UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA ANALYTICKÉ CHEMIE DIPLOMOVÁ PRÁCE

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ

KATEDRA ANALYTICKÉ CHEMIE

DIPLOMOVÁ PRÁCE Stanovení vitamínů A, D, E metodou sekvenční injekční chromatografie

Vedoucí diplomové práce: PharmDr. Hana Sklenářová, Ph.D.

Hradec Králové 2009

Kateřina Trefilová

1

Místopřísežně prohlašuji, že jsem celou diplomovou práci vypracovala samostatně. Zdroje, z nichž jsem čerpala při zpracování, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. ………………………… Hradec Králové

Kateřina Trefilová

15. 5. 2009

2

Touto cestou bych chtěla poděkovat vedoucí diplomové práce PharmDr. Haně Sklenářové, Ph.D. za trpělivost a čas, kterou mě věnovala, a za cenné rady a připomínky, které mě pomohly vyřešit problémy související s touto diplomovou prací. V neposlední řadě chci poděkovat za pomoc rovněž Doc. RNDr. Daliborovi Šatínskému, Ph.D. za pomoc při sestrojení celého přístroje. 3

Abstrakt Byl vypracován postup separace vitamínů A, D a E pomocí monolitických kolon zapojených v systému sekvenční injekční analýzy. Po provedené optimalizaci byly vybrány následující podmínky separace: analýza na: monolitické koloně 25 mm dlouhé Chromolith Flash RP-18e kolony, 4,6 mm I.D. (Merck, Germany), při rychlosti (10 µl/s) za použití mobilní fáze acetonitril metanol (1:1, v/v). Monolitická kolona byla v SIA

systému

zapojena

mezi

vícecestný

ventil

a

průtokovou

Z

celu.

Spektrofotometrická detekce byla provedena při vlnových délkách absorpčních maxim pro vitamín A – 324 nm, D - 265 nm, E – 285. Celková délka SIA analýzy byla 400 s (z toho 230 s trvala vlastní separace). Ze základních chromatografických validačních parametrů byly vyhodnoceny faktor symetrie AS, rozlišení RS, počet teoretických pater a opakovatelnost. Faktor symetrie pro vitamín A - 1,309, pro vitamín D2 - 1,302, pro D3 - 1,286 , pro vitamín E - 1,158. Rozlišení píků pro vitamíny A-D2 je 3,607, D2-D3 4,232, D-E 1,532. Počet teoretických pater pro vitamín A 998, pro vitamín D2 1621, pro vitamín D3 2091 a vitamín E 2376. Opakovatelnost byla vypočítána z 6 nástřiků, kdy z výšky píků jednotlivých látek byla vypočítaná relativní směrodatná odchylka. Opakovatelnost je pro vitamín A - 0,53 %, pro vitamín D2 - 0,35 %, pro vitamín D3 - 0,81 % a vitamín E 0,71 %. Všechny parametry vyhovují požadavkům validačních autorit. Z výsledků stability roztoků jsme zjistily postupné snižování koncentrace vitamínů, proto je vhodné je připravovat každý den čerstvě.

4

Abstract The working isntruction was created for separation vitamins A, D and E by means of monolithic column engaged in system sequentional injectional analysis. Following conditions of separation were chosen after performance of optimalization: Analysis at monolithic column 25 mm long Chromolith Flash RP-18e column, 4,6 mm I.D. (Merck, Germany), with speed (10 µl/s) with applied mobile phase acetonitril metanol (1:1, v/v). Monolithic column was in SIA system and was engaged between moreway valve and flow Z cell. Spectrophotometric detection was performed at wave length for absorbing maximum for vitamins A – 324 nm, D - 265 nm, E – 285. Total SIA analysis time was 400 s (from that 230 s lasted separation process).

From basic chromatographic validation parameters were evaluated the following symetric factor As, resolution Rs, amount theoretical trays and repeatability. Symetric factor for vitamin A – 1.309; vitamin D2 – 1.302; vitamin D3 – 1.286; vitamin E – 1.158. Peak resolution for vitamins A-D2 je 3.607; D2-D3 4.232; D-E 1.532. Amount theoretical stages for vitamin A 998, vitamin D2 1621, vitamin D3 2091 and vitamin E 2376. Repeatability was worked out from 6 sprays, and relative standard deviation of particular substances was calculated from the highest point of the graph peak. Repeatability was for vitamin A – 0.53 %, vitamin D2 – 0.35 %, vitamin D3 – 0.81 % and vitamin E 0.71 %. All parameters are in compliance with the requirements validation authority. From result of stabilization solutions we found out a gradual decrease in concentration of vitamins. Therefore is suitable to prepare them fresch on a daily basis.

5

Obsah

1. Úvod a cíl práce …………………………………………………………………… 10 1.1. Úvod práce ……………………………………………………………………….. 10 1.2. Cíl práce…………………………………………………………………………. 11 2. Teoretická část …………………………………………………………………….. 12 2.1. Stanovované látky………………………………………………………………… 12 2.1.1. Vitamin A (axeroftol) ………………………………………………………..

12

2.1.2. Vitamin D2 (Ergokalciferol) ………………………………………………….. 13 2.1.3 Vitamin D3 (cholekalciferol) ………………………………………………….. 14 2.1.4. Vitamin E (tokoferol) ………………………………………………………… 15 2.2. Metody stanovení………………………………………………………………… 16 2.2.1. Retinol-A……………………………………………………………………… 16 2.2.2. Ergokalciferol-D2……………………………………………………………… 16 2.2.3. Cholekalciferol-D3……………………………………………………………….17 2.2.4. Tokoferol-E…………………………………………………………………… 18 2.3. Sekvenční injekční analýza……………………………………………………… 19 2.3.1. Úvod do sekvenční injekční analýzy (SIA) …………………………………… 19 2.3.2. Srovnání, odlišnosti, přednosti SIA a FIA……………………………………

20

2.3.3. Jednotky SIA systému………………………………………………………… 21 2.3.3.1. Čerpadlo……………………………………………………………………

21

2.3.3.2. Pístová pumpa……………………………………………………………

21

2.3.3.3. Selekční ventil……………………………………………………………

21

2.3.3.4. Mísící cívky……………………………………………………………

21

2.3.3.5. Detektory……………………………………………………………

22

2.4. Sekvenční injekční chromatografie SIC………………………………

23

2.4.1. Postup měření v SIC……………………………………………………

24

2.4.2. Přehled aplikací SIC metody………………………………………………

25

2.5. Monolitické kolony…………………………………………………………

26

2.5.1.Charakteristika Monolitických kolon………………………………………

26

2.5.1.1. Anorganické monolity…………………………………………………

27

2.5.1.2. Makroporézní polymerní monolity………………………………………

27

2.5.1.3. Stlačitelné monolity (komprimované gely)………………………………

28

6

2.5.1.4. Reprodukovatelnost měření na monolitických kolonách…………………… 28 2.5.1.5. Technologie přípravy monolitických kolon ………………………………

28

2.5.1.6. Monolitická vs. částicová struktura ……………………………………...

29

3. Experimentální část……………………………………………………………

32

3.1. Použité přístroje, chemikálie a příprava roztoků……………………………

32

3.1.1. Použité přístroje……………………………………………………………

32

3.1.2. Použité chemikálie……………………………………………………………

33

3.1.3. Příprava roztoků…………………………………………………………………34 3.2. Vývoj a optimalizace separačního procesu…………………………………..……36 3.2.1. Výběr vlnové délky pomocí spektrofotometrie………………………………… 36 3.2.2. Orientační zjištění retenčních časů na HPLC…………………………………

36

3.2.3. Výběr mobilní fáze………………………………………………………………37 3.2.4. Hodnocení separace pomocí vybraných validačních parametrů…………….

37

3.2.5. Stabilita roztoků……………………………………………………………….. 37 3.3. Vytvoření SIA programu ………………………………………………………

38

3.4. Vývoj separačního procesu v SIA systému ……………………………………… 38 3.5. Test vhodnosti chromatografického systému ……………………………………..39 3.5.1. Opakovatelnost - retenční čas a plocha pod píkem …………………………… 39 3.5.2. Rozlišení píku……………………………………………………………………39 3.5.3. Faktor symetrie píku…………………………………………………………… 39 3.5.4. Počet teoretických pater……………………………………………………….. 40 3.5.5. Stabilita roztoků………………………………………………………………… 40 4. Výsledky a diskuse………………………………………………………………

41

4.1. Výběr vlnové délky pro detekci………………………………………………

41

4.2. Výběr mobilní fáze……………………………………………………..………

43

4.2.1. Metanol………………………………………………………………………

43

4.2.2. Acetonitril………………………………………………………………

47

4.2.3. Metanol-acetonitril 1:1……………………………………………………

51

4.3. Vyhodnocení vybraných validačních parametrů……………………………

55

4.4. Vyhodnocení opakovatelnosti………………………………………………

56

4.5. Vyhodnocení stability…………………………………………………………

57

5. Souhrn…………………………………………………………………………

59

7

6. Závěr……………………………………………………………………………

60

7. Seznam literatury…………………………………………………………………

61

8

Seznam zkratek A - vitamín A D2 - vitamín D2 D3 - vitamín D3 E – tokoferol-acetát FIA - průtoková injekční analýza SIA - sekvenční injekční analýza SIC - sekvenční injekční chromatografie LOV – Lab on Valve HPLC - vysokoúčinná kapalinová chromatografie GC - plynová chromatografie CE - kapilární elektroforéza A - absorbance C - koncentrace

9

1. ÚVOD A CÍL PRÁCE 1.1. Úvod práce Metoda sekvenční injekční analýzy SIA se vyvinula z průtokové injekční analýzy FIA. Jedná se o metodu počítačem řízeného zpracování vzorků, které nahradilo manuální činnost. Je to velice efektivní, účinná, rychlá, přesná metoda. Z toho vyplývá minimalizace chyb, které dříve vznikaly při manuálním používání FIA. Vzhledem k menší spotřebě vzorku a nosného proudu v SIA se snížilo množství odpadu a tím i dopad na naše životní prostředí [1]. Výhodou metody je její schopnost spojení s jinými analytickými technikami. SIA s využitím monolitických kolon dostala možnost kvalitnějšího separačního kroku srovnatelného s HPLC metodou, kde se využívají hlavně částicové kolony, jejichž nevýhodou je vysoký zpětný tlak při průtoku mobilní fáze. Monolitické kolony naopak poskytují separace v rychlejším čase než separace na klasických částicových kolonách a jejich výhodou je, že nejsou limitovány vysokým tlakem, vykazují nízký odpor a mohou být tedy použity při vyšších průtokových rychlostech v nízkotlakých průtokových systémech[1]. Vzhledem k výše popsaným výhodám monolitických kolon je sekvenční injekční chromatografie SIC alternativním řešením k HPLC separaci směsi menšího počtu látek.

10

1.2. Cíl práce Podstatou zadání této diplomové práce bylo stanovit vhodné podmínky pro optimální separaci a stanovení vitamínů A, D a E pomocí metody sekvenční injekční analýzy se zapojenou monolitickou kolonou. Po optimalizaci stanovení vitamínů A, D a E byla zvolena částečná validace pomocí vybraných validačních parametrů: opakovatelnost, asymetrie, rozlišení, počet teoretických pater a stabilita roztoků.

11

2. TEORETICKÁ ČÁST 2.1. Stanovované látky 2.1.1 Vitamín A (axeroftol)

Obr. č. 1: Vzorec Vitamínu A Vitamín A (axeroftol) je v tucích rozpustný vitamín. Existuje ve dvou přirozených formách – vitamín A1 (retinol) a vitamín A2 (3-dehydroretinol). Vitamín A je nutný pro tvorbu rodopsinu, zrakového pigmentu používaného za nízkého osvětlení. Nedostatek vitamínu proto vede k šerosleposti. Vitamín A je také důležitý antioxidant. Fyzikálně chemické vlastnosti vitamínu A viz. tabulka č. 1 [2,3]. Tabulka č. 1: Fyzikálně chemické vlastnosti vitamínu A Sumární vzorec

C20H30O

Molární hmotnost

286,456 g/mol

Teplota tání

62–64 °C

Teplota varu

137–138 °C 900 μg (dospělý muž) 700 μg (dospělá žena) 3000 μg

Doporučená denní dávka Maximální denní dávka

Hypovitaminóza: poruchy vidění počínaje šeroslepostí, vysychání rohovky a spojivky a poškození epitelu, atrofie potních žláz, porucha tvorby růstu kostí Hypervitaminóza: poškození jater, závratě, bolesti hlavy Indikace: substituce v případě nedostatku, např. atrofické změny rohovky, akné či rohovatění kůže Kontraindikace: těhotné ženy Aplikace: perorální, intramuskulární [4]

12

2.1.2. Vitamín D2 (Ergokalciferol)

Obr. č. 2: Vzorec vitamínu D2 Vitamín D2 (Ergokalciferol) je v tucích rozpustný vitamín. Vzniká ze steroidních vitamínů. Spolu s parathormonem a kalcitoninem se účastní regulace vápníkové homeostázi. Fyzikálně chemické vlastnosti provitamínu D2 a vitamínu D2 viz. tabulka č. 2 [2,3].

Tabulka č. 2: Fyzikálně chemické vlastnosti provitamínu D2 a vitamínu D2. Ergosterol (provitamín D2)

Ergokalciferol (vitamín D2)

C28H44O

C28H44O

Molekulová hmotnost (g/mol)

396,63

396,63

Teplota tání (oC)

166-169

115-118

262; 271; 282; 293 (ethanol)

264,5 (hexan)

Sumární vzorec

Spektrální charakteristika (max - nm)

Hypovitaminóza: u dětí se projevuje křivicí, u dospělých osteomalácií Hypervitaminóza: vyšší dávky D2 mobilizují vápník z kostí a ten se pak ukládá v orgánech (ledvinách, plicích atd.) Indikace: rachitida u dětí, terapie hypovitaminózy, chronická renální onemocnění Kontraindikace: hyperkalcémie Aplikace: perorálně, intramuskulárně NÚ: zvracení [5]

13

2.1.3. Vitamín D3 (cholekalciferol)

Obr. č. 3: Vzorec vitamínu D3 Vitamín D3 (cholekalciferol) je v tucích rozpustný vitamín. Vzniká ze steroidních vitamínů. Spolu s parathormonem a kalcitoninem se účastní regulace vápníkové homeostázi. Fyzikálně chemické vlastnosti provitamínu D3 a vitamínu D3 viz. tabulka č. 3 [2,3]. Tabulka č. 3: Fyzikálně chemické vlastnosti provitamínu D3 a vitamínu D3 7-Dehydrocholesterol (provitamín D3)

Cholekalciferol (vitamín D3)

C27H44O

C27H44O

Molekulová hmotnost (g/mol)

384,62

384,62

Teplota tání (oC)

150-151

84-85

260; 270; 281; 294

264,5 (hexan)

Sumární vzorec

Spektrální charakteristika (max - nm)

Hypovitaminóza: u dětí se projevuje křivicí, u dospělých osteomalácií Hypervitaminóza: vyšší dávky D mobilizují vápník z kostí a ten se pak ukládá v orgánech (ledvinách, plicích atd.) Indikace: rachitida u dětí, terapie hypovitaminózy, chronická renální onemocnění Kontraindikace: digitálisové přípravky Aplikace: perorálně, intramuskulárně NÚ: zvracení, zácpa [6]

14

2.1.4. Vitamín E (tokoferol)

Obr. č. 4: Vzorec vitamínu E Vitamín E (tokoferol) je v tucích rozpustný vitamín, výborný antioxidant. Velký obsah vitamínu E je obsažen v játrech. Nachází se v mase, mléce, vejcích. Vylučuje se játry a močí. Působí synergicky se selenem. Typy vitamínu E viz. tabulka č. 4

[2,3]

.

Tabulka č. 4: Typy vitamínu E

Tokoferol

Chemický název

α-tokoferol

5,7,8-trimethyltokol

β-tokoferol

5,8-dimethyltokol

γ-tokoferol

7,8-dimethyltokol

δ-tokoferol

8-methyltokol

Hypovitaminóza: slabost, únava, poruchy plodnosti Indikace: hrozící potraty a svalová dystrofie, poruchy KVS, vzácnější typ anémie Kontraindikace: přecitlivost na složky přípravku Aplikace: perorálně NÚ: bolest hlavy, únava [7]

15

2.2. Metody stanovení 2.2.1. Retinol-A Vlastnosti: žlutá olejovitá kapalina, všechny estery retinolu jsou nerozpustné ve vodě, rozpustné v ethanolu. Lékopisné stanovení obsahu dle ČL 2005 – Dopl. 2006 Stanovení aktivity: 25 až 100 mg se naváží s přesností 0,1 % a rozpustí v 5 ml pentanu R a zředí se propan-2-olem R1 na předpokládanou koncentraci 10 m.j. až 15 m.j. v mililitru. Změří se absorbance v maximu při 226 nm. Aktivita vitamínu A v gramech se vypočítá podle vzorce: A326 ∙ V ∙1900 /100 ∙m A326

absorbance při 326 nm

V

celkový objem, na který byla zkoušená látka naředěna, aby byla koncentrace 10 m.j. až 15 m.j. v mililitru

1900

faktor k převedení absorbance esterů retinolu na mezinárodní jednotky v gramu

m

hmotnost zkoušené látky v gramech [3]

2.2.2. Ergokalciferol-D2 Vlastnosti: slabě žluté nebo bílé krystalky. Nerozpustné ve vodě, rozpustné v lihu a mastných kyselinách. Vzduchem, teplem a světlem se rozkládá. Lékopisné stanovení dle ČL 2005. Provede se kapalinovou chromatografií. Zkoušený roztok: 10,0 mg ergokalciferolu se rozpustí v 10,0 ml toluenu R a zředí mobilní fází na 100,0 ml. Porovnávací roztok (a): 10,0 mg ergokalciferolu CRL se rozpustí v 10,0 ml toluenu R a zředí mobilní fází na 100,0 ml. Porovnávací roztok (b): 1,0 ml cholekalciferolu pro test způsobilosti CRL se zředí mobilní fází na 5 ml. Zahřívá se 45 minut pod zpětným chladičem a poté se ochladí. Provede se kapalinová chromatografie, ze které se následně vypočítá obsah. Mobilní fáze: směs objemových dílů pentan-1-olu R a hexanu R (3+997), průtoková rychlost je 2 ml/min, spektrofotometrická detekce při 254 nm.

16

Obsah ergokalciferolu v procentech se vypočítá podle vzorce: m´/m x SD/S´D x 100 m´

navážku zkoušené látky ve zkoušeném roztoku v miligramech

m

navážku ergokalciferolu CRL v porovnávacím roztoku(a) v miligramech

SD

plochu píku ergokalciferolu na chromatogramu zk. roztoku

S´D

plochu

píku

ergokalciferolu

na

chromatogramu

porovnávacího

roztoku(a) [3]

2.2.3. Cholekalciferol-D3 Vlastnosti: bílé nebo téměř bílé krystaly. Nerozpustný ve vodě, rozpustný v lihu a mastných olejích. Vzduchem, teplem a světlem se rozkládá. Lékopisné stanovení dle ČL 2005. Provede se kapalinovou chromatografií Zkoušený roztok: 10,0 mg se rozpustí bez zahřívání v 10,0 ml toluenu R a zředí se mobilní fází na 100,0 ml. Porovnávací roztok (a): 10,0 mg cholekalciferolu CRL se bez zahřívání rozpustí v 10,0 ml toluenu R a zředí se mobilní fází na 100,0 ml Porovnávací roztok (b): 1,0 ml cholekalciferolu pro test způsobilosti CRL se zředí mobilní fází na 5,0 ml. Roztok se zahřívá 45 minut ve vodní lázni při 90 pod zpětným chladičem a ochladí se. Mobilní fáze: směs objemových dílů pentanolu R a hexanu R (3+997), průtoková rychlost je 2 ml/min, spektrofotometrická detekce při 254 nm. Obsah cholekalciferolu v procentech se vypočítá podle vzorce: m´/m x SD/S´D x 100 m´

navážku zkoušené látky ve zkoušeném roztoku v miligramech

m

navážku cholekalciferolu CRL v porovnávacím roztoku(a) v miligramech

SD

plochu píku cholekalciferolu na chromatogramu zk. roztoku

S´D

plochu

píku

cholekalciferolu

roztoku(a) [3]

17

na

chromatogramu

porovnávacího

2.2.4. Tokoferol-E Vlastnosti: čirá bezbarvá nebo žlutohnědá viskózní olejovitá kapalina. Prakticky nerozpustný

ve

vodě,

snadno

rozpustný

v acetonu,

v ethanolu

bezvodém,

dichlormethanu, a v mastných olejích. Lékopisné stanovení obsahu dle ČL 2005. Stanovení pomocí plynové chromatografie. Vnitřní standard: 1,0 g skvalanu R se rozpustí v cyklohexanu R a zředí se jim na 100,0 ml. Zkoušený roztok (a): 0,100 g se rozpustí v 10,0 ml vnitřního standardu. Porovnávací roztok (a): 0,100 g tokoferol-alfa CRL se rozpustí v 10,0 ml roztoku vnitřního standardu. Průtoková rychlost 1 ml/min. Detekce: plamenoionizační detektor. Obsah v procentech se vypočítá z deklarovaného obsahu v tokoferolu-alfa CRL [3].

18

2.3. SIA - sekvenční injekční analýza 2.3.1. Úvod do sekvenční injekční analýzy (SIA) SIA neboli sekvenční injekční analýza, patří do skupiny průtokových analytických metod. Poprvé byla popsána roku 1990 Růžičkou a Marshalem na University of Washington v Seattle [1]. Vyvinula se z průtokové injekční analýzy. Z důvodu přesné synchronizace a opakovatelnosti kroků je řízena vždy počítačem, který kontroluje, ovládá a provádí vlastní měření. Principem je disperze vzorku v nosném proudu. Jeho pohyb je řízen pístovou pumpu a to v obou směrech s možností zastavení v určitém místě. Nosným proudem bývá často destilovaná voda, do které je aspirováno určité množství vzorku a činidel, měnících analyt na stanovitelný produkt. Aspirace probíhá v selekčním ventilu o různém množství portů. Mechanismem je aspirace vzorku a činidel pomocí pístové pumpy do mísící cívky. Po této fázi je nosným proudem posílána do detektoru, kde dojde k zaznamenání signálů a přenosu dat do počítače pro vyhodnocení a uchování výsledků analýzy. Výsledný signál je zaznamenáván ve formě píku[1]. V řídícím programu firmy FIAlab existuje ovládací a vyhodnocovací program, díky kterému lze provést automatickou manipulaci s analyzovaným vzorkem. Aspirovaný objem lze jednoduše zadat a také dle požadavků změnit. Rychlost, kterou aspirace, mísení a další pohyb v SIA systému probíhá, se nazývá průtoková. Je velice variabilní a umožňuje rychlou a účelnou analýzu. Objem, jak spotřebovaných vzorků, tak i použité mobilní fáze je menší, což vede k redukci množství odpadu. Je toho docíleno tím, že nosný proud není přiváděn kontinuálně, ale jen v určitých intervalech. Navíc jsou vzorky i činidla aspirovány pomocí příkazů v ovládacím programu a není tudíž nutný zásah do systému pro změnu jejich objemu. Objevují se vyšší hodnoty průtokových rychlostí, které jsou dány možností pístové pumpy. SIA metoda je principem hodně podobná FIA systému, přesto se liší a má určité výhody [1].

19

2.3.2. Srovnání, odlišnosti, přednosti SIA a FIA Obě popsané techniky mají základní princip stejný, přesto se liší v mnoha detailech, což je předurčuje pro různé aplikace. Hlavními odlišnostmi jsou: U FIA systému se pohybuje nosný proud pouze jedním směrem a je čerpán neustále. Zatímco SIA má schopnost změny směru toku proudu a k aspiraci dochází jen při dávkování vzorku a činidel. Díky tomu je spotřeba roztoků v SIA nižší. Dalším rozdílem je dávkování vzorku. U FIA probíhá propláchnutím určitého objemu dávkovací smyčky injekčního ventilu nosným proudem. Tento objem lze bohužel změnit jen výměnou smyčky. U SIA se tyto děje uskutečňují pomocí selekčního ventilu a objem vzorku je řízen ovládacím programem. Průtokové rychlosti se volí podle účelu jednotlivých kroků měření a podle aplikací různých detekčních technik. U SIA se mohou použít i větší rychlostí, zatímco u FIA je vyšší zase frekvence dávkování. Detekční techniky jsou stejné. U SIA systému se navíc objevují detekční cely, které u FIA nemůžou být použity z důvodu nemožnosti obousměrného toku. Porovnání metody FIA a SIA viz. tabulka č. 5 [1]. Tabulka č. 5: Porovnání metody FIA a SIA

Parametr

FIA

SIA

Geometrie nosného

Kontinuální jednosměrný

Diskontinuální obousměrný

proudu Typ čerpadla

Peristaltická pumpa

Typ dávkovacího ventilu

Dvoupolohový injekční ventil Selekční ventil

Počet kanálů v systému

Jeden a více

Jeden

Objem vzorku

Desítky-stovky

Desítky

Průtoková rychlost

Do 2 ml/min

Až 6 ml/min

Objem odpadu

Stovky ml

Desítky ml

Frekvence analýz

Až 300 vzorků za hodinu

Do 120 vzorků za hodinu

Řízení systému

Manuální i automatizované

Automatizované

20

Pístová pumpa

2.3.3. Jednotky SIA systému SIA systém je tvořen z několika základních jednotek:  Čerpadlo  Selekční ventil  Mísící cívka  Detektor 2.3.3.1. Čerpadlo Čerpadlo poskytuje hnací sílu, pomocí které jsou aspirovány vzorky, činidla nebo mobilní fáze do systému [1]. 2.3.3.2. Pístová pumpa Pístová pumpa zajišťuje jednoduchou změnu směru toku nosného proudu při plnění pístu či jeho vyprazdňovaní. Součástí pístové pumpy je dvojcestný ventil, který je ovládán počítačem. Tok nosného proudu může poskytovat i peristaltická pumpa. Její přesnost je však nižší a generovaný tok není konstantní (vykazuje pulzování) [1]. 2.3.3.3. Selekční ventil Selekční ventil zajišťuje propojení jednotek systému a řídí pohyb nosného proudu svojí polohou. Na centrální port je většinou připojena mísící cívka a přes ni je připojena pístová pumpa. Na zbytek portů jsou připojeny vzorky, činidla, pomocný odpad a kanál vedoucí k detektoru. Dávkování roztoků selekčním ventilem je možné pouze při zastaveném toku nosného proudu. Ventil se přetočí do požadované polohy a následuje aspirace příslušného roztoku [1]. 2.3.3.4. Mísící cívky Mísící cívky slouží k dostatečnému promíchání vzorků s činidlem nebo několika činidly najednou. Hlavní cívka umístěná mezi selekčním ventilem a pístovou pumpou má navíc zabraňovat vstupu roztoků vzorku a činidel do pístu pístové pumpy. V tomto prostoru se vyskytuje pouze nosný proud [1].

21

2.3.3.5. Detektory Způsob detekce záleží na charakteru měřeného vzorku. Nejčastěji používané typy detekce: Optická detekce: nejpoužívanější detekční systémy jsou spektrofotometry pracující v UV a viditelné oblasti. Důvodem je možnost detekce velkého počtu látek, které absorbují v UV oblasti. Nevýhodou je však nežádoucí přítomnost bublin, kterých je třeba se při použití této detekce vyvarovat (např. odplyněním používaných roztoků ultrazvukem). Dále se k optickým detektorům řadí detektory založené na principu fluorimetrie,

atomové

absorpční

spektroskopie,

chemiluminiscence

a

IR

spektroskopie [1]. Elektrochemická detekce: je výhodná pro své vlastnosti, jako jsou vysoká selektivita, citlivost a lineární odpověď v širokém rozsahu koncentrací. Mezi tyto metody patří amperometrie, potenciometre, konduktometrie. Elektrochemické senzory v průtokových systémech můžeme rozdělit podle jejich geometrie na následující tři základní typy: anulární, vláknový a tzv. wall-jet typ. 

Anulární detektor představuje trubice vložená do průtokového kanálu.



Vláknový detektor je kovová elektroda, jejíž povrch je rovnoběžný se směrem toku nosného proudu.

Wall-jet typ – tok přichází kolmo nebo pod určitým úhlem na aktivní povrch elektrody, který může být planární nebo sférický [1].

22

2.4. Sekvenční injekční chromatografie SIC U většiny současných analytických metod je potřeba před vlastním stanovením provést krok oddělení jednotlivých složek vzorku. Doposud byly k tomuto účelu používané analytické metody např.: Plynová chromatografie GC, Kapilární elektroforéza CE a samozřejmě nejčastěji používaná metoda HPLC, která si doposud drží první místo mezi separačními technikami [8-11]. Uvedení monolitických kolon do běžné chromatografické praxe vedlo k jejich zapojení do SIA systému a tím byl umožněn separační krok i v této průtokové metodě. Jedná se o začlenění monolitické kolony mezi selekční ventil a průtokovou Z celu. Tato metoda byla poprvé prakticky vyzkoušena v Laboratoři průtokových metod Katedry analytické chemie Farmaceutické fakulty v Hradci Králové. Selekční ventil umožňuje mísení mobilní fáze on-line v SIA systému a díky pístové pumpě je umožněna změna průtokové rychlosti a směru toku. Sekvenční injekční chromatografie (SIC) je založena na aspiraci vzorků, jejich on-line zpracování (např. naředění, extrakční krok apod.) s následnou separací stanovovaných složek při průchodu vzorku kolonou. SIC zaplňuje mezeru mezi HPLC a FIA nebo SIA, které se zaměřují ve většině případů na stanovení pouze jediného analytu [8-11]. Přestože je ještě příliš brzy říci, zdali tato nově vyvinutá technika splní požadované očekávání, je snaha ukázat možnost jejího využití pro praktické aplikace. Je reálné předpokládat, že SIC metoda bude využívaná ve výzkumné oblasti, protože poskytuje řadu možností manipulace se vzorkem a také podmínky v systému i při samotné separaci je možné pružně a rychle měnit v ovládacím programu. Sekvenční injekční chromatografie (SIC), která byla vytvořena týmem pracovníků Katedry analytické chemie Doc. RNDr. D. Šatínský, Ph.D., Prof. RNDr. P. Solich, CSc, PharmDr. P. Chocholouš, Ph.D. a Prof. RNDr. R. Karlíček, DrSc., byla demonstrována na separaci účinných látek v kompozitním léčivém přípravku s využitím monolitní kolony v SIA systému [8-11]. Na rozdíl od konvenčních chromatografických technik, SIC je založena na programovatelném

průtoku mobilní

fáze, který je provázen

zjednodušeným

přístrojovým vybavením a sníženou spotřebou mobilní fáze i produkovaného odpadu. SIC technika byla dále zdokonalena prostřednictvím integrace do systému LOV a tím umožněné miniaturizace [1,8-11]. Schéma SIA systému viz obr. č. 5.

23

Obr. č. 5: Schéma SIA systému [1]

2.4.1. Postup měření v SIC SIC protokol se skládá z pěti kroků: 1. Aspirace vzorku 2. Manipulace se vzorkem 3. Příprava mobilní fáze 4. Vlastní separace složek vzorku 5. Detekce analytů V rámci jednotného systému čerpadlo nasává vzorek přes selekční ventil do mísící cívky a obráceným tokem nosného proudu (mobilní fáze) ho posílá na monolitní kolonu, kde dochází k vlastní separaci. Odtud pokračuje do detektoru, kde je vyhodnocen signál a zaznamenány píky jednotlivých analytů. Na rozdíl od HPLC, která používá hlavně kolony plněné velmi jemnými částicemi a vysokotlaké čerpadlo k toku mobilní fáze kolonou, SIC používá pórovité monolitické kolony. Monolitické kolony, které jsou tvořeny sol-gel procesem, vykazují nízký

24

průtokový odpor a dostatečný počet teoretických pater poskytující efektivní separace vhodné i pro oddělení strukturně blízkých sloučenin [1,8-11]. 2.4.2. Přehled aplikací SIC metody Tabulka č. 6: Přehled SIC metody Látka

Kolona Průtoková Mobilní fáze (mm) rychlost (ml/min)

Detekce (nm)

Čas Citace analýzy (min)

245

<11

15

220; 256

<4

16

240

<7

17

Acetonitril:voda (30:80, v/v) 241; 271 Acetonitril:methanol:voda 243 (35:5:65, v/v/v) s 0,05% nonylaminem a H3PO 4 Acetonitril:voda (35:60, v/v) 240 s 98% H3PO 4

<8

18

<6

19

<7

20

Ambroxol, methyl 50 paraben, benzoová kyselina

0,48

Naphazolin nitrát, methylparaben

25

0,9

Triamciolon, salicylová kyselina Betametason, chloramfenikol Triamciolon, methylparaben, propylparaben Salicylová kyselina, metylasalicylát Diklofenak sodný, methylparaben, propylparaben Ambroxol, hydrochlorid, doxyciklin Paracetamol, kofein, acetylsalicylová kyselina Lidokain, prokain

50

0,9

25

0,48

25

0,6

50

0,6

25

0,48; 0,9; Acetonitril:voda (40:70, v/v) 275 1,2 s 0,05% trietylaminem a H3PO 4 0,48 Acetonitril:voda (20:90, v/v) 213 s 98% H3PO 4

<8

21

<9

22

25

0,6

Acetonitril:voda (10:90, v/v) 210 s 98% H3PO 4

<7

23

25

0,6

Acetonitril:voda (40:80, v/v) 212 s 0,01% trietylaminem a H3PO 4

<7

24

25

Acetonitril:tetrahydroforan: voda (10:10:90, v/v/v) s triethylaminem a kyselinou octovou Methanol:voda (40:65, v/v) s triethylaminem a kyselinou octovou Acetonitril:voda (35:65, v/v) s kyselinou octovou

Uvedené údaje se týkají separace farmaceuticky aktivních látek, doba analýz je zkrácená ve srovnání se separacemi na částicových kolonách. Je jen otázkou času, kdy se tato metoda dostane do popředí zájmu širší analytické obce a začnou se projevovat její výhody, které vybízejí k většímu rozšíření používání uvedené techniky. Vzhledem k jejím vlastnostem jako je nízký tlak v systému, vyšší průtoková rychlost, automatizace, rychlá analýza, menší spotřeba vzorků, menší odpad 25

a tím ochrana životního prostředí, tak i menší finanční náklady, mluví jen pro zavedení této metody do praxe [1,8-11]. 2.5. Monolitické kolony Účinnost kolony závisí na použité stacionární fázi, na délce kolony a na jejím průměru, na materiálu kolony, na úpravě vnitřního povrchu kolony a na množství spojovacích částí. Chromatografické kolony se zhotovují z nerezové oceli nebo ze skla. Nejvýhodnější jsou kovové kolony, jejichž vnitřní povrch je potažen vrstvou skla. V současnosti se obvykle používají kolony o délce 10 až 25 cm. Průměr analytických kolon bývá v řádu jednotek milimetrů. V současnosti se jako velice nadějné jeví tzv. sub-2 mikronové kolony, které poskytují velice kvalitní separaci při užití menšího objemu vzorku i mobilní fáze, ale objevuje se u nich vyšší zpětný tlak, takže jejich užití v nízkotlakých systémech by bylo příliš problematické [9,10].

2.5.1. Charakteristika kolon Klasické částicové kolony o velikosti 3-5 µm mají výbornou separační účinnost, ale se snižující se velikostí sorbentu stoupá zpětný tlak, tudíž maximální rychlost průtoku je omezená. Monolitické kolony se od běžných stacionárních fází, které jsou plněny částicemi sorbentu o definované velikosti, liší tím, že jsou tvořeny jedním kusem pórovitého materiálu, který zcela vyplňuje vnitřek separační kolony. Největší výhodou monolitických kolon ve srovnání s klasickými částicemi plněnými kolonami jsou jejich hydrodynamické vlastnosti [9,10]. Monolitické kolony mají dva typy pórů: 

Velké póry (makropóry) zajišťují rychlý konvektivní tok mobilní fáze monolitem a významně zrychlují přenos hmoty mezi mobilní a stacionární fází.



Středně velké póry (mesopóry) poskytují monolitu dostatečně veliký povrch, a tím vysokou separační kapacitu. Struktura umožňuje používání monolitů při značně vysokých rychlostech mobilních fází bez přílišného zvýšení tlaku a

26

zároveň bez ztráty separační účinnosti, a to i pro separované makromolekuly (bílkoviny, syntetické polymery) [9,10]. Podle kritérií jako jsou chemická podstata a způsob přípravy se mohou monolitické stacionární fáze rozdělit na:  Anorganické monolity  Makroporézní polymerní monolity  Stlačitelné monolity (komprimované gely)

2.5.1.1. Anorganické monolity Jsou to stacionarní fáze na bázi silikagelu. V současné době jsou komerčně dostupné pod značkou Chromolith ® od firmy Merck nebo v licenci od firmy Phenomenex kolony OnyxTM. Připravují se hydrolytickou polymerací tetramethoxysilanu nebo tetraethoxysilanu ve vodném roztoku kyseliny octové v přítomnosti polyethylenglykolu. Výroba umožňuje přípravu monolitů s přesně definovanou strukturou, kdy vznikají výhradně mesopóry a makropóry vhodných a nastavitelných rozměrů [9,10]. Nevýhodou těchto kolon je objemová kontrakce, ke které při zrání monolitu dochází, což vyžaduje zatěsnění monolitu do pláště kolony před jeho aplikací v HPLC. Připravené monolitické silikagelové kolony mohou být snadno modifikovány například zavedením oktadecylových funkčních skupin na jejich povrch pro použití v chromatografii s reverzními fázemi. Monolitické kolony poskytují srovnatelnou účinnost jako kolony konvenční s velikostí sorbentu 5 µm. Výhodou monolitu je ovšem skutečnost, že se mohou aplikovat podstatně vyšší průtoky mobilní fáze, např. při použití monolitické kolony o vnitřním průměru 4,6 mm a délce 10 cm, může rychlost mobilní fáze nabývat až 5 ml/min bez překročení tlakového limitu čerpadla a kolony. Silikagelové monolity se osvědčily na rozdíl od organických monolitů i při separaci malých molekul [9,10].

2.5.1. 2. Makroporézní polymerní monolity Tyto monolity jsou připravovány přímo v prázdné koloně, která se naplní polymerační směsí, tedy směsí monomerů, porogenů a iniciátorem, pak se uzavře a za tepla je

27

provedena polymerace. Monolit se následně promyje vhodným solventem pro odstranění nezpolymerizovaných látek a může být rovnou užit pro HPLC separace. K těmto typům organických polymerů se především řadí polymerní gely na bázi hydroxyethyl-methakrylátu, glycidyl-methakrylátu a polystyrenu [9,10].

2.5.1.3. Stlačitelné monolity (komprimované gely) Koncem 80-tých let prováděl prof. Hjertén experimenty s částicemi neporézní agarózy a zjistil, že při stlačení sloupce sorbentu hydrostatickým tlakem proudící kapaliny překvapivě došlo ke zvýšení permeability stacionární fáze a současně i ke zlepšení separace. Na základě těchto experimentů připravil monolit polymerací vodného roztoku N,N’-methylenbis-akrylamidu a kyseliny akrylové v přítomnosti anorganické soli (síran amonný), který následně v koloně silně stlačil (až na 10 % původního objemu) a s tímto materiálem získal velmi dobré separace bílkovin [9,10].

2.5.1.4. Reprodukovatelnost měření na monolitických kolonách Přestože každá připravená monolitická kolona je vlastně prototypem, je jejich příprava většinou poměrně dobře reprodukovatelná. Například, reprodukovatelnost relativních retenčních časů dosahovaná na komerčních monolitech Chromolith vyjádřená jako RSD se pohybuje do 4 % [9,10].

2.5.1.5. Technologie přípravy monolitických kolon Použití tradičních kolon založených na 3 a 5 µm částicích silikagelu je "věčným soubojem" účinnosti dělení a protitlaku, 3-mikronové sorbenty nabízejí vyšší účinnost spolu s negativním působením protitlaku, naopak 5-mikronové sorbenty protitlakem tolik netrpí, mají ale naopak nižší účinnost. Při vývoji silikagelu pro monolitické kolony byl brán zřetel právě na výše uvedená fakta a výsledkem je sorbent kombinující výhody silikagelu s částicemi obou velikostí. Technologickým řešením je bimodální struktura pórů obsahující velké póry zvané makropóry a póry s velkým povrchem nazývané mesopóry. Ačkoliv je fyzikální struktura silikagelu monolitických kolon diametrálně 28

odlišná od silikagelu tradičního, jsou chemické vlastnosti sorbentu velmi podobné a tak zde většinou odpadá problém s přenosem metod [9,10]. Monolitická silikagelová HPLC kolona je tvořena touto "tyčinkou" velmi čistého polymerního

silikagelu

zapouzdřenou

v

PEEK

trubici

opatřené

příslušným

šroubením [9,10]. Makropóry umožňují vysoký průtok kolonou (až do 9 ml/min) za nízkého protitlaku. Makropóry o průměru přibližně 2 µm tvoří prostorovou síť, kterou může mobilní fáze za nízkého tlaku rychle protékat a podstatně tak snížit dobu separace. Mezopóry s velkým povrchem vytvářejí naopak jemnou porézní strukturu vnitřní části kolony. Na vnitřním povrchu makropórů, dochází díky odlišným fyzikálně-chemickým vlastnostem analytů k jejich separaci viz obr. č. 6.

Obr. č. 6: Složení monolitických kolon Unikátní kombinace makropórů a mezopórů v monolitických HPLC kolonách je klíčem k vynikající separaci analytů, dosažitelné navíc ve zlomku doby nutné ke stejné separaci na kolonách se standardními částicovými nosiči [9,10].

2.5.1.6. Monolitická vs. částicová struktura Doposud byly náplně HPLC kolon vyráběny především ze sorbentů ve formě drobných, většinou sférických, částic. Malé částice již vlastní podstatou vytvářejí jako náplň kolon

29

výrazný odpor průtoku směsi mobilní fáze i vzorku. Navíc mají však také mnohá další omezení. Částicová fáze, A 

vysoký odpor průtoku mobilní fáze



vysoký protitlak (zkracuje životnost HPLC zařízení)



snížený výkon (dlouhá doba analýzy)



trhání sloupce (zkracuje životnost, horší opakovatelnost)

Monolitická fáze, B 

vysoký průtok (díky velké porozitě)



nízký protitlak (menší namáhání HPLC zařízení)



zvýšený výkon (zkracuje dobu analýzy)



stabilita sloupce (delší životnost, lepší opakovatelnost)

Obr. č. 7: Porovnání složení kolon (A – částicová kolona; B – monolitická kolona)

30

Tabulka č. 7: Specifikace monolitických kolon Typ silikagelu Struktura Velikost pórů Objem pórů Porozita Měrný povrch pH stabilita Teplotní limit Tlakový limit

Vysoce čistý silikagel Monolitická 130 Å mezopóry a 2 µm makropóry 1 ml/g > 80% 300 sqm/g 2,0 – 7,5 45 °C 20 MPa (200 bar / 3000 psi)

Výhody a přínosy monolitických kolon Účinnost separace je jedním z nejdůležitějších parametrů HPLC analýzy a monolitické kolony nabízí účinnost srovnatelnou s klasickými 3 µm nosiči. Účinnost lze navíc díky nízkému odporu fáze modifikovat zvýšením počtu teoretických pater HPLC systému zapojením několika kolon do série [9,10].

31

3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3.1. Použité přístroje, chemikálie a příprava roztoků 3.1.1. Použité přístroje a) SIA 

FIAlab 3000, automatický SIA systém (FIAlab Inc., Seattle, USA)



Software FIAlab for Windows 5.0



Pístové čerpadlo s objemem 5 ml



Šesticestný selekční ventil (Valco Instruments Co., USA)



„Z“ průtoková optická 10 mm cela



Monolitické kolony: 25 and 50 mm dlouhé Chromolith Flash RP-18e kolony, 4.6 mm I.D. (Merck, Germany). Monolitická kolona byla vždy zapojena mezi 6cestný selekční ventil and 10 mm „Z“ průtokovou detekční celu.



UV světelný zdroj D-2000 CE



USB 2000 UV-VIS CCD, detektor pracující s optickými vlákny (OceanOptics, USA)



Solarizací rezistentní optická vlákna (Avantes, USA)



Detekce - vlnové délky: 265 nm pro Vitamin D, 290 nm Vitamin E a 325 nm Vitamin A, vlnová délka 700 nm byla použita pro korekci základní linie



Spojovací materiál: teflonové hadičky s vnitřním průměrem 0,50 mm

b) HPLC systém 

HPLC – LC 2010 C, Shimadzu Corp. (Kyoto, Japonsko)

c) spektrofotometr  Jednopaprskový UV-VIS diode array spektrofotometr Hewlett Packard 8453 (Agilent Technologies, Německo) d) Analytické váhy A&D HR 120

32

3.1.2. Použité chemikálie 

retinol (all-trans vitamin A), Sigma-Aldrich (Praha, Česká republika)



ergocalciferol (D2), Sigma-Aldrich (Praha, Česká republika)



cholecalciferol crystalline (D3) Sigma-Aldrich (Praha, Česká republika)



tocoferol-acetate, Sigma-Aldrich (Praha, Česká republika)



methanol, Sigma-Aldrich (Praha, Česká republika)



n-hexane, Sigma-Aldrich (Praha, Česká republika)



acetonitril, Sigma-Aldrich (Praha, Česká republika)



deionisovaná purifikovaná voda upravená Milli-Q systémem (Millipore, Bedford, MA, USA)

33

3.1.3. Příprava roztoků Roztok vitamínu A: vznikl navážením 0,00286 g vitamínu A a rozpuštěním ve 100 ml 100 % metanolu. Výsledná koncentrace roztoku byla 100 µM. Roztok vitamínu D2: vznikl navážením 0,00397 g vitamínu D2 a jeho rozpuštěním ve 100 ml 100 % metanolu. Výsledná koncentrace roztoku byla 100 µM. Roztok vitamínu D3: vznikl navážením 0,000775 g do 20 ml 100 % metanolu. Výsledná koncentrace roztoku byla 100 µM. Roztok vitamínu E: vznikl navážením 0,5 g a rozpuštěním v 50 ml heptanu; 100 µl vzniklého roztoku bylo rozpuštěno v 10 ml 100% metanolu. Získaná koncentrace byla 2000 µM. Druhá koncentrace vznikla rozpuštěním 0,005 g v 50 ml heptanu a 100 µl vzniklého roztoku bylo rozpuštěno v 50 ml metanolu. Výsledná koncentrace byla 40 µM.

34

Standardní roztoky: Standardní roztok směsi vitamínů A a D2: vznikl smísením 5 ml 100 µM vitamínu A s 5 ml 100 µM vitamínu D2 a jejich převedením do 50 ml baňky a doplněním 100 % metanolem. Standardní roztok směsi vitamínů A, E a D2↓c: vznikl smísením 5 ml 100 µM vitamínu A s 5 ml 100 µM vitamínu D2 a 5 ml 40 µM vitamínu E. Standardní roztok směsi vitamínů A, E a D2↑c: vznikl smísením 10 ml 100 µM vitamínu A s 10 ml 100 µM vitamínu D2 a 5 ml 40 µM vitamínu E. Standardní roztok směsi vitamínů A, E a D3↓c: vznikl smísením 5 ml 100 µM vitamínu A s 5 ml 100 µM vitamínu D3 a 5 ml 40 µM vitamínu E. Standardní roztok směsi vitamínů A, E a D3↑c: vznikl smísením 10 ml 100 µM vitamínu A s 10 ml 100 µM vitamínu D3 a 5 ml 40 µM vitamínu E. Všechny standardy byly skladovány při teplotě 4 °C.

35

3.2. Vývoj a optimalizace separačního procesu 3.2.1. Výběr vlnové délky pomocí spektrofotometrie Vhodná vlnová délka detekce, která byla následně použita v SIA systému pro detekci po separaci uvedených vitamínů, byla zjištěna proměřením jejich absorbčních spekter v UV oblasti pomocí diode array spektrofotometru. Měření spekter se provádělo pro roztoky vitamínů v methanolu. Z měření byly zjištěny vlnové délky absorbčních maxim jednotlivých vitamínů, tedy vlnové délky, při kterých je měření jejich absorbance nejcitlivější. 3.2.2. Orientační zjištění retenčních časů na HPLC Prvotní studie na HPLC Prvotní studie optimalizace separačního procesu byly prováděny na HPLC systému, z důvodu zjištění parametrů separace a přibližných hodnot retenčních časů, podle kterých pak byla navržena separační metoda v SIA systémů. Měření proběhla za použití monolitické kolony 25 mm dlouhé a metanolu jako mobilní fáze při průtokové rychlosti 1 ml/min.

0.030

vit D2 - 1.848

vit A - 1.191

0.035

0.025

AU

0.020

0.015

0.010

0.005

0.000 0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00 Minutes

3.50

4.00

4.50

5.00

5.50

Obr. č. 8: Separace vitamínů A a D pomocí HPLC, za použití 25 mm monolitické kolony a mobilní fáze metanolu při průtokové rychlosti 1 ml/min

36

3.2.3. Výběr mobilní fáze Odplyněná mobilní fáze byla vždy aspirována přes fritu do pístu pístové pumpy a použita v SIA systému místo nosného proudu. Nejdříve byl vybrán jako mobilní fáze metanol. Testoval se na monolitických kolonách o délce 25 a 50 mm (Chromolith Flash RP-18e) průměr 4,6 mm. Zkoušeným vzorkem byl standardní roztok vitamínů A a D2. Byla testována různá průtoková rychlost mobilní fáze. Druhou mobilní fázi byl zvolen acetonitril. Použité podmínky byly stejné. Opět jsme zkoušely mobilní fázi na separaci standardního roztoku vitamínů A a D2 na obou typech kolon. Třetí mobilní fází byla směs methanolu a acetonitrilu 1:1. Opět jsme použily obě kolony, na kterých byly testovány různé průtokové rychlosti mobilní fáze. V tomto případě 5 cm kolona nevyhovovala, protože retenční čas vitamínu D2 byl 650 s, což by příliš prodlužovalo analýzu. 3.2.4. Hodnocení separace pomocí vybraných validačních parametrů Účinnost systému navržené SIC metody byla zjišťována pomocí vybraných validačních parametrů. Ze základních chromatografických parametrů byla vypočítaná data jako faktor symetrie As, rozlišení Rs, počet teoretických pater N a opakovatelnost výšky píků jednotlivých látek hodnocených jako měřená absorbance. Symetrie, rozlišení a počet teoretických pater byly vypočítány ze třech nástřiků roztoků standardů, opakovatelnost byla vyhodnocena ze šesti nástřiků. 3.2.5. Stabilita roztoků Byly změřeny roztoky vitamínů A-100 µM, D2↑ c -100 µM, D3↑c100 µM, a E 40 µM, které byly nastřikovány po 4 dny, a to 1., 2., 4. a 7. den, vždy 6x za sebou. Připravené roztoky byly po celou dobu hodnocení stability uchovávány v tmavých odměrných baňkách při teplotě 4 °C. Měření probíhalo při nalezených optimálních podmínkách separace (viz. Souhrn). Z výsledků absorbancí píků a retenčních časů byli pak vypočítány hodnoty RSD v % pro retenční čas i absorbancí určitého píku každého dne.

37

Údaje z prvního den byl vzat jako 100 % a další dny byly dopočítány vzhledem ke dni prvnímu.

3.3. Vytvoření SIA programu Celý SIA systém je řízen softwarem počítače, takže bylo nutné sestavit jednoduchý ovládací program, který krok po kroku ovládal jednotlivé části přístroje. Analýza probíhala za dříve uvedených podmínek. Celý SIA program, podle něhož probíhala analýza je uveden v tabulce č. 8. Tabulka č. 8: Sestavený SIA program Jednotka

Příkaz

Dvoucestný ventil Poloha IN Pístová pumpa

Aspirace mobilní fáze 2000 µl, při rychlosti 100 µl/s

Dvoucestný ventil Poloha OUT Vícecestný ventil

Port 2

Pístová pumpa

Nasávání vzorku 20 µl, při rychlosti toku …

Vícecestný ventil

Port 6 DETEKTOR Analýza vzorku

Pístová pumpa

Transport vzorku na kolonu a do detektoru rychlostí 10 µl/s

Spektrofotometr

Měření absorbance – Pík na chromatogramu Ukončení jednoho cyklu (3 cykly pro každý vzorek)

3.4. Vývoj separačního procesu v SIA systému Výsledky prvních experimentů na SIA systému. Monolitická kolona 25 mm dlouhá (Chromolith Flash RP-18e) průměr 4,6 mm. byla zapojena mezi vícecestný selekční

38

ventil a průtokovou Z celu. Separace provedena za těchto podmínek je znázorněna na SIC chromatogramu, viz obr. č. 24., kapitola „Výsledky a hodnocení“ . 3.5. Test vhodnosti chromatografického systému Účinnost systému navržené SIC metody byla zjišťována pomocí vybraných validačních parametrů, jako jsou opakovatelnost, asymetrie, rozlišení píků a počet teoretických pater [14]. Ze základních chromatografických parametrů byla vypočítána data jako faktor symetrie AS, Rozlišení RS, počet teoretických pater a opakovatelnost. Hodnoty dosažených parametrů jsou přehledně znázorněny v tabulce č. 30. 3.5.1. Retenční čas a retenční objem VR = tR . v Je to interval od nástřiku vzorku do okamžiku detekce odpovídající průchodu maximální koncentrace látky detektorem VR – retenční objem tR – retenční čas v – průtoková rychlost mobilní fáze 3.5.2. Rozlišení píku RS = 1,18.( tR2 –tR1 ) / (Wh1 + Wh2) tR1, tR2

retenční časy dvou sousedních píků

Wh1, Wh2

šířky píků v poloviční výšce

-

hodnota rozlišení umožňuje číselně vyjádřit úroveň separace

-

látky považujeme za zcela oddělené, jestliže R ≥ 1,5

-

v případě symetrických píků mnohdy postačí rozlišení R = 1,0

3.5.3. Faktor symetrie píku

AS = W 0,05 / 2d W0,05

šířka píku v jedné dvacetině jeho výšky

2d

vzdálenost mezi kolmicí spuštěnou z vrcholu píku a vzestupnou částí píku v jedné dvacetině jeho výšky

39

3.5.4. Počet teoretických pater Vychází z hypotetického předpokladu, že kolona může být rozdělena na sled elementárních jednotek – pater. V rámci jednoho patra se uskuteční kompletní elementární separační krok. Tato teorie (odvozená z diskontinuálních procesů vícestupňové extrakce a kolonové destilace) nemůže být přijata bez výhrad. Pro praxi však přináší výhodné vyjadřování účinnosti chromatografických kolon počtem teoretických pater a výškou teoretického patra, popřípadě pro srovnání separační účinnosti kolon různých délek se používá parametr „výškový ekvivalent teoretického patra“. N = 5,54 . ( tR /Wh )2 tR

retenční čas

Wh

šířka píku v polovině jeho výšky

N

počet teoretických pater [14]

3.5.5. Opakovatelnost Jeden roztok standardu analyzované látky se x nastříkne na kolonu a změří se odpovídající plochy píku (Ai) – v našem případě výšky píků (sledované jako absorbance procházející složky) - a retenční časy tR1. Získané hodnoty se hodnotí pomocí relativní směrodatné odchylky RSD. RSD-relativní směrodatná odchylka v %.100 s /ø směrodatná odchylka

s

=√ ( ∑ (xi- ø)2/(n-1)) n

počet měření

ø

průměr hodnot

požadavek SR ≤ 1 %

40

4.0. VÝSLEDKY A DISKUZE 4.1. Výběr vlnové délky pro detekci Na spektrofotometru byly zjištěny absorpční maxima pro vitamín A - 324 nm, D - 265 nm, E - 285 nm. Použitý SIA systém umožňuje detekci při čtyřech vlnových délkách najednou, takže na základě zjištěných výsledků a konkrétních měření v SIA systému byly zvoleny měřící vlnové délky detektoru A – 325 nm, D – 265 nm, E – 290 nm a vlnová délka pro korekci základní linie byla zvolena při 700 nm. Spektra jednotlivých

324

vitamínů jsou uvedeny na Obr. č. 9-12.

204

1.2

1

Absorbance (AU)

0.8

0.6

260

0.4

0.2

Obr. č. 9: UV spektrum vitamínu A 0

250

300

350

400

Wavelength (nm)

265

200

212

1.4

1.2

1

228

Absorbance (AU)

0.8

0.6

0.4

0.2

Obr. č. 10: UV spektrum vitamínu D2 0 200

250

41

300

350

265 213 1.75

1.5

Absorbance (AU)

228

1.25

1

0.75

0.5

Obr. č. 11: UV spektrum vitamínu D3 364

360

0.25

0 225

250

275

300

325

350

375

Wavelength (nm)

212

200

2.5

Absorbance (AU)

2

1.5

285

278 281

1

0.5

254

Obr. č. 12: UV spektrum tokoferol acetátu. 0 200

220

240

260

42

280

300

320

Wavelength (nm)

4.2. Výběr mobilní fáze

4.2.1. Metanol Pro kolonu o délce 25 mm bylo možno použít rychlosti až do 40 µl/s, zatímco u kolony o délce 50 mm došlo většinou k zastavení pumpy u rychlosti 15 µl/s a vyšší rychlosti nebylo možné využít kvůli vyššímu zpětnému tlaku. Vitamíny A a D2 se při zvýšené průtokové rychlosti vymývaly z kolony blízko sebe, takže rozdíly retenčních časů byly nepatrné. Pro úspěšné stanovení obou vitamínů však bylo potřeba, aby se vyhodnocované píky dokonale separovaly, abychom zajistili opakovatelnou a robustní separaci obou vitamínů. V některých záznamech nebyl separován pík vitamínu A od mrtvého objemu. Konkrétní výsledky jsou uvedeny v tabulkách č. 9-16 a v grafech na obrázcích č. 13-16. A

0,16 0,14

D2

Abs orbanc e

0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 -0,02 0

20

40

60

80

100

R e te nč ní č a s (s)

Obr. č. 13: Chromatogram separace vitamínů A a D2 (délka kolony – 25 mm, mobilní fáze – metanol, průtoková rychlost - 40 µl/s)

43

Separace vitamínů A a D2, délka kolony – 25 mm, mobilní fáze – metanol Tabulka č. 9: Vitamín A, mobilní fáze - metanol Průtoková rychlost (µl/s) 4 5 10 15 20 30 40

Měření 1 2 3 4 5 6 7

Retenční čas (s) 310 138 88 70 61 54 47

Tabulka č. 10: Vitamín D2, mobilní fáze - metanol Průtoková rychlost (µl/s) 4 5 10 15 20 30 40

Měření 1 2 3 4 5 6 7

Retenční čas (s) 425 202 123 94 79 64 56

Průtoková rychlost (µl/s)

50 40 30 20 10 0 0

100

200

300

400

500

Čas (s) Vitamin A

Vitamin D2

Obr. č. 14: Závislost průtokové rychlosti na retenčních časech vitamínů A, D2; délka kolony – 25 mm; mobilní fáze – metanol

44

Separace vitamínů A a D2, délka kolony – 50 mm, mobilní fáze – metanol Tabulka č. 11: Vitamín A, mobilní fáze - metanol Průtoková rychlost (µl/s) 5 10 15

Měření 1 2 3

Retenční čas (s) 253 146 109

Tabulka č. 12: Vitamín D2, mobilní fáze - metanol Průtoková rychlost (µl/s) 5 10 15

Měření 1 2 3


Průtoková rychlost ( µl/s)

20 15 10 5 0 0

100

200 Vitamin A

300 Čas (s)

400

500

Vitamin D2

Obr. č. 15: Závislost průtokové rychlosti na retenčních časech A, D2; délka kolony – 50 mm; mobilní fáze - metanol

45

Separace vitamínů A, D2 (D3) a E, délka kolony – 25 mm, mobilní fáze – metanol Tabulka č. 13: Vitamín A, mobilní fáze - metanol Měření 1 2 3 4 5 6 7

Průtoková rychlost (µl/s) 4 5 10 15 20 30 40

Retenční čas (s) 310 138 88 70 61 54 47

Tabulka č. 14: Vitamín D2, mobilní fáze - metanol Měření 1 2 3 4 5 6 7

Průtoková rychlost (µl/s) 4 5 10 15 20 30 40

Retenční čas (s) 425 202 123 94 79 64 56

Tabulka č. 15: Vitamín D3, mobilní fáze - metanol Měření 1 2 3 4 5

Průtoková rychlost (µl/s) 10 15 20 30 40

Retenční čas (s) 122 90 75 64 56

Tabulka č. 16: Vitamín E, mobilní fáze - metanol Měření 1 2 3 4 5


Retenční čas (s) 142 105 87 70 61

46


50 40 30 20 10 0 0

100

200

Čas (s)

300

400

Vitamin A

Vitamin D2

Vitamin D3

Vitamin E

500

Obr. č. 16: Závislost průtokové rychlosti na retenčních časech A, D2, D3, E; délka kolony – 25 mm; mobilní fáze - metanol

4.2.2. Acetonitril Při experimentech s různými průtokovými rychlostmi, jako v předchozím případě i zde, se ukázalo, že při použití kratší kolony můžeme použít vyšší rychlosti průtoku než u delší kolony. V tomto případě se opět mrtvý objem překrýval s vitamínem A. Výsledky experimentů jsou shrnuty v tabulkách č. 17-24 a v grafech na obr. č. 17-20 0,30 0,25

A

Absorbance

0,20 0,15

D2

D

0,10 0,05 0,00 0

20

40

60

80

100

120

140

-0,05 -0,10 Retenční čas (s)

Obr. č. 17: Chromatogram separace vitamínů A a D2 (délka kolony – 25 mm, mobilní fáze – acetonitril, průtoková rychlost - 40 µl/s)

47

Separace vitamínů A a D2, délka kolony – 25 mm, mobilní fáze – acetonitril Tabulka č.17: Vitamín A, mobilní fáze - acetonitril Průtoková rychlost (µl/s) 5 10 15 20 25 30 35 40

Měření 1 2 3 4 5 6 7 8

Retenční čas (s) 168 107 86 75 69 65 62 60

Tabulka č. 18: Vitamín D2, mobilní fáze – acetonitril Průtoková rychlost (µl/s) 5 10 15 20 25 30 35 40

Měření 1 2 3 4 5 6 7 8

Retenční čas (s) 393 229 167 136 119 105 97 90


50 40 30 20 10 0 0

100

200

Čas (s)

300

Vitamin A

400

500

Vitamin D2

Obr. č. 18: Závislost průtokové rychlosti na retenčních časech A, D2; délka kolony – 25 mm; mobilní fáze - acetonitril

48

Separace vitamínů A a D2, délka kolony – 50 mm, mobilní fáze – acetonitril Tabulka č. 19: Vitamín A, mobilní fáze - acetonitril Průtoková rychlost (µl/s) 5 10 15

Měření 1 2 3


Tabulka č. 20: Vitamín D2, mobilní fáze - acetonitril


Měření 1 2 3

Průtoková rychlost (µl/s) 5 10 15


20 15 10 5 0 0

100

200

300

400

500

Čas (s) Vitamin A

Vitamin D2

Obr. č. 19: Závislost průtokové rychlosti na retenčních časech A, D2; délka kolony – 50 mm; mobilní fáze – acetonitril

49

Separace vitamínů A, D2 (D3) a E, délka kolony – 25 mm, mobilní fáze – acetonitril Tabulka č. 21: Vitamín A, mobilní fáze - acetonitril Měření 1 2 3 4 5 6 7 8

Průtoková rychlost (µl/s) 5 10 15 20 25 30 35 40

Retenční čas (s) 168 107 86 75 69 65 62 60

Tabulka č. 22: Vitamín D2, mobilní fáze - acetonitril Měření 1 2 3 4 5 6 7 8


Retenční čas (s) 393 229 167 136 119 105 97 90

Tabulka č. 23: Vitamín D3, mobilní fáze – acetonitril Měření 1 2 3 4 5 6 7 8


Retenční čas (s) 455 256 177 145 124 112 103 96

Tabulka č. 24: Vitamín E, mobilní fáze - acetonitril Měření 1 2 3 4 5 6 7 8


Retenční čas (s) 500 260 185 160 137 115 110 97 50


45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0

100

200

300 Čas (s)

400

Vitamin A

Vitamin D2

Vitamin D3

Vitamin E

500

600

Obr. č. 20: Závislost průtokové rychlosti na retenčních časech A, D2, D3, E; délka kolony – 25 mm; mobilní fáze – acetonitril

4.2.3. Metanol-acetonitril 1:1 Tato mobilní fáze vyhovovala při použití 25 mm kolony, kdy se vitamín A nepřekrýval s mrtvým objemem a rozdíly všech retenčních časů byly dostatečné. Vitamín E (tokoferol acetát) se separoval za vitamínem D. Výsledky separace splnily ve sledovaných parametrech (rozlišení, asymetrie) nároky na dokonalou separaci uvedených vitamínů - A, D2 (resp. D3) a E, proto byla tato mobilní fáze zvolena pro částečnou validaci navrženého SIC systému. Výsledky jsou uvedeny v tabulkách č. 25-30 a v grafech na obrázcích č. 21-23.

51

0,30 0,25

Absorbance

0,20

E

0,15

A

0,10

D2

0,05 0,00 -0,05

0

100

200

300

400

500

-0,10 Retenční čas (s)

Obr. č. 21: Chromatogram separace vitamínů A, D2 a E (délka kolony – 25 mm, mobilní fáze – metanol:acetonitril 1:1 (v/v), průtoková rychlost - 5 µl/s) Separace vitamínů A, D2, délka kolony – 25 mm, mobilní fáze – acetonitril:metanol Tabulka č. 25: Vitamín A, mobilní fáze – acetonitril:metanol 1:1 Měření 1 2 3 4 5


Retenční čas (s) 97 72 55 49 46

Tabulka č. 26: Vitamín D2, mobilní fáze – acetonitril:metanol 1:1 Měření 1 2 3 4 5


Retenční čas (s) 159 118 83 68 62

52


45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0

25

50

75

100

125

150

175

Čas (s) Vitamin A

Vitamin D2

Obr. č. 22: Závislost průtokové rychlosti na retenčních časech A, D2; délka kolony – 25 mm; mobilní fáze – acetonitril:metanol 1:1 Separace vitamínů A, D2 (D3) a E, délka kolony – 25 mm, mobilní fáze – acetonitril:metanol Tabulka č. 27: Vitamín A, mobilní fáze - acetonitril:metanol 1:1 Měření 1 2 3 4 5


Retenční čas (s) 97 72 55 49 46

Tabulka č. 28: Vitamín D2, mobilní fáze - acetonitril:metanol 1:1 Měření 1 2 3 4 5


Retenční čas (s) 159 118 83 68 62

53

Tabulka č. 29: Vitamín D3, mobilní fáze - acetonitril:metanol 1:1 Průtoková rychlost (µl/s) 10 15 25 35 40

Měření 1 2 3 4 5

Retenční čas (s) 167 126 93 79 75

Tabulka č. 30: Vitamín E, mobilní fáze - acetonitril:metanol 1:1 Průtoková rychlost (µl/s) 10 15 20 25 30 35 40


Měření 1 2 3 4 5 6 7

Retenční čas (s) 207 147 132 114 105 89 82

50 40 30 20 10 0 0

50

100

150

200

250

Čas (s) Viamin A

Viamin D2

Vitamin D3

Vitamin E

Obr. č. 23: Závislost průtokové rychlosti na retenčních časech A, D2, D3, E; délka kolony – 25 mm; mobilní fáze – acetonitril:metanol 1:1

54

4.3. Vyhodnocení vybraných validačních parametrů Uvedené validační parametry byly vyhodnoceny při optimálních podmínkách separace s užitím 25 mm dlouhé monolitické kolony (Chromolith Flash RP-18e, průměr 4,6 mm), mobilní fáze metanol:acetonitril 1:1 (v/v), průtokové rychlosti 10 µl/s a dávkovaného objemu vzorku 20 µl. Separace byla hodnocena zvlášť pro analýzu směsi vitamínů A, D2, E a směsi A, D3, E. Chromatogram separace vitamínů A, D2 a E je uveden na obr. č. 24. Výsledky hodnocení vybraných validačních parametrů jsou shrnuty v tabulce č. 31 spolu s požadovanými kritérii pro jednotlivé parametry. Ve všech případech byly požadované limity splněny. Tabulka č. 31: Hodnoty vybraných validačních parametrů

Opakovatelnost Rozlišení píků R

Kritéria

A

D2

D3

E

RSD ≤ 1%

0,53

0,35

0,81

0,71

(A-D2)

(A-D3)

(D-E)

3,607

4,232

1,532

R > 1,5

Faktor symetrie píku T

T<2

1,309

1,302

1,286

1,158

Počet teor. pater N

N > 900

998

1621

2091

2376

Záznamy byly hodnoceny po převedení dat do Excelu, vytištění zvětšených záznamů a změření výšky píku i ostatních parametrů po určení vlastní „baseline“.

55

0,4

E

0,35 0,3

Absorbance

0,25 0,2

0,15

A

D2

0,1

0,05 0 -0,05 0

50

100

-0,1

150

200

250

300

Retenční čas (s)

Obr. č. 24: Separace standardního roztoku (A, D2, E na koloně 25 mm s mobilní fází metanol-acetonitril 1:1, průtoková rychlost – 10 µl/s) v SIA systému. 4.4. Vyhodnocení opakovatelnosti Tabulka č. 32: Vitamín A

Tabulka č. 33: Vitamín E

Čas tR

Vitamín A Absorbance

Čas tR

Vitamín E Absorbance

93,81 93,97 93,86 93,92 94,14 93,87

0,1218 0,1179 0,1194 0,1226 0,1241 0,1185

183,18 183,94 182,02 181,75 181,75 180,21

0,2765 0,2457 0,2760 0,2734 0,2753 0,2683

Ø = 93,93 Ø = 0,12 RSD (%) = 0,11 RSD (%) = 1,88

Ø = 182,14 Ø = 0,27 RSD (%) = 0,65 RSD (%) = 4,03

Tabulka č. 34: Vitamín D2↑c Vitamín D2↑c Čas tR Absorbance

Tabulka č. 35: Vitamín D3↑c Vitamín D3↑c Čas tR Absorbance

150,35 149,68 148,40 149,00 149,56 149,39

158,90 157,85 156,53 156,26 155,87 155,61

0,0861 0,0749 0,0831 0,0876 0,0767 0,0746

Ø = 149,40 Ø = 0,08 RSD (%) = 0,40 RSD (%) = 6,60

0,0784 0,0757 0,0794 0,0804 0,0801 0,0803

Ø = 156,83 Ø = 0,08 RSD (%) = 0,74 RSD (%) = 2,08

56

Hodnoty získané z opakovatelnosti výšky píků vykazovaly velkou odchylku způsobenou hodnocením absorbance programem FIAlab, který nehodnotí aktuální „baseline“, ale počítá vždy od nuly. Pro vitamín A byla nalezena hodnota RSD -1,88 %, D3↑c – 2,08 %, D2↑c – 6,60 %, E – 4,03 %. 4.5. Vyhodnocení stability Tabulka č. 36: Vitamín A Den 1.den 2.den 4.den 7.den

Retenční čas 93,93 93,80 94,00 93,98

Vitamín A Retenční čas (%) 100,00 99,86 100,07 100,05

Absorbance 0,1207 0,1197 0,1182 0,1105

Absorbance (%) 100,00 99,20 97,90 91,50

Tabulka č. 37: Vitamín D2↑c Den 1.den 2.den 4.den 7.den

Retenční čas 150,56 153,52 150,54 150,85

Vitamín D2↑c Retenční čas (%) 100,00 101,96 99,98 100,19

Absorbance 0,0929 0,0687 0,0789 0,0641

Absorbance (%) 100,00 73,95 84,93 68,99

Tabulka č. 38: Vitamín D3↑c Den 1.den 2.den 4.den 7.den

Retenční čas 156,83 158,36 158,98 160,26

Vitamín D3↑c Retenční čas (%) 100,00 100,97 101,37 102,15

57

Absorbance 0,0795 0,0755 0,0756 0,0497

Absorbance (%) 100,00 94,96 95,09 62,51

Tabulka č. 39: Vitamín E-acetát Den 1.den 2.den 4.den 7.den

Vitamín E-acetát Retenční čas Retenční čas Absorbance (%) 182,41 100,00 0,2692 183,45 100,57 0,2393 184,74 101,27 0,2824 184,97 101,40 0,2029

Absorbance (%) 100,00 88,89 104,90 75,37

U zkoušek stability roztoků bylo zjištěno, že roztoky vitamínů podléhají rozkladu a z toho důvodu je vhodné připravovat roztoky vitamínů s nízkou koncentrací každý den čerstvě ředěním koncentrovanějších standardů.

58

5. SOUHRN Separace vitamínů A, D a E v SIA systému za použití monolitických kolon. Byla optimalizována

z pohledu

mobilních

fází

acetonitril,

metanol

a

směsi

metanol:acetonitril (1:1, v/v). Stacionární fáze byla testována s ohledem na různou délku monolitické kolony. Při různých průtokových rychlostech mobilní fáze byly využity kolony 25 mm a 50 mm dlouhé. Po zjištění optimálních podmínek probíhala separace vitamínů při rychlosti 10 µl/s, na koloně

25

mm

dlouhé

a

mobilní

fáze

metanol:acetonitril

(1:1,

v/v)

se

spektrofotometrickou detekcí při vlnových délkách absorpčního maxima pro vitamín A – 324 nm, D - 265 nm, E - 285 nm. Účinnost systému navržené SIC metody byla zjišťována pomocí vybraných validačních parametrů. Ze základních chromatografických parametrů byly vypočítány faktor symetrie As, rozlišení Rs, počet teoretických pater N a opakovatelnost výšky píků jednotlivých látek hodnocených jako měřená absorbance. Uvedené parametry vyhovovaly požadavkům validačních autorit. U zkoušek stability roztoků bylo zjištěno, že roztoky vitamínů podléhají rozkladu a z toho důvodu je vhodné připravovat roztoky vitamínů s nízkou koncentrací každý den čerstvě ředěním koncentrovanějších standardů.

59

6. ZÁVĚR Cílem diplomové práce bylo najít optimální podmínky pro separaci vitamínů A, D a E na monolitické koloně zapojené v systému sekvenční injekční analýzy. Předběžně zjištěné podmínky separace na HPLC systému byly převedeny do podmínek sekvenční injekční chromatografie. Kvalita separace byla vyhodnocena vybranými validačními parametry. Diplomová práce částečně ověřila možnost využití vyvinuté separační metody pro stanovení vitamínů v léčivých přípravcích (ve formě kapek a masti), které obsahují vitamíny A a D, tokoferol-acetát je v tomto případě praktických aplikací navržen pro funkci vnitřního standardu. Pro stanovení vitamínů v konkrétních přípravcích bude nutno dokončit kompletní validaci.

60

7. SEZNAM LITERATURY [1]

H. Paseková: Disertační práce “Využití automatizovaných průtokových metod ve

farmaceutické analýze“, FaF UK 2001. [2]

D. Lincová, H. Faughali: Základní a aplikovaná farmakologie (2002), Galén, 373-446.

[3]

Lékopisná komise MZ.: Český lékopis (2005). doplněk (2006), Grada publishing

Praha, 2006. [4]

http://cs.wikipedia.org/wiki/axeroftol, únor 2009.

[5]

http://hplc.1.sweb.cz/Vitamin/ch_VitD2.htm, únor 2009.

[6]

http://hplc.1.sweb.cz/Vitamin/e_VitD3.htm, únor 2009.

[7]

http://cs.wikipedia.org/wiki/Vitamin_D, únor 2009.

[8]

J. Huclová, D. Šatínský, R. Karlíček: Analytica Chimica Acta 494 (2003) 133.

[9]

D. Šatínsky, P. Solich, P. Chocholouš, R. Karlíček: Analytica Chimica Acta 499

(2003) 205. [10]

L. Urbánek, D. Solichová: Analytica Chimica Acta 573-574 (2006) 267.

[11]

Constantinos K. Zacharis, Georgios: Journal of chromatography A, 1121 (2006) 46.

[12]

http://www.hplc.cz./Faq/monolitic_columns.htm, únor 2009.

[13]

http://www.detekceplynu.cz/onyx.htm, únor 2009.

[14]

J. Klimeš: Kontrola chemických léčiv-1.část, Karolinum 2002.

[15]

D. Šatínský, J. Huclová, RLC. Ferreira, M.C. Montenegro, P. Solich, Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis 40 (206) 293. [16]

P. Chocholouš, D. Šatínský, P. Solich: Talanta 70 (2006) 408.

[17]

P. Chocholouš: et al.: Talanta 72 (2007) 854.

[18]

D. Šatínský, P. Chocholouš, M. Salabová, P. Solich, Journal of Separation Science

29 (2006) 2494. [19]

D. Šatínský, J. Huclová, P. Solich, R. Karlíček: Journal of Chromatography A 1015

(2003) 239. [20]

J. Huclová, D. Šatínský, R. Karlíček: Analytica Chimica Acta 494 (2003) 133.

[21]

D. Šatínský, P. Solich, P. Chocholouš, R. Karlíček: Analytica Chimica Acta 499

(2003) 205. [22]

D. Šatínský, L. Santos, H. Sklenářová, P. Solich, M.C. Montenegro, A. Araújo:

Talanta 68 (2005) 214. [23]

D. Šatínský, I. Neto, P. Solich, H. Sklenářová, M.C. Monteneger, A. Araújo, Journal

of Separation Science 27 (2004) 529. [24]

J. Klimundová, D. Šatínský, H. Sklenářová, P. Solich: Talanta 69 (2006) 73. 61

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA ANALYTICKÉ CHEMIE DIPLOMOVÁ PRÁCE

Recommend Documents