Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové. Katedra biofyziky a fyzikální chemie

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biofyziky a fyzikální chemie

Použití polarizovaného světla ke studiu interakcí látek v roztocích (rigorózní práce)

Hradec Králové 2008

Hana Moţíšová

Čestné prohlášení Prohlašuji, ţe jsem rigorózní práci zpracovala samostatně a uvedla veškeré pouţité prameny a pouţitou literaturu.

x. x. 2008

2

Poděkování 3

SOUHRN Tato rigorózní práce se zabývá aplikací polarizovaného světla při studiu interakce tenzidu

(cetrimidu)

a

organického

barviva

fluoresceinu

metodou

fluorescenční

spektofotomerie. V práci je uvedená metoda testována, neboť lze předpokládat její další vyuţití v gerontofarmacii. Na základě výsledků lze konstatovat, ţe mezi FLSS a CTAB dochází k významným interakcím, a dále je moţno o případných agregátech FLSS a CTAB ve zkoumaných roztocích říci, ţe nepatří k tzv. vysoce uspořádaným agregátům a mají relativně volnou strukturu.

4

OBSAH OBSAH ...................................................................................................................................... 5 1. ÚVOD .................................................................................................................................... 7 2. TEORETICKÁ ČÁST ......................................................................................................... 9 2.1. LÁTKY POVRCHOVĚ AKTIVNÍ – TENZIDY ................................................. 10 2.1.1. Rozdělení tenzidů dle schopnosti disociace......................................... 10 2.1.2. Charakteristika tenzidů ............................................................................... 11 2.1.3. Interakce organických barviv s tenzidy .................................................. 11 2.1.4. Tvorba agregátů ............................................................................................ 11 2.1.5. Premicelární agregáty H-typu a J-typu ................................................... 12 2.2. FLUORESCENČNÍ SPEKTROMETRIE – LUMINISCENCE........................... 13 2.2.1. Struktura látek a fotoluminiscence .......................................................... 13 2.2.2. Luminiscence................................................................................................. 13 2.2.3. Charakteristiky fluorescence..................................................................... 15 2.2.4. Vliv prostředí na absorpční a emisní spektra ....................................... 15 2.2.5. Intenzita fluorescence ................................................................................. 16 2.2.6. Polarizovaná fluorescence ......................................................................... 17 2.2.7 Spektrofluorimetrie ....................................................................................... 17 3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ............................................................................................. 20 3.1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE.................................................................................. 21 3.2. POUŽITÉ PŘÍSTROJE ................................................................................... 22 3.3. PŘÍPRAVA ZÁSOBNÍCH ROZTOKŮ ............................................................. 22 3.3.1. Příprava základních vodných roztoků fluoresceinu sodné soli ....... 22 3.3.2. Příprava základních vodných roztoků cetrimidu ................................. 22 3.3.3. Příprava Britton – Robinsonova (BR) pufru .......................................... 22 3.4. PRACOVNÍ POSTUP ..................................................................................... 23 3.4.1. Příprava vzorků ............................................................................................. 23 3.4.2. Spektrofluorimetrie – měření emisních spekter ................................... 24 3.4.2.1. Měření vzorků při spektrálních pološířkách 4 nm ..................................... 24 3.4.2.2. Měření slepých vzorků při spektrálních pološířkách 4 nm ....................... 25 3.4.2.3. Měření vzorků při spektrálních pološířkách 2 nm a 4 nm ........................ 25 3.4.2.4. Měření slepých vzorků při spektrálních pološířkách 2 nm a 4 nm .......... 25 4.VÝSLEDKY ......................................................................................................................... 26

5

4.1. VÝSLEDKY MĚŘENÍ VZORKŮ PŘI SPEKTRÁLNÍCH POLOŠÍŘKÁCH 4 NM .......................................................................................... 27 4.2. VÝSLEDKY MĚŘENÍ SLEPÝCH VZORKŮ PŘI SPEKTRÁLNÍCH POLOŠÍŘKÁCH 4 NM ........................................................................................... 36 4.3. VÝSLEDKY MĚŘENÍ VZORKŮ PŘI SPEKTRÁLNÍCH POLOŠÍŘKÁCH 2 NM A 4 NM .............................................................................. 45 4.4. VÝSLEDKY MĚŘENÍ SLEPÝCH VZORKŮ PŘI SPEKTRÁLNÍCH POLOŠÍŘKÁCH 2 NM A 4 NM .............................................................................. 54 5. DISKUZE ............................................................................................................................ 63 6. ZÁVĚR ................................................................................................................................ 66 7. LITERATURA ................................................................................................................... 68

6

1. ÚVOD

7

Jedním z okruhu zájmů gerontofarmacie je vysvětlení otázek, proč a jak ţivé organismy stárnou. V současnosti se tento obor rozvíjí také na molekulární úrovni. Jsou sledovány změny nitrobuněčných iontů a pH, membránového potenciálu, polarity okolí, „fluidity“ membrán, či přenosu energie mezi molekulami. Jednou z moţností, jak získat určité informace o relativních změnách dynamiky a uspořádání membránových sloţek, je vyuţití metody fluorescenční spektrofotometrie. Ke svým experimentům jsem zvolila následující látky, a to z těchto důvodů: 

Tenzidy obecně jsou povrchově aktivní látky vyuţívané v průmyslu i v teoretickém výzkumu, vykazují smáčecí, emulgační a čistící účinky.Tyto sloučeniny jsou schopné ovlivňovat fotochemické reakce, jsou u nich pozorovány katalytické účinky, a co je zajímavé, mají vlastnosti analogické vlastnostem biologických membrán.



Organické barvivo fluorescein, které je samo o sobě, či v různých sloučeninách pouţíváno jako chemická sonda, fluorescenční sonda nebo značka, při sledování nitrobuněčného prostředí a vlastností buněčných membrán, právě metodou spektrofluorimetrie.

Vzhledem k velmi zajímavým vlastnostem obou skupin látek jsem se zaměřila na studium interakce tenzidu (cetrimidu) a organického barviva (fluoresceinu) v roztocích metodou fluorescenční spektrofotometrie. Uvedené roztoky představují modelové systémy, na nichţ byla pouţitá metoda testována pro případné vyuţití v gerontofarmacii. .

8

2. TEORETICKÁ ČÁST

9

2.1. LÁTKY POVRCHOVĚ AKTIVNÍ – TENZIDY (1) Tenzidy (povrchově aktivní látky, surfaktanty) jsou látky, které ve své struktuře obsahují vţdy dvě části, hydrofobní a hydrofilní, s protikladnou afinitou k danému médiu. Látky s takovouto strukturou jsou nazývány amfipatické nebo také amfifilní. Hydrofobní je nepolární část nebo části molekuly tenzidu, odpuzující vodu. Hydrofobní sloţku tvoří obvykle uhlovodíkové řetězce alkanů, alkenů nebo struktury aromatických sloučenin. Hydrofilní jsou ty polární části molekuly tenzidu, jeţ mají afinitu k vodě a ve vodném médiu jsou v různém rozsahu hydratovány. Hydrofilní části molekuly tenzidu mohou ve vodném roztoku disociovat. Polárními skupinami schopnými disociace, které nalézáme v tenzidech nejčastěji, jsou -COOH, -O-SO3H, -SO3H, -NH2 a kvarterní dusík. 2.1.1. Rozdělení tenzidů dle schopnosti disociace Podle schopnosti disociace ve vodě se rozlišují tenzidy: 

Iontové



Neiontové Skupinu iontových tenzidů dále členíme na tenzidy: 

Anionaktivní



Kationaktivní



Amfoterní

Aniontové tenzidy jsou látky, které ve vodném prostředí disociují na negativně nabitý, povrchově aktivní aniont a obvykle menší kationt. V kationtovém tenzidu povrchově aktivní část nese pozitivní náboj, proti ní stojí malý aniont. Amfoterní tenzidy obsahují aniontové i kationtové funkční skupiny. Jejich náboj závisí na koncentraci protonů, tj. na pH. Při vysokém pH se chovají jako aniontové, při nízkých hodnotách pH jako kationtové. V určité oblasti pH, v blízkosti neutrální oblasti, existují jako amfionty, coţ znamená, ţe se náboj vyrovná. Vykazují malou rozpustnost ve vodě, na stupnici pH se hovoří o isoelektrické oblasti. Neiontové tenzidy nemají schopnost ve vodě disociovat.

10

2.1.2. Charakteristika tenzidů Jsou-li amfipatické látky přítomny v disperzním mediu v nízké koncentraci, existují odděleně a mají velikost částic pod hranicí koloidních dimenzí. Po dosaţení tzv. kritické micelární koncentrace (cmc) se molekuly nebo ionty tenzidu spontánně sdruţují do větších útvarů označovaných jako micely. Tyto soustavy jsou vratné, protoţe potřebným zředěním vznikne opět pravý roztok. V oblasti cmc se prudce mění fyzikální vlastnosti soustavy, jako hustota, povrchové napětí, vodivost, osmotický tlak a další, neboť v mikroměřítku se homogenní soustava mění na heterogenní. 2.1.3. Interakce organických barviv s tenzidy Barviva lze rovněţ povaţovat za amfifilní látky, neboť obsahují objemnou neiontovou část, připojenou k iontovým skupinám. Jelikoţ však postrádají dlouhé alkylové řetězce, jsou pouze slabě povrchově aktivní a netvoří micely ve vodném prostředí. Zvyšování koncentrace barviva můţe směřovat k postupné agregaci (vytváření dimerů, trimerů, polymerů a nakonec koloidů). V případě ţe je tenzid přidán do roztoku agregovaného barviva v koncentraci niţší neţ cmc, monomer tenzidu a agregáty barviva mohou interagovat za tvorby speciálního typu agregátu – tzv. smíšeného agregátu. Přiblíţí-li se koncentrace tenzidu k cmc a nebo ji převýší, je barvivo nakonec inkorporováno do micel tenzidu (2). Interakce tenzidu a barviva závisí na různých faktorech (3), a to především na délce alkylového řetězce tenzidu, na typu a poloze substituentu v aromatickém řetězci barviva. Uvádí se také, ţe pro agregaci je nezbytný dialkyloamino substituent v molekule barviva. 2.1.4. Tvorba agregátů Tvorba agregátů je poměrně běţná pro barvivo a tenzid, jenţ nesou opačný náboj (2,4). R.K. Dutta a S.N. Bhat (4) ve své studii došli k závěru, ţe interakce mezi organickými barvivy a tenzidy jsou jak povahy elektrostatické, tak hydrofobní. Na důleţitost elektrostatických přitaţlivých sil poukazuje i skutečnost, ţe ţádné změny v absorpčních spektrech barviv nebyly pozorovány v přítomnosti souhlasně nabitých tenzidů (4,5,6).

11

Na tvorbu agregátu má také vliv poloha a typ iontové skupiny v molekule barviva. Významnější roli při interakci mezi azobarvivem a tenzidem hraje poloha tohoto iontu v molekule neţ jeho typ. Sledováním spektrálních posunů (7) u barviva, kde je iontová skupina v poloze para (methyloranţ), bylo zjištěno, ţe spektrální posuny jsou výraznější, neţ v případě, kdy se vyskytuje iontová skupina v poloze ortho (methylčerveň) nebo kde iontová skupina zcela chybí (methylţluť). Vliv iontové síly na absorpční spektrum barviva ve vodném roztoku tenzidu byl zkoumán (7) prostřednictvím měnících se koncentrací chloridu sodného, který byl přidáván do soustavy tenzidu (cetyltrimethylamoniumbromid) a azobarviva (MO) ve vodném prostředí a bylo zjištěno, ţe čím je vyšší koncentrace přidávaného chloridu (roste iontová síla v soustavě), tím se zmenšuje absorpční pás v oblasti vlnové délky 380 nm. Toto v podstatě odráţí důleţitost elektrostatických interakcí při tvorbě agregátů. 2.1.5. Premicelární agregáty H-typu a J-typu Indičtí autoři (6) popisují tvorbu premicelárních agregátů při koncentraci tenzidu pod cmc. Při těchto interakcích se mohou tvořit buď nespecifické agregáty, nebo vysoce uspořádané agregáty (H-typu, J-typu). V případě, ţe se koncentrace tenzidu přiblíţí cmc, dochází k rozpadu premicelárních agregátů a inkorporaci molekul barviva do micel tenzidu. V některých případech můţe tvorbě H-agregátu předcházet tvorba J-agregátu. Jednotlivé typy premicelárních agregátů (H-typu, J-typu) se tvoří při rozdílných koncentracích tenzidu. U porphyrinových barviv (6) přeměna monomeru barviva v J-agregát je dokončena, jakmile je koncentrace tenzidu asi dvojnásobná vůči koncentraci barviva. J-agregát obsahuje tudíţ barvivo a tenzid v poměru 1:2. Dalším zvyšováním koncentrace tenzidu se J-agregát stává nestabilním, jestliţe je koncentrace tenzidu oproti koncentraci porphyrinového barviva čtyřnásobná, J-agregát mizí. Vzniká nová forma, H-agregát.

12

2.2. FLUORESCENČNÍ SPEKTROMETRIE – LUMINISCENCE(8)

Molekuly absorbující energii mohou tuto energii předat jiným částicím při vzájemných kolizích nebo mohou emitovat luminiscenční záření.

2.2.1. Struktura látek a fotoluminiscence 

Podmínkou fotoluminiscence je absorpce záření v UV/VIS oblasti.



Skupiny, kde dochází k absorpci a emisi záření, se nazývají fluorofory.



Luminiscenci pozorujeme u látek s konjugovanými dvojnými vazbami, zejména u aromatických sloučenin s rigidní planární multicyklickou strukturou.



Fluorescence bývá ovlivněna hodnotou pH roztoku.



Látky obsahující heteroatomy vykazují výraznější fosforescenci neţ fluorescenci.

2.2.2. Luminiscence

Definice luminiscence: 1.

Luminiscence je přebytek záření nad tepelným vyzařováním tělesa v tom případě, máli toto přebytečné záření konečnou dobu trvání, jeţ podstatně převyšuje periodu světelných kmitů.

2.

Luminiscence je emise světla z nějaké látky a nastává z elektronových excitovaných stavů.

Luminiscence se dělí na: 1.

fluorescenci

2.

fosforescenci

3.

zpoţděnou fluorescenci

13

Jev fluorescence(9) Jev fluorescence je zaloţen na tom, ţe fotony, které tvoří světlo, nesou určitou energii, kterou mohou předat elektronům v různých molekulách. Při tomto předání energie dochází k tzv. excitaci elektronů - tyto se přesouvají do vyšší energetické hladiny (do vyššího orbitalu). Tento stav ale není stabilní - elektron obsahuje nadbytek energie, která má tendenci se opětovně uvolnit, kdyţ je elektron "přitaţen" jádrem molekuly zpátky na niţší energetickou hladinu (do niţšího orbitalu). Tato energie se uvolní v podobě fotonu, který je vyzářen. Děj shrnuje níţe uvedené schéma. Protoţe při kaţdé přeměně energie dochází ke ztrátám - část energie se uvolní do prostředí v podobě tepla (konkrétně v podobě tepelných pohybů molekul), obsahuje vyzářený foton menší mnoţství energie. Protoţe světlo má vlnovou povahu, je vlnová délka vyzářeného (emitovaného) světla delší, neţ vlnová délka světla, které fluorescenci vybudilo (excitovalo).

Obr. 1. Jev fluorescence

Pohlcení a vyzáření jednoho fotonu ovšem není běţným okem ani mikroskopem pozorovatelné. Fluorescenční barviva jsou proto velké molekuly, obsahující velké mnoţství elektronů, které lze snadno a koordinovaně excitovat a které se také rychle vracejí zpět do niţší energetické hladiny. Jako fluorescenční barviva se proto nejčastěji pouţívají aromatické sloučeniny a heterocykly s konjugovanými elektrony, které lze relativně snadno excitovat. Typické fluorofory jsou např.: 

chinin (tonik)

14



fluorescein, rhodamin B (nemrznoucí směsi, fluorescenční značení)



POPOP (scintilátory)



akridinová oranţ (DNA)



umbeliferon (ELISA)



antracén, perylén (znečištění ţivotního prostředí oleji)

2.2.3. Charakteristiky fluorescence(8) Hlavní charakteristiky fluorescence jsou: 1. intenzita – počet fotonů procházejících v daném směru jednotkovou plochou za jednotku času 2. spektrální složení – spektrální hustota fotonového toku na jednotkový interval vlnových délek nebo frekvencí 3. polarizace – směr kmitání elektrického vektoru elektromagnetické vlny 4. doba dohasínání – je dána vnitřní dobou ţivota excitovaného stavu, z něhoţ dochází k emisi; úzce souvisí s pochody vedoucími k nezářivé deaktivaci tohoto stavu 5. koherenční vlastnosti – vztahy mezi fázemi světelných vln 2.2.4. Vliv prostředí na absorpční a emisní spektra V roztocích dochází vlivem elektrostatických interakcí dipól-dipól, nebo dipólindukovaný dipól mezi molekulami fluoroforu a rozpouštědla k solvataci fluoreskujících molekul (Obr. 1.). Protoţe molekuly mají v základním a v excitovaném stavu obecně různé dipólové momenty i polarizovatelnosti, dochází při měření fluorescence v roztocích ke změnám v optických spektrech vlivem různé solvatace molekul. Doba potřebná pro molekulární relaxace je mnohem delší, neţ je rychlost elektronového přechodu, ale obvykle kratší, neţ doba ţivota excitovaného stavu. K emisi proto dochází ze stavu, kdy jiţ bylo dosaţeno rovnováţné konfigurace. Protoţe část absorbované energie se spotřebuje na relaxaci molekul rozpouštědla kolem molekuly fluoroforu v excitovaném i základním stavu, je energie emitovaného fluorescenčního záření menší, neţ by odpovídalo čistě elektronovému přechodu.

15

Obr. 2. Solvatace fluoroforu při absorpci a emisi v roztocích.

  absorpce

fluorescence

  1 – rovnovážná konfigurace v základním stavu 2 – nerovnovážná konfigurace v excitovaném stavu (Franckův-Condonův stav) 3 – rovnovážná konfigurace v excitovaném stavu 4 – nerovnovážná konfigurace v základním stavu (Franckův-Condonův stav)

2.2.5. Intenzita fluorescence Intenzita fluorescence je úměrná intenzitě absorpce násobené kvantovým výtěţkem fluorescence. Jestliţe fluorescenci měříme pod „magickými“ úhly 54°44´8´´ nebo 125°15´51´´ ke směru excitačního paprsku, potom není její intenzita ovlivněna případnou anizotropií emise systému. Při pouţití citlivých fotonásobičů pro detekci fluorescenčního záření a při buzení intenzivním světlem lze detekovat koncentrace rozpuštěných látek aţ 10-12 mol/l, coţ je alespoň o 4 řády vyšší citlivost, neţ pro absorpční měření. Protoţe kvantový výtěţek fluorescence roztoků sloţitých molekul je obvykle nezávislý na vlnové délce budícího záření, je excitační spektrum fluorescence zředěných roztoků přesnou replikou jejich absorpčního spektra a lze tak spektrofluorimetricky získat absorpční spektrum fluoreskující látky při daleko niţších koncentracích, neţ při přímém měření absorpce na spektrofotometru.

16

2.2.6. Polarizovaná fluorescence Je-li roztok fluoroforů excitován lineárně polarizovaným zářením, potom budou excitovány pouze ty molekuly, které mají nenulový průmět svého absorpčního přechodového momentu do směru polarizace (fotoselekce). Je-li průměrná rotační relaxační doba (charakterizující rotační difúzi v roztocích) mnohem delší neţ doba dohasínání fluorescence, potom také výsledná fluorescence bude polarizována. Bude-li naopak průměrná rotační relaxační doba mnohem kratší neţ doba dohasínání fluorescence, potom anizotropie systému klesne ještě před emisí na limitní hodnotu (v izotropním systému o malé viskozitě aţ na nulu). Pokud jsou doba dohasínání fluorescence a rychlost molekulární reorientace srovnatelné, potom bude polarizace fluorescence modulována molekulárním pohybem a analýza časové závislosti emisní anizotropie bude poskytovat informaci o anizotropii systému, v němţ se fluorofor nachází. Měření polarizace fluorescence poskytuje informace o molekulární orientaci a pohyblivosti a procesech, které je modulují, např.: 

fluidita membrán



interakce ligand-receptor



proteolýza



interakce protein-DNA



kontrakce svalů



aktivita proteinkináz

2.2.7 Spektrofluorimetrie Spektrofluorimetry mají zdroj budícího záření v ultrafialové a viditelné oblasti spektra. Pro měření ustálené fluorescence se běţně pouţívají vysokotlaké výbojky, přístroje pro měření časově rozlišené fluorescence vyuţívají jako zdroj budícího záření obvykle pulzní laser. Budící záření prochází excitačním monochromátorem a dopadá na vzorek (obvykle temperovaná kyveta s roztokem). Nejčastěji ve směru kolmém k budícímu paprsku se měří emitované fluorescenční záření, které nejprve prochází emisním monochromátorem a je detekováno

pomocí

fotonásobiče.

Pouţívá

se

uspořádání

s jedním

emisním

monochromátorem (uspořádání „L“) nebo se dvěma protilehlými emisními monochromátory (uspořádání „T“). Při měření polarizované fluorescence jsou za excitační monochromátor a

17

před emisní monochromátor zařazeny polarizátory, které jsou otočné kolem osy paprsku jimi procházejícího. Při měření emisních spekter fluorescence je excitační monochromátor nastaven na pevnou vlnovou délku budícího záření. Při měření excitačních spekter je pevně nastavena vlnová délka na emisním monochromátoru. Kromě vlnových délek excitace a emise se běţně nastavují ještě šířky štěrbin obou monochromátorů, které ovlivňují citlivost a spektrální rozlišení daného měření. Polarizovaná fluorescence roztoků se měří ve směru kolmém ke směru budícího paprsku, který je polarizován ve svislém směru. Je přitom nutno provádět korekci na vliv emisního monochromátoru spektrofluorimetru na polarizaci jím procházejícího záření. Anizotropie fluorescence se určuje ze vztahu

(1. 1)

r = (IIIV - G IV)/(IIIV + 2 G IV)

kde IIIV a IV jsou sloţky světelné intenzity rovnoběţné nebo kolmé k směru (vertikálnímu) polarizace budícího záření a G je korekční faktor, který lze změřit při excitačním záření polarizovaném vodorovně jako poměr IH/IIIH. U fluoroforů s dlouhou dobou ţivota v roztocích o malé viskozitě je faktor G při měření excitačního spektra konstantní.

18

Obr. 3. Uspořádání při měření polarizované fluorescence.

Kyveta se vzorkem

Monochromátor

Štěrbina

Fotonásobič

Štěrbina

Monochromátor

Zdroj světla

Bude-li analyzátor otočen o „magický“ úhel 54,74° (=54°44´8´´), potom je

(1.2)

I54,7(t) = III (t) + 2 I(t)

V roztocích, kde je doba dohasínání fluorescence srovnatelná s rotační relaxační dobou je nutno měřit celkovou intenzitu fluorescence pomocí analyzátoru otočeného o 54,7°, čímţ se získají hodnoty dohasínání fluorescence neovlivněné molekulárními rotacemi.

19

3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

20

3.1. POUŽITÉ CHEMIKÁLIE Během svých experimentů jsem pouţila níţe uvedené chemikálie: -

Cetrimid – cetyltrimethylamoniumbromid (viz vzorec č. 1), MERCK (for cosmetics), pouţitá zkratka CTAB

-

Hydroxid sodný, Lachema s. p. Brno, o. z. Neratovice

-

Lihomethanol, FaF UK

-

Destilovaná voda, FaF UK

-

Fluorescein sodná sůl (viz vzorec č. 2), Spolek pro chemickou a hutní výrobu, n. p. Praha, pouţitá zkratka FLSS

-

Kyselina octová, Lachema a. s. , Neratovice

-

Kyselina fosforečná, Lachema s. p. Brno, o. z. Neratovice

-

Kyselina boritá, Lachema s. p. Brno

Vzorec č. 1: Cetrimid (Mr = 364,46)

N Vzorec č. 2: Fluorescein sodná sůl (Mr = 376,28)

21

Br

3.2. POUŽITÉ PŘÍSTROJE V průběhu své práce jsem uţívala tyto přístroje: -

digitální analytické váhy – Sartorius

-

fluorimetr AMINCO- Bowman Series 2

-

pH-metr PerpHect 350 - ORION

3.3. PŘÍPRAVA ZÁSOBNÍCH ROZTOKŮ

3.3.1. Příprava základních vodných roztoků fluoresceinu sodné soli Na analytických váhách jsem naváţila 0,09407 g barviva FLSS, toto mnoţství jsem kvantitativně přenesla do odměrné baňky, rozpustila a doplnila na 50 ml destilovanou vodou. Získala jsem tak základní roztok FLSS o koncentraci 5.10 -3 mol.l-1 . Potřebné roztoky niţších koncentrací jsem připravila příslušným ředěním roztoku základního. 3.3.2. Příprava základních vodných roztoků cetrimidu Základní roztok tenzidu o koncentraci 5.10

-3

mol.l-1 jsem připravila naváţením

0,091115 g cetrimidu na analytických vahách, rozpuštěním a následným doplněním destilovanou vodou na objem 50 ml v odměrné baňce. Potřebné roztoky niţších koncentrací jsem připravila příslušným ředěním roztoku základního. 3.3.3. Příprava Britton – Robinsonova (BR) pufru Při svých experimentech jsem potřebovala BR pufr o hodnotě pH 7,96, který jsem připravila takto. Ke 100 ml základního roztoku kyselin o koncentraci 0,04 mol.l-1, který jsem připravila dle publikace (1), jsem přidala 60ml 0,2 mol.l-1 hydroxidu sodného.

22

3.4. PRACOVNÍ POSTUP 3.4.1. Příprava vzorků K přípravě roztoků barviva FLSS jsem pouţila třináct kádinek, do kterých jsem odpipetovala 0,8 ml roztoku cetrimidu o koncentraci 1.10

-4

mol.l-1 , potřebné mnoţství

roztoku FLSS o koncentraci dle rozpisu tabulky ( viz tabulka č. 1). Objem jsem doplnila BR pufrem o pH 7,96 na 4 ml. Potom jsem vzorky promíchala a ponechala 10 minut stát. Dále jsem připravila slepé vzorky, které odpovídaly roztokům FLSS o různé koncentraci. Tyto slepé vzorky jsem připravila odpipetováním potřebného mnoţství zásobního roztoku FLSS o koncentracích odpovídajících rozpisu tabulky č. 1. Roztok tenzidu byl ve slepých vzorcích nahrazen vodou a vzorky byly doplněny BR pufem o pH 7,96 na objem 4 ml. Tabulka č. 1: Koncentrační řada barviva FLSS Slepý roztok

Vzorek Koncentrace

Objem zás.

Objem

Koncentrace

Objem zás.

Objem BR

zás. roztoku

roztoku

BR pufru

barviva

roztoku

pufru

FLSS

FLSS

[ml]

ve vzorku

barviva

[ml]

[ mol.l-1 ]

[ml]

[mol.l-1 l]

[ml]

2,5. 10 -4

0,32

2,88

2,00. 10 -5

0,00

3,20

2,5. 10 -4

0,35

2,85

2,19. 10 -5

0,03

3,17

2,5. 10 -4

0,38

2,82

2,38. 10 -5

0,06

3,14

2,5. 10 -4

0,41

2,79

2,56. 10 -5

0.09

3,11

2,5. 10 -4

0,45

2,75

2,81. 10 -5

0,13

3,07

2,5. 10 -4

0,48

2,72

3,00. 10 -5

0,16

3,04

2,5. 10 -4

0,64

2,56

4,00. 10 -5

0,32

2,88

2,5. 10 -4

0,80

2,40

5,00. 10 -5

0,48

2,72

2,5. 10 -4

0,96

2,24

6,00. 10 -5

0,64

1,60

2,5. 10 -4

1,12

2,08

7,00. 10 -5

0,80

2,40

2,5. 10 -4

1,28

1,92

8,00. 10 -5

0,96

2,24

5,00. 10 -4

0,80

2,40

1,00. 10 -4

0,64

2,56

5,00. 10 -4

0,96

2,24

1,20. 10 -4

0,80

2,40

23

3.4.2. Spektrofluorimetrie – měření emisních spekter

U vzorků, které jsem připravila postupem uvedeným v kapitole 3.4.1., jsem proměřila emisní spektra.

U kaţdého z proměřených emisních spekter byly zároveň odečteny hodnoty

emisních maxim (EM) a hodnoty intenzit fluorescence (IF), které jsem pouţila pro výpočet hodnot r (Anizotropie) (viz 1.1), G (korekční faktor) a hodnot I54,7 (viz 1.2). 3.4.2.1. Měření vzorků při spektrálních pološířkách 4 nm Nejprve jsem měřila emisní spektra vzorků při nastavení spektrálních pološířek na hodnoty 4 nm (spektrální pološířka před polarizátorem) a 4 nm (spektrální pološířka za analyzátorem). Citlivost přístroje jsem nastavila u vzorků 1-6 na slepý vzorek č. 6 a pro vzorky 7-13 na slepý vzorek č. 13. V první sérii měření byl polarizátor za emisním monochromátorem nastaven do polohy open (nepolarizovaný paprsek) a polarizátor před analyzátorem na tzv. magický úhel 54,7°, dále na úhel 0° (vertikální polarizace) a 90° (horizontální polarizace). U dalších měření zůstalo

nastavení analyzátoru stejné jako v předchozím případě,

polarizátor emisního monochromátoru pak byl nastaven tak, ţe jím procházel vertikálně polarizovaný excitační paprsek (0°). Poslední sérii měření jsem provedla při excitaci horizontálně polarizovaným paprskem (90°) a při emisi vertikálně (0°) a horizontálně polarizovaným paprskem (90°). V tomto případě bylo nutné nastavit citlivost přístroje pro všechny vzorky na slepý vzorek číslo 13. Pro výpočet hledaných hodnot (r, G, I54,7 ) bylo potřebné odečíst hodnoty IF maxim emisních spekter, která byla naměřena při excitaci nepolarizovaným (open), vertikálně polarizovaným (0°) a horizontálně polarizovaným

paprskem (90°) a emisi horizontálně

polarizovaným paprskem (90°), při takových EM, které odpovídaly EM při emisi vertikálně polarizovaným paprskem (0°).

24

3.4.2.2. Měření slepých vzorků při spektrálních pološířkách 4 nm Emisní spektra slepých vzorků připravených dle tabulky č. 1 jsem proměřila postupem popsaným v kapitole 3.4.2.1. Z měření byl vyjmut slepý vzorek číslo 1, neboť neobsahuje barvivo FLSS. I při těchto měřeních byly zároveň odečteny hodnoty emisních maxim (EM) a hodnoty intenzit fluorescence (IF). 3.4.2.3. Měření vzorků při spektrálních pološířkách 2 nm a 4 nm Identický postup proměřování popsaný v kapitole 3.4.2.1., jsem aplikovala znovu na stejných 13 vzorků s tím rozdílem, ţe spektrální pološířka před polarizátorem byla nastavena na hodnotu 2 nm a spektrální pološířka za analyzátorem na hodnotu 4 nm.

3.4.2.4. Měření slepých vzorků při spektrálních pološířkách 2 nm a 4 nm Slepé vzorky č. 2-13 jsem proměřila postupem opsaným v kapitole 3.4.2.2. Slepý vzorek č. 1 byl z měření z výše uvedených důvodů vyjmut.

25

4.VÝSLEDKY

26

4.1. Výsledky měření vzorků při spektrálních pološířkách 4 nm

1. série měření – polarizátor v poloze „ open“ Nejprve bylo provedeno měření vzorků připravených postupem uvedeným v kapitole 3.4.1., kde byl polarizátor nastaven do polohy „open“ (nepolarizovaný paprsek) a analyzátor na tzv. „magický“ úhel 54,7°, dále na úhel 0° (vertikální polarizace) a 90° (horizontální polarizace). Tabulka č. 2.: Naměřené EM a IF při nastavení open-0°, 90° a 54,7°

Vzorek

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Emisní maximum [nm], intenzita fluorescence EM IF EM IF EM IF EM IF EM IF EM IF EM IF EM IF EM IF EM IF EM IF EM IF EM IF

open 54,7°

0°

90°

517 4,30359 517 4,96185 517 5,36774 517 5,61096 518 6,02661 518 6,40015 519 0,889577 519 1,0849 521 1,25336 521 1,40015 521 1,49139 523 1,8396 524 2,12769

517 5,41595 517 6,34735 517 6,7727 519 7,07886 519 7,60406 518 8,10394 519 1,12885 521 1,39191 521 1,58813 521 1,79474 522 1,90277 523 2,37701 525 2,74323

517 3,49976 517 4,13574 517 4,4458 517 4,5813 517 4,93988 517 5,26672 518 0,725708 519 0,892029 521 1,01929 520 1,14838 521 1,21979 523 1,49933 523 1,17615

27

Pro další výpočty jsem potřebovala hodnoty IF stejných vlnových délek. Srovnávací hodnotou pro hledaný odečet byla vlnová délka emisního maxima při nastavení polarizátorů open-0° . Tabulka č. 3.: Hodnoty intenzit fluorescence pro výpočet I54,7 při nepolarizovaném excitačním světle Vzorek 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Vlnová délka [nm], intenzita fluorescence λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF

open 0°

90°

517 5,41595 517 6,34735 517 6,7727 519 7,07886 519 7,60406 518 8,10394 519 1,12885 521 1,39191 521 1,58813 521 1,79474 522 1,90277 523 2,37701 525 2,74323

517 3,49976 517 4,13574 517 4,4458 519 4,53461 519 4,92554 518 5,24109 519 0,725098 521 0,883484 521 1,01929 521 1,14777 522 1,21307 523 1,49933 525 1,72028

Z hodnot uvedených v tabulce č. 3 jsem vypočetla pro kaţdý vzorek hodnotu I54,7 podle vztahu (1.2). Vypočítané hodnoty uvádím v tabulce č. 4.

28

Tabulka č. 4.: Vypočtené hodnoty I54,7 Vzorek

I 54,7  I 0  2  I 90

1

12,41547

2

14,61883

3

15,6643

4

16,14808

5

17,45514

6

18,58612

7

2,579046

8

3,158878

9

3,62671

10

4,09028

11

4,32891

12

5,37567

13

6,18379

Obrázek č. 4.: Graf k tabulce č. 4. Závislost intenzity fluoreccence (I 54,7) na koncentraci vodného roztoku FLSS 25 20 15 I(54,7) 10 5 0 2,00 2,19 2,38 2,56 2,81 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 1,00 1,20 E-05 E-05 E-05 E-05 E-05 E-05 E-05 E-05 E-05 E-05 E-05 E-04 E-04 c [ mol.l-1 ]

29

2. série měření – polarizátor v poloze „ 0°“ Měření proběhlo při nastavené vertikální polarizaci excitačního paprsku. Analyzátor byl postupně nastaven stejně jako v 1.sérii experimentů. Tabulka č. 5.: Naměřené EM a IF při nastavení 0° - 0°, 90° a 54,7°

Vzorek

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13


0° 54,7°

0°

90°

517 1,28387 517 1,51947 517 1,62872 517 1,69617 518 1,83594 519 1,94 520 0,267334 520 0,328979 521 0,376892 521 0,422668 523 0,447998 523 0,555725 524 0,647583

517 1,64642 518 1,93268 517 2,06146 519 2,15271 519 2,35016 519 2,48871 519 0,345459 521 0,421448 521 0,488892 521 0,548401 522 0,58197 523 0,722961 525 0,84198

517 1,06628 517 1,25702 517 1,38519 518 1,38794 517 1,50208 519 1,59515 519 0,220032 520 0,269165 521 0,309143 521 0,348816 522 0,367126 522 0,451965 524 0,524902

Pro další výpočty jsem potřebovala hodnoty IF stejných vlnových délek. Srovnávací hodnotou pro hledaný odečet byla vlnová délka emisního maxima při nastavení polarizátoru i analyzátoru do polohy 0°.

30

Tabulka č 6.: Hodnoty intenzit fluorescence pro výpočet I54,7 a r při vertikálně polarizovaném excitačním světle Vzorek 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13


0° 0°

90°

517 1,64642 518 1,93268 517 2,06146 519 2,15271 519 2,35016 519 2,48871 519 0,345459 521 0,421448 521 0,488892 521 0,548401 522 0,58197 523 0,722961 525 0,84198

517 1,06628 518 1,25553 517 1,38519 519 1,37238 519 1,48865 519 1,59515 519 0,220032 521 0,265808 521 0,309143 521 0,348816 522 0,367126 523 0,451965 525 0,523682

Podle vztahu (1.2) jsem z naměřených hodnot vypočetla hodnotu I54,.

31


I 54,7  I 0  2  I 90

1

3,77898

2

4,44374

3

4,83184

4

4,89747

5

5,32746

6

5,67901

7

0,785523

8

0,953064

9

1,107178

10

1,246033

11

1,316222

12

1,626891

13

1,889344

Obrázek č. 5.: Graf k tabulce č. 7 Závislost intenzity fluoreccence (I 54,7) na koncentraci vodného roztoku FLSS 7 6 5 4 I(54,7) 3 2 1 0 2,00E- 2,19E- 2,38E- 2,56E- 2,81E- 3,00E- 4,00E- 5,00E- 6,00E- 7,00E- 8,00E- 1,00E- 1,20E05 05 05 05 05 05 05 05 05 05 05 04 04 c [ mol.l-1 ]

32

3.série měření – polarizátor v poloze „ 90°“ Polarizátor jsem nastavila tak, ţe jím procházel horizontálně polarizovaný paprsek. Analyzátor byl postupně nastaven stejně jako v 1.sérii experimentů. Tabulka č. 8.: Naměřené EM a IF při nastavení 90° - 0°, 90°

Vzorek

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13


90° 0°

90°

518 2,22961 518 2,51312 518 2,75665 517 2,82562 518 3,04779 519 3,34381 519 4,28162 520 5,05798 521 6,09558 521 6,92352 523 7,4707 523 9,73267 523 6,48865

517 1,48041 517 1,6748 518 1,81885 518 1,86707 518 2,01538 519 2,1817 519 2,79053 519 3,33405 521 3,95569 521 4,48608 522 4,84039 523 6,28479 522 4,15436

Pro další výpočty jsem potřebovala hodnoty IF stejných vlnových délek. Srovnávací hodnotou pro hledaný odečet byla vlnová délka emisního maxima při nastavení polarizátoru na 90° a analyzátoru na 0°.

33

Tabulka č. 9.: Hodnoty intenzit fluorescence pro výpočet G při horizontálně polarizovaném excitačním světle Vzorek 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13


90° 0°

90°

518 2,22961 518 2,51312 518 2,75665 517 2,82562 518 3,04779 519 3,34381 519 4,28162 520 5,05798 521 6,09558 521 6,92352 523 7,4707 523 9,73267 523 6,48865

518 1,46179 518 1,64308 518 1,81885 517 1,86127 518 2,01538 519 2,1817 519 2,79053 520 3,32764 521 3,95569 521 4,48608 523 4,7995 523 6,28479 523 4,1539

Pro výpočet hodnot korekčního faktoru G jsem pouţila hodnoty uvedené v tabulce č. 9, a následně pro hodnoty anizotropie r ( viz. vztah 1.1) výsledky z tabulky č.6. Vypočtené hodnoty uvádím v tabulce č. 10.

34

Tabulka č. 10.: Hodnoty korekčního faktoru G a anizotropie r Vzorek

G

I I

H

r

90 H 0

I

I V 0



 G  I 90 V  2  G  I 90

V 0

1

0,655626

0,311156

2

0,653801

0,311048

3

0,659804

0,295037

4

0,658712

0,315273

5

0,661259

0,316231

6

0,652459

0,316819

7

0,651746

0,31957

8

0,657899

0,319728

9

0,648944

0,32386

10

0,647948

0,322248

11

0,642443

0,328478

12

0,645742

0,32993

13

0,640179

0,335032

V



Obrázek č. 6.: Graf k tabulce č. 10 Závislost hodnot anizotropie na koncentraci vodného roztoku FLSS 0,4 0,38 0,36 0,34 0,32 r 0,3 0,28 0,26 0,24 0,22 0,2 2,00 E-05

2,19 2,38 2,56 E-05 E-05 E-05

2,81 3,00 E-05 E-05

4,00 5,00 6,00 E-05 E-05 E-05

c [ mol.l-1 ]

35

7,00 8,00 1,00 E-05 E-05 E-04

1,20 E-04

4.2. Výsledky měření slepých vzorků při spektrálních pološířkách 4 nm 1. série měření – polarizátor v poloze „ open“ Byla provedena série měření vzorků připravených postupem uvedeným v kapitole 3.4.1., kde byl polarizátor nastaven do polohy „open“ (nepolarizovaný paprsek) a analyzátor na tzv. „magický“ úhel 54,7°, dále na úhel 0° (vertikální polarizace) a 90° (horizontální polarizace). Z měření byl vyjmut slepý vzorek č. 1, neboť neobsahuje barvivo FLSS. Tabulka č. 11.: Naměřené EM a IF při nastavení open-0°, 90° a 54,7°

Vzorek

Emisní maximum [nm], intenzita fluorescence

open 54,7°

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

0°

90°

513 0,590515 513 1,11115 515 1,6745 515 2,33429 515 2,83112 519 0,621338 519 0,824585 521 0,843506 521 1,27228 521 1,42487 523 1,83472 525 2,33978

513 0,392456 513 0,741577 513 1,11267 515 1,55121 515 1,87073 517 0,40802 517 0,535583 521 0,834656 521 0,817566 521 0,924683 521 1,17645 523 1,50177

EM IF EM IF EM IF EM IF EM IF EM IF EM IF EM IF EM IF EM IF EM IF EM IF

514 0,466309 514 0,880127 515 1,32446 515 1,84143 514 2,22626 517 0,486145 519 0,650024 521 1,0144 521 0,993652 521 1,11725 521 1,4212 523 1,79962

Pro další výpočty jsem potřebovala hodnoty IF stejných vlnových délek. Srovnávací hodnotou pro hledaný odečet byla vlnová délka emisního maxima při nastavení polarizátorů open-0° .

36

Tabulka č. 12.: Hodnoty intenzit fluorescence pro výpočet I54,7 při nepolarizovaném excitačním světle

Vzorek

Emisní maximum[nm], intenzita fluorescence

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

open 0°

90°


513 0,590515 513 1,11115 515 1,6745 515 2,33429 515 2,83112 519 0,621338 519 0,824585 521 0,843506 521 1,27228 521 1,42487 523 1,83472 525 2,33978

513 0,392456 513 0,741577 515 1,10901 515 1,55121 515 1,87073 519 0,406189 519 0,535278 521 0,834656 521 0,817566 521 0,924683 523 1,16913 525 1,48621


37


I 54,7  I 0  2  I 90

1

-

2

1,375427

3

2,594304

4

3,89252

5

5,43671

6

6,57258

7

1,433716

8

1,895141

9

2,512818

10

2,907412

11

3,274236

12

4,17298

13

5,3122

Obrázek č. 7.: Graf k tabulce č. 13 Závislost intenzity fluoreccence (I 54,7) na koncentraci vodného roztoku FLSS 7 6 5 I (54,7)

4 3 2 1 0 2,19 E-05

2,38 E-05

2,56 E-05

2,81 E-05

3,00 E-05

4,00 5,00 E-05 E-05 c [ mol.l-1 ]

38

6,00 E-05

7,00 E-05

8,00 E-05

1,00 E-04

1,20 E-04

2. série měření – polarizátor v poloze „ 0°“ Provedla jsem měření vzorků, kde byl polarizátor nastaven do polohy „ 0° “ (nepolarizovaný paprsek) a analyzátor na tzv. magický úhel 54,7°, dále na úhel 0° (vertikální polarizace) a 90° (horizontální polarizace). Z měření byl vyjmut slepý vzorek č 1. Tabulka č. 14.: Naměřené EM a IF při nastavení 0° - 0°, 90° a 54,7°

Vzorek


0° 54,7°

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

0°

90°

513 0,180359 513 0,342407 515 0,512085 515 0,723572 517 0,871887 517 0,189514 519 0,251465 521 0,396118 521 0,390625 521 0,435181 523 0,559082 524 0,72113

513 0,117493 513 0,223389 515 0,336914 515 0,4776 515 0,569763 517 0,122207 519 0,160828 521 0,25177 521 0,248718 521 0,432434 521 0,354309 523 0,457153


514 0,140381 514 0,267029 515 0,398254 515 0,560608 515 0,678406 517 0,146484 519 0,192875 521 0,30426 521 0,298767 521 0,332031 523 0,427246 524 0,551453

¨ Pro další výpočty jsem potřebovala hodnoty IF stejných vlnových délek. Srovnávací hodnotou pro hledaný odečet byla vlnová délka emisního maxima při nastavení polarizátoru i analyzátoru do polohy 0°.

39

Tabulka č. 15.:

Hodnoty intenzit fluorescence pro výpočet I54,7 a r při vertikálně

polarizovaném excitačním světle

Vzorek


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

0° 0°

90°

λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF

513 0,180359 513 0,342407 515 0,512085 515 0,723572 517 0,871887 517 0,189514 519 0,251465 521 0,396118 521 0,390625 521 0,435181 523 0,559082 524 0,72113

513 0,117493 513 0,223389 515 0,336914 515 0,4776 517 0,561523 517 0,122207 519 0,160828 521 0,25177 521 0,248718 521 0,432434 523 0,352173 524 0,457153


40


I 54,7  I 0  2  I 90

1

-

2

0,415345

3

0,789185

4

1,185913

5

1,678772

6

1,994933

7

0,433928

8

0,573121

9

0,899658

10

0,888061

11

1,300049

12

1,263428

13

1,635436

Obrázek č. 8.: Graf k tabulce č. 16 Závislost intenzity fluoreccence (I 54,7) na koncentraci vodného roztoku FLSS 7 6 5 I (54,7)

4 3 2 1 0 2,19E- 2,38E- 2,56E- 2,81E- 3,00E- 4,00E- 5,00E- 6,00E- 7,00E- 8,00E- 1,00E- 1,20E05 05 05 05 05 05 05 05 05 05 04 04 c [mol.l-1]

41

3.série měření – polarizátor v poloze „ 90°“ Polarizátor jsem nastavila tak, ţe jím procházel horizontálně polarizovaný paprsek. Analyzátor byl postupně nastaven stejně jako v 1.sérii experimentů . Nebyl měřen slepý vzorek č. 1. Tabulka č.17 .: Naměřené EM a IF při nastavení 90° -0°, 90°

Vzorek


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

90° 0°

90°


511 0,0119019 513 0,0283813 513 0,0454712 515 0,0662231 517 0,0778198 517 0,155945 519 0,193787 521 0,318909 521 0,315857 521 0,358887 523 0,449829 523 0,615234

511 0,00701904 513 0,0180054 513 0,0289917 515 0,0436401 516 0,0509644 517 0,102539 519 0,126953 521 0,206604 521 0,205383 521 0,232544 521 0,293274 523 0,396729


42

Tabulka č. 18.: Hodnoty intenzit fluorescence pro výpočet G

při

horizontálně


Vzorek


90° 0°

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

90°


511 0,0119019 513 0,0283813 513 0,0454712 515 0,0662231 517 0,0778198 517 0,155945 519 0,193787 521 0,318909 521 0,315857 521 0,358887 523 0,449829 523 0,615234

511 0,00701904 513 0,0180054 513 0,0289917 515 0,0436401 517 0,0506592 517 0,102539 519 0,126953 521 0,206604 521 0,205383 521 0,232544 523 0,290527 523 0,396729

Pro výpočet hodnot korekčního faktoru G jsem pouţila hodnoty uvedené v tabulce č. 18, a následně pro hodnoty anizotropie r ( viz. vztah 1.1) výsledky z tabulky č. 15. Vypočtené hodnoty uvádím v tabulce č. 19.

43

Tabulka č. 19.: Hodnoty korekčního faktoru G a anizotropie r

G

Vzorek

I I

H

r

90 H 0

I

I

V 0

V 0

 G  I 90

V

 2G  I

1

-

-

2

0,589741

0,348243

3

0,634411

0,320663

4

0,637584

0,315676

5

0,658986

0,302165

6

0,650981

0,31588

7

0,657533

0,311683

8

0,655116

0,316114

9

0,647846

0,322579

10

0,65024

0,320551

11

0,647959

0,32567

12

0,645861

0,327051

13

0,644842

0,325272



V 90



Obrázek č. 9.: Graf k tabulce č. 19 Závislost hodnot anizotropie na koncentraci vodného roztoku FLSS 0,4 0,38 0,36 0,34 0,32 r 0,3 0,28 0,26 0,24 0,22 0,2 2,19 E-05

2,38 E-05

2,56 E-05

2,81 E-05

3,00 E-05

4,00 E-05

5,00 E-05

c [mol.l-1]

44

6,00 E-05

7,00 E-05

8,00 E-05

1,00 E-04

1,20 E-04

4.3. Výsledky měření vzorků při spektrálních pološířkách 2 nm a 4 nm

1. série měření – polarizátor v poloze „ open“ Provedla jsem měření vzorků připravených postupem uvedeným v kapitole 3.4.1., kde byl polarizátor nastaven do polohy „open“ (nepolarizovaný paprsek) a analyzátor na tzv. „magický“ úhel 54,7°, dále na úhel 0° (vertikální polarizace) a 90° (horizontální polarizace). Tabulka č. 20.: Naměřené EM a IF při nastavení open-0°, 90° a 54,7°

Vzorek

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13


open 54,7°

0°

90°

517 1,40991 517 1,69586 517 1,80481 517 1,93695 518 2,06879 518 2,24609 519 3,04535 520 3,63617 521 4,45404 522 4,8589 521 5,30579 523 6,34491 525 7,69165

516 1,77246 517 2,15637 518 2,28912 518 2,453 519 2,62421 519 2,74821 520 3,88397 521 4,59381 521 5,64667 523 6,18436 523 6,73279 523 8,11005 525 9,84802

516 1,16974 517 1,39252 517 1,48315 517 1,60431 517 1,70135 517 1,853603 520 2,50458 520 2,96692 521 3,61481 521 3,95264 523 4,27948 523 5,16876 524 6,25671

Pro další výpočty jsem potřebovala hodnoty IF stejných vlnových délek. Srovnávací hodnotou pro hledaný odečet byla vlnová délka emisního maxima při nastavení polarizátorů open-0° .

45

Tabulka č. 21.: Hodnoty intenzit fluorescence pro výpočet I54,7 při nepolarizovaném excitačním světle

Vzorek

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Emisní maximum [nm], intenzita fluorescence λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF

open 0°

90°

516 1,77246 517 2,15637 518 2,28912 518 2,453 519 2,62421 519 2,74821 520 3,88397 521 4,59381 521 5,64667 523 6,18436 523 6,73279 523 8,11005 525 9,84802

516 1,16974 517 1,39252 518 1,47369 518 1,59271 519 1,67847 519 1,84326 520 2,50458 521 2,95197 521 3,61481 523 3,9328 523 4,27948 523 5,16876 525 6,24573


46


I 54,7  I 0  2  I 90

1

4,11194

2

4,94141

3

5,2365

4

5,63842

5

5,98115

6

6,43473

7

8,89313

8

10,49775

9

12,87629

10

14,04996

11

15,29175

12

18,44757

13

22,33948

Obrázek č. 10.: Graf k tabulce č. 22 Závislost intenzity fluoreccence (I 54,7) na koncentraci vodného roztoku FLSS 25 20 15 I(54,7) 10 5 0 2,00 2,19 2,38 2,56 2,81 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 1,00 1,20 E-05 E-05 E-05 E-05 E-05 E-05 E-05 E-05 E-05 E-05 E-05 E-04 E-04 c [ mol.l-1 ]

47

2. série měření – polarizátor v poloze „ 0°“ Měření jsem provedla při nastavené vertikální polarizaci excitačního paprsku. Analyzátor byl postupně nastaven stejně jako v 1.sérii experimentů. Tabulka č. 23.: Naměřené EM a IF při nastavení 0° - 0°, 90° a 54,7°

Vzorek

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13


0° 54,7°

0°

90°

516 0,4245 517 0,510559 518 0,544739 518 0,585022 519 0,620728 519 0,678101 519 0,92926 521 1,09497 521 1,3327 521 1,46942 523 1,58875 523 1,90521 524 2,2998

517 0,545654 519 0,653076 518 0,700684 519 0,748291 518 0,799255 519 0,874634 520 1,19629 521 1,41479 521 1,71967 522 1,89819 523 2,05994 523 2,48993 525 3,03131

517 0,352173 517 0,422058 517 0,451965 517 0,482788 517 0,519104 518 0,56366 518 0,762939 520 0,906372 521 1,09528 521 1,21155 522 1,3089 523 1,57135 524 1,89545


48

Tabulka č. 23.: Hodnoty intenzit fluorescence pro výpočet I54,7 a r při vertikálně polarizovaném excitačním světle

Vzorek

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Emisní maximum [nm], intenzita fluorescence λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF λ IF

0° 0°

90°

517 0,545654 519 0,653076 518 0,700684 519 0,748291 518 0,799255 519 0,874634 520 1,19629 521 1,41479 521 1,71967 522 1,89819 523 2,05994 523 2,48993 525 3,03131

517 0,352173 51 0,415955 518 0,447998 519 0,480347 518 0,515137 519 0,561829 520 0,76803 521 0,91489 521 1,09528 522 1,21033 523 1,29333 523 1,57135 524 1,87836


49


I 54,7  I 0  2  I 90

1

1,25

2

1,484986

3

1,59668

4

1,708985

5

1,829529

6

1,998292

7

2,73235

8

3,24457

9

3,91023

10

4,31885

11

4,6466

12

5,63263

13

6,78803

Obrázek č. 11.: Graf k tabulce č. 25 Závislost intenzity fluoreccence (I 54,7) na koncentraci vodného roztoku FLSS 7 6 5 4 I(54,7) 3 2 1 0 2,00 E-05

2,19 E-05

2,38 E-05

2,56 E-05

2,81 E-05

3,00 E-05

4,00 E-05

5,00 E-05

c [ mol.l-1 ]

50

6,00 E-05

7,00 E-05

8,00 E-05

1,00 E-04

1,20 E-04

3.série měření – polarizátor v poloze „ 90°“ Polarizátor byl nastaven tak, ţe jím procházel horizontálně polarizovaný paprsek. Analyzátor byl postupně nastaven stejně jako v 1.sérii experimentů. Tabulka č. 26.: Naměřené EM a IF při nastavení 90° - 0°, 90°

Vzorek

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13


90° 0°

90°

517 0,127869 517 0,142517 518 0,156555 519 0,161438 517 0,176392 518 0,184937 518 0,238647 520 0,279541 521 0,32959 523 0,361633 522 0,401306 523 0,527039 524 0,597534

516 0,0830078 515 0,0930786 516 0,103149 517 0,106506 517 0,115967 517 0,21155 519 0,159302 521 0,180969 520 0,213318 522 0,232544 521 0,26062 523 0,341187 523 0,383911


51

Tabulka č. 27.: Hodnoty intenzit fluorescence pro výpočet korekčního faktoru G při horizontálně polarizovaném excitačním světle

Vzorek

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13


90° 0°

90°

517 0,127869 517 0,142517 518 0,156555 519 0,161438 517 0,176392 518 0,184937 518 0,238647 520 0,279541 521 0,32959 523 0,361633 522 0,401306 523 0,527039 524 0,597534

517 0,0830078 517 0,0927734 518 0,11929 519 0,103149 517 0,115967 518 0,12085 518 0,158691 520 0,180359 521 0,213013 523 0,227051 522 0,26001 523 0,341187 524 0,38208

Pro výpočet hodnot korekčního faktoru G jsem pouţila hodnoty uvedené v tabulce č. 27, a následně pro hodnoty anizotropie r ( viz. vztah 1.1) výsledky z tabulky č.23. Vypočtené hodnoty uvádím v tabulce č. 28.

52

Tabulka č. 28.: Hodnoty korekčního faktoru G a anizotropie r pro nastavení 90° – 0°, 90° Vzorek

G

I I

H

r

90 H 0

I

I V 0



 G  I 90 V  2  G  I 90

V 0

1

0,649163

0,316123

2

0,650964

0,320022

3

0,761969

0,259738

4

0,638939

0,324039

5

0,657439

0,311922

6

0,653466

0,31543

7

0,664961

0,309139

8

0,645197

0,317685

9

0,646297

0,322698

10

0,627849

0,333027

11

0,64791

0,327094

12

0,647366

0,325499

13

0,639428

0,336845

V



Obrázek č. 12.: Graf k tabulce č. 28 Závislost hodnot anizotropie na koncentraci vodného roztoku FLSS 0,4 0,35 0,3 0,25 r 0,2 0,15 0,1 0,05 0 2,00 2,19 2,38 2,56 2,81 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 1,00 1,20 E-05 E-05 E-05 E-05 E-05 E-05 E-05 E-05 E-05 E-05 E-05 E-04 E-04 c [ mol.l-1 ]

53

4.4.

Výsledky měření slepých vzorků při spektrálních pološířkách

2 nm a 4 nm 1. série měření – polarizátor v poloze „ open“ Provedla jsem měření vzorků připravených postupem uvedeným v kapitole 3.4.1., kde byl polarizátor nastaven do polohy „open“ (nepolarizovaný paprsek) a analyzátor na tzv. „magický“ úhel 54,7°, dále na úhel 0° (vertikální polarizace) a 90° (horizontální polarizace). Z výše uvedených důvodů nebyl měřen slepý vzorek č. 1. . Tabulka č. 29.: Naměřené EM a IF při nastavení open-0°, 90° a 54,7°

Vzorek


open 54,7°

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

0°

90°

514 0,0558472 513 0,133057 515 0,205078 516 0,220642 515 0,32074 517 0,55542 519 0,78125 521 1,2326 521 1,17096 521 1,37451 523 1,97906 523 2,41516

511 0,0354004 513 0,0881958 514 0,0135803 515 0,1474 515 0,212708 516 0,366821 519 0,516052 521 0,797729 520 0,769348 521 0,899353 523 1,28998 523 1,56799


513 0,0436401 513 0,104065 515 0,161743 515 0,174255 515 0,25177 517 0,436096 519 0,616455 521 0,955505 521 0,91156 521 1,0733 523 1,53809 523 1,87042

54

Pro další výpočty jsem potřebovala hodnoty IF stejných vlnových délek. Srovnávací hodnotou pro hledaný odečet byla vlnová délka emisního maxima při nastavení polarizátorů open-0° . Tabulka č. 30.:

Hodnoty intenzit fluorescence pro výpočet I54,7 při nepolarizovaném

excitačním světle

Vzorek


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

open 0°

90°


514 0,0558472 513 0,133057 515 0,205078 516 0,220642 515 0,32074 517 0,55542 519 0,78125 521 1,2326 521 1,17096 521 1,37451 523 1,97906 523 2,41516

514 0,0354004 513 0,0881958 515 0,0134888 516 0,145569 515 0,212708 517 0,365295 519 0,516052 521 0,797729 521 0,766602 521 0,899353 523 1,28998 523 1,56799


55


I 54,7  I 0  2  I 90

1

-

2

0,126648

3

0,309449

4

0,232056

5

0,51178

6

0,746156

7

1,28601

8

1,813354

9

2,828058

10

2,704164

11

3,173216

12

4,55902

13

5,55114

Obrázek č. 13.: Graf k tabulce č. 31 Závislost intenzity fluoreccence (I 54,7) na koncentraci vodného roztoku FLSS 7 6 5 4 I (54,7) 3 2 1 0 2,19E- 2,38E- 2,56E- 2,81E- 3,00E- 4,00E- 5,00E- 6,00E- 7,00E- 8,00E- 1,00E- 1,20E05 05 05 05 05 05 05 05 05 05 04 04 c [mol.l-1]

56

2. série měření - polarizátor v poloze „ 0°“ Provedla jsem měření vzorků, kde byl polarizátor za emisním monochromátorem nastaven do polohy „ 0° “ (nepolarizovaný paprsek) a analyzátor na tzv. magický úhel 54,7°, dále na úhel 0° (vertikální polarizace) a 90° (horizontální polarizace). Nebyl měřen slepý vzorek č. 1. Tabulka č. 32.: Naměřené EM a IF při nastavení 0°- 0°, 90° a 54,7°

Vzorek


0° 54,7°

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

0°

90°

511 0,0131226 514 0,0369263 515 0,0595093 516 0,0650024 517 0,09552 519 0,167847 519 0,236816 521 0,37262 521 0,359497 521 0,418396 523 0,603333 525 0,737305

511 0,00762939 512 0,0228882 514 0,0396729 513 0,0411987 515 0,0619507 516 0,108337 517 0,154114 521 0,239563 521 0,231934 520 0,270386 523 0,386353 523 0,472412


514 0,00946045 516 0,0280762 514 0,0460815 514 0,0500488 516 0,0735474 517 0,129089 517 0,181274 520 0,285034 521 0,275554 521 0,321655 522 0,460205 523 0,563965


57

Tabulka č. 33.:

Hodnoty intenzit fluorescence pro výpočet I54,7 a r při vertikálně


Vzorek


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

0° 0°

90°


511 0,0131226 514 0,0369263 515 0,0595093 516 0,0650024 517 0,09552 519 0,167847 519 0,236816 521 0,37262 521 0,359497 521 0,418396 523 0,603333 525 0,737305

511 0,00762939 514 0,0228882 515 0,0396729 516 0,0405884 517 0,06073 519 0,106506 519 0,153503 521 0,239563 521 0,231934 521 0,269165 523 0,386353 525 0,467224


58


I 54,7  I 0  2  I 90

1

-

2

0,028381

3

0,082703

4

0,138855

5

0,146179

6

0,21698

7

0,380859

8

0,543822

9

0,851746

10

0,823365

11

0,956726

12

1,376039

13

1,671753

Obrázek č. 14.: Graf k tabulce č. 34 Závislost intenzity fluoreccence (I 54,7) na koncentraci vodného roztoku FLSS 7 6 5 4 I (54.7) 3 2 1 0 2,19E- 2,38E- 2,56E- 2,81E- 3,00E- 4,00E- 5,00E- 6,00E- 7,00E- 8,00E- 1,00E- 1,20E05 05 05 05 05 05 05 05 05 05 04 04 c [mol.l-1]

59

3.série měření – polarizátor v poloze „ 90°“ Polarizátor jsem nastavila tak, ţe jím procházel horizontálně polarizovaný paprsek. Analyzátor byl postupně nastaven stejně jako v 1.sérii experimentů . Z měření vyjmut slepý vzorek č. 1. Tabulka č. 35.: Naměřené EM a IF při nastavení 90° -0°, 90° Vzorek


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

90° 90°

0°


513 0,0241089 515 0,0280762 514 0,046085 516 0,0509644 516 0,0744629 517 0,131226 521 0,184937 521 0,293274 521 0,283813 521 0,329895 523 0,475464 523 0,583801

512 0,015564 516 0,0177002 514 0,0302124 514 0,0326538 515 0,0491333 517 0,0872803 517 0,122986 519 0,193787 521 0,186768 520 0,21698 521 0,312195 523 0,379944


60

Tabulka č. 36.: Hodnoty intenzit fluorescence pro výpočet G

při

horizontálně

polarizovaném excitačním světle Vzorek


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

90° 90°

0°


513 0,0241089 515 0,0280762 514 0,046085 516 0,0509644 516 0,0744629 517 0,131226 521 0,184937 521 0,293274 521 0,283813 521 0,329895 523 0,475464 523 0,583801

513 0,015564 515 0,017395 514 0,0302124 516 0,032435 516 0,0488281 517 0,0872803 521 0,120544 521 0,192261 521 0,186768 521 0,21698 523 0,310974 523 0,379944

Pro výpočet hodnot korekčního faktoru G jsem pouţila hodnoty uvedené v tabulce č. 36, a následně pro hodnoty anizotropie r ( viz. vztah 1.1) výsledky z tabulky č. 33. Vypočtené hodnoty uvádím v tabulce č. 37.

61

Tabulka č. 37.: Hodnoty korekčního faktoru G a anizotropie r pro nastavení 90° – 0°, 90° Vzorek

G

I I

H

r

90 H 0

I

I

V 0

V 0

 G  I 90

V

 2G  I

1

-

-

2

0,645571

0,356819

3

0,619564

0,34839

4

0,65558

0,300381

5

0,636425

0,335755

6

0,655737

0,317968

7

0,665114

0,313411

8

0,651811

0,313007

9

0,655568

0,313913

10

0,658067

0,311197

11

0,657724

0,312452

12

0,654043

0,316259

13

0,650811

0,321996



V 90



Obrázek č. 15.: Graf k tabulce č. 37 Závislost hodnot anizotropie na koncentraci vodného roztoku FLSS 0,4 0,38 0,36 0,34 0,32 r 0,3 0,28 0,26 0,24 0,22 0,2 2,19E- 2,38E- 2,56E- 2,81E- 3,00E- 4,00E- 5,00E- 6,00E- 7,00E- 8,00E- 1,00E- 1,20E05 05 05 05 05 05 05 05 05 05 04 04 c [mol.l-1]

62

5. DISKUZE

63

Tato rigorózní práce se zabývá měřením intenzit fluorescence v roztocích FLSS a CTAB, přičemţ pouţívá polarizovaného světla. Polarizační filtry byly vţdy pouţívány u emitovaného paprsku, zatímco excitační paprsek nebyl u části experimentů polarizován. Literatura (10) totiţ uvádí, ţe měření intenzity fluorescence u anizotropních vzorků bez pouţití polarizačních filtrů můţe způsobit chybu aţ 20 %. Z porovnání výsledků experimentů provedených bez polarizace excitačního záření a výsledků, kdy byl excitační paprsek vertikálně polarizován, nelze případnou chybu měření intenzity fluorescence kvantifikovat, neboť obě měření bylo nutno z experimentálních důvodů provádět při různých citlivostech. Je pouze moţné konstatovat, ţe pokud pouţití nepolarizovaného excitačního paprsku nějakou chybu způsobuje, je tato chyba nezávislá na koncentraci měřených vzorků. V práci je dále provedeno porovnání naměřených a vypočtených hodnot I(54,7). Naměřené hodnoty I(54,7) jsou niţší, neţ vypočítané ve všech provedených experimentech. Rozdíl je výraznější v pokusech s nastavením spektrálních pološířek na 4nm. Při tomto nastavení jsou v grafu vypočítaných hodnot patrné výrazné skoky mezi 6 a 7 vzorkem, coţ je způsobeno rozdílným nastavením citlivosti přístroje pro 1-6 vzorek a 7-13 . Tato situace se opakuje také u slepých vzorků. Lze si povšimnout, ţe poměr naměřených a vypočtených hodnot I(54,7) je u všech vzorků a slepých vzorků přibliţně konstantní. Příčinou rozdílu naměřených a vypočtených hodnot I(54,7) je totiţ opět rozdílná citlivost nastavená pro měření intenzity vertikálně polarizovaného emisního záření, intenzity horizontálně polarizovaného emisního záření a intenzity emisního záření polarizovaného v magickém úhlu. Nastavit stejnou citlivost při všech třech orientacích analyzátoru se totiţ během experimentů nepodařilo. Nejdůleţitějším výsledkem této práce jsou hodnoty anizotropie naměřené u jednotlivých vzorků a slepých vzorků. Měření byla vedena snahou provést je při minimálních moţných spektrálních pološířkách. To bylo samozřejmě limitováno citlivostí instalovaného fotonásobiče v roli detektoru spektrofluorimetru. V práci jsou uváděny výsledky měření s nastavením štěrbin obou monochromátorů na 4 nm a výsledky, kdy štěrbina excitačního monochromátoru byla nastavena na 2 nm, zatímco štěrbina emisního monochromátoru zůstala na 4 nm. Z porovnání získaných hodnot anizotropie (tabulky č. 10, 19, 28 a 37; obrázky č. 6, 9, 12 a 15) plyne, ţe zmíněná malá změna spektrální pološířky excitačního monochromátoru nemá na výsledné hodnoty anizotropie významný vliv. Zajímavý je rozdíl ve zjištěných

64

hodnotách anizotropie mezi měřenými vzorky a příslušnými slepými vzorky v oblasti nízkých koncentrací barviva. Z této skutečnosti lze usuzovat na významné interakce mezi FLSS a CTAB, jestliţe jsou jejich koncentrace blízké. Nečekaně ovšem dochází v přítomnosti CTAB ke sníţení anizotropie k hodnotám, které byly zjištěny při vyšších koncentracích FLSS. To znamená, ţe přítomnost CTAB v roztocích FLSS nevede k tvorbě vysoce uspořádaných agregátů barviva a tenzidu. Hodnoty anizotropie zjištěné u slepých vzorků při nízkých koncentracích se blíţí hodnotě tzv. fundamentální anizotropie (r0), coţ je hodnota anizotropie molekuly bez rotačních pohybů. Experimentální hodnoty (r(t)) nelze prakticky nikdy měřit ve stavu bez rotačních pohybů a nazývají se limitní anizotropie. Vztah mezi fundamentální anizotropií a limitní anizotropií je:

r t   r0  f t  , kde f(t) je tzv. orientační autokorelační funkce, která charakterizuje dynamiku rotačních pohybů. Pro FLSS uvádí literatura (11) hodnotu fundamentální anizotropie 0,373±0,002). Podle mých výsledků se zvyšuje vliv rotačních pohybů na anizotropii FLSS (zvyšuje vliv orientační autokorelační funkce na hodnotu limitní anizotropie) s rostoucí koncentrací a s přídavkem CTAB. Ze získaných výsledků ovšem nelze rozhodnout, zda jde o vliv experimentálního uspořádání (velký objem vzorku při měření) nebo o vlastnost měřených vzorků. Tato záleţitost by si zaslouţila dalšího zkoumání. V grafech č. 10, 19, 28 a 37 je patrný výkyv třetí, resp. čtvrté hodnoty anizotropie z celkového trendu. Tuto anomálii nelze na základě mých pozorování vysvětlit. Je pouze moţné konstatovat, ţe zřejmě nejde o chybu při přípravě vzorku, neboť měření těchto vzorků probíhalo v různých dnech a tedy s nově připravenými vzorky. Navíc jde o většinou o vzorky různých koncentrací.

65

6. ZÁVĚR

66

Tato rigorózní práce navazuje na mou diplomovou práci (12), v níţ byly studovány stejné roztoky jako nyní, ale jinými metodami (extrakční spektrofotometrie, UV-VIS absorpční spektrofotometrie, fluorimetrie). Na základě výsledků diplomové práce (12) je konstatováno, ţe k významným interakcím mezi FLSS a CTAB dochází v oblasti, kde se koncentrace obou látek příliš neodlišují. To je potvrzeno i v této rigorózní práci. Navíc je moţno konstatovat, ţe případné agregáty FLSS a CTAB ve zkoumaných roztocích nepatří k tzv.

vysoce

uspořádaným

agregátům

67

a

mají

relativně

volnou

strukturu.

7. LITERATURA

68

(1) Chalabala M. et al.: Technologie léků, nakladatelství Galén, Praha 2001. (2) Casero I., Sicilia D., Rubio S., Pérez-Bendito D., Study of the formation of dye-induced premicellar aggregates and its application to the determination of quarternary ammonium surfactants, Talanta 45 (1997), 167-180. (3) Buwalda R.T., Molecular aggregation in water: the interplay of hydrophobic and electrostatic interactions, www.ub.rug.nl/eldoc/dis/science/r.t.buwalda. (4) Dutta R.K., Bhat S.N., Interaction of phenazinum dyes and methyl orange with micelles of various charge types, Colloids and Surfaces A: Physicochemical and engineering aspects 106 (1996), 127-134. (5) Gehlen M.H., Ferreira M., Neumann M.G., Interactions of methylorange with cationic micelles and its effect on dye photochemistry, J. Photochem. And Photobiol. A.: Chemistry 87 (1995), 55-60. (6) Maiti N.C., Muzumdar S., Periasamy N., J- and H- Aggregates of Porphyrin-Surfactants Complexes: Time-Resolved Fluorescence and Other Specroscopic Studies, J. Phys. Chem. B. 102 (1998), 3705. (7) Buwalda R.T., Jonker J.M., Engberts J.B.F.N, Aggregation of Azo Dyes with Cationic Amphiphles at Low Concentrations in Aqueous Solution, Langmuir 15 (1999), 10831089. (8) zdroj internet: http://psych.lf1.cuni.cz/fluorescence/soubory/principy.htm (9) zdroj internet: http:/biologie.upol.cz/metody/Slovnik/Fluorescencni%20barvivo.htm (10) Resch-Genger U., Pfeifer D., Monte C., Pilz W., Hoffmann A., Spieles M., Rurack K., Hollandt J., Taubert D., Schönenberger B. and Nording P.: Traceability in Fluorometry: Part II. Spectral Fluorescence Standards, J. Fluorescence 15 (2005), 315-336. (11) Johansson L. B.: J. Chem. Soc. Faraday Trans. 86 (1990), 2103. (12) Ţídková H.: Interakce tenzidů a barviv v roztocích II, diplomová práce, katedra biofyziky a fyzikální chemie, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, UK Praha, 2007.

69

Abstrakt: Tato rigorózní práce se zabývá studiem interakcí mezi cetrimidem a organickým barvivem fluoresceinem pomocí fluorescenční spektrofotometrie s polarizovaným světlem. Cílem této práce bylo navázat na výsledky autorčiny diplomové práce a ověřit vznik agregátů v roztocích tenzidu a organického barviva. Na základě výsledků lze konstatovat, ţe k významným interakcím mezi cetrimidem a fluoresceinem dochází v oblasti, kde se koncentrace obou látek příliš neodlišují. Dále je moţné usuzovat, ţe případné agregáty fluoresceinu a cetrimidu ve zkoumaných roztocích nepatří k tzv. vysoce uspořádaným agregátům a mají relativně volnou strukturu.

Abstract:

This rigorous thesis deals with a study of interaction between cetrimide and organic dye fluorescein utilizing fluorescent spectroscopy with polarized light. The aim of this work has been stated to verify a formation of aggregates in solutions of the tenside and the organic dye, which were indicated in the author´s diploma thesis. Based on the results it can be concluded that the significant interaction between cetrimide and fluorescein occurs in the concentration range, where the concentration of both substances do not differ sharply. We can also come to a conclusion, that eventual aggregates of fluorescein and cetrimide in the studied solutions do not belong to so-called highly organized aggregates and are of relatively loose structure.

70

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové. Katedra biofyziky a fyzikální chemie

Recommend Documents