Fakultní studentské vědecké konference Interní grantové agentury VFU Brno 2011

Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

FAKULTA VETERINÁRNÍHO LÉKAŘSTVÍ FAKULTA VETERINÁRNÍ HYGIENY A EKOLOGIE FAKULTA FARMACEUTICKÁ

Fakultní studentské vědecké konference Interní grantové agentury VFU Brno 2011

Sborník příspěvků z výsledků řešení projektů IGA VFU Brno 2011 financovaných z prostředků účelové podpory na specifický vysokoškolský výzkum MŠMT na rok 2011

14. prosince 2011

BRNO

Fakultní studentské vědecké konference Interní grantové agentury VFU Brno 2011 Fakulta veterinárního lékařství Fakulta veterinární hygieny a ekologie Fakulta farmaceutická

Editace:

doc. MVDr. Miloslava Lopatářová, CSc. prof. MVDr. Vladimír Celer, Ph.D. prof. MVDr. Jiří Pikula, Ph.D. doc. RNDr. Bc. Jiří Pazourek, Ph.D.

Za věcnou a jazykovou správnost odpovídají autoři.

Vydání: první Copyright © 2011 Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

2

Vážení kolegové,

současná doba je charakteristická obrovským nárůstem vědeckých informací. V České republice k tomu přispívají především univerzitní a vysokoškolská pracoviště, Akademie věd, výzkumné ústavy a další instituce. Tento trend záplavy nových poznatků zaznamenáváme i ve veterinární a farmaceutické vědě a je výborné, že mezi přispívateli v této oblasti hraje naše Veterinární a farmaceutická univerzita Brno nejvýznamnější roli. Věřím, že výsledky výzkumu na naší univerzitě dosažené v roce 2011 budou kvalitně publikovány. Je to dnes jeden z velmi důležitých a také sledovaných úkolů každého vědeckého pracovníka, učitele - každého z nás. Jsem velmi ráda, že naše fakulty byly v roce 2011 opět publikačně aktivní i v rámci specifického výzkumu. Je to přece jedna z cest, jak přivést ke vědeckému bádání mladé kolegy, jak je naučit pracovat v kolektivech a zařadit je postupně do velkých vědeckých týmů, které jistě výsledky specifického výzkumu už dnes dále využijí. Věřím, že právě předložený Sborník z konference Interní grantové agentury VFU Brno k těmto cílům svým dílem přispěje. Děkuji Vám všem za práci, kterou jste při jeho tvorbě odvedli.

Doc. MVDr. Miloslava Lopatářová, CSc. Prorektorka pro vědu, výzkum a zahraniční vztahy

V Brně 14. 12. 2011

3

4

Obsah

Vztah vybraných molekulárních markerů a výskytu piroplazem u polodivoké populace koní v Dunajské deltě ......................................................................................................................................................................... 11 Hostitelská specifita dvou druhů kokcidií rodu Eimeria z holubů, jejich patogenita, endogenní vývoj a molekulární diverzita. ...................................................................................................................................... 14 Surveillance Q horečky v chovech skotu a malých přežvýkavců na území České republiky ........................... 17 Exprese rekombinantního glykoproteinu D herpesviru psů 1 v buňkách kvasinek......................................... 20 Sledování hladin pohlavních hormonů z trusu u rozdílných věkových kategorií druhu Nomascus leucogenys, Nomascus siki a Nomascus gabriellae spojených se změnou barvy srsti ........................................................ 23 Hodnocení hemokultivace a koagulopatií u novorozených hříbat .................................................................. 26 Zavedení zátěžového testu u koní s využitím vysokorychlostního trenažéru ................................................. 30 Kvantifikace sonografie jater ve vztahu k vyšetření krve a jaterních bioptátů ............................................... 33 Vývoj účinného protokolu vitrifikace oocytů skotu......................................................................................... 36 Vliv GnRH implantátů na ovariální aktivitu samic chameleóna jemenského .................................................. 39 Transvaginální sonografická intrafolikulární aplikace hCG a LH u skotu ......................................................... 42 Hodnocení vybraných změn vnitřního prostředí u syndromu dilatace a volvulu žaludku .............................. 46 Studium metabolizmu mědi ve vztahu matka – mládě u koz při dotaci mědi ve formě anorganické a organicky vázané ............................................................................................................................................. 49 Mikrobiální flóra periapikálních abscesů králíka domácího ............................................................................ 53 Volná nervová zakončení a ultrastruktura intraartikulárních vazů u psa........................................................ 56 Matematický model mechanického testování fixace segmentálního defektu femuru 4,5mm LCP................ 60 Stanovení obsahu jódu ve skupině masných výrobků typu „fermentovaná masa“ pořízených na trhu ČR ... 65 Nová elektrochemická metoda pro stanovení akrylamidu v potravinách a krmivech .................................... 68 Výskyt původce chytridiomykózy u obojživelníků Kamerunu ......................................................................... 71 Ektoparazité volně žijících ptáků v jižním Vietnamu ....................................................................................... 74 Zastoupení potenciálních alergenů v mléčných výrobcích .............................................................................. 77 Kachna divoká (Anas platyrhynchos) jako bioindikátor kontaminace vodního ekosystému olovem ............. 80 Zvěř jako indikátor kontaminace životního prostředí ..................................................................................... 83 Vliv výživy na jateční hodnotu a kvalitu masa orebice chukar ........................................................................ 86

5

Suplementace vybraných rostlinných olejů do diety užitkových nosnic ......................................................... 89 Studium účinků vybraných platinových kovů na zástupce producentů ve vodních ekosystémech ................ 92 Stanovení inhibičních účinků platinových kovů na růst vybraných druhů rostlin ........................................... 95 Zlepšení nutriční hodnoty masných výrobků, přídavkem olejů s obsahem mastných kyselin řady n-3 a přírodních antioxidantů. .................................................................................................................................. 98 Riziko kombinované expozice ptáků cyanotoxiny, inhibitory acetylcholinesterázy a antikoagulanty .......... 101 Riziko kombinované expozice ptáků nesteroidním antiflogistikům a olov ................................................... 104 Perorální toxicita mikrocystinů pro ptáky ..................................................................................................... 107 Obsah kovů ve tkáních ryb z nádrží Skalka a Želivka a jejich podíl na vznikuoxidativního stresu u ryb........ 110 Stanovení biomarkerů oxidativního stresu u ryb po dlouhodobém působení triazinů ................................ 113 Stanovení významných barviv u vybraných produktů rostlinného původu a sledování jejich změn v závislosti na technologických operacích a skladovacích podmínkách .......................................................................... 116 Působení ionizujícího záření na rezidua pesticidů ve vodním prostředí použitím biotestu na Artemia franciscana .................................................................................................................................................... 119 Sledování vybraných parametrů masa pernaté zvěře z pohledu ochrany veřejného zdraví ........................ 122 Rostlinné inhibitory ureáz ............................................................................................................................. 127 Zvýšení bezpečnosti perorálních pevných lékových forem s úzkým terapeutickým indexem ...................... 130 Vliv oxidativního stresu na biosyntézu sekundárních metabolitů – polyfenolů............................................ 133 Role zinku v mitochondriální dysfunkci a apoptóze. ..................................................................................... 136 Vývoj chitosanových mikročástic pro přívod modelového léčiva do kolonu ................................................ 139 Formulace a hodnocení mukoadhezivních flexibilních filmů připravených metodou impregnace .............. 142 Optimalizace metod pro stanovení inhibiční aktivity potenciálních inhibitorů histondeacetyláz ................ 146 Mikrovlnná syntéza nových substituovaných derivátů chinolinu jako potenciálních antimikrobiálních látek ....................................................................................................................................................................... 149 Syntéza nových inhibitorů histondeacetylas – modulace struktury chromatinu .......................................... 152 Izolace obsahových látek Paulownia tomentosa........................................................................................... 155 Validace metody pro stanovení sacharidů pomocí hydrofilní interakční chromatografie (HILIC) s detektorem ELSD ............................................................................................................................................................... 158 Testování antioxidační aktivity přírodních látek s využitím buněčných kultur ............................................. 161

6

Hodnocení cytodiferenciačních účinků látek izolovaných z Morus alba a Paulownia tomentosa na lidských leukemických THP-1 buňkách ........................................................................................................................ 164 Chemoenzymatická syntéza opticky čistých chirálních látek ovlivňujících adrenoreceptory a stanovení jejich enantiomerní čistoty* ................................................................................................................................... 167

7

8

Příspěvky Fakulty veterinárního lékařství

9

10

Vztah vybraných molekulárních markerů a výskytu piroplazem u polodivoké populace koní v Dunajské deltě 1

2

Eva Jánová , Moneeb Quablan , Martina Galusová, Katja Persson2, David Modrý2 , Petr Hořín1 Ústav genetiky, Fakulta veterinárního lékařství VFU Brno1,Ústav patologické morfologie a parazitologie, Fakulta veterinárního lékařství VFU Brno2

Úvod Studium interakcí mezi hostitelem a patogeny je u domácích zvířat komplikováno tím, že veterinární management a chovatelská praxe umožňuje reprodukci a přežívání i jedinců méně odolným k chorobám. Populace koní v deltě Dunaje je v tomto směru unikátním modelem pro studium mechanismu rezistence a vnímavosti vůči působení patogenů. Populace je vystavena vlivu patogenů, aniž by byla zásadní měrou ovlivňována veterinární péčí. Přirozenou selekci jedinců citlivých na důležité patogeny je možno sledovat i na molekulární úrovni jako změny četností genotypů některých genů spojených s imunitní odpovědí organismu. Polodivocí koně v deltě Dunaje jsou vystaveni velké imunitní výzvě, kterou je piroplazmóza, onemocnění působené krevními prvoky rodu Theileria a Babesia přenášenými klíšťaty. U oslů již byl potvrzen vztah mezi polymorfismem DRA (genu ze skupiny MHC) a vnímavostí k infekci piroplasmami (Vranová et al. 2011). U koní z Camarque byl nalezen vztah mezi genem PRKAR1B a piroplasmami (Futas, in prep.) a podobně i u myší byl nalezen vztah mezi IL12 a babeziózou (Aguilar-Delfin et al. 2003). Cílem naší práce bylo zjistit, zda mají tyto markery vztah k výskytu piroplasem v krvi koní v deltě Dunaje a jestli je tato infekce asociována i s formami jiných kandidátních genů TLR4 a OAS1. Získané

výsledky

mohou

přispět

k vytipování

genetických

markerů

indikujícím

resistenci/vnímavost k piroplazmóze u domácích koní a tím zlepšit management řízené plemenitby v oblastech s endemickým výskytem těchto infekcí.

Materiál a metodika Odběry periferní krve polodivokých a domestikovaných koní krve byly provedeny v létě 2011 v okolí Sfantu Gheorge, okres Tulcea, Rumunsko. Spolu se vzorky z roku 2010 jsme měli k dalším analýzám k dispozici celkem 108 koní. Jelikož je výskyt piroplazem spojen s věkem (hříbata a mladí koně se často ještě nedostali do styku s patogenem), molekulární analýzy byly provedeny jen na koních starších 3 let, kterých bylo 92.

11

Z periferní krve byla pomocí kitu NucleoSpin Blood (Macherey-Nagel) izolována DNA. Pomocí již publikovaných nebo známých primerů (Futas in prep.) byly amplifikovány tyto úseky genů: 3. exon genu TLR4, 2. exon genu DRA, 2. a 4. exon genu OAS1, intron genu PRKAR1B a intron IL12p35. Pro reakci bylo použito 6,25µl HotStarTaq Master Mix (Qiagen, Carlsbad, CA, USA), 25-50pmolu primeru a 100ng DNA. PCR začínala denaturací při 94°C/15 min, 35-40 cyklů spočívajících z annealingu při 55-64°C/30 s, denaturace při 94°C/20 s a extenze při 68-72°C/90 s a ze závěrečné extenze při 68- 72oC/10 min. Genotyp SNP testovaných genů byl stanoven pomocí RFLP metody- čtyři známé alely DRA byly rozpoznány pomocí tří enzymů (BsaJI, Hpy166II, Cac8I), 3 SNP pozice genu TLR4 pomocí dvou enzymů (Dde I a BssSI), u ostatních genů byl genotypován jeden SNP jedním enzymem- IL12p35 enzymem TaqI, PRKAR1B enzymem BmgBI, OAS1e2 enzymem Taq I a OAS1e4 enzymem AfaI. Diagnostika DNA piroplazem v celkové DNA z krve koní byla provedena s využitím univerzálních primerů

amplifikujících

gen

pro

SSUrRNA

CTTCAGCACCTTGAGAGAAAT-3´;

reverse

(forward primer

primer

TB-F

TB-R

5´(5´-

TCDATCCCCRWCACGATGCRBAC-3´). Krev koní z ČR byla použita jako negativní kontrola. Detaily PCR diagnostiky viz Sloboda et al. (2011). Na základě výsledků PCR byli koně hodnoceni jako pozitivní nebo negativní. Následně byly pozitivní jedinci vyšetřeni druhově specifickými primery navrženými pro diferenciální diagnostiku Theileria equii a Babesia caballi (forward TBM (5´-CTTCAGCACCTTGAGAGAAATC-3´); TGCCTTAAACTTCCTTGCGAT-3´)

and

reverse BC-R

primers

Equi-R

(5´-

(5´-GATTCGTCGGTTTTGCCTTGG-3´)

(Sloboda et al., 2011). Pomocí χ2 testu byla provedena asociační analýza vztahu četností jednotlivých genotypů a přítomnosti piroplazem zjištěných univerzálními primery. Dále jsme provedli tutéž asociační analýzu i pro vztah mezi negativními jedinci a jedinci, u nichž byla zjištěna pouze Theleria equii. Tyto podrobné analýzy nebylo možno provést pro jedince s pozitivním nálezem Babesia cabballi, neboť jejich prevalence byla příliš nízká. Výsledky Pomocí univerzálních primerů byla přítomnost piroplazem potvrzena u 45 ze 108 (41.7%) vyšetřovaných jedinců. Specifickými primery byla u 35 jedinců potvrzena přítomnost pouze Theileria equi, u 4 jedinců přítomnost pouze Babesia cabballi, u 2 jedinců byla zjištěna DNA obou patogenů a u 4 byla zjištěna piroplazmóza jen nespecifickými primery. Výsledky asociačních

12

analýz pro prevalenci piroplazem pomocí univerzálních primerů a primerů pro Theleria equii jsou shrnuty v tabulce 1. Byl nalezen slabý vztah mezi genotypy genů DRA a přítomností piroplazem. Ačkoli by bylo možno očekávat účinnější imunitní odpověď u zvířat s heterozygotní formou MHC genu DRA, byli heterozygoti naopak výrazně častěji infikováni (při použití univerzálních primerů χ2=4,053, p< 0,05, analýza přítomnosti Theleria equii χ2=4,201, p< 0,05). Při analýze vztahu mezi prevalencí Theileria equii a markerem IL12P35 byla nalezena slabá tendence pro zvýhodnění jednoho typu homozygota, při použití univerzálních primerů nebyl tento vztah dokázán. U markerů OAS1, TLR4 (všechny SNP) and PRKAR1B nebyl nalezen žádný vztah mezi prevalencí a genotypem. Tabulka 1: Průkaznost asociací mezi prevalencí piroplazem a genotypy molekulárních markerů

Univ. primery Theleria equii

p χ2 p χ2

DRA 0,091 14,986 0,053 16,743

TLR4 >0.1 (BssSI) 0,753 >0.1 0,364

TLR4 >0.1 (DdeI) 8,575 >0.1 6,401

IL12p35 >0.1 4,414 0,054 5,824

PRKAR1B >0.1 0,286 >0.1 1,213

OAS1e2 >0.1 0,11 >0.1 0,622

OAS1e4 >0.1 0,232 >0.1 2,357

Shrnutí Byl potvrzen slabý vztah mezi četností jednotlivých genotypů molekulárních markerů DRA a IL12p35 a mezi infekcí piroplazmózou. Nevelká statistická významnost je vysvětlitelná celkově malým počtem sledovaných zvířat. Soubor dat bude podroben statistické analýze za použití speciálně vyvinutého softwaru. Seznam literatury 1) AGUILAR-DELFIN, I., WETTSTEIN, P.J., PERSING, D.H. Resistance to acute babesiosis is associated with interleukin-12- and gamma interferon-mediated responses and requires macrophages and natural killer cells. Infection and Immunity, 2003, vol. 71, no 4, p. 2002-2008. 2) SLOBODA, M., JIRKŮ, M, LUKEŠOVÁ, D., QABLAN, M., BATSUKH, Z., FIALA, I., HOŘÍIN, P., MODRÝ, D., LUKEŠ, J. A survey for piroplasmids in horses and Bactrian camels in North-Eastern Mongolia. Veterinary Parasitology, 2011, vol. 179, p. 246-249. 3) VRANOVÁ, M., ALLOGIO, I., QABLAN, M., VYSKOČIL, M., BAUMEISTEROVÁ A., SLOBODA, M., PUTNOVÁ, L., VRTKOVÁ, I., MODRÝ, D., HOŘÍN P. Genetic diversity of the class II major histocompatibility DRA locus in European, Asiatic and African domestic donkeys. Infection, Genetics and Evolution, 2011, vol. 11, no 5, p. 1136-1141.

13

Hostitelská specifita dvou druhů kokcidií rodu Eimeria z holubů, jejich patogenita, endogenní vývoj a molekulární diverzita. Ján Jamriška1,3, Jana Běhalová1 , David Modrý1,2 Ústav patologické morfologie a parazitologie, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno1, Parazitologický ústav, Biologické centrum AV ČR, České Budějovice2, Katedra zoologie, Prírodovedecká fakulta Univerzity Komenského v Bratislave3 email: [email protected], [email protected]

Úvod Kokcidie rodu Eimeria představují jednu z nepočetnějších skupin monoxenních parazitů ptáků v zajetí i ve volné přírodě. Přestože fauna ptáků řádu měkkozobých je relativně početná a zahrnuje více než 300 druhů, informací o diverzitě kokcídií je minimum, a to i přes to, že představují zásadní patogeny v chovech domácích holubů. Doposud je z měkkozobých popsáno jen 13 druhů eimérií (Pellérdy, 1974; Duszynski et al., 1999; Alyousif et al., 2009), většina popisů je nedostatečných a pouze u jednoho zástupce známe i jeho endogenní vývoj. Právě neznalost hostitelské specifiky umocňuje riziko obousměrného šíření kokcidií mezi divokými populacemi holubovitých a zájmovými chovy. Experimentální studie byla zaměřena tak, aby bylo možné sledovat jak endogenní vývoj u přirozeného hostitele tak i možný přenos a vliv na hostitele jiného druhu. V rámci tak rozsáhlé skupiny organizmů jakými jsou kokcídie je jednou z hlavních cest k pochopení jejich diverzity experimentální studium skupin modelových druhů, nicméně práce tohoto typu skoro chybí. Materiál a metodika Při experimentech bylo použito 8 jedinců C. livia, získaných ve věku 8-12 dní a 4 jedinci C. palumbus ve věku 36 měsíců. Skupiny holubů byly opakovaně vyšetřeny na přítomnost kokcídií tak, aby se vyloučila předešlá možná infekce. Holubi byli následně infikováni dvěma rozdílnými izoláty eimérií o koncentraci 103 oocyst/ml per os, získanými z volně žijících populací C. livia a C. palumbus. Z infikovaných jedinců pak byly získané sety vzorků trusu, které byly koproskopicky vyšetřeny a zpracovány dle metodiky Dolnik et al. (2009). Morfologie a morfometrie oocyst byla hodnocena s pomocí mikroskopu Olympus AX 70 s Nomarskiho kontrastem, za použití kalibrovaného okulárového mikrometru. Jednotlivé oocysty byly následně použity na izolaci DNA. Ptáci byli v průběhu pokusu utráceni (v souladu s projektem pokusu) cervikální torzí a následně

14

byly odebrány tkáně na pato-histologickou analýzu. Odebrané vnitřní orgány byly fixovány v 10% formaldehydu, zality do parafínu a po nařezání barveny haematoxylin-eosinem. Stadia v trusu i tkáních byla dokumentována digitální kamerou Olympus DP 70. Na základě dosavadních zkušeností a publikovaných dat byla z jednotlivých oocyst izolovaná DNA s použitím bead-beateru, přičemž byl použit protokol izolace pomocí Chelexu (Dolnik et al., 2009) a klasickou metodou PCR. Pro každou reakci bylo použito 12,5µl HotStarTaq Master Mix (Qiagen, Carlsbad, CA, USA), 1,0 µl každýho primeru a 4 µl templátu DNA. PCR začínala denaturací při 96°C/5 min, 40 cyklů spočívajících z annealingu při 60°C/30 s, denaturace při 94°C/20 s a extenze při 68-72°C/90 s a ze závěrečné extenze při 68- 72oC/10 min. Diagnostika DNA z oocyst holubů byla provedena s využitím univerzálních primerů amplifikujících gen pro SSU1 rRNA (forward primer 5'AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3'; reverse primer 5'-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3') (Mortison et al., 2004) a pro CO1 (forward primer Cocci CO1 5'-GGTTCAGGTGTTGGTTGGAC3'; reverse primer Cocci CO1 5'-AATCCAATAACCGCACCAAG-3') (Ogedengbe et al., 2011).

Výsledky Experiment prokázal možný vzájemný přenos studovaných druhů eimerií mezi použitými druhy holubů, resp. z C. livia na C. palumbus. Experimentální infekce C. palumbus je v době odeslání příspěvku v průběhu. Vysporulované oocysty izolátu z volně žijící populace C. palumbus se zřetelně liší od jiných u nás popsaných druhu holubích eimerií velikostí, charakterem stěny oocysty, tvarem sporocyst i charakterem komplexu Stiedova a substiedálního tělíska. Morfometrické analýzy oocyst tak potvrdily opodstatnění popisu izolátu z C. palumbus jako nového druhu (publikace v přípravě). Endogenního vývoj probíhá v jejunu, kde byla zaznamenána gametogonie, merogonii se zaznamenat nepodařilo. Prepatentní doba u tohoto nového druhu je 5-6 dní (u C. livia). Druhý izolát eimérií z volně žijící populace holubů C. livia byl determinován jako Eimeria columbae s prepatentní periodou 7-8 dní. Endogenní vývoj probíhal v celém tenkém střevě, i zde se podařilo zaznamenat jen gametogonii. Zaměřili jsme se na dva geny CO1 a SSU, jejichž sekvence poslouží při fylogenetické analýze. K posouzení skutečné diverzity ve všech vzorcích bude třeba dosekvenovat ještě řadu izolátů. Závěr V minulém roce byl naším týmem v populaci divokých holubů C. palumbus v ČR i SR objeven dosud nepopsaný druh r. Eimeria. Studium hostitelské specifity tohoto druhu kokcidiíe v nově vznikající situaci úzkého kontaktu expanzivního druhu C. palumbus a holuba domácího C. livia

15

pomůže porozumět fenoménu hostitelské specifity kokcidií. Popis životního cyklu, endogenního vývoje a patogenity je nezbytný ke kvalitnímu popisu tohoto „nového“ patogena.

Seznam literatury 1) ALYOUSIF, S. M., AL-SHAWAY.R. & S.S. AL-ASIRI. Eimeria livialis sp. n. (Apicomplexa: Eimeriidae) from the domestic pigeon, Columba livia domestica in Saudi Arabia. J. Egypt. Soc. Parasitol., 2009. 39 (2): 383 – 388. 2) LEVINE, N. D. Taxonomy of the sporozoa. J. Parasitol., 1970 56: 208209 3) LEVINE, N. D. Progress in taxonomy of the Apicomplexan protozoa. J. Protozool., 1988. 35: 518520. 4) DOLNIK, O. V., PALINAUSKAS V. & S. BENSCH. Individual oocyst of Isospora (Apicomplexa: Coccidia) parasites from avian feces: From photo to sequence. J. Parasitol., 2009. 95(1): 169 – 174. 5) DUSZYNSKI, D. W., UPTON, S. J., & L. COUCH. The Coccidia of Columbiformes (doves, pigeons, sandgrouse). http://biology.unm.edu/biology/coccidia/columb.html, Verzia 24.2. 1999. 6) MORRISON, D. A., BORNSTEIN, S., THEBO, P., WERNERY, U., KINNE, J. & J. G. MATTSSON. The current status of the small subunit rRNA phylogeny of the coccidian (Sporozoa). Int. J. Parasitol., 2004. 34: 501514. 7) OGEDENGBE, J. D., HANNER R. H. & J. R. BARTA. 2011. DNA barcoding indifies Eimeria species and contributes to the phylogenetics of coccidian parasites (Eimeriorina, Apicomplexa, Alveolata). Int. J. Parasitol., 2011. 41(8): 843850. 8) PELLÉRDY, L. P. Coccidia and Coccidiosis. Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg. 1974. 959 pp.

16

Surveillance Q horečky v chovech skotu a malých přežvýkavců na území České republiky Petra Charvátová, Dagmar Zendulková, Kateřina Rosenbergová, Jana Pospíchalová Ústav infekčních chorob a mikrobiologie, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Q horečka je významná zoonóza způsobená obligátně intracelulární bakterií Coxiella burnetii (C. burnetii). Hostitelské spektrum zahrnuje různé druhy savců (včetně člověka), ptáků i členovců. U zvířat probíhá onemocnění velmi často asymptomaticky, nejčastějšími příznaky jsou aborty, porody mrtvých nebo málo životných mláďat, případně metritidy (Angelakis and Raoult, 2010). U člověka se akutní infekce projevuje nejčastěji jako atypická pneumonie nebo hepatitida, chronický průběh jako závažná endokarditida. V těhotenství může onemocnění vést k abortu nebo předčasnému porodu (Angelakis and Raoult, 2010, Parker et al., 2006). Nejčastějším zdrojem infekce pro člověka jsou domácí přežvýkavci, kteří bakterii vylučují močí, trusem, mlékem a především tkáněmi a sekrety vyloučenými při porodu či abortu. Nejdůležitější cestou infekce je inhalace kontaminovaných aerosolů. Méně popisovaný zdroj infekce představuje kontaminované mléko (Jäger and Willems, 2004). Studiu výskytu Q horečky na našem území (Literák, 1994) ani v dalších zemích (EFSA, 2010) nebyla v minulosti věnována příliš velká pozornost, úroveň promoření tedy není příliš známa. Obrat nastal v roce 2007, kdy Nizozemí zasáhla dosud nejrozsáhlejší epidemie Q horečky v lidské populaci (2007-2009 – více než 3500 klinických případů) (Roest et al., 2011). Tato situace byla podnětem k vypracování vědeckého stanoviska (EFSA, 2010) a k monitoringu Q horečky u domácích přežvýkavců ve všech členských státech EU. Materiál a metodika Bylo vyšetřeno celkem 473 vzorků krevních sér různých druhů domácích i oborově chovaných přežvýkavců - konkrétně ovce domácí (Ovis aries) – 66 vzorků z jednoho chovu, muflon (Ovis orientalis musimon) – 112 vzorků ze 4 chovů, koza bezoárová (Capra aegagrus aegagrus) – 87 vzorků, opakované odběry v jednom chovu a skot (Bos taurus) – 208 vzorků z chovu s reprodukčními problémy. Od vyšetřovaného skotu byly získány také vzorky mléka a dvě placenty odebrané po abortu. Všechny vzorky byly až do vlastního vyšetření skladovány při teplotě -18°C. Krevní séra byla vyšetřena dle návodu výrobce nepřímou ELISA metodou (ID Screen Q fever Indirect Multi-species, ID Vet, Francie) detekující specifické protilátky proti antigenní fázi I a II C. burnetii. K vyhodnocení výsledků byl použit ELISA reader TECAN (Great Britain).

17

Metodou real-time PCR bylo vyšetřeno celkem 46 vzorků mléka sérologicky pozitivních zvířat (skot) a obě placenty. Ze vzorků byla izolována DNA pomocí komerční soupravy NucleoSpin Tissue (Macherey-Nagel, Germany) dle návodu od výrobce. Přítomnost patogena ve vzorcích byla provedena pomocí metody real-time PCR založené na detekci sekvence genu citrate synthase (g1tA). Pro amplifikační reakci byla využita komerční souprava qPCR 2x Master Mix (TopBio,ČR). Real-time PCR reakce byla provedena v termocykléru Rotor-Gene RG - 3000 (Corbett Research, Australia). Použité sekvence primerů pro real-time PCR jsou uvedeny v tabulce č. 1. Tab. č. 1: Sekvence primerů pro detekci C. burnetti pomocí real-time PCR Název

Cílové sekvence primerů

Cox. burn., Sn primeru Cox. burn.,/ sondy Asn

5' CGA TTA ATA GCC AAA ATG CCC A3'

Cox. burn., sonda

5' [FAM] ACC GTT TAT GCA CCC TCG CCG [Tamra]3'

5' GGG TCA GGT TCT GTC TCT TCG TAA 3'

Velikost cílové sekvence 152 bp

Výsledky Sérologické vyšetření nepřímou ELISA metodou Všechny vzorky odebrané od ovce domácí a mufloní zvěře byly sérologicky negativní. U kozy bezoárové měl jeden vzorek dubiózní hodnotu, ostatní byly negativní. Z krevních sér skotu (celkem 208) vykazovalo 48 vzorků pozitivní a 14 dubiózní hodnotu. Průkaz původce metodou real-time PCR Ze 46 vyšetřených vzorků mléka sérologicky pozitivních krav byla u 5 vzorků prokázána přítomnost specifické sekvence DNA bakterie C. burnetii. Pozitivní byly také obě placenty. Závěr K průkazu specifických protilátek proti C. burnetii v krevním séru jsme zvolili nepřímou ELISA metodu, která podle zahraničních referencí vykazuje vysokou senzitivitu a specificitu (Kittelberger et al., 2009; Rousset et al., 2007) a je doporučována OIE (OIE, 2010). Jak je známo z odborné literatury, ne všechna séropozitivní zvířata C. burnetii vylučují a někteří vylučovatelé mohou zůstávat séronegativní (Berri et al., 2002, Rousset et al., 2007). Nicméně pro screening Q horečky je ELISA nejvhodnější metodou. V testovaném souboru zvířat jsme v krevním séru prokázali pozitivní hladiny specifických protilátek proti C. burnetii ve 48 vzorcích skotu a dubiózní hodnotu u 14 vzorků skotu a 1 vzorku kozy bezoárové.

18

U séropozitivních jedinců je doporučováno doplnit diagnostiku o průkaz původce metodou PCR (Rodolakis, 2006). C. burnetii byla prokázána v 5 vzorcích mléka skotu (ze 46 vyšetřených) a v obou placentách odebraných od abortujících krav. Námi dosažené výsledky dokládají prozatím ojedinělý výskyt Q horečky u skotu na území České republiky, nicméně vyjadřují potřebu pokračovat v dalších studiích. Seznam literatury 1) ANGELAKIS, E. AND RAOULT, D.: Q fever. Vet Microbiol, 140, 2010, 297-309 2) BERRI, M., SOURIAU, A., CROSBY, M., RODOLAKIS, A.: Shedding of Coxiella burnetii in ewes in two pregnancies following an episode of Coxiella burnetii abortion in a sheep flock. Vet Microbiol, 85, 2002, 55-60 3) EFSA Panel on Animal Health and Welfare (AHAW); Scientific Opinion on Q fever. EFSA Journal 2010; 8(5):1595. [114 pp.] 4) JÄGER, C. AND WILLEMS, H.: Coxiella burnetii. In: Encyclopedia of Diary Sciences, 2004, pp. 539 5) KITTELBERGER, R., MARS, J., WIBBERLEY, G., STING, R., HENNIG, K., HORNER, G.W., GARNETT, K.M., HANNAH, M.J., JENNER, J.A., PIGGOT, C.J., O’KEEFE, J.S.: Comparison of the Q fever complement fixation test and two commercial enzyme-linked immunosorbent assays for the detection of serum antibodies against Coxiella burnetii (Q fever) in ruminants: Recommandations for use of serological tests on imported animals in New Zealand. NZ Vet J, 57, 2009, 262-268 6) LITERÁK, I.: Coxiella burnetii antibodies in calves concentrated in a large-capacity calf house in an area with endemic incidence of Q fever. Acta Vet Brno, 63, 1994, 65-69 7) http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.12_Q-FEVER.pdf (accessed Aug 03, 2011) 8) PARKER, N.R., BARRALET, J.H., BELL, A.M.: Q fever. Lancet, 367, 2006, 679-688 9) RODOLAKIS, A.: Q fever, state of art: Epidemiology, diagnosis and prophylaxis. Small Ruminant Research, 62, 2006, 121-124 10) ROEST, H.I.J., TILBURG, J.J.H.C., VAN DER HOEK, V., VELLEMA, P., VAN ZIJDERVELD, F. G., KLAASSEN, C.H.W., RAOULT, D.: The Q fever epidemic in The Netherlands: history, onset, response and reflection. Epidemiol Infect 139, 2011, 1-12 11) ROUSSET, E., DURAND, B., BERRI, M., DUFOUR, P., PRIGENT, M., RUSSO, P., DELCROIX, T., TOURATIER, A., RODOLAKIS, A., AUBERT, M. F.: Comparative diagnostic potential of three serological tests for abortive Q fever in goat herds. Vet Microbiol, 124, 2007, 286-297.

19

Exprese rekombinantního glykoproteinu D herpesviru psů 1 v buňkách kvasinek Markéta Vaňková, Vladimír Celer Ústav infekčních chorob a mikrobiologie, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Herpesvirus psů 1 (CHV-1) je patogenem psovitých šelem, jehož typickou vlastností je schopnost navodit latentní infekci. Infekce CHV1 se spolupodílí na vzniku „psincového kašle“, u dospělých zvířat však často probíhá jako inaparentní onemocnění horních cest dýchacích, případně pohlavního aparátu a očí. Komplikace nastávají při transplacentární infekci či nakažení novorozených štěňat, kdy dochází k potratům, porodům mrtvých štěňat či se infekce projevuje jako generalizované hemorrhagické onemocnění končící smrtí štěněte a velmi často ztrátou celého vrhu (Carmichael, 1970). Pro specifickou profylaxi onemocnění je v Evropě dostupná vakcína určená pro prevenci reprodukčních problémů březích fen, specifická terapie neexistuje. Vzhledem k nedostupnosti dostatečně specifických a citlivých sérologických testů není prevalence herpesvirového onemocnění v České republice známa, i když na základě vyšetření omezeného souboru diagnostických vzorků lze usuzovat na značné rozšíření tohoto onemocnění (Sedlák, 2007). Výsledky sérologických depistáží v jiných zemích poskytují široké rozpětí hodnot prevalence v závislosti na konkrétní zemi a použitém diagnostickém testu. V případě glykoproteinu D, který představuje jednu z perspektivních virových struktur pro případné diagnostické nebo vakcinační využití, exprese v eukaryotických buňkách sice již byla uskutečněna, rekombinantní protein však nebyl nijak využit (Tohya and Mikami 1997; Xuan et al 1997). Cílem naší práce bylo vyvinout rekombinantní glykoprotein D a použít jej jako antigen pro imunoenzymatický test a jeho prostřednictvím získat přesnější údaje o prevalenci onemocnění v ČR a získat nástroj pro studium patogeneze herpesvirové infekce u psů. Materiál a metodika Příprava expresního vektoru Pro snadné klonování genů do buněk kvasinek jsme adaptovali komerčně dostupné plazmidové vektory pPICZ (Invitrogen), který jsme modifikovali inzercí sekvence umožňující transpozici lambda fága tak, aby výsledný vektor byl kompatibilní s expresním systémem Gateway.

20

Plazmid pPICZ byl štěpen restrikční endonukleázou Pml I, defosforylován a následně elektroforeticky purifikován v agarózovém gelu. Do purifikovaného vektoru byla následně vligována genová kazeta obsahující transpoziční sekvence lambda fága (attR1 a attR2), gen kódující rezistenci k chloramfenikolu a gen ccdB. Konstruktem byly následně transformovány E. coli buňky, kmen „ccdB Survival“ (Invitrogen) vykazující rezistenci k účinkům ccdB genu. Získané transformanty byly testovány na přítomnost funkční kazety ve správné orientaci, vhodný klon byl označen jako pPICZ-GW a použit v dalších fázích řešení projektu. Příprava genového fragmentu gD Extrakce virové DNA byla provedena komerčně dostupným kitem NucleoSpin Tissue, Genomic DNA from Tissue (Macherey-Nagel GmbH, Německo) ze 100 μl supernatantu buněčné kultury. Gen kódující glykoprotein D byl amplifikován metodou PCR, za použití primerů navrhnutých dle dostupných sekvencí genomu CHV-1 pomocí programu Vector NTI: gDnesec1F: GAAACGATGGGATATAAATGGGTAGACCCTC, gDnesec1R: TGGGGTATTATTTATTGGTGTTGGGGTAGT Amplifikovaný fragment gD byla elektroforeticky rozdělen v 1% agarózovém gelu a extrahován kitem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Klonování a exprese Amplifikovaný fragment genu byl klonován do expresního vektoru pCR8 (Invitrogen), vzniklou rekombinantní konstrukcí byly transformovány buňky E.coli, kmen TOP10. Buňky byly po transformaci vysety na agar se spectinomycinem a inkubovány 24 hodin při 37ºC. Narostlé kolonie byly poté testovány na přítomnost a správnou orientaci rekombinantního konstruktu. Bakterie obsahující ověřený klon byly pomnoženy v LB mediu se spectinomycinem a rekombinantní plazmid pak byl extrahován kitem QIAGEN Plasmid Mini Kit dle pokynů výrobce. Následně byla provedena transpozice gD fragmentu mezi pCR8 vektorem a recipientním destinačním vektorem pPICZ-GW. Výsledný rekombinantní konstrukt byl linearizován restrikční endonukleázou Sac I a použit pro transformaci kvasinkových buněk P. pastoris kmenů X-33 a KM71H. Buňky kvasinek byly po transformaci vysety na agar s přídavkem zeocinu a inkubovány při 30 ºC 2-3dny. Narostlé kolonie byly kontrolovány na přítomnost genu pro gD a několik pozitivních kolonií bylo testováno na schopnost exprimovat rekombinantní gD po indukci 0,5 % metanolem. Indukce probíhala 8 dní při

21

30 ºC za intenzivní aerace a rozdílných kultivačních podmínek v závislosti na příslušném kmenu kvasinek. Každý den byl odebrán vzorek kvasinkové suspenze a doplněn metanol na odpovídající koncentraci. Produkce proteinu byla detekována v odebraných vzorcích metodou SDS-PAGE. Výsledky Výsledkem přípravy expresního vektoru bylo získání celkem čtyř transformantů. Pouze dva z nich však obsahovaly ccdB genovou kazetu ve správné orientaci. Jeden z těchto klonů byl použit pro následné genové manipulace. Amplifikací získané virové DNA pomocí CHV-1 specifických primerů jsme získali fragment molekuly DNA kódující gD o velikosti 877 bp, který byl klonován do vektoru pPICZ-GW. Vzniklým konstruktem (pPICZ-gD) byly transformovány buňky Pichia pastoris (kmeny X-33 a KM71H), a přítomnost gD fragmentu byla ověřena sekvenováním. Indukce a následná analýza na SDS-PAGE gelu prokázala u jednoho z klonů kmen KM71H expresi proteinu o velikosti 37 kDa. Závěr V našich experimentech jsme vyvinuli plazmidový vektor umožňující klonování cizorodých genů do buněk P.pastoris systémem Gateway a využili jej pro klonování genu pro glykoprotein D viru CHV-1. Připraveným konstruktem (pPICZ-gD) byly transformovány buňky P. pastoris a po indukci metanolem byla pozorována produkce proteinu o odpovídající velikosti. Lze předpokládat, že díky glykosylaci uskutečňované kvasinkovými buňkami bude získaný rekombinantní glykoprotein D antigenně podobný nativnímu glykoproteinu D CHV-1 a bude tudíž dostatečně citlivě a specificky detekovat gD specifické protilátky v psích sérech. Seznam literatury 1) CARMICHAEL, L. E. Herpesvirus canis: aspects of pathogenesis and immune response. Journal of the American Veterinary Medical Association, 1970, vol. 156, no. 12, p. 1714–1721. 2) SEDLÁK, K. Výskyt protilátek proti herpesviru (CHV-1) u psů v České republice. Veterinářství, 2007, roč. 57, s. 416-417. 3) TOHYA, Y. AND MIKAMI, T. Characterization of canine herpesvirus glycoprotein D (Hemagglutinin). Journal of Veterinary Medical Science, 1997, vol. 59, no. 11, p. 1003-1009. 4) XUAN, X., KOJIMA, A., MURATA, T., MIKAMI, T. AND OTSUKA, H. Analysis of canine herpesvirus gB, gC and gD expressed by a recombinant vaccinia virus. Archives of Virology, 1997, vol. 142, no. 5, p. 1003-1010.

22

Sledování hladin pohlavních hormonů z trusu u rozdílných věkových kategorií druhu Nomascus leucogenys, Nomascus siki a Nomascus gabriellae spojených se změnou barvy srsti Michaela Korytárová1, Petra Bolechová2, Jana Petrášová1 Ústav fyziologie, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno1, Zoo Liberec, Masarykova 1347/31, 460 01 Liberec2 Úvod Primáti rodu Nomascus patří do čeledi Hylobatidae, která je nejméně studovanou skupinou primátů, a tak existuje jen omezené množství základních informací o fyziologii reprodukce. Monogamně žijící dospělí jedinci rodu Nomascus se liší výrazným pohlavním dimorfismem, který se projeví až při dosažení sexuální dospělosti. Ovariální cyklus byl stanoven na základě dat o říji, době a způsobu páření, avšak jen některé jej stanovily na základě hormonálních změn v moči nebo trusu (Lukas et al., 2002; Geissmann and Anzenberger, 2009). Většina analýz však byla provedena jen na jednom jedinci. Data o počátku ovariálního cyklu, tedy zda pohlavní dospívaní koreluje se změnou barvy srsti, však chybí. Použití neinvazivních metod pro sledování hladin hormonů je důležité, protože všechny druhy čeledi Hylobatidae jsou kriticky ohrožené druhy. Pro účely tohoto projektu byla zavedena a biologicky validována metoda EIA stanovující metabolity progesteronu z trusu primátů rodu Nomascus. Metodika Do projektu byly zahrnuty juvenilní jedinci do 2 let stáří, samice ve věku 4 let (odpozorovaná doba přebarvování srsti) a dospělí samci a samice s pravidelným ovariálním cyklem (věk 9-27 let). Vzorkování jedinců probíhalo zejména v zoologických zahradách ČR a SR, a to u poddruhů Nomascus gabriellae a Nomascus leucogenys, ale také v zahraničních zoologických zahradách ve Francii, Nizozemsku, Slovinsku, Polsku a Španělsku (všechny 3 poddruhy). Z důvodu nefunkčnosti transportního boxu (deklarováno výrobcem Laminar Systems, CZ) byl transport vzorků ze zahraničních zoologických zahrad odložen a z tohoto důvodu vzorky nebyly zařazeny do analýz. Čerstvý vzorek trusu, nejdéle 2 hodiny po defekaci, byl zamražen na -20 ºC až do doby transportu a dalšího zpracování. Odběr vzorku byl jednou týdně od každého sledovaného jedince. Délka odběru se u samic pohybovala v rozmezí 5 až 8,5 měsíců a 1-2 měsíce u samců a mláďat. Vzorky od 4 jedinců byly paralelně zpracovány na VFU Brno a v Deutsches Primatenzentrum v Göttingenu, Německo. Z důvodů těžce detekovatelných hladin metabolitů estrogenu a testosteronu v trusu u

23

lidoopů (Heistermann et al., 2010), a také ve vzorcích analyzovaných v Německu, byly u všech vzorků trusu analyzovány jen metabolity progesteronu. Vzorky trusu o hmotnosti 0,5 g byly zafixovány v 5 ml 80% metanolu. Po odstředění (30 min) byla supernatantová frakce ředěna v poměru 1:10 v solném pufru. Mikrotitrační destičky byly pokryty progesteron-polyklonální protilátkou (CL425, C. Munro, University of California, USA) v ředění 1:1 600. V rámci kompetitivní enzymové imunoreakce byl použit konjugovaný progesteron s HRS (horseradish peroxidase) v ředění 1:1 600 000 a byla také sledována zkřížená reaktivita progesteronových protilátek. Ředění standardu progesteronu bylo v rozmezí 2,3-5000 pg/jamka. Všechna stanovení hormonů byla prováděna duplicitně pro výpočet koeficientu variability. Výsledky byly propočteny na steroidní metabolity progesteronu v ng/g vlhkého trusu. Délka ovariálního cyklu byla definována jako počet dní od první zvýšené hodnoty metabolitu progesteronu až po další první zvýšené hodnoty metabolitu progesteronu následujícího cyklu. Pro statistické vyhodnocení hladin metabolitů progesteronu s ohledem na pohlaví a reprodukční fázi byl použit neparametrický Mann-Whitney test. Stanovení pohlaví u mláďat (černě zabarvených) bylo provedeno pomocí PCR. Fenolchloroformovou extrakcí byla z trusu získána DNA. Pozitivní kontrolou, tj. DNA samčího a samičího pohlaví, byla DNA z dospělých jedinců v plné reprodukci. Pro determinaci byla provedena PCR s kombinací dvou setů primerů, a to Sry a Zfy-Zfx a podmínek podle Bryja and Konečný (2003). Výsledek byl odečten pomocí gelové elektroforézy. Ze samčí DNA vznikly dva produkty o velikosti 150 bp a 450 bp a samičí jeden produkt o velikosti 450 bp. Výsledky V rámci projektu bylo analyzováno 353 ks vzorků trusu od 14 jedinců rodu Nomascus gabriellae (3 samci, 8 samic a 3 mláďata) a 10 jedinců Nomascus leucogenys (5 samců a 5 samic). Pomocí PCR byla určena 2 mláďata jako samci a 1 jako samice a zařazena do příslušných skupin. Délka ovariálního cyklu (OC) samic rodu Nomascus gabriellae byla 24,7±4,8 dní, s průměrně nejnižšími hladinami metabolitů progesteronu 104,02 ng/g trusu a

24

nejvyššími hladinami 327,28 ng/g trusu v rámci ovariálního cyklu. U dvou samic bylo zachyceno také část období gestace, kdy hladiny metabolitů progesteronu byly v rozmezí 1414,3 – 3516,7 ng/g trusu u jedné samice a 1511,92 – 2887,42 ng/g trusu samice druhé. Délka OC samic rodu Nomascus leucogenys byla 25,1±4,5 dní, s průměrně nejnižšími hladinami 51,54 ng/g trusu a nejvyššími hladinami 349,1 ng/g trusu v rámci OC. Dvě samice (z každého druhu jedna) s pravidelným OC ve věku 4 a 5 let v čase vzorkování přebarvovaly. U černě zabarvené samice rodu Nomascus leucogenys ve věku 3,5 let byl pravidelný OC také potvrzen. Průměrné hladiny metabolitů progesteronu samců byly 131,2 ng/g (Nomascus gabriellae) a 122,8 ng/g (Nomascus leucogenys). Průměrné hodnoty byly vyneseny do grafu (Graf 1). Srovnání rozdílů hladin metabolitů progesteronu samců s nejvyššími hladinami v rámci OC samic bylo statisticky významné (Z=-2,73388; p=0,006260) a samců s nejnižšími hladinami v čase OC samic statisticky nevýznamné (Z=0,594322; p=0,552297). Z důvodu nedostatečného množství vzorků od gravidních samic nebylo možné testovat rozdíl mezi hladinami v čase ovariálního cyklu a gestace, ale hodnoty v období gravidity byly u jedné samice o 200 % a u druhé o 150 % vyšší než v píku jejich ovariálního cyklu. Senzitivita analýzy byla 2,3 pg/jamka pro progesteron a koeficienty variability byly intra-assay <10 % a inter-assay <14 %. Závěr Úspěšně zavedena a biologicky validovaná EIA analýza pro stanovení metabolitů progesteronu z trusu primátů rodu Nomascus ukázala, že délka ovariálního cyklu u obou podruhů koreluje s dostupnou literaturou. Z důvodu nedostatečného počtu zvířat ve fáze přebarvování a těsně před ním, nebylo možné objektivně posoudit korelaci nástupu ovariálního cyklu a změnu barvy srsti. Seznam literatury 1) BRYJA, J., KONEČNÝ, A. Fast sex identification in wild mammals using PCR amplification the Sry gene. Folia Zoologica, 2003, vol. 52, s. 269-274. 2) GEISSMANN, T., ANZENBERGER, G. Hormonal correlates of the ovarian cycle in the yellow-cheeked gibbon (Nomascus gabriellae), and a review of ovarian cycles in gibbons (Hylobatidae). Gibbon Journal, 2009, vol. 5, s. 61–70. 3) HEISTERMANN, M. Non-invasive monitoring of endocrine status in laboratory primates: methods, guidelines and applications. Advances in Science and Research, 2010, vol. 5, s. 1-9. 4) LUKAS, K.E., BARKAUSKAS, R.T., MAHER, S.A., JACOBS, B.A., BAUMAN, J.E., ANDERSON, A.J., CALCAGNO, J.M. Longitudinal study of delayed reproductive sukces in a pair of white-cheeked gibbon (Hylobates leucogenys). ZOO Biology, 2002, vol. 21, s. 413-434.

25

Hodnocení hemokultivace a koagulopatií u novorozených hříbat Taťana Hytychová, Barbora Bezděková Klinika chorob koní, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Úvod Nejčastější příčinou úmrtí novorozených hříbat bývá bakteriální sepse. Identifikace patogena je možná hemokultivačním vyšetřením. Výsledky studie Russela a kol. (2008) a Marshe a kol. (2001) naznačují trend zvyšování G+ bakterií izolovaných z kriticky nemocných novorozených hříbat a také tendenci ke zvyšování antimikrobiální rezistence a celkově nízkou citlivost izolátů. Komponentou zánětlivé odpovědi je koagulační kaskáda, proto systémové koagulopatie mohou být významnou komplikací bakteriémie a sepse. U pacientů se systémovým onemocněním je alterace koagulace spojena se zvýšením mortality a morbidity (Dallap a Epstein 2009). Cílem naší práce bylo zhodnotit výsledky hemokultivace u hospitalizovaných novorozených hříbat a zjistit případné korelace koagulopatií a bakteriémie. Materiál a metodika Do naší studie bylo zařazeno 20 hříbat ve věku 0 až 42 dní, která byla hospitalizována na Klinice chorob koní od března do srpna 2011. U všech hříbat bylo provedeno klinické vyšetření dle standardizovaného protokolu a bylo určeno septické skóre. U 20 hříbat byl proveden sterilní odběr 2 vzorků krve do speciálních zkumavek s kultivačním mediem (aerobní a anaerobní) z vena jugularis nebo vena cephalica pro hemokultivační vyšetření. Celkem bylo odebráno 41 takovýchto vzorků a ty byly odeslány k vyšetření na specializované pracoviště. Dle dostupnosti laboratoře v době přijetí k hospitalizaci bylo u většiny hříbat provedeno hemostazeologické vyšetření. Vyšetření krve a další klinická a paraklinická vyšetření byla prováděna opakovaně dle diagnózy a stavu pacienta. Výsledky Šest koní z 20, u nichž byla provedena hemokultivace, mělo pozitivní nález. Přehled vykultivovaných patogenů a jejich citlivost uvedena v tabulce 1. Výsledky hemostazeologických vyšetření jsou shrnuty v tabulce 2. Při vyhodnocování septického skóre dle standardizovaného protokolu mělo 9 koní ≥11, což znamená 90% pravděpodobnost, že jedinec má sepsi. U jednoho hříběte chyběly kompletní informace pro zhodnocení septického skóre, ale dle dostupných informací a klinického vyšetření byla též vysoká pravděpodobnost sepse. Osm hříbat z 20 uhynulo

26

nebo muselo být utraceno pro nepříznivou prognózu. Septické skóre, výsledky hemokultivace, diagnóza a přežitelnost jednotlivých hříbat v tabulce 3.

Tabulka 1: Přehled pozitivních hemokultivačních vyšetření (6/20).

hříbě 6

patogen

kultivace

Bacillus circulans

aerobní

citlivost ampicilin/amoxicilin, chloramfenikol, doxycyklin, kotrimoxazol, ofloxacin

rezistence cephalexin

diagnoza klinicky bez obtíží

amox./klav., ampicilin/amox., hříbě 9

Moraxella lacunata

aerobní

chloramphenikol, doxycyklin, kotrimoxazol, cefuroxim, ofloxacin,

cephalexin

sepse

framykoin, gentamicin amox./klav., doxycyklin, kotimoxazol, ampicilin/ Proteus vulgaris

anaerobní

hříbě 14 Clostridium perfringens hříbě 18 hříbě 19

Enteroccocus casseliflavus/gallin Streptococcus beta-hemol. sk. C

Escherichia coli

anaerobní aerobní aerobní

anaerobní

hříbě 20 Staphylococcus xylosus

aerobní

cefotaxim, ceftazidim, ciprofloxacin,

amoxicilin,

gentamicin, amikacin, meropenem,

cefalotin,

imipenem

kolistin

penicilin, clindamycin, metronidazol

sepse

X

penicilin, amox./klav., doxyciklin,

cefuroxim,

Idiopatická

gentamicin

amikacin

hematúrie

penicilin, erytromycin, cefuroxim, clindamycin

X

amox./klav., doxycyklin, cefuroxim,

ampicilin/

cefotaxim, ceftazidim, ciprofloxacin,

amoxicilin,

kolistin, gentamycin, amikacin,

kotrimoxazol,

meropenem, imipenem

cefalotin

septická artritida

amox./klav., oxacilin, erytromycin,

septická

chloramfenikol, doxyciklin,

artritida

kotrimoxazol, cefaclor, cefuroxim, vankomycin, rifampicin, teicoplanin,

X

linezolid/zyvoxid, clindamycin, gentamicin

27

Tabulka 2: Výsledky hemostazeologických vyšetření (17/20). TT (s) fibrinogen (g/l) PTT (s)

APTT (s) diagnóza inguinální kýla

hříbě 1

49

2,81

19,9

52,1

hříbě 2

71,5

3,63

21

45

dysurie

hříbě 3

10,6

4,74

18,8

14

septikémie

hříbě 4

8,4

3,34

19

41,6

urachus patens

hříbě 5

8

1,92

22,9

55,1

kontraktura karpu

hříbě 6

9,2

2,5

21

50

klinicky bez obtíží

hříbě 7

75

4,66

15,3

53,3

hříbě 8

96,1

6,29

19,7

72,5

hříbě 10

73

4,08

23,6

85,3

prematurita, sepse

hříbě 11

63

2,24

22,5

51,2

prenatální asfyxiční syndrom

hříbě 13

75,8

2,81

23,3

55,1

kolika

fibrinogen (g/l)

PTT (s)

TT (s hříbě 14

4,2

3,63

21,8

hříbě 15

7,9

4,26

hříbě 16

8,9

2,54

hříbě 17 hříbě 18

6,1

1,93

x

hříbě 19

79,9

APTT(s)

selhání pasivního transferu protilátek aspirační pneumonie, kachexie, hepatopatie

diagnóza

42,6

sepse

38,6

134

sepse

17,1

50,2

prematurita, ruptura střeva

19,3

49,5

4,66

73

149,6

klinicky bez obtíží idiopatická hematúrie

6,02

21,8

69

septická artritida

28

Tabulka 3: Septické skóre, výsledky hemokultivace, diagnóza a přežitelnost jednotlivých hříbat hříbě septické skóre

hemokultivace

diagnóza

přežitelnost

1

0

negativní

inguinální kýla

přežilo

2

4

negativní

dysúrie

přežilo

3

14

vzorek znehodnocen v laboratoři

septikémie

nepřežilo

4

4

negativní

urachus patens

přežilo

5

(9) chybí data

negativní

kontraktura karpu

nepřežilo

6

6

1. Bacillus circulans / 2. negativní klinicky bez obtíží

přežilo

7

8

negativní

přežilo

8

12

negativní

selhání pasivního transferu Ig aspirační pneumonie, kachexie, hepatopatie

(10) chybí data Moraxella lacunata

9

přežilo

sepse

nepřežilo

10

18

negativní

prematurita, sepse

nepřežilo

11

6

negativní

prenatální asfyxiční syndrom

přežilo

sepse

nepřežilo

kolika

přežilo

sepse

přežilo

12

(19) chybí data negativní negativní

13

5

14

12

15

14

negativní

sepse

přežilo

16

14

negativní

prematurita, ruptura střeva

nepřežilo

17

6

negativní

klinicky bez obtíží

přežilo

18

8

Enteroccocus casseliflavus/gallin

idiopatická hematúrie

přežilo

septická artritida

nepřežilo

septická artritida

nepřežilo

Proteus vulgaris, Clostridium perfringens

19

(14) chybí data Streptococcus beta-haemol. sk. C

20

(11) chybí data

Escherichia coli, Staphylococcus xylosus

Seznam literatury 1) DALLAP, B. L.; EPSTEIN K. Coagulopathy of the critically ill equine patient. J Vet Emerg Crit Care, 2009, 19 (1), p. 53-56. 2) MARSH, P. S.; PALMER, J. E. Bacterial isolates from blood and their susceptibility patterns in critically ill foals. J Am Vet Med Assoc, 2001, 218, p. 1608-1610. 3) RUSSELL, C. M.; AXON, J. E.; BLISHEN, A.; BEGG, A. P. Blood culture isolates and antimicrobial sensitivities from 427 critically ill neonatal foals. Aust Vet J, 2008, 86, p. 266-271.

29

Zavedení zátěžového testu u koní s využitím vysokorychlostního trenažéru Pavlína Melková, Olga Dobešová, Petr Jahn, Jaroslav Hanák Klinika chorob koní, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Příčiny zátěžové intolerance u koní mohou být různé. Nejčastěji se jedná o onemocnění respiračního, kardiovaskulárního nebo muskuloskeletálního aparátu (1, 3). V některých případech příčinu snížené výkonnosti nelze odhalit při běžném vyšetření v klidu, protože problém se manifestuje pouze při zátěži střední až vysoké intenzity (1, 2). Pro stanovení diagnózy je proto nutné vyšetření při zátěži. Zátěžové testy je možné provádět v terénních podmínkách, které napodobují běžnou zátěž koně. V současné době se upřednostňují zátěžové testy na vysokorychlostním trenažéru, které umožňují zajistit standardní podmínky vyšetřování (rychlost, teplota, sklon trenažéru) a významně usnadňují sledování vybraných parametrů a provádění odběrů vzorků během zátěže (2, 3). Materiál a metodika Vyšetřeno bylo celkem sedm koní. Před vlastním zátěžovým testem byli koně navykáni na pohyb na trenažéru, standardně bylo provedeno hematologické a biochemické vyšetření a také klidové elektrokardiografické vyšetření. Vlastní zátěžový test byl vybrán podle typu koně (plnokrevníci, teplokrevníci) a sestával z předehřátí koně (10 min krok, klus), po kterém následovala vlastní stupňovaná zátěž (viz tab. 1). Poté byl koni zaveden flexibilní endoskop a bylo pokračováno v zátěži až do únavy koně. V průběhu celého testu bylo snímáno ekg a během posledních 10 s každého stupně ergometrické zátěže byly odebírány vzorky krve na stanovení hladiny laktátu. Po 4 hodinách od ukončení zátěže byly odebírány vzorky krve na stanovení aktivity svalových enzymů (AST, CK). Tabulka č. 1: Zátěžové testy Plnokrevníci Warm-up Vlastní zátěžový test

5 min krok 5 min klus Step 1 cval 7 m/s 6% náklon Step 2 cval 8 m/s 6% náklon Step 3 cval 9 m/s 6% náklon Zátěžová endoskopie

Teplokrevníci 5 min krok 5 min klus 2 min klus 4,0 m/s 10% 2 min klus 4,0 m/s 0% 2 min klus 4,5 m/s 10% 2 min klus 4,5 m/s 0% 2 min klus 5,0 m/s 10% 2 min klus 5,0 m/s 0% Zátěžová endoskopie

30

Výsledky Bylo vyšetřeno celkem sedm koní (pět hřebců, jeden valach a jedna klisna). Šest koní bylo plemene anglický plnokrevník, jeden plemene český teplokrevník. Všichni koně přišli s anamnézou snížené výkonnosti a většina koní také vykazovala stridor při zátěži (6/7). Mezi další uváděné anamnestické údaje patřila ztráta tempa ke konci dostihu (3/7), potíže popisované jako problém se nadechnout (2/7) a kašel při zátěži (1/7). U všech koní klinické vyšetření v klidu neprokázalo žádné odchylky v celkovém zdravotním stavu. Hematologické a biochemické vyšetření odhalilo pouze mírné a nespecifické alterace některých parametrů. Endoskopickým vyšetřením v klidu byla v jednom případě zjištěna idiopatická hemiplegie laryngu 2. stupně, v jednom případě lymfoidní hyperplazie faryngu 1. stupně a v jednom případě přítomnost sekretu v průdušnici. U ostatních koní bylo vyšetření bez patologického nálezu. Zátěžová endoskopie prokázala, že u čtyř koní dochází při zátěži k dorzální dislokaci měkkého patra, u jednoho pacienta k axiální deviaci aryepiglotických řas. U dvou koní nebyly odhaleny během zátěže žádné abnormality. Elektrokardiografickým vyšetřením byly zjištěny pouze fyziologické arytmie vlivem zvýšené parasympatikotonie v klidu (sinusová arytmie, SA blok), v jednom případě vyšetření odhalilo také výskyt extrasystol při zátěži, suspektně bez klinického významu. Výsledky shrnuje tabulka č. 2.

Tabulka č. 2: Přehled výsledků Pacient

Anamnéza

č. 1

Stridor při zátěži

Hemat/biochem.

Endoskopie

Endoskopie při

vyšetření

v klidu

zátěži

bez nálezu

bez nálezu

bez nálezu

EKG

Sinusová arytmie po zátěži

2

Kašel a stridor při

bez nálezu

zátěži

malé množství

Na začátku zátěže

sekretu v

DDSP

bez nálezu

průdušnici 3

Stridor při zátěži,

bez nálezu

PLH 1. st.

Opakovaně DDSP

bez nálezu

Mírně zvýšená

bez nálezu

Axiální deviace

Výskyt síňových

aryepiglotických řas

extrasystol během

ztráta tempa v dostihu 4

V rychlejším tempu problém se nadechnout

aktivita sval. enzymů před i po

zátěže a krátce po

31

zátěži 5

Stridor při zátěži,

zátěži

bez nálezu

bez nálezu

DDSP opakovaně

SA blok v klidu

Mírně zvýšená

IHL 2. st.

bez nálezu

bez nálezu

bez nálezu

DDSP opakovaně

bez nálezu

ztráta rychlosti ke konci dostihu 6

Stridor při zátěži

aktivita jaterních enzymů 7

Stridor při zátěži, problém se nadechnout, ztráta tempa v dostihu

Mírně zvýšený hematokrit, zvýšená hladina bilirubinu

Vysvětlivky zkratek: DDSP – dorzální dislokace měkkého patra, IHL – idiopatická hemiplegie laryngu, PLH – lymfoidní hyperplazie faryngu V našem souboru sedmi pacientů vyšetřených na KCHK byly u všech v anamnéze uvedeny zhoršená výkonnost a respirační příznaky. Diagnóza byla u pěti pacientů stanovena pomocí zátěžové endoskopie (4x DDSP, 1x axiální deviace aryepiglotických řas). U všech pacientů bylo současně provedeno zátěžové ekg a biochemické vyšetření krve bez specifického nálezu. Takto zavedený zátěžový test s využitím vysokorychlostního trenažéru na KCHK VFU Brno bude používán u dalších pacientů s intolerancí zátěže. Data takto získána budou prezentována ve vědeckých časopisech a odborných publikacích.

Seznam literatury 1) HINCHCLIFF, K. W., KANEPS, A. J., GEOR, R. J. Equine sports medicine and surgery. 1st edition, Elsevier 2004. 1364p. ISBN 0702026719 2) EVANS, D. E. Physiology of equine performance and associated tests of function. Equine Veterinary Journal. 2007, vol. 39, no. 4, 373-383. 3) REED, S. M., Bayly, W. M., Sellon, D. C. Equine internal medicine, 2nd edition, Clinical Assessment of Poor Performance 3.11, Elsevier 2004, p. 163-167. ISBN-10: 0721697771

32

Kvantifikace sonografie jater ve vztahu k vyšetření krve a jaterních bioptátů Zbyněk Dvořák1, Alena Pechová1, Miša Škorič2, Elizaveta Zvonareva1 Klinika chorob přežvýkavců a prasat1, Ústav patologické morfologie a parazitologie2, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Využití sonografie v diagnostice chorob skotu v posledních letech nabývá na významu. Velký zájem je věnován hodnocení stavu jaterního parenchymu. V posledních letech byly prováděny pokusy s cílem nalezení možnosti kvantifikace sonografického obrazu (Thijssen et al., 2008) a jeho komparaci s vybranými biochemickými parametry (Haudum et al., 2010), či výsledky histologického vyšetření (Szebeni et al., 2006). Tyto metody využívají softwarové kvantifikace sonografických snímků a na jejich základě stanovují stupeň alterace jaterního parenchymu. Podle prvních výsledků jsou při počítačovém zpracování sonografického snímku získány údaje s vysokou vypovídací hodnotou především ve vztahu k obsahu tuku v játrech. Tato metoda se tak jeví jako perspektivní náhrada invazivních zákroků pro zhodnocení stavu jaterního parenchymu (Haudum et al., 2010). Cílem naší práce je rozpracovat metodu sonografického vyšetření jater na pacientech hospitalizovaných na klinice a dále zhodnotit možnosti jejího využití v terénních podmínkách. Materiál a metodika Rozpracování sonografického vyšetření jater u dojnic bylo realizováno na 30 pacientech, kteří byli hospitalizováni na KCHPP. U těchto pacientů bylo provedeno biochemické vyšetření krve, sonografické vyšetření jater a biopsie jater. Sonografické vyšetření Sonografické vyšetření bylo provedeno pomocí sonografu Sonosite Titan s lineární sondou (7,5 MHz), snímky byly tvořeny s rozsahem sondy do hloubky 12 cm (transmit focus sondy 5 cm) s vizuální kontrolou tak, aby obsahovaly minimální množství artefaktů, způsobených okolními tkáněmi, případně jaterními cévami. Před samotným vyšetřením byla srst ostříhána elektrickým strojkem na výšku 0,2 mm, místo bylo očištěno roztokem Betadine a následně omyto vodou. Vyšetření bylo prováděno po aplikaci lihobenzinu se sondou krytou vyšetřovacím sonogelem. Byly zhotoveny snímky jater v rozsahu 8. - 12. interkostálního prostoru vpravo, ve střední třetině dutiny břišní, vždy jeden snímek pro každý interkostální prostor. Sonografické snímky byly transformovány do formátu .bmp pomocí softwaru Irfanview 3.31 a následně kvantifikovány pomocí softwarového programu MaZda® (Version 4.7, 2010, Technická

33

Univerzita Lodz, Polsko; Materka a Szczypinski 1999), kdy byly vybrány 3 oblasti (ROI - region of interest) o stejné velikosti v hloubce 5 cm od sondy. Z těchto tří ROI byl vybrán ROI bez artefaktů, který byl následně zpracován. Vyhodnocením pomocí programu MaZda® bylo získáno 285 parametrů, kvantifikujích danou oblast (ROI). Výsledky byly získány srovnáním těchto parametrů po rozdělení dojnic, dle postižení jater. Srovnání bylo provedeno pomocí F-testu a t-testu. Odběr krve a biochemické vyšetření Vzorky krve na biochemické vyšetření byly odebírány bezprostředně před biopsií jater, kdy jako místo odběru byla zvolena v. jugularis. Krev byla odebírána do 2 zkumavek, 1 zkkumavka na sérum s akcelerátorem a 1 zkumavka na krevní plazmu s přídavkem heparinu. V krevním séru byla stanovena koncentrace neesterifikovaných mastných kyselin, beta-hydroxybutyrátu (BHB), celkového bilirubinu a aktivita aspsrtátaminotransferázy (AST), gama-glutamyltransferázy (GMT) a laktátdehydrogenázy (LDH). Stanovení glukózy bylo provedeno z krevní plazmy, která byla oddělena do 30 minut po odběru. Stanovení bylo provedeno v Klinické laboratoři pro velká zvířata za pomoci standardizovaných metodik. Biopsie jater Biopsie byla standardně prováděna v horní až střední třetině 11. interkostálního prostoru s předchozí sonografickou kontrolou zvoleného místa, tak aby bylo minimalizováno riziko alterace velkých jaterních cév. Zvířata byla sedována pomocí 2% xylazinu (Rometar Bioveta 20 mg/ml injekční roztok) v dávce 0,7 - 1 ml i.v. pro toto. Po nastoupení sedace byla provedena dezinfekce operačního pole a infiltrační anestezie pomocí 2% prokainu (Prokain Bioveta 100 mg/ml injekční roztok), v dávce 10 ml pro toto. Bioptát byl bezprostředně po odběru uložen v roztoku formaldehydu. Histologické vyšetření Bioptáty jater byly rutinně připraveny pro histologické vyšetření. Vzorky byly fixovány v 10% roztoku formaldehydu, dehydrovány a na závěr fixovány v parafínovém vosku. Dále byly nařezány pomocí mikrotomu na šíři 4 μm a obarveny pomocí haematoxylin-eosinu. Histologickým vyšetřením byly vzorky rozděleny do 6 skupin (zdravá játra, játra postižena steatózou I., II. a III. stupně, játra postižená mírným a vyšším stupněm hydropické degenerace hepatocytů). Výsledky Na základě vyhodnocení sonografických nálezů bylo nalezeno místo pro získání sonografického snímku s minimálním množstvím artefaktů, které je nejvhodnější pro získání snímku pro následné softwarové hodnocení. Jako optimální místo byl vyhodnocen 11. a 10. interkostální prostor ve vzdálenosti cca 25 cm paramediálně vpravo od linie hřbetu.

34

Histologickým vyšetřením byla zjištěna játra bez patologického nálezu u 9 dojnic (skupina Z), steatóza jater u 6 dojnic (skupina S), přičemž u 1 byla mírného stupně a u 5 středního stupně. Hydropická degenerace (skupina H) byla u 13 dojnic (mírný stupeň u 1 dojnice, vyšší stupeň u 12 dojnic). Při využití výsledků ze snímků zhotovených v 9. a 11. interkostálním prostoru bylo nalezeno 88 parametrů, které vykazovaly signifikantní rozdíl (p < 0,05) mezi skupinou se steatózou jater a skupinami Z a H. Sonografickým vyšetřením nebyly zjištěny signifikantní rozdíly mezi skupinami Z a H. Pro srovnání sonografického vyšetření s výsledky biochemického vyšetření byly dojnice rozděleny podle aktivity AST, která byla vyhodnocena jako nejcitlivější parametr při steatóze jater u dojnic (Pechová, 1992). Byly vytvořeny 3 skupiny (sk. I – AST < 1,4 μkat/l, n = 9; sk. II – AST 1,4 - 2,0 μkat (l, n = 11; sk.III AST > 2,0 μkat/l, n = 10). Při tomto způsobu rozdělení byla zjištěna vysoká variabilita u jednotlivých sledovaných parametrů sonografického obrazu v rámci skupin, což se odrazilo v nízkém počtu signifikantních rozdílů mezi skupinami. Závěr Sonografie jater se jeví jako vhodná alternativní metoda k diagnostice steatózy jater, kdy lépe charakterizuje skutečný obsah tuku v játrech než biochemické vyšetření krve. Tuto metodu nelze využít pro diagnostiku hydropické degenerace jater. Pro praktické využití této metody je nezbytné vytipovat užší spektrum matematických charakteristik sonografického obrazu jaterní tkáně a získat širší spektrum pacientů, což by umožnilo vyhodnotit vypovídací schopnost sonografického vyšetření při různém stupni steatózy jater.

Seznam literatury 1) HAUDUM, A., STARKE, A., WEIERS, G.: Ultrasonographic echotexture analysis in diary cows with hepatic steatosis by using the software MaZda. In WBC 2010 Congress Abstracts (CD), Santiago, Chile, 2010, p. 866, (http://www.kenes.com/buiatrics/cd/pdf/866.pdf) 2) PECHOVÁ, A.: Diagnostika a prevence lipomobilizačního syndromu u dojnic v poporodním období. Kandidátská disertační práce VFU Brno, 1992, 170 s. 3) SZEBENI, A., TOLVAJ, G., ZALATNAI, A.: Correlation of ultrasound attenuation and histopatological parameters of the liver in chronic diffuse liver diseases. European journal of Gastroenterology and Hepatology, 2006, vol. 18, no. 1, p. 37-42 4) THIJSSEN, J. M., STARKE, A., WEIERS, G.: Computer-aided B-mode ultrasound diagnosis of hepatic steatosis:a feasibility study. IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control, 2008, vol. 55, no. 6, p. 1343-54

35

Vývoj účinného protokolu vitrifikace oocytů skotu Helena Ševelová, Miloslava Lopatářová, Pavla Musilová Oddělení reprodukce kliniky chorob přežvýkavců a prasat, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární univerzita Brno Úvod Cílem naší práce bylo vyvinout vysoce efektivní metodiku kryokonzervace bovinních oocytů. Tato metodika měla dále splňovat požadavek minimální finanční náročnosti, aby byla dostupná pro chovatele skotu. Rozhodli jsme se pro kryokonzervaci vitrifikací, jelikož tato metoda nevyžaduje žádné speciální přístrojové vybavení, je méně časově náročná a při správném provedení poskytuje lepší výsledky než klasické protokoly pomalého mražení (Gardner, 2007). Porovnávali jsme mezi sebou dvě nejčastěji používané kombinace kryoprotektiv a pro posouzení účinnosti naší metody byl použit i komerčně prodávaný kit určený pro humánní medicínu. Materiál a metodika Oocyty byly získány z jatečných vaječníků krav a jalovic aspirací injekční stříkačkou a jehlou, prohlédnuty při 40 - 80násobném zvětšení a vybrány ty nejkvalitnější podle kritérií publikace článku autorů Bilodeau-Goeselsové a Paniche (2001). Po 22 – 24 hodinách kultivace byly pro další práci vybrány jen oocyty s expandovaným homogenním kumulem. Část oocytů z každé dodávky vaječníků byla pro kontrolu jejich celkové kvality in vitro oplozena dávkami z homogenní série inseminačních dávek získaných od jednoho býka a byl sledován jejich další vývoj až do stádia blastocysty. To samé bylo provedeno s částí rozmražených oocytů. Kumulus nemohl být před oplozením zcela odstraněn, jelikož bez něj u skotu neproběhne řádně oplození (Chiana, 1994). To znesnadňovalo určení oocytů, které korektně nazrály do fáze MII, a tedy částečně snížilo i dosažené počty vyvíjejících se zygot (o přibližně 15 %). Pro snažší manipulaci byly oocyty před vitrifikací 15 s vortexovány, tak aby na nich zůstalo jen přibližně deset vrstev kumulárních buněk. Část oocytů byla vitrifikována. Jako nonpermeabilní kryoprotektivum byla použita sacharóza a jako permeabilní

kombinace

ethylenglykolu

(EG)

s dimethylsulfoxidem

(DMSO)

nebo

propylenglykolem (PROH). Vitrifikace byla provedena podle námi vyvinutého a odzkoušeného protokolu, který vychází především z prací Albarracína (2005) a Kyono (2007). Kryoprotektiva byla přidávána do základního roztoku skládajícího se z TCM199 HEPES (Sigma) s 20 % fetálním telecím sérem (Fluka). Při vitrifikaci byly vždy dva oocyty přeneseny do 20 µl kapky základního roztoku na

36

destičce s šesti kónickými jamkami. Poté k nim bylo přidáno 20 µl 7,5 % EG s 7,5 % DMSO/PROH. Po třech minutách bylo přidáno dalších 20 µl téhož roztoku. Po dalších třech minutách bylo přidáno 240 µl opět stejného roztoku. Za tři minuty byly oocyty přeneseny do 300 µl 7,5 % EG se 7,5 % DMSO/PROH, kde zůstaly šest minut. Pak byly přeneseny pipetou v co nejmenším objemu kapaliny na povrch jamky s 300 µl 15 % EG s 15 % DMSO/PROH. Po cca pěti sekundách byly oocyty nasáty skleněnou pipetou, ponořeny, několikrát v roztoku promyty a po 45 sekundách přeneseny na nosič a vitrifikovány. Celý postup byl prováděn za pokojové teploty. Použitý nosič splňoval požadavek na kryokonzervaci a skladování buněk v uzavřeném systému, který zabraňuje potenciální kontaminaci vzorků (Kuwayama, 2005). Byl vyroben z 0,25 ml pejety na mražení spermatu, která se vkládá do v 0,5 ml pejety podchlazené v kapalném dusíku. Ta se následně na otevřeném konci zatavila nahřátou pinzetou. Oocyty byly minimálně měsíc skladovány v kapalném dusíku a poté rozmraženy. Jelikož je pro přežití buněk nutná velmi vysoká rychlost rozmražení (Seki, 2009), byl nosič vkládán do 4 ml základního roztoku s 1 M sacharózou předehřátého na 38°C. Po jedné minutě byly oocyty přeneseny do 300 µl základního roztoku s 0,5 M sacharózou, odkud byly po třech minutách přeneseny do 300 µl základního roztoku (bez dalších složek). Zde zůstaly čtyři minuty. Poté byly na dvě minuty přeneseny do nové jamky s 300 µl základního roztoku, a pak už byly dále zpracovány podle oplozovacího protokolu pro kontrolu přežitelnosti a oplozeníschopnosti nebo byly tři hodiny ponechány v inkubátoru v oplachovacím médiu (použité zrací médium bez FSH), což je doba nutná pro znovuustavení dělicího vřeténka, které se během vitrifikace rozpadá (Morató, 2008), a následně zpracovány podle barvicího protokolu. Oocyty byly pro

vyhodnocení

vřeténka

zbaveny zony pellucidy

a

fixovány ve

4

% paraformaldehydu. Chromozomy byly barveny DAPI (Sigma), vřeténko se po inkubaci s primární protilátkou (TU-01, mouse monoclonal antibody against porcine brain alpha-tubulins, Exbio) a barvilo za použití sekundární protilátky s FITC (Anti-Mouse IgG whole molecule FITC antibody produced in sheep, Sigma). Vyhodnocení probíhalo na fluorescenčním nebo konfokálním mikroskopu. Výsledky Mezi jednotlivými kategoriemi kryoprotektiv nebyl nalezen statisticky průkazný rozdíl (modifikovaný χ2 test) ani z hlediska dalšího vývoje oocytů (Tabulka 1) ani z hlediska poškození dělicího vřeténka (Tabulka 2), které je u oocytu klíčové. Přestože vyhodnocovaný soubor oocytů nebyl příliš rozsáhlý, je zjevné, že námi vyvinutá metoda je funčkní a zaveditelná do praxe. Lze doporučit používání roztoky s PROH, který je na rozdíl od DMSO netoxický jak pro pracovníky, tak pro buňky (Aye, 2010).

37

n

dělící se

blastocysty

kontrola

467

232 (49,67)

51 (10,92)

DMSO

46

7 (15,27)

2 (3 )

PROH

47

8 (17,02)

0 (0)

Kitazato kit

15

5 (50)

0 (0)

normální 57 (89) 17 (53,1) 13 (44,83) 4 (80)

abnormální 7 (10,94) 12 (37,5) 15 (51,72) 1 (20)

Tabulka 1. Vývoj oocytů po oplození.

kontrola DMSO PROH Kitazato kit

n 64 32 29 5

bez vřeténka 0 (0) 3 (9,38) 1 (3,45) 0 (0)

Tabulka 2. Vyhodnocení stavu vřeténka (u oocytů s vyloučeným polárním tělískem). Seznam literatury 1) Albarracín J. L., Morató R., Rojas C., Mogas T. (2005): Effects of vitrification in open pulled straws on the cytology of in vitro matured prepubertal and adult bovine oocytes. Theriogenology 63, 890 – 901. 2) Aye M., Di Giorgio C., De Moa M., Botta A., Perrin J., Courbiere B. (2010): Assessment of the genotoxicity of three cryoprotectants used for human oocyte vitrification: Dimethyl sulfoxide, ethylene glycol and propylene glycol. Food and Chemical Toxicology 48, 1905 – 1912. 3) Bilodeau-Goeseels S. and Panich P. (2001): Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos. Anim. Reprod. Sci. 71, 143–155. 4) Gardner D. K. (2007): Analysis of oocyte physiology to improve cryopreservation procedures. Theriogenology 67, 64–72. 5) Chiana R.C., Okuda K., Niwa K. (1994): Influence of cumulus cells on in vitro fertilization of bovine oocytes derived from in vitro maturation. Animal Reproduction Science 38, 37 - 48. 6) Kuwayama M., Vajta G., Ieda S., Kato O. (2005): Comparison of open and closed methods for vitrification of human embryos and the elimination of potential contamination. Reproductive BioMedicine Online 11(5), 608 – 614. 7) Morató R., Izquierdo D., Paramio M. T., Mogas T. (2008): Cryotops versus open-pulled straws (OPS) as carriers for the cryopreservation of bovine oocytes: Effects on spindle and chromosome configuration and embryo development. Cryobiology 57, 137–141. 8) Kyono K., Nakajo Y., Kumagai S., Nishinaka C. (2007): Vitrifying and warming of oocytes using Cryotop. In: Vitrification in Assisted Reproduction: A User's Manual and Troubleshooting. Informa UK Ltd. 9) Seki S, Mazur P. (2009): The dominance of warming rate over cooling rate in the survival of mouse oocytes subjected to a vitrification procedure. Cryobiology 59(1), 75 - 82.

38

Vliv GnRH implantátů na ovariální aktivitu samic chameleóna jemenského

Zora Knotková1, Eva Čermáková1, Anna Hrdá1, Zdeněk Knotek1,2 Klinika chorob ptáků, plazů a drobných savců, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno1, Clinic for Avian, Reptile and Fish Medicine, University of Veterinary Medicine, Vienna2, Austria

Úvod U individuálně chovaných samic plazů v zájmových chovech je častou zdravotní komplikací porucha ovulace s perzistencí ovariálních folikulů1-3. Samice chameleóna jemenského (Chamaeleo calyptratus) jsou s tímto problémem prezentovány veterinárním lékařům často již ve věku okolo 6 měsíců a při hmotnosti nedosahující ani 100 g. Bez kastrace většinou hynou v důsledku závažných metabolických poruch nebo zánětů vaječníků a pleuroperitonea. Kastrace však vzhledem k anatomickým poměrům a velikosti pacienta představuje poměrně náročný chirurgický zákrok. Alternativu představuje preventivní využití méně invazivních a zároveň reverzibilních metod řízené reprodukce. Jako velmi perspektivní se v tomto směru jeví použití implantátů s GnRH agonistou deslorelinem (Suprelorin® 4,7mg Virbac Animal Health, Francie), které se již osvědčily u samic jiného druhu ještěrů4. Materiál a metodika Do sledování bylo zařazeno 20 klinicky zdravých samic chameleóna jemenského ve věku 5 měsíců. Samice byly umístěny do 5 terárií ve čtyřčlenných skupinách, v pravidelných intervalech k nim byl přidáván samec za účelem stimulace pohlavní aktivity. Zdravotní stav byl na začátku i v průběhu sledování kontrolován klinickým vyšetřením a hodnocením biochemického a hematologického profilu. Aktivita ovarií byla zjišťována dále pomocí rentgenologického a ultrasonografického vyšetření. Dvanáct samic bylo ponecháno v kontrolní skupině bez implantátu. Osmi samicím byl v celkové injekční anestézii (alfaxalon i.v.) zaveden do podkoží na pravém boku GnRH implantát (Suprelorin® 4,7mg Virbac Animal Health, Francie). Implantát byl aplikován v době, kdy byla rentgenologickým vyšetřením a biochemickým vyšetřením plazmy (koncentrace celkového kalcia) zjištěna minimální aktivita ovarií – u šesti samic až po vykladení první snášky vajec.

39

Následně byla hodnocena funkce pohlavního systému u samic s implantátem a u samic z kontrolní skupiny. Když samice dosáhly hmotnosti nutné k odběru dostatečného množství krve ke stanovení pohlavních hormonů, byly zamražovány vzorky plazmy pro následné vyšetření.

Výsledky U všech 12 samic v kontrolní skupině vykazoval pohlavní aparát aktivitu (tabulka 1). Čtyři samice z této skupiny v průběhu pokusu uhynuly – u dvou byly při pitvě pozorovány vaječníky s množstvím folikulů, u dvou retence vajec ve vejcovodech. U pěti samic z kontrolní skupiny došlo v průběhu sledování k jedné ovipozici. Zbývající tři samice z kontrolní skupiny vejce nevykladly, ale rentgenologickým vyšetřením u nich byla zjištěna přítomnost folikulů na vaječnících a biochemickým vyšetřením zároveň zvýšená koncentrace celkového kalcia v krevní plazmě. Všech 6 samic, kterým byl aplikován Suprelorin až po prvním vykladení vajec, vykazovalo i nadále pohlavní aktivitu srovnatelnou se samicemi v kontrolní skupině a minimálně jednou u nich proběhla další ovipozice. Dvěma samicím byl Suprelorin aplikován bez předchozího zjištění aktivity ovarií – jedna z nich po zavedení implantátu v průběhu sledování dvakrát vykladla vejce, u druhé byla sledována pouze zvýšená koncentrace celkového kalcia v krevní plazmě (tabulka 2).

Tabulka 1. Kontrolní skupina Číslo 1 2 5 9 10 11 12 13 14 17 19 20

Kladení vajec

Poznámka

8.10.2011 28.9.2011 7.9.2011, 9.11.2011 25.9.2011 4.11.2011 12.9.2011 3.10.2011

úhyn – ovariální folikuly úhyn – retence vajec

úhyn – retence vajec úhyn – ovariální folikuly

Koncentrace Ca 2+ v plazmě (mmol/l) 1. odběr 2.odběr 3. odběr 4. odběr 4,69 4,09 2,9 3,64 >4 3,6 2,74 2,64 3,75 3,65 2,56 2,5 >5 >5 >5 3,44 >4 2,91 >4 3,03 >5 3,96 >5 2,99 2,31 >4 3,58 >4 3,77 >4 3,47 4,47 3,21 >4 3,32 >4 >4 >5 3,02 4,64 3,22 >5 >5 -

40

Tabulka 2. Skupina samic s GnRH implantáty Číslo

Aplikace

3 4 6 7 8 15 16 18

implantátu 24.6.2011 19.7.2011 24.6.2011 24.6.2011 24.6.2011 19.8.2011 24.6.2011 24.6.2011

Kladení vajec 12.8.2011, 15.11.2011 18.7.2011, 2.11.2011 1.6.2011, 17.10.2011 4.6.2011, 1.9.2011, 15.11.2011 7.8.2011, 4.11.2011 6.6.2011, 9.9.2011 13.6.2011, 13.9.2011

Koncentrace Ca 2+ v plazmě (mmol/l) 1. odběr 2.odběr 3. odběr 4. odběr 5,18 3,22 6,11 4,56 2,96 >4 2,5 >4 2,86 >4 2,73 >4 >4 3,5 3,09 4,42 3,57 3,84 >4 >5 >5 3,66 2,19 >5 2,82 >4 3,08 >5 3,4 >4 5,78

Závěry U samic chameleóna jemenského nebyl dosavadním sledováním potvrzen vliv GnRH implantátů na aktivitu ovarií. Na rozdíl od samic leguána zeleného, u kterých po aplikaci implantátu došlo k dlouhodobému útlumu pohlavní činnosti4, samice chameleóna jemenského i několik měsíců po zavedení implantátu vykazovaly normální funkci pohlavního aparátu a kladly vejce. Kromě mezidruhových rozdílů v hormonální regulaci pohlavního cyklu lze uvažovat i o vhodnosti způsobu a místa aplikace GnRH implantátu a ovlivnění jeho vstřebávání do organismu. Samice chameleóna jemenského budou podrobeny dalšímu sledování včetně vyhodnocení koncentrace pohlavních hormonů. Seznam literatury 1) KNOTEK, Z., DORRESTEIN, G. M., KNOTKOVÁ, Z., JEKL, V., TRNKOVÁ, Š. Haematology and Plasma Chemistry in Female Veiled Chameleons (Chamaeleo calyptratus) Suffering from Pre-Ovulatory Follicle Stasis (POFS). Proc. 7th EAZWV Scientific Meeting, Leipzig, 30. 4. - 3. 5. 2008, 189 – 195 2) KUMMROW, M. S., MASTROMONACO, G. F., CRAWSHAW, G., SMITH, D. A. Fecal hormone patterns dutiny non-ovulatory reproductive cycles in female veiled chameleons (Chamaeleo calyptratus). General and Comparative Endocrinology 2010,168:349-355 3) DORRESTEIN GM, NOUEL S, KIK MJL, KNOTKOVÁ Z, DIELEMAN SJ, KNOTEK Z. Steroid hormone concentration related to preovulatory follicle stasis in the green iguana (I. iguana). Proc. 43 rd. International Symposium on Diseases of Zoo and Wild Animals, Edinburgh 16th –20th May 2007, 96 – 101 4) KNOTEK, Z., KNOTKOVÁ, Z., KLEY, N., MÖSTL, E., KNEIDINGER, N. Is Ovariectomy in Female Lizards Necessary? Clinical Study with GnRH Analogue Implants in Green Iguanas. Proc. Abstr. BVZS Autumn Meeting, York 7. – 8. 11. 2009, 76

41

Transvaginální sonografická intrafolikulární aplikace hCG a LH u skotu Jana Malá, Svatopluk Čech Klinika chorob přežvýkavců a prasat, Fakulta veterinárního lékařství, VFU Brno Úvod Transvaginální punkce vaječníku pod sonografickou kontrolou je běžně používanou metodou ve výzkumu i asistované reprodukci (1, 2). Jednou z nových aplikací transvaginální punkce vaječníku je intrafolikulární injekce účinných látek, která může navázat na intracystickou aplikaci hCG, popsanou v minulosti (3). Cílem práce bylo propracovat metodiku intrafolikulární injekce u skotu (IFT), u jalovic ošetřených deslorelinem ověřit účinky intrafolikulárně podaného LH po aplikaci do dominantních folikulů po exogenní stimulaci FSH a stanovit minimální účinné dávky LH a hCG u cyklujích jalovic v luteální fázi cyklu. Materiál a metodika Experiment 1: Intrafolikulární aplikace fyziologického roztoku u cyklujících jalovic Pět pokusných jalovic jsme synchronizovali použitím syntetického analogu prostaglandinu F2α (cloprostenol, Oestrophan®) a syntetického GnRH (gonadorelin, Depherelin Gonavet®). Po synchronizaci říje (říje=D0) byl v D5 aplikován fyziologický roztok (n=2) o objemu 0,2 ml do dominantního folikulu (IFT), kontrolní zvířata (n=2) nebyla ošetřena. Intrafolikulární injekce byly provedeny nově vyvinutým dvoucestným nástrojem za použití sonografu Aloka SSD 500 a konvexní sondy 7,5 MHz. Odběry krve pro stanovení koncentrace LH probíhaly 3 hodiny před a 5 hodin po IFT v intervalu 15 minut. Za 45 hodin po IFT byl aplikován cloprostenol. V čase očekávaného LH peaku následovaly odběry krve pro stanovení hladin LH v intervalu 60 minut. Do začátku říje byly jalovice sonograficky denně vyšetřovány (lineární sonda 7,5 MHz), poté až do ovulace probíhala vyšetření v intervalu 8 hodin. Experiment 2: Intrafolikulární aplikace LH u jalovic s inhibovanou činností hypofýzy U pěti jalovic byl na zevní stranu ušního boltce podkožně aplikován implantát obsahující deslorelin (4,7 mg, Suprelorin®) za účelem desenzibilizace hypofýzy a inhibice ovariální aktivity. Odběry krve pro stanovení hladin LH probíhaly v intervalu 15 minut, a to 3 hodiny před a 9 hodin po aplikaci implantátu, následně 24 hodin po aplikaci implantátu po dobu 3 hodin. Během následujícího týdne byly jalovice pravidelně sonograficky vyšetřovány. Poté jsme aspirovali zbývající folikuly a zahájili

42

stimulaci růstu folikulů aplikací FSH (Stimufol®, 20 µg, 2x denně po 5 dnů). Za 12 hodin po skončení této stimulace jsme pomocí nového zařízení aplikovali do vybraného folikulu 0,2 ml roztoku LH v různém ředění. Ovariální responsi jsme sledovali ultrasonograficky v intervalu 24 hodin, odběry krve na stanovení koncentrace progesteronu jsme prováděli v den intrafolikulární aplikace (D0), a následně v D3 a D7. Vzhledem k délce účinnosti použitých implantátů s deslorelinem postačilo před dalším cyklem ošetření folikulů odsát zbývající folikuly z předcházející části pokusu. Po indukované luteolýze byl postup opakován s jinou dávkou LH. Jako kontrolu jsme použili intravenózní aplikaci hCG (2000 U.I., Pregnyl®). Experiment 3: Intrafolikulární aplikace LH a hCG u cyklujících jalovic Ve třetí části pokusu jsme využili jalovice v komerčních chovech. Pohlavní cyklus jalovic byl synchronizován pomocí cloprostenolu na základě rektálního vyšetření. Sedmý den cyklu byla provedena intrafolikulární aplikace (D0) různých dávek LH a hCG, ovariální responzi jsme kontrolovali v D7. Krev pro stanovení koncentrace progesteronu byla odebrána v den ošetření (D0) a den kontroly (D7). Jako kontrolu jsme použili intravenózní aplikaci hCG (2000 U.I., Pregnyl ®) a intravenózní a intramuskulární aplikaci LH (12,5 mg a 25 mg, Lutropin®). Výsledky Výsledky endokrinologického vyšetření zatím nejsou k dispozici. Experiment 1: Po IFT fyziologického roztoku folikuly u pokusných zvířat pokračovaly v růstu stejně jako u kontrolních jalovic. Ovulace ošetřených i kontrolních folikulů byla pozorována v čase 72 - 80 hodin po aplikaci cloprostenolu. Experiment 2: Po aplikaci deslorelinu došlo u 4 jalovic k ovulaci přítomného folikulu a ke vzniku žlutého tělíska, u jedné jalovice folikul perzistoval. Po indukované luteolýze došlo úplnému zastavení ovariální aktivity. Po aplikaci exogenního FSH jsme pozorovali růst kohorty folikulů, počet byl individuálně variabilní (1 – 25). Klinická odezva na intrafolikulární aplikaci různých dávek LH je uvedena v tabulce 1. Po intravenózní aplikaci hCG došlo u kontrolních jalovic k multipní ovulaci všech přítomných folikulů.

43

Tab. 1: Ovariální responze po intrafolikulární aplikaci různých dávek LH u jalovic s inhibovanou činností hypofýzy Dávka LH [µg] Ovulace Bez ovulace Celkem

10 3 0 3

5 3 0 3

1 3 0 3

0,01 0 3 3

Experiment 3: Pozorované výsledky u cyklujících jalovic potvrzují, že k vyvolání ovulace folikulu postačují velmi nízké dávky obou zkoumaných hormonů. Teprve dávka 0,01 µg LH a 0,001 IU hCG nevyvolá vznik CL ani v jednom případě (tabulka 2). U kontrolních zvířat bylo možné pozorovat ovulaci po intravenózní aplikaci 2000 I.U. ve všech 3 případech. Intravenózní (n=2) aplikací 12,5 mg LH jsme v jednom případě dosáhli vzniku CL, ve druhém případě vzniklo atypické žluté tělísko s velmi tenkou stěnou. Po intramuskulární aplikaci 12,5 mg LH nebyl pozorován vznik CL. Výsledky po i.v. a i.m. aplikaci 25 mg LH zatím nejsou dohodnoceny. V experimentu 3 jsme celkem provedli 39 IFT, 3 aplikace nezdařily, ve sledování je hodnoceno 36 úspěšných aplikací (92,3%). Tab. 2: Ovariální responze po intrafolikulární aplikaci různých dávek LH a hCG u cyklujících jalovic Dávka LH [µg]

10

5

1

0,5

0,1

0,01

0,001

Ovulace

2

2

2

3

2

0

0

Bez ovulace

1

1

1

0

1

3

3

Celkem

3

3

3

3

3

3

3

Dávka hCG [IU] Ovulace

10 3

1 3

0,1 3

0,01 2

0,001 0

Bez ovulace

0

0

0

1

3

Celkem

3

3

3

3

3

Závěr 1. Intrafolikulární aplikace nově vyvinutým setem je spolehlivým postupem k injekci účinných látek do folikulů u skotu. 2. Po intrafolikulární aplikaci fyziologického roztoku nedošlo k ovlivnění vývoje ošetřených folikulů.

44

3. Po intrafolikulární aplikaci sestupných dávek LH u jalovic ošetřených deslorelinem došlo k ovulaci ošetřených folikulů ještě po injekci 1 µg LH. Ovulace nemohla být vyvolána endogenním uvolnění LH, schopnost folikulů ovulovat byla potvrzena uniformní reakcí kontrolních zvířat. 4. Po intrafolikulární aplikaci sestupných dávek LH a hCG u cyklujících jalovic došlo k ovulaci ošetřených folikulů ještě po injekci 0,1 µg LH a 0,01 IU hCG. Tyto dávky můžeme pokládat za minimálně účinné. Seznam literatury 1) CECH, S., INDROVA, E., LOPATAROVA, M., MALA, J., PECHOVA, A., DOLEZEL, R. (2011): Limitations of ultrasound guided follicular aspiration for analysis of follicular fluid in dairy cattle. Acta Vet., 80, 179-184. 2) PIETERSE, M. C., KAPPEN, K. A., KRUIP, TH. A. M., TAVERNE, M. A. M. (1988): Aspiration of bovine oocytes during transvaginal ultrasound scanning of the ovaries. Theriogenology, 30, 751-762. 3) ROBERTS, S. J. (1957): A preliminary report on the treatment of cystic ovaries in dairy cattle by the injection of gonadotropic hormones directly into the follicular cyst. J. Am. Vet. Med. Assoc., 131, 510-513.

45

Hodnocení vybraných změn vnitřního prostředí u syndromu dilatace a volvulu žaludku Ivana Uhríková1, Leona Raušerová2, Kristína Řeháková3, Kateřina Macháčková4, Jaroslav Doubek1 Ústav fyziologie1, Klinika chorob psů a koček2, Klinická laboratoř pro malá zvířata3, studentka MSP4, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Syndrom dilatace a volvulu žaludku (GDV) je akutním onemocněním psů s vysokou morbiditou a mortalitou. Onemocnění spočívá v rotaci žaludku s kumulací plynu, což brání jeho spontánní repozici. V organismu dochází k rozvoji systémové zánětové odpovědi (SIRS) a alteraci acidobazické rovnováhy. Cílem práce bylo hodnocení rozvoje SIRS prostřednictvím laboratorních ukazatelů (hematologické vyšetření, stanovení C-reaktivního proteinu a proteinu high mobility group box 1), identifikace poruch acidobazické rovnováhy a posouzení vlivu infuzní terapie na jejich úpravu. Materiál a metodika Zvířata Celkem bylo do studie zahrnuto 18 psů (6 samic, 12 samců) s rentgenologicky diagnostikovaným syndromem dilatace a volvulu žaludku, kteří podstoupili terapeutický operační zákrok na Klinice chorob psů a koček Veterinární a farmaceutické univerzity Brno. Zastoupena byla plemena: německý ovčák (n=4), velký švýcarský salašnický pes (n=2), středoasijský pastevecký pes (n=1), dobrman (n=1), bernský salašnický pes (n=1), knírač (n=1), neapolský mastin (n=1), hovawart (n=1), německá doga (n=1), brazilská fila (n=1) a labrador (n=1), tři psi byli kříženci. Odběr vzorků Od všech probandů byla odebrána krev (arteria dorsalis pedis a/nebo vena jugularis) pro acidobazické (AB), biochemické a hematologické vyšetření v čase: před operačním zákrokem (1. odběr), po operačním zákroku (2. odběr), 6-10 h (3. odběr) a 20-24 h (4. odběr) po operačním zákroku. U čtyř psů byla při laparotomii zjištěna masivní nekróza žaludku a tito jedinci byli utraceni. Jeden pacient byl propuštěn z hospitalizace před provedením posledního odběru. Celkem tedy bylo získáno 63 vzorků krve (13x4, 4x2 a 1x3 vzorky).

Metody AB vyšetření bylo provedeno do 10 minut po odběru (EasyBloodGas, Medica, USA). Zbylá heparinová krev byla centrifugována (5 min, 3000 otáček/min) a z plazmy byla stanovena

46

koncentrace laktátu (DPC Konelab 20i, Thermo Fischer Scientific Finland). Hematologické vyšetření bylo provedeno ze vzorku EDTA krve na analyzátoru Celltac Alpha (Nihon Kohden, Japan). Sérum bylo po odstředění (15 min, 3000 otáček/min) skladováno při -20°C. Ze vzorků séra byl ELISA metodou stanoven C-reaktivní protein (CRP, Biovendor a.s., Česká republika) a high mobility group box 1 (HMGB1, IBL International GmbH, Germany). Hemolytické vzorky byly vyloučeny z analýzy HMGB1. Pro hodnocení nálezů byly použity referenční hodnoty Klinické laboratoře pro malá zvířata FVL VFU Brno. Hodnocení SIRS Zařazení jedinců do skupiny SIRS bylo na základě splnění minimálně dvou z následujících kritérií1: teplota nižší než 38 °C nebo vyšší než 39 °C, srdeční frekvence vyšší než 120 pulzů/min, dechová frekvence vyšší než 20/min, počet bílých krvinek nižší než 6.109/l, vyšší než 16.109/l nebo počet tyček vyšší než 3 %. Výsledky Hodnocení rozvoje SIRS Při vstupním vyšetření splňovalo kritéria SIRS 16 jedinců. CRP, HMGB1 a hladina leukocytů byly použity pro posouzení rozvoje SIRS v dalších odběrech, nakolik tradiční kritéria hodnocení byla ovlivněna terapeutickým zákrokem (anestezie) a medikací (antiarytmika). Hodnota CRP byla před i po operaci zvýšena nad referenční rozmezí pouze u 8 psů, kdežto ve 3. i 4. odběru byla zvýšena u všech jedinců se stoupající tendencí. Iniciální koncentrace CRP byla signifikantně vyšší u nepřeživších jedinců (p<0,05, průměrně 85,76 g/ml) oproti přeživším (průměrně 25,53 g/ml). Koncentrace HMGB1 byla před operací vyšší u 14, ve 2. a 3. odběru u 17, a ve 4. odběru u 16 psů. Kinetika HMGB1 však neměla jednoznačně klesající nebo stoupající charakter (graf 1). Iniciální hodnota HMGB1 byla signifikantně vyšší u nepřeživších jedinců (p<0,05, průměrně 26,8 pg/ml) oproti přeživším (průměrně 4,29 pg/ml). Leukopenie byla v prvním odběru zaznamenána u dvou jedinců, leukocytóza byla přítomna u čtyř psů. Po operaci došlo k poklesu počtu leukocytů u 11 pacientů, u ostatních se počet leukocytů zvýšil. Ve 3. odběru byl zaznamenán vzestup leukocytů u všech jedinců, přičemž u 11 z nich přesáhl počet leukocytů horní mez referenčního rozmezí. V posledním odběru se dále zvýšil počet leukocytů u 6 psů.

47

Změny acidobazického statusu Z 18 psů byli pouze dva jedinci přijati bez alterace acidobazického statusu. Nejčastější poruchou byla respirační acidóza (RAC, n=5) a kombinace metabolické alkalózy s respirační acidózou (n=4). Dále se u pacientů vyskytovala metabolická acidóza (MAC, n=3), kombinace metabolické acidózy s respirační acidózou (n=2) a kompenzovaná RAC (n=1). U jednoho pacienta nebylo předoperační vyšetření AB situace z důvodu sražení vzorku provedeno. Ve 2. odběru byla nejčastější AB poruchou RAC (n=6), dále se vyskytovala kombinovaná porucha RAC s MAL (n=5) a RAC s MAC (n=4). U dvou pacientů byla zaznamenána MAC a u jednoho psa nebyla přítomna odchylka AB profilu. Ve 3. odběru byla nejčastěji přítomna kompenzovaná MAC (MACk, n=6) nebo MAC (n=3). Zbylí pacienti nevykazovali alteraci acidobazického statusu. Ve 4. odběru byla MACk u 4 jedinců, MAC a RAL u dvou psů a MAC u jednoho jedince. Ostatní pacienti byli beze změny AB rovnováhy. Vliv infuzní terapie na úpravu acidobazického statusu Pro hodnocení vlivu infuzní terapie (Hartmannův roztok, fyziologický roztok NaCl a Ringerův rozrok) na úpravu AB profilu jsme zvolili porovnání průměrů změny koncentrace bikarbonátu, base excess a koncentrace laktátu mezi skupinami. Hodnoty všech tří parametrů se v 1. odběru mezi skupinami signifikantně nelišily. Hladina bikarbonátu ve skupině psů s infuzí Hartmannova roztoku stoupla průměrně o 1,58 mmol/l, naproti tomu pokles koncentrace bikarbonátu byl zaznamenán při aplikaci Ringerova roztoku, a to o 0,38 mmol/l. Psům, kterým byl aplikován fyziologický roztok NaCl, se zvýšila hladina bikarbonátu průměrně o 0,32 mmol/l. Podobné výsledky byly zaznamenány u base excess (BE). Hartmannův roztok zvyšoval BE průměrně o 1,36 mmol/l, kdežto fyziologický roztok NaCl a Ringerův roztok snižoval BE v průměru o 1,06 mmol/l, resp. 1,55 mmol/l. Hladina laktátu klesla nejvýznamněji u skupiny psů s podaným fyziologickým roztokem NaCl (průměrně o 2,37 mmol/l), následovala skupina pacientů s infuzí Ringerova roztoku (1,57 mmol/l) a Hartmannova roztoku (1,45 mmol/l).

Seznam literatury 1) HAUPTMAN, J. G.; WALSHAW, R; OLIVIER, N. B. Evaluation of the sensitivity and specificity of diagnostic criteria for sepsis in dogs. Vet Surg. 1997, 26, s. 393-397.

48

Studium metabolizmu mědi ve vztahu matka – mládě u koz při dotaci mědi ve formě anorganické a organicky vázané Irma Kadavová, Leoš Pavlata, Kateřina Hauptmanová, Elizaveta Zvonareva, Tomáš Páleník, Eva Krupíková, Taťána Husáková, Alena Pechová Klinika chorob přežvýkavců a prasat, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Úvod Význam mikroprvků pro fyziologické funkce je obecně známý, názory na jejich dostupnost pro organizmus, při jejich podávání v různých formách či koncentracích, však nejsou jednotné (1). Měď (Cu) je esenciální složkou několika enzymových systémů, je nutná pro tvorbu kostí, vývoj pojivových tkání, keratinizaci a pigmentaci tkání a myelinizaci míchy, účastní se syntézy hemoglobinu. Hraje klíčovou roli v procesu absorpce a mobilizace železa a stimuluje růst (2). Je popisován pozitivní vliv suplementace Cu na přírůstky a imunitu kůzlat (3). Vyšší přírůstky a snížení hladin plazmatického cholesterolu bylo zaznamenáno po suplementaci organickými formami Cu (4). Je popsán také pozitivní vliv některých forem Cu na snížení výskytu nematod gastrointestinálního traktu (5). Z hlediska obecného metabolismu Cu se většinou uvádí, že Cu přestupuje přes placentu do plodu. Pokud však vyšetřujeme plazmatické koncentrace Cu u novorozených telat, zjišťujeme v jejich krvi výrazně nižší koncentrace Cu než u jejich matek (6). To ovšem neznamená, že u koz a jejich kůzlat bude situace obdobná, protože v metabolismu mikroprvků ve vztahu matka – mládě jsou mezi skotem a kozami postupně odhalovány poměrně významné rozdíly (7). Cílem naší práce bylo popsat metabolizmus Cu na úrovni matka – mládě u koz při dotaci jejich různých forem (anorganické a organicky vázané). Dále jsme studovali vliv rozdílného stupně saturace organizmu matky mědí na složení a kvalitu kolostra a také obsah Cu v placentě a plodových vodách. Materiál a metody Do pokusu bylo zařazeno 22 klinicky zdravých vysokobřezích bílých krátkosrstých koz, které byly rozděleny do 3 skupin tak, aby průměrné plazmatické koncentrace Cu byly vyrovnané (u všech skupin byla průměrná koncentrace Cu v krevní plasmě 16,5 μmol/l). Jedna skupina sloužila jako kontrola (C; n = 8), bez přídavku Cu. Kozy experimentálních skupin byly dotovány různými

49

formami Cu, která byla součástí granulované krmné směsi (s obsahem Cu 30 mg/kg sušiny). Zvířata skupiny E1 (n = 8) byla dotována Cu ve formě CuSO4 a zvířata skupina E2 (n = 6) dostávala přídavek chelátu mědi (Bioplex Cu, Alltech). Krmení koz přídavkem Cu bylo zahájeno 2 měsíce před očekávaným termínem porodu. Jinak byla krmná dávka všech zvířat stejná a skládala se z lučního sena, granulované krmné směsi a solného lizu. Zvířata měla trvalý přístup k pitné vodě. Množství krmiv a jejich živinové složení odpovídalo dané kategorii a fázi reprodukce zvířat. V průběhu porodu byly odebrány vzorky plodových vod (aspirací z plodového vaku) a bezprostředně po porodu kolostrum (oddojení cca 300 ml prvního kolostra), placenta (při jejím odchodu odstřižením části) a krev od matek i jejich kůzlat (punkcí v. jugularis). Ve vzorcích byla stanovena koncentrace Cu metodou AAS. V kolostru byla dále stanovena kolostroměrem specifická hmotnost a metodou FT-NIR obsah bílkoviny, laktózy, tuku a sušiny.

Výsledky V kontrolní skupině byla v den porodu průměrná koncentrace Cu v krevním séru 15,18 ± 4,36 µmol/l. V obou pokusných skupinách byly koncentrace Cu vyšší, ale jen ve skupině E1 (CuSO4) signifikantně (p < 0,05). Průměrná koncentrace Cu u skupiny E1 byla 19,52 ± 1,69 μmol/l a u skupiny E2 (chelát Cu) 18,46 ± 2,46 μmol/l. Průměrné koncentrace Cu v kolostru byly u kontrolní skupiny 8,27 ± 4,78 μmol/l, u skupiny E1 10,63 ± 3,33 μmol/l, u skupiny E2 7,12 ± 1,54 μmol/l. Koncentrace Cu v kolostru koz skupina E1 byla signifikantně vyšší (p < 0,05) ve srovnání se skupinou E2. Ostatní parametry vyšetřované v kolostru neukázaly žádné signifikantní rozdíly (Tab. 1). Také nebyl prokázán signifikantní rozdíl v koncentraci Cu v placentách a plodových vodách. Tabulka 1: Složení kolostra (x – průměr; s – směrodatná odchylka) koz jednotlivých skupin (C – kontrola, E1 – kozy dotované síranem měďnatým, E2 – kozy dotované chelátem Cu) Bílkovina (%) Laktóza (%) Sušina (%) Tuk (%) Hustota C x 12,04 3,88 23,89 6,58 1049,88 s 2,45 0,59 4,01 2,05 6,17 E1 x 13,80 3,40 25,86 6,62 1054,00 s 3,92 0,87 4,50 1,64 10,37 E2 x 10,18 4,06 21,79 5,84 1044,17 s 2,40 0,45 3,31 1,29 4,22 Tabulka 2: Obsah mědi (průměr ± směrodatná odchylka) v plodových vodách (μmol/l) a placentě (μg/kg čerstvé tkáně) u koz jednotlivých skupin (C – kontrola, E1 – kozy dotované síranem měďnatým, E2 – kozy dotované chelátem Cu)

50

skupina C E1 E2

amnion 1,02 ± 0,25 0,90 ± 0,33 1,28 ± 0,54

alantois 0,98 ± 0,10 1,08 ± 0,21 1,04 ± 0,12

placenta 9,10 ± 2,10 8,50 ± 2,00 8,20 ± 2,20

U kůzlat kontrolní skupiny (C, n = 16) byla průměrná koncentrace Cu v krevním séru v den porodu 5,97 ± 0,97 μmol/l. Kůzlata koz krmených anorganicky vázanou Cu (E1, n = 16) měla průměrnou koncentraci Cu 6,66 ± 0,75 μmol/l a u mláďat koz krmených organicky vázanou Cu (E2, n = 9) byla průměrná koncentrace Cu 6,03 ± 0,52 μmol/l. Koncentrace Cu u kůzlat skupiny E1 byla průkazně vyšší (p < 0,05) než u kůzlat skuliny C, ale i E2. Pokud porovnáme průměrné plasmatické koncentrace Cu v krvi kůzlat a jejich matek v den porodu, pak je zřejmé, že koncentrace Cu v krevní plasmě kůzlat jsou průkazně nižší než u jejich matek a dosahují v jednotlivých skupinách následující podíl z hodnoty koncentrace Cu v plasmě koz: C - 39 %, E1 - 34 %, E2 - 33 %. Výsledky naši studie jednoznačně ukazují na lepší vliv suplementace anorganicky vázanou Cu v porovnání s použitou formou Cu organicky vázané. Fyziologická koncentrace Cu v krevní plasmě kůzlat dosahuje jen 33 – 39 % z hodnot koncentrace Cu v krevní plasmě koz.

Seznam literatury 1) SPEARS, J. W. Organic trace minerals in ruminant nutrition. Animal Feed Science and Technology, 1996, vol. 58, p. 151-163. 2) PAVLATA, L. Poruchy metabolismu mědi. In HOFÍREK, B., DVOŘÁK, R., NĚMEČEK, L., DOLEŽEL, R., POSPÍŠIL, Z. A KOL. Nemoci skotu, Noviko a.s., 2009, s. 708-710. 3) SOLAIMAN, S. G., CRAIG JR., T. J., REDDY, G., SHOEMAKER, C. E. Effect of high levels of Cu suplement on growth performance, rumen fermentation, and immune responses in goat kids. Small Ruminant Research, 2007, vol. 69, p. 115-123. 4) DATTA, C., MONDAL, M. K., BISWAS, P. Influence of dietary inorganic and organic form of copper salt on performance, plasma lipids and nutrient utilization of Black Bengal (Capra hilus) goat kids. Animal Feed Science and Technology, 2007, vol. 135, p. 191-209. 5) BURKE, J. M., SOLI, F., MILLER, J. E., TERRILL, T.H., WILDEUS, S., SHAIK, S.A., GETZ, W.R., VANGURU, M. Administration of copper oxide wire particles in a kapsule or

51

feed for gastrointestinal nematode control in goats. Veterinary Parasitology, 2010, vol. 168, p. 346-350. 6) PAVLATA, L., PECHOVÁ, A., DVOŘÁK, R. Microelements in colostrum and blood of cows and their calves during colostral nutrition. Acta Veterinaria Brno, 2004, vol. 73, p. 421-429. 7) MIŠUROVÁ, L., PAVLATA, L., PECHOVÁ, A., DVOŘÁK, R. Selenium metabolism in goats – maternal transfer of selenium to newborn kids. Veterinarni Medicina, 2009, vol. 54, p. 125130. Naše studie byla realizována za podpory projektu MSM6215712403 a projektu IGA VFU 4/2011/FVL

52

Mikrobiální flóra periapikálních abscesů králíka domácího Andrea Mináriková, Vladimír Jekl Klinika chorob ptáků, plazů a drobných savců Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Úvod Syndrom onemocnění dentice je u drobných herbivorních savců chovaných ze záliby prezentován jako jeden z nejčastějších problémů řešených ve veterinární praxi drobných savců (Jekl a kol. 2008). Projevuje se mnoha klinickými příznaky jako je anorexie, dysfagie, hubnutí, ptyalismus nebo epifora. Periapikální abscesy však u králíků v porovnání s morčetem, činčilou nebo osmákem degu diagnostikujeme mnohem častěji. Terapeutické zvládnutí periapikálního abscesu je závislá na debridementu celého abscesu včetně jeho kapsuly, extrakci postiženého zubu, odstranění nekrotické/infikované části kostního podkladu a aplikaci antibiotik (Capello 2008). Cílem práce byly popsat mikrobiální mikroflóru periapikálních abscesů u králíka domácího a stanovit optimální antibiotickou terapii pro tento typ onemocnění. Materiál a metodika Diagnostika periapikálního procesu Do studie bylo zahrnuto 50 králíků domácích (Oryctolagus cuniculus) ve věku 1,5-8 let s příznaky faciálních abscesů odontogenního původu, které zahrnovaly přítomnost faciální masy, případně prominence kostěného podkladu zubních arkád. U všech pacientů bylo provedeno klinické vyšetření, vyšetření krve (hematologické a biochemické vyšetření), vyšetření dutiny ústní pomocí endoskopu a extraorální rentgenologické vyšetření lebky a dentice pacienta. V případech postižení horní čelisti bylo provedeno vyšetření lebky pomocí počítačové tomografie (CT). V průběhu vlastního chirurgického zákroku byl také hodnocen rozsah postižení zubů a kosti s porovnáním s preoperačně zjištěnými poznatky ze zobrazovacích metod. Chirurgický zákrok probíhal vždy v celkové anestézii pacienta při jeho intubaci, perioperační intravenózní infuzi a monitoringu životních funkcí. Ve všech případech byla chirurgická rána ponechána k sekundárnímu vyhojení (marsupializace abscesu). Odběr vzorků, laboratorní diagnostika a kultivace Vzorky hnisu, kapsuly abscesu, postiženého zubu a kosti byly odebírány sterilně do zkumavek z transportní půdou AMIES v průběhu chirurgického zákroku. Vzorky byly zaslány do

53

bakteriologické laboratoře s osvědčením o akreditaci ČSN 15189:2007. Vzorky byly dále kultivovány na selektivních půdách a přesné určení bakterie bylo určeno na základě enzymatické aktivity bakterií. Citlivost bakterií na antibiotika zahrnovala penicilin G, cefalosporiny, enrofloxacin, marbofloxacin, trimetoprim-sulpha, doxycyklin a metronidazol. Výsledky Kombinace klinického vyšetření, vyšetření dutiny ústní pomocí endoskopu a rentgenologické vyšetření se ukázalo dostačující při postižení 1-2 mandibulárních premolárů nebo molárů. Při větším postižení alveolární kosti, zubů a všeobecně při postižení horní čelisti byla diagnosticky přínosnější kombinace endoskopického vyšetření dutiny ústní a vyšetření pomocí CT. Výsledky aerobní a anaerobní kultivace shrnuje tabulka 1. Aerobní bakterie byly většinou senzitivní k fluorochinolonům (enrofloxacin, marbofloxacin; 71,4 %) a beta-laktamům (ampicilin, penicilin, amoxicilin-klavulanát; 89,7 %). Anaerobní bakterie byly citlivé k metronidazolu (90 %) a betalaktamům (ampicilin, penicilin, amoxicilin-klavulanát; 96,5 %). U pěti králíků bylo kultivačním vyšetřením a zjištěním sensitivity potvrzeno 6 multirezistentních patogenů (Escherichia coli -2x, Enterobacter cloacae -2x, Proteus vulgaris, Pseudomonas sp., Streptococcus beta-haemol. group G). Tabulka 1. Aerobní a anaerobní bakterie zjištěné v případech periapikálních abscesů Aerobní bakterie

Streptococcus beta-haemol. Group F, Streptococcus beta-haemol. Group G, Streptococcus

alfa-haemol,

Streptococcus

vestibularis,

Streptococcus

viridans, Streptococcus anginosus, Acinetobacter sp., Escherichia coli, Enterococcus

faecalis,

Enterobacter

cloacae,

Proteus

vulgaris,

Staphylococcus aureus, Staphylococcus sp. -coagulase neg., Pseudomonas aeruginosa Anaerobní bakterie

Streptococcus intermedius, Bacteroides fragilis, Bacteroides capillosus, Peptostreptococcus sp, Peptococcus sp., Mobiluncus mulieris, Bacteroides fragilis, Micromonas micros, Parvimonas micra, Gemella morbillorum, Prevotella

oris,

Actinomyces

viscosus,

Actinomyces

odontolyticus,

Actinomyces naeslundii, Clostridium butyricum, Fusobacterium nucleatum

Závěr Klinické vyšetřené, vyšetřen í dutiny ústní pomocí rigidního endoskopu a rentgenologické vyšetření se ukázalo jako dostačující při postižení 1-2 mandibulárních premolárů nebo molárů. Při diagnostice periapikálních abscesů zubů maxilární arkády a v případech většího rozsahu postižení

54

spodní čelisti je z hlediska přesného plánování chirurgického zákroku a stanovení prognózy vyšetření pomocí počítačové tomografie nezastupitelné. Spektrum druhového zastoupení bakterií je obdobný jako u ostatních savců včetně člověka. V doposud jediné publikované studii, která popisuje periapikální patologickou mikroflóru u 10 zvířat byly popsány tyto bakterie: Fusobacterium nucleatum, Prevotella spp., Peptostreptococcus micros, Streptococcus milleri group, Actinomyces israelii, a Arcanobacterium haemolyticum (Tyrell a kol. 2002). V uvedené studii byly bakterie citlivé zejména na klindamycin (100 %), penicillin a ceftriaxon (96 %) a ciprofloxacin (54 %). V porovnání s touto publikací byly zjištěny další bakterie podílející se na vzniku periodontitidy a osteomyelitidy, a to bakterie rodu Enterobacter, E.coli a Actinomyces. Vzhledem k dosaženým výsledkům autoři této publikace doporučují kombinaci chirurgického zákroku a antibiotické terapie beta-laktamy (parenterálně) a fluorochinolony (parenterálně nebo perorálně). Na základě výsledků antibiogramu lze perorálně aplikovat také metronidazol. Během této studie bylo vykultivováno 6 multirezistentních aerobních bakterií. Většina těchto mikrobů, zejména Enterobacter cloacae, jsou významnými nosokomiálními patogeny zodpovědné za různé druhy infekcí včetně sepse, pneumonie, infekce kůže a měkkých tkání, artritid a osteomyelitid (Qureshi ZA, et al., 2011). Rezistence bakterií vůči antibiotikům je vážným problémem zejména v humánní medicíně. Z tohoto důvodu by se měly antibiotika volit pouze v indikovaných případech a cíleně. Poděkování Autoři děkují za zhotovení rentgenogramů a vyšetření pomocí CT Oddělení zobrazovacích metod Kliniky chorob psů a koček. Tato práce vznikla za podpory grantu IGA 28/2011/FVL.

Seznam literatury 1) Capello, V. Clinical technique: Treatment of periapical infections in pet rabbits and rodents. Journal of Exotic Pet Medicine, 2008, 17, 124-131. 2) Jekl, V., Hauptman, K., Knotek Z. Quantitative and qualitative assessments of intraoral lesions in 180 small herbivorous mammals. Veterinary Record, 2008, 162, 442-449. 3) Qureshi, Z. A., Paterson, D. L., Pakstis, D. L., a kol. Risk factors and outcome of extendedspectrum β-lactamase-producing Enterobacter cloacae bloodstream infections. International journal of antimicrobial agents, 2011, 37, 26-32. 4) Tyrrell, KL, Citron, DM, Jenkins, JR, a kol. Periodontal bacteria in rabbit mandibular and maxillary abscesses. Journal of Clinical Microbiology, 2002, 40, 1044-1047.

55

Volná nervová zakončení a ultrastruktura intraartikulárních vazů u psa Barbora Doškářová1, Michal Kyllar1, Hana Hlávková2, Anna Horáková2, Aneta Kasanová2 Ústav anatomie, histologie a embryologie, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno1, studentka 3. ročníku magisterského studijního programu, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno2 Úvod Mechanické vlastnosti vazů jsou závislé na jejich složení a struktuře.1 V posledním desetiletí se upouští od myšlenky, že vazový aparát je jen statický systém, který limituje pohyb kloubů a přechází se k funkčnímu/biomechanickému náhledu, kde jsou jednotlivé součásti kloubu v interakci a reflexně přes nervová zakončení se ovlivňuje aktivní aparát kloubu – svalové skupiny.2,3 Cílem této studie bylo zhodnotit ultrastrukturu vybraných intraartikulárních vazů u psa. Materiály a metodika V rámci studie bylo získáno 10 vazů z kyčelního kloubu (ligamentum capitis femoris, LCF) a 42 (ligamentum cruciatum craniale, LCCr), resp. 40 (ligamentum cruciatum caudale, LCCd) vazů z kloubu kolenního psů utracených z důvodů nesouvisejících s touto studií. Vyloučeni byli psi se známým předchozím traumatem vyšetřované končetiny nebo předchozí operací kolenního nebo kyčelního kloubu. Před odběrem zkřížených vazů byl vždy kolenní kloub zrentgenován v mediolaterální projekci a na bočním snímku kolene byl změřen úhel sklonu tibiálního plata (TPA). Vzorky vazů byly odebrány spolu s jejich odstupy a úpony pro zajištění zhodnocení celého vazu a možnosti určení odstupu a úponu a fixovány ve 4% roztoku formaldehydu. Pak byly připraveny pro klasickou světelnou mikroskopii a pro imunohistochemické vyšetření zalitím do parafínu. Z každého z ligament byly zhotoveny longitudinální řezy o tloušťce 4 µm a to vždy v proximální, mediální a distální části vazu sériovými řezy. Pro histologické vyšetření světelnou mikroskopií bylo použito barvení hematoxylin-eosinem (HE) pro běžné posouzení buněčné populace vazů a alciánová modř/PAS pro kvantifikaci mukopolysacharidů (GAG). Imunohistochemické vyšetření bylo provedeno s využitím polyklonálních protilátek proti S-100 proteinu, jimiž měla být označena volná nervová zakončení v intraartikulárních vazech u psa, jež bylo cílem identifikovat. Prvními provedenými imunohistochemickými reakcemi byla ale zjištěna afinita protilátek proti S-100 proteinu k metaplastickým fibrocytům. Další imunohistochemické

56

protokoly se zabývaly reakcí vzorků s polyklonálními protilátkami proti neurofilamentům a MMP2 (matrix metaloproteináza 2). Pozitivní imunoreaktivita byla vyhodnocena pomocí DAB. Výsledky imunohostochemických a histologických vzorků byly porovnány mezi jednotlivými vazy navzájem a v závislosti na věku, váze a pohlaví psa. Výsledky Ultrastruktura jednotlivých LCCr hodnocených světelnou mikroskopií po obarvení hematoxilin eosinem (HE) a alciánovou modří (AC-PAS) vykazovala výrazně odlišnou strukturu, která přímo korelovala se stupněm TPA a nebyla zaznemenána ani u LCCd, ani u LCF. Sklon naměřených TPA byl v rozpětí 20° až 36°. V rámci naměřených úhlů nebyly zjištěny rozdíly mezi věkovými a váhovými kategoriemi, ani pohlavími. Při TPA do 24° měly přední zkřížené vazy klasickou stavbu ligamenta. Jednalo se o normální vazivovou tkáň s paralelně situovanými kolagenními vlákny, s minimálním množstvím extracelulární amorfní hmoty a s fibrocyty rovnoměrně distribuovanými v rámci struktury vazu a jádrem typického vřetenovitého tvaru. Barvení AC-PAS bylo slabé poukazující na minimální výskyt glykosaminoglykanů (GAG) v mezibuněčné hmotě. Tato standardní struktura byla zaznamenána i u téměř všech vzorků zadního zkříženého vazu a vazů hlavičky stehenní kosti. U vzorků vazů (LCCr) z kolenních kloubů s TPA od 25° do 30° se objevila nerovnoměrná distribuce fibrocytů vytvářejících shluky. Jádra fibrocytů byla více oválného tvaru, zakulacovala se a kolem některých z nich se vyskytovalo perinukleární prosvětlení („perinuklear halo“). Tyto fibrocyty pak vykazovaly přeměnu v chondrocytům podobné buňky. AC-PAS prokázalo zvýšené barvení mezibuněčné hmoty - zvýšená deposita extracelulární matrix ve vazech. Při TPA vyšším než 30° přední zkřížené vazy ztrácely svou typickou strukturu. Kolagenní vlákna byla neuspořádaná. Fibrocyty v nich vykazovaly metaplazii v chondrocytům podobné buňky uspořádané v některých oblastech v trámce nebo isogenetické skupiny typické pro chrupavku. Tyto změny byly zejména ve střední části vazu. Vaz vykazoval výraznou afinitu k barvení AC-PAS. Imunohistochemické barvení pro S-100 protein mělo výraznou afinitu právě k LCCr z kolenních kloubů s TPA>30° a vykazovalo tedy výraznou korelaci se sklonem kloubní plochy holenní kosti. Imunohistochemické vyšetření s protilátkami proti S-100 proteinu prokázalo u zkřížených vazů zejména pozitivitu na metaplastické fibrocyty a jen v malé míře byla identifikována volná nervová

57

zakončení. Protilátky proti MMP-2 reagovaly pozitivně pouze u vzorků s vysokým stupněm metaplazie a vysokým TPA. Protokoly používající protilátku proti neurofilamentům byly negativní. Hodnocením vzorků LCCd se v 75%-tech zjistila normální struktura charakteristická pro vaz. Nebyla prokázána závislost ultrastruktury vazu na TPA. U deseti vzorků LCCd jsme pozorovali zakulacení jader fibrocytů a zvýšené barvení AC-PAS. Reaktivita s protilátkami proti S-100 proteinu byla výrazně pozitivní pouze u dvou vzorků, kde se objevila metaplazie fibrocytů. Imunoreaktivita pro MMP-2 a neurofilamenta byla negativní. Vzorky LCF nevykazovaly žádné metaplastické změny. Klasická struktura vazu byla zachována. Imunohistochemické vyšetření s protilátkami proti S-100 proteinu bylo u všech vzorků jen slabě pozitivní. Prokázalo přítomnost volných nervových zakončení typu IVa (nemyelinizovaná FNE přenášející informace o bolesti a zánětu - reflexogenní funkce, nocicepce) ve všech odebraných vzorcích LCF a to mnohem vyšší než v LCCr a LCCd. Frekvence výskytu byla 6-81 FNE/100 mm2. Imunoreaktivita pro MMP-2 a neurofilamenta byla negativní. Závěr Pozitivní imunohistochemické barvení s protilátkami proti S-100 proteinu na změněných fibrocytech potvrzuje metaplazii fibrocytů v chondrocyty, které vytvářejí mezibuněčnou hmotu charakteristickou pro fibrózní chrupavku a bohatou na GAG a to zejména ve středu těchto vazů.4 Dochází i ke kompletní přestavbě kolagenních vláken. Tato metaplazie je podle našeho názoru odezvou na přetěžování a nadměrnou zátěž na vaz v důsledku nadměrného sklonu tibiálního plata (TPA). Vytvořené okrsky fibrózní chrupavky jsou sice odolné vůči kompresním silám, ale mají minimální odolnost vůči silám tenzním.5 Takto patologicky změněný vaz je pak náchylnější k ruptuře. Ve všech vazech byla nalezena pouze volná nervová zakončení typu IVa, nikoli mechanoreceptory typu I (Ruffiniho tělíska), II (Paciniho tělíska) nebo III (Golgiho tělíska). Přesná role kloubních receptorů není stále úplně jasná, ale informace o výskytu, typu a hustotě volných nervových zakončení v jednotlivých částech intraartikulárních vazů může pomoct objasnit schopnost propriocepce těchto vazů, jejich úlohu při prevenci nadměrného zatížení kloubu a jejich případnou predispozici k ruptuře. 6

58

Seznam literatury 1) FRANK, C. B., HART, D. A., SHRIVE, N. G. Molecular biology and biomechanics of normal and healing ligaments-a review. Osteoarthritis and Cartilage, 1999, vol. 7, s. 130140. 2) HALATA, Y., HAAS, J. The ultrastructure of sensory nerve endings in human anterior cruciate ligament. Anatomy and Embryology, 1989, vol. 179, s. 415-442. 3) LEUNIG, M., BECK, M., STAUFFER, E., HERTEL, R., GANZ, R. Free nerve endings in the ligamentum capitis femoris. Acta Orthopaedica Scandinavica, 2000, vol. 71, s. 452-454. 4) WREN, T. A. L., BAUPRE, G. S., CARTER, D. R. Mechanobiology of tendon adaptation to compressive loading through fibrocartilaginous metaplasia. Journal of Rehabilitaion Research and Development, 2000, vol. 37, s. 135-143. 5) BENJAMIN, M., RALPHS, J. R. Fibrocartilage in tendons and ligaments – an adaptation to compressive load. Journal of Anatomy, 1998, vol. 193, s. 481-494. 6) ARCAND, M. A., RHALMI, S., RIVARD, C. - H. Quantification of mechanoreceptors in the canine anterior cruciate ligament. International Orthopaedics, 2000, vol. 24, s. 272-275.

59

Matematický model mechanického testování fixace segmentálního defektu femuru 4,5mm LCP 1

1

Iva Blažek-Fialová , Robert Srnec , Pavel Proks2, Lucie Urbanová1,Alena Štokrová3 Robert Snášil3, Alois Nečas1 1

Oddělení chirurgie a ortopedie KCHPK, Fakulta veterinárního lékařství, VFU Brno

2

Oddělení zobrazovacích metod KCHPK, Fakulta veterinárního lékařství, VFU Brno 3

Student, Fakulta veterinárního lékařství, VFU Brno Úvod

V návaznosti na naše dřívější práce, kde jsme se, v souvislosti s hojením kostních lézí transplantací mezenchymových kmenových buněk (MSCs), zabývali mechanickými vlastnostmi LCP („Locking Compression Plate“ = zámková kompresní ploténka) (Synthes®) použité ke stabilizaci těchto defektů kostí (Necas et al., 2010a; Necas et al., 2010b; Urbanova et al., 2010), jsme se v této studii zaměřili na ověření možnosti náhrady mechanických testů matematickými modely. Mechanické testování jsme v předchozí studii provedli na zkušebním stroji ZWICK Z 020-TND (Urbanova et al. 2010). Toto testování však bylo velice časově a materiálově náročné, proto jsme se pokusili celou problematiku převézt do roviny počítačového modelování. Cílem bylo vytvořit matematický model konstrukce kost-implantát (KKI), který by definovanými vlastnostmi odpovídal reálné konstrukci použité k mechanickému testování, a porovnat výsledky matematického modelování s výsledky předchozích mechanických testů. Materiál a metodika Předlohou pro matematický model byly jednak reálné vzorky pravých femurů miniaturních prasat (použitých ve studii hojení segmentálního defektu levého femuru transplantací MSCs (projektu NPV II 2B06130), a jednak trojrozměrné reformáty konstrukce kost-implantát vytvořené computerovou tomografií na oddělení zobrazovacích metod KCHPK VFU Brno. Femury byly vypreparovány po lege artis eutanazii miniaturních prasat. V jejich diafýze byl vytvořen segmentální ostektomický defekt, který byl následně přemostěn pětiděrovou titanovou 4,5mm LCP se čtyřmi zámkovými šrouby. Konstrukce byla na proximálním a distálním konci femuru opatřena bloky polymethylmetakrylátu (PMMA) umožňujícími její upnutí do zkušebního stroje (Urbanova et al., 2010). Takto připravená konstrukce kost-implantát (včetně upínacího zařízení pro mechanické testování) byla předána na VUT v Brně k dalšímu grafickému zpracování a numerickému modelování.

60

Po provedení segmentace, vektorizace a vyhlazení tkání byl 3D geometrický vektorový model konstrukce

kost-implantát

(http://www.cz.rhino3d.com).

importován V tomto

do

3D

systému

CAD

byl

systému

pomocí

Rhinoceros

NURBS

ploch

(http://www.rhino3d.com/nurbs.htm) vytvořen uzavřený objemový 3D geometrický model soustavy včetně vnitřních anatomických struktur femuru. Prostorový geometrický model byl importován pomocí SAT formátu do výpočtového systému ANSYS (http://www.ansys.com/), který při analýze využívá deformační variantu metody konečných prvků. Při analýze chování soustavy při zatížení silami působícími paralelně s dlouhou osou soustavy, byly zohledněny deformace, kdy byly podmínky rovnováhy sestavovány na deformované konstrukci. Do úvahy bylo vzato materiálově nelineární chování konstrukce kost-implantát, kdy po dosažení hodnoty napětí na mezi kluzu vznikají nevratné plastické deformace materiálu. Matematický model konstrukce byl následně zatížen ve směru S-I (paralelně s dlouhou osou konstrukce). Matematickým modelováním byla vytvořena detailní studie průběhu ekvivalentního von Misesova napětí SEQV na LCP (která byla součástí testovaného modelu KKI) a bylo stanoveno napětí na mezi kluzu, při němž dochází k nevratné plastické deformaci materiálu. Výsledky Z vektorového posunu jednotlivých bodů konstrukce (obr. 1) je patrné, že k největšímu účinku působení sil zátěže na matematický model kost-implantát dochází v úsecích kosti, které jsou v těsné blízkosti ostektomického defektu, a

v části implantátu, která

přemosťuje osteotomii femuru (v místě centrálního otvoru LCP nevyplněného šroubem). Průběh ekvivalentního von Misesova napětí SEQV (obr. 2) na LCP, jakožto součásti testovaného modelu KKI, ukázal, že k největším změnám

napětí

došlo

v

místě

centrálního

otvoru

LCP

nevyplněného šroubem, přičemž rozložení tohoto napětí bylo relativně souměrné po obou stranách otvoru. Ke vzniku nevratných plastických deformací, resp. překročení napětí na mezi

Obr. 1: Celkové vektorové posunutí USUM [mm] při působení zatížení 1.05 kN.

kluzu na LCP, došlo v uvedené oblasti LCP při působení 12 přírůstků zatížení, tj. při působení síly o velikosti 360 N. Na obr. 2 je zobrazen postupný vývoj plastizování LCP při uvažování barevné škály v intervalu 0 až 480 MPa, což odpovídá hodnotě napětí na mezi kluzu. Oblasti modelu LCP implantátu, ve kterých došlo k překročení napětí na mezi kluzu (plastická deformace materiálu) jsou vyznačeny šedě (obr. 2).

61

Závěry Změny napětí a výsledné deformace konstrukce kost-implantát v tomto matematickém modelu, znázorněné změnám

barevnou

napětí

a

škálou,

deformacím

odpovídaly KKI

při

předchozích mechanických testech, čímž byla ověřena správnost a vhodnost parametrů Obr. 2: Ekvivalentní von Misesovo napětí zadaných při tvorbě tohoto matematického SEQV [MPa] v LCP při působení zatížení o modelu KKI. velikosti 360 N (a), 480 N (b), 600 N (c), 720 N (d), 840 vhodný N (e) a 1200 N (f) v intervalu Byl vytvořen matematický model 0konstrukce kost-implantát, který bude možno dále využívat pro matematickou modelaci zatížení podobných konstrukcí, využívaných v klinické praxi i v experimentu, silami o různých velikostech a působících komplexně v různých směrech tak, aby bylo možno computerově co nejpřesněji modelovat reálné působení sil na implantáty použité k fixaci kostních defektů in vivo. Poděkování Tato práce vznikla za podpory grantové agentury IGA VFU Brno (Projekt 31/2011/FVL) a za podpory MŠMT České republiky (Výzkumný projekt NPV II 2B06130).

Literatura 1) ANSYS [online]. 2011 [cit. 2011-11-24]. ANSYS Mechanical Structural Linear or Nonlinear & Dynamics Analysis. Available from WWW: . 2) NECAS, A., PROKS, P., URBANOVA, L., SRNEC, R., STEHLIK, L., CRHA, M., RAUSER, P., PLANKA, L., JANOVEC, J., DVORAK, M., et al. (2010a). Healing of Large Segmental Bone Defect after Implantation of Autogenous Cancellous Bone Graft in Comparison to Hydroxyapatite and 0.5% Collagen Scaffold Combined with Mesenchymal Stem Cells. Acta Vet Brno 79, 607-612. 3) NECAS, A., URBANOVA, L., FURST, T., ZENCAK, P., AND TUCEK, P. (2010b). Mathematical Modelling of Crack Fractography after Implant Failure of Titanium 4.5 LCP Used for Flexible Bridging Osteosynthesis in a Miniature Pig. Acta Vet Brno 79, 621-627. 4) URBANOVA, L., SRNEC, R., PROKS, P., STEHLIK, L., FLORIAN, Z., NAVRAT, T., AND NECAS, A. (2010). Comparison of the Resistance to Bending Forces of the 4.5 LCP Plate-rod Construct and of 4.5 LCP Alone Applied to Segmental Femoral Defects in Miniature Pigs. Acta Vet Brno 79, 613-620. 5) Rhinoceros NURBS modelling for Windows [online]. 2010 [cit. 2011-11-24]. Modeling tools for designers. Available from WWW: . 6) Rhinoceros NURBS modelling for Windows [online]. 2010 [cit. 2011-11-24]. Rhinoceros - What is NURBS?. Available from WWW:

62

Příspěvky Fakulty veterinární hygieny a ekologie

63

64

Stanovení obsahu jódu ve skupině masných výrobků typu „fermentovaná masa“ pořízených na trhu ČR Pavla Steinhauserová1, Jiří Ruprich1,2 Ústav hygieny a technologie mléka1, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Centrum zdraví, výživy a potravin Brno, Státní zdravotní ústav Praha2 Úvod Jódový deficit je intenzivně řešený problém nejen v Evropských zemích ale na celém světě [1, 2]. Nejrozšířenější a nejlepší strategií zajištění požadovaného množství jódu (I) v populaci je obohacování soli [2, 3]. Jódovaná sůl je běžně používána v domácnostech, i při výrobě potravin. Zpracované potraviny však

tvoří dle Vědeckého poradního výboru pro výživu (SACN) ze 70 – 75% hlavní zdroj sodíku (Na) v dietě populace, masné výrobky (MV) zatupují po cereáliích a jejich produktech druhé místo (21 30 % denního přívodu Na) [4]. Nadměrný přívod Na v dietě způsobuje vysoký krevní tlak patřící mezi hlavní rizikové faktory vzniku ischemické choroby srdeční, cévních mozkových příhod a onemocnění ledvin, představující hlavní příčiny morbidity i mortality v Evropě [1, 4 a 5]. Dle Evropského úřadu pro bezpečnost potravin (EFSA) přijímá evropská populace denně 3-5 g Na, což překračuje denní doporučenou dávku 1,5 g/Na/os./den [1]. Omezení přívodu Na v populaci je cílem jak na národní, tak mezinárodní úrovni. Tento zásah však může ovlivnit i množství přívodu I populací. Jde tedy

o velmi komplikovanou problematiku. Vzhledem k tomu, jak zásadním zdrojem soli MV v dietě populace jsou, je a byla možnost užití jódované soli či fortifikace MV různými nosiči I (např. pšeničné vlákniny či sójového izolátu) v masném průmyslu několikrát zkoumána [6 a 7]. Ne u všech MV však technologie jejich výroby tento proces dovoluje. U sledované skupiny fermentovaných sušených mas byla zjištěna relativní stabilita I (vzhledem k příznivým podmínkám jejich výroby) a tedy i poměrně vysoká potenciální možnost jejich fortifikace jodizovanou solí [6]. V současné práci jsme navázali na předešlý projekt (IGA č. 69/2010/FVHE). V masném průmyslu není používání jódované soli povinné. Zajímalo nás tedy, jaký podíl těchto produktů vyskytující se na trhu ČR mají v technologii výroby použitou sůl jodovanou a mohou tak hrát roli jako dietární i expoziční zdroj nejenom Na, ale i I v populaci ČR. A existují-li rozdíly v jejich obsahu u dané skupiny MV produkovaných v různých státech EU.

Materiál Z předešlého projektu IGA 69/2010 FVHE bylo použito celkem 24 MV typu fermentovaná sušená masa. V měsících červen až srpen roku 2011 byl opětovně proveden průzkum trhu ČR a byly dokoupeny nově se vyskytující MV této skupiny (celkem 12). Veškeré MV byly pořízeny v celkem 9ti hlavních obchodních

řetězcích na trhu a byly vyrobeny v těchto zemích: Česká republika (5), Belgie (1), Francie (2), Itálie (9), Německo (5), Rakousko (2), Slovenská republika (1), Slovinsko (1) a Španělsko (10).

65

Metodika Nově zakoupené vzorky byly ihned transportovány na Státní zdravotní ústav v Brně, do akreditované laboratoře dle ČSN ISO standardu ISO/IEC 17025 pro všechny potřebné analýzy. Vzorky byly skladovány při 0-4 °C a homogenizovány v přístroji Grindomix (120 s, 3 000 ot./min). Společně

se vzorky z předešlého roku byly do počátku analýz Na/I skladovány při teplotě -18 °C. Analýza Na: Pro stanovení obsahu Na byla použita akreditovaná metoda AAS-FT. Asi 1 g homogenizovaného vzorku byl smíchán s 6 ml HNO3 a 1 ml H2O2 a byl proveden jeho rozklad v uzavřeném mikrovlnném systému ETHOS (Milestone, Itálie). Po následném smísení s roztokem 0,2% KCl (FIAS 400, Perkin-Elmer) byl zmlžován do plamene acelylen-vzduch. Na spektrometru AAS 3300 Perkin-Elmer byla měřena jeho emise při vlnové délce 589,6 nm. Analýza I: Asi 1 g homogenizovaného vzorku byl smíchán s 1 ml H2O, 2 ml 2 M KOH, 1 ml 10% ZnSO4 a KCl2O5. Vzorek byl následně vysušen při teplotě 105 °C a spálen v muflové peci při kontinuálně se zvyšující teplotě 0–600 °C. Popel byl smíchán s 6 ml H2O a centrifugován (10 min, 2 500 ot./min). Následně bylo provedeno spektrofotometrické stanovení založené na oxido-redukční katalytické reakci dle Sandell-Kolthoffa. Reakce byla ukončena přídavkem brucinu a barevnou změnou. Absorbance byla měřena na spektrometru Spekol 11 (Carl Zeiss Jena) při vlnové délce 430 nm. Výsledky (1 vzorek = 3 paralelní měření) byly hodnoceny běžnými statistickými metodami. Výsledky a závěr Na 10/36 analyzovaných MV nebyla uvedena žádná informace o množství soli/Na. Pouze 4/36 MV měly uvedené množství Na (3 MV z ČR, 1 z Itálie). U všech těchto MV bylo detekované množství nižší, než deklarované na obalu. Pouze na 2 MV byla uvedena informace o použití jodované jedlé soli, ne však o jeho množství (Selská šunka, Německo: 1040 µg/kg a Ardénská šunka, Belgie: 53 µg/kg). Selská šunka byla ze všech analyzovaných MV největším zdrojem I, nebyla však zároveň největším zdrojem Na (18,6 g/kg). Z výsledků těchto dvou MV lze usuzovat, že informace o použití jodované soli ještě neznamená, že je tento MV jeho bohatým zdrojem. Na jednom z analyzovaných MV byla uvedena informace o použití soli mořské (Tyrolská šunka, Rakousko: 29 µg/kg I). Tento MV není opět jeho bohatým zdrojem, i když uvedená deklarace o použití mořské soli by na toto mohla záměrně poukazovat. Z výsledků (tabulka č. 1) nelze konstatovat, že by producenti MV některých států EU používaly pouze jodizovanou sůl. Naopak, množství I v MV ve státech, jako je např. Německo a Španělsko bylo detekováno ve velmi širokém rozmezí. Typické španělské iberské a seránské šunky měly velmi nízké množství I (21-28 µg/kg) a naopak relativně vysoké množství Na (13-20 g/kg). Naopak v ČR, kde není tento typ MV dlouhodobě tradičně vyráběn, byly ve všech

66

měřených MV detekovány relativně vysoké a konzistentnější hodnoty I (570-836 µg/kg). Tyto MV mohou být tedy vnímány jako relativně bohatý expoziční zdroj nejen Na, ale i I v dietě populace. Tabulka č. 1 – Rozmezí naměřených hodnot Na a I u jednotlivých MV různé produkce Skupina MV

Fermentovaná sušená masa

Stát produkce

Počet Rozmezí naměřeného vzorků sodíku (g/kg vzorku) Česká republika 5 11,0 - 22,8 Španělsko 10 13,0 - 20,4 Itálie 9 9,1 - 22,5 Francie 2 15,55 - 15,7 Německo 5 13,8 - 22,2 Slovenská republika 1 11,8 Slovinsko 1 15,4 Rakousko 2 12,8 - 12,9 Belgie 1 22,1 Celkem analyzovaných vzorků = 36

Rozmezí naměřeného jódu (µg/kg vzorku) 570 - 836 < 15 - 590 < 15 - 50 < 15 < 15 - 1014 63 50 29 - 65 53

Poděkování Práce byla podpořena finančními prostředky IGA VFU, projekt č. 69/2011/FVHE. Analýzy byly provedeny díky laskavé spolupráci s pracovníky SZÚ – Janou Řehákovou a Radkem Kavříkem. Použitá literatura 1) EFSA Panel on Dietetic Products, Nutrition, Allergies (NDA), Tolerable upper intake levels for vitamins and minerals. EFSA, February 2006, ISBN: 92-9199-014-0. 2) WHO (World Health Organisation). Assessment of iodine deficiency disorders and monitoring their elimination, A guide for programme managers, 3thedition (2007). ISBN 978-92-4159582-7, WHO, Geneva. 3) Benoist, B., McLean, E., Andersson, M., Gogers, L. Iodine deficiency in 2007 Global progress since 2003 (2008). In: Food and Nutrition Bulletin, vol. 29, no. 3, p. 195-202. 4) SACN (Scientific Advisory Committee on Nutrition), 2003. Salt and Health. The Stationery Office. ISBN: 0-11-243075-9. 5) WHO/FAO (World Health Organisation/Food and Agriculture Organisation), 2003. Expert Report: Diet, nutrition and prevention of chronic diseases. Report of a Joint WHO/FAO Experts Consultation. WHO Technical Report Series 916. ISBN: 92-4-120-916-X. 6) Ciriano, M.G., Larequi, E., Rehecho, S. et al. Selenium, iodine, ω-3 PUFA and natural antioxidant from Melissa officinalis: A combination of components from healthier dry fermented sausages formulation (2010). In: Meat Science, vol. 85, s. 274-279. 7) Waszkowiak, K., Szymandera-Buszka, K. The application of wheat fibre and soy isolate impregnated with iodine salts to fortify processed meats (2008). In: Meat Science, vol. 80, s. 1340-1344.

67

Nová elektrochemická metoda pro stanovení akrylamidu v potravinách a krmivech Helena Veselá, Emanuel Šucman Ústav biochemie, chemie a biofyziky, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Akrylamid je sloučenina, která se používá v chemickém, stavebním, kosmetickém a papírenském průmyslu. Používá se i v laboratořích k výrobě polyakrylamidového gelu pro elektroforézu. Je také jednou z karcinogenních složek cigaretového kouře.1 V roce 2002 byla prokázána přítomnost této látky v potravinách, kde vzniká působením vysokých teplot tzv. Maillardovou reakcí, při které reagují aminokyseliny s karbonylovými skupinami sacharidů. Největší koncentrace akrylamidu byly zjištěny u smažených potravin (brambůrky, hranolky), dále v pečených potravinách (chléb, sušenky). Ve vařených potravinách nebyl akrylamid nalezen.2 Akrylamid je látka s neurotoxickými a mutagenními účinky, je prokázán jeho karcinogenní účinek u laboratorních zvířat. Dle Mezinárodní agentury pro výzkum rakoviny (IARC) je zařazen do skupiny 2A (pravděpodobně karcinogenní pro člověka).3 Pro stanovení akrylamidu v potravinách se běžně používají separační metody, zejména plynová chromatografie s hmotnostní spektrometrií (GC-MS) a vysoce účinná kapalinová chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií (HPLC-MS/MS). Popsány byly i metody elektromigrační a enzymatické.4, 5 Cílem naší práce bylo vytvořit metodiku pro elektrochemické stanovení akrylamidu v potravinách a krmivech, najít optimální podmínky a parametry metody, včetně přípravy vzorků pro voltametrické měření. Materiál a metoda Veškerá

měření

byla

prováděna

na

zařízení

Autolab

(Eco

Chemie,

Holandsko),

s elektrodovým systémem VA Stand 663 (Metrohm, Švýcarsko) v 3-elektrodovém zapojení s pracovní visící rtuťovou kapkovou elektrodou, s referentní argentochloridovou elektrodou a pomocnou uhlíkovou elektrodou. Celé zařízení bylo řízeno softwarem Nova 1.5 (Eco Chemie. Holandsko). Na přípravu všech roztoků byla použita ultračistá voda, jejíž specifická vodivost je menší než 1 μS.m-1. Rtuť byla v čistotě pro polarografii (Merck, SRN). Pro plnění referentní elektrody

68

(Ag/AgCl) sloužil roztok KCl o koncentraci 3 mol/l nasycený AgCl (ORION research Inc., USA). Jako standard Ni2+ byl použit roztok Astasol o koncentraci 1,000 ± 0,005 g/l (Analytika, ČR). Všechny ostatní použité chemikálie byly čistoty Suprapur (Merck, SRN). Pro odstranění rozpuštěného kyslíku se používal stlačený argon 4.6 UN 1006, GA260 (Linde Technoplyn a.s., ČR). K ověření funkčnosti metody byl použit referenční materiál Crispbread (European Reference Material ERM®-BD272, SRN). Měřené vzorky byly bramborové lupínky a granule pro psy, běžně dostupné v tržní síti. V amoniakálních pufru o různém pH bylo za přítomnosti standardního roztoku akrylamidu proměřeno elektrochemické chování vybraných přechodných kovů (Zn2+, Co2+, Cu2+, Fe2+, Ag+). Při době elektrodepozice 120 s a 300 s jsme proměřili následující rozmezí pH: 8,5; 9,0; 9,5; 10,0 a 10,5 a hledali nejvhodnější koncentraci vybraného přechodného kovu pro tvorbu komplexu s akrylamidem, a to v rozmezí 50 mol/l až 500 mol/l. Koncentrace standardu akrylamidu byla 10 mol/l. Po optimalizaci metody jsme hledali nejlepší podmínky přípravy vzorků pro voltmetrické stanovení. Bramborové lupínky byly nadrceny v achátové misce a extrahovány ve směsi vody a alkoholu. Byly testovány různé alkoholy (metanol, etanol, propanol) a různé poměry vody a alkoholu v extrakčním roztoku. Dále se zkoumalo pH extrakční směsi přidáním kyseliny chlorovodíkové o různých koncentracích. V konečné fázi přípravy byly vzorky vloženy na 1 hodinu do ultrazvukové vodní lázně (Sonic 10, Polsonic, Polsko) a následně odstřeďovány po dobu 20 minut při 4000 otáčkách za minutu (Table Top Centrifuge Z 300, HERMLE Labortechnik GmbH, SRN). Pro měření se používalo 200 µl extraktu vzorku. Všechny vzorky byly proměřeny metodou adsorptivní diferenční pulzní voltametrie v amoniakálním pufru za přítomností iontů niklu. Voltamogramy byly zaznamenány od počátečního potenciálu -0,72 V ke koncovému potenciálu -0,05 V, při rychlosti změny potenciálu 5 mV/s a době elektrodepozice 300 s. Pro vyhodnocení voltamogramů byla použita metoda standardního přídavku. Diskuze a výsledky Z přechodných kovů byla nejlepší odezva signálu zaznamenána u niklu. Pro voltametrické měření se ukázalo pH= 9,5 amoniakálního pufru jako nejvhodnější. Při tomto pH vytvářel akrylamid v komplexu s ionty niklu o koncentraci 500 μmol/l dobře patrný pík s maximem výšky v potenciálové oblasti -0,30 V. Výška maxima píku vzrůstala se zvyšující se koncentrací

69

akrylamidu v měřeném roztoku a se zvyšující se dobou elektrodepozice. Byly nalezeny tyto optimální hodnoty: počáteční potenciál Ei=-0,72 V a koncový potenciál Ef=-0,05 V. Rychlost změny potenciálu při přechodu od Ei po Ef byla SR=5 mV/s. K přípravě vzorků se ukázala jako nejvhodnější extrakční směs složená z vody a etanolu v poměru 2:1 s přídavkem kyseliny chlorovodíkové, která upravila výsledné pH na hodnotu pH=1,38. Metanol není vhodný jako extrakční činidlo díky své vysoké polaritě. Po extrakci vzorku v propanolu se na voltamogramu neobjevil pík akrylamidu. Ve vzorcích bramborových lupínků jsme naměřili průměrné hodnoty akrylamidu 1000 μg/kg, což jsou koncentrace odpovídající naměřeným hodnotám pomocí chromatografických metod. Naměřené hodnoty referenčního materiálu odpovídaly údajům v certifikačním listu. Technologie výroby granulovaných krmiv pro zvířata ukazuje na možnost přítomnosti akrylamidu i v této komoditě. Naše měření potvrdila výskyt akrylamidu v krmivech pro psy. Závěr Naše výsledky ukazují, že voltmetrická metoda je vhodná pro stanovení akrylamidu v potravinách a krmivech. Extrakce vzorků ve vodě a alkoholu v kyselém prostředí je vyhovující pro elektrochemickou analýzu. Námi naměřené koncentrace akrylamidu ve vzorcích odpovídají hodnotám uvedených v literatuře. Seznam literatury 1) TAEYMANS, D., et al. A review of acrylamide: An industry perspective on research, analysis, formation, and control. Critical rewiews in food and nutrition, 2004, vol. 44, p. 323-347 2) BECALSKI, A., et al. Acrylamide in foods: Occurrence, sourses, and modeling. Journal of agricultural and food chemistry, January 2003, vol. 51, p. 802-808. 3) CAPUANO, E.; FOGLIANO, V. Acrylamide and 5-hydroxymethylfurfural (HMF): A review on metabolism, toxicity, occurrence in food and mitigation strategies. LWT – Food Scienceand Technology, 2011, vol. 44, p. 793-810. 4) KERAMAT, J. et al. Acrylamide in Foods: Chemistry and Analysis. A Review. Food and bioprocess technology, 2011, vol.4, no.3, p.340-363 5) CHEN, QD.; ZHAO, WF.; FUNG, YS. Determination of acrylamide in potato crisps by capillary electrophoresis with quantum dot-mediated LIF detection. Electrophoresis, 2011, vol.32, p. 1252-1257

70

Výskyt původce chytridiomykózy u obojživelníků Kamerunu Vojtech Baláž1, Václav Gvoždík2, Ivan Literák1 Ústav biologie a chorob volně žijících zvířat, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno1, Národní muzeum, Praha2 Úvod Batrachochytrium dendrobatidis je parazitický druh houby patřící do primitivní skupiny Chytridiomycota, který u obojživelníků způsobuje nemoc chytridiomykózu. Tento patogen je považován za příčinu vyhynutí desítek druhů žab v Austrálii a Americe (Berger et al. 1998; Lips et al. 2005). B. dendrobatidis má širokou hostitelskou specifitu, pro mnohé druhy je silně patogenní a v současné době patrně dosahuje globálního rozšíření (Fisher et al. 2009). Z pohledu ochrany přírody a ohrožení druhové pestrosti je považován za nejnebezpečnější patogen volně žijících živočichů současnosti (Blaustein and Dobson 2006). B. dendrobatidis byla po světě rozšířena lidskou činností v průběhu dvacátého století (Morehouse et al. 2003; Morgan et al. 2007). Názory na geografický původ této mykózy se liší. Možným zdrojem B. dendrobatidis jsou africké drápatky rodu Xenopus využívané v biologickém a medicínském výzkumu. Pro hypotézu afrického původu svědčí nálezy pozitivních obojživelníků v muzejních sbírkách z třicátých let 20. století. Dosud nejstarší potvrzený záznam B. dendrobatidis z Afriky je z drápatky původem z Kamerunu (Soto-Azat et al. 2009). V recentních populacích z dané oblasti ale přítomnost B. dendrobatidis dosud nebyla potvrzena. Cílem práce bylo zjištění přítomnosti a prevalence B. dendrobatidis u obojživelníků z horských i nížinných oblastí Kamerunu a začlenění zjištěných dat do kontextu výzkumu B. dendrobatidis v Africe. Materiál a metodika Vzorky K dispozici byly dvě sady vzorků. První sada byla tvořena vzorky odebranými nedestruktivní metodou kožních stěrů ze živých obojživelníků pomocí DryswabTM MW100 (MWE Medical Wire) během výzkumného pobytu v Kamerunu v roce 2010 (104 ks). Druhá sada vzorků byla vytvořena z části muzejních sbírek obojživelníků původem z Kamerunu, které jsou v Národním muzeu v Praze. Jednalo se konkrétně o sběry z roku 2009 a počet vyšetřených jedinců byl 289. Vzorky z muzejních exemplářů byly odebírány pomocí mezizubních kartáčků OH 16D (Husch).

71

Izolace DNA DNA ze vzorků byla izolována pomocí izolační sady PrepMan® (Applied Biosystems) s homogenizací pomocí zirkon-silikátových keramických kuliček 0,4-0,6mm (Ginzel) v přístroji MagNA Lyser (Roche). Detekce B. dendrobatidis Detekce přítomnosti B. dendrobatidis ve vzorcích byla provedena pomocí real-time qPCR na přístroji LC480 I. (Roche) podle dříve publikované metody (Boyle et al. 2004; Garland et al. 2010). Reakční směs obsahovala Light Cycler Probes Master (Roche), specifické primery ITS a 5.8S rDNA, fluorescenční sondu TaqMan (Applied Biosystems) a bovinní sérum BSA (Sigma Aldrich). K vytvoření standardní křivky nezbytné ke kvantifikaci byly použity standardy DNA získané z kultur B. dendrobatidis, které nám byly poskytnuty z Institute of Zoology, Zoological Society of London. Vyhodnocení výsledků: Prevalence a její konfidenční intervaly byly spočítány pomocí programu Quantitative Parasitology verze 3.0. (Rozsa et al. 2000). Výsledky V první sadě vzorků jsme potvrdili výskyt B. dendrobatidis v současných populacích obojživelníků Kamerunu, v datovém vzorku 104 jedinců jsme zaznamenali jeden pozitivní exemplář (Phlyctimantis leonardi). Prevalence B. dendrobatidis podle našich prvních výsledků 1,0 % (95% Sterne's exact method confidence interval: 0.1 – 05,1 %) byla výrazně nižší, než v oblastech, ze kterých jsou známé masové úhyny. Druhá sada vzorků, z roku 2009, ukázala vyšší prevalence a zároveň i výrazně vyšší intenzitu infekce. Celkově jsme v sadě 289 vzorků zaznamenali 58 pozitivních jedinců, takže prevalence byla 20,0% (95% Sterne's exact method confidence interval 1-25%). Vzorky pocházely z 32 lokalit a zástupců čeledí Hyperoliidae, Petropedetidae, Phrynobatrachidae, Pipidae, Ptychadenidae, Ranidae a Rhacophoridae. Na základě toho, že nebyli zaznamenáni uhynulí ani evidentně nemocní jedinci a podle výsledků qPCR, kdy intenzita infekce pozitivních jedinců byla nízká až střední (hodnoty genomických ekvivalentů byly v řádech 101 až 103 a odpovídají chronickým nákazám), lze předpokládat, že výskyt B. dendrobatidis je už dlouhodobý a situace lze považovat za enzootii. Výskyt B. dendrobatidis v Kamerunu je ostrůvkovitý, z 32 lokalit byl potvrzen na devíti z nich.

Seznam literatury 1) BERGER, L., SPEARE, R., DASZAK, P., GREEN, D.E., et al. Chytridiomycosis causes amphibian mortality associated with population declines in the rain forests of Australia and

72

Central America. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1998, vol. 95, p. 9031-9036. 2) BLAUSTEIN, A.R. AND DOBSON, A. Extinctions: A message from the frogs. Nature, 2006, vol. 439, no. 7073, p. 143-144. 3) BOYLE, D.G., BOYLE, D.B., OLSEN, V., MORGAN, J.A.T. AND HYATT, A.D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms, 2004, vol. 60, no. 2, p. 141-148. 4) FISHER,

M.C.,

GARNER,

T.W.J.

AND

WALKER,

S.F.

Global

Emergence

of

Batrachochytrium dendrobatidis and amphibian chytridiomycosis in space, time, and host. Annual Reviews of Microbiology, 2009, vol. 63, p. 291-310. 5) GARLAND, S., BAKER, A., PHILLOTT, A.D. AND SKERRATT, L.F. BSA reduces inhibition in a TaqMan (R) assay for the detection of Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms, Nov 2010, vol. 92, no. 2-3, p. 113-116. 6) LIPS, K.R., BURROWES, P.A., MENDELSON, J.R. AND PARRA-OLEA, G. Amphibian declines in Latin America: Widespread population declines, extinctions, and impacts. Biotropica, Jun 2005, vol. 37, no. 2, p. 163-165. 7) MOREHOUSE, E.A., JAMES, T.Y., GANLEY, A.R.D., VILGALYS, R., BERGER, L., MURPHY, P.J. AND LONGCORE, J.E. Multilocus sequence typing suggests the chytrid pathogen of amphibians is a recently emerged clone. Molecular Ecology, 2003, vol. 12, no. 2, p. 395-403. 8) MORGAN, J.A.T., VREDENBURG, V.T., RACHOWICZ, L.J., et al. Population genetics of the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Aug 2007, vol. 104, no. 34, p. 13845-13850. 9) ROZSA, L., REICZIGEL, J. AND MAJOROS, G. Quantifying parasites in samples of hosts. Journal of Parasitology, 2000, vol. 86, p. 228-232. 10) SOTO-AZAT, C., CLARKE, B.T., POYNTON, J.C. AND CUNNINGHAM, A.A. Widespread historical presence of Batrachochytrium dendrobatidis in African pipid frogs. Diversity and Distributions, Jan 2009, vol. 16, no. 1, p. 126-131. Poznámka: Na základě výsledků ze vzorků z roku 2010 jsme připravili a zaslali článek „Presence of the chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis confirmed in contemporary amphibian populations of Cameroon, Africa“ (autoři Vojtech Baláž, Oldřich Kopecký a Václav Gvoždík) do časopisu Herpetological Journal.

73

Ektoparazité volně žijících ptáků v jižním Vietnamu Oldřich Sychra, Tomáš Najer, Filip Kounek Ústav biologie a chorob volně žijících zvířat, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Znalosti o celkové biodiverzitě v jihovýchodní Asii jsou i přes neustále se zvyšující množství výzkumů věnujících se této oblasti jen velmi kusé. Obecně se předpokládá, že ani problematika výskytu druhů volně žijících ptáků na území Vietnamu ještě není úplně zmapována, natož výskyt ektoparazitů (všenek, blech, dvoukřídlých) na těchto ptácích. Výskyt všenek u ptáků Vietnamu zatím nebyl mapován vůbec, údaje o možném výskytu všenek na zde žijících ptácích pochází z okolních zemí, kde se tyto druhy také vyskytují, popř. z chovů v zajetí (Price et al., 2003). První odchyty věnující se této problematice ve Vietnamu byly provedeny pracovníky Ústavu biologie a chorob volně žijících zvířat FVHE VFU Brno v letech 2008 a 2010 v severním Vietnamu, na území NP Ba Be a NP Cuc Phuong. Na těchto lokalitách byl i přes poměrně nízký počet odchycených ptáků nalezen relativně vysoký počet dosud nepopsaných druhů všenek a parazitohostitelských vazeb (Sychra et al., 2009). Materiál a metodika Vyšetřování ptáků a sběr ektoparazitů probíhal podle metodik uvedených v předchozích studiích podobného typu, zaměřených na jiné hostitele (např. Sychra et al., 2009). Metodika rámcově sestává z následujících kroků: odchyt volně žijících ptáků do nárazových sítí; určení odchycených ptáků do druhu (podle Robson, 2008), popř. určení pohlaví, stáří, zvážení, biometrie zobáku; sběr ektoparazitů podrobnou prohlídkou ptáků doplněnou metodou podle Clayton & Drown (2001); morfologické třídění získaných ektoparazitů do vyšších taxonomických kategorií, u všenek následné určení do rodů a druhů podle dostupné literatury (např. Uchida, 1948; Hellenthal & Price, 2003; Mey, 2004 and Sychra et al. 2009). Odchyt volně žijících ptáků v jižním Vietnamu proběhl ve dnech 9.–30. 9. 2011. První lokality se nacházely na území NP Cat Tien. S průměrnou nadmořskou výškou 119 m n. m. a zastoupením vodních ploch na území NP jsou lokality výzkumu srovnatelné s lokalitami v severním Vietnamu, na kterých probíhaly odchyty v minulých letech (Sychra et al. 2009). Odchyt trval dva týdny. Další odchyt proběhl na lokalitě v NP Binh Chau – Phuoc Buu ležícím na pacifickém pobřeží. Odchyt trval jeden týden.

74

Výsledky Celkem bylo odchyceno 190 ptáků 43 druhů v NP Cat Tien a 49 ptáků 18 druhů v NP Binh Chau – Phuoc Buu. Z odchycených ptáků bylo 212 ptáků 40 druhů pěvců (Passeriformes) a 27 ptáků 10 druhů z jiných řádů než pěvci. U celkem 122 ptáků (prevalence 51 %, n = 239) 32 druhů byli nalezeni tzv. péřoví roztoči (Psoroptidia); u 7 ptáků (3 %) 4 druhů byly zaznamenány trombikuly (Trombiculidae); u 6 ptáků (2,5 %) 4 druhů klíšťata a u 3 jedinců šámy bělořité (Copsychus malabaricus) (1 %) také roztoči rodu Bakericheyla. Z hmyzích ektoparazitů byl zaznamenán výskyt ptakotrudek (Hippoboscidae) a to u 18 ptáků (7,5 %) 9 druhů. Z celkem 52 ptáků (22 %) 20 druhů bylo získáno 406 všenek 10 rodů. Dominantním rodem byli luptouši rodu Myrsidea (dominance 32 %, n = 406). U dalších rodů byla zjištěna následující dominance: luptouši Menacanthus (26,8 %) a Meromenopon (2,5 %); péřovky Brueelia (22,4 %), Penenirmus (7,4 %), Meropoecus (3,7 %), Cuculicola (1,5 %), Philopterus (1,5 %), Alcedoecus (1,2 %), a Philopteroides (1 %). Pokud jde o všenky tak bylo v souladu s původními předpoklady nalezeno 29 parazitickohostitelských interakcí, z toho 14 dosud nepopsaných, u nichž se může jednat i o potenciálně nové druhy všenek. První záznam výskytu všenek byl zjištěn u vousáka Megalaima lineata, drongů Dicrurus aeneus a Dicrurus paradiseus, timálií Malacopteron cinereum a Pellorneum ruficeps, u lejska Cyornis hainanus, šámy Copsychus malabaricus a lejskovce Hypothymis azurea. Za zvláště zajímavý považujeme nález luptouše rodu Myrsidea u loboše červenočerného (Cymbirhynchus macrorhynchos), u kterého dosud nebyl výskyt všenek znám. Z celé čeledi lobošovitých (Eurylaimidae) byl zatím popsán pouze jeden druh Myrsidea flavida (Piaget, 1880) z loboše žlutočerného (Eurylaimus ochromalus), který je znám z Bornea, Sumatry a Malajského poloostrova. U jednoho vyšetřeného loboše byla také nalezena nejvyšší intenzita napadení a to 31 luptoušů. Nejvyšší prevalence napadení všenkami byla zaznamenána u vlhy hnědohlavé (Merops leshenaultii). Všech 10 vyšetřených ptáků tohoto druhu bylo napadeno celkem 3 druhy všenek, přičemž průměrná intenzita napadení byla 7,2. Nálezy péřovek rodu Brueelia a luptoušů rodu Myrsidea u bulbulce jihoasijského (Alophoixus pallidus), bulbulčíka šedookého (Iole propinqua) a bulbula proužkohrdlého (Pycnonotus finlaysoni), které byly popsány v předchozích pracích ze severního Vietnamu (Sychra et al., 2009; Najer et al., submitted), potvrdily přítomnost těchto druhů parazitů u bulbulů i v jiných částech jejich areálu rozšíření.

75

Závěry Byl zmapován výskyt ektoparazitů u volně žijících ptáků v jižním Vietnamu. Výsledky prohlubují především znalosti o výskytu všenek v dané zoogeografické oblasti, jejich rozšíření, hostitelské specifitě a možnosti šíření na nové hostitele. Nalezené druhy všenek budou využity jako srovnávací materiál pro následné revize jednotlivých rodů, případně ke zpracování určovacích klíčů. V několika případech lze s velkou pravděpodobností očekávat popis zcela nových druhů všenek.

Seznam literatury 1) CLAYTON, D. H. – DROWN. D. M. Critical evaluation of five methods for quantifying chewing lice (Insecta: Phthiraptera). Journal of Parasitology, 2001, vol. 87, no. 6, s. 1291– 1300. 2) HELLENTHAL, R. A. – PRICE, R. D. The genus Myrsidea Waterston (Phthiraptera: Menoponidae) from bulbuls (Passeriformes: Pycnonotidae), with descriptions of 16 new species. Zootaxa, 2003, no. 354, s. 1–20. 3) MEY, E. Zur Taxonomie, Verbreitung und parasitophyletischer Evidenz des PhilopterusKomplexes (Insecta, Phthiraptera, Ischnocera). Ornithologischer Anzeiger, 2004, vol. 43, s. 149–203. 4) PRICE, R. D. – HELLENTHAL, R. A. – PALMA, R. L. World checklist of chewing lice with host associations and keys to families and genera. In The Chewing Lice: World Checklist and Biological Overview. Illinois Natural History Survey, 2003. s. 1–448. 5) ROBSON, C. A Field Guide to the Birds of South East Asia. 2008. New Holland Publisher, London, 544 s. 6) SYCHRA, O – LITERÁK, I. – HUNG, N. M. – PODZEMNÝ, P. Chewing lice from wild passerines (Aves, Passeriformes) from Vietnam, with description of a new species of the genus Brueelia (Phthiraptera, Ischnocera, Philopteridae). Acta Parasitologica, 2009, vol. 54, no. 2, s. 154–157. 7) UCHIDA, S. Studies on the biting-lice (Mallophaga) of Japan and adjacent territories (Suborder Ischnocera Pt. I). Japanese Medical Journal, 1948, vol. 1, no. 4, s. 303–326.

76

Zastoupení potenciálních alergenů v mléčných výrobcích Lenka Ruprichová, Michaela Dračková, Ivana Borkovcová, Lenka Vorlová Ústav hygieny a technologie mléka, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod V současné době jsou mléčné výrobky oblíbené mezi spotřebiteli, protože jsou spojovány s celkovou kvalitou stravy a poskytují velké množství významných nutrientů (Steijns, 2008). Alergie na mléko a mléčné výrobky se v dnešní době objevuje stále častěji, zejména u dětí. Mezi hlavní alergeny mléka patří kaseiny, α-laktalbumin a β-laktoglobulin (Monaci et al., 2006). Dosavadní léčba alergie na danou potravinu spočívá v jejím celkovém odstranění z jídelníčku. Avšak publikované výsledky naznačují, že postupné zvyšování dávek mléka vede u dětí k celkové adaptaci, toleranci alergenu, který původně vyvolával alergické reakce (Skripak et al., 2008). To je jeden ze závažných důvodů proč je důležité znát obsah alergenů nejen v mléku, ale také v mléčných výrobcích. Cílem tohoto projektu bylo zjistit obsah potenciálních alergenních látek nejvíce zastoupených v mléčných výrobcích (jako jsou sýry, jogurty apod.). Vhodnou metodou pro stanovení majoritních proteinů mléka a mléčných výrobků je moderní instrumentální metoda RP-HPLC (vysokoúčinná kapalinová chromatografie s reverzní fází), což ve své práci potvrzují také autoři Karoui a Baerdemaeker (2007). Materiál a metodika Vzorky Bylo analyzováno celkem 50 vzorků mléčných výrobků, které byly získány z farem a tržní sítě ČR. Vzorky zahrnovaly několik druhů mléčných výrobků. Jednalo se o sýry (n=37), kysané mléčné výrobky – jogurty (n=10) a tvarohy (n=3). Vzorky byly zchlazeny na teplotu 4–6 °C až do doby analýzy. U každého vzorku byla provedena 2 paralelní stanovení. Příprava vzorků 5 g vzorku bylo smícháno s 15 ml vody a homogenizováno pomocí sonikátoru. Vzorky s vyšším pH byly upraveny na pH 4,6. Vzorky jogurtů byly naváženy přímo do zkumavek a odstředěny, další postup byl shodný s ostatními mléčnými výrobky. Vzorky byly odstředěny (4000 otáček/10 minut) a oddělená syrovátka byla zmražena na teplotu -18 °C. Kaseiny byly promyty roztokem o složení dichlormethan-voda (1:1) a lyofilizovány (López–Fandiño et al., 1993) pomocí lyofilizátoru ALPHA 1–4 LSC (Christ, Germany).

77

Před vlastním stanovením byl lyofilizovaný kasein rozpuštěn v roztoku Tris-HCl (pH 6.8) a 2mercaptoethanolu. Dále byly vzorky kaseinů a syrovátkových bílkovin přefiltrovány přes nylonový membránový filtr (0.22 μm) do vialek. Podmínky HPLC stanovení Ke stanovení kaseinů, α–laktalbuminu a β–laktoglobulinu byl použit kapalinový chromatograf Alliance 2695 s PDA 2996 detektorem (Waters, USA) a kolonou X Bridge TM C18, 150 x 3,0 mm, 3,5 μm (Waters, Ireland). Teplota kolony pro stanovení kaseinů byla 45 °C a pro stanovení syrovátkových bílkovin 40 °C. Mobilní fáze A obsahovala vodu/acetonitril/trifluoroctovou kyselinu (TFA) v poměru 95/5/0,1 (v/v/v) a mobilní fáze B vodu/acetonitril/TFA v poměru 5/95/0,1 (v/v/v). Bylo použito gradientové eluce a průtoku mobilní fáze 0,4 ml.min-1. Detekce byla prováděna při 205 nm. Analýza kaseinů i syrovátkových bílkovin probíhala 25 minut. Velikost nástřiku kaseinů byla 5 µl a syrovátkových bílkovin 10 µl. Vyhodnocení, validace a optimalizace metody RP-HPLC pro syrovátkové bílkoviny a kaseiny jsou uvedeny v práci Ruprichová a kol. (2011). Ukázky chromatogramů standardů jsou na obrázku 1 a 2. 1.40

LA

1.20

LG-B LG-A

1.00

AU

0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 -0.20 2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00 Minutes

14.00

16.00

18.00

20.00

22.00

24.00

20.00

22.00

24.00

Obrázek 1. Chromatogram standardů α-laktalbuminu a β-laktoglobulinu

1.40

κ-CN

0.80

AU

αS-CN

1.00

0.60

β-CN

1.20

0.40 0.20 0.00 -0.20 -0.40 2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00 Minutes

14.00

16.00

18.00

Obrázek 2. Chromatogram standardů kaseinů

78

Výsledky Průměrné hodnoty obsahu kaseinů, α-laktalbuminu a β-laktoglobulinu v jednotlivých komoditách jsou uvedeny v tabulce 1. Tabulka 1. Průměrný obsah kaseinů, α- laktalbuminu a β- laktoglobulinu v sýrech, jogurtech a tvarozích v %. Bílkovina

sýry

jogurty

tvarohy

αS-kasein

50,0±9,1

47,1±2,6

44,5±8,6

β-kasein

39,0±8,4

44,0±3,8

45,0±8,9

κ-kasein

11,0±3,7

9,0±5,2

10,5±0,4

α-laktalbumin

22,5±20,3

96,7±8,4

0

β-laktoglobulin

77,5±20,3

14,7±15,3

100

Součet αS-CN, β-CN a κ-CN činí 100% stejně jako součet LA a LG.

Obsah kaseinů se v jednotlivých komoditách příliš nelišil. Nejmenší množství bylo zaznamenáno u κ-kaseinu a naopak nejvíce bylo zjištěno αS-kaseinu, který je považován za kasein s největším alergenním potenciálem. Ze všech druhů analyzovaných mléčných výrobků byl obsah αS-kaseinu nejmenší u tvarohů. Jiná situace byla zjištěna u syrovátkových bílkovin. Hlavní potenciálně alergenní bílkovina β-laktoglobulin byla nejvíce zastoupena u tvarohů a nejméně pak u jogurtů. Závěr Pomocí metody RP-HPLC byl stanoven obsah syrovátkových bílkovin a kaseinů u 50-ti vzorků mléčných výrobků. Největší alergenní potenciál v mléku a mléčných výrobcích vykazuje αS-kasein a β-laktoglobulin. Výsledky ukázaly, že zastoupení αS-kaseinu a β-laktoglobulinu je u jednotlivých druhů mléčných výrobků rozdílné, a konzument s konkrétní nesnášenlivostí si tedy může zvolit výrobek z jeho pohledu méně problémový.

Poděkování: Práce vznikla za finanční podpory IGA VFU Brno 75/2011/FVHE.

79

Kachna divoká (Anas platyrhynchos) jako bioindikátor kontaminace vodního ekosystému olovem Zdeňka Hutařová , Olga Čelechovská2, Jana Hosnedlová1, Zdeňka Svobodová1 1

Ústav veřejného veterinárního lékařství a toxikologie, 2Ústav biochemie, chemie a biofyziky,

1

Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Otrava olovem je jednou z nejčastěji se vyskytujících otrav v životním prostředí. Mezi hlavní zdroje úniku olova do životního prostředí můžeme zařadit: dřívější užívání olovnatého benzínu (s obsahem tetraethylolova), používání herbicidů a insekticidů obsahující tento kov (arseničnan olovnatý), chromanu olovnatého jako součást žlutého pigmentu barev a keramických glazur a mnoho dalších (Gad, 2005). Některé z činností a přípravků, v nichž se olovo uplatňovalo, byly již zakázány. Nicméně stále nová kontaminace životního prostředí olovem je možná například prostřednictvím myslivecké a sportovní činnosti (používání nábojů s olověnými broky), menší význam se přikládá rybářské činnosti (užití olověných závaží). Právě tyto aktivity mohou predisponovat určité lokality k vyššímu zatížení životního prostředí olovem, s následným negativním dopadem na faunu zde žijící, popř. navštěvující tyto lokality (Francisco et al., 2003). Mnohé zahraniční výzkumy prokázaly zvýšenou kontaminaci životního prostředí právě v okolí mokřadů a jiných vodních ploch. Tato kontaminace je dávána v největší míře do souvislosti právě s myslivostípoužívání nábojů s olověnými broky, které se během lovu dostávají do životního prostředí (Francisco et al., 2003; Mateo et al., 2007). Mohou tak být začleněny do potravního řetězce a následně být zdrojem primárních či sekundárních otrav zvířat (Francisco et al., 2003; Guillemain et al., 2007), popřípadě představují možné riziko i pro člověka. Dle zákona o myslivosti (č.449/2001 Sb. ve znění pozdějších předpisů) je v České republice od 1. 1. 2011 zakázáno používání „olověných brokových nábojů“ k lovu vodního ptactva. Dopady kontaminace prostředí na zdravotní stav vodních ptáků v České republice byly zkoumány jen v nepatrném rozsahu (Marjánková, 1975). Cílem naší práce bylo zjistit míru zatížení životního prostředí olovem v okolí vodních ploch (užívaných pro mysliveckou činnost) s použitím vodních ptáků (Anas platyrhynchos) jako bioindikátoru. Materiály a metodika Míra kontaminace životního prostředí olovem, za použití kachny divoké jako bioindikátoru, byla sledována na dvou vybraných vodních plochách s dlouholetou mysliveckou tradicí. Jednalo se o nádrž Nedveka, lokalizovanou na jižní Moravě o rozloze 8,3 ha (experiment 1), a rybník Dolní u Lišova (oválného tvaru), lokalizovaný v jižních Čechách, o rozloze 5,9 ha (experiment 2).

Pro realizaci projektu byly použity kachny divoké, vysazené na vodní plochu vybraných lokalit, střelené na společných lovech ocelovými broky (pokusné skupiny). Kontrolní skupiny byly vytvořeny jedinci kachny divoké, pocházející ze stejných chovů jako pokusné skupiny, odchovaných mimo vodní plochu. Z jedinců pokusné a kontrolní skupiny byly odebrány vzorky zvolených tkání (svalová tkáň, mozek, plíce, játra,

80

ledviny, kost a peří). V odebraných tkáňových vzorcích byly stanoveny koncentrace olova prostřednictvím metody prostřednictvím metody atomové absorpční spektrometrie s kontinuálním zdrojem a vysokým rozlišením (HR-CS AAS). Výsledky a diskuze Porovnání koncentrací olova stanovených v odebraných tkáňových vzorcích kachen (n=10) jsou uvedeny v grafu č. 1. Z tohoto grafu vyplývá, ve všech sledovaných tkáních byly zjištěny vyšší průměrné koncentrace olova u skupiny pokusné než u skupiny kontrolní. Statisticky významné rozdíly byly mezi skupinou pokusnou a kontrolní zjištěny v případě vzorků žaludku (p˂0,05). Získané výsledky experimentu 1 potvrzují hypotézu zvýšené kontaminace okolí vodních ploch olovem. Zvýšené zatížení sledovaného okolí vodní plochy olovem se projeví zvýšenými koncentracemi olova ve tkáních kachen, žijících v tomto prostředí.

1,5

14,25±4,53

5,08±0,75

Graf č. 1. Porovnání obsahu olova [mg/kg] v tělních tkáních kachen divokých (experiment 1).

1,25 1 0,75 0,5 0,25

*

0 Svalovina

Játra

Kontrola

žaludek Hostim

Ledviny

Peří

Plíce

Mozek

Kosti

* statisticky významný rozdíl (p˂0,05)

Porovnání koncentrací olova mezi pokusnou a kontrolní skupinou kachen divokých jsou dále uvedeny v grafu č. 2. Z grafu č. 2 vyplývá, že koncentrace olova byla ve všech sledovaných tkáních u pokusné skupiny nižší než u skupiny kontrolní. Statisticky významný rozdíl byl zaznamenán v případech svaloviny, ledvin, plic a kostí (p˂0,05).

81

2,22±0,35

8,93±1,01

Graf č. 2. Porovnání obsahu olova [mg/kg] v tělních tkáních kachen divokých (experiment 2).

Pb [mg/kg]

1,00 0,75 0,50 0,25

* *

*

*

0,00 Svalovina

Játra

Kontrola

žaludek

Ledviny

Peří

Plíce

Mozek

Kosti

* statistiky významný rozdíl (p˂0,05)

Lišov

Hypotézou pro výsledek získaný v experimentu 2 je velmi malé zatížení bezprostředního okolí vodní plochy olovem, z důvodu malé velikosti a oválného tvaru rybníka. Olověné broky, používané k lovu v dřívějších letech, ve většině případů nedopadaly do bezprostřední blízkosti vodní plochy, nýbrž na vzdálenější polní plochu. Koncentrace olova, stanovené ve tkáních kontrolních skupin obou experimentů, je dávána do souvislosti s možnou přítomností určité koncentrace olova v krmivu. Práce byla financována v rámci projektu IGA 76/2011/FVHE.

Seznam literatury

1) Gad, SC. Encyclopedia of Toxicology. 2nd edition. UK: Academic Press, 2005. Počet stran. ISBN. kapitola x: Lead, p. 705 - 709. 2) Francisco, ND.; Troya, JDR.; Agűera, EI. Lead and lead toxicity in domestic and free living birds. Avian Patology 2003, 32, 3 - 13. 3) Guillemain, M.; Devineau, O.; Lebreton, J.; Mondain-Monval, J.; Johnson, AR.; Simon, G. Lead shot and teal (Anas crecca) in the Camargue, Southern France: Effects of embedded and ingested pellets on survival. Biological Conservation 2007, 137, 567 - 576. 4) Mateo, R.; Green, AJ.; Lefranc, H.; Baos, R.; Figuerola, J. Lead poisoning in wild birds from southern Spain: A comparative study of wetland areas and species affected, and trends over time. Ecotoxicology and Enviromental Safety 2007, 66, 119 - 126. 5) Marjánková, K. Otravy kachen způsobené broky. Československé rybníkářství 1975, 1, 32-34.

82

Zvěř jako indikátor kontaminace životního prostředí Lenka Zelníčková, Petr Maršálek, Jitka Mikuláštíková Ústav veřejného veterinárního lékařství a toxikologie, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Úvod Znečištění biosféry škodlivými látkami je jedním z nejzávažnějších problémů ochrany životního prostředí. Zvlášť problematický je výskyt organohalogenovaných polutantů, které již při nízké koncentraci mohou vykazovat toxické, mutagenní případně karcinogenní účinky a mohou mít nepříznivé účinky na reprodukci a vývoj (Van der Oost et al., 2003; Van der Berg et al., 1998). Nacházejí se ve všech sférách globálního systému, tedy ve vzduchu, půdě, vodě, biotě (Safe, 1992). Mezi nejvíce zkoumané organické látky v posledních pěti desetiletích, které znečišťují životní prostředí, řadíme perzistentní organické polutanty (POPs). Představují jednu z nejvýznamnějších skupin kontaminantů (Naccari et al., 2004). Do přírodního prostředí se s intenzivní zemědělskou výrobou dostává celá řada kontaminantů, a to především pesticidů na bázi organofosfátů, karbamátů, pyrethroidů, antikoagulačních rodenticidů a dalších. K hodnocení kontaminace životního prostředí jsou využívány různé bioindikátory a to živočišného nebo rostlinného původu. Největším nebezpečím pro člověka, jakožto konzumenta potravin, jsou však kontaminující cizorodé látky, které jsou obsaženy v mase a vnitřních orgánech, které se konzumují a dostávají se tak do potravního řetězce člověka. Proto je nesmírně důležitý cílený monitoring, který umožní řídícím orgánům učinit správné rozhodnutí a zavést správné opatření (Niewiadowska et al., 2010). Lovná zvěř je velice úzce spojena s přírodním prostředím a s intezivní zemědělskou výrobou, je tedy vhodným bioindikátorem kontaminace, zejména pesticidními látkami. Cílem projektu bylo zjištění úrovně kontaminace prostředí pesticidy a PCB analýzou svaloviny volně žijící zvěře se zaměřením na divoká prasata a jeleny.

Materiál a metodika Pro monitoring výskytu xenobiotik v přírodním prostředí byla vybrána lovná zvěř. Zvířata nebyla řešitelským týmem usmrcována, ale vzorky byly získány ze zvířat odlovených myslivci. Vzorky divokých prasat a jelenů (svalovina) byly odebírány na území jižní Moravy (zejména oblast v okolí Znojma) v průběhu roku 2011.

Vlastní stanovení indikátorových kongenerů PCB a organochlorových pesticidů a jejich metabolitů ve svalovině bylo provedeno metodou plynové chromatografie s hmotnostním spektrometrem (GC/MS).

83

Výsledky Byla zavedena a validována metodika pro stanovení obsahu indikátorových kongenerů PCB a organochlorových pesticidů a jejich metabolitů ve svalovině divokých prasat a jelenů. Výsledky obsahu PCB (indikátorové kongenery 28, 52, 101, 118, 138, 153 a 180), HCH (izomery alfa HCH, beta HCH, gamma HCH a delta HCH), HCB a organochlorových pesticidů (metabolity o,p DDT, o,p DDE, o,p DDD, p,p DDT, p,p DDE a p,p DDD) ve svalovině divočáků a jelenů v μg.kg-1 a průměrné obsahy jednotlivých látek u divokých prasat a jelenů jsou uvedené v tabulce 1 [μg.kg-1] svaloviny ± SD. Při statistické analýze byly pomocí T-testu zjištěny u PCB a HCB statisticky významné rozdíly mezi hodnotami zjištěnými u divokých prasat a jelenů (P < 0,05), u organochlorovaných pesticidů DDT, DDE a DDD a jejich metabolitů byl zjištěn statisticky velmi významný rozdíl mezi hodnotami zjištěnými u divokých prasat a jelenů (P < 0,01). Statisticky významné a velmi významné rozdíly mezi zjištěnými hodnotami jsou způsobeny cca 5x větším množstvím tuku u divokých prasat než u jelenů. V případě HCH byl rozdíl mezi jeleny a divočáky statisticky nevýznamný (P > 0,05). Divoké prase [n = 26] Σ PCB [μg.kg-1] Σ HCH [μg.kg-1] HCB [μg.kg-1] Σ DDT [μg.kg-1] Tuk [%]

Jelen [n = 7]

min

max

Ø ± SD

min

max

Ø ± SD

0,105

5,840

1,049 ± 1,251

0,211

0,581

0,387 ± 0,146

0,002

0,443

0,147 ± 0,128

0,048

0,330

0,193 ± 0,092

0,049

0,714

0,224 ± 0,173

0,005

0,169

0,040 ± 0,058

0,255

150,003

41,713 ± 43,646

0,263

2,472

0,711 ± 0,796

1,060

9,347

3,519 ± 2,551

0,101

2,577

0,643 ± 0,868

Tab. 1: Minimální, maximální a průměrný obsah jednotlivých látek u divokých prasat a jelenů [μg.kg-1] svaloviny ± SD a obsah tuku [%] Hygienické limity pro Σ PCB 2 000 μg.kg-1, Σ DDT 100 μg.kg-1, HCB 20 μg.kg-1 a Σ HCH 13 μg.kg-1 (SVS ČR). Žádné námi naměřené hodnoty nepřekračovaly tyto hygienické limity. V rámci monitoringu divokých prasat v ČR dle SVS ČR nepřekročila rezidua chlorovaných pesticidů a polychlorovaných bifenylů (PCB) stanovené hygienické limity u žádného z vyšetřených vzorků (všechny hodnoty nedosahovaly 50 % hygienických limitů) (SVS).

84

Ve skupině ostatní spárkaté zvěře (mimo prasata divoká) bylo vyšetřeno 18 jelenů evropských a 3 jeleni sika, 5 daňků evropských a 3 srnci. Nebyly zjištěny nadlimitní hodnoty u žádného z vyšetřovaných vzorků. Všechny hodnoty ležely v intervalu do 50 % hodnot hygienických limitů (SVS). V případě stanovení 1-hydroxypyrenu ve žluči a moči byla zavedena a validována metodika pomocí HPLC s fluorescenční detekcí a pro stanovení organofosfátových pesticidů, pesticidů na bázi karbamátů, pyrethroidů a bromadiolonu byla zavedena a validována metoda kapalinové chromatografie s hmotnostním spektrometrem (LC/MS/MS) a vlastní vzorky budou teprve měřeny. Práce byla financována v rámci projektu IGA 77/2011/FVHE.

Seznam literatury 1) NACCARI F., GIOFRE F., LICATA P., MARTINO D., CALO M., PARISI N. Organochlorine pesticides and PCBs in wild boars from Calabria (Italy). Environ. Monit. Assess. 2004, 96, 191202. 2) NIEWIADOWSKA A., KILJANEK T., SEMENIUK S., ZMUDZKI J. Determination of pyrethroid residues in meat by gas chromatography with electron capture detection. Bull. Vet. Inst. Pulawy 2010, 54, 595-599. 3) SAFE S.. Development, validation and limitations of toxic equivalency factors. Chemosphere 1992, 25, 61-64. 4) VAN DER OOST R., BEYER J., VERMEULEN, NPE. Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment: a review. Environ. Toxicol. Pharmacol. 2003, 13, 57–149. 5) VAN DEN BERG M., BIRNBAUM L., BOSVELD, ATC., BRUNSTROM B., COOK P., FEELEY M., GIESY JP., HANBERG A., HASEGAWA R., KENNEDY SW., KUBIAK T., LARSEN JC., VAN LEEUWEN FXR., LIEM AKD., NOLT C., PETERSON RE., POELLINGER L., SAFE S., SCHRENK D., TILLITT D., TYSKLIND M., YOUNES M., WAERN F., ZACHAREWSKI T. Toxic equivalency factors (TEFs) for PCBs, PCDDs, PCDFs for humans and wildlife. Environ. Health Persp. 1998, 106, 775-792. 6) Státní veterinární správa České republiky. Informační bulletin č. 1/2011. Kontaminace

potravních řetězců cizorodými látkami – situace v roce 2010.

85

Vliv výživy na jateční hodnotu a kvalitu masa orebice chukar Radovan Jůzl, Pavel Suchý, Eva Straková, Lucie Rusníková

Ústav výživy, zootechniky a zoohygieny, FVHE, VFU Brno

Úvod Cílem naší práce bylo sledovat jateční hodnotu a kvalitu masa orebic chukar odchovaných intenzivním způsobem. U vzorků prsní a stehenní svaloviny orebic jsme sledovali základní chemické parametry, vypovídající o kvalitě masa. Způsob výkrmu je jedním z faktorů ovlivňujících jatečnou hodnotu, kvalitu masa a jeho cenu. V našich podmínkách orebice nepatří mezi tradičně odchovávanou pernatou zvěř, jako je tomu u bažanta, stejně tak není zaveden ani intenzivní výkrm orebic, podobný výkrmu brojlerových kuřat. Jsou chovány pouze k zájmovým účelům a i výzkum v oblasti odchovu a výkrmu orebic je omezený, ve srovnání s jinými druhy ptáků, ačkoli zájem o maso orebic k lidské spotřebě stoupá (1). Sledovali jsme vliv intenzivního výkrmu na kvalitu masa vykrmovaných zvířat. Hodnotila se prsní a stehenní svalovina, tedy části jatečně opracovaného těla (JOT) pro spotřebitele nejvýznamnější. Výkrmem orebic se zabývá několik autorů, jejich práce jsou však zaměřeny především na složení krmné směsi, například na obsah energie a dusíkatých látek v krmných směsích použitých v chovu orebic (2, 3), než na základní složení výsledného produktu. Existují ale práce, hodnotící obsah mastných kyselin ve svalovině orebic (1). Zaměřili jsme se tedy na srovnání kvality masa orebic s kvalitou masa brojlerových a bažantích kuřat. Složení prsní a stehenní svaloviny u brojlerových kuřat se od sebe liší. Prsní svalovina obsahuje více hrubého proteinu (CP), popelovin a fosforu a méně sušiny, tuku a vápníku oproti svalovině stehenní (4). Prsní i stehenní svalovina bažanta obsahuje více CP a fosforu, méně tuku a vápníku než u brojlerových kuřat (5). Obsah hrubé energie (BE) v prsní a stehenní svalovině je nejnižší u orebice, následuje bažant a nejvyšších hodnot BE bylo dosaženo u brojlera. U všech druhů byly vyšší hodnoty BE zjištěny u stehenní svaloviny (6).

Materiál a metodika Jako materiál sloužily vzorky masa orebic, a to konkrétně stehenní a prsní svalovina. Tyto vzorky pocházely z biologického pokusu, realizovaného v roce 2010 v experimentální stáji Ústavu výživy, zootechniky a zoohygieny, Veterinární a farmaceutické univerzity Brno. Zmíněný pokus byl založen na 90 denním intenzivním výkrmu 60 jedinců (slepičky i kohoutci) orebice chukar.

Pokusná zvířata byla krmena

granulovanými kompletními krmnými směsmi, které jsou komerčně dostupné k výkrmu brojlerových kuřat. Od 1. do 20. dne věku byla použita krmná směs (KS) BR 1 ve složení sušiny: dusíkaté látky (NL) 235,4 g.kg1

, tuk 47,8 g.kg-1, popel 58,9 g.kg-1, ME 13,6 MJ.kg-1. Od 20. do 81. dne věku byla použita KS BR 2 ve

složení sušiny: NL 244,9 g.kg-1, tuk 100,1 g.kg-1, popel 62,0 g.kg-1, ME 15,3 MJ.kg-1. Od 81. do 90. dne KS BR 3 ve složení sušiny: NL 245,8 g.kg-1, tuk 112,0 g.kg-1, popel 63,6 g.kg-1, ME 15,5 MJ.kg-1. Orebice byly krmeny ad libitum a všechny typy KS byly granulované. Během pokusu nedošlo k úhynu. V průběhu

86

výkrmu byla u pokusných zvířat sledována živá hmotnost. V 90. dnu věku bylo vybráno 30 jedinců, u kterých byly sledovány vybrané ukazatele prsní a stehenní svaloviny. V původní hmotě vzorku byla sledována sušina (g.kg-1), v sušině vzorku byly následně sledovány tyto parametry: CP (g.kg-1), tuk (g.kg-1), popel (g.kg-1), vápník (g.kg-1), fosfor (g.kg-1), hořčík (g.kg-1), spalné teplo BE (MJ.kg-1). Po stanovení předsušiny a sušiny (v sušárně) byl vzorek homogenizován a následně podroben dalším analýzám. Obsah dusíku byl stanoven dle Kjeldahla na přístroji Büchi Kjeldahl (firma Centec automatika spol. s.r.o.). Vynásobením faktorem 6,25 vyjádříme obsahu CP ve vzorku (g.kg-1). Tuk (g.kg-1) byl stanoven přístrojem ANKOMXT10 Fat Analyzer (firma O.K. Servis BioPro). Popel (g.kg-1) byl stanoven vážkově po zpopelnění při 550° C v Muflové peci za předepsaných podmínek. Vápník, hořčík a fosfor (g.kg-1) byly stanoveny z popela vzorku. Vápník a hořčík vyluhováním a následnou titrací, fosfor na spektrofotometru HELIOS α

(firma Fisher Stientific, spol. s.r.o.). Spalné teplo bylo měřeno na kalorimetru AC 500 (firma Leco s.r.o. Plzeň). Dále byla vyhodnocena výtěžnost jatečně opracovaného těla (%), a výtěžnost prsní (%) a stehenní svaloviny (%). Bylo provedeno statistické hodnocení výsledků chemické analýzy pomocí programu Unistat (5.6 Excel). Naše práce si klade za cíl vyhodnotit výsledky výtěžnosti a kvality masa s ohledem na výživu.

Výsledky Živá hmotnost v průběhu výkrmu rovnoměrně stoupala, přičemž ke konci výkrmu, v 90. dnu věku orebic byl přírůstek méně výrazný. Výtěžnost jatečně opracovaného těla v porážkovém věku 90 dní činila 73,72 % (průměr ze sledování 30 kusů), výtěžnost prsní svaloviny se pohybovala kolem 18,09 % (průměr ze sledování 29 kusů) a výtěžnost stehenní svaloviny 20,80 % (průměr ze sledování 30 kusů). U získaných vzorků prsní a stehenní svaloviny byla provedena chemická analýza, která ukázala statisticky vysoce významný rozdíl (P ≤ 0,01) mezi prsní a stehenní svalovinou a to konkrétně pro tyto měřené parametry: NL, tuk, popel, BE. V obsahu popela byl prokázán významný rozdíl (P ≤ 0,05). Prsní svalovina obsahovala více sušiny, CP a Ca. Stehenní svalovina obsahovala více tuku, popela, P a BE. Při porovnání s údaji

z literatury, které se týkají kvality masa brojlerových kuřat, je patrný rozdíl zejména v obsahu CP. Maso orebic obsahuje v prsní i stehenní svalovině menší množství tuku a fosforu a vyšší množství vápníku a CP, stehenní svalovina orebic obsahuje více CP než stehenní svalovina bažanta.

Závěr Z výsledků vyplývá rozdíl mezi prsní a stehenní svalovinou, jak v hodnotách jatečné výtěžnosti, tak i v chemické analýze. Za hodnotnější partii JOT orebic by se dala považovat prsní svalovina, která stejně jako prsní svalovina brojlera nebo bažanta obsahuje vyšší množství CP a méně tuku, než svalovina stehenní.

Tento fakt řadí maso orebic mezi nutričně ceněné maso pernaté zvěře.

Výsledky jsou o to zajímavější, že nebylo použito speciálních krmných směsí pro orebice, ani šlechtitelských metod ke zlepšení jatečné výtěžnosti a kvality masa, orebice byly pouze krmeny v intenzivních podmínkách.

87

Seznam literatury 1) GULSEN, N., UMUCALILAR, H. D., KIRIKCI, K., HAYIRLI, A., AKTUMSEK, A., ALASAHAN, S. Sunflower oil supplementation alters meat quality but not performance of growing partridges (Alectoris chukar). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 2010, vol. 24, no. 2, p. 196-203. 2) CUFADAR, Y., OLGUN, O., BAHTIYARCA, Y., YILDIZ, A. O. Effects of dietary energy and protein on performance, reproduction traits and nitrogen-excretion of breeder chukar partridges (Alectoris chukar). Revue de Medecine Veterinaire, 2010, vol. 161, no. 4, p. 151-156. 3) ŐZEK, K. The optimum protein content in high-energy starter diet for chukar partridge (Alectoris chucar chucar). International Journal of Poultry Science, 2006, vol. 5, no. 6, p. 522– 525. 4) SUCHÝ, P., JELÍNEK, P., STRAKOVÁ, E., HUCL, J. Chemical composition of muscles of hybrid broiler chicken during prolonged feeding. Czech Journal of Animal Sciences, 2002, vol. 47, no. 12, p. 511-518. 5) VEČEREK, V., SUCHÝ, P., STRAKOVÁ, E., VITULA, F., MIKUNDOVÁ, M. Variation in the chemical composition of muscles in young pheasants during their growth. Archiv für Tierzucht-Archives of Animal Breeding, 2005, vol. 48, no. 3, p. 290-298. 6) VITULA, F., SUCHY, P., STRAKOVA, E., KARASKOVA, K., ZAPLETAL, D, KROUPA, L. Energy value of meat in selected species of feathered game. Acta Veterinaria Brno, 2011, vol. 80, no. 2, p. 197-202. Práce vznikla za finanční podpory projektu IGA 78/2011/FVHE.

88

Suplementace vybraných rostlinných olejů do diety užitkových nosnic Petra Hudečková, Eva Straková, Pavel Suchý, Miroslav Macháček Ústav výživy, zootechniky a zoohygieny, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Úvod Zařazení olejů do krmných směsí umožňuje dosažení vyšší koncentrace energie v dietě. Při sestavování receptur je třeba zvažovat nejen celkový obsah tuku ve směsi, ale také jeho složení. Zvláště je třeba přihlížet k obsahu kyseliny linolové a kyseliny α-linolenové, které jsou esenciálními mastnými kyselinami [1]. Kyselina α-linolenová patří do skupiny polynenasycených mastných kyselin řady n-3. Tato kyselina společně s kyselinou eikosapentaenovou a dokosahexaenovou jsou nejdůležitějšími mastnými kyselinami z této skupiny [2]. Vyšší příjem esenciálních mastných kyselin má za následek nižší výskyt kardiovaskulárních onemocnění, snižuje hladinu triglyceridů v krvi, snižuje krevní tlak, slouží jako prevence arytmií, jsou neuroprotektivní [3]. Složení mastných kyselin ve vejci je krmivem ovlivněno a to vždy ve prospěch mastné kyseliny, která v dané plodině (v oleji) převažuje [4]. Cílem práce bylo porovnat vliv vybraných olejů na profil mastných kyselin ve žloutcích vajec.

Materiál a metodika Byly použity vzorky z biologického pokusu, který proběhl v roce 2010. V tomto pokusu bylo krmení nosnic realizováno pomocí komerčně vyráběných kompletních krmných směsí (KS pro kuřice a KS pro nosnice N1). Nosnice byly chovány v klecové technologii v akreditované experimentální stáji s řízeným světelným, teplotním, zoohygienickým a krmně-technologickým režimem. Pokus trval dva měsíce. Nosnice byly rozděleny do čtyř skupin. V prvním měsíci byl do diet všech skupin přidán sojový olej. Ve druhém měsíci byl třem skupinám nahrazen olej sojový (SO) jinými druhy rostlinných olejů: slunečnicovým (SLO), řepkovým (RO) a lněným (LO). Množství olejů přidávaných do KS bylo u všech skupin totožné a to 1,5 kg oleje na 50 kg KS. Z pokusu byla získána vejce, žloutky vajec byly připraveny k analytickým účelům a zmraženy. Následně byly žloutky analyzovány z pohledu změny složení mastných kyselin po podání různých rostlinných olejů. Ve vzorcích se stanovovaly mastné kyseliny pomocí plynové chromatografie za

89

použití GC 2010 SHIMADZU GAS CHROMATOGRAPH. Vzorky pro stanovení mastných kyselin se připravovaly metodikou podle Folche a kol. (1957) [5]. Byly porovnávány vzorky z prvního odběru (všechny skupiny nosnic krmeny sojovým olejem) a druhého odběru (náhrada sojového oleje třem skupinám nosnic). Výsledky byly porovnány statistickým programem Unistat CZ, for Excel verze 5.6 (2005) na hladině významnosti P≤0,01 (statisticky vysoce významný rozdíl) a P≤0,05 (statisticky významný rozdíl), NS (není signifikantní).

Výsledky V Tab.1 uvádíme hodnoty vybraných mastných kyselin ve vzorcích z druhého odběru. První odběr sloužil jako kontrola a v tabulce je tedy zaznamenáno, jestli byla hodnota u dané mastné kyseliny vyšší nebo nižší oproti prvnímu, kontrolnímu odběru. Statistická významnost rozdílů hodnot je označena symboly ** (P≤0,01), * (P≤0,05). Tab. 1 Obsah vybraných mastných kyselin ve vzorcích žloutků druhého odběru SO

SLO

RO

LO

palmitová

16,87↓**

17,93↓**

18,47↓*

NS

myristová

0,19↓*

0,21↓**

NS

0,20↑*

stearová

5,46↓**

5,64↓**

5,30↓**

NS

myristolejová

0,03**

NS

0,05↑**

0,04↑**

olejová

25,20↓**

26,18↓**

35,1↑**

28,95↑**

linolová

NS

16,85↓**

12,21↓**

13,22↓**

γ-linoleová

0,08↓*

0,094↓*

0,08↓**

0,06↓**

arachidonová

NS

NS

NS

0,88↓**

linolenová

NS

0,33↓**

0,92↑*

5,63↑**

eikosapentaenová

0,09↓**

0,01↓*

NS

0,13↑**

dokosahexaenová

NS

0,00↓**

1,30↑**

1,63↑**

Nasycené mastné kyseliny

MUFA n-9

PUFA n-6

PUFA n-3

90

Závěry Z našich výsledků vyplývá, že nejvhodnější olej pro zařazení do krmných směsí nosnic je olej lněný. Po zařazení lněného oleje do krmné směsi bylo zaznamenáno vyšší množství důležitých PUFA n-3 ve žloutcích (zejména kyseliny linolenové, jenž je esenciální mastnou kyselinou). Rovněž řepkový olej měl pozitivní vliv na polynenasycené mastné kyseliny řady n-3, kdy u kyseliny linolenové a dokosahexanenové bylo zaznamenáno vyšší množství po podání řepkového oleje. Slunečnicový olej v krmných směsích měl negativní vliv na vybrané mastné kyseliny. Byla sledována nižší hladina oproti prvnímu kontrolnímu odběru, kdy byl nosnicím přidán do krmné směsi olej sojový.

Seznam literatury 1. BARTH, C. A. Nutritional value of rapeseed oil and its high oleic/low linolenic variety – A call for differentiation, European Journal of Lipid Science and Technology, 2009, vol. 111, p. 953–956 2. NETTLETON, J. A. Omega-3 fatty acids and health, USA: Chapman & Hall, 1995, 359 p. ISBN 0-412-98861-5 3. WANG, L., HUO, G. The effects of dietary fatty acid pattern on layer’s performance and egg quality, Agricultural Sciences in China, 2010, vol. 9, no. 2, p. 280-285 4. WOODS, V. B., FEARON, A. M. Dietary sources of unsaturated fatty acids for animals and their transfer into meat, milk and eggs: A review, Livestock Science, 2009, vol. 126, no. 1-3, p. 1-20 5. FOLCH, J., LEES, M., SLOANE-STANLEY, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry, 1957, vol. 226, p. 497-509

Práce vznikla za finanční podpory projektu IGA 79/2011/FVHE.

91

Studium účinků vybraných platinových kovů na zástupce producentů ve vodních ekosystémech Ivana Bednářová, Hana Mikulášková, Miroslava Beklová Ústav veterinární ekologie a ochranyživotního prostředí, Fakulta veterinárního hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Produkce škodlivin vznikajících při spalování pohonných hmot, zejména oxidu uhelnatého a oxidů dusíku, je eliminována zaváděním katalyzátorů, ve kterých se používá jako katalyticky účinná substance

směs

platinových

kovů

(zejména

Pt,

Pd,

Rh).

Vzhledem

k tomu,

že katalyzátory jsou vystavovány velkým tepelným rozdílům, dochází k uvolňování platinových kovů do životního prostředí (1, 2). Ekotoxikologickými biotesty se hodnotí vliv testovaných látek na biotickou složku s využitím zástupců různých trofických úrovní ekosystému. Cílem je získat informace o toxických efektech a bioakumulaci testovaných látek. Byly provedeny testy inhibice růstu sladkovodních řas Pseudokirchneriella subcapitata a testy inhibice růstu vyšší cévnaté rostliny okřehku menšího (Lemna minor), podle metodik OECD 201 [ČSN EN 28692 (75 7740)] a OECD

221(ČSN

EN

ISO

20079).

Účinek

platinových

kovů

byl

hodnocen

na základě vegetativního růstu testovaných organismů, biokumulace kovů byla sledována pomocí různých biochemických markerů.

Materiál a metodika Experimenty byly provedeny na základě metodika OECD 201 a ČSN EN 28692 (75 7740) Jakost vod –

Zkouška inhibice růstu sladkovodních řas Scenedesmus subspicatus a Pseudokirchneriella subcapitata (Selenastrum capricornutum). Koncentrační řada PtCl4 a RhCl2 použitá v našich experimentech

byla

stanovena

na

základě

předběžných

testů.

Jednalo

se

o koncentrace 0 0,625 1,25 2,5 5 a 10 µmol.l-1. Na počátku testu se provedla inokulace 25 tis. řasových buněk do všech koncentrací i kontrolních vzorků. V intervalu 24h se v Bürkerově komůrce počítala hustota řasové suspenze. Experimenty trvaly 72 hodin. V případě okřehku menšího bylo postupováno podle modifikované metodiky OECD 221 a ČSN EN ISO 20079 Jakost vod – Stanovení toxických účinků složek vody a odpadní vody na okřehek (Lemna minor). Modifikace metody spočívala v její miniaturizaci, která umožnila testovat vzorky ve větších sériích. Rostlinky okřehku v kontrolních vzorcích byly kultivovány v podmínkách stanovených normou v SIS

(Swedish standard) mediu, které sloužilo i jako ředicí voda pro přípravu koncentrační řady platinových kovů. Koncentrace PtCl4 a RhCl3 použité v testech byly 0 1 5 10 25 50 100 µmol.l-

92

1

. V intervalu 24 hodin se sledoval počet lístků a morfologické změny rostlin s cílem kvantifikovat

účinek platinových kovů na vegetativní růst okřehku. Biokumulace testovaných kovů v biomase experimentálních rostlin, byla sledována pomocí různých biochemických markerů (celkové bílkoviny, antioxidační aktivita: ABTS, FRAP, enzymy: AST, ALT, atd.), dále byly stanovovány thioly, redukovaný (GSH) a oxidovaný (GSSG) glutation, které jsou specifickou odpovědí organismu na působení platinových kovů. Pro stanovení biochemických markerů byl použit automatický spektrofotometr BS-400 (Mindray, China), který se skládá z kyvetového prostoru (temperovaný na 37±0,1°C), reagenčního prostoru s karuselem pro reagencie a přípravu vzorků (temperovaný na 4±1°C) a optického detektoru. Zařízení je plně kontrolováno softwarem BS-400 (Mindray, China). Absorbance byla měřena po 10 minutách při vlnové délce 530 nm. Stanovení thiolů a platinových kovů probíhalo pomocí vysoko-účinné kapalinové chromatografie s elektrochemickou detekcí (HPLC-ED). HPLC-ED systém byl složen ze dvou chromatografických pump Model 582 ESA a chromatografické kolony s reverzní fází Zorbax eclipse AAA C180 (150 × 4.6; 3.5 µm velikost částic, Agilent Technologies, USA) a dvanácti-kanálového CoulArray elektrochemického detektoru (Model 5600A, ESA, USA) (3). Výsledky Zkouška

inhibice

růstu

sladkovodních

řas

Pseudokirchneriella

subcapitata

ukázala,

že účinek platinových kovů na růst řasové kultury byl natolik výrazně inhibiční, že se nepodařila stanovit hodnota 72hIC50 (50% inhibiční koncentrace). Již nejnižší koncentrace 0,625 µmol.l-1 způsobila inhibici 74 %, koncentrace 1,25 µmol.l-1 93%, následující koncentrace 2,5 µmol.l-1, 5 µmol.l-1 a koncentrace 10 µmol.l-1 způsobily inhibici už přesahující 100 %. Z dosažených výsledků lze usuzovat, že sladkovodní řasa Pseudokirchneriella subcapitata může sloužit jako významný bioindikátor znečištění povrchových vod platinovými kovy. Působení platinových kovů na okřehek menší (Lemna minor) mělo také výrazný inhibiční účinek, a to jak na vegetativní růst i na stav rostlin, kdy zejména u nejvyšších koncentrací (50 a 100 µmol.l-1) byla pozorována, chloróza a nekróza lístků. Koncentrace platiny, která způsobila 50% inhibici růstu okřehku menšího na

ve

12,85 µmol.l-1.

srovnání

U

rhodia

s kontrolou

tato

hodnota

činila

(168hIC50)

48,12

µmol.l-1.

byla

stanovena

Markery,

ukazující

na bioakumulaci platinových kovů byly stanoveny u koncentrací 0 1 10 100 µmol.l-1(PtCl4 a RhCl2). Hodnoty biochemických markerů: antioxidační aktivita (FRAP, ABTS) stoupala s rostoucí koncentrací a délkou expozice (Graf A, B, C, D).

93

A

antioxidační aktivita Lemna minor v experimentu s PtCl4 1200 1000

2.den

4.den

C

800 600 400 200 0 2.den

6.den

4.den

6.den

antioxidační aktivita Lemna minor v experimentu s RhtCl3 3

D

300

2,5

250

ABTS [mg.l-1]

FRAP [mg.l-1]

B

1400

ABTS [mg.l-1]

FRAP [mg.l-1]

16 14 12 10 8 6 4 2 0

2

1,5 1 0,5

200 150 100 50

0 2.den

4.den

6.den

0 2.den

4.den

kontrola

6.den

1 µM

Také hodnoty enzymatické aktivity (např. AST, ALT, GMT) se výrazně zvýšily zejména u koncentrace 100 µmol.l-1. Výsledky ekotoxikologických testů i následných chemických analýz potvrdily, že platina ve srovnání s rhodiem má vyšší toxický účinek na zástupce producentů ve vodních ekosystémech, který se projevil nejen výraznější inhibicí růstu a morfologickými změnami rostlin, ale i vyšší bioakumulací kovu v rostlinné biomase. Seznam literatury 1. WISEMAN, C., L., S., ZEREINI, F. Airborne particulate matter, platinum group elements and human health: a review of recent evidence. Sci. Total. Environ., 2009, vol. 407, iss. 8, p. 2493 00. 2. DUBIELLA-JACKOWSKA, A., KUDLAK, B., POLKOWSKA, Z., NAMIESNIK, J. Environmental fate of traffic-derived platinum group metals. Crit. Rev. Anal. Chem., 2009, vol. 39, iss.4, p. 251-271. 3. SUPALKOVA, V., BEKLOVA, M., BALOUN, J., SINGER, C., SURES, B., ADAM, V., HUSKA, D., PIKULA, J., RAUSCHEROVA, L., HAVEL, L., KIZEK, R. Affecting of aquatic vascular plant Lemna minor by cisplatin revealed by voltammetry. Bioelectrochemistry, 2008, vol. 72, p. 59-65.

94

Stanovení inhibičních účinků platinových kovů na růst vybraných druhů rostlin Hana Mikulášková, Ivana Bednářová, Miroslava Beklová Ústav veterinární ekologie a ochrany životního prostředí Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod V posledním desetiletí byl v životním prostředí zaznamenán výrazný narůst koncentrace prvků ze skupiny platinových kovů. Mezi hlavní zdroje emisí těchto prvků do životního prostředí patří automobilové katalyzátory, průmyslový a nemocniční odpad. Z hlediska kontaminace potravního řetězce jsou kovy platinové skupiny klasifikovány jako nebezpečné polutanty. Naše práce byla zaměřena na výzkum a rozšíření znalostí o účincích platinových kovů (platiny a palladia) na rostliny. Pro experiment byla vybrána kukuřice setá (Zea mays L.) a hrách setý (Pisum sativum L.), které jsou důležitou součástí krmiv hospodářských zvířat a také potravy člověka. Cílem bylo experimentálně vyhodnotit vliv platinových kovů na klíčivost a růst rostlin s ohledem na délku expozice danému kovu (8 a 12 dnů). Následně v rostlinách stanovit markery indikující přítomnost sledovaných kovů. Ke stanovení těchto markerů bylo využito biochemických a elektrochemických analýz. Materiál a metodika Ke stanovení inhibičních účinků platinových kovů (Pt) a (Pd) na klíčení a růst rostlin v počátečních stádiích vývoje, byla použita semena hrachu (Pisum sativum L.) a kukuřice (Zea mays L.). V experimentu byla semena hrachu a kukuřice vystavena působení PtCl4 a PdCl2 v koncentracích 0; 5; 10; 25; 50 a 100 M. Pro každou koncentraci a kontrolu bylo vybráno 100 semen rozmístěných na klíčních destičkách pokrytých buničinou. Klíční destičky byly umístěny do nádob o objemu 500 ml. Do každé nádoby bylo aplikováno 300 ml příslušné koncentrace kovu tak, aby konce buničiny byly smáčeny v roztoku a docházelo k jeho vzlínání k semenům. Jako ředicí voda byla použita destilovaná voda. Následně byla semena klíčena v kultivačním boxu po dobu 8 a 12 dnů ve tmě při teplotě 25 °C a vlhkosti 60 %. V 8. a 12. dnu experimentu byly provedeny odběry klíčků, u kterých byly zjištěny metrické údaje (délka, hmotnost) nadzemní a kořenové části. Dále byly v rostlinách pomocí biochemických a elektrochemických analýz stanoveny vybrané markery, indikující přítomnost kovu v rostlinách např. obsah bílkovin, které se obvykle podílejí na regulaci stresových faktorů způsobené cizorodými látkami, obsah zinku, který je důležitým

95

chemickým prvkem při aktivaci enzymů a syntéze bílkovin a enzymová aktivita GST (glutathion Stransferázy). Výsledky Provedenými experimenty byly sledovány inhibiční účinky platinových kovů (Pt a Pd) na klíčivost semen a vegetativní růst hrachu (Pisum sativum L.) a kukuřice (Zea mays L.). Platina působila inhibičně, jak na klíčivosti semen obou druhů rostlin (≤ 50 %), tak na jejich vegetativní růst. Hodnoty klíčivosti semen vystavených působení palládia dosahovaly hodnot 50 - 70 %. Koncentrace platiny, která způsobila 50% inhibici růstu hrachu ve srovnání s kontrolou v úseku 12 dní, byla 25 M (12dIC50), u palládia tato hodnota činila 100 M. Z naměřeného celkového obsahu zinku můžeme u hrachu pozorovat nárůst obsahu zinku s rostoucí koncentrací PtCl4 (obr. a, b). Podobný trend byl pozorován i u kukuřice (obr. c, d). Dále jsme zjistili, že PtCl4 a PdCl2 snižují syntézu bílkovin ve všech koncentracích u nadzemních i kořenových částí rostlin hrachu a kukuřice v obou odběrových dnech. Nejvyšší inhibice syntézy proteinů byla zjištěna u koncentrací 50 a 100 M. Dalším měřeným parametrem byla aktivita enzymů GST (glutathion-S-transferáza). Získané výsledky ukázaly, že aktivita GST narůstá s rostoucí koncentrací aplikovaného kovu PtCl4. Aktivita GST se ve srovnání s kontrolou zvýšila pětkrát v nadzemní části a čtyřikrát u kořene rostlin (obr. a,b), přičemž vyšší aktivita GST byla zaznamenána u rostlin vystavených koncentraci kovů 100 M. Aktivita GST se výrazně zvýšila u kukuřice v kořenové části, a to zejména v prvním odběru ve srovnání s druhým odběrem (obr. d). Dosažené výsledky prokázaly, že platina ve srovnání s palladiem

má

na

rostliny

výraznější

inhibiční

účinky.

Vliv PtCl4 na obsah zinku u hrachu v nadzemní (a) a kořenové (b) části a u kukuřice v nadzemní (c) a kořenové (d) části rostlin.

96

Vliv PtCl4 na aktivitu GST u hrachu v nadzemní (a) a kořenové (b) části rostlin a u kukuřice v nadzemní (c) a kořenové (d) části. Závěr Platinové kovy se v současnosti řadí k závažným environmentálním polutantům. Nárůst koncentrací platinových kovů v životním prostředí vzbuzuje obavy z možných zdravotních rizik ve vztahu k obyvatelstvu. Toxický efekt, který byl měřen na základě klíčivosti semen, inhibici růstu rostlin a pomocí markerů z biochemických a elektrochemických měření potvrdily biologickou dostupnost kovu do rostlin. Seznam literatury 1) BAREFOOT, R.R. Distribution and speciation of platinum group elements in environmental matrice. Trac-Trends in Analytical Chemistry.1999, vol. 18, p. 702-707. 2) KÖNIG, H. P., HERTEL, R.F., KOCH, W., ROSNER, G. Determination of platinum emissions from a three-way catalyst-equipped gasoline engine. Atmospheric Environment. 1992, vol. 26A, no. 5, p. 741-745. 3) SCHÄFER, J. Uptake of traffic – related heavy metals and platinum group elements (PGE) by plants. The Science of the Total Environment. 1998, vol. 215, p. 59-67. 4) SIKOROVA L., LICBINSKY R., ADAMEC V. Platinum Group Elements from Automobile Catalysts in the Environment. Chemické listy. 2011, vol. 105, p. 361-366.

97

Zlepšení nutriční hodnoty masných výrobků, přídavkem olejů s obsahem mastných kyselin řady n-3 a přírodních antioxidantů. Pavlík Zdeněk, Saláková Alena, Kameník Josef, Dominik Petr, Steinhauserová Iva Ústav hygieny a technologie masa, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Vícenenasycené mastné kyseliny řady n-3 jsou dnes uznávány jako dietní faktor, který je příznivý pro zdraví a působí k snížení rizika mnoha chorob, především ateroskleróze a dalších kardiovaskulárních onemocnění. Strava v západním světě je na mastné kyseliny řady n-3 chudá a poměr mezi nimi a n-6 kyselinami v potravě není takový, jako je doporučováno (1:5). Důsledkem zaměření se na zvýšení příjmu n-3 mastných kyselin je vývoj nových, funkčních potravin o tyto látky obohacených. Vyšší stupeň nenasycení má však za následek rychlejší oxidaci. Tato náchylnost vícenenasycených mastných kyselin k oxidačním procesům limituje jejich použití v potravinách. Ochranu vícenenasycených mastných kyselin před oxidací je možné zajistit syntetickými, ale i přírodními antioxidanty. Antioxidační účinky některých druhů bylin a koření, jsou již delší dobu dobře známé a zdokumentované. V poslední době jsou popisovány antioxidační účinky extraktů meduňky, přidaných do masných výrobků. Podobně by mohl být využit extrakt vinných semen. Přírodním antioxidantem, který bývá nejčastěji zmiňován v souvislosti s masnými výrobky, je rozmarýn.

Efektivita

těchto

extraktů

byla

testována

v různých

potravinách,

včetně

slunečnicových a rybích olejů, rybím, kuřecím a krůtím mase i vepřovém a hovězím. Cílem práce je optimalizovat recepturu trvanlivých salámů přídavkem mastných kyselin řady n-3 a ověřit, jestli je k jejich ochraně před oxidací vhodné použít přírodní antioxidanty. Materiály Pro účel pokusu byly vyrobeny dva typy trvanlivých masných výrobků. Trvanlivý tepelně opracovaný masný výrobek Vysočina a trvanlivý fermentovaný masný výrobek Poličan. Kontrolní sada vzorků byla vyrobena dle klasické receptury. Vzorky byly označeny tak, že nejprve je uveden druh masného výrobku – P – Poličan, V – Vysočina, číslo označuje druh vzorku – 1 – kontrolní vzorek, 2 – vzorek s přídavkem n-3 mastných kyselin, 3 – vzorek s přídavkem n-3 mastných kyselin a rozmarýnového extraktu, 4 – vzorek s přídavkem rozmarýnového extraktu. Poslední číslo v označení vzorku uvádí dobu zrání, respektive sušení 21 – hotový výrobek. Ze všech sad byly odebírány vzorky k analýze, a to z díla salámu, každý týden v průběhu zrání, z hotového salámu a po jednom a dvou měsících skladování.

98

Metodika Stanovení obsahu tuku – stanovení na přístroji SOXTEC, pro extrakci se byl použit diethyleter. Stanovení obsahu mastných kyselin – plynovou chromatografií s plamenově ionizační detekcí. Stanovení obsahu cholesterolu

–

enzymatická

příprava

vzorků

se

spektrofotometrickým

stanovením.

Stanovení

thiobarbiturového čísla – spektrofotometrické stanovení malondialdehydu. Stanovení hodnoty pH – k měření byl použit pH metr 340i WTW s vpichovou elektrodou SentixSp. Stanovení barvy – měří se přístrojem spektrofotometr KONICA MINOLTA v systému CIELAB. Textura – byla měřena na přístroji INSTRON (W–B test, TPA test). Stanovení obsahu bílkovin – stanovení bylo provedeno na přístroji KJELTEC. Stanovení obsahu kolagenu – stanovení obsahu hydroxyprolinu spektrofotometricky. Stanovení obsahu kyseliny mléčné a kyseliny octové – enzymatická příprava vzorků se spektrofotometrickým stanovením. Stanovení sušiny – gravimetrické stanovení, suší se při teplotě 103 ± 2 °C po dobu 24 hodin. Stanovení soli – titračně dusičnanem stříbrným s přídavkem dichromanu draselného. Aktivita vody – byla měřena na přístroji Novasina LabMaster–aw. Senzorické hodnocení – senzorický profil proveden formou dotazníků se 100 mm stupnicemi. Výsledky Výsledky základních fyzikálně-chemických analýz hotových výrobků jsou uvedeny v tabulce 1. Nebyly zjištěny výrazné rozdíly mezi vzorky v závislosti na přídavku nenasycených mastných kyselin a rozmarýnového extraktu, s výjimkou obsahu malondialdehydu – produktu oxidace tuků. V tabulce

2 jsou uvedeny výsledky instrumentálního měření barvy a textury. Přídavek nenasycených mastných kyselin se u salámu Vysočina projevil zvýšením světlosti výrobku a podílu žluté barvy. V průběhu senzorického hodnocení nezaznamenali hodnotitelé výrazné rozdíly mezi jednotlivými druhy vzorků. Tabulka 1: Výsledky základních fyzikálně-chemických analýz po 21 dnech Vzorek

pH

aw

sušina [%]

tuk [%]

TBA [mg/kg]

sůl [%]

ČSB [%]

P1 21

4.600 ± 0.005 0.895 ± 0.002 71.400 ± 0.290

43.560 ± 2.400

2.262 ± 0.117

3.893 ± 0.018 18.593 ± 0.581

P2 21

4.565 ± 0.005 0.884 ± 0.002 71.455 ± 0.505

42.350 ± 0.410

4.290 ± 0.117

3.885 ± 0.180 17.258 ± 0.083

P3 21

4.484 ± 0.005 0.881 ± 0.000 70.780 ± 0.270

39.455 ± 1.595

2.789 ± 0.215

3.918 ± 0.103 18.501 ± 1.191

P4 21

4.559 ± 0.006 0.898 ± 0.001 71.600 ± 0.700

43.265 ± 0.915

2.360 ± 0.020

3.748 ± 0.088 17.223 ± 0.460

V1 21

5.390 ± 0.053 0.918 ± 0.001 68.255 ± 0.035

41.870 ± 0.200

0.605 ± 0.058

3.858 ± 0.122 17.983 ± 0.400

V2 21

5.573 ± 0.027 0.920 ± 0.002 68.815 ± 0.145

42.045 ± 1.365

3.819 ± 0.273

3.828 ± 0.023 16.943 ± 0.311

V3 21

5.466 ± 0.072 0.912 ± 0.003 69.870 ± 0.560

40.050 ± 1.400

1.741 ± 0.001

3.710 ± 0.145 18.642 ± 1.329

V4 21

5.536 ± 0.030 0.917 ± 0.002 69.380 ± 0.440

40.145 ± 0.045

2.028 ± 0.000 3.855 ± 0.165

18.210 ± 0.336

Tabulka 2: Výsledky instrumentálního měření textury a barvy po 21 dnech

99

max. síla Vzorek W-B [N]

max. síla TPA [N]

soudržnost

L*

a*

b*

P1 21

42.66 ± 5.58

97.13 ± 18.99

1.32 ± 0.03

43.85 ± 1.28

14.23 ± 1.77

8.50 ± 1.68

P2 21

39.41 ± 2.95

92.40 ± 7.52

1.32 ± 0.02

42.20 ± 1.23

14.27 ± 0.88

10.10 ± 0.46

P3 21

38.20 ± 4.29

92.70 ± 7.72

1.34 ± 0.01

41.76 ± 0.59

14.12 ± 0.72

10.35 ± 1.67

P4 21

41.93 ± 2.36

97.83 ± 8.81

1.32 ± 0.02

42.69 ± 2.34

14.52 ± 1.30

11.91 ± 1.80

V1 21

35.16 ± 4.00

42.11 ± 8.47

1.36 ± 0.02

43.94 ± 3.72

15.10 ± 1.53

11.22 ± 0.80

V2 21

33.46 ± 3.93

41.03 ± 3.49

1.36 ± 0.02

49.28 ± 0.26

16.69 ± 0.41

13.40 ± 0.79

V3 21

33.27 ± 3.56

39.96 ± 8.81

1.36 ± 0.05

43.44 ± 2.55

15.92 ± 0.75

10.40 ± 0.56

V4 21

38.00 ± 2.17

49.99 ± 8.90

1.36 ± 0.02

40.93 ± 0.19

15.70 ± 0.81

10.13 ± 0.42

(L* - světlost, a* - podíl červené barvy, b* - podíl žluté barvy)

Závěry V pokusu jsme sledovali vliv přídavku nenasycených mastných kyselin a přírodních antioxidantů na jakostní parametry masných výrobků. Mezi jednotlivými druhy vzorků nebyly zjištěny výrazné rozdíly v senzorických ani fyzikálně-chemických parametrech. Byly však zjištěny výrazné rozdíly v průběhu oxidačních změn. Masné výrobky s přídavkem samotných nenasycených mastných kyselin vykazovaly zvýšenou míru oxidace. Tento efekt byl z velké části eliminován u vzorků, kde byl navíc přítomen rozmarýnový extrakt. Naopak přídavek samotného antioxidantu neměl výrazný vliv na tlumení oxidačních procesů ve srovnání s kontrolními vzorky.

Seznam literatury 1) BRANNAN, R. G.: Effect of grape seed extract on descriptive sensory analysis of ground chicken during refrigerated storage. Meat Science, 2009, 81, 589–595. 2) GARCÍA-IŃIGUEZ DE CIRIANO, M. et al.: Effect of lyophilized water extracts of Melissa officinalis on the stability of algae and linseed oil-in-water emulsion to be used as a functional ingredient in meat products, Meat science, 2010a, 85, 373 – 377. 3) GARCÍA-IŃIGUEZ DE CIRIANO, M. et al.: Selenium, iodine, x-3 PUFA and natural antioxidant from Melissa officinalis L.: A combination of components from healthier dry fermented sausages formulation, Meat science, 2010b, 85, 274 – 279. 4) HAAK, L.: Effect of plant phenolics, tocopherol and ascorbic acid on oxidative stability of pork patties. J Sci Food Agric, 2009, 89, 1360 –1365. 5) SHIRAHIGUE, L. D. et al.: Wine industry residue as antioxidant in cooked chicken meat. International Journal of Food Science and Technology, 2010, 45, 863 – 870.

100

Riziko kombinované expozice ptáků cyanotoxiny, inhibitory acetylcholinesterázy a antikoagulanty Karel Ondráček, Jiří Pikula, Hana Banďouchová, Veronika Damková, Jiří Král, Jitka Osičková Ústav veterinární ekologie a ochrany životního prostředí, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod V životním prostředí mohou být ptáci vystaveni mnoha rizikům včetně přírodních toxinů a antropogenních kontaminantů. Z přírodních toxinů se mohou uplatňovat toxiny sinic (cyanotoxiny) z antropogenních polutantů např. inhibitory acetylcholinesterázy a antikoagulanty. Kromě případových studií se toxicitou sinic zabývaly i experimentální studie (Skocovska et al., 2007); stejně tak u antikoagulantů (Beklová et al., 2007). Nejčastěji byly demonstrovány převážně subletální efekty na úrovni biochemických odpovědí a subcelulární histopatologické změny u jednotlivých sledovaných látek. V současné době je aktuální nenazírat na danou problematiku jako na soubor jednotlivých rizik, ale pochopit možnosti kombinací jednotlivých stresorů. V prostředí se většina toxických látek dostává do potravního řetězce v subletálních dávkách, kdy můžeme uvažovat o ovlivňování jejich účinků jinou toxickou látkou nebo infekčním agens ve směsi. Jejich účinky se pak mohou sčítat nebo potencovat. Na toto téma již bylo upozorněno (Kortenkamp et al., 2007) a některé studie hodnotící více rizik pro ptáky již byly publikovány (Pikula et al., 2010). Cílem tohoto projektu je ověření hypotézy, že koexpozice ptáků subletálními dávkami cyanotoxinů, inhibitorů acetylcholinesterázy a antikoagulantů ovlivní klinické příznaky, biochemické a histopatologické změny, kumulaci jednotlivých toxinů případně úmrtnost více, než jednotlivé expozice těmito látkami. Materiál a metodika Experiment byl prováděn dle metodiky OECD 205 s drobnými modifikacemi pro naše experimentální podmínky a v souladu s vyhláškou č. 207/2004 Sb., o ochraně, chovu a využití pokusných zvířat a podle zákona č. 312/2008 Sb., na ochranu zvířat proti týrání. Modelovým ptačím druhem byla křepelka japonská (Coturnix coturnix japonica). Do pokusu byli zařazeni jedinci ve věku 2 měsíce. Ptáci byli rozděleni po párech do skupin po šesti kusech. Celkem bylo použito 46 experimentálních ptáků (8 skupin po šesti jedincích, poměr pohlaví 1:1). Experimentální skupiny byly sestaveny následovně: 1. Kontrola, 2. Expozice cyanotoxinům, 3. Expozice inhibitorům acetylcholinesterázy, 4. Expozice antikoagulantům, 5. Kombinovaná expozice cyanotoxinům a inhibitorům acetylcholinesterásy, 6. Kombinovaná expozice cyanotoxinům a antikoagulantům, 7. Kombinovaná expozice inhibitorům acetylcholinesterásy a antikoagulantům, 8. Kombinovaná

101

expozice cytotoxinům, inhibitorům acetylcholinesterásy a antikoagulantům. Test zahrnoval 10 dní aklimatizace a 10 dní vlastního testu. Expozice sinicím byla prováděna formou přídavku lyofilizované cyanobakteriální biomasy do kompletní krmné směsi. Expozice inhibitory acetylcholinesterázy a antikoagulanty byla prováděna aplikací (500mg/kg bromadiolone a 0,5mg/kg paraoxon) perorálně. Po uplynutí desetidenní expozice byl u všech exponovaných i kontrolních jedinců proveden odběr krve pro hematologické a biochemické vyšetření a ptáci byli utraceni pro odběr vzorků tkání (játra, mozek, plíce, ledvina, slezina, varlata, vaječník, svalovina) na histopatologii, elektronovou mikroskopii, stanovení parametrů oxidativního stresu a analýzu obsahu mikrocystinů, inhibitorů acetylcholinesterázy a antikoagulantů. Výsledky V průběhu pokusu nebyla zaznamenána změna chování exponovaných skupin oproti kontrole ani úhyn testovaných jedinců. I přes absenci klinických příznaků byl zjištěn významný vliv bromadiolonu, paraoxonu a cyanotoxinů na biochemické parametry krve podílejících se na energetickém metabolismu organizmu, především u celkového cholesterolu, high-density lipoprotein cholesterolu a glukosy (obr. 1-3). Dále byly odebrány vzorky tkání ke stanovení parametrů oxidativního stresu a analýze obsahu mikrocystinů, inhibitorů acetlychlinesterázy a antikoagulantů pro ucelení informací. 8,5

Total cholesterol (mmol/l)

7,5 6,5 5,5 4,5 3,5 2,5 k

p

p+b

b

b+s

p+s

s

p+b+s

±Std. Dev. ±Std. Err. Mean

Groups of birds

Obr.1 Celkový cholesterol: porovnání parametru celkového cholesterolu v krvi u jednotlivých skupin ptáků: k-kontrola, p-paraoxon, p+b-kombinace paraoxon a bromadiolone, b-bromadiolone, b+s-kombinace bromadiolone a biomasa sinic, s-biomasa sinic, p+b+s-kombinace paraoxon, bromadiolon a biomasa sinic.

102

High-density lipoprotein cholesterol (mmol/l)

5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 k

p

p+b

b

b+s

p+s

s

p+b+s

±Std. Dev. ±Std. Err. Mean

Groups of birds

Obr.1 HDL cholesterol: porovnání parametru High-density lipoprotein cholesterolu v krvi u jednotlivých skupin ptáků. 19,5

Glucose (mmol/l)

18,0

16,5

15,0

13,5

12,0 k

p

p+b

b

b+s

p+s

s

p+b+s

±Std. Dev. ±Std. Err. Mean

Groups of birds

Obr.1 Glukosa: porovnání parametru glukosy v krvi u jednotlivých skupin ptáků. Seznam literatury 1) BEKLOVA M, KRIZKOVA S, SUPALKOVA V, MIKELOVA R, ADAM V, PIKULA J, KIZEK R: Determination of bromadiolone in pheasants and foxes by differential pulse voltametry. International Journal of Enviromental and Analytical Chemistry, 2007, 87: 459469. 2) KORTENKAMP A, FAUST M, SCHOLZE M, BACKHAUS T: Low-Level Exposure to Multiple Chemicals: Reason for Human Health Concerns? Environmental Health Perspectives, 2007, 115: 106-114. 3) PIKULA J, BANDOUCHOVA H, HILSCHEROVA K, PASKOVA V, SEDLACKOVA J, ADAMOVSKY O, KNOTKOVA Z, LANY P, MACHAT U, MARSALEK B, NOVOTNY L, POHANKA M, VITULA F: Combined exposure to cyanobacterial biomass, lead and the Newcastle virus enhances avian toxicity. Science of the Total Environment, 2010, 408: 4984– 4992. 4) SKOCOVSKA B, HILSCHEROVA K, BABICA P, ADAMOVSKY O, BANDOUCHOVA H, HORAKOVA J, KNOTKOVA Z, MARSALEK B, PASKOVA V, PIKULA J: Effects of cyanobacterial biomass on the Japanese quail. Toxicon, 2007, 49: 793–803.

103

Riziko kombinované expozice ptáků nesteroidním antiflogistikům a olov Jitka Osičková, Jiří Pikula, Hana Banďouchová, Veronika Damková, Jiří Král, Karel Ondráček Ústav veterinární ekologie a ochrany životního prostředí, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Diclofenac, nesteroidní antiflogistikum, je v současné době považován za významný kontaminant životního prostředí. Používá se jako analgetikum, antiflogistikum a antipyretikum. Je extrémně toxický pro supy, u kterých způsobuje viscerální dnu, selhání ledvin a následný úhyn jedince za několik dnů po expozici. Primárním zdrojem potravy pro supy je mrtvý dobytek. Byla proto vytvořena hypotéza, že požití veterinárních léčiv v mršinách dříve léčeného dobytku může být odpovědné za renální selhání mrchožravých ptáků. Zatímco toxicita olova pro vodní i terestriální ptáky je podrobně prostudována, účinky nesteroidních antiflogistik na ptáky byly dlouho popsány jen formou případových studií a experimentálně se touto problematikou zabývalo málo autorů. Volně žijící ptáci mohou být vystaveni kombinovanému účinku řady stresorů včetně přirozených toxinů, antropogenních polutantů či infekčních agens, jejichž negativní účinky se mohou sčítat či potencovat. Hypotézou tohoto projektu je, že subletální kombinovaná expozice nesteroidním antiflogistikům a olovu způsobí větší efekty a úhyn ptáků než expozice jednotlivé.

Materiál a metodika Do pokusu bylo zařazeno 40 jedinců křepelky japonské (Coturnix coturnix japonica) ve stáří 2 měsíců o průměrné hmotnosti 180 g. Byly vytvořeny 4 experimentální skupiny po 10 jedincích (1. kontrola, 2. expozice olovu, 3. expozice nesteroidním antiflogistikům, 4. expozice nesteroidním antiflogistikům a olovu). Expozice nesteroidním antiflogistikům probíhala intramuskulárním podáním přípravku Dolmina (Zentiva, a.s.) v množství 2,5 mg.kg-1. Expozice olovu byla provedena vložením šesti olověných broků o celkové hmotnosti 1,5 g do volete. Ty se poté stávají součástí gritu svalnatého žaludku. Kontrolním zvířatům bylo podáváno stejné krmivo bez přídavku léčiv a Pb. U všech jedinců byla sledována úmrtnost, dále váhové parametry na začátku a na konci pokusu, příznaky intoxikace a projevy abnormálního chování.

104

Design testu zahrnoval 7 dní aklimatizace a 10 dnů vlastního pokusu. Zvířata byla krmena potravou obsahující zkoušenou látku v periodě pěti dnů. Začátkem šestého dne byli ptáci krmeni základní potravou bez zkoušené látky, a to minimálně po dobu dalších tří dnů. Denně byly zaznamenávány úhyny a příznaky toxicity. Výsledky Během pokusu nevykazovaly exponovaní jedinci žádné odchylky v chování nedošlo ani k žádným úhynům. Z tohoto důvodu lze předpokládat, že uvedené dávky olova a nesteroidních antiflogistik byly pro exponované jedince subletální. Na základě hematologického vyšetření byly zjištěny nižší hodnoty hemoglobinu u jedinců exponovaných olovu (Graf č.1). Hodnoty hematokritu byly nejnižší u jedinců exponovaných olovu a kombinaci olova a nesteroidních antiflogistik (Graf č. 2). Pro získání kompletních informací byly odebrány vzorky jater, plic, srdce, ledvin, mozku, sleziny a pohlavních orgánů k histologickému vyšetření, ke stanovení parametrů oxidativního stresu a analýzu obsahu reziduí olova. Graf č.1: Naměřené hodnoty hemoglobinu (g/l)

180

Hemoglobin (g/l)

160

140

120

100

80 Control

NSAIDs

Pb

Pb+NSAIDs

±Std. Dev. ±Std. Err. Mean

Groups

105

Graf č.2: Zjištěné hodnoty hematokritu

0,64 0,60

hematocrit (l/l)

0,56 0,52 0,48 0,44 0,40 Control

NSAIDs

Pb

Pb+NSAIDs

±Std. Dev. ±Std. Err. Mean

Groups

Seznam literatury

1) Todd PA, Sordin EM. Diclofenac sodium. A reappraisal pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic efficacy. Drugs, 1988, 35: 244-285. 2) Rattner BA, Whitehead MA, Gasper G, Meteyer CU, Link WA, Taggart MA, Meharg AA,

Pattee OH, Pain DJ. Apparent tolerance of turkey vultures (Cathartes aura) to the nonsteroidal anti-inflammatory drug diclofenac. Environmental Toxicology and Chemistry, 2008, 27(11): 2341-2345.

3) Fisher IJ, Pain DJ, Thomas VG. A review of lead poisoning from ammunition sources in terrestrial birds. Biological Conservation, 2006, 131: 421–432. 4) Oaks JL, Gilbert M, Virani MZ, Watson, RT, Meteyer, CU, Rideout BA, Shivaprasad HL, Ahmed S, Chaudhry MJI, Arsha M, Mahmood S, Ali A, Khan AA. Diclofenac residues as the 5) cause of vulture population decline in Pakistan. Nature, 2004, 427: 630-633. 6) Pikula J, Bandouchova H, Hilscherova K, Paskova V, Sedlackova J, Adamovsky O,

Knotkova Z, Lany P, Machat J, Marsalek B, Novotny L, Pohanka M, Vitula F. Combined exposure to cyanobacterial biomass, lead and the Newcastle virus enhances avian toxicity. Science of the Total Environment, 2010, 408: 4984–4992.

106

Perorální toxicita mikrocystinů pro ptáky Jiří Král, Jiří Pikula, Hana Banďouchová, Veronika Damková, Jitka Osičková, Karel Ondráček Ústav veterinární ekologie a ochrany životního prostředí, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Sinice neboli cyanobakterie představují skupinu prokaryotických organismů, schopných produkce toxických

sekundárních metabolitů – cyanotoxinů. V posledních desetiletích dochází především díky eutrofizaci vod k rozvoji sinic, což při masových úhynech zejména volně žijícího vodního ptactva vyslovuje hypotézu o možné intoxikaci cyanotoxiny.

Sinice se v současné době stávají celosvětovým problémem v souvislosti s produkcí cyanotoxinů, které mohou vstupovat do potravního řetězce a po kumulaci v orgánech a tkáních lovné pernaté zvěře ohrožovat i zdraví člověka. Volně žijící ptáci mohou být vystaveni účinku řady stresorů, zejména přirozených toxinů, antropogenních polutantů či infekčních agens, jejichž negativní účinky se mohou sčítat či potencovat. Subletální účinky a expozice mixturám toxikantů často zůstávají nerozpoznány. Přesto mohou mít velký význam a dopad na úrovni ptačích populací. Takto získané výsledky budou environmentálně relevantní a budou využitelné pro odhad rizik mikrocystinů pro volně žijící ptáky s praktickým dopadem v jejich ochraně. Materiál a metodika Do pokusu bylo zařazeno 50 kusů křepelky japonské (Coturnix coturnix japonica) ve stáří 14 dnů o průměrné hmotnosti 50g, z nichž byly vytvořeny vždy po deseti kusech 4 skupiny pokusné a 1 kontrolní. Pokusným skupinám byla jednorázově perorálně podána biomasa sinic, jejíž množství se řídilo obsahem mikrocystinu v ní obsaženém (1 862,77µg/g sušiny). Základní dávka mikrocystinu byla přejata z nejvyšší perorální LD50 pro savce, což činí 10 000µg/kg. Jednotlivým skupinám bylo podáno množství ¼LD50, ½LD50, LD50 a 2LD50 (Tab. 1). Již při podávání biomasy bylo jasné, že objemy biomasy potřebné k vyvolání ½LD50 a víše nejsou daní jedinci za fyziologických podmínek schopni jednorázově pozřít. Jelikož nedošlo k žádným úhynům, byly ptáci po pěti dnech usmrceni a jednotlivé orgány byly podrobeny dílčím analýzám (oxidativní stres, histologické vyšetření a stanovení množství mikrocystinu ve tkáních)

107

Výsledky Během pokusu nevykazovaly exponovaní jedinci žádné výrazné anomálie v chování a nedošlo ani k úhynům, proto lze vyslovit, že toxicita mikrocystinu v biomase sinic je pro ptactvo mnohem nižší než pro savce. Přesto, že nebyly pozorovány klinické projevy, byl zjištěn vliv mikrocystinu na jaterní parenchym, což dokládají hodnoty poměru hmotnosti jater k hmotnosti živých jedinců (Graf 1). Pro dokreslení celého obrazu byly odebrány vzorky plic, srdce, jater, ledvin, mozku a sleziny k histologickému vyšetření, dále byly zaslány vzorky plic, srdce, jater, svalu, ledvin a mozku ke stanovení oxidativního stresu a na závěr byl odebrán vzorek svalu a jater pro stanovení obsaženého množství mikrocystinu v těchto tkáních.

Dávka microcystinu (µg/kg) 1/4LD50

20 000

1/2LD50

10 000

LD50

5 000

2LD50

2 500

Tab. 1 Dávky mikrocystinu pro jednotlivé pokusné skupiny

46

Body/liver weight ratio

42 38 34 30 26 22 1/4 LD 50

1/2 LD 50

LD50

2 LD 50

Control

±Std. Dev. ±Std. Err. Mean

Groups

Graf 1 Poměr hmotnosti jater k živé hmotnosti zvířat

108

Seznam literatury

1) Alonso-Andicoberry C, Garcia-Villada L, Lopez-Rodas V, Costas E: Catastrophic mortality of flamingos in a Spanish national park caused by cyanobacteria. Veterinary Record 2002, 151:706–7. 2) Damkova V, Sedlackova J, Bandouchova H, Peckova L, Vitula F, Hilscherova K, Paskova V,

Kohoutek J, Pohanka M, Pikula J: Effects of cyanobacterial biomass on avian reproduction: a Japanese quail model. Neuroendocrinology Letters, 2009, 30 (Suppl 1): 205-210. 3) Peckova L, Bandouchova H, Hilscherova K, Damkova V, Sedlackova J, Vitula F, Paskova V, Pohanka M, Kohoutek J, Pikula J: Biochemical responses of juvenile and adult Japanese quails to cyanobacterial biomass. Neuroendocrinology Letters, 2009, 30 (Suppl 1): 199-204. 4) Skocovska B, Hilscherova K, Babica P, Adamovsky O, Bandouchova H, Horakova J, Knotkova Z, Marsalek B, Paskova V, Pikula J: Effects of cyanobacterial biomass on the Japanese quail. Toxicon, 2007, 49: 793–803. 5) Takahashi S, Kaya K: Quail spleen is enlarged by microcystin RR as a blue–green algal hepatotoxin. Natural Toxins 1993, 1: 283–285.

109

Obsah kovů ve tkáních ryb z nádrží Skalka a Želivka a jejich podíl na vznikuoxidativního stresu u ryb Marie Ševčíková, Helena Modrá, Kamila Novotná Kružíková, Adriana Kratošová, Tomáš Král

Ústav veřejného veterinárního lékařství a toxikologie, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Kovy jsou významnými kontaminanty vodního prostředí. Protože akumulace a nízká biodegrabilita kovů ve tkáních ryb umožňuje jejich zapojení do potravního řetězce, představují ryby významný zdroj toxických kovů pro člověka (Luoma and Rainbow, 2008). Z toho důvodu jsou pro obsah olova, kadmia a rtuti stanoveny Nařízením ES č. 1881/2006 maximální limity, které nesmí být ve svalovině ryb překročeny. Kovy se zapojují do mnoha biologických procesů. Těžké kovy mají navíc schopnost katalyzovat reakce za vzniku volných kyslíkových radikálů, které mohou způsobit peroxidaci lipidů membrán, oxidaci proteinů a oxidaci DNA. Jako obrana proti škodlivému působení volných kyslíkových radikálů u ryb se uplatňují enzymatické i neenzymatické systémy, které zároveň slouží jako biomarkery oxidativního poškození (Di Giulio and Meyer, 2008).

Cílem projektu bylo zhodnotit podíl toxických kovů na vzniku oxidativního stresu u ryb v terénních podmínkách a posoudit svalovinu ryb z hlediska obsahu kovů a z toho vyplývající riziko konzumace pro člověka.

Materiál a metodika Lokality a odebírané vzorky Pro řešení projektu byly vybrány lokality, které jsou dlouhodobě sledovány z hlediska kontaminace kovy, především organickou rtutí (Maršálek et al., 2005). Nádrž Skalka je dlouhodobě kontaminovaná rtutí, nádrž Želivka slouží jako kontrolní nezatížená lokalita. Z nádrže Skalka bylo odloveno 11 druhů ryb, celkem 53 kusů, a z nádrže Želivka 8 druhů ryb, celkem 50 kusů. V terénu byly odebrány vzorky svaloviny, jater (hepatopankreatu), žaber a ledvin. Vzorky byly transportovány do laboratoře při teplotě -18°C, poté byly až do analýzy zmraženy na -85°C. Analýzy kovů Obsah celkové rtuti ve svalovině a játrech (hepatopankreatu) byl stanoven metodou AAS na jednoúčelovém analyzátoru AMA 254. Methylrtuť ve svalovině byla stanovena po kyselé digesci vzorku s HCl a extrakci do toluenu pomocí plynové chromatografie s detekcí elektronového

110

záchytu. Po mineralizaci vzorků s kyselinou dusičnou a peroxidem vodíku byla analýza ostatních kovů (Cd, Cu, Ni, Pb, Zn a As) provedena rovněž metodou AAS. Analýza parametrů oxidativního stresu Ve vzorcích jater (hepatopankreatu), žaber a ledvin byl stanoven poměr redukovaného a oxidovaného glutathionu vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s elektrochemickou detekcí a obsah metalothioneinů diferenční pulzní voltametrií (Brdičkovou reakcí). Glutathionreduktáza, glutathion-S-transferáza a produkty lipidní peroxidace byly stanoveny spektrofotometricky.

Výsledky Stanovení celkové rtuti a metylrtuti Porovnáním nádrží Skalka a Želivka z hlediska obsahu celkové rtuti ve svalovině, celkové rtuti v játrech (hepatopankreatu) a metylrtuti ve svalovině byl zjištěn statisticky významný rozdíl u dravých (Graf 1.) i nedravých druhů ryb (p < 0,01). Maximální limit pro celkovou rtuť ve svalovině, dle Nařízení ES č. 1881/2006, byl překročen u čtyř vzorků z nádrže Želivka (n = 50) a pouze 19 vzorků z nádrže Skalka (n = 53) tento limit nepřekročilo. Metylrtuť představovala většinový podíl z celkové rtuti ve svalovině u obou nádrží (dravé a nedravé druhy ryb z nádrže Želivka 79,1% a 71,1%; dravé a nedravé druhy ryb z nádrže Skalka 98,7% a 97,4%). Stanovení ostatních kovů Statisticky významný rozdíl mezi lokalitami byl zjištěn u dravých druhů ryb v obsahu Cd, Cu a As ve svalovině a As v játrech (p < 0,05). Srovnáním nedravých druhů ryb z obou lokalit byl zjištěn statisticky významný rozdíl v obsahu As ve svalovině a Cd, Zn a As v hepatopankreatu (p < 0,05). Maximální limit pro Pb a Cd ve svalovině ryb nebyl překročen u žádného vzorku z nádrže Skalka (n = 53) ani z nádrže Želivka (n = 50). Stanovení parametrů oxidativního stresu Obsah celkové rtuti ve svalovině a játrech (hepatopankreatu) a obsah metylrtuti, ve vzorcích z nádrže

Želivka

(n

=

50),

koreluje

negativně

s obsahem

metalothioneinů

v játrech

(hepatopankreatu). Obsah metalothioneinů v ledvinách, ve vzorcích z nádrže Skalka (n = 53), koreluje negativně s obsahem celkové rtuti ve svalovině a játrech (hepatopankreatu). Ostatní parametry oxidativního stresu (GR, GST, LPO) neukázaly statisticky významné rozdíly.

111

Závěry Na základě získaných hodnot lze potvrdit přetrvávající kontaminaci nádrže Skalka rtutí. Konzumace ryb z této lokality může pro člověka představovat zdravotní riziko, zvláště kvůli většinovému podílu metylrtuti z celkové rtuti ve svalovině. Vzhledem k negativní korelaci obsahu metalothioneinů a rtuti ve tkáních ryb, lze usoudit, že v případě terénních studií s rtutí, nejsou metalothioneiny vhodnými markery. Protože nebyly pozorovány rozdíly hodnot parametrů oxidativního stresu v játrech (hepatopankreatu) ryb odlovených v nádržích Skalka a Želivka, lze konstatovat, že se ryby v nádrži Skalka na dlouhodobé působení rtuti adaptovaly. 2,00 1,80 1,60

mg/kg

1,40 1,20

Celková rtuť (svalovina)

1,00

Metylrtuť (svalovina)

0,80

Celková rtuť (játra)

0,60 0,40 0,20 0,00 Želivka

Skalka

Graf 1. Porovnání obsahu celkového rtuti a metylrtuti ve svalovině a celkové rtuti v játrech u dravých druhů ryb mezi nádržemi Želivka a Skalka (p < 0,01). Seznam literatury 1) DI GIULIO, R.T., MEYER, D.E. Reactive oxygen species and oxidative stress. In The toxicology of fishes. 1st edition. Boca Raton: CRC Press Taylor & Francis Group, 2008. Capitol 6, p. 273-324. 2) LUOMA, S.N., RAINBOW, P.S. Sources and cycles of trace matals. In Metal contamination in aquatic environments: Science and lateral management. 1st edition. New York: Cambridge University Press, 2008. Capitol 4, p. 47-66. 3) MARŠÁLEK, P. et al. J. Mercury and methylmercury contamination of fish from the Skalka reservoir. Acta Veterinaria Brno, 1996, vol. 74, no. 4, p. 427–434.

112

Stanovení biomarkerů oxidativního stresu u ryb po dlouhodobém působení triazinů Martin Hostovský, Zdeňka Svobodová, Zuzana Široká, Lenka Divišová, Jana Poláčková Ústav veřejného veterinárního lékařství a toxikologie, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Pesticidy jsou látky a směsi látek, určené pro prevenci, ničení nebo kontrolu škůdců (FAO, 2002). Současným dlouhodobým problémem je extenzivní používání pesticidů v zemědělství a perzistence těchto látek v životním prostředí, zejména v povrchových a podzemních vodách (ČHMÚ, 2010). Triazinové pesticidy jsou selektivní herbicidy, které působí jako inhibitory fotosyntézy rostlin (Roberts et al., 1998). Tyto heterocyklické sloučeniny lze rozdělit do dvou skupin – asymetrické (metribuzin) a symetrické triaziny (např. atrazin, simazin nebo terbutylazin). Triaziny jsou ve velkém množství

používány jak na některé obiloviny, tak na ostatní zemědělské plodiny Waxman, 1998). Přestože některé triaziny, např. atrazin, byly v mnohých zemích zakázány, jsou stále jednou z nejčastěji používaných skupin pesticidů (SRS, 2010). K negativním účinkům pesticidů na ryby patří také oxidativní stres. Možností, jak sledovat a hodnotit působení volných radikálů, je stanovení biomarkerů oxidativního stresu. Biomarkery oxidativního stresu jsou zejména produkty peroxidace lipidů, např. – malondialdehyd (MDA), který je sekundárním lipidickým oxidačním produktem vznikajícím reakcí volných radikálů s nenasycenými mastnými kyselinami. Dalším biomarkerem je antioxidační enzym glutathion reduktasa (GR) katalyzující přeměnu oxidovaného glutathionu na redukovaný glutathion za spotřeby NADPH (Di Giulio and Meyer, 2008). Jako ukazatel detoxikace triazinů je vhodné použít stanovení aktivity enzymu glutathion-S-transferasy (GST) (Zhu, 2011).

Cílem práce bylo zavedení metodik stanovení výše uvedených biomarkerů oxidativního stresu ve vzorcích ryb z dlouhodobých testů toxicity. Výsledkem bude zhodnocení vlivu dlouhodobého působení triazinů na ryby. Materiál a metodika Ke stanovení biomarkerů oxidativního stresu byly využity vzorky ryb a jejich tkání získané z dlouhodobých testů toxicity s triazinovými přípravky na rybách, které proběhly na Ústavu veřejného veterinárního lékařství toxikologie v roce 2010. Testy embryo-larvalní toxicity byly provedeny semistaticky dle metodiky OECD 210 (Fish, Early-life stage toxicity test) (OECD210, 1992). Oplodněné jikry ryb byly rozděleny do skupin dle koncentrace aktivní látky a do jedné kontrolní skupiny K. Testovány byly terbutylazin (přípravek Sencor 70 WG; AgroBio Opava, s.r.o.; koncentrace aktivní látky pro skupiny T1-T4 byla 0.9, 160, 520 a 820 µg/L) a metribuzin (přípravek

113

Click 500 SC; SIPCAM S.p.A.; koncentrace aktivní látky pro skupiny M1-M4 byla 0.9, 4, 14 a 32 mg/L) na kaprovi obecném (Cyprinus carpio). Test trval 30 dní a poté bylo provedeno zhodnocení řady ukazatelů hematologických, biochemických a histopatologických. Část ryb byla uskladněna při teplotě -86°C a poté použita pro hodnocení biomarkerů oxidativního stresu. Pro stanovení MDA - lipidní peroxidace byla využita metoda TBARS test (thiobarbituricacid reactive

substances = látky reaktivní s kyselinou thiobarbiturovou). Metoda je založená na stanovení barevných adduktů, vznikajících reakcí produktů lipidní peroxidace s kyselinou thiobarbiturovou, které jsou kvantifikovány spektrofotometricky při 532 nm (Livingstone et al. 1989; Surai et al. 1996, Uchiyama and Mihara 1978). Aktivita GR je stanovována na základě úbytku množství NADPH v reakci, kde GR katalyzuje přeměnu oxidovaného glutathionu (GSSG) na redukovaný glutathion (GSH) a spotřeby NADPH (Carlerg a Mannervik, 1985). Metoda je modifikovaná na mikrodeskové provedení a využívá spektrofotometrické koncovky 340 nm. Katalytická koncentrace GST byla měřena spektrofotometricky na základě detekce tvorby konjugátu mezi redukovaným glutathionem a substrátem 1-chloro-2,4-dinitrobenzenem (Habig et al., 1974) při 340 nm. Všechna spektrofotometrická měření byla provedena na mikrodeskách s použitím přístroje Varioskan Flash Spectral Scanning Multimode Reader (Thermo Fisher Scientific Inc.) a pro základní zpracování výsledků byl použit program Excel MS Office 2007 CZ. Výsledky Pro změnu lipidní peroxidace po působení terbutylazinu jsme zjistili výraznější nárůst hladiny TBARS (12,81 nmol/g vzorku) srovnáním skupiny T4 s nejvyšší koncentrací aktivní látky oproti kontrole (10,52 nmol/g vzorku). Metribuzin vyvolal nárůst hladiny TBARS oproti kontrole u skupin M2 (27,11 nmol/g vzorku) a M4 s nejvyšší koncentrací metribuzinu (16,62 nmol/g vzorku). Nárůst aktivity enzymu GR v porovnání s kontrolní skupinou K (17,88 nmol NADPH/min/mg protein) jsme pro terbutylazin zaznamenali u skupin T2 (19,45 nmol), T4 (21,98 nmol) a zejména T3 (23,01 nmol). Nárůst aktivity po působení metribuzinu byl pro skupiny M1; M2 a M3 (24,99; 23,31 a 25,94 nmol NADPH/min/mg protein). Detoxikační aktivita enzymu GST se projevila ve srovnání s testovanou kontrolní skupinou K (73,64 nmol/min/mg protein) po působení terbutylazinu zejména zvýšenou aktivitou ve skupinách T1, T3 a T4 (80,56; 78,58 a 83,91 nmol/min/mg protein). Pro metribuzin se v jednotlivých M1 až M4 skupinách zvyšovala aktivita GST přímo dle zvyšující se koncentrace aktivní látky (96,98; 107,90; 126,64 a 139,87 nmol/min/mg protein) oproti kontrole. Souhrnné výsledky uvádí tabulka 1.

114

Tabulka 1: TBARS, aktivita GR a aktivita GST po působení terbutylazinu a metribuzinu TBARS (nmol/g vzorku):

Aktivita GR (nmol NADPH/min/mg protein)

Aktivita GST (nmol/min/mg protein)

10,52

17,88

73,64

0.9

6,85

17,91

80,56

T2

160

7,75

19,45

75,45

T3

520

5,49

23,01

78,58

T4

820

12,81

21,98

83,91

Metribuzin

(mg/L)

M1

0.9

9,72

24,99

96,98

M2

4

27,11

23,31

107,90

M3

14

9,20

25,94

126,64

M4

32

16,62

18,96

139,87

Aktivní látka/skupiny:

Koncentrace aktivní látky:

Kontrola

0

Terbutylazin

(µg/L)

T1

Závěry Pesticidy jsou významnými polutanty a jejich výskyt ve vodním prostředí má velký vliv na organismy, jež jsou součástí tohoto ekosystému. Zaměřili jsme konkrétně na triazinové pesticidy a jejich možný vliv na antioxidační a detoxikační mechanismy u ryb v dlouhodobém testu toxicity. Tato skupina pesticidů měla vliv na zvýšení biomarkerů oxidativního stresu a detoxikačních enzymů především ve vyšších koncentracích testované aktivní látky. Vliv triazinů na oxidativní stres u ryb byl popsán zejména zvýšením lipidní peroxidace (Oropesa, 2009; Elia, 2002). Další práce ukazují negativní vliv triazinů s použitím biomarkerů oxidativního stresu (Slaninová. 2009; Velíšek, 2011). Pro celkové posouzení vlivu triazinů na ryby budou vyhodnoceny také ostatní biomarkery oxidativního stresu. Práce byla financována v rámci projektu IGA 90/2011/FVHE

Seznam literatury Seznam literatury a citovaných zdrojů je k dispozici u autorů.

115

Stanovení významných barviv u vybraných produktů rostlinného původu a sledování jejich změn v závislosti na technologických operacích a skladovacích podmínkách Tauferová, A., Tremlová, B., Ošťádalová, M., Pokorná, J., Talandová, M. Ústav vegetabilních potravin a rostlinné produkce, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Předkládaný projekt se zabýval analýzou významných barviv v zelenině (rajčata) a výrobcích z ní, a dále ve vybraných druzích čajů a kávy. Pro analýzu jsme vybraly karotenoidní barviva a chlorofyl, které mají vztah ke zdraví spotřebitele a také mohou být významným ukazatelem zejména čerstvosti, kvality suroviny a výrobků a také správnosti technologie výroby. Součástí projektu byly také metody doplňkové, používané k určení pevnosti a barevnosti surovin a potravin. Cíl projektu Projekt měl dva cíle. Prvním cílem projektu bylo sledování kvantity vybraných barviv u vybraných surovin (čaj, káva, rajčata a výrobky z nich), a dále jejich změn v závislosti na podmínkách a době skladování a opracování, což jsou faktory, které mohou významně ovlivnit nejen kvalitu suroviny, ale i ekonomické kalkulace mnoha zpracovatelských podniků a velkoobchodů. Druhým cílem projektu bylo navrhnutí vhodné metody pro odhad stáří suroviny a správnosti technologických postupů (při zpracování zeleniny a pochutin). Materiál a metodika Pro vybrané analýzy byly použity metody TLC pro identifikaci daných barviv a metody UV-VIS spektrofotometrie pro stanovení kvantity daných látek. Principem těchto metod byla extrakce daných látek ve vhodných rozpouštědlech a následné měření absorbance při dané vlnové délce. Dalšími použitými metodami byla analýza obrazu pro určení barevnosti a penetrometrie, což je metoda zjišťující pevnost a tažnost surovin, polotovarů a potravin. Tuto metodu jsme využily pro stanovení pevnosti slupky rajčat a jejích změn v průběhu skladování. Sledování chlorofylu u vybraných druhů čajů Pro sledování chlorofylů bylo využito metody TLC a UV-VIS spektrofotometrie. Pro stanovení chlorofylů a jeho degradačních produktů byly použity vzorky čajů, které prošly různým způsobem zpracování (zaměřily jsme se na fermentaci a velikost čajových listů). Cílem analýzy bylo sledování kvantitativních změn uvedených barviv v závislosti na způsobu zpracování u vybraných druhů komerčních sypaných a porcovaných čajů.

116

Sledování barvy u vybraných druhů kávy Pro sledování barvy byla použita metoda analýzy obrazu. Touto metodou byla sledována barva u vybraných komerčních druhů kávy (zelené a různě pražené) s cílem prokázat změnu barevnosti vlivem technologického opracování a vytvořit objektivní metodu pro přesné posouzení kvality pražícího procesu. Sledování vybraných karotenoidů u vybraných druhů rajčat Pro sledování vybraných karotenoidů v rajčatech bylo využito metody TLC a UV-VIS spektrofotometrie. Pomocí těchto metod bylo zjišťováno množství β - karotenu a lykopenu u rajčat. Dále byla měřena pevnost slupky pomocí penetrometrie. Pro analýzu byla použita rajčata zakoupená v tržní síti a dále rajčata vypěstovaná v oblasti jižní (Slavkov u Brna a Kyjov) a střední Moravy (Kroměříž), sklizena v plné a stejné zralosti. U těchto rajčat byly následně sledovány změny těchto barviv a pevnosti slupky v závislosti na době a způsobu skladování. Jedním z cílů práce bylo porovnání obsahu vybraných karotenoidů u rajčat pocházejících z různé pěstební oblasti. Dalším cílem bylo zjistit závislost mezi obsahem vybraných karotenoidů, pevností slupky a stářím rajčat a vytvořit tak objektivní metodu pro zjištění stáří rajčat. Výsledky Na základě naměřených dat bylo zjištěno následující: 

Fermentované čaje obsahovaly nižší hodnoty chlorofylů a výrazně vyšší hodnoty jeho degradačních produktů v porovnání s čaji nefermentovanými.



Sypané čaje obsahovaly vyšší hodnoty chlorofylů a nižší hodnoty degradačních produktů v porovnání s čaji porcovanými (tj. čaje s velikostně menšími čajovými listy).



Na základě statistické analýzy (porovnávání barvy zelené a pražené kávy) bylo prokázáno, že metodou analýzy obrazu lze stanovit stupeň pražení, a tak velmi účinně určit některé kvalitativní znaky kávy.



Rajčata pocházející ze zahraničních pěstebních oblastí obsahují vyšší množství analyzovaných karotenoidů; vyšší množství měla i rajčata pocházející z jižnějších pěstebních oblastí ČR.



V průběhu skladování rajčat docházelo k výkyvům v obsahu karotenoidů; ke zvyšování došlo v prvních dnech skladování - v prvních dvou dnech skladování u rajčat vyskladněných při pokojové teplotě; u rajčat uložených v chladu zvýšení nastalo až ve druhém a třetím dni. Od čtvrtého dne docházelo k postupnému poklesu a po týdnu skladování klesl obsah karotenoidů pod původní hodnotu (hodnota z 0. dne, a to u obou způsobů skladování).



Dle hodnot pevnosti slupky stanovených pomocí penetrometru jsme prokázaly, že rajčata v plné zralosti mají pevnost slupky v rozmezí 2,85 - 4,37 kN (dle odrůdy rajčete) a k výraznému měknutí slupky rajčat (až o 30 %) dochází již od druhého dne skladování rajčat při pokojové teplotě a po čtyřech dnech u rajčat skladovaných v ledničce.

117

Závěry Na základě výsledků bylo prokázáno, že obsah barviv je do významné míry závislý na technologii opracování surovin a polotovarů a barviva tudíž mohou být jedny z ukazatelů správnosti technologických kroků. Při analýze rajčat a určování jejich zralosti jsme prokázaly, že obsah karotenoidů je ovlivněn zejména pěstební oblastí a také klimatickými podmínkami. Obsah karotenoidů v rajčatech může být jeden z ukazatelů zralosti rajčat. Prokázaly jsme, že množství těchto barviv po třetím dnu skladování klesá a ve čtvrtém dnu je jejich hodnota nižší než 20 mg/kg rajčat. Ovšem tyto analýzy nelze objektivně použít v praxi, neboť obsah karotenoidů je variabilní (odrůdově) a stáří rajčat lze jen odhadnout a ne přesně určit. Proto tuto metodu lze využít ve většině případů pouze jako doplňkovou a jako objektivní ji lze využít v případě, že odběratel odebírá rajčata pravidelně od stejného producenta a sleduje obsah karotenoidů u jednotlivých šarží, což je časově velmi náročné. K podobným

závěrům jsme došly i u vyhodnocení metody analýzy obrazu. Metoda penetrometrická (pro stanovení pevnosti) je v praxi více využitelná, neboť se znalostmi o pěstování a kvalitě rajčat lze na základě pevnosti slupky rychle a poměrně přesně odhadnout zralost a hlavně stáří daných plodů rajčat. Naše cíle byly splněny. Na základě výše uvedeného jsme potvrdily dopad technologie výroby, manipulace a skladování na množství barviv obsažených v dané surovině a potravině. Dále jsme vytvořily metody, kterými lze potvrdit stáří rajčat. Tyto metody bychom rády na základě dalšího sběru dat statisticky potvrdily a následně je aplikovaly do praxe jako součást metod pro ověřování rajčat a pochutin, ale i dalších surovin a potravin rostlinného původu.

Literatura Použitá literatura dostupná u autora.

118

Působení ionizujícího záření na rezidua pesticidů ve vodním prostředí použitím biotestu na Artemia franciscana Žďárský M., Dvořák P.

Ústav biochemie, chemie a biofyziky, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Palackého 1-3, 612 42 Brno, Česká republika Úvod Již od 50. let minulého století jsou různé druhy bezobratlých využívány v radiobiologickém výzkumu a testování toxicity. Cílem je zejména zjednodušení průběhu testování a omezení počtu pokusných obratlovců na minimum, což odpovídá i Evropská konvenci o ochraně obratlovců používaných pro pokusné a jiné vědecké účely. Důležitým rozdílem, který odlišuje pokus na zvířeti od jiných druhů testování, například tkáňových kultur, je složitost živých soustav, jež nelze zjednodušit. Použijeme-li k výzkumu tkáně či buňky, jde o studium dílčích systémů, nikoli o zjednodušený organizmus. V dílčím sytému nemohou plně fungovat veškeré reparační mechanismy, které má organismus k dispozici. Požadavkům vyhovuje různé uspořádání subakutního biotestu na Artemia franciscana (dříve uváděná jako A. salina). Podle charakteru líhnutí organismů z klidových stádií ho lze zařadit mezi testy druhé generace. Naše předchozí práce byly zaměřeny zejména na sledování letality Artemia franciscana v závislosti na dávce ionizujícího záření, v závislosti na expozici toxických látek, na sledování toxického vlivu aniontů u sloučenin kadmia, na sledování toxicity látek a spolupůsobení fyzikálních faktorů a na sledování antioxidativních a prooxidativních účinků látek. Bylo stanoveno LD50 za 96 hodin po expozici na 600-700 Gy záření gama

60

Co, což odpovídá i fylogenetickému zařazení druhu. Dále

jsme sledovali morfologocké změny Artemia franciscana působením ionizujícího záření. Byly sledovány zejména morfologické změny, změny rozměrů a změny vzájemných poměrů těla u jedinců v závislosti na obdržené dávce ionizujícího záření. Testovali jsme možné interakce působení ionizujícího záření 60Co na toxicitu reziduí účinných látek pesticidních přípravků ve vodním prostředí použitím biotestu na Artemia franciscana.

Materiál a metodika V experimentu byly použity 3 účinné látky komerčních pesticidních přípravků bez dalších pomocných látek a kosolventů. Dvě účinné látky A a B byly v pevném stavu ve formě prášku, látka C byla kapalná. Pevné látky byly rozpouštěny za pomocí magnetické míchačky a ultrazvuku v 10 násobně silnější koncentraci, než byly použity v biotestu. Pro průběh biotestu a rozpouštění sledovaných látek byla použita slaná voda ve složení [g·l-1] 23.9 NaCl; 10.83 MgCl2·6H2O; 2.25

119

CaCl2·6H20; 0.68 KCl; 9.06 Na2SO4·10 H2O; 0,20 NaHCO3; 0.04 SrCl2 · 6H2O; 0.099 KBr; 0.027 H3BO3 o salinitě 47 g·l-1 a pH 7,6  0,1. Klidová stádia Artemia franciscana pocházela od firmy SANDERS (Utah, USA) pod označením „Maxima brine schrimp eggs“. Líhnutí naupliových stádií Artemia franciscana bylo prováděno při teplotě 25°C po dobu 24 hodin. Látka A byla testována v koncentracích 0,2; 0,4 a 0,8 mg·l-1. Látka B v koncentracích 5 a 15 mg·l-1. Látka C byla testována v koncentraci 400 mg·l-1. Za 12 hodin od ukončení rozpouštění byly připravené roztoky nality do plastových vzorkovnic v množství 80 ml a vystaveny ionizujícímu záření gama (60Co) o dávce 2 500 a 5 000 Gy (dávkový příkon 1,875 kGy·h-1). V lahvi bylo 80 ml roztoku pesticidní látky rozpuštěné v roztoku slané vody. Naupliová stádia ve stáří 24 h byla rozdělena v počtu 5 jedinců do petriho misek o průměru 60 mm. Pro každý test jednotlivé koncentrace bylo použito 10 misek, tedy 50 jedinců pro každou koncentraci. Objem roztoku v misce s veškerými přidanými látkami činil vždy 5 ml. Počítání živých nauplií se provádí vždy po 24 hodinách. Validita testu byla zachována, tj. úhyn kontrolních skupin nepřekročil 10 %. Výsledky a diskuse Rozpustnost sledovaných látek v pevném stavu je velmi nízká. Rozpouštění sledovaných látek bylo velmi náročné a zdlouhavé a trvalo 10 hodin. V deionizované vodě se látky téměř nerozpouštějí. Látka B se rozpouští maximálně do koncentrace 20 g·l-1, vyšší koncentrace již obsahují nerozpustné podíly. Senzorickým sledováním látka B změnila po působení ionizujícího záření barvu z čirého roztoku na zelenomodrý. Látka C z čirého roztoku na růžovofialový. Změna barvy je závislá na koncentraci účinné látky v roztoku, nikoliv na dávce ionizujícího záření. Látka A byla testována v koncentracích 0,2; 0,4 a 0,8 mg·l-1. Nejvyšší účinek ionizujícího záření na snížení toxicity se projevil u koncentrace 0,2 mg·l -1 a to u dávek 2500 a 5000 Gy. Snížení letality A. franciscana bylo 20 % a více. U vyšších koncentrací byl efekt působení ionizujícího záření mnohem nižší a nebyl statisticky průkazný. Látka B byla testována v koncentracích 5 a 15 mg·L-1. Zatímco u koncentrace 5 mg·l-1 nebylo použitím ionizujícího záření dosaženo statisticky průkazného efektu, u koncentrace 15 mg·l-1 a dávek ionizujícího záření 2500 a 5000 Gy došlo ke snížení letality o 20 – 40 %. Látka C byla testována v interakci s ionizujícím zářením pouze v koncentraci 400 mg·l-1, neboť předchozí testování prokázalo, že nižší koncentrace nevykazují za 96 hodin dostatečnou toxicitu a koncentrace vyšší jsou již příliš toxické a způsobují úhyn 100 % jedinců již za 72 hodin. U látky C nevedlo použití různých dávek ionizujícího záření ke statisticky průkaznému efektu snížení letality. U všech použitých koncentrací se jeví použití dávky 10 000 Gy jako součtu dávky 5 000 Gy a 5 000 Gy po 168 hodinách jako nevhodné. Uchování roztoku a opakované ozáření nevedlo k uspokojivým výsledkům.

120

Závěr Z dosavadních výsledků plyne, že ionizující záření ovlivňuje toxicitu vybraných pesticidních látek, což jsme prokázali biotestem II. generace na Artemia franciscana. U vybraných látek a koncentrací vede již ozáření dávkou 2 500 Gy ke snížení toxicity.

Seznam literatury 1) Councill of Europe (1976) European convention for the protection of animals kept for farming purposes. European Treaty Series Nr. 87, Strasbourg, European Council 20:62-65 2) Beňová, K., Dvořák, P., Falis, M., Danova, D., 2006. Elimination of negative effects of cadmium in Artemia franciscana by exposure to ionizing radiation. Folia Vet. 50, 3, Supplementum, 21-22. 3) Beňová, K., Dvořák, P., Falis, M., Sklenář, Z., 2007. Interaction of low doses of ionizing radiation, potassium dichromate and cadmium chloride in Artemia franciscana biotest. Acta Vet. Brno 76, 35-40. 4) Burlakova

EB,

Naidich

VI

(2010)

Radiation

safety

as

a

research

problem.

Herald of the Russian academy of science 76, 6 : 591-594

5) Dvořák, P., Beňová, K., 2002. The investigation of interactions of low doses of ionizing radiation and risk factors by means of Artemia salina biotest. Folia Vet. 46, 4, 195 – 197. 6) Dvořák, P., Šucman, E., Beňová, K. The development of a ten-day bio-test using Artemia salina naupli. Biologia 60, 2005, No. 5, pp. 593-597. 7) Dvořák, P., Žďárský, M., Beňová, K., 2009. Possibilities of alternative generation II biotests at Artemia. Interdisc. toxicol. 2, 45-47. 8) Dvořák, P., Beňová, K., Žďárský, M., Sklenář, Z., Havelková, A. Second-generation alternative biotests on crustaceans of genus Artemia. Acta Veterinaria Brno, 2010, vol. 79, pp 47-53 9) Grosch DS, Erdman HE (1955) X-Ray effects on adult Artemia. Biological Bulletin 108, 3:277282 10) Ruppert, E. E., Fox, R. S., Barnes, R. D., 2003. Invertebrate zoology. Itps Thompson Learning, USA, 435 p. 11) Sterba G (1983) Ansetzen des Seewassers und seine Kontrolle. In: Aquarienkunde, Band 2, 9th ed. Urania-Verlag, Jena, Germany, pp. 283-285

121

Sledování vybraných parametrů masa pernaté zvěře z pohledu ochrany veřejného zdraví Zdeňka Hutařová1, Petr Chloupek1, Radka Hulánková2, Gabriela Bořilová2, Vladimír Večerek1 Ústav veřejného veterinárního lékařství a toxikologie, 2Ústav hygieny a technologie masa, Fakulta

1

veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Úvod Maso zvěřiny patří k vysoce ceněným potravinám. Díky specifickému složení se vyznačuje vynikajícími dietetickými a senzorickými vlastnostmi. Z hygienického hlediska je pro kvalitu zvěřiny rozhodující způsob ulovení zvěře a její následné ošetření. Vzhledem k odlišnému složení svaloviny zvěřiny (v porovnání se svalovinou hospodářských zvířat) je stanoven i odlišný způsob manipulace s touto surovinou. V praxi se

setkáváme se třemi odlišnými způsoby ošetření pernaté zvěře po ulovení. Prvním je ponechání těla pernaté zvěře bez zásahu do dutiny tělní. Jedním z požadavků Nařízení EP a Rady č. 853/2004 je však co nejrychlejší odstranění střevního traktu. V praxi se rychlé odstranění trávicího traktu provádělo tzv. vyháčkováním. Jelikož při zmíněném způsobu ošetření dochází k narušení celistvosti střeva, představuje vyháčkování riziko kontaminace dutiny tělní střevním obsahem. Z tohoto důvodu je způsob ošetření zvěře po ulovení vyháčkováním diskutován jako hygienicky nevhodný. V současné době se doporučuje ošetření těl ulovené pernaté zvěře kompletní eviscerací orgánů dutiny tělní, která by měla zajišťovat hygienickou nezávadnost svaloviny. Zajištění hygienické kvality zvěřiny cestou kompletní eviscerace však může na druhé straně vést k negativním senzorickým změnám (např. vysychání svaloviny) či k negativnímu hygienickému dopadu (např. sekundární kontaminaci po otevření dutiny tělní). Cílem studie bylo posoudit vliv výše zmíněných způsobů ošetření pernaté zvěře po ulovení na hygienickou kvalitu masa po určité době skladování.

Materiál a metodika Posuzování vlivu různých způsobů ošetření zvěřiny zvěře pernaté bylo provedeno u druhu kachna divoká (Anas platyrhynchos). Výše zmíněný druh byl vybrán z důvodu poměrně častého využívání zvěřinovými zpracovatelskými závody pro obchodování a další zpracování. Těla kachen divokých (60 ks) byla bezprostředně po ulovení ošetřena třemi vybranými způsoby („HPA“- vyháčkování, „KPA“- kompletní eviscerace, „NPA“ - bez zásahu do tělní dutiny); každá skupina zahrnovala 20 ks vzorků. Těla byla následně skladována v rozmezí teplot 0-1 °C. Ve stanovených časových intervalech (1., 7., 14., 21. den po ulovení) byl prováděn odběr vzorků prsní svaloviny pro mikrobiologickou analýzu, která zahrnovala stanovení celkového počtu

122

mikroorganismů (CPM), provedené podle ČSN EN ISO 4833:2003. V rámci jednoho odběrového termínu byly v každé skupiny odebírány vzorky prsní svaloviny z 5 ks těl kachny divoké. Výsledky a diskuze Celkové počty mikroorganismů na 1 gram prsní svaloviny, získané v rámci mikrobiologického stanovení jsou uvedeny grafu č. 1. Graf č. 1. Rozvoj mikroorganismů v prsní svalovině kachen skladovaných při 0-1 °C.

CPM [log KTJ/g]

5,5 4,5 3,5

NPA

2,5

HPA KPA

1,5 2 Termín odběru 3

1

4

CPM - celkový počet mikroorganismů; KTJ - kolonie tvořící jednotky; NPA - kachny neošetřené po ulovení; HPA - kachny vyháčkované; KPA - kachny vykuchané

Trend růstu mikroorganismů, patrný z grafu č. 1 značí, že způsoby použité k ošetření pernaté zvěře po ulovení měly rozdílný vliv na míru kontaminace prsní svaloviny. K nejmenšímu nárůstu počtu mikroorganismů došlo u skupiny kachen vyháčkovaných (HPA), následně u skupiny vzorků kachen neošetřených po ulovení (NPA). K nejvyššímu nárůstu mikrobiální kontaminace došlo u skupiny vzorků kachen vykuchaných (KPA). Výsledky stanovení jsou dávány do souvislosti se stavem těla zvěře po ulovení. Pokud je zvěř střelena, dochází ve většině případů v různém rozsahu k poškození svaloviny i orgánů dutiny tělní (včetně

střevního

traktu).

Narušený

střevní

trakt

následně

představuje

možný

zdroj

mikroorganismů, které se v průběhu skladování mohou množit a šířit do svaloviny. Požadavek Nařízení EP a Rady č. 853/2004 na rychlé odstranění trávicího traktu je z hygienického hlediska

nezbytný. Pokud zůstane střelená pernatá zvěř po ulovení neošetřená, zůstává uvnitř dutiny tělní střevní trakt do různé míry narušený vstřelenými broky (Paulsen et al., 2008). Ten následně představuje možný zdroj mikroorganismů, které se mohou snadno šířit do okolní svaloviny. Určité množství střevního obsahu, uvolněné do dutiny tělní převážně v průběhu manipulace před uskladněním však představuje, dle získaných výsledků, menší zdroj mikrobiální kontaminace prsní svaloviny v porovnání s kontaminací vyskytující se po ošetření těl pernaté zvěře vykucháním.

123

Ošetření pernaté zvěře kompletní eviscerací orgánů (vykucháním), může vést k vyšší kontaminaci povrchu svaloviny (El-Ghareeb et al., 2009) prostřednictvím sekundární kontaminace mikroorganismy z vnějšího prostředí, která může být při skladování po delší dobu zdrojem šíření mikroorganismů do svaloviny v okolí dutiny tělní.

Z výše uvedených výsledků vyplývá, že

otevření dutiny tělní při ošetření pernaté zvěře „vykucháním“ vedlo k velkému rozvoji mikroflóry v prsní svalovině. Pro způsob ošetření pernaté zvěře vyháčkováním ze získaných výsledků plyne, že i když v některých případech dochází k porušení celistvosti střev a následné kontaminaci dutiny tělní střevním obsahem, množství uvolněného střevního obsahu není zdrojem mikrobiální kontaminace prsní svaloviny v takovém rozsahu, který zapříčinily další 2 způsoby ošetření po ulovení. Závěr Dle získaných výsledků mikrobiologického vyšetření jsou vyháčkování nebo neošetření pernaté zvěře po ulovení způsoby neumožňující v prsní svalovině rozvoj mikroorganismů v takové míře, která se

projevila při ošetření pernaté zvěře vykucháním. K nejmenšímu rozvoji mikroorganismů v prsní svalovině došlo u skupiny kachen vyháčkovaných. Poděkování Práce byla financována v rámci projektu IGA 93/2011/FVHE.

Seznam literatury 1) El-Ghareeb, WR.; Smudlers, FJM.; Morshdy, AMA.; Winkelmayer, R.; Paulsen, P. Microbiological condition and self life of meat from hunter game birds. European Journal of Wildlife Research 2009, 55, 317-323. 2) Regulation (EC) No. 853/2004 of European Parliament and of the Council of 29 April 2004 laying down specific hygiene rules for the hygiene of food of animal origin. Official Journal of the European Union 2004, L226, 22-82. 3) Paulsen, P.; Nagy, J.; Popelka, P.; Ledecký, V.; Marcinčák, S.; Pipová, M.; Smudler, FJM.; Hofbauer, P.; Lazar, P.; Dicakova, Z. Influence of storage and shotshell wounding on the hygienic condition of hunter, uneviscerated pheasant (Phasianus colchicus). Poultry Science 2008, 87, 191-195. 4) Vodňanský, M. Základní faktory ovlivňující kvalitu zvěřiny-příklady nesprávného ošetření drobné zvěře po ulovení. Myslivost 2008, 10, 14.

124

Příspěvky Fakulty farmaceutické

125

126

Rostlinné inhibitory ureáz Petra Hřibová, Milan Žemlička Ústav přírodních léčiv, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Úvod Ureáza (EC 3.5.1.5) je enzym přítomný v rostlinách, bakteriích, houbách, řasách a některých bezobratlích. Proteinová struktura enzymu je rozdílná v závislosti na organismu, ve kterém se vyskytuje, ovšem plní vždy stejnou katalytickou funkci, kterou je urychlení hydrolýzy urey (močoviny) na amoniak a karbamát, který spontánně přechází na oxid uhličitý. [1] V rostlinách má produkce ureázy význam pro metabolismus dusíku. Bakterie produkce amoniaku chrání před silně kyselým prostředím a umožňuje tak patogenům (např. Helicobacter pylori, ureolytické bakterie) infikovat gastrointestinální nebo urogenitální trakt člověka. [2, 3] Konvenční léčba antibiotiky má řadu závažných nežádoucích účinků, a proto je žádoucí najít účinné a dostupné inhibitory ureázy. Cílem práce bylo zavedení rychlé a spolehlivé metodiky pro rutinní testování inhibitorů ureázy a otestování řady rostlinných extraktů. Test je založen na detekci amoniaku vznikajícího při reakci.

Materiál a metodika Chemikálie Enzym (jack bean ureáza typ III izolovaná z Canavalia ensiformis, Sigma), fenolová červeň (Sigma), urea (Sigma), dihydrogenfosforečnan draselný (K lab Veverská Bitýška), voda, methanol (Penta). Přístroje Reader Synergy HT (BIO-TEK), vakuová rotační odparka (Büchi Rotavapor R-114), lyofilizátor (Christ Alpha 1-2 LO). Stanovení inhibice ureázy 75 µl směsi enzymu v 10 mM fosfátovém pufru (pH 6,8) a 75 µl roztoku inhibitoru testovaného ve dvou různých koncentracích bylo inkubováno při 27 °C. Po 10-ti minutách inkubace bylo přidáno 75 µl roztoku fenolové červeni ve vodě a 75 µl 1,67 M urey ve vodě (urea je substrát enzymu a spouští reakci). Absorbance byla měřena na Multiplate readeru v 96-ti jamkových mikrotitračních

127

destičkách při vlnové délce 560 nm. Naměřené výsledky se vynesly na graf časové závislosti množství uvolněného amoniaku sledovaného jako hodnota absorbance fenolové červeni. Ze získané křivky byla určená směrnice, která v poměru se směrnicí kontroly (inhibitor byl nahrazen vodou, takže se projevila plná aktivita enzymu) udávala inhibiční aktivitu extraktu.

Rostlinný materiál Nadzemní části rostlin byly sbírány v roce 2011 v České republice (Aesculus hippocastanum, Achillea millefolium, Anchusa officinalis, Brassica napus, Convallaria majalis, Euphorbia cyparissias, Gallium odoratum, Lupinus spp., Polymnia sonchifolia, Symphytum officinale, Veronica spp., Vicia spp.), v Rakousku (Linaria alpina) a v roce 2010 v Sýrii (Achillea bibersteinii, Convolvulus pilosellifolius).

Příprava rostlinných extraktů 5,0 g sušené rostliny bylo rozdrceno na prášek a extrahováno v 60% methanolu za podpory ultrazvuku po dobu 30 minut při laboratorní teplotě. Extrakt byl přefiltrován, rozpouštědlo odpařeno na vakuové rotační odparce a voda odstraněna lyofilizací. Suchý extrakt byl rozpuštěn ve vodě na koncentrace 20 mg/ml (mg extraktu na 1 ml vody) a 10 mg/ml.

Výsledky Byla vypracována metoda na testování antiureázové aktivity rostlinných extraktů, pomocí které bylo otestováno 16 rostlinných extraktů. Inhibiční aktivitu testovaných extraktů shrnuje tabulka 1. Nejvýraznější inhibiční aktivitu vykazoval methanolický extrakt z Aesculus hippocastanum. V koncentraci 20 mg/ml dosáhla inhibice ureázy 96% v porovnání s kontrolou, poloviční koncentrace 10 mg/ml inhibovala 78%. Při vyšší koncentraci (20 mg/ml) vykazovaly více než 50% inhibici extrakty z Brassica napus L., Achillea bibersteinii Afan., Euphorbia cyparissias L., Gallium odoratum (L.) Scop., Achillea millefolium L. a Vicia spp. Nižší koncentrace těchto extraktů neměly významnou inhibiční aktivitu.

128

Testovaná rostlina 1

Aesculus hippocastanum L.

2

Achillea bibersteinii Afan.

3

Achillea millefolium L.

4

Anchusa officinalis L.

5

Brassica napus L.

6

Convallaria majalis L.

7

Convolvulus pilosellifolius Desr.

8

Euphorbia cyparissias L.

9

Gallium odoratum (L.) Scop.

10

Linaria alpina (L.) Miller

11

Lupinus spp.

12

Polymnia sonchifolia Poeppig &

13

Endl. Symphytum officinale L.

14

Symphytum tuberosum L.

15

Veronica spp.

16

Vicia spp.

Tabulka 1

Koncentrace [mg/ml] extraktu v jamce 20 10 20 10 20 10 20 10 20 10 20 10 20 10 20 10 20 10 20 10 20 10 20 10 20 10 20 10 20 10 20 10

5,0 2,5 5,0 2,5 5,0 2,5 5,0 2,5 5,0 2,5 5,0 2,5 5,0 2,5 5,0 2,5 5,0 2,5 5,0 2,5 5,0 2,5 5,0 2,5 5,0 2,5 5,0 2,5 5,0 2,5 5,0 2,5

[%] inhibice 96 ureázy 78 72 40 54 22 44 21 75 22 31 1 10 0 62 4 56 2 30 0 44 9 34 0 38 2 22 0 11 0 51 0

Antiureázová aktivita testovaných extraktů.

Seznam literatury 1) KRAJEWSKA, B.: UREASES I. FUNCTIONAL, CATALYTIC AND KINETIC PROPERTIES: A REVIEW. J. MOL. CATAL. B.: ENZYM., 2009; 59, 9-21. 2) WILLIAMSON, J. S.: Helicobacter pylori: Current Chemotherapy and New Targets for Drug. Curr. Pharm. Design, 2001; 7, 357-394. 3) THOMAS, B., TROLLEY, D.: Concurrent urinary tract infection and stone disease: pathogenesis, diagnosis and management. Nat. Clin. Pract. Urol., 2008; 5, 668-675.

Práce vznikla za podpory grantu IGA VFU Brno č. IG313121 (2011).

129

Zvýšení bezpečnosti perorálních pevných lékových forem s úzkým terapeutickým indexem Aleš Franc, Jan Muselík, Jana Kvapilová, Radka Máslová Ústav technologie léků, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod V současné době probíhá diskuse ohledně generických náhrad léků s obsahem léčiv s „nízkým terapeutickým indexem“ (NTI). Jelikož při léčbě generickými náhradami existovaly v minulosti případy zdravotních komplikací až náhlých úmrtí, způsobených nepatrnými rozdíly v plazmatických hladinách vlivem kolísání obsahu účinné látky v tabletách, bylo například v USA zakázáno zahájit léčbu generickými tabletami s obsahem warfarinu. Progresivní technologií přípravy tablet je tzv. přímé lisování. Během procesu suchého mísení zde ovšem často dochází k tzv. segregaci účinné látky způsobené tzv. vymícháváním, a tím právě i k obsahové nestejnoměrnosti léčiva v jednotlivých tabletách. Proto se dodnes při přípravě tablet s nízkým obsahem účinných látek využívá především vlhké granulace. To ovšem značně prodlužuje a prodražuje výrobu, často zhoršuje stabilitu a samozřejmě i zvyšuje cenu léků. Metoda přímého lisování tablet s nízkým obsahem účinných látek proto zůstává nedořešena a farmaceutické firmy věnují enormní úsilí k jejímu zavedení a optimalizaci pro výrobu tablet s nízkým obsahem látek s NTI. Tato práce ukazuje vztahy mezi vybranými výrobními parametry a výslednou obsahovou stejnoměrností lékové formy. Konkrétně se jedná o vliv různých plniv, vliv přísady kluziva v různém stupni mísení a konečně i o celkovou dobu homogenizace. Kvalitně ošetřená technologie přímého lisování by neměla vést jen k úspoře času, materiálů a snížení nákladů resp. ceny vyráběných léků, ale i k bezpečné farmakoterapii. K průkazu standardnosti procesu je nutné zvolit takový matematický resp. statistický aparát, který umožní spolehlivě prokázat, že proces dosahuje předem stanovených kriterií kvality, které jsou obvykle dány platnými lékopisy. Patří sem zejména index správnosti Cpk, a relativní směrodatná odchylka RSD. Její hodnota je odvozena z tzv. Bergumova rozdělení, případně je její limit deklarován například doporučením registračních autorit. Cílem této práce bylo nalézt optimální složení a postup přípravy tablet s obsahem 2 % klatrátu sodné soli warfarinu, které by odpovídaly výše uvedeným limitům. Za tímto účelem bylo vyzkoušeno celkem pět postupů přípravy tablet metodou přímého lisování. Byla vyzkoušena dvě plniva s různou hustotou (Tab. 1), přičemž se měnila délka procesu mísení spolu s přísadou kluziva v různém čase.

130

Materiál a metodika Postup mísení: Jednotlivé látky 1-5 byly přesítovány sítem o velikosti oka 250 mikronů a míseny 2, 5 nebo 15 minut (technologie A-C) nebo byly jednotlivé látky 1-4 přesítovány sítem o velikosti oka 250 mikronů a smíseny 10 minut a následně byla přidána látka 5 a mísení pokračovalo 2 minuty (technologie D) nebo 5 minut (technologie E). Mísení probíhalo v homogenizačním zařízení Turbula. Složení směsí je uvedeno v tabulce 1. Každý postup byl jednou reprodukován. Celkem bylo připraveno 20 šarží. Z jednotlivých tabletových směsí bylo rovnoměrně z celého obsahu homogenizátoru odebráno 10 vzorků o hmotnosti cca 0,5 g a byl v nich stanoven obsah warfarinu. Tabletování: Z každé šarže byly na excentrickém lisu EK 0 nalisovány tablety o hmotnosti 200 mg a v průběhu lisování bylo odebráno celkem 10 tablet z každé šarže a v jednotlivých tabletách byl stanoven obsah warfarinu. Chromatografická analýza: Pro stanovení warfarinu v odebraných vzorcích tablet nebo tabletových směsí byl použit kapalinový chromatograf YL 9100 (Young Lin Instrument) s kvaternární pumpou, automatickým dávkovačem a detektorem s diodovým polem. Chromatografické separace byly provedeny na koloně BDS HYPERSIL C18 (150 × 4,6 mm; 5,0 μm). Složení rozpouštědel bylo 64 % methanolu a 36 % 40 mM kyseliny mravenčí. Celková délka analýzy byla 7 minut. Průtok mobilní fáze byl 1,4 ml/min; teplota kolony byla 25 °C. Spektra byla snímána při 280 nm. Bylo dávkováno 10 μl vzorku. Kvantifikace byla provedena na základě kalibrační přímky. Tabulka 1. Použité suroviny a složení tabletových směsí. Surovina

Hustota

Velikost částic

(kg/m3)

(µm)

Složení 1

Složení 2

1. Klatrát sodné soli warfarinu

1312.8

2. Laktosa monohydrát

1547.1

61

70 %

-

2. Hydrogenfosforečnan vápenatý

2915.8

91

-

70 %

3. Mikrokrystalická celulosa

1572.4

56

25 %

4. Sodná sůl kroskarmelosy

1611.5

42

2%

5. Stearan hořečnatý

1085.9

12

1%

2%

131

Výsledky Všechny připravené šarže tablet vyhovují lékopisným požadavkům na obsahovou stejnoměrnost, vyjma šarže s obsahem laktosy při délce mísení 2 minuty. Z toho je patrné, že po 2 minutách ještě nedochází k rovnoměrnému promísení směsi. Pokud laktosu nahradíme hydrogenfosforečnanem vápenatým, je tato doba k dosažení obsahové stejnoměrnosti dostačující. To lze zřejmě vysvětlit vyšší hustotou plniva, která způsobí dokonalejší promísení během procesu homogenizace. Při prodloužení času mísení z pěti na 15 minut již nedochází ke statisticky významnému zlepšení u obou plniv. V případě, že je stearan hořečnatý přidán do již předmísené směsi, lze pozorovat statisticky významné zlepšení obsahové stejnoměrnosti po době mísení 5 minut (Tab. 2). Nejpřísnějšímu limitu Bergumovu rozdělení spolehlivě vyhoví pouze tablety s obsahem hydrogenfosforečnanu vápenatého, kde byl stearan hořečnatý přidán k již předmísené směsi a dále mísen po dobu 5 minut. Tabulka 2. Výsledky hodnocení tablet připravených technologií E. Hodnocené kritérium

Složení 1

Složení 2

Šarže 1

Šarže 2

Šarže 1

Šarže 2

Průměr (%)

98,9

101,3

100,1

103,3

RSD

3,81

3,21

2,53

2,35

Bergumovo rozdělení

3,03

2,92

3,19

2,49

Cpk

1,23

1,41

1,98

1,61

ČL 2.9.6

vyhovuje

vyhovuje

vyhovuje

vyhovuje

ČL 2.9.40

vyhovuje

vyhovuje

vyhovuje

vyhovuje

Závěr Ze získaných výsledků lze konstatovat, že se podařilo optimalizovat složení a postup přípravy tablet metodou přímého lisování, které vyhoví všem výše uvedeným limitům pro testování obsahové stejnoměrnosti. Těchto přísných limitů se dnes v USA využívá pro zavádění výroby nových léků. Tyto limity, zejména u léčiv s NTI, zajišťují bezpečnou farmakoterapii.

132

Vliv oxidativního stresu na biosyntézu sekundárních metabolitů – polyfenolů Veronika Kohoutková1, Jiří Sochor1, Zuzana Pobořilová1, Ondřej Vodička1, René Kizek2, Radka Opatřilová3, Petr Babula1 Ústav přírodních léčiv, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno1, Ústav chemických léčiv, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno3 a Ústav chemie a biochemie, Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně2

Úvod Oxidativní stres je definován jako soubor faktorů, jejichž působením vznikají reaktivní formy kyslíku (ROS), přičemž jejich produkce převyšuje možnosti protektivních - antioxidačních mechanismů daného organismu - a vedou obvykle k oxidativnímu poškození biomolekul a buněčných struktur. Původ ROS je jednak fyziologický, kdy vznikají během metabolických pochodů, kde hrají významné role (např. fotosyntéza), ale také patologický, kdy ROS vznikají, jak je výše uvedeno, v důsledku oxidativního stresu [1, 2]. Mezi významné induktory ROS patří těžké kovy, které vystupují rovněž jako významné kontaminanty životního prostředí, zejména v souvislosti s antropogenní činností. Byla publikována řada prací ukazující na souvislost mezi ionty těžkých kovů (zejména kadmium, olovo, rtuť, měď, zinek a železo) a mírou oxidativního stresu [3]. Zatímco u některých kovů (železo, měď) byly popsány mechanismy generování ROS - Fentonova reakce, u dalších zůstávají tyto mechanismy neznámé. Rostliny disponují řadou protektivních mechanismů, a to jak enzymatických (superoxid dismutáza - SOD, kataláza - CAT a další) i neenzymatických (zejména tripeptid glutathion, askorbát, karotenoidy, polyfenoly) [4]. Polyfenoly jako sekundární metabolity rostlin představují důležitý ochranný mechanismus, zejména díky svým antioxidačním vlastnostem a schopnostem tvořit komplexy s ionty těžkých kovů [5]. Byla prokázána souvislost mezi oxidativním stresem a aktivitou enzymů participujících na biosyntéze fenylpropanoidů jako skupiny polyfenolů, nicméně bližší data stále chybí. V publikacích nebylo doposud poukázáno na souvislost mezi neenzymatickými antioxidačními systémy typu glutathionu a polyfenoly jako protektivními molekulami.

133

Materiál a metodika Rostlinný materiál, použité chemikálie a metody V projektu byla využita modelová in vitro kalusová kultura Reynoutria japonica, která byla odvozena z kořenů primární explantátové kultury na Ústavu přírodních léčiv (Doc. Babula) a která vykazuje stabilní růst a vysokou míru produkce sekundárních metabolitů ze skupiny polyfenolů, včetně farmakologicky velmi zajímavého stilbenu resveratrolu. Jako stresový faktor byly požity měďnaté ionty v koncentrační řadě, a kromě toho ionty lanthanité. Zvolené koncentrace byly následující: 0, 50, 100, 250, 500 a 1000 µM. Pro objasnění vztahu glutathion - polyfenoly byl využit inhibitor biosyntézy glutathionu - buthionin sulfoximin a phoron, látka přímo inaktivující glutathion tvorbou konjugátů - v aplikované koncentraci 50 µM. Odběr vzorku probíhal v přesně definovaných časových intervalech 1, 5, 10, 20 a 30 dní. Sledovány a determinovány byly následující parametry: růstové parametry (hmotnostní přírůstek), akumulace fenolů a polyfenolů (celkové polyfenoly, odihydroxyfenoly, celkové flavonoidy, resveratrol, spektrofotometrické a HPLC metody). Dále byly sledovány neenzymatické (glutathion oxidovaný a redukovaný, fytochelatiny PC2-5, HPLC metody) a enzymatické (SOD, CAT, komerční kity, spektrofotometrické metody) protektivní systémy. Výše uvedené metody jsou optimalizovány a používány na pracovištích řešitelského kolektivu. Výsledky Získané výsledky umožňují nový pohled na vzájemný vztah mezi protektivními systémy představovanými thioly (glutathion, fytochelatiny), které hrají významnou roli v homeostáze iontů kovů a mají i vlastnosti antioxidační, fenolickými sloučeninami, které vykazují vlastnosti antioxidační, a enzymovými systémy, které jsou představovány SOD a CAT. Aplikace iontů měďnatých a lanthanitých vedla u variant bez aplikace buthionin sulfoximinu a phoronu k projevům toxicity a depresi růstu (u La3+ až u nejvyšších aplikovaných koncentrací), které byly výraznější pro ionty měďnaté, naopak aplikace iontů lanthanitých vedla v nejnižších aplikacích ke stimulaci růstu, a naopak ke snížené produkci polyfenolů. Aplikace lanthanitých iontů výrazným způsobem ovlivnila také aktivitu SOD a CAT, která byla snížena již v případě nejnižší aplikované koncentrace 50 µM. Naproti tomu aplikace iontů měďnatých vedla v nejnižších koncentracích ke stimulaci biosyntézy polyfenolů, i ke zvýšené aktivitě enzymových protektivních mechanismů, tedy SOD a CAT. Stimulována byla i tvorba thiolů, a to jak thiolů celkových, tak i fytochelatinů. Ty však byly indukovány aplikací lanthanitých iontů až ve vyšších koncentracích od 250 µM. Jiná situace nastala po aplikaci dvou výše uvedených látek interferujících buď se syntézou thiolů (buthionin

134

sulfoximin), nebo přímo s glutathionem (phoron). Zde byly zjištěny jak významné odlišnosti v závislosti na aplikovaných iontech a jejich koncentracích (Cu2+, La3+), a to jak v růstové charakteristice kalusových kultur, tak i v syntéze polyfenolů a dalších sekundárních metabolitů typu flavonoidů a resveratrolu) a aktivitě SOD a CAT. Při porovnání obou aplikovaných látek byly změny po aplikaci phoronu patrné již v rámci krátkého časového intervalu (1, 5 a 10 dní), po aplikaci buthionin sulfoximinu pak v delším časovém intervalu (10, 20 a 30 dní). Aplikace obou látek tedy vedla k depleci thiolů, a naopak v nižších aplikovaných koncentracích iontů kovů ke zvýšené biosyntéze jak polyfenolů, tak i stilbenu resveratrolu. Aktivita SOD a CAT byla zvýšena v případě iontů měďnatých, v případě iontů lanthanitých byla jejich aktivita snížena oproti kontrole, ovšem za zvýšené produkce polyfenolů. Ve vyšších koncentracích iontů kovů vedla jejich společná aplikace s buthionin sulfoximinem nebo phoronem k výraznému zpomalení růstu s převažujícími projevy toxicity. Výše uvedené shrnutí výsledků je komplexní, výsledky budou podrobněji představeny při prezentaci.

Seznam literatury PI, J. B.; ZHANG, Q.; FU, J. Q.; WOODS, C. G.; HOU, Y. Y.; CORKEY, B. E.; COLLINS, S.; ANDERSEN, M. E., ROS signaling, oxidative stress and Nrf2 in pancreatic beta-cell function. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2010, 244, (1), 77-83. YOSHIOKA, H.; MASE, K.; YOSHIOKA, M.; KOBAYASHI, M.; ASAI, S., Regulatory mechanisms of NO and ROS generation and role in plant immunity. Nitric Oxide-Biol. Chem. 2010, 22, S10-S10. GYULKHANDANYAN, A. V.; FEENEY, C. J.; PENNEFATHER, P. S., Effect of copper on mitochondrial membrane potential and ROS production in astrocytes induced by mitochondrial electron transport chain inhibitors. Biophys. J. 2002, 82, (1), 1384. WENDEHENNE, D.; DURNER, J.; CHEN, Z. X.; KLESSIG, D. F., Benzothiadiazole, an inducer of plant defenses, inhibits catalase and ascorbate peroxidase. Phytochemistry 1998, 47, (4), 651657. DAI, J.; MUMPER, R. J., Plant Phenolics: Extraction, Analysis and Their Antioxidant and Anticancer Properties. Molecules 2010, 15, (10), 7313-7352.

135

Role zinku v mitochondriální dysfunkci a apoptóze. Petr Babula1, Jiří Sochor1, Zuzana Pobořilová1, Ondřej Vodička1, René Kizek2, Michal Masařík3 Ústav přírodních léčiv, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno1,Ústav chemie a biochemie, Agronomická fakulta, Mendlova univerzita v Brně2 a Ústav patologické fyziologie, Lékařská fakulta, Masarykova univerzita3

Úvod Zinek představuje významný esenciální prvek nutný pro správnou funkci eukaryotických buněk. Podílí se na regulaci imunitního systému, genové exprese, energetického metabolismu, transdukce signálu a plní strukturální funkci [1]. Protože vyšší hladiny těchto iontů působí toxicky, je nutná přesná regulace jejich hladiny. Na té se podílejí zinkové přenašeče a zinek-vázající proteiny, zejména metallothioneiny [2]. Prostatická tkáň je v metabolismu Zn2+ specifická. Její buňky akumulují až desetinásobně větší množství těchto iontů. Metabolismus zinku a citrátu, je v prostatických buňkách odlišný oproti řadě jiných tkání. Citrát se běžně využívá v Krebsově cyklu za vzniku velkého množství ATP. Aby nedocházelo ke vstupu citrátu do tohoto cyklu a jeho následné degradaci v něm, musí být zablokován mitochondriální enzym akonitáza, přeměňující citrát na izocitrát [3]. Akonitáza je blokována právě zinečnatými ionty, které prostata akumuluje ve zvýšené míře, až desetinásobně více oproti jiným tkáním [4]. Na akumulaci Zn2+ se podílejí zinkové přenašeče, zodpovědné za redistribuci zinku mezi extracelulárním prostředím, cytoplazmou a organelami, a zinek-vázající proteiny. Touto drahou však přichází prostata o podstatnou část energie v podobě ATP (65 % ATP oproti kompletní oxidaci glukózy) [3]. Zinek má kromě přímých efektů na akonitázu také další vlivy, a to indukce apoptózy cestou cytochromu C a regulace exprese řady genů prostřednictvím kináz [5]. Apoptózu způsobuje přímými vlivy na jádro a mitochondrie a dále regulací apoptických signálních drah [5]. Cílem příspěvku je nastínění vlivu zinku na mitochondriální dysfunkci s následnou aktivací apoptických drah.

Materiál a metodika Buněčné linie, použité chemikálie a metodiky V práci byly použity buněčné linie 22RV1, která je odvozena od lidského nádoru prostaty, a PNT1A, linie, která byla odvozena posmrtně ze zdravé prostatické tkáně. V obou případech se jedná o adherentní buněčné linie. Zinek ve formě síranu zinečnatého (Sigma-Aldrich) byl aplikován

136

v koncentracích 0, 500, 800, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, a 2000 µM (primární screaning toxicity), pro další experimenty byly použity koncentrace nižší (0, 50, 75, 100, 250 a 500 µM). Vzorky byly odebrány ve dvou časových intervalech (24 a 72 hodin). Pro následné analýzy byly použity chemikálie, případně kity, zakoupené od Sigma-Aldrich. Byly analyzovány následující parametry: růstové a proliferační charakteristiky (MTT test, xCELLigence systém – Roche), celkové množství proteinů (spektrofotometrie), množství volného a vázaného zinku (elektrochemie, spektrofotometrie, fluorescenční mikroskopie s analýzou obrazu), celkové thioly (glutathion oxidovaný a redukovaný) a metallothionein (HPLC s elektrochemickou detekcí, vizualizace pomocí fluorescenční mikroskopie), stanovené exprese MT genů (MT1A, MT2A, PCR), dále ROS (fluorimetrie,

fluorescenční

mikroskopie,

2´,7´-dichlorofluorescein

jako

substrát),

SOD2

(imunohistochemie, analýza obrazu), akonitáza (komerčně dostupný kit) a apoptóza (fluorescenční mikroskopie, annexin V konjugát s FITC, Hoechst 33257). Použity byly metodiky zavedené a optimalizované na pracovištích řešitelského kolektivu (pro omezenou velikost příspěvku neuvádím). Výsledky Experiment prokázal výrazné rozdíly ve sledovaných parametrech mezi linií 22RV1 (nádorová buněčná linie) a PNT1A (nenádorová buněčná linie). Signifikantní rozdíly byly zjištěny již v toleranci zinečnatých iontů, kde 22RV1 prokázala signifikantně vyšší toleranci k Zn2+ (více než 10 % buněk přežívalo i při nejvyšší aplikované koncentraci 2000 µM, zatímco u nenádorové buněčné linie již koncentrace 400 µM znamenala pokles viability na 0 %). Výsledky je však zapotřebí posuzovat komplexně, a to nejen ke vztahu k metallothioneinu, proteinu, který vzkazuje antioxidační vlastnosti a je zodpovědný za homeostázu zinečnatých iontů, ale také ve vztahu k reaktivním formám kyslíku (resp. O2.- a aktivitě klíčového enzymu a markeru mitochondriální funkce – akonitáze). Porušení mitochondriální funkce následně vede k iniciaci procesu apoptózy. Tolerance linie 22RV1 byla jednoznačně spjata s množstvím oxidovaného i redukovaného glutathionu, které se u této buněčné linie kontinuálně zvyšovalo ve vztahu k aplikovaným Zn 2+. Podobný trend byl pozorován i v případě metallothioneinu a exprese MT2A. Bylo zjištěno, že buňky nádorové buněčné linie 22RV1 jsou schopny vázat signifikantně vyšší množství zinku, než buňky buněčné linie nenádorové. Výše uvedené poznatky poukazují na roli thiolových sloučenin v rezistenci k zinku. Navíc, uvedené poznatky byly v souladu i se zjištěními dalšími – u buněk nenádorové buněčné linie PNT1A byl zjištěn výrazný pokles aktivity akonitázy spolu s poklesem SOD2 a naopak nárůst hladiny ROS se vzrůstající koncentrací zinečnatých iontů aplikovaných do kultivačního média. U nádorové buněčné linie byl pokles aktivity akonitázy i SOD2 patrný až u

137

vyšších aplikovaných koncentrací zinečnatých iontů. Tato skutečnost se odrazila i v posledním sledovaném parametru – apoptóze. Zatímco u nenádorové buněčné linie procento apoptických buněk kontinuálně stoupalo se zvyšující se koncentrací zinečnatých iontů (již od koncentrace 50 µM) a snižující se viabilitou, u nádorové 22RV1 byl tento trend patrný až u vysokých aplikovaných koncentrací zinečnatých iontů (od 250 µM). Shrneme-li výše uvedené výsledky, můžeme konstatovat, že thioly glutathion i metallothionein hrají protektivní roli a jsou schopné chelatovat volné zinečnaté ionty. Tento fakt je vystupňován u nádorové buněčné linie 22RV1 (vyšší množství vázaného zinku), kdy nadbytek volných zinečnatých iontů díky jejich chelataci nevede k indukování reaktivních forem kyslíku, jejichž homeostáza je v mitochondriích přísně regulována, porušení mitochondriálních funkcí a k následné aktivaci kaskády apoptózy.

Obrázek 1. barvení volného zinku u linie 22RV1, koncentrace 100 µM. Nápadné jsou „spoty“, kompartmenty vytvářející zásobu volných zinečnatých iontů – zinkozomy. Fluorescenční mikroskopie, barveno N-(6-methoxy-8-chinolyl)-p-toluen sulfonamidem.

Seznam literatury 1) BABULA, P.; KOHOUTKOVA, V.; OPATRILOVA, R.; DANKOVA, I.; MASARIK, M.; KIZEK, R., Pharmaceutical importance of zinc and metallothionein in cell signalling. Chim. Oggi-Chem. Today 2010, 28, (6), 18-21. 2) SHEN, H.; QIN, H. H.; GUO, J. S., Cooperation of metallothionein and zinc transporters for regulating zinc homeostasis in human intestinal Caco-2 cells. Nutr. Res. 2008, 28, (6), 406-413. 3) FRANKLIN, R. B.; FENG, P.; MILON, B.; DESOUKI, M. M.; SINGH, K. K.; KAJDACSYBALLA, A.; BAGASRA, O.; COSTELLO, L. C., hZIP1 zinc uptake transporter down regulation and zinc depletion in prostate cancer. Mol. Cancer 2005, 4, 13. 4) COSTELLO, L. C.; FRANKLIN, R. B., The clinical relevance of the metabolism of prostate cancer; zinc and tumor suppression: connecting the dots. Mol. Cancer 2006, 5, 13. 5) FRANKLIN, R. B.; COSTELLO, L. C., The Important Role of the Apoptotic Effects of Zinc in the Development of Cancers. J. Cell. Biochem. 2009, 106, (5), 750-757.

138

Vývoj chitosanových mikročástic pro přívod modelového léčiva do kolonu Jakub Vysloužil1, Martina Bajerová1, Kateřina Dvořáčková1 Ústav technologie léků, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno1

Úvod V současné době roste zájem o lékové systémy s řízeným uvolňováním léčiva připravené z polymerů přírodního původu. Biopolymery a jejich polysyntetické deriváty tvoří hydrogely, které lze následně použít k přípravě filmů či mikročástic. Jedním z takových polymerů je i polosyntetický polysacharid chitosan, disponující několika výhodnými vlastnostmi jako např. biodegradovatelnost, biokompatibilita, téměř nulová toxicita, mukoadhezivita či mírný antibakteriální účinek. Má kationtový charakter a s polyanionty, jako je např. tripolyfosfát či algináty, tvoří gely. Cílem práce bylo připravit chitosanové mikročástice s obsahem léčiva a provést jejich hodnocení. Jako modelové léčivo se použila kyselina 5- aminosalicylová, která se využívá k terapii nespecifických střevních zánětů. Materiál a metodika Injektabilita roztoku chitosanu V preformulačním experimentu byla stanovena injektabilita roztoků chitosanu k nalezení vhodných koncentrací chitosanu pro přípravu mikročástic s léčivem. Použily se čtyři typy chitosanu: s nízkou molekulovou hmotností (Sigma Aldrich; LMW), se střední molekulovou hmotností (Sigma Aldrich; MMW), s vysokou molekulovou hmotností (Sigma Aldrich; HMW) a speciální typ chitosanu získaný z krabích schránek (Sigma Aldrich; CS). Příslušné množství chitosanu se rozpustilo v 1% roztoku kyseliny octové. Roztok chitosanu byl následně aplikován insulinovými stříkačkami s obsahem 1 ml za pomoci lineárního dávkovače do 10% roztoku tripolyfosfátu ve vodě. Připravené mikročástice se v roztoku tripolyfosfátu tvrdily po dobu 30 minut, poté se zfiltrovaly a usušily. Příprava mikročástic s obsahem 5- aminosalicylové kyseliny Metoda 1) Chitosan se rozpustil v 1% roztoku kyseliny octové obsahující 0,25 % 5aminosalicylové kyseliny. Roztok byl následně aplikován injekční stříkačkou s jehlou o průměru 0,7 mm za pomoci lineárního dávkovače do 10% roztoku tripolyfosfátu ve vodě. Metoda 2) Chitosan se rozpustil v 1% roztoku kyseliny octové a aplikoval se do 10% roztoku tripolyfosfátu obsahujícím 0,116 % 5- aminosalicylové kyseliny.

139

Metoda 3) Chitosan se rozpustil v 1% roztoku kyseliny octové obsahující 0,25 % 5aminosalicylové kyseliny a aplikován se do 10% roztoku tripolyfosfátu obsahujícím 0,116 % 5aminosalicylové kyseliny. Připravené mikročástice se v roztoku tripolyfosfátu tvrdily po dobu 30 60 minut, poté se zfiltrovaly a usušily. Optická analýza mikročástic Z příslušného vzorku bylo odebráno 100 mikročástic a pomocí mikroskopu STM 902 a programu IA32 byla změřena sfericita a zjištěn ekvivalentní průměr částic. Stanovení obsahu Z příslušného vzorku se odebralo 200 mg mikročástic, které se kvantitativně přenesly do 50 ml odměrné baňky. Objem se doplnil destilovanou vodou. Připravené vzorky se ponechaly na ultrazvukové lázni po dobu 5 hodin a poté se zfiltrovaly. Obsah léčiva se změřil při vlnové délce 330 nm pomocí UV/Vis spektrofotometru Perkin Elmer Lambda 25 a programu Lambda25. Z výsledků se vypočítala enkapsulační účinnost. Zkouška disoluce Zkouška disoluce byla provedena na přístroji Sotax AT7 SMART košíčkovou metodou při 100 otáčkách za minutu, 37 °C, ve fosforečnanovém tlumivém roztoku s hodnotou pH 6,8. Výsledky byly vyhodnoceny pomocí programu WinSotax.

Výsledky Výsledky optické analýzy jsou znázorněny v tabulce 1). Sfericita připravených mikročástic se s rostoucí koncentrací chitosanu zvyšovala, popř. se neměnila. Závislost ekvivalentního průměru na koncentraci lze pozorovat jen u některých typů chitosanu. Tabulka 2) uvádí enkapsulační účinnost použitých metod přípravy. Nejefektivnější se ukázala metoda č. 3, která proto byla vybrána k další přípravě mikročástic. Graf 1) představuje výsledky zkoušky disoluce mikročástic připravených z HMW 1,75% chitosanového roztoku s obsahem 5- aminosalicylové podle metody 3). Z výsledku je patrné, že se dle lékopisu jedná okamžité uvolnění léčiva. Mikročástice budou proto dále obaleny materiálem s rozpustností závislou na pH, aby se zajistil jejich přívod do kolonu.

140

Chitosan

LMW

MMW

HMW

CS

Koncentrace (%)

Sfericita

Směr. odch.

Ekviv. průměr (mm2)

Směr. odch.

1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 0,75 1,00 1,25 1,50 1,75 0,75 1,00 1,25 1,50 1,75 0,50 0,75 1,00

0,59 0,72 0,71 0,70 0,70 0,54 0,59 0,65 0,67 0,73 0,76 0,72 0,77 0,75 0,78 0,61 0,71 0,74

0,115 0,093 0,114 0,118 0,134 0,115 0,084 0,065 0,067 0,065 0,051 0,064 0,041 0,060 0,040 0,078 0,057 0,064

975,32 1157,70 982,31 1100,16 1262,94 787,71 747,51 822,285 890,46 930,17 788,59 881,27 1017,97 1058,30 1246,09 713,53 669,30 708,25

149,043 186,857 74,949 120,734 194,249 157,469 81,189 62,731 61,408 49,801 91,125 103,383 80,931 64,722 71,843 87,942 72,367 98,523

Tabulka 1) Sfericita a ekvivalentní průměr částic Koncentrace chitosanu Metoda 1) (%)

0,75 1,00

Enkapsulační účinnost (%)

4,11 4,70

1,25

2,99

1,50

3,63

1,75

5,95

Metoda 2)

1,75

15,98

Metoda 3)

1,75

32,69

Tabulka 2) Srovnání účinnosti metod přípravy mikročástic s léčivem

Graf 1) Zkouška disoluce mikročástic připravených metodou 3) z 1,75% roztoku HMW chitosanu

141

Formulace a hodnocení mukoadhezivních flexibilních filmů připravených metodou impregnace Hana Landová, Jan Gajdziok, David Vetchý, Martina Čujanová, Monika Kovářová, Eliška Havlová, Barbora Jakešová, Ladislava Juřenová Ústav technologie léků, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Onemocnění sliznice dutiny ústní patří do skupiny chorob, s nimiž se v průběhu života setká drtivá většina populace. Problémy spojené s poškozením sliznice vyplývají z jejího trvalého vystavení vnějším vlivům, souvisejících mimo jiné s příjmem potravy, dýchacími procesy a mluvením. Léze v dutině ústní bývají velmi bolestivé a značně snižují kvalitu života pacientů1). V současnosti jsou ve farmakoterapii slizničních defektů nejčastěji používány ústní vody, gely a pasty. Nevýhodou těchto lékových forem je jejich krátká doba setrvání v místě aplikace z důvodu jejich rychlého vymývání slinami a tudíž nutnost aplikovat tyto přípravky opakovaně. Vývoj mukoadhezivních filmů by přispěl k výraznému zefektivnění farmakoterapie – jednak je lze použít samotné jako krytí slizničních defektů, nebo lze pod ně aplikovat konvenční přípravky, čímž by se prodloužila doba aktivní farmakoterapie. Tím by se také značně omezila četnost opakování aplikace léčivých přípravků, jejich spotřeba a ekonomická náročnost léčby. Cílem projektu byla optimalizace přípravy pevného flexibilního nemedikovaného mukoadhezivního filmu metodou impregnace karboxymethylcelulosového hydrokoloidního krytí a jeho hodnocení. Materiál a metodika Materiál: Základem připravovaných flexibilních filmů byla kyselá forma karboxymethylcelulosy v podobě plošné netkané textilie (Hcel HT, Holzbecher Medical, CZ). Pro zlepšení mukoadhezivních vlastností byla impregnována 2% disperzí sodné soli karboxymethylcelulosy (NaCMC) (Blanose 7LF-PH, Ashland Aqualon Functional Ingredients, USA). K této disperzi byly eventuálně přidány další mukoadhezivní polymery: různé typy hydroxypropylmethylcelulosy (HPMC) (K100LV, respektive E4M, Methocel™, Dow Wolff Cellulosics, USA), respektive polyethylenoxid (Polyox™, Dow Wolff Cellulosics, USA). Pro zvýšení flexibility filmů byl přidán glycerol (Kulich, CZ) v různých koncentracích. Nakonec byla na filmy nanesena krycí vrstva z hydrofobní směsi bílého vosku (Kulich, CZ) a bílé vazelíny (Kulich, CZ) v poměru 70:30, díky níž dochází k prodloužení setrvání filmů ve vlhkém prostředí ústní dutiny.

142

Metodika: V první fázi byla optimalizována disperze určená k impregnaci netkané textilie. K základu tvořenému 2% disperzí NaCMC ve vodě se přidávaly další mukoadhezivní polymery a také glycerol jako plastifikátor (viz Tabulka 1). vzorek

NaCM Polyox HPMC HPM glycer C

NaCM C 1A NaCM C 1B NaCM C 1C NaCM C 1D NaCM C 1E NaCM C 2A NaCM C 2B NaCM C 2C NaCM C 2D NaCM C 2E

2% 2% 2% 2% 2% 2% 2% 2% 2% 2%

™ 0,5% 0,5% 0,5% 0,5% 0,5%

K100L V -

C E4M -

voda

vzorek

ad

NaCM

100% ad

C 3A NaCM

100% ad

C 3B NaCM

100% ad

C 3C NaCM

100% ad

C 3D NaCM

100% ad

C 3E NaCM

100% ad

C 4A NaCM

100% ad

C 4B NaCM

100% ad

C 4C NaCM

100% ad

C 4D NaCM

100%

C 4E

NaCM Polyox HPMC HPM glycer

ol 1% 1,5% 2% 2,5% 3% 1% 1,5% 2% 2,5% 3%

C

™

K100L

C

ol

2%

-

0,5% V

E4M

1%

2%

-

0,5%

-

1,5%

2%

-

0,5%

-

2%

2%

-

0,5%

-

2,5%

2%

-

0,5%

-

3%

2%

-

-

0,5%

1%

2%

-

-

0,5%

1,5%

2%

-

-

0,5%

2%

2%

-

-

0,5%

2,5%

2%

-

-

0,5%

3%

Tabulka 1. Složení disperzí pro přípravu filmů (% w/w)

voda ad 100 ad % 100 ad % 100 ad % 100 ad % 100 ad % 100 ad % 100 ad % 100 ad % 100 ad % 100 %

Flexibilní filmy se připravily metodou odpařování rozpouštědla. Připravené homogenní směsi se pomocí automatické pipety nadávkovaly do plastových kruhových forem (Ø 63 mm) v množství 18 ml. Rozpouštědlo se odpařilo za pokojové teploty. Ze získaných filmů se vyrazily vzorky o rozměrech 25 x 25 mm a 10 x 40 mm, které byly podrobeny dalšímu testování. Tloušťka filmu se stanovila pomocí optické analýzy (IA 32, LECO, USA) a pevnost filmu v tahu, odolnost proti protržení a vykonaná práce při těchto procesech se naměřily pomocí Texture Analyzeru CT3, Brookfield, USA a sond TA39 (síla potřebná k protržení) a TA-DGA (síla potřebná k roztržení). Flexibilita připravených filmů se hodnotila organolepticky. Na základě naměřených výsledků, které byly prezentovány na konferenci Syntéza a analýza léčiv 2), byly vybrány disperze NaCMC 1A, NaCMC 2A a NaCMC 4A k impregnaci netkané textilie. Textilie upravená do tvaru kruhu o průměru 63 mm byla vložena do plastové kruhové formy a impregnována takovým množstvím disperze, aby hmotnost výsledných filmů odpovídala hmotnosti filmů připravených v první fázi. Rozpouštědlo se odpařilo za pokojové teploty.

143

Takto připravené filmy byly z jedné strany ponořeny do natavené směsi bílého vosku a bílé vazelíny, jejímž ztuhnutím vznikla krycí vrstva. Vyražené vzorky o rozměrech 25 x 25 mm a 10 x 40 mm byly opět podrobeny optické analýze a hodnocení pomocí Texture Analyzeru. Výsledky Vzhledem k různým hodnotám tloušťky jednotlivých vzorků byly naměřené výsledky pomocí Texture Analyzeru vztaženy k tloušťce filmu 100 μm a následně porovnány. Samotnou textilii jsme kvůli její struktuře podrobili měření ve dvou různých směrech. Síla potřebná k roztržení vzorku se významně lišila (0,61 N vs. 1,42 N), a proto jsme se rozhodli dále měřit vzorky s výhodněji orientovanou strukturou textilie. Vzorky o rozměrech 25 x 25 mm se použily ke stanovení síly, která byla potřebná k protržení filmu upevněného v Texture Analyzeru pomocí sondy TA39 (Tab. 2). Další parametr mechanické odolnosti připravených filmů, síla potřebná k roztržení filmu upevněného v Texture Analyzeru pomocí sondy TA-DGA (Tab. 3), se stanovoval se vzorky o rozměrech 10 x 40 mm.

impregnovaná textilie primární film

NaCMC

NaCMC

NaCMC

NaCMC

NaCMC

NaCMC

1A

2A

4A

1A

2A

4A

7,50

7,10

7,51

20,75

19,61

18,90

19,35

16,89

22,19

26,55

22,11

29,97

Tab. 2. Síla potřebná k protržení filmu [N]

impregnovaná textilie primární film

Tab. 3. Síla potřebná k roztržení filmu [N]

Oproti očekávání byla síla potřebná k protržení samotného filmu bez impregnované textilie z karboxymethylcelulosy větší, dokonce více jak dvojnásobná. Stejně tak naměřené hodnoty síly potřebné k roztržení samotných filmů jsou výrazně vyšší, z čehož vyplývá, že jsou samotné filmy bez impregnované textilie z karboxymethylcelulosy mechanicky odolnější, a to jak proti protržení, tak i roztržení. Tento jev lze vysvětlit tím, že samotné filmy jsou více flexibilní a elastické. I přes toto zjištění je mechanická odolnost všech filmů, tedy i impregnovaných, dostačující a nižší naměřené hodnoty nejsou limitujícím faktorem pro použití v dutině ústní.

144

Závěr Připravené mukoadhezivní filmy jsou určeny ke krytí slizničních defektů dutiny ústní. Pod tyto filmy může být aplikován vhodný léčivý přípravek ve formě běžně používaných orálních gelů, past nebo prášků, čímž se zajistí dlouhodobější setrvání účinné látky v místě aplikace. Připravené filmy musí být tedy dostatečně pevné a flexibilní. Z naměřených výsledků vyplývá, že všechny připravené filmy měly dobrou mechanickou odolnost, nicméně u filmů ze samotné NaCMC (bez impregnované textilie) byla signifikantně větší. Vybrané vzorky budou dále testovány in vitro a také ve spolupráci se stomatologickými pracovišti in vivo. Seznam literatury 1) GAJDZIOK, J., TAJOVSKÁ, E., BAJEROVÁ, M., CHALUPOVÁ, Z.: Choroby sliznice dutiny ústní. Praktické lékárenství, 2009, 6(1): 26-28 2) LANDOVÁ, H., GAJDZIOK, J., VETCHÝ, D., ČUJANOVÁ, M., KOVÁŘOVÁ, M.: Porovnání fyzikálně-chemických vlastností bukálních filmů z různých mukoadhezivních polymerů. In Sborník 40. konfernce “Syntéza a analýza léčiv”, Brno, září 2011.

145

Optimalizace metod pro stanovení inhibiční aktivity potenciálních inhibitorů histondeacetyláz Zuzana Slivová, Anna Lišková Ústav chemických léčiv, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Pôsobením histónových deacetyláz (HDAC) dochádza k deacetylácii histónov a spoločne s histónovými acetyltransferázami (HAT) tak regulujú acetyláciu histónov a tým i transkripčnú aktivitu. Histónové deacetylázy hrajú taktiež kľúčovú úlohu v priebehu bunkového cyklu (1) a pri nádorovej transformácii (2). Inhibítory históndeacetyláz predstavujú sľubné zlúčeniny pre možné použitie v terapii hematologických i solídnych malignít. Doposiaľ boli určené štyri štruktúrne triedy inhibítorov HDAC a to hydroxamové kyseliny, mastné kyseliny s krátkymi reťazcami, cyklické tetrapeptidy a benzamidy (3). Cieľom projektu bolo optimalizovať metódu stanovenia inhibičnej aktivity potenciálnych inhibítorov históndeacetylázy (HDAC) za použitia známych inhibítorov Trychostatínu A (TSA) a suberoylanilid hydroxamovej kyseliny (SAHA). Materiál a metodika Podmienky pre stanovenie inhibičnej aktivity potenciálných inhibítorov HDAC boli optimalizované za využitia komerčných kitov „Fluor de Lys®-Green HDAC Assay Kit“. Stanovenie koncentrácie aktívnej históndeacetylázy spočívalo v rekcii prebiehajúcej v dvoch krokoch. V prvom kroku reagoval

„Fluor

de

Lys®-Green

Substrát“

poskytujúci

acetylovaný

lyzínový

reťazec

s históndeacetylázou obsiahnutou v nukleárnom HeLa extrakte. V druhom kroku deacetylovaný substrát reagoval s „Fluor de Lys® Developerom“ za vniku flurofóru. Emitované žiarenie v rozsahu 520 – 550 nm bolo zmerané za pomoci readeru, pričom množstvo emitovaného žiarenia rástlo s množstvom deacetylovaného substrátu, a teda s aktivitou HDAC. Aktivita HDAC resp. inhibítora bola odvodená z koncentrácie deacetylovaného substrátu vstupujúceho do reakcie s developerom. Táto koncentrácia bola vypočítaná z koncentračnej krivky substrátu, ktorá bola zostrojená použitím Fluor de Lys®-Green deacetylovaného štandardu. Koncentračná krivka vykazovala polynomálnu závislosť s regresným koeficientom R = 0,9971. Optimalizovaná bola jednak doba inkubácie Fluor de Lys®-Green Substrátu s HeLa extraktom potrebná

na

deacetyláciu

dostatočného

množstva

substrátu

a jednak

doba

inkubácie

146

deacetylovaného substrátu s Fluor de Lys® Developerom potrebná na zreagovanie celého množstva deacetylovaného substrátu s developerom. Na stanovenie inhibičnej aktivity boli ako modelové inhibítory históndeacetylázy použité Trychostatín A (TSA) a suberoylanilid hydroxamová kyselina (SAHA). Roztoky oboch inhibítorov boli pre stanovenie inhibičnej aktivity pripravené riedením 50 mM zásobných roztokov. V prípade TSA boli pripravené roztoky v rozpätí koncentrácií 0,1 – 10 000 nM, pre stanovenie inhibičnej aktivity SAHY boli použité roztoky v rozpätí koncentrácií 0,05 – 20 µM. Komponenty komerčného kitu „Fluor de Lys®-Green HDAC Assay Kit“ (ENZO Life Sciences) použité na stanovenie: -

Nukleárny HeLa extrakt (6 – 9 mg proteínu/ml v 0,1 M KCl; 20 mM HEPES/NaOH; pH 7,9; 20% (v/v) glycerolu; 0,2 mM EDTA; 0,5 mM DTT; 0,5 mM PMSF)

-

Fluor de Lys®-Green Substrát (50 mM v DMSO)

-

Fluor de Lys® Developer, koncentrát (20x)

-

Trychostatín A (0,2 mM v DMSO)

-

Fluor de Lys®-Green deacetylovaný štandard

-

Tlmivý roztok (50 mM Tris/Cl; pH 8,0; 137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 1 mM MgCl2)

-

96 jamková ½ objemová čierna mikrotitračná doska

Ďalšie použité chemikálie (modelové inhibítory HDAC): -

Trychostatín A (50 mM v DMSO, Sigma Aldrich, Nemecko)

-

SAHA (50 mM v DMSO, nasyntetizovaná na ÚCHL FaF VFU Brno)

Použité prístroje a nastavené parametre: -

prístroj: Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader (Biotek, USA)

-

excitácia pri vlnovej dĺžke: 485 nm

-

emisia pri vlnovej dĺžke: 528 nm

-

výťažnosť: 60 Výsledky

Bola

vypracovaná

metodika

stanovenia

inhibičnej

aktivity

potenciálnych

inhibítorov

históndeacetylázy, ktorá bola na Ústave chemických liečiv použitá prvý krát. V rámci projektu boli optimalizované nasledujúce podmienky: -

doba inkubácie enzýmu a substrátu: 20 minút

-

doba inkubácie deacetylovaného substrátu a developera: 20 minút

147

-

inkubačná teplota: 37 °C

Inhibičné aktivity referenčných inhibítorov bola vyjadrené ako IC50. Vypočítané boli pomocou programu Sigma-Plot s využitím sigmoidálnej regresie. Hodnoty IC50 a korelačné koeficienty boli nasledujúce: IC50 stanovená pre TSA: 65,64 nM (R = 0,9952)

-

IC50 stanovená pre SAHA: 0,55 µM (R = 0,9870)

koncentrácia substrátu [pM / well]

-

inhibičná aktivita TSA

koncentrácia TSA [nM]

koncentrácia substrátu [pM / well]

Graf č. 1: Inhibičná aktivita TSA, IC50 = 65,64 nM inhibičná aktivita SAHA

koncentrácia SAHA [μM]

Graf. č. 2: Inhibičná aktivita SAHA, IC50 = 0,55 μM Vypracovaná metodika bude použitá na pre-screening potenciálnych inhibítorov HDAC. Seznam literatury 1) Cheng, H. L, Molostavsky, R., Saito, S., Manis, J. P., Gu, Y., Patel, P. et al. Developmental defects and p53 hyperacetylation in Sir2 homolog (SIRT1)-deficient mice. Proc. Natl. Acad. Sci. 2003, 100, s. 10749-10794. 2) Bode, A. M. and Dong, Z. Post-translational modification of p53 tumorigenesis. Nat. Rev. Cancer. 2004, 4, s. 793-805. 3) Finnin, M. S., Donigian, R. J., Cohen, A., Richon, V. M., Rifkind, R. A., Marks, P. A. et al. Structures of a histone deacetylasehomologue bound to the TSA and SAHA inhibitors. Nature. 401, s. 188-193.

148

Mikrovlnná syntéza nových substituovaných derivátů chinolinu jako potenciálních antimikrobiálních látek Josef Šujan, Libor Veselý, Eva Křečková, Pavel Bobáľ Ústav chemických léčiv, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Úvod Deriváty obsahující chinolinový skelet vykazují specifické fyzikálně-chemické vlastnosti a jsou součástí mnoha biologicky aktivních látek. Amidová skupina mnohdy simuluje peptidickou vazbu, vytváří stabilní vodíkové vazby a sloučeniny obsahující tuto skupinu v molekule mohou mít specifickou aktivitu k řadě receptorů a enzymů1. Z předcházejících studií se zjistilo, že tyto jednoduché látky vykazují široké spektrum biologických účinků od antimikrobiálních, antifungálních, antiparazitických, antivirotických, až po antineoplastickou aktivitu. Materiál a metodika Cílem projektu byla příprava sérií substituovaných alifatických a aromatických amidů kyseliny chinaldinové a jejího izosteru obecného vzorce (obr. 1). R1 N

X

R2

O X = N, CH

R1 = H, R2

H N

X

O R2 = alkyl, cykloalkyl

X

Obrázek 1: Obecné struktury připravovaných látek. Standardní metoda přípravy amidů kyseliny chinaldinové a jiných amidů je založena na aktivaci karboxylové skupiny a následné kondenzaci s aminem nebo anilinem. Aktivace se nejčastěji provádí pomocí thionylchloridu na acylchlorid, případně na směsný anhydrid, nebo aktivovaný ester. Všechny tyto metody se provádějí ve dvou krocích s nutností izolace reaktivního intermediátu. Další nevýhodou tradičních metod je vznik vedlejších produktů. Při reakci chinaldinové kyseliny s thionylchloridem v přítomnosti malého množství DMF dochází k chloraci chinolinového kruhu v poloze 4 (schéma 1) obdobně jako je to známé u pyridinu2. Cl SOCl2 OH

N

DMFcat

Cl

N

O

O

Cl

N O

Schéma 1: Reakce vzniku nežádoucího 4-chloro derivátu.

149

Předmětem tohoto projektu byl vývoj metodiky přípravy substituovaných amidů a anilidů v jednom kroku vycházející ze samotné kyseliny nebo jejího esteru a alifatického nebo aromatického aminu pomocí mikrovlnného záření. V posledním období se stalo používání mikrovlnného záření velmi populární díky větším výtěžkům, čistějším reakcím a kratšímu reakčnímu času. Tím, že se v mnoha případech nepoužívá rozpouštědlo je zvýšená bezpečnost a efektivita. Mikrovlnná aktivace byla využita s velkým úspěchem v několika případech syntézy amidů3,4. Metodika byla testována na příkladu reakce kyseliny chinolin-2-karboxylové a jejích esterů (Me a Ph) a kyseliny naftalen-2-karboxylové a jejího Et esteru s 4-bromanilinem. Reakce byly prováděny v mikrovlnném reaktoru StartSynth s frekvencí záření 2.45 GHz od firmy Milestone S.r.l., Sorisole, Italy. Teplota reakční směsi byla udržována na 150 °C a měřena interním infračerveným senzorem. Maximální výkon reaktoru byl zvolen 800 W. Reakce byly prováděny, jak bez rozpouštědla, tak v rozpouštědlech (chlorbenzen, dimethylformamid), bez katalyzátoru nebo s katalyzátorem (tBuOK, PTSA, silikagel, KF/Al2O3). Poměr kyseliny nebo jejího derivátu k aminu byl 1:1,5. Pro získání rychlé zpětné vazby a optimalizaci procesu byly všechny prováděné reakce monitorovány pomocí RP HPLC. Při použití této analytické techniky bylo taky možné sledovat profil nečistot při srovnávacích studiích. Monitorování bylo prováděno na HPLC systémech Agilent 1200 Series a Young-Lin 9100 s UV detekcí. Vzorky z jednotlivých reakcí byly odebírány v časech 0,5, 1 a 2 hodiny. H2N O

X

R

O

Br

H N

X

MW 150 °C, 800 W

O

X=N

R = H, CH3, Ph

X=N

X = CH

R = H, CH2CH3

X = CH

X

Br

X=N X = CH

Schéma 2: Optimalizace mikrovlnné syntézy 4-bromanilidu chinolin-2-karboxylové a naftalen-2karboxylové kyseliny. Výsledky Bylo uskutečněno více, než 60 reakcí s cílem najít nejvhodnější reakční podmínky. Ze získaných výsledků je zřejmé, že chinolin-2-karboxylová kyselina ochotně dekarboxyluje na rozdíl od kyseliny naftalen-2-karboxylové. Použitím methylesteru je sice tento problém potlačen, ale tvorba žádaného produktu není signifikantně urychlena. Obdobné zjištění bylo pozorováno i v případě ethylesteru naftalen-2-karboxylové kyseliny. Použití rozpouštědel, jako reakčního média mělo negativní vliv na průběh reakce. Také použití katalyzátorů nepřineslo významné urychlení samotné reakce.

150

Bylo zjištěno, že nejvhodnějšími reakčními podmínkami pro vznik 4-bromanilidu, je mikrovlnné zahřívání

fenylesteru

chinolin-2-karboxylové

kyseliny s 4-bromanilinem

bez

přítomnosti

katalyzátoru a rozpouštědla. Již v průběhu půlhodiny byla pozorována konverze 96 % a po 1 hodině reakční směs neobsahovala ani stopy výchozí látky. Po skončení reakce byl produkt izolován tradičním způsobem v 88 % výtěžku a ve vynikající čistotě. Po vypracování a optimalizaci této mikrovlnné metodiky byla připravena série substituovaných anilidů chinolin-2-karboxylové kyseliny se substituenty Br, Cl, F, OCH3, CH3 a CF3 v o-, m- a ppoloze (schéma 3). Připravené nové v literatuře nepopsané deriváty byly charakterizovány pomocí spektrálních metod (NMR, MS, IČ) a poskytnuty na biologické hodnocení. R' H2N O

N O

MW 150 °C, 800 W, 1 h

H N

N O

R'

R' = Br, Cl, F, OCH3, CH3, CF3

Schéma 3: Příprava substituovaných anilidů chinolin-2-karboxylové kyseliny. Vypracovaná metodika byla srovnávána s tradičními metodikami5, při kterých dochází k tvorbě vedlejších produktů. Kromě získání produktů s vyšší čistotou byl pozorován také významný narůst výtěžků reakcí. Z původních 26-57 % při tradiční metodě5 vzrostl použitím mikrovlnného urychlení na 61-89 %6. Tato práce byla financována grantem IGA č. 49/2011/FaF. Seznam literatury 1) Otevřel, J.; Mandelová, Z.; Peško, M. a kol. Molecules 2010, 15, 8122-8142. 2) Bankston, D.; Dumas, J.; Natero, R. a kol. Org. Process Res. Dev. 2002, 6, 777-781. 3) Perreux L.; Loupy, A., Volatron, F. Tetrahedron 2002, 58, 2155-2162. 4) Bogdal D. Microwave-assisted Organic Synthesis, One Hundred Reaction Procedures, Elsevier, Oxford, 2005. 5) Goněc, T.; Bobáľ, P.; Šujan, J. a kol. Molecules, 2011, (odesláno k publikaci). 6) Bobáľ, P.; Šujan, J.; Otevřel, J. a kol. Molecules, 2011, (připraveno k odeslání).

151

Syntéza nových inhibitorů histondeacetylas – modulace struktury chromatinu Ingrida Pažitná, Alexandra Mikudíková, Pavel Bobáľ Ústav chemických léčiv, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Úvod Genetické, ale i epigenetické změny v DNA se podílejí na vývoji a progresi nádorových onemocnění. Epigenetické změny, mnohdy související s acetylací histonových proteinů, jsou významným prvkem regulace genové exprese. Na stavu acetylace histonů mají vliv dvě skupiny enzymů, histonacetyltransferasy (HAT) a histondeacetylasy (HDAC). HAT katalyzují acetylaci lyzinových zbytků histonů a HDAC naopak deacetylaci, a tím se obě významně podílejí na modulaci struktury chromatinu. Hypoacetylovaný chromatin je více kompaktní a transkripčně neaktivní, na rozdíl od transkripčně aktivního, acetylovaného chromatinu. Zvýšená aktivita HDAC byla zjištěna v řadě maligních nádorů a ve významné míře ovlivňuje represi nádorových supresorových genů. Inhibitory histondeacetylas představují v dnešní době slibná potenciální léčiva pro možnost použití v terapii hematologických i solidních malignit1. Inhibitory HDAC také potencují účinky radioterapie a některých cytostatik. Tato skutečnost pravděpodobně souvisí se změnou struktury chromatinu, protože acetylovaný chromatin je lépe přístupný cytostatikům, která poškozují DNA nádorových buněk2. Prvním léčivem ze skupiny HDAC inhibitorů byl pro léčbu kožních T-lymfomů v r. 2006 FDA schválený vorinostat. Chemicky je vorinostat suberoylanilidem hydroxamové kyseliny (SAHA). Aktivita některých inhibitorů HDAC souvisí s jejich schopností vázat kationy zinku3. Aktivním místem enzymu HDAC je úzká štěrbina se Zn2+ umístěným na dně. Aby se inhibitory do této skuliny dostaly, obsahují spojovací alifatický řetězec tvořený několika atomy uhlíku. Funkční skupina hydroxamové kyseliny slouží k chelataci zinku a tzv. „hlavice“ interaguje s aminokyselinami, které jsou na povrchu aktivního místa enzymu.

Materiál a metodika Cílem projektu bylo připravit nové inhibitory HDAC analogické k již existujícím a v praxi využívaným inhibitorům typu SAHA, kde se funkce hydroxamové kyseliny, jako skupiny vázající kov, nahradí 3-hydroxy-4H-pyran-4-onem (obr. 1). Tento fragment vykazuje vynikající chelatační schopnosti, a to při zachování malých rozměrů. To jej předurčuje pro volný průnik štěrbinou aktivního místa enzymu. Pro optimalizaci inhibiční aktivity se připravila série látek se spojovacím řetězcem o délce n = 1 – 5.

152

O H N

N H

O

Pro syntézu nových inhi-

OH

O

bitorů se jako základní

H N

OH

n

O

SAHA

O

komerční substrát použil

n = 1-5

5-hydroxy-2-(hydroxyspojovací řetězec

"hlavice"

skupina vázající kov

"hlavice"

spojovací skupina vázacící řetězec kov

Obrázek 1: Struktury SAHA a navržených potenciálních inhibitorů.

methyl)-4H-pyran-4-on s triviálním

názvem

kyselina kojová. Po její protekci (Bn) v poloze 5, byla modifikována na bočním řetězci v poloze 2 na chlorid nebo karbaldehyd. Z chloridu byl dále připraven fosfonát. První inhibitor s nejkratším řetězcem byl syntetizován dvěma paralelními cestami. První z nich vycházela z karbaldehydu chráněné kyseliny kojové a esteru kyseliny diethylfosfonooctové (schéma 1). Touto tzv. HornerWadsworth-Emmonsovou reakcí se vytvořil kondenzační produkt, jenž byl posléze hydrolyzován na substituovanou akrylovou kyselinu. Druhou cestou byla Knoevenagelova kondenzace karbaldehydu s kyselinou malonovou v pyridinu katalyzovaná ionexem. Tímto způsobem vzniklá dikarboxylová kyselina se dekarboxylovala na substituovanou akrylovou kyselinu, a ta byla dále spojena s anilinem pomocí kondenzačních činidel (CDI, DCC, BOP). Finální inhibitor se získal působením vodíku a katalyzátoru (Pd(OH)2/C). O

O OH

HO

O

O O

BnCl

CH3ONa, CH3OH

HO

O

MnO2 CH2Cl2

O

O

O

EtO

HOOC

kyselina kojová

EtOOC

O

P

OEt HOOC

Dowex 50W Pyridin

K2CO3, H2O O O

O HO

O

HO

O

O

100 °C Pyridin

O O

KOH EtOH

O

O OH H2, Pd(OH)2/C

H N

O O

O O

THF

O O

H N

O O

O

PhNH2 HO CDI, THF (DCC, DMAP, CH2Cl2) (BOP, DIPEA, CH2Cl2) O

O

Schéma 1: Příprava potenciálního inhibitoru s nejkratším řetězcem. V případě dalších čtyř potenciálních inhibitorů se při syntéze vycházelo se stejného derivátu karbaldehydu (schéma 2). Připojení k linkerům bylo provedeno v případě karbaldehydu pomocí Wittigovy reakce s fosfónium ylidem, který se generoval z fosfóniové soli a silné báze např. terciárního butoxidu draselného. Fosfóniové soli se získaly z příslušných bromalkylesterů a trifenylfosfanu za zvýšené teploty. Produkty Wittigovy reakce – estery – byly následně

153

hydrolyzovány uhličitanem draselným ve vodně methanolickém roztoku. Kondenzace vzniklých kyselin s anilinem se realizovala s použitím osvědčených činidel (CDI, DCC, BOP). Hydrogenací na palládiovém katalyzátoru se redukovala dvojná vazba a odstranila se benzylová chránící skupina. O O Ph R

O

Br

n

O n=1-4 R = CH3, CH2CH3

Ph3P

R

120 °C

O

P

n

O

Ph Ph

Br

O t

O

BuOK, PhMe, THF -80 °C, 48 h O

O

O

O HO

K2CO3

O

n-1

CH3OH, H2O

O

R

O

O

n-1 O

PhNH2, CDI, THF (DCC, DMAP, CH2Cl2) (BOP, DIPEA, CH2Cl2) O

O O

H N

OH

H2, Pd(OH)2/C n-1

O

THF

O

H N

n-1

O

O

n=1-4

Schéma 2: Příprava dalších potenciálních inhibitorů s různou délkou řetězce.

Výsledky Byly vypracovány postupy přípravy nových potenciálních inhibitorů HDAC s novou skupinou vázající kov a se spojovacím řetězcem o délce 1 – 5 methylénových jednotek. Připravené nové a v literatuře nepopsané látky se charakterizovaly pomocí spektrálních metod a budou poskytnuty na in vitro hodnocení jejich inhibiční aktivity. Tato práce byla financována grantem IGA č. 51/2011/FaF. Seznam literatury 1) Carraway, H.E.; Gore, S.D. J. Clin. Oncol. 2007, 25, 1955-1956. 2) Engel, D.; Nudelman, A.; Levovich, I. a kol. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2006, 132, 673-683. 3) Finnin, M.S.; Donigian, J.R.; Cohen, A. a kol. Nature 1999, 401, 188-193.

154

Izolace obsahových látek Paulownia tomentosa Mgr. Zuzana Hanáková, PharmDr. Karel Šmejkal, Ph.D. Ústav přírodních léčiv, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Úvod P. tomentosa (Thunb.) Siebold et. Zucc. ex Steud. (Paulowniaceae) je na Ústavu přírodních léčiv intenzivně studovanou rostlinou a to zejména pro obsah velkého množství polyfenolických látek se zajímavou biologickou aktivitou. Byly izolovány látky ze skupin fenylpropanoidních glykosidů, prenylovaných flavonoidů (flavanonů typu diplakonu) a lignanů.1-4 Naše práce byla zaměřena na separaci ethanolického extraktu P. tomentosa a následně na izolaci čistých látek. Díky velkému množství získaného ethanolického extraktu jsme navíc vedle těch již dříve izolovaných očekávali také izolaci minoritních obsahových látek, které zatím nebyly popsány v literatuře. Materiál a metodika Rostlinný materiál Jako rostlinný materiál byly použity dozrávající i zralé plody P. tomentosa, posbírané na podzim 2010 v areálu VFU Brno. 12,9 kg plodů bylo pětkrát extrahováno ethanolem. Extrakt byl zbaven rozpouštědla na vakuové rotační odparce a zbytků vody na lyofilizátoru. Suchý extrakt vážil 401 gram. Liquid-liquid extrakce První dělení probíhalo systémem vytřepávání mezi vzájemně nemísitelná rozpouštědla. Ethanolický extrakt byl rozpuštěn v 10% methanolu, k němuž byl přidán chloroform. K chloroformovému podílu, který byl vysušen a znovu rozpuštěn v 90% methanolu, byl přidán hexan k odstranění silně lipofilních látek. Pro další separaci byl použit methanolový podíl (115,8 g).

Sloupcová chromatografie K separaci methanolového podílu byla použita sloupcová chromatografie na silikagelu (velikost zrn 40 – 63 μm) s mobilní fází benzen:aceton 95:5 a 90:10 (V/V). Frakce byly jímány o objemu cca 120

155

ml. Celkových 328 frakcí bylo na základě TLC a HPLC analýzy spojeno do konečných 24 frakcí (PT4-1 až PT4-24). Pomocí sloupcové chromatografie na silikagelu byly následně děleny i tyto frakce: PT4-8 (mobilní fáze chloroform:methanol:benzen 8,5:0,5:1, V/V/V), PT4-8-C (mobilní fáze benzen:ethylacetát 3:2, V/V) a PT4-10 (mobilní fáze chloroform:methanol:benzen 8,5:0,5:1, V/V/V). Preparativní HPLC K separaci metodou preparativní HPLC byl použit přístroj YL 9100 HPLC System (Young Lin) s FOXY R2 sběračem frakcí (Teledyne Isco) a semipreparativní kolona Ascentis™ RP-AMIDE 25 cm × 10 mm, velikost zrn 5 μm (Supelco). Jako mobilní fáze byl použit gradient methanolu a 0,2% kys. mravenčí s rostoucím zastoupením methanolu pro dělení frakce PT4-8-C-2, nebo gradient recyklovaného acetonitrilu a 0,2% kys. mravenčí s rostoucím zastoupením recyklátu pro dělení frakce PT4-10-C, PT4-10-D, PT4-10-E, PT4-10-F a PT4-14. Preparativní TLC Pro purifikaci některých frakcí ze sloupcové chromatografie nebo preparativní HPLC byla použita preparativní TLC na deskách Analtech (20 × 20 cm, s indikátorem F254, tloušťka 500 μm). Jako mobilní fáze byla použita směs benzen:ethylacetát v poměru 1:4 (PT4-8-E), 2:3 (PT4-8-C-2/2, PT410-E/2 a PT4-10-E/3), nebo 3:2 (PT4-10-C/2, PT4-10-C/5, PT4-14/1 a PT4-14/2). Identifikační metody Identifikace probíhala za použití NMR (kromě jednodimenzionálních spekter i HMBC, HSQC, COSY a NOESY), UV spektrometrie, cirkulárního dichroismu, polarimetrie a vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie. Výsledky Separací methanolového podílu extraktu P. tomentosa pomocí sloupcové chromatografie bylo získáno celkem 328 frakcí, které byly na základě TLC a HPLC analýzy spojeny do konečných 24 frakcí (PT4-1 až PT4-24). K další separaci byly vybrány frakce PT4-8, PT4-10 a PT4-14. Frakce PT4-8 byla nejdřív dělena na sloupci a takto byly získány frakce PT4-8-A až PT4-8-F. Frakce PT4-8-E byla identifikována jako tomentodiplakon B. Frakce PT4-8-C byla znovu separována pomocí sloupcové chromatografie s jinou mobilní fází a byly získány frakce PT4-8-C-1 až PT4-8-C-12, z nichž byly nejzajímavější první dvě frakce. Látka PT4-8-C-1 byla určena jako 3‘O-methyldiplakon, zatímco frakce PT4-8-C-2 vyžadovala další separaci pomocí preparativní

156

HPLC. Takto byly získány látky PT4-8-C-2/2-a a PT4-8-C-2/2-b (nové látky) a látka PT4-8-C-2/6, opět 3‘-O-methyldiplakon. Frakce PT4-10 byla nejdříve pomocí sloupcové chromatografie rozdělena na frakce PT4-10-A až PT4-10-H. Frakce PT4-10-C byla dále separována pomocí preparativní HPLC a byly takto získány frakce PT4-10-C/2 (6-prenyl-3’-methoxyeriodictyol), PT4-10-C/3 (nová látka), PT4-10-C/4 (nová látka), PT4-10-C/5 (nová látka) a PT4-10-C/6 (nová látka). Frakce PT4-10-D byla pomocí prep. HPLC přečištěna a identifikována jako mimulon. Frakce PT4-10-E byla opět rozdělena za použití prep. HPLC a byly získány frakce PT4-10-E/1 až PT4-10-E/5. Frakce PT4-10-E/2 a PT4-10-E/3 musely být dále separovány pomocí prep. TLC desek a takto byly získány frakce PT4-10-E/2-a (nová látka), PT4-10-E/2-b (nová látka) a PT4-10-E/3‘ (bonnanion B). Frakce PT4-10-E/4 je nová látka a PT4-10-E/5 byla identifikována opět jako mimulon. Nakonec frakce PT4-10-F byla pomocí prep. HPLC rozdělena na látky PT4-10-F/1 (doposud neidentifikováno) a PT4-10-F/2 (nová látka, shodná s PT4-10-E/2-b). Frakce PT4-14 byla také separována za použití preparativní HPLC a byly získány frakce PT4-14/1 až PT4-14/4. PT4-14/1 a PT4-14/2 bylo třeba dále rozdělit na prep. TLC deskách a takto jsme získali látky PT4-14/1-b (doposud neidentifikováno), PT4-14/2-a (doposud neidentifikováno), PT414/2-b (doposud neidentifikováno) a PT4-14/2-e (doposud neidentifikováno). PT4-14/3 je nová látka a PT4-14/4 byla identifikována jako 3‘-O-methyl-5‘-methoxydiplakon. Závěr Z vybraných frakcí získaných dělením methanolického extraktu P. tomentosa na sloupci se podařilo vyizolovat celkem 22 látek s flavonoidní strukturou obsahující prenylový nebo geranylový řetězec. Doposud bylo identifikováno 17 látek, z toho se v 10 případech jedná o látky nové, dosud nepopsané v literatuře a v 12 případech se jedná o látky poprvé izolované z druhu P. tomentosa. Seznam literatury 1) Šmejkal, K., Grycová, L., Marek, R., et al.: C-Geranyl Compounds from Paulownia tomentosa Fruits. J. Nat. Prod., 2007, 70 (8), 1244-1248 2) Šmejkal, K., Chudík, S., Klouček, P., et al.: Antibacterial C-Geranylflavonoids from Paulownia tomentosa fruits. J. Nat. Prod., 2008, 71 (4), 706-709. 3) Šmejkal, K., Svačinová, J., Šlapetová, T., et al.: Cytotoxic activities of several geranylsubstituted flavanones. J. Nat. Prod., 2010, 73, 568-572. 4) Kang, H.K., Jang, S.J., Kim, B.K., et al.: Antibacterial phenylpropanoid glycosides from Paulownia tomentosa. Arch. Pharm. Res., 1994, 17 (6), 470-5.

157

Validace metody pro stanovení sacharidů pomocí hydrofilní interakční chromatografie (HILIC) s detektorem ELSD Tereza Kvačková, Monika Rzymanek, Jiří Pazourek Ústav chemických léčiv, Fakulta farmaceutická, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Palackého 1-3, 612 42 Brno Úvod Sacharidy (a jejich deriváty) jsou rozšířenými analyty, jejichž detekce, identifikace i kvantifikace je komplikována jejich značnou polárností a absencí vhodného chromoforu pro UV-VIS detekci. Metoda separace monosacharidů s ELSD detektorem již byla na FaF VFU Brno vyvinuta [1], avšak byla primárně určena pro identifikaci glykosidů po hydrolýze, kdy byla preferována selektivita. Tato práce měla za úkol tuto analytickou metodu validovat resp. najít podmínky této metody vhodnější pro stanovení. Jako stacionární fáze se typicky používá chemicky vázaný aminopropyl („NH2“ stacionární fáze), jehož nevýhodou je pomalé rozpouštění nosiče-silikagelu v důsledku alkalického pH v pórech. Jako alternativu lze použít jiné chemicky vázané fáze jako je glycidylpropyl („DIOL“ stacionární fáze). Povrch této stacionární fáze obsahuje polyolové skupiny, které jsou velmi hydrofilní. V současnosti se používají i tzv. zwitteriontové stacionární fáze (sulfoalkylbetain), u nichž však přítomnost solí (pufrů) v mobilní fázi omezuje použití detektorů převádějících analyt do plynné fáze (LS nebo MS detektory) [2].

Materiál a metodika Přístroje a vybavení HPLC systém Young Lin Instruments, YL9100 (Korea) vybavený kvartérní HPLC pumpou, termostatem a autosamplerem spojený s detektorem Agilent 1200 Series Evaporative Light Scattering Detector (ELSD), (Agilent, Germany). Kolona I: ZIC-pHILIC 150 x 4.6 mm, 5 um SeQuant(TM) (zwitteriontová fáze) (Merck, Německo), kolona II: LiChrospher 100 NH2 250x4 mm, 5 um (Merck, Německo), Kolona III: LiChrospher 100 DIOL 125x4 mm, 5um (Merck, Německo).

158

Standardy fruktosa, glukosa (Sigma Aldrich), sacharosa (Kulich Pharma, ČR), palatinosa (isomaltulosa). Vzorky 

Drill Pastilky (otorinolaryngologikum): deklarované složení cukrů jako pomocných látek: glukosa 1,5 g, sacharosa 0,8 g v 1 pastilce (2,5 g), (Pierre Fabre Medicament, Francie)



želé Marťánci (Wallmark, ČR)

Obr 1.

isomaltulosa (palatinosa)

sacharosa

Optimalizovaná metoda MF: isokratická eluce - acetonitril/voda 91:9 %, průtok 2ml/min, teplota 20°C, dávkováno 10ul. ELSD: gain 6, 40°C, tlak dusíku 3 bary příprava vzorku: rozpuštěn ve směsi acetonitril/voda 1:1 Výsledky Byly testovány kolony aminopropylová (kolona I), zwitteriontová (kolona II) a diolová (kolona III). Kolona III poskytla nejlepší výsledky z hlediska citlivosti i selektivity. Byla optimalizována metoda stanovení mono a disacharidů, např. pro rychlé stanovení fruktosy, glukosy a sacharosy v léčivech či potravinách jako jednodušší alternativa enzymatických metod. Zvolený detektor ELSD je citlivější a lze jej použít i pro gradientovou eluci. Odhad limitu detekce optimalizované metody (LOD) je 0,02 mg/ml.

Obr. 2 Kalibrační grafy s uvedenými korekčními exponenty b

159

Tab 1. Hodnocení opakovatelnosti optimalizované metody (n=10) fruktosa glukosa sacharosa Migrační čas

0.86%

0.50%

1.20%

Korigovaná plocha

0.93%

2.20%

3.10%

Tab 2. Hodnocení kalibračních závislostí optimalizované metody (n=15) plocha^b = a*koncentrace

fruktosa

glukosa

sacharosa

a

224,15

360,38

263,29

b

0,73

0,77

0,75

se

5,01

6,89

6,20

r

0,9965

0,9975

0,9961

[mV.s]

[mg /mL]

Obr 3. Separace standardů cukrů (hodnocení opakovatelnosti), číselné údaje jsou v Tab 1, časová osa je zkrácená.

Obr 4. Separace isomerů – kvantitativní separace sacharosy a isomaltulosy (palatinosy)

Výsledky byly částečně prezentovány na konferenci SAL2011, Brno 12.-14. 9. 2011. Tato práce vznikla z podpory grantu 56/2011/FaF IGA FaF VFU Brno. Seznam literatury 1) Pazourek J., Monitoring of mutarotation of monosaccharides by hydrophilic interaction chromatography. J Sep Sci (2010) 33(6-7), 974-81. 2) Hinterwirth H., Lämmerhofer M., Preinerstorfer B., Gargano A., Reischl R., Bicker W., Trapp O., Brecker L., Lindner W., Selectivity issues in targeted metabolomics: Separation of phosphorylated carbohydrate isomers by mixed-mode hydrophilic interaction/weak anion exchange chromatography. J Sep Sci (2010), 33(21), 3273-82.

160

Testování antioxidační aktivity přírodních látek s využitím buněčných kultur Jakub Treml1, Karel Šmejkal1, Jan Hošek1 Ústav přírodních léčiv, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno1

Úvod Oxidační stres je jev, při kterém není v rovnováze tvorba reaktivních forem kyslíku a dusíku (ROS/RNS) a obranný systém buňky. ROS/RNS tak mohou poškozovat okolní biomolekuly – nukleové kyseliny, proteiny a lipidy. Výzkum ukazuje, že s oxidačním stresem je spojen rozvoj mnoha nemocí (1). Existují in vitro antioxidační metody založené na zhášení stabilního radikálu (např. DPPH nebo ABTS) nebo na redukci iontu kovu (např. FRAP) (2). Ve výzkumu je ale snaha používat metody bližší reálným podmínkám v živé buňce. Naše metoda využívá k vyvolání oxidačního stresu peroxid vodíku (H2O2), který je přítomný i in vivo. Míra poškození, popř. účinku antioxidantu, se určuje pomocí tří markerů. Oxidativní poškození DNA přímo úměrné koncentraci 8hydroxydeoxyguaninu, lipoperoxidace je měřená metodou TBARS a je testováno i ovlivnění exprese antioxidačních enzymů: katalázy, superoxid dismutázy 1 a 2. Cílem práce byla optimalizace metodiky práce s buněčnou kulturou, vyvolání oxidačního stresu a měření všech tří markerů. Materiál a metodika Buněčné kultury Pro ovlivnění exprese enzymů a oxidativní poškození DNA jsme použili makrofágy diferencované z monocytární linie THP-1. Makrofágy byly přisedlé v jamkách v roztoku PBS na mikrotitrační destičce. Počet buněk na jamku byl přibližně 0,5×106. Pro měření lipoperoxidace jsme použili erytrocyty izolované z krve zdravých dobrovolníků. Suspenzi erytrocytů v roztoku PBS jsme napipetovali do jamek na mikrotitrační destičce přibližně v koncentraci 0,5×106 na jamku. Oxidační stres K vyvolání stresu jsme použili peroxid vodíku v koncentracích 0,5 mM; 1,0 mM a 2,5 mM. Doba inkubace byla pro indukci exprese enzymů 5 a 24 hodin. Pro poškození DNA 2 a 5 hodin. Kromě

161

peroxidu

vodíku

jsme

k vyvolání

lipoperoxidace

použili

ještě

tert-butylhydroperoxid

v koncentracích 100 µM; 200 µM a 400 µM. První marker – indukce exprese antioxidačních enzymů Po inkubaci jsme do každé jamky přidali 500 µl lyzačního pufru. Po lýze buněk jsme obsah jamek přenesli do eppendorfek. Každý vzorek jsme poté rozdělili pomocí SDS-PAGE podle molekulové hmotnosti. Vzorky z gelů jsme metodou Western blotu přenesli na nitrocelulózovou membránu a vizualizovali použitím primárních a sekundárních protilátek. Antioxidační enzymy, u kterých jsme sledovali expresi, jsou kataláza, superoxid dismutáza 1 a 2 (SOD 1 a 2). Druhý marker – oxidativní poškození DNA Na izolaci DNA z jádra jsme použili kit DNeasy Blood&Tissue (QIAGEN). Po době inkubace jsme podle návodu lyzovali buňky a poté lyzát odpipetovali do eppendorfek. U každého vzorku jsme spektrofotometricky změřili koncentraci DNA a vždy stejné množství DNA použili na enzymatické štěpení DNA podle protokolu z publikace Aging Methods and Protocols (3). Takto naštěpenou DNA jsme pak podrobili HPLC analýze s ECD ampérometrickým detektorem. Použili jsme kolonu Zorbax Eclipse XDB C18 50×2,1 mm, isokratický systém mobilní fáze s průtokem 0,2 ml/min. Mobilní fází byl 50mM roztok fosforečnannu draselného a 8% methanolem (pH 5,1). Třetí marker – lipoperoxidace pomocí metody TBARS Třetí stanovení probíhalo podle upravené dříve publikované metody (4). Erytrocyty v suspenzi jsme lyzovali pomocí roztoku SDS a nechali 1 hodinu při 95°C inkubovat s reakční směsí thiobarbiturové a octové kyseliny (1:1). Po inkubaci jsme vzniklý produkt třepáním extrahovali do butanolu. Butanolické extrakty jsme poté analyzovali na HPLC s fluorescenční detektorem. Použili jsme kolonu C8 150×4,6 mm s velikostí částic 3 µm. Jako mobilní fáze sloužil 50mM roztok dihydrogenfosforečnanu draselného a 30% metanolu (pH 7,0). Detektor byl nastaven na excitaci při 515 nm a emisi při 553 nm. Výsledky První marker – indukce exprese antioxidačních enzymů Výsledky Western blotu pro enzym katalázu jsou znázorněny na obrázku 1. Koncentrace H 2O2 přidávaného do média s makrofágy roste zleva doprava, čemuž odpovídá rostoucí velikost skvrn. Sloupce 8 a 9 ukazují bazální hladinu exprese katalázy.

162

Bohužel pro enzymy SOD 1 a 2 se nám zatím nepodařilo najít závislost indukce exprese na koncentraci H2O2. 1

2

3

4

5

6

7

8

9

Obrázek č. 1 – Western blot – enzym kataláza (60 kDa) – inkubace 5 hodin (1: ladder; 2 a 3: 0,5mM H2O2; 4 a 5: 1,0mM H2O2; 6 a 7: 2,5mM H2O2; 8 a 9: CTRL – H2O) Druhý marker – oxidativní poškození DNA Vytvořili jsme kalibrační křivky pro standard 8-hydroxydeoxyguanosin – graf 1. Při zpracování vzorků se ukázalo, že používání kitu DNease Blood&Tissue od firmy QIAGEN není nejlepší volbou, kvůli malým výtěžkům z izolace. Proto pro další pokusy budeme používat upravený protokol chloroformové extrakce podle autorů Wood et al. (3).

Kalibrační křivka - 8hydroxydeoxyguanosin AUC

10000 5000 0 0 0,5 1 1,5 y = 6373,2x + 0,536 množství 8-OHdG v nástřiku [ug] R² = 0,9999

Graf č.1 – Kalibrační křivka 8-OHdG Třetí marker – lipoperoxidace pomocí metody TBARS Z výsledků této metody vyplývá, že H2O2 není vhodný pro vyvolání lipoperoxidace buněčné

membrány erytrocytů. Tert-butylhydroperoxid je naopak vhodný. K vyvolání optimální odezvy tvorby malondialdehydu bude třeba zvýšit jeho koncentraci. Seznam literatury 1) COOKE M. S., OLINSKI R., EVANS M. D. Does measurement of oxidative damage to DNA have clinical significance? Clinica Chimica Acta, 2006, vol. 365, s. 30-49. 2) NIKI E. Assessment of antioxidant capacity in vitro and in vivo. Free Radical Biology & Medicine 2010, vol. 49, s. 503-515. 3) WOOD S.G., GEDIK C.M.,VAUGHAN N. J., COLLINS A. R. Measurement of 8-oxodeoxyguanosine in lymphocytes, cultured cells and tissue samples by HPLC with electrochemical detection. Aging Methods and Protocols. In Methods in Molecular Medicine, 2000, vol. 38. 4) LYKKESFELDT J. Determination of malondialdehyde as dithiobarbituric acid adduct in biological samples by HPLC with fluorescence detection: comparison with UV/VIS spectrophotometry. Clinical Chemistry, 2001, vol. 47, no. 9, s. 1725-1727.

163

Hodnocení cytodiferenciačních účinků látek izolovaných z Morus alba a Paulownia tomentosa na lidských leukemických THP-1 buňkách Peter Kollár, Pavlína Trnová, Markéta Poláková Ústav humánní farmakologie a toxikologie, Farmaceutická fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Úvod Protinádorová farmakologická léčba je široký pojem zahrnující protinádorovou chemoterapii, protinádorovou hormonální léčbu, a také léčbu diferenciačními látkami. Skupina diferenciačních léků je zatím nejmenší a zahrnuje především retinoidy. Tyto látky indukují buněčnou diferenciaci a brzdí proliferaci různých buněk organizmu, včetně maligních [1]. V praxi je použití retinoidů limitováno zejména dvěma aspekty. Jedním je tzv. syndrom kyseliny retinové (retinoic acid syndrome), který je pozorován asi u 40 % pacientů léčených kyselinou all-trans retinovou (ATRA), a představuje její nejzávažnější toxický účinek. Druhou komplikací je vznik rezistence při prolongované léčbě ATRA [2,3]. Proto každý nový lék, schopný navodit diferenciaci nádorové buňky může představovat významný pokrok v terapii onkologických nemocí. Náš řešitelský tým již v minulosti hodnotil biologické účinky přírodních látek nově izolovaných z rostlin Morus alba (MA-12, MA-13 a MA-14; prenylované fenoly) a z Paulownia tomentosa, přičemž u některých z nich jsme detailněji charakterizovali účinky na buněčný cyklus nádorových buněk [4,5,6]. Zástava cyklu a proliferace nádorové buňky je prvním předpokladem nastartování cytodiferenciačního programu. Cílem práce bylo zhodnotit cytodiferenciační účinky prenylovaných fenolů izolovaných z Morus alba a geranylovaných flavanonů izolovaných z Paulownia tomentosa na ÚPL VFU Brno na lidských leukemických buňkách.

Materiál a metodika Použité přírodní látky Prenylované fenoly MA12/1, MA13 a MA14, izolované z Morus alba a geranylované flavanony PT4-8-C1 a PT1I6 izolované z Paulownia tomentosa na ÚPL VFU Brno, jsou velmi slabě rozpustné ve vodě. Proto byly nejdéle 1 den před testováním připraveny jejich čerstvé 10 mM roztoky v dimethylsulfoxidu (DMSO), a následně uskladněny v –20 °C. Tyto roztoky byly poté naředěny médiem pro buněčnou kultivaci na požadované finální koncentrace.

164

Buňky V práci byla použita buněčné linie THP-1 lidské monocytární leukémie, která má schopnost diferenciace na buňky podobné lidským makrofágům.

Stanovení cytotoxicity a vlivu na buněčnou kinetiku Ke stanovení vlivu testovaných látek na buněčný počet a viabilitu byla použita metoda barvení 0,1% erythrosinem s využitím hemocytometru. Jako druhá byla použita metoda WST-1, založená na přeměně solí tetrazolia na barevný formazan živými buňkami. Stanovení cytodiferenciace Pro účely hodnocení vlivu testovaných látek na diferenciaci nádorových buněk THP-1 byla použita metoda NBT a analýza na průtokovém cytometru CellLab QUANTA SC (Beckman Coulter, USA). NBT metoda je založena na spektrofotometrickém hodnocení redukce nitroblue tetrazolium chloridu (NBT) diferencovanými buňkami. Jako pozitivní kontrola byla zvolena ATRA v koncentracích 10-6 a 10-7 M, která je v praxi užívaná v diferenciační terapii leukémií. Všechny experimenty probíhaly ve třech na sobě nezávisle rostoucích buněčných kulturách pro každou experimentální skupinu (triplikát). Výsledky Výsledky hodnocení NBT-redukční aktivity prenylovaných fenolů z Morus alba jsou znázorněny v grafu 1. Nejvyšší cytodiferenciační efekt ze všech testovaných látek obou rostlin vykazovala látka MA14 v koncentraci 20 µM. Její účinek byl v porovnání s kontrolou dokonce signifikantně (P < 0,001)

vyšší,

než **

**

v případě

obou

testovaných

koncentrací

ATRA

(P

<

0,01).

***

Graf 1 Stanovení NBT-redukční aktivity prenylovaných fenolů z Morus alba.

165

Analýza cytodiferenciačních účinků testovaných látek pomocí průtokové cytometrie nepřinesla hodnotitelné výsledky. Cytodiferenciační aktivita geranylovaných flavanonů PT4-8-C1 a PT1I6 izolovaných z Paulownia tomentosa nebyla stanovena vzhledem k silné toxicitě těchto látek. Prenylovaný fenol MA14 (3΄-O-methylkuwanon E) nebo jeho možné synteticky upravené deriváty by mohly vzhledem k uvedeným silným cytodiferenciačním účinkům představovat nadějnou látku použitelnou v terapii určitých typů nádorových onemocnění.

Seznam literatury 1) Mayer J, Starý J a kol.: Leukemie. Grada Publishing 2002, Praha, 392 s. 2) Melnick A., Licht D.J.: Deconstructing a disease: RARα, its fusion partners, and their roles in the pathogenesis of acute promyelocytic leukemia. Blood 1999, 93:3167-215. 3) Warrell RP, Frankel SR, Miller WH Jr. et al.: Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid). N Engl J Med 1991, 324:1385-93. 4) Šmejkal K, Svačinová J, Šlapetová T et al..: Cytotoxic activities of several geranyl-substituted flavanones. Journal of Natural Products 2010, 73(4):568-72. 5) Kollár P, Závalová V, Bárta T et al.: Geranylated flavanone tomentodiplacone B affects circuitries regulating progression of the cell cycle in human monocytic leukemia cells. British Journal of Pharmacology 2011, in press, 6) Hošek J, Bartoš M, Chudík S et al.: Natural Compound Cudraflavone B Shows Promising Antiinflammatory Properties In Vitro. Journal of Natural Products 2011, in press,

166

Chemoenzymatická syntéza opticky čistých chirálních látek ovlivňujících adrenoreceptory a stanovení jejich enantiomerní čistoty* Jan Otevřel, Jana Golianová, Pavel Bobáľ, Jozef Csollei Ústav chemických léčiv, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Úvod Převážnou část klinicky užívaných adrenergik můžeme rozdělit do dvou strukturních skupin: arylaminoethanolů a aryloxyaminopropanolů. V těchto molekulách je vždy přítomen alespoň jeden stereogen, který při vazbě s adrenergním receptorem ovlivňuje kvalitu interakce. V případě ß3-adrenergního receptoru jsou eutomerní látky s (R)-konfigurací.1 Pro přípravu adrenergik lze využít enzymatických metod. Enzymy, které vyhovují tomuto účelu, můžeme rozdělit do skupiny karbonyl reduktas, lipas, epoxid hydrolas a hydroxynitril lyas. Optickou čistotu produktů je možné stanovit mnoha způsoby, např. polarimetricky, pomocí chirálních HPLC či GC kolon nebo chirálních derivatizačních činidel (MTPA ad.) v kombinaci s klasickou RP-HPLC nebo GC, také s použitím NMR posunových činidel ad.

Materiál a metodika Naším záměrem bylo modifikovat CL-316,243, selektivní a účinné ß3-adrenergikum,2 s cílem zvýšit jeho lipofilitu, a tím i perorální biologickou dostupnost,3 a prostudovat jednotlivé bioizostery, což znázorňuje schéma 1. Pro OH NH

O

COOH

O

COOH

O

OH NH R

R CL-316,243

O

přípravu

těchto látek jsme zvolili konvergentní přístup, kdy byl příslušný aminoalko-

O

OH

OH

NH R

NH R

hol, jako levý fragment molekul, připraven kyanhydrinovou reakcí kataly-

OH NH R

zovanou enzymem 4.1.2.10,

Schéma 1: Modifikace struktury CL-316,243

EC

(R)-hydro-

xynitril lyasou, získaným

v surovém stavu ze semen Prunus amygdalus a následnou redukcí tetrahydridohlinitanem lithným.

167

K přípravě pravé části molekul byla vyzkoušena řada postupů, které jsou alespoň zčásti dokumentované ve schématu 2. Nakonec se jako nejvhodnější ukázala syntetická cesta (2), kdy byl daný

triflát

nukleofilně

(C)

(R)-HNL

NH2

LAH N

HCN donor R

(A) THF R

R X

NBS / Br2

Br 1. 2.5M n-BuLi, THF 2. propylene oxide

X

(1) O

ß-aminoalkoholem

OH

OH O

substituován

OH

X

PCC

X

DCM

Y

O (B)

O

O

Tf2O

DCM PY

OT f

X

(C)

(2) O

Y

SnCl4

X

Cl2CHOCH3

Y

O

NH4OAc

X

EtNO2

Y

NO 2

Fe, HCl

(3) O

CMD

OH

O OH NH

Dean-Stark

X

(A) + (B) NaBH(OAc)3 AcOH

Y R OH NH

DCM

X

(A) + (C) TEA R O

R =

H, 3-Me, 3-F, 3-Cl

Y

4-OMe, 4-Cl

OH NH

Dean-Stark

(A) + NaBH(OAc)3 AcOH

Ar =

benzodioxol,

R

Schéma 2: Příprava látek odvozených od CL-316,243

(A) za vzniku odpovídajícího produktu. Pro enzymaticky katalyzovanou kyanhydrinovou syntézu se testovala dvě uspořádání, v prvním sloužil jako donor HCN kyanid draselný, jenž v reakci s octovou kyselinou při pH 5,5 uvolňoval kyanovodík, který se zachycoval do EtOAc. Teprve tento roztok byl využíván pro enzymatickou reakci probíhající 3 dny v dvoufázovém systému EtOAc / 0,02M citrátový pufr (pH 5,5) při 5 ºC. Ve druhém způsobu přípravy hydroxynitrilů se jako donor HCN používal acetonkyanhydrin (ACH) a reakce probíhala 3 dny při laboratorní teplotě ve dvoufázovém systému DIPE / 0,02M tartrátový pufr (pH 5,4). Celkový výtěžek se určoval RP-HPLC a optická aktivita byla po skončení reakce a dalším zpracování stanovovaná polarimetrií (tabulka 1) a po syntéze příslušných diastereomerních esterů s (S)-naproxenem4 HPLC s MS detektorem. Následná redukce kyanhydrinu LAH již optickou konfiguraci nijak neovlivňuje.5

168

Výsledky Tabulka 1: Souhrn HPLC a polarimetrických měření

R fenyl 3-Me-fenyl 3-F-fenyl 3-Cl-fenyl 4-Cl-fenyl 4-MeO-fenyl indan-5-yl (2,3-dihydro-1-benzofuran)(1,3-benzodioxol)-5-yl 5-yl 1-naftyl

K Y A N H Metoda s KCN výtěže spec. C 70,1% 62º k otáčivos 64,0% Ct 43º 93.4% C40º 65,5% C42º 74,1% C35º 48,9% C16º 30,8% C20º 52,3% C34º 36,4% E17º 42,3% C27º

Y D R I N Metoda s ACH ret. výtěže spec. C 1,7 9º čas 84,5% k otáčivos 2,0 98,8% Ct 9º 2,2 95,0% C5º 2,2 89,0% C5º 1,9 93,5% C2º 1,7 72,4% C0º 2,7 62,3% C2º 1,7 69,4% C3º 2,0 85,0% C0º 2,5 51,3% C11º

CHO ret. 2,0 čas 1,7 1,8 2,2 2,7 2,0 2,6 1,7 2,0 2,4

ret. čas 2,1 3,1 2,6 3,1 3,5 2,1 4,3 2,1 2,5 4,3

RCHO = výchozí aldehyd, C = CHCl3, E = EtOH, 1% koncentrace, 589,3 nm, 25ºC

Ačkoli existuje řada prací, které označují metodu založenou na použití ACH jako donoru HCN pro (R)-HNL za superiorní z hlediska optického výtěžku6, v našich podmínkách jsme dospěli k právě opačnému závěru. Z literatury je známo, že paralelně s enzymaticky katalyzovanou reakcí probíhá také neenzymatická adice HCN na karbonyl produkující racemát, která bývá až o několik řádů rychlejší. Existuje řada možností, jak neenzymatickou reakci potlačit,7 nejjednodušší je snížit reakční teplotu a použít pufr s nižším pH, což bude námětem pro naše další studium. Výtěžky enzymatické kyanhydrinové reakce podle očekávání klesají směrem k méně vlastním a více stéricky bráněným substrátům a všeobecně jsou u transkyanhydrinace s ACH vyšší než u metody využívající KCN. *Tato práce byla financována grantem IGA č. 63/2011/FaF.

Seznam literatury 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7)

Washburn, W. G. Et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. (2001) 11, 3035–3039. Nisoli, E.; Tonello, C.; Carruba, M. O. Curr. Med. Chem. (2003) 3, 257-273. Sawa, M.; Harada, H. Curr Med. Chem. (2006) 13, 25-37. Solis, A. et al. Tetrahedron Lett. (1998) 39, 8759-8762. Effenberger, F.; Jäger J. J. Org. Chem. (1997) 62, 3867-3873. Effenberger, F. Pure Appl. Chem., (1998) 70, 2136-2143. Brovetto, M. et al. Chem. Rev., (2011) 111, 4346–4403.

169