UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra Analytické chemie
STUDIUM HILIC SEPARAČNÍHO MECHANISMU A VLIVU SLOŽENÍ MOBILNÍ FÁZE NA SELEKTIVITU A RETENCI ANALYTŮ
Autor práce: Michal Lepáček Vedoucí práce: RNDr. Hana Vlčková, Ph.D Vedoucí katedry: Prof. RNDr. Petr Solich, CSc. Hradec Králové 2014
Abstrakt Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra Analytické chemie Kandidát: Michal Lepáček Školitel: RNDr. Hana Vlčková, Ph.D. Název diplomové práce: Studium HILIC separačního mechanismu a vlivu složení mobilní fáze na selektivitu a retenci analytů. Tato diplomová práce se zabývá studiem retence, selektivity a HILIC mechanismů v závislosti na složení mobilní fáze. Pro studii byla zvolena kolona Zorbax HILIC plus (2,1 x 100 mm, 3,5 μm, Agilent Technologies), jedna ze základních druhů HILIC stacionárních fází. Byl testován vliv koncentrace acetonitrilu, pH (3,8, 4,8 a 6,8) a koncentrace pufru (0,5 – 200 mM) na retenci vybraných analytů. Na základě fyzikálně-chemických vlastností (log P a pKa) bylo zvoleno celkem 35 analytů, které zahrnovaly bazické, kyselé a neutrální látky. Byla použita isokratická eluce s průtokem 0,7 ml/min a objem nástřiku 2 μl. Detekce analytů byla provedena pomocí PDA detektoru při vlnové délce 254 nm. Pro snadnější hodnocení byly z naměřených hodnot sestrojeny grafy a tabulky. Vliv procentuálního zastoupení acetonitrilu v mobilní fázi byl hodnocen na základě grafické závislosti k´ = f (% ACN), ze které byla patrná zvyšující se retence se zvyšujícím procentuálním zastoupením ACN pro všechny testované analyty. Dále byl pozorován značný vliv pH a koncentrace pufru na retenci testovaných analytů. Se zvyšující koncentrací pufru byla pozorována zvyšující retence kyselých analytů a snižující retence bazických analytů. Změna pH mobilní fáze ovlivnila zejména retenci bazických analytů, zvýšení pH vedlo ke snižení jejich retence, a v menší míře ovlivnila retenci kyselých analytů, kdy zvýšení pH vedlo k mírnému vzestupu retence většiny kyselých látek. Vliv pH mobilní fáze a koncentrace pufru na retenci neutrálních látek, nekleosidů a nukleových bazí byl zanedbatelný. Při testování vlivu pH na selektivitu bylo zjištěno, že změna pH výrazně neovlivní selektivitu testované stacionární fáze pro většinu testovaných analytů. Na základě lin-log a log-log grafů byl hodnocen retenční mechanismus, který vypovídal o komplexním retenčním mechanismu s převahou rozdělovacího mechanismu.
2
Abstract Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Analytical Chemistry Candidate: Michal Lepáček Supervisor: RNDr. Hana Vlčková Ph.D. Title of Graduation Thesis: Study of HILIC separation mechanism and the influence of mobile phase composition on selectivity and retention of the analytes. This graduation thesis deals with a study of retention, selectivity and HILIC mechanisms depending on the mobile phase composition. The column Zorbax HILIC plus (2,1 x 100 mm, 3,5 μm, Agilent Technologies), one of the basic types of HILIC stationary phases, was chosen for the purposes of this study. The influence of acetonitrile concentration, buffer pH (3,8, 4,8 and 6,8) and buffer concentration (0,5 – 200 mM) on retention of selected analytes was tested. Based on the physical-chemical properties (log P and pKa) a set of 35 analytes including bases, acids and neutral compounds was chosen. Isocratic flow of 0,7 ml/min and injection volume of 2 μl were used. Detection of analytes was performed by a PDA detector at the wavelength of 254 nm. The data are presented in charts and tables for an easier evaluation. The effect of concentration of acetonitrile in mobile phase was evaluated by the dependence k´ = f (% ACN). An increasing retention of analytes with increasing concentration of acetonitrile in mobile phase was shown. The effect of pH and buffer concentration on the retention of tested analytes was tested as well. With increasing buffer concentration increasing retention of acid analytes and decreasing retention of basic analytes was observed. Change of mobile phase pH affected especially the retention of basic analytes, increasing pH led to a decrease of their retention. However, lower influence was shown for the acidic analytes, increasing pH led to a slight increase in retention. The buffer pH and buffer concentration effect were insignificant for neutral compounds, nucleosides and nucleobases. There was also studied the effect of pH on selectivity and the results shew, that pH doesn´t affect the selectivity of the tested stationary phase. Lin-log and log-log charts were constructed for the evaluation of retention mechanism. The results confirmed the complex retention mechanism with the predominance of partitioning mechanism.
3
Prohlášení Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpal, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. V Hradci Králové dne ....................
.............................. Michal Lepáček
4
Poděkování Děkuji RNDr. Hanke Vlčkové, Ph.D. za odborné vedení, mnoho cenných rad a pomoc při zpracování mé diplomové práce. Dále děkuji pracovníkům Katedry analytické chemie za příjemné prostředí a možnost měření pro mou diplomovou práci. Také chci poděkovat mým rodičům a přítelkyni za trpělivost a podporu během studia.
5
Obsah 1. Úvod ..................................................................................................................................... 8 2. Cíl a zadaní práce .................................................................................................................. 9 3. Teoretická část .................................................................................................................... 10 3.1. Obecná charakteristika a mechanismus retence v HILIC ..................................................... 10 3.2. HILIC stacionární fáze ........................................................................................................ 11 3.2.1. Neutrální stacionární fáze ........................................................................................... 13 3.2.2. Nabité stacionární fáze ............................................................................................... 14 3.2.3. Zwitteriontové fáze..................................................................................................... 16 3.3. Mobilní fáze používané pro HILIC....................................................................................... 16 3.3.1. Efekt koncentrace ACN na retenci a selektivitu ........................................................... 18 3.3.2. Efekt pH pufru na retenci a selektivitu ........................................................................ 19 3.3.3. Efekt koncentrace pufru na retenci a selektivitu ......................................................... 19 3.4. Výhody a nevýhody HILIC .................................................................................................. 20 3.5. Použité analyty a jejich vlastnosti ...................................................................................... 21 4. Experimentální část ............................................................................................................. 25 4.1. Použité chemikálie ............................................................................................................ 25 4.2. Použitá kolona ................................................................................................................... 25 4.3. Příprava zásobních roztoků................................................................................................ 25 4.4. Příprava pracovních roztoků pro experiment ..................................................................... 26 4.5. Příprava vodných složek mobilní fáze ................................................................................ 26 4.6. Přístrojové vybavení ……………………………………………………………………………………………………….…27 4.7. Vlastní měření ................................................................................................................... 27 4.8. Schéma experimentu......................................................................................................... 28 5. Výsledky a diskuze .............................................................................................................. 29 5.1. Závislost retence analytů na koncentraci ACN v mobilní fázi .............................................. 29 5.2. Závislosti retence analytů na koncentraci pufru octanu ammoného v mobilní fázi ............. 31 5.3. Závislost retence analytů na rostoucí hodnotě pH pufru octanu ammoného ...................... 34 5.4. Vliv pH na selektivitu ......................................................................................................... 37 5.5. Vyhodnocení retenčního mechanismu HILIC ...................................................................... 40 6. Závěr .................................................................................................................................. 42 Seznam použité literatury ........................................................................................................ 43
6
Seznam použitých zkratek
AcAc
kyselina octová, acetic acid
AmAc
octan amonný, ammonium acetate
ACN
acetonitril
EtOH
ethanol
MeOH
methanol
HPLC
high-performance liquid chromatography
HILIC
hydrophilic interaction liquid chromatography
PVA
polyvinyl alkohol
RP
reverzní fáze, reverse phase
LC
kapalinová chromatografie
NP
normální fáze, normal phase
RF
retenční faktor
MF
mobilní fáze
7
1. Úvod Požadavky na separaci polárních látek, zejména látek biologicky aktivních, se stále zvyšují, a proto je nutné zavádění nových a účinnějších metod. Jednou z nejčastěji používaných analytických metod je vysokoúčinná kapalinová chromatogragie (HPLC). Využití kapalinové chromatografie (LC) na normální fázi (NP) je však problematické kvůli špatné reprodukovatelnosti výsledků a špatné rozpustnosti polárních látek v mobilní fázi typické pro NPLC. Další nevýhodou NPLC je také vysoká toxicita organických rozpouštědel. Z těchto důvodů je NPLC málo používanou metodou. Na druhou stranu LC na reverzní fázi (RP) velmi často používaná pro stanovení nepolárních látek je pro analýzu polárních látek nevhodná z důvodu velmi nízké retence. Proto bylo nutné najít vhodnější metodu pro analýzu polárních látek, kterou je hydrofilní interakční chromatografie (HILIC). Termín HILIC poprvé definoval americký chemik Andrew Alpert v roce 1990 a metoda HILIC se stala vhodnou alternativou NP a RP pro analýzu polárních látek. Využívá stacionární fáze, které jsou typické pro použití NPLC v kombinaci s mobilní fází typickou pro RPLC, tedy s vysokým podílem organické složky, čímž je dosaženo dostatečné retence polárních látek a reprodukovatelnosti výsledků. Předpokládaným mechanismem retence analyzovaných látek v HILIC je rozdělovací mechanismus analyzované látky mezi nepolární mobilní fázi a vodnou vrstvou, která se tvoří na povrchu stacionární fáze. Podrobný mechanismus v HILIC zatím nebyl úplně objasněn, nicméně výsledky dosavadních studií prokázaly značnou komplexitu retenčních mechanismů [1][3].
8
2. Cíl a zadaní práce Tato diplomová práce se zabývá studiem HILIC mechanismu a vlivu složení mobilní fáze na retenci a selektivitu vybrané skupiny testovaných analytů. Pro experimentální měření byla vybrána kolona Zorbax HILIC plus (Agilent technologies, UK) a skupina 35 biologicky aktivních látek zahrnujících bazické, kyselé a neutrální látky. Byl sledován vliv procentuálního zastoupení acetonitrilu v mobilní fázi, vliv pH a koncentrace pufru mobilní fáze. A zároveň byl sledován také vliv pH na selektivitu testované stacionární fáze a hodnocen její retenční mechanismus.
9
3. Teoretická část Od zavedení HPLC v roce 1970 došlo v oblasti kapalinové chromatografie k výraznému rozvoji a to zejména v oblasti nových typů stacionárních fází, miniaturizace částic a také došlo k zavedení ultra vysokoúčínné kapalinové chromatografie a hydrofilní interakční chromatografie (HILIC) [3]. Termín HILIC, který poprvé použil americký chemik Andrew Aplert, byl zaveden v roce 1990 a popisoval chromatografickou metodu využívající interakce mezi testovanými analyty a hydrofilní stacionárnou fází, kdy jednotlivé analyty byly eluovány hydrofobní mobilní fází obsahující malé procentuální zastoupení vodné složku jako silného elučního činidla [2][12]. Význam hydrofilní interakční chromatografie v posledních několika letech stále roste a to zejména z důvodu usnadnění separace polárních a ionizovaných látek, které jsou špatně zadržovány v RP módu. První publikace využívající HILIC mód se začaly objevovat v roce 2002 a značný nárast počtu publikovaných prací byl zaznamenán v roce 2003, kdy společnost Waters uvedla na trh silikagelovou kolonu Atlantis HILIC a společnost SeQuant AB představila kolonu ZIC-HILIC. Tento vzestupný trend v HILIC módu přispěl k dalšímu rozvoji v dané oblasti a v následujících letech bylo na trh uvedeno několik dalších typů HILIC stacionárních fází od různých výrobců. Později, v roce 2006, se na trhu objevily HILIC kolony s pevným jádrem, které také našly široké uplatnění v analýze polárních látek. V roce 2009 byla poprvé komerčně představena první UHPLC-HILIC kolona s částicemi menšími než 2 µm. V důsledku soustavného vývoje nových typů HILIC stacionárních fází se HILIC stal druhým nejpoužívanějším módem v oblasti kapalinové chromatografie [1][4][24][27].
3.1. Obecná charakteristika a mechanismus retence v HILIC Hydrofilní interakční chromatografie je chromatografická metoda, která se používá k analýze polárních látek špatně zadržovaných pomocí RPLC. HILIC je zároveň vhodnou alternativou pro NPLC. V HILIC chromatografii se používa polární stacionární fáze a zároveň mobilní fáze tvořena organickým rozpouštědlem, nejčastěji acetonitrilem a vodnou fází jako silné eluční činidlo [13]. Přesný HILIC separační mechanismus zatím není zcela objasněn. Předpokládaným principem HILIC separace je rozdělovací mechanismus mezi hydrofóbní částí mobilní fáze a silně hydrofilní vrstvu vody, která se imobilizuje na povrchu polární stacionární fáze. Příčinou imobilizace vodné vrstvy na povrchu stacionární fáze je adsorpce vody na polárních centrech stacionární fáze. Důsledkem toho dochází ke vzniku difúzní vrstvy, která má gradient koncentrace vody směrem do mobilní fáze, což je vidět na Obr.1a [2][10]. V HILIC mechanismu se také popisuje, že stacionární fáze vystupuje jako určitý transportér vody, a 10
proto zde vodíkové vazby mají také důležitý vliv. Určitý vliv na mechanismus retence v HILIC módu se připisuje i iontovým interakcím, jejichž síla je závislá na použitých chromatografických podmínkách jako je například pH a koncentrace aditiva mobilní fáze. Dochazi-li k disociaci analytu, retence se mění v závislosti na získaném náboji analytu. Jestliže analyt získá opačný náboj vzhledem ke stacionární fázi, dochází vlivem silných iontových interakcí ke zvýšení retence analytu, naopak při shodném náboji analytu a stacionární fáze dochází ke snížení retence [2]. V posledních několika letech se studiem HILIC retenčního mechanismu zabývalo několik studií [1][3], které potvrdily velmi komplexní charakter mechanismu, na kterém se podílí hydrofilní, iontově výměnné, elektrostatické a další interakce. Nicméně podrobnější popis jednotlivých mechanismů se zatím nepodařilo podrobně vysvětlit.
a)
b)
Obr.1 a) difúzní vrstva vody na povrchu HILIC stacionární fáze (stacionární fáze je polární) [2], b) znázornění rozdělovacího mechanismu HILIC systému [6]
3.2. HILIC stacionární fáze Pro separaci polárních analytů v HILIC módu byla v posledních několika letech vyvinuta široká škála různých typů stacionárních fází. Niceméně použití HILIC módu není limitováno pouze na tyto kolony, ale lze také užít širokou škálu polárních stacionárních fází, které byly původně konstruované pro NP chromatografii [6][7]. Zahrnují stacionární fáze obsahující nejen nemodifikovaný silikagel, ale také silikagelové stacionární fáze modifikované polárními funkčními skupinami, jako například hydroxyethyl, amino, amide, zwitterion, sulfobetain a další polární skupiny. Modifikovaný může být nejen silikagelový materiál, ale i polymerní a hybridní materiál [2][7][14].
11
Stacionární fáze používané pro HILIC chromatografii lze rozdělit na základě navázaných funkčních skupin do tří skupin [2][7]: neutrální – bez elektrostatických interakcí (amid, diol, cyklodextrin, cyanopropyl, PVA) viz Obr.2a [7] nabité – silné elektrostatické interakce (nemodifikovaný silikagel, aminopropyl, imidazol, triazol) viz Obr.2b [7] zwitterionty – slabé elektrostatické interakce (sulfobetain (ZIC-HILIC), fosfocholin, obelisk N), viz Obr.2c [7]
AMID
DIOL
CYANO
PVA
Obr.2a) Funkční skupiny neutrálních stacionárních fází [7]
SILIKAGEL
AMINOPROPYL SILIKAGEL
12
IMIDAZOL
TRIAZOL
Obr.2b) Funkční skupiny nabitých stacionárních fází [7]
SULFOBETAIN
FOSFOCHOLIN
OBELISC N
Obr.2c) Funkční skupiny zwitteriontových stacionárních fází [7]
Nejčastěji používanou HILIC stacionární fází je nemodifikovaný silikagel a hned po nich stacionární fáze modifikované aminovou skupinou. Pro selektivní separaci bazických látek jsou vhodné zejména amidové a zwitteriontové stacionární fáze, pro kyselé látky je to naopak aminová stacionární fáze [2][14].
3.2.1. Neutrální stacionární fáze Funkční skupiny modifikující stacionární fáze této kategorie (například amid, diol, cyano a cyklodextrin) nejsou nabité v celém rozsahu pH. Amidová stacionární fáze je jedna z nejpoužívanějších neutrálních stacionárních fází a pro svou vysokou selektivitu k bazickým 13
látkám našla široké uplatnění v oblasti HILIC analýz [7][9]. Obsahuje navázanou amidovou funkční skupinu navázanou na silikagel pomocí krátkého alkylového řetězce nebo pomocí karbamoylové skupiny. Nejčastěji používanou kolonou této skupiny je například BEH Amide kolona, která má funkční skupinu navázanou přes ethylenový můstek, nebo TSK-gel Amide 80 kolona obsahující karbamoylovou funkční skupinu a využívá se pro separaci sacharidů, cukerných derivátů, peptidů a aminokyselin [9]. Dalšími, v porovnání s amidovou stacionární fází, podstatně méně používané stacionární fáze jsou cyano a diolová stacionární fáze. Přestože se jedná o stacionární fáze běžně používané v chromatografii na normální fázi, jejich využití v oblasti HILIC chromatografie je stále velmi omezeno [7]. Cyano stacionární fáze má vždy polární funkční skupinu navázanou přes propylový řetězec. Tato SF tvoří velmi malý počet a slabé hydrofilní vodíkové vazby, což vede k nedostatečné retenci polárních látek a proto má v praxi malé využití. Diolové stacionární fáze našli v praxi větší využití, používaly se k separaci proteinů, ale také nízkomolekulárních fenolických sloučenin. Je to způsobeno díky obsaženým dihydroxylovým skupinám, které jsou schopny tvořit více vodíkových vazeb potřebných pro vytvoření vodní vrstvy na povrchu stacionární fáze. Používanými kolonami obsahujících diolovou skupinu jsou například YMC Pack Diol nebo Luna HILIC [7][9]. Cyklodextrinová stacionární fáze obsahuje také hydroxylovou skupinu, nicméně navázanou na okraji užší části kuželovité struktury cyklodextrinu. Dříve byla tato stacionární fáze využívána zejména k chirální separaci enantiomerů v RP nebo NP módu, nicméně vlivem hydroxylových skupin na povrchu dextrinu je možné stacionární fázi využít také k HILIC separaci. Cyklodextrinové stacionární fáze jsou v HILIC módu používány zejména pro separaci cukerných alkoholů, monosacharidů, oligosacharidů a dalších polárních látek. Retence většiny polárních látek, zejména aminokyselin, je v porovnání s amidovou stacionární fází vyšší, což bylo potvrzeno studií [7][9].
3.2.2. Nabité stacionární fáze Základní nabitou stacionární fází je nemodifikovaný silikagel, který má v praxi největší využití. U silikagelové stacionární fáze rozlišujeme typ A, B a C. Typ A je v praxi původní univerzální chromatografický materiál, který se vyrábí alkalizací silikagelového roztoku, ale je kontaminovaný nečistotami kovů a tak není vhodný pro využití v HILIC aplikaci. Typ B jsou sférické částice tvořené agregací silikagelových solí kyslíkem a obsahují už pouze malé množství kovových nečistot. Díky tomuto způsobu přípravy je typ B stabilnější i při vyšších hodnotách pH (až pH = 9). Typ C tzv. „hydrid silikagelu“ má velkou část Si-OH skupin nahrazených Si-H skupinami, které vznikly v průběhu hydrolyzace. V HILIC módu se používají typy B a C. Silikagelové fáze byly původně určeny pro nevodné aplikace, avšak další 14
silikagelové materiály s menším povrchem silanolových skupiny byly připraveny pro aplikaci s vodně-organickou mobilní fází (např. Atlantis HILIC) [6][9]. Mezi nabité stacionární fáze jsou dále řazeny stacionární fáze modifikované funkčními skupinami, jako například amino, imidazol, triazol, poly(2-sulfoethyl), poly(aspartová kyselina), polyamin. V závislosti na schopnosti ionizace funkčních skupin stacionární fáze je pozorován velmi výrazný vliv nejen rozdělovacího mechanismu, ale také ionto-výměnného mechanismu. Podíl ionto výměnných interakcí na retenci a selektivitě je značně závislý na pH a iontové síle pufru. Stacionární fáze s navázanou amino skupinou jsou typickým příkladem nabité stacionární fáze a má široké využití pro HILIC separaci zejména kyselých látek. V současné době existuje několik typů amino stacionárních fází, které jsou různou formou navázany na silikagel a vykazují značné rozdíly v retenci a selektivitě [7][9]. Tento rozdíl může být pravděpodobně způsobený rozdílnou přípravou stacionární fáze a způsobem vazby amino skupiny na silikagelovou skupinu. Rozlišujeme amino stacionární fáze, kde je navázána primární, sekundární nebo terciární amino skupina. Jelikož primární aminoskupiny jsou značně reaktivní a velmi ochotně vytvářejí shiffovy baze, může docházet k ireverzibilní adsorpci kyselých látek nebo sacharidů. Z těchto důvodů často používaná aminopropylová stacionární fáze může poskytovat výsledky se špatnou reprodukovatelností a velmi silnou retencí kyselých látek, často až ireverzibilní adsorpci snižujíci životnost kolon. Sekundární a terciární aminoskupiny netvoří shiffovy baze, což značně ovlivní nejen životnost kolon, ale také odstraní problémy výše zmíněných nevýhod spojených s využitím primárních amino stacionárních fází. Proto se v HILIC módu používají polyaminové stacionární fáze, jako jsou například YMC Polyamine II, PolyWAX LP, a Luna NH2. Stacionární fáze YMC Polyamine II obsahuje výhradně sekundární a terciární aminové skupiny a stacionární fáze PolyWAX LP obsahuje lineární polyethylenimin pokrytý převážně sekundárními aminoskupiny rovnoměrně rozloženými ve struktuře [7][9]. Dalšími nabitými stacionárními fázemi jsou imidazolové a triazolové stacionární fáze. Obě stacionární fáze jsou připravované obalením částic silikagelu a mohou být pozitivně nabité v širším rozsahu pH (2 – 8), zatím co ostatní SF můžou být nabity v rozsahu pH (3 – 7). Triazolové stacionární fáze jsou účinné hlavně v separaci ve vodě rozpustných vitamínů, karboxylových kyselin, aminokyselin, peptidů a některých polárních léčiv [7][9]. Kromě pozitivně nabitých stacionárních fází se do této skupiny řadí také negativně nabité stacionární fáze, jako například poly(amid 2-sulfoethylasparagové kyseliny), poly(asparagová kyselina) a sulfonované S-DVB stacionární fáze. Tyhle stacionární fáze mají typické použití v ionto-výměnné chromatografii. V porovnání s pozitivně nabitými fázemi se negativně nabité stacionární fáze používají v HILIC módu podstatně méně a to většinou pouze k separaci peptidů a některých bazických látek [7]. 15
3.2.3. Zwitteriontové fáze Zwitteriontové stacionární fáze jsou relativně novou třídou HILIC stacionárních fází, které obsahují na svém povrchu silný kladný (kvartérní dusík) a záporný (sulfonová skupina) náboj v poměru 1:1, a proto je náboj na povrchu je zdánlivě nulový. Zwitteriontové stacionární fáze jsou dostupné například jako kolony ZIC-HILIC, ZIC-pHILIC, Obelisc N, ZICcHILIC a KS-polyMPC. Typickým zástupcem je zwitteriontová stacionární fáze obsahující sulfobetainovou skupinu, tedy 3-sulfopropyldimethylalkyl-ammoniovou funkční skupinou (Obr.2c). Tato funkční skupina může být navázána na silikagelovém základě, komerční označení těchto kolon je ZIC-HILIC, nebo na polymerním základu, kolony jsou komerčně dostupné pod označením ZIC-pHILIC. Je důležité zdůraznit, že negativní náboj sulfonové kyseliny na periferní části sulfobetainové stacionární fáze může také zahrnovat elektrostatické interakce s nábojem analyzovaných látek. Tím se dosáhne vyšší retence zejména bazických látek, které při nižších hodnotách pH získávají kladný náboj. Tato stacionární fáze byla zpočátku vyvinuta pro separaci aniontových solí a malých iontových sloučenin, ale nakonec našla široké využití v HILIC separaci [7][9]. Podobný jev jako u sulfobetainového typu zwitteriontové stacionární fáze byl zaznamenán u fosfocholinové stacionární fáze. Fosfocholinová stacionární fáze je vyrobena navázaním fosforylcholinových skupin na povrchu polymeru. Fosfocholinové stacionární fáze jsou dostupné jako kolony např. ZIC-cHILIC nebo KS-polyMPC. Hlavním rozdílem mezi sulfobetainovou a fosfocholinovou stacionární fází je, že na konci sulfobetainové fáze má na distálním konci negativně nabitou sulfonovou skupinu, zatím co fosfocholinová fáze má na distálním konci pozitivně nabitý kvartérní dusík. Stacionárna fáze Obelisc N (SIELC) je dalším typem zwitteriontových stacionárních fází, který byl použit v HILIC módu, ale chemickou povahu pozitivně a negativně nabitých skupin výrobce nezveřejnil [7][9].
3.3. Mobilní fáze používané pro HILIC HILIC mobilní fáze je tvořena malým procentem vodné složky a velkým podílem organického rozpouštědla, tzn. HILIC oblast je v rozpětí 70 - 95 % organické složky. Vodná složka je tvořena malým procentem vody nebo těkavého pufru (pufr nejčastěji tvoří mravenčnan ammoný nebo octan ammoný) pro dosažení požadovaného pH mobilní fáze. Jako organická složka mobilní fáze je zvolen acetonitril, nicméně může být použito jakékoli vodou mísitelné polární organické rozpouštědlo protické (metanol, etanol, isopropanol) nebo aprotické (acetonitril, tetrahydrofuran, dioxan) [6][9][21]. Při HILIC separaci má výběr organického rozpouštědla zásadní vliv na retenci a selektivitu. Je známo, že eluční síla organických rozpouštědel se zvyšuje se zvyšující polaritou rozpouštědla. Dalším faktorem 16
ovlivňujícím eluční sílu je schopnost rozpouštědla podílet se na proton-donor nebo proton– akceptorových interakcích [2][9]. Relativní eluční síla rozpouštědel v HILIC lze shrnout následujícím způsobem [6][9]: MeOH > EtOH > propan-2-ol > tetrahydrofuran > ACN U alkoholů je potřeba jejich větší koncentrace k dosažení stejného stupně retence analytu v porovnání s aprotickým rozpouštědlem. Ve studiích [3][19] porovnávající dvě nejběžnější vodou mísitelná organická rozpouštědla, acetonitril (aprotické rozpouštědlo) a metanol (protické rozpouštědlo) byl sledován vliv eluční síly rozpouštědla na retenci a tvar píku analytů. Na základě výsledku studie byla prokázána vyšší retence při použití acetonitrilu. Při použití acetonitrilu také dosáhneme ostrých a symetrických píků, zatím co při použití MeOH dochází k distorzi píků vlivem nízké retence a separační účinnosti [3][6][9][19]. Nejpoužívanějším organickým rozpouštědlem v HILIC módu je tedy acetonitril, zatím co použití ostatních organických rozpouštědel (například THF, isopropanol, metanol) je využíváno zejména ke změně selektivity systému. Voda se v HILIC módu používá jako nejsilnější eluent a zvýšení podílu v mobilní fázi způsobí snížení retence analyzovaných látek. Nízký podíl vodné složky mobilní fáze je tedy zásadním předpokladem retence v HILIC módu. Důležitým faktorem pro dosažení optimálně vysoké retence a účinnosti separace je snížení obsahu vody v mobilní fázi někdy i pod 5 %, hlavně pro látky s nízkou retencí. Pro vytvoření vodné vrstvy na povrchu stacionární fáze a udržení HILIC mechanismu je nutný minimální obsah vody 2 % [2][9][10]. Dalším důležitým faktorem pro dosažení účinné separace a vhodných tvarů píků je výběr vhodného rozpouštědla vzorku. Rozpouštědlo vzorku musí mít podobné případně stejné složení v porovnání s mobilnou fází. Některé látky se však špatně rozpouštějí v čistě organickém rozpouštědle, případně dochází k jejich srážení. Proto určitý podíl rozpouštědla tvoří protické rozpouštědlo, často voda. Kdyby se vzorek rozpouštěl v rozpouštědle, kde je vysoký obsah vody tak často dochází ke ztrátě účinnosti separace a může dojít taky k distorzi píku. Tyto efekty jsou pak nejvíce pozorovány u analyzovaných látek, které mají nízke hodnoty retence. Akceptovatelný podíl vody může být ještě 50 %, kdy se získávají ještě uspokojivé tvary píků. Je možnost použí také alternativní organická rozpouštědla jako je isopropanol, etanol či metanol, která však jako samotná rozpouštědla nejsou moc vhodná pro rozpouštění vzorků v HILIC, protože způsobují nižší retenci a distorzi píku. Vhodným rozpouštědlem organických látek vzhledem k jeho častému použití v preparativní chromatografii je také dimetylsulfoxid, ale v HILIC módu vykazuje špatné píky analytů, proto není jako rozpouštědlo vhodný [2][9][28]. V případě nutnosti použít jiné složení než MF je možné eliminovat efekt dávkováním objemu analytu. Aby se dosáhlo účinnější separace a lepších tvarů píků v HILIC, tak je důležité dávkování co nejmenších objemů vzorků analytů do systému (jednotky μl). Pokud by se do 17
systému dávkovaly vyšší objemy vzorků, způsobilo by to rozmývání chromatografických píků a snížilo účinnost separace v systému [2]. Kvalita separace analyzovaných látek na chromatografické koloně závisí také od způsobu dávkování analytu. Rychlý nástřik vzorku do systému zvyšuje předpoklad pro dosažení úzkých, ostrých píků. Na dávkování vzorků analytů do systému se používají hlavně automatické dávkovací zařízení pro rychlý a přesný nástřik vzorku [18].
3.3.1. Efekt koncentrace ACN na retenci a selektivitu Vliv % zastoupení ACN v mobilní fázi na retenci analytů je v HILIC chromatografii podobný jako v chromatografii na normální fázi [2][7][9][14]. Retence se snižuje se zvýšující polaritou mobilní fáze, tedy vyšším podílem vody nebo pufru v mobilní fázi. Daný efekt je pozorován pro všechny HILIC stacionární fáze a to i bez ohledu na acidobazické vlastnosti polárních analytů, nicméně míra změny retence analytů je již odlišná v závislosti na druhu stacionární fáze a vlastnostech analytu. Ve většině případů docházelo k největšímu nárastu retence analyzovaných látek od více než 85 % acetonitrilu v mobilní fázi [1][2][14]. Daný efekt byl prokázán v mnoha studiích. Například Guo a kol. ve své studii prokázal daný efekt na čtyřech typech kolon: YMC-PACK NH2, TSKgel Amide-80, ZIC-HILIC a HILIC Silica a 11 analytech (amid kyseliny salicylové, salicylová kyselina, 4-aminosalicylová kyselina, acetylsalicylová kyselina, 3,4-dihydroxyfenyloctová kyselina, uracil, adenosin, cytosin, guanosin, uridin a cytidin). Vyšší retenci vykazovaly hlavně kyselé látky na koloně YMC-PACK NH2, což bylo způsobeno přitažlivými silami mezi opačně nabitou stacionární fází a analyty. Nejvyšší retenci dosahovala kyselina 3,4-dihydroxyfenyloctová [11]. Další studie testující vliv procentuálního zastoupení ACN na retenci fenolických kyselin byla provedena na kolonách Cogent Silica Hydride (silikagel), Cogent Bidentate (C18), Cogent UDC (cholesterolová sk.), Cogent Diamond Hydride (Si-OH a Si-H skupiny). Obecně zde byla zaznamenána zvyšující se retence analytů při zvyšování podílu organické fáze [17]. Jiná rozsáhlejší studie věnující se porovnání několika HILIC stacionárních fází, které zahrnují několik různých amidových a nemodifikovaných silikagelových kolon potvrdila také vzrůstající retenci 29 testovaných analtů při zvyšující se procentuálním zastoupení ACN a to zejména v rozsahu 85 – 95 %. Byly zde použity kolony: ZIC-HILIC (sulfobetain), Atlantis (silikagel), Luna HILIC (diol), TSK Amide-80 (amid) [1]. Stejné výsledky jako v předchozí studii byly potvrzeny při testování kolony ZIC-HILIC s použitím těchto analytů: thymin, uracil, adenin, guanin a cytosin [19].
18
3.3.2. Efekt pH pufru na retenci a selektivitu Hodnota pH pufru má významný vliv na selektivitu a retenci analytů, protože ovlivňuje nejen míru ionizace analyzovaných látek, ale také míru ionizace funkčních skupin stacionární fáze. Výběr optimálního pH mobilní fáze závisí hlavně na fyzikálně-chemických vlastnostech analytů a použitém typu stacionární fáze [1][11]. Vyšší vliv pH mobilní fáze je pozorován pro nabité stacionární fáze, kdy dochází k ionizaci funkčních skupin. Jestliže analyt získá opačný náboj než stacionární faze, dochází ke zvýšení retence, při stejném náboji analytu a stacionární fáze dochází naopak ke snížení retence, někdy až eluci analytu s mrtvým objemem. V případě užití neutrálních stacionárních fází je olivněna pouze ionizace analytů, která zvýší polaritu analytů a následně zvýší jejich retenci [2]. Výše popsaný efekt hodnoty pH na retenci analytů byl potvrzen v mnoha studiích při použití různých analyzovaných látek a chromatografických podmínek, napřiklad studie Guo a kol. testující vliv pH pufru 10 mM mravenčanu ammoného na retenci 4 analytů: kyseliny acetylsalicylové, kyseliny salicylové, cytosinu a cytidinu, při použití kolon TSKgel Amide-80, ZIC-HILIC a HILIC Silica. Byla zaznamenána stoupající retence kyseliny acetylsalicylové na všech kolonách při rostoucím pH. Na koloně TSKgel Amide-80 při rostoucí hodnotě pH retence cytosinu a cytidinu mírně klesala, zatím co u kyseliny salicylové nebyla zaznamenána změna retence. U kolony YMCPack-NH2 nebyla zaznamenána změna retence cytidinu, zatímco u ostatních analytů měla retence vzrůstající charakter při zvyšující se hodnotě pH. Na této koloně měl cytosin největší vzrůst retence v porovnaní s ostatními analyty a kolonami. U kolon HILIC Silica a ZIC-HILIC studie nezaznamenala změnu retence u cytosinu a kyseliny salicylové, a u cytidinu se retence jen nepartně zvýšila při zvyšující se hodnotě pH [11]. V další studii byla sledována změna retence analytů, nortriptylinu, difenhydraminu, benzylaminu a prokainamidu, při použití kolony Atlantis silica HILIC a 100 mM mravenčanu ammoného při pH 3 a 4,5 a byl zaznamenán patrný vzrůst retence daných analytů [15].
3.3.3. Efekt koncentrace pufru na retenci a selektivitu Koncentrace pufru má obecně také vliv na retenci analytů, nicméně je odlišný v závislosti na použité koloně a acidobazických vlastnostech analytu. Rostoucí koncentrace pufru má za následek zvětšení tloušťky vodné vrstvy. Tím dochází ke stínění iontových interakcí. Mezi kyselými analyty a negativně nabitou stacionární fází tak dojde ke zvýšení jejich retence, zatím co u bazických látek vede ke snížení jejich retence stíněním přitažlivých iontových interakcí [1]. U některých neutrálních látek může také dojít k patrnému vzrůstu retence se zvyšující se koncentrací pufru. Několik studií [1][11] se zabývalo vlivem koncentrace pufru na retenci analytů. 19
Studie testující vliv koncentrace pufru na retenci 29 analytů pro kolony ZIC-HILIC, Atlantis, LUNA Hilic, TSK Amide-80, XBridge BEH Amide, Acclaim-mixed mode HILIC-1 potvrdila, že při zvyšující se koncentraci pufru (pH = 3,0) dochází k poklesu retence bazických analytů a kvartérních solí na všech použitých kolonách. Naopak bylo zaznamenáno, že vzrůst koncentrace pufru vedl k vzrůstu retence kyselých analytů. Patrný efekt vzrůstu retence při zvyšující koncentraci pufru byl zaznamenán také u některých neutrálních analytů [1]. Další studie zkoumala závislost retence analytů kyseliny acetylsalicylové, kyseliny salicylové a cytosinu při zvyšující se koncentraci pufru octanu ammoného v rozsahu 5 mM – 20 mM na kolonách TSKgel Amide-80, HILIC Silica a ZIC-HILIC. Byl zde zaznamenán patrný vzrůst retence látek při zvyšující se koncentraci pufru. Při zvýšení koncentrace pufru byl však zaznamenán výrazný pokles retence kyseliny salicylové a kyseliny acetylsalicylové při použití kolony YMCPack-NH2, které bylo způsobeno stíněním iontových přitažlivých sil, zatím co retence cytosinu se na dané koloně zvýšila jen o patrnou hodnotu [11].
3.4. Výhody a nevýhody HILIC HILIC mód představuje vhodnou alternativu pro stanovení širokého spektra polárních látek, jako například peptidy, aminokyseliny, sacharidy a mnoho dalších biologicky významných sloučenin a nahrazuje problematiké stanovení pomocí NPLC a RPLC. Protože HILIC chromatografie využívá stacionární fázi typickou pro NPLC a mobilní fázi užívanou pro RPLC, odstranila většinu problémů spojených s analýzou polárních látek, jako například špatnou rozpustnost analytů, špatnou reprodukovatelnost a nízkou retenci [3][12]. Problémy spojené se špatnou reprodukovatelností výsledků a dlouhým časem ekvilibrace spojené s analýzou pomocí NPLC byly také odstraněny v případě využití HILIC chromatografie, kdy po dostatečné ekvilibraci (cca 20 min) nutné k ustálení vodné vrstvy na povrchu stacionární fáze, jsou získány výsledky s dostatečnou reprodukovatelností a zároveň životnost HILIC kolon je také mnohem vyšší. Další výhodou je nízká viskozita HILIC mobilní fáze obsahující vysoký podíl organického rozpouštědla, což umožňuje provést separaci při nižším tlaku než při použití RPLC. Praktický význam toto získalo zejména pro UHPLC HILIC kolony, které je možné použít i na klasickém HPLC systému anebo v pípadě použití vyšších průtoků, které vedou ke zkrácení času analýzy [3]. HILIC stacionární fáze představuje také vhodnou stacionární fázi pro využití v 2D (dvourozměrné) chromatografii a to zejména v kombinaci s RPLC. Tyto dvě chromatografické dimenze se vzhledem ke své naprosto opačné selektivitě vhodně doplňují a umožňují separaci komplexních vzorků, které nelze separovat v klasickém 1D módu [6][9]. Další výhodou je také kompatibilita HILIC mobilní fáze s elučním činidlem získaným při přečištění vzorku. Jelikož eluční roztok získaný při extrakci na tuhou fázi či supernatant po proteinové precipitaci velmi často obsahuje vysoké procento ACN je možné při využití HILIC chromatografie vynechat krok odpaření a rozpuštění vzorku, čímž se velmi výrazně sníží 20
časová náročnost přípravy vzorků [23]. Nadruhou stranu HILIC mechanismus na rozdíl od RP dosud nebyl plně objasněn a proto v HILIC chromatografii je obtížnější předvídání separační účinnosti a selektivity při určitých chromatografických podmínkách. HILIC chromatografie, také v porovnání s RPLC používá velký objem organických rozpouštědel, což je z ekologického hlediska nevhodné [3].
3.5. Použité analyty a jejich vlastnosti Pro studium HILIC separačního mechanismu v této práci bylo vybráno a použito celkem 35 analytů. Zastoupené látky zahrnovaly jak kyselé, bazické tak neutrální látky. Jednalo se většinou o látky nízké molekulární hmotnosti polárního charakteru. Vybíralo se z látek vhodných pro HILIC. Dané látky, jejich triviální název, chemický název, molekulová hmotnost, fyzikálně-chemické vlastnosti (pKa a log P) jsou uvedeny v Tab. 1.
Triviální název atenolol
Chemický název 2-{4-[(2RS)-2-hydroxy-3-(isopropylamino)propoxy]fenyl}- acetamid (RS)-1-(isopropylamino)-3-[4-(2methoxyethyl)fenoxy]propan-2-ol 1-(1H-indol-4yl)oxy-3-(isopropylamino)propan-2-ol N-{3-acetyl-4-[2-hydroxy-3-(propan-2ylamino)propoxy]fenyl}butanamid 1-(isopropylamino)-3-(naftalen-1yloxy)propan-2-ol 3-[(4-amino-2-methyl-5-pyrimidinyl)methyl]-5-(2-hydroxyethyl)-4methylthiazolinium chlorid pyrimidin-2,4(1H,3H)-dion
Mw 266,34
244,20
thymin
3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pirimidin-2,4-dion 4-amino-1-[3,4-dihydroxy-5(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidin-2-on 5-methylpyrimidin-2,4-dion
cytosin
4-amino-1H-pyrimidin-2-on
111,10
guanin
2-amino-1H-purin-6(9H)-on
151,13
adenin
6-aminopurin
135,13
metoprolol pindolol acebutolol propranolol thiamin
uracil uridin cytidin
21
267,36 248,32 336,43 259,34 337,28
112,09
243,22 126,11
pKa 13,88 9,43 13,89 9,43 13,94 9,54 13,78 9,40 13,84 9,50 neuveden
log P 0,34
8,95 -4,19 9,39
-1,04
13,48 4,26 9,24 -4,15 9,00 4,18 9,63 3,40 9,42
-1,81
1,63 1,68 1,77 2,90 neuveden
-1,58
-0,62 -1,96 -0,96 -2,13
guanosin
283,24
kreatinin
2-amino-9-[3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3H-purin-6-on 2-(6-amino-9H-purin-9-yl)-5(hydroxymethyl)oxolan-3,4-diol 4,5-bis(hydroxymethyl)-2-methylpyridin-3-ol 2-amino-1-methylimidazol-4-on
-1,47
113,12
13,24 3,12 13,11 3,82 9,63 5,01 6,89
tyrosol
4-(2-hydroxyethyl)fenol
138,16
10,17
0,85
nikotinamid
pyridin-3-karboxamid
122,12
-0,37
kofein
1,3,7-trimethylxanthin
194,19
14,83 3,54 0,52
paracetamol
N-(4-hydroxyfenyl)acetamid
151,16
0,48
theofylin
1,3-dimethylxanthin
180,16
p-anisová kys.
4-methoxybenzoová kyselina
152,15
9,86 1,72 8,60 1,64 4,47
2,3-dihydroxybenzoová kys. p-hydroxybenzoová kys. gentisová kys.
2,3-dihydroxybenzoová kyselina
154,12
2,96
1,62
4-hydroxybenzoová kyselina
138,12
4,57
1,40
2,5-dihydroxybenzoová kyselina
154,12
3,01
1,39
salicylová kys.
2-hydroxybenzoová kyselina
138,12
3,01
2,01
vanilová kys.
4-hydroxy-3-methoxybenzoová kyselina
168,15
4,45
1,30
ferulová kys.
3-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)-prop-2énová kyselina 3-(3,4-dihydroxyfenyl)-prop-2-énová kyselina 3-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyfenyl)-prop2-énová kyselina 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoová kyselina (5R)-[(1S)-1,2-dihydroxyethyl]-3,4dihydroxyfuran-2(5H)-on 3,4,5-trihydroxycyklohex-1-en-1karboxylová kyselina 3,4,5-trihydroxybenzoová kyselina
194,18
4,58
0,96
180,16
4,58
0,66
224,21
4,53
1,00
198,17
4,33
1,28
176,12
4,09
-2,78
174,15
4,48
-2,22
170,12
4,33
0,53
adenosin pyridoxin
kávová kys. sinapová kys. syringová kys. L-askorbová kys. šikimová kys. gallová kys.
267,24 169,18
Tab. 1: Fyzikálně-chemické vlastnosti testovaných analytů [22]
22
-0,76 -0,83 -0,80
-0,63
-0,28 1,78
Atenolol, metoprolol a acebutolol patří do skupiny nejčastěji používaných kardioselektivních betablokátorů a jsou používány v léčbě ischemické choroby srdeční a poruch srdečního rytmu [8]. Pindolol a propranolol jsou neselektivní betablokátory. Propranolol má ISA (vnitřní sympatomimetickou aktivitu, zatím co pindolol danou aktivitu nemá [5] Cytosin, guanin, adenin, thymin a uracil jsou nukleové baze, které jsou součástí nukleových kyselin (DNA i RNA). Cytosin, thymin a uracil jsou pyrimidinové baze, zatím co adenin a guanin jsou purinové baze. Thymin je methylovaný uracil a vyskytuje se jen v DNA, zatím co uracil jen v RNA. Adenin tvoří v nukleových kyselinách komplementární pár s thyminem v DNA a s uracilem v RNA. Cytosin a guanin tvoří vzájemně komplementární pár v nukleových kyselinách, kde se vážou třemi vodíkovými můstky. Adenosin, guanosin, cytidin a uridin jsou nukleosidy. Adenosin a guanosin jsou složené z purinové baze a cukru ribózy, které jsou spojeny N-glykosidickou vazbou, zatím co cytidin a uridin mají pyrimidinovou bazi. Jsou přítomný v každé buňce lidského těla. Pyridoxin neboli vitamin B6 je vitamin rozpustný ve vodě. Pomáhá vytvořit tělu několik neurotransmiterů, což jsou chemické látky zabezpečující přenos informace z jedné nervové buňky do další. Je potřebný pro normální vývoj a funkci mozku a podílí se na tvorbědalších látek jako serotonin, noradrenalin a melatonin. Dalším vitaminem rozpustným ve vodě je thiamin neboli vitamin B1, který má příznivé působení na nervový systém, hlavně proti únavě. Kreatinin je vedlejším produktem svalového energetického metabolismu. Jeho koncentrace v krvi se používá pro diagnostiku funkce ledvin a clearance kreatininu pro posouzení glomerulární filtrace. p-Anisová kyselina je přirozeně se vyskytující látka v anýzu. Jedná se o bílou krystalickou látku rozpustnou ve vodě, alkoholu étheru a ethyl-acetátu. Má antiseptické vlastnosti a používá se jako konzervační látka v kosmetice. Gentisová kyselina a 2,5-dihydroxybenzoová kyselina jsou látky chemicky blízké kyselině salicylové. Sodnou sůl kyseliny gentisové lze použít jako analgetikum, antipyretikum a antirevmatikum. Tyrosol je fenolická látka obsažena v olivovém oleji, která podporuje zdraví buněk a působí jako antioxidant v krevním oběhu. Nikotinamid je amid kyseliny nikotinové. Je známý jako niacin (vitamin B3, vitamin PP). Je to vitamin rozpustný ve vodě esenciální pro lidský organismus. Je potřebný při tvorbě energie
23
v buňkách a je důležitý při srdeční, nervové a svalové činnosti, při udržování zdravé kůže a pro správnou funkci trávicího traktu. Kofein je alkaloid, který příznivě stimuluje centrální nervovou soustavu a srdeční činnost. Nachází se v mnoha nápojích a někdy i potravinách, proto se považuje za jeden z nejrozšířenějších stimulantů. Paracetamol (4-acetamidofenol) je nejčastěji používané antipyretikum a analgetikum. Salicylová kyselina (o-hydroxybenzoová kyselina) je výchozí látkou kyseliny acetylsalicylové. V kožním lékařství se využívá jejího působení na kůži, buď v malých koncentracích pro keratoplastický efekt (tzn. podpora epitelu kůže pro růst), nebo ve vyšších koncentracích pro keratolytický účinek. Theofylin je alkaloid obsažený v listech čaje, svým chemickým složením i účinky podobný kofeinu. Léčebně se využívá bronchodilatačního účinku. Gallová kyselina je organická kyselina přítomna ve většině rostlin, jako jsou hrozny, chmel nebo dubová kůra. Působí jako antioxidant, má dobré antifungální a antivirové vlastnosti. Vanilová kyselina je oxidovaná forma vanilinu a je meziproduktem při výrobě kyseliny ferulové, která je antioxidant a chrání buňky před poškozením UV zářením. Je často přidávaná jako složka doplňků proti stárnutí. Kávová kyselina je látka obsažena v mnoha rostlinách. Káva je primárním zdrojem kávové kyseliny, ale také víno obsahuje její značné množství. Používá se v doplňcích stravy určených k povzbuzení fyzického výkonu. Sinapová kyselina je fenolická látka obsažena v řepkovém oleji. Je odvozena od sinapinu, což je její cholinester. Má významné antioxidační vlastnosti [25]. Syringová kyselina inhibuje aktivitu alfa-glukosidázy, čím se sníží štěpení cukrů z přijímané potravy a tím pak absorpce cukrů v gastrointestinálním traktu do krve. Kyselina L-askorbová (vitamín C) je jeden ze základních antioxidantů. Podílí se na tvorbě kolagenu a při dalších metabolických pochodech organismu. Šikimová kyselina vzniká při metabolismu cukrů. Je meziproduktem pro syntézu aromatických aminokyselin (fenylalanin, tyrosin a tryptofan) a dalších sekundárních metabolitů mikroorganismů [29]. p-Hydroxybenzoová kyselina slouží ve formě esterů (tzn. parabeny) jako konzervační látka, nejčastěji ve směsi methyl a propylparabenu [16].
24
4. Experimentální část
4.1. Použité chemikálie
Použity byly následující standardy: atenolol (99 %), metoprolol (≥ 98 %), pyridoxin (≥ 98 %), kreatinin (≥ 98 %), cytosin (≥ 99 %), adenin (≥ 99,0 %), p-anisová kyselina (≥ 99 %), 2,3-dihydroxybenzoová kyselina (99 %), phydroxybenzoová kyselina (≥ 99 %), gentisová kyselina (≥ 98 %), tyrosol (98 %), nikotinamid (≥ 99,5 %), kofein (analytical standard), paracetamol (analytical standard), salicylová kyselina (≥ 99 %), theofylin (≥ 99 %), gallová kyselina (≥ 99 %), vanilová kyselina (≥ 97 %), ferulová kyselina (≥ 99,0 %), kávová kyselina (≥ 98 %), sinapová kyselina (≥ 98 %), syringová kyselina (≥ 95 %), askorbová kyselina (99 %), šikimová kyselina (≥ 99 %), uracil (≥ 99,0 %), adenosin (≥ 99 %), guanin (98 %), guanosin (≥ 97,0 %), cytidin (≥ 99 %), uridin (≥ 99 %), pindolol (≥ 98 %), acebutolol (analytical standard), thiamin (≥ 99 %), propranolol (≥ 99 %), Thymin (≥ 99 %) Standardy byly zakoupeny od firmy Sigma-Aldrich, ČR. Chemikálie: - Acetonitrile CHROMASOLV Plus, for HPLC (≥ 99.9 %) (Sigma-Aldrich, ČR) - Hydroxid amonný (≥ 25 %) (Sigma-Aldrich, ČR) - Kyselina octová (99,7 %) (Sigma-Aldrich, ČR) - Ultračistá voda Millipore MilliORG (Millipore Corp., USA)
4.2. Použitá kolona Pro experimentální část byla použita kolona Zorbax HILIC plus (2,1 x 100 mm, 3,5 μm) (Agilent Technologies, UK).
4.3. Příprava zásobních roztoků Zásobní roztoky většiny analytů byly připravovány rozpuštěním 5 mg látky v 5 ml ACN. Výjimkou byly pouze askorbová kyselina, kreatinin, šikimová kyselina, thiamin, všechny nukleové baze a nukleosidy, které byly připravovány rozpuštěním 5 mg standardu v 5 ml směsi ACN a vody (50 : 50). Všechny zásobní roztoky byly připraveny o koncentraci 1 mg/ml. Pyridoxin se připravoval rozpuštěním 5 mg látky v 5 ml vody. Naprosto odlišný způsob 25
přípravy byl zvolen u guaninu. 0,5 mg guaninu bylo rozpuštěno v 5 ml vody s přídavkem 100 μl hydroxidu ammoného. Všechny zásobní roztoky byly uchovávány v lednici.
4.4. Příprava pracovních roztoků pro experiment Pracovní roztoky byly připravovány ředěním zásobních roztoků vždy v den potřeby. Byly použity pracovní roztoky o koncentraci 10 μg/l. Výjimkou byly pouze roztoky atenololu, metoprololu, pyridoxinu, kreatininu, askorbové kyseliny, které byly použity v koncentraci 100 μg/l a roztok p-anisové kyseliny v koncentraci 1 μg/l. - Příprava pracovních roztoků: K 100 μl zásobního roztoku bylo přidáno 900 μl ředící směsi, která se skládala z různých poměrů acetonitrilu a vody. Poměr roztoku ACN/voda byl volen na základě použité mobilní fáze. Byly použity ředící směsi v poměrech (ACN : voda): 90 : 10 ; 70 : 30 ; 50 : 50 ; 30 : 70 ; 10 : 90 Další koncentrace byly připraveny postupným ředěním stejnou ředící směsí.
4.5. Příprava vodných složek mobilní fáze - 50 mM roztok octanu amonného o pH = 3,8 byl připravován napipetováním 713 μl koncentrované kyseliny octové do kádinky obsahující přibližně 400 ml vody. Za stálého míchání byl pipetou po kapkách přidáván vodný roztok amoniaku až do dosažení požadovaného pH = 3,8. Následně byl roztok kvantitativně převeden do 500 ml odměrné baňky a doplněn vodou po rysku. - 50 mM roztok octanu amonného o pH = 4,8 byl připravován napipetováním 713 μl koncentrované kyseliny octové do kádinky obsahující přibližně 400 ml vody. Za stálého míchání byl pipetou po kapkách přidáván vodný roztok amoniaku až do dosažení požadovaného pH = 4,8. Následně byl roztok kvantitativně převeden do odměrné baňky o velikosti 500 ml a doplněn vodou po rysku. - 50 mM roztok octanu amonného o pH = 6,8 byl připravován napipetováním 713 μl koncentrované kyseliny octové do kádinky obsahující přibližně 400 ml vody. Za stálého míchání byl pipetou po kapkách přidáván vodný roztok amoniaku až do dosažení požadovaného pH = 6,8. Následně byl roztok kvantitativně převeden do odměrné baňky o velikosti 500 ml a doplněn vodou po rysku. 26
- 5 mM roztok octanu amonného o pH = 4,8 byl připravován ředěním připraveného 50 mM roztoku octanu amonného. Odměřilo se 50 ml octanu amonného (50 mM) a následně byl tento roztok kvantitativně převeden do odměrné baňky o velikosti 500 ml a doplněn vodou po rysku. - 0,5 mM roztok octanu amonného o pH = 4,8 byl připravován ředěním připraveného 50 mM roztoku octanu amonného. Napipetovalo se 5000 μl octanu amonného (50 mM) do odměrné baňky o velikosti 500 m a následně byl tento roztok doplněn vodou po rysku. - 200 mM roztok octanu amonného o pH = 4,8 byl připravován napipetováním 2852 μl koncentrované kyseliny octové do kádinky obsahující přibližně 400 ml vody. Za stálého míchání byl pipetou po kapkách přidáván vodný roztok amoniaku až do dosažení požadovaného pH = 4,8. Následně byl roztok kvantitativně převeden do odměrné baňky o velikosti 500 ml a doplněn vodou po rysku.
4.6. Přístrojové vybavení - HPLC systém (Shimadzu Corp., Japonsko): Shimadzu LC-20 AD (čerpadlo) Shimadzu DGU-14 ALVP (degasér) Shimadzu SIL-MTA (autosampler) Shimadzu CTO-10 ACVP (termostat) Shimadzu SPAD-M10 AVP (DAD detektor) - Laboratorní pH metr Hanna (Fisher Scientific, ČR) - Automatické pipety se špičkami Biohit (Fisher Scientific, ČR) - Vakuová pumpa a filtrační zařízení Millipore (Millipore Corp., USA) - Analytické váhy Sartorius 2004 MP (Sartorius, Německo)
4.7. Vlastní měření Měření probíhalo za isokratické eluce při průtoku 0,7 ml/min. Teplota na koloně byla udržována na 20 °C. Nástřik vzorku byl 2 μl. Detekce analytu byla provedena pomocí PDA detektoru při vlnové délce 254 nm.
27
4.8. Schéma experimentu - Kolona Zorbax HILIC plus (Agilent technologies, UK) - HPLC systém (Shimadzu Corp., Japonsko) - Testované analyty: atenolol, metoprolol, pyridoxin, kreatinin, cytosin, adenin, p-anisová kyselina, 2,3dihydroxybenzoová kyselina, p-hydroxybenzoová kyselina, gentisová kyselina, tyrosol, nikotinamid, kofein, paracetamol, salicylová kyselina, theofylin, gallová kyselina, vanilová kyselina, ferulová kyselina, kávová kyselina, sinapová kyselina, syringová kyselina, askorbová kyselina, šikimová kyselina, uracil, adenosin, guanin, guanosin, cytidin, uridin, pindolol, acebutolol, thiamin, propranolol, thymin. - Mobliná fáze: 50 mM AmAc pH = 3,8 50 mM AmAc pH = 4,8 50 mM AmAc pH = 6,8 0,5 mM AmAc pH = 4,8 5 mM AmAc pH = 4,8 200 mM AmAc pH = 4,8
28
5. Výsledky a diskuze
5.1. Závislost retence analytů na koncentraci ACN v mobilní fázi
Retence analytů byla hodnocena graficky pro vybrané zástupce z každé skupiny látek. Jako vodná složka mobilní fáze byl použit 50 mM octan ammoný pH 4,8. Vliv koncentrace ACN v mobilní fázi byl hodnocen na základě lin-lin závislosti k´= f (% ACN) a na Obr.3 je znázorněn graf pro vybranou skupinu analytů. 120 atenolol propranolol
100
cytosin adenin
80
k´
pyridoxin nikotinamid
60
theophylin gentisová kys.
40
vanilová kys. 20
šikimová kys.
0 50
55
60
65
70
75 % ACN
80
85
90
95
100
Obr.3 : Vliv koncentrace ACN na retenční faktor vybraných analytů. Z Obr.3 je patrné, že v oblasti 50 % až 70 % ACN nedocházelo ke zvýšení retence analyzovaných látek. Nicméně v oblasti od 70 % ACN docházelo již k vzestupu retence jednotlivých analytů, vyjimkou jsou pouze kyselé analyty a theophylin, jejichž retence se vzrůstacící koncentrací ACN rostla jen velmi nepatrně. K výraznému vzestupu retence všech analyzovaných látek docházelo až při koncentraci ACN v rozmezí 85 – 95 %. Nejvíce se na použité koloně zadržovaly bazické látky, což je způsobeno disociací bazických látek při pH 4,8. Bazické analyty jsou za těchto podmíněk kladně nabité a vlivem negativního náboje silanolové skupiny dochází k vyššímu nárastu jejich retence. Na rozdíl od ostatních kyselých látek, vysoká retence byla pozorovatelná také u kyseliny šikimové, což koresponduje s její velmi nízkou hodnotou log P a tedy vysokou hydrofilicitou. 29
a)
b) 120
9 atenolol
7
propranolol 80
adenin
6 5
60
k´
k´
cytosin
8
100
4
40
3 2
20
1
0
0 70
75
80
85
90
95
100
70
75
80
% ACN
85
90
95
100
85 90 % ACN
95
100
% ACN
c)
d) 3,0
50
gentisová kys.
pyridoxin nikotinamid 2,0
vanilová kys.
40
šikimová kys.
theophylin k´
k´
30 20 1,0 10 0,0
0 70
75
80
85 90 % ACN
95
100
70
75
80
Obr.4 : Závislost retenčního faktoru na koncentraci ACN v mobilní fázi u vybraných skupin zástupců: a) bazické látky, b) nukleosidy a nukleové baze, c) neutrální látky, d) kyselé látky Při pozorování vlivu hodnoty log P u bazických analytů je z Obr.4a patrné, že u atenololu (log P = 0,335) je retenční faktor výrazně vyšší než u propranololu (log P = 2,900). Atenolol je díky své hydrofilicitě více zadržován ve vodné vrstvě na povrchu stacionární fáze, čímž pak dochází k jeho pozdější eluci, zatímco propranolol snadněji přechází do organické organické fáze. U nukleových bazí je pozorována vyšší hodnota retenčního faktoru pro cytosin než adenin (viz Obr.4b). Pro neutrální a kyselé látky byl pozorován stejný vliv 30
rozdělovacího koeficientu na retenční faktor analytů jako u bazických látek. pyridoxinu je tedy vyšší na rozdíl od nikotinamidu a theofylinu (viz Obr.4c).
Retence
Kyselé analyty jsou na rozdíl od ostatních analytů výrazně méně zadržovány, s výjimkou kyseliny šikimové, která má výrazně nižší rozdělovací koeficient (viz Obr.3). Nízká retence kyselých analytů je způsobena hodnotou rozdělovacího koeficientu, kdy většina se dostáva více do organické fáze. Kyselé látky jsou při daném pH jen částečně disociovány, a proto iontové interakce mají patrný vliv na nižší retenci kyselých analytů. Kyselina šikimová má však výrazně vyšší retenci oproti ostatním kyselým analytům (viz Obr.4d).
5.2. Závislosti retence analytů na koncentraci pufru octanu ammoného v mobilní fázi Pro hodnocení retence testovaných analytů v závislosti na koncentraci pufru byly sestrojeny křivky k´= f (c pufru) pro všechny analyzované látky. Jako mobilní fáze byla použita směs ACN/octan amonný pH 4,8 v poměru 90/10 a byly testovány koncentrace pufru 0,5 mM, 5 mM, 50 mM a 200 mM.
180
150 atenolol metoprolol
120
k´
pindolol acebutolol
90
propranolol 60
30
0 0,5
5
50
koncentrace pufru AmAc [mM]
Obr.5 : Vliv koncentrace pufru na retenci bazických analytů. 31
200
Výrazný vliv koncentrace pufru na retenci analytu byl pozorován pro bazické analyty, které vykazují v porovnání s kyselými látkami opačný efekt. S rostoucí koncentrací pufru dochází ke snížení retence bazických látek, viz Obr.5. Nejvyšší vliv koncentrace pufru byl pozorován pro atenolol v porovnání s ostatními bazickými látkami a pro metoprolol, jehož retenční čas při koncentraci pufru 0,5 mM nebyl z důvodu velmi silné retence zaznamenán. Thiamin byl velmi silně zadržován na koloně již při koncentracích pufru 200 mM (k´= 53,397), a proto nebylo možné zaznamenat ostatní hodnoty retenčního času odpovídající koncentracím 0,5 mM, 5 mM a 50 mM.
4,0
uracil adenin cytidin
cytosin adenosin uridin
guanin guanosin thymin
k´
3,0
2,0
1,0
0,0 0,5
5
50
200
koncentrace AmAc [mM]
Obr.6 : Vliv koncentrace pufru na retenci analytů nukleosidů a nukleových bazí. Z Obr.6 je patrné, že vliv koncentrace pufru je odlišný pro jednotlivé nukleosidy a nukleové baze. U analytů odvozených od pyrimidinu je pozorována vyšší retence cytosinu a cytidinu oproti uracilu, uridinu a thyminu. Zvyšování retence cytidinu je výraznější než u cytosinu. Je možné, že tento efekt je pravděpodobně způsoben přítomností cukerné složky u nukleosidového analytu cytidinu. Tento efekt není pozorovatelný u analytů uracilu a uridinu, což může být způsobeno jejich nízkou retencí a daný jev se neprojevil. U analytů odvozených od purinu je pozorovatelné postupné zvyšování retence guanosinu a guaninu, zatímco retence adeninu a adenosinu se neměnila v závislosti na rostoucí koncentraci pufru. U guanosinu je větší zvyšování retence v porovnání s guaninem, což může být taky způsobeno přítomností cukerné složky. U adenosinu v porovnání s adeninem tento jev není pozorován, čož je pravděpodobně způsobeno nízkou hodnotou retence. 32
25
20
2,3-dihydroxybenzoová kys.
gentisová kys.
salicylová kys.
kávová kys.
syringová kys.
askorbová kys.
šikimová kys.
k´
15
p-anisová kys.
10
5
0 0,5
5
50
200
koncentrace pufru AmAc [mM] 2,0
1,5
p-anisová kys.
2,3-dihydroxybenzoová kys.
gentisová kys.
salicylová kys.
kávová kys.
syringová kys.
k´
1,0
0,5
0,0
-0,5 0,5
5
50
200
koncentrace pufru AmAc [mM]
Obr.7: a) vliv koncentrace pufru na retenci kyselých analytů, b) vliv koncentrace pufru na retenci kyselých analytů – přiblížení (vynechání k. askorbové a šikimové) Jak už bylo zmíněno výše, celková retence kyselých látek je nízká s vyjimkou kyseliny šikimové a askorbové. Na základě výsledků bylo ověřeno, že se zvyšující koncentrací pufru docházelo ke zvýšení retence kyselých látek, kdy při koncentraci pufru 0,5 mM většina kyselých látek byla eluována s mrtvým objemem, viz Obr.7. Vysoká koncentrace pufru pravděpodobně potlačí elektrostatickou repulzaci mezi negativně nabitou kyselinou 33
a negativně nabitou stacionární fází. Z grafu na Obr.7b je patrné, že kyselina gentisová, salicylová a 2,3-dihydroxybenzoová nebyly na koloně zadržovány v celém rozsahu koncentrace pufru (0,5 – 200 mM). Vyšší retence kyseliny šikimové a kyseliny askorbové je zřejmě způsobena jejich nízkými hodnotami rozdělovacího koeficienu, tedy značnou hydrofilicitou. Z důvodu velkého počtu testovaných kyselin, některé kyselé analyty nebyly v Obr.7 zahrnuty (kyselina p-hydroxybenzoová, gallová, vanilová, ferulová a sinapová), nicméně průběh křivek odpovídá hodnotám mezi křivkami pro kyselinu p-anisovou a syringovou.
5,0
pyridoxin
kreatinin
tyrosol
kofein
paracetamol
teofylin
nikotinamid
4,0
k´
3,0
2,0
1,0
0,0 0,5
5
50
200
koncentrace pufru AmAc [mM]
Obr.8 : Vliv koncentrace pufru na retenci neutrálních analytů. Na Obr.8 je vidět, že změna koncentrace pufru neměla výrazný vliv na změnu retence neutrálních látek. Retence kreatininu a pyridoxinu je vyšší oproti ostatním neutrálním analytům, nicméně vliv koncentrace pufru také není patrný.
5.3. Závislost retence analytů na rostoucí hodnotě pH pufru octanu ammoného Pro hodnocení retence byly sestrojeny křivky závislosti retenčního faktoru na pH pufru 34
mobilní fáze k´= f (pH pufru) pro všechny analyzované látky. Jako mobilní fáze byla použita směs ACN/50 mM octan ammoný v poměru 90/10 a bylo testováno pH pufru 3,8, 4,8 a 6,8.
18
15
p-anisová kys.
2,3-dihydroxybenzoová kys.
gentisová kys.
salicylová kys.
kávová kys.
syringová kys.
askorbová kys.
šikimová kys.
k´
12
9
6
3
0 3,8 2,5
2,0
4,8
pH
5,8
p-anisová kys.
2,3-dihydroxybenzoová kys.
gentisová kys.
salicylová kys.
kávová kys.
syringová kys.
6,8
k´
1,5
1,0
0,5
0,0
-0,5 3,8
4,8
pH
5,8
6,8
Obr.9: a) vliv pH pufru na retenci kyselých analytů, b) vliv pH pufru na retenci kyselých analytů – přiblížení (vynechání k. askorbové a šikimové) Na základě výsledků bylo potvrzeno, že většina kyselých látek vykazuje zvyšující retenci v závislosti na rostoucí hodnotě pH (viz Obr.9). Některé kyseliny, jako například 35
kyselina gentisová, salicylová a 2,3-dihydroxybenzoová byly velmi slabě zadržovány v celém testovaném rozsahu pH (3,8 - 6,8). Z důvodu velkého počtu testovaných kyselin, některé nebyly v Obr.9 zahrnuty (kyselina p-hydroxybenzoová, gallová, vanilová, ferulová a sinapová), nicméně průběh křivek odpovídá hodnotám mezi křivkami pro kyselinu p-anisovou a syringovou.
3,5 3,0
uracil
cytosin
guanin
adenin
guanosin
cytidin
uridin
thymin
adenosin
2,5
k´
2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 3,8
4,8
pH
5,8
6,8
Obr.10 : Vliv pH pufru octanu ammoného na retenci analytů nukleosidů a nukleových bazí.
4,5
pyridoxin nikotinamid theofylin
4,0
kreatinin kofein
tyrosol paracetamol
3,5 3,0 k´
2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 3,8
4,8
pH
5,8
Obr.11 : Vliv pH pufru octanu ammoného na retenci neutrálních analytů. 36
6,8
Vliv pH pufru na retenci nukleosidů a nukleových bazí, stejně jako na retenci neutrálních látkek byl zanedbatelný (viz Obr.10 a Obr.11). V porovnání s ostatními nukleosidy a nukleovými bazemi byl pozorován určitý vliv pH pro cytidin, guanin a guanosin, kdy se vzrůstajícím pH mírně rostla retence těchto analytů. Patrný pokles retence byl pozorován pouze u kreatininu.
27 24 21
atenolol
metoprolol
pindolol
acebutolol
propranolol
18 k´
15 12 9 6 3 0 3,8
4,8
pH
5,8
6,8
Obr.12 : Vliv pH pufru octanu ammoného na retenci bazických analytů. Retence bazických analytů klesala v závislosti na rostoucí hodnotě pH od 3,8 do 6,8 (viz Obr.12), což je pravděpodobně způsobeno oslabením iontových interakcí mezi pozitivně nabitým bazickým analytem a negativně nabitou stacionární fází a zároveň nižší hydrofilicitou. V porovnání s ostatními látkami byl vliv pH nejsilnější právě pro bazické látky. Thiamin není v grafu zobrazen v důsledku jeho velmi silné retenci při použití 50 mM octanu ammoného.
5.4. Vliv pH na selektivitu Na základě závislosti retenčního faktoru každé sloučeniny při dvou různých podmínkách (v tomto případě dvou hodnot pH 3,8 a 6,8) byl vyhodnocen rozdíl selektivity u analyzovaných látek. V grafu byl zaznamenán lineární průběh a pomocí lineární regrese byl získán korelační koeficient r2. Rozdíl selektivy s2 mezi dvěma podmínkami byl spočítán pomocí vzorce: s2 = 1 – r2 37
V případě, že hodnota s2 se rovná nule, znamená to, že při obou testovaných podmínkách je naprosto shodná selektivita, zatímco hodnota 1 určuje zcela odlišnou selektivitu. K porovnání selektivity byla sestrojena závislost retenčního faktoru každé sloučeniny při pH 3,8 a 6,8. Jako mobilní fáze byla použita směs ACN/50 mM octan amonný pH 4,8 v poměru 90/10
Analyzovaná látka atenolol metoprolol pindolol acebutolol propranolol uracil uridin cytidin thymin cytosin guanin adenin guanosin adenosin pyridoxin kreatinin tyrosol nikotinamid kofein paracetamol theophylin p-anisová kys. 2,3-dihydroxybenzoová kys. p-hydroxybenzoová kys. gentisová kys. salicylová kys. vanilová kys. ferulová kys. kávová kys. sinapová kys. syringová kys. askorbová kys. šikimová kys.
k´ (pH = 3,8) 25,70 11,51 9,46 14,52 8,88 0,36 0,53 2,22 0,30 2,68 1,89 1,87 1,72 1,37 1,27 3,92 0,64 0,64 0,41 0,13 0,42 0,33 0,07 0,29 0,05 0,09 0,39 0,38 0,39 0,46 0,92 1,11 4,80
k´ (pH = 6,8) 15,90 6,18 4,88 8,63 4,44 0,44 0,79 3,06 0,37 2,77 2,30 1,66 2,54 1,50 1,39 3,49 0,61 0,61 0,36 0,16 0,47 1,35 0,08 1,47 0,13 0,04 1,69 1,72 2,06 1,94 1,97 3,42 16,30
Tab.2 : Retenční faktory jednotlivých látek při pH = 3,8 a při pH = 6,8. Mobilní fáze 38
skupina kyselé látky bazické látky neutrální látky nukleosidy a nukleové baze
hodnota s2 0,013 0,002 0,006 0,148
Tab.3 : Hodnoty s2 pro jednotlivé skupiny analytů
18
R² = 0,987
16
R² = 0,998
14
k´(pH = 6,8)
12
10 bazické látky 8 nukleosidy a nukleové baze 6 neutrální látky R² = 0,852
4
R² = 0,994
kyselé látky
2
0 0
5
10
15 k´(pH = 3,8)
20
25
30
Obr.13 : Vliv pH na selektivitu kolony Zorbax HILIC plus (pH = 3,8 a pH = 6,8). Mobilní fáze ACN/50 mM octan ammoný v poměru 90/10.
39
Při porovnání selektivity kolony Zorbax HILIC plus neměla hodnota pH vliv na selektivitu analyzovaných látek. Vypočítané hodnoty s2 jednotlivých skupin analytů jsou zaznamenány v Tab. 3. U analytů kyselých látek se kolona vyznačovala větší selektivitou pro kyselinu syringovou při pH = 3,8. Ze skupiny analytů nukleosidů a nukleových bazí kolona vykazovala odlišnou selektivitu pro guanosin a cytidin při pH = 6,8 a pro adenin a cytosin při pH = 3,8.
5.5. Vyhodnocení retenčního mechanismu HILIC K hodnocení retenčního mechanismu se používají křivky závislostí lin-log a log-log. Závislost lin-log, která je vyjádřena jako log k´ = f (% ACN) naznačuje převahu rozdělovacího mechanismu. Závislost log-log vyjádřena jako log k´ = f log (% ACN) zase vypovídá o absorbčním procesu. Pro hodnocení byly sestrojeny oba typy grafů pro vybrané analyty. Hodnocení retenčního mechanismu bylo provedeno v oblasti 70 – 95 % ACN.
2,5 2,0 1,5
atenolol
propranolol
cytosin
adenin
pyridoxin
nikotinamid
theophylin
šikimová kys.
log k´
1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5 70
75
80
85
90
95
100
% ACN
Obr.14 : Závislost lin-log u vybraných analytů. Mobilní fáze ACN/50 mM octan ammoný v poměru 90/10.
40
2,5 2,0
atenolol
propranolol
cytosin
adenin
pyridoxin
nikotinamid
theophylin
šikimová kys.
1,5
log k´
1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5 1,84
1,86
1,88
1,90
1,92
1,94
1,96
1,98
2,00
log (% ACN)
Obr.15 : Závislost log-log u vybraných analytů. Mobilní fáze ACN/50 mM octan ammoný v poměru 90/10.
Analyzovaná látka hodnota r2 (lin-log) atenolol 0,914 propranolol 0,918 cytosin 0,927 adenin 0,940 pyridoxin 0,939 nikotinamid 0,970 theophylin 0,989 šikimová kys. 0,980
hodnota r2 (log-log) 0,887 0,892 0,902 0,917 0,915 0,954 0,980 0,965
Tab.5 : Hodnoty r2 vybraných látek pro grafickou závislost lin-log (viz Obr. 14) a log-log (viz Obr.15) Byly sestrojeny grafy lin-log (viz Obr.14) a log-log (viz Obr.15) u vybraných analyzovaných látek a zjištěny hodnoty r2 u obou typů závislostí (viz Tab.5). Při porovnání hodnot r2 závislostí lin-log a log-log je patrné, že rozdělovací mechanismus má převahu u většiny vybraných zástupců analyzovaných látek. Nicméně jelikož linearita lin-log ani log-log závislostí není dostatečně lineární, byl prokázan smíšený retenční mechanismus. 41
6. Závěr
Tato diplomová práce se zabývala studiem HILIC separačního mechanismu a vlivem složení mobilní fáze (% acetonitrilu, pH a koncentrace pufru) na retenci a selektivitu analytů. Na základě výsledků bylo potvrzeno typické HILIC retenční chování všech testovaných analytů, se zvyšující koncentrací acetonitrilu se zvyšovala retence jednotlivých analytů. Pro většinu neutrálních látek, nukleosidů a nukleových bazí nebyl prokázán vliv koncentrace a pH pufru. Nejvyšší vliv jak koncentrace pufru tak pH byl prokázán pro bazické látky, kdy s roustoucí koncentrací pufru a rostoucí hodnotou pH klesala retence bazických analytů. Naopak retence kyselých analytů se zvyšovala s rostoucí koncentrací pufru a rostoucí hodnotou pH. Kolona Zorbax HILIC plus byla hodnocena z hlediska selektivity (pH 3,8 a 6,8). Hodnota pH neměla významný vliv na změnu selektivity kolony. Ze skupiny analytů nukleosidů a nukleových bazí kolona vykazovala vyšší selektivitu pro guanosin a cytidin při pH = 6,8 a pro adenin a cytosin při pH = 3,8. Ze skupiny kyselých látek se kolona vyznačovala větší selektivitou pro kyselinu syringovou při pH = 3,8. Pomocí závislostí lin-log a log-log byl hodnocen také retenční mechanismus. Na základě hodnot r2 je pravděpodobné, že u všech analyzovaných látek převažoval rozdělovací mechanismus retence, nicméně na základě nedostatečné linearity obou typů křivek byl potvrzen smíšený retenční mechanismus.
42
Seznam použité literatury
[1] A. Kumar, J. C. Heaton, D. V. McCalley, J. Chromatogr. A, 1276 (2013) 33– 46 [2] L. Nováková, M. Douša a kolektiv, Moderní HPLC separace v teorii a praxi II., 1.vydání, Europrint (2013) 235 s., ISBN: 978-80-260-4244-0 [3] M. R. Gama, R. G. da Costa Silva, C. H. Collins, C. B. G. Bottoli, Trend. Anal. Chem. 37 (2012) 48-60 [4 ] A. J. Alpert, J. Chromatogr. A, 1218 (2011) 5879 [5] M.Doležal a kolektiv, Farmaceutická chemie léčiv působících na autonomní nervový system, Karolinum (2009) 134 s., ISBN: 978-80-246-1633 [6] B. Buszewski, S. Noga, Anal. Bioanal. Chem., 402 (2012) 231–247 [7] Y. Guo, S. Gaiki, J. Chromatogr. A, 1218 (2011) 5920 – 5938 [8] J. Vlček, D. Fialová a kol., Klinická farmacie I., 1.vydání, Grada Publishing a.s. (2010) 368 s., ISBN: 978-80-247-3169-8 [9] P. Jandera, Anal. Chim. Acta 692 (2011) 1–25 [10] G. Kahsay, H. Song, A. Van Schepdael, D. Cabooter, E. Adams, J. Pharmaceut. Biomed. 87 (2014) 142– 154 [11] Y. Guo, S. Gaiki, J. Chromatogr. A, 1074 (2005) 71–80 [12] B. A. Olsen, J. Chromatogr. A, 913 (2001) 113–122 [13] D. V. McCalley, J. Chromatogr. A, 1217 (2010) 3408–3417 [14] T. Ikegami, K. Tomomatsu, H. Takubo, K. Horie, N. Tanaka, J. Chromatogr. A, 1184 (2008) 474–503 [15] D. V. McCalley, J. Chromatogr. A, 1171 (2007) 46–55 [16] J.Hartl a kolektiv, Farmaceutická chemie IV., Karolinum (2006) 166 s., ISBN: 978-80-2461169-3 [17] J. Soukup, P. Jandera, J. Chromatogr. A, 1228 (2012) 125– 134 [18] Ž. Bezáková a kol., Základy farmaceutickej analýzy, Kvalitatívne hodnotenie chemických liečiv, VA PRINT Nitra (2002), 722 s., ISBN: 80-968256-7-4 43
[19] T. Jonsson, P. Appelblad, SeQ. AB, Umeå, Sweden, App. Note. — Sep. (2004) 72-73 [20] P. Chen, W. Li, Q. Li , Y. Wang, Z. Li , Y. Ni, K. Koike, Talanta 85 (2011) 1634–1641 [21] N. Nakov, J. Acevska, K. Brezovska, R. Petkovska, A. Dimitrovska, Maced. J. Chem. Chem. En. 31 (2012) 47-54 [22] https://scifinder.cas.org/scifinder/view/scifinder/scifinderExplore.jsf (02/2014) [23] W. Jian, R. W. Edom, Y. Xu, N. Weng, J. Sep. Sci. 33 (2010) 681–697 [24] D. Guillarme, J.-L. Veuthey, UHPLC in Life sciences, Roy. Soc. Ch. (2012), 446 s., ISBN: 978-1-84973-388-5 [25] R. Khattab, M. Eskin, M. Aliani, U. Thiyam, J. Am. Oil. Chem. Soc. 87 (2010) 147-155 [26] J. J. Kirkland, S. A. Schuster, W. L. Johnson, B. E. Boyes, J. Pharm. Anal. 3 (2013) 303-312 [27] L. Nováková, H. Vlčková, Anal. Chim. Acta 656 (2009) 8-35 [28] J. Ruta, S. Rudaz, D. V. McCalley, J. L. Veuthey, D. Guillarme, J. Chromatogr. A, 1217 (2010) 8230-8240 [29] R. Pavlovičová, Chem. Listy 92 (1998) 406-414
44
