FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra analytické chemie

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ

Katedra analytické chemie

Využití průtokových analytických metod pro stanovení biologicky aktivních látek

Disertační práce

Hradec Králové 2011

Mgr. Petra Koblová (roz. Žáková)

Prohlášení Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla použita k získání stejného, nebo jiného titulu.

2

Poděkování Ráda bych poděkovala svému školiteli prof. RNDr. Petru Solichovi, CSc. a PharmDr. Haně Sklenářové, Ph.D., školitelce specialistce, za jejich odborné vedení, motivaci ke studiu, cenné rady, péči po celou dobu mého postgraduálního studia, připomínky a inspiraci jak pro tvůrčí praktickou práci, tak při psaní odborných publikací. Dále bych ráda poděkovala PharmDr. Petru Chocholoušovi, Ph.D. a Doc. RNDr. Daliboru Šatínskému, Ph.D., kolegům z Laboratoře průtokové analýzy, kteří mi pomohli se seznámením s průtokovými metodami, hlavně s metodami SIA a SIC. Jejich zkušenosti se SIA technikou a především se softwarovým prostředím byly pro mne výborným základem pro rychlou orientaci a ovládání přístrojového vybavení. Díky patří také mým kolegyním PharmDr. Ludmile Matysové, Ph.D. a PharmDr. Lucii Havlíkové, Ph.D. za cenné rady a pomoc při řešení problémů v oblasti validací a HPLC metod. Mé poděkování patří samozřejmě i všem ostatním členům katedry za ochotnou pomoc kdykoliv jsem byla v nesnázích, za porozumění, rady, trpělivost a v neposlední řadě za příjemnou atmosféru po celou dobu mého doktorského studia. Děkuji grantové agentuře Univerzity Karlovy (GAUK) za finanční podporu mých výzkumných úkolů a za možnost prezentovat tyto výsledky na tuzemských i zahraničních konferencích. V neposlední řadě děkuji své rodině především za trpělivost a za to, že stáli při mně v dobrém i zlém a tím mi zpříjemnili dobu mého studia. Tato práce vznikla za podpory grantu SVV 263 002.

3

Abstrakt Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra: Analytické chemie Kandidát: Mgr. Petra Koblová Školitel: prof. RNDr. Petr Solich, CSc. Název disertační práce: Využití průtokových analytických metod pro stanovení biologicky aktivních látek Disertační práce se zabývá vývojem HPLC a SIC metod pro stanovení účinných látek a degradačních produktů ve farmaceutických přípravcích. Vyvinuté metody byly validovány a splňují všechny požadavky kladené na vhodnost, přesnost a správnost. V první práci byla vyvinuta metoda HPLC pro stanovení účinné látky klotrimazolu a příslušných nečistot (2-chlorfenyl)difenylmethanolu a imidazolu v přípravku Clotrimazol spray 1 %. Jako vnitřní standard byl použit ibuprofen. Cílem další práce bylo porovnat separační účinnost částicové kolony a monolitických kolon různé délky. K porovnání byla použita HPLC metoda stanovení indometacinu a jeho dvou rozkladných produktů. Ketoprofen byl použit jako vnitřní standard k hodnocení dat v průběhu celé studie. Byla vyvinuta metoda SIC pro stanovení ve vodě nerozpustných vitamínů (retinol acetát, D2, nebo D3 a tokoferol acetát). Nová SIC metoda s použitím monolitické kolony a UV spektrofotometrické detekce byla použita pro stanovení vitamínu D3 v léčivém přípravku Vigantol a vitamínů A, D2 v přípravku Vitamin AD Slovakofarma kapsle. Jako vnitřní standard pro kvantifikaci byl použit tokoferol acetát. Použitelnost a separační účinnost SIC a HPLC s gradientovou elucí byla demonstrována na separaci a současném stanovení účinné látky indometacinu a jeho

dvou

rozkladných

produktů

v topickém

farmaceutickém

přípravku

(Indobene gel 1 %). Ketoprofen byl použit jako vnitřní standard. Další práce se zabývala vývojem a validací HPLC metody pro stanovení účinné látky nonoxynolu a trimekainu v topických přípravcích - lubrikačních

4

gelech. Amitriptylin byl vybrán jako vnitřní standard. Vyvinutá metoda byla prakticky aplikována pro hodnocení přípravku LG non-stop. Poslední HPLC metoda, která je uvedena v této práci, popisuje stanovení kyseliny

askorbové,

fenylefrinu,

paracetamolu

a

kofeinu.

Byla

použita

monolitická kolona a UV detekce. Kyselina salicylová byla použita jako vnitřní standard. Optimalizovaná metoda byla aplikována na stanovení účinných látek ve farmaceutickém přípravku Coldrex tablety.

5

Abstract Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Analytical Chemistry Candidate: Mgr. Petra Koblová Supervisor: prof. RNDr. Petr Solich, CSc. Title of Doctoral Thesis: Using of flow analytical method for determination of biological active compounds The presented dissertation thesis is dealing with development of HPLC and SIC methods for determination of active substances and degradation products in pharmaceutical formulations. Developed methods were validated and meet all requirements for suitability, precision and reliability. In the first work, HPLC method for determination of active compound clotrimazole and its degradation products (2-chlorophenyl) diphenylmethanol and imidazole in Clotrimazol spray 1 % was developed. Ibuprofen was used as the internal standard. The aim of the next work was to compare separation efficiency particle based and monolithic columns with various lengths. HPLC method for determination of indomethacin and its two degradation products was used for comparison. Ketoprofen was used as an internal standard for data evaluation throughout the study. SIC method for determination of water-insoluble vitamins (retinol acetate, D2, or D3 and tocopherol acetate) was developed. The novel SIC method with the monolithic column and UV spectrophotometric detection was applied for the determinations of vitamin D3 in the pharmaceutical formulation Vigantol and vitamins A, D2 in the formulation Vitamin AD Slovakofarma capsules. Tocopherol acetate was used for quantification as an internal standard. Applicability and separation efficiency of SIC and HPLC with gradient elution was demonstrated on the separation a simultaneous assay of active compound indomethacin and its two degradation products

6

in topical

pharmaceutical formulation (Indobene gel 1 %). Ketoprofen was used as internal standard. Next work dealt with development and validation of HPLC method for determination of nonoxinol and trimecaine in topical formulations – lubricant gels. Amitriptyline was chosen as internal standard. The developed method was practically applied for evaluation of preparation LG non-stop. The last method that is mentioned in this work described determination of ascorbic acid, phenylephrine, paracetamol and caffeine. Monolithic column and UV detection were used. Salicylic acid was used as internal standard. Optimized method was applied for determination of active compounds in pharmaceutical formulation Coldrex tablets.

7

Disertační práce

Obsah

Obsah 1 Seznam použitých zkratek ..................................................................... 11 2 Úvod ....................................................................................................... 12 3 Cíl práce ................................................................................................. 13 4 Teoretická část....................................................................................... 14 4.1 Principy chromatografie ...................................................................... 15 4.1.1 Definice, princip a rozdělení chromatografických metod............................... 15 4.1.2 Vybrané pojmy a charakteristiky chromatografického procesu ..................... 15 4.1.2.1 Chromatogram ....................................................................................... 15 4.1.2.2 Retenční charakteristiky a distribuční konstanta........................................ 16 4.1.2.3 Účinnost separace v chromatografii ......................................................... 18 4.1.2.4 Rozlišení ................................................................................................ 22 4.1.2.5 Faktor symetrie ...................................................................................... 24 4.2 Kapalinová chromatografie.................................................................. 25 4.2.1 Definice kapalinové chromatografie............................................................ 25 4.2.2 Dělení HPLC ............................................................................................. 25 4.2.3 Instrumentální vybavení v kapalinové chromatografii .................................. 26 4.2.4 Stacionární fáze ........................................................................................ 28 4.2.4.1 Stacionární fáze na bázi silikagelu............................................................ 29 4.2.4.1.1 Stacionární fáze pro normální chromatografii ......................................... 29 4.2.4.1.2 Stacionární fáze pro reverzní chromatografii........................................... 30 4.2.4.2 Hybridní stacionární fáze ......................................................................... 31 4.2.4.3 Stacionární fáze na bázi oxidu zirkoničitého, hlinitého a titaničitého ........... 32 4.2.4.4 Stacionární fáze pro HILIC ...................................................................... 33 4.2.4.5 Polymerní stacionární fáze....................................................................... 34 4.2.4.6 Monolitické stacionární fáze..................................................................... 35 4.2.4.6.1 Makroporézní polymerní disky ............................................................... 35 4.2.4.6.2 Makroporézní polymerní kolony ............................................................. 36 4.2.4.6.3 Tubulární kolony s radiálním tokem ....................................................... 37 4.2.4.6.4 Komprimované gely.............................................................................. 37 4.2.4.6.5 Monolitické kolony z anorganických materiálů ........................................ 37 4.2.4.7 Nové trendy ve stacionárních fázích ......................................................... 39 4.2.4.7.1 Porézní částice menší než 2 mikrometry................................................. 40 4.2.4.7.2 Porézní částice s neporézním jádrem ..................................................... 41 4.2.4.7.3 Monolitické kolony High Resolution........................................................ 42 4.2.5 Mobilní fáze .............................................................................................. 42 4.3 Nízkotlaké průtokové metody.............................................................. 44 4.3.1 Definice a základní charakteristiky.............................................................. 44 4.3.2 Princip...................................................................................................... 44 4.3.3 Rozdělení průtokových metod .................................................................... 45

8

Disertační práce

Obsah

4.3.4 Průtoková injekční analýza ........................................................................ 45 4.3.5 Sekvenční injekční analýza ........................................................................ 47 4.3.6 Sekvenční injekční chromatografie ............................................................. 49 4.3.6.1 Definice sekvenční injekční chromatografie............................................... 49 4.3.6.2 Princip sekvenční injekční chromatografie ................................................ 50 4.3.6.3 Instrumentální vybavení v sekvenční injekční chromatografii ..................... 51 4.3.6.4 SIC aplikace ........................................................................................... 53 4.4 Porovnání HPLC a SIC .......................................................................... 57 5 Komentář k publikovaným pracím......................................................... 58 5.1 Optimalizace HPLC stanovení klotrimazolu ......................................... 59 5.2 Aplikace monolitických kolon ve farmaceutické analýze. Stanovení indometacinu a jeho degradačních produktů ...................................... 60 5.3 Separace vitamínů A acetátu, ergokalciferolu, nebo cholekalciferolu a tokoferolu acetátu pomocí sekvenční injekční chromatografie .......... 61 5.4 Tvorba gradientové eluce v sekvenční injekční chromatografii s využitím monolitických kolon............................................................ 62 5.5 Chromatografické stanovení účinných látek v topických přípravcích . 63 5.6 Vývoj a validace HPLC metody pro stanovení kyseliny askorbové, fenylefrinu, paracetamolu a kofeinu s využitím monolitické kolony... 64 6 Přehled všech publikovaných prací ....................................................... 65 7 Přehled přednášek a posterů ................................................................. 66 8 Přílohy I – publikace .............................................................................. 69 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6

Příloha 1 ............................................................................................... 70 Příloha 2 ............................................................................................... 76 Příloha 3 ............................................................................................... 84 Příloha 4 ............................................................................................... 96 Příloha 5 ............................................................................................. 102 Příloha 6 ............................................................................................. 110

9 Přílohy II – postery .............................................................................. 120 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7

Příloha 1 ............................................................................................. 121 Příloha 2 ............................................................................................. 123 Příloha 3 ............................................................................................. 125 Příloha 4 ............................................................................................. 127 Příloha 5 ............................................................................................. 129 Příloha 6 ............................................................................................. 131 Příloha 7 ............................................................................................. 133

10 Shrnutí................................................................................................ 135 9

Disertační práce

Obsah

11 Summary ............................................................................................ 137 12 Závěr .................................................................................................. 139 13 Seznam literatury............................................................................... 141

10

Disertační práce

Seznam použitých zkratek

1 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK BEH

Hybridní technologie silikagelu a polymeru (Bridge Ethylene Hybride)

FIA

Průtoková injekční analýza (Flow injection analysis)

GC

Plynová chromatografie (Gas Chromatography)

HILIC

Chromatografie hydrofilních interakcí (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography)

HPLC

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (High performance liquid chromatography)

LC

Kapalinová chromatografie (Liquid Chromatography)

LC - MS

Kapalinová

chromatografie – hmotnostní

spektrometrie

(Liquid

Chromatography – mass spectrometry) MF

Mobilní fáze (Mobile phase)

MS

Hmotnostní spektrometrie (Mass spectrometry)

MK

Monolitická kolona (Monolithic column)

NP

Normální fáze (Normal phase)

PBD

Polybutadien

PC

Papírová chromatografie (Paper Chromatography)

pH

Záporný dekadický logaritmus koncentrace vodíkových iontů

PS

Polystyren

RP

Reverzní fáze (Reverse phase)

RP-HPLC

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi

SIA

Sekvenční injekční analýza (Sequential injection analysis)

SIC

Sekvenční

injekční

chromatografie

(Sequential

injection

chromatography) SPE

Extrakce na tuhou fázi (Solid phase extraction)

SST

Test vhodnosti systému (System Suitability Test)

TLC

Tenkovrstvá chromatografie (Thin Layer Chromatography)

UV-VIS

Spektrofotometrie v ultrafialové a viditelné oblasti (ultra-violet and visible spectrometry)

8

Disertační práce

Úvod

2 ÚVOD

Farmaceutické přípravky jsou nejčastěji směsi účinných a pomocných látek. Pro jejich stanovení se s výhodou používají chromatografické separační metody, které umožňují zároveň stanovit jak jednotlivé účinné látky, tak i látky pomocné a případně i rozkladné produkty. Mezi takové metody patří např. HPLC, GC a nově také sekvenční injekční chromatografie (SIC). Farmaceutické přípravky se mohou vyskytovat v různých lékových formách (roztoky, tablety, masti, gely,...) a ve většině případů je před vlastním stanovením nutná předúprava vzorku. Někdy postačí pouhé naředění

vzorku

mobilní

fází

(či

jiným

rozpouštědlem),

jindy

je

úprava

složitější - extrakce organickým rozpouštědlem, centrifugace, SPE,... HPLC a SIC jsou průtokové separační chromatografické techniky, které se používají k separaci, identifikaci a stanovení směsi látek a to vše během jedné analýzy. Chromatografické metody jsou vysoce účinné separační techniky, při kterých dochází k dělení látek mezi dvě vzájemně nemísitelné fáze. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie je vysoce instrumentálně pokročilá separační technika. Je to metoda univerzální, robustní, citlivá (v závislosti na použitém detektoru) s možností automatizace. Využití automatického dávkovače umožňuje analýzy velkých sérií vzorků, což je výhodné pro rutinní využití metody. Rutinně se HPLC využívá ve všech typech analytických laboratoří zabývajících se kontrolou

léčiv,

monitorováním

kontrolou lékových

životního hladin,

prostředí,

toxikologií,

klinickým biochemií,

hodnocením analýzou

léčiv,

potravin,

diagnostikou markerů různých onemocnění či dědičných poruch. Sekvenční injekční chromatografie je nízkotlaká separační technika, která vzniká začleněním chromatografické kolony, nejčastěji monolitické kolony, do SIA systému. Díky své porozitě kladou monolity při průtoku minimální odpor, a proto k dosažení požadovaného průtoku dostačují nízkotlaké pístové pumpy. Právě použití monolitů umožňuje začlenění SIC do širší skupiny separačních technik, i když se zatím používá jen k výzkumným účelům.

12

Disertační práce

Cíl práce

3 CÍL PRÁCE

Cílem této disertační práce byl vývoj a validace HPLC a SIC metod pro stanovení účinných látek ve farmaceutických přípravcích. Některé metody byly určeny pro sledování stability léčiv a analyzovány byly i degradační produkty. Při optimalizaci metod byla práce zaměřena na výběr vhodné chromatografické kolony, složení mobilní fáze, jejího pH, vnitřního standardu, rychlosti průtoku mobilní fáze a objem vzorku. U metod SIC byl navíc optimalizován řídící program. Po optimalizaci jednotlivých metod byly tyto vždy validovány a tím ověřena vhodnost, správnost a spolehlivost nově vyvinutých metod. Cílem práce nebyl jen vývoj nových (HPLC a SIC) metod, ale také jejich vzájemné porovnání, ověření výhod a nevýhod SIC techniky oproti HPLC. Byly studovány a kriticky zhodnoceny možnosti přenosu vyvinuté a optimalizované HPLC metody na SIC techniku. Předmětem mé práce bylo otestovat možnost zapojení monolitických kolon do HPLC a SIC systému a aplikovat tyto metody v oblasti farmaceutických analýz a také porovnat separační účinnost konvenční částicové kolony a monolitických kolon a otestovat podmínky převodu metody z částicové na monolitickou kolonu. Cílenou snahou bylo vyvinout metodu sekvenční injekční chromatografie s gradientovou elucí a prakticky ji aplikovat na stanovení vybraného léčivého přípravku.

13

Disertační práce

Teoretická část

4 TEORETICKÁ ČÁST

14

Disertační práce

Principy chromatografie

4.1 Principy chromatografie 4.1.1 Definice, princip a rozdělení chromatografických metod Chromatografie je separační a současně analytická fyzikálně chemická metoda, sloužící k oddělení analyzovaných složek ze směsi. Svým určením je to především metoda kvalitativní a kvantitativní analýzy vzorku [1, 2]. Při chromatografickém procesu se mnohonásobně ustavuje rovnováha součástí analyzované směsi mezi dvěma vzájemně nemísitelnými fázemi. Jedna nepohyblivá stacionární fáze má schopnost různou měrou zadržovat jednotlivé součásti analyzované směsi, druhá pohyblivá mobilní fáze pak vymývá (eluuje) jednotlivé součásti směsi z nepohyblivé fáze a odnáší je ve směru toku různou rychlostí, čímž dojde k jejich oddělení [3]. Chromatografických

metod

je

velké

množství.

Vzhledem

ke

značné

různorodosti se dělí podle několika hledisek [1]: 1) Podle skupenství mobilní fáze (LC, GC) 2) Podle uspořádání stacionární fáze •

Kolonová chromatografie

•

Plošné techniky (PC, TLC)

3) Podle povahy děje, který převládá při separaci (rozdělovací, adsorpční, iontově-výměnná chromatografie, gelová a afinitní chromatografie)

4.1.2 Vybrané pojmy a charakteristiky chromatografického procesu

4.1.2.1 Chromatogram Záznam chromatogram.

odezvy Zóny

chromatografického separovaných

látek

detektoru

na

procházející

čase

se

detektorem

nazývá jsou

zaznamenávány jako koncentrační profily (chromatografické píky). V ideálním případě je chromatografický pík symetrický a má Gaussovský tvar [4]. 15

Disertační práce


Pokud je zkoumaná směs dobře rozdělena, pak každý pík na chromatogramu odpovídá jedné ze složek směsi. Poloha píku na ose x uváděná pomocí retenčního času (určeno podle polohy vrcholu píku) určuje, o jakou látku se jedná (kvalitativní analýza), plocha píku (nebo jeho výška) určuje koncentraci látky ve směsi (kvantitativní analýza) [2].

Obr. 1: Chromatogram [7]

4.1.2.2 Retenční charakteristiky a distribuční konstanta Molekula složky stráví v koloně určitou dobu, která se nazývá retenční čas tR. Tato doba se dělí na čas, který molekula setrvává v mobilní fázi - mrtvý retenční čas

tM a čas strávený ve stacionární fázi - redukovaný retenční čas t´R. Tyto časy splňují retenční rovnici:

t R = t M + t ′R

U inertní látky, která se nepoutá na stacionární fázi, je její retenční čas totožný s mrtvým retenčním časem. Retenční charakteristiky se používají ke kvalitativní analýze, protože v daných podmínkách můžeme konkrétní složku charakterizovat jejím retenčním nebo redukovaným retenčním časem. Během separace dochází v koloně k neustálému vytváření a porušování fázové rovnováhy mezi mobilní a stacionární fází. Děj probíhá nepřetržitě.

16

Disertační práce


Složka má při ustavení rovnováhy ve stacionární fázi koncentraci cs a v mobilní fázi cm. Poměr mezi těmito koncentracemi je v ideálním případě konstantní a nazývá se distribuční konstanta KD, protože charakterizuje distribuci – rozdělení složky mezi obě fáze:

KD =

cS cM

Čím je hodnota distribuční konstanty vyšší, tím je složka více vázána stacionární fází a déle zadržována v koloně. Pro oddělení dvou složek je nutné, aby se od sebe lišily svými distribučními konstantami. Distribuční konstanta závisí na teplotě. Zvolíme-li konstantní teplotu, pak se závislost koncentrace složky ve stacionární fázi na koncentraci složky v mobilní fázi nazývá izoterma [5]. Tvar izotermy má úzký vztah ke tvaru píku. V případě lineární izotermy je pík symetrický. Jinak bývá nesymetricky natažen na jednu stranu, buď v přední nebo v zadní části píku. Hovoříme o píku s rozmytou přední částí nebo píku chvostujícím (obr. 2).

Obr. 2: Souvislost tvaru píku s tvarem izotermy (cs a cm – koncentrace složky ve stacionární a mobilní fázi, R – signál detektoru, t – čas [5]

17

Disertační práce


4.1.2.3 Účinnost separace v chromatografii Účinností kolony charakterizujeme její schopnost separovat složky směsi. Čím je kolona účinnější, tím lépe dokáže od sebe složky směsi oddělit. Mírou účinnosti kolony je počet teoretických pater kolony N. Teoretické patro je pomyslná část kolony, ve které dochází k ustavení rovnováhy mezi mobilní a stacionární fází. Délka této části kolony se nazývá výškový ekvivalent teoretického patra H. Proto kolona o délce L má výškový ekvivalent teoretického patra [5]:

H =L

N

Kolona je tím účinnější, čím více má teoretických pater a čím menší má výškový ekvivalent teoretického patra. Počet teoretických pater N lze určit z chromatogramu z šířky píku v základně w nebo z šířky píku v polovině jeho výšky w1/2 a retenčního času tR podle vztahů [5]:

t N = 16 R   w

2

t  N = 5,54 R  w 1/ 2  

2

Podle van Deemterovy teorie vedou k rozšiřování zóny v koloně a tím k růstu výškového ekvivalentu teoretického patra děje, které probíhají v koloně během separace. Sleduje se vliv lineární rychlosti mobilní fáze u na účinnost separace. Lineární rychlost mobilní fáze je v podstatě rychlost jejího pohybu v koloně a lze ji vypočítat z délky kolony L a mrtvého retenčního času tM [5]:

u= L

•

tM

Turbulentní (vířivá) difúze - HA

Tento příspěvek souvisí s nehomogenitou stacionární fáze. Mobilní fáze proudí v širších kanálcích rychleji než v kanálcích užších [4]. Proto se dvě porovnávané molekuly za určitou dobu dostanou do jiné vzdálenosti. Tím se zóna složky v koloně

18

Disertační práce


rozšiřuje [5]. Příspěvek vířivé difúze k rozmytí zón je závislý pouze na rozměrech částic a pravidelnosti uspořádání náplně kolony [4]. Žádný vliv na tento děj nemá lineární rychlost mobilní fáze [5]. Příspěvek je možno vyjádřit výrazem: H A = A = 2λ ⋅ d p

A … konstantní člen van Deemterovy rovnice λ … koeficient nerovnoměrného plnění chromatografické kolony dp … velikost částic náplně kolony [6] U náplňových kolon není možné člen A van Deemterovy rovnice eliminovat, naopak u kapilárních kolon tento člen odpadá [4]. •

Molekulární difúze - HB

Molekuly látky difundují z místa s vyšší koncentrací do místa s koncentrací nižší. Molekuly se takto pohybují ve směru toku mobilní fáze i proti toku mobilní fáze. Molekulová difúze je popsána podle Fickových zákonů [4]. Příspěvek narůstá s časem, který složka stráví v koloně, tedy se uplatňuje zejména při malých průtokových rychlostech. Proto je nepřímo úměrný lineární rychlosti mobilní fáze [4, 5]. Příspěvek molekulové difúze k rozmytí zón je dán vztahem:

HB = B = u

2γ ⋅ DM

u

γ … korekční faktor charakterizující tvar kanálků v náplni kolony Dm … difúzní koeficient u … lineární průtoková rychlost mobilní fáze [6] Při hodnotách průtoku mobilní fáze běžných v kapalinové chromatografii je příspěvek molekulové difúze zanedbatelný [4].

19

Disertační práce •


Odpor proti převodu hmoty - HC

Molekula složky proniká do různé hloubky stacionární fáze. Ta molekula, která do ní pronikne hlouběji, se v ní zdrží déle než ta, která ulpí na jejím povrchu. Zóna se tak rozšiřuje. Příspěvek HC je přímo úměrný lineární rychlosti mobilní fáze, protože rychlý pohyb mobilní fáze způsobí větší vzájemné vzdálení molekul. V kapalinové chromatografii se uplatňuje tento odpor i v mobilní fázi, která je podstatně viskóznější než plyn [5]. Příspěvek odporu proti převodu hmoty k rozmytí zón lze popsat vztahem: H c = (c M + c S ) ⋅ u

cM … konstanta závislá na difúzním koeficientu analytu v mobilní fázi cS … konstanta závislá na difúzním koeficientu analytu ve stacionární fázi u … lineární průtoková rychlost mobilní fáze [4] Výškový ekvivalent teoretického patra lze vyjádřit jako součet dílčích příspěvků: H = H A + HB + Hc

H … výška teoretického patra HA … příspěvek turbulentní difúze k výšce teoretického patra HB … příspěvek molekulární difúze k výšce teoretického patra HC … příspěvek odporu proti převodu hmoty k výšce teoretického patra [4]

20

Disertační práce


Obr. 3: 1. Vířivá difúze, 2. Podélná molekulární difúze, 3. Odpor proti přenosu hmoty ve stacionární fázi , 4. Odpor proti přenosu hmoty v mobilní fázi [7] Vzhledem ke vztahu jednotlivých příspěvků k lineární průtokové rychlosti mobilní fáze se tato rovnice používá také ve tvaru: H = A + B + Cu u

kde A, B a C jsou konstanty, které charakterizují kolonu a nezávisí na lineární rychlosti u [5]. Grafickým znázorněním závislosti výškového ekvivalentu teoretického patra na lineární rychlosti mobilní fáze je křivka, v jejímž minimu najdeme optimální lineární rychlost, při které daná kolona vykazuje největší účinnost a tedy minimálně rozšiřuje zóny analytů. Pracovat budeme s takovou rychlostí mobilní fáze, při které je separace dostatečně účinná a ještě dosti rychlá. Proto volíme rychlost poněkud vyšší než odpovídá přesně minimu křivky bez výrazné ztráty na účinnosti separace [5, 7].

21

Disertační práce


Obr. 4: Závislost účinnosti kolony na lineární rychlosti mobilní fáze podle van Deemterovy rovnice [8]

4.1.2.4 Rozlišení Hlavním cílem chromatografické metody je dosáhnout dobrého rozdělení analyzovaných látek v přijatelném čase. Rozdělení látek může být dokonalé nebo nedokonalé a je vhodné tento stupeň kvantitativně vyjádřit. Rozlišení je pak nejpoužívanější vyjádření míry kvality separace dvou sousedních elučních křivek [9]. Obecně je pak rozlišení definováno:

R1, 2 =

2(t R 2 − t R1 )

w1 + w2

tR1, tR2 ... retenční časy složek w1, w2 ... šířka píků na základní linii [7, 9] Rozlišení se tedy udává jako rozdíl retenčních časů, dělený průměrnou hodnotu šířky elučních křivek. Rozlišení je veličina bezrozměrná a větší hodnota R znamená lepší separaci, při volbě separačních podmínek nejde však o dosažení co největšího rozlišení, ale o dosažení právě potřebného rozlišení [9].

22

Disertační práce Rozlišení

Principy chromatografie je

ovlivněno třemi

faktory – selektivity (separační), kapacitní

(retenční) a účinnosti [9]. Vztah mezi rozlišením, selektivitou, kapacitou a účinností je dán rovnicí:

R1, 2 = Fsel + Fkap +

Fúč

4

[4]

N α −1 k ⋅ ⋅ 4 α 1+ k

R=

N ... počet teoretických pater α ... separační faktor (selektivita)

k ... retenční faktor (kapacita) [7, 10] Separační faktor (selektivita):

α=

k 2 t R′ 2 K D 2 = = [7] k1 t R′ 1 K D1

Parametr charakterizující vzájemnou retenci dvou analytů [11]. Retenční faktor (kapacita):

k=

(t R − t M )

tM

=

t R′

tM

[7]

Udává kolikrát více času stráví analyt ve stacionární fázi než ve fázi mobilní, tj. v kolika násobku mrtvého času analyt eluuje [11]. Faktor účinnosti Kinetický faktor související s počtem teoretických pater kolony [4].

23

Disertační práce


4.1.2.5 Faktor symetrie Faktor symetrie píku je míra souměrnosti chromatografického píku a vypočítá se ze vzorce:

AS =

w0, 05 2d

w0,05 ... šířka píku v jedné dvacetině jeho výšky d ... vzdálenost mezi kolmicí spuštěnou z vrcholu píku a vzestupnou částí píku v jedné dvacetině jeho výšky [11, 12] Hodnota faktoru symetrie 1,0 značí úplnou (ideální) symetrii píku. Hodnota vyšší než 1,0 značí asymetrické píky v sestupné části („tailing“), naopak hodnota nižší než 1,0 značí asymetrické píky ve vzestupné části („fronting“) [11, 12].

24

Disertační práce

Kapalinová chromatografie

4.2 Kapalinová chromatografie 4.2.1 Definice kapalinové chromatografie Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) je nejčastěji používaná separační metoda založená na rozdílu v distribuci látek mezi dvě nemísitelné fáze, z nichž mobilní fází je kapalina, která prostupuje stacionární fází naplněnou do kolony [12]. Vyniká vysokou účinností, dobrou opakovatelností a robustností. Tato metoda je vhodná pro dělení netěkavých a polárních látek, jejichž analýza příbuznou plynovou chromatografií bývá často obtížná [13]. K účinné separaci je třeba použít dostatečně malých zrníček sorbentu, která kladou prostupující kapalině značný odpor, proto je nutné pracovat při vysokém tlaku [14].

4.2.2 Dělení HPLC a) dle typu stacionární fáze [6, 12] o Chromatografie s normální fází (NP) Jako stacionární fáze se používají látky polární povahy, např. silikagel, oxid hlinitý nebo porézní grafit. Jako mobilní fáze se pak používají nepolární rozpouštědla (n-hexan, chloroform, tetrahydrofuran a další). o Chromatografie s reverzní fází (RP) Jako stacionární fáze se používají nepolární látky. Jsou to různé druhy chemicky modifikovaných nosičů připravených z polymerů, silikagelu nebo porézního grafitu. Běžně užívané vázané fáze jsou nejčastěji nosiče modifikované řetězci C8 nebo C18. Mobilní fáze je polární a obvykle se používají vodné mobilní fáze, jak s organickým rozpouštědlem (acetonitril, nebo metanol), tak bez něj. b) dle typu eluce [6, 12] o Izokratická eluce Používá se pouze jedna mobilní fáze s konstantním složením. Eluční síla mobilní fáze je po celou dobu separace stejná. Pokud analyzujeme velké množství látek s různou polaritou, může analýza trvat velmi dlouhou dobu.

25

Disertační práce


o Gradientová eluce Složení a tedy i eluční síla mobilní fáze se mění podle předem daného programu. Využívá se k separaci látek rozdílné afinity ke stacionární fázi, kdy je potřeba zachovat přiměřeně krátkou dobu analýzy. c) dle typu separačního mechanismu [1] o Rozdělovací chromatografie o Adsorpční chromatografie o Iontově-výměnná chromatografie o Gelová chromatografie o Afinitní chromatografie

4.2.3 Instrumentální vybavení v kapalinové chromatografii Přístroj pro kapalinovou chromatografii se skládá z čerpacího systému (vysokotlaká pumpa), dávkovacího zařízení, chromatografické kolony (může být použit i regulátor teploty kolony), detektoru a zařízení na zpracování dat (počítač). Mobilní fáze je do systému přiváděna z jednoho nebo více zásobníků a protéká obvykle konstantní rychlostí kolonou a poté detektorem [12]. Aparaturou protéká mobilní fáze, která je ze zásobních lahví vedena přes vysokotlakou pumpu do kolony, z ní do detektoru a dále pak do odpadu. Dávkovačem je do proudu mobilní fáze nadávkován vzorek (řádově jednotky či desítky µL). Vzorek je unášen mobilní fází do kolony, kde dochází k separaci jednotlivých složek. Výstup z kolony vede do detektoru, kde jsou jednotlivé složky detekovány. Signál z detektoru je zaznamenáván pomocí počítače [2].

26

Disertační práce


Obr. 5: Schéma kapalinového chromatografu [7] Jednotlivé součásti HPLC systému: Vysokotlaká pumpa Vysokotlaká bezpulzní pumpa je velmi důležitou součástí HPLC aparatury. Kolony pro HPLC jsou plněny mikročásticemi, které při průchodu mobilní fáze kladou značný odpor. Z toho důvodu musí být mobilní fáze pod vysokým tlakem (až desítky MPa), aby mohla projít přes kolonu [2]. Průtok musí být konstantní, reprodukovatelný a bezpulzní. Jeho hodnoty se pohybují kolem 1 mL min-1 pro běžné částicové kolony [10]. Dávkovací zařízení Vzorek je dávkován do proudu mobilní fáze pomocí dávkovací smyčky nebo pomocí automatického dávkovače (autosampleru) [2]. Kapalné vzorky lze aplikovat přímo. Pevné vzorky musí být rozpuštěny ve vhodném rozpouštědle. Je vhodné před nadávkováním vzorku do systému z něj odstranit případné částice. K odstranění se používá filtrace nebo odstřeďování [6]. Chromatografické kolony Jedná se o skleněné či nerezové trubice o délce 10 – 25 cm a vnitřním průměru 3 - 4,6 mm naplněné sorbentem o průměru zrn 3 - 10 µm, který je držen v koloně

27

Disertační práce

Stacionární fáze

pomocí frit. O schopnosti kolony separovat určité složky směsi rozhoduje zejména typ stacionární fáze [2, 7]. Detektory V HPLC je dostupná řada různých detektorů, které se liší principem funkce, konstrukcí, selektivitou, citlivostí, mezí detekce a lineárním dynamickým rozsahem. Metoda HPLC využívá tyto typy detektorů: spektrofotometrický detektor (UV-VIS), fluorescenční detektor, hmotnostní spektrometr, refraktometrický detektor a další. Volba detektoru opět závisí na konkrétní aplikaci. Často používanými detektory jsou detektor spektrofotometrický (UV-VIS) a fluorescenční. Podmínkou použití těchto detektorů je, aby daný analyt absorboval záření určité vlnové délky (UV-VIS detekce) anebo emitoval fluorescenční záření (fluorescenční detekce). Pokud analyt sám o sobě neabsorbuje záření v oblasti UV-VIS nebo neemituje fluorescenční záření, je použití těchto detektorů podmíněno derivatizací vzorku (vzorek je chemickou reakcí převeden na sloučeniny, které mají potřebné vlastnosti - absorpce UV-VIS, fluorescence) [2].

4.2.4 Stacionární fáze Stacionární

fáze

je

v chromatografickém

systému

ta

fáze,

která

je

nepohyblivá, může to být pevná látka nebo film kapaliny zakotvený na pevné látce [2]. Konvenční stacionární fáze jsou stacionární fáze částicové. Částice mohou mít různý tvar, velikost i strukturu. Tyto vlastnosti, spolu s délkou a vnitřním průměrem kolony, ovlivňují separační vlastnosti. V dnešní době se používají výhradně sférické částice, které vykazují proti starším částicím s nepravidelným tvarem vyšší účinnost. Velikost původně vyráběných částic byla několik desítek mikrometrů. Při plnění kolon vznikal velký prostor mezi částicemi, a tím docházelo ke snížení účinnosti separace vlivem zvýšené turbulentní difúze a zvýšeného odporu proti převodu hmoty. Vývoj nových

technologií

umožnil

přípravu

částic

s průměrem

pouhých

několika

mikrometrů. Tyto částice mají vyšší účinnost a kapacitu, ale také způsobují vyšší tlak na koloně. Nejčastěji používaný průměr částic je dnes 3 – 10 µm. Částice mohou být neporézní, mohou mít porézní povrchovou vrstvu, nebo být porézní [15].

28

Disertační práce

Stacionární fáze

Jednotlivé druhy stacionárních fází: 4.2.4.1 Stacionární fáze na bázi silikagelu Silikagel je obecně nejrozšířenější polární sorbent [16]. Pro účely kapalinové chromatografie má nejčastěji porézní amorfní formu o složení SiO2 . x H2O. Voda je chemicky vázána v nestechiometrickém množství za vzniku silanolových skupin Si-OH. Nejčastější velikost částeček náplně je 3 - 5 µm. Silanolové skupiny udělují povrchu silikagelu polární charakter a jsou pro svoji reaktivitu využívány k přípravě kovalentně vázaných fází. Silanolové skupiny a jejich typ mají velký vliv na chromatografické chování silikagelu [17]. Povrch silikagelu je slabě kyselý, takže více zadržuje bazické látky než látky kyselé a neutrální a může tak působit chvostování jejich píků. Tomu lze zabránit přídavkem slabé organické báze (většinou aminového typu – triethylamin) do mobilní fáze, ale je nutné dbát, aby pH mobilní fáze nepřesáhlo pH 8, kdy dochází k rozpouštění silikagelu. Protože povrch silikagelu je kyselý, může vystupovat jako iontoměnič [16].

4.2.4.1.1 Stacionární fáze pro normální chromatografii V kapalinové chromatografii s normálními fázemi se využívá jako stacionární

fáze nemodifikovaný silikagel nebo polárními skupinami chemicky modifikovaný silikagel, např. se skupinami aminopropylovými, kyanopropylovými, diolovými nebo pentafluorfenylpropylovými v kombinaci s nepolární mobilní fází [12, 16]. Retence látek kyselé povahy na aminopropylu je daleko větší než na silikagelu. Nevýhodou aminopropylu je jeho vysoká reaktivita a může reagovat s aldehydy nebo ketony za vzniku iminů, nebo může být funkční skupina NH2 oxidována např. peroxidy. V přítomnosti vody dochází k částečné hydrolýze NH2 skupiny a výsledkem je vysoce alkalické prostředí v pórech, které se může pohybovat až kolem hodnoty pH 10 a vyšší a dochází k rozpouštění silikagelu. Proto je nutné se vyhnout promývání aminopropylové fáze vodou [16]. Separace na pentafluorfenylpropylové fázi je obdobná jako na oktadecylové fázi, pouze je nutné používat mobilní fáze o silnější eluční síle. Stacionární fáze

29

Disertační práce

Stacionární fáze

vykazuje vyšší selektivitu vůči aromatickým látkám. Na těchto fázích je možné používat 100 % vodné mobilní fáze bez zhroucení stacionární fáze v rozmezí pH 2,0 - 8,0 do teplot až 70°C [16].

4.2.4.1.2 Stacionární fáze pro reverzní chromatografii Reverzní fáze na bázi silikagelu jsou dnes nejběžněji připravovány reakcí

vhodného monofunkčního organosilanu (např. ethoxydi(methyl)oktadecylsilanu) se silikagelem. Kovalentně vázaný alifatický řetězec, kterým je nejčastěji oktadecylová nebo oktylová skupina (dále také fenylová či alkylfenylová skupina), uděluje vzniklé stacionární fázi hydrofobní charakter. Je ovšem prokázáno, že silanizace vede ke zreagování jen asi poloviny všech přítomných silanolových skupin na povrchu silikagelu. Za jistých okolností se zbytkové silanoly mohou spolupodílet na retenci analytů. Tato obvykle nežádoucí interakce je často doprovázena snížením separační účinnosti a chvostováním píků. Uvedený efekt se projevuje především při dělení bazických látek, které mohou být protonizovány, což vede k jejich zadržování na deprotonizovaných silanolech elektrostatickou interakcí. Jednoduché řešení tohoto problému, tj. snížení protonizace báze zvýšením pH pufru, totiž není možné vzhledem k rozpustnosti silikagelu při vyšším pH [16, 17]. Jednou z velkých slabin reverzních fází na bázi silikagelu je jejich omezená stabilita v bazickém a silně kyselém prostředí. Typická C18 fáze je stabilní jen v úzkém rozsahu pH, asi 3 – 9. Jakmile je pH mobilní fáze nižší než 3, dochází ke kysele katalyzované hydrolýze siloxanové vazby mezi silikagelem a organosilanem. Tento proces vede ke kontinuální ztrátě vázané fáze a ve svém důsledku ke ztrátě chromatografické retence pro hydrofobní analyty. Při hodnotě pH nad 9 nastává naopak rozpouštění silikagelové matrice. Rozpouštění silikagelu je doprovázeno poklesem účinnosti, vznikem volného prostoru v koloně, nakonec dojde k úplné destrukci stacionární fáze. Dalším důležitým faktorem ovlivňujícím stabilitu stacionární fáze je teplota. Teplotní stabilita reverzních fází na bázi silikagelu bývá uváděna v rozmezí 5°C - 100°C. Obecně ovšem platí, že zvyšování teploty vždy vede k rychlejší degradaci sorbentu, což se zejména projeví při extrémních hodnotách pH. Nejjednodušším řešením problému omezené stability sorbentu je striktní udržování 30

Disertační práce

Stacionární fáze

pH mobilních fází v rozmezí od 3 do 7 - 9, což však zásadně omezuje možnost optimalizace složení mobilní fáze. Eliminace sekundárních interakcí vede ke zvýšení separační účinnosti a zlepšení symetrie píků bazických látek. Zlepšení stability v kyselém prostředí bylo docíleno zvětšením velikosti a hydrofobicity organosilanu vázaného na silikagel. C18 fáze je tedy z tohoto pohledu stabilnější než C8. Předpokládá se, že objemný alkyl lépe chrání siloxanovou vazbu před hydrolýzou. Jiné přístupy vedoucí ke zvýšené odolnosti sorbentu vůči silně kyselému prostředí jsou založeny na vzniku většího počtu kovalentních vazeb mezi silikagelem a modifikujícím silanem. Komerčně nejúspěšnější je zatím použití tzv. stericky chráněných silanů. Stericky chráněné silany jsou tvořeny jedním alkylem (C8, C18) nebo fenylem, dvěma objemnými isopropylovými nebo isobutylovými skupinami a jednou reaktivní funkční skupinou (Cl), vázanými na křemíkový atom. Vzniklé fáze jsou stabilní i v agresivních podmínkách. Pouhé prodloužení alkylových modifikujících řetězců vede ke zlepšené odolnosti v alkalickém prostředí pravděpodobně v důsledku zlepšeného stínění silikagelové

matrice.

Jinou

možností

jsou

dodatečné

modifikující

reakce

(„endcapping“). Technika je založena na modifikaci povrchu organosilanem s příslušně dlouhou hydrofobní skupinou a následné dodatečné modifikaci povrchu reakcí např. s trimethylchlorsilanem nebo hexamethyldisilazanem. Malé rozměry endkapujících činidel jim umožní lépe proniknout k povrchu silikagelu. Proces vede k dramatickému zlepšení odolnosti fáze vůči alkalickému prostředí [17].

4.2.4.2 Hybridní stacionární fáze Hybridní anorganicko-organické stacionární fáze kombinují nejlepší vlastnosti silikagelu, tj. vysokou účinnost a vynikající mechanickou stabilitu, s nejlepšími vlastnostmi polymerních sorbentů, tj. mimořádnou pH stabilitou a sníženým efektem reziduálních silanolů. V roce 1999 byla na trh uvedena první generace hybridních fází pod názvem XTerra firmou Waters. Syntéza je založena na reakci dvou organosilanů, jeden z nich tvoří silikagelovou matrici a druhý do vznikající matrice vnáší methylsiloxanové jednotky [17].

31

Disertační práce

Stacionární fáze

Pro potřeby RP-HPLC je povrch následně kovalentně modifikován buď trifunkčními silany za vzniku fází, optimalizovaných pro maximální chemickou stabilitu a určených pro LC-MS, a nebo monofunkčními silany za vzniku fází RP8 a RP18, s vloženými karbamáty, optimalizovaných pro minimální chvostování bazických látek. Vzhledem k tomu, že na povrchu hybridu je ve srovnání s klasickými silikagelovými materiály asi jen třetina silanolových skupin, chvostování bazických látek je na hybridních fázích výrazně omezeno a symetrie píků je daleko lepší. Hybridy vykazují velkou odolnost vůči vysoké hodnotě pH mobilní fáze. Hybridní reverzní fáze byly úspěšně testovány v rozmezí pH 1,2 až 11,5. Další důležitou vlastností hybridních sorbentů je jejich zlepšená odolnost vůči zvýšené teplotě mobilní fáze. Možnost chromatografie při teplotách kolem 60°C přináší řadu výhod: snížení viskozity mobilní fáze, a tím tlaku na koloně, zlepšení separační účinnosti a zmenšení závislosti účinnosti kolony na rychlosti průtoku [17]. V roce 2006 byl úspěšně dokončen vývoj druhé generace hybridních sorbentů a byl uveden na trh firmou Waters pod označením XBridge. Tyto kolony jsou připravovány pomocí tzv. BEH technologie (Bridge Ethylene Hybride) a obsahují ve své struktuře ethylénové můstky, kterými je část siloxanů přemostěná. Ve srovnání se sorbenty XTerra byla dále podstatně zvýšena chemická odolnost v silně bazickém prostředí a separační účinnost [17, 18]. Do skupiny hybridních kolon patří také kolony Gemini od firmy Phenomenex (USA). Jsou vyrobené pomocí Twin technologie kombinující ty nejlepší vlastnosti silikagelu a polymerních nosičů, nabízející vysokou životnost a účinnost dělení v rozsahu pH od 1 do 12. Při produkci kolon Gemini projde v posledním stádiu výroby částice silikagelu speciální chemickou procedurou, jejímž výsledkem je unikátní povrchová organokřemičitá vrstva vytvářející novou kompozitní částici. Částice si však zachovává svoji vnitřní, celým procesem nedotčenou, strukturu čistého silikagelu a tím i mechanickou pevnost, rigiditu a především i vynikající dělící účinnost [19, 20].

4.2.4.3 Stacionární fáze na bázi oxidu zirkoničitého, hlinitého a titaničitého Omezená chemická odolnost silikagelu v alkalickém prostředí vedla k vývoji alternativních HPLC kolon na bázi oxidů kovů (oxidu titaničitého, oxidu hlinitého a zejména oxidu zirkoničitého) [16, 17]. Ukázalo se, že tyto oxidy jsou podstatně 32

Disertační práce

Stacionární fáze

stabilnější v silně alkalickém prostředí než silikagel. Navíc jsou tyto nové materiály v bazickém prostředí stabilní i při zvýšené teplotě, což neplatí pro silikagelové fáze. Zvýšená stabilita a pracovní rozsah pH přináší řadu výhod. Mechanická odolnost vůči vysokému tlaku je u všech zmíněných oxidů velmi dobrá, plně srovnatelná nebo lepší než v případě silikagelu [17]. Nejčastěji jsou oxidy kovů modifikovány polybutadienem (PBD), který má pro neionizovatelné látky podobnou separační selektivitu jako silikagelové C8 a C18 fáze, nebo polystyrenem (PS), který je svou selektivitou spíše blízký fenylové modifikaci silikagelu. PBD sorbenty vykazují velmi dobrou pH stabilitu, pro oxid hliníku v rozmezí pH 3−12, pro oxid zirkonia v rozmezí pH 1−14. Kromě toho také tepelná odolnost zvláště zirkoniových PBD fází je mimořádná (až do 200°C). Velmi dobrou pH a tepelnou stabilitu mají i kovové oxidy pokryté vrstvou polystyrenu, které mohou být provozovány v rozmezí pH nejméně 1−13 a při teplotách až do 160°C. Kompatibilita sorbentů s vysokými teplotami nabízí mnoho zajímavých aplikačních výhod. Řada z nich již byla výše zmíněna, zde lze navíc připomenout možné využití samotné vody jako mobilní fáze. Je totiž známo, že při teplotě 200°C má voda podobnou polaritu jako methanol při laboratorní teplotě. Tímto způsobem lze dosáhnout snížení spotřeby organických rozpouštědel [17]. Oxid zirkoničitý lze připravit ve formě monodisperzních porézních kulových částeček. Takto připravené kolony vykazují srovnatelnou účinnost s kolonami silikagelovými. Nemodifikovaný oxid zirkoničitý se používá v systému s normálními fázemi (ZirChrom®-PHASE). Častější je použití oxidu zirkoničitého v reverzním módu. Povrch oxidu zirkoničitého se modifikuje tenkou vrstvou polybutadienu (ZirChrom®PBD, Discovery Zr-PBD), polystyrenu (ZirChrom®-PS, Discovery Zr-PS) nebo pyrolyticky vyloučeného uhlíku (ZirChrom®-CARB, Discovery Zr-Carbon), které lze případně modifikovat ligandem C18 (Discovery Zr-CarbonC18) [16, 21, 22].

4.2.4.4 Stacionární fáze pro HILIC HILIC může být chápána jako rozšířená chromatografie na normální fázi s vodnými mobilními fázemi. HILIC je separační technika vhodná pro polární a hydrofilní látky. Retence se zvyšuje s polaritou analytu a snižuje se zvýšením polarity mobilní fáze (klesá s rostoucím podílem vody nebo pufru) [16]. 33

Disertační práce

Stacionární fáze

Mobilní fáze je naopak obdobná mobilním fázím používaných v reverzní chromatografii a používá se voda nebo pufr s organickým rozpouštědlem [16]. Typické HILIC aplikace používají acetonitril, který má malou viskozitu a tím dostáváme vysokou účinnost separace a nízký tlak na chromatografické koloně. Obvyklá koncentrace acetonitrilu se pohybuje v rozmezí 50 - 90% [16, 23]. Stacionární fáze je velmi hydrofilní: silikagel, polární vázané fáze, polární polymerní fáze a iontoměniče. Hydrofilnější stacionární fáze více poutá vodu z mobilní fáze a retence analytu se zvyšuje. Retenční mechanismus se může vysvětlit jako rozdělování analytů mezi na vodu bohatší stacionární fází a na vodu chudší mobilní fází. Jako druhý mechanismus, který se uplatňuje, je mechanismus iontové výměny, neboť uvedené stacionární fáze mají vlastnosti iontoměniče. Klasickým příkladem separace technikou HILIC je separace sacharidů, aminokyselin, peptidů a polárních organických kyselin a zásad [16]. Unikátní technologie společnosti Merck ZIC®-HILIC používá jako stacionární fázi porézní silikagel s kovalentně navázanou vysoce polární zwitterionickou funkční skupinou, která zaručuje vyšší stabilitu a robustnější HILIC separaci. Kolony ZIC®-pHILIC jsou založeny na polymerních částicích o velikosti 5 µm, navázaných na stejnou zwitterionickou funkční skupinu a tudíž nabízejí srovnatelnou selektivitu [24].

4.2.4.5 Polymerní stacionární fáze Hlavní a podstatnou nevýhodou chemicky modifikovaného silikagelu je jeho rozpustnost v alkalické oblasti pH, ale mnoho chromatografických systémů využívá alkalickou oblast pH zejména pro separaci bazických látek. Tomuto požadavku vyhovují polymerní stacionární fáze, které jsou většinou použitelné v celém rozsahu pH. Nevýhodou polymerních fází je, že částečky obsahují mikropóry o velikosti asi 1 nm, což zabraňuje přenosu hmoty zejména pro malé molekuly. Polymerní stacionární fáze jsou dále omezeny maximálním pracovním tlakem na koloně a to 20 MPa, i když 10 MPa je pro většinu aplikací HPLC dostačující. Stabilita polymerních stacionárních fází je omezena stabilitou funkčních skupin polymeru – pro methylakrylát je limitující stabilita esterové skupiny, pro akrylamid je limitující stabilita amidové skupiny. I když současně připravované polymerní fáze jsou

34

Disertační práce

Monolitické stacionární fáze

dostatečně mechanicky i chemicky stálé, pro jejich nižší účinnost dosud nevytlačily z použití chemicky vázané nepolární stacionární fáze [16].

4.2.4.6 Monolitické stacionární fáze Na rozdíl od konvenčních stacionárních fází, které se skládají z jednotlivých částic sorbentu o definované velikosti, monolitické HPLC kolony tvoří jediný kus pórovitého materiálu, který zcela zaplňuje vnitřek separační kolony. Proti typickým kolonám plněným drobnými částicemi, monolity neobsahují mezičásticové prostory, kterými se v klasických kolonách uskutečňuje valná část průtoku. Proto musí veškerá mobilní fáze nutně protékat póry monolitu [16, 25, 26]. Monolitické kolony mají dva typy pórů: a) velké póry (makropóry) zajišťují rychlý konvektivní tok mobilní fáze skrz monolit a významně zrychlují přenos hmoty mezi mobilní a stacionární fází, b) středně velké póry (mesopóry) poskytují monolitu dostatečně veliký povrch, a tím vysokou separační kapacitu. Tato struktura umožňuje provozování monolitů při značně vysokých rychlostech mobilních fází bez přílišného zvýšení tlaku a zároveň bez ztráty separační účinnosti, a to i pro separované makromolekuly (bílkoviny, syntetické polymery) [16, 26]. Během minulého desetiletí byla zveřejněna celá řada originálních přístupů zahrnujících jak přípravu systémů vyznačujících se pouze některými prvky charakteristickými pro monolity (jako je snížený objem mezičásticových prostorů), tak i technologie skutečně monolitické. Do první skupiny patří např. kazety naplněné vrstvenými listy modifikované celulosy či srolované tkaniny. Monolity druhého typu jsou reprezentovány stlačenými hydrofilními gely, polymerními makroporézními disky, kolonami a trubicemi, jakož i monolity na bázi siliky, což je dnes již vžitý termín pro materiály na bázi oxidu křemičitého. Některé z těchto materiálů již doznaly i praktického uplatnění [25].

4.2.4.6.1 Makroporézní polymerní disky Jedním z prvních chromatograficky využitelných formátů monolitických médií

byly monolitické disky (monolitické membrány). Tyto materiály různého chemického složení a v mnoha geometriích byly poprvé úspěšně připraveny až v polovině 80. let, především za účelem rychlých separací bílkovin. Brzy se potvrdilo, že pro dosažení 35

Disertační práce


dobrého dělení stačí jen poměrně tenká membrána, a tím se vytvořil široký prostor pro další vývoj konceptu monolitických médií ve formě disku [17]. Příprava monolitů je jednoduchá. Získávají se radikálovou polymerizací směsi, jež obsahuje monovinylový monomer s funkční či reaktivní skupinou jako je butyl- či glycidyl-methakrylát, síťovadlo, typický monomer se dvěma či více dvojnými vazbami např. divinylbenzen a ethylendimethakrylát, iniciátor, a porogenní rozpouštědlo. Tato směs se naplní do formy, kde po zahřátí polymerizuje [25]. Nelze-li získat disk s požadovanými funkčními skupinami přímou polymerizací odpovídajícího monomeru, mohou se v následujícím stupni funkční skupiny vzniklého polymeru modifikovat [27, 28]. V současnosti jsou již monolitické disky komerčně dostupné, konkrétně např. od firmy CIM (BIA Separations). Disky o tloušťce do 3 mm jsou při vlastní separaci umístěny ve speciálním držáku, kam může být vloženo i několik různých membrán lišících se chemickou modifikací, a tak lze provádět vícerozměrné separace [17]. 4.2.4.6.2 Makroporézní polymerní kolony Začátkem devadesátých let připravili Švec a spol. první rigidní makroporézní

monolitické kolony [28]. Jejich syntéza se provádí velmi jednoduchým způsobem, a to in situ polymerizací vhodných monomerů přímo v chromatografické koloně či v kapiláře [17, 25]. Příprava spočívá v naplnění trubice směsí monomerů, radikálového iniciátoru a porogenů. Následně je trubice uzavřena, utěsněna a provedena polymerizace za pečlivě kontrolované teploty [17]. Při přímé výrobě v koloně odpadá manipulace, avšak pouhá výměna monolitu za jiný v téže trubici je prakticky nemožná. Polymerační směs používaná pro přípravu těchto monolitů je do značné míry obdobná té, která se používá k přípravě disků. Mimořádně nízký odpor vůči proudění kapalin póry je předpokladem vysokých průtokových rychlostí vhodných k velmi rychlým separacím. Funkční skupiny monolitických

kolon

připravených

přímou

polymerizací

jsou

dány

použitými

monomery. Další možností kontroly funkčních skupin je příprava monolitu s reaktivními skupinami a modifikace vzniklého polymeru [25]. V neposlední řadě je třeba upozornit i na možnost roubování monolitů s využitím UV záření, které umožňuje přípravu stacionárních fází s vysokou separační kapacitou [17]. 36

Disertační práce


4.2.4.6.3 Tubulární kolony s radiálním tokem Principiálně by vše nasvědčovalo tomu, že monolitické kolony by mohly být

velmi zajímavé také pro preparativní separace. Problém je ovšem v tom, že radikálová polymerizace v koloně je exotermní proces, při kterém se uvolňuje velké množství tepla. Polymerizace probíhá bez míchání a odvod tepla je obtížný [17]. Tato obtíž byla do značné míry elegantně vyřešena konceptem tubulárních monolitů s radiálním tokem [30]. Jedná se o trubice s definovanou tloušťkou monolitem tvořených stěn, mobilní fáze a analyty procházejí přes stěnu v radiálním směru [17]. Teplota při polymerizaci je snáze udržována v požadované toleranci. Kromě toho lze snadno měnit jak průměr tak i tloušťku této monolitické trubice [25]. 4.2.4.6.4 Komprimované gely Koncem 80.tých let prováděl prof. Hjertén experimenty s částicemi neporézní

agarózy a zjistil, že při stlačení sloupce sorbentu hydrostatickým tlakem proudící kapaliny překvapivě došlo ke zvýšení permeability stacionární fáze a současně i ke zlepšení separace [31]. Na základě těchto experimentů připravil monolit polymerizací vodného roztoku N,N’-methylenbis-akrylamidu a kyseliny akrylové v přítomnosti anorganické soli (síran amonný), který následně v koloně silně stlačil (až na 10 % původního objemu) a získal velmi dobré separace bílkovin. Tato technologie po určitém vylepšení byla přejata firmou BioRad [16]. 4.2.4.6.5 Monolitické kolony z anorganických materiálů První monolitické stacionární fáze na bázi silikagelu připravili a popsali

profesoři Nakanashi, Soga a Tanaka [32, 33]. V současné době jsou komerčně dostupné pod značkou Chromolith od firmy Merck nebo v licenci Merck od firmy Phenomenex, kolony Onyx™. Připravují se hydrolytickou polymerizací tetramethoxysilanu nebo tetraethoxysilanu ve vodném roztoku kyseliny octové v přítomnosti polyethylenglykolu. Technologie výroby umožňuje přípravu monolitů s přesně definovanou strukturou, kdy vznikají výhradně mesopóry (13 nm) a makropóry (2 µm) vhodných a nastavitelných rozměrů [16].

37

Disertační práce

Monolitické stacionární fáze Makropóry: 2 µm

Mesopóry: 13 nm

Celková porozita > 80%

Obr. 6: Mesopóry a makropóry monolitické stacionární fáze [16] Porézní struktura silikových monolitů je odlišná od organických monolitů. Zatímco struktura organických polymerů se skládá z pospojovaných skupin málo uspořádaných mikroglobulí s makropóry mezi nimi (obr. 7a), silikové monolity se skládají z dobře uspořádaných přibližně stejně velikých skeletů prostoupených téměř monodisperzními póry (obr. 7b). Skelety samy jsou též porézní a propůjčují těmto monolitům specifický povrch, tedy vlastnost, jež je ceněna právě při separacích malých molekul. Nízký odpor k toku, typický pro všechna monolitická média, umožňuje použití kolony o vnitřním průměru 4,6 mm při průtokové rychlosti až 9 mL min-1, aniž by tlak přesáhl hodnotu 8 MPa, což jsou podmínky zcela nepředstavitelné pro stejnou kolonu naplněnou 5 µm částicemi [25].

Obr. 7: Morfologie polymerního (a) a silikonového (b) monolitu [25]

38

Disertační práce

Nové trendy ve stacionárních fázích

Na rozdíl od rigidních makroporézních polymerních médií, silikagelové monolity analytických rozměrů nemohou být připraveny přímo v chromatografické koloně, neboť při tuhnutí během hydrolyticky iniciované polykondenzace dochází k výraznému zmenšování objemu. Nejprve je tedy připraven monolit, ten je pak zatěsněn do kolony odpovídajících rozměrů, a nakonec obvykle následuje chemická modifikace povrchu podle účelu použití monolitu. Vzhledem ke srážení monolitu při jeho syntéze je obtížné připravit média s délkou nad ~ 15 cm [17]. Platí, že příprava silikagelových monolitů v kapilárním měřítku je snazší a reprodukovatelnější než výroba kolon větších rozměrů, a to proto, že kapiláry s úspěchem polymerizují podobně jako rigidní polymerní monolity, tedy přímým in situ procesem [17]. Na rozdíl od organických monolitických kolon, které se mimořádně osvědčily při separacích velkých molekul, většina zatím popsaných separací používajících silikové monolity se týká malých molekul. To činí tyto kolony unikátními v celé rodině monolitů určených pro HPLC [25].

4.2.4.7 Nové trendy ve stacionárních fázích V posledních letech je patrná silná tendence ke zmenšování rozměrů zrn/částic sorbentů. Stále běžněji jsou komerčně dostupné i sorbenty s velikostí částic pod 2 µm. Zmenšování sorbentu jde ruku v ruce se zkracováním chromatografických kolon. Výsledkem je podstatné zkrácení dob analýz bez ztráty účinnosti ve srovnání se separacemi provedenými na kolonách tradiční délky (250 mm) plněných 5 µm sorbentem. Doby analýz na krátkých kolonách (50 mm, 20 mm i menších) určených pro tzv. rychlou chromatografii bývají kolem 1 až 2 minut. Vedle zkracování kolon dochází postupně také ke zmenšování jejich vnitřního průměru. Tradiční průměr analytických kolon 4,6 mm je postupně opouštěn a nahrazován dnes již běžnějšími průměry kolem 3 - 4 mm. S nástupem techniky LC-MS vzrostla popularita kolon o průměru 2 mm a menším. Tento trend souvisí nejen se snahou o zrychlení analýz, ale také s úsilím o zlepšení ekonomiky provozu chromatografických laboratoří a v neposlední řadě i s hledisky ekologickými. Spotřeba mobilních fází, obvykle obsahujících organická rozpouštědla, a množství vznikajících odpadů může být tímto způsobem řádově sníženo. 39

Disertační práce


Pokud se jedná o separační možnosti HPLC, je možno konstatovat, že dělení na reverzních fázích (RP) je stále nejrozšířenější technikou, přitom dominantní postavení mají již tradičně částicové fáze na bázi silikagelu. Ze silikagelových RP fází jsou dlouhodobě nejpopulárnější C18 modifikace. Vedle silikagelových částicových sorbentů se v moderní RP-HPLC stále více prosazují materiály nové, jako např. anorganicko-organické hybridy a modifikované oxidy kovů. Velmi perspektivní jsou také monolitické kolony [17]. 4.2.4.7.1 Porézní částice menší než 2 mikrometry Jedním z cílů při vývoji nových chromatografických sorbentů vždy bylo

dosažení vysoké separační účinnosti, která úzce souvisí s morfologií porézních částic. Většina povrchu typických porézních sorbentů je tvořena difuzivními póry. Zmenšení velikosti částic sorbentu zlepšuje inter i intra partikulární přenos hmoty. V porézní částici putuje analyt z pohybující se mobilní fáze do nepohyblivé mobilní fáze, a pak do stacionární fáze uvnitř pórů, kde dochází k jeho interakci. Následně se analyt uvolní ze stacionární fáze a musí difundovat zpět do pohybující se mobilní fáze. Tímto mnohonásobně se opakujícím procesem analyt postupuje kolonou. V případě použití malých zrn sorbentu je difuzní proces rychlejší. Pomalý přenos hmoty ve stacionární fázi bývá hlavní příčinou malé separační účinnosti spojené s rozšiřováním píků a následně nedostatečným chromatografickým rozlišením [17]. Řešení našla firma Waters (USA) ve vývoji nových stacionárních fází s velikostí 1,7 µm podporovaných novou přístrojovou technikou, která na rozdíl od předešlé generace umožňuje bezpečně a reprodukovatelně pracovat s tlaky přes 80 MPa, tedy více než dvojnásobnými ve srovnání s předchozími přístroji. Obdobné produkty dalších významných producentů chromatografických zařízení pak na sebe nedaly dlouho čekat. Samozřejmě, že každá firma ke svým přístrojům dodává i odpovídající kolony. Jejich společným jmenovatelem je náplň s velikostí částic 2 µm či menší, jakož i celková porozita (95 – 300 Å). Póry těmto fázím dodávají požadovaný povrch potřebný pro dosažení potřebné selektivity [34].

40

Disertační práce


4.2.4.7.2 Porézní částice s neporézním jádrem Technologie s pevným jádrem a porézním povrchem se nazývá „fused core“

technologie. V současné době je několik firem, které se touto technologií zabývají: Advanced Materials Technology (USA, kolony Halo); Sigma-Aldrich (USA, kolony Ascentis Express) a Phenomenex (USA, kolony Kinetex) [35, 36].

Obr. 8: Model částice s neporézním jádrem [35] Částice s porézní povrchovou vrstvou se skládají ze dvou vrstev. Vnitřní vrstvu tvoří kompaktní kulovité jádro z anorganického materiálu, často velmi čistého pevného silikagelu. Neporézní jádro je překryté slabší vrstvou porézního materiálu. Čím tenčí je porézní vrstva, tím snazší je převod hmoty a roste účinnost separace. To je výhodou zejména pro makromolekuly, které difundují do a z pórů pomaleji než malé molekuly. Zároveň se ovšem s klesající tloušťkou porézní vrstvy snižuje specifický povrch stacionární fáze, a klesá sorpční kapacita kolony [15]. Jako první začala tyto částice vyrábět firma Advanced Materials Technology (USA), pod obchodním názvem Halo. Neporézní silikové jádro (core) s velikostí 1,7 µm je obaleno 0,5 µm silnou vrstvou slinutých (fused) silikových nanočástic. Konečná velikost stacionární fáze je tedy 2,7 µm. Kolony plněné částicemi této velikosti mohou být použity ve standardních přístrojích, neboť nevyžadují zvýšený tlak k dosažení požadovaných průtokových rychlostí. Přitažlivost „fused-core“ technologie spočívá v tom, že vzdálenost, jež musí být překonána difuzí v nepohyblivé mobilní fázi uvnitř pórů, není nikdy delší než 0,5 µm. To znamená, že rozmývání chromatografických zón je omezené, což se promítá do účinnosti separace [34].

41

Disertační práce

Mobilní fáze

4.2.4.7.3 Monolitické kolony High Resolution Na podzim roku 2011 uvedla na trh firma Merck (Německo) nový typ

monolitických kolon nazývaný Chromolith® HighResolution (Chromolith® HR). Tento nový typ nabízí vyšší účinnost, symetrický tvar píků a delší životnost v porovnání s částicovými kolonami. Nový typ kolony generuje zpětný tlak o polovinu nižší než částicové kolony stejných parametrů. Pro dosažení vyššího rozlišení je možné spojit dvě kolony Chromolith® HighResolution k sobě. V porovnání s klasickými monolitickými kolonami (Chromolith®) vykazují nové kolony větší separační účinnost, která je dána větší separační plochou, tedy velikostí mesopórů. Klasické monolitické kolony mají velikost mesopórů 11 - 13 nm, kdežto materiál Chromolith® HR obsahuje mesopóry velikosti 14 - 16 nm. Na druhou stranu vykazují nové kolony vyšší zpětný tlak oproti klasickým monolitickým kolonám, což je dáno velkostí makropórů. Kolony Chromolith® obsahují makropóry o velikosti 1,9 - 2 µm a Chromolith® HR o velikosti 1,1 - 1,2 µm [24].

4.2.5 Mobilní fáze V chromatografii s normálními fázemi se používají méně polární mobilní fáze. Aby se dosáhlo reprodukovatelných výsledků, je nutné přísně kontrolovat přítomnost vody v mobilní fázi. V chromatografii s obrácenými fázemi se používají vodné mobilní fáze jak s organickým rozpouštědlem, tak bez něj. Složky mobilní fáze se obvykle filtrují, aby z nich byly odstraněny částice větší než 0,45 µm. Vícesložkové mobilní fáze se připravují odměřením požadovaných objemů (pokud nejsou předepsány hmotnosti) jednotlivých složek a jejich smísením. Jinou možností je přivádět rozpouštědla pomocí jednotlivých čerpadel ovládaných ventily, které umožňují mísení složek v požadovaném poměru. Rozpouštědla jsou před

čerpáním

do

systému

obyčejně

odplyňována

probubláváním

heliem,

v ultrazvukové lázni nebo se používají membránová či vakuová zařízení zařazená přímo do systému, která zabraňují vstupu vzduchových bublin do HPLC systému. Používaná rozpouštědla a jiné složky mobilní fáze mají mít vhodnou kvalitu. Pokud je nutné nastavení pH, provádí se pouze s vodnou částí mobilní fáze, nikoli s celou směsí.

Jestliže

se

používají

tlumivé

42

roztoky,

systém

se

po

dokončení

Disertační práce

Mobilní fáze

chromatografických analýz patřičně promyje směsí vody a organického rozpouštědla použitého v mobilní fázi (5 % (V/V)), aby se zabránilo krystalizaci solí [12]. Na rozdíl od plynové chromatografie zde mobilní fáze vstupuje do interakce se složkami analyzované směsi a konkrétní složení mobilní fáze může významným způsobem ovlivňovat celou analýzu (kvalitu separace) [2].

43

Disertační práce

Nízkotlaké průtokové metody

4.3 Nízkotlaké průtokové metody 4.3.1 Definice a základní charakteristiky Nízkotlaké průtokové metody jsou analytické metody založené na měření vzorku v proudu kapaliny (nosném proudu), jsou charakterizovány nízkým tlakem nosného proudu v systému (2,5 – 3,0 MPa). Základní charakteristiky metod průtokové analýzy [37]: •

Odstraňují fázi odměřování objemu vzorku, pipetování

•

Vyšší rychlost analytického procesu

•

Možnost automatizace - sériové analýzy

•

Miniaturizace aparatury - hospodárnost analytického stanovení

•

Eliminace kontaktu pracovníků s toxickými látkami a organickými rozpouštědly

•

Omezení kontaktu používaných chemikálií s atmosférou

•

Nevýhodou tradičních průtokových metod bývá malá flexibilita

4.3.2 Princip Základním principem všech průtokových analytických metod je sledování závislosti odezvy na impulzu. Impulz je transformován na odpověď pomocí modulátoru. Modulátorem může být mísící cívka (FIA, SIA), nebo analytická kolona (HPLC, SIC) [38]. Impuls

Odezva

Modulátor

Vzorek

Pumpa

Ventil

Modulátor

Detektor

Obrázek 9: Základní princip průtokových metod [38]

44

Disertační práce

Průtoková injekční analýza

Uplatňují se zde dva procesy: •

Fyzikální disperze zóny vzorku uvnitř nosného proudu

•

Chemická reakce složky vzorku s činidlem

4.3.3 Rozdělení průtokových metod A) Metody kontinuálního toku Chromatografie – HPLC (vysokotlaká průtoková metoda) FIA - Flow injection analysis (nízkotlaká průtoková metoda) B) Metody programovatelného toku SIA - Sequential injection analysis SIC - Sequential injection chromatography [38]

4.3.4 Průtoková injekční analýza Průtoková injekční analýza (FIA) [39, 40] je technika založená na vstřikování kapalných vzorků do pohyblivého nesegmentovaného nosného proudu vhodné kapaliny. Nadávkovaný vzorek vytváří zónu, která je pak transportována k detektoru, který zaznamenává změny v požadovaném fyzikálním parametru. FIA využívá kontinuálního průtoku pro transport zóny vzorku, smísení s činidlem a přenos produktu do průtokové cely detektoru [38].

Pumpa

Vzorek Mísící cívka

UV-VIS detektor

Nosný proud Odpad

Obr. 10: Základní schéma FIA systému se skládá ze čtyř částí: peristaltická pumpa, injekční systém – dávkovací nízkotlaký ventil, reakční zóna – mísící cívka a detektor [38].

45

Disertační práce

Průtoková injekční analýza

Vlastní pohyb vzorku a činidel, jejich mísení a chemická reakce probíhá v teflonových nebo polyethylenových trubicích o vnitřním průměru 0,5 – 1 mm. Výsledkem analýzy jsou za sebou jdoucí píky závislosti signálu (např. absorbance) na čase, jejich výška h je mírou koncentrace analytu [41]. Vzorek je při průchodu systémem rozmýván v nosném proudu, který může zároveň obsahovat činidlo a vytváří se koncentrační gradient. Kontrolovaná disperze je základní charakteristikou metody FIA. K disperzi vzorku může dojít přímo v rozpouštědle, kdy nedochází k chemické reakci, a nebo i při chemické reakci v proudu činidla. K popisu koncentračního gradientu se užívá disperzní koeficient D, který je dán poměrem počáteční koncentrace a aktuální koncentrace v daném bodě (čase): D = c0/c kde c0 je počáteční koncentrace a c je aktuální koncentrace. Hodnota D je vždy větší než jedna a nejčastěji se odečítá v bodě maximální koncentrace (cmax), které pak odpovídá hodnota Dmax [41].

Fáze 1

Vzorek

Dávkování

Nosný proud

Fáze 2

Disperze

Nosný proud

Fáze 3

Detekce

Nosný proud

Fáze 4

Vymytí

Nosný proud

Obr. 11: Princip FIA [38] Velikost rozptýlení zóny, a tedy i tvar a výška zaznamenaného signálu, závisí na objemu vzorku, délce reakčních cívek (délce celého vedení) a na parametrech průtokového systému. Pro kvalitní záznam signálu v metodě FIA musí být na jedné straně dosaženo malé disperze vzorku a zároveň musí být poskytnut čas

46

Disertační práce

Sekvenční injekční analýza

pro dostatečný průběh reakce (při měření ale nenastává rovnovážný stav, nestacionární metoda). Oba tyto požadavky jsou však protichůdné, proto je velmi důležité nalézt optimální podmínky pro provedení dané analýzy. Ve FIA metodě je obecně nutné zajistit bezpulsní tok všech chemikálií a přísně reprodukovatelný objem vzorku. Pro detekci ve FIA systému je možné použít jakýkoliv detektor vhodný pro daný reakční produkt v kombinaci s průtokovou celou (vnitřní objem několik desítek µl). Mezi detektory využívající optické vlastnosti látek patří: fotometrické, citlivější fluorimetrické, detektory využívající chemiluminiscenci, a detektory refraktometrické. Z elektrochemických detektorů lze použít iontově selektivní elektrody a vodivostní nebo coulometrické detektory [41].

4.3.5 Sekvenční injekční analýza Sekvenční injekční analýza (SIA) je průtoková analytická metoda, řešící některé nedostatky průtokové injekční analýzy (FIA), ze které byla vyvinuta v roce 1990 [42]. Sekvenční injekční analýza umožňuje snadnou automatizaci složitých postupů sériových analýz velkého počtu vzorků. Významnými rozdíly technik SIA a FIA je odlišnost v geometrii nosného toku, kdy FIA využívá přímý konstantní tok, zatímco SIA využívá změnu přímého a zpětného toku. Tím je dosaženo vyššího stupně konverze analytu na výsledný produkt [43]. Technika SIA používá odlišný princip, jehož charakteristickým rysem jsou oddělené měřící cykly. Nejprve jsou zóny nosného média, vzorku a činidla postupně (jednorázově) aspirovány do jednokanálového systému s využitím selekčního vícecestného ventilu (nejčastěji 6, 8 či 10 cestného) a pístového čerpadla. Pomocí selekčního ventilu jsou řazeny zóny činidel a vzorku v mísící cívce. Pohyb toku je dále pomocí čerpadla obrácen a tím dojde k dokonalejšímu promísení zón za vzniku reakčního produktu, který je dále detekován. Někdy se využívá uzavření zóny vzorku mezi dvě zóny činidla, což zvyšuje výtěžek chemické reakce [43, 44].

47

Disertační práce

Sekvenční injekční analýza

Detektor

Vzorek Produkt Činidlo Nosný proud Nosný proud

Obr. 12: Princip SIA [38] Typická základní konfigurace příslušného SIA systému je schematicky znázorněna na obr. 13. Systém je tvořen jednokanálovým dvousměrným pístovým čerpadlem, vícecestným selekčním ventilem, vhodným detektorem, mísící cívkou, která slouží zároveň jako pojistka proti vniknutí vzorku a činidel do čerpadla, a spojovacím materiálem [44].

Pístová pumpa

Mísící cívka

Detektor

Odpad

Odpad

Nosný proud

Vzorek Pumpa Odpad Činidlo 1

Činidlo 2

Obr. 13: Základní schéma SIA systému [38]

48

Disertační práce

Sekvenční injekční chromatografie

V podstatě se dá říci, že SIA systém pracuje v cyklu naprogramovaných pohybů pístu čerpadla, synchronizovaných s přepínáním pozic selekčního ventilu. Přesná synchronizace a opakovatelnost těchto kroků je nutnou podmínkou k dosažení reprodukovatelné disperze jednotlivých zón v SIA systému a tím i k získání reprodukovatelného koncentračního gradientu reakčního produktu, resp. odpovědi detektoru. Z toho vyplývá, že nezbytnou součástí SIA systému musí být i vhodný počítač s příslušným programovým vybavením, který řídí kroky měřícího cyklu a současně sbírá, uchovává a vyhodnocuje výstupní data [43, 44]. Průtokové rychlosti v SIA se prakticky neliší od FIA a pohybují se obvykle okolo 1 mL min-1 a doba trvání jednoho měřicího cyklu v SIA většinou nepřesahuje 30 s, což je v mnoha případech srovnatelné s frekvencí dávkování vzorku ve FIA. Zatímco ve FIA je v rámci jedné série měření dávkovaný objem vzorku fixní, což je dáno konstantní délkou dávkovací smyčky, u SIA je možno v jednotlivých cyklech objem vzorku cíleně měnit v rozsahu jednotek až stovek µL programováním doby otevření příslušného kanálu selekčního ventilu; tímto postupem lze optimalizovat disperzi zóny vzorku (a tedy citlivost stanovení) podle koncentrace analytu [44]. Protože SIA využívá zastavení a změnu směru toku, jsou spotřeby vzorku a hlavně činidel podstatně nižší než u FIA, kde je čerpání kontinuální. Velkou výhodou je i její flexibilita, daná snadnou změnou parametrů měření pomocí změny příkazů ovládacího programu beze změn konfigurace SIA systému. Nevýhodou SIA proti FIA je nižší frekvence dávkování vzorků [43].

4.3.6 Sekvenční injekční chromatografie 4.3.6.1 Definice sekvenční injekční chromatografie Sekvenční injekční chromatografie (SIC) je originální separační analytická technika vyvinutá v roce 2003 na Katedře analytické chemie, FaF UK, která umožňuje užití speciálních chromatografických materiálů pro separaci látek v nízkotlakém SIA systému. Tato technika vzniká zapojením monolitických kolon do SIA systému s cílem aplikace metody pro analýzu farmaceuticky významných látek. Farmaceutické přípravky mohou obsahovat v matrici více účinných látek nebo degradačních produktů, které mohou mezi sebou při stanovení výrazně interferovat. V těchto případech je nutné před vlastní analýzou přítomné analyty separovat.

49

Disertační práce


Většina dříve vyvinutých SIA a FIA metod se zabývala stanovením léčiv ve farmaceutických přípravcích s jednou účinnou látkou, kde nejsou ve většině případů požadavky na odstranění jednoduché matrice a na separaci. Pro udržení tempa s moderními separačními technikami při vývoji analýz multikomponentních přípravků, je však nutné do SIA systémů začlenit separační prvek, který umožní zvýšit selektivitu a citlivost analýzy. Použití chromatografických kolon je zde ale omezeno kvůli nízkotlakému systému, který nesnese příliš vysoký zpětný tlak. Tento problém je vyřešen použitím monolitických kolon, které díky své porozitě kladou při průtoku mobilní fáze minimální odpor, a proto k dosažení požadovaného průtoku postačují i nízkotlaké pístové SIA pumpy při zachování dostatečné separační účinnosti. Při porovnání s HPLC čerpadly, schopny čerpat mobilní fázi pod tlakem až 40 MPa, je pístová pumpa SIA analyzátoru schopna vyvinout tlak pouze přibližně 2,5 – 3,0 MPa v závislosti na průměru použitého pístu. Písty menšího průměru jsou schopné vyvinout větší tlak, avšak jejich nevýhodou je poměrně malý objem. SIC systém dává nový prostor pro on-line chromatografickou separaci vícesložkových vzorků v nízkotlakém průtokovém systému, což má výhodu v programovatelnosti toku a v možnosti manipulace se vzorkem. SIC je metoda, která je vhodná pro rychlou analýzu jednoduchých směsí (2 - 5 složkových) a pro možnost on-line provedení úpravy vzorku a následnou separaci a stanovení analytů v jednom

systému.

Mezi

výhody

průtokových

metod

patří

automatizace,

miniaturizace a nízká spotřeba vzorků a mobilní fáze [38, 45, 46].

4.3.6.2 Princip sekvenční injekční chromatografie SIC je založena na programovatelném toku mobilní fáze, umožňuje pohodlný výběr objemu vzorku a dokonce i umožňuje jednoduše vytvořit gradient dvou mobilních fází.

50

Disertační práce


A B

C D E Obr. 14: Princip SIC [38]: A) Aspirace vzorku pomocí selekčního ventilu do mísící cívky B) Selekční ventil je přepnut, obrátí se tok mobilní fáze a vzorek prochází na kolonu, kde dochází k separaci C) Aspirace mobilní fáze pomocí selekčního ventilu D) Tok mobilní fáze je obrácen a mobilní fáze vstupuje přes selekční ventil do kolony, odkud je analyt eluován E) Separované analyty jsou unášeny do detektoru

4.3.6.3 Instrumentální vybavení v sekvenční injekční chromatografii Typická základní konfigurace příslušného SIC systému je schematicky znázorněna na obr. 15. Systém je tvořen jednokanálovým dvousměrným pístovým čerpadlem, mísící cívkou, vícecestným selekčním ventilem, separační kolonou a detektorem [38]. Vývoj SIC techniky vyústil ve výrobu komerčního systému SIChromTM (FIAlab®, USA). Přístroj je vybaven 8-cestným selekčním ventilem a pístovou pumpou, která má maximální pracovní tlak do 700 psi (4,8 MPa), což umožňuje analýzy při vyšších průtokových rychlostech mobilní fáze, či analýzy na delších monolitních, nebo krátkých částicových kolonách [45, 47].

51

Disertační práce

Sekvenční injekční chromatografie Pístová pumpa

Mísící cívka

Separační kolona

Odpad

UV-VIS detektor

Vzorek

Nosný proud

Pumpa Mobilní fáze 1

Mobilní fáze 2

Odpad

Odpad

Obr. 15: Základní schéma SIC systému [38] Jednotlivé součásti SIC systému: Čerpadlo Jednotkou generující tok nosného proudu v SIA systému je nejčastěji pístová pumpa, která je poháněna vysoce přesným krokovým motorem. Ten umožňuje aspiraci velmi malých objemů roztoků od jednotek do tisíců mikrolitrů. Pístová pumpa zajišťuje jednoduchou změnu směru toku nosného proudu při plnění nebo vyprazdňování objemu rezervoáru pístové pumpy. Součástí pístové pumpy je trojcestný ventil, který je rovněž ovládán počítačem a který spojuje rezervoár pumpy se zásobníkem nosného proudu a v opačné poloze se SIA systémem [48]. Mísící cívka Mísící cívky mohou být buď přímé, nebo stočené a slouží k dostatečnému promísení vzorku a činidla či několika činidel. Delší průtok těmito cívkami má v podstatě stejnou funkci jako několikanásobná změna směru toku nosného proudu a pro běžná měření stačí hlavní mísící cívka zapojená mezi pístovou pumpu a selekční ventil [48]. Toto umístění je výhodné hlavně proto, že také zabraňuje vniknutí vzorku nebo činidel do rezervoáru pístové pumpy.

52

Disertační práce

SIC aplikace

Selekční ventil Další součástí systému je vícecestný selekční ventil. Nejčastěji se jedná o 6, 8 a 10-cestné ventily. Selekční ventil představuje jednotku, která řídí seřazení jednotlivých zón v mísící cívce, zajišťuje připojení všech požadovaných roztoků k systému, jejich aspiraci a po obrácení toku i transport zón na kolonu a dále do detektoru. Časování poloh selekčního ventilu a jejich synchronizaci s pohybem čerpadla řídí a kontroluje počítač [44]. Separační kolona Jako chromatografické kolony v SIC systému jsou nejčastěji používané monolitické kolony. Ty jsou tvořeny z jednoho kusu vysoce porézního polymerního silikagelu s dvojí porézní strukturou (makropóry a mezopóry). Makropóry (průměrná velikost 2 µm) tvoří hustou síť pórů velmi dobře prostupných pro mobilní fázi, což dramaticky snižuje zpětný tlak a umožňuje použití vyššího průtoku mobilní fáze. Mezopóry (průměrná velikost 13 nm) tvoří porézní jemnou strukturu a vytváří velkou plochu povrchu, na které může docházet k adsorpci molekul analyzované látky. Díky vysoké porozitě mohou být použity velmi vysoké průtokové rychlosti s velmi nízkým zpětným tlakem. Mezi další výhody patří vynikající mechanická stabilita [45, 46]. Detektor Detektory v SIA nejsou systémově omezeny, jejich volba záleží na druhu použité analytické reakce. Využívají se zejména spektrofotometrické, fluorescenční a elektrochemické

detektory

s

příslušnými

průtokovými

celami.

U

spektrofotometrických detektorů se nejčastěji vyskytuje Z-cela s optickou délkou 10 mm a vnitřním průměrem 1,5 mm [44].

4.3.6.4 SIC aplikace Analýzy v sekvenční injekční chromatografii jsou zaměřeny na relativně jednoduché vícesložkové vzorky farmaceutických přípravků. Mohou to být např. roztoky, kapky, sirupy, které mohou být stanoveny přímo jen naředěním vzorku mobilní fází. Ostatní matrice (krémy, tablety, kapsle, apod.) musí být před vlastním stanovením předupraveny (např. extrakcí organickým rozpouštědlem). 53

Disertační práce

SIC aplikace

Délka kolony byla vybírána v závislosti na chromatografických vlastnostech sloučenin obsažených ve vzorku. Mobilní fází byl většinou methanol, nebo acetonitril v objemu dostačujícím pro eluci všech látek z chromatografické kolony. Průtok mobilní fáze byl optimalizován podle délky kolony a tvaru píku (obvykle méně než 1 mL min-1). UV-VIS detektor byl používán ve spojení s Z-průtokovou celou. Dvě nebo tři vlnové délky byly často použity pro detekci současně, hlavně pokud bylo potřeba zvýšit citlivost detekce. Objem vzorku pro jednu analýzu se pohyboval v rozmezí 10 – 20 µL v závislosti na délce kolony. Celý systém byl kontrolován softwarem FIAlab®. SIC slouží jako automatická metoda pro rychlá chromatografická stanovení jednoduchých směsí s možností jednoduché on-line manipulace a předúpravy vzorku [45]. Tab. 1 shrnuje vybrané SIC aplikace pro stanovení účinných látek ve farmaceutických přípravcích:

54

Disertační práce

Analyty Triamcinolon acetonid, kyselina salicylová, propylparaben (IS)

SIC aplikace Farmaceutické přípravky Topický roztok

Rozměry kolony

-1

(mm)

(mL min )

MK 50 + 5 x 4,6 MK

Lidokain, prilokain, trimekain (IS)

Topický krém

Kyselina salicylová, methylsalicylát, propylparaben (IS)

Topická pasta

Ambroxol hydrochlorid, methylparaben, kyselina benzoová, kyselina salicylová (IS)

Farmaceutické

MK

sirupy a kapky

50 + 10 x 4,6

Nafazolin nitrát, methylparaben, ethylparaben (IS)

Methylparaben, propylparaben, diklofenak sodný, buthylparaben (IS)

Methylparaben, propylparaben, triamcinolon acetonid, ketoprofen (IS) Ambroxol hydrochlorid, doxycyklin, ethylparaben (IS) Paracetamol, kofein, kyselina acetylsalicylová, kyselina benzoová (IS)

Nosní kapky

Topický krém

Topický krém

Kapsle a tablety

Tablety

Průtok

0,9

0,6

25 x 4,6 MK

0,6

50 x 4,6

Mobilní fáze ACN/H2O (35:65, v/v) pH 3,3 (upraveno kys. octovou) ACN/fosforečnanový pufr (40:80, v/v) pH 7,1 (upraveno triethylaminem a H3PO4) ACN/H2O (35:60, v/v) pH 2,5 (upraveno 98% H3PO4)

Detekce UV (nm)

Ref.

240

49

212

50

240

51

245

52

220, 256

53

275

54

243

55

213

56

210, 230

57

ACN/tetrahydrofuran/ kyselina octová 0,48

(10:10:90, v/v/v) pH 3,75 (upraveno triethylaminem) methanol/H2O (40:65, v/v)

MK 25 + 5 x 4,6

0,9

pH 5.2 (upraveno triethylaminem a kyselinou octovou)

MK

0,48; 0,9;

25 x 4,6

1,2

ACN/ H2O (40:70 (v/v) pH 2,5 (upraveno triethylaminem a H3PO4) ACN/MeOH/ H2O (35:5:65)

MK 25 + 10 x 4,6 MK

0,6

H3PO4) 0,48

25 x 4,6 MK

0,6

25 x 4,6

55

pH 2,5 (upraveno nonylaminem a

ACN/ H2O (20:90, v/v) pH 2,5 (upraveno 98% H3PO4) ACN/fosforečnanový pufr (10:90, v/v) pH 4,05 (upraveno 8,5% H3PO4)

Disertační práce

Fenoxycarb, permethrin

Indometacin, 2 degradační produkty, ketoprofen (IS)

Vitamín A-acetát, D2, nebo D3, E-acetát

Paracetamol, kofein, propyfenazon, kyselina salicylová (IS)

SIC aplikace Veterinární kožní

MK

sprej

10 x 4,6

Topický gel

Roztok, kapsle

0,6; 1,2

Gradient:

MK

1,2

25 x 4,6

ACN/ H3PO4 (0,2%) 30:70 → 50:50

MK

0,9

25 x 4,6 MK

Tablety

ACN/ H2O (60:40, v/v)

25 + 5 x 4,6

0,9

10 x 4,6

1,2

ACN/MeOH/H2O (20:20:1, v/v/v)

ACN/ H2O (10:90, v/v) pH 3.5 (upraveno kyselinou octovou)

225

224, 237, 305 265, 290, 325

58

59

60

210

61

225

62

ACN/ H2O (30:70, v/v)

MK 100 x 3 α-estradiol, β-estradiol, ethinyl-estradiol, estron, ethylparaben (IS)

roztok standardů

Ascentis® Express C18 30 x 4.6 (2,7 µm)

MK – monolitická kolona

56

0,48

ACN/ H2O (40:60, v/v)

Disertační práce

Porovnání HPLC a SIC

4.4 Porovnání HPLC a SIC Metoda SIC vykazuje srovnatelnou účinnost separace ve srovnání s tradiční HPLC technikou. Mezi výhody SIC patří: krátká doba analýzy, možnost on-line použití činidel ve všech krocích stanovení, produkce odpadů a spotřeba rozpouštědel je nižší než u HPLC (vzhledem k diskontinuálnímu toku u SIC), což umožní snížit náklady na analýzu. SIC přináší možnosti on-line úpravy vzorku v systému díky jednoduché manipulaci s roztoky v systému s obousměrným tokem. Rozměry systému a možnost měření „v terénu“ jsou dalšími výhodami SIC systému. Na druhé straně, je metoda SIC omezena použitím kolon a maximálním množstvím mobilní fáze, která je k dispozici pro jednu analýzu (dáno velikostí rezervoáru pístové pumpy). Robustnost použitého SIC systému není tak vysoká jako u klasické HPLC, hlavně kvůli limitaci objemu pístové pumpy a zpětnému tlaku produkovanému při vyšších průtokových rychlostech mobilní fáze. Další nevýhodou je fakt, že komerční program pro zpracování dat využívá pro kvantifikaci pouze výšky píků [45]. Porovnání výhod a nevýhod SIC a HPLC systému je shrnuto v tab. 2 [45]: Charakteristika

HPLC

SIC

Separace

Ano

Ano – jednoduché směsi

Průtok mobilní fáze

Kontinuální

Diskontinuální

Směr toku mobilní fáze

Jednosměrný tok

Obousměrný tok

Rychlost průtoku mobilní fáze

Konstantní

Variabilní

Spotřeba mobilní fáze

Vysoká

Nízká (diskontinuální tok)

Použití činidel

Limitované

Ano

Předúprava vzorku

Ano (omezená)

Ano

Vyhodnocení dat

Sofistikované

Jednoduché

Cena zařízení

Vysoká

Nízká

Přenosnost

Ne

Ano

57

Disertační práce

Experimentální část

5 KOMENTÁŘ K PUBLIKOVANÝM PRACÍM

58

Disertační práce


5.1 Optimalizace HPLC stanovení klotrimazolu Byla vypracována HPLC

metoda pro stanovení

obsahu

účinné

látky

klotrimazolu a příslušných nečistot (2-chlorfenyl)difenylmethanolu a imidazolu v přípravku Clotrimazol spray 1 %. Předložená práce byla zaměřena na výběr vhodné chromatografické kolony, složení mobilní fáze, jejího pH a vnitřního standardu pro analýzu léčivého přípravku obsahujícího lokálně užívané antimykotikum klotrimazol. Celkem bylo testováno 7 chromatografických kolon: Discovery HS F5 (150 x 4,6 mm, 5 µm);

Chromolith®

Performance,

RP-18e

(100 x 3 mm);

ZIC®

HILIC

(50 x 2,1 mm; 3,5 µm); XTerra® RP 18 (100 x 3 mm, 5 µm); Discovery RP Amide C 16 (250 x 3 mm, 5 µm); Zorbax Extend-C18 (75 x 4,6 mm; 3,5 µm); Discovery ZR-PBD (150 x 4,6 mm, 5 µm). Jako optimální kolona byla zvolena Discovery ZR-PBD. Tato kolona je vyrobena z materiálu na bázi oxidu zirkoničitého, který je potažený vrstvou polybutadienu. Největší výhodou oxidu zirkoničitého je jeho chemická a tepelná stabilita: je stálý v celém rozsahu pH při vysokém tlaku a teplotě až do 200 °C. Byla použita spektrofotometrická detekce při 210 nm. Jako optimální mobilní fáze byla vybrána směs acetonitrilu a vody (pH 9,7) v poměru 50:50. Jako optimální množství nastřikovaného vzorku byl zvolen objem 3 µL a průtok mobilní fáze byl 1 mL min-1. Jako vnitřní standard byl použit ibuprofen. Celkový čas analýzy byl kratší než 4,5 min. Robustnost byla testována pro roztok standardů s vnitřním standardem ibuprofenem. Byl sledován vliv změny pH mobilní fáze v oblasti 9,2 – 11,0 a vliv zvýšené pracovní teploty v rozmezí 25 - 60 °C. Výsledky ukazují pouze malou změnu retenčních časů a ploch píků a tím prokazují vysokou robustnost prezentované metody, která je požadována při rutinním využití pro stanovení klotrimazolu v uvedeném přípravku. Detaily viz. příloha 1.

59

Disertační práce


5.2 Aplikace monolitických kolon ve farmaceutické analýze. Stanovení indometacinu a jeho degradačních produktů Cílem této práce bylo porovnat separační účinnost konvenční částicové kolony a monolitických kolon různé délky. K porovnání byla použita HPLC metoda stanovení indometacinu a jeho dvou rozkladných produktů. Ketoprofen byl použit jako vnitřní standard k hodnocení dat v průběhu celé studie. Konvenční separace byla provedena s využitím částicové kolony Zorbax SB-Phenyl (75 x 4,6 mm; velikost částic 3,5 µm), mobilní fáze složené z acetonitrilu a 0,2 % fosforečné kyseliny v poměru 50:50 (v/v) a průtoku mobilní fáze 0,6 mL min-1. Byly testovány monolitické kolony různé délky: Chromolith Flash RP-18e (25 x 4,6

mm);

Chromolith

SpeedRod

RP-18e

(50 x 4,6 mm)

a

Chromolith

Performance RP-18e (100 x 3 mm). Protože složení mobilní fáze používané v původní metodě nebylo optimální pro monolitické kolony, bylo nutné upravit složení mobilní fáze (pouze zvýšením poměru vodné složky) a její průtok pro jednotlivé kolony tak, aby byly parametry SST zachovány v přijatelných mezích. Vyvinuté metody byly použity pro stanovení všech uvedených látek ve farmaceutickém

přípravku

Indobene

gel.

Chromatografické

parametry

byly

porovnány s parametry získanými z analýzy na konvenční částicové stacionární fázi. Touto prací bylo prokázáno, že monolitické kolony lze použít pro analýzu účinných látek ve farmaceutických přípravcích jen s nepatrnou změnou původních chromatografických podmínek (použitých v HPLC separaci na částicové koloně). Výhodou monolitických kolon je jejich nízký zpětný tlak, který umožňuje využití vyšších průtoků mobilní fáze a tím i zkrácení celkové doby analýzy. V případě stanovení indometacinu a jeho dvou rozkladných produktů byl čas analýzy za využití monolitických kolon zkrácen o polovinu proti částicové koloně. Detaily viz. Příloha 2.

60

Disertační práce


5.3 Separace vitamínů A acetátu, ergokalciferolu, nebo cholekalciferolu a tokoferolu acetátu pomocí sekvenční injekční chromatografie SIC technika vzniká zapojením monolitických kolon do SIA systému s cílem aplikace metody pro analýzu farmaceuticky významných látek. Mezi výhody průtokových metod patří automatizace, miniaturizace a nízká spotřeba vzorků a mobilní fáze. Cílem této práce bylo vyvinout a validovat novou nízkotlakou metodu sekvenční injekční chromatografie pro separaci a současné stanovení ve vodě nerozpustných vitamínů (retinolu acetátu, ergokalciferolu, nebo cholekalciferolu a tokoferolu acetátu). Vitamíny D2 a D3 nebyly stanoveny současně, ale bylo prokázáno, že vyvinutá metoda je použitelná pro analýzu farmaceutických přípravků obsahujících jeden z těchto dvou forem vitamínu D bez potřeby změny separačních podmínek. Různé separační podmínky (délka kolony, složení mobilní fáze, průtok mobilní fáze a aspirovaný objem vzorku) byly testovány. SIC analýzy byly provedeny na komerčně vyráběném přístroji FIAlab® 3000 (FIAlab® Inc., Bellevue, USA), který obsahoval pístovou pumpu o objemu 5 mL, 6-cestný selekční ventil a 10 mm optickou Z-průtokovou celu. Monolitická kolona byla umístěna mezi selekčním ventilem a průtokovou celou. Pro úspěšnou separaci byla použita monolitická kolona OnyxTM Monolithic C18 (25 x 4,6 mm, Phenomenex, USA) s 10 mm předkolonou, mobilní fáze acetonitril:methanol:voda v poměru 20:20:1 (v/v/v), při průtoku mobilní fáze 0,9 mL min-1 (odpovídající 15 µL s-1), detekce při 265 nm (vitamín D), 290 nm (vitamín E) a 325 nm (vitamín A). Celkový čas analýzy byl 5,5 min. Nová SIC metoda s použitím monolitické kolony a UV spektrofotometrické detekce byla použita pro stanovení vitamínu D3 ve farmaceutickém přípravku Vigantol (Merck KGaA, Německo) a vitamínů A, D2 ve farmaceutickém přípravku Vitamin AD Slovakofarma kapsle (Zentiva a.s., Slovensko). Jako vnitřní standard pro kvantifikaci byl použit tokoferol acetát. Detaily viz. Příloha 3.

61

Disertační práce


5.4 Tvorba gradientové eluce v sekvenční injekční chromatografii s využitím monolitických kolon Tato práce se zabývala vývojem a validací gradientové eluce v sekvenční injekční chromatografii (GE - SIC). Použitelnost a separační účinnost navržené SIC metody byla demonstrována na separaci a současné stanovení účinné látky indometacinu

a

methylindoloctové

jeho a

dvou kyseliny

rozkladných

produktů

4-chlorobenzoové)

(kyseliny

v topickém

5-methoxy-2farmaceutickém

přípravku. Ketoprofen byl použit jako vnitřní standard. Byl popsán koncept jednoduché a opakovatelné tvorby gradientu mobilní fáze v SIC pomocí automatizovaného a programovatelného mísení dvou mobilních fázích s různou eluční silou přímo v systému. Optimalizace profilu gradientu GE - SIC s respektem na separační kvalitu může být relativně jednoduše dosaženo pomocí programované změny poměru jednotlivých mobilních fází a jejich rychlosti aspirace do mísící cívky. Byl testován různý profil gradientové eluce. Chromatografická separace byla provedena na monolitické koloně OnyxTM Monolithic C18 (25 mm x 4,6 mm, Phenomenex®, USA). Optimální podmínky gradientové eluce využívají binární mobilní fázi o složení acetonitril a 0,2 % kyselina fosforečná v poměru 30:70 (v/v, MF 1) a 50:50 (v/v, MF 2), průtok mobilní fáze 1,2 mL min-1. Byla použita UV spektrofotometrická detekce při 224 nm (kyselina 5-methoxy-2-methylindoloctová), 237 nm (kyselina 4-chlorobenzoová, ketoprofen) a 305 nm (indometacin). Dále byla vyvinuta technika HPLC s gradientovou elucí, která sloužila jako porovnávací metoda. Obě techniky byly úspěšně použity k separaci a stanovení uvedené účinné látky a degradačních produktů v topickém přípravku Indobene gel 1 % (Ratiopharm GmbH, Ulm, Německo). Detaily viz. Příloha 4.

62

Disertační práce


5.5 Chromatografické stanovení účinných látek v topických přípravcích Cílem této práce bylo vyvinout a validovat novou HPLC metodu pro stanovení obsahu účinných látek nonoxynolu (nonoxyn-9-ol) a trimekainu (trimekainu hydrochloridu) v topických přípravcích - lubrikačních gelech. Práce byla zaměřena na výběr vhodné chromatografické kolony, složení mobilní fáze, pH její vodné složky a výběr vnitřního standardu a dále na validaci navržené HPLC metody. Během vývoje a optimalizace metody byly testovány analytické kolony s různými stacionárními fázemi: Discovery® Cyano (100 x 4 mm, 5 µm), Discovery® RP Amide C16 (250 x 3 mm, 5 µm), Discovery ZR-PBD (150 x 4,6 mm, 5 µm), Luna-NH2 5µm (100 x 3 mm, 5 µm) a X BridgeTM Shield RP18 (50 x 3 mm, 2,5 µm). Separace byla úspěšně provedena na analytické koloně Discovery ZR-PBD (150 × 4,6 mm, velikost částic 5 µm), mobilní fáze byla směsí methanolu a 50 mM triethylaminu (78:22 v/v), pH 9 (upraveno kyselinou octovou) a jako nejvhodnější průtok mobilní fáze byl zvolen 1,0 mL min-1. Pro detekci byla vybrána vlnová délka 210 nm. Ke kvantitativnímu hodnocení byla použita metoda vnitřního standardu, kterým byl zvolen amitriptylin. Celkový čas analýzy byl 7,5 min. Po optimalizaci izolačního postupu (jednoduchá extrakce do roztoku vnitřního standardu v acetonitrilu, působení ultrazvuku a centrifugace) byla metoda úspěšně validována

a

prakticky

aplikována

pro

hodnocení

přípravku

LG

(Herbacos-Recordati, Pardubice, Česká republika). Detaily viz. Příloha 5.

63

non-stop

Disertační práce


5.6 Vývoj a validace HPLC metody pro stanovení kyseliny askorbové, fenylefrinu, paracetamolu a kofeinu s využitím monolitické kolony Nová HPLC metoda s využitím monolitické kolony a UV detekce pro stanovení kyseliny askorbové, fenylefrinu, paracetamolu a kofeinu byla vyvinuta a validována. Kyselina salicylová byla použita jako vnitřní standard. V průběhu optimalizace byly testovány monolitické kolony různé délky (25 - 100 mm) a různého průměru (2 - 4,6 mm). Směs acetonitrilu, methanolu s vodou či pufrem (2,5 -7,5) byla testována jako mobilní fáze pro získání optimálních separačních podmínek. Chromatografická separace výše uvedených účinných látek byla provedena na monolitické koloně Onyx Monolithic C18 (100 x 4,6 mm), mobilní fáze je směsí acetonitrilu a fosforečnanového pufru (pH 6,50) v poměru 10:90 (v/v). Všechny experimenty byly měřeny při laboratorní teplotě. Čas analýzy byl 5 min při průtoku 1 mL min-1. Detekce byla provedena v UV oblasti spektra při vlnové délce 210 nm (pro

fenylefrin, paracetamol a kyselinu salicylovou) a 235 nm (pro kyselinu

askorbovou a kofein). V oblasti kontroly léčiv je novým trendem použití monolitických kolon umožňující zkrácení doby analýzy. Nově vyvinutá metoda v porovnání s dříve publikovanou HPLC metodou [63], využívající částicovou kolonu pro separaci výše zmíněných látek, zkracuje celkový čas analýzy 6 krát. Optimalizovaná metoda byla aplikována na stanovení účinných látek ve farmaceutickém přípravku Coldrex tablety (GlaxoSmithKline Dungarvan Ltd., Co. Waterford, Irsko). Je mnoho farmaceutických přípravků obsahujících stejné účinné látky jako testovaný přípravek. Navrhovaná metoda může být použita pro separaci a současné stanovení testovaných sloučenin v různých farmaceutických přípravcích po jednoduché revalidaci metody. Detaily viz. Příloha 6.

64

Disertační práce

Přehled všech publikovaných prací

6 PŘEHLED VŠECH PUBLIKOVANÝCH PRACÍ 1) Žáková P., Sklenářová H., Havlíková L., Matysová L., Šatínský D.: Optimalizace HPLC stanovení klotrimazolu, Chemické Listy 103(3) (2009) 251 - 255 2) Žáková P., Sklenářová H., Nováková L., Hájková R., Matysová L., Solich P.: Application of monolithic columns in pharmaceutical analysis. Determination of indomethacin and its degradation products, Journal of Separation Science 32 (15 - 16) (2009) 2786 - 2792, Special Issue: Monoliths 3) Sklenářová H., Koblová P., Chocholouš P., Šatínský D., Krčmová L., Kašparová M., Solichová D., Solich P.: Separation of vitamins retinol acetate, ergocalciferol or cholecalciferol and tocopherol acetate using sequential injection chromatography, Analytical Letters, 44 (1 - 3) (2011) 446 - 456 4) Koblová P., Sklenářová H., Chocholouš P., Polášek M., Solich P.: Simple automated generation of gradient elution conditions in sequential injection chromatography using monolithic column, Talanta 84 (5) (2011) 1273 – 1277 5) Matysová L., Koblová P., Galla L., Sklenářová H., Havlíková L., Solich P.: Chromatographic determination of active compounds in topical formulations, Analytical Methods, 2011, přijato k tisku (DOI: 10.1039/C1AY05336A) 6) Koblová P., Sklenářová H., Brabcová I., Solich P.: Development and validation of a rapid HPLC method for the determination of ascorbic acid, phenylephrine, paracetamol and caffeine using monolithic column, Anal. Methods, 2011, odesláno k publikaci

65

Disertační práce

Přehled přednášek a posterů

7 PŘEHLED PŘEDNÁŠEK A POSTERŮ 1) Žáková P., Sklenářová H., Havlíková L., Matysová L., Šatínský D.: Optimalizace HPLC stanovení klotrimazolu, 37. ročník konference Syntéza a analýza léčiv, 8. - 10.9. 2008, Brno, Česká republika 2) Matysová L., Havlíková L., Šestakova V., Žáková P., Solich P.: Application of Monolithic Columns for Determination of Estradiol, Methylparaben and Propylparaben, 5th Conference of Nordic Separation Science Society, 26. - 29.8. 2009, Tallinn, Estonsko 3) Havlíková L., Žáková P., Sklenářová H., Matysová L., Solich P.: Stanovení účinných látek v lubrikačních gelech metodou HPLC, 38. ročník konference Syntéza a analýza léčiv, 14. - 16.9. 2009, Hradec Králové, Česká republika 4) Žáková P., Sklenářová H., Chocholouš P., Brabcová I., Šatínský D., Solich P.: Determination of indomethacin and its degradation products by SIC with gradient elution using monolithic column, 11th Flow Analysis, 14. - 18.9. 2009, Pollensa, Mallorca, Španělsko 5) Žáková P., Sklenářová H., Chocholouš P., Šatínský D., Krčmová L., Solichová D., Solich P.: Separation of vitamins A, D3 and E acetate using sequential injection chromatography (SIC), 11th Flow Analysis, 14. - 18.9. 2009, Pollensa, Mallorca, Španělsko Oceněn odbornou porotou jako nejlepší poster. 6) Chocholouš P., Sklenářová H., Žáková P., Šatínský D., Krčmová L., Kašparová M., Solichová D., Solich P.: Sequential injection chromatography (SIC) for determination of fat-soluble vitamins in human blood serum, 11th Flow Analysis, 14. - 18.9. 2009, Pollensa, Mallorca, Španělsko

66

Disertační práce


7) Sklenářová H., Škrlíková J., Žáková P., Chocholouš P., Andruch V., Solich P.: On-line sample preparation in the sequential injection system, 16th International Conference on Flow Injection Analysis, 25. - 30.4. 2010, Pattaya, Thajsko 8) Žáková P., Sklenářová H., Chocholouš P., Solich P.: Comparison of separation quality in SIC and HPLC systems using gradient elution, 16th International Conference on Flow Injection Analysis, 25. - 30.4. 2010, Pattaya, Thajsko 9) Žáková P., Sklenářová H., Solich P.: Determination of vitamins A-acetate, D2 and E-acetate in ointment samples by HPLC using monolithic column, 28th International Symposium on Chromatography, 12. - 16.9. 2010, Valencie, Španělsko 10) Solich P., Sklenářová H., Škrlíková J., Žáková P., Chocholouš P., Andruch V., Polášek M.: On-line sample preparation in the sequential injection system, International Chemical Congress of Pacific Basin Socities, 15. - 20.12. 2010, Honolulu, USA 11) Koblová P., Sklenářová H., Chocholouš P., Solich P.: Advantages of monolithic columns for separation of pharmaceuticals, 1. fakultní PGS konference, 1. - 2.2. 2011, Hradec Králové, Česká republika 12) Koblová P., Sklenářová H., Brabcová I., Solich P.: Development and validation of a rapid HPLC method for the determination of ascorbic acid, phenylephrine, paracetamol, salicylic acid (internal standard) and caffeine using a monolithic column, 36th International Symposium on High-Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques, 19. - 23.6. 2011, Budapešť, Maďarsko 13) Brabcová I., Koblová P., Dvořáková P., Šatínský D., Solich P.: HPLC Determination of Lutein, Zeaxanthin and Beta-Carotene in Dietary Supplements, 36th International Symposium on High-Performance Liquid

67

Disertační práce


Phase Separations and Related Techniques, 19. - 23.6. 2011, Budapešť, Maďarsko 14) Koblová P., Sklenářová H., Košvancová T., Brabcová I., Solich P.: Stability of active substances using different Coldrex HotRem preparation conditions, 11th International NUTRITION & DIAGNOSTICS, 28. - 31.8. 2011, Brno, Česká republika 15) Brabcová I., Koblová P., Dvořáková P., Šatínský D., Solich P.: Comparison of different extraction methods for the determination of lutein, zeaxanthin and beta-carotene in dietary supplements, International NUTRITION & DIAGNOSTICS, 28. - 31.8. 2011, Brno, Česká republika

68

Disertační práce

Přílohy I-Publikace

8 PŘÍLOHY I – PUBLIKACE

69

Disertační práce

Příloha 1

8.1 Příloha 1 Žáková P., Sklenářová H., Havlíková L., Matysová L., Šatínský D.: Optimalizace HPLC stanovení klotrimazolu, Chem. Listy 103(3) (2009) 251 – 255, IF = 0,620

70

Disertační práce

Příloha 1

71

Disertační práce

Příloha 1

72

Disertační práce

Příloha 1

73

Disertační práce

Příloha 1

74

Disertační práce

Příloha 1

75

Disertační práce

Příloha 2

8.2 Příloha 2 Žáková P., Sklenářová H., Nováková L., Hájková R., Matysová L., Solich P.: Application of monolithic columns in pharmaceutical analysis. Determination of indomethacin and its degradation products, J. Sep. Sci. 32 (15 - 16) (2009) 2786 - 2792, Special Issue: Monoliths, IF = 2,631

76

Disertační práce

Příloha 2

77

Disertační práce

Příloha 2

78

Disertační práce

Příloha 2

79

Disertační práce

Příloha 2

80

Disertační práce

Příloha 2

81

Disertační práce

Příloha 2

82

Disertační práce

Příloha 2

83

Disertační práce

Příloha 3

8.3 Příloha 3 Sklenářová H., Koblová P., Chocholouš P., Šatínský D., Krčmová L., Kašparová M., Solichová D., Solich P.: Separation of vitamins retinol acetate, ergocalciferol or cholecalciferol and tocopherol acetate using sequential injection chromatography, Anal. Lett., 44 (1 - 3) (2011) 446 – 456, IF = 0,920

84

Disertační práce

Příloha 3

85

Disertační práce

Příloha 3

86

Disertační práce

Příloha 3

87

Disertační práce

Příloha 3

88

Disertační práce

Příloha 3

89

Disertační práce

Příloha 3

90

Disertační práce

Příloha 3

91

Disertační práce

Příloha 3

92

Disertační práce

Příloha 3

93

Disertační práce

Příloha 3

94

Disertační práce

Příloha 3

95

Disertační práce

Příloha 4

8.4 Příloha 4 Koblová P., Sklenářová H., Chocholouš P., Polášek M., Solich P.: Simple automated generation of gradient elution conditions in sequential injection chromatography using monolithic column, Talanta 84 (5) (2011) 1273 – 1277, IF = 3,722

96

Disertační práce

Příloha 4

97

Disertační práce

Příloha 4

98

Disertační práce

Příloha 4

99

Disertační práce

Příloha 4

100

Disertační práce

Příloha 4

101

Disertační práce

Příloha 5

8.5 Příloha 5 Matysová L., Koblová P., Galla L., Sklenářová H., Havlíková L., Solich P.: Chromatographic determination of active compounds in topical formulations, Anal. Methods, 2011, přijato k tisku (DOI: 10.1039/C1AY05336A), IF = 1,036

102

Disertační práce

Příloha 5

Chromatographic Determination of Active Compounds in Topical Formulations a

a

Ludmila Matysová , Petra Koblová , Lubomír Gallaa,b, Hana Sklenářováa, Lucie Havlíková*a, Petr Solicha *Correspondence: Lucie Havlíková, Department of Analytical Chemistry, Faculty of Pharmacy, Charles University, Heyrovského 1203, Hradec Králové, Czech Republic E-mail: [email protected] Tel.: +420495067265 Fax: +420495067164

Abstract The aim of this study was to develop and validate new methods for the determination of active compounds in topical gels. Method for the determination of nonoxinol-9 and trimecaine hydrochloride in lubricant gel by HPLC with UV detection was described. Separation was carried using Discovery ZR-PBD analytical column (150 × 4.6 mm, 5 µm), and mobile phase composed of a mixture of triethylammonium acetate buffer (pH 9; 50 mM) and methanol (22:78, v/v). Determination of terpinen-4-ol in lubricant gel was achieved by GC with flame ionization detector (FID). Alltech-AT-624 (0.32 mm ID × 30 m, 1.8 µm film thickness) fused-silica capillary column and helium as the carrier gas, at flow rate 28 cm s−1 were employed. The analysis time was less than 7.5 min for HPLC and 5 min for GC analyses. Both methods were successfully applied to the analysis of pharmaceuticals.

Keywords HPLC, GC, nonoxinol-9, terpinen-4-ol, trimecaine

Introduction The determination of concentration profile of the active compounds, control of their identity, purity, content and control of limits of active substances and contaminants are the integral part of quality control. Quality assurance is conducted in pharmaceutical control and also in case of dietary supplements and para-pharmaceuticals. Nonoxinol-9 (N-9) is a nonionic surfactant used as the active ingredient in most intravaginal contraceptives. It acts by disrupting the cell membrane of sperm as well as those of some sexually transmitted viral and bacterial pathogens [1 - 3]. Recently a number of reports dealing with HPLC methods for the determination of N-9 [1, 4 - 6] was published. These methods were applied for separation of oligomeric components in spermicide N-9 [1], monitoring vaginal retention and thus antiviral activity of N-9 [2], determination of N-9 in human endometrium [3], vaginal lavage [4], determination of N-9 residues in cleaning process [5] and N-9 assay in biological fluids (serum, urine and vaginal fluid) [6]. Trimecaine hydrochloride is acetanilide derivative used as a local anesthetic and cardial antiarrhythmic. A method for the determination of trimecaine and its de-ethylated metabolites in blood plasma by capillary isotachophoresis was described [7]. A technique for determination of drug– protein binding based on a membrane extraction technique termed “equilibrium sampling through membrane” was presented [8]. Tea tree oil (TTO) also known as Melaleuca oil is a complex mixture of terpene hydrocarbons distilled from leaves of the Australian native plant Melaleuca alternifolia. More than 50 individual chemicals have been identified in TTO [9]. The main constituent of TTO is terpinen-4-ol (30–40%) [10]. A HPTLC method for the determination of TTO from cosmetical formulations has been developed [11]. TTO concentration was estimated by analyzing the terpinen-4-ol content. The solvent system consisted of toluene and ethyl-acetate in the ratio 85:15. Another paper described in vitro studies on release and human skin permeation of TTO from topical formulations [9, 10]. Gas

103

Disertační práce

Příloha 5

chromatography for quantitative and qualitative determination of terpinen-4-ol was carried out [12]. FID detector and hydrogen as carrier gas was used for quantitative determination. A qualitative determination was performed using MS detector and helium. The aim of this study was to develop and to validate simple method for the determination of active compounds in lubricant gel where N-9, trimecaine and terpinen-4-ol are commonly presented as active ingredients in different combinations or individually. The determination was divided into two independent methods because of high volatility of terpinen-4-ol. Previous works found in literature were focused on specific applications demanding high separation efficiency or detection sensitivity. In our case simple, quick and robust method was required. Thus the HPLC method deals with the simultaneous determination of active components trimecaine and N-9 with internal standard amitriptyline, the second GC method describes the determination of terpinen-4-ol with internal standard geraniol. Both methods were applied to the analysis of the pharmaceutical products lubricant gels LG non-stop and Tea Tree Fantasy, Herbacos-Recordati, Pardubice, Czech Republic.

Experimental Materials Working standards of N-9, trimecaine hydrochloride, terpinen-4-ol, amitriptyline (internal standard for HPLC), geraniol (internal standard for GC) were used for the purpose of this study. N-9 and terpinen-4-ol active substances were provided by Herbacos-Recordati (Pardubice, Czech Republic). Amytriptyline and geraniol were obtained from Sigma-Aldrich (Prague, Czech Republic). Trimecaine hydrochloride was purchased from Kulich Pharma s.r.o. (Hradec Králové, Czech Republic). Methanol, acetonitrile and tetrahydrofuran (Chromasolv, for LC) were obtained from Sigma– Aldrich. Acetic acid (98%) and hexane were obtained from Lachema (Neratovice, Czech Republic) and triethylamine from Fluka (Sigma–Aldrich). HPLC grade water was prepared by Milli-Q reverse osmosis Millipore (Bedford, MA, USA) and meets European Pharmacopoeia requirements. Tested pharmaceutical gels LG non-stop and Tea Tree Fantasy were supplied from HerbacosRecordati (Pardubice, Czech Republic). LG non-stop contains N-9 and trimecaine hydrochloride as active compounds and water, glycerine, triethanolamine, carbomer, chloroacetamide, sodium benzoate as excipient. Tea Tree Oil is main ingredient in lubricant gel Tea Tree Fantasy. Water, glycerine, carbomer, sodium hydroxide, chloroacetamide and sodium benzoate as excipient are included in this type of lubricant gel. HPLC and GC apparatus Analyses were performed on Shimadzu LC-20 Prominence (Shimadzu, Kyoto, Japan). The chromatographic system consisted of a computer-controlled pump (model LC 20AD), autosampler (model SIL-20AC), photodiode array detector (model SPD-M20A). Shimadzu LC Solution software was used for the system and data management. In optimization step different analytical columns with various stationary phases were tested: Discovery® Cyano (100 x 4 mm, 5 µm), Discovery® RP Amide C16 (250 x 3 mm, 5 µm) and Discovery ZR-PBD (150 x 4.6 mm, 5 µm) columns, bought from Sigma-Aldrich (Prague, Czech Republic). The separation was tested also using Luna-NH2 5µm (100 x 3 mm, 5 µm) column purchased from Phenomenex (Torrance, USA). The last analytical column tested was X BridgeTM Shield RP18 (50 x 3 mm, 2.5 µm) from Waters Corp. (Milford, USA). The Shimadzu GC-17A system with FID detector, split/splitless injector and AOC-20i autosampler (Shimadzu, Japan) was used for all chromatographic analyses. For the GC separation the Alltech-AT-624 (0.32 mm ID × 30 m, 1.8 µm film thickness) fused-silica capillary column (Supelco, Sigma–Aldrich, Prague, Czech Republic) was employed. All collected data were processed by software CSW 1.7 for Windows (Data Apex, Prague, Czech Republic). HPLC and GC analysis The analytical column Discovery ZR-PBD (150 mm × 4.6 mm, 5 µm), was used for the chromatography. The optimal mobile phase for the separation of N-9 and trimecaine was a mixture of triethylammonium acetate (TEAA) buffer (pH 9; 50 mM) and methanol (22:78, v/v). The finally selected and optimized conditions were as follows: sample volume 1 µL, isocratic elution at a flow-rate of 1 mL min−1 at ambient temperature, detection wavelength at 210 nm. The retention times of analytes were as follows: 2.00 min trimecaine; 2.70 N-9; 6.38 min amitriptyline (IS).

104

Disertační práce

Příloha 5

For the GC separation the Alltech-AT-624 (0.32 mm ID × 30 m, 1.8 µm film thickness) fusedsilica capillary column was chosen. Helium was used as the carrier gas, flow rate 28 cm s−1 and an injection volume of 1 µL were employed. The temperatures of injector, column and detector were 220, 200 and 220 °C, respectively. The retention time of terpinen-4-ol was 4.18 min and of geraniol (IS) 4.77 min.

Standard preparation

HPLC: Standard solutions were prepared by dissolving the appropriate substance in acetonitrile. The final concentrations of the sample or reference standards were about 250 mg L−1 of trimecaine hydrochloride, 400 µg L−1 of N-9 and 200 mg L−1 of internal standard amitriptyline. It was necessary to keep the solution at decreased temperature (4 °C) and in dark. GC: Standard solutions were prepared by dissolving appropriate substance in methanol. The final concentrations of the sample or reference standards were about 60 mg L−1 of terpineol and 80 mg L−1 of internal standard geraniol. The solution was kept at decreased temperature (4 °C) and in dark. Sample preparation

HPLC: Amount of 1 g of the gel (corresponds to 5 mg of the active substance trimecaine and 4 µg of

N-9) was accurately weighted and transferred into a centrifuge flask. 10 mL of working solution of internal standard (200 mg L−1 solution of amytriptyline in acetonitrile) was added. The mixture was placed into the ultrasonic bath for 10 min and then centrifuged at 3904 × g (6000 rpm) for 10 min. The supernatant was filtered through 0.45 µm pore filters (Biotech, Czech Republic) and injected directly into the chromatographic system.

GC: Amount of 1.5 g of the gel (corresponds to 0.6 mg of the active substance terpinen-4-ol) was

accurately weighted and transferred into a centrifuge flask. 10 mL of working solution of internal standard (80 mg L−1 solution of geraniol in methanol) was added. The mixture was placed into the ultrasonic bath for 10 min and then centrifuged at 3904 × g (6000 rpm) for 10 min. The supernatant was filtered through 0.45 µm pore filters (Biotech, Czech Republic) and injected directly into the chromatographic system. Mobile phase preparation Solution of 50 mM TEAA buffer was prepared by dissolving 7.0 ml of triethylamine (molar mass 101.19 g L-1) in 1 L of water for HPLC andthe pH was adjusted to 9.0 with acetic acid. Mobile phases were prepared by simple mixing of individual components methanol and TEAA buffer and filtering with the Millipore filtration device.

Results and discussion The aim of this study was to develop and validate a new method for the determination of N-9 and trimecaine using HPLC and terpinen-4-ol using GC in a pharmaceutical formulation (gel).

HPLC

Various types of analytical columns were tested for obtaining sufficient selectivity and separation efficiency. Firstly two different types of analytical columns (Discovery® Cyano and Discovery® RP Amide C16) were used. Separation conditions were based on original previously validated methods [4, 13]. Mobile phases consisting of acetonitrile, methanol, tetrahydrofuran and water in different ratios and combinations were applied. Therefore, some experiments were performed using water in pH range 2.5 – 7.5 either in combination with acetonitrile or methanol (40 – 90 %). The pH value was used with respect to a working pH range of individual columns. In the next step we tested analytical columns (Luna-NH2 5µm and X BridgeTM Shield RP18) using higher pH values up to 11. Chromatography was performed using isocratic elution with mobile phase of binary mixture composed of acetonitrile or methanol with water. It was not possible to use above mentioned columns due to low value of resolution between trimecaine and N-9. No sufficient results were obtained under the above mentioned conditions;

105

Disertační práce

Příloha 5

separation was not improved using different mobile phases and pH of aqueous phase. In our study, we did not use the gradient elution, the isocratic elution was preferred for simple and quick analysis. Analytical column Discovery ZR-PBD (150 x 4.6 mm, 5 µm) enables separation in pH range 1 – 13. Various mobile phase compositions (acetonitrile or methanol, water, ammonium acetate buffer, ammonium hydrogen phosphate buffer, triethylammonium acetate buffer) and different pH of aqueous phase were tested. The best results were reached with Discovery ZR-PBD column with a mobile phase composed of TEAA buffer (pH 9; 50 mM) and methanol (22:78, v/v) at a flow rate of 1.0 mL min-1. In this case analysis lasted about 7.5 min. Many different substances were tested as internal standards. Trimethoprim, hydrocortisone and fluphenazine had longer retention time than 20 min. Verapamil, prilocaine, procaine, diltiazem ejected retention time about 6 min, but symmetry factor was not sufficient. Ibuprofen, propylparaben, lidocaine coeluted with tested active substances with retention time about 2 min. Amitriptyline was successfully separated from other compounds in solution, having the retention time about 6.5 min and good symmetry factor. Therefore, amitriptyline has been used as internal standard. The extraction procedure of the compounds from the gel was developed. Organic modifiers acetonitrile and methanol were tested and the time of sonication (5-25 minutes) was optimized. 10 minutes in the ultrasonic bath and acetonitrile enabled sufficient recovery value (99.87 % for trimecain and 99.65% for N-9).

GC

Development of GC method was based on the previously published method for the determination of p-cymene in TTO with terpinen-4-ol as an internal standard [14]. The column temperature was modified to get better response of the FID detector. Two types of solvents for sample extraction were tested (methanol and hexane). Methanol was chosen as more suitable trough its good properties for sample preparation mainly lower toxicity and volatility. Optimization of the separation conditions was carried out with respect to appearance of gel basis peak. Thus terpinen-4-ol analysis could not be shortened because of complete separation from the matrix peak corresponded to gel basis residues. Several types of substances were tested as potential internal standard (geraniol, eugenol, bornyl acetate and carvacrol for example). Geraniol was chosen as internal standard because its retention time was optimal for the analysis. The concentration of internal standard solution was tested to get comparable area of both separated substances. The optimal concentration of internal standard solution was found as 80 mg L−1. The extraction to various solvents and two types of centrifugation tubes was tested. Hexane was found unsuitable solvent because tube with screw cap was necessary to be used and these tubes had unsuitable shape. The gel sample was kept in conical bottom and the recovery value was very low. Methanol was tested as potential solvent too. Because of lower volatility than hexane it was possible to use the tube of spherical shape which was closed only by parafilm for extraction of terpinen-4-ol from gel. The obtained content was 0.043 % (limit for assay of terpinen-4-ol is minimal 0.030% in gel). Analytical parameters and validation System suitability parameters and validation parameters were evaluated. Afterwards, the method was successfully applied for the determination of active substances in gel material. All compounds were successfully separated using the proposed procedures and several chromatographic parameters, such as peak symmetry factor, resolution, number of theoretical plates, repeatability (system suitability parameters), linearity, selectivity, robustness, precision and accuracy (method validation) were calculated from experimental data and are presented in Table 1. All results were in good agreement with values set by validation authorities [15-17].

106

Disertační práce

Příloha 5

Table 1 Validation parameters of the individual compounds Parameter SST Theoretical platesa HETPa (µm) Symmetry factora Peak resolutiona Repeatabilitya of tR (%) Repeatabilitya of area (%) Validation Precisiona (% R.S.D.) Linearityb (correlation coefficient) Accuracya (% R.S.D.) Accuracya (% recovery) Selectivity a b

Nonoxinol-9

Trimecaine

Terpinen-4-ol

1371 109.41 1.34 3.36 0.14 0.84

3562 42.11 1.45 1.54 0.00 0.20

50378 595.50 1.06 6.75 0.92

2.68 0.9992 0.82 99.65 No interference

2.48 0.9992 0.75 99.87 No interference

3.03 0.9967 2.24 101.41 No interference

made in six replicates at six concentration levels

System suitability parameters were measured to verify the system performance. All important characteristics were measured and calculated using standard solution injection in six replicates. In the case of the parameters number of prepared sample or standard solutions and individual injections will be described in detail in following captures. The chromatogram in Fig. 1 was obtained using the described HPLC method with the standard solution of trimecaine, N-9 and amitriptyline. All compounds were completely separated. The chromatogram in Fig. 2 shows the GC analysis of standard solution of terpinen-4-ol and geraniol.

FIG 1: HPLC chromatogram of the standard solutions (trimecaine, nonoxinol-9 and amitriptyline) using column Supelco Discovery® ZR-PBD (150 x 4.6 mm, 5 µm), mobile phase 50 mM TEAA buffer and methanol (22:78, v/v) at a flow rate of 1.0 mL min-1, detection wavelength at 210 nm

107

Disertační práce

Příloha 5

FIG 2: GC chromatogram of the standard solutions (terpinen-4-ol and geraniol) using fused-silica capillary column Alltech-AT-624 (0.32 mm ID × 30 m, 1.8 µm film thickness) and helium as carrier gas

HPLC: All results were in a good agreement with values set by validation authorities. Linearity was established with a series of working solutions prepared by diluting the stock solution in acetonitrile to the final concentrations in the range from 250 to 750 mg L−1 for trimecaine and from 200 to 600 µg L−1 for N-9. The method of linear regression was used for data evaluation. Each concentration was injected in triplicate and the mean value of peak area was taken for the calibration curve. The calibration graph involved at least six experimental points and was described by the correlation coefficient 0.9992 for trimecaine and 0.9992 for N-9. To validate the precision of the method a number of six different pharmaceutical sample solutions were used, which were prepared from the same batch and analyzed consecutively. The precision of the method calculated as R.S.D. of six sample determinations, including sample preparation, the obtained value was 2.48% for trimecaine and 2.68% for N-9. The accuracy (% of recovery, % of R.S.D.) of the method was carried out measuring the pharmaceutical samples fortified with known quantity of the analyte (addition of 100% amount of the standard to pharmaceutical preparation). Spiked sample solutions and un-spiked sample solutions were compared for recovery evaluation. Mean values of the recoveries (and R.S.D) were found as 99.87% (0.75%) for trimecaine and 99.65% (0.82%) for N-9. GC: The validation parameters showed good results for all analytical parameters corresponding to set limits: peak symmetry factor 1.06; resolution 6.75 (terpinen-4-ol and geraniol); number of theoretical plates 50378; repeatability of peak area 0.92%. Linearity was established with a series of working solutions prepared by diluting the stock solution with methanol to the final concentrations. Each concentration was injected in triplicate and relation between the ratio A of the peak areas (Asample/AIS) of calibration solutions and the concentration of terpinen-4-ol was evaluated by the linear regression method. Calibration range was 30 – 90 mg L−1, with correlation coefficient 0.9967 for terpinen-4-ol. Precision and accuracy of the method were evaluated for terpinen-4-ol and obtained values were 3.03% (R.S.D.) and 101.41% (recovery; 2.24% R.S.D.) respectively. Conclusion Two novel simple methods for the determination of active substances in the lubricant gels were described. The first method – HPLC with UV detection was used to determine trimecaine, N-9, using amitriptyline as internal standard, the second method – GC with flame ionisation detection deals with the determination of terpinen-4-ol using geraniol as internal standard. Compared to previous works that solved complicated separations of degradation products or determination of trace amounts the developed methods were prepared for quick and robust determinations that fulfilled all requirements of pharmaceutical authorities relating to system suitability test and process validation. Separations of compounds were obtained with sufficient peak symmetry factor, resolution; both methods are simple, reproducible, with a good accuracy and precision.

108

Disertační práce

Příloha 5

The described methods are used for routine analysis of active compounds in pharmaceutical products - lubricant gels LG non-stop and Tea Tree Fantasy that was proved by identification and quantitative analysis of the mentioned compounds in tested gels. Acknowledgements The authors gratefully acknowledge following financial support: L.M., P.K.,H.S., L.H., P.S. from the Ministry of Education of the Czech Republic (MSM 0021620822), P.K. the Grant Agency of the Charles University (34609/2009) and P.K. the Student grant SVV-2011-263-002.

Notes and References a

Department of Analytical Chemistry, Faculty of Pharmacy, Charles University, Heyrovského 1203,Hradec Králové, Czech Republic b Herbacos Recordati, Štrossova 239, Pardubice, Czech Republic [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17]

B. A. Walter, G. A. Digenis, Pharm. Res. 8, 1991, 3, 409. F. R.Witter, P. Barditch-Crovo, L. Rocco, C. B. Trapnell, Int. J. Gyn. Obst., 1999, 65, 165. J. K. Jain, A. Li, P. Minoo, D. L. Nucatola, J. C. Felix, Contraception, 2005, 71, 137. J. L. McPherson, J. H. Nichols, P. Bardltch-Crovo, F. M. Hamzeh, J. Chromatogr. B, 1996, 677, 204. M. J. Shifflet, M. Shapiro, C. Levin, R. DeNisco, LCGC, 2001, 19 (3), 312. G. J. Beck, D. Kossak, S. J. Saxena, J. Pharm. Sci, 1990, 79 (11), 1029. Z. Stránský, Z. Chmela, P. Peč, L. Šafařík, J. Chromatogr. B, 1985, 342, 167. T. Trtić-Petrović, J. A. Jönsson, J. Chromatogr. B, 2005, 814, 375. J. B. Nielsen, F. Nielsen, Arch. Dermatol. Res., 2006, 297, 395. J. Reichling, U. Landvatter, H. Wagner, K. H. Kostka, U. F. Schaefer, Eur. J. Pharm. Biopharm., 2007, 64, 222. S. S. Biju, A. Ahuja, M. R. M. Rafiullah, R. K. Khar, J. Pharm. Biomed. Anal., 2005, 38, 41. I. A. Southwell, M. F. Russell, Phytochemistry, 2002, 59, 391. K. Yu, Y. W. Chien, Int. J. Pharm., 1995, 125, 81. G. A. Shabir, J. Pharm. Biomed. Anal., 2005, 39, 681. International Conference on Harmonization (ICH), Q2 (R1): Validation of Analytical Procedures: Text, US FDA Federal Register, 1995, 60, 11260. International Conference on Harmonization (ICH), Q2 (R1): Validation of Analytical Procedures: Methodology, US FDA Federal Register, 1997, 62, 27463. European Pharmacopoeia, the seventh edition, Council of Europe, 2010.

109

Disertační práce

Příloha 6

8.6 Příloha 6 Koblová P., Sklenářová H., Brabcová I., Solich P.: Development and validation of a rapid HPLC method for the determination of ascorbic acid, phenylephrine, paracetamol and caffeine using monolithic column, Anal. Methods, 2011, odesláno k publikaci

110

Disertační práce

Příloha 6

Development and validation of a rapid HPLC method for the determination of ascorbic acid, phenylephrine, paracetamol and caffeine using monolithic column

Petra Koblová, Hana Sklenářová*, Ivana Brabcová, Petr Solich Department of Analytical Chemistry, Faculty of Pharmacy, Charles University, Heyrovského 1203, 500 05 Hradec Králové, Czech Republic [email protected], tel.: +420495067265, fax: +420495067164

Abstract This article reports a fast and simple liquid chromatographic method for determination of ascorbic acid, phenylephrine, paracetamol and caffeine. Salicylic acid was used as internal standard. The analytes were successfully separated in less than 5 min by isocratic elution using monolithic column, Onyx Monolithic C18 (100 x 4.6 mm), with mobile phase composed of acetonitrile - phosphate buffer (pH 6.50) (10:90, v/v) at a flow rate of 1.0 mL min-1 and 25°C, sample volume was 10 µL. Detection was observed at two wavelengths 210 nm (phenylephrine, paracetamol and salicylic acid) and 235 nm (ascorbic acid and caffeine). The optimized method was applied for the determination of the analytes in pharmaceutical formulation Coldrex tablets (Smithkline Beecham Consumer Healthcare, United Kingdom) commonly used in the virosis treatment.

Keywords: ascorbic acid; caffeine; monolithic column; paracetamol; phenylephrine

1. Introduction

Ascorbic acid, phenylephrine, paracetamol and caffeine are widely used in diseases accompanied by pain and fever such as common cold and other viral infections as an analgesic, antipyretic and decongestant active substances.

111

Disertační práce

Příloha 6

A variety of methods for the determination of some of these compounds were found in literature [1–22] but only one of them [1] described the determination of all four compounds simultaneously. Analysis was performed with a particle column LiChrospher 100 RP-18 (250 x 4 mm, 5 µm); the mobile phase consisted of a mixture of methanol and phosphate buffer (pH 3) in ratio of 35:65 (v/v) and the analysis time was 30 min. Theophyline was chosen as internal standard. Developed method was used for analysis of tested compounds in pharmaceutical formulations (Panadol Extra, Vitaminum C and Efferalgan Vitamine C). Most of the above mentioned methods were used for the determination of paracetamol combinations like paracetamol - ascorbic acid [8, 14], paracetamol - phenylephrine hydrochloride [5, 10, 11, 13, 20, 21] and paracetamol - caffeine [2, 4, 9, 12, 16, 17, 22]. The aim of this study was to develop and validate a rapid HPLC method for the determination of ascorbic acid, phenylephrine, paracetamoland caffeine using a monolithic column. The optimized method was applied for the determination of tested analytes in the pharmaceutical formulation Coldrex tablets (GlaxoSmithKline Dungarvan Ltd., Co. Waterford, Ireland) commonly used in virosis treatment.

2. Experimental 2.1.

Chemicals

Working standards of ascorbic acid (ASC), phenylephrine (PHE), paracetamol (PAR), caffeine (CAF) and salicylic acid (SAL) were provided by Sigma–Aldrich (Prague, Czech Republic). Monopotassium phosphate and disodium hydrogen phosphate were obtained from Merck (Darmstadt, Germany). HPLC grade acetonitrile and methanol were purchased from Sigma–Aldrich (Prague, Czech Republic). The deionised water was purified by a Milli-Q system (MilliporeTM, Czech Republic). All other used chemicals were of analytical grade quality. The pharmaceutical formulation used for method validation was Coldrex tablets (GlaxoSmithKline Dungarvan Ltd., Co. Waterford, Ireland). 1 tablet contains: Paracetamol (500 mg), Caffeine (25 mg), Phenylephrine hydrochloride (5 mg), Terpine hydrate (20 mg), Ascorbic acid (30 mg) and excipients including cornstarch, pregelatinized starch, talc, stearic acid, povidone, potassium sorbate, sodium lauryl sulphate, sunset yellow (E 110).

2.2.

Chromatographic system

Analyses were performed using the Breeze HPLC System (Waters Corp., USA), consisting of a binary pump (Waters 1525 Binary HPLC Pump), an autosampler (Waters 717 plus), a UV detector

112

Disertační práce

Příloha 6

(Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector) and a PC for data processing. The data were collected and analyzed by the Breeze software. The analytes were successfully separated in less than 5 min by isocratic elution on the monolithic column (Onyx Monolithic C18, 100 x 4.6 mm, Phenomenex), with a mobile phase composed of acetonitrile - phosphate buffer (pH 6.50) (10:90, v/v) at a flow rate of 1.0 mL min-1 at 25°C, sample volume was 10 µL. Detection was observed at two wavelengths 210 nm (PHE, PAR and SAL) and 235 nm (ASC and CAF) to keep sufficient precision for all active substances.

2.3.

Standards preparation

Stock and standard solutions of ASC, PHE, PAR, CAF and SAL were prepared by dissolution in mobile phase. Mixed standard solution for separation experiments contained 300 µg mL-1 of ASC, 50 µg mL-1 of PHE, 100 µg mL-1 of PAR, 250 µg mL-1 of CAF and 50 µg mL-1 of SAL in mobile phase. All stock and standard solutions were stored at 4°C and mixed standard solution was prepared weekly.

2.4.

Sample preparation

A total amount of 10 tablets (Coldrex tablets) was accurately weighed and powdered in a mortar. Quantity equivalent to one quarter of tablet was accurately weighed and dissolved in internal standard solution (50 µg mL-1 of SAL) in mobile phase in 25.00 mL volumetric flask. After 15 min in an ultrasonic bath, the solution was transferred to centrifuge tube and centrifuged at 3904 × g (6000 rpm) for 15 min. Supernatant was filtered through membrane filter (Nylon, pore size 0.45 µm) (Solution A – expected concentrations corresponded to mixed standard solution) and then diluted 50 times with internal standard solution to final concentration (Solution B – for PAR determination at 100 µg mL-1 level). Solution A was used for quantitation of ASC, PHE, CAF and solution B for evaluation of PAR concentration.

3. Results and discussion 3.1.

Optimization of chromatographic parameters

113

Disertační práce

Příloha 6

Separation efficiency of monolithic columns (C18; 25-100 mm long) with various internal diameters (2 - 4.6 mm) was compared and 100 mm long monolithic column with internation diameter 4.6 mm was chosen for the next optimization due to sufficient resolution of all analyzed substances. During our preliminary experiments, several combinations of the mobile phase composition (acetonitrile, methanol and mixture of acetonitrile, methanol and water or buffers) and pH were tested to obtain the optimum separation conditions. Acetonitrile percentages (5 - 15%) and mobile phase pH (2.5 - 7.5) were examined in detail. Prolonged retention time with decreased acetonitrile content was more significant for CAF Retention times of CAF ranged from 2.60 min (15 % of acetonitrile) to 12.20 min (5 % of acetonitrile). pH did not affect retention of ASC and CAF, but retention of PHE and PAR was decreased with lower pH. Resolution of ASC and PHE was not sufficient in pH lower than 5. On the other hand the peaks of PHE and PAR were overlapped in pH higher than 7.5. The best separation was achieved with mobile phase composed of acetonitrile and phosphate buffer (pH 6.50) (10:90, v/v). The method of internal standard was used for precise data evaluation and several compounds were tested throughout the method development (methylparaben, diclophenac, ibuprofen, salicylic acid, sodium benzoate). SAL was chosen as optimal for the purpose of the described analysis. Extraction procedure for tablets containing ASC, PHE, PAR and CAF was optimized as well. The isolation procedure was based on previous experience with analysis of tablets routinely carried out in our laboratory. Two extraction media - methanol and mobile phase were tested and mobile phase was chosen because of lower recovery of ASC (86.51 %) and PHE (85.49 %) using methanol as extraction agent.

3.2.

Analytical parameters and validation

All compounds were successfully separated using the proposed procedures (Onyx Monolithic C18, 100 x 4.6 mm, Phenomenex, 10 µL sample volume, a mobile phase composed of acetonitrile - phosphate buffer pH 6.50, 10:90 at a flow rate of 1.0 mL min-1, ambient temperature, detection wavelengths of 210 and 235 nm) and several chromatographic parameters, such as peak asymmetry, peak resolution, number of theoretical plates, height equivalent to a theoretical plate, repeatability of peak area and retention time, were calculated from experimental data. Results are given in Table 1 and obtained

114

Disertační práce

Příloha 6

values were in good agreement with limits set by validation authorities (ICH; European Pharmacopoeia) [23-25].

The repeatability (Table 1) of the method was checked by six injections of standard solution (ASC, PHE, PAR, CAF and SAL) and was expressed as the relative standard deviation values (RSD %).

The chromatogram in Fig. 1 was obtained using the HPLC method for separation of mentioned substances in the standard solution. Fig. 2 shows separation of tested analytes in Coldrex tablets (including sample solutions A and B).

Fig. 1: HPLC chromatogram of standard solution using Onyx™ Monolithic C18 column (100 x 4.6 mm), mobile phase acetonitrile:phosphate buffer (pH 6.50) 10:90 (v/v), flow rate 1.0 mL min-1; ASC - ascorbic acid, PHE - phenylephrine, PAR - paracetamol, SAL - salicylic acid, CAF – caffeine

115

Disertační práce

Příloha 6

Fig. 2: HPLC chromatogram of sample solution A and B (Coldrex tablets) using Onyx™ Monolithic C18 column (100 x 4.6 mm), mobile phase acetonitrile:phosphate buffer (pH 6.50) 10:90 (v/v), flow rate 1.0 mL min-1; main figure – solution A, inserted figure – solution B; ASC – ascorbic acid, PHE – phenylephrine, PAR – paracetamol, SAL – salicylic acid, CAF - caffeine

The validation parameters included linearity, precision and accuracy and results are described in Table 2. Values of mentioned parameters were, in all cases, calculated as a ratio of the respective value for individual compound and the value for internal standard obtained in one analysis. Linearity (Table 2) was established with a series of working solutions prepared by dilution of the stock solution in mobile phase to the final concentrations corresponded to 50, 70, 90, 100, 120, and 150 % of the labeled content of each active substance. The calibration graphs thus involved six experimental points for each compound and solutions were injected in triplicate. The correlation coefficient values were 0.9992 for ASC, 0.9994 for PHE, 0.9999 for PAR and 0.9992 for CAF, respectively. To validate the precision (Table 2) of the method six sample solutions prepared from the same pharmaceutical formulation were analyzed consecutively; three injections of each preparation were used for evaluation. The results were expressed as RSD values and obtained results were 2.24 % for ASC, 0.30 % for PHE, 1.29 % for PAR and 2.17 % for CAF, respectively. The accuracy of the method was carried out measuring the pharmaceutical samples fortified with known quantity of the analytes (addition of 100 % amount of the standard to sample solution).

116

Disertační práce

Příloha 6

Spiked and un-spiked sample solutions results were compared for recovery evaluation. Obtained values of the recoveries (and RSD) were 101.28 % (2.51 %) for ASC, 103.30 % (1.81 %) for PHE, 98.67 % (1.80 %) for PAR and 101.87 % (3.64 %) for CAF. Accuracy proved that the method allows direct determination of ASC, PHE, PAR and CAF in tablets of Coldrex formulation in the presence of other excipients. The developed method was then applied for the determination of tested substances in the commercially available tablets Coldrex (Smithkline Beecham Consumer Healthcare, United Kingdom) commonly used in virosis treatment. Active substance content was evaluated as percentage of labeled amount and obtained results were: 98.52 % for ASC, 97.45 % for PHE, 96.76 % for PAR and 97.04 % for CAF. These values were in set limits for content of the active ingredient in tablets with amount lower than 0.05 g (ASC, PHE, CAF; limit 5 %) or higher than 0.05 g (PAR; limit 10 %).

4. Conclusions The HPLC method with the monolithic column and UV spectrophotometric detection for the determination of ASC, PHE, PAR and CAF in the pharmaceutical formulation Coldrex tablets (GlaxoSmithKline Dungarvan Ltd., Co. Waterford, Ireland) using SAL as internal standard was developed. Complete separation of all mentioned compounds was carried out in 5 min with the 100 x 4.6 mm monolithic column. The mobile phase consumption was 5 mL (0.5 mL of acetonitrile) per single analysis. In the field of drug control modern trend of monolitihic columns offer quick analysis

117

Disertační práce

Příloha 6

compared to particle based columns and in the described determination analysis time was shortened 6-times. As many pharmaceutical formulations used in virosis treatment (with the same active substances as Coldrex tablets) are produced the proposed method can be used for the separation and simultaneous determination of tested compounds in different formulations after re-validation to the respective formulation.

Acknowledgements

This study was supported by the Charles University in Prague (Project SVV2011/263 002) and the Grant Agency of the Charles University, No. 34609/2009.

References [1] I. Muszalska, M. Zajac, K. Czajkowski, M. Nogowska, Simultaneous Determination of Paracetamo), Caffeine, Ascorbic Acid and Phenylephrine Hydrochloride in Pharmaceutical Formulations by HPLC, Chem. Anal. (Warsaw) 45 (2000) 825-833. [2] A. W. Abu-Qare, M. B. Abou-Donia, A validated HPLC method for the determination of pyridostigmine bromide, acetaminophen, acetylsalicylic acid and caffeine in rat plasma and urine, J. Pharm. Biomed. Anal. 26 (2001) 939-947. [3] B. Gowramma, S. Rajan, S. Muralidharan, S. N. Meyyanathan and B. Suresh, Int. J. Chem. Tech. Res. 2(1) (2010) 676-680. [4] C. Pistos, J.T. Stewart, Assay for the simultaneous determination of acetaminophen–caffeine–butalbital in human serum using a monolithic column, J. Pharm. Biomed. Anal. 36 (2004) 737–741. [5] A. Marín, C. Barbas, CE versus HPLC for the dissolution test in a pharmaceutical formulation containing acetaminophen, phenylephrine and chlorpheniramine, J. Pharm. Biomed. Anal. 35 (2004) 769–777. [6] U. R. Cieri, Determination of Phenylephrine Hydrochloride, Chlorpheniramine Maleate, and Methscopolamine Nitrate in Tablets or Capsules by Liquid Chromatography with Two UV Absorbance Detectors in Series, J. AOAC Int. 89 (1) (2006) 53-57. [7] I. Baranowska, P. Markowski, J. Baranowski, Development and Validation of an HPLC Method for the Simultaneous Analysis of 23 Selected Drugs Belonging to Different Therapeutic Groups in Human Urine Samples, Anal. Sci. 25 (2009) 1307-1313. [8] M. A. Korany, O. T. Fahmy, H. Mahgoub, H. M. Maher, High performance liquid chromatographic determination of some guaiphenesin-containing cough-cold preparations, Journal of Advanced Research 2 (2011), 121–130. [9] M. Kartal, LC method for the analysis of paracetamol, caffeine and codeine phosphate in pharmaceutical preparations, J. Pharm. Biomed. Anal. 26 (2001) 857–864. [10] B. Olmo, A. García, A. Marín, C. Barbas, New approaches with two cyano columns to the separation of acetaminophen, phenylephrine, chlorpheniramine and related compounds, J. Chromatogr. B 817 (2005) 159-165. [11] A. García, F.J. Rupérez, A. Marín, A. de la Maza, C. Barbas, Poly(ethyleneglycol) column for the determination of acetaminophen, phenylephrine and chlorpheniramine in pharmaceutical formulations, J. Chromatogr. B 785 (2003) 237–243.

118

Disertační práce

Příloha 6

[12] J.T. Franeta, D.D. Agbaba, S.M. Eric , S.P. Pavkov, S.D. Vladimirov, M.B. Aleksic, Quantitative analysis of analgoantipyretics in dosage form using planar chromatography, J. Pharm. Biomed. Anal. 24 (2001) 1169-1173. [13] C. A. Bastos, M.A. L. de Oliveira, Quantitative determination of acetaminophen, phenylephrine and carbinoxamine in tablets by high-performance liquid chromatography, Quim. Nova 32 (7) (2009) 1951-1955. [14] S. Yu. Garmonov, I. A. Salakhov, Quantitative hplc determination of antigrippin drug components, Pharm. Chem. J. 43 (11) (2009) 637-640. [15] P. R. Battu, M. S. Reddy, RP-HPLC method for simultaneous estimation of paracetamol and ibuprofen in tablets, Asian J. Research Chem. 2(1) (2009) 70-72. [16] D. Šatínský, I. Neto, P. Solich, H. Sklenářová, M. Conceicao, B. S. M. Montenegro, A. N. Araújo, Sequential injection chromatographic determination of paracetamol, caffeine, and acetylsalicylic acid in pharmaceutical tablets J. Sep. Sci. 27 (2004) 529–536. [17] S. Sun, G. Liu, Y. Wang, Simultaneous Determination of Acetaminophen, Caffeine, and Chlorphenamine Maleate in Paracetamol and Chlorphenamine Maleate Granules, Chromatographia 64 (11/12) (2006) 719-724. [18] S. M. Amer, S. S. Abbas, M. A. Shehata, Simultaneous Determination of Phenylephrine Hydrochloride, Guaifenesin, and Chlorpheniramine Maleate in Cough Syrup by Gradient Liquid Chromatography, J. AOAC Int. 91 (2) (2008) 276-284. [19] V. V. Vaidya, G. R. Singh, M. P. Choukekar, M. B. Kekare, Simultaneous RP HPLC Determination of Aceclofenac, Paracetamol and Tizanidine in Pharmaceutical Preparations, E-J. Chem. 7 (1) 2010 260-264. [20] I. M. Palabiyik, F. Onur, The Simultaneous Determination of Phenylephrine Hydrochloride, Paracetamol, Chlorpheniramine Maleate and Dextromethorphan Hydrobromide in Pharmaceutical Preparations, Chromatographia 66 (2007) 93-96. [21] A. Marín, E. García, A. García, C. Barbas, Validation of a HPLC quantification of acetaminophen, phenylephrine and chlorpheniramine in pharmaceutical formulations: capsules and sachets, J. Pharm. Biomed. Anal. 29 (2002) 701–714. [22] P. Chocholouš, D. Šatínský, H. Sklenářová, P. Solich, Two-column Sequential Injection Chromatography—New approach for fast and effective analysis and its comparison with gradient elution chromatography, Anal. Chim. Acta 668 (2010) 61–66. [23] European Pharmacopoeia, 7th Edition, Council of Europe, Strasbourg, 2010. [24] International Conference on Harmonization (ICH), Q2 (R1): Validation of Analytical Procedures: Text, US FDA Federal Register, 60 (1995) 11260. [25] International Conference on Harmonization (ICH), Q2 (R1): Validation of Analytical Procedures: Methodology, US FDA Federal Register, 62(96) (1997) 27463-27467.

119

Disertační práce

Přílohy II-Postery

9 PŘÍLOHY II – POSTERY

120

Disertační práce

Příloha 1

9.1 Příloha 1

121

Disertační práce

Příloha 1

122

Disertační práce

Příloha 2

9.2 Příloha 2

123

Disertační práce

Příloha 2

124

Disertační práce

Příloha 3

9.3 Příloha 3

125

Disertační práce

Příloha 3

126

Disertační práce

Příloha 4

9.4 Příloha 4

127

Disertační práce

Příloha 4

128

Disertační práce

Příloha 5

9.5 Příloha 5

129

Disertační práce

Příloha 5

130

Disertační práce

Příloha 6

9.6 Příloha 6

131

Disertační práce

Příloha 6

132

Disertační práce

Příloha 7

9.7 Příloha 7 International NUTRITION & DIAGNOSTICS, 28. - 31.8. 2011, Brno, Česká republika

133

Disertační práce

Příloha 7

134

Disertační práce

Shrnutí

10 SHRNUTÍ

Tato disertační práce je věnována vývoji HPLC a SIC metod pro stanovení účinných látek i degradačních produktů ve farmaceutických přípravcích. Vyvinuté metody byly validovány a splňují všechny požadavky kladené na vhodnost, přesnost a správnost. Předložená práce nejprve pojednává o teoretických základech chromatografie, popisuje definici, princip, rozdělení a vybrané pojmy a charakteristiky. V další části práce shrnuje teoretické poznatky o kapalinové chromatografii, důraz byl kladen na instrumentální vybavení, kde jsou zmíněny i nové trendy ve vývoji stacionárních fází (monolitické kolony, hybridní stacionární fáze, částice menší než 2 µm a porézní částice s neporézním jádrem). Následující část se zabývá průtokovými metodami, popisuje vybrané metody – FIA, SIA a SIC. Poslední kapitola porovnává techniku HPLC a SIC. V první práci (Příloha 1, kap. 5.1) byla vyvinuta metoda HPLC pro stanovení účinné látky klotrimazolu a příslušných nečistot (2-chlorfenyl)difenylmethanolu a imidazolu v přípravku Clotrimazol spray 1 %. Jako vnitřní standard byl použit ibuprofen. Celkem bylo testováno 7 chromatografických kolon. Jako optimální byla vybrána kolona Discovery ZR-PBD (150 x 4,6 mm, 5 µm) a UV spektrofotometrická detekce při 210 nm. Dále byly vyvinuty dvě HPLC metody pro stanovení účinných látek z farmaceutických přípravků. První z těchto HPLC prací (Příloha 5, kap. 5.5) se zabývala vývojem a validací metody pro stanovení účinné látky nonoxynolu a trimekainu v topických přípravcích - lubrikačních gelech. Separace byla provedena na analytické koloně Discovery ZR-PBD (150 × 4,6 mm, velikost částic 5 µm) a jako vnitřní standard byl vybrán amitriptylin. Vyvinutá metoda byla prakticky aplikována pro hodnocení přípravku LG non-stop. Druhá HPLC metoda (Příloha 6, kap. 5.6) popisuje stanovení kyseliny askorbové, fenylefrinu, paracetamolu a kofeinu. Byla použita monolitická kolona a UV detekce. Kyselina salicylová byla použita jako vnitřní

135

Disertační práce

Shrnutí

standard. Optimalizovaná metoda byla aplikována na stanovení účinných látek ve farmaceutickém přípravku Coldrex tablety. Cílem další práce (Příloha 2, kap. 5.2) bylo porovnat separační účinnost částicové kolony a monolitických kolon různé délky. K porovnání byla použita HPLC metoda stanovení indometacinu a jeho dvou rozkladných produktů. Ketoprofen byl použit jako vnitřní standard k hodnocení dat v průběhu celé studie. Sekvenční injekční chromatografie je další technika, kterou se zabývá tato disertační práce. Vývoj SIC techniky pro stanovení ve vodě nerozpustných vitamínů (retinol acetát, D2, nebo D3 a tokoferol acetát) popisuje práce, která je přiložena v příloze 3 (kap. 5.3). Nová SIC metoda s použitím monolitické kolony a UV spektrofotometrické detekce byla použita pro stanovení vitamínu D3 v léčivém přípravku Vigantol a vitamínů A, D2 v přípravku Vitamin AD Slovakofarma kapsle. Jako vnitřní standard pro kvantifikaci byl použit tokoferol acetát. Poslední metoda (Příloha 4, kap. 5.4), která je zmíněna v tomto shrnutí je metoda SIC s gradientovou elucí. Použitelnost a separační účinnost navržené SIC metody byla demonstrována na separaci a současném stanovení účinné látky indometacinu

a

methylindoloctové

jeho a

dvou kyseliny

rozkladných

produktů

4-chlorobenzoové)

(kyseliny

v topickém

5-methoxy-2farmaceutickém

přípravku. Ketoprofen byl použit jako vnitřní standard. Dále byla vyvinutá technika HPLC s gradientovou elucí, která sloužila jako porovnávací metoda. Obě techniky byly úspěšně použity k separaci a stanovení uvedené účinné látky a degradačních produktů v topickém přípravku Indobene gel 1 %.

136

Disertační práce

Summary

11 SUMMARY

The doctoral thesis concerns with development of HPLC and SIC methods for determination of active substances and degradation products in pharmaceutical formulations. Developed methods were validated and meet all requirements for suitability, precision and reliability. At first theoretical principles of chromatography, definition, principle, sorting, chosen terms and characteristics are described in this work. In the next part, thesis summarizes theoretical knowledge about liquid chromatography, with the emphasis to the instrumentation, mentioning the new trends in stationary phase’s development (monolithic columns, hybrid stationary phase, sub-2-microns phases and porous particles with nonporous core). Next part deals with flow methods, describe selected methods – FIA, SIA and SIC. The last chapter compares technique HPLC and SIC. In the first work (attachment 1, chapter 5.1), HPLC method for determination of active compound clotrimazole and its degradation products (2chlorophenyl) diphenylmethanol and imidazole in Clotrimazol spray 1 % was developed. Ibuprofen was used as the internal standard. Seven chromatographic columns were tested in total. A Discovery ZR-PBD column (150 × 4.6 mm, 5 µm) and spectrophotometric detection at 210 nm were selected. Two HPLC methods for determination of active substances in pharmaceutical formulations were developed. The first of them (attachment 5, chapter 5.5) was concerned with development and validation of methods for determination of nonoxinol and trimecaine in topical formulations – lubricant gels. Separation was carried using Discovery ZR-PBD analytical column (150 × 4.6 mm, 5 µm), and amitriptyline was chosen as internal standard. The developed method was practically applied for evaluation of preparation LG non-stop. The second HPLC method (attachment 6, chapter 5.6) described determination of ascorbic acid, phenylephrine, paracetamol and caffeine. Monolithic column and UV detection were used. Salicylic

137

Disertační práce

Summary

acid was used as internal standard. Optimized method was applied for determination of active compounds in pharmaceutical formulation Coldrex tablets. The aim of the next work (attachment 2, chapter 5.2) was to compare separation efficiency particle based and monolithic columns with various lengths. HPLC method for determination of indomethacin and its two degradation products was used for comparison. Ketoprofen was used as an internal standard for data evaluation throughout the study. Sequential injection chromatography is another technique that deals with this thesis. Development of SIC technique for determination of water-insoluble vitamins (retinol acetate, D2, or D3 and tocopherol acetate) is described in attachment 3, chapter 5.3. The novel SIC method with the monolithic column and UV spectrophotometric detection was applied for the determinations of vitamin D3 in the pharmaceutical formulation Vigantol and vitamins A, D2 in the formulation Vitamin AD Slovakofarma capsules. Tocopherol acetate was used for quantification as an internal standard. SIC with gradient elution (attachment 4, chapter 5.4) is the last method that is mentioned in this summary. Applicability and separation efficiency was demonstrated on the separation a simultaneous assay of active compound indomethacin and its two degradation products (5-methoxy-2 methylindoleacetic acid and 4 chloro-benzoic acid) in topical pharmaceutical formulation. Ketoprofen was used as internal standard. HPLC technique with gradient elution was developed. This method was used as comparative method. Both techniques were used for separation and determination of mentioned active substance and degradation products in topical formulation Indobene gel 1 %.

138

Disertační práce

Závěr

12 ZÁVĚR Výsledky této disertační práce ukazují na několika případech vývoj nových HPLC a SIC metod pro stanovení účinných látek a degradačních produktů ve vybraných farmaceutických přípravcích. Nové metody jsou validovány a výsledky validace jsou přehledně zpracovány. V průběhu vývoje metod byly zjištěny některé výhody, ale i nevýhody SIC techniky v porovnání s HPLC. Mezi výhody patří např. diskontinuální průtok mobilní fáze, který umožňuje snížit spotřebu rozpouštědel (mobilní fáze) a tedy i snížit produkci odpadů a náklady na analýzu. U SIC metody si v řídícím programu přesně určíme aspirovaný objem mobilní fáze, který je dostačující pro jednu analýzu a poté aspirujeme vzorek, kdežto u HPLC je mobilní fáze čerpána ihned po startu analýzy, ještě před nadávkováním vzorku, a proto nemáme ani přesný odhad spotřeby MF. Jednoduchý software pro zpracování dat, který využívá pro kvantifikaci pouze výšky píků patří k jedné z nevýhod SIC techniky. Toto bylo v mé práci vyřešeno využitím Cauchy-Riemannova integrálu [64], který byl použit pro výpočet ploch píků.

Další nevýhodou je omezené množství chromatografických

kolon, které je možné zapojit do SIC systému, což umožňuje jen analýzy jednoduchých směsí. Přenos metody HPLC na SIC techniku je jednoduchý, bez nutnosti měnit chromatografické podmínky stanovení. Jediné, co je potřeba optimalizovat je řídící program, hlavně aspirovaný objem mobilní fáze. Byla

prokázána

výhoda

používání

monolitických

kolon

pro

separace

farmaceuticky významných látek jak při použití HPLC, tak SIC techniky. Všechny vyvinuté metody splňují kritéria moderních požadavků validace podle příslušných autorit. Bylo otestováno porovnání konvenčních metodik (za použití částicových kolon) s metodikami využívajícími nové typy stacionárních fází (monolitické kolony). Konvenční metody lze snadno převést na monolitické kolony, v našem případě bylo nutné upravit pouze složení mobilní fázi (byl zvýšen poměr vodné složky) a průtok mobilní fáze.

139

Disertační práce

Závěr

Předložená práce popisuje vývoj a optimalizaci SIC a HPLC s gradientovou elucí. Byl úspěšně optimalizován řídící program a obě metody byly aplikovány na separaci a hodnocení účinné látky a jejích degradačních produktů.

140

Disertační práce

Seznam literatury

13 SEZNAM LITERATURY 1. P. Klouda, Moderní analytické metody; druhé, upravené a doplněné vydání nakladatelství Pavel Klouda, Ostrava 2003 2. http://old.lf3.cuni.cz/chemie/cesky/materialy_B/chromatografie.doc (10/2011) 3. R. Karlíček a kolektiv, Analytická chemie pro farmaceuty, 2. vydání, Univerzita Karlova v Praze, Nakladatelství Karolinum, Praha 2001 4. http://users.prf.jcu.cz/sima/analyticka_chemie/separa.htm (10/2011) 5. http://www.vscht.cz/ktk/www_324/lab/texty/gc/GC02.pdf (10/2011) 6. Y.Kazachevich, H. McNair, Texbook on High Performance Liquid Chromatography (http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/) 7. http://web.natur.cuni.cz/~pcoufal/hplc.html (10/2011) 8. http://www.pmfhk.cz/WWW/UMP/separacni_metody.pdf (10/2011) 9. http://www.hplc.cz/Teorie/resolution.html (10/2011) 10. K. Štulík a kolektiv, Analytické separační metody, Univerzita Karlova v Praze, Nakladatelství Karolinum, Praha 2004 11. http://web.natur.cuni.cz/analchem/bosakova/hplc1.pdf (10/2011) 12. Český lékopis 2009, Ministerstvo zdravotnictví ČR, GRADA, Praha 2009 13. http://web.natur.cuni.cz/~tesarove/hplc.pdf (10/2011) 14. http://www.vscht.cz/ktk/www_324/lab/texty/hplc/HPLC.pdf (10/2011) 15. http://chemie.jiriurban.cz/22-konvencni-stacionarni-faze (10/2011) 16. www.hplc.cz (10/2011) 17. D. Sýkora, E. Tesařová, M. Vosmanská, M. Zvolánková: Moderní stacionární fáze pro RP - HPLC, Chem. Listy 101 (2007) 190−199 18. http://www.waters.com/waters/nav.htm?cid=10009386 (10/2011) 19. http://chromservis.cz/item/GEMINI-phase?lang=CZ (10/2011) 20. http://www.phenomenex.com/Products/HPLCDetail/Gemini/ (10/2011) 21. http://www.zirchrom.com/Columns.asp (10/2011) 22. http://www.sigmaaldrich.com/analyticalchromatography/hplc/columns/discovery-hplc.html (10/2011) 23. http://www.sequant.com/default.asp?ml=11625 (10/2011) 24. http://www.merck-chemicals.cz/ (10/2011) 141

Disertační práce

Seznam literatury

25. F. Švec: Monolitické stacionární fáze pro HPLC. Místo narození: Praha, Chem. Listy 98 (2004) 232 - 238 26. G. Guiochon: Monolithic columns in high-performance liquid chromatography, J. Chromatogr. A, 1168 (2007) 101–168 27. F. Švec, M. Jelínková, E. Votavová: Macroporous membranes, I. Reactive macroporous membranes based on glycidyl methacrylate-ethylene dimethacrylate copolymer for high-performance membrane chromatography, Angew. Makromol. Chem. 188 (1991) 167 – 176 28. J. Hradil, M. Jelínková, M. Ilavský, F. Švec: Macroporous membranes. 3. Properties of macroporous membranes synthesized from glycidyl methacrylate, ethylene dimethacrylate and alkyl- or hydroxyalkyl methacrylate, Angew. Makromol. Chem. 185/186 (1991) 275 – 282 29. F. Švec, J. M. J. Frechet: Continuous rods of macroporous polymer as high-performance liquid chromatography separation media, Anal. Chem. 64 (1992) 820 – 822 30. A. Podgornik, M. Barut, A. Strancar, D. Josic, T. Koloini: Construction of Large-Volume Monolithic Columns, Anal. Chem. 72 (2000) 5693 – 5699 31. S. Hjertén, J. L. Liao, R. Zhang: High-performance liquid chromatography on continuous polymer beds, J. Chromatogr. A 473 (1989) 273 – 275 32. K. Nakanashi, N. Soga: Phase Separation in Gelling Silica–Organic Polymer Solution: Systems Containing Poly(sodium styrenesulfonate), J. Am. Ceram. Soc., 74 (1991) 2518 - 2530 33. N. Tanaka, N. Ishizuka, K. Hosoya, K. Kimata, H. Minakuchi, K. Nakanashi, N. Soga: Octadecylsilyated porous silica rod for reversed-phase liquid chromatography, Kuromatogurafi 14 (1993) 50 - 51 34. F. Švec: Co dnes hýbe kapalinovou chromatografií?, Chem. Listy 103 (2009) 266−270 35. http://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/hplc/columns/ascentisexpress/fused-core-advantage.html (10/2011) 36. http://www.phenomenex.com/Products/Detail/Kinetex (10/2011) 37. http://users.prf.jcu.cz/sima/vybrane_kapitoly/prutok_anal.htm (10/2011) 38. J. Růžička: Flow Injection – CD, the 3rd ed. 2005

142

Disertační práce

Seznam literatury

39. J. Růžička, E.H. Hansen: Flow-injection analysis, 2nd Ed. Wiley, New York 1988 40. J. Růžička, E.H. Hansen: Flow Injection Analysis. Part I. A New Concept of Fast Continuous Flow Analysis, Anal. Chim. Acta 78 (1975) 145 - 157 41. http://www.natur.cuni.cz/~analchem/pprakt/fia.pdf (10/2011) 42. J. Růžička, G. D. Marshall: Sequential Injection: A New Concept for Chemical Sensors, Process Analysis and Laboratory Assays, Anal. Chim. Acta 237 (1990) 329 - 343 43. http://www.natur.cuni.cz/~analchem/pprakt/sia.pdf (10/2011) 44. H. Paseková, M. Polášek, P. Solich: Sekvenční injekční analýza, Chem. Listy 93 (1999) 354 – 359 45. P. Chocholouš, P. Solich, D. Šatínský: An overview of sequential injection chromatography, Anal. Chim. Acta 600 (2007) 129 - 135 46. D. Šatínský, Disertační práce: Využití reaktorů s tuhou fází v průtokové a sekvenční injekční analýze, FaF UK, kat. analytické chemie 2003 47. www.sichrom.com (10/2011) 48. H. Paseková, Disertační práce: Využití automatizovaných průtokových metod ve farmaceutické analýze, FaF UK, kat. analytické chemie 2001 49. P. Chocholouš, P. Holík, D. Šatínský, P. Solich: A novel application of Onyx™ monolithic column for simultaneous determination of salicylic acid and triamcinolone acetonide by sequential injection chromatography, Talanta 72 (2007) 854 - 858 50. J. Klimundová, D. Šatínský, H. Sklenářová, P. Solich: Automation of simultaneous release tests of two substances by sequential injection chromatography coupled with Franz cell, Talanta 69 (2006) 730 - 735 51. J. Huclová, D. Šatínský, R. Karlíček: Coupling of monolithic columns with sequential injection technique: A new separation approach in flow methods, Anal. Chim. Acta 494 (2003) 133 – 140 52. D. Šatínský, J. Huclová, R. L.C. Ferreira, M. C. Montenegro , P. Solich: Determination of ambroxol hydrochloride, methylparaben and benzoic acid in pharmaceutical preparations based on sequential injection technique coupled with monolithic column, J. Pharm. Biomed. Anal. 40 (2006) 287 - 293.

143

Disertační práce

Seznam literatury

53. P. Chocholouš, D. Šatínský, P. Solich: Fast simultaneous spectrophotometric determination of naphazoline nitrate and methylparaben by sequential injection chromatography, Talanta 70 (2006) 408 – 413 54. D. Šatínský, P. Solich, P. Chocholouš, R. Karlíček: Monolithic columns - a new concept of separation in the sequential injection technique, Anal. Chim. Acta 499 (2003) 205 – 214 55. D. Šatínský, J. Huclová, P. Solich, R. Karlíček: Reversed-phase porous silica rods, an alternative approach to high-performance liquid chromatographic separation using the sequential injection chromatography technique, J. Chromatogr. A, 1015 (2003) 239 – 244 56. D. Šatínský, L. Santos, H. Sklenářová, P. Solich, M. C. Montenegro, A. Araújo: Sequential injection chromatographic determination of ambroxol hydrochloride and doxycycline in pharmaceutical preparations, Talanta 68 (2005) 214 – 218 57. D. Šatínský, I. Neto, P. Solich, H. Sklenářová, M.C. Montenegro, A. Araújo: Sequential injection chromatographic determination of paracetamol, caffeine, and acetylsalicylic acid in pharmaceutical tablets, J. Sep. Sci 27 (2004) 529 – 536 58. P. Chocholouš, D. Šatínský , R. Sladkovský, M. Pospíšilová, P. Solich: Determination of pesticides fenoxycarb and permethrin by sequential injection chromatography using miniaturized monolithic column, Talanta 77 (2008) 566 - 570 59. P. Koblová, H. Sklenářová, P. Chocholouš, M. Polášek, P. Solich: Simple automated generation of gradient elution conditions in sequential injection chromatography using monolithic column, Talanta 84 (2011) 1273 – 1277 60. H. Sklenářová, P. Koblová, P. Chocholouš, D. Šatínský, L. Krčmová, M. Kašparová, D. Solichová, P. Solich: Separation of Vitamins Retinol Acetate, Ergocalciferol, or Cholecalciferol and Tocopherol Acetate Using Sequential Injection Chromatography Anal. Lett. 44 (2011) 446 - 456 61. P. Chocholouš, D. Šatínský, H. Sklenářová, P. Solich: Two-column Sequential Injection Chromatography-New approach for fast and effective analysis and its comparison with gradient elution chromatography, Anal. Chim. Acta 668 (1) (2010) 61 - 66

144

Disertační práce

Seznam literatury

62. P. Chocholouš, L. Kosařová, D. Šatínský, H. Sklenářová, P. Solich: Enhanced capabilities of separation in Sequential Injection Chromatography - Fused-core particle column and its comparison with narrow-bore monolithic column, Talanta 85 (2) (2011) 1129 – 1134 63. I. Muszalska, M. Zajac, K. Czajkowski, M. Nogowska: Simultaneous Determination of Paracetamol, Caffeine, Ascorbic acid and Phenylephrine Hydrochloride in Pharmaceutical Formulation by HPLC, Chem. Anal. (Warsaw) 45 (2000) 825 – 833 64. M. Hazewinkel, Encyclopaedia of Mathematics, Springer-Verlag, Berlín, 2002

145

FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra analytické chemie

Recommend Documents