Univerzita Karlova v Praze farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie

Univerzita Karlova v Praze farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie

Sekvenční injekční chromatografie – testování moderních chromatografických kolon pro rychlé a efektivní separace (diplomová práce)

Vedoucí diplomové práce: PharmDr. Petr Chocholouš, Ph.D. Hradec Králové, 2014

Bc. Viktor Kubala

Prohlašuji, že tato diplomová práce je mým původním autorským dílem a veškeré myšlenky, data a jejich zdroje, z nichž jsem pro zpracování čerpal, řádně cituji. Tato práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem

Datum

Podpis

2

Zde bych velmi rád poděkoval svému školiteli PharmDr. Petru Chocholoušovi Ph.D. za vstřícné jednání, trpělivost a pomocné rady, které mi poskytl při psaní mé diplomové práce.

3

ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra Analytické chemie Kandidát:

Bc. Viktor Kubala

Školitel: PharmDr. Petr Chocholouš, Ph.D. Název diplomové práce: Sekvenční injekční chromatografie – testování moderních chromatografických kolon pro rychlé a efektivní separace Tato diplomová práce se zabývá separací a stanovením vybraných Azobarviv (Sudan Orange G, para red, Sudan I, Sudan II, Sudan III a Sudan IV) metodou sekvenční injekční chromatografie. Při metodě bylo využíváno UV-vis detektoru, který měřil při hodnotách vlnových délek 400, 480, 500 a 600 nm. Separace byla provedena na monolitické koloně Chromolith® FastGradient RP-18 endcapped 50-2. Separace probíhala v gradientovém módu, kdy jako mobilní fáze byly použity směsi acetonitrilu a vody. Mobilní fáze číslo 1 byla acetonitril:voda 55:45 a mobilní fáze číslo 2 byla acetonitril:voda

90:10.

Dalším

cílem

byla

aplikace

vyvinuté

metody

pro

stanovení vybraných azobarviv v chilli omáčkách, kde by mohly být nelegálně přidány. Výsledky měření prokázaly, že žádná látka z matrice neinterferuje se stanovovanými látkami. Výsledky výtěžnosti odpovídaly kriteriím pouze v jedné koncentraci ze dvou, u druhé musela vzniknout nejspíše chyba při přípravě. Po dalším vývoji by mohla být metoda validována.

4

ABSTRACT Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Deparment of Analytical chemismy Candidate:

Bc. Viktor Kubala

Supervisor:

PharmDr. Petr Chocholouš, PhD.

Title of diploma thesis: Sequential injection chromatography - testing of modern chromatographic columns for fast and efficient separation This diploma thesis deals with the separation and determination of chosen azodyes (Sudan Orange G, para red, Sudan I, Sudan II, Sudan III and Sudan IV) with the method of sequential injection chromatography .There was used a UV-vis detector that was measuring at the wavelengths of 400, 480, 500 and 600 nm. The separation was done at a monolithic column Chromolith® FastGradient RP-18 endcapped 50-2. The separation was processed in a gradient mode. The mixtures of acetonitril and water were used as mobile phases. Mobile phase number 1 was acetonitril:water 55:45 while the mobile phase number 2 was acetonitril: water 90:10. Next aim was the application of a developed method for determination of chosen azodyes in chilli sauces where they could be added illegally. The results of measurements showed that none substance from the matrix interferes with the determinate substances. The results of the recovery met the criteria just with one concentration level of both, in the second case were influenced probably by an error during the preparation. This method could be validated after further development.

5

Obsah Seznam zkratek ........................................................................................................................... 8 Seznam Obrázků ......................................................................................................................... 9 Seznam Tabulek ....................................................................................................................... 10 1.

Úvod .................................................................................................................................. 11

2.

Cíl a popis zadání práce .................................................................................................. 12

3.

Teoretická část ................................................................................................................. 13 3.1.

3.1.1.

První generace průtokových metod .......................................................... 13

3.1.2.

Sekvenční injekční análýza ....................................................................... 14

3.1.3.

Sekvenční injekční chromatografie .......................................................... 15

3.2.

Monolitické kolony .......................................................................................... 17

3.2.1.

Historie vývoje monolitických kolon ....................................................... 17

3.2.2.

Charakteristika monolitů........................................................................... 17

3.2.3.

Makroporézní polymerní kolony .............................................................. 18

3.2.4.

Monolity z anorganických materiálů ........................................................ 18

3.3.

4.

Průtokové metody ............................................................................................ 13

Barviva ............................................................................................................. 19

3.3.1.

Sudan I ...................................................................................................... 19

3.3.2.

Sudan II ..................................................................................................... 20

3.3.3.

Sudan III ................................................................................................... 20

3.3.4.

Sudan IV ................................................................................................... 21

3.3.5.

Para Red .................................................................................................... 21

3.3.6.

Sudan orange G ......................................................................................... 21

Experimentální část ......................................................................................................... 23 4.1.

Použité přístroje ............................................................................................... 23

4.2.

Použité chemikálie ........................................................................................... 23

4.3.

Parametry SIC .................................................................................................. 23 6

4.3.1.

Kalibrační závislost................................................................................... 23

4.3.2.

Přesnost – opakovatelnost ......................................................................... 24

4.3.3.

Správnost .................................................................................................. 24

4.4.

Příprava mobilních vzorků a standardů............................................................ 25

4.4.1.

Příprava mobilní fáze ................................................................................ 25

4.4.2.

Příprava standardů .................................................................................... 25

4.5.

Měření analytů ................................................................................................. 25

4.6.

Kalibrační závislost .......................................................................................... 30

4.7.

Opakovatelnost ................................................................................................. 37

4.8.

Interference se vzorky ...................................................................................... 40

4.8.1.

Příprava vzorku ......................................................................................... 40

5.

Závěr .................................................................................................................................. 45

6.

Seznam použité literatury ............................................................................................... 46

7

Seznam zkratek FIA

Průtoková injekční analýza

C

Koncentrace

Cmax

Maximální výška píku

SIA

Sekvenční injekční analýza

SHC

Zastavení v mísící cívce

SFC

Zastavení v průtokové kyvetě

HPLC

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

SI

Sudan I

S II

Sudan II

S III

Sudan III

S IV

Sudan IV

SOG

Sudan orange G

PR

Para Red

IARC

Mezinárodní agentura pro výzkum rakoviny

8

Seznam Obrázků Obr. 1 Schéma vícekanálového systému průtokové injekční analýzy (18). ................... 14 Obr. 2 Sekvenční injekční analýzy s vícecestným selekčním ventilem(18). .................. 14 Obrázek 3 Schéma systému SIC se zapojením chromatografické kolony (18). ............. 16 Obr. 4 Sudan I ................................................................................................................. 20 Obr. 5 Sudan II ................................................................................................................ 20 Obr. 6 Sudan III .............................................................................................................. 21 Obr. 7 Sudan IV .............................................................................................................. 21 Obr. 8 Para red ................................................................................................................ 21 Obr. 9 Sudan orange G .................................................................................................... 22 Obr. 10 Chromatogram SOG λ=480 nm, PR λ= 500 nm a S I λ= 500 nm, c = 20 µg/ml , mobilní fáze ACN:voda 50:50 ........................................................................................ 26 Obr. 11 S1 λ= 600 nm, S III λ= 600 nm a S IV λ= 600 nm, c = 20 µg/ml , mobilní fáze ACN:voda = 80 : 20 ........................................................................................................ 27 Obr. 12 Chromatogram gradientové eluce SOG, PR, S I – S IV (c = 10 µg/ml). ........... 29 Obr. 13 Chromatogram gradientové eluce SOG, PR, S I – S IV (c = 10 µg/ml). Mobilní fáze č.1 55:45, č.2 90:10. ............................................................................................... 30

9

Seznam Tabulek Tab. 1 Program analýzy, bez koncentračního gradientu. ................................................ 25 Tab. 2 Program analýzy s koncentračním gradientem tvořeným dvěma fázemi. ........... 28 Tab. 3 Konečný program analýzy s koncentračním gradientem mobilních fází 55:45 a 90:10 ............................................................................................................................... 29 Tab. 4 Kalibrační křivka SOG ........................................................................................ 31 Tab. 5 Kalibrační křivka PR............................................................................................ 32 Tab. 6 kalibrační křivka S I ............................................................................................. 33 Tab. 7 Kalibrační křivka S II........................................................................................... 34 Tab. 8 kalibrační křivkaa S III ........................................................................................ 35 Tab. 9 kalibrační křivka S IV .......................................................................................... 36 Tab. 10 Opakovatelnost se standardem Sudanu Orange G ............................................. 37 Tab. 11 Opakovatelnost se standardem Para red............................................................. 38 Tab. 12 Opakovatelnost se standardem Sudan I ............................................................. 38 Tab. 13 Opakovatelnost se standardem Sudan II ............................................................ 39 Tab. 14 Opakovatelnost standardu Sudan III .................................................................. 39 Tab. 15 Opakovatelnost standardu Sudanu IV ................................................................ 40 Tab. 16 výsledky standardu SOG s ochucovadly............................................................ 41 Tab 17 výsledky standardu PR s ochucovadly ............................................................... 41 Tab. 18 výsledky standardu S I s ochucovadly ............................................................... 42 Tab. 19 výsledky standardu S II s ochucovadly .............................................................. 42 Tab. 20 výsledky standardu S III s ochucovadly ............................................................ 43 Tab. 21 výsledky standardu S IV s ochucovadly ............................................................ 43

10

1.

Úvod

Sekvenční injekční chromatografie je metoda, která vychází z průtokových metod a kapalinové chromatografie. Tato metoda se vyvinula postupně z průtokové analýzy takzvané flow injection analysis, přes sekvenční injekční analýzu. U těchto metod se využívá nastavitelnost toku kapaliny (rychlost, směr a objem). Díky objevu monolitických kolon, které mají vysokou porozitu sorbentu a tím nižší zpětný tlak vůči mobilní fázi, vznikla metoda sekvenční injekční chromatografie. Výhodou je výrazně nižší náročnost na vybavení v porovnání s moderními přístroji pro kapalinovou chromatografii. Tato metoda je stále ve vývoji, a postupně nachází své uplatnění. Monolitické kolony jsou tvořeny monolitickým sorbentem s póry. Mobilní fáze s analyty protéká póry kde, analyty interagují s aktivním povrchem (mezopory) a dochází k chromatografické separaci a eluci na detektor. Azobarviva jsou červeně barvící látky, které jsou zdraví škodlivé. V České republice je zakázané je používat jako potravinová barviva, ale občas se objeví v potravních ochucovadlech, zejména pálivých chilli omáčkách, kde napomáhají lepšímu zbarvení dochucovadla.

11

2.

Cíl a popis zadání práce Cílem a zadáním předložené diplomové práce bylo optimalizovat metodu

sekvenční injekční chromatografie pro separaci a stanovení šesti azobarviv Sudan I, Sudanu II, Sudanu III, Sudanu IV, Para Red a Sudan orangeG a jejích stanovení ve vzorcích potravin (ochucovadla a koření).

12

3.

Teoretická část

3.1.

Průtokové metody

Průtokové metody jsou založeny na toku kapaliny v úzkých hadičkách uzavřeného systému poháněného pumpou a usměrňovaného směrem k detektoru. Pro tyto metody je charakteristická reakce kapaliny (činidlo) s kapalinou (vzorek), kdy dojde ke změně fyzikálních vlastností (produkt). Vývoj průtokových metod, prošel postupně od nejjednodušší metody, což je prostá reakce kapaliny s kapalinou, až po zapojení separační kolony a gradientové eluce.

3.1.1.

První generace průtokových metod

První generace průtokových metod je průtoková injekční analýza tzv. Flow injection analysis (FIA). Tato metoda se může provádět za konstantní rychlosti, nebo naprogramovatelnou rychlostí toku. Nejsnadnější ukázkou průtokových metod je nástřik vzorku do nosného proudu kapaliny, se kterým vzorek reaguje. Produkt vzniká na rozhraní zón nosné kapaliny a vzorku. Produkt nejčastěji mění barvu nebo jiné měřitelné fyzikálně - chemické vlastnosti. Poté produkt doputuje proudem kapaliny do průtokové cely detektoru, kde je odečten výsledek (1). Základní aparatura FIA se skládá z pumpy pohánějící nosnou kapalinu, z injekčního ventilu, jímž se zavádí do aparatury vzorek, z mísící cívky, v níž reaguje vzorek s činidlem, a z detektoru s průtokovou celou. Pro kvantifikaci vzorku se nejčastěji využívá metody kalibrační křivky, do které je vynesena hodnota měřeného vzorku. Každá metoda FIA musí být optimalizována. Základními znaky metody jsou: nástřik vzorku do nosného proudu, kontrolovaná disperze a opakovatelnost celého procesu (měření). Nástřik vzorku je proveden pomocí injekčního ventilu a zároveň je využíván jako startér času analýzy. Opakovatelnost znamená, že detektor bude vydávat stále stejné výsledky při opakovaných měřeních známého vzorku o stejné koncentraci. Odezva detektoru i retenční čas by měly být stále stejné. Disperze je definována jako koncentrační gradient, kdy detektorem prochází různá koncentrace (C) vzorku s činidlem, Nejvyšší koncentrace odpovídá maximální výšce 13

píku (Cmax) (2).

Obr. 1 Schéma vícekanálového systému průtokové injekční analýzy (18).

3.1.2.

Sekvenční injekční analýza

Sekvenční injekční analýza (SIA), je druhou generací průtokových metod a zároveň byla první analytickou metodou, která začala využívat programovaného průtoku řízeného počítačem.

3.1.2.1.

SIA systém

Základními pilíři SIA systému jsou vícecestný, polohovatelný ventil a obousměrné čerpadlo (pístová pumpa). Čerpadlo slouží k nasávání vzorku, činidel, a nosného proudu. Čerpadlo nasaje vzorky a činidla do mísící cívky a po promíchání je vypustí opačným tokem zpět přes ventil k detektoru a dál do odpadu. Obrovskou výhodou je, že se objemy nástřiku vzorku a činidel, jakož i rychlost toku kapalin, nastaví v počítači, který provádí automaticky všechny tyto činnosti. Počítač zároveň zaznamenává a vyhodnocuje všechny údaje z detektoru.

Obr. 2 Sekvenční injekční analýzy s vícecestným selekčním ventilem(18).

14

3.1.2.2.

Stop/flow techniky

Stop/flow technika je metoda, kdy je zastaven proud v důsledku cíleného prodloužení inkubační doby děje (reakce) v průtokovém systému. Vzniká kvalitní a měřitelná zóna produktu ze vzorku a činidla. Možnosti zastavení proudu jsou dvě: zastavení v mísící cívce (SHC), nebo v průtokové kyvetě detektoru (SFC). SHC je metoda, která inkubuje vzorek s činidlem v mísící cívce a vykazuje odezvu ve formě vrcholu křivky, podobně jako FIA. To znamená, že Cmax píku je rovna koncentraci vzorku. Výhodou SHC metody je snadná optimalizace, neboť kromě vzorku a reagencie je jedinou proměnnou čas inkubace vzorku. SFC je metoda, kdy se zastaví vzorek v průtokové kyvetě a zajišťuje reakční rychlost křivky. Monitorování chemické reakce probíhá od počátku zastavení, tedy vzniku produktu. Důvodem lepších výsledků SFC oproti SHC je eliminace pozadí vzorků a reagencií a indexu lomu. Obtíží SFC metody je složitost optimalizace, protože zóna reakce se musí zastavit přesně v průtokové kyvetě (3). Sekvenční injekční chromatografie

3.1.3.

Sekvenční injekční chromatografie (SIC) je spojení dvou metod SIA a kapalinové chromatografie (LC). Síla separace LC je spojena se zpracováním vzorku pomocí programovaného průtoku vzorku a činidel. Pro SIC je možno používat klasické kolony s reverzní fází i ionto-výměnné kolony. Využitím monolitických kolon, nebo kolon s taveným jádrem se sníží tlak na hodnoty menší, než jaké se používají u vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC).

3.1.3.1.

Vznik SIC

SIC mohla vzniknout díky použití kolon, které vykazují střední hodnoty tlaku. Jedná se o kolony monolitické, nebo částicové kolony s pevným jádrem. Díky těmto kolonám lze používat nižší tlak oproti HPLC (4). Poprvé popsali výhody programovatelnosti toku a nízkého zpětného tlaku monolitické kolony ve své pionýrské práci Šatínský, Solich, Chocholouš a Karlíček. Připojením monolitické kolony Chromolith® C 18 4,6 x 25 mm ke standardnímu SIA zařízení se jim povedlo separovat a kvantifikovat čtyři analyty v topickém antiflogistickém gelu. Později tato skupina prokázala širokou škálu použitelnosti SIC (5).

3.1.3.2.

Instrumentace 15

SIC se skládá ze zkumavky se vzorkem a nádobami s mobilními fázemi. Vzorek je nasát do zadržovací cívky a přiveden tokem mobilní fází číslo jedna přes vícecestný ventil na kolonu. Pro vymytí vzorku z kolony se použije postupný gradient mobilní fáze číslo 1 s postupným přechodem do mobilní fáze číslo 2. Eluent poté teče postupně k detektoru a do odpadu. Celý systém je řízen počítačovým programem, který dokáže zpracovat výsledky. Výsledky jsou zaznamenávány ve formě chromatogramu (8).

Obrázek 3 Schéma systému SIC se zapojením chromatografické kolony (18).

3.1.3.3.

Úprava vzorku

Úprava vzorku napomáhá k lepší a přesnější detekci. Využívá se chemickofyzikálních vlastností vzorků, které je třeba upravit. Pro vzorky které neabsorbují světlo a nelze je měřit na UV-vis detektoru. Tyto úpravy se nejčastěji dějí jako postkolonová derivatizace. Úpravy vzorku se dělají i kvůli izolaci ostatních látek, které by mohli interferovat v chromatogramu, popřípadě i lepší zadržování na koloně. Tato úprava se nazývá předkolonová derivatizace. 3.1.3.3.1. Postkolonová derivatizace Je to reakce, která slouží k derivatizaci analytů, které vycházejí z kolony. K derivatizaci za kolonou je nutné, aby derivatizační činidlo mělo nepřetržitý tok k analytům, proto je používáno druhé nízkotlaké čerpadlo. Mísení toků je za kolonou před detektorem. Tato metoda je např. využívána při separaci opiových alkaloidů, biogenních aminů v moči s využitím chemiluminiscence (6).

16

3.1.3.3.2. Předkolonová derivatizace Derivatizace, u které už z názvu vyplývá, že se děje před kolonou. V praxi probíhá derivatizace před kolonou postupným nasátím vzorku a derivatizačního činidla do mísící cívky. V zadržovací cívce se promíchá činidlo s analytem a vzniká derivatizovaný vzorek, který je poté dávkován na kolonu. Předkolonová derivatizace je využívána při stanovení aminokyselin. Jako derivatizační činidlo se používá o-ftalaldehyd (7).

3.2.

Monolitické kolony

Monolitická kolona je, jak už vyplývá z jejího názvu, tvořena jedinou velikou částicí. Hlavní rozdíl oproti kolonám naplněným malými částicemi je v tom, že u monolitické kolony neprotéká mobilní fáze se vzorkem mezi částicovým prostorem, ale póry monolitu.

3.2.1.

Historie vývoje monolitických kolon

První monolitická kolona byla vyvinuta v Praze na začátku 60. let. Jednalo se 2hydroxyethyl-methakrylátové gely. Příprava těchto gelů probíhala jako radikálová polymerace 22% vodného roztoku ve skleněné trubici. Poté se tento houbovitý elastický gel vyjmul, vyvařil ve vodě a vložil do skleněné kolony. Tato monolitická kolona ovšem nebyla příliš úspěšná, neboť díky rychlosti průtoku 4 mililitry za hodinu (ml/hod) a nízké účinnosti nedocházelo ke kvalitní separaci. Další pokus o monolitické kolony přišel nezávisle z Německa a USA o pár let později. Kolona obsahovala polyurethanové pěny, jež byly připraveny napěněním in situ. Účinnost kolon se zvýšila, ovšem klasickým kolonám pro chromatografii se nepřiblížily. Novodobá historie monolitických kolon se začala vyvíjet na konci osmdesátých let.

3.2.2.

Charakteristika monolitů

Monolit je jednotná hmota zaplňující celý objem kolony. Monolitická kolona neobsahuje žádné mezi částicové prostory. Mobilní fáze se vzorkem tudíž musí protékat póry monolitu. Pro monolity jsou typické stlačené hydrofilní gely, polymerní makroporézní disky i kolony na bázi siliky. Prouděním kapaliny monolitem je zajišťován rychlejší přenos hmoty v koloně.

17

Hlavní hnací silou je u přenosu hmoty z kapaliny podél částic v částicové koloně difúze. U monolitických kolon je výhodou zrychlení separace díky průtoku póry, zejména u velkých molekul (bílkovin, nukleových kyselin atd.). Separace právě těchto velkých molekul je pomocí difúze velmi pomalá. Makroporézní polymerní kolony

3.2.3.

Jedna z mnoha forem podlouhlých kolon vyvinuta na začátku devadesátých let. Monolity v koloně jsou připraveny přímo ve vnitřním prostoru kolony. Vnitřní prostor se zaplní polymerační směsí, uzavře se a za přesně stanovené teploty z polymerizuje. Takto vyrobený monolit už poté nelze vyjmout a je uzavřen v koloně natrvalo. Polymerizace metathesí za otevření kruhu vede k lépe definovaným monolitům. Podmínkou je ovšem použití speciálních monomerů. Modifikace makroporézních polymerních kolon. Monolity mají funkční skupiny stejné jako monomery, ze kterých se skládají.

3.2.3.1.

Modifikace

Aby byly zajištěny správné funkční skupiny v koloně, lze provést modifikaci monolitu. Idealní pro modifikaci bývají monolity vytvořené na základě glycidylmethakrylátu. Při modifikaci monolitických kolon reaguje funkční skupina polymeru s novou funkční skupinou. Modifikací je získávána celá řada funkčních skupin na monolitických kolonách.

3.2.3.2.

Roubování

Roubováním je umožněno zvýšit počet funkčních skupin a tím je zvyšována vazebnost kolony. Z každé povrchové skupiny narůstá pomocí roubování řetězec s novými funkčními skupinami. Jednou z možností roubování je výroba kolony pomocí stabilních volných radikálů v latentní formě, která je teprve po zaplnění novou polymerační směsí aktivována zahřátím.

3.2.4.

Monolity z anorganických materiálů

Anorganické látky jsou velmi populární pro používání v kolonách. Z toho důvodu se začalo uvažovat i o monolitických kolonách z anorganického materiálu. Tanaka použil tyčinek z oxidu křemičitého. Tyčinky mají přesně kontrolované 18

porézní vlastnosti, díky nimž byl Tanaka schopen dojít k vysoce účinné separaci malých molekul, což je obrovský rozdíl oproti organickým monolitickým kolonám, které hlavně účinně separují velké molekuly.

3.2.4.1.

Výroba

Výroba monolitů z anorganických materiálů je trošku odlišnější, nelze je vyrábět in situ. Problém nastává při tuhnutí během hydrolyticky iniciované polykondenzace tetraalkoxysilanů v přítomnosti poly(ethylenoxidu), kdy se mění objem monolitu. Tyčinka monolitu se zmenšuje z 6 mm na 4,6 mm. Z tohoto důvodu se tyčinka vyrábí odděleně a po vyrobení se vloží do trubice, která je schopná se smrštit. Smršťovací trubice je z PEEK materiálu (poly(ether-etherketon)). PEEK poté tvoří tělo kolony. Tyto kolony mají ovšem i jedno omezení, a to ohyb tyčinek nad velikost 15 cm.

3.2.4.2.

Struktura

Silikové monolity mají strukturu dobře uspořádaných, velmi si podobných skeletů prostupných monodisperzními 1 mikrometr velikými póry. Skelet monolitu je sám o sobě porézní a zapříčiňuje specifický povrch monolitu, který je m2.g-1. To je přesně ta vlastnost, která zapříčiňuje kvalitní separaci malých molekul.

3.3.

Barviva

Tato diplomová práce se zabývá detekováním barviva z rodiny Azo-barviv, konkrétně Sudan I (SI), Sudan II (SII), Sudan III (SIII), Sudan IV (SIV), Para red (PR) a Sudan orange G (SOG). Látky Sudan I-IV jsou klasifikovány Mezinárodní agenturou pro výzkum rakoviny (IARC) jako toxické. Látky SOG a PR nejsou hodnoceny IARC, ale přesto jsou brány jako toxické. Tyto látky jsou běžně užívány jako průmyslová barviva. Ovšem už se našlo několik případů, kdy byly nalezeny v potravinách, a to zejména v potravinách obsahujících chilli. Látky zde byly přidávány, aby si chilli zachovalo svoji lákavou červenou barvu, protože u přírodních barviv hrozí vyblednutí. Tyto potraviny byly okamžitě po zjištění těchto látek staženy z pultů.

3.3.1.

Sudan I

19

Chemický název S I je 1-fenylazo-2-naftol. S I má vzhled červeno-oranžového prášku, používá se zejména k barvení vosků, olejů, rozpouštědel a leštidel. Přímá karcinogenita na člověka nebyla prokázána, ale testy na krysách přinesly důkaz o karcinogenitě na jejich játra a močový měchýř. A díky podobnostem zvířecího a lidského cytochromu P450 se dá předpokládat podobný vliv i na člověka. Proto je v hodnocení IARC klasifikován do kategorie 3 karcinogenních látek: nezařazené do skupiny prokazatelně karcinogenních látek působících na člověka. Zároveň je S I považován za velmi silný alergen kůže (9).

Obr. 4 Sudan I

Ilustrace 1: Sudan I 3.3.2.

Sudan II

Chemickým názvem 1 - (2,4-dimethylfenyl) azonapthalen-2-ol. SII je červený až oranžově-hnědý prášek. Co se týče toxikologie, působí na člověka drážděním kůže, vážně dráždí oči a může způsobit podráždění dýchacích cest (10).

Obr. 5 Sudan II

Ilustrace 2: Sudan II 3.3.3.

Sudan III

Celým chemickým názvem 1 - ((4 - (phenyldiazenyl) fenyl) azonaphthalen-2ol. Další používané názvosloví je: Sudan G, Sudan red BK Scarlet B a mnoho jiných. Podle IARC je SIII zařazen do kategorie 3: přímo neprokazatelný karcinogen (11). Sudan III se využívá k barvení trigliceridů v živočišných tkáních. Vzorkem tkáně bývá zmražený řez, který se obarví ponořením do roztoku ethanolu a S III nebo S IV, u vzorku se ještě provede dobarvení jádra hematoxylinem. Poté se řez 20

ještě zafixuje. K fixaci je použita Barkerova tekutina, která se skládá z vody, formolu a chloridu vápenatého. Výsledná barva buněk obsahujících tuky je červená (12).

Obr. 6 Sudan III

Ilustrace 3: Sudan III 3.3.4.

Sudan IV

S IV Chemickým názvem 1- (2-methyl-4-(2-methylphenyldiazenyl) fenyl) azonapthalen-2-ol, se využívá stejně jako S III při barvení lipidů. Způsob barvení je stejný jako u S III.(12)

Obr. 7 Sudan IV

Ilustrace 4: Sudan IV 3.3.5.

Para Red

Celým chemickám názvem 1 - [(E) - (4-nitrofenyl) diazenyl]-2-naftol. PR je látka velmi podobná S I. PR bylo objeveno roku 1880 a je nejstarším známým azobarvivem. Používá se zejména jako barvivo do tiskáren (14).

Obr. 8 Para red

Ilustrace 5: Para red 3.3.6.

Sudan orange G

SOG je celým oficiálním chemickým názvem 2,4 – dihydroxy azobenzen (15). 21

Obr. 9 Sudan orange G

Ilustrace 6: Sudan orange G

22

Experimentální část

4. 4.1.

Použité přístroje

Systém SIChromTM (FIAlab®, Bellevue, WA, USA) Analytické váhy Sartorius 2004 MP, SRN VIS lampa Ocean Optics HL-2000 Kolony Merck millipore, United Kingdom Chromolith® FastGradient RP-18 endcapped 50-2 HPLC column Ultrazvuková lázeň Bandelin SONOREX RK 52, Berlín, SRN Automatické pipety, Biohit

4.2.

Použité chemikálie

Sudan I čistota ≥95 %, Sigma Aldrich Sudan II čistota 90 %, Sigma Aldrich Sudan III čistota >90%, Sigma Aldrich Sudan IV čistota ≥80 %, Sigma Aldrich Sudan Orange G čistota >97%, Sigma Aldrich Para Red čistota 95 %, Sigma Aldrich Tetrahydrofuran HPLC grade ≥ 99,9%, inhibitor free, Sigma Aldrich Acetonitril, gradient grade for HPLC ≥ 99,9%, Sigma Aldrich Superčistá voda Millipore

4.3.

Parametry SIC

Základní parametry SIC se vyčtou z chromatogramu. Chromatogram je záznam odezvy detektoru, z něhož se vyčte absorbance, která je závislá na koncentraci látky. Proto, aby bylo možno dosáhnout uvedení metody do praxe, je nutno zjistit základní charakteristiky měření, jakými jsou linearita - kalibrace, přesnost - opakovatelnost a správnost měření. Tyto charakteristické hodnoty byly získány zpracováním výsledků ze všech měření.

4.3.1.

Kalibrační závislost

Linearita je vyjádřena přímkovou závislostí proměnných, kterými jsou odezva detektoru (v tomto případě absorbance) a koncentrace analytu ve vzorku. Vzájemná závislost je charakterizována korelačním koeficientem r – čím bližší hodnotě 1, tím 23

více je závislost propojena (hodnota rovná 1 vyjadřuje absolutní lineárnost).

, kde: x, y – vyjadřují konkrétní hodnoty proměnných , - vyjadřují průměry proměnných řad Přesnost – opakovatelnost

4.3.2.

Přesnost je vyjádřena výsledky opakovaných měření. Největší přesnost je, pokud všechna měření vyjdou jako stejná hodnota ve stejném retenčním čase. Náhodná a nepravidelná chyba je vyjádřena jako směrodatná odchylka, a to dle vzorce:

SMODCH =

, kde platí:

x - vyjadřuje jednotlivé hodnoty charakteristiky píku (v daném případě výška píku, používá se i plocha píku nebo poměr ploch vzorku a standardu) - průměr hodnot n - počet hodnot minus 1 Opakovatelností, jsou myšlena opakovatelná měření za stejných podmínek (stejná laboratoř, pracovník, činidla, přístroje a stejný pracovní postup) Je určena podle toho jak se jednotlivá hodnota liší od průměru a je vyjádřena jako relativní směrodatná odchylka, vyjadřuje se v procentech. podle vzorce: RSD=SMODCHx∙100

4.3.3.

Správnost

Hodnotí se přesnost od přípravy vzorku až po jeho analýzu. Ve výsledku se projeví přítomnost soustavné chyby, shoda výsledku se správnou hodnotou. Srovnává se několik stejných, samostatně připravených vzorků, se vzorkem z přesného množství standardů. =ℎ (ℎ + −ℎ )∙100, kdy: hv – odezva vzorku (výška píku) 24

hv+s – odezva vzorku s přídavkem standardu (výška píku) Správnost bývá také označována jako výtěžnost, a hodnota R by se měla pohybovat v rozmezí 95% - 105% (17) .

4.4. 4.4.1.

Příprava mobilních vzorků a standardů Příprava mobilní fáze

Pro dané měření bylo používáno různých poměrů ACN a vody.

4.4.2.

Příprava standardů

Dle požadované koncentrace 1mg/ml a finálního objemu byla vypočtena navážka standardu. Látka byla navážena na analytických vahách, kvantitativně převedena do odměrné baňky a rozpuštěna v tetrahydrofuranu nebo ACN. Odměrná baňka byla doplněna po rysku, roztok byl protřepán a odplyněn. Pro přípravu pracovních roztoků standardů a vzorků bylo odpipetováno potřebné množství roztoku standardů a doplněno mobilní fází do 1ml.

4.5.

Měření analytů

Nejdříve byly měřeny standardy zvlášť SOG, PR a S I při poměru mobilní fáze ACN:H2O, 50:50. Poté S II – S IV v poměru mobilní fáze 70:30. Později byly použity směsi standardů SOG – SI a S II – S IV. Pro nástřik bylo použito 10 µl roztoku standardu v objemu 1ml Průtoková rychlost byla nastavená na 15 µl/s. Měřeno bylo při vlnových délkách λ= 400, 500, 480 a 600 nm. K analýze bylo použito toto nastavení softwaru (Tabulka1 znázorňuje schéma systému).

Tab. 1 Program analýzy, bez koncentračního gradientu.

Jednotka

Příkaz / Děj

Vícecestný ventil

Přepnout do polohy 8

Pumpa

Nasát 3800µl mobilní fáze rychlostí 70µl/s 25

Pumpa

Vyčkat do konce a poté ještě 2s

Vícecestný ventil


Pumpa

Nasát 10µl vzorku rychlostí 10µl/s

Pumpa

Vyčkat na dokončení akce

Vícecestný ventil


Pumpa

Vytlačit celý objem na kolonu rychlostí 15µl/s

Pumpa

Vyčkat 5s

Spektrometr

Skenování absorbance a referenčního spektra

Pumpa

Vyčkat do konce akce

Spektrometr

Konec skenování

V první fázi měření byla ověřena dobrá eluce standardu z kolony, odečitatelnost z chromatogramu, což se u obou skupin Azobarviv povedlo.

Obr. 10 Chromatogram SOG λ=480 nm, PR λ= 500 nm a S I λ= 500 nm, c = 20 µg/ml , mobilní fáze ACN:voda 50:50

26

Obr. 11 S1 λ= 600 nm, S III λ= 600 nm a S IV λ= 600 nm, c = 20 µg/ml , mobilní fáze ACN:voda = 80 : 20

Dalším cílem bylo najít optimální poměry ACN s H2O, aby byla možnost pomocí dvou mobilních fází eluovat všechny standardy využitím gradientové eluce. Další parametry, které bylo nutno nastavit, byly rychlost průtoku, objem mobilních fází, které měli být nasáty přes ventil. Nejdříve byla vyzkoušena mobilní fáze číslo 1 v poměru ACN:voda 50:50 a mobilní fáze číslo dvě ACN:voda 80:20. U těchto dvou koncentrací nastal problém v tom, že píky PR a S I byly eluovány velmi rychle za sebou z kolony a u měřených vzorků by mohlo dojít i interferenci s šumem matrice a nemožnosti vyhodnocení. Další problém byl s píkem standardu S IV, pro který nebyla koncentrace druhé mobilní fáze dostatečně silná a nebyl eluován z kolony. V další fázi byly vyzkoušeny poměry mobilních fází č.1 40:60 a č.2 90:10 Zde se opět objevil problém s malým rozdílem retenčních časů píků standardů PR a S I. Naprosto stejný problém nastal i při koncentracích mobilních fází č.1 30:70 a 90:10. Podobně si vedla i kombinace mobilních fází č.1 30:70 a č.2 100% ACN. U těchto měření byly vyzkoušeny různé změny nasátých objemů mobilních fází a rychlostí, ovšem bez větších úspěchů na podobě píků. Proto bylo v dalším případě vyzkoušeno i použití tří mobilních fází. Pokusy započaly s poměry mobilních fází č.1 50:50, č.2 70:30 a č.3 100% ACN. Po nastavení softwaru a nachystání všech tří mobilních fází vycházely píky poměrně dobře oddělené, ale problém byl, že píky vycházely rozmyté a vytvářely dvě 27

maxima apod. Totéž se stalo i s poměry č.1 50:50, č.2 60:40 a č.3 100% ACN. Přes různé pokusy o změny objemů nasávaných přes ventil do mísící cívky nepřišlo kýžené zlepšení v tvorbě symetrických a úzkých píků. (Tabulka č.2 schéma systému) Tab. 2 Program analýzy s koncentračním gradientem tvořeným dvěma fázemi.

Jednotka

Příkaz / Děj

Vícecestný ventil


Pumpa

Nasát 600µl mobilní fáze č.1 rychlostí 70µl/s, vyčkat do konce

Vícecestný ventil


Pumpa


Vícecestný ventil


Pumpa

Nasát 10µl vzorku rychlostí 10µl/s, vyčkat do konce

Pumpa

Vyčkat do ukončení

Vícecestný ventil


Pumpa

Vytlačit objem 3800µl na kolonu rychlostí 10µl/s

Pumpa

Počkat 5s

Spektrometr


Spektrormetr

Počkat 380s

Vícecestný ventil


Pumpa


Pumpa

Vyčkat do ukončení

Pumpa

Počkat 2s

Vícecestný ventil


Pumpa

Vytlačit objem pumpy na kolonu rychlostí 10µl/s

Pumpa

Počkat 5s

Spektrometr


Pumpa

Počkat 25s

Spektormetr

Ukončit skenování

28

Obr. 12 Chromatogram gradientové eluce SOG, PR, S I – S IV (c = 10 µg/ml).

Po neúspěšných pokusech s třemi mobilními fázemi byl opětovný návrat ke dvěma fázím. Byly vybrány mobilní fáze č.1 55:45 a č.2 90:10 S těmito mobilními fázemi začaly píky v chromatogramu vycházet ostře, bez rozmytí, bez dvou vrcholů apod. Finální nastavení softwaru vypadalo takto.(tabulka č.3 znázorňuje schéma systému) Tab. 3 Konečný program analýzy s koncentračním gradientem mobilních fází 55:45 a 90:10

Jednotka

Příkaz / Děj

Vícecestný ventil


Pumpa

Nasát 2300µl mobilní fáze č.2, rychlostí 80µl/s, vyčkat do konce a 2 sekundy

Vícecestný ventil


Pumpa

Nasát 1500µl mobilní fáze č.1, rychlostí 80µl/s, vyčkat do konce a 2 sekundy

Vícecestný ventil


Pumpa

Nasát 10µl vzorku rychlostí 10µl/s počkat do konce

Vícecestný ventil

Přepnout do polohy tři

Pumpa

Vyprázdnit pumpu rychlostí 15µl/s a počkat 5s

Spektrometr

Skenování absorbance a referenčního spektra počkat 250s

Vícecestný ventil


Pumpa

Nasát 400µl mobilní fáze č.2 rychlostí 80µl/s, vyčkat do konce a 2 sekundy

Vícecestný ventil


29

Pumpa

Vyprázdnit pumpu rychlostí 15µl/s, počkat do konce a 5s

Spektrometr

Skenování absorbance a referenčního spektra počkat 25s

Pumpa

Vyprázdnit pumpu

Spektrometr

Ukončit skenování

Obr. 13 Chromatogram gradientové eluce SOG, PR, S I – S IV (c = 10 µg/ml). Mobilní fáze č.1 55:45, č.2 90:10.

4.6.

Kalibrační závislost

Kalibrační křivka byla vytvořena pro každé barvivo, pomocí devíti koncentrací. Použité byly koncentrace standardů 40; 30; 20; 10; 5; 2,5; 1; 0,5 a 0,25ug/ml. Kalibrační křivky jsou uvedeny pro každé barvivo i s korelačním koeficientem v tabulkách 4-9

30

Tab. 4 Kalibrační křivka SOG

C

Cmax

R2 = 0,9974

Kalibrační křivka: y= 0,0229x + 0,0289

ug/ml 40

0,928

30

0,716

20

0,508

10

0,287

5

0,149

2,5

0,077

1

0,037

0,5

0,026

Cmax

Kalibrační křivka Sudan orange G

1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0

10

20

31

ug/ml

30

40

50

Tab. 5 Kalibrační křivka PR

C

Cmax

R2 = 0,9958


ug/ml 40

0,858

30

0,668

Cmax

Kalibrační křivka Para red

1

20

0,493

10

0,256

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5

5

0,124

0,4 0,3

2,5

0,062

0,2 0,1

1

0,028

0,5

0,015

0,25

0,014

0 0

20 ug/ml

10

32

30

40

50

Tab. 6 kalibrační křivka S I

C

Cmax


R2 = 0,9898

ug/ml 40

0,737

30

0,604

Kalibrační křivka Sudan I

Cmax 0,9

20

0,451

0,8 0,7

10

0,250

0,6 0,5

5

0,130

0,4 0,3

2,5

0,067

1

0,035

0,5

0,021

0,25

0,014

0,2 0,1 0 0

5

10

15

33

20ug/ml 25

30

35

40

45

Tab. 7 Kalibrační křivka S II

C

Cmax


R2 = 0,982

ug/ml 40

0,521

30

0,437

Cmax

Kalibrační křivka Sudan II

0,6

20

0,346

10

0,181

5

0,092

0,5 0,4 0,3 0,2

2,5

0,050

1

0,027

0,5

0,016

0,25

0,013

0,1 0 0

20 ug/ml

10

34

30

40

50

Tab. 8 kalibrační křivkaa S III

C

Cmax


R2 = 0,9927

ug/ml 40

0,876

30

0,650

Cmax

0,522

1,000 0,900

0,257

0,800 0,700

20 10

0,600 0,500 0,400

5

0,130

2,5

0,072

0,300 0,200

0,034

0,100 0,000

1

Kalibrační křivka Sudan III

0

0,5

0,019

0,25

0,009

10

20

35

ug/ml

30

40

50

Tab. 9 kalibrační křivka S IV

C

Cmax

Kalibrační křivka:

R2 = 0,9922

y = 0,0121x + 0,0108

ug/ml 40

0,488

30

0,354

Kalibrační křivka Sudan IV

Cmax 0,600

20

0,288

10

0,144

0,500 0,400 0,300

5

0,072

2,5

0,038

0,200 0,100 0,000

1

0,018

0,5

0,010

0,25

0,005

0

10

20

ug/ml

30

40

50

Z dosažených výsledků byly určeny i limity detekce a kvantifikace. Pro SOG byl stanoven limit detekce 0,15 µg/ml a limit kvantifikace 0,5 µg/ml. U ostatních azobarviv byl limit detekce stanoven na koncentraci 0,075 µg/ml a limit kvantifikace 0,25 µg/ml. Koeficient determinace (Korelační koeficient) u dvou standardů azobarviva byl vyšší než 0,995, konkrétně SOG R2=0,9974 a PR R2=0,09958. U ostatních azobarviv koeficient determinace vyšel nižší než 0,995, Proto nelze tuto metodu měření validovat. Z grafu kalibračních křivek lze vypozorovat, že v oblasti koncentrace 20 µg/ml, leží bod výrazněji mimo prokládající přímku.

36

4.7.

Opakovatelnost

Opakovatelnost byla zjištěna ve třech koncentracích standardů SOG, Para red a Sudanů I-IV. Použito bylo vždy sedm stejných nástřiků o jednotné koncentraci všech standardů ve vzorku. Byly Použity koncentrace 5, 10 a 20µg/ml. Z těchto měření byly spočteny směrodatné odchylky a relativní směrodatné odchylky. V tabulkách (10-15) jsou uvedeny výsledky opakovatelnosti.

Tab. 10 Opakovatelnost se standardem Sudanu Orange G

Koncentrace 5µg/ml Vzorek č. 1 2 3 4 5 6 7 Ø SMODCH RSD (%)

Výška píku 0,159 0,144 0,155 0,156 0,155 0,151 0,153 0,1533 0,00447 2,89

Retenční čas 141,7 145,7 142 142,6 142,2 142,2 142,1 142,643 1,2726 0,89

Koncentrace 10µg/ml Výška píku 0,275 0,269 0,254 0,274 0,265 0,243 0,254 0,262 0,0111 4,23

37

Koncentrace 20µg/ml

Výška Retenční čas píku 141,3 0,493 141,4 0,485 141,5 0,5 141,4 0,499 141,8 0,468 141,8 0,469 141,6 0,485 141,5429 0,4856 0,1841 0,0121 0,13 2,5

Retenční čas 141,8 141,9 141,8 142 141,6 142,1 141,8 141,8571 0,1498 0,11

Tab. 11 Opakovatelnost se standardem Para red


Výška píku 0,101 0,097 0,11 0,102 0,101 0,102 0,103 0,1023 0,0036 3,53

Retenční čas 227,8 230,8 227,4 227,1 226,8 226,4 226,2 227,5 1,4412 0,63



Výška píku 0,204 0,199 0,199 0,199 0,202 0,188 0,197 0,1983 0,0047 2,37

Výška píku 0,426 0,425 0,413 0,407 0,401 0,398 0,409 0,4113 0,0101 2,45

Retenční čas 226,3 226,2 226,2 226,1 225,9 225,9 226,4 226,1429 0,1761 0,08

Retenční čas 227,4 226,5 226,5 227,2 226,8 226,3 226 226,6714 0,4589 0,20

Tab. 12 Opakovatelnost se standardem Sudan I


Výška píku 0,097 0,099 0,106 0,103 0,1 0,108 0,101 0,102 0,0036 3,55

Retenční čas 254,7 259,1 256 256,4 255,4 255 254,2 255,829 1,505 0,59

Koncentrace 10µg/ml Koncentrace 20µg/ml Výška píku 0,202 0,187 0,188 0,186 0,182 0,18 0,19 0,1879 0,0066 3,51

38

Retenční čas 255,4 254,7 255,5 254,8 254,2 254,1 254,4 254,7286 0,5119 0,20

Výška píku 0,406 0,392 0,386 0,399 0,371 0,359 0,384 0,3853 0,0149 3,87

Retenční čas 255,8 253,6 253,9 256,2 255,3 255,1 253,5 254,7714 1,0166 0,39

Tab. 13 Opakovatelnost se standardem Sudan II


Výška píku 0,069 0,077 0,091 0,085 0,092 0,095 0,091 0,0857 0,0088 10,22

Retenční čas 301,4 305,0 299,7 301,1 301,2 300,6 301,0 301,429 1,548 0,51



Výška píku 0,152 0,153 0,146 0,148 0,136 0,136 0,145 0,1451 0,0064 4,4

Výška píku 0,306 0,300 0,284 0,305 0,286 0,283 0,262 0,2894 0,0145 5

Retenční čas 301,4 300,7 300,3 300,9 299,6 299,5 300,1 300,3571 0,6411 0,21

Retenční čas 301,2 301,5 301,2 299,6 300,5 300,8 301,7 300,9286 0,6584 0,22

Tab. 14 Opakovatelnost standardu Sudan III


Výška píku 0,108 0,114 0,122 0,118 0,126 0,135 0,13 0,1219 0,0087 7,11

Retenční čas 334 338,7 333 334 334,1 333,5 334,8 334,586 1,7561 0,52

Koncentrace 10µg/ml Výška píku 0,261 0,267 0,257 0,26 0,248 0,246 0,263 0,2574 0,0071 2,79

39


Výška Retenční čas píku 335,3 0,54 333,8 0,518 332,6 0,491 333,5 0,516 333,2 0,499 333,4 0,499 333,1 0,422 333,5571 0,4979 0,7908 0,0345 0,24 6,92

Retenční čas 335,2 336,1 335,4 332,7 334 333,9 335,9 334,7429 1,15 0,34

Tab. 15 Opakovatelnost standardu Sudan IV


Cmax 0,052 0,054 0,057 0,055 0,059 0,062 0,06 0,057 0,0033 5,78

Retenční čas 390 392,2 386,1 387,4 387,9 387 388,5 388,443 1,9085 0,49

Koncentrace 10µg/ml Cmax 0,124 0,134 0,13 0,123 0,13 0,126 0,13 0,1281 0,0036 2,84

Retenční čas 389,4 386,9 386 386,6 386,8 386,7 387 387,0571 1,0026 0,26

Koncentrace 20µg/ml Cmax 0,307 0,29 0,281 0,291 0,285 0,285 0,236 0,2821 0,0204 7,22

Retenční čas 390,4 391,1 389,8 386,6 387,9 388 389,6 389,0571 1,4792 0,38

RSD < 1% je dáno jako limit opakovatelnosti. Tuto hodnotu se nám povedlo dokázat pouze u retenčních časů. U Cmax byl nejlepší výsledek 2,4% u Para Red při koncentraci 10µg/ml. Většina výsledků se vešla do 5%. Nejhorší výsledek byl u Sudanu II při koncentraci 5µg/ml kdy RSD přesáhla 10%, pokud by byla vynechána jedna odlehlá hodnota, RSD by se klesla na hodnotu 6,7%. Ale u žádné hodnoty jsme se nedostali ani po vyloučení k hodnotě pod 1%.

4.8.

Interference se vzorky

Pro možnosti stanovení barviv v potravinách, bylo nutno vyzkoušet interference v chilli omáčkách, které neobsahovaly námi měřené azobarviva. Vzorky byly měřeny při koncentrací 1 a 5 µg/ml a to čistý extrakt, extrakt neobohacený standardy všech látek a roztok standardů. 4.8.1.

Příprava vzorku

Byl odebrán 1g chilli omáčky, ke kterému bylo přidáno 10 ml tetrahydrofuranu. Poté byla směs umístěna do ultrazvukové lázně na 10 minut. Po vyjmutí z lázně byla smě ponechána 10 minut k usazení. Po usazení bylo odebráno 5 ml tekutiny a přefiltrováno přes filtr 0,45 µm. k přefiltrovanému vzorku se nyní mohl přidat standard a vzorek se zředil s vodou v poměru 1:1. Takto připravený vzorek je připraven k měření. Výsledky měření jsou obsaženy v tabulkách 40

Tab. 16 výsledky standardu SOG s ochucovadly

fereronová Koncentrace Chilli Chilli omáčka + feferonová omáčka 1µg/ml omáčka standard omáčka standart měření číslo 1 2 3 Ø

Výška píku 0 0 0 0

Výška píku 0,032 0,029 0,032 0,031

Retenční čas 144,4 143,9 144,5 144,267


Výška píku 0,035 0,033 0,04 0,036

+ Standard

Retenční čas 144,4 143,9 144,5 144,267

Výška píku 0,036 0,034 0,033 0,0343

Retenční čas 143,8 144,5 143,4 143,9

Koncentrace Výška Výška Retenční Výška Výška Retenční Výška Retenční 5µg/ml píku píku čas píku píku čas píku čas 5 0 0,09 148,3 0 0,09 146,3 0,153 145 6 0 0,091 144,7 0 0,09 146,1 0,137 144 7 0 0,093 146,9 0 0,096 146,9 0,137 144,5 Ø 0 0,0913 146,633 0 0,092 146,433 0,1423 144,5 Výtěžnost SOG v koncentraci 1 µg/ml 90,4% u chilli omáčky a 104% u feferonové omáčky v C 5 µg/ml 64,2% u chilli om. a 64,7% u feferonové om. Tab 17 výsledky standardu PR s ochucovadly

fereronová Koncentrace Chilli Chilli omáčka + feferonová omáčka 1µg/ml omáčka standard omáčka standart Výška měření číslo píku 1 0 2 0 3 0 Ø 0

Výška píku 0,021 0,023 0,026 0,0233

Retenční čas 232,2 230,8 231,7 231,57


Výška píku 0,023 0,022 0,021 0,022

+

Retenční čas 231,5 231,8 234 232,43

Standard Výška píku 0,022 0,023 0,023 0,0227

Retenční čas 231,5 231,1 231,4 231,33

Koncentrace Výška Výška Retenční Výška Výška Retenční Výška Retenční 5µg/ml píku píku čas píku píku čas píku čas 5 0 0,085 239,7 0 0,075 236,5 0,155 232,4 6 0 0,087 233 0 0,084 233,2 0,149 231,6 7 0 0,09 233,9 0 0,082 234,3 0,159 231,7 Ø 0 0,0873 235,53 0 0,0803 234,67 0,1543 231,9 Výtěžnost PR v koncentraci 1 µg/ml 102,6% u chilli omáčky a 96,9% u feferonové omáčky v C=5 µg/ml 56,6% u chilli om. a 52% u feferonové om.

41

Tab. 18 výsledky standardu S I s ochucovadly

fereronová Koncentrace Chilli Chilli omáčka + feferonová omáčka 1µg/ml omáčka standard omáčka standart měření číslo 1 2 3 Ø


Výška píku 0,034 0,031 0,033 0,0327

Retenční čas 260,3 257,4 257,9 258,53


Výška píku 0,035 0,033 0,038 0,0353

+ Standard

Retenční čas 257,7 258,1 259,2 258,33

Výška píku 0,034 0,031 0,032 0,0323

Retenční čas 256,9 258,5 258,8 258,07

Koncentrace Výška Výška Retenční Výška Výška Retenční Výška Retenční 5µg/ml píku píku čas píku píku čas píku čas 5 0 0,111 261,4 0 0,093 259,9 0,156 259 6 0 0,092 259,3 0 0,094 258,9 0,136 258,2 7 0 0,106 259,6 0 0,109 260,2 0,135 258 Ø 0 0,103 260,1 0 0,0987 259,67 0,1423 258,4 Výtěžnost S I v koncentraci 1 µg/ml 101,2 u chilli omáčky a 109,3 u feferonové omáčky v C 5 µg/ml 72,4% u chilli om. a 69,4% u feferonové om. Tab. 19 výsledky standardu S II s ochucovadly

fereronová Koncentrace Chilli Chilli omáčka + feferonová omáčka 1µg/ml omáčka standard omáčka standart

+ Standard

měření číslo 1 2 3 Ø


Výška píku 0,024 0,022 0,026 0,024

Retenční čas 301,9 302,2 301,6 301,9


Výška píku 0,024 0,023 0,024 0,0237

Retenční čas 299,8 301,5 300,5 300,6

Výška píku 0,028 0,025 0,025 0,026

Retenční čas 301,8 302,4 302,5 302,23

Koncentrace 5µg/ml 5 6 7 Ø


Výška píku 0,072 0,074 0,074 0,0733

Retenční čas 301,2 303,3 302,2 302,23


Výška píku 0,06 0,07 0,08 0,07

Retenční čas 302,5 303,2 301 302,23

Výška píku 0,117 0,108 0,111 0,112

Retenční čas 302,2 302,5 302,6 302,43

Výtěžnost S II v koncentraci 1 µg/ml 92,3% u chilli omáčky a 91,2% u feferonové omáčky v C 5 µg/ml 65,4% u chilli om. a 62,5% u feferonové om.

42

Tab. 20 výsledky standardu S III s ochucovadly

fereronová Koncentrace Chilli Chilli omáčka + feferonová omáčka 1µg/ml omáčka standard omáčka standart

+ Standard



Výška píku 0,03 0,029 0,033 0,0307

Retenční čas 333,8 335 334,8 334,53


Výška píku 0,027 0,032 0,033 0,0307

Retenční čas 332,7 334,6 333,2 333,5

Výška píku 0,033 0,032 0,031 0,032

Retenční čas 335,2 335,5 335,1 335,27

Koncentrace 5µg/ml 5 6 7 Ø


Výška píku 0,104 0,117 0,122 0,1143

Retenční čas 333,8 336,9 335,6 335,43


Výška píku 0,089 0,099 0,115 0,101

Retenční čas 336,6 336,4 333,9 335,63

Výška píku 0,173 0,165 0,177 0,1717

Retenční čas 334,9 335,5 335,3 335,23

Výtěžnost S III v koncentraci 1 µg/ml 95,9% u chilli omáčky a 95,9% u feferonové omáčky v C 5 µg/ml 66,6% u chilli om. a 58,8% u feferonové om. Tab. 21 výsledky standardu S IV s ochucovadly

Koncentrace 1µg/ml

fereronová Chilli Chilli omáčka + feferonová omáčka omáčka standard omáčka standart



Výška píku 0,014 0,014 0,016 0,0147

Retenční čas 385,9 388,9 387,7 387,5


Výška píku 0,012 0,015 0,014 0,0137

+

Retenční čas 385,6 386,3 386,7 386,2

Standard Výška píku 0,014 0,016 0,013 0,0143

Retenční čas 388,9 387,4 388,2 388,17

Koncentrace Výška Výška Retenční Výška Výška Retenční Výška Retenční 5µg/ml píku píku čas píku píku čas píku čas 5 0 0,054 389,6 0 0,044 391,4 0,102 387,9 6 0 0,059 391,4 0 0,05 391 0,096 387,9 7 0 0,063 389,2 0 0,057 387,4 0,101 387,4 Ø 0 0,0587 390,07 0 0,0503 389,93 0,0997 387,73 Výtěžnost S IV v koncentraci 1 µg/ml 102,8% u chilli omáčky a 95,8% u feferonové omáčky v C 5 µg/ml 58,9% u chilli om. a 50,5% u feferonové om. Výsledek s chilli omáčkami nám ukázal, že v námi měřených vlnových délkách nic neinterferuje s vybranými azobarvivy. Při koncentraci 1 µg/ml nedošlo ani k snížení 43

absorbance oproti standardu. Horší výsledek přišel při koncentraci 5 µg/ml, při této koncentraci je ve výsledcích vidět zřetelný pokles absorbance oproti standardu. Možná chyba výsledku by mohla vypovídat o chybě při přidávání standardu do vzorku s omáčkami.

44

5.

Závěr

Má diplomová práce se zabývá možnostmi vyvinout metodu, která by byla schopna kvalitně a přesně stanovovat azobarviva (Sudan orange G, Para Red, Sudan I, Sudan II, Sudan III a Sudan IV) pomocí metody sekvenční injekční chromatografie. Prvním cílem mé diplomové práce bylo najít ideální poměr mobilní fáze, která se skládala z acetonitrilu a vody. Odzkoušeno bylo hodně poměrů, nejdříve byla odzkoušena eluce s jednou mobilní fází. Tato možnost nevedla ke správné separaci. Další možností byla gradientová eluce, při které byly použity dvě mobilní fáze. Nejlepší separační účinek byl při poměru mobilních fází číslo 1 55:45 a číslo 2 90:10. S tímto gradientem už byla separace azobarviv úspěšná. Dalším úkolem bylo prokázat vhodnost této metody k běžnému užívání. Testována byla linearita, opakovatelnost a výtěžnost. Pro linearitu byla stanovena hodnota koeficientu determinantu na >0,995, této hodnoty bylo dosaženo pouze u SOG a PR. ostatní azobarviva už tak dobrou linearitu neměla, ovšem z kalibračních křivek lze vypozorovat, že jedna hodnota u všech azobarviv leží výrazně mimo kalibrační křivku. Opakovatelnost se vyjadřuje ve formě relativní směrodatné odchylky v procentech, jejich hodnota pro opakovatelnost by měla být RSD < 1%. Tyto hodnoty byly zjištěny pouze u retenčních časů, u absorbancí se hodnoty pohybují na úrovni 3%, ale bohužel byly vypočítány i výsledky kolem 7%. Výtěžnost byla testována na dvou potravních dochucovadlech. U červených dochucovadel bylo prokázáno, že jiná červená barviva neinterferovala s našimi azobarvivy. Výtěžnost byla měřena se vzorky, ke kterým byly přidány standardy o dvou koncentracích 1 a 5 µg/ml. Výtěžnost vyšla pouze v koncentraci 1 µg/ml ale pouze u PR, u S III a S IV byla výtěžnost v rozmezí 95-105% u obou omáček. U SOG a S I se do daného rozmezí vešla výtěžnost u jedné ze dvou omáček se standardem. U S II se oba vzorky vešly do rozmezí 90-95%. Problém nastal s koncentrací 5 µg/ml, kde všechny vzorky skončily s výtěžností v rozmezí 50,5 – 72,4%. Nejspíše nastala chyba v přípravě vzorků. Z dosažených výsledků vyplývá, že tato metoda nemůže být v aktuální podobě validovaná. Ale při dalším vývoji této metody se tyto základy určitě mohou použít.

45

6.

Seznam použité literatury

1) Ruzicka J., Hansen E.H., Anal. Chim. Acta, 78, (1975), str 145-157 2) Ruzicka J., Hansen E.H., Flow Injection Analysis 2nd ed. J. Wiley, N.Y. 1988 3) Ruzicka J. Marshall G.D., Anal. Chim. Acta, 237, 329, (1990), str 329-343 4) Cabrera K., LCGC LC Column Technology Supplement, (2008), str. 32-35 5) Chocholouš P., Solich P., Šatínský D.: Anal. Chim. Acta, 600 (2007), str. 129-13 6) Adcock J.L., Francis P.S., Agg K.M., Marshall G.D., Barnett N.W., Anal. Chim. Acta 600 (2007), str. 136-141. 7) Herbelin A., Ruzicka J. a kolektiv, Czech. Chem. Commun., 66 (2001), str. 12191237. 8) Šatínský D., Solich P., Chocholouš P., Karlíček R., Anal. Chim. Acta, 499 (2003), str. 205-214. 9) http://www.scbt.com/datasheet-215922-sudan-i.html (únor 2014) 10) http://www.scbt.com/datasheet-215923-sudan-ii.html (únor 2014) 11) http://www.scbt.com/datasheet-203761-sudan-iii.html (únor 2014) 12) http://www.wikiskripta.eu/index.php/Histochemie (únor 2014) 13) http://www.scbt.com/datasheet-203762-sudan-iv.html (únor 2014) 14) http://www.lookchem.com/Para-Red/ (únor 2014) 15) http://www.scbt.com/datasheet-215924-sudan-orange-g.html (únor 2014) 16) http://www.hplc.cz/ (únor 2014) 17) wikipedia.org 18) http://www.flowinjectiontutorial.com/

46

Univerzita Karlova v Praze farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie

Recommend Documents