen pufferek esetében a legkisebb. Az előzetes vizsgálatok alapján a HEPES puffer volt a legmegfelelőbb. Így a Ni-kötő flagellinmutánsok közül a Thr239-(His)6-Gly240 és a Leu209HisVal235His-Lys241His-Ser264His (18. ábra), illetve az As-kötő (19. ábra) mutáns vizsgálata 10mM HEPES 150mM NaCl pH=7.0 pufferben történt 25 °C-on, az injektálásra kerülő 0.2 mM NiSO4 és PAO szintén ebben a pufferben voltak oldva. Az As-kötő flagellin esetében a molekulán belüli diszulfid-hidak megakadályozása érdekében 1mM TCEP-t (Trisz(2-karboxietil)foszfin) alkalmaztam.

52

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása A méréshez használt műszer MicroCal VP-ITC kaloriméter volt, a mérések beállításai pedig a következők voltak: Filename: 26404211.itc Tű: 1 mM NiSO4, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl pH=7.0 Cella: 0,077 mM 209-235-241-264 filamentum formában, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl pH=7.0 32 injektálás, 25 degC, 16μcal/sec, 10μl injektálási térfogat

N=0,99+/-0,00635 K=1,318x105+/-4870 ΔH=-1,77x104+/-168,8 ΔS=-36,17

18. ábra: A Leu209His-Val235His-Lys241His-Ser264His Ni-kötő flagellin ITC görbéje.

53


Filename:aa905181.itc Tű: 1mM PAO-DMSO, 1 mM TCEP, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl Cella:0,029mM AA9 monomer formában, 1 mM TCEP, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, DMSO (10% ugyanúgy mint a tűben 200μl-2 ml pufferben) 32 injektálás, 25 degC, 16μcal/sec, 10μl injektálási térfogat

N=0,48+/-0,0432 K=2,589x105+/7,205x104 ΔH=-2,1x104+/-2382 ΔS=-45,65

19. ábra: As-kötő flagellin ITC görbéje.

A mérések kiértékelését a Microcal Origin programmal végeztem. A mérések alapján a legerősebb Ni-kötést, a Leu209-Val235-Lys241-Ser264 oldalláncok hisztidinre cserélésével

54

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása létrehozott variáns mutatta. Ebben az esetben a kötődés disszociációs állandója Kd~5μM volt, és egy flagellinalegységhez egy Ni-ion kötődött. A Thr239-(His)6-Gly240 variáns egy nagyságrenddel gyengébb kötést mutatott (Kd~50μM), bár ebben az esetben alegységenként átlagosan két Ni-ion megkötését tapasztaltam. Természetesen a módosított flagellinreceptorok szelektivitása sem hanyagolható el, a hisztidinek beillesztésével várható volt, hogy nemcsak Ni ionok kötésére lesznek specifikusak, további vizsgálatok azt mutatják, hogy a Cu- és Znionok kötése is jól mérhető. Az előállított As-kötő flagellinmutáns esetében a kötődés disszociációs állandója ugyancsak μM-os tartományba esett. Ezek az eredmények arra engednek következtetni, hogy a kapott kötési állandók alapján, a kötés elég erős ahhoz, hogy a Ni- és As-kötő flagellinekből felépülő filamentumokat szenzorok érzékelő elemeiként használhassuk.

55


4.4. Rekonstruált filamentumok előállítása és felületi rögzítése Rekonstruált

filamentum megjelölés alatt

monomer

flagellinekből in

vitro

polimerizációval felépített filamentumot értünk. Kutatásaink fontos célja, hogy a flagellinalapú nehézfém-kötő receptorokból (Ni- és As-kötő flagellinekből) filamentáris receptor struktúrákat építsünk, ehhez a flagellin polimerizációs képességének ismerete elengedhetetlen. Az irodalmi összefoglalóban említett korábbi vizsgálatok [HOMMA ÉS MTS., 1990] megállapították, hogy a flagellinmolekulák terminális régiói hidrofób aminosavak hetes ismétlődéseit tartalmazzák, ami arra utal, hogy a térszerkezet kialakítása során ezek a régiók α-helikális kötegeket képeznek. A távoli UV-ban felvett CD spektrumon pedig látható, hogy a flagellinmolekulák polimerizációja során a rendezetlen régiók α-helikális szerkezetet vesznek fel. Mivel ezek a motívumok más fehérje-kölcsönhatásokban is gyakoriak, ezért azt feltételezték, hogy a flagelláris filamentumok képződése során az axiális irányban szomszédos alegységek α-hélix képző N- és C-terminális régiói egymással kölcsönhatásba lépve közösen formálnak helikális kötegeket. További feltételezésük az volt, hogy a helikális kötegek egymásba fonódó láncolata eredményezi a folytonos filamentáris szerkezet kialakulását, úgy, hogy mindig a filamentum végén lévő szabad N-terminálishoz kötődik a következő alegység C-terminálisa.

Ennek

a

feltételezésnek

bizonyítására,

fluoreszcencia

rezonancia

energiatranszfer (FRET) kísérleteket végeztünk, melyben a flagellinmolekula különböző méretben és terminálisán csonkított fragmentumait fluoreszcens festékkel (akceptor) jelöltük és beépülési képességüket vizsgáltuk egy szintén fluoreszcens festékkel (donor) jelölt filamentum kezdemény végére. A FRET, akkor jön létre, ha a gerjesztett állapotban levő energiát kibocsátó donor molekula emissziós spektruma átfedi egy energiafelvevő akceptor molekula abszorpciós spektrumát, a két kromofór közötti elektromos dipól-dipól kölcsönhatás egy nem sugárzásos energiaátadást eredményez. A flagellinmolekula terminális régiói rendezetlenségüknél fogva könnyen emészthetők nagy specificitású proteázokkal, mint az Endoproteináz Lys-C (ELC) és Endoproteináz Glu(V8), és tervezett módon eltávolíthatók, majd a különböző méretű fragmentumok FPLC ioncserélő kromatográfiával tisztíthatók. Az ELC kétszer hasít az N-terminálison, a 19. és az 58. helyen álló lizin után, eredményeképp egy 49 kDa méretű F49-es fragmentum jön létre és egy 46 kDa-os F46 fragmentum. A V8 enzim esetében az első hasítóhely a C-terminálison, a 461., a második az N-terminálison, a 29. helyen álló glutaminsav után található, így egy 48 56

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása kDa-os F48 és 44 kDa-os F44 fragmentumot kapunk. Kísérleteinkhez az F49, F48 fragmentumokat és tripszines emésztéssel előállított mindkét terminális részen csonkított flagellint, az F40-es fragmentumot használtuk fel ( 20. ábra) [GUGOLYA ÉS MTS., 2003].

20. ábra: Kötődési vizsgálat a különböző fragmentumokkal.

Az emésztetlen flagellinnel végzett kontrollvizsgálatok alapján az ép N- és Cterminálisok kötődésekor, a törzsoldatban lévő filamentumok végét borító Alexa 350-nel jelölt flagellinalegységek és az Alexa 488-cal jelölt flagellin monomerek között jött létre az energiatranszfer. A további kötődést vizsgálva, újabb de már Alexa 350-nel jelölt flagellin monomert adva ehhez az oldathoz, megint bekövetkezett az energiatranszfer, hiszen a filamentum végére kötődött Alexa 488-cal jelölt flagellinekhez képesek voltak odakötődni az újonnan odaérkezett Alexa 350-nel jelölt flagellinmolekulák (21. ábra).

57


250000 Törzsoldat+488-as flagellin kötődés előtt és után

Intenzitás (cps)

200000

150000

Az előző oldathoz 350-es flagellint adva, kötődés előtt és után

100000

50000

0 400

450

500

550

600

Hullámhossz (nm)

21. ábra: A filamentum felépülésének vizsgálata fluoreszcens festékekkel jelölt flagellinekkel.

Az F49-es fragmentummal végzett kísérletek azt mutatták, hogy az F49-es fragmentum képes a flagellinhez kötődni, erre bizonyítékul szolgál az energiatranszfer (22. ábra).

700000

Törzsoldat

Intenzitás (cps)

600000

Törzsoldat+488as F49 kötődés előtt Törzsoldat+488as F49 kötődés után

500000 400000 300000 200000 100000 0 400

450

500

550

600

Hullámhossz (nm)

22. ábra: Az F49 fragmentum kötődésének vizsgálata.

Az Alexa 488-cal jelölt F48 nem mutatott energiatranszfert az Alexa 350-nel jelölt flagellinalegységekkel, ennek oka az, hogy az F48-as fragmentumnak a C- terminálisáról 33 aminosav hiányzik, ami emiatt nem tud kötődni a flagellin N-terminálisához, ezért energiatranszfer nem lép fel (23. ábra).

58


800000

Törzsoldat

Intenzitás (cps)

700000 600000

Törzsoldat+488-as F48 mérés előtt

500000 400000

Törzsoldat+488-as F48 mérés után

300000 200000 100000 0 400

450

500

550

600

Hullámhossz (nm)


Az F40-es fragmentum esetében sem tapasztalható energiatranszfer, kötődés nincs, hiszen a flagellinmolekula a proteolízis során mindkét terminális régióját elveszítette, ezért nem képes a-helikális kötegek kialakítására az emésztetlen flagellinmolekula Nterminálisával (24. ábra).

700000

Törzsoldat

Intenzitás (cps)

600000

Törzsoldat+488-as F40 mérés előtt

500000

Törzsoldat+488-as F 40 mérés után

400000 300000 200000 100000 0 400

420

440

460

480

500

520

540

560

580

600

Hullámhossz (nm)


59

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása Kísérleteink alapján elmondható, hogy a feltételezett modellt, miszerint a helikális kötegek egymásba fonódó láncolata eredményezi a folytonos filamentáris szerkezet kialakulását, úgy, hogy mindig a filamentum végén lévő szabad N-terminálishoz kötődik a következő alegység C-terminálisa [HOMMA ÉS MTS., 1990] igazoltuk. A flagellinből előállított fragmentumok polimerizációs tulajdonságait fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer módszerrel vizsgálva azt tapasztaltuk, hogy az N-terminálisán csonkított F49 képes volt a filamentumok végére beépülni. A magyarázat az, hogy az F49-es fragmentum C-terminálisa teljesen ép, ezért képes a filamentum végén levő flagellinalegység N-terminálisával a helikális köteg kialakítására. A mérések során az N- és C-terminálisok egymásba fonódását energiatranszfer jelezte, egy következő réteg F49 beépülése viszont nem történt meg, ugyanis a már kötött F49-es fragmentum N-terminálisáról 19 aminosav hiányzik, ami nélkülözhetetlen az újonnan odaérkező ép C-terminálissal rendelkező F49 bekötődéséhez. Az F48 nem mutatott energiatranszfert a filamentumok végével, aminek az az oka, hogy az F48-as fragmentumnak a C-terminálisa erőteljesen csonkított, ezért nem tud kötődni a flagellin N-terminálisához. Az F40-es fragmentum esetében sem tapasztaltunk kötődést, de ez várható is volt, hiszen a proteolízis során mindkét terminálisát elveszítette, így egyáltalán nem tudott kötődni a filamentum végéhez [G UGOLYA ÉS MTS., 2003]. Ezzel a kísérlettel még több információt nyertünk a flagellin polimerizációjáról, amely további kutatásainkat is segítheti.

60

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása A polimerizáció ismerete mellett fontos célunk, hogy a nagy felületi kötőhely sűrűségű filamentáris receptor struktúrákat létrehozva, majd azokat optikai érzékelők felületére rögzítve olyan szenzorelemeket hozzunk létre, amelyek optikai úton képesek detektálni a mintában található nehézfémek kötődését. Előkísérleteket végeztünk annak kiderítése érdekében, hogy flagellinből épített filamentumok miként rögzíthetők különböző tulajdonságú felületeken. Különféle modellfelületek filamentummal történő beborítását vizsgáltuk. Megfigyeléseink szerint a flagelláris filamentumok a sima tisztított üvegfelszínhez is egyik végüknél fogva erősen kitapadnak, s a felület nagy filamentumsűrűséggel (~ 60%-os borítottság) lefedhető. A tárgylemezt c=0.06 mg/ml koncentrációjú filamentum mintával 20mM Tris 150 mM NaCl (pH=7.8) pufferben 10 percig inkubálva fluoreszcens festékkel jelölt

filamentumokat

használva TIRFM (teljes

belső

visszaverődés

fluoreszencia

mikroszkóp) segítségével jelenítettük meg a beborított felületet. A teljes belső visszaverődés fluoreszcencia (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy) mikroszkópiában pár száz nanométer magasságú gerjesztési mező jön létre, mely kiválóan alkalmas egyetlen molekularéteg fluoreszcencia gerjesztésére. A kísérleti elrendezésben ugyanazt a mintát felülről AFM segítségével pásztázzák, miközben alulról evaneszcens gerjesztés közben vizualizálják. Az atomerőmikroszkóp (AFM) nagy felbontású képalkotó módszer, melyben egy rugólapkán levő tűvel tapogatható le a minta felülete. Magas lefedettséget tapasztaltunk még az 1%-os nitrocellulóz oldattal kezelt hidrofil felületek esetén is (25. ábra), c=0.06mg/ml koncentrációjú filamentum mintát alkalmazva 10 percig inkubálás után kb. 20%-os lefedettséget sikerült elérnünk és a flagelláris filamentumok teljes hosszukban feküdtek rá a hidrofil felületre, kitapadásuk erőssége lehetővé tette, hogy atomerő mikroszkópiával jellemezhessük a felület lefedettségét. Mindez azt jelenti, hogy ha a felületet a Ni-kötő filamentumokkal borítanánk, a kötőhelyek átlagos sűrűsége ~104/μm2 lenne.

61


25. ábra: Flagelláris filamentumokkal borított nitrocellulóz felszín 3D AFM-es felvétele. [SEBESTYÉN ÉS MTS., 2006].

Az AQUANAL PROJEKT keretében glutár-aldehides keresztkötéssel, szilanizált SiO2 illetve Ta2O5 felszínre is sikerült kovalensen az aminocsoportokon keresztül filamentumokat rögzíteni, ebben az esetben is nagy lefedettséget tapasztaltunk. Ehhez a munkához kapcsolódóan az MFA munkatársai olyan folyadékcellát fejlesztettek, amelyben az immobilizáció is folyadékfázisban történhet, így olyan aspecifikus kitapadások is elkerülhetők, amelyek a száraz rögzítéskor felmerültek.

62


4.5. A Ni-kötő filamentum fémkötő képességének vizsgálata A mutáns filamentumok rögzítési kísérletei fontosak abból a szempontból, hogy a módosított flagellinekből épített filamentumok milyen borítottságot eredményeznek egy-egy felszínen. Emellett egy további fontos kérdés, hogy egy szenzorchip felületére rögzítve a filamentáris receptorokat, a kötődő Ni-ionok elegendő optikai törésmutató változást okoznake ahhoz, hogy a kötődési folyamatot optikai úton detektálni lehessen. Az ITC mérések alapján az már látható, hogy a Ni-kötő flagellinmonomer formában erősen köti a Ni-ionokat. A továbbiakban, hogy választ találjunk arra, hogy egy szenzorchip felületére rögzített filamentáris receptorainkhoz kötődő nehézfémek elegendő optikai törésmutató változást okoznak-e a kötődési folyamat optikai úton való érzékeléséhez, a Leu209His-Val235His-Lys241His-Ser264His Ni-kötő variánst polimerizáltattam, egy mátrix nélküli felületre rögzítettem (C1 szenzor chip), és felületi plazmon rezonancia spektroszkópia (SPR) módszerrel további vizsgálatokat végeztem. A mérést egy BIACore X készülékkel végeztem, a rögzítés egy Pioneer C1 szenzor chipre történt (26. ábra).

C1 chip

26. ábra: A Pioneer C1 szenzor chip.

A Ni-kötő filamentumot a mérés előtt Na-acetát pH=4.5 pufferbe dializáltam. Az immobilizálás menete a következő volt. Először be kellett helyezni a szenzor chipet (C1) a műszerbe, majd beállítottam az áramlási sebességet 10 ml/percre (Prime). A mérés során alkalmazott puffer az ITC méréseknek megfelelően 10 mM HEPES, 150 mM NaCl pH=7,0 volt. A felületet elő kellett készíteni, kétszer 2 percnyi 0.1M glicin-HCl, 0.3% Triton X-100, pH=12. puffer 20 ml-es injektálásával. Ezt egy rövid mosás követte (Flush), majd a felület aktiválása következett az aminocsoportokon keresztül történő rögzítés miatt, 1:1 arányú NHS (N-hydroxysuccinimide) és EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide) oldat injektálásával. Ez után jött a Ni-kötő filamentum injektálása (70ml), ~4 mg/ml

63

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása koncentrációban. Ezt a lépést többször megismételve (2-3 injektálás), sikerült jelentős alapvonal emelkedést elérni. A felületen megmaradt aktív csoportokat le kellett zárni, ez etanolamin injektálással történt, amit egy rövid mosás (Flush) követett. A méréseket 25 °C-on, 10 ml/min áramlási sebesség mellett végeztem. A műszernél lehetőség van a folyadékcellát két független részre osztani. A mutáns filamentumok felkötését az 1-es cellában végeztem, a 2-es cellában üres felkötés történt. A méréseknél az üres cellát referencia felületként használtam, és a két cella jelének a különbségével számoltam. A vizsgálat során, 0, 1, 2, 5, 10, 100 μM-os koncentrációjú NiSO4 oldat áramoltatása történt

az

aminocsoportjaikon

keresztül

rögzített

Leu209His-Val235His-Lys241His-

Ser264His Ni-kötő flagellinvariánsból álló filamentumok felett. A szenzorgram a C1 Pioneer chip felületén az üres referenciacella és a mintacellában rögzített mutáns filamentumok közötti különbségi jel, ami a különböző koncentrációjú NiSO4-oldat áramoltatásakor jelentkezett (27. ábra).

27. ábra: A Ni-kötő filamentum SPR szenzorgramja.

A vizsgálat eredményei azt mutatják, hogy az 1-100 μM-os koncentrációjú NiSO4 oldat áramoltatása az aminocsoportjaikon keresztül rögzített Leu209His-Val235HisLys241His-Ser264His variánsból álló filamentumok felett, jól mérhető törésmutató változást okoz. Ez alapján elmondható, hogy a filamentáris receptoraink felületi kötőhely sűrűsége elég nagy ahhoz, hogy a Ni-ionok kötődése optikai úton detektálhatóvá váljék.

64


4.6. D3 domén vázfehérje klónozása és vizsgálata 4.6.1. Klónozás, fehérjeexpresszió és tisztítás A S. typhimurium SJW1103 törzsből származó flagellin D3 domént kódoló génszakaszát (190-285) polimeráz láncreakcióval (PCR) amplifikáltam és a pET21c vektorba illesztettem, NheI-NotI (Fermentas) hasítóhelyek segítségével. A PCR-hez felhasznált oligonukleotid primerek a következők voltak: NheI hasítóhelyhez 5’-GCGGCTAGCGGATATGCCGATAC-3’) NotI hasítóhelyhez 5’- GCGGCGGCCGCTGCAACTTGTACATTTTTCACATCCTC-3’ A reakcióhoz hibajavító aktivitással rendelkező Advantage polimerázt (Clontech) használtam. A reakciókörülmények a következők voltak: 1. 98 °C 30 másodperc 2. 98 °C 20 másodperc 3. 54 °C 30 másodperc 4. 68 °C 2 perc a 2-4 lépést 20 cikluson keresztül ismételve 5. 68 °C 8 perc 5. 4°C 10 perc A PCR terméket agaróz gélből izoláltam, gélextrakciós kit (PureLink-Invitrogen) segítségével tisztítottam. NheI-NotI enzimekkel emésztettem, a pET21c vektort is ennek megfelelően, majd T4 DNS-ligázzal (New England Biolabs) a két fragmenst összeligáltam. A ligálási elegyet E. coli TOP10 (Invitrogen) törzsbe transzformáltam, belőle plazmidot preparáltam Quaigen kittel és szekvenáltattam. A szekvenáltatott klónt E. coli BL-21(DE3)pLysS törzsben termeltettem. 20 ml overnight kultúrából 1 ml-vel beoltva a 100 ml amplicillint (100μg/ml) (Sigma) és klormafenikolt (30μg/ml) (Sigma) tartalmazó LB tápoldatot 37 oC-on inkubáltam 3-4 órát (OD600=0.6) majd 1 mM végkoncentrációban IPTG-vel indukáltam és további 4 órát növesztettem. Ezt követően a kultúrát 4000 rpm 20 percig centrifugáltam (Eppendorf Biofuge) és a csapadékot -20 oC-on tároltam a tisztításig. A fehérjét a C-terminális részén kialakított His6-tag segítségével tisztítottam affinitás kromatográfiás módszerrel. A 100 ml kultúrából származó -20 oC-os csapadékot 10 ml 20

65

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása mM PB, 150 mM NaCl pH=7.4 pufferben szuszpendáltam, jégen szonikáltam 5-ször 1 percig (10 W), a szonikált szuszpenziót 40000 rpm 20 perc 4 oC-on centrifugáltam (Beckmann ultrafuge) a csapadék eltávolítása miatt. A felülúszót HisTrap HP (Amersham Pharmacia Biotech) 0,1 M NiSO4-el töltött oszloppal tisztítottam, a kikötődött fehérjét növekvő imidazol koncentrációjú pufferrel eluáltam (50, 100, 150, 200 mM imidazol) a D3- His6 150mM imidazol koncentrációnál jött le az oszlopról. A fehérje tisztaságát SDS gélelektroforézissel ellenőriztem, koncentrációját spektrofotométerrel állapítottam meg. 4.6.2. A D3 domén vizsgálata DSC-vel, CD-vel és proteolízissel Tisztítást követően a fehérjén stabilitási vizsgálatot végeztem differenciális pásztázó mikrokalorimetria (DSC) módszerrel. A méréshez alkalmazott készülék szoftvervezérelt MicroCal VP-DSC volt. A méréseket 10 mM PB pH=7 pufferben végeztem 1 oC/perc felfűtési sebességgel 20-60 oC között. A fehérjekoncentráció 0.3 mg/ml volt, felfűtéskor egy éles endoterm csúcsot kaptam, 46oC-os csúcshőmérséklettel (28. ábra). A második felfűtés hasonló jelleget mutatott, tehát a fehérje reverzibilis denaturációt szenvedett, képes volt újra feltekeredni. A méréseket pH=4 (29. ábra) és pH=11-en (30. ábra) megismételtem és hasonló görbéket kaptam.

28. ábra: A D3 domén (pH=7) felfűtésekor kapott görbék, a folytonos vonal az első, a szaggatott vonal a második felfűtést jelzi. [SEBESTYÉN ÉS MTS., 2008].

66


29. ábra: A D3 domén (pH=4) felfűtésekor kapott görbék, a folytonos vonal az első, a szaggatott vonal a második felfűtést jelzi.

30. ábra: A D3 domén (pH=11) felfűtésekor kapott görbék, a folytonos vonal az első, a szaggatott vonal a második felfűtést jelzi.

A D3 domén DSC vizsgálatai azt mutatják, hogy stabil harmadlagos szerkezettel rendelkező önálló fehérje, amelyet többszöri felfűtés és pH változás esetén is megtart. A kalorimetrikus és Van’t Hoff entalpia egyenlőségéből adódóan elmondható, hogy kétállapotú önálló folding doménként viselkedik.

67

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása A CD méréshez használt műszer egy JASCO J-720 típusú spektropolariméter volt. A mérést 1 mm-es vastagságú, 200 ml-es küvettában végeztem. A fehérje koncentrációja 0,15 mg/ml volt. A mérések kezdetén felvettem a 10 mM PB pH=7 puffer alapvonalát 185 és 260 nm között, amelynek célja elsősorban a küvetta tisztaságának ellenőrzése volt. A spektrum mérésekhez használt protokoll a következő volt: 260 nm-től 185 nm-ig vettem fel a CD-jelet 10 nm/perc sebességgel. A pontok 0.2 nm-enként követték egymást, a válaszidő 4 sec, a csatornaszélesség 20 nm, az érzékenység pedig standard volt. A CD mérés során felvett spektrum a következőnek adódott (31. ábra)

31. ábra: A D3 domén távoli UV-ban felvett CD spektruma.

[SEBESTYÉN ÉS MTS., 2008]. A flagellinmolekula hipervariábilis D3 doménjének távoli UV-ban (185-260 nm) felvett CD spektruma egy random polipeptidnek megfelelő jelet mutatott, hasonlóan az irodalomból ismeretes flagellin emésztésekor kapott F27 fragmentum esetében. A filamentok előnyös tulajdonsága, hogy ellenállnak a proteázoknak és fizikailag is stabilak. Viszont ha a D3 domént kívánjuk alkalmazni önmagában mesterséges fehérjék vázelemeként szintén fontos követelmény a stabilitás. Proteolitikus emésztéssel szerettem volna megmutatni, hogy mennyire ellenálló a D3 domén. A tripszin arginin és lizin után hasít, a D3 domén 8 lizin aminosavat tartalmaz, melyek mellett a tripszin hasíthat. A kísérletet 10 mM PB, 150 mM NaCl pH=7 pufferben végeztem, szobahőmérsékleten. A fehérje koncentrációja 0.15 mg/ml volt, a fehérje tripszin arány pedig 300:1 (m/m). A mintavétel a kiindulási (0) mintából, majd 10 perc (10), 20 perc (20), 30 perc (30), 1 óra, 2 óra, 4 óra múlva történt és a mintákat SDS –gélelektroforézissel ellenőriztem (32. ábra).

68


32. ábra: A D3 domén tripszines emésztési vizsgálata.

[SEBESTYÉN ÉS MTS., 2008]. A D3 domén 8 lizin aminosavat tartalmaz, mégis nagyfokú ellenállást mutat a tripszines emésztéskor. Korábbi vizsgálatok alapján a monomer flagellin rendezetlen régiói tripszinnel történő kezelésekor teljesen degradálódnak 1 perc alatt, és előáll az F40-es fragmentum, majd továbbemésztve megkapjuk az F27-es fragmentumot (33. ábra).

33. ábra: SJW1103 FliC emésztése tripszinnel.

[YOSHIOKA ÉS MTS., 1995]. A D3 doménnél, az intakt fehérje sávja látszik 4 óra múlva is, ami azt jelzi, hogy a D3 doménben a lehetséges hasítóhelyek el vannak temetve, és az enzim nem fér hozzá. Ez a megfigyelés szintén arra utal, hogy a D3 domén egy kompakt, jól feltekeredett harmadlagos szerkezettel bír. A D3 domén kis mérete és a stabil szerkezete lehetővé teszi, hogy mesterséges kötő fehérjék vázelemeként alkalmazhatóvá váljon, a későbbiekben pórusos szilíciumba zárva szenzorként alkalmazható legyen.

69


5. ÖSSZEFOGLALÁS A környezetvédelemben kiemelt jelentőségű a szennyvizek, talaj- illetve felszíni vizek minőségének

ellenőrzése,

a

toxikus

anyagok

(peszticidek,

nehézfémek,

klórozott

szénhidrogének) szintjének meghatározása környezeti mintákban. Kiemelt fontosságúvá válik olyan módszerek kidolgozása, amelyek a szennyezések gyors, megbízható és valós idejű kimutatására szolgálnak. A kutatások egyre inkább a bioszenzorok irányába mutatnak, amelyek egy molekuláris felismerést biztosító biológiai eredetű felismerő részből és egy fizikai-kémiai jelátvivő egységből állnak. Mivel a fehérjék rendkívül specifikus molekula felismerésre képesek, és számos mikroorganizmusban találhatók olyan fehérjék, amelyek átmeneti és nehézfém ionok erős és szelektív megkötésére, azok közegbeli koncentrációjának precíz érzékelésére képesek, bioszenzorok alapelemeiként érzékelési feladatokra használhatók. Ötvözve ezt a sajátságot önszerveződésre képes fehérjékkel, együttesen kiválóan alkalmazhatók molekuláris objektumok építésére. Kutatásaink egy újfajta megközelítési módot kínálnak a nehézfémion szennyezők kimutatására. Kísérleteimben megmutattam, hogy a flagellin polimerizációs képességének megőrzése mellett a D3 domén szerkezetének számítógépes molekulamodellezésen alapuló módosításával nehézfémionok megkötésére képes receptorfehérjék állíthatók elő. Munkám során Ni- és As-kötő flagellineket állítottam elő génsebészeti eszközök segítségével, a mutáns flagellinek Ni- és As-kötő tulajdonságait vizsgáltam, és megállapítottam, hogy monomer formában erősen kötik az adott nehézfémiont. Előkísérleteink alapján látszik, hogy a flagellin receptorokból képzett, nagy felületi kötőhelysűrűséggel rendelkező filamentumok alkalmas hordozóra egyszerűen rögzíthetők, emellett filamentáris formában optikai úton is kimutatható a nehézfémion kötés. A D3 doménnal végzett kísérleteimből látszik, hogy a D3 domén, önmagában is stabil szerkezetű, ezért akár önállóan is mesterséges receptorok vázeleméül szolgálhat. A D3 alapú receptorok főként a kis méretük miatt lehetnek előnyösek, de az eddig ismeretes mesterséges fehérjereceptorokhoz képest igazán figyelemre méltó előnyöket, a D3 doménjükben módosított flagellinreceptorok előállítása és alkalmazása ígér. Elsősorban azért, mert a mesterséges flagellinreceptorokból filamentáris receptorstruktúrák építése válik lehetővé. Egyfajta flagellinből a polimerizációs folyamat precíz kontrollálásával kívánt méretű filamentáris struktúrák építhetők (hosszuk a 0.1mm – 10mm tartományba eshet), 70

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása amelyek több száz, de akár több tízezer alegységet is tartalmazhatnak. Ezen filamentumok felületén rendkívül nagy kötőhelysűrűség érhető el, a kötőhelyek távolsága kb. 5nm. Így az egyes receptoralegységek megfelelő sűrűségű térbeli elhelyezéséhez nincs szükség speciális hordozó mátrixra, s további előnyt jelent, hogy a filamentáris szerkezetet alkotó receptoregységek azonos lokális környezetben találhatók. A nagy kötőhelysűrűség még kis molekulatömegű ligandumok esetén is (pl. nehézfémionok) reményt nyújt a kötődés a kimutatásra, s alacsony koncentrációjú anyagok megkötését is lehetővé teszi. Kutatásaink hosszú távú célja olyan optikai szenzorok előállítása és vizsgálata, amelyek ilyen filamentáris receptorokat használnak érzékelő elemként.

71


ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK / TÉZISEK

1. A

flagellinmolekula

ismert

szerkezetéből

kiindulva,

számítógépes

grafika

és

molekulamodellezés alkalmazásával megállapítottam, hogy a flagellin variábilis D3 régiójában mely aminosavak oldalláncai vannak megfelelő orientációban és távolságban ahhoz, hogy hisztidinre cserélve őket, fémkötő centrumot alakíthassak ki. A kiválasztott aminosavakat irányított mutagenezis módszerrel hisztidinre cseréltem. A mutáns flagellin Ni-kötő képességét, kvantitatív izotermális titrációs mikrokalorimetria (ITC) módszerrel vizsgáltam. Megállapítottam, hogy a kötődés disszociációs állandója Kd ~5 μM, és egy flagellin alegységhez egy Ni-ion kötődik. 2. A bakteriális arzénkötő fehérjék (ArsR fehérjék) esetén ismeretes, hogy az arzenit ion specifikus megkötéséért felelős polipeptidszegmens aminosavszekvenciája a következő: SerGlyGluLeuCysValCysAspLeuCysThrAlaLeuAspGln. A rendelkezésre álló adatok szerint ez a szegmens erősen nyújtott konformációjú, végeinek távolsága közel 20Å. Méretéből adódóan megállapítottam, hogy a D3 domén Ala262-Thr273 öblös felületi hurokrégiója megfelelő vázként szolgálhat az arzénkötő motívum befogadására. Ennek megfelelően az Ala262-Thr273 szegmenst a D3 doménből kivágtam, majd ennek helyére ültettem be az arzénkötő motívumot többlépcsős PCR segítségével. Az előállított As-kötő flagellinmutáns esetében a kötődés disszociációs állandója ugyancsak mM-os tartományba esik. 3. A filamentumok képződésének mechanizmusát kutatva azt a feltételezést, hogy a filamentum végén lévő szabad N-terminálishoz kötődik a következő alegység Cterminálisa, fluoreszcencia rezonancia energiatranszfer módszerrel igazoltam. A csonkított flagellinek polimerizációs vizsgálatából megállapítottam, hogy a megfigyeléseink megfelelnek a hipotézisnek, miszerint az axiális irányban szomszédos flagellin alegységek N- illetve C-terminális régiói egymásba fonódó helikális kötegeket alkotva építik fel a filamentumok belső gyűrűjének szerkezetét. 4. A Ni-kötő variánsból épített filamentum struktúrát, egy hordozómátrix nélküli szenzorchip felületre rögzítettem, és felületi plazmon rezonancia spektroszkópia

72

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása módszerrel vizsgáltam. A mérések alapján megállapítottam, hogy a mutáns filamentum felületi kötőhely sűrűsége elég nagy ahhoz, hogy megfeleljen a nehézfémion kötés optikai úton történő detektálására. 5. A flagellinmolekula D3 domént kódoló génszakaszát klónoztam és differenciális pásztázó kaloriméteres (DSC), valamint tripszines emésztési vizsgálattal megmutattam, hogy D3 domén stabil harmadlagos szerkezettel rendelkező önálló fehérje, amely nagyfokú ellenállást mutat a proteolitikus emésztéssel szemben. Ennek ismeretében a D3 domén kis mérete és stabil szerkezete lehetővé teszi, hogy alkalmazható legyen a későbbi receptor fejlesztések vázelemeként.

73


NEW SCIENTIFIC RESULTS / THESES 1. In Ni-binding proteins occuring in nature, the coordination of the Ni ions usually performed by imidazole groups of several (2-4) histidine side chains. By computerized graphics and molecular modeling I have established the variable D3 region of the flagellin to identify amino acids having side chains in suitable orientation and distance for constructing metal ion binding centre by replacing the relevant amino acids with histidine. The proposed Ni-binding variants were constructed by site-directed mutagenesis. Quantitative analysis of the Ni-binding ability of Leu209His-Val235His-Lys241HisSer264His mutant was performed by isothermal titrating microcalorimetry. I have proved, that the dissociation constant of Ni-binding Kd= 5 μM and one Ni ion was bound to one flagellin subunit. 2. In the bacterial arsenic-binding protein (ArsR) can be found a polypetide segment specific binding of arsenic-ion. The amino acid sequence of As-binding motif is the next: SerGlyGluLeuCysValCysAspLeuCysThrAlaLeuAspGln. This segment has strongly streched conformation, distance of ends is close 20 Å. From size of this segment I have found it can be inserted into the Ala 262-Thr273 surface loop region of D3 domain. I have cut the Ala 262-Thr273 region from D3 domain, and I have inserted the As-binding motif by multi-steps PCR. The As-binding flagellin variant also showed an affinity for arsenite in the micromolar range. 3. Investigating the mechanism of filament formation, the hypothesis that the free N-terminal region of filament bind to the C-terminal region of the next subunit I have verified by fluorescence resonance energy transfer method. From examination of truncated flagellin’s polymerization I established that the observations are consistent with the coiled-coil model of filament formation, which suggests that the α-helical N- and C-terminal regions of axially adjacent subunits form an interlocking pattern of helical bundles upon polymerization. 4. Filamentous structure building Ni-binding variants was immobilized on surface of a sensor chip without dextran matrix and it was examined by SPR method. I have proved,

74

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása that the mutant filament have very high binding site density on their surface allowing trace level heavy metal ion analysis by optical methods. 5. I have cloned the gene segment encoding the D3 domain of flagellin. The structural stability of isolated D3 was characterized by differential scanning microcalorimetry, and proteolysis by trypsin. The experiments have revealed that isolated D3 has a stable tertiary structure which is highly resistant against proteolytic digestion. Its small size and stable structure makes D3 a promising protein scaffold for the development of artificial binding proteins.

75


KÖZLEMÉNYEK Az értekezés alapjául szolgáló közlemények SEBESTYÉN, A., MUSKOTÁL, A., VÉGH B.M., & VONDERVISZT, F. (2008). The Hypervariable D3 Domain of Salmonella Flagellin Is an Autonomous Folding Unit. Protein and Peptide Letters, 15, 54-57. SEBESTYÉN, A, VÉGH, B.M., SZEKRÉNYES, Á., KURUNCZI, S., VONDERVISZT, F. (2006). Nehézfém-kötő flagellin alapú receptorok. Biokémia XXX/4. GUGOLYA, Z., MUSKOTÁL, A., SEBESTYÉN, A., DIÓSZEGHY, Z. & VONDERVISZT, F. (2003). Interaction of the disordered terminal regions of flagellin upon flagellar filament formation. FEBS Letters, 535, 66-70.

Egyéb közlemények MUSKOTÁL, A., KIRÁLY, R., SEBESTYÉN, A., GUGOLYA, Z.,VÉGH B.M. VONDERVISZT, F. (2006). Interaction of FliS flagellar chaperone with flagellin. FEBS Letters, Vol. 580, 3916-3920. FECZKÓ, T., MUSKOTÁL, A., GÁL, L., SZÉPVÖLGYI, J., SEBESTYÉN, A., VONDERVISZT, F. Synthesis of Ni-Zn ferrite nanoparticles in radiofrequency thermal plasma reactor and their use for purification of histidine-tagged proteins, J. Nanoparticle Research, közlésre elfogadva.

Tudományos előadások, poszterek: SEBESTYÉN, A., MUSKOTÁL, A., GYIMESI, G., VONDERVISZT, F., BÁRSONY, I.: Ni- and As-binding flagellin-based receptors E-MRS (2007) Spring Meeting, Strasbourg (France).

76


KURUNCZI, S., NAGY, N., TÓTH, A. L., SEBESTYÉN, A., VONDERVISZT, F., BÁRSONY, I.: Immobilization of protein filaments on surfaces for optical sensing E-MRS (2007) Spring Meeting, Strasbourg (France). PAP, A. E., KURUNCZI, S., SEBESTYÉN, A., TÓTH, A. L., VONDERVISZT, F., BÁRSONY, I.: Immobilization of protein segments into porous silicon for biosensor application E-MRS (2007) Spring Meeting, Strasbourg (France). SEBESTYÉN, A., MUSKOTÁL, A., SZEKRÉNYES, Á., GYIMESI, G., KURUNCZI, S., VONDERVISZT, F.: Nehézfém-kötő flagellin alapú receptorok Műszaki Kémiai Napok ’07 Veszprém, (2007). SEBESTYÉN, A., MUSKOTÁL, A., SZEKRÉNYES, Á., GYIMESI, G., KURUNCZI, S. ÉS VONDERVISZT,

F.:

Nehézfém-kötő

flagellin

alapú

receptorok

Nanobiológia

Miniszimpózium Pécs (2006). (Legjobb poszter díja). SEBESTYÉN, A., GUGOLYA, Z., JAKAB, G., DIÓSZEGHY, Z., ZÁVODSZKY, P. & VONDERVISZT, F.: The FliH component of the flagellar export apparatus is a multizinc enzyme with phospholipase activity. 30th FEBS Congress - 9th IUBMB Conference. Budapest, Hungary (2005). SEBESTYÉN, A., GUGOLYA, Z., JAKAB, G., MUSKOTÁL, A., DIÓSZEGHY, Z., ZÁVODSZKY, P., VONDERVISZT, F.: A flagellumspecifikus exportrendszer FliH komponense foszfolipáz aktivitással rendelkező multi-cink fehérje. A Magyar Biofizikai Társaság XXII. Kongresszusa. Debrecen, (2005). KURUNCZI, S., TÓTH, A. L., SEBESTYÉN, A., VONDERVISZT, F., BÁRSONY, I.: Immobilization of protein filaments on surfaces for optical sensing. Hungarian Nanotechnolgy Symposium. Budapest, Hungary (2005). MUSKOTÁL, A., KIRÁLY, R., SEBESTYÉN A., VÉGH B., VONDERVISZT F.: A flagellinspecifikus FliS dajkafehérje jellemzése. A Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztályának 8. Munkaértekezlete. Tihany (2003). 77

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása MUSKOTÁL, A., SEBESTYÉN, A.: A flagellinmolekula rendezetlen terminális régióinak szerepe az alegységek kölcsönhatásaiban, ELTE, OTDK Konferencia ( 2003). Kémiai és Vegyipari Szekcióban, a biokémia-biotechnológia tagozatában III. helyezés. MUSKOTÁL, A., SEBESTYÉN, A., GUGOLYA, Z., DIÓSZEGHY, Z., VONDERVISZT, F.: A flagellinmolekula kölcsönhatásaiban.

rendezetlen A

terminális

Magyar

Biokémiai

régióinak Egyesület

szerepe

az

Molekuláris

alegységek Biológiai

Szakosztályának 7. Munkaértekezlete. Keszthely, (2002). VONDERVISZT, F., MUSKOTÁL, A., SEBESTYÉN, A., GUGOLYA, Z., DIÓSZEGHY Z.: Interaction of the disordered terminal regions of flagellin upon filament formation. XIV. International Biophysics Congress, Buenos Aires, Argentina (2002). MUSKOTÁL A., SEBESTYÉN A., VONDERVISZT F.: A flagellinmolekula rendezetlen terminális régióinak szerepe az alegységek kölcsönhatásaiban. A Magyar Biofizikai Társaság Molekuláris Biofizika Szekciójának szegedi szekcióülése (2002). MUSKOTÁL A., SEBESTYÉN A.: A flagellinmolekula rendezetlen terminális régióinak szerepe az alegységek kölcsönhatásaiban, VIII. Országos Felsőoktatási Környezettudományi Diákkonferencia, Veszprém (2002) Környezeti Kémia Szekcióban Környezetvédelmi és Vízügyi Minisztérium különdíja. MUSKOTÁL A., SEBESTYÉN A.: A flagellinmolekula rendezetlen terminális régióinak szerepe az alegységek kölcsönhatásaiban, VE, TDK Konferencia (2001) Kémiai és Vegyipari Szekcióban II. helyezés.

78


IRODALOMJEGYZÉK AIZAWA, S.-I., VONDERVISZT, F., ISHIMA, R. & AKASAKA, K. (1990). Termini of Salmonella flagellin are disordered and become organized upon polymerization into flagellar filament. J. Mol. Biol. 211, 673-677. AMSTUTZ, P., FORRER, P., ZAHND, C., PLUCKTHUN, A., (2001). In vitro display technologies: novel developments and applications. Curr. Op. Biotech. 12, 400-405. AQUANAL NKFP PROJEKT: „Természetes vizek, földtani közegek helyszíni analízise mikro- és nano-érzékelési módszerekkel” (2005-2007). ASAKURA, S. (1970). Polymerization of flagellin and polymorphism of flagella. Advan. Biophys. (Japan) 1, 99-155. ASAKURA, S., EGUCHI, G. & IINO, T. (1964). Reconstitution of bacterial flagella in vitro. J. Mol. Biol. 10, 42-56. BÁLINT M.,(2000) Molekuláris biológia I.; II. Műszaki könyvkiadó BEATSON, S.A.,MINAMINO, T.,PALLEN, M.J.(2006). Variation in bacterail flagellin are disordered in solution. Trends Microbiol. 14, 151-155 BLAIR, D.F. & BERG, H.C. (1990). The MotA protein of E. coli is a proton-conducting component of the flagellar motor. Cell 60, 439-449. BLOCKER A., KOMORIYA K., AIZAWA S-I (2003) Type III. secretion systems and bacterial flagella: insights into their function from structural similarities. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 100, 3021-3030 BUSENLEHNER, L. S., PENELLA, M. A., GIEDROC, D. P. (2003) The Smtb/ArsR family of metalloregulatory transcriptionalrepressors: structural insight into prokaryotic metal resistance. FEMS Microbiol. Rev., 27: 131–143. DEAN, G.E., MACNAB, R.M., STADER, J., MATSUMURA, P. & BURKE, C. (1984). Gene sequence and predicted amino acid sequence of the MotA protein, a membraneassociated protein required for flagellar rotation in Eschericia coli. J.Bacteriol. 159, 991-999. DEPAMPHILIS, M.L. & ADLER, J. (1971). Attachment of flagellar basal bodies to the cell envelope: specific attachment to the outer lipopolysaccharide membrane and the cytoplasmic membrane. J. Bacteriol. 105, 396-407. DRIKS, A. & DEROSIER, D.J. (1990). Additional structures associated with bacterial flagellar basal body. J. Mol. Biol. 211, 669-672.

79

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása FRANCIS, N.R., IRIKURA, V.M., YAMAGUCHI, S., DEROSIER, D.J. & MACNAB, R.M. (1992). Localization of the Salmonella typhimurium flagellar switch protein FliG to the cytoplasmic M-ring face of the basal body. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6304-6308. FRANCIS, N.R., SOSINSKY, G.E., THOMAS, D. & DEROSIER, D.J. (1994). Isolation, characterization and structure of bacterial flagellar motors containing the switch complex. J. Mol. Biol. 235, 1261-1270. GUGOLYA, Z., MUSKOTÁL, A., SEBESTYÉN, A., DIÓSZEGHY, Z., VONDERVISZT, F. (2003). Interaction of the disordered terminal regions of flagellin upon flagellar filament formation. FEBS Letters 535, 66-70 HIRANO, T., YAMAGUCHI, S., OOSAWA, K. & AIZAWA, S.-I. (1994). Roles of FliK and FlhB in determination of flagellar hook length in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 176, 5439-5449. HOMMA, M., DEROSIER, D.J. & MACNAB, R.M. (1990). Flagellar hook and hook-associated proteins of Salmonella typhimurium and their relationship to other axial components of the flagellum. J. Mol. Biol. 213, 819-832. IINO, T. (1969). Polarity of flagellar growth in Salmonella. J. Gen. Microbiol. 56, 227-239. JONES, C.J., MACNAB, R.M., OKINO, H. & AIZAWA, S.-I. (1990). Stoichiometric analysis of the flagellar hook-(basal-body) complex of Salmonella typhimurium. J. Mol. Biol. 212, 377-387. JOYS, T.M. (1985). The covalent structure of the phase-1 flagellar filament protein of Salmonella typhimurium and its comparison with other flagellins. J. Biol. Chem. 260, 15758-15761. KAGAWA, H., AIZAWA, S.-I., ASAKUA, S.(1979) Transformations in isolated polyhooks. J. Mol. Biol. 129, 333-336 KANTO, S., OKINO, H., AIZAWA, S.-I. & YAMAGUCHI, S. (1991). Amino acids responsible for flagellar shape are distributed in terminal regions of flagellin. J. Mol. Biol. 219, 471-480 KATO, S., OKAMOTO, M. & ASAKURA, S. (1984). Polymorphic transition of the flagellar polyhook from Escherichia coli and Salmonella typhimurium. J. Mol. Biol. 173, 463476. KHAN, I.M., REESE, T.S. & KHAN, S. (1992). The cytoplasmic component of the bacterial flagellar motor. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89, 5956-5960.

80

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása MACNAB R.M. (2004) Type III flagellar protein export and flagellar assembly. BBA 1694, 107-217. MACNAB, R. M. (1995) Flagella and motility. In: E. coli and Salmonella. Cellular and molecular biology. (Neidhart, F. C., Ed.) American Society for Microbiology, Washington D.C., USA pp.123–145. METZGER, H. (1990). Fc receptors and the action of antibodies American Society of Microbiology. MIMORI-KIYOSUE, Y., VONDERVISZT, F. & NAMBA, K. (1997). Locations of terminal segments of flagellin in the filament structure and their roles in polymerization and polymorphism. J. Mol. Biol. 270, 222-237. MUSKOTÁL, A., KIRÁLY R., SEBESTYÉN, A., GUGOLYA, Z.,VÉGH B.M. VONDERVISZT, F. (2006). Interaction of FliS flagellar chaperone with flagellin. FEBS Letters, 580, 39163920. MYSZKA, D. G. (2000). Kinetic, equilibrium and thermodynamic analysis of macromolecular interactions with Biacore. Methods in Enzymology 323, 325-339. NAMBA, K. & VONDERVISZT, F. (1997). Molecular architecture of bacterial flagellum. Quarterly Rev. of Biophysics 30, 1, 1-65. NAMBA, K., YAMASHITA, I. & VONDERVISZT, F. (1989). Structure of the core and central channel of bacterial flagella. Nature (London) 342, 648-654. NYGREN, P. & UHLEN, M., (1997) Scaffolds for engineering novel binding sites in proteins. Curr. Op. Struct. Biol 7, 463-469 OHNISHI, K., OHTA, Y., AIZAWA, S.-I., MACNAB, R.M. & IINO, T. (1994). FlgD is a scaffolding protein needed for flagellar hook assembly in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 176, 2272-2281. PHARMACIA BIOSENSOR AB (1994). BIAtechnology Handbook (BR-1001-84). ROMERO-ISART, N., VASÁK, M. (2002) Advances in the structure and chemistry of metallothioneins. J. Inorg. Chem., 88: 388–396. SAIJO-HAMANO, Y., UCHIDA, N, NAMBA, K. (2004) In vitro characterization of FlgB, FlgC, FlgF, FlgG and FliE, flagellar basak body proteins of Salmonella J. Mol. Biol. 339, 423-435 SAMATEY, F.A., IMADA, K., NAGASHIMA, S. (2001).Structure of the bacterial flagellar protofilament and implications for a switch for supercoiling Nature 410, 331-337.

81

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása SCHOENHALS, G. & WHITEFIELD C. (1993). Comparative analysis of flagellin sequences from E. coli strains possessing serologically distinct flagellar filaments with a shared complex surface pattern. J. Bacteriol, 175, (17), 5395 SHARP, L.L., ZHOU, J. & BLAIR, D.F. (1995). Tryptophan-scanning mutagenesis of MotB, an integral membrane protein essential for flagellar rotation in Eschericia coli. Biochemistry 34, 9166-9171. SKERRA, A. (2001). Anticalins: a new class of engineered ligand-binding proteins with antibody-like properties. Rev. Mol. Biotech. 74, 257-275 SOSINSKY, G.E., FRANCIS, N.R., DEROSIER, D.J., WALL, J.S., SIMON, M. & HEINFELD, J. (1992). Mass determination and estimation of subunit stoichiometry of the bacterial hook-basal body flagellar complex of Salmonella typhimurium by scanning transmission electron microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4801-4805. UENO, T., OOSAWA, K. & AIZAWA, S.-I. (1992). M ring, S ring and proximal rod of the flagellar basal body of Salmonella typhimurium are composed of subunits of a single protein, FliF. J. Mol. Biol. 227, 672-677. URATANI, Y., ASAKURA, S., IMAHORI, K.,(1972). A circular dichroism study of Salmonella flagellin: evidence of conformational change of polymerization J. Mol. Biol. 67, 8598. YOSHIOKA, K:, AIZAWA, S. I. & YAMAGUCHI S. (1995). Flagellar filament structure and cell motility of Salmonella typhimurium mutants lacking part of the outher domain of flagellin. J. Bacteriol.,177, (4), 1090-1093. VAN DER MERWE, P. A. (2000). Surface Plasmon Resonance (Protein-Protein Interactions: A Practical Approach). Oxford University Press. VÉGH, B.M., GÁL, P., DOBÓ, J., ZÁVODSZKY, P. & VONDERVISZT, F. (2006). Localization of the flagellim-specific secretion signal in Salmonella flagellin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 345, 93-98. VONDERVISZT, F., AIZAWA, S.-I. & NAMBA, K. (1991). Role of the disordered terminal regions of flagellin in filament formation and stability. J. Mol. Biol. 221, 1461-1474. VONDERVISZT, F., ISHIMA, R., AKASAKA, K. & AIZAWA, S.-I. (1992). Terminal disorder: a common structural feature of the axial proteins of bacterial flagellum. J. Mol. Biol. 226, 575-579. VONDERVISZT, F., KANTO, S., AIZAWA, S.-I. & NAMBA, K. (1989). Terminal regions of flagellin are disordered in solution. J. Mol. Biol. 209, 127-133.

82

Sebestyén Anett: Flagellinalapú molekuláris objektumok létrehozása VONDERVISZT, F., UEDAIRA, H., KIDOKORO, S. & NAMBA, K. (1990). Structural organization of flagellin. J. Mol. Biol. 214, 97-104. WEAVER, R. F., HEDRICK P. W., (2000) Genetika Panem Könyvkiadó WEI, L.-N. & JOYS, T.M. (1985). Covalent structure of three phase-1 flagellar filament proteins of Salmonella. J. Mol. Biol. 186, 791-803. WILSON, D.R. & BEVERIDGE, T.J. (1993). Bacterial flagellar filaments and their component flagellins. Can. J. Microbiol. 39, 451-474. XU, L. (2002). Directed evolution of high-affinity antibody mimics using m-RNA display. Chemistry& Biology 9, 933-942 YAMASHITA, I., HASEGAWA, K., SUZUKI, H., (1998) Structure and switching of bacterial flagellar filament studied by X-ray fiber diffraction. Nature Struct. Biol. 5, 125-132. YAMASHITA, I., VONDERVISZT, F., MIMORI, Y., SUZUKI, H., OOSAWA, K. & NAMBA, K. (1995). Radial mass analysis of the flagellar filament of Salmonella: implications for subunit folding. J. Mol. Biol. 253, 547-558. YONEKURA, K., MAKI-YONEKURA S. NAMBA, K., (2003). Complete atomic model of the bacterial flagellar filament by electron cryomicroscopy Nature 424, 643-650 ZHOU, J., FAZZIO, R.T. & BLAIR, D.F. (1995). Membrane topology of the MotA protein of Eschericia coli. J. Mol. Biol. 251, 237-242. ZHU, H. & SNYDER, M. (2003). Protein chip technology. Curr. Op. Chem. Biol. 7, 55-63

83


KÖSZÖNET KÖSZÖNETET MONDOK MINDAZOKNAK, AKIK A DOLGOZAT MEGÍRÁSÁHOZ SEGÍTSÉGET NYÚJTOTTAK.

Külön szeretném köszönetemet kifejezni témavezetőmnek, Dr. Vonderviszt Ferencnek, aki már egyetemi éveim alatt betekintést engedett a “fehérjék világába”, egyengette szakmai pályafutásomat, és segítette munkámat. Köszönettel tartozom a Pannon Egyetem Környezettudományok Doktori Iskola vezetőinek, Dr. Mészáros Ernőnek és Dr. Pósfai Mihálynak, hogy PhD tanulmányaimat a Doktori Iskolában végezhettem. Köszönet illeti Dr. Bársony Istvánt az MTA MFA igazgatóját aki lehetővé tette, hogy munkámat az ösztöndíjam lejárta után tovább folytathattam. Köszönöm az MTA SZBK Enzimológiai Intézet igazgatójának, Dr. Závodszky Péternek, hogy kutatómunkám egy részét az intézetben végezhettem. Szeretném megköszönni Dr. Gál Péternek azt a meghatározó nyári gyakorlatot, amely alatt megtanulhattam a molekuláris biológiai eljárások alapjait, és köszönöm Végh Barbarának is akitől sok segítséget kaptam a DNS-munkában. A számítógépes modellezésben nyújtott segítséget Gyimesi Gergelynek, Prettl Zsoltnak és Barna Lászónak köszönöm. Köszönet illeti Szekrényes Ákost és Kurunczi Sándort a filamentumok felületi rögzítésének vizsgálataiért. Köszönöm Muskotál Adélnak az együtt töltött “munkás” éveket, és azt a sokoldalú segítséget amit ezalatt tőle kaptam. Munkám befejezését támogatta, ezért köszönettel tartozom a Richter Gedeon Centenáriumi Alapítványnak. Végül nagyon köszönöm Családomnak, Szüleimnek, hogy hittek bennem, bíztattak és támogatták tanulmányaimat. És nagyon, de nagyon köszönöm Férjemnek, hogy nap mint nap mellettem állt és támogatott mindenben. KÖSZÖNÖM!

84

FLAGELLINALAPÚ MOLEKULÁRIS OBJEKTUMOK LÉTREHOZÁSA

Recommend Documents