UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA BIOFYZIKY A FYZIKÁLNÍ CHEMIE DIPLOMOVÁ PRÁCE

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA BIOFYZIKY A FYZIKÁLNÍ CHEMIE

DIPLOMOVÁ PRÁCE

RADIOAKTIVNÍ ZNAČENÍ HYALURONOVÉ KYSELINY

Školitel diplomové práce: Doc. Ing. Alice Lázníčková, Csc. Hradec Králové 2007

Ester suchánková

Děkuji Doc. Ing. Alici Lázníčkové, Csc. za vedení a pomoc při sestavování této diplomové práce.

2

Obsah 1.

Obsah........................................................................................................................3

2.

Úvod a cíl práce........................................................................................................5

3.

Charakteristika kyseliny hyaluronové......................................................................6 Chemická charakteristika....................................................................................6 Farmakologické vlastnosti..................................................................................8 Interakce............................................................................................................10 Fyzikální a biologické vlastnosti.......................................................................11

4.

Role hyaluronanu v nádorovém onemocnění..........................................................13

5.

Lékařské použití hyaluronanu.................................................................................15

6.

Použití hyaluronanu v estetické medicíně...............................................................16

7.

Radioaktivní značení kyseliny hyaluronové...........................................................18

8.

Značení hyaluronanu triciem 3H.............................................................................19 Substituce vodíkových atomů v molekule triciem............................................19 Alkylace molekuly 3H – methylbromidem.......................................................20 Analýza produktu a výsledky........................................................................... 20

9.

Studium absorpce, distribuce, metabolismu a exkrece kyseliny hyaluronové produkované baktériemi......................................................23 Radioaktivní značení hyaluronanu sodného uhlíkem – 14...............................23 Biologické studie...............................................................................................24 Úprava vzorků...................................................................................................25 Výsledky studií..................................................................................................26

10.

Značení radioaktivními izotopy halogenů pro účely PET a SPECT......................31 Značení hyaluronanu 124I……………………………………………………..31 Značení hyaluronanu bromem – 76..................................................................32 Značení kyseliny hyaluronové konjugací Bolton – Hunterovým činidlem a jodací 125I........................................................................................33

11.

Značení tyramin – celobiosy hyaluronanu jodem – 125........................................33 Radioaktivní značení hyaluronanu modifikovaného tyramin – celobiosou........................................................................................34 Biologické testy...............................................................................................36 Výsledky studií................................................................................................37

3

12.

Značení hyaluronanu 125I – tyrosinem pro studie in vivo a in vitro.........................40 Značení hyaluronanu.......................................................................................40 Příprava kultur jaterních buněk.......................................................................40 Biologické studie.............................................................................................40 Výsledky..........................................................................................................42

13.

Značení chelatačním činidlem modifikovaného hyaluronanu kovovým radionuklidem........................................................................................45

14.

Značení hyaluronan – butyrátu techneciem – 99mTc pro studie in vivo a in vitro....................................................................................45 Příprava HA – But...........................................................................................46 Značení HA a komplexu HA – But techneciem – 99mTc.................................46 Studie značeného komplexu HA - But in vitro................................................47 Výsledky studie................................................................................................48 Biodistribuční studie komplexu 99mTc – HA – But in vivo..............................49 Značení a biodistribuce komplexu 99mTc – HA – paclitaxel............................49

15.

Značení kyseliny hyaluronové rheniem – 188 pro biodistribuční studii in vivo..........................................................................................................50 Značení hyaluronanu rheniem – 188.................................................................51 Biodistribuce komplexu in vivo........................................................................51

16.

Závěr.......................................................................................................................52

17.

Použité zkratky.......................................................................................................54

18.

Použitá literatura.....................................................................................................56

19.

Souhrn a abstrakt....................................................................................................58

4

Úvod a cíl práce V roce 1934 se Meyerovi a Palmerovi podařilo extrahovat do té doby neznámý polysacharid z očních čoček hovězího dobytka, který nazvali kyselina hyaluronová kvůli obsahu kyseliny uronové (uronic acid) a jejího původu z čoček (hyaloid = sklo). Protože se kyselina hyaluronová prakticky nikdy nenachází ve fyziologickém prostředí jako kyselina, ale jako sodná či jiná sůl, začal se od roku 1996 užívat název hyaluronan pro celou skupinu. Kyselina hyaluronová (HA) je látka tělu vlastní, o které se ještě donedávna předpokládalo, že je to biopolymer, který má v těle pouze mechanickou funkci a slouží jen jako organizátor výstavby podpůrných tkání, do kterých se zabudovávají buňky za vzniku jednotlivých orgánů. Díky schopnosti HA vázat velké množství vody a měnit se v transparentní gel s výbornými lubrikačními vlastnostmi, byly kyselině připisovány ještě další funkce, a to schopnost lubrikovat pohybující se části organismu (klouby) a schopnost zabezpečit tvar oka a naplnit jej transparentním, silně viskoelastickým prostředím. Z toho se také odvíjelo užití HA v medicíně. Kyselina byla a je používána jako lubrikační prostředek při osteoartróze a jiných onemocněních kloubů a jako viskosuplementační přípravek při operacích oka. Díky svým hydratačním vlastnostem našla také své uplatnění v kosmetice a estetické chirurgii. Poprvé byla kyselina hyaluronová extrahována z pupečníku, dnes jsou hlavním zdrojem tohoto biopolymeru kohoutí hřebínky. Samotná extrakce je technicky obtížná, drahá a extrakt může obsahovat mnoho příměsí (proteiny, chondroitin sulfát, beta D - glukany), což může vést k vyšší incidenci alergických reakcí. Je zde též teoretické nebezpečí přenosu virových onemocnění. Novým způsobem získávání kyseliny hyaluronové je fermentace baktériemi, které obsahují kyselinu hyaluronovou v mucinovém obalu. Tímto novým způsobem je možné získat vysoce čistý produkt. Takto exogenně získaná kyselina hyaluronová je navíc absolutně strukturálně identická s endogenní, a proto též podléhá metabolické přeměně jako endogenní látka. Moderní fermentační produkt má mnoho výhod - baktérie, které vytvářejí mucinový obal bohatý na kyselinu hyaluronovou, mohou za kontrolovaných kultivačních podmínek vyprodukovat kyselinu hyaluronovou s vysokým stupněm čistoty. Cílem této diplomové práce bylo prostudovat současnou literaturu týkající se vlastností kyseliny hyaluronové a také metod radioaktivního značení, které se používají pro studium metabolismu HA in vivo a in vitro.

5

Charakteristika kyseliny hyaluronové (1,2) Hyaluronová kyselina je ubikvitní u všech obratlovců, kde tvoří základní součást extracelulární matrix. Navíc se nachází v mucinovém obalu některých streptokoků, ty pravděpodobně získaly schopnost ji syntetizovat. Představuje základní složku všech spojovacích tkání a extracelulární matrix savců a vyskytuje se ve větším množství v rychle rostoucích fetálních tkáních než ve zralých tkáních dospělého organismu. To platí však pro místa, která nejsou spojovací, hlavně v nervovém systému. Lidské tělo obsahuje asi 15 g hyaluronanu, přičemž polovina celkového množství se nachází v kůži a čtvrtina v kostře a kloubech. Nejvyšší koncentrace hyaluronanu se nachází v typických spojovacích tkáních, v pupečníkové šňůře, synoviální tekutině, kůži a vitrózní tekutině. Kohoutí hřebínek, specializovaná kožní tkáň, obsahuje nejvyšší koncentrace hyaluronanu (až 7, 5 mg/ml). Obsah hyaluronanu v matrix ostatních spojovacích tkáních například těch, které obklopují buňky hladkého svalu v aortě je nižší. Zaznamenatelná množství jsou také přítomna v plicích, ledvinách, mozku a svalu, ale velmi malé množství se nachází v játrech. Nejnižší koncentrace jsou v krevním séru. Hladina plazmatického hyaluronanu může být zvýšena indukcí syntézy hyaluronanu při různých patologických stavech. Chemická charakteristika (1,2,5) Hyaluronan (HYA, syn. hyaluronová kyselina, hyaluronát) patří chemicky mezi polysacharidy, přítomné v extracelulární matrix spojovacích tkáních obratlovců (v chrupavce, pojivu). Dříve byly označovány jako kyselé mukopolysacharidy a nyní je známe pod pojmem glykosaminoglykany. Glykosaminoglykany (GAG) jsou nerozvětvené jednořetězcové polymery složené z jednotek disacharidu obsahující N - acetylhexosamin a hexosu. Druhý sacharid je často hexuronová kyselina a vyskytuje se ve všech glykosaminoglykanech kromě keratan sulfátu, který na místo toho obsahuje molekulu galaktózy.

6

Obr.1: Schéma struktury proteoglykanu

Všechny glykosaminoglykany kromě hyaluronové kyseliny obsahují sulfátové skupiny a jejich polysacharidové řetězce jsou relativně krátké ( 50 kDa, obecně 15 - 20 kDa). Jejich syntéza probíhá v endoplazmatickém retikulu a Golgiho aparátu a jsou substituovány v peptidovém jádru odlišnými sacharidy za účelem tvorby proteoglykanu. Různé druhy sulfatovaných glykosaminoglykanů mohou být spojeny s peptidovým jádrem, čímž lze vytvořit obrovské množství strukturních typů proteoglykanů, které mohou reagovat s ostatními komponentami extracelulární matrix a s řadou odlišných buněk. Většina proteoglykanů je spojena prostřednictvím jedné nebo více silných vazeb s fixními strukturami matrix nebo buňkami a proto jsou imobilní. HYA se liší od ostatních glykosaminoglykanů v mnoha ohledech. Vyskytuje se pouze jeden druh hyaluronanu. Ostatní strukturně příbuzné glykosaminoglykany, jako na příklad chondroitin, keratan a heparin sulfát, vytváří enormní počet isomerů, protože obsahují sulfátové skupiny, které mohou být distribuovány podél molekuly polymeru několika různými způsoby. Jeho primární struktura neobsahuje žádný peptid a je syntetizována v plasmatické membráně. Hyaluronan také netvoří proteoglykany. Molekuly hyaluronanu jsou tvořeny rovnými řetězci složenými ze stovek až tisíc sacharidových jednotek dvojího typu: N - acetylglukosaminu a glukuronátu, které se střídají v molekule disacharidu beta - 1, 4 a beta - 1, 3 glykosidickými vazbami (Obr. 2). Každá glukuronátová jednotka má charakter aniontu při fyziologickém pH díky přítomnosti karboxylových skupin.

7

Počet opakujících se jednotek, n, v konečné molekule hyaluronanu může dosáhnout počtu 10 000. Průměrná délka disacharidového řetězce je přibližně 1 nm a pokud je molekula napřímena, tak dosahuje šířky větší než 15 µm, což je přibližně průměr lidského erytrocytu. I když je molekula hyaluronanu složena z jednoduchého polysacharidového řetězce jako ostatní glykosaminoglykany, její molekulová hmotnost obvykle dosahuje hodnoty 4 x 106 Da, v synoviální tekutině je například průměrná hmotnost zhruba 7 x 106 Da. Zdá se, že uniformita této struktury bude omezovat biologické vlastnosti hyaluronanu, ale toto omezení je překonáno velkým počtem vazebných míst vyskytujících se v extracelulární matrix a na buněčných površích.

Obr.2: disacharid kyseliny hyaluronové: glukuronát-N-acetylglukosamin

Farmakologické vlastnosti (1,2,4) Biosyntéza a degradace (1,4) Hyaluronan je syntetizován v plasmatické membráně membránově - vazebným proteinem, hyaluronan syntázou, jejíž genetický kod byl již v současnosti určen u bakterií, myši a člověka. U obratlovců se vyskytují 3 druhy hyaluronan syntázy HA1, HA2, HA3. Ty mají za úkol přidávat jednotky sacharidu z nukleotidových prekurzorů k řetězci na cytoplasmatické membráně a přemístit rostoucí řetězec do mezibuněčného prostoru. Růst řetězce probíhá na redukujícím se konci ve srovnání se syntézou ostatních polysacharidů spojovacích tkání. Je zřejmé, že většina druhů buněk obratlovců syntetizuje hyaluronan v průběhu morfogeneze ve tkáně. Tato schopnost může být potlačena nebo aktivována v případě probíhajících změn, jak lze například pozorovat u hladkosvalových buněk arterií podléhající procesu aterosklerozy. Ve vyspělém organismu syntéza hyaluronanu více probíhá v buňkách mesodermálního původu, i když zůstává aktivní i v jiných tkáních jako na příklad v epidermis.

8

Hyaluronan je degradován enzymem zvaným hyaluronidáza. U člověka se vyskytuje 7 typů hyaluronidázových enzymů, které hrají různé role ve fyziologických a patologických procesech v organismu. Některé umožňují přestup spermie do vajíčka, jiné se podílejí na šíření buněčné infekce a některé jsou zodpovědné za potlačení růstu nádoru. Degradační produkty hyaluronanu, oligosacharidy a nízkomolekulární hyaluronan mají proangiogenetické vlastnosti. Fragmenty hyaluronanu mohou také indukovat zánětlivou odpověď v mikrofázích a dendritických buňkách v poraněných tkáních a při procesu rejekce transplantátu.

Metabolismus a eliminace (1,2) Metabolismus hyaluronanu je velmi dynamický. Některé buňky jako například chondrocyty v chrupavkách aktivně syntetizují a katabolizují hyaluronan v průběhu celého života tkáně. Syntéza je obvykle udržována v rovnováze s rozkladem, proto je ve tkáních konstantní koncentrace hyaluronanu. Metabolickými studiemi bylo zjištěno, že poločas života molekuly hyaluronanu přítomného v chrupavce je za normálních okolností 2 - 3 týdny. Keratinocyty v epidermis představují jiný typ buněk, jež také aktivně syntetizují a odstraňují hyaluronan. V tomto případě, poločas života molekuly hyaluronanu je překvapivě krátký, činí méně než jeden den. Někdy buňky buď přednostně syntetizují nebo katabolizují hyaluronan. Například buňky v dermis aktivně syntetizují hyaluronan ve větším množství než ho katabolizují. Poločas života molekuly hyaluronanu v krevním kompartmentu je velmi krátký, pouze několik minut. Buňky v kloubní hlavici kolene syntetizují hyaluronan a uvolňují ho do synoviální tekutiny, kde tvoří hlavní složku a svými vlastnostmi přispívá k viskoelasickým vlastnostem synoviální tekutiny. Synoviální tekutina odtéká lymfou, předtím než vstupuje do krevního oběhu. Buňky retikuloendotelového systému přítomné v lymfě aktivně odstraňují kolem 90 % hyaluronanu, předtím než vstoupí do žilního systému. Po vstupu do krevního oběhu zhruba 85 – 90 % je eliminováno játry prostřednictvím vazby s receptorem a katabolismu probíhajícího v jaterních sinusoidních endotelových buňkách. Ledviny extrahují asi 10 % celkového množství, ale vylučují pouze 1 – 2 % močí. V některých živočišných druzích je místem absorpce hyaluronanu slezina a má schopnost rychle metabolizovat hyaluronan, ale tento účinek závisí na její velikosti a prokrvení. Normální obrat hyaluronanu v plazmě u člověka je asi 15 – 30 % za minutu. Jedna třetina celkového množství hyaluronanu je odstraněna a nahrazena během jednoho dne.

9

Interakce hyaluronanu (1) V extracelulární matrix Proteoglykany chrupavky, nazývané v současnosti jako agrekany, jsou schopny vázat molekulu hyaluronanu. Hyaluronan hraje hlavní roli ve stabilizaci matrix chrupavky, i když tvoří pouze malou frakci obsahu materiálu chrupavky. Obrovské množství agrekanů se váže prostřednictvím specifické oblasti proteinového jádra k relativně krátkým řetězcům hyaluronanu a tato vazba je posílena pomocí malých spojovacích proteinů. Některé z těchto agrekanů jsou vystavěny také na hyaluronových řetězcích spojených se specifickými vazebnými místy na chondrocytech. Kompletní makrokomplexy dosahují jednotlivých hmotností řádově několika milionů Daltonů a jsou rozloženy mezi kolagenními vlákny a přitahují vodu osmotickými jevy. Tento mechanismus je omezen na oblast chrupavky, ale několik ostatních proteoglykanů vážících hyaluronan (versikan, neurokan, brevican a jiné) se objevují v měkkých tkáních v mozku a jejich role není prozatím zcela objasněna. Buněčně – povrchová vazebná místa HA Vazebná místa v buněčné membráně byla poprvé identifikována v myších buňkách fibroblastu pozměněných virem (SV– 3T3). Vazebné místo v membráně je inhibováno HA6 fragmenty nebo chondroitinem a liší se od rozpustného proteinu vážícícího hyaluronan extrahovaného z mozku. Tento druh vazebného místa je také odlišný od hyaluronan syntázy, která je lokalizována v buněčné membráně, ale uvolňuje hyaluronan po syntéze. Vysoko afinitní hyaluronan vazebné místo bylo charakterizováno v jaterních endotelových buňkách, kde probíhá ingesce a katabolismus hyaluronanu . Tato vazebná místa byla společně označena jako skupina hyaladherinů. V současnosti, některé z nich mohou být jasně označeny za receptory za předpokladu, že indukují odpověď buňky na určitý podnět, např. zprostředkovávají endocytózu a katabolismus v jaterních endotelových buňkách nebo ovlivňují buněčnou proliferaci. Buněčná vazba hyaluronanu také byla identifikována pomocí rozlišovacích markerů CD44, známých jako Hermes antigen, H - CAM, Pgp - 1, který byl jako první charakterizován jako antigen lymfocytů zahrnutý v lymfocytovém homingu a je všeobecně považováno, že se tato molekula zúčastní mezibuněčné adheze. CD44 představuje afinitu k hyaluronanu na lymfocytech a může působit adhezi mezi lymfocyty B řady a buňkami stromatu. CD44 s aktivitou vázat hyaluronan byl identifikován v SV - 3T3 fibroblastech a následně v mnoha ostatních buňkách. Skupina hyaluronan vazebných peptidů jako je CD44 mají různé funkce v různých buňkách. Liší se od receptoru spojeného s katabolismem v játrech. 10

Jiná forma hyaluronanového receptoru (později nazývaného RHAMM, receptor zprostředkovávající pohyblivost hyaluronanu) je spojena s buněčnou pohyblivostí. Funkčně je spojena s p21 proteinem ras - pozměněných buněk, pokud se vazebné místo ztratí, buněčná pohyblivost se sníží. Je také spřažena s protein - kinazovou aktivitou. Jiná specifická místa slouží k upevnění hyaluronanu k buněčnému povrchu, jako glykokalyx umožňující vazbu mezi buňkami (hlavně v případě imunocytů) nebo k zahájení procesu tvorby specializované matrix v případě chrupavky.

Fyzikální a biologické vlastnosti (1,3,5) Hyaluronová kyselina (HA) je hlavním GAG extracelární matrix, která obklopuje migrující a proliferující buňky, zvláště v embryonálních tkáních. Je také největší komponentou komplexu proteoglykanů EM řady tkání, jako např. v chrupavce. Má velmi výhodné vlastnosti pro pojivovou tkáň, jakým je prostředí kloubů. Vzhledem k částečně hydrofilním a částečně hydrofobním vlastnostem, může kyselina hyaluronová vytvářet ve vodných roztocích náhodně spirálovitou konfiguraci. Kyselina hyaluronová funguje jako molekulové síto, skrz které mohou difundovat malé molekuly jako např. voda, elektrolyty a živiny, ale velké molekuly (proteiny) mohou procházet jen velmi pomalu. Četné hydrofilní komponenty na povrchu HA váží velké množství vody a tvoří již při nízké koncentraci HA viskózní hydratovaný gel. HA mezi jednotlivými buňkami plně vyplňuje prostor. Tato struktura

je schopna

bobtnání, vytváří určité napětí a různým

způsobem blokuje vzájemný pohyb buněk. Karboxylové skupiny hyaluronanu jsou plně ionizovány v extracelulárním pH, kromě toho váží na povrchu ionty, čímž ovlivňují osmotický tlak. To způsobuje přitahování osmoticky aktivních kationtů jako je Na+, což vede k tomu, že do EM je vtahována voda. Důsledkem tohoto jevu je bobtnání struktury a turgor. Velké množství vázané vody dává extracelulární hmotě schopnost odolávat kompresním silám. To je důležité např. pro chrupavku pokrývající styčné plochy kloubu. Chrupavka tak absorbuje sílu vznikající třením při pohybu kloubu. Při poruše chrupavky dochází k odírání styčných ploch a poškození kloubu. Zvlášť užitečnou vlastností k. hyaluronové v roztoku či gelu je její viskoelasticita, která částečně vyplývá ze schopnosti vázat vodu. Viskoelasticita je termín užívaný pro tekutiny, jež mají vlastnosti pevných látek a tekutin. Abnormální viskozita HA ukazuje možnost jejího použítí jako lubrikantu.

11

Lubrikační role hyaluronanu v měkkých tkáních spojujících jednotlivé klouby je již dávno známa, ale jakým mechanismem přispívá k ochraně chrupavek nebylo zatím vysvětleno. Velmi tenký film může udržovat separaci povrchů nesoucích velké statické břemeno, ale redukce tření na chrupavce pravděpodobně spočívá ve složité souhře interakcí jejího povrchu s molekulami hyaluronanu, částečně s glykoproteinem synoviální tkáně a fosfolipidovými micelami. Funkčí role anomální elasticity není snadno popsatelná, ale zdá se, že minimalizuje buněčnou deformaci a urychluje reparaci buněk při jejich poškození mechanickým stresem, kterému jsou měkké tkáně vystaveny. Jak viskozita, tak elasticita jsou pozitivně ovlivňovány složitým způsobem molekulovou hmotností a koncentrací. Tento fakt musí být zohledněn při přípravě HA za účelem viskoprotekce a viskosuplementace v terapii některých onemocnění. Hyaluronová kyselina je také signifikantní faktor růstu, vývoje a obnovy tkání. Je součástí pojivové tkáně a byla detekována v gingivě. Koncentrace kyseliny hyaluronové se zvyšují během hojení rány, embryonálního vývoje a rozvoje nádoru. Vysokomolekulární kyselina hyaluronová stimuluje časné hojení rány dlouhých kostí laboratorních potkanů a reparativní tvorbu dentinu. Kyselina hyaluronová také zvyšuje in vitro migraci a diferenciaci buněk mezenchymu a rovněž ovlivňuje řadu parametrů krevních buněk, zejména s ohledem na zánětlivou odpověď, tj. fagocytózu a chemotaxi. Kyselina hyaluronová hraje dále významnou roli v buněčné proliferaci, migraci a diferenciaci. HA brání adhezi. Je proto vázaná na povrchu migrujících buněk (receptor CD44). Ztráta HA či schopnost vázat různé komponenty a hydratace tak přispívá k vzájemnému oddělení jednotlivých buněk

a ve svém konečném důsledku usnadňuje jejich proliferaci

a diferenciaci.

12

Role hyaluronanu v nádorovém onemocnění (7) Hyaluronan hraje klíčovou roli v mikroprostředí nádorové buňky. Je složkou desmoplazie, je spojen s ostatními makromolekulami a přispívá k vytváření síťovité struktury matrix. Nádorové buňky exprimují vazebná místa pro hyaluronan (CD44, RHAMM). Buněčná adheze k hyaluronanu může ovlivnit pohyblivost buňky. Hyaluronan chrání nádorové buňky proti ataku buněk imunitního systému. Sérové hladiny hyaluronanu jsou často zvýšené u pacientů s metastázami. Hyaluronan je syntetizován v buněčné membráně a vytváří mezibuněčnou matrix v kultuře. Jeho distribuce je s malými výjimkami hlavně extracelulární. V tumorech se kumuluje hlavně ve stromatu a v matrix obklopující epitelové nádorové buňky. Přežití nádorových buněk závisí na jejich schopnosti adheze k matrix tkání, proliferaci, migraci, invazi do tkání a schopnosti vytvářet metastáze. Obsah hyaluronanu v tumorech je často zvýšený, což odpovídá zvýšené koncentraci hyaluronanu v séru pacientů s karcinomem. I když hladina hyaluronanu v séru pacientů nemůže být měřítkem diagnózy a prognózy onemocnění, koncentrace hyaluronanu v nádorových tkáních kolísá od 50 - 800 μg/g a je většinou větší než 250 μg/g, což je koncentrace vyskytující se v normálních tkáních. Buněčný původ hyaluronanu v jednotlivých nádorových buňkách se liší. Maligní tumory se skládají z klusterů nádorových buněk smíšených s fibroblasty (část desmoplasia) a buňkami cév (mikrofágy, lymfocyty, monocyty) zachycených v matrix. Z těchto buněk některé, fibroblasty, endotelové buňky a většina druhů nádorových buněk, produkují hyaluronan in vitro. Maligní buňky mohou také stimulovat syntézu hyaluronanu nemaligními buňkami stromatu, buď přímým kontaktem s plazmatickými membránami nebo humorálními způsoby. Schopnost hyaluronanu adherovat k buněčným povrchům byla potvrzena objevením hyaluronan vazebného místa na SV - 3T3 buňkách ( linie buněk myšího fibrosarkomu). Vazebné místo bylo později definováno jako CD44. Je zodpovědné za adhezi hyaluronanu k endotelovým buňkám a buněčným liniím lidského myelomu a za adhezi lymfocytů B řady k buňkám stromatu. CD44 se vyskytuje ve dvou formách, jedna je epiteliální a ostatní hematopoetická s různými adhezními potenciály pro hyaluronan. Hyaluronan se nevyskytuje jako adhezní molekula in vitro u buněk lidských solidních tumorů. Hyaluronan se účastní procesu buněčné proliferace a tento účinek závisí na velikosti molekuly, ale mechanismus není kompletně vysvětlen.

13

Můžeme však rozlišit aktivitu vycházející z vazby hyaluronanu k buněčné membráně z nepřímého vlivu hyaluronanu v matrix. Hyaluronan vážící se k RHAMM může na příklad aktivovat protein kinázu, která může modifikovat buněčné chování. V matrix, je hyaluronan mobilní člen vyplňující složení prostoru a přispívá k fyzikální stabilitě této struktury. S ohledem na tyto skutečnosti, hyaluronan podporuje růst nádorové buňky stejným způsobem jako

v

normální

buňce.

Hyaluronan

může

vykazovat

antiproliferativní

aktivitu

prostřednictvím nízkoafinitní interakce s růstovými faktory. Proliferace indukovaná PDGF (růstový faktor trombocytů) ve dvou odlišných buněčných liniích lidského gliomu byla potlačena přidáním hyaluronanu (10 mg/L) do media. Tato koncentrace hyaluronanu simuluje hladiny naměřené v tumorových extraktech. To podporuje hypotézu přímé nízko afinitní interakce mezi hyaluronanem a růstovými faktory, a tak hyaluronan může inhibovat aktivitu růstových faktorů v tumorech, v regeneraci a v zánětlivých procesech. Angiogeneze je zvláštní případ proliferace indukované hyaluronanem. Nerozložený hyaluronan není schopen těchto účinků. Buňky migrující během embryonálního vývoje vytváří matrice bohaté na hyaluronan. Periferní oblasti v lidském karcinomu prsu obsahují vyšší množství hyaluronanu než centrální oblasti tumoru. Buněčně spřažené hyaluronan vazebné proteiny mají také funkci receptorů indukující proliferaci v některých buňkách a za některých okolností. Isoforma CD44 podporuje migraci nádorových buněk na povrch hyaluronanového pláště. Hyaluronan může ovlivnit motilitu ras - transformovaných fibroblastů prostřednictvím souhry s RHAMM. V některých buněčných typech se CD44 účastní v procesu absorpce a degradace hyaluronanu. Vliv hyaluronanu je podobný v sekundárních ložiskách (metastázách) a v primárních tumorech. Slabě metastazující buňky exprimují asi dvakrát větší množství hyaluronan vazebných proteinů než vysoce metastázující buňky a váží hyaluronan s vysokou afinitou na rozdíl od vysoce metastazujících buněk. Z toho lze soudit, že nízká adheze k hyaluronanu a nízká afinita jsou podmínky pro oddělení metastázujících buněk. K rozvoji nádorového onemocnění přispívá poškozená funkce imunitního systému. Ten je zodpovědný za identifikaci a následnou destrukci nádorových buněk. Hyaluronan má potenciální imunosupresivní účinky in vitro. Potlačuje

transformaci lymfocytů, blokuje

destrukci normálních fibroblastů lymfocyty a zvyšuje rezistenci nádorových buněk vůči buňkám imunitního systému. Ještě zbývá mnoho pochopit, jakým způsobem se hyaluronan účastní ve vývoji nádorových onemocnění. 14

Hyaluronan je však zahrnut ve všech aspektech chování nádorové buňky. Adheze hyaluronanu je zprostředkována u mnoha buněk vazebnými místy nebo receptory jako je CD44. Proliferace je v některých případech snížena přímo hyaluronanem. V ostatních případech může být omezena redukcí aktivity růstových faktorů prostřednictvím jejich vazby k hyaluronanu. Oligosacharidy odvozené z hyaluronanu se mohou vázat k CD44 na membráně endotelových buněk, což umožňuje angiogenezi, aktivaci buněčné proliferace a migrace. Buněčná migrace je zřejmě podpořena hyaluronanem, jak při vývoji normálních tkáních, tak i při procesu metastázování nádorových buněk. Schopnost invaze a tvorby metastáz nádorových buněk závisí na uvolnění hyaluronanu z matrix (hyaluronidázou), na migraci a rezistenci vůči imunitnímu systémemu. Množství hyaluronanu v tumoru může být zvýšeno syntézou v nádorových buňkách.

Lékařské použití hyaluronanu (1,4) První využití hyaluronanu v medicíně bylo za účelem náhrady vitrózní tekutiny v oční chirurgii na konci 50 let. Používaný hyaluronan se nejdříve získával izolací z lidského pupečníku a poté extrakcí z kohoutích hřebínků. Hyaluronan připravený metodou firmy Pharmacia

se

vyskytuje

pod

obchodním

názvem

Healon

a

běžně

se

používá

v oftalmologických operacích (při transplantaci rohovky, chirurgické operaci katarakty, glaukomu, odchlípené retiny). Ostatní společnosti také vyrábí značky hyaluronanu pro využití v oční chirurgii. Hyaluronan se také používá k léčbě gonartrózy. K tomu se používá jiný hyaluronanový produkt, Artz. Je aplikován v injekční formě do zánětlivého kloubu za účelem zlepšení viskozity synoviální tekutiny. Působí pozitivně na chondrocyty, zvlhčuje kloub a zprostředkovává analgetický účinek. Protizánětlivý efekt může být způsoben aktivitou exogenního

hyaluronanu,

který

funguje

jako

lapač

uvolněných

prostaglandinů,

metaloproteináz a jiných bioaktivních molekul. Antiedematózní efekt může souviset s ovlivněním osmotické aktivity. Hyaluronan se strukturou zesítěnou kovalentními vazbami Synvisc (Biomatrix), s lepšími viskoelastickými vlastnostmi se také používá ke stejným účelům. Vzhledem k vysoké biokompatibilitě a přítomnosti hyaluronanu v extracelulární matrix tkání se často hyaluronan používá v tkáňovém inženýrství.

15

U některých typů nádorového bujení plasmatické koncentrace hyaluronanu odpovídají malignitě a prognóze tumoru. Hyaluronan může sloužit jako nádorový marker u nádoru prostaty a prsu. Hyaluronan lze také využít v léčbě zánětlivých procesů v ortopedii, dermatologii a oftalmologii. Signifikantního zlepšení klinických parametrů je dosaženo použitím hyaluronanu v léčbě osteoartritidy kolen a revmatoidní artritidy a při kataraktě. Příznivý efekt na stav dásní má aplikace gelu s obsahem hyaluronové kyseliny, čehož se využívá v léčbě plakem indukované gingivitidy. Za tento jev jsou zodpovědny antiedematózní a protizánětlivé účinky této látky.

Použití hyaluronanu v estetické medicíně (3,6) Kyselina hyaluronová hraje zásadní roli ve fyziologii kůže, v její strukturální funkci a regeneraci. Má výjimečně vysokou schopnost vázat vodu a vyplňuje prostor mezi buňkami, kterým tak umožňuje vytvářet prostor k jejich dělení a metabolickým funkcím. Během fyziologického stárnutí a také při některých onemocněních způsobených zevními vlivy (jako např. expozice UV světlu nebo expozice lékům) dochází k poruše její normální funkce a snížení schopnosti hojení. Experimentální a klinické pokusy ukazují, že takové změny jsou provázeny snížením koncentrace volné kyseliny hyaluronové v kůži. Po intradermální aplikaci exogenní kyseliny hyaluronové dochází k úpravě těchto poruch. Předpokládá se, že vyšší koncentrace kyseliny hyaluronové aktivuje desmosomy, a tak umožňuje permanentní obnovu keratinocytů. Po buněčném dělení keratinocyty zůstávají buď v bazální vrstvě nebo se pohybují do vyšších vrstev epidermis a podléhají terminální diferenciaci a keratinizaci. Kyselina hyaluronová oddaluje terminální diferenciaci, navíc efektivně váže volné radikály, proto může chránit epidermis před škodlivými účinky aktivovaných kyslíkových radikálů produkovaných UV zářením. S přibývajícím věkem dochází k pevnější vazbě mezi SH skupinou v pokožce a hyaladheriny, která redukuje zásobu „volné“ kyseliny hyaluronové. V závislosti na věku také klesá koncentrace SH skupin ve vrchních vrstvách epidermis, ale koncentrace k. hyaluronové je v hlubších vrstvách vyšší. U starých lidí je SH pouze v horní dermis, což vysvětluje suchost a omezenou schopnost hojení ve vyšším věku.

16

K. hyaluronová vpravená do kůže podporuje fyziologickou funkci této endogenní látky v extracelulární matrix, která zda vyplňuje prostor mezi buňkami a působí jako prostředí absorbující vodu. Tím se struktura extracelulární matrix stává jemnější, umožňuje lépe migraci buněk. Kyselina hyaluronová se aplikuje ve formě průhledného gelu injekčním způsobem do kůže v oblasti, kterou chceme korigovat, v množství potřebném pro vyrovnání kožního povrchu. Látka se absorbuje všemi vrstvami kůže a dosáhne podkoží (koria) do 30. minut. Navíc je absorbována buňkami dolní části pokožky, koria a endotelem lymfatických cév. Exogenní kyselina hyaluronová je následně metabolizována jako endogenní a vyloučena. Cílového efektu je dosáženo po několika aplikacích. Každá injekce je většinou bolestivá. Abychom tomu zamezili, provádí se aplikace gelu u většiny lokalit v místním znecitlivění, pak je ošetření takřka nebolestivé. Klientce v polosedě je aplikován gel do kůže pomocí velmi tenké jehličky. Zákrok trvá zhruba 30 - 45 minut a po ukončení jsou v ošetřených partiích patrný mírný otok a zarudnutí, které do 1 - 2 dnů vymizí. Na trhu je k dispozici několik variant přípravků s různou velikostí částic gelu, z nichž některé jsou vyráběny pro jemné vrásky v okolí očí, např. Restylane Fine Lines, jiné pro vrásky kolem úst, jako je Restylane či Teosyal. Pro hluboké vrásky je určen např. přípravek Perlane. Dále se kyselina hyaluronová využívá ke korekci drobných asymetrií obličeje, při zvýraznění či zvětšení rtů a při úpravě jizev. Přípravky s kyselinou hyaluronovou není nutné předem testovat, což je naopak nezbytné u kolagenových preparátů.

Obr. 3: Kožní implantát v injekční formě používaný při korekci vrásek obličeje a modelaci rtů

17

Radioaktivní značení kyseliny hyaluronové (8,9,12) Radioaktivní

značení

se

provádí

za

účelem

stanovení

farmakokinetických

charakteristik kyseliny hyaluronové nebo za účelem identifikace hyaluronan vazebných proteinů, které jsou strukturní součástí extracelulární matrix nebo mají funkci receptorů nalézajících se na povrchu mnoha buněk a prostřednictvím nichž kyselina hyaluronová zprostředkovává důležitou roli v organismu. Existuje několik metod pro přípravu radioaktivně značené kyseliny hyaluronové. Biochemická syntéza je založena na schopnosti živých organismů produkovat z jednoduchých organických sloučenin biochemickými procesy radioaktivně značený materiál. Biochemické syntézy se používá v případě, kdy jinými metodami nelze danou sloučeninu připravit nebo je její příprava velmi složitá a obtížná. Při biochemické syntéze je radioaktivní prekurzor např. 14

C - glukoza obsažen v kultivačním prostředí a živými mikroorganismy je zabudován do

metabolitů tvořených metabolickými pochody. Následně je tento metabolit chemicky separován. Tímto způsobem lze připravit kyselinu hyaluronovou značenou izotopem uhlíku 14

C. Jiným způsobem je izotopová výměnná reakce, při které je stabilní atom organické

sloučeniny nahrazen svým radioaktivním izotopem, jako v případě radioaktivního značení kyseliny hyaluronové triciem

3

H. Dále můžeme navázat na molekulu vhodný ligand

(Tyramin) například na aminoskupinu po deacetylaci v N–acetyl–D-glukosaminu nebo navázat modifikovanou chelatační skupinu na karboxyl glukuronové kyseliny. I když několik metod pro značení hyaluronové kyseliny již bylo publikováno, příprava kyseliny hyaluronové o vysoké molekulové hmotnosti s vysokou specifickou aktivitou stále představuje nevyřešený problém. Biosyntetické metody, ve kterých je hyaluronová kyselina syntetizována z radioaktivního prekurzoru (glukózy nebo N – acetylglukosaminu) přidaného k buňkám nebo tkáňovým kulturám, jsou obvykle laboratorní, užitečné a s výtěžností limitovaného množství HA často neznámé specifické aktivity.

18

Značení hyaluronanu triciem 3H (8) Radioaktivní značení je velmi důležitá technika, která se používá v biomedicinském výzkumu k identifikaci, izolaci, k charakterizaci exprese a vlastností endogenních látek v biologických systémech. Pro tyto účely je vhodné používat pro značení kyseliny hyaluronové tricium. Značení molekul triciem se také využívá v radioimunologické analýze. Je to čistý beta zářič s poločasem rozpadu 12, 3 roku. K měření aktivity nízkoenergetického zářiče beta se používá tzv. kapalný scintilátor, což jsou roztoky nebo suspenze organických scintilátorů v organických rozpouštědlech (toluen, xylen, dioxin a další). Vzorky radioaktivních látek se rozpouštějí nebo suspendují v roztoku obsahujícího dvě fluorescenční látky (primární a sekundární scintilátory). Část kinetické energie ionizujícího záření je převáděna na fotony viditelného záření, které jsou snímány fotonásobičem a převáděny na elektrické impulzy. Existují dvě metody pro přípravu 3H - kyseliny hyaluronové. V prvním případě lze vodíkové atomy v molekule nahradit triciem. Tato izotopová substituce se provádí v přítomnosti Pd/CaCO3 jako katalyzátoru. V druhém případě je molekula kyseliny hyaluronové alkylována s 3

H - methylbromidem o vysoké specifické aktivitě (1, 5 TBq/mmol) ve vodném roztoku amoniaku.

Reakce probíhá při teplotě - 33, 5 ˚C. Substituce vodíkových atomů v molekule triciem (8) Kyselina hyaluronová izolovaná z kohoutích hřebínků (10 mg) byla rozpuštěna ve 0, 5 ml vody. K roztoku v reakční baňce (o objemu 1 ml) bylo přidáno 10 mg (10 %) Pd/CaCO3 ve funkci katalyzátoru. Reakční baňka vybavená magnetickým míchadlem byla připojena k aparatuře. Baňka byla chlazena tekutým dusíkem a aparatura byla evakuována. Nosič volného plyného tricia (200 GBq) byl přemístěn do reakční baňky Toeplerovou pumpou a reakční směs byla míchána 100 minut při pokojové teplotě. Obsah baňky byl zmrazen a zbytek tricia byl navrácen do reservoáru. Voda a nenavázané tricium byly odstraněny lyofilizací v uzavřeném systému. Redestilovaná voda (2 ml) byla přidána k produktu a katalyzátor byl centrifugován. Voda a zbytek nestabilně navázaného tricia byly odstraněny opakovanou lyofilizací v uzavřeném systému. Vzorek byl poté přečištěn gelově - permeační chromatografií (GPC) a analyzován kapalinovou scintilační spektrometrií (LSC).

19

Alkylace molekuly 3H - methylbromidem (8) Ethanol (0, 6 ml) a diethylether (9 ml) byly přidány do vodného roztoku hyaluronové kyseliny (5 mg HA v 0, 5ml redestilované vody). Bílá suspenze byla odpařena ve vakuu na konstantní hmotnost. Reakční aparatura byla naplněna bezvodým amoniakem a poté připojena k reakční baňce. Bezvodý amoniak (3 ml) byl přidán do baňky destilací a směs byla míchána tyčinkou a udržována pod teplotou - 33, 5 ˚C. Sodík (2 mg) byl přidán ke směsi. Po odbarvení modré směsi, bylo přidáno 5 GBq 3H - methylbromidu (rozpuštěného v 0, 5 ml toluenu). Reakční směs byla míchána 1 hodinu. Amoniak byl odpařen a residuum bylo rozpuštěno v redestilované vodě. Roztok byl odpařen ve vakuu do konstantní hmotnosti. Reziduum bylo rozpuštěno opět v redestilované vodě a po frakcionaci pomocí GPC byla provedena analýza prostřednictvím gelově – permeační chromatografie a kapalné scintilační spektrometrie. Analýza produktu a výsledky (8) Pro izolaci a charakterizaci

3

H - hyaluronanu se používá gelová permeační

chromatografie. Pro kalibraci chromatografického systému se použily hydroxyethylové standardy v rozmezí molekulových hmotností Mw 54, 8 - 937 kDa. Parametry molekulových hmotností pro označené biopolymery byly: Mw = 128 kDa, Mw/Mn = 1, 88 (v první metodě) a Mw = 268 kDa, Mw/Mn = 1, 55 (v druhé metodě). Chromatografie byla provedena při pokojové teplotě. Vzorky obsahující označený i neoznačený hyaluronan byly inkubovány se specifickou testikulární hyaluronidázou a produkty byly analyzovány. Enzymatický rozklad vzorků hyaluronátu byl proveden v 0, 067 M fosfátovém pufru (pH 7, 4) při teplotě 37 ˚C. Roztok hyaluronidázy (1 ml, 1600 nkat) byl přidán k 1 ml roztoku hyaluronátu (1 mg) a směs byla inkubována 24 hodin. Rozklad byl ukončen zahřátím směsi 5 minut ve vroucí vodní lázni. Po ochlazení na pokojovou teplotu, každý vzorek byl centrifugován a supernatanty byly analyzovány pomocí GPC a scintilační spektrometrie. Indikátorem enzymatického rozkladu vzorku byl pokles hmotnosti materiálu. Každá metoda poskytuje jiné výsledky. Metoda 1), ve které vodíkové atomy byly nahrazeny triciem poskytuje výtěžnost 3H - hyaluronanu o specifické aktivitě 20 MBq/mg. Chromatografickou separací získali autoři tři frakce radioaktivně značeného hyaluronátu (Obr. 4). Přibližné hodnoty molekulové hmotnosti derivátu 3H - hyaluronanu jsou znázorněny v tabulce č. 1. Na základě těchto výsledků lze soudit, že použitím této metody radioaktivního značení je zahájen degradační proces.

20

Výsledkem tohoto procesu není pouze získání frakcí s nízkou molekulovou hmotností, ale také se zvětší polydisperzita molekulových hmotností jednotlivých frakcí. Větší množství aktivity bylo nalezeno v nízkomolekulárních formách značené kyseliny hyaluronové. Tabulka č. I: Molekulové hmotnosti frakcí derivátu 3H-hyaluronové kyseliny připravené metodou č. 1

a)

Frakce

Mw, kDaa

Mw/Mnb

1

128. 00

1. 88

2

13. 50

1. 37

3

1. 26

1. 31

Mw znamená průměrnou molekulovou hmotnost, b) Mw/Mn je stupeň polydisperzity

Metoda 2) ve které původní kyselina hyaluronová o vysoké molekulové hmotnosti byla podrobena alkylaci s 3H – methylbromidem při - 33, 5 ˚C, výtěžnost radioaktivně značeného vzorku činila zhruba 80 MGq/mg specifické aktivity. Když 3H - methyl bromid měl specifickou aktivitu (1, 5 TBq/mmol), specifická aktivita výsledného vzorku hyaluronátu byla také vysoká. Chromatografickou separací vzorku byly získány pouze dvě frakce radioaktivně značeného hyaluronátu (obr. 5).

Obr. 4: Chromatogram 3H-HA

Obr. 5: Chromatogram 3H-HA

připravené metodou č.1

připravené metodou č.2

(V je eluční objem, a je aktivita 3H)

Parametry molekulové hmotnosti těchto frakcí jsou uvedeny v tabulce č. II. Objevují se významné odlišnosti v distribuci aktivity tricia ve vzorcích hyaluronanu připravených různými metodami.

21

Zatímco frakce vzorku hyaluronátu o vysoké molekulové hmotnosti připravená metodou č. 1) měla malou hodnotu radioaktivity, frakce vzorku hyaluronátu o vysoké molekulové hmotnosti připraveného metodou č. 2) vykazovala velké množství radioaktivity. Obr. 5 ukazuje distribuci radioaktivity ve vzorku připraveného metodou č. 2. Tabulka č. II: Parametry molekulové hmotnosti frakcí derivátů 3H-hyaluronové kyseliny připravené metodou č. 2)

Frakce

Mw kDaa

Mw/Mnb

1

268. 00

1. 55

2

1. 26

1. 32

a) Mw znamená průměrnou molekulovou hmotnost, b) Mw/Mn je stupeň polydisperzity Frakce 3H - hyaluronanu o vysoké molekulové hmotnosti připravené podle metody č. 2 a separované 3

od

nízkomolekulárních

produktů

může

poskytnout

radioaktivně

značenou

H - hyaluronovou kyselinu k metabolickým a enzymatickým experimentům, stejně tak může být

takto značená kyselina hyaluronová použita ke studiím zaměřené na interakci hyaluronanu s jinými biologickými makromolekulami. Tato frakce je již charakterizována specifickým rozkladem hyaluronidázou (E.C.3.2.1.35). Rozkladem radioaktivně značeného vzorku enzymem vznikly stejné produkty o nízké molekulové hmotnosti jako v případě vzorku obsahujícího neoznačenou hyaluronovou kyselinu (Obr.6). Z těchto zjištěních lze usuzovat, že proces značení nezpůsobuje podstatné změny ve struktuře molekuly hyaluronanu. Posun chromatografického peaku radioaktivně značené HA ve srovnání s neoznačenou HA může být způsoben rozkladem HA během procesu značení.

Z výsledků jasně vyplývá, že nově navržená metoda radioaktivního

3

značení hyaluronátu H - methylbromidem je procedurou první volby.

22

Obr. 6: Chromatogramy derivátu HA před (plná čára) a po enzymatické úpravě (přerušovaná čára). a) profil refraktivity, b) profil radioaktivity. V je eluční objem, a je aktivita 3H, r je

odpověď refraktometrického detektoru

Studium absorpce, distribuce, metabolismu a exkrece kyseliny hyaluronové produkované baktériemi (9) Pro účely použití roztoku hyaluronanu získaného činností bakterií v oční chirurgii byla provedena studie zabývající se metabolismem a farmakokinetickými vlastnostmi materiálu biosynteticky značeného uhlíkem 14C aplikovaného dvěma druhům laboratorních zvířat, krysám a králíkům. Studie se skládala ze studií absorpce materiálu po aplikaci do oční komory králičího oka, distribuce a metabolismu materiálu aplikovaného intravenózně krysám a králíkům a ze studie exkrece provedené na krysách. Radioaktivní značení hyaluronanu sodného uhlíkem - 14 (9) Radioaktivně značená HA uhlíkem

14

C byla připravena bakteriální fermentací s využitím

glukózy jako zdroje radioaktivně značeného uhlíku. Zásobní roztok

14

C - HA se skládal ze

sterilního roztoku 1 % hyaluronanu sodného, 0, 14 M NaCl a 0, 01 M fosforečnanu sodného o pH 7, 4. Specifická radioaktivita byla 2, 88 x 107 cpm/mg a průměrná molekulová hmotnost změřená viskozimetrií byla 2, 8 x 106 daltonů. Ve všech studiích intravenózní aplikace se zásobní roztok používal v ředěném stavu. Pro účely intraokulární aplikace byl zásobní roztok s 1 % neoznačeným roztokem HA o totožné molekulové hmotnosti.

23

14

C - HA smíchán

Biologické studie (9) Studie intravenózní aplikace provedená na králících Dva králíci byli anestezováni intramuskulární aplikací hydrochloridu xylazinu (3 mg/kg) a hydrochloridu ketaminu (35 mg/kg). Roztok značené HA (7, 2 x106 cpm ve 2 ml) byl aplikován do ušní žíly a byly odebírány krevní vzorky z kanyly upevněné ve femorální žíle do injekčních stříkaček obsahující EDTA v 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 30 a 60. minutě po aplikaci. Krevní vzorky byly chlazeny ledem. Na konci 60. minuty, zvířata byla usmrcena intravenózním podáním nembutalu. Játra byla vyjmuta a skladována v chladu.

Studie intravenózní aplikace provedená na krysách Třicet devět krys bylo rozděleno do 13 skupin po třech. Krysy byly anestezovány xylazinem a ketaminem.Radioaktivně značená HA (983, 000 cpm v 0, 5 ml) byla aplikována intravenózně. Krevní vzorky byly odebírány kardiální punkcí po 2, 5, 7, nebo 15 minutách, nebo z aorty ( 5 - 6 ml) po uplynutí 10, 20, 30, 60 minut nebo po 4, 8, 24, 48, 72 hodinách. Zvířata byla usmrcena dislokací krčního obratle, různé orgány byly vyjmuty a uskladněny v chladu pro další zpracování.

Studie exkrece provedená na krysách Metabolická komora byla vybavena polypropylen - polykarbonátovým exsikátorem s dvěma plynovými konektory na vrchní straně a otvorem pro moč na spodní straně přístroje. Drátěná podlaha sloužila ke sběru exkrementů. Potrava a voda byly společně umístěny v imobilním kontejneru uvnitř komory. Vzduch proudil komorou a byl nasáván dvěma sériově spojenými trubkami obsahující ethanolamin pro vychytávání radioaktivního CO2. Krysy byly umístěny do metabolické klece poté, co jim byl intravenózně aplikován roztok (1 x 106 cpm v 0, 5ml). Nádoby s ethanolaminem absorbující

14

14

C - HA

CO2 sloužily jako vzorky a byly

odebírány ve 2., 4. a 8. hodině po aplikaci. Ve 24., 48. a v 72. hodině byl ethanolamin nahrazen čerstvým materiálem. Moč byla sbírána po 8, 24, 48, a 72 hodinách. Vzorky s ethanolaminem byly určeny k přímému měření aktivity, vzorky s močí byly zpracovány způsobem popsaným níže.

24

Studie intraokulární aplikace provedená na králících Dvě studie byly provedeny s nitrooční aplikací materiálu. První studie byla provedena za účelem studia farmakokinetických parametrů eliminace látky z přední oční komory a metabolismu residuální HA, zatímco druhá studie se zabývala identifikací metabolitů HA v krevním řečišti. Zvířata byla anestetezována výše popsaným způsobem a jehlou bylo odebráno 0, 2 ml oční tekutiny z jednoho oka. Injekční stříkačka byla oddělena, jehla byla ponechána na místě a 0, 2 ml 14

C - HA roztoku (10 mg/ml hyaluronanu sodného, 400 000 cpm v 0, 2 ml) bylo aplikováno. Tento

postup byl zopakován i na druhém oku. Zvířata byla usmrcena v 0, 1, 5, 15, 24, 34, 48 a 72. hodině, obsah získaný z přední oční komory každého oka byl odstraněn pomocí jehly a poté dvakrát promyt s 0, 3 ml fyziologického roztoku. Oční tekutina a oční tekutina s aplikovaným vzorkem byly smíchány a analyzovány. V druhé studii, 14C - HA o vysoké specifické aktivitě (0, 2 ml s obsahem 10 mg/ml NaHA, 4 x 106 cpm) byl aplikován do obou očí dvěma králíkům, jak bylo popsáno výše, a krevní vzorky byly odebírány z ušní žíly ve 1., 3., 5., 8., 11., 15.5., 24., 32., 50. a 74. hodině po aplikaci. Vzorky byly zpracovány stejným způsobem jako v intravenózní studii. Úprava vzorků (9) Krevní vzorky Krev byla odebírána do stříkaček obsahující EDTA. Plazma byla separována centrifugací a promíchána s roztokem neoznačeného hyaluronanu sodného v 3 M NaCl. Část byla odebrána pro analýzu radioaktivity scintilační spektroskopií. Jiná frakce byla smíchána s 70 % ethanolem. Supernatant byl po oddělení precipitátu po centrifugaci analýzován gelovou permeační chromatografií. Zbytek plazmy byl skladován při - 20 ˚C pro následnou analýzu. Vzorky tkání Zmrazené tkáně byly homogenizovány při 4˚C v roztoku obsahujícím neoznačený hyaluronan sodný, který byl použit pro zpracování plazmy. Vzorky byly posléze centrifugovány po dobu 20 minut, část supernatantu byla odebrána pro měření před a po vzniku precipitátu s ethanolem. Předběžnými výsledky bylo zjištěno, že více než 90 % radioaktivity bylo získáno z vodného roztoku. Extrakty byly uchovávány zmrazené při – 20 ˚C pro další zpracování. Vzorky s obsahem moči Moč byla smíchána s roztokem neoznačeného hyaluronanu sodného a zpracována stejným způsobem jako plazma. 25

Vzorky s obsahem oční tekutiny Vzhledem k poměrně vysoké koncentraci NaHA v tekutině nebylo přidáno žádné množství neoznačeného hyaluronanu sodného a vzorky byly následně zpracovány způsobem popsaným výše.

Výsledky studií (9) Vzorky z různých experimentů byly analyzovány gelovou permeační chromatografií. Sloučené frakce získané gelovou chromatografií byly zkoncentrovány na přibližný objem 100 µl, pH bylo upraveno přidáním 50 mM acetátového pufru o pH 5, 5 a vzorky byly inkubovány s hyaluronidázou při 37 ˚C po dobu 24 hodin. Hydrolyzáty byly uchovávány při – 20 ˚C pro následné zpracování. Inkubace s hyaluronidázou byla provedena za účelem objasnění chemické struktury vysokomolekulárních metabolitů. Absorpce:

Pro účely použití NaHA v oční chirurgii byla provedena studie s radioaktivně

značeným NaHA introkulárně aplikovaným do přední oční komory králíka. Obr.10 znázorňuje eliminaci 1 % roztoku NaHA z přední oční komory králičího oka. Eliminace probíhá kinetikou 1. řádu během 24 hodin s biologickým poločasem 10, 5 hod. 48 hodin po aplikaci množství 14C - HA přítomné v oku činí 0, 4 % aplikované dávky a 72 hodin po aplikaci se v oční komoře nevyskytuje žádný radioaktivně značený materiál. Způsob eliminace z přední oční komory závisí na objemu aplikované látky a na molekulové hmotnosti polymeru. S ohledem na rozdílné podmínky experimentu je zřejmé, že rychlost eliminace produktu získaného činností bakterií

se

významně

Chromatografická analýza

neliší

od

materiálu

získaného

extrakcí

z kohoutích

hřebínků.

rezidua materiálu ve vodných tekutinách odhalila, že nedochází

k žádnému místnímu rozkladu. Tyto vzorky jsou plně rozložené hyaluronidázou. NaHA se eliminuje z přední oční komory přes angulární vodní plexus a řasnaté tělísko duhovky a poté se objevuje v krevním řečišti během několika hodin. Z obr. 11 , který znázorňuje farmakokinetické chování radioaktivně značeného materiálu v plasmě vyplývá, že v průběhu prvních hodin koncentrace v plasmě rychle vzrůstala až na maximální hodnotu 24 hodin po aplikaci, kde činila 1 g/ml plasmy (2, 5 % aplikované dávky) a poté hodnota zůstala konstantní následujících 48 hodin. Autoři tento průběh vysvětlují přítomností části aktivity v precipitátu s ethanolem (spolusrážení při deproteinaci vzorku). Výsledné plazmatické hladiny byly nízké, což lze vysvětlit rychlou eliminací z krevního oběhu.

26

Intravenózně aplikovaný materiál byl rychle eliminován z krevního oběhu krys a

Distribuce:

králíků. Obrázek 8 představuje farmakokinetické chování roztoku 14C – HA v krevním oběhu krys po intravenózní aplikaci. Prvních 20 minut hodnoty celkové radioaktivity HA byly podobné hodnotám naměřených u králika. Biologický poločas při využití jednokompartmentového modelu byl 3, 7 minut. Po uplynutí této doby plasmatické hladiny vzrůstaly, v 60. minutě dosáhly maxima a poté klesaly. Autoři vysvětlují tento nárůst aktivity částečnou přítomností aktivity v precipitátu s ethanolem. Poločas eliminace u králíků činí asi 5 minut, což přibližně odpovídá hodnotám eukaryotické HA. Obrázek 7 zobrazuje farmakokinetické chování roztoku

14

C - HA aplikovaného

králíku. Jak je patrné, hodnoty radioaktivity v plazmě klesaly významně v prvních 15 minutách na 6 – 8 % počáteční hodnoty. Více než 90 % této radioaktivity bylo obsaženo v precipitátu v roztoku neoznačené HA ethanolem. V průběhu 15 - 60 minut po aplikaci se hodnota celkové radioaktivity snížila a poté znovu vzrostla. Tato radioaktivita není způsobena precipitátem neoznačené HA. Vzrůst a následný pokles plasmatické radioaktivity jak u krysy, tak i u králíka 20 - 30 minut po intravenózní aplikaci (obr. 7) je neobvyklý pro většinu látek a může představovat uvolnění metabolizovaného hyaluronátu z jater, a tak prostřednictvím enterohepatálního oběhu se látka dostává znovu do plazmy. Tato hypotéza souhlasí s rychlou počáteční akumulací a následným poklesem radioaktivity v játrech po 20 minutách a s chemickou povahou metabolitů v játrech. Hyaluronan se nevyskytoval v rozložené formě v různých orgánech s výjimkou jater, kde dochází

k metabolismu. Tento model distribuce je konsistentní s modelem popsaným u

eukaryotické HA. Metabolismus a exkrece:

Vzorky plasmy odebrané v 1., 10., 30. a 60. minutě po aplikaci byly

analyzovány chromatografií GPC. Z výsledků vyplývá, že v prvních 10 minutách většina radioaktivity pochází z vysokomolekulární HA. HA postupně zkracuje délku svého řetězce a je rozložena na dvě minoritní jednotky v 60. minutě. Chromatografická analýza jaterních extraktů odhalila, že v 60. minutě většina radioaktivity pochází od nízkomolekulárních sloučenin. Z analýzy radioaktivity v krvi vyplývá, že vzrůstá molekulová hmotnost značených metabolitů po 24 hodinách. Za účelem určení chemické struktury vysokomolekulárních metabolitů byla frakce získaná z kolony 4 hodiny po aplikaci vystavena působení hyaluronidázy a poté byla znovu provedena chromatografie. Stejným způsobem byla upravena frakce vzorku 5 minut po aplikaci. Z výsledků na obrázku č. 9 vyplývá, že zatímco většina vysokomolekulárního materiálu nalezená v krysí plasmě krátce po aplikaci podléhá enzymatickému štěpení, většina metabolitů objevující se v plasmě 4 hodiny po aplikaci je resistentní na působení hyaluronidázy. 27

Intravenózně aplikovaný materiál byl významně eliminován z oběhu prostřednictvím jater, kde došlo k rozkladu absorbované HA na oligomerní sacharidové řetězce, které byly následně znovu utilizovány v metabolismu cukrů a inkorporovány do nových vysokomolekulárních molekul. Hodnoty v játrech klesaly, z čehož vyplývá, že dochází k aktivnímu metabolismu absorbovaného materiálu. Část radioaktivity byla dále nalezena ve slezině, srdci a ledvinách a dosahovala maxima 1 hodinu po aplikaci (2, 6, 1, 4 a 1, 26 %). Obrázek 9 představuje model exkrece

14

C - radioaktivity po intravenózním podání

14

C - HA. Jak je patrné, většina materiálu (70 %) se vyloučuje z organismu plícemi ve formě

radioaktivního CO2, zatímco malá část (22 %) se vylučuje z těla močí. Více než 90 % materiálu bylo odstraněno během 72 hodin. Určitá část radioaktivně značeného materiálu v moči (přibližně 65 %) byla vysrážena s neoznačenou HA ethanolem, což ukazuje na přítomnost metabolitů o vysoké molekulární hmotnosti. Studie provedená na dvou živočišných druzích, prokázala, že absorpce, distribuce, metabolismus a exkrece materiálu získaného biotechnologicky odpovídá výsledkům studíí prováděných s eukaryotickou HA.

Obr. 7: Farmakokinetické hodnocení intravenózně aplikovaného materiálu králikům.

28

Obr. 8: Farmakokinetické chování v plazmě po i.v. aplikaci 14C-HA krysám. Body a vertikální závorky v hlavním grafu znázorňují standardní chybu. Body ve vloženém grafu znázorňují individuální hodnoty radioaktivity přítomné v precipitátu ethanolem

Obr. 9 Kinetika exkrece 14C-HA i.v. aplikovaného krysám. Body a meze reprezentují hodnoty získané ze dvou zvířat

29

Obr. 10: Pokles hladiny hyaluronanu sodného po podání 0, 2 ml roztoku 1 % NaHA do přední oční komory králíka. Body a meze znázorňují způsob a rozsah s ohledem na procentuální zastoupení residuální HA v oční komoře obou očí.

Obr. 11: Kinetika 14C-HA (0,2ml 1% NaHA) v plazmě po intraokulární aplikaci králíku

30

Značení radioaktivními izotopy halogenů pro účely PET a SPECT (10) Pozitronová emisní tomografie (PET) a jednofotonová emisní počítačová tomografie (SPECT) jsou neinvazivní zobrazovací techniky, které jsou založeny na detekci záření emitovaného radioaktivními nuklidy. Používají se pro detekci distribuce sloučenin in vivo. Radionuklidy, které se používají pro tyto účely jsou izotopy

124

I a

76

Br. Tyto tracery se často

využívají pro účely SPECT a své uplatnění nalézají v in vitro detekčních technikách. Halogeny mohou být zavedeny do molekuly obsahující aktivované aromatické kruhy, např. aminokyselinu tyrosin, oxidativní halogenací. Pro tyto účely můžeme provést konjugační reakci označené prostetické skupiny s příslušnou označenou molekulou. Prostetické skupiny by měly pouze minimálně pozměnit biologickou aktivitu značené molekuly a měly by zvyšovat stabilitu molekuly vůči degradačním procesům a usnadnit exkreci. Radioaktivní halogeny vytváří chemicky stabilní kovalentní vazby s aromatickými skupinami v proteinech a mají vysokou specifickou radioaktivitu. V rámci charakterizace musí být také provedeny určité testy, které potvrdí, že vlastnosti analogu se neliší od původní molekuly. Přímá metoda značení například proteinů s jodem je oxidativní halogenace tyrosinových zbytků. Brom má vyšší oxidativní vlastnost než jod, ale oxidativní bromace se provádí s použitím enzymů ve funkci oxidačních činidel nebo použitím chloraminu - T. Chloramin-T je sodná sůl N-monochlor-p-toluensulfonamidu a působí jako slabé oxidační činidlo. Chloramin-T oxiduje jod na elektrofilní I+, který se pak naváže na molekulu. Metoda poskytuje vysokou výtěžnost značení, ale oxidační podmínky mohou ztížit proces separace enzymu od značeného produktu. Proteiny označené oxidativní jodací na tyrosinu mohou často podléhat dehalogenaci in vivo. Pro čištění značených produktů se rutinně používá kapalinová chromatografie (LC) a extrakce na pevných fázích (SPE). LC se také používá k identifikaci, ke kvantifikaci s použitím UV a radiometrického detektoru pro srovnání retenčního času označené substance se standardem. LC - MS je důležitá metoda k detekci sloučeniny podle molekulové hmotnosti. Značení kyseliny hyaluronové 124I (10) Při procesu značení kyseliny hyaluronové je třeba nejdříve molekulu derivatizovat, protože zatím nebyla vynalezena metoda pro přímou halogenaci molekuly. Konjugační značení probíhá ve dvou krocích a často je výtěžnost nižší ve srovnání s metodou přímého značení.

31

Výhodou konjugačního značení jsou mírné reakční podmínky a také zvýšená stabilita vůči dehalogenaci in vivo způsobené enzymy. Hyaluronová kyselina je radioaktivně značená jodem reakcí tyraminu s terminálním aldehydickou skupinou následovanou oxidativní jodací skupiny tyraminu. Vysokomolekulární kyselina hyaluronová je značena jodem po aktivaci polysacharidu pomocí bromkyanu. Poté následuje konjugační reakce tyraminem a jodace. Vzhledem k možnosti velkého počtu vazebných míst v molekule, které mohou být jodovány, získáme sloučeninu s vysokou specifickou radioaktivitou. N - deacetylace provedená hydrazinolýzou amidové skupiny zpřístupňuje aminové skupiny k derivatizaci tyramin - celobiosou a následné jodaci. Hyaluronová kyselina také může být značena izotopem s krátkým poločasem rozpadu

11

C

11

(T1/2 =20 min) s použitím ( C) CNBr. Značení hyaluronanu bromem – 76 (10) 76

Br má poločas rozpadu 16 h a emituje + záření. Pro účely studia distribuce radioaktivně

značeného materiálu se používá pozitronová emisní tomografie. Bromace aktivovaných aromatických kruhů (tyrosinu) je provedena elektrofilním

76

Br+, který vzniká oxidací

chloraminem - T nebo kyselinou peroctovou. Radionuklid se vyrábí ozařováním Cu2Se obohaceného na

76

Se protony v cyklotronu (reakce p, n).

76

Br je získán z ozářeného terče

termochromatografickou metodou ve vodném nebo etanolickém roztoku. Pro získání reprodukovatelných výsledků v procesu značení je vodný roztok

76

Br - bromidu

přečištěn extrakcí na reverzní fázi, aby došlo k odstranění lipofilních složek. Značení vysokomolekulární kyseliny hyaluronové (Mw = 1,5 x 106g/mol) modifikované tyraminem se používá pro studium distribuce látky in vivo pomocí PET. Pro tyto účely není důležitá vysoká hodnota specifické radioaktivity. Specifická radioaktivita je množství radioaktivity na jednotku hmotnosti a také může být vyjádřena jako množství radioaktivity na mol. Metodou lze získat HA o nízké specifické radioaktivitě, ale výhodou této metody je fakt, že hyaluronová kyselina je tak vystavena minimální derivatizaci molekuly. Aldehydický konec hyaluronové kyseliny se podrobí redukční aminaci pomocí tyraminu a kyanborohydridu. Konec pozměněné molekuly se označí oxidativní bromací (chloraminem - T). Značená hyaluronová kyselina se podrobí precipitaci směsí obsahující ethanol : methanol : propanol (90:5:5) nasycené NaCl a provede se centrifugace. Pelet se rozpustí ve vodě a je analyzován gelovou permeační chromatografií.

32

Značení kyseliny hyaluronové konjugací Bolton - Hunterovým činidlem a jodací 125I (11,10) Značení kyseliny hyaluronové také může být provedeno aktivovaným esterem N -hydroxysukcinimidu, což je elektrofil, který může být vázán s aminoskupinami a vytvářet stabilní amidovou vazbu. Prostetická skupina používaná pro konjugační značení v současnosti je N - hydroxysukcinimid ester 3 - (4 - hydroxyfenyl) propionové kyseliny pod názvem Bolton - Hunterovo činidlo. Činidlo může být označeno

125

I a separováno extrakcí rozpouštědlem.

NHS - esterový konec molekuly Bolton - Hunterova činidla reaguje s primárními aminovými skupinami v modifikované molekule HA. hyaluronové

Oligosacharidy

kyseliny,

které

nemají

volné

aminoskupiny

jsou

derivatizovány alkylaminem a následně jsou podrobeny reakci s Bolton - Hunterovým činidlem. Hydroxyfenylový derivát je poté jodován například pomocí Na125I. Touto metodou lze získat obrovská množství hyaluronové kyseliny o vysoké specifické aktivitě. Nebo lze nejdřív provést jodaci Bolton-Hunterova činidla a poté ho navázat na molekulu.

Značení tyramin – celobiosy - hyaluronanu jodem - 125 (12) Pro účely identifikace vazebných míst absorpce sacharidu se provádí

substituce

hyaluronanu hydrolyzovaného hydrazinem tyramin – celobiosou, kterou lze snadno označit

125

I ve

fenolickém kruhu tyraminu. Hyaluronan lze substituovat tyramin - celobiosou na aminoskupinách po předchozí hydrolýze hydrazinem a po N - deacetylaci polysacharidu. Volné aminoskupiny jsou poté znovu acetylovány a karboxylické hydrazidy odstraněny HIO3. 125I - hyaluronan lze připravit buď vazbou radioaktivně značené

125

celobiosy - hyaluronanu

I – tyramin - celobiosy k hyaluronanu nebo značením aduktu tyramin – 125

I. Označený polysacharid, který je minimálně modifikován procesem

značení a pravděpodobně obsahuje nepozměněnou strukturu hyaluronanu mezi substituenty, může být použit při experimentech in vivo ke studiu katabolismu hyaluronanu. Příprava N - deacetylovaného hyaluronanu Výchozí materiál (hyaluronan o vysoké molekulové hmotnosti) je dialyzován a odpařen do sucha. Vzorky polysacharidu (1 %, w/v) se smísí s hydrazinem, který obsahuje 1 % hydrazin sulfát jako katalyzátor.

33

Hydrolýza hydrazinem probíhá v uzavřených skleněných zkumavkách při 100 ˚C v časových intervalech od 30 - 240 min a reakce je ukončena ochlazením. Poté se přidává 1 ml toluenu a směs se nechá odpařit do sucha. Tento krok se opakuje dvakrát, aby došlo k odstranění hydrazinu. Malé množství hydrazin sulfátu se může navázat na aminoskupiny částečně deacetylovaného hyaluronanu. Proto se produkt rozpouští ve vodě a hydrazin sulfát se odstraňuje dialýzou, ultrafiltrací nebo gelovou chromatografií. Přečištěný polysacharid se skladuje při teplotě - 4 ˚C. Příprava aduktu tyramin – celobiozy redukční aminací 3, 42 g (10 mmol) celobiosy, 1, 74 g (10 mmol) tyramin hydrochloridu, 25 µCi 14C – tyramin - hydrochloridu a 0, 73 g (10 mmol) propionové kyseliny se nechá rozpustit ve 40 ml dimethylsulfoxidu. Jiná rozpouštědla jako fosfátový pufr nebo methanol, dříve užívaná v syntéze tyramin - celobiosy, se již nepoužívají, protože nerozpouští celobiosu kompletně. Tyramin hydrochlorid se rozpustí v dimethylsulfoxidu a celobiosa se rozpustí kompletně po 8 hodinách míchání při pokojové teplotě. Během míchání se přidává po kapkách borohydrid sodný rozpuštěný v 15 ml dimethylsulfoxidu. Celou noc se směs nechá míchat tyčinkou při pokojové teplotě a poté je odpařena, abychom dosáhli odstranění 30 % rozpouštědla. Poté se přidává aceton za účelem vytvoření precipitátu celobiosy a tyramin – celobiosy, který je filtrován a smíchán s 200 ml acetonu. Precipitát se rozpouští ve vodě a přečišťuje se iontově - výměnnou gelovou chromatografií. Po promytí vodou tyramin – celobiosa se eluuje 500 ml NH4OH. Výtěžnost této reakce činí více než 95 %. Zbylý amoniak se odstraní lyofilizací. Radioaktivní značení hyaluronanu modifikovaného tyramin – celobiosou (12) Značení tyramin - celobiosy jodem - 125 a následná vazba na hyaluronan Mikroreakční kádinka byla potažena 10 µg 1,3,4,6–tetrachloro–3a,6a-diphenylglycourilu (jodogenu). Následovalo promytí vodou, aby se odstranilo nenavázané činidlo. V nádobce bylo inkubováno 20 nmol tyramin-celobiosy v 1 µl 0, 02 M KH2PO4 (pH 7, 2) a 2 mCi Na125I (20 µl). Inkubace trvala jednu hodinu a směs byla přemístěna do kádinky obsahující 10 µl pyrosiřičitanu sodného a 5 µl 0, 1M KI. K aktivaci aduktu byl přidán chlorid kyseliny kyanurové v 20 µl acetonu a 40 nmol NaOH v 5 µl H2O. Po 30 vteřinách byla přidána kyselina octová v 4 µl H2O, abychom zastavili reakci.

34

10 nmolů výsledného aktivovaného

125

I - tyramin - celobiosového aduktu bylo inkubováno 2

hodiny při pokojové teplotě s 10 µg N - deacetylovaného hyaluronanu v 0, 5 M Tris - HCl, o pH 9, 5. Směs byla odsolena gelovou chromatografií, tím jsme získali čistý označený hyaluronan. Značený hyaluronan byl přidán ke směsi obsahující 25 µl acetanhydridu 4 krát během jedné hodiny při pH nad 7, 5. Tímto způsobem došlo k reacetylaci zbývajících aminových skupin, které neměly navázánu značenou tyramin - celobiosu. Tento reacetylovaný označený hyaluronan byl chromatografován za účelem odstranění solí. Vazba tyramin – celobiosy na hyaluronan a značení tyramin - celobiosa - hyaluronan jodem - 125 .

Hyaluronan po 30 minutové hydrolýze hydrazinem byl inkubován s tyramin - celobiosou 2

hodiny při pokojové teplotě. Výsledný komplex tyramin-celobiosa-hyaluronan byl dialyzován vodou za účelem odstranění volné tyramin - celobiosy a jiných nízkomolekulárních sloučenin. Reacetylace a oxidativní jodace byly provedeny přidáním 1 mCi Na125I k 10 µg modifikovaného hyaluronanu. Odstranění karboxylových hydrazidů. Hydrolýza hydrazinem kromě toho, že způsobuje N - deacetylaci, má za následek také tvorbu hydrazidů v poloze C6 ve zbytku uronové kyseliny. Z tohoto důvodu byl takto hydrolyzovaný hyaluronan upraven HIO3, čímž došlo k přeměně hydrazidů zpět na uronové kyseliny. K ukončení této reakce byl hydrolyzovaný hyaluronan buď před či po substituci tyramin - celobiosou dialyzován nejméně 24 hodin s 0, 25 HIO3 a poté přečištěn dialýzou, ultrafiltrací nebo gelovou chromatografií. Studie rozkladu hyaluronanu hydrazinolýzou 3

H - acetylhyaluronan a hyaluronan označený

14

C v cukerných řetězcích byly podrobeny

hydrolýze hydrazinem v časových úsecích od 30 - 240 minut a analyzovány chromatografií. V těchto experimentech nebyl hydrazin odstraněn odpařením s toluenem a odsolování bylo vynecháno před provedením analýzy. Aktivita

3

H a

14

C byla měřena. Pozice eluovaného

polysacharidu o Mr 10 000 byla určena z kalibračních křivek standardů. Afinita značeného hyaluronanu k vazebnému místu pro hyaluronan v chrupavkovém proteoglykanu K potvrzení zda je modifikovaný polysacharid biologicky rovnocenný neoznačenému hyaluronanu byla testována vazba hyaluronanu k příslušnému proteoglykanu. 35

Značený tyramin - celobiosa - hyaluronan byl smíchán s neoznačeným nosičem (2, 4 mg) na celkový objem 2 ml. 1 ml byl inkubován 6 hodin při 60 ˚C s enzymem hyaluronidázou po smíchání směsi s 0, 1 M octanem sodným a 0, 15 M chloridem sodným o pH 5, 2. Jako kontrolní vzorky byly použity nerozložený a enzymaticky rozložený původní hyaluronan. Směsi byly chromatografovány a frakce byla hodnocena radioaktivita

125

I a analyzována přítomnost uronové

kyseliny. Biologické testy (12) Biotransformace in vivo distribuce 125I - tyramin - celobiosa hyaluronanu Krysy byly anestezovány intraperitoneální injekcí pentobarbitalu (50 mg/kg) a 125

I - tyramin - celobiosa - hyaluronan byl aplikován intravenózně do ocasní žíly. Krevní vzorky o

objemu 25 µl byly sbírány do kalibrovaných zkumavek. Játra byla inkubována s kolagenázou. Byla

hodnocena

kultivovaných

radioaktivita solubilizátů

Kupfferových

buněk,

jaterních

endotelových buněk a parenchymatických buněk. Buňky v kulturách fixovaných glutaraldehydem byly počítány pomocí fázově kontrastního mikroskopu. Ledviny, moč, plíce, slezina a ocas byly odebrány ke stanovení distribuce radioaktivity v těchto orgánech. Analýza metabolických produktů 125I - tyramin - celobiosa - hyaluronanu in vivo u krys Krysám byl aplikován intravenózně

125

I - tyramin - celobiosa - hyaluronan a za 90 minut

byly usmrceny. Játra byla vyjmuta, rozkrájena a část výsledného solubilizátu bylo chromatografováno gelovou chromatografií za účelem zjištění molekulové hmotnosti značených metabolických produktů. Izolace a kultivace jaterních buněk Byly připraveny kultury Kupfferových, jaterních endotelových a parenchymatických buněk. Játra byla inkubována s kolagenózou a suspenze byla centrifugována za účelem získání suspenze

parenchymatických

a

neparenchymatických

parenchymatických buněk byly umístěny do

buněk.

Jednovrstevné

kultury

nádob pokrytých fibronektinem. Suspenze

neparenchymatických buněk obsahovala Kuppferové buňky, jaterní endotelové a hvězdicovité buňky. Buněčná suspenze byla umístěna do nádoby potažené glutaraldehydem s lidským albuminem. Následovala 15 minutová inkubace při 37 ˚C, což vedlo k navázání Kuppferových buněk.

36

Volné buňky byly přemístěny do nádob potažených fibronektinem za účelem vazby s jaterními endotelovými buňkami. Průměrný počet buněk pěstovaných na cm čtvereční byl 0, 5 x 105 Kuppferových buněk, 2, 5 x 105 jaterních endotelových buněk a 1 x 105 parenchymatických buněk. Kultury Kuppferových buněk obsahovaly méně než 1 % jaterních endotelových buněk a 10 % hvězdicovitých buněk. Vazba a absorpce označeného hyaluronanu kultivovanými jaterními endotelovými buňkami. Kultury jaterních endotelových buněk byly promyty a zásobeny čerstvým mediem obsahujícím 1 % hovězí sérový albumin a

125

I – hyaluronan. Inkubace byla provedena při 4 ˚C

(16 h), aby bylo možno určit vazbu, a při 37 ˚C ke změření absorpce. Inhibice vazby a absorpce byla studována v přítomnosti původního hyaluronanu (100 µg/ml). Radioaktivita způsobená buňkami byla změřena prostřednictvím množství traceru, který se uvolnil po promytí kultur směsí 1 % (w/v) dodecylsulfátu sodného a 0, 3 M hydroxidu sodného. Výsledky studií (12) Osud intravenózně podaného 125I – Tyramin – celobiosy - hyaluronanu Hyaluronan upravený 30 minutovou hydrolýzou, který se vyskytuje v krevním oběhu v lidském organismu, má molekulovou hmotnost 1, 4 – 2, 7 x 105. 30 minut po aplikaci pouze 10 % materiálu se vyskytuje v plasmě. Eliminace hyaluronanu z krve po 30 minutové hydrolýze hydrazinem je rychlejší (50 % aktivity bylo vyloučeno v čase 0,9 minut) než hyaluronan hydrolyzovaný 240 minut (50 % bylo vyloučeno v čase 2,8 minut). Prodlužováním doby hydrolýzy se zvyšuje poločas polysacharidu v séru, což také odpovídá skutečnosti, že rychlost eliminace

se snižuje se

zmenšující se molekulovou hmotností hyaluronanu. Analýzou radioaktivity

125

I ve třech hlavních populacích jaterních buněk bylo zjištěno, že

jaterní endotelové buňky obsahují přibližně 80 % ligandu absorbovaného játry. Kuppferovy a parenchymatické buňky obsahují 15 a 5 %. Hlavním místem absorpce hyaluronanu jsou tedy jaterní endotelové buňky. Chromatografií vodného roztoku jaterního extraktu po absorpci hyaluronanu jsme zjistili, že produkty značené

125

125

I – tyramin - celobiosa

I měly nízkou molekulovou hmotnost a menší

hodnoty než materiál rozložený in vitro hyaluronidázou. Zřejmě ligand už byl rozložen nejenom lysosomální hyaluronidázou, ale také exoglykosidázou (hexosaminidázou a glukuronidázou).

37

Vzrůstající dobou trvání hydrolýzy se zvyšuje množství hyaluronanu vylučovaného ledvinami, což lze vysvětlit tím, že delším působením hydrazinu se hyaluronan degraduje na fragmenty menší než 25 000 Da molekulové hmotnosti, což je limit velikosti molekuly pro filtraci v ledvinách u králíka a člověka (18, 19). Vazba a absorpce 125I – Tyramin – celobiosa - hyaluronanu kultivovanými jaterními endotelovými buňkami Kultivované jaterní endotelové buňky váží a absorbují

125

I – tyramin - celobiosa -

hyaluronan prostřednictvím mechanismu, který může být inhibován v přítomnosti neoznačeného hyaluronanu, který se váže na hyaluronanové receptory na povrchu buněk. To lze vysvětlit tím, že nadbytečné množství neoznačeného hyaluronanu soutěží o vazbu na receptory. Tato schopnost neoznačeného hyaluronanu vzrůstá s dobou trvání hydrolýzy. Označený hyaluronan je proto rozpoznáván receptory na povrchu buněk. Množství absorbovaného materiálu se může významně zvýšit, když inkubace probíhá při 37 ˚C.

Stabilita vazby Jodovaná tyramin - celobiosa navázaná na chlorid kyseliny kyanuranové se eluuje ve stejné pozici jako materiál, z čehož lze usuzovat, že produkt obsahuje

125

I - tyramin - celobiosa chlorid

kyseliny kyanuronové. Z chromatografických záznamů vyplývá, že produkt neobsahuje uronovou kyselinu. Materiál se nehromadí v játrech a není absorbován jaterními endotelovými buňkami. Hydrazin způsobuje kromě odstranění N - acetylovaných skupin tvorbu hydrazidů vazbou ke karboxylovým skupinám glukuronové kyseliny. Počet hydrazidů vzrůstá s dobou trvání procesu hydrolýzy. Pokud hydrazin poskytuje amino skupiny, které mohou vázat tyramin - celobiosu, existuje možnost, že tracer se může navázat na hydrazidy a způsobit nestabilitu vazby traceru. Distribuce molekulové hmotnosti tyramin-celobiosa-hyaluronan Analýza tyramin - celobiosou značeného hyaluronanu podrobeného 30 minutové hydrazinolýze zjistila, že Mw a Mn byly 2, 2 – 2, 9 x 105 a 3, 2 – 5, 7 x 104. Jodované produkty uskladněné zhruba 1 měsíc měly molekulovou hmotnost Mw 1, 3 – 1, 7 x 105. Při uskladnění hyaluronanu značeného radioaktivním 125I dochází k rozkladu molekuly. Gelová chromatografie

125

I - označeného tyramin – celobiosa - hyaluronanu odhalila

přítomnost sloučeniny eluující se později než je retenční čas, což nabízí teorii, že vedle efektu molekulového síta působí při chromatografii i proces adsorpce gelovým materiálem.

38

Označený tyramin - celobioso - kyanuran chlorid je eluován ve stejné pozici, a tak pozdní eluující materiál obsahuje tuto sloučeninu, která kvůli aromatickému charakteru je gelem adsorbována. Skladováním radioiodovaného materiálu dochází k radiolytickému rozkladu. Z tohoto důvodu musíme z materiálu odstranit tuto látku, např. pomocí Sephadexu, předtím než se bude používat v metabolických studiích. Degradace tyramin – celobiosy - hyaluronanu streptomycetovou hyaluronidazou 125

I značený a neoznačený tyramin - celobiosa - hyaluronan lze rozložit streptomycetovou

hyaluronidázou. Degradační produkty označené

125

I byly chromatograficky eluovány dříve než

hlavní podíl uronové kyseliny obsahující oligosacharidy. Enzym je také pravděpodobně vyřazen z míst příléhajících k substituentům. Vyřazení rozpoznávajících proteinů přiléhajících k tyramin - celobiosovým zbytkům také vysvětluje snížené rozpoznání afinitním proteinem v hyaluronanovém vzorku a skutečnost, že některé fragmenty nejsou rozkládány in vivo. Účinek hydrolýzy hydrazinem na acetylaci a molekulovou hmotnost hyaluronanu Účinek hydrolýzy hydrazinem na molekulovou hmotnost byl studován využitím hyaluronanu biosynteticky značeného v acetylových skupinách a cukerném řetězci 3H a 14C. Vzrůstající doba trvání této hydrolýzy měla za následek zvýšené uvolňování acetylových skupin a větší redukci délky řetězce. Hydrolýza způsobující N – deacetylaci tak přeměnila karboxylové skupiny na hydrazidy, které způsobily C5 – epimerizaci zbytků uronové kyseliny a β – eliminaci substituentů vázaných k C4. Tím se β (1 - 4) glykosidická vazba v řetězci se rozpadla, což způsobilo redukci délky řetězce hyaluronanu. Hydrazidy obsahovaly aminové zbytky a mohou vázat tyramin – celobiosu ve stejném rozsahu jako nesubstituované aminoskupiny v glukosaminových zbytcích. K vyloučení přítomnosti karboxylových hydrazidů byl produkt upraven přidáním HIO3. Eluční profily uronové kyseliny a profil radioaktivity

125

I značeného materiálu získané ze

záznam z gelové chromatografie 125I značeného a neoznačeného tyramin – celobiosa -hyaluronanu se jevily identické, což dokazuje, že tracer byl stejně distribuován podél polysacharidových řetězců. Stupeň substituce hyaluronanu hydrolyzovaného 30 minut tyramin – celobiosou byl vyšetřován

14

C – značeným tyraminem. Bylo zjištěno, že molekulová hmotnost různých vzorků

hyaluronanu se lišila od 2, 2 – 2, 9 x 105, můžeme si spočítat, že přibližně 5 – 30 molekul tyramin

–

celobiosy

bylo

navázáno

na

molekulu

polysacharidu.

Tudíž

inkorporace

tyramin – celobiosy do molekuly hyaluronanu způsobuje pouze malou modifikaci molekuly.

39

Značení hyaluronanu 125I – tyrosinem pro studie in vitro a in vivo (13) Studie metabolismu polysacharidu hyaluronanu se potýkala s nedostatkem radioaktivního hyaluronanu o vysoké molekulové hmotnosti a vysoké specifické aktivitě. V této studii hyaluronan značený

125

I – tyrosinem (T) byl produkován po předešlé aktivaci polysacharidu CNBr. Hodnota

specifické aktivity byla přibližně 0, 1 MBq. Značení hyaluronanu (13) Hyaluronan (15 mg) byl podroben 5 minutové reakci s 8 mg CNBr v reakčním prostředí o pH 11 a tím došlo k aktivaci polysacharidu. Poté byl polysacharid extrahován z reakční směsi malou kolonou s navázaným Sephadexem. Aktivovaný hyaluronan byl inkubován s 1 mg tyrosinu přes noc. T navázaný na hyaluronan (T – hyaluronan) byl oddělen od neoznačeného T kolonou se Sephadexem nasycenou fosfátovým pufrem (PBS) obsahující NaCl, KH2PO4 a Na2HPO4. Část T – hyaluronanu byla podrobena oxidativní jodaci 0, 3 - 1, 0 mCi

125

125

I. 100 µg T - hyaluronanu a

I bylo umístěno do malé skleněné zkumavky pokryté filmem 10 µg jodogenu.

Nenavázaný 125I byl odstraněn chromatografií na Sephadexu.

125

I – T – hyaluronan byl uchováván

při 5 ˚C. Příprava kultur jaterních buněk (13) Byla připravena buněčná suspenze získaná z jater krys po provedení 10 minutové inkubace s kolagenázou při 37 ˚C. Jaterní endotelové buňky, Kupfferovy buňky a parenchymální buňky byly separovány centrifugací, čímž bylo získáno přibližně 95 % čistých buněk. Jednovrstevné kultury byly uchovávány za standardních kultivačních podmínech v mediu RPMI (L – glutamin - 2 mMol/l, gentamycin 50 µg/mL a v případě parenchymatických buněk, 10 %ní (v/v) fetální hovězí sérum). Jaterní endotelové buňky byly kultivovány bez séra. Všechny buňky byly kultivovány přes noc před začátkem experimentu. Před začátkem experimentu byly parenchymatické buňky kultivovány po dobu 2 - 3 h v mediu bez hovězího séra. Biologické studie (13) Studium absorpce v buněčných kulturách in vitro 125

I – T – hyaluronan a ve slepých vzorcích neoznačené polysacharidy byli přidáni k

chlazenému mediu RPMI obsahujícího L – glutamin a gentamycin.

40

Poté byla směs přidána k buněčným kulturám o obsahu 100 - 200 000 jaterních endotelových buněk v nádobách pokrytých fibronektinem. Kultury buněk byly inkubovány při standardních kultivačních podmínkách v 300 µl media. Po skončení inkubace bylo odstraněno medium a byla provedena analýza radioaktivity. V některých experimentech rozložený polysacharid byl separován od nerozloženého gelovou chromatografií. Buňky byly promyty třikrát ve fosfátovém pufru, obsahující NaCl, KCl, KH2PO4 a Na2HPO4 a následně analyzovány, nebo byly buňky homogenizovány a frakcionovány způsobem popsaným výše. Vazba byla porovnána s naměřenou radioaktivitou v miskách bez buněk.

Studie in vivo Krysy byly anestezované pentobarbitalem (45 mg/kg tělesné hmotnosti), kterým byl aplikován

125

I – T - hyaluronan a některým byl místo toho podán intravenózně neoznačený

hyaluronan v dávce 1 - 2 mg jako slepý pokus. Za účelem studia kinetiky byly v opakovaně sbírány krevní vzorky (25 µl). Množství radioaktivity přítomné v krvi v čase 0 bylo získáno extrapolací dat získaných z prvních třech měření. V některých případech byl na konci experimentu odebírán vzorek o větším objemu (300 - 400 µl). V časových rozmezích 10 minut až 24 hodin po aplikaci byly krysy usmrceny. Játra, plíce, slezina a v některých případech tuk, kůže, střeva a moč byly také použity k analýze radioaktivity. V některých případech játra byla inkubována s kolagenózou a jaterní buňky byly separovány. K určení hodnoty jaterní absorpce a distribuce mezi různé typy jaterních buněk se využívá skutečnosti, že normální krysí játra obsahují odhadem 400 x 106 neparenchymatických a 1200 x 106 parenchymatických buňek. Hodnota celkové jaterní aktivity byla určena změřením aktivity části buněčné suspenze vzniklé po perfúzi kolagenózou přepočítáním na celkovou buněčnou populaci v játrech. Celková aktivita byla dále vyjádřena jako frakce aktivity v čistých parenchymatických buňkách a frakce v neparenchymatických bunkách. Počet buněk v suspenzi byl spočítán pomocí Burkerovy komůrky ve fázově kontrastním mikroskopu. Na miskách byl určen počet buněk použitím mikroskopu vybaveného mřížkou. Scintigrafická studie, analýza in vivo Krysy byly anestezovány a byl jím aplikován radioaktivně značený hyaluronan. Krysy byly umístěny v gamma kameře za účelem studia jaterní absorpce.

41

První zobrazení byla pořizována každou minutu po dobu 15 minut. Po 15 minutách statické obrazy byly pořizovány v různé době po aplikaci za účelem studia eliminace materiálu z jater. Výsledky (13) Značením hyaluronanu tyrosinem po předešlé aktivaci polysacharidu bromkyanem lze získat polysacharid, který je možno podrobit jodaci, a tím získat produkt o vysoké specifické radioaktivitě. Produkt o specifické radioaktivitě přibližně 0, 1 MBq/g se získá značením 100 μg hyaluronanu 2 hodiny 18 MBq 125I. Radioaktivně značený hyaluronan se separuje za stejných podmínek jako neoznačený materiál kalibrovanou gelově – filtrační chromatografií. Molekulová hmotnost neoznačeného stejně jako označeného polysacharidu je 480 000 Da. Materiál je polydisperzní, přibližně 90 % polysacharidů má molekulovou hmotnost v rozmezí 2000 000 – 100 000 Da (obr. 12). Tudíž značení hyaluronanu tyrosinem po předešlé aktivaci CNBr nezpůsobí změnu MW polysacharidu.

Obr. 12: Kumulativní četnost neoznačeného HA (о) a

125I-T-HA

(●) po provedení gelově

permeační chromatografie. Objem kolony Vo a eluční objem Vt kolony kalibrované standardy HA o Mw 2.0x106 a 0,12x106

125

I – T hyaluronan se efektivně absorbuje játerními endotelovými buňkami v kultuře

(obr. 13). Absorpci hyaluronanu lze efektivně inhibovat neoznačeným hyaluronanem a nedochází k žádné významné absorpci v parenchymatických buňkách. Značení hyaluronanu tyrosinem neinterferuje při vazbě na specifické receptory na povrchu buněk (obr. 13). 42

Obr.č.13: Vazba 125I-T-HA k jaterním endotelovým buňkám v kultuře. Výsledky byly určeny ze 4 měření dvou různých vzorků. Sloupce znázorňují dva odlišné vzorky

Po aplikaci dávky traceru in vivo, přibližně 90 % radioaktivity se nachází v jaterních endotelových buňkách, 5 % v Kupfferových buňkách a pouze 2 – 3 % v parenchymatických buňkách (obr. 13). Po dávce traceru 125I - T - hyaluronanu aplikovaného intravenózně krysám dochází k velmi rychlé eliminaci z cirkulace a biologický poločas činí asi 2 minuty (obr. 14). Při podání traceru s 200 násobným nadbytkem neoznačeného hyaluronanu se výrazně sníží rychlost eliminace a proces probíhá kinetikou 0. řádu. Většina značeného materiálu je přítomna v játrech. Po 10 minutách v krevním oběhu, přibližně 10 % injektované dávky se stále nachází v krevním řečišti, zatímco 80 - 85 % aplikované dávky je přítomno v játrech. Absorpci v játrech lze inhibovat současným podáním neoznačeného polysacharidu. Menší množství se také nachází ve slezině, ledvinách a plicích (obr. 14). Avšak absorpce v těchto orgánech je malá a nelze ji inhibovat aplikací neoznačeného hyaluronanu.

43

Obr.č.3 Hodnoty radioaktivity v různých orgánech krysy 10 minut po i.v. aplikaci vložený graf znázorňuje eliminaci z krve po i.v. aplikaci

125-T-HA

125I-T-HA,

(Kc-Kuppferovy buňky, PC

parenchymatické buňky, LEC jaterní endotelové buňky)

24 hodin po injekční aplikaci dávky traceru přibližně jedna třetina radioaktivně značeného materiálu se eliminuje z jater a je vyloučena z organismu močí. Metabolismus označeného polysacharidu in vivo se shoduje dobře s předchozími studiemi používajícími biosynteticky značený hyaluronan o vysoké Mw. Tento způsob eliminace z organismu je významně pomalejší než v případě 3H - hyaluronanu. Zatímco 96 % biosynteticky značeného 3H - hyaluronanu není přítomno v buněčné kultuře po 24 h, pouze 29 % radioaktivity z 125I - T značeného hyaluronanu se eliminuje z buněčné kultury po 24 hodinách. Za účelem stanovení hodnoty clearance materiálu in vivo se studuje eliminace z jaterních buněk in vivo. Po 24 hodinách přibližně 35 % aktivity počátečně absorbované játry zmizí z organismu a je detekováno v moči. V jednom experimentu byla studie provedená na krysách 5 dní po aplikaci traceru. Po uplynutí této doby je v organismu přítomno pouze 2 - 3 % množství z aplikované dávky. Lze učinit závěr, že přibližně 60 % injektované dávky traceru opouští organismus v prvních 2 dnech. V příštích 2 dnech se 80 % dávky ještě vyloučí z organismu. Zanedbatelné množství se kumuluje ve štítné žláze, z čehož vyplývá, že pravděpodobně velmi malé množství jodu se uvolňuje během rozkladu polysacharidu. Z výsledků studie vyplývá, že

125

I - T - hyaluronan je vhodný pro studie metabolismu

hyaluronanu. Gamma zářiče 125I a 131I lze snadno monitorovat a použít ke studiím in vivo SPECT. Pomalá eliminace radioaktivity z míst absorbce je výhodná při studiu tkání s relativně nízkými hodnotami absorbce. Týden po aplikaci se očekává, že 99 % materiálu se bude eliminovat z buněk absorbující materiál a tudíž lze provést nový experiment.

44

125

I - T - hyaluronan je také vhodný pro autoradiografické studie tkání in vitro po podání in

vivo, a tak tímto způsobem lze identifikovat buňky absorbující hyaluronan.

Značení

chelatačním

činidlem

modifikovaného

hyaluronanu

kovovým

radionuklidem (10) Značení kyseliny hyaluronové pomocí kovových radionuklidů vázaných k molekule prostřednictvím chelatačních skupin může být využito k zobrazení pomocí SPECT, která je založena na detekci záření pocházejícího z radio-aktivního nuklidu. Tyto techniky se používají k detekci distribuce radioaktivity látky v živých organismech. Technika pozitronové emisní tomografie je založena na použití pozitron emitujících radionuklidů, které jsou elektron deficitní a vyzařují pozitron. V několikamilimetrové vrstvě v tkáni se pozitron sloučí s elektronem a částice emitují fotony (gamma záření) v protilehlých směrech. Tyto fotony jsou detekovány PET kamerou a tak lze měřit distribuci radioaktivity v živých organismech s vysokou přesností a kvantifikovat ji v určité oblasti i časově.

Značení hyaluronan – butyrátu techneciem

99m

Tc

pro studie in vivo a

in vitro (14, 16) Butyrát sodný (But) je inhibitor histon deacetylázy, který má významnou antineoplastickou aktivitu vůči mnoha buněčným liniím lidských nádorových buněk včetně hepatocelulárního karcinomu. Jednou z hlavních vlastností této látky je silná afinita k receptorům CD44, což je specifický membránový receptor, který je exprimován ve zvýšené míře u většiny lidských karcinomů včetně jaterních. Inhibitory histon deacetylázy (HDACi) včetně butyrátu sodného, jsou potenciálními induktory zástavy buněčného růstu, diferenciace, nebo apoptózy mnoha transformovaných buněk včetně hepatocelulárního karcinomu a intrahepatálních metastáz. Jejich mechanismus je založen na schopnosti inhibovat aktivitu enzymů histon - deacetyláz (HDACs). Tyto enzymy jsou zahrnuty v procesu regulace exprese genů určené stupněm acetylace histonů, jaderných proteinů. Inhibice HDACs způsobí reaktivaci několika genů včetně těch, které jsou zodpovědné za kontrolu buněčného růstu a diferenciace. Na základě tohoto faktu, lze považovat HDACi za skupinu potenciálně efektivních cytostatik.

45

Klinická aplikace But je však omezena velmi krátkým biologickým poločasem této sloučeniny. Z tohoto důvodu se používá biokonjugát s kyselinou hyaluronovou (HA - But), jehož molekulární struktura je tvořena řetězcem kyseliny hyaluronové částečně esterifikovaného kyselinou máselnou. Hyaluronan je schopen vazát se na CD44, specifický membránový receptor pro HA, který je ve zvýšeném množství exprimován ve většině typů nádorových buněk. Příprava HA – But (16) Esterifikace HA kyselinou máselnou se provede s využitím aktivované formy But, aduktem, který vzniká reakcí anhydridu kyseliny máselné a 4 - dimethylaminopyridinu. Sloučenina se poté přečistí tenkovrstvou chromatografií a struktura se identifikuje NMR spektroskopií a stupeň substituce se změří kapilární elektroforézou po získání volných zbytků kyseliny máselné zásaditou hydrolýzou esteru. Značení HA a komplexu HA – But

99m

Tc (16)

Ha a komplex HA - But se značí

99m

Tc radioizotopem emitujícího gamma záření často

používaným pro radiodiagnostické účely. Vzhledem k jeho výhodným optimálním jaderným vlastnostem (T1/2 = 6, 02 hod, E = 140 keV), umožňujícím detekci gamma kamerou,

99m

Tc lze

použít jako radioaktivní próbu ve farmakologických studiích distribuce nových léčiv in vivo. Pokud je cílová molekula vysokomolekulární homopolymer, značení

99m

Tc způsobí malé změny

v náboji, konformaci a polaritě bez významných změn v distribuci a v interakcích. Protože HA a HA - But obsahují mnoho funkčních skupin schopných vázat

99m

Tc oxo skupinami (karboxylem, 99m

hydroxylem) a aminoskupinou, provádí se přímá metoda značení polymerů

Tc.

99m

Tc - pertechnát čerstvě eluovaný z 99Mo/ 99mTc generátoru se redukuje 1 µl 0, 1 M SnCl2

roztoku (v 0, 1 M HCl) v přítomnosti glukonátu sodného (1 µl 0, 01M roztoku) jako přechodného ligandu. Přidává se 3 mg polymeru, upraví se pH na hodnotu 4 pomocí 0, 01 M HCl a označená směs se mírně míchá 1, 5 hodiny při 50 ˚C. Označené polymery jsou přečištěny a odsoleny gelovou chromatografií. HA označený techneciem vodou, zatímco

99m

Tc a

99m

Tc – HA - But se eluují z kolony

99m

Tc - pertechnát a nízkomolekulární sloučeniny jsou zadrženy na koloně

Sephadexu. Touto reakcí lze získat 85 - 95 % označeného materiálu. Stabilita komplexu

99m

Tc HA - But se zkouší u označené směsi a v přítomnosti krysího

séra (200 µl značené směsi bylo přidáno k 400 µl čerstvého séra). V obou případech se směsi inkubují při 37 ˚C a množství reziduálního

99m

Tc - pertechnátu se monitoruje 6 hodin gelovou

permeační chromatografií. Během této doby se netvoří žádné množství komplex kovu a polymeru je stabilní pro studie in vivo a in vitro. 46

99m

Tc - pertechnátu, tudíž

K určení hodnoty buněčné absorpce a distribuce materiálu in vivo, se původní HA - But přidává k přečištěnému roztoku 99mTc - HA - But a a koncentrace směsí se upraví na hodnoty 5 a 30 mg/ml. Studie značeného komplexu HA – But in vitro (16) Buněčné linie a inhibice buněčného růstu Buněčné linie hepatocelulárního karcinomu zahrnující buňky HepG2 a HepB3 se inkubují v Eaglově esenciálním mediu, který obsahuje 10 % fetálního hovězí séra, 1 % glutaminu, 1 % pyruvátu sodného a 1 % neesenciálních aminokyselin v plastikových nádobách při 37 ˚C v atmosféře nasycené 5 % CO2. Buňky se inkubují 6 dní, což je interval vhodný k pozorování statisticky významných rozdílů s ohledem na kontrolní vzorek, v mediu doplněném vzrůstající koncentrací HA (0, 016 - 4 mg/ml), HA - But (0, 016 - 4 mg/ml), nebo butyrátem sodným (0, 016 - 4 mM). Experimenty se provádějí minimálně dvakrát. Na konci pokusů se antiproliferativní účinek určuje pomocí 3-(4,5–dimethylthiazol–2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromidu. Precipitáty se rozpouští v dimethylsulfoxidu a měří se absorbance vzorků při vlnové délce 540 nm. Slepý vzorek obsahuje všechny látky kromě buněk a IC50 je definována jako koncentrace látky, která inhibuje růst 50 % buněk. Průtoková cytometrie Exprese receptoru CD44 se určuje průtokovou cytometrií pomocí myší monoklonální protilátky proti lidskému CD44. Buňky jsou odstraněny z nádob pomocí roztoku trypsin - EDTA, promyty PBS a centrifugovány 5 minut. Buňky se inkubují s primární protilátkou v poměru ředění 1 : 20 60 minut při pokojové teplotě. Poté jsou promyty PBS a inkubovány se sekundární protilátkou konjugovanou s fluoreskující sloučeninou v poměru ředění 1 : 50 30 minut při pokojové teplotě a na tmavém místě. Slepý kontrolní vzorek se inkubuje se samotnou sekundární protilátkou. Po imunoflorescenčním zbarvení jsou buňky centrifugovány a resuspendovány. Fluorescence se měří pomocí průtokového cytometru. Buněčná absorpce 99mTc-HA-But HepG2 a HepB3 buňky se umísťují v komůrkách (5 x 10 000 buněk/komůrku) obsahujících Eaglovo základní medium doplněného fetálním hovězím sérem, glutaminem, pyruvátem sodným a neesenciálními aminokyselinami. Buňky se inkubují při 37 ˚C v atmosféře nasycené 5 % CO2, dokud se nedostanou do exponenciální fáze růstu. Medium se odstraní a buňky se promývají dvakrát roztokem PBS. 47

Přečištěná

99m

Tc - HA - But se ředí roztokem původního chlazeného polymeru na koncentraci 5

mg/ml. 2 ml media se přidává do komůrky a buňky se inkubují 0, 5, 1, 2, 3, 4, 5 a 6 h při 37 ˚C. Po skončení inkubace se buňky promývají pufrem PBS a provede se měření reziduální radioaktivity. Buňky v paralelní sérii experimentu se inkubují 4 hodiny při 37 ˚C s koncentrovaným roztokem HA (50 mg/ml) před přidáním 99mTc - HA za účelem určení absorpce HA na receptorech CD44. Výsledky studie (16) Exprese CD44 na povrchu buněk, buněčná absorpce 99mTc-HA-But a inhibice buněčného růstu Průtoková cytometrie odhalila, že pouze 18 % HepG2 buněk exprimuje na svém povrchu receptor CD44, zatímco 78 % HepB3 buněk obsahuje na svém povrchu CD44. Z experimentů používající radioaktivně značenou sloučeninu vyplývá, že dvě buněčné linie mají odlišnou schopnost vazát HA - But v závislosti na době expozice. Schopnost HepB3 buněk se zvyšuje v průběhu času a dosahuje hodnoty plató 6 hodin po inkubaci, zatímco HepG2 buňky mají limitovanou schopnost vazby, která se začíná snižovat po 4 hodinách. Navzdory odlišné schopnosti buněk exprimovat receptor CD44, je HA - But schopen inhibovat růst buněk v obou buněčných liniích. 6 dní po inkubaci je inhibiční účinek závislý na dávce. V HepB3 buňkách o nejvyšší koncentraci (4mg/ml s ohledem na 1M koncentraci máselné kyseliny), HA - But indukuje téměř kompletní inhibici buněčného růstu (90 %), zatímco v HepG2 buňkách s menší expresí CD44 působí mírně inhibičně (60 %). Z toho lze usuzovat, že při dostatečně dlouhé inkubaci, v tomto případě se jedná o 6 dní, HA – But také účinkuje v nádorových buňkách s nízkou expresí CD44. Tuto skutečnost lze vysvětlit tím, že po absorpci komplexu HA - But dochází k rychlému obratu receptoru CD44, čímž se dosáhne inhibiční intracelulární koncentrace. I když CD44 je hlavní receptor pro HA, ostatní membránové receptory včetně hyaluronan receptoru spraženého s buněčnou motilitou mohou být zodpovědné za internalizaci HA - But. HA - But je efektivnější než butyrát sodný samotný, tudíž použitím HA jako transportéru pro butyrát sodný lze významně dosáhnout lepších biologických účinků bez viditelných negativních vlastností způsobených obrovskou molekulou. Vysoká afinita komplexu s buňkami

HepG2

ukazuje,

99m

Tc - HA - But k buňkám HepB3 in vitro ve srovnání

že

značené

deriváty

hyaluronanu

vytvářejí

receptorem

zprostředkovanou endocytickou absorpci. Z tohoto důvodu se zdá být užitečné používat hyaluronan jako receptorově specifický nosič pro cytostatika.

48

Biodistribuční studie komplexu 99mTc - HA - But in vivo (14) Studie biodistribuce komplexu

99m

Tc - HA - But in vivo se provádí pomocí kamery

nízkoenergetického pozitronového záření gamma YAP, založené na vysoké hustotě scintilátoru Yttrium - Alluminium Perovskite, dopovaného Cesiem. K testování farmakologických účinků Ha - But na játra se používá model jaterních metastáz, získaný injekcí buněk plicního karcinomu do sleziny myší.

Vysoké množství

komplexu HA - But se nalézá v játrech při rozdílných způsobech aplikace. Vyskytují se však rozdíly v čase, kdy dochází k absorpci tohoto komplexu. Středně rychle probíhá absorpce po intravenózní aplikaci a mnohem pomaleji po intraperitoneální a subkutánní aplikaci (trvá nejméně 30 min). Intraperitoneálně aplikovaný komplex HA - But významně způsobuje redukci tvorby metastáz jaterních buněk a u 87 % ošetřených laboratorních zvířat se neobjevují metastáze. Intravenózní aplikací

99m

Tc - HA - But lze rychle dopravit hyaluronové deriváty

k jaterním buňkám, ale preferenčními způsoby, jak dosáhnout kontrolované dopravení k buňkám jaterního karcinomu, je aplikace intraperitoneální nebo subkutánní. Značení a biodistribuce komplexu 99mTc - HA - paclitaxel (15) Cytostatikum lze navázat na polymer kyseliny hyaluronové za účelem získání výhodnějších farmakokinetických vlastností léčiva a snížení vedlejších nežádoucích cytotoxických účinků. Některé konjugáty oligomerů kyseliny hyaluronové s léčivy jako je mitocin, epirubicin a kyselina máselná se vyznačují lepší rozpustností léčiva, stabilitou, i lokalizací, kontrolovaným uvolňováním a významně zvýšenou selektivitou pro nádorové buňky. Pro možnosti terapeutického použití tohoto konjugátu je nutné zjistit jeho farmakologické vlastnosti. Pro tyto účely se komplex značí izotopem

99m

Tc.

Biodistribuce komplexu 99mTc - paclitaxel - hyaluronanu Biokonjugát se značí přímou metodou způsobem popsaným výše. Za účelem určení stability komplexu se provádí ředění komplexu. 100 µl přečištěného komplexu se rozpustí ve fosfátovém pufru (0, 1M, pH 7, 4) v poměru 1 : 10 a směs se nechá inkubovat 6 hodin při 37 ˚C. Čistota komplexu se analyzuje každou hodinu pomocí HPLC s reverzní fází. Sloučenina je stabilní pro studie in vitro a in vivo. Za účelem studia distribuce komplexu in vivo, se 4 skupinám myší aplikuje intravenózně, intraperitoneálně, intravesikálně a perorálně 200 µl označeného komplexu. Většina materálu je absorbována játry a slezinou a pouze malé procento se vyskytuje v močovém měchýři. 49

Po intraperitoneální aplikaci označený komplex zůstává v peritoneu. Z hodnot aktivit po distribuci komplexu do žaludku a měchýře vyplývá, že označený komplex většinou zůstává v orgánu aplikace. Komplex paclitaxelu a oligomeru HA se také vyznačuje buněčně specifickou vazbou a specifickou absorpcí v buněčné kultuře. Ze studií biokonjugátu in vitro vyplývá přímá souvislost mezi absorpcí a cytotoxicitou. Po absorpci komplexu dochází k intracelulárnímu rozkladu a následně hydrolyticky uvolněný paclitaxel působí cytotoxicky. Komplex je účinnější v kontrole metastázování, adheze a růstu nádorových buněk in vivo a má menší nežádoucí účinky než samotný paclitaxel nebo oligomer HA.

Značení kyseliny hyaluronové rheniem - 188 pro biodistribuční studii in vivo (17) Rhenium - 188 je smíšený  (Emax = 2, 12 MeV) a  (155 keV) zářič. Je to velmi atraktivní radioizotop s širokým uplatněním v klinické praxi. V onkologii se používá za účelem paliativní léčby kostních metastáz a obecně se používá jako radiotracer cytostatik. Je produkován ve W - Re generátoru. Chemicky je podobný

99m

Tc, metastabilnímu techneciu, který je nejvíce používaný

radioizotop v nukleární medicíně zejména pro radioizotopovou diagnostiku in vivo. rozpadá na

188

188

Re se

Os s poločasem rozpadu 0, 7 dní a jeho beta záření může být použito k destrukci

nádorových buněk.

188

Os produkuje gamma záření o energii 155 keV, které lze použít pro účely

scintigrafie. Vzhledem k jeho podobnosti s techneciem může být navázán na molekulu hyaluronanu spojenou s léčivem, která zprostředkuje transport radioizotopu do specifickým míst v lidském organismu a způsobí kumulaci a retenci léčiva v játrech. Kyseliny hyaluronová je tedy molekula, kterou lze použít jako vektor pro cytostatika. Vzhledem k těmto vlastnostem by mohl být používán v terapii nádorových onemocnění jater. Ale na druhé straně beta radiace může interferovat s procesem značení a zničit tak molekulu, která je zodpovědná za distribuci radioizotopu k cílovému orgánu, a tak snižovat terapeutický efekt. Vzhledem k relativně dlouhému poločasu a bohatému spektrem fotonů, s vysokou energií, fotonové detektory používané pro zobrazení

99m

Tc nejsou dostatečně citlivé. Tudíž pro studie

metabolismu radiofarmaka značeného 188Re se používá vysoce citlivá gamma kamera YAP.

50

Před matrix kamery se umísťuje vysoce citlivý 20 mm tlustý kolimátor, který pohlcuje paprsky gama, které se nepohybují ve směru jeho otvorů, a tak vytváří rovinnou projekci distribuce radioindikátoru. Značení hyaluronanu rheniem - 188 (17) Hyaluronan se značí přímou metodou pomocí

188

Re - perrhenátem, který je čerstvě

eluovaný z 188W/188Re generátoru v chemické formě aniontu. Rhenistan

188

ReO4 se redukuje

pomocí 60 µl roztoku 0,1 M SnCl2 rozpuštěného v 0,1 M HCl v přítomnosti glukonátu sodného (1 µl z roztoku o koncentraci 0,02 M) ve funkci výměnného lignadu. Přidá se 2 mg polymeru, provede se úprava pH na hodnotu 4 pomocí 0, 02 M HCl a označená směs se mírně míchá 1, 5 hodiny při 50 ˚C. Směs se přečistí a odsoluje gelovou permeační chromatografií. Označený komplex se eluuje z kolony vodou, zatímco

188

Re - perrhenát a nízkomolekulární sloučeniny jsou

zadrženy na koloně. Výtěžnost této reakce je asi 75 - 80 %. Stabilita značeného komplexu se testuje na označené směsi a u 200 µl směsi označené látky s 400 µl čerstvého krysího séra. Směsi jsou inkubovány při 37 ˚C a zbývající procento nenávazaného perrhenátu je monitorováno 6 hodin pomocí GPC. Během této doby nedochází k žádné tvorbě 188Re - perrhenátu, tudíž komplex polymeru a kovu je dostatečně stabilní pro studie in vivo a in vitro.

Distribuce komplexu in vivo (17) Pro scintigrafické studie distribuce značeného komplexu in vivo se používá YAP kamera. Ze studíí in vivo provedených na laboratorních myších vyplývá, že několik málo minut po intravenózní aplikaci dochází ke kompletní absorpci materiálu v játrech a vysoké procento zůstává v játrech dlouhou dobu (2 h). Schopnost

188

Re indukovat poškození DNA se posuzuje podle přítomnosti jadérka v

buňkách myšího fibrosarkomu. Buňky jsou vystaveny účinkům

188

Re - HA v přítomnosti

cytochalasinu - B (inhibitor aktinu zodpovědný za tvorbu dvoujadrených buněk). Inkubace trvá 72 hodin. Komplex

188

Re - HA je vhodný vektor pro transport radionuklidu do jater, kde může

uplatňovat své radioterapeutické účinky na nádorové buňky.

51

Závěr Tato diplomová práce je rešerše, která vznikla na základě zpracování literatury, která se týkala obecné charakteristiky hyaluronové kyseliny, která je důležitá pro možnosti využití této biomolekuly v mnoha oblastech medicíny. Dále se tato práce zaměřila na přehled metod radioaktivního značení této sloučeniny za účelem studia farmakokinetických vlastností této sloučeniny, které dále předurčují její aplikaci v terapii mnoha onemocnění. Hyaluronan (hyaluronová kyselina, hyaluronát), je důležitý polysacharid přítomný extracelulárně v mnoha tkáních. Během několika let byl učiněn velký pokrok ve znalostech týkajících se syntézy, cirkulace v lymfě a krvi, absorpci a katabolismu v lymfatických uzlinách a v játrech. Hyaluronan je důležitým pomocníkem v oční chirurgii, hodnoty sérová koncentrace hyaluronanu se využívá v diagnostice revmatoidní artritidy, jaterní cirhózy a maligním mesotheliomu. Radioaktivní značení kyseliny hyaluronové se provádí za účelem studia metabolismu této látky nebo za účelem identifikace hyaluronan vazebných proteinů ve tkáních. Pro účely použití NaHA v oční chirurgii se provádí značení hyaluronanu radioaktivním uhlíkem připravuje bakteriální fermentací s využitím radioaktivně značeného prekurzoru

14

14

C, který se

C – glukózy.

V oční komoře nedochází k žádnému místnímu rozkladu této látky, tudíž radioaktivně značená látka je dostatečně stabilní a pro praktické účely je důležitý závěr, že způsob eliminace z přední oční komory závisí na objemu aplikované látky a na molekulové hmotnosti polymeru. Rychlost eliminace produktu získaného činností bakterií se významně neliší od materiálu získaného extrakcí z kohoutích hřebínků. Způsob absorpce, distribuce, metabolismu a exkrece materiálu získaného biotechnologicky se shoduje s HA získanou extrakcí z kohoutích hřebínků. Radioaktivně značená hyaluronová kyselina připravená izotopovou výměnnou reakcí, při které je stabilní atom organické sloučeniny nahrazen svým radioaktivním izotopem, se používá v biomedicinském výzkumu k identifikaci, izolaci, k charakterizaci exprese a vlastností proteinů v biologických systémech. Pro tyto účely se používá značení triciem 3H. Z výsledků studií vyplývá, že značení hyaluronanu triciem nezpůsobuje podstatné změny ve struktuře molekuly. Nově vynalezená metoda radioaktivního značení hyaluronátu 3H - methylbromidem je procedurou první volby.

52

Pro účely distribuce sloučenin in vivo se využívá zobrazovacích technik PET a SPECT. Radionuklidy, které se používají pro tyto účely jsou izotopy

124

I a

76

Br. Při procesu značení

kyseliny hyaluronové je třeba nejdříve molekulu derivatizovat, protože zatím nebyla vynalezena metoda pro přímou halogenaci molekuly. Konjugační značení probíhá ve dvou krocích a často je výtěžnost nižší ve srovnání s metodou přímého značení (oxidativní jodace tyrosinových zbytků). Výhodou konjugačního značení jsou mírné reakční podmínky a také zvýšená stabilita vůči dehalogenaci in vivo způsobené enzymy. Hyaluronovou kyselinu lze radioaktivně značit jodem reakcí tyraminu s terminálním aldehydickou skupinou následovanou oxidativní jodací skupiny tyraminu. Vzhledem k možnosti velkého počtu vazebných míst v molekule, které mohou být jodovány, lze takto získat sloučeninu s vysokou specifickou radioaktivitou. Metodou radioaktivního značení kyseliny hyaluronové bromem - 76 lze získat HA o nízké specifické radioaktivitě, ale výhodou této metody je fakt, že hyaluronová kyselina je vystavena minimální derivatizaci molekuly. Pro účely identifikace vazebných míst absorpce sacharidu se provádí

substituce

hyaluronanu upraveného hydrazinem tyramin - celobiosou, kterou lze snadno označit fenolickém kruhu tyraminu. 125

125

125

I ve

I - hyaluronan lze připravit buď vazbou radioaktivně značené

I - tyramin - celobiosy k hyaluronanu upraveného hydrazinolýzou nebo značením

tyramin - celobiosy - hyaluronanu

125

aduktu

I. Označený polysacharid, který je minimálně modifikován

procesem značení a pravděpodobně obsahuje nepozměněnou strukturu hyaluronanu mezi substituenty, může být používán při experimentech in vivo ke studiu katabolismu hyaluronanu. 125

I - T - hyaluronan je vhodný pro studie metabolismu hyaluronanu. Gamma zářiče

125

I

lze snadno monitorovat a použít ke studiím in vivo SPECT. Pomalá eliminace radioaktivity z míst absorbce je výhodná při studiu tkání s relativně nízkými hodnotami absorbce. 125I - T - hyaluronan je také vhodný pro autoradiografické studie tkání in vitro po podání in vivo, pro účely identifikace buněk absorbující hyaluronan. Značení kyseliny hyaluronové pomocí kovových radionuklidů vázaných k molekule prostřednictvím chelatačních skupin se využívá pro účely SPECT. Kyselina hyaluronová je molekula, kterou lze použít jako vektor pro cytostatika. Radioaktivně značená molekula hyaluronanu spojená s léčivem zprostředkuje transport radioizotopu do specifickým míst v lidském organismu a způsobí kumulaci a retenci léčiva v játrech. Za účelem vývoje nových cytostatik používaných v terapii nádorových onemocnění se provádí biodistribuční studie značené kyseliny hyaluronové rheniem - 188 in vivo. Z výsledků studií vyplývá, že značený materiál se kumuluje v játrech, kde může uplatňovat své radioterapeutické účinky na nádorové buňky.

53

Hyaluronan lze také konjugovat s molekulou butyrátu a radioaktivně značit techneciem pro účely studia farmakologických vlastností tohoto komplexu. Z biodistribučních studií vyplývá, že velké množství komplexu HA - But se nalézá v játrech při rozdílných způsobech aplikace a HA - But významně způsobuje redukci tvorby metastáz jaterních buněk a tak lze tento komplex použít k léčbě nádorových onemocnění jater.

Použité zkratky HYA – kyselina hyaluronová EM - extracelulární matrix NaHA - hyaluronan sodný CD – cluster of differentiation (rozlišovací shluk) GAG – glykosaminoglykany EDTA – ethylen – diamin – tetraoctová kyselina GPC – gelová permeační chromatografie ADME – adsorpce, distribuce, metabolismus a exkrece PDGF – růstový faktor trombocytů HA - But – kyselina hyaluronová esterifikovaná kyselinou máselnou PBS – fosfátový izotonický pufr používaný v cytologii Yttrium- aluminium perovskit - Er3+ aktivované a Ce3+ - senzitizované Y-Al ametystové krystaly. Číselně střední relativní molekulová hmotnost - M n

M n je vyjádřením molekulové hmotnosti mediánové molekuly v daném vzorku polymeru při hypotetickém seřazení molekul podle velikosti. Za předpokladu, že wi je hmotnostní zlomek molekul o molekulové hmotnosti Mi zastoupený počtem molekul Ni , je možno hodnotu M n vypočíst ze všech hodnot Ni : 

Mn 

N i 1

i

Mi



N i 1

  xi M i i

i

54

10.1.

xi je molární zlomek frakce polymerního vzorku molekulové homotnosti Mi. Charakteristika M n bere v úvahu všechny molekuly ve vzorku jako rovnocenné. Proto je možno ji stanovovat měřením koligativních vlastností nebo stanovením koncových skupin. Nejèastìji se používá pro měření molekulových hmotností metoda GPC. Hmotnostně střední relativní molekulová hmotnost - M w .

M w je charakteristikou hypotetické molekuly, která je ve středu mezi dvěma polovinami hmotnosti daného vzorku s molekulami hypoteticky seřazenými podle velikosti. Tato hodnota odráží stoupající význam jednotlivých molekul ve vzorku se stoupající hmotností. Je věrnější charakteristikou při sledování závislosti změn některých vlastností roztoků na molekulové hmotnosti, jakými je např. viskozita, sedimentace v silovém poli nebo rozptyl laserového paprsku. Pro hodnoty M w platí rovnice: 

Mw 

w M i

i 1 

w

i

i 1

Hodnota blízká hodnotě M w



i



N M i

2 i

i 1 

N M i

  wi Mi

10.2.

i i

i 1

zjištěná na základě viskozity roztoků polymeru bývá

označována symbolikou M v . Autentické hodnoty M w jsou prezentovány jako výsledek měření metodou rozptylu světla. V běžné praxi se nejčastěji používá metoda GPC, přičemž kalibrace bývá provádìna měřením chromatografického chování standardů známé molekulové hmotnosti. Mw/Mn – polydisperzita YAP – Yttrium - Alluminium – Perovskite gamma kamera

55

Použitá literatura 1. .

J. R. E. Fraser, T. C. Laurent, U. B. Laurent: Hyaluronan: its nature, distribution, functions and turnover Journal of Internal Medicine, 242: 27-33 (1997)

2.

V. Hascall, T. Laurent: Hyaluronan: Structure and Physical properties. www.glycoforum.gr.jp, prosinec 15. (1997)

3.

J. Hercogová: Implantáty, výpně do vrásek, jizev, zvětšování rtů: Viscontour (SVS 18) www.dermatology.cz, březen 13. (2003)

4.

Hyaluronic-acid, From Wikipedia, the free encyclopedia, http://en.wikipedia.org./wiki/Hyaluronic-acid

5.

Cytosol a extracelulární matrix (On-line knihovna, Patobiochemie buňky, Cytosol a extracelulární matrix) www.zdravcentra.cz

6.

Aplikace kyseliny hyaluronové: www.mlc-laser.com/cz/provadene-zakroky/aplikace-kyseliny hyaluronove.php

7.

B. Delpech, N. Girard, P. Bertrand, M.-N. Courel, C. Chauzy a A. Delpech: Hyaluronan: Fundamentals principles and applications in cancer. Journal of Internal Medicine, 242: 41-48 (1997)

8.

P. Chabreček, L, Šoltys, H. Hradec, J. Filip a E. Odvislý: Preparation and characterization of high molecular weight 3H hyaluronic acid. Collect Czech. Chem. Commun. (Vol.57) 2151-2156 (1992)

9.

A. Nimrod, E. Ezra, N. Ezov, G. Nachum a B. Parisada: Absorption, distribution, metabolism and excretion of bacteria-derived hyaluronic acid in rats and rabbits. Journal of Ocular Pharmacology, volume 8, No. 2, 161-172 (1992)

10.

U. Yngve: Labelling of various makromolecule using positron emitting 76Br a 68Ga, Synthesis and characterisation. www.diva-portal.org/diva/getDocument%3Furn_nbn_se_uu_diva-5951_fulltext.pdf

11.

Pierce instructions: Bolton-Hunter reagent www.piercenet.com, 2. srpna (2006)

56

12.

L. B. Dahl, F. C. Laurent a B. Smedsrod: Preparation of biologically intact radioiodinated hyaluronan of high specific radioaktivity: Coupling of 125I-tyramine-cellobiose to amino groups after partial N- deacetylation. Analytical Biochemistry 175,397-407 (1988)

13.

S. Gustafson, T. Bjorkman and J,-E. Westlin: Labelling of high molecular weight hyaluronan with 125I-tyrosine: studies in vitro and in vivo in the rat. Glycoconjug. Journal, 11, 608-613 (1994)

14.

A. Banzato, M. Bello, D. Bernardini, P. Boccaccio, D. Bollini, D. Camporese, F. deNotaristefani, M. C. Giron, U. Mazzi, L. MelendezAlafort, G. Moschini, A. Nadali, F.-L. Navarria, A. Rosato,E. Zangoni: Labelling and biodistribution studies by using a YAP kamera of 99mTc-HAPaclitaxel komplex. www.lnl.infn.it/~annrep/read_an/2005/contributions/pdfs/FBB053T.pdf

15.

R. Rossin, S. Zorzet, C. Turrin, G. Sava, C. Pellizzaro, D. Coradini, I. Scarlata, M. Bello, D. Bollini, F. deNotaristefani, G. Moschini, A. Perbellini, U. Mazzi: 99mTc direct labelling and biodistribution studies on Hyaluronan-butyrate by using YAP-camera. www.lnl.infn.it/~annrep/read_an/2003/contrib_2003/pdfs/B099TTTT.pdf

16.

D. Coradini, S. Zorzet, R. Rossin, I. Scarlata, C. Pellizzaro, C. Turrin, M. Bello, S. Cantoni, A. Speranza, G. Sava, U. Mazzi and A. Perbellini: Inhibition of hepatocellular carcinomas in vitro and hepatic metatases in vivo in mice by the histone deacetylase inhibitor Ha-But. Clinical Cancer Research vol.10, 4822-4830, July 15 (2004)

17.

A. Antoccia, A. Banzato, M. Bello, D. Bernardini, P. Boccaccio, D. Bollini, F. deNotaristefani, M. C. Giron, U. Mazzini, G. Moschini, F-L Navarra, M.Riondato, A.Rosato, A.Sgura, C.Tanzarella, A.Zampieri: Preliminary data on evaluation of Rhenium-188 in radiotherapy application Hyaluronic Acid as vector for liver neoplasies and DNA damane induced by 188Re in vitro systems. www.lnl.infn.it/~annrep/read_an/2004/contrib_2004/B101T.pdf

18.

I. M. S. Dahl, and T.C. Laureát: Cancer: 62, 326 – 330 (1988) – citováno podle 9

19.

A.N. de Belder, and K.O.Wik, Carbohydrate response. 44, 251 – 257 (1975) – citováno podle 9

57

Souhrn Cílem této diplomové práce bylo prostudovat současnou literaturu, která se týká biofyzikálních a farmakologických vlastností hyaluronové kyseliny, které jsou důležité pro aplikaci této biomolekuly v mnoha oblastech medicíny. Druhá část práce se zabývá metodami radioaktivního značení sloučeniny, které jsou používány za účelem studia metabolismu kyseliny hyaluronové in vivo a in vitro. Radioaktivně značená látka má dále využití pro identifikaci hyaluronan - vazebných proteinů, které hrají důležitou roli v mnoha fyziologických a patologických jevech v organismu, pro biodistribuční a farmakokinetické studie například na hyaluronové kyselině založených nových cytostatik vhodných při léčení nádorových onemocnění jater.

Abstract The aim of the work was studying of recent literature about biophysical and pharmacological features of hyaluronic acid, which are important for application of this biomolecule in many regions of medicine. Another part of work deals with methods of radioactive labelling of compound used for studying of metabolism of hyaluronic acid in vivo and in vitro. Radioactive - labelled material is used for identification of hyaluronan - binding proteins, which play important roles in lot of physiological and pathological phenomena in organism, for biodistribution and pharmakokinetic studies for example an antineoplastic agents based on hyaluronic acid available for treatment of liver tumor.

58