Tudományos Diákköri Dolgozat
GYULAI GERGİ
Felületmódosítás hatása biodegradábilis polimer fehérjeadszorpciós képességére
Témavezetı: Dr. Kiss Éva ELTE Kémiai Intézet, Fizikai Kémiai Tanszék Határfelületi- és Nanoszerkezetek Laboratóriuma
Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2009
Tartalomjegyzék 1. Bevezetés ............................................................................................................... 2 2. Irodalmi áttekintés ............................................................................................ 4 3. Célkitőzés ............................................................................................................. 9 4. Kísérleti rész ...................................................................................................... 10 4.1. Felhasznált anyagok........................................................................ 10 4.2. Mintakészítés ................................................................................... 11 4.3. Vizsgálati módszerek....................................................................... 12 4.3.1. Nedvesedés mérés........................................................ 12 4.3.2. Röntgen-fotoelektron spektroszkópia .......................... 13 4.3.3. Atomi erı mikroszkópia............................................... 14 4.3.4. Ellipszometria.............................................................. 15
5. Eredmények és értékelésük.......................................................................... 18 5.1. Mintakészítés ................................................................................... 18 5.2. Nedvesedési tulajdonságok ............................................................. 18 5.3. Felületi összetétel ............................................................................. 20 5.4. Felületi morfológia .......................................................................... 23 5.5. Fehérjeadszorpció ........................................................................... 26
6. Összefoglalás ..................................................................................................... 33 7. Irodalomjegyzék .............................................................................................. 35
1
1. Bevezetés Az elmúlt évtizedekben az anyagtudomány terén óriási fejlıdés ment végbe, melynek során számtalan új szerkezeti és funkcionális anyag látott napvilágot. Az egyik leggyorsabban fejlıdı alkalmazás az orvosbiológia területén figyelhetı meg. A betegségek kezelésének egyik módja a gyógyszeres terápia. A gyógyszerek hatóanyagai akkor tudják megfelelıen kifejteni hatásukat a szervezetben, ha a szükséges mennyiségben, a megfelelı helyre jutnak el. A legtöbb gyógyszer jótékony hatása mellett különbözı mértékő mellékhatásokat is okozhat. A mellékhatások a legtöbb esetben akkor lépnek fel, ha a hatóanyagok nem a rendeltetési helyükön fejtik ki hatásukat. A mai napig a legtöbb gyógyszer irányított célba juttatása nem megoldott, így azokat a kívánatosnál jóval nagyobb mennyiségben kell adagolni, hogy a testben szétterülve a célszervben is a megfelelı koncentrációban legyenek jelen. Az utóbbi idıkben ezért az új hatóanyagok kifejlesztése mellett egyre több kutatás irányul a szövetbarát, biokompatibilis gyógyszerhordozó anyagok kifejlesztésére. A bioanyag általános meghatározás szerint olyan élettelen anyag, amelyet orvosi eszközökben alkalmaznak biológiai rendszerekkel való kölcsönhatás céljából, a biokompatibilitás pedig az anyagnak az a tulajdonsága, hogy se rövid, se hosszú távon ne legyen mérgezı, allergén, vagy gyulladáskeltı hatása, ne váltson ki immunológiai válaszreakciót, ne legyen rákkeltı, ne károsítsa a környezı szövetet, hanem segítse elı a belıle készült eszköz sikeres mőködését [1]. Gyógyszerhordozóként, illetve szövettámaszként használt bioanyagok esetén rendkívül kedvezı tulajdonság, ha az alkalmazott rendszer biodegradábilis, vagyis a szervezetben uralkodó körülmények között idıvel fokozatosan lebomlik. Az utóbbi években egyre nagyobb figyelem irányult a poli(tejsav)-ra (PLA), illetve a tejsav és glikolsav különbözı arányú random kopolimerjeire (PLGA) (1. ábra). O H
O
C H2
O OH
H
n
O H C CH3
Poli(glikolsav)
OH n
Poli(tejsav)
1. ábra A poli(glikolsav) és a poli(tejsav) szerkezeti képlete
2
Ezen poliészterek nagy elınye, hogy a kedvezı mechanikai tulajdonságaik mellett a szervezetben az észterkötés hidrolizál, melynek következtében tejsav és glikolsav képzıdik, melyek a szervezetben is megtalálható, nem toxikus anyagok. A monomerek arányával és a polimer kristályossági fokával, valamint átlagos molekulatömegével jól befolyásolható a lebomlás sebessége, így kiváló gyógyszerhordozók lehetnek a hozzájuk
kevert
hatóanyagok
szabályos,
egyenletes
leadásával.
Kolloidális
nanogömböcskék formájában, a véráramban maradva hosszú távon biztosíthatnák a szervezetben az egyenletes hatóanyag koncentrációt. Alkalmazásuk során azonban problémát
okoz
a
felületük
hidrofób
jellege,
melynek
következtében
nem
biokompatibilisek, vagyis a szervezet védekezı mechanizmusát beindítva nem kívánatos reakciókat váltanak ki. Ennek eredményeként nanogömböcskék formájában alkalmazva a részecskék véráramból való gyors kiürülése, míg makroszkópikus formában alkalmazva a környezı szövetek gyulladása és kilökıdés következik be. Ebbıl következıen felmerül az igény, hogy megváltoztassuk a polimer felületi tulajdonságait, csökkentsük a hidrofób jelleget, így növelve a biokompatibilitásukat.
3
2. Irodalmi áttekintés A biológiailag lebomló polimerek között a leggyakrabban vizsgált lehetséges gyógyszerhordozó a PLA, illetve a különbözı PLGA-k. Mikro-, nanogömböcskék formájában a felhasználásuk korlátja a felületi hidrofóbitásuk, melynek hatására aktiválják a szervezet védekezı rendszerét. In vivo kísérletek azt mutatják, hogy a hidrofób részecskék jelentısen gyorsabban kiürülnek a szervezetbıl, mint a hidrofilek [2]. Szükséges tehát ezeknek a polimereknek a felületét módosítani úgy, hogy a hidrofób jellegük csökkenjen. A felületi tulajdonságok javításának egyik leghatásosabb módja biokompatibilis molekulák kémiai rögzítése az anyag felületéhez. A különbözı molekulák közül, mint például
poli(hidroxietil-metakrilát),
poli(akril-amid),
a
poli(etilén-oxid)
(PEO)
bizonyult az egyik legjobb tulajdonságúnak. A PEO (2. ábra) segítségével kiváló "fehérje taszító" felületeket lehet létrehozni, mivel a molekulának nagy a hidrofilitása, flexibilis, nem toxikus, és nem vált ki immunválaszt a szervezetben. Tömbfázisként való alkalmazásának viszont gátat szabnak a kedvezıtlen mechanikai tulajdonságai.
HO
C H2
H2 C
H
O n
2. ábra A poli(etilén-oxid) szerkezeti képlete Számos módszert fejlesztettek ki a PEO molekulák felülethez való kötésére. Ilyen például a szililezett PEO molekulák szilícium, illetve üvegfelületekhez történı kapcsolása önrendezıdı monoréteg (SAM) módszerrel [3]. Az így elıállított felületek hidrofilitása, melyet peremszög méréssel jellemeztek, jelentıs növekedést mutatott. A PLA/PLGA felületek kémiai módosítása nehézségekbe ütközik, ugyanis a polimerben nem található reaktív funkciós csoport. A funkciós csoportok kialakítása minden technika esetében (kémiai, vagy például plazma kezelés) a polimer degradációján alapul. Különbözı kémiai eljárásokkal -OH, -COOH, és -NH2 funkciós csoportokat alakítottak ki a felületen [4, 5]. Az így kialakított funkcionalizált felületen már megvalósítható a PEO kapcsolás. Az egyik módszer során a polimer felületét NaOH-oldattal enyhén hidrolizálják, majd a láncvégeken etilén-diaminnal alakítják ki
4
az amin csoportokat. A továbbiakban pedig a PEO-ot aldehid formában kapcsolják a felülethez az amin csoportokon keresztül. A kémiai módosítás legnagyobb hátránya, hogy a funkciós csoportok kialakításához mindig szükséges a polimer lánc hasítása. Mivel a PLA/PLGA polimerek általában elég kis molekulatömegőek, a hidrolízis hatására jelentısen változhatnak a mechanikai tulajdonságaik. Éppen ezért a felületre a funkcionalizálást követıen rögzíthetı módosító molekulák száma korlátozott, és így nem érhetı el jelentısebb javulás a biokompatibilitásban. A kémiai módosítás egy egészen más megközelítése a poli(tejsav/lizin) (PLAL) szintézise, melynek során magát a polimer láncot alakították át úgy, hogy az tartalmazza a reaktív oldalláncokat [6]. Az ilyen módszerek esetében azonban alapvetıen megváltozhatnak az eredeti polimer tömbfázisbeli tulajdonságai is. A felületi tulajdonságok javításának másik módja a fizikai módosítás. Quirk és munkatársai a PLA felszínének olyan módosítását írják le, melynek során a módosító anyagot beágyazzák az alap polimer mátrixba (entrapment technika) [7]. A módszer lényege, hogy a polimer felületet egy olyan oldószerelegybe merítik, melynek egyik komponense oldja, másik nem oldja a PLA-t. Az oldószerben oldva található a módosító anyag, mely a PLA-t nem oldó komponensben is oldható kell legyen. Az oldószerbe kerülve a PLA felülete duzzadni, gélesedni kezd. Ez a folyamat megfordítható, ha a PLA-t nem oldó komponenst nagy mennyiségben hozzáadagoljuk a rendszerhez. A folyamat során a módosító anyag, például PEO, nagy mennyiségben bezáródik a felületi rétegbe. Röntgen-fotoelektron spektroszkópiai (XPS) mérések szerint a módszerrel közel 75%-os felületi PEO borítottság is elérhetı. A megkötött PEO tartalom jól befolyásolható a módszer több paraméterének változtatásával, ezek az oldószer elegy összetétele, az oldott PEO koncentrációja és moláris tömege és a kezelés idıtartama [8]. A módszer segítségével PEO mellett sokféle anyagot fel lehet használni a módosításra, például polipeptideket, mint a poli(L-lizin) [7], vagy a selyem fibroin [4]. A technika nagy hátránya, hogy csak nagyobb vastagságú, sík felületeken lehet eredményesen alkalmazni, mivel a kismérető, 3D struktúrák az oldódás következtében tönkre mennének [9]. A felületi immobilizáció egyik legegyszerőbb módja a módosító anyag fizikai adszorpciójával valósítható meg. Ennek megvalósulásához a módosító speciesznek elegendıen felületaktívnak és a megkötıdésnek irreverzibilisnek kell lennie. Gyenge adhéziójuk miatt a PEO molekulák nem bizonyultak megfelelınek adszorpciós réteg 5
kialakítására, mivel a testfolyadékokban fokozatosan leoldódnak. Az utóbbi években egyre több kutatás irányult a poli(etilén-oxid)-poli(propilén-oxid)-poli(etilén-oxid) (PEO-PPO-PEO) vízoldható, blokk-kopolimerek alkalmazására (3.ábra). Ezek a polimerek jelentıs felületaktivitással rendelkeznek amfipatikus szerkezetükbıl adódóan. A PEO részek adják a molekula hidrofil-, a PPO mag a hidrofób részét. Ezek a nemionos tenzidek a kereskedelemben a Pluronic® márkanév alatt kaphatók.
HO
H2 C
C H2
PEO
O n
H2 H C C O CH3
PPO
H2 C m
C H2
O
H n
PEO
3. ábra A Pluronic®-ok általános szerkezeti képlete Szerkezetük jól definiált, a hidrofil, hidrofób arány változtatásával a molekulák tulajdonságai változtathatók. A Pluronic-ok gyógyszerhordozók felületét módosító szerként való alkalmazását az is indokolja, hogy toxicitásuk igen kicsi. A legtöbb Pluronic, illetve a PLA és a PLGA-k az Amerikai Egyesült Államok Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hivatala által engedélyezett anyagok [4, 10]. A felület hidrofilitása az adszorpciós rétegben lévı etilén-oxid egységek számától függ. Különbözı Pluronic-okkal végzett mérések alapján azonban nem a legnagyobb PEO tartalmú adalékok esetén érték el a legnagyobb csökkenést a felület hidrofóbicitásában [11]. Az adszorbeált mennyiség a molekula PPO tartalmával és oldhatóságával van összefüggésben, minél hosszabb a PPO egység, annál nagyobb a hidrofób felülettel kialakuló kölcsönhatás mértéke. A legnagyobb felületi PEO koncentráció tehát a PEO és PPO egységek hosszúságának megfelelı megválasztásával érhetı el. A módosító anyagok bejuttatásának másik egyszerő módja, ha közös oldószerben a PLA-val a kívánt arányban összekeverjük, és a keverék oldatból hozzuk létre a kívánt struktúrákat. Fontos azonban ilyenkor tisztában lenni az alkalmazott anyagok tulajdonságaival, hiszen túl nagy koncentráció esetén fázisszeparáció mehet végbe a szilárd termékben. A fázisszeparáció felhasználható porózus mikrorészecskék létrehozására is, ha a módosító komponenst szelektíven ki tudjuk oldani a keverékbıl. Erre példa, hogy PLGA-hoz nagy mennyiségben Pluronic-ot keverve, majd az oldatból
6
emulziós módszerrel mikrorészecskéket létrehozva, a Pluronic vízzel kioldható a részecskékbıl. Az így kapott mikrogömböcskék rendkívül porózusak, utólagos funkcionalizálást követıen jelentıs mennyiségő hatóanyag hordozására képesek [12]. A PLA/PLGA polimerek Pluronic-okkal alkotott keverék rendszereinek felületi jellemzésérıl eddig viszonylag kevés közlemény született. A keverék oldatokból "solvent casting" technikával elıállított filmek jelentıs hidrofilitás növekedést mutattak, melyet víz peremszög mérésekkel mutattak ki [13]. XPS mérések szerint a Pluronic jelentısen dúsul a felületi rétegben. A dúsulás mértéke az alap polimertıl és a Pluronic adalék típusától függ. Kimutatták, hogy a nedvesedési tulajdonságokat a nagyobb molekulatömegő Pluronic adalékok javították legjobban. A biokompatibilitás jellemzésére számos módszert kifejlesztettek. Az egyik legelterjedtebb és általában alapvetı mérési módszer, a fehérje adszorpció vizsgálata. A fehérje adszorpciót általánosan a sejt megkötıdést kiváltó elsı lépésnek tartjuk [14]. A megkötıdı fehérjék megváltoztathatják a felület szerkezetét, melynek hatására végbe mehet a sejtek megtapadása. Kalasin és munkatársai kimutatták, hogy negatív töltéső felületeken igen kis mennyiségben jelenlévı adszorbeált fibrinogén hatására képesek megtapadni a sejtek. Modellezésre negatív felületi töltéső szilika mikrorészecskéket használtak [15]. A véráramba jutva az idegen anyagokon elsı lépésben a vérplazma fehérjéi adszorbeálódnak. Ezt követıen a vérsejtek, mint például a vérlemezkék kölcsönhatnak a kialakult fehérjeréteggel. Fibrinogén jelenlétében a lemezkék megkötıdnek, mely végül vérrög képzıdéséhez vezethet. A vérben legnagyobb mennyiségben elıforduló fehérje a szérum albumin (40-48 g/l) [16], mely nem specifikus adszorpcióval megkötıdik a vérbe bejutó idegen anyagokon. Különbözı anyagok vérkompatibilitásának meghatározásakor gyakran vizsgálják a felületen megkötött szérum albumin és fibrinogén mennyiségek arányát. Amennyiben jelentısen nagyobb mértékő az albumin adszorpció, a felületet vérkompatibilisnek tekintjük, mivel a fibrinogén sokkal kisebb koncentrációban van jelen a vérben (2-4 g/l) [16], így mielıtt adszorbeálódhatna, már kialakul a felületen az albumin réteg, ami megakadályozza a további adszorpciót [17]. A biokompatibilitás szigorúbb feltételeként azt követeljük meg, hogy a felületen egyáltalán ne menjen végbe fehérje adszorpció. Az ilyen típusú vizsgálatoknál leggyakrabban a szérum albumint használják, mind modell fehérjét. Kísérleti tapasztalatok alapján a fehérjék felületen történı adszorpciója irreverzibilis folyamatnak tekinthetı, az adszorbeált molekulák deszorpcióval nem távolíthatók el,
7
csak leszorítással. Szerkezetükbıl adódóan elektrosztatikus, hidrofób és H-hidas kölcsönhatásokon keresztül képesek kapcsolódni a felülethez. A fehérje adszorpció visszaszorítása megnöveli a gyógyszerhordozó részecskék véráramban való tartózkodási idejét, lehetıvé téve a fokozatos gyógyszerleadást. A PLGA polimerek Pluronic-kal módosított felületének fehérje megkötı képességét Langmuir-technikával vizsgálták [18]. A technika lényege, hogy a polimerekbıl, illetve ezek kevert rendszereibıl vízfelszínen felületi réteget hoznak létre, majd a réteg alatti oldatba fehérjét juttatnak és mérik a film oldalnyomás változását az idıben. Az eredmények alapján a Pluronic-kal kevert rétegen kimutathatóan kisebb mértékő az adszorpció. Az ilyen modellvizsgálatok elınye az in situ jelleg, hátránya viszont, hogy az oldalnyomás változás csak indirekt információt szolgáltat az adszorpcióról. A fehérje adszorpció követésének egy másik nagy pontosságú módszere az ellipszometria. A módszerrel a fény polarizációs állapotának változását mérjük sík, szilárd, vagy folyadék felületen történı visszaverıdés hatására. A paraméterek változásából a réteg vastagságára és törésmutatójára lehet következtetni. Bár a technika fejlıdését elsısorban a félvezetı ipar hajtja, biológiai rendszerek és ezen belül adszorbeált fehérjerétegek meghatározására is évek óta sikeresen alkalmazzák [17, 19, 20]. Az újabb spektroszkópiai ellipszométerek segítségével, rövid mérési idejüknek köszönhetıen, a fehérje adszorpció folyadékcellákban in situ is nyomon követhetıvé vált.
8
3. Célkitőzés A tanszéken korábbi munkák során a PLA és különbözı PLGA-k hidrofóbicitásának csökkentését vizsgálták, ami feltétele, hogy eredményesen alkalmazhassák ezeket a rendszereket kolloidális gyógyszerhordozóként. A polimerek különbözı Pluronic-okkal (PEO-PPO-PEO blokk-kopolimerek) készített keverékeibıl szilárd hordozón oldatból terítés (solvent casting) technikával filmeket hoztak létre. A technika lényege, hogy a hordozóra felvitt polimer oldatot lezárt gıztérben, lassan hagyják elpárologni. Az így készült mintáknak vizsgálták a nedvesedési tulajdonságaikat és felületi összetételüket [13]. Vizsgálták továbbá ezen rendszerek felületi tulajdonságait Langmuir-mérleg segítségével, ezeket a Langmuir-filmeket modellként használva összehasonlították különbözı Pluronic-ok hatását a fehérje adszorpcióra [18]. Jelenlegi célunk, hogy folyadékcellában in situ ellipszomteriás mérésekkel nyomon kövessük a PLGA és Pluronic keverékébıl álló felületen a fehérje adszorpció mértékét, és számszerően meghatározzuk az adszorbeált mennyiségeket. Mivel a mérésekhez elegendıen vékony rétegek szükségesek, ezért forgótárcsás (spin-coating) technikával néhány tíz nm vastagságú filmeket hozunk létre szilíciumhordozón a polimerekbıl. Az így készített mintákat az ellipszometriás mérések mellett nedvesedési tulajdonságaik, felületi
összetételük
modellrendszernek
az
és
morfológiájuk
elınye,
hogy
a
alapján felületi
is
jellemezzük.
réteg
összetétele
Ennek
a
pontosan
meghatározható, a film változása a vizes közeggel való érintkezés során érzékelhetı. A fehérje adszorpció mértéke és kinetikája is nyomonkövethetı, és megismerhetı a kapcsolat a felület morfológiája és az adszorpciós tulajdonságok között.
9
4. Kísérleti rész 4.1. Felhasznált anyagok PLA, PLGA polimerek (1. táblázat) Polimer neve
Glikolsav tartalom / %
Polimer jelölése
M/ g/mol
poli(tejsav)
-
DL-PLA
106000
25
PLGA75/25
poli(tejsav / glikolsav) poli(tejsav / glikolsav)
50
90000126000 50000PLGA50/50 75000
Származás Sigma-Aldrich, Németország Sigma-Aldrich, Németország Sigma-Aldrich, Németország
1. táblázat A felhasznált PLA, PLGA polimerek Pluronic®, PEO-PPO-PEO blokk-kopolimerek (2. táblázat), BASF Hungaria Kft. Anyag megnevezése EO/PO/EO monomer arány Pluronic® 6100 3/30/3 Pluronic® 6400 13/30/13 Pluronic® 6800 56/30/56 Pluronic® 12700 97/63/97
Mw / g/mol 2000 2870 6710 9430
2. táblázat A felhasznált Pluronic®-ok Diklór-metán, HPLC tisztaságú, LGC Promochem Kénsav, 96%, laboratóriumi célra, Molar Chemicals Kft. Hidrogén-peroxid, 30%, technikai, Molar Chemicals Kft. Etanol, 96%, technikai, Molar Chemicals Kft. Marha szérum albumin (BSA), liofilizált, V. frakció, M = 66000 Merck Kft. Na2HPO4 és KH2PO4, p.a., Riedel de Haën NaCl, p.a., Riedel de Haën KCl, p.a., Radelkis Kft. Kétszer desztillált víz, γ > 71,5 mN/m Az ellipszometriás mérések során használt PBS puffer készítése: 728 cm3 11,876 g/l Na2HPO4-oldat és 272 cm3 9,078 g/l KH2PO4-oldat összeöntésével a pH = 7,4 [21]. Kiizzított NaCl-ot és és KCl-ot felhasználva fiziológiás sókoncentrációt állítottunk be a pufferben: 0,137 mol/dm3 NaCl, 0,0027 mol/dm3 KCl. A PBS puffer ionerıssége: 0,340 mol/dm3. 10
4.2. Mintakészítés A kísérleteket különbözı PLGA polimerekkel (PLGA50/50, PLGA75/25, PLA-DL), és ezek Pluronic-okkal (Pluronic 6100 / 6400 / 6800 / 12700), alkotott keverékeivel végeztük. A PLGA-kat és a Pluronic-okat diklór-metánban oldottuk, majd a megfelelı arányokban összekevertük. A mintákat spin-coating technikával állítottuk elı szilícium felületen. A módszer lényege, hogy kis mennyiségő oldatot a hordozóra juttatva, majd a hordozót nagy fordulatszámon pörgetve, a folyadék, a tehetetlenségébıl adódó centrifugális "erı" hatására szétterül a felületen és egyenletes filmet képez. A szilíciumlapokat vizes, abszolút etanolos, majd diklór-metános mosogatást követıen 30%-os hidrogén-peroxid és tömény kénsav 1:2 térfogatarányú frissen készített oldatába helyeztük legalább 4 órára, általában egy éjszakára. A savból kivéve a lapokat kétszer desztillált vízzel alaposan átmosogattuk, majd felhasználásig kétszer desztillált vízben, lezárt edényben tároltuk. A polimer filmek készítése elıtt a lapokat friss kétszer desztillált vízzel ismételten átmostuk, majd exszikkátorban vízlégszivattyúval elıállított vákuumban, szilikagél szárítószer mellett két órán keresztül szárítottuk. Az elıkészített lapokat rögzítettük a spin-coaterben, majd programozható automata Hamilton fecskendı segítségével juttattuk a polimerek diklór-metános oldatait a felületre. Az oldatok felvitele után azonnal indítottuk a minták forgatását 4000 fordulat/percen. A különbözı mérési módszerekhez eltérı nagyságú szilíciumlapokra volt szükség, így ennek megfelelıen a szükséges oldatmennyiség is különbözı (3. táblázat). Vizsgálati módszer Nedvesedés Ellipszometria AFM XPS
Szilíciumlap mérete / cm 2,0 x 2,0 2,0 x 6,5 1,5 x 1,5 1,0 x 1,0
Oldatmennyiség / µl 150 200 100 75
3. táblázat Az egyes vizsgálati módszerekhez használt szilíciumlapok mérete és a felhasznált oldatmennyiség A diklór-metán gyors párolgása miatt a minták szinte azonnal megszáradnak. Az elkészített filmeket szárítószekrényben 4 órán át 60 °C-on hıkezeltük, elısegítve ezzel a Pluronic®-kal módosított mintákban a felületaktív anyag felületen való dúsulását, illetve az oldószermaradékok elpárolgását. A hımérsékletet úgy választottuk meg, hogy a polimerek üvegesedési hımérsékletei fölött legyen.
11
A továbbiakban a minták elnevezésekor a készítésükhöz használt oldatok koncentrációit is feltüntetjük. 4.3. Vizsgálati módszerek 4.3.1. Nedvesedés mérés Az elıállított felületek nedvesedési tulajdonságait az OCA15+ (Dataphysics, Németország) felületi feszültség- és peremszögmérı készülékkel mértük (4. ábra).
4. ábra Az OCA15+ készülék sematikus rajza A berendezés függı-, vagy ülıcseppek profiljának elemzésébıl peremszögek, illetve felületi feszültség meghatározására alkalmas. A méréshez használt kétszer desztillált vízbıl (γ > 71,5 mN/m) 4 µl végtérfogatú cseppet képeztünk Hamilton fecskendı tőjének végén, számítógép-vezérelt folyadékadagoló segítségével 0,5 µl/s sebességgel. A kialakított cseppet a felülethez érintve levettük, majd 10 s elteltével a cseppbıl 1,6 µlt leszívtunk és a tőt ezután is kiemeltük a cseppbıl, elkerülendı a tőnek kis térfogatoknál fellépı jelentıs alaktorzító hatását. A folyamatot digitális videokamerával rögzítettük, és a felvételekbıl a peremszögeket az SCA20 (Dataphysics, Németország) program segítségével elliptikus profil illesztéssel határoztuk meg. A cseppek térfogati állandóságának biztosítása érdekében a méréseket zárt üveg küvettában végeztük, melynek az alját vízzel átáztatott szőrıpapírral béleltük, így biztosítva a telített gızteret. Egy-egy rendszeren 8-9 párhuzamos mérést végeztünk. A haladó peremszögek meghatározása a kezdetben kialakult cseppekrıl készült felvételekbıl, míg a hátráló peremszögeké a leszívást és az ezzel járó peremvonal elmozdulást követıen a tő kiemelése után történt. A Hamilton fecskendıt kétszer desztillált vizes áztatással és mosogatással tisztítottuk. 12
4.3.2. Röntgen-fotoelektron spektroszkópia A polimer minták felületi rétegének kémiai összetételét röntgen-fotoelektron spektroszkópiával (XPS) jellemeztük. A módszer röntgen fotonoknak az anyaggal bekövetkezı kölcsönhatásán alapszik (5. ábra).
5. ábra Az XPS készülék sematikus rajza A sugárzás a vizsgált atomok törzselektronjait is képes eltávolítani, és a kilépı elektronokat tudjuk detektálni. A folyamat energia mérlege: hν = Ei + E kin + Φsp ,
ahol hν a besugárzó röntgen-foton energiája, Ei ionizációs energia, Ekin az elektron kinetikus energiája és Φsp a spektrométer kilépési munkája. hν és Φsp ismeretében, valamint Ekin-t mérve megkaphatjuk a minta atomjainak ionizációs energiáit. Ezek alapján meghatározható a felületi réteg atomi összetétele. A kvalitatív és kvantitatív kémiai analízis mellett, mivel az ionizációs energiát befolyásolja a kémiai környezet, a kapott spektrum felhasználható a minták kémiai összetételének jellemzésére. A módszer rendkívül felületérzékeny, mivel a kilépı elektronok közepes szabad úthossza szilárd anyagokban igen kicsi, λ = 1-3 nm közötti tartományba esnek, így a detektorba jutó elektronok 90%-a kevesebb, mint 3λ mélységbıl érkezik (5-10 nm) [22]. XPS mérésekkel követtük a felületi réteg összetételének megváltozását PLGA50/50 esetében. Ehhez felvettük a 10 g/l PLGA50/50 oldatból készült, illetve a 10 g/l PLGA50/50 mellett 1 g/l különbözı Pluronic-ot tartalmazó filmek XPS-spektrumát. 13
Vizsgáltuk továbbá az ellipszometriás méréseknél alkalmazott 10 g/l PLGA75/25 és 10 g/l PLGA75/25 + 1 g/l Pluronic 12700 rendszerek fehérje megkötı képességét, melynek során az elıállított felületeket 30 percre különbözı koncentrációjú (0,6, 1,2, 1,8, 2,4 g/l) BSA-oldatokba helyeztük, majd ezt követıen kétszer desztillált vízzel kétszer mostuk. A spektrumok felvétele Kratos XSAM800 készülékkel történt. Az áttekintı spektrumokat 0 és 1150 eV között 0,5 eV lépésközzel, míg az O 1s, C 1s, N 1s, Si 2p csúcsokat 0,1 eV lépésekkel detektáltuk. Elıször mindig a C 1s csúcsot mértük meg, mivel a hosszan tartó röntgen besugárzás kismértékő intenzitásváltozást okoz a szénspektrumban. Az adatokat Kratos VISION 2000 program segítségével dolgoztuk fel, az átlapoló csúcsokat Shirley típusú háttérkorrekció után Gauss-csúcsokat alkalmazó csúcsszintézis-módszerrel bontottuk fel. Az atomarányok számítását az XPS MultiQuant program segítségével végeztük. 4.3.3. Atomi erı mikroszkópia
Az
atomi
erı
mikroszkópia
(AFM)
felhasználható
különbözı
felületek
szerkezetének, morfológiájának vizsgálatára. Az AFM érzékelıje egy ismert erıállandóval rendelkezı kis laprugóra rögzített apró, hegyes tő (görbületi sugara < 10 nm), mellyel a minta felületét végigpásztázzák. A tő és a felület között a távolság függvényében vonzó, vagy taszító erık lépnek fel, melynek hatására a rugó elhajlik. A rugó mozgásának követésére egy lézer dióda fényét a rugó hátoldalára fókuszálják, és a visszavert fénynyalábot egy négy részre osztott detektorba vezetik. A készülék fontos egysége a piezoelektromos mozgató rendszer. A minta mozgatása x, y irányban történik, míg a tő ettıl függetlenül z irányban mozoghat. A mőszerrel a felületek nm-es felbontású, 3 dimenziós leképezése valósítható meg (6. ábra).
14
6. ábra Az AFM készülék sematikus rajza 10 g/l PLGA75/25 és 10 g/l PLGA75/25 + 1 g/l Pluronic® 12700 filmek felületét vizsgáltuk
PSIA
Inc.
XE-100
készülékkel.
A
minta
jellegébıl
adódóan
szobahımérsékleten, szilárd/levegı határfelületen, kontakt módban mértünk. A méréshez CSC38-as (MikroMasch) típusú, Si3N4 anyagú, hátoldalán alumínium reflektáló felülettel borított pásztázó tőt használtunk, mely kis rugóállandójának (átlagosan 0,05 N/m) köszönhetıen különösen jó a polimer minták jellemzéséhez. A mérések 3-4 véletlenszerő módon kiválasztott helyen történtek. Felvétel készült mindkét rendszerrıl hıkezelés elıtt és után, valamint a keverék rétegrıl egy órás, PBS pufferben való áztatás után. A mintákról 100 µm x 100 µm-es és 20 µm x 20 µm-es felvételek készültek. A rétegvastagság meghatározása céljából vékony, fém fecskendıtővel óvatosan megkarcoltuk a mintákat, és a réteg vastagságát az így nyert tiszta szilícium szintjéhez viszonyítva határoztuk meg. A mérési eredményeket a XEI 1.6 (PSIA Inc., Dél-Korea) programmal értékeltük ki. 4.3.4. Ellipszometria
Az elıállított felületek fehérje megkötı képességét folyadékcellában, ellipszometriás módszerrel követtük. Amikor a fény két eltérı törésmutatójú közeg határfelületén reflektálódik, polarizációs állapota megváltozhat. Ennek mértéke a két közeg anyagi minıségének függvénye. Az ellipszometria ezt a polarizációváltozást méri. A fény E
15
elektromos térerısség vektora két független síkhullám komponensre bontható úgy, hogy az egyik párhuzamos ( Ep ), a másik merıleges ( E r ) a beesési síkra (a felülvonás a mennyiségek komplex voltát jelöli). Ekkor: 0 i ( ω t +δ s ) s
Es = E e
e
n −i ω r c
n −iω r 0 i ( ω t +δ p ) c p
és E p = E e
e
,
ahol ω a síkhullám frekvenciája, δ a fázisa, n = n − ik a közegbeli komplex törésmutató, c a vákuumbeli fénysebesség. Így a síkhullám polarizációs állapota a polarizációs
együtthatóval jellemezhetı:
χ=
Ep Es
.
Mindez a beesı sugár mellett a reflektáltra is felírható. A két sugár polarizációs együtthatójának hányadosa a komplex reflexiós tényezı (i index jelöli a beesı, r a reflektált sugárra vonatkozó mennyiségeket):
ρ=
χ r χ r i (δ = e χi χi
r −δ i )
= tan Ψ ⋅ e i∆ , ahol
∆ = δ r − δ i = (δ r , p − δ r ,s ) − (δ i , p − δ i ,s ) = (δ r , p − δ i , p ) − (δ r ,s − δ i ,s ) = ∆ p − ∆ s Ψ és ∆ az ellipszometriai mérés két független, a megvilágított mintára jellemzı paramétere. Ha a Ψ és ∆ értékeket nem csak egyetlen hullámhosszon, hanem egy hullámhossztartományon keresztül mérjük, spektroszkópiai ellipszometriáról beszélünk. Az így mért Ψ és ∆ spektrumokból visszakövetkeztethetünk a minta ismeretlen fizikai paramétereire (rétegvastagság, törésmutató, mikroszerkezet). Ezen paraméterek meghatározásához ismernünk kell a mintát alkotó összetevık törésmutatóját, emellett a minta mikrostruktúrájáról kell legyen valamilyen elızetes elképzelésünk, ami alapján felépíthetjük a mért spektrumra illesztendı optikai modellt. A feltételezett modell paramétereit numerikusan illesztenünk kell a mért Ψ(λ) és ∆(λ) görbékre. A
méréseket
Woollam
M2000DI
forgókompenzátoros
spektroszkópiai
ellipszométerrel végeztük. Minden mintának felvettük a spektrumát levegın, szárazon, a folyadékcella felhelyezését követıen szárazon, majd a folyadékkal feltöltve. A mért rendszerek: 10 g/l PLGA75/25 10g/l PLGA75/25 + 0,4 g/l Pluronic 12700 10g/l PLGA75/25 + 1 g/l Pluronic 12700 5 g/l PLGA75/25 + 0,2 g/l Pluronic 12700
16
5 g/l PLGA75/25 + 0,5 g/l Pluronic® 12700 Az in situ fehérje adszorpció vizsgálata három részre tagolódott. PBS pufferrel (pH = 7,4, I = 0,340 M , cNaCl = 0,137 mol/dm3, cKCl = 0,0027 mol/dm3) alapvonal felvétele 30 percen keresztül, ezt követte a 20 perces fehérje adszorpció, majd 10 perces lemosás a pufferrel. Az adszorpció vizsgálathoz négy különbözı koncentrációjú (0,3, 0,6, 1,2, 1,8 g/l) BSA pufferes oldatát (PBS) használtuk. A folyadék 0,128 cm3/perc sebességgel áramlott a cellában, melynek térfogata 5 cm3. Az oldatok cseréjekor nagy sebességgel néhány másodperc alatt átöblítettük az új oldattal a cellát. Az adatokat 191-1650 nm hullámhossz tartományban 3 másodpercenként győjtöttük, a mintavételezési idı 1 másodperc. A spektrumoknak csak a 300-900 nm-es tartományát használtuk az abszorpciós zavarások kiküszöbölése végett. Az adatgyőjtéshez és a kiértékeléshez a CompleteEASE (J. A. Woollam Co., Inc.) programot használtuk.
17
5. Eredmények és értékelésük 5.1. Mintakészítés A spin-coating technikával szilícium lapon létrehozott filmekkel szemben elsıszámú követelmény volt, hogy a film a lapot egyenletesen befedje, illetve a létrejött polimer réteg vastagsága elegendıen kicsi legyen. Ennek elérése kisebb nehézségekbe ütközött a diklór-metán oldószer rendkívüli illékonysága miatt, melyet sok próba árán, a technika finomításával sikerült megoldani. A mérésekhez felhasznált, a Kísérleti részben leírt módon készült minták szabad szemmel nézve egyenletesek lettek, az ellipszometriai mérések tanulsága szerint vastagságuk néhány nm-es hibán belül jól reprodukálható volt. A minták készítése során két különbözı koncentrációjú PLGA oldatot használtunk. Az 5 g/l-es oldatokkal vékony, ellipszometriai mérések szerint 20-30 nm vastagságú filmeket kaptunk. A nedvesedési mérések alapján azonban szükséges volt a töményebb 10 g/l-es PLGA oldatokra áttérni, az így kapott rétegek 80-90 nm vastagságúak lettek. A 4 órás 60°C-os hıkezelést követıen a Pluronic 6100-at és Pluronic 6400-at 1 g/l koncentrációban tartalmazó filmek egyenletessége megszőnt, foltosakká váltak, feltételezhetıen fázisszeparáció ment végbe. Ezeket a rendszereket a továbbiakban nem használtuk. A Pluronic 6800-at és Pluronic 12700-at tartalmazó filmekben nem látható változás a hıkezelés hatására.
5.2. Nedvesedési tulajdonságok Szilárd anyagok nedvesedését a legfelsı atomi réteg összetétele befolyásolja. Ez alapján, amennyiben a keverék rendszerekben a felületen dúsul a Pluronic, azt a peremszögek csökkenésébıl észlelnünk kell. Ezzel szemben a mintakészítési eljárás finomításával párhuzamosan végzett ellenırzı mérések alapján nem tapasztaltunk különösebb peremszög csökkenést az 5 g/l PLGA50/50 + 0,5 g/l Pluronic 6800 esetében, ahogyan az várható lett volna korábbi tanulmányok alapján hasonló rendszerekben [13]. Ellenırzésként a referenciaként használt tanulmányban közölt "solvent casting" technikával elıállított rétegeken is elvégeztük a mérést, melynek során a korábban közölt eredményekhez hasonló értékeket kaptunk (4. táblázat).
18
Módszer Rendszer
ΘA
σ
Spin coating
5 g/l PLGA 50/50
74,0
1,0
5 g/l PLGA 50/50 + 0,5 g/l Pluronic 6800
70,3
0,8
Solvent casting
5 g/l PLGA 50/50
74,7
0,6
5 g/l PLGA 50/50 + 0,5 g/l Pluronic 6800
54,3
3,1
78
<1,5
45
<1,5
Irodalmi PLGA 50/50 értékek PLGA 50/50 + 10% Pluronic 6800
4. táblázat A különbözı technikákkal készült PLGA50/50 felületek haladó peremszögei A tapasztalatok alapján feltételeztük, hogy a kisebb koncentrációjú, 5 g/l polimer tartalmú oldatok alkalmazása során nem alakult ki elég vastag réteg a hordozón, és ezért nem volt jelentıs a Pluronic felületi dúsulása. A továbbiakban ezért töményebb oldatokat használtunk: 10 g/l polimer + 1 g/l Pluronic. A mért polimer rendszerek haladó és hátráló szögeit az 5. táblázatban győjtöttük össze. Rendszer Tiszta 1 g/l Pluronic 6800 1 g/l Pluronic 12700 Tiszta PLGA75/25 1 g/l Pluronic 6800 (10 g/l) 0,4 g/l Pluronic 12700 1 g/l Pluronic 12700 Tiszta PLGA50/50 1 g/l Pluronic 6800 (10 g/l) 1 g/l Pluronic 12700 DL-PLA (10 g/l)
ΘA
σA
ΘR
σR
69,8 60,6 54,9 69,5 55,8 68,8 51,6 71,8 54,5 55,5
0,6 1,4 1,9 2,1 2,0 0,3 1,2 1,2 2,4 1,3
69,7 64,7 50,1 67,8 54,9 52,9 42,7 63,5 48,6 52,4
0,5 0,8 2,5 0,6 1,5 0,6 1,9 0,5 2,0 1,7
5. táblázat Víz haladó és hátráló peremszöge a vizsgált polimer filmeken, valamint a szórásuk Több esetben a hátráló peremszögek nagyobb értékőek, mint a megfelelı haladó szögek, illetve sokszor ahhoz nagyon közeliek. Ez alapján feltételezhetı, hogy a felületen bekövetkezik valamilyen változás a mérés során. Próbaként desztillált vizes mosásnak tettük ki a mintákat, majd szárítás után ismételten megmértük a peremszögeket. Ekkor a haladó peremszögek a tiszta polimeréhez hasonló eredményeket mutattak. Ebbıl arra lehet következtetni, hogy a felület legfelsı rétegében lévı vízoldható felületaktív anyag részben kioldódik a filmbıl. 19
75 70 65 ΘA
módosítatlan 60
10% PE6800 10% PE12700
55 50 45 0
20
40
60
Glikolsav-tartalom %
7. ábra A haladó peremszög alakulása a PLGA glikolsav-tartalma és az alkalmazott Pluronic függvényében A Pluronic 6800 és 12700 jelentıs hidrofilitás növelést idézett elı a felületben. Az eredmények alapján az ellipszometriás mérésekhez a PLGA75/25 + Pluronic 12700 rendszert használtuk, mivel itt tapasztaltuk a hidrofilitás legnagyobb növekedését.
5.3. Felületi összetétel A szilíciumhordozóra felvitt PLGA rétegeket a felületanalitikai XPS mérés eredménye szerint szén és oxigén alkotja (hidrogén mellett). Nem detektáltunk egyik minta esetében sem szilíciumot, ami szerint a polimer teljesen beborítja a felületet. Két összetett csúcsot kaptunk, a C 1s csúcsot 285 eV körül és az O 1s csúcsot 532 eV körül. A polimerek szerkezeti tulajdonságaiból adódóan a szén csúcs 4, míg az oxigén csúcs 2 komponensre bontható az adott atom eltérı kémiai környezetének megfelelıen (8. ábra).
20
2
O H
O
3
1
H O C2
3
CH3
O
H2 C
OH
2
HO
1 1
2
n
H2 C 4
1 4
C H2
H2 H C C 4 O 1 CH3
H2 C
4
O n
4
m
1 4
C H2
O
H n
1
PLGA
Pluronic 8. ábra A PLGA és a Pluronic szerkezeti képlete, a különbözı típusú szén és oxigén atomok jelölésével A CH komponens elektronjai (284,5 eV) a tejsav egységek metil csoportjaiból származnak, de ez a CHx jellegő, mindig elıforduló szennyezıdések miatt nagyobb lehet, így a mennyiségi kiértékeléshez nem használtuk [13]. A 288,8 eV-nál jelentkezı komponenst a PLGA-ból származó karboxilos csoporthoz (C=OO, 3. típusú), a 286,5 eV-nál jelentkezıt pedig a karboxil csoport oxigénjéhez kapcsolódó szénatomhoz rendeltük (C-O, 2. típusú). A Pluronic étercsoportjaiból származó szénjel kisebb kötési energiánál jelentkezik, mint a 2. típusú szén. A jól mérhetı 0,8 eV-os energiakülönbség lehetıvé teszi, hogy a Pluronic-ból és a PLGA-ból származó jeleket egymástól függetlenül meghatározhassuk (9. ábra). Az O 1s csúcs a két eltérı kötési energiánál jelentkezı komponense megfelel a kémiai szerkezetnek, hiszen az oxigén elektronjainak energiaállapota változó, annak megfelelıen, hogy az oxigén atom egyszeres, vagy kétszeres kötéssel kapcsolódik a szénatomhoz. A tiszta PLGA50/50 kémiai összetétele jól tükrözıdik a kvantitatív XPSanalízisben, ugyanis a 2. és 3. típusú szénatomok és a megfelelı oxigénatomok aránya mérési hibán belül 1:1:1:1-nek adódott.
9 .ábra 10 g/l PLGA50/50 (baloldali) és 10 g/l PLGA50/50 + 1 g/l Pluronic 12700 (jobboldali) minták C 1s spektrumai
21
A 6. táblázat a tiszta PLGA50/50 és a Pluronic-kal kevert filmek spektrumaiból a fent leírt csúcsfelbontás alapján meghatározott összetételt atomszázalékban kifejezve tartalmazza.
Rendszer 10 g/l PLGA50/50 10 g/l PLGA50/50 + 1 g/l Pluronic 6800 10 g/l PLGA50/50 + 1 g/l Pluronic 12700
C(C=OO) C(C-O) C(C-O-C) C(C-H) O(O-C) O(C=O) (2) (3) (4) (1) (2) (1) 288,8eV 286,5eV 285,4eV 284,5eV 533,5eV 531,9eV 20,9 21,7 0 16,5 20,1 20,6 14,2
19,6
14
15
13,8
23,4
14,6
20,8
11,8
17,8
13,7
21,3
6. táblázat A C 1s és O 1s csúcsok felbontásából kapott atom%-os összetétel A 10 g/l PLGA50/50 + 1 g/l Pluronic 12700 rendszerben, ideális keveredés esetén, ha a felületi rétegben a Pluronic koncentráció azonos a tömbfázissal, az éteres szén atomszázalékának a karboxilos szén negyedének kéne lennie. A mérés szerint az arány ennél jóval nagyobb, közel 1:1, tehát jelentıs felületi dúsulás következett be. A fehérje oldatban kezelt minták XPS-spektrumában jelentıs különbség az eddigiekhez képest, hogy megjelenik a N 1s csúcs is, melynek relatív intenzitásából az adszorbeált fehérje mennyiségére lehet következtetni. A módosítatlan PLGA75/25 felületen az alkalmazott BSA koncentráció növelésével nı a nitrogén csúcs intenzitása (7. táblázat). A 10 g/l PLGA75/25 + 1 g/l Pluronic 12700 kevert réteg spektrumában nem jelenik meg a N 1s csúcs. A kevert réteg esetén csak a két legtöményebb fehérje koncentrációjú oldatban áztatott mintát mértük meg. A kiértékelés során az oxigén csúcs felbontásához bevezettünk egy új komponenst a fehérjében lévı különbözı kémiai környezető oxigének figyelembe vételére. A C 1s csúcs komponenseit nem változtattuk, de ezekbıl már nem lehet kvantitatív információt kinyerni, mivel a polimer és a fehérje szénatomjaiból származó jelek összeadódnak. A N 1s csúcsot egykomponensőnek tekintettük (10 ábra).
22
10. ábra PLGA75/25 minta fehérje adszorpciót követıen felvett N 1s spektruma 10 g/l PLGA75/25 + 1 g/l Pluronic 12700
10 g/l PLGA75/25 cBSA / g/l 0,6 1,2 1,8 2,4
cBSA / g/l 0,6 1,2 1,8 2,4
N 1s 3,2 5,6 6,7 5,7
N 1s 0 0
7. táblázat Nitrogén atomszázalék a tiszta és a Pluronic 12700-al kevert felületen, az áztatáshoz használt BSA koncentráció függvényében Az XPS mérés alapján a 10 g/l PLGA75/25 + 1 g/l Pluronic 12700 összetételő felületen a 30 perces BSA oldatos áztatást követıen nincs kimutatható mennyiségben adszorbeált fehérje. Tehát a vizsgált BSA koncentráció tartományban a Pluronic 12700 10%-os
adagolásával,
a
PLGA75/25-ön
eredményesen
megakadályozható
a
fehérjekötıdés.
5.4. Felületi morfológia A 10 g/l PLGA75/25 és 10 g/l PLGA75/25 + 1 g/l Pluronic 12700 mintákról készült topográfiai képek legszembetőnıbb tulajdonsága a felület barázdáltsága. A hullámos felületen esetenként akár 30-50 nm-es szintkülönbségek is láthatók. Ez a szerkezet a minta készítésekor használt 10 g/l-es polimer oldat nagy viszkozitásának és az oldószer illékonyságának köszönhetıen a hirtelen fellépı erıhatások miatt alakulhatott ki (11.ábra). A PLGA75/25 minta felületének barázdáltságából adódó átlagos érdessége,
23
Ra= 10,7 nm. Ez a vizsgált felület magasságpontjaiból a következı szerint megadható mennyiség: Ra =
1 N ∑ z j . Fontos hangsúlyozni, hogy bár az ábrák igen jelentısnek N j =1
ábrázolják a felületi egyenetlenségeket, a valóságban ezek rendkívül elnyúló lankáknak tekinthetık, a közelítı hullámhosszuk 50 µm, vagyis kb. ezerszerese az amplitúdónak.
11. ábra 10 g/l PLGA75/25 minta topográfiai képe és három keresztmetszeti profilja A Pluronic-kal kevert mintán is látható hullámzás a tiszta polimeréhez képest kisebb amplitúdójú. A felület átlagos érdessége, Ra = 7,1 nm. A felület leginkább szembetőnı képzıdményei a néhány száz nm átmérıjő és akár 100-200 nm magasságú kitüremkedések, melyek a tiszta PLGA filmen nem voltak megfigyelhetık (12. ábra).
24
12 . ábra 10g/l PLGA75/25 + 1 g/l Pluronic 12700 minta hıkezelés nélkül (baloldali) és hıkezelés után (jobboldali) Ezek a képzıdmények feltehetıen a felületben dúsuló és részben külön fázist alkotó Pluronic-ból származnak. Ezt alátámasztja, hogy a hıkezelés hatására jelentısen megnı a számuk, vízszintes és függıleges kiterjedésük. További bizonyíték, hogy az egy órás áztatást követıen gyakorlatilag teljesen eltőnnek a felületrıl a kiemelkedések, mely alátámasztja, hogy a minták legfelsı rétegébıl kioldódik a Pluronic (13. ábra).
25
13. ábra 10 g/l PLGA75/25 + 1 g/l Pluronic 12700 hıkezelt minta 1 órás pufferes áztatást követıen Az AFM mérések alapján meghatározott rétegvastagságokat a 8. táblázatban győjtöttük össze. A kapott értékek nagy szórása a nagy mértékő felületi egyenetlenségekbıl adódik. Az adatok alapján a réteg folyadék hatására jelentıs mértékben megduzzadt, melyet az ellipszometriás mérések is alátámasztanak. Minta 10 g/l PLGA75/25 10 g/l PLGA75/25 + 1 g/l Pluronic 12700
nem hıkezelt hıkezelt nem hıkezelt hıkezelt hıkezelt, áztatott
d / nm 132 120 72 67 103
σ / nm 20 21 8 8 16
8. táblázat AFM mérésekbıl meghatározott rétegvastagságok
5.5. Fehérjeadszorpció A spektroszkópiai ellipszometriás spektrumokból a minta fizikai paramétereinek meghatározásához ismernünk kell a mintát alkotó anyagok törésmutatóját, és elızetes elképzeléssel kell legyünk a vizsgált réteg mikroszerkezetérıl. Sok esetben a mintát valamilyen ismeretlen törésmutatójú anyag alkotja, illetve gyakran nem tudjuk,
26
pontosan milyen irodalmi törésmutatót kellene felhasználnunk. A második feltételnek sem tudunk általában pontosan megfelelni, hiszen ha ismerjük is a közegeket alkotó anyagokat, ezek sokféleképpen összeállhatnak, és így a legkülönfélébb optikai tulajdonságokkal bíró vékonyrétegeket hozhatják létre. Ilyen esetekben használhatóak a különbözı közelítı törésmutató modellek. Az egyik elterjedten használt, egyszerőbb modell a Cauchy-függvény. Ennek alapja az a feltételezés, hogy a szilárd anyag független lineáris oszcillátorok összegeként jellemezhetı. Ekkor a törésmutató a következı sorösszeggel adható meg: n (λ ) = ∑ j
Bj
λ2 j
,
illetve a gyakorlatban: n (λ ) = A +
B
λ
2
+
C
λ4
ahol A, B, C együtthatók a modell illesztendı paraméterei. A sor elsı tagja adja a törésmutatót, a többi ennek a diszperzióját határozza meg. A harmadik Cauchy paraméter, C, az esetek többségében elhanyagolhatóan kicsi, így a változó paraméterek számának csökkentése érdekében nullára lerögzítjük. A szilíciumhordozóra felvitt polimer réteget a Cauchy-modellel írtuk le. A minták általános optikai modellje az 14. ábrán látható.
Cauchy réteg /PLGA/
Natív oxidréteg
Szilícium tömbfázis
14. ábra Szilíciumhordozón lévı PLGA film optikai modellje A polimer rétegnek megfelelı Cauchy-modellnek két fı paramétere van, a rétegvastagság (d), és a komplex törésmutató: n~ = n + ik , ahol n a Cauchy-egyenlettel leírható valós törésmutató (változó paraméterei A és B), k pedig az extinkciós koefficiens, mely a fény abszorpcióját írja le a közegben: 1 1
κ 2 ⋅12400⋅ − λ l
k ( λ ) = κ1 ⋅ e
.
27
A kifejezésben csak a κ1 és κ2 paraméterek változók, l rögzített érték, az a hullámhossz, ahol az extinkciós koefficiens egyenlı a κ1-el. A modellben látható átmeneti natív SiO2 réteg vastagságát tiszta szilícium lapok spektrumából határoztuk meg. A különbözı mérési pontokban a vastagság értékek gyakorlatilag megegyeztek: doxid = 1,66 nm. A késıbbi paraméterbecsléseknél ezt a rögzített értéket használtuk. A kiértékelés ideális esetben három fı lépésben zajlott volna. Elıször meghatározzuk levegın a minta paramétereit, összesen 5 paramétert illesztünk: d, A, B, κ1, κ2. Ezután a száraz mintán, a folyadékcella felhelyezését követıen felvett spektrum kiértékelésekor, a réteg paramétereit lerögzítjük. A cella ablakainak kismértékő torzítását két paraméterrel vettük figyelembe. Az ablakkorrekcióra azért van szükség, mert a fény szinte soha nem pontosan merılegesen esik rá az üvegre, így kismértékő fénytörést szenved. Ekkor két paraméterre illesztünk. Ezt követıen a cella pufferrel történı feltöltése után kezdıdött az in situ mérés. Az alapvonal felvételekor a modellünket annyiban változtatjuk, hogy a közeg törésmutatójának a PBS puffer refraktométerben megmért törésmutatóját adjuk meg. A kiértékelések során nPBS = 1,3351 értéket használtuk. Az alapvonal kiértékelésekor a rétegvastagságot és a valós törésmutató Cauchy paramétereit illesztettük. A fehérjeadszorpció kezdetekor a polimer réteg paramétereit az alapvonal kiértékelésénél kapott átlagos értékeken lerögzítjük. Az adszorbeált fehérje figyelembe vételéhez egy új Cauchy réteget helyezünk el a polimer réteg fölé, melynek csak a rétegvastagságát és az elsı Cauchy paraméterét (A) hagyjuk változni (15. ábra). A második Cauchy paraméter értékét (B) lerögzítjük 0,01 értékre, mely közelítıen jól írja le a fehérjék diszperzióját. A réteg abszorpcióját elhanyagoljuk, tehát k paraméterei nullára rögzítettek. Cauchy réteg /BSA/
Cauchy réteg /PLGA/
Natív oxidréteg
Szilícium tömbfázis
15. ábra Fehérjeadszorpció során használt rétegmodell
28
Mindez azonban több oknál fogva nem volt megvalósítható, ugyanis a minták felülete nem tekinthetı egyenletesnek, helytıl függıen több nm-es eltéréseket mértünk, tehát nem indokolt az ablakkorrekció meghatározásakor a polimer réteg paramétereinek rögzítése, hiszen a két mérés között a minta mindig elmozdul. Ekkor azonban az ablakkorrekció paramétereinek illesztése során már 7 paramétert kéne illesztenünk. Egy 7 paraméteres függvény illesztésekor a program gyakorlatilag minden újbóli illesztéskor különbözı eredményeket adott, tehát a kapott értékek nem megbízhatóak. Közelítı megoldásként megmértük az ablakkorrekciót tiszta szilícium lapon is, hiszen ebben az esetben a felület ténylegesen homogénnek tekinthetı. A további értékelésekhez az így kapott korrekciós tényezıket használtuk. A másik ennél is nagyobb probléma, hogy a mérések szerint a felület a pufferben idıben nem állandó, a rétegvastagság és a törésmutató is változik. A kiértékelést ennek megfelelıen az alábbi módon végeztük. A független mérésben megállapított ablakkorrekciós paramétereket felhasználva az alapvonal felvételének 15. percében illesztettük a polimer réteg vastagságát és a komplex törésmutató négy paraméterét. Ezt követıen lerögzítettük a kapott extinkciós koefficiens két paraméterét, így csak három paramétert illesztettünk a továbbiakban (d, A, B). Ezeket a paramétereket meghatároztuk az alapvonal összes pontjára és ábrázoltuk ıket az idı függvényében. Az értékek a 20. perctıl általában már lineárisan változtak. A tiszta PLGA75/25 filmek esetében a rétegvastagság a teljes idıtartam alatt egyenletesen nıtt, mely a réteg lassú duzzadásával magyarázható. A kevert rendszerek esetén egy rövid kezdeti rétegvastagság növekedést követıen – mely általában csak akkor volt látható, ha a cella folyadékkal való feltöltését követıen elég gyorsan el tudtuk kezdeni a mérést – a rétegvastagság elıször gyorsan, majd lelassulva csökkenni kezdett (16. ábra). 130 129 128 127
d / nm
126 125 124 123 122 121 0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
t/s
16. ábra A Pluronic-kal kevert minta rétegvastagságának változása az alapvonal felvétele során
29
Az ábrán rendkívül meredeknek tőnı csökkenés az ellipszometriai mérések nagy pontosságát is jól mutatják. A rétegvastagság csökkenés a teljes vastagsághoz képest soha nem haladta meg a 10%-ot. Ez a viselkedés két ellentétes folyamat, az alap polimer lassú duzzadásából adódó növekedés és a Pluronic oldódásából származó rétegvastagság csökkenés együttes hatásával magyarázható. A kapott görbéket extrapoláltuk és ezeket a számított értékeket írtuk be a fehérje adszorpció során a leolvasandó idıpillanatokban a polimer paramétereiként, majd illesztettük a fehérje réteg két változó paraméterét (d, A). A kapott rétegvastagságokból és törésmutatókból a de Feitjer egyenlet szerint számíthatjuk ki az adszorbeált mennyiségeket [19, 20]:
Γ=
d ⋅ (n − nw ) , a
ahol d és n a fehérje réteg vastagsága, illetve törésmutatója, nw a közeg törésmutatója és
a=
∂n , a fehérje oldat törésmutató inkrementuma, mely BSA-ra λ = 436 nm-en 0,193 ∂c
cm3/g [23]. A 300s-nál és 900s-nál számított adszorbeált mennyiségeket a 9. táblázatban győjtöttük össze. Az egyes vizsgált rendszerek teljes adszorpciós görbéit 0,6 g/l BSA mellett a 17. és 18. ábrák mutatják be.
10 g/l PLGA75/25 10 g/l PLGA75/25 + 0,4 g/l Pluronic 12700 10 g/l PLGA75/25 + 0,1 g/l Pluronic 12700 5 g/l PLGA75/25 + 0,2 g/l Pluronic 12700 5 g/l PLGA75/25 + 0,5 g/l Pluronic 12700
t = 300s t = 900s t = 300s t = 900s t = 300s t = 900s t = 300s t = 900s t = 300s t = 900s
0,3 g/l BSA 0,999 1,098 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 0,758 0,922 < 0,05 0,271
Γ / mg/m2 0,6 g/l 1,2 g/l BSA BSA 1,189 1,174 1,296 1,299 0,467 0,689 0,585 0,772 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 1,576 1,62 1,727 2,228 1,255 1,398 1,431 1,397
1,8 g/l BSA 0,95 1,032 0,601 0,768 < 0,05 < 0,05 1,378 1,434 1,073 1,201
9. táblázat Adszorbeált BSA mennyiségek a vizsgált felületeken 300 és 900 másodpercnél, a négy alkalmazott fehérjekoncentráció esetén
30
1,4 1,2
Γ / mg/m
2
1,0 0,8 0,6 0,4
10 g/l PLGA75/25
0,2
10 g/l PLGA75/25 + 0,4 g/l Pluronic 12700
0,0 0
200
400
600
800
1000
1200
t/s
17. ábra BSA adszorpció az idı függvényében 10 g/l PLGA75/25 és 10 g/l PLGA75/25 + 0,4 g/l Pluronic 12700 felületeken
1,8 1,6 1,4
Γ / mg/m
2
1,2 1,0
5 g/l PLGA75/25 + 0,2 g/l Pluronic 12700
0,8 0,6
5 g/l PLGA75/25 + 0,5 g/l Pluronic 12700
0,4 0,2 0
200
400
600
800
1000
1200
t/s
18. ábra BSA adszorpció az idı függvényében 5 g/l PLGA75/25 + 0,2 g/l Pluronic 12700 és 5 g/l PLGA75/25 + 0,5 g/l Pluronic 12700 felületeken
31
A mérések tanulsága szerint a keverék polimer réteg vastagságának jelentıs hatása van a fehérje adszorpcióra. A vékonyabb rétegeken (5 g/l PLGA oldatból készült film) sokkal jelentısebb az adszorpció, mint a vastagokon. Ez feltehetıen abból következik, hogy az átlagosan 25 nm vastaságú rétegekben nincs elegendıen nagy mennyiségben jelen a Pluronic, így a felületi dúsulás is jóval kisebb mértékő, mint a vastag filmekben. Ezt a nedvesedés mérések is alátámasztják. Másrészt a víz képes behatolni a rétegbe és onnan fokozatosan kioldja a vízoldható Pluronic egy részét [24]. A vékony rétegekbıl a víz jobban ki tudja mosni a felületmódosító adalékot, ezáltal csökken a „fehérje taszító” hatás. A Pluronic koncentrációjának növelésével jól láthatóan csökken a megkötött fehérje mennyisége. A vastagabb rétegek (80 - 90 nm rétegvastagság, 10 g/l PLGA oldatból készült film) esetén ugyancsak jól látható a Pluronic hatása, olyannyira, hogy a 10 g/l PLGA75/25 + 1 g/l Pluronic 12700 filmen még a legtöményebb BSA oldatból sem adszorbeált érzékelhetı mennyiségő fehérjét. Ennek a rendszernek a spektrumaiban általában, de nem minden esetben, lehet látni a mért paraméterekben a fehérje oldat hatására egy kis változást. Ez azonban olyan kis mértékő, hogy a kiértékelés során nem látszik semmilyen rétegvastagság növekedés. Figyelembe véve, hogy a többi rendszer spektrumaiban már 0,05 mg/m2 felületi fehérjekoncentrációt is ki tudtunk mutatni, így ezen a rendszeren ennél kisebb mennyiségben kötıdik meg a BSA.
32
6. Összefoglalás Munkánk során különbözı poli(tejsav / glikolsav) kopolimerek és ezek Pluronicokkal alkotott keverék rendszereinek felületi tulajdonságait vizsgáltuk. A szilícium felületen a polimer filmeket forgótárcsás (spin coating) technikával hoztuk létre. Az így nyert mintákat a Pluronic adalék felületi dúsulásának elérése céljából 4 órás 60°C-os hıkezelésnek vetettük alá. A módszerrel sikerült az ellipszometriás mérésekhez megfelelı vastagságú és a készülék felbontó képességével összemérve egyenletes filmeket létrehoznunk szilíciumhordozón. A két különbözı koncentrációjú PLGA oldattal két jól megkülönböztethetı vastagság tartományba esı rétegeket tudtunk elıállítani. Az 5 g/l PLGA oldatokból 20-30 nm közötti vékony filmeket, míg a 10 g/l PLGA oldatból 80-90 nm-es vastagabb rétegeket hoztunk létre. A filmeken nedvesedés mérést végeztünk csepp-profil analízis segítségével, aminek alapján megállapítottuk, hogy a tanulmányozott hat polimer + Pluronic rendszer közül a PLGA75/25 polimer Pluronic 12700-zal alkotott keverék rendszernél tapasztalható a felületi hidrofilitás legnagyobb növekedése, amire a peremszög csökkenésébıl következtetünk (több mint 20°). A további mérésekhez ezt a rendszert választottuk. A mérésekbıl az is kiderült, hogy a rétegvastagság jelentısen befolyásolja a mért peremszögeket, mivel a vékonyabb filmekben nincs elegendı mennyiségő adalék és ezek felületi dúsulása nem jelentıs. Vízzel érintkezve a Pluronic egy része kioldódik a felsıbb rétegekbıl, ami a peremszögek növekedésében is tükrözıdik. A
polimer
filmek
felületi
rétegének
összetételét
rönteg-fotoelektron
spektroszkópiával határoztuk meg. A mintákon a polimer réteg egybefüggınek adódott, a spektrumokból hiányzik a Si 1s csúcs. A C 1s csúcsot a tiszta PLGA esetében három, a kevert filmnél négy komponensre lehetett felbontani. Egyenletes Pluronic eloszlás esetén, ha nincs felületi dúsulás, a Pluronic-ból származó éteres szén atomszázalékának a PLGA-ból származó karboxilos szén atomszázalékának a negyede kéne, hogy legyen. A mérések alapján azonban a kétféle szén atomaránya közel 1:1, vagyis a Pluronic igen jelentısen dúsul a felületi rétegben. Az atomi erı mikroszkópos felvételekbıl kiderül, hogy a polimer filmek feltehetıen a készítésükhöz használt oldat töménysége miatt nem lettek egyenletes vastagságúak, néhány tíz µm periódusú és néhány tíz nm amplitúdójú hullámok láthatók a felületen. Ennek következtében az AFM mérésekbıl megállapított rétegvastagságok nagy szórásúak. A kevert filmek felvételein látható kisebb különálló fázisok és ezek
33
számának, kiterjedésének a hıkezelés hatására bekövetkezı növekedése, valamint az áztatást követı eltőnése igazolják a Pluronic felületi dúsulását, illetve víz hatására a részleges kioldódását. Az ellipszometriás mérések alátámasztották, hogy a PLGA filmek vizes közegben duzzadnak, illetve a rétegvasagság változása alapján nyomonkövethetı a keverék rendszereknél a Pluronic részleges kioldódása. A mért spektrumok kiértékeléséhez sikerült felállítanunk egy olyan felületi modellt, mellyel a becsült értékekhez hasonló eredményeket kapnunk. Az in situ fehérjeadszorpciós mérések jól korrelálnak a nedvesedés mérés adataival. Az adszorbeált mennyiség a filmben lévı Pluronic mennyisége mellett függ a réteg vastagságától is. A vékonyabb rétegeken, melyekben nincs jelentısebb felületi Pluronic dúsulás, jelentısen nagyobb mértékő az adszorbeált fehérje mennyiség, mint a vastagabb rétegeken, tehát kevésbé érvényesül az adalék hatása. A vastagabb filmen a Pluronic koncentráció növelésével lényegesen nagyobb mértékben vissza lehet szorítani az adszorpciót, akár Γ = 0,05 mg/m2 alá. A 10 g/l PLGA75/25 + 1 g/l Pluronic 12700 oldatból elıállított rétegen gyakorlatilag elhanyagolható mértékben megy csak végbe fehérjeadszorpció.
34
7. Irodalomjegyzék [1]
I. Bertóti, Gy. Marosi, A. Tóth, Mőszaki felülettudomány és orvosbiológiai alkalmazásai, B+V (medical&technical) Lap- és Könyvkiadó kft., 11-12 (2003)
[2]
S. M. Moghimi, Biochim. Biophys. Acta, 1336, 1-6 (1997)
[3]
Z. Guo, S. Meng, W. Zhong, Q. Du, L. L. Chou, Appl. Surf. Sci. 255, 6771-6780 (2009)
[4]
K. Cai, K. Yao, Y. Cui, Z. Yang, X. Li, H. Xie, T. Qing, L. Gao, Biomaterials 23, 1603-1611 (2002)
[5]
E. Kutnyánszky, Gyógyszerhordozó polimer felületének kémiai módosítása és jellemzése, Szakdolgozat, ELTE Fizikai Kémiai Tanszék, 2008
[6]
D. A. Barrera, E. Zylstra, P. T. Lansbury, R. Langer, J. Am. Chem. Soc., 115, 11010-11011 (1993)
[7]
R. A. Quirk, M. C. Davies, S. J. B. Tendler, K. M. Shakesheff, Macromolecules 33, 258-260 (2000)
[8]
R. A. Quirk, M. C. Davies, S. J. B. Tendler, W. C. Chan, K. M. Shakesheff, Langmuir 17, 2817-2820 (2001)
[9]
Y. Cao, T. I. Croll, J. J. Cooper-White, A. J. O’Connor, G. W. Stevens, Production and Surface Modification of Polylactide-Based Polymeric Scaffolds for Soft-Tissue Engineering, In: A. P. Hollander, P. V. Hatton (Ed.), Biopolymer Methods in Tissue Engineering, Humana Press, 90-91 (2003)
[10] R. M. Ottenbritte, Frontiers in Biomedical Polymer Applications Volume 2, Technomic Publishing Company Inc., 20 (1999) [11] É. Kiss, K. Erdélyi, E. Szendrı, E. I. Vargha-Butler, J. Adhesion 80, 815-829 (2004) [12] H. J. Chung, H. K. Kim, J. J. Yoon, T. G. Park, Pharm. Res. 23, 1835-1841 (2006) [13] É. Kiss, I. Bertóti, E. I. Vargha-Butler, J. Colloid Interf. Sci. 245, 91–98 (2002) [14] Gy. Marosi, B. Marosfıi, Orvosbiológiai alkalmazások, In: I. Bertóti, Gy. Marosi, A. Tóth, Mőszaki felülettudomány és orvosbiológiai alkalmazásai, B+V (medical&technical) Lap- és Könyvkiadó kft., 225-235 (2003) [15] S. Kalasin, M. M. Santore, Colloids Surfaces B: Biointerfaces 73, 229-236 (2009) [16] B. D. Ratner, A. S. Hoffman, F. J. Schoen, J. E. Lemons, Biomaterials Science: An Introduction to Materials in Medicine, Academic Press, 470 (1996) [17] S. Logothetidis, Diamond & Related Materials 16, 1847-1857 (2007)
35
[18] É. Kiss, K. Dravetzky, K. Hill, E. Kutnyánszky, A. Varga, J. Colloid Interf. Sci. 325, 337-345 (2008) [19] C. Gölander, É. Kiss, J. Colloid Interf. Sci. 121, 240-253 (1987) [20] X. Wang, Y. Wang, H. Xu, H. Shan, J. R. Lu, J. Colloid. Interf. Sci. 323, 18-25 (2008) [21] Poly(L-lactide) resins and fabricated forms for surgical implants - In vitro degradation testing, ISO 13781:1997 [22] I. Bertóti, Röntgen-fotoelektron spektroszkópia, In: I. Bertóti, Gy. Marosi, A. Tóth, Mőszaki felülettudomány és orvosbiológiai alkalmazásai, B+V (medical&technical) Lap- és Könyvkiadó kft., 120-143 (2003) [23] J. Brandrup, E. H. Immergut, Polymer Handbook, John Wiley & Sons Inc.,VII/461 (1989) [24] T. G. Park, S. Cohen, R. Langer, Macromolecules 25, 116-122 (1992)
36
Köszönetnyilvánítás Szeretném megköszönni témavezetımnek, Dr. Kiss Évának a munkám során nyújtott odaadó segítségét, tanácsait és türelmét. Köszönöm Dr. Lohner Tivadarnak, Dr. Petrik Péternek és Dr. Kurunczi Sándornak, az MTA Mőszaki Fizikai és Anyagtudományi Kutatóintézet tagjainak, hogy lehetıvé tették az ellipszometriás méréseket és segítették munkámat. Köszönettel tartozom Dr. Mohai Miklósnak, az MTA Kémiai Kutatóközpont Anyag- és Környezetkémiai Intézet tagjának az XPS mérésekért, Pénzes Csanád Botondnak az AFM vizsgálatokért és Hórvölgyi Zoltánné Petı Idának az önzetlen segítségéért.
37
