Fakultní studentská vědecká konference Interní grantové agentury VFU Brno 2010

Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

FAKULTA VETERINÁRNÍHO LÉKAŘSTVÍ FAKULTA VETERINÁRNÍ HYGIENY A EKOLOGIE FAKULTA FARMACEUTICKÁ

Fakultní studentská vědecká konference Interní grantové agentury VFU Brno 2010

Sborník příspěvků z výsledků řešení projektů IGA VFU Brno 2010 financovaných z prostředků účelové podpory na specifický vysokoškolský výzkum MŠMT na rok 2010

15. prosince 2010

B R N O

1

Fakultní studentské vědecké konference Interní grantové agentury VFU Brno 2010 Fakulta veterinárního lékařství Fakulta veterinární hygieny a ekologie Fakulta farmaceutická

Editace:

Doc. MVDr. Miloslava Lopatářová, CSc. Prof. MVDr. Vladimír Celer, Ph.D. Doc. MVDr. Vladimíra Pištěková, Ph.D. Doc. RNDr. Bc. Jiří Pazourek, Ph.D.

Za věcnou a jazykovou správnost odpovídají autoři.

Vydání: první Copyright © 2010 Veterinární a farmaceutická univerzita Brno 2

Vážení kolegové,

současná doba je charakteristická obrovským nárůstem vědeckých informací. V České republice k tomu přispívají především univerzitní a vysokoškolská pracoviště, Akademie věd, výzkumné ústavy a další instituce. Tento trend záplavy nových poznatků zaznamenáváme i ve veterinární a farmaceutické vědě a je výborné, že mezi přispívateli v této oblasti hraje naše Veterinární a farmaceutická univerzita Brno nejvýznamnější roli. Věřím, že výsledky výzkumu na naší univerzitě dosažené v roce 2010 budou kvalitně publikovány. Je to dnes jeden z velmi důležitých a také sledovaných úkolů každého vědeckého pracovníka, učitele - každého z nás. Jsem velmi ráda, že naše fakulty byly v roce 2010 opět publikačně aktivní i v rámci specifického výzkumu. Je to přece jedna z cest, jak přivést ke vědeckému bádání mladé kolegy, jak je naučit pracovat v kolektivech a zařadit je postupně do velkých vědeckých týmů, které jistě výsledky specifického výzkumu už dnes dále využijí. Věřím, že právě předložený Sborník z konference Interní grantové agentury VFU Brno k těmto cílům svým dílem přispěje. Děkuji Vám všem za práci, kterou jste při jeho tvorbě odvedli.

Doc. MVDr. Miloslava Lopatářová, CSc. Prorektorka pro vědu, výzkum a zahraniční vztahy

V Brně 15. 12. 2010

3

4

Obsah Hormonální modulace ovariálního cyklu morčete domácího ............................................................................ 9 PCR diagnostika trypanosom T. evansi/equiperdum u domácích zvířat amplifikací genu pro Spliced Leader RNA a asociace infekce s genetickými markery hostitelů .............................................................................. 12 PCR diagnostika, polymorfismus a hostitelská specifita původců atoxoplasmózy ptáků ............................... 15 Charakterizace hydrolytických enzymů symbiotických nálevníků lidoopů T. abrassarti a posouzení úlohy nálevníků při fermentaci v tlustém střevě........................................................................................................ 18 Stanovení hladiny EGF (epidermal growth factor) v moči koček s FIC (feline idiopathic cystitis) Pouţití nesteroidních antiflogistik v terapii FIC .......................................................................................................... 21 Sledování výskytu Helicobacter spp. u psů v České republice ....................................................................... 24 Inhibice kaspázy-3 v explantátových kulturách .............................................................................................. 27 Alfaxalon v anestézii plazů.............................................................................................................................. 31 Reverzibilní suprese pohlavní aktivity kocourů .............................................................................................. 34 Změny v tukové tkáni dojnic během tranzitního období ................................................................................. 37 Studium výskytu Mycoplasma bovis v chovech skotu České republiky ......................................................... 41 Vznik a výskyt rozštěpu pysku a /nebo patra u prasat ..................................................................................... 44 Matematické modelování zatíţení titanové LCP ploténky pouţívané k přemosťující osteosyntéze fraktury femuru u miniaturních prasat ........................................................................................................................... 47 Význam parametrů oxidačního stresu u fen s tumory mléčné ţlázy a efekt vybraných antioxidantů suplementovaných těmto fenám ...................................................................................................................... 50 Optimalizace histochemických a imunohistochemických vyšetření pro mikroskopii potravin ...................... 55 Vyuţití moderních instrumentálních analytických metod pro hodnocení fyzikálně-chemických parametrů medu a mléka z hlediska jakosti a zdravotní nezávadnosti pro spotřebitele ................................................... 58 Studium obsahu mastných kyselin/sodíku u vybraných tepelně opracovaných a fermentovaných masných výrobků na trhu v ČR a EU vzhledem k moţným zdravotním nebo nutričním tvrzením ............................... 61 Stanovení biologicky aktivních látek u vybraných produktů rostlinného původu .......................................... 65 Indikace čerstvosti kuřecího masa baleného v modifikované atmosféře prostřednictvím analýzy organických těkavých látek .................................................................................................................................................. 68 Vyuţití ţluče ryb pro studium zátěţe vodního ekosystému ............................................................................ 72 Sledování obsahu rizikových kovů ve tkáních jelce tlouště (Leuciscus cephalus L.) z řek v okolí Brna ....... 76 Speciace rtuti z pohledu bezpečnosti potravin-ryb z významných rybářských revírů ČR .............................. 79 5

Studium akutních a subchronických účinků pesticidů na ryby........................................................................ 82 Vliv účinků léčiv detekovaných v našich tocích na vodní organismy ............................................................. 85 Antibiotická rezistence u kmenů Escherichia coli kolonizujících trávicí trakt psů, koček a zvířat chovaných v zoologických zahradách ............................................................................................................................... 88 Účinky subletální expozice zajíce polního pesticidům na průběh infekce Francisella tularensis ................... 92 Effects of cyanotoxins and lead on avian reproduction: testicular toxicity in Japanese quails ....................... 95 Změny chemického sloţení těla baţantích kuřat v průběhu ontogenetického vývoje s cílem optimalizovat krmné směsi ..................................................................................................................................................... 98 Biochemistry values in the Grey Partridge (Perdix perdix): normal values and effects of mycoplasmosis .. 101 Morfologické změny na Artemia franciscana působením ionizujícího záření .............................................. 104 Mikročásticová léková forma pro řízené uvolňování léčiva.......................................................................... 109 Ovlivnění biodostupnosti metodou přípravy polymorfů léčivé látky během výroby lékové formy .............. 112 Hodnocení cytotoxicity a vlivu látek izolovaných z Morus alba na buněčný cyklus lidských leukemických buněk ............................................................................................................................................................. 115 Ověření hepatoprotektivního efektu šťávy z Ecballium elaterium na modelu tetrachlormethanem (CCl4) indukované hepatopatie u laboratorních potkanů .......................................................................................... 118 Detekce genového polymorfismu 94C→A v genu pro inosin trifosfát pyrofosfatázu a genového polymorfismu 837C→T v genu pro xanthin dehydrogenázu, jejich vztah k výskytu neţádoucích účinků terapie azathioprinem. ................................................................................................................................... 121 Pharmaceutical importance of zinc and metallothionein in cell signalling ................................................... 124 Antimikrobiálně aktivní prenylované polyfenoly izolované z Paulownia tomentosa ................................... 127 HPLC-DAD metoda pro stanovení MA-13 v tělesných tekutinách a tkáních ............................................... 130 Izolace obsahových látek Polygonum lapathifolium L. a stanovení jejich anticholinesterasové aktivity ..... 133 Studium flavonoidních glykosidů po hydrolýze metodou HPLC-DAD-ELSD zaměřené na identifikaci cukerné sloţky ............................................................................................................................................... 136 Vyuţitie kapilárnej zónovej elektroforézy a nukleárnej magnetickej rezonancie pri stanovení fyzikálnochemického profilu potenciálnych liečiv ....................................................................................................... 139 Testování biologické aktivity látky s potenciálně cytostatickým účinkem ................................................... 142 Látky s fragmentem N-fenyl-2-(2-oxo-1-azacykloalkan-1-yl)acetamidu jako inhibitory aminopeptidas..... 146 Penetrace léčiv biologickými membránami a její ovlivnění látkami usnadňujícími přestup ........................ 150

6

Příspěvky Fakulty veterinárního lékařství

7

8

Hormonální modulace ovariálního cyklu morčete domácího Silvia Kohůtová, MVDr. Karel Hauptman, Ph.D. Klinika chorob ptáků, plazů a drobných savců, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Morčata jsou polyestrická zvířata. Pohlavní cyklus se pohybuje v rozmezí 15 – 17 dnů, ovulace je spontánní (Hutz a kol. 1990). U starších samic morčat dochází často k tvorbě ovariálních cyst (Jekl a kol. 2004). Jedná se o unilaterální nebo častěji bilaterální cystické útvary vyplněné tekutinou. Etiologie a patogeneze výskytu těchto cyst je doposud málo známá. S největší pravděpodobností se jedná o poruchu epiteliálních iontových pump. V současné době jsou pro konzervativní terapii ovariálních cyst u morčat pouţívány různé hormonální preparáty – hCG, GnRH (Mayer, 2003). Další moţností je odsátí tekutiny z cyst, případně kombinace s uvedenou hormonální terapií (Shaeffer, 1996). Ve všech případech se jedná o krátkodobou terapii s nejistým výsledkem. U ovariálních cyst nad 5 mm průměru je současná hormonální léčba neúčinná. Proto se jako nejefektivnější terapie jeví ovariohysterektomie. Pouhá ovariektomie není doporučována, protoţe neřeší současnou cystickou hyperplazii endometria. Deslorelin acetát je analog pouţívaný ve formě podkoţního implantátu pro zastavení ovariálního cyklu a léčbu hyperadrenokorticismu u fretek (Wagner a kol 2005). Při krátkodobé terapii mají GnRH agonisté stejné účinky jako hypotalamický GnRH, ale při dlouhodobém podávání sniţují vylučování GnRH v hypotalamu a sniţují citlivost receptorů v hypofýze. Tímto dochází k útlumu tvorby a vylučování FSH a LH, které jsou přímo zodpovědné za tvorbu folikulů a ţlutého tělíska na ováriích. U fretek dochází po podání implantátu k zastavení pohlavního cyklu na dobu asi 18 měsíců. Předpokládáme, ţe podobný účinek bude mít zavedení implantátu také u morčat a tak by mohl přispět k prevenci vzniku ovariálních cyst. Materiál a metodika Do studie bylo zařazeno 10 samic morčete domácího (Cavia porcellus) ve stáří o 3,5 - 4 měsíce, hmotnosti 320 - 460 g. Před zahájením pokusu bylo uskutečněno klinické vyšetření, které zahrnovalo kontrolu tělesného pokryvu, zbarvení sliznic, vyšetření velikosti submandibulárních a popliteálních mízních uzlin palpací, auskultaci kardiovaskulárního a respiračního aparátu, palpaci dutiny břišní. Dále bylo provedeno kontrolní hematologické a biochemické vyšetření krve, které bylo v průběhu celého pokusu opakováno vţdy na začátku ovariálního cyklu samic. Zvířata byla chována ve skupinách při umělém osvětlení, délka světelného dne byla 12 hodin. 9

U samic byl sledován pohlavní cyklus klinickým monitoringem (otevření a uzavření pochvy vaginální zátkou). Dále byla jednou za tři dny odebírána krev z v. cava cranialis a byla zjišťována hladina plazmatického progesteronu. Celá skupina byla sledována po dobu dvou ovariálních cyklů. V průběhu třetího cyklu byl po skončení estru, tj. uzavření pochvy vaginální zátkou, aplikován implantát Suprelorin 4,7 mg (Deslorelini acetas, Virbac S.A., Francie). Po aplikaci deslorelinu byl dále vyšetřován progesteron po dobu 60 dní. Naměřené hodnoty koncentrace progesteronu v průběhu fyziologického cyklu a cyklu navozeného aplikací deslorelinu byly porovnány pomocí t-testu. Pořadí dne v cyklu jsme vţdy počítali od příznaků říje, tedy den aplikace deslorelinu byl uvaţován jako 3. den cyklu. Výsledky Při sledování pohlavního cyklu morčat jsme zjistili změny v chování, v otevření vaginy a v hormonálních hladinách. Při klinickém vyšetření morčat jsme zjišťovali otevření vaginy, kterému předcházela perioda zvýšeného neklidu a plachosti u morčat. Ta přešla v době říje do další fáze, kdy byla zvířata klidnější, nechala se snadno chytit a na manipulaci reagovala klidněji. Délka pohlavního cyklu se u jednotlivých morčat pohybovala od 15 do 20 dní (16,8 ± 1,6 dní). V průběhu pohlavního cyklus jsme zjistili pravidelné kolísání progesteronu (graf 1). Nejvyšší koncentrace jsme zjistili 6. aţ 15. den (10,3 ± 2,1) a dosahovali od 3,30 do 7,00 pg/l (4,60 ± 0,88 pg/l). Druhá část pokusu byla zahájena uvolněním vaginální zátky samic na počátku třetího sledovaného cyklu. Tři dny po otevření vagíny jsme aplikovali zvířatům implantát, po jehoţ aplikaci byly naměřeny zvýšené koncentrace progesteronu. Nejvyšší hodnoty byly v rámci individuální variability zjištěny po třech dnech, šesti či devíti dnech (průměrně 4,0 ± 2,0 dny. Koncentrace progesteronu klesla u všech zvířat do 12. dne (10,3 ± 1,5 dne) od aplikace pod 1 pg/l a jiţ nedošlo k jejímu nárůstu po celou dobu sledování (graf 1). Pouze 12. den cyklu (9. den po aplikaci deslorelinu) jsme zjistili statisticky významný rozdíl (p<0,01) koncentrace progesteronu, která byla po aplikaci deslorelinu niţší. Můţeme tedy říci, ţe u morčat je po aplikaci deslorelinu pokles koncentrace progesteronu rychlejší, neţ je tomu v průběhu fyziologického cyklu. Dvanáctý a 15. den po aplikaci deslorelinu jsme nezjistili statisticky významný rozdíl v hladinách progesteronu. Za fyziologických podmínek dochází k další vlně nárůstu koncentrace progesteronu, ale u zvířat s implantátem zůstala jeho hladina nízká po celou dobu experimentu.

10

Graf 1. Koncentrace progesteronu u morčat v průběhu fyziologického pohlavního cyklu (modrá linie) a po aplikaci deslorelinu 3 den po začátku cyklu (červená linie) Závěr Zjistili jsme, ţe aplikace deslorelinu navodí v organismu samice morčete následný vzestup koncentrace progesteronu a poté jeho dlouhodobé sníţení bez cyklických změn. Domníváme se, ţe zastavení pohlavního cyklu pomocí aplikace deslorelinového implantátu by mohlo předejít vzniku ovariálních cyst u morčat, coţ bude předmětem našeho dalšího výzkumu. Zároveň lze uvedený implantát pouţít jako metodu umělé kontracepce u samic morčat. Seznam literatury 1. Hutz, R. J.; Bejvan, S. M.; Durning, M.; Dierschke, D. J.; Fischer, C. L.; Zachow, R. J. Changes in follicular populations, in serum estrogen and progesterone, and in ovarian steroid secretion in vitro during the guinea pig estrous cycle. Biology of Reproduction. 1990, 42, 266-272 2. Jekl, V.; Havlínová, E.; Kohout, P.; Knotek, Z. Poruchy reprodukce u morčat – ovariální cysty. Veterinářství 2004;54:498-502 3. Mayer, J. The use of GnRH to treat cystic ovaries in a guinea pig. Exotic DVM, 2003, 36 4. Shaeffer, D. O. Disease problems of guinea pigs and chinchillas. In: Hillyer E. V., Quesenberry K. E. (eds.). Ferrets, rabbits, and rodents. Clinical medicine and surgery. Philadelphia; W. B. Saunders, 1996; 260-282. 5. Wagner, R.A., Piché, C.A., Jochle, W., Oliver, J.W. Clinical and endocrine responses to treatment with deslorelin acetate implants in ferrets with adrenocortical disease. Am. J. Vet. Res., 2005: 910 – 914

11

PCR diagnostika trypanosom T. evansi/equiperdum u domácích zvířat amplifikací genu pro Spliced Leader RNA a asociace infekce s genetickými markery hostitelů Jan Hlaváč1, Michaela Nečesánková2 , Moneeb Qablan1, Ján Futas2, Christoph Schneider1, Marie Vranová2, David Modrý1,3 Ústav parazitologie, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno1,Ústav genetiky, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno 2

, Ústav parazitologie AV ČR, České Budějovice3 Úvod

Trypanosoma evansi a T. equiperdum způsobují smrtelná onemocnění koní a velbloudů (surra, resp. dourina) s váţnými ekonomickými dopady. Oba druhy podle recentních poznatků představují poddruhy T. brucei (Lai et al., 2008), přičemţ u nich díky kompletní či parciální ztrátě kinetoplastu došlo k rozšíření spektra hostitelů a šíření mimo území Afriky. Z hlediska diagnostiky se jako ideální a vysoce citlivé jeví molekulární metody, umoţňující detekci těchto patogenů i v případě chronických infekcí nebo naopak v iniciální fázi onemocnění, kdy např. metody sérologické diagnostiky selhávají (Holland et al., 2001). Pro PCR diagnostiku se jako vhodný jeví gen pro Spliced Leader RNA kinetoplastid který se vysoce konzervovaný vyskytuje u všech druhů (Liang et al., 2003). Incidence, projev a rozšíření infekcí jsou ovlivněny interakcí patogena s hostitelským organismem. Reakce hostitele je individuálně variabilní a je ovlivněna polymorfismem specifických imunitních genů (např. Single-nucleotide polymorphism SNP), účastnících se odpovědi na onemocnění (Slev and Potts, 2002). Infekce T. evansi byly popsány mj. i u psů (Franke et al., 1994), jejich úloha v epidemiologii trypanozomiázy je však nejasná podobně jako v případě populací oslů, kteří ţijí sympatricky s koňmi. Populace keňských psů a oslů jsou vhodným modelem populací přirozeně exponovaných patogenům, u kterých lze díky dlouhodobé selekci předpokládat asociace mezi vybranými geny imunitní odpovědi a infekcemi. Odpovědi na tyto problémy jsou, po zavedení a validování nové metody PCR diagnostiky, klíčovými body předkládaného projektu. Materiál a metodika K extrakci DNA ze vzorků krve fixovaných etanolem byla vyuţita jak fenol-chloroformová metoda izolace, tak komerční kity (InnuPREP Forensic Kit, Jena Bioscience, Jena, Germany); kvalita a koncentrace DNA byla ověřena spektrofotometricky (NanoDrop, Thermo Scientific). Na základě

publikovaných

sekvencí

byly

navrţeny

primery

SL-F

(5´-

CTATATTGGTATGAGAAGCTCCCAG-3´) a SL-R (5´-CGCCTGCTCAGTAGACATGTAGAG12

3´) amplifikující 465 bp dlouhý úsek genu pro Spliced reader RNA. Pomocí gradientové PCR byly definovány podmínky reakce: iniciální denaturace 94 °C / 2 min následovaná 35 cykly 94 °C / 30s, 62 °C / 30s a 72 °C °C 30s s finální extenzí 72 °C / 2 min. Specifita navrţených primerů byla ověřena s DNA jak různých druhů kinetoplastid (Leishmania aethiopica, L. major, L. tropica, L. donovani, Trypanosoma brucei, T. congolense, T. simiae, T. vivax, T. malophagium, T. theileri) tak dalších krevních parazitů (Babesia caballi, Theileria equi, Anaplasma canis, Hepatozoon canis). Senzitivita reakce byla determinována na základě výsledků získaných ze vzorků krve obohacené o známé mnoţství trypanosom z kultury (106 – 1 buňka/ml krve). Zavedená metoda byla vyuţita k vyšetření materiálu z oslů (n = 145), velbloudů (n = 71) a psů (n = 273) pocházejících ze severní Keni a Jordánska, kde tato zvířata ţijí v úzkém kontaktu a sdílí zde potenciální vektory studovaných trypanosom. Výsledky Byla zavedena nová metoda PCR diagnostiky trypanozom T. evansi/equiperdum vyuţívající amplifikace části genu pro Spliced Leader RNA s citlivostí aţ do intenzity 5 buňky parazita/ml krve. Z celkového souboru vyšetřovaných zvířat byly trypanosomy detekovány u oslů a velbloudů; v souboru vyšetřovaných psů z Keni byly trypanosomy detekovány pouze u jednoho zvířete. Standardními technikami doporučenými výrobcem bylo v laboratoři Agrogenomiky Mendelovy univerzity genotypováno celkem 188 oslů na polymorfismy v 17 mikrosatelitních lokusech a 84 psů na polymorfismy ve 27 mikrosatelitních lokusech. Podle očekávání bylo 12 ze 14 lokusů amplifikovaných koňskými primery polymorfních. U oslů byly na ústavu genetiky FVL vyvinuty PCR-RFLP markery jednonukleotidových polymorfismů (SNP) v kandidátních genech IL12p40, IL12p35, IL12RB2 a IL17A, u psů bylo plánovanou metodikou vyvinuto 16 markerů v genech NOS3, IL6, TLR1, TLR9, MD2, MyD88, TLR2, TLR4, TLR7. Data o polymorfismu mikrosatelitů poslouţila k analýze neutrální genetické diverzity sledovaných oslích populací, kde bylo zjištěno, ţe populace oslů z Evropy (Itálie) se geneticky odlišuje od asijských (Jordánsko) a afrických (Keňa) oslů. Osli jsou v současné době genotypováni na SNP a výsledků bude vyuţito dalšímu hodnocení diverzity v jiném typu markerů. U psů bylo genotypováno v SNP 84 psů (Keňa). Výsledky byly porovnány s mikrosatelity a ukázaly rozdíly v neutrálních a exprimovaných lokusech. Obě skupiny psů (Keňa vs. ČR) se od sebe nijak významně neliší. Vzhledem k minimálnímu výskytu trypanosom ve sledovaných populacích nemohly být výsledky vyuţity k asociační analýze rezistence k infekci tímto prvokem, ale budou vyuţity k analýze infekcí piroplasmami, jejichţ výskyt byl ve všech populacích potvrzen. 13

Závěr Navrţená, vysoce citlivá metoda PCR obohatí spektrum vyuţitelných metod diagnostiky trypanozom domácích i volně ţijících zvířat. Hypotéza o přenosu trypanosom primárně infikujících koňovité a velbloudy na psy v oblastech, kde tato zvířata ţijí v těsném kontaktu a sdílí stejné krevsající bezobratlé vektory byla potvrzena, nicméně k tomuto přenosu dochází zřejmě výjimečně. Byly rovněţ analyzovány modelové populace oslů a psů a byla popsána jejich genetická diverzita. Prioritně byly identifikovány SNP v kandidátních genech imunitní odpovědi u oslů a psů a byl vypracován systém jejich genotypizace. Výsledky jsou vyuţitelné k analýze genetické diverzity v exprimovaných lokusech a k asociačním analýzám s různými znaky včetně infekcí.

Seznam literatury: 1. LAI, D., H., HASHIMI, H., LUN, Z., AYALA, F. J., LUKEŠ, J. Adaptation of Trypanosoma brucei to gradual loss of kinetoplast DNA: T. equiperdum and T. evansi are petite mutants of T. brucei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008, vol. 105, s. 1999-2004. 2. HOLLAND,W.,G., CLAES, F., MY, L., N., THANH, N., G., TAM, P., T., VERLOO, D., BUSCHER, P., GODDEERIS, B., VERCRUYSSE, J. A comparative evaluation of parasitological tests and a PCR for Trypanosoma evansi diagnosis in experimentally infected water buffaloes. Veterinary Parasitology, 2001, vol. 97, s. 23-33. 3. LIANG, X., HARITAN, A., ULIEL, S., MICHAELI, S. Trans and cis splicing in trypanosomatids: mechanism, factors, and regulation. Eukaryotic Cell, 2003, vol. 2, s. 830840. 4. FRANKE, C., R., GREINER, M., MEHLITZ, D. Investigation on naturally occuring Trypanosoma evansi infections in horses, cattle, dogs and capybaras (Hydrochaeris hydrochaeris) in Pantanal de Poconé (Mato Grosso, Brazil). Acta Tropica, 1994, vol. 58, s. 159-169. 5. SLEV, P., POTTS, W., K. Disease consequences of pathogen adaptation. Current Opinion in Immunology, 2002, vol. 14, s. 609-614. Kontaktní adresa: David Modrý, Ústav parazitologie, VFU Brno, Palackého 1/3, Brno, email: [email protected]

14

PCR diagnostika, polymorfismus a hostitelská specifita původců atoxoplasmózy ptáků David Modrý1,2, Ján Jamriška1 Ústav parazitologie, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno1,Ústav parazitologie, biologické centrum AV ČR, České Budějovice2 Úvod Kokcidie rodu Isospora představují nejčastější monoxenní parazity ptáků v zajetí i ve volné přírodě. Díky přímému vývoji jsou tito prvoci schopni kompletovat cykly v podmínkách chovu ptáků v zajetí a představují tak zásadní patogeny zejména u zástupců řádu pěvců. Dosavadní studie ukazují na existenci dvou typů vývojového cyklu ptačích isospor: (i) klasický vývoj ve střevě a (ii) vývoj kdy část merogonie probíhá v buňkách bílé krevní řady a RES (Box, 1975; Cooper et al., 1989). V obou případech jsou v trusu ptáků vylučovány oocysty, které jsou zodpovědné za přenos a jsou základem pro koproskopickou diagnostiku. V případě extraintestinálního vývoje (typ ii) jsou pak stadia merogonie nalézána i v krevních roztěrech nebo orgánech při pitvě (např. Quiroga et al., 2000). Právě přítomnost oocyst a přímý vývoj spolu s merogonií v orgánech jsou zodpovědné za přenosy a vysokou patogenitu této skupiny kokcidií v záchranných chovech pěvců, které z epizootologického pohledu představují ideální podmínky pro šíření mezi zvířaty. V řadě případů je pak atoxoplasmóza hlavním problémem chovů, jejichţ úspěšnost je předpokladem reintrodukce do přírody. Hostitelská specifita těchto kokcidií je nejasná, její znalost je ovšem klíčová pro odhalení přenosů a pro terapeutické/profylaktické programy zacílené na ozdravení chovů (Partington et al., 1989). Durrell Wildlife Conservation Trust je přední světová organizace vlastnící skupiny kriticky ohroţených druhů pěvců, jejichţ chov není moţný bez veterinárního managementu. V posledních letech se u řady druhů mnoţí úhyny v důsledku atoxoplasmózy, pro jejíţ studium a řešení problému jsme byli přizváni s ohledem na předchozí publikace a výsledky.

Materiál a metodika Během řešení projektu jsme kombinovali metody přímé diagnostiky klasickými metodami s metodami molekulární diagnostiky a molekulární taxonomie a fylogenetiky. Během pobytu v DWC byly s místními veterináři provedeny odběry trusu a krve ohroţených skupin pěvců (Garrulax courtoisi, Garrulax galbanus, Leucopsar rothschildi, Hypsipetes leucocephalus, Zoothera doherty, Hypsipetes madagascarensis). Z rozsáhlé banky tkání uhynulých zvířat v DWC byly vybrány orgány a krevní roztěry jedinců kteří uhynuli na suspektní atoxoplasmózu. Získané sety vzorků trusu byly vyšetřeny koproskopicky (flotace, mikroskopie, morfometrie oocyst). Na základě 15

anamnestických dat a výsledků koproskopie byly vytipovány infikované skupiny, z nichţ byl získán materiál pro izolaci DNA, tj. vzorky krve, trusu a tkání/orgánů uhynulých ptáků. Na základě dosavadních zkušeností a publikovaných dat byly v biologickém materiálu klasickou metodou PCR amplifikovány a sekvenovány geny pro ssu rRNA a mezerník ITS (Macrogen, Korea). Výsledky Práce v DWC: Kritické posouzení materiálu a anamnestických dat provedené přímo ve veterinárním centru v DWC jasně naznačuje přímý podíl atoxoplasmózy na mortalitě některých druhů pěvců, jmenovitě především u Garrulax courtoisi, Leucopsar rothschildi, Hypsipetes leucocephalus. Koproskopie: Předběţné analýzy ukazují přítomnost minimálně tří druhů kokcidií, ve dvou případech se zřejmě jedná o nové druhy r. Isospora, jejichţ taxonomické zpracování je finalizováno a popisy nových druhů jsou v přípravě. Oocysty jednotlivých druhů isospor je zřetelně liší velikostí, charakterem stěny oocysty tvarem sporocyst i charakterem komplexu Stiedova a substiedálního tělíska. U jednoho z druhů je moţná identita s patogenním druhem I. rotschildi popsaným z majny L. rotschildi v nedávné minulosti (Upton et al., 2001). Molekulární detekce v tkáních a krvi: Ze všech vzorků byla provedena izolace DNA s přiměřenou výtěţností a dostačující kvalitou. Amplifikace s pouţitím v literatuře uvedených primerů poskytla produkt odpovídající velikosti ve většině z vyšetřovaných vzorků. Následná sekvenace a předběţná analýza sekvencí metodou BLAST ukázala na přítomnost minimálně dvou odlišných taxonů r. Isospora. V několika případech však sekvenace produktů PCR odhalila přítomnost plísní, coţ ukazuje na nízkou specifitu z literatury převzatých primerů. V současné době finalizujeme přípravu vlastních primerů aplifikujících ITS1. K posouzení skutečné diverzity ve všech vzorcích bude třeba dosekvenovat ještě řadu izolátů. Molekulární detekce v trusu ptáků: Oocysty isospor byly detekovány pouze v části vzorků sesbíraných během pobytu v DWC. Po provedení morfometrické analýzy oocyst a po jejich koncentrování flotační metodou byly s vyuţitím bead beateru a komerčního kitu (Quiagene) izolována DNA, která je nyní k dispozici pro PCR. Vyšetření budou dokončena během prosince. Závěr Naše výsledky jasně ukazují, ţe kokcidie r. Isospora představují v kolekci ptáků chovaných v DWC rozšířené patogeny. Koprologická detekce vedla k nálezu oocyst u více neţ 45% vyšetřených ptáků. Z dosavadních výsledků je zřejmé, ţe na infekcích se podílí řada druhů, lišících se mj. velikostí oocyst, některé z nalezených druhů jsou zatím vědě neznámé. I přes to, ţe 16

sekvenační analýzy nebyly zatím dokončeny je zřejmé, ţe ne všechny druhy se podílí na orgánových infekcích.

Seznam literatury 1. BOX, E.D. Exogenous stages of Isospora serini sp. in the canary (Serinus canarius Linnaeus). Journal of Protozoology, 1975, vol. 22, s. 165-169. 2. COOPER, J.E., GSCHMEISSNER, S., GREENWOOD, A.G. Atoxoplasma in greenfinches (Carduelis chloris) as a possible cause of „going light‟. Veterinary Records, 1989, vol. 124, s. 343-344. 3. PARTINGTON, C.J., GARDINER, C.H., FRITZ, D., et al. Atoxoplasma in Bali mynahs. Journal of Zoo and Wildlife Medicine, 1989, vol. 20, s. 328-335. 4. QUIROGA, M.I., ALEMAN, N., VAZQUEZ, S., NIETO, J.M. Diagnosis of atoxoplasmosis in a canary (Serinus canaries) by histopathologic and ultrastructural examination. Avian Disseases, 2000, vol. 44, s. 465-469. 5. UPTON, S.J., WILSON, S.C., NORTON, T.M., et al. A new species of Isospora (Apicomplexa: Eimeriidae) from Rothschild Mynah Leucopsar rothschildi (Passeriformes: Sturnidae). Journal of Parasitology, 2001, vol. 48, s. 47-53. Kontaktní adresa: Doc. MVDr. David Modrý, Ústav parazitologie, VFU Brno, Palackého 1/3, Brno, email: [email protected]

17

Charakterizace hydrolytických enzymů symbiotických nálevníků lidoopů T. abrassarti a posouzení úlohy nálevníků při fermentaci v tlustém střevě Ilona Profousová1,2, Kateřina Pomajbíková1, David Modrý1,3 Ústav parazitologie, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno1,Ústav biologie obratlovců AV ČR, Brno2, Ústav parazitologie, biologické centrum AV ČR, České Budějovice3 Úvod V přirozených podmínkách se šimpanzi (Pan troglodytes) ţiví potravou s dominantním podílem rostlinných sloţek. Rostlinná vláknina je fermentovaná v tlustém střevě komplexní populací mikroorganismů (bakterie, houby, nálevníci). Zásadní sloţkou mikrobiomu tlustého střeva afrických lidoopů jsou entodiniomorfní nálevníci Troglodytella abrassarti (Pomajbíková et al., 2010). Jejich role ve střevě lidoopů dosud nebyla uspokojivě objasněna, ačkoliv první výsledky biochemických analýz naznačují jejich podíl na trávení strukturálních polysacharidů (především hemicelulózy) a škrobu (Kišidayová et al., 2009; Profousová et al., nepublikovaná data). Objasnění hydrolytických aktivit T. abrassarti je nezbytným předpokladem pro pochopení jejich funkce nejen v ekosystému střeva, ale i v energetickém metabolismu hostitele. Cílem práce bylo (i) charakterizovat enzymy T. abrassarti a upřesnit význam těchto nálevníků ve střevě hostitele a (ii) a standardizovat metodiku Flotac® pro kvantifikaci T. abrassarti v trusu lidoopů a současně pro dalšího nálevníka, Balantidium coli, který se běţně nachází u šimpanzů v zajetí a je povaţován za oportunního patogena.

Materiál a metodika Charakterizace enzymu T. abrassarti: Ţiví trofozoiti T. abrassarti byli izolováni z čerstvého trusu šimpanzů chovaných v Zoo Liberec pomocí galvanotaxie (Kišidayová et al., 2007) a sedimentace v anaerobních podmínkách. V suspenzi buněk byly bakterie odstraněny promytím. Stanovována byla enzymatická aktivita CM-calulázy, xylanu, α–amylázy a inulinázy a to kvantitativně měřením mnoţství redukujících cukrů (Miller et al., 1960;

Bradford, 1976)

vznikajících z různých substrátů (CM-celulóza, škrob, xylan, inulín), za různých inkubačních podmínek (pH 5,25; 7,0, teplota 22°C, 38°C a 50°C) a kvalitativně pomoci SDS-PAGE elektroforézy (zymogramy) (Flint et al., 1994). Následně byly jednotlivé proteiny osekvenovány pomocí MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation) a srovnány s dostupnou databází

18

proteinů (např. BLAST). Data byla hodnocena GLM ANOVA s interakcemi druhého stupně (Statistica, version 8.0, StatSoft. Inc. 2008). Diagnostika a kvantifikace: Pro kvantifikaci T. abrassarti v trusu šimpanzů byla provedena kalibrace přístroje Flotac®, jeţ spočívala v selekci nejvhodnějšího flotačního roztoku s optimální specifickou hustotou. Stejně byl flotak zoptimalizován i pro Balantidium coli. Vzorky trusu byly vyhodnoceny semikvantitativně flotací, a následně byly pozitivní vzorky zpracovány metodikou Flotac® dle standardního postupu kalibrace (Cringoli et al., 2010). Kaţdý vzorek byl hodnocen 9 flotačními roztoky s různou specifickou hustotou (S1: Sheatherův cukerný roztok-1,2; S2: nasycený NaCl-1,2;

S3: ZnSO4-1,2; S4-NaNO3- 1,2; S5: Rinaldiho roztok-1,25; S6: MgSO4-1,28; S7:

ZnSO4,-1,34; S8: K2[HgI4]-1,34; S9: cukerný roztok-1,35), přičemţ v kaţdém roztoku byl vzorek kvantifikován 6× a hodnocen kalibračními kritérii (jas, mnoţství dedritu a bublin). Následně byly počty statisticky zpracovány metodou GLM repeated measures ANOVA. Výsledky V bezbuněčné suspenzi T. abrassarti jsme naměřili sledované enzymatické aktivity. Teplota a pH měli významný vliv na specifickou aktivitu xylanázy a α–amylázy. Testované teploty a pH neměli vliv na specifickou aktivitu CM-celulázy a inulinázy. Nejvyšších specifických hydrolytických aktivit dosahovala xylanáza, nejniţších naopak fruktanáza. Analýza zymogramů ukázala, ţe na CM-celulázové, inulinásové a xylanásové aktivitě se podílí více izoforem těchto enzymů. Amylázová aktivita byla přítomna jen v jedné izoformě. V kaţdém vzorku byly kvantifikovány počty trofozoitů jednotlivě pro oba nálevníky. V obou případech byly nejniţší počty trofozoitů (χ=0-3,5) zaznamenány v roztocích S1, S4, S5, S7, S8 a S9, navíc pro B. coli nízké počty byly i v roztocích S2 a S6 (χ=2; 2,5). Vyšší počty trofozoitů T. abrassarti byly zachyceny v roztocích S2 (χ=8,5) a S6 (χ=8,5). Nejvyšší počty trofozoitů obou nálevníků byly v roztoku S3 (χ: T. abrassarti-14,5; B. coli-9). Tento roztok byl shledán jako nejoptimálnější i z hlediska dalších kalibračních kritérií a statistického zhodnocení (P<<0,01). Závěr Naše výsledky ukazují, ţe T. abrassarti se aktivně podílí na trávení nejen stavebních, ale i zásobních rostlinných polysacharidů v tlustém střevě šimpanzů. Vůbec poprvé byla demonstrovaná inulinásová aktivita u nálevníků. Tyto výsledky přispívají k prohloubení poznání trávení lidoopů. V současné době se Flotac® zdá být nejvhodnější metoda pro kvantifikaci střevních nálevníků, jako i jiných parazitů (Cringoli et al., 2010). V současné době probíhá testování citlivosti flotaku, tzn., jakou nejniţší infekci uvedenými nálevníky je moţné flotakem zachytit. Výhodami této 19

kvantifikační metody jsou přesnost a efektivita, a proto bude aplikována do několika jiţ v této probíhajících pokusů.

Seznam literatury 1. BRADFORD, M., M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Analitical Biochemie, 1976, vol. 72, s. 248-254. 2. CRINGOLI, G., RINALDI, L., MAURELLI, M. P., UTZINGER, J. FLOTAC: new multivalent techniques for qualitative and quantitative copromicroscopic diagnosis of parasites in animals and humans. Nature Protocols, 2010, vol. 5, s. 503-515. 3. FLINT, H., J., ZHANG, J., X., MARTIN, J. Multiplicity and expression of xylanases in the rumen cellulolytic bacterium Ruminococcus flavefaciens. Current Microbiology, 1994, vol. 29, s. 139-143. 4. KIŠIDAYOVÁ, S., VÁRADYOVÁ, Z., MIHÁLIKOVÁ, K. Highly efficient galvanotaxis aparatus for cleaning and concentrating rumen ciliates. Folia Microbiologica, 2007, vol. 52(6), s. 637-640. 5. KIŠIDAYOVÁ, S., VÁRADYOVÁ, Z., PRISTAŠ, P., PIKNOVÁ, M., NIGUTOVÁ, K., PETRŢELKOVÁ, K. J., PROFOUSOVÁ, I., SCHOVANCOVÁ, K., KAMLER, J., MODRÝ, D. Effect of high- and low- fiber diets on fecal fermentation and fecal microbial populations of captive chimpanzees. American Journal of Primatology, 2009, vol. 71, s. 110. 6. MILLER, G., L., BLUM, R., GLENNON, W., E., BURTON, A., L. Measurement of CMCase aktivity. Analytical biochemie, 1960, vol. 2, s. 127-132. 7. POMAJBÍKOVÁ, K., PETRŢELKOVÁ, K., J., PROFOUSOVÁ, I., PETRÁŠOVÁ, J., KIŠIDAYOVÁ, S., VÁRADYOVÁ, Z., MODRÝ, D. A survey of entodiniomorphid ciliates in chimpanzees and bonobos. American Journal of Physical Antropology, 2010, vol. 142, s. 42-48.

Kontaktní adresa: Ing. Ilona Profousová, Ústav parazitologie, VFU Brno, Palackého 1/3, Brno, email: [email protected]

20

Stanovení hladiny EGF (epidermal growth factor) v moči koček s FIC (feline idiopathic cystitis) Použití nesteroidních antiflogistik v terapii FIC Daniel Honzák, Simona Kovaříková, Nikola Hronová Klinika chorob psů a koček, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Stanovení hladiny EGF v moči koček s FIC Úvod Onemocnění dolních cest močových představuje významnou část urologických problémů řešených v klinické praxi koček. Jedná se o onemocnění močového měchýře a močové trubice, které můţe probíhat v obstruktivní či neobstruktivní formě. V současné době je více neţ 50% případů FeLUTD (Feline Lower Urinary Tract Disorders) diagnostikováno jako idiopatická forma onemocnění dolních cest močových (FIC, Feline Idiopathic Cystitis). Tato diagnóza je stanovena na základě vyloučení všech známých příčin (anatomické abnormality, neurogenní poruchy, urolity, uretrální zátky, zánětlivá onemocnění, traumata, neoplazie, iatrogenní vlivy), které mohou tento urologický problém vyvolat. Existuje také určitá podobnost mezi FIC a intersticiální cystitidou (IC) u lidí. Rovněţ klinické projevy FIC jsou shodné se symptomatologií IC u lidí. Mezi nejčastěji pozorované příznaky patří strangurie, dysurie, hematurie, polakisurie a u koček téţ periurie. Snaha o nalezení neinvazivní diagnostické metody IC u lidí, vedla k provedení několika studií, zabývajících se močovými markery. V jedné takové studii zjistili, ţe hladiny epiteliálního růstového faktoru EGF jsou významně zvýšené v moči pacientů s IC oproti kontrolním skupinám. Vzhledem k dosaţeným výsledkům navrhují autoři tento parametr jako vhodný diagnostický marker IC. Velmi podobných výsledků bylo dosaţeno i v následujících studiích zabývajících se tímto markerem. Vzhledem k podobnosti FIC u koček a IC u lidí, můţeme předpokládat velmi podobné výsledky ve stanovení hladin tohoto markeru v moči kočičích pacientů trpících idiopatickou cystitidou. Stanovení hladin epiteliálního růstového faktoru v moči těchto pacientů by tak mohlo přispět k diagnostice a pochopení patofyziologie tohoto onemocnění. Cílem této studie je tedy zhodnocení hladiny EGF v moči a pouţití v rámci diagnostiky Felinní idiopatické cystitidy.

Metodika Pacienti jsou do této studie zařazováni, tak jak majitelé přicházejí na naše pracoviště. Jsou rozdělováni do několika skupin: 1. pacienti s idiopatickou cystitidou, 2. pacienti s přítomností anorganického sedimentu, konkrementů v močovém měchýři, pacienti s přítomností močové zátky 21

a obstrukcí močových cest, 3. pacienti s infekcí močových cest, 4. kontrolní skupina pacientů nemající v anamnéze ţádné urologické onemocnění. Kritéria pro zařazení do první skupiny pacientů FIC sestávají: z přítomnosti klinických projevů tohoto onemocnění, z nepřítomnosti bakteriální infekce, anorganického sedimentu, konkrementů a uretrální obstrukce. Vzorky moči od všech skupin pacientů jsou získávány cystocentézou, ihned zpracovány (vyšetření moči, močového sedimentu, kultivace moči) a supernatant je uskladněn při -80 stupních Celsia. V těchto vzorcích získané moči je pak stanovována hladina EGF, humánním Elisa testem. Dosavadní výsledky 1. skupina FIC

2. skupina

3. skupina

4. skupina

Močový písek, urolity,

Infekce močových

kontrolní skupina

obstrukce

cest

pacientů

Hladina EGF v moči (ng/ml) 11,66

9,19 6,57 4,69 1,17 6,02 3,79 1,07 3,93 4,2 4 3,49 4,85 0

22,43 0

1,2 0,7 2,29 4,64

Závěr Vzhledem k prozatím nedostatečnému mnoţství získaných vzorků moči, nelze tyto výsledky zcela validně reprodukovat a statisticky zhodnotit. Zejména pak nedostatek vzorků moči od pacientů s idiopatickou formou onemocnění dolních cest močových je v této studii limitující. Sběr dalších vzorků moči ke stanovení hladiny EGF stále probíhá tak jak majitelé přicházejí se svými pacienty na naše pracoviště.

22

Použití nesteroidních antiflogistik v terapii FIC Úvod Vzhledem k nejasné etiologii a patofyziologii FIC je problematická i terapie tohoto onemocnění. Klinické příznaky felinní idiopatické cystitidy obvykle spontánně vymizí během 5-10 dnů. Nicméně zahájení terapie lze doporučit vzhledem k bolestivému charakteru onemocnění, moţnému vzniku obstrukce uretry či zabránění traumatizace perineální oblasti. Bohuţel pouze malé mnoţství navrhované léčby FIC se opírá o kontrolované studie a většina terapeutických doporučení je zaloţena na nekontrolovaných klinických pozorováních a osobních názorech. Spontánní vymizení klinických příznaků a nedostatečné mnoţství kontrolovaných studií podtrhuje potřebu dvojitě kontrolovaných studií, zaměřených na terapii FIC. Cílem tohoto projektu je tedy zhodnocení pouţití nesteroidních antiflogistik v terapii tohoto onemocnění.

Metodika Ve studii zaměřené na terapii FIC jsou zahrnuti ti samí pacienti jako v 1. skupině předchozího projektu. S majiteli těchto pacientů je vyplněn podrobný anamnestický dotazník, je provedeno ultrasonografické vyšetření močového měchýře, vyšetření moči (močový sediment, kultivace moči). Pacienti jsou náhodně rozdělování do skupin léčených farmaky a do skupiny s podáváním placeba. Zařazení pacienta do skupiny zůstává vyšetřovateli a majiteli v celém průběhu studie neznámé. Pacientům je, dle rozdělení do skupin podáván Ketoprofen, Acidum tolfenamicum, Robenacoxib a placebo. Současně s tím jsou pacienti převedeni na urologickou dietu společně s doporučením zavést další moţná chovatelská opatření. Hodnocení účinnosti léčby představuje dotazník zahrnující změny v chování pacientů. Rozhovor s majiteli je prováděn 5 a 14 dní, dále pak 2 a 6 měsíců po zahájení terapie. Po 14 dnech a 2 měsíce po zahájení terapie jsou pacienti vyšetřeni klinicky a je provedeno kontrolní sonografické vyšetření močového měchýře. Podmínkou zahrnutí pacientů do tohoto projektu je schválený projekt pokusů a písemný informovaný souhlas majitele se zařazením do klinické studie. Závěr Do tohoto projektu se stále nabírají noví pacienti, prozatím je jejich počet nedostatečný k interpretaci výsledků a studie není ukončena. Získávání nových pacientů je do určité míry komplikováno nesouhlasem některých majitelů se zařazením do klinické studie. Nicméně pacienti jsou a budou, na základě souhlasu majitele, zařazováni do této studie tak jak budou přicházet na naše pracoviště. 23

Sledování výskytu Helicobacter spp. u psů v České republice Roman Husník1, Michal Kolorz2, Kateřina Wróblová2, Ladislava Bartošová2, Lucia Frgelecová3, Petr Fictum3, Jiří Klimeš4, Kateřina Pavlicová5 Klinika chorob psů a koček, FVL, VFU Brno1, Ústav humánní farmakologie a toxikologie, FaF, VFU Brno2, Ústav patologické morfologie, FVL, VFU Brno3, Ústav biologie a chorob volně žijících zvířat, FVHE, VFU Brno4, studentka 6. ročníku, FVHE, VFU Brno5 Úvod Jiţ delší dobu není pochyb o významu H. pylori v rozvoji chronické gastritidy lidí (je známo, ţe H. pylori se podílí na rozvoji chronické gastritidy u 80 - 90 % případů). Vzhledem k tomu, ţe jiţ neplatí dřívější tvrzení o neexistenci přirozené infekce H. pylori u psa, můţe být pes jakoţto druh ţijící v těsném souţití s člověkem moţným zdrojem infekce. Stejně i H. heilmannii a v menší míře i H. felis kolonizují určité nezanedbatelné procento lidí s chronickou gastritidou, u kterých se nedaří najít ţádný environmentální zdroj těchto bakterií. Cílem projektu je sledování výskytu Helicobacter spp. v ţaludku psů s trávicími obtíţemi se zaměřením na získání údajů o zastoupení jednotlivých druhů bakterií rodu Helicobacter u vyšetřovaných jedinců. Materiál a metodika Do sledování bylo dosud zahrnuto 51 pacientů s příznaky postiţení horní či horní i dolní části trávicí

trubice,

u

nichţ

byla

provedena

ezofagogastroduodenoskopie.

K diagnostice

helikobakterové infekce byly vyuţívány invazivní metody zahrnující průkaz ureázové aktivity bioptátů ţaludku, cytologické vyšetření otiskových preparátů bioptátů ţaludku, histologické vyšetření bioptátů ţaludku a vyšetření bioptátů ţaludku pomocí PCR. Minimálně 14 dní před vyšetřením byla u všech pacientů zařazených do studie vysazena veškerá medikace. Pro průkaz ureázové aktivity byl minimálně jeden bioptát odebraný z oblasti velkého zakřivení těla ţaludku vloţen do Helicobacter test media. Změna barvy byla sledována po dobu 24 hodin. Minimálně jeden bioptát (opět z velkého zakřivení ţaludku) byl pouţit k přípravě otiskového preparátu pro cytologické vyšetření. K obarvení cytologických preparátů bylo pouţito barvivo Haemacolor (Merck). Během cytologického vyšetření byla hodnocena přítomnost spirálovitých mikroorganizmů. Současně s ureázovým testem a cytologickým vyšetřením bylo provedeno standardní histologické vyšetření bioptátů ţaludku s barvením histologických řezů hematoxylinem - eozinem a 24

dále barvení stříbrem. Histologické vyšetření sledovalo zejména přítomnost zánětlivých buněk, přítomnost sekundárních lymfatických folikulů, tkáňových změn charakteru metaplazie, dysplazie, atrofie, přítomnost intraepiteliálních lymfocytů a spirálovitých mikroorganizmů. Histologicky byly změny klasifikovány podle běţně popisovaných schémat. U kaţdého pacienta byly odebrány bioptáty pro vyšetření pomocí PCR. Z bioptátů byla izolována celková DNA. Tyto vzorky byly pouţity pro detekci přítomnosti mikroorganizmů rodu Helicobacter pomocí rodově specifických primerů. U pozitivních vzorků bude v další fázi upřesněno druhové zastoupení helikobakterů pomocí primerů specifických pro jednotlivé druhy rodu Helicobacter. Výsledky Sledování přítomnosti helikobakterů zahrnovalo následující nálezy: (1.) pozitivní ureázový test v kombinaci s pozitivním výsledkem cytologického vyšetření, pozitivním nálezem helikobakterů při vyšetření bioptátů ţaludku při barvení hematoxylinem – eozinem, pozitivním nálezem helikobakterů při vyšetření bioptátů ţaludku při barvení stříbrem a pozitivním PCR (32 případů); (2.) pozitivní ureázový test v kombinaci s negativním výsledkem cytologického vyšetření, negativním nálezem helikobakterů při vyšetření bioptátů ţaludku při barvení hematoxylinem – eozinem, negativním nálezem helikobakterů při vyšetření bioptátů ţaludku při barvení stříbrem a negativním PCR (1 případ); (3.) negativní výsledek všech prováděných testů (8 případů); (4.) pozitivní ureázový test v kombinaci s negativním výsledkem cytologického vyšetření, pozitivním nálezem helikobakterů při vyšetření bioptátů ţaludku při barvení hematoxylinem – eozinem, pozitivním nálezem helikobakterů při vyšetření bioptátů ţaludku při barvení stříbrem a pozitivním PCR (3 případy); (5.) pozitivní ureázový test v kombinaci s pozitivním výsledkem cytologického vyšetření, negativním nálezem helikobakterů při vyšetření bioptátů ţaludku při barvení hematoxylinem – eozinem, negativním nálezem helikobakterů při vyšetření bioptátů ţaludku při barvení stříbrem a pozitivním PCR (2 případy); (6.) negativní ureázový test v kombinaci s pozitivním výsledkem cytologického vyšetření, pozitivním nálezem helikobakterů při vyšetření bioptátů ţaludku při barvení hematoxylinem – eozinem, pozitivním nálezem helikobakterů při vyšetření bioptátů ţaludku při barvení stříbrem a pozitivním PCR (1 případ); (7.) negativní ureázový test v kombinaci s negativním výsledkem cytologického vyšetření, negativním nálezem helikobakterů při vyšetření bioptátů ţaludku při barvení hematoxylinem – eozinem, negativním nálezem helikobakterů při vyšetření bioptátů ţaludku při barvení stříbrem a pozitivním PCR (2 případy); (8.) negativní ureázový test v kombinaci s pozitivním výsledkem cytologického vyšetření, pozitivním nálezem helikobakterů při vyšetření bioptátů ţaludku při barvení hematoxylinem – 25

eozinem, pozitivním nálezem helikobakterů při vyšetření bioptátů ţaludku při barvení stříbrem a negativním PCR (1 případ) a (9.) negativní ureázový test v kombinaci s pozitivním výsledkem cytologického vyšetření, negativním nálezem helikobakterů při vyšetření bioptátů ţaludku při barvení hematoxylinem – eozinem, negativním nálezem helikobakterů při vyšetření bioptátů ţaludku při barvení stříbrem a negativním PCR (1 případ) Lze tedy konstatovat, ţe výskyt spirálovitých bakterií a/nebo bakterií produkujících ureázu (tj. Helicobacter spp.) byl zaznamenán u 43 sledovaných pacientů, coţ představuje 84,3 % vyšetřovaných psů. Mírná lymfocytárně plazmocytární gastritida (LPG) byla spojena s nálezem Helicobacter spp. v 10 případech. Jednou bylo vyšetření na helikobatery negativní. LPG středního stupně byla zaznamenána a současně spojena s výskytem Helicobacter spp. ve dvou případech. Těţká LPG byla zaznamenána pouze v jednom případě a v souvislosti s tímto nálezem nebyla potvrzena přítomnost helikobakterové infekce. V jednom případě byla detekována eozinofilní gastritida a v souvislosti s tímto nálezem nebyla potvrzena přítomnost helikobakterové infekce. V jednom případě byla zaznamenána akutní hnisavě nekrotická gastritida a v souvislosti s tímto nálezem byla potvrzena přítomnost helikobakterové infekce. V šesti případech byla detekována neoplazie a ve všech případech byla spojena s přítomností helikobakterové infekce. Nespecifické změny byly během histologického vyšetření detekovány ve 27 případech. Ve 24 případech byla prokázána přítomnost helikobakterové infekce.

Seznam literatury: 1. Fixa, B.: Gastritida. In: Gastroenterologie. Z. Mařatka (ed.). Praha, nakladatelství Karolinum 1999, s. 117-129. 2. Flatland, B.: Helicobacter Infection in Humans and Animals. Compendium Cont. Educ. Pract. Vet., 24, 2002, s. 688 – 696. 3. Kubiak, K., Jankowski, M., Spuzak, J. et al.: Application of classical-PCR, nested-PCR and seminested-PCR in identification of Helicobacter species colonizing gastric mucosa in dogs with gastritis. Poster, 19th ECVIM-CA Congress, Porto, 2009.

26

Inhibice kaspázy-3 v explantátových kulturách Judita Kudělová, Ivana Chlastáková, Jaroslav Doubek, Eva Matalová Ústav fyziologie, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Orgánové explantátové kultury jsou obecně vhodným řešením, které nabízí moţnost provádění výzkumu na intaktních tkáňových a orgánových systémech, ovšem bez zásahů na citlivém ţivém organismu zvířete. Orgánové kultury ex vivo umoţňují zachování buněčných interakcí, sledování molekulárních komunikací a jejich cílenou modulaci mimo organismus po dobu několika dnů. Vzhledem k ex vivo kultivaci jsou velmi snadné modulační zásahy na genové, transkriptomové i proteinové úrovni. Kaspázy jsou cysteinové proteázy, které jsou součástí intracelulární buněčné mašinérie. Centrální pozici zaujímá kaspáza-3. Kaspáza-8 zahajuje vnější apoptotickou cestu a kaspáza-9 je iniciační kaspázou mitochondriální dráhy. Klasický knock-out/double knock-out přístup u myšího modelu při výzkumu role kaspáz v morfogenezi má však často omezení v letalitě takto vytvořených zvířat. Proto je vhodná kombinace s přístupem s vyuţitím explantátových kultur. Hlavním cílem práce bylo zavedení metodiky kultivace končetinových štěpů na VFU Brno s moţností farmakologické inhibice kaspázy-3. Dalším cílem bylo sledování vlivu inhibice aktivní kaspázy-3 na průběh apoptózy. Materiál a metodika Experimentální design: Výběr nejvhodnějšího stádia pro kultivaci (detekce kaspázy-3 u končetin ED 12,5-15,5). Kultivace 3 skupin končetinových explantátových kultur u ED 13 – 1) kontrola – pouze kultivační médium, 2) kontrola s DMSO – rozpouštědlo inhibitoru kaspáz, 3) inhibice aktivní kaspázy-3 (FMK inhibitor, 200 µM). Odběr vzorků v 24-hodinových intervalech, zpracování do parafinových bloků a histologických řezů. Explantátové kultury: Končetinové explantáty byly získány z myších embryí ve stádiu ED 13 oddělením předních končetin, následným umístěním do kultivačních misek s ţivným médiem (DMEM, L-glu, P/S, 10% FBS) a kultivovány v CO2 atmosféře při 37 °C po dobu 2 dnů. Analýza vzorků: Sériové histologické řezy byly barveny hematoxylinem a eosinem (posouzení morfologie), pouţity pro imunohistochemickou detekci aktivní kaspázy-3 a PCNA (hodnocení růstu explantátů) a biochemickou detekci apoptotických zlomů DNA metodou TUNEL (posouzení vlivu

27

inhibice), vše s vyuţitím DAB substrátové reakce a protibarvení hematoxylinem pro vizualizaci (pozitivní buňky hnědé, negativní modré). Výsledky A)

kaspáza-3

B)

TUNEL

Demonstrace Výskyt kaspázy-3 kaspázy-3 v meziprstí a apoptózy koreloval in vivo ED 13,5 Výskyt kaspázy-3 (A) v meziprstních segmentech byl v tomto období nejvýraznější a koreloval s distribucí apoptotických buněk (B). v meziprstních segmentech (černé šipky).

Kontrola - přední myší končetiny ED 13 po 24- a 48-hodinové kultivaci s přídavkem 1% DMSO 24 hod: Kontrola končetin ex vivo (A) neukázala změny v morfologii v porovnání s vývojem končetin in vivo. Proliferace (B, hnědé buňky) byla lokalizována převáţně v chrupavčitých (bílé šipky) a apikálních oblastech formujících se prstů (červené šipky). TUNEL pozitivní buňky (C) byly situovány v distálních a v okrajových částech meziprstních segmentů (bílé šipky). 48 hod: Po 48 hod kultivace - (D) odpovídala morfologie končetin situaci in vivo. Proliferace (E) byla soustředěna hlavně na vrcholcích prstů (červené šipky) a okolo chrupavčité tkáně. Apoptotické buňky (F) vyplňovaly meziprstní segmenty (bílé šipky). A) Haemat. – eosin – al. blue

D) Haemat. – eosin – al. blue

B) PCNA

C) TUNEL

E) PCNA

F) TUNEL

28

Přední myší končetiny ED 13 po 24- a 48-hodinové kultivaci s inhibitorem kaspázy-3 24 hod: Končetinové explantáty kultivované s kaspázovým-3 inhibitorem (A) odpovídaly morfologicky kontrolám. Proliferace (B) byla soustředěna zejména do oblasti meziprstí a chrupavčité tkáně (bílé šipky). Apoptotické buňky (C) nebyly zaznamenány. 48 hod: Morfologie (D) i proliferační aktivita (E) odpovídaly kontrole, ale s větším počtem pozitivních buněk na vrcholcích prstů a okolo budoucích kostních základů prstů (bílé šipky). Znovu se objevila degradace meziprstních segmentů (F) s apoptotickými buňkami (červené šipky). A) Haemat. – eosin – al. blue

D) Haemat. – eosin – al. blue

B) PCNA

C) TUNEL

E) PCNA

F) TUNEL

Shrnutí výsledků Distribuce aktivní kaspázy-3 v interdigitálních segmentech in vivo pozitivně korelovala s výskytem apoptózy a negativně s proliferací. 29

Porovnání apoptózy a proliferace, stejně tak diferenciace chrupavčitých základů myších předních končetin in vivo a ex vivo, ukázaly srovnatelnou morfologii. Inhibice kaspázy-3 dočasně blokuje apoptózu v meziprstních segmentech, nicméně nezabrání jejich regresi. To vede k předpokladu existence kompenzačního mechanismu mezi kaspázami nebo nástupu alternativních drah buněčné smrti.

30

Alfaxalon v anestézii plazů Anna Hrdá1, Zdeněk Knotek1,2, Zora Knotková1 Klinika chorob ptáků, plazů a drobných savců, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno1, Clinic for Avian, Reptile and Fish Medicine, University of Veterinary Medicine, Vienna2, Austria Úvod Alfaxalon představuje ve veterinární medicíně moţnou alternativu léků pouţívaných k nitroţilní řízené sedaci nebo anestézii. Z praktického hlediska patří mezi výhody pouţití alfaxalonu jeho velmi rychlý nástup1. Aplikace alfaxalonu není u pacientů nijak bolestivá a při perivaskulární aplikaci nedochází k podráţdění ani k zánětu. Doposud byl ověřován zejména u savců1-4. Vysoké dávky alfaxalonu mohou být spojeny s některými komplikacemi2-3. Lze očekávat časově omezenou hypotenzi, dále můţe vyvolat prolongovanou apnoi1-3. O pouţití alfaxalonu u plazů doposud existují jen ojedinělé studie5-6. Přitom právě u této kategorie pacientů by bylo velmi vhodné pouţít nízké dávky alfaxalonu v úvodu inhalační anestézie před zavedením tracheální rourky a převedením pacienta na inhalační anestézii, jak je to popisováno u savců1. Cílem projektu bylo vyhodnocení krátkodobé anestézie alfaxalonem u experimentálních plazů leguánů zelených (Iguana iguana) a ţelv nádherných (Trachemys scripta elegans). Materiál a metodika Plánovaný klinický výzkum se uskutečnil na modelu dospělých 13 samců experimentálních leguánů zelených a 10 dospělých samic experimentálních ţelv nádherných. Pro objektivní posouzení zdravotního stavu experimentálních zvířat byly hodnoceny hematologické i biochemické parametry vzorků periferní krve. Při aplikaci alfaxalonu (5 mg/kg, Alfaxan® 10 mg/ml, Vétoquinol, Francie) do ventrální ocasní ţíly byli leguáni fixováni ve hřbetní poloze. U ţelv nádherných byl alfaxalon (10 mg/kg, Alfaxan® 10 mg/ml, Vétoquinol, Francie) aplikován do svalů za levou hrudní končetinou. U plazů byly hodnoceny časové údaje o ztrátě a návratu vybraných reflexů a odpovědi na mechanické podněty. U leguánů zelených byly vyhodnocovány rovněţ frekvence dechu, frekvence pulsu, SpO2 a koncentrace vydechovaného CO2 prostřednictvím monitorovacího zařízení (VitalScan, Vetronic, UK).

31

Výsledky Výsledky anestézie plazů pomocí alfaxalonu jsou znázorněny v tabulkách 1 – 6. U leguánů zelených byl při nitroţilní aplikaci alfaxalonu pozorován účinek velmi záhy, většinou došlo ke ztrátě vzpřimovacího reflexu do konce první minuty (41,54 ± 27,69 s). Zavedení tracheální rourky bylo moţno provést do dvou minut (69,62 ± 37,03 s). Ztráta hluboké citlivosti byla u leguánů zaznamenána mezi druhou a devátou minutou a k obnovení plné aktivity došlo do dvaceti minut od aplikace anestetika (14,23 ± 4,15 min). U ţelv nádherných byla po intramuskulární aplikaci alfaxalonu pozorována ztráta vzpřimovacího reflexu do deseti minut (9,40 ± 6,83 min). Výrazná myorelaxace trvala přibliţně 30 minut, k úplnému návratu koordinovaného pohybu došlo déle neţ za hodinu (71,10 ± 11,15 s) o aplikaci alfaxalonu. Tabulka č. 1

Anestézie alfaxalonem (5 mg/kg IV) u 13 samců leguánů zelených Ztráta Zavedení Ztráta hluboké vzpřimovacího tracheální citlivosti reflexu rourky (min) (s) (s) 41,54 69,62 2,20 27,69 37,03 1,47

x s Tabulka č. 2

n

9 12 13 13 13 13 12 12 12 12 10 9 9

čas měření (min) 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

Návrat hluboké citlivosti (min)

Návrat plné aktivity (min)

8,60 2,18

14,23 4,15

Anestézie alfaxalonem (5 mg/kg IV) u leguánů zelených Frekvence pulsu (puls/min)

Dechová frekvence (dech/min)

SpO2

ETCO2

(%)

(%)

x

s

x

s

x

s

x

s

60,3 65,0 62,7 65,3 65,0 64,3 62,5 62,2 63,6 64,2 62,3 64,9 61,7

13,6 16,1 12,6 12,3 11,8 11,0 8,8 8,5 8,8 8,9 4,5 8,2 6,8

4,3 4,9 5,1 5,4 5,2 5,8 5,5 5,8 6,4 6,8 6,1 6,8 6,9

3,2 3,3 3,3 3,4 2,9 3,2 2,6 2,3 2,1 2,3 1,5 1,6 1,8

70,8 76,5 77,6 76,8 73,7 75,2 73,3 74,5 76,7 76,8 74,6 78,9 76,4

12,1 12,9 11,7 8,4 12,8 12,9 14,2 13,3 16,5 13,5 17,4 12,1 11,5

43,65 38,06 36,94 35,07 35,06 33,46 32,45 30,41 28,98 27,60 28,25 26,58 24,56

10,54 11,91 11,31 11,32 10,85 8,96 8,93 8,05 7,44 6,03 6,40 8,10 7,44

32

Tabulka č. 3

Intramuskulární sedace alfaxalonem (10 mg/kg) u 10 samic ţelv nádherných

x s

Ztráta vzpřimovacího reflexu (min) 9,40 6,83

Svalová relaxace (min) 12,60 6,56

Zvýšený pohyb (min) 41,70 18,83

Návrat vzpřimovacího reflexu (min) 71,10 11,15

Závěry Nitroţilní aplikace alfaxalonu u plazů v dávce 5 mg/kg se ukázala jako bezpečná a spolehlivá anestézie, vhodná k zavedení tracheální rourky a vedení inhalační anestézie. Nitrosvalová aplikace alfaxalonu ve vyšší dávce (10 mg/kg) navozuje u ţelv nádherných pouze svalovou relaxaci, bez ztráty hluboké citlivosti. Tuto variantu z praktického hlediska nedoporučujeme. Alfaxalon je vhodným a bezpečným anestetikem pro plazy, pokud je aplikován nitroţilně v dávce 5 mg/kg. V takovém případě nenavozuje apnoickou pauzu ani neovlivňuje výrazně základní fyziologické funkce.

Seznam literatury: 1. Maddern K, Adams VJ, Hill NAT, Leece EA. Alfaxalone induction dose following administration of medetomidine and butorphanol in the dog. Vet Anaesthesia and Analgesia, 2010, 37:7-13. 2. Muir W, Lerche P, Wiese A, Nelson L, Pasloske K, Whittem T. The cardiorespiratory and anesthetic effects of clinical and supraclinical doses of alfaxalone in cats. Vet Anaesthesia and Analgesia, 2009, 36:42-54. 3. Muir W, Lerche P, Wiese A, Nelson L, Pasloske K, Whittem T. Cardiorespiratory and anesthetic effects of clinical and supraclinical doses of alfaxalone in dogs.

Vet

Anaesthesia and Analgesia, 2008, 35:451-462. 4. Ferre PJ, Pasloske K, Whittem T, Ranasinghe MG, Li Q, Lefebvre HP. Plasma pharmacokinetics of alfaxalone in dogs after an intravenous bolus of Alfaxan-CD RTU. Vet Anaesthesia and Analgesia, 2006, 33:229-236. 5. Carmel B. Use of Alfaxan-CD for Intravenous Anaesthesia in Reptiles. In:Control and Therapy. October 2002, Post Graduate Foundation in Veterinary Science, No: 4413 6. Simpson M. Anaesthesia of Reptiles. In: Proceedings of the First Joint Conference of the Unusualand Exotic Pet and Avian SIGs of the Australian Veterinary Association, AVA National Conference. 2004:119-126.

33

Reverzibilní suprese pohlavní aktivity kocourů Robert Novotný, Roman Vitásek Klinika chorob psů a koček, Oddělení reprodukce, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod V současnosti představuje převaţující metodu ovlivnění pohlavního chování kocourů chirurgická kastrace, tedy trvalé odstranění samčích pohlavních ţláz – varlat. Nevýhodou je ovšem definitivní charakter zákroku, který omezuje jeho pouţití pouze na zvířata, u kterých se dále nepočítá s působením v reprodukci. V reprodukci psů a některých ostaních druhů zvířat se v poslední době zvyšuje uplatnění hormonální suprese pohlavní aktivity prostřednictvím GnRH agonistů. Cílem práce je ověřit účinost a bezpečnost GnRH agonisty deslorelinu při pouţití u kocourů a současně potvrdit předpoklad o reverzibilitě potlačení pohlavní aktivity. Materiál a metodika V projektu se předpokládá zařazení celkově 30 zdravých, pohlavně dospělých kocourů, u kterých jiţ bylo pozorováno samčí pohlavní chování. Jedná se o zvířata soukromých majitelů, kteří ţádají o řešení kontroly reprodukce. Majitelé jsou podrobně seznámeni s protokolem projektu a se zařazením zvířete vyjadřují svůj informovaný souhlas. Před zařazením do sledování jsou zvířata klinicky vyšetřena a je jim odebrána krev ke stanovení hladiny testosteronu. Po jednorázové stimulaci HCG (50 m.j./kg) pro eliminaci moţných chyb způsobených cirkadiánními výkyvy je opětovně odebrána krev ve 4 hodinovém intervalu. V celkové anestezii je získán ejakulát elektroejakulací pro vyšetření a zaveden Suprelorin implantát. Ve sledováních prováděných u psů docházelo po krátkodobé úvodní stimulaci k potlačení pohlavní činnosti nejpozději do 6 týdne. Abychom mohli posoudit úroveň suprese a znovuobnovení spermiogeneze, jsou námi sledovaní kocouři rozděleni do 15 skupin skupin po dvou zvířatech. U zvířat ve skupinách 1 aţ 7 sledujeme rychlost nástupu a stupeň potlačení pohlavní aktivity. U všech sledovaných jedinců provedeme klinické vyšetření, odběr krve pro stanovení sérové koncentrace testosteronu, odběr ejakulátu a jeho zhodnocení, orchiektomii a histologické posouzení tkáně pro zjištění stupně potlačení spermiogeneze v tomto schématu:

34

Číslo skupiny

1

2

3

4

5

6

7

Týdnů po implantaci

4

6

8

10

12

14

16

Pro dosaţení plné suprese spermatogeneze ponecháváme implantát zavedený 16 týdnů. Poté je vyjmut v celkové anestezii nebo hluboké sedaci. U zvířat ve skupinách 8 aţ 15 sledujeme rychlost znovuobnovení pohlavní aktivity po explantaci Suprelorinu a její úroveň. U všech kocourů je provedeno klinické vyšetření, odběr krve pro stanovení sérové koncentrace testosteronu, odběr ejakulátu a jeho zhodnocení, orchiektomie a histologické posouzení varlat v tomto harmonogramu: Číslo skupiny

8

9

10

11

12

13

14

15

Týdnů po implantaci

18

20

22

24

26

28

30

32

U všech zvířat zařazených do projektu je kromě výše zmíněných kontrol pravidelně v měsíčních intervalech odebírána krev ke stanovení sérové koncentrace testosteronu a ve dvouměsíčním intervalu odebírán ejakulát k posouzení. Výsledky V současnosti jsou k dispozici dílčí výsledky od 11 sledovaných zvířat z celkového počtu 30. Po implantaci Suprelorinu dochází u kocourů ke zmenšení velikosti varlat (Graf 1), poklesu sérové koncentrace testosteronu (Graf 2) a postupné azoospermii (Graf 3). Graf 1 - Změna velikost varlat během 4 měsíců po implantaci Suprelorinu

Graf 2 - Změna sérové koncentrace testosteronu po implantaci Suprelorinu

180,00 160,00 140,00 120,00 mm2

100,00

Levé varle

80,00

Pravé varle

60,00 40,00 20,00

8,00 7,00 6,00 5,00 ng/ml 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00

6,92

2,40 0,85 0,02 1

0,00 1

2

3

4

2

3

0,02 0,02

4

0,02 0,02

0,03 0,03 5

měsíce

5

měsíce

Testosteron před stimulací

Testosteron 4 hodiny po stimulaci HCG

Graf 3 - Počet spermií v ejakulátu po implantaci Suprelorinu

Celkový počet spermií

16 475 000 18 000 000 16 000 000 14 000 000 12 000 000 10 000 000 8 000 000 6 000 000 4 000 000 2 000 000 0

65 375 0 1

2

3 měsíce

4

5

35

Po explantaci Suprelorinu docházi k návratu sledovaných parametrů na výchozí úroveň (Graf 4,5,6). Graf 5 - změna sérové koncentrace testosteronu po explantaci Suprelorinu

Graf 4 - Změna velikosti varlat během 4 měsíců po explantaci Suprelorinu 180,00 160,00 140,00 120,00 100,00 mm2 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00

2,50 2,09

2,00

1,74

Levé varle Pravé varle

1,50 ng/ml 1,00

0,96

0,50

1

2

3

4

1

5

0,02

0,06

0,18

0,02 0,00

2

0,05 3

0,03

0,30 4

5

měsíce

měsíce

Testosteron před stimulací

Testosteron 4 hodiny po stimulaci HCG

Graf 6 - Počet spermií v ejakulátu po explantaci Suprelorinu 56 095 000 Celkový počet spermií

60 000 000 50 000 000 40 000 000 30 000 000 18 710 000 20 000 000 10 000 000 0 0 1

2

3

4

5

měsíce

Závěr Na základě předběţných výsledků se GnRH agonista deslorelin jeví jako účinná, bezpečná a vratná alternativa k chirurgické kastraci kocourů. Reverzibilita metody umoţňuje dočasné potlačení pohlavní aktivity včetně jejích neţádoucích doprovodných projevů (značkovaní zapáchající močí) a tím vyuţití plemených kocourů pouze v krycí sezóně.

Seznam literatury Munson, L. "Contraception in felids.," Theriogenology (66:1), 2006, pp. 126--134. Kutzler, M. and Wood, A. "Non-surgical methods of contraception and sterilization.," Theriogenology (66:3), 2006, pp. 514-525. Junaidi, A., Williamson, P. E., Cummins, J. M., Martin, G. B., Blackberry, M. A. and Trigg, T. E. "Use of a new drug delivery formulation of the gonadotrophin-releasing hormone analogue Deslorelin for reversible long-term contraception in male dogs.," Reprod Fertil Dev (15:6), 2003, pp. 317-322. Ludwig, C., Desmoulins, P. O., Driancourt, M. A., Goericke-Pesch, S. and Hoffmann, B. "Reversible downregulation of endocrine and germinative testicular function (hormonal castration) in the dog with the GnRH-agonist azagly-nafarelin as a removable implant "Gonazon"; a preclinical trial.," Theriogenology (71:7), 2009, pp. 1037-1045. Goericke-Pesch, S., Spang, A., Schulz, M., Ozalp, G., Bergmann, M., Ludwig, C. and Hoffmann, B. "Recrudescence of spermatogenesis in the dog following downregulation using a slow release GnRH agonist implant.," Reprod Domest Anim (44 Suppl 2), 2009, pp. 302-308. 36

Změny v tukové tkáni dojnic během tranzitního období Oldřich Pěnkava1, Soňa Šlosárková2 1

Ústav fyziologie, 2Klinika chorob přežvýkavců, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod

Pro dojnice je po porodu rozhodující aktivita tukové tkáně jako hlavního zdroje energie pro vyrovnání negativní energetické balance. Lipomobilizace z tukové tkáně se zvyšuje jiţ před porodem (1), přičemţ její patologicky zvýšená úroveň je zaznamenávána zejména v souvislosti s obezitou zvířat v tomto období (2). U lidí je obezita v současnosti chápána také jako chronický zánětlivý stav organizmu. Tuková tkáň se při obezitě odlišuje mimo jiné morfologicky, zvětšuje se velikost adipocytů i míra infiltrace makrofágy (3). Cílem práce bylo popsat histologické změny tukové tkáně v peripartálním období dojnic, zejména pak posoudit změnu průměrné velikosti adipocytů podkoţní tukové tkáně a míru infiltrace této tkáně makrofágy, imunohistochemicky (IHC) značenými, ve vztahu s tělesnou kondicí a biochemickými markery lipomobilizace. Materiál a metody Do pokusu bylo zahrnuto 30 plemenic holštýnského plemene s průměrným pořadím laktace při otelení 2,4. U kaţdého zvířete byla provedena dvě vyšetření zahrnující odběr vzorků krve, vzorků podkoţního tuku z oblasti u kořene ocasu (regio clunis) pomocí bioptických kleští a určení tělesné kondice dle běţné metodiky (1-5 bodů). První vyšetření bylo prováděno 9-2 dny do očekávaného termínu porodu, druhé 5-12 dnů po porodu (tabulka 1). Tuková tkáň po odběru byla fixována v 10% neutrálním formalínu, vzorky byly zpracovány běţnou parafinovou metodou a obarveny hematoxylin-eozinem. Morfometrické vyšetření bylo provedeno metodou obrazové počítačové analýzy Soft Imaging System Cell F (OLYMPUS, Japan). Pouţita byla metoda tradiční a automatické počítačové morfometrie v 2D projekci. Velikost tukových buněk byla stanovena jako průměrný obsah (µm2) 20 buněk se zachovalým jádrem na kaţdém preparátu. Po demaskování antigenů teplem (v mikrovlnné troubě při pH 6 a teplotě 98°C po dobu 20 minut) byly preparáty tukové tkáně obarveny v rámci nepřímé imunohistochemické metody s vyuţitím primární protilátky anti-CD68 (klon EBM 11, DAKO, Denmark) a barvícího systému CSA, HRP (DAKO, Denmark). Mnoţství makrofágů v tukové tkáni bylo počítáno ve světelném 37

mikroskopu (Motic BA310) jako počet značených buněk ve třech zorných polích při zvětšení 10x40. Z krevního séra byly vyšetřovány hladiny celkového bilirubinu, neesterifikovaných mastných kyselin (NEMK) a β-hydroxybutyrátu (BHB) pomocí automatického analyzátoru Cobas Mira (ROCHE, Switzerland). Statistická analýza byla provedena v programu KyPlot (v. 2.0 beta 15, Koichi Yoshioka, Japan). Rozdíly v obsahu tukových buněk v rámci celé skupiny zvířat jak před tak po porodu byly prověřeny Kruskal-Wallisovým testem. Posouzení rozdílu v obsahu adipocytů před a po porodu u jednotlivých dojnic a porovnání parametrů krve u skupiny před a po porodu bylo provedeno neparametrickým Mann-Whitneyovým testem. Vazba mezi jednotlivými parametry byla testována Spearmannovým korelačním testem. Výsledky a diskuze Vzhledem k náročné optimalizaci IHC metody nejsou k termínu odevzdání příspěvku k dispozici ještě všechny výsledky a ve sdělení jsou prezentovány pouze dílčí výsledky od 8 dojnic. Další výstupy, včetně počtu makrofágů v řezu tukové tkáně stanovený pomocí IHC metody, budou zpracovány do vlastní prezentace na konferenci. Charakteristika pokusné skupiny je shrnuta v tabulce 1. Výsledky morfometrie adipocytů podkoţní tukové tkáně pokusných zvířat jsou prezentovány v tabulce 2, sledované parametry krve u těchto zvířat pak v tabulce 3. Tabulka 1 Charakteristika pokusných zvířat před a po porodu Interval mezi vyšetřením Tělesná kondice Pořadí před

rozdíl před

po

laktace porodem porodu Průměr

před

a po porodu porodem

Interval mezi po porodu

vyšetřeními (dny)

3,8

3,2

-0,6

5,3

8,8

14,0

0,99

0,32

0,47

0,40

2,71

2,71

0,00

Min

1

3,25

2,75

-1

2

5

14

Max

4

4,25

4,25

0

9

12

14

s

2,1

a porodem (dny)

38

Tabulka 2 Obsah adipocytů podkoţní tukové tkáně pokusných zvířat Obsah buněk před porodem (µm2)

Zvíře

Obsah buněk po porodu (µm2)

Průměr

s

Průměr

s

1

8331

3075,4

6086**

2033,6

2

5655

2284,5

5012

1587,4

3

8562

2213,8

5650***

2017,9

4

6255

1900,6

4223***

1464,4

5

5669

1862,5

6225

2254,8

6

5540

2150,6

4013**

1346,5

7

5247

2238,0

3795*

1065,6

8

6916

1665,9

4327**

1943,4

6530

2480,5

5001***

1939,4

Průměr skupiny

*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 Tabulka 3 Vybrané parametry krve pokusných zvířat Celkový bilirubin

NEMK

ß-hydroxybutyrát

(µmol/l)

(mmol/l)

(mmol/l)

před

po porodu

porodem

Před

před

porodem

po porodu

porodem

po porodu

Průměr

2,7

5,2*

0,1

0,9**

0,6

0,7

s

1,18

2,50

0,13

0,46

0,15

0,33

Min

1,8

2,3

0,01

0,27

0,32

0,26

Max

5,5

10,6

0,36

1,72

0,75

1,21

*p<0,05; **p<0,01; NEMK-neesterifikované mastné kyseliny Velikost adipocytů byla v rámci celé skupiny zvířat před a po porodu rozdílná (p<0,001), pozitivní korelace s tělesnou kondicí, která je zmiňována v literatuře (4), prokázána nebyla. U dojnic po porodu tělesná kondice klesla, případně zůstala beze změny (tabulka 1). Zároveň došlo k průkaznému zmenšení velikosti adipocytů u většiny zvířat (tabulka 2). Takový nález odpovídá odbourávání energetických rezerv z tukové tkáně v době okolo porodu, kdy dojnice sniţuje příjem krmiva a zejména s nastupující laktací se ocitá v negativní energetické balanci (2). Tento stav dokumentuje i signifikantní nárůst koncentrace NEMK mezi vyšetřeními (tabulka 3). Průkazně

39

vyšší hladina celkového bilirubinu po porodu můţe indikovat vyšší zátěţ jater, nezměněné koncentrace BHB ale ukazují na jejich zachovanou schopnost utilizovat dostupné mastné kyseliny. Závěry Předběţné výsledky ukazují výrazné zmenšení adipocytů u dojnic po porodu, coţ odpovídá zvýšené mobilizaci tukových rezerv. Souvislosti s tělesnou kondicí a biochemickými parametry krve budou ověřeny na větším souboru zvířat a zkompletovány s posouzením míry infiltrace tukové tkáně makrofágy.

Seznam literatury 1. SUMNER, JM, MCNAMARA, JP 2007: Expression of lipolytic genes in the adipose tissue of pregnant and lactating Holstein dairy cattle. Journal of Dairy Science 90:5237-5246 2. DRACKLEY, JK, DANN, HM, DOUGLAS, GN, GURETZKY, NAJ, LITHERLAND, NB, UNDERWOOD, JP, LOOR, JJ 2005: Physiological and pathological adaptations in dairy cows that may increase susceptibility to periparturient diseases and disorders. Italian Journal of Animal Science 4:323-344 3. CURAT, CA, WEGNER, V, SENGES, C, MIRANVILLE, A, TONUS, C, BUSSE, R, BOULOUMIE, A 2006: Macrophages in human visceral adipose tissue: increased accumulation in obesity and a source of resistin an visfatin. Diabetologia 49:744-747 4. STRISSEL, KJ, STANCHEVA, Z, MIYOSHI, H, PETRFIELD, JW, DEFURIA, J 2007: Adipocyte death, adipose tissue remodeling, and obesity complications. Diabetes 56:29102918

40

Studium výskytu Mycoplasma bovis v chovech skotu České republiky Jana Pospíchalová, Dagmar Zendulková, Kateřina Rosenbergová Adéla Šperlová, Alena Hekrlová Ústav infekčních chorob a epizootologie, Fakulta veterinárního lékařství Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Mycoplasma bovis představuje v současné době druhý nejzávaţnější primární mykoplazmový patogen skotu. Je rozšířena v mnoha zemích světa. Na území bývalého Československa byla Mycoplasma bovis poprvé izolována v roce 1975 ze sporadických případů (Jurmanová a kol., 1975) a pak aţ v roce 2007 (Zendulková a kol., 2007). Mycoplasma bovis je příčinou pneumonií telat, artritid, reprodukčních problémů dospělého skotu, byla prokázána v abortovaných fétech, způsobuje mastitidy (Pfützner a Sachse, 1996), keratokonjuktivitidy (Kirby a Nicholas, 1996), nově také otitidy (Lamm a kol., 2004) a neurologické příznaky (Ayling a kol., 2005). Cílem projektu je jednak přispět k hlubšímu poznání o zastoupení Mycoplasma bovis a jejím dopadu na zdraví skotu na území České republiky a současně se pokusit navrhnout moţnosti účinné antimikrobiální terapie. Materiál a metodika V období řešení projektu bylo vyšetřeno celkem 131 vzorků získaných v 21 různých chovech. Podle dostupných informací byly v těchto chovech dlouhodobě zjišťovány respirační problémy u telat a mladého skotu a v chovech mléčného skotu bylo v klinické anamnéze uváděno větší procento dojnic se zvýšeným počtem somatických buněk v mléce. K mykoplazmologickému vyšetření byly pouţity vzorky mléka, nosních a spojivkových výtěrů, výtěrů zevního zvukovodu, stěry z kořene jazyka, transtracheální laváţe a také stěr z mléčného filtru. Odběr byl prováděn pracovníky našeho ústavu nebo byly vzorky získány v rámci spolupráce s praktickými veterinárními lékaři a pracovníky firmy Pfizer, s.r.o. Vzorky byly odebírány formou pasivního monitoringu u 52 telat, vykazujících klinické příznaky respiračního onemocnění, která neodpovídala adekvátně nebo vůbec na zvolenou antibiotickou terapii, a u 23 dojnic s podezřením na subklinickou mastitidu nebo trpících chronickým zdravotním postiţením bez jiné prokázané příčiny.

41

Ke kultivačnímu vyšetření slouţily tekuté a pevné půdy pro mykoplazmata. Pro druhovou identifikaci byla vyuţita metoda nested-PCR, zaloţená na amplifikaci uvrC genu specifického pro Mycoplasma bovis. Pro stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC) vybraných antibiotik byla zvolena mikrodiluční metoda. Příprava kitů byla zadána firmě Trios, spol. s. r. o. Soubor testovaných antibiotik byl vybrán na základě studií zahraničních autorů, obdobně vyšetřovaných mikrodiluční metodou nebo dříve pouţívanou diskovou difuzní metodou. Výsledky Mycoplasma bovis jsme prokázali ve čtyřech chovech z 21 sledovaných (19 %). Celkový počet vyšetřených vzorků a pozitivních záchytů Mycoplasma bovis je znázorněn v tabulce 1. Tab. 1: Výsledky kultivačního a molekulárně biologického vyšetření na Mycoplasma bovis druh odebraných vzorků

celkem

počet pozitivních vzorků kultivačně1

nested-PCR

mléko

59

8

4

transtracheální laváţ

6

4

0

nosní výtěr

31

7

2

výtěr spojivky

33

3

0

výtěr zevního zvukovodu

17

0

0

stěr z kořene jazyka

2

0

0

stěr z mléčného filtru

1

0

0

celkový počet vzorků

1312

22

6

1

Za kultivačně pozitivní byly povaţovány vzorky, u nichţ byly pozorovány na pevné půdě pro

mykoplazmata typické kolonie nebo fenomén „film a tečky“. 2

Celkový počet vzorků (131) nekoresponduje se součtem vyšetření u jednotlivých druhů vzorků

(149) z důvodu analýzy některých vzorků jako směsných.

42

Byla navrţena a rozpracována metodika pro stanovení citlivosti izolovaných kmenů Mycoplasma bovis k vybraným antibiotikům mikrodiluční metodou. Tento dílčí úsek řešení projektu není prozatím ukončen a očekávané výsledky budou zpracovány během následujícího období. Závěr Během řešení tohoto projektu jsme zachytili 22 bovinních izolátů Mycoplasma spp. Metodou nested-PCR byla Mycoplasma bovis identifikována v šesti z nich. Z našich dosaţených výsledků je zřejmé, ţe Mycoplasma bovis byla prozatím častěji izolována z mléka neţ z případů respiračního onemocnění telat. Uvedené výsledky však nemusí odráţet skutečný stav, protoţe většina vzorků odebraných z respiračního traktu telat byla v závislosti na termínu řešení projektu provedena v teplém jarním a letním období, kdy infekce respiračního aparátu zdaleka nedosahují svého vrcholu. Nicméně i problematice infekcí mléčné ţlázy mykoplazmového původu je třeba věnovat zvýšenou pozornost a to nejen z hlediska moţného vzniku mastitid, ale i snadného přenosu nákazy na telata. Co se týče stanovení citlivosti Mycoplasma bovis k antibiotikům, standardizovaná metodika nebyla v odborné literatuře dosud popsána. Plánované výsledky řešení by proto po jejich dokončení mohly dílčím způsobem přispět k doplnění znalostí v oblasti terapie infekcí vyvolaných Mycoplama bovis a současně tak napomoci i klinické praxi. Literatura 1. AYLING R D, NICHOLAS R A J, WESSELLS J, HOGG R, BYRNE W. 2005: Isolation of Mycoplasma bovis from the brain tissue of calves. Vet Rec 156: 391–392. 2. JURMANOVÁ K, HÁJKOVÁ M, KREJČÍ J, CERNA J. 1975: The participation of mycoplasmas in the respiratory diseases of calves in large-capacity calf houses in the Czechoslovak Socialist Republic. Vet Med Praha 20: 583 – 593. 3. KIRBY F D, NICHOLAS R A J. 1996: Isolation of Mycoplasma bovis from bullocks eyes. Vet Rec 138: 552. 4. LAMM C G, MUNSON I, THURMOND M C, BARR B C, GEORGE L W. 2004: Mycoplasma otitis in California calves. J Vet Diagn Investig 16: 397–402. 5. PFÜTZNER H, SACHSE K. 1996: Mycoplasma bovis as an agent of mastitis, pneumonia, arthritis and genital disorders. Rev Sci Tech Off Int Epiz 15: 1477–1494. 6. ZENDULKOVÁ D, HAAS D, ROSENBERGOVÁ K, POSPÍŠIL Z, LÁNY P, BURDOVÁ E. 2007: Bacterial profile of bovine respiratory disease in young calves. Suppl Rev Rom Med Vet 2 (17): 64 43

Vznik a výskyt rozštěpu pysku a /nebo patra u prasat Iveta Putnová1, Dana Horáková1, Svetlana Odehnalová2, Ladislav Stehlík3, František Tichý1, Marcela Buchtová1 Ústav anatomie, histologie a embryologie, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno 1, Klinika chorob prasat 2, Klinika chorob psů a koček 3 Úvod Projekt je zaměřen na kraniofaciální vývoj u prasete a vznik souvisejících malformací. Důraz byl kladen především na vývoj zubů, v případě kongenitálních anomálií na rozštěp pysku a/nebo patra. Tato vrozená vývojová vada se vyskytuje relativně často v souvislosti s dalšími vadami (Wyszynsky et al, 2006) a je v případě zvířat buď sama o sobě, nebo jako komplikující faktor, neslučitelná se ţivotem. Rozštěp patra je jednou z dědičně podmíněných zdravotních poruch, které jsou sledovány v rámci kontroly dědičnosti

zdraví (kód 22658

– www. cmsch.cz).

Rozštěp pysku a/nebo patra je způsoben chybným srůstem bilaterálních obličejových výběţků ve středové linii, ale vlastní mechanizmus patogeneze jeho vzniku není dosud dobře definován. Orální rozštěpy jsou etiologicky heterogenní a na jejich vzniku se podílejí četné genetické a enviromentální faktory (Murray, 2002). Molekulární analýzy lidských pacientů s rozštěpy patra identifikovaly více neţ 20 genů podílejících se na jejich patogenezi. V rámci tohoto projektu jsme věnovali pozornost nejen analýze rozštěpových vad, ale rovněţ problematice prořezávání zubů u prasat. Důvodem byla skutečnost, ţe u rozštěpových selat byla vţdy do jisté míry narušena erupce dočasného chrupu a zejména fakt, ţe laterální řezák (i3) byl lokalizován ve všech případech aţ za linií rozštěpu. To nás vedlo k vyslovení hypotézy, ţe původ tohoto řezáku bude odlišný od řezáků uloţených meziálně (i1, i2). Materiál a metodika 1. Studium vývoje kraniofaciální oblasti prasete Embrya a féty prasat byly získány z chovu miniprasat v Liběchově. Jsou součástí sbírky embryonálního materiálu Laboratoře embryologie ţivočichů AV ČR. Pro naše účely byla vybrána tři vývojová stádia: E30, E35 a E36. Na tranzverzálních řezech kraniální oblasti embryí těchto vývojových stádií byla provedena histologická analýza a následně 3D rekonstrukce vybraných kraniofaciálních struktur (software WinSURF, 3.6).

44

2. Histopatologická analýza selat postiţených rozštěpem pysku a/nebo patra Během řešení projektu se nám podařilo získat 11 postiţených selat. Postiţení jedinci pocházeli jednak ze zmíněného chovu v Liběchově, jednak z komerčních chovů prasat. U kaţdého selete byla provedena patologicko-anatomická pitva s důrazem kladeným na kraniofaciální oblast. Byla provedena klasifikace rozštěpu s vyuţitím kritérií uţívaných v humánní medicíně, dále byl posouzen stav prořezávání dočasného chrupu. Veškeré údaje byly zaznamenány do protokolů a následně byla pořízena fotodokumentace.

3. Studium polymorfismů Z postiţených selat byly odebrány vzorky tkáně, pro zajištění izolace DNA. Genomová DNA byla izolována s vyuţitím „DNeasy Blood and Tissue Kit“ (Qiagen). Primery byly designovány s vyuţitím programu Primer-BLAST (PubMed), který je volně dostupný na internetu. Na základě dostupných údajů u jiných ţivočišných druhů, především u myši a člověka, jsme vybrali pro sledování mutací a polymorfismů u prasat několik kandidátních genů: Msx1, Shh, Tbx10, Tbx22, Lhx8, Pax9. Kandidátní geny jsou studovány s vyuţitím metody PCR (polymerase chain reaction). Roztok pro PCR obsahuje mimo DNA vzorek získaný izolací z rozštěpových (popř. kontrolních) jedinců, směs nukleotidů (dNTP), dvojici námi navrţených primerů pro jednotlivé kandidátní geny, Taq DNA polymerázu (Invitrogen), komerčně dodávaný pufr a MgCl2. PCR produkty jsou následně sekvenovány (Elisabeth Pharmacon) a analyzovány na přítomnost polymorfismů. 4. CT zobrazení kraniofaciální oblasti postiţených selat Vzhledem ke skutečnosti, ţe rozštěpové vady mohou postihovat buď pouze měkké nebo i tvrdé tkáně, provedli jsme u takto postiţených selat analýzu kostního podkladu rostrálních struktur.

45

Výsledky Na základě provedení 3D rekonstrukce kraniální oblasti horní čelisti prasete ve třech vývojových stádiích (E30, E35, E36) byla posouzena kontinuita zubní lišty horní čelisti a dále byl posouzen vývojový stupeň jednotlivých zubních základů. Ve stádiu E30 byl patrný první řezák (i1) ve stádiu zubního pupene a výrazně vyvinutý špičák (c) ve stádiu raného zubního pohárku, který byl lokalizován bezprostředně za linií fůze mediálních nosních výběţků s maxilárními výběţky. Ve stádiu E35 se navíc objevuje základ třetího (i3) řezáku ve stádiu zubního pupene, lokalizovaného rovněţ za linií fůze v těsné blízkosti špičáku. V posledním zkoumaném stádiu (E36) třetí řezák jiţ dosáhl stádia raného zubního pohárku. První řezák byl situován blízko mediánní linie v oblasti frontonazální masy, zatímco třetí řezák se nacházel za linií fůze v oblasti maxilární prominence. Analýza erupce zubů u rozštěpových prasat odhalila poruchu prořezávání prvních dvou řezáků a premolárů u těchto jedinců, zatímco laterální řezák (i3) a špičák (c) nebyly v ţádném ze sledovaných případů postiţeny a byly lokalizovány vţdy aţ za linií rozštěpu. Tyto nálezy nás vedly k závěru, ţe embryonální původ třetího řezáku je odlišný od prvního a druhého řezáku. První dva řezáky (i1, i2) se tedy zakládají v oblasti frontonazální masy, kdeţto třetí řezák má spolu se špičákem embryonální původ v maxilární prominenci. V současné

době

probíhá

molekulární

analýza

kandidátních genů u rozštěpových prasat.

Literatura Murray JC (2002): Gene/environment cause of cleft lip and/or palate. Clin. Genet, 61:248-256 Wyszynski DF, Sarkozi A, Czeizel AE (2006): Oral clefts with associated anomalies: Methodological issues. Cleft Palate Craniofac J, 43:1-6

46

Matematické modelování zatížení titanové LCP ploténky používané k přemosťující osteosyntéze fraktury femuru u miniaturních prasat MVDr. Lucie Urbanová, MVDr. Michal Crha Ph.D., MVDr. Ladislav Stehlík, Prof. MVDr. Alois Nečas, Ph.D., MBA, MVDr. Pavel Proks, MVDr. Robert Srnec, Robert Snášil, Petra Fedorová Oddělení chirurgie a ortopedie, Klinika chorob psů a koček, Fakulta Veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Cílem této studie bylo vyuţít matematicko-stochastické modelování ke stanovení sil, které způsobily selhání (zlomení) pětiděrové titanové 4,5 mm Locking Compression Plate (LCP), která byla pouţita k flexibilní pilířové osteosyntéze segmentálního defektu diafýzy femuru miniaturního prasete v experimentální studii hojení této kostní léze pomocí transplantace mezenchymových kmenových

buněk

v kombinaci

s biokompatibilními

skafoldy.

Matematicko-stochastické

modelování probíhalo s vyuţitím softwaru COMSOL Multiphysics. V klinické praxi se pouţívají různé způsoby fixace segmentálních defektů kostí, přičemţ kaţdý způsob má své výhody i nevýhody, a nebývá vţdy jednoduché zvolit na daný typ zlomeniny vhodnou metodu fixace tak, aby byl umoţněn optimální průběh hojení kosti. Kritické je zejména riziko moţného selhání implantátu v důsledku neschopnosti dostatečně odolat všem působícím silám, které nejsou dodnes u zvířat přesně popsány. V dnešní době existuje několik studií zabývajících se testováním mechanických vlastností, v ţádné z nich však dosud není jednoznačně definováno, která sloţka působících sil je zásadní příčinou případného selhání fixace fraktury. Zmíněné práce se zabývají ex vivo testováním pevnosti různých konstrukcí kost/implantát. Všechny tyto studie vyţadovaly vyrobení testovaných vzorků a pouţití zkušebního stroje pro simulaci předem určeného zatíţení dané konstrukce kost/implantát. Tento způsob testování je velmi náročný časově i materiálově, zejména proto, ţe na kaţdý typ zatíţení modelu kost/implantát je zapotřebí nového měření a nových vzorků zlomené kosti s implantátem. Proto jsme jako alternativu uvedeného mechanického testování zvolili počítačovou modelaci (známou jako matematicko-stochastické modelování), která umoţňuje vytvořit přesný 3D model kost/implantát, a ten následně podrobit deformačním testům v prostředí matematických softwarů. Snahou je, na základě takto vyvinuté metody matematického modelování, provádět computerovou simulaci selhání různých druhů konstrukce kost/implantát představujících v klinické praxi pouţívané typy osteosyntézy ploténkou (neutralizační, pilířová, kompresní), a následně určit nejpravděpodobnější typ moţného selhání implantátu v dané konstrukci. Testováním různých 47

způsobů zatíţení implantátu pomocí matematicko-stochastického modelování by bylo moţné v budoucnu nahradit drahé a časově náročné mechanické ex vivo testy konstrukce kost/implantát v laboratoři. Materiál a metodika Pro matematické modelování charakteristiky lomu implantátu byla zvolena pětiděrová titanová 4,5 mm LCP (Synthes ®) pouţívaná k flexibilní pilířové osteosyntéze segmentálního diafyzálního defektu femuru stehenní kosti miniaturního prasete pouţitého v rámci výzkumného projektu NPV II 2B06130. Po lege artis utracení zvířat byly vypreparovány nedotčené femury prasat a ex vivo na nich byl vytvořen kostní defekt, fixovaný pětiděrovou 4,5mm LCP (Synthes ®). Tento vzorek byl předán k matematickému modelování na Regionální centrum pokročilých technologií a materiálů a katedru matematické analýzy a aplikací matematiky pomocí softwaru COMSOL Multiphysics. V první fázi byl vytvořen zjednodušený 3D model výše uvedené titanové kostní ploténky fixované dvěma šrouby v nejproximálnějším a nejdistálnějším otvoru ploténky. Tento model byl dále podroben modelaci zatíţení vnějšími silami se známým rozloţením. Tento zjednodušený model byl následně zatíţen dvěma způsoby. V prvním případě byl 3 D model pětiděrové titanové 4,5 mm LCP se dvěma šrouby zatíţen tak, ţe působící síly směřovaly proti sobě (obr. 1) a paralelně s dlouhou osou ploténky. Byla stanovena výsledná deformace ploténky a barevně byly znázorněny hodnoty von Misesova napětí. Ve druhém případě byl 3 D model pětiděrové titanové 4,5 mm LCP se dvěma šrouby zatíţen tak, ţe působící síly směřovaly proti sobě, avšak šikmo (obr. 2) k dlouhé ose ploténky. I v tomto případě byla stanovena výsledná deformace ploténky a barevně byly znázorněny hodnoty von Misesova napětí. V místech, kde von Misesovo napětí překročilo kritickou mez, došlo k lomu titanového implantátu. Hodnoty von Misesova napětí, kdy překročení jeho kritické hodnoty vede ke zlomení ploténky (implantátu), jsou na matematickém modelu znázorněny barevnou škálou od modré (malé napětí) aţ po červenou barvu (velké napětí). Výsledky působení sil u takto vytvořených a zatíţených 3D matematických modelů pětiděrové titanové 4,5 mm LCP se dvěma šrouby byly makroskopicky porovnány s etalonovým vzorkem, kterým byla v reálné situaci (za podmínek in vivo) zlomená pětiděrová titanová 4,5 mm LCP, vyjmutá z femuru miniaturního prasete po selhání fixace segmentálního defektu stehenní kosti.

48

Výsledky Síly působící na model ploténky paralelně s jeho dlouhou osou vedly k symetrickému rozloţení napětí, došlo k ohybu modelu ploténky a maximálního von Misesova napětí bylo dosaţeno na vnějších okrajích otvorů modelu ploténky (obr. 1). Výsledné deformace a barevně znázorněné hodnoty von Misesova napětí na 3 D modelu pětiděrové titanové 4,5 mm LCP se dvěma šrouby, který byl zatíţen tak, ţe působící síly směřovaly proti sobě, avšak šikmo k dlouhé ose ploténky ukazuje obr. 2. Síly působící na model ploténky šikmo k jeho dlouhé ose vedly k asymetrickému rozloţení napětí. V tomto případě byla patrná tendence von Misesova napětí kumulovat se šikmo okolo prostředního otvoru modelu implantátu (obr. 2).

Obr.1: Působící síly směřující proti sobě paralelně s dlouhou osou ploténky.

Obr.2: Působící síly směřující proti sobě, avšak šikmo k dlouhé ose ploténky.

Závěr První testovaný způsob zátěţe modelu implantátu (model LCP zatíţen tak, ţe působící síly směřovaly proti sobě, paralelně k dlouhé ose ploténky) vede k symetrickému rozloţení napětí, dojde k ohybu ploténky a maximálního von Misesova napětí je dosahováno na vnějších okrajích otvorů. Toto působení zátěţe se zdá být dobře simulovatelné v laboratorních podmínkách (při zátěţovém testu) a výstup můţe tedy slouţit ke kalibraci modelu. Z výsledků druhého testovaného způsobu zátěţe modelu LCP implantátu (model zatíţen tak, ţe působící síly směřovaly proti sobě, avšak šikmo k dlouhé ose ploténky) si lze všimnout, ţe von Misesovo napětí má tendenci se kumulovat šikmo kolem středního otvoru, coţ odpovídá daleko lépe skutečným lomům, které v reálných klinických podmínkách vedou šikmo přes prostřední otvor ploténky. Podle našeho názoru by metoda matematického modelování mohla v budoucnu najít široké uplatnění při testování sil působících na implantát pouţitý pro různé typy fixace fraktur. Vyuţít matematického modelování jako relativně jednoduchou a časově nenáročnou metodu ke zjištění nejpravděpodobnějšího typu selhání daného implantátu pouţitého k fixaci určité zlomeniny by mohlo vést k rozšíření poznatků o biomechanice fraktur a tím k omezení výskytu těchto neţádoucích komplikací osteosyntéz v klinické praxi. 49

Význam parametrů oxidačního stresu u fen s tumory mléčné žlázy a efekt vybraných antioxidantů suplementovaných těmto fenám Renata Stavinohová 1, Jana Lorenzová 1 Oddělení chirurgie a ortopedie, Klinika chorob psů a koček, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brn 1 Úvod Tumory mléčné ţlázy, chirurgický zákrok a anestézie představuje velkou zátěţ pro organismus. Organismus reaguje na zátěţ zvýšením kyslíkových radikálů a tím i aktivací antioxidačních mechanismů. Zatím existuje jediná studie, která u fen s tumory mléčné ţlázy (TMŢ) sleduje zastoupení markerů antioxidačních a oxidačních mechanismů. 1 Cílem naší klinické studie bylo stanovit u zdravých a tumorem mléčné ţlázy postiţených pacientů suplementovaných vitamínem E v krmivu a ve vitamínovém doplňku (VD) další markery oxidační a antioxidační aktivity. Zajímala nás dynamika vývoje hodnot markerů oxidační a antioxidační aktivity před operací, na začátku operace, v průběhu hojení rány a po zhojení rány u fen s TMŢ. Posuzovali jsme vliv anestézie na markery oxidační a antioxidační aktivity u fen. Zajímal nás vliv oxidačního stresu na hojení rány u fen po odstranění TMŢ. Stanovovali jsme hodnoty vitamínu E v séru zdravých fen a fen s tumory mléčné ţlázy suplementovaných vitamínem E v krmivu a ve vitamínovém doplňku (VD). Zajímalo nás, zda-li je moţné markery oxidační a antioxidační aktivity více ovlivnit další suplementací vitamínem E v podobě VD. Sledovali jsme také moţný vliv suplementace vitamínu E ve VD na hojení rány po odstranění TMŢ u fen. Chtěli jsme zjistit vliv oxidačního stresu na hematologické a biochemické parametry krve u fen s TMŢ. Materiál a metodika Do klinické studie bylo zařazeno 40 fen různého plemene, pohlaví, stáří a diagnózy, kteří byli rozděleni do 5ti skupin. Feny všech skupin byly krmeny komerční granulovanou stravou, která vţdy obsahovala vitamín E. Zákrok probíhal u fen v I. a II. skupině v inhalační anestézii (isofluran), které předcházela premedikace butomidorem 0,2mg/kg, domitorem 0,1 mg/kg a propofolem 1mg/kg. Doba anestézie byla 2 hodiny. Stejná anestézie a doba anestézie byla u fen IV. skupiny. U všech pacientů jsme odebrali při diagnostice krev z vény jugularis na hematologické a biochemické vyšetření a provedli jsme vyšetření moči. Pacienti byli lační. Kaţdý pacient se při diagnostice podrobil kompletnímu klinickému vyšetření a provedlo se u něj RTG vyšetření hrudníku. Všechny vzorky tkáně mléčné ţlázy byly histologicky vyšetřeny. Vitamínový doplněk (VD) obsahoval pouze

50

α tokoferol /vitamín E, byl podáván fenám v I. a V. skupině v dávce 100 mg pro toto perorálně 1x denně. I.

skupina

zahrnovala

7

pacientek,

fen,

nekastrovaných,

různého

stáří,

s klinicky

diagnostikovaným TMŢ, bez jiného onemocnění, které byly 10 dní před operací suplementovány VD. U těchto fen byla provedena mastektomie různého rozsahu a kastrace. II. Skupina zahrnovala 8 pacientek, fen, nekastrovaných, různého stáří, s klinicky diagnostikovaným TMŢ, bez jiného onemocnění, které nebyly před operací suplementovány VD. U těchto fen byla provedena mastektomie různého rozsahu a kastrace. III. skupinu tvořilo 24 pacientek, fen, nekastrovaných i kastrovaných, do 5ti let stáří, bez tumoru mléčné ţlázy a jiného onemocnění. Feny nebyly suplementovány VD. Skupinu IV. tvořilo 6 pacientek, fen, nekastrovaných i kastrovaných, do 5ti let stáří, bez tumoru mléčné ţlázy a jiného onemocnění. U těchto fen byla provedena anestézie. Feny IV. skupiny nebyly suplementovány VD. V V. skupině bylo 14 fen, nekastrovaných i kastrovaných, do 5ti let stáří, bez tumoru mléčné ţlázy a jiného onemocnění. Těmto fenám jsme podávali VD. Markery oxidačního stresu (ORAC, TRAP, TBARS a proteinové SH skupiny) jsme stanovovaly v krevním séru, jen neproteinové SH skupiny v buněčném lyzátu (Ery masa) z 1ml stočené plné krve a v tkáních mléčné ţlázy s a bez tumoru. Markery oxidačního stresu jsme měřili ve všech skupinách. V I. skupině jsme je měřili při diagnostice, 10 dní po suplementaci vitamínem E ve VD, 14 dní po operaci. Ve II. skupině jsme je stanovovali při diagnostice a 14 dní po operaci. U III. skupiny jsme je měřili při diagnostice. U IV. skupiny jsme je měřili před anestézií a po anestézii. U V. skupiny jsme je měřili 10 dní po suplementaci vitamínem E ve VD. Marker oxidačního stresu TBARs (thiobarbituric acid reactive substance) se stanovuje spektrofotometricky. U této metody měříme koncentraci malondialdehydu vzniklého reakcí polynenasycených mastných kyselin s thiobarbiturovou kyselinou. Antioxidační kapacitu ORACu (oxygen radical absorption capacity), zaloţenou na eliminaci kyslíkových radikálů, jsme stanovovali spektrofotometricky. Celkovou antioxidační kapacitu TRAPu (total radical-trapping antioxidative potential) stanovujeme chemiluminiscenčně s vyuţitím přesně definované produkce volných radikálů v měřeném vzorku a kalibrace stabilním analogem vitaminu E (trolox). Metoda stanovení proteinových a neproteinových thiolů je zaloţena na specifických reakcích mezi kyselinou dithionitrobenzoovou a volných sulfhydrylových skupinách. Vytvoří se obarvený anion. Měří se spektrofotometricky. Koncentraci proteinových SH skupin obdrţíme po subtrakci neproteinových SH skupin z totálních SH skupin. Vitamín E jsme měřili v I., II., III. a V. skupině. V I. skupině při diagnostice a 10 dní po suplementaci VD, u II. a III. při diagnostice u V. skupiny při diagnostice a 10 dní po suplementaci VD. Tokoferol je z krevního séra extrahován technikou 51

kapalina/kapalina do nepolárního rozpouštědla (n-hexan) a stanoven metodou kapalinové chromatografie UPLC. Stočené krevní sérum jsme skladovali v mrazničce při teplotě -60°C. Převoz zamraţených vzorků probíhal v přenosné ledničce do 15 minut. Poté byly opět umístěny do mrazničky při teplotě -80°C. Výsledky Zatím jediným výsledkem studie významu parametrů oxidačního stresu u fen s tumory mléčné ţlázy a efektu vybraných antioxidantů suplementovaných těmto fenám je zjištění, ţe hojení ran u fen suplemementovaných navíc vitamínem E ve vitamínovém doplňku (VD) bylo bez komplikací na rozdíl od fen nesuplementovaných vitamínem E ve VD. Mezi nejčastější komplikace hojení rány u fen nesuplemetovaných vitamínem E ve VD patřily podkoţní hematomy (4 feny – mastektomie různého rozsahu), dehiscence rány 4 cm 10.den post op (1fena – totální unilaterální mastektomie), nekróza kůţe 5 cm 11.den post op (1 fena), exfoliace kůţe 5 cm 15. den post op (1 fena), podkoţní píštěl 11.den post op (1 fena - totální unilaterální mastektomie), pustuly 18.den post op (1 fena), lymfedém pánevních končetin 3.den post op (1 fena). Hojení ran je zdokumentováno fotografickým záznamem 1.3.7.10. a 14. den po operaci. Výsledky hojení operační rány fen po operaci tumoru mléčné ţlázy z této studie vyuţijeme do souboru pacientů (r.2006-r.2009) operovaných pro nádor mléčné lišty, u kterých si hojení ran také dokumentujeme. Další výsledky studie budou uvedeny v závěrečné zprávě a prezentovány při obhajobě grantu IGA15.12.2010. Statické zpracovaní výsledků jsme nemohli provést, protoţe ještě nemáme k dispozici výsledky analýz posledních vzorků. Analýzy posledních vzorků končí k 29.11.2010. Závěr Závěrem studie lze zatím říct, ţe i přes deklarovaný obsah vitamínu E v granulovaných krmivech má velký význam podávání vitamínu E formou vitamínového doplňku fenám před operací, protoţe dojde k pozitivnímu zlepšení hojení operační rány.

Literatura M. Szczubial, M. Kankofer, W. Lopuszynski, R. Dabrowski, J. Lipko. Oxidative stress parameters in bitches with mammary gland tumors. J.Vet. Med.A. Blackwell Verlag, Berlin, ISSN 0931-184X, 2004(51):336-340

52

Příspěvky Fakulty veterinární hygieny a ekologie

53

54

Optimalizace histochemických a imunohistochemických vyšetření pro mikroskopii potravin Matej Pospiech, Bohuslava Tremlová, Zuzana Řezáčová Lukášková, Zdeňka Randulová, Jana Geclová Ústav vegetabilních potravin a rostlinné produkce, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Úvod Při výrobě řady potravin se pouţívají různá rostlinná nebo ţivočišná aditiva, z nichţ některá mohou být riziková pro konzumenta, i kdyţ jsou schválena jako zdravotně nezávadná. V některých případech se můţe jednat o pouţití zdravotně nezávadné suroviny, která ale při špatně zvolené kombinaci můţe vést ke změně či zhoršení některých vlastností finální potraviny. Takovouto změnou můţe být například změna trvanlivosti. Dalším rizikovým faktorem jsou sloţky potravin s alergenním potenciálem (Vyhláška č. 113/2005 Sb, Směrnice, 2003). Tyto potraviny mohou u citlivých konzumentů vyvolávat neţádoucí klinické projevy alergie. U většiny alergenů nejsou známy prahové hodnoty vyvolávající neţádoucí reakce, a proto je nutné sledovat jiţ jejich minimální výskyt. Z těchto důvodů a pro kontrolu dodrţování výše uvedené legislativy je velmi důleţitý vývoj citlivých a spolehlivých metod detekce. Všeobecně uznávaný poţadavek na limit detekce alergenů v potravinách se pohybuje mezi 1 aţ 100 mg/kg (Kubík, 2007). V současnosti se na průkaz alergenů v potravinách pouţívají zejména metody imunochemické, z nichţ nejpouţívanější je metoda ELISA (Poms et al., 2004) která je pro řadu alergenů dostupná ve formě komerčních kitů. To umoţňuje i výrobcům kontrolovat vlastní výrobky. ELISA kity nebo vývoj vlastní ELISA metody je však cenově a časově náročný. Alternativní moţností detekce alergenů mohou být metody mikroskopické, kterými je moţné detekovat různé formy aditiv v potravinách. Mikroskopické postupy lze kombinovat s metodami imunologickými. Které řada autorů také doporučuje pro vyšetření potravin na různé rizikové sloţky (Tersteeg et al., 2001). Cílem projektu bylo sestavit dostupnou formu protokolů pro výrobce potravin, nebo jiná partnerské pracoviště, která mají zájem o mikroskopické vyšetření potravin se zaměřením na riziková aditiva. Jako výstup projektu byla zvolena forma webové aplikace obsahující protokoly pro vyšetření potravin (www.foodmicroscopy.com), která zájemcům umoţní výběr pro ně vhodných protokolů pro běţné mikroskopické (histochemické) metody nebo imunohistochemické metody.

55

Materiál a metodika Odběr vzorků potravin byl proveden v koncových zařízeních tak, jak jsou dodávány výrobcem konečnému spotřebiteli – ve volném prodeji, vakuově balené, balené v ochranné atmosféře anebo zmrazené. Pro určení meze detekce jednotlivých metod byly zhotoveny modelové vzorky (vepřová svalovina s přídavkem sledované příměsi) o známé koncentraci sledované příměsi. Zvolené byli koncentrace: 0,01 %, 0,1 %, 1 %, 10 %. Část vzorků byla pouţita z archivu bločků Ústavu vegetabilních potravin a rostlinné produkce FVHE VFU Brno. Vzorky byly zpracovány histologickou technikou vhodnou pro potravinářskou mikroskopii se zaléváním do parafínu, dle postupu uvedeného v manuálu metodik (Manual, 2005). Byla pouţita barvení: hematoxylin – eosin, PAS – Calleja, Lugol – Calleja, Alizarinová červeň. Vzorky pro imunohistochemické vyšetření byly zpracovány nepřímou trojstupňovou metodou avidin – biotin komplexu. Vizualizace navázaných protilátek byla provedena pomocí 3,3´diaminobenzidínu. Pozadí bylo dobarveno modifikovaným barvením dle Calleji nebo Toulidinovu modří. U devíti obarvených řezů bylo provedeno také kvalitativní histologické vyšetření při zvětšení 100x a 400x ve světelném mikroskopu Nikon Eclipce E200. Výsledky Za nález, který svědčí o přítomnosti sezamu lze povaţovat nález osemení bílé difúzní barvy tvořící můstky. Pod osemením se nachází endosperm, který je s osemením srostlý (Gassner et al., 1989). Endosperm je tvořen parenchymatickými buňkami, které jsou vyplněny mnoţstvím aleuronových zrn, stejně jako zárodečné listy. Při pouţití barvení PAS – Calleja se lze opřít také o nález růţově zbarvených pletiv sezamu. Vţdy je však nutné opírat se také o morfologické znalosti plodu sezamu. Podzemnici olejnou lze identifikovat na základě nálezu rostlinných pletiv. Mezi hlavní morfologické znaky patří tenkostěnné parenchymatické buňky, které obsahují velké mnoţství aleuronových zrn pravidelného tvaru a četná škrobová zrna v mnoţství více neţ jedno škrobové zrno na jednu parenchymatickou buňku zárodečného listu. Velikost škrobových zrn podzemnice olejné se pohybuje v rozmezí 5 – 15 μm (Gassner et al., 1989). Za pozitivní nález podzemnice olejné v potravině pomocí histochemického vyšetření lze povaţovat nález hnědě aţ černě zbarvených škrobových zrn v parenchymatických buňkách podzemnice olejné při pouţití barvení Lugol – Calleja. Z důvodu odlišení od jiného, např. kukuřičného škrobu, je ale nevyhnutelné se opřít také o morfologické znalosti pletiv podzemnice olejné. Kostní úlomky lze v potravinách ţivočišného původu stanovit několika cílenými barveními. Mezi běţné postupy patří barvení dle Kossi nebo barvení Alizarinovou červení (Branscheid, 2009). 56

Pro naše účely se ukazuje jako nejvhodnější barvení Alizarinovou červení. V případě pouţití tohoto barvení jsou kostní úlomky obarveny červeně. Rostlinné bílkoviny lze pozorovat jako houbovité, srpkovité aţ krouţkovité útvary, které jsou doprovázené malými zbytky polysacharidů. Pšeničná bílkovina vytváří v masných výrobcích houbovité struktury s otvory a nepatrnými zbytky škrobu, čímţ ji lze odlišit od jiných rostlinných bílkovin. V případě kombinace histochemického vyšetření s imunohistochemickým vyšetřením lze prokázat pšeničnou bílkovinu na základě specifické hnědé reakce na pšeničné bílkovině. Závěr Mikroskopie představuje účinný a v mnohých případech nenahraditelný nástroj pro získání potřebných informací o potravině. Nemusí se přitom vţdy jednat jenom o průkaz rizikových sloţek. Nezanedbatelné jsou také informace, které lze získat o struktuře či sloţení potravin. Díky finanční podpoře IGA 86/2010/FVHE se podařilo vytvořit dostupnou formu pro zájemce v oblasti bezpečnosti potravin nebo také pro samotné výrobce www.foodmicroscopy.com.

Seznam literatury: Branscheid W., Judas M., Höreth R. (2009) The morphological detection of bone and cartilage particles in mechanically separated meat. Meat Science, vol. 81, no. 1, p 46–50. Gassner G. et al. Mikroskopische Untersuchung Pflanzlicher Lebensmittel. 5st. ed. Stuttgart: Gustav Fischer Verlag, 1989, 414 p. Kubík M. Laboratorní kontrola přítomnosti alergenů v potravinách. Výživa a potraviny, 2007, roč. 62, č. 4, s. 111. Manuál metodik pro histologii potravin. Laboratoř pro histologii potravin, VFU Brno, 2005, 38 s. Poms R.E., Klein C.L., Anklam E. Methods for allergen analysis in food: a review. Food Additives and Contaminants, 2004, vol. 21, no. 1, p. 1–31. Smernica Európskeho parlamentu a Rady 2003/89/ES z 10. novembra 2003, ktorou sa mení a dopĺňa smernica 2000/13/ES pokiaľ ide o označovanie zloţiek prítomných v potravinách . Úradný vestník L 308, 25.11.2003 s. 0015 – 0018. Tersteeg M.H.G., Koolmees P.A. and van Knapen F. (2001): Immunohistochemical detection of brain tissue in heated meat products. Meat science, vol. 61, p. 67–72. Vyhláška č. 113/2005 Sb., o způsobu označování potravin a tabákových. Sbírka zákonů, 2005 č. 37, s. 1163 – 1176.

57

Využití moderních instrumentálních analytických metod pro hodnocení fyzikálně-chemických parametrů medu a mléka z hlediska jakosti a zdravotní nezávadnosti pro spotřebitele Zuzana Procházková, Lenka Ruprichová, Daniel Vlkovič, Ivana Borkovcová, Michaela Dračková, Lenka Vorlová Ústav hygieny a technologie mléka, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Konvenční metody pouţívané ke stanovení fyzikálně-chemických parametrů mléka i medu jsou časově náročné, pracné, finančně nákladné a vyţadují vysoce kvalifikovaný personál. Blízká infračervená spektrometrie (FT-NIR) je moderní, nedestruktivní a rychlá metoda, která nevyţaduje sloţitou přípravu vzorku. I přes své mimořádné výhody jde o metodu sensitivní, umoţňující simultánní stanovení mnoha parametrů (Prieto et al., 2006). Alergie na mléko a mléčné výrobky se v dnešní době objevuje stále častěji, zejména u dětí. Mezi hlavní alergeny mléka patří kaseiny, α-laktalbumin a β-laktoglobulin. Dosavadní léčba potravinových alergií se orientuje vyřazení potraviny z jídelníčku. Publikované výsledky však naznačují, ţe právě postupné zvyšování dávek mléka vede u dětí k celkové adaptaci (Skripak et al., 2008). To je jeden z důvodů proč je důleţité znát obsah alergenů v různých druzích mléka. Rozbor medu stanovením jeho parametrů umoţňuje přehled o jakosti, zdravotní nezávadnosti, ale i porušení, resp. falšování medu. Zároveň poukazuje na kvalitu včelařské praxe daného včelaře. Komerční rozbory medu se zaměřují převáţně na stanovení legislativních parametrů (HMF, obsah vody, kyselost medu, případně další). Spotřebitel se však orientuje podle senzorických vlastností, zejména barvy medu. Tento ukazatel však můţe být ovlivněn obsahem HMF, coţ představuje v mnoha ohledech potenciální riziko. Cílem tohoto projektu je vyuţití moderní rychlé instrumentální metody FT-NIR spektrometrie pro stanovení specifických analytů významných z hlediska jakosti a zdravotní bezpečnosti ve výše uvedených komoditách. Pro úspěšné vyuţití FT-NIR spektrometrie v praxi se přístroj kalibruje s vyuţitím hodnot získaných metodou HPLC. Tato časově a finančně nákladná metoda je v současnosti nahrazována modernější metodou UPLC, kde je významným pozitivem výrazná úspora času a sníţení nákladů. Uvedenými metodami byly stanoveny tyto analyty: α–laktalbumin, β-laktoglobulin a kaseiny v mléce, elektrická vodivost, obsah vody, obsah HMF v medu.

58

Materiál a metodika Vzorky medu a mléka Vzorky medu (n = 42) pocházely od včelařů z Brna a okolí a z brněnské trţní sítě. Vzorky z trţní sítě byly dále rozděleny na vzorky ze supermarketů a na vzorky ze včelařských prodejen a z prodejen zdravé výţivy. Mezi vzorky byly medy květové, medovicové i smíšené. Vzorky syrového kravského mléka (n = 40) byly získány z mlékomatů umístěných v Brně a okolí, část vzorků z Českých Budějovic. Vzorky syrového kozího mléka (n = 40) pocházely z kozí farmy v Jihomoravském kraji. Vzorky syrového ovčího mléka (n = 40) pocházely z farmy ve zlínském kraji. Analýza vzorků medu U vzorků medů byly stanoveny parametry: elektrická vodivost, obsah vody, obsah HMF (HPLC), titrační kyselost a aktivita diastasy, dle metod popsaných v Harmonizovaných metodách mezinárodní komise pro med (Bogdanov, 2002). Pro obsah HMF byla zavedena metoda stanovení pomocí UPLC. U vzorků byla stanovena barva a zavedena metoda pro stanovení sacharidového spektra pomocí HPLC. Získané hodnoty byly porovnány s výsledky mikrospické pylové analýzy. Analýza vzorků mléka Ke stanovení α–laktalbuminu a β–laktoglobulinu byla pouţita metoda HPLC (kapalinový chromatograf Alliance 2695 s PDA 2996 detektorem) (Waters, USA) s kolonou X Bridge TM C18, 150 x 3,0 mm, 3,5 µm (Waters, Ireland). Teplota kolony byla 40 °C. Mobilní fáze A obsahovala vodu/acetonitril/trifluoroctovou kyselinu (TFA) v poměru 95/5/0,1 (v/v/v) a mobilní fáze B vodu/acetonitril/TFA v poměru 5/95/0,1 (v/v/v). Bylo pouţito gradientové eluce a průtoku mobilní fáze 0,4 ml.min-1. Detekce byla prováděna při 205 nm. Analýza probíhala 35 minut a velikost nástřiku byla 10 µl. Analýza kaseinů se lišila v teplotě kolony, která byla 45 °C, velikosti nástřiku 5 µl a době analýzy 20 min. FT-NIR analýza Měření vzorků medu a mléka probíhalo při 20 °C, po důkladné homogenizaci vzorku. Spektra byla měřena na integrační sféře v reţimu reflektance s pouţitím transflektanční kyvety o tloušťce vrstvy 0,5 mm pro med a 0,1 mm pro mléko. Kaţdý vzorek medu i mléka byl změřen třikrát a pro kalibraci bylo pouţito průměrné spektrum. NIR spektra byla měřena na spektrometru Nicolet Antaris Near – IR Analyzer (Thermo Elektron Corporation, Madison, USA) ve spektrálním rozsahu 10 000 – 4 000 cm-1 se 100 scany se spektrálním rozlišením 8. Naměřená data byla zpracována pomocí programu TQ Analyst verze 6.2.1.509 metodou částečných nejmenších čtverců (PLS) a ověřena pomocí kříţové validace s pouţitím stejné sady vzorků jako při kalibraci. Pomocí programu 59

Microsoft Excel 2007 byly u všech referenčních ukazatelů vypočteny základní statistické charakteristiky (průměr, směrodatná odchylka, minimum, maximum). Výsledky Celkový obsah syrovátkových bílkovin s alergenním potenciálem byl nejniţší v kozím mléce 4,34 g.l-1, dále pak v kravském mléce 5,26 g.l-1 a nejvyšší koncentrace byla naměřena v ovčím mléce 6,92 g.l-1. Celkový obsah kaseinů byl nejvyšší v kozím mléce 6,04 g.l-1. U ovčího mléka, jehoţ obsah činil 4,38 g.l-1 nebyl v porovnání s kravským mlékem 4,11 g.l-1 významný rozdíl v koncentraci. Pro stanovení bílkovin byla zavedena metoda extrémně účinné kapalinové chromatografie. Obsah HMF (HPLC, UPLC) se pohyboval od 0,89 do 85,25 mg.kg-1. Obsah vody byl naměřen v rozmezí 14,6 aţ 21,4 %, vodivost se pohybovala mezi 9,5 aţ 101,7 mS.m -1, a vodní aktivita mezi 0,362 aţ 0,489. Titrační kyselost měla hodnoty od 9 do 44 mekv.kg-1 a pH od 3,56 do 4,39. Aktivita diastasy, aţ na výjimky, korespondovala s obsahem HMF a pohybovala se v rozmezí od 3,5 do 20,5 DN. Obsah fruktosy se měnil od 35 do 41 %, glukosy pak od 26 do 33 %. Obsah ostatních sacharidů se pohybovaly od 8 do 12 %. Barva medu se měřila ve dvou stupnicích (US a Pfundově). Rozsah v závislosti na druhu medu byl od US 1 do US 6 a od 6 Pfundů do 86 Pfundů. Po kalibraci FT-NIR spektrometru byly získány spolehlivé kalibrační modely pro α-laktalbumin a β-laktoglobulin kravského mléka, ostatní kalibrační modely byly posouzeny jako nespolehlivé, i přes vyuţití předchozí úpravy dat. U medu byly získány spolehlivé kalibrační výsledky pro parametry obsah vody, aktivita vody, pH. Závěr Bylo provedeno stanovení specifických parametrů medu a mléka se zaměřením na jakost a zdravotní nezávadnost a to jak metodami standardními, tak pomocí FT-NIR spektrometrie. Z výsledků vyplývá, ţe FT-NIR spektrometrie je metoda vhodná pro stanovení pouze některých parametrů. V těchto případech poskytuje moţnost rychlého jednoduchého stanovení s přesnými výsledky. U některých analytů nebylo dosaţeno spolehlivých výsledků, coţ je způsobeno především výběrem souboru dat, kdy u ryze přírodních substancí, jako je mléko a med není moţné zaručit, ţe ve vybraném souboru budou hodnoty analytů rovnoměrně zastoupeny. Vznikají tak velké odchylky, které by mohly být odstraněny doplněním souboru dat o další vzorky tak, aby bylo rozpětí hodnot rovnoměrněji pokryto. Poděkování Práce vznikla za finanční podpory Interní grantové agentury VFU Brno 72/2010/FVHE 60

Studium obsahu mastných kyselin/sodíku u vybraných tepelně opracovaných a fermentovaných masných výrobků na trhu v ČR a EU vzhledem k možným zdravotním nebo nutričním tvrzením Pavla Steinhauserová1, Radka Hulánková2, Jiří Ruprich1,3 Ústav hygieny a technologie mléka1, masa2, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Dislokované pracoviště v Brně, Státní zdravotní ústav Praha3 Úvod V ČR přetrvává tradiční a relativně vysoká spotřeba masných výrobků. Potraviny ţivočišného původu a zejména masné výrobky jsou často povaţovány za bohatý zdroj tuku (zejména nasycených mastných kyselin - SFA) a sodíku, tedy látek, které jsou při jejich vyšším přívodu spojovány s rozvojem civilizačních onemocnění (kardiovaskulární onemocnění, obezita, hypertenze aj.). Tato povaha můţe v očích veřejnosti diskreditovat produkci potravin ţivočišného původu. Proto se v dnešní době na trhu objevují výrobky deklarující příznivé zdravotní působení, či lepší „nutriční profil“. Za příklad lze povaţovat fermentovaná masa pocházejících ze španělských iberských prasat, kde je propagován vyšší obsah zdravotně cenných mono a polynenasycených mastných kyselin (MUFA a PUFA). Cílem projektu proto bylo provést analýzu obsahu mastných kyselin (MK) a sodíku (Na) ve skupině 60 trvanlivých fermentovaných masných výrobků (TFMV) a vybraných tepelně opracovaných masných výrobků (TOMV), popsat význam výsledků a případné rozdíly mezi typy výrobků původem z ČR a EU. Vzhledem ke sdruţení finančních prostředků se Státním zdravotním ústavem v Brně bylo celkem analyzováno 94 vzorků. V této práci je vyhodnoceno zatím 70 vzorků. Materiál V šesti hlavních obchodních řetězcích na trhu v ČR bylo zakoupeno celkem 94 vzorků masných výrobků pocházejících ze zemí: Španělsko (18), Itálie (17), Slovinsko (1), Slovenská republika (1), Rakousko (7), Německo (5), Maďarsko (3), Francie (3) a Česká republika (39). Tři specifické výrobky z iberských prasat byly pořízeny z internetového zdroje a do laboratoře zaslány, další tři byly zakoupeny přímo ve Španělsku. Všechny výrobky byly označeny a rozděleny do 3 skupin a 6 podskupin dle několika kritérií (viz. Tabulka č. 1).

61

Metodika Informace uvedené na obalu analyzovaných výrobků byly zaznamenány v databázi, která byla pouţita i pro naměřené hodnoty MK a Na. Vzorky byly analyzovány v laboratoři Státního zdravotního ústavu v Brně. Pro stanovení MK i Na byly pouţity akreditované metody dle ČSN-ENISO/IEC 17025 (SOP CH_33 a CH_60). Ze vzorku byl extrahován tuk a zmýdelněné triacylglyceroly byly reesterifikovány methanolem na methylestery MK. Následně bylo provedeno stanovení 37 individuí MK (výčet viz standard Supelco 37 Component FAME Mix) metodou plynové chromatografie (separace na kapilární koloně 100m x 0,25mm x 0,2µm – Supelco SPTM2560) s plamenoionizační detekcí (GC-FID; Trace, TemoQuest Italy). Tabulka č. 1 – Charakter a počet jednotlivých analyzovaných masných výrobků. Označe Skupina

Podskupina

ní

Počet vzorků

Česká produkce

I - CZ

4

Zahraniční produkce

I - EU

13

Původ v zahraničí / prodej v ČR

II - EU

36

Původ i prodej v ČR

II - CZ

23

S tvrzením

III - A

13

Bez tvrzení

III - B

5

Fermentovaná sušená masa Trvanlivé fermentované masné výrobky (TFMV) Masné výrobky TFMV a TOMV

Celkem vzorků

94

Pro stanovení obsahu Na byla pouţita akreditovaná metoda AAS-FT (SOP CH_12). Vzorek byl po rozkladu a smísení s roztokem 0,2% chloridu draselného zmlţován do plamene acelylen-vzduch a měřena jeho emise při vlnové délce 589,6 nm. Výsledky byly hodnoceny běţnými statistickými metodami. Hodnoty pro jednotlivé MK byly sečteny dle charakteru jejich nasycení (vlivu na lidské zdraví) do skupin SFA (17), MUFA (9), PUFA (11). Pro relativní posouzení procentuálního zastoupení jednotlivých skupin MK byl proveden přepočet vzhledem k sumě MK = 100% . Výsledky Analyzované vzorky obsahovaly velmi široké rozmezí sodíku (6,8 – 28,8 g/kg). Stejně tak tomu bylo u celkového obsahu tuku (14,1 – 506,5 g/kg) (viz. Tabulka č. 2).

62

Tabulka č. 2 – Rozmezí procentuálního zastoupení jednotlivých skupin MK a naměřené množství ∑ MK a Na. Jednotka

Rozmezí - relativní množství v %

[g/kg vzorku]

[g/kg vzorku]

N*

∑ MK

SFA

MUFA

PUFA

Na

I - CZ

4

38,6 – 503,2

38 - 41

43 - 56

6 - 17

12,7 - 22,8

I - EU

12

61,9 – 278,9

33 - 41

49 - 58

4 - 14

13,0 – 22,3

II - CZ

12

260,7 – 465,7

38 - 43

46 - 50

9 - 13

12,6 – 19,7

II - EU

28

18,5 – 506,5

35 - 55

43 - 55

2 - 16

9,1 – 28,8

III - A

10

14,1 – 390,5

18 - 47

20 - 58

2 - 61

6,8 – 18,6

III - B

4

33,4 – 386,4

10 - 46

16 - 53

1 - 74

8,8 – 20,7

Skupina

**7 Celkem

0

(**70 = počet vyhodnocených vzorků z celkového mnoţství 94 vzorků)

* N – Počet vyhodnocených vzorků

V analyzovaných vzorcích dominovaly kyselina palmitová a stearová (SFA), olejová (MUFA) a linolová (PUFA). Zdravotně nejvýhodnější zastoupení jednotlivých skupin MK bylo zjištěno u kuřecí prsní šunky (10 % SFA a 74 % PUFA), včetně relativně nízkého obsahu tuku - 3,3 %. Tabulka č. 3 uvádí srovnání mezi vybranými fermentovanými masy (tzv. sušené syrové šunky) pocházejících ze zemí EU a ČR. Při porovnání je zřetelné, ţe tyto výrobky produkované v ČR mají vyšší procentuální zastoupení PUFA neţ např. iberské šunky, coţ je překvapivé, vzhledem k obvyklé reklamě a povědomí. Mnoţství MUFA je mírně sníţeno. Tyto výrobky ale obecně obsahují poměrně hodně Na, coţ je dáno specifickou technologií výroby. Tabulka č. 3 – Zastoupení jednotlivých skupin MK a Na ve vybraných vzorcích skupin „sušených syrových šunek“ Naměřená koncentrace

(g/kg

(g/kg vzorku) ∑

SKUPI VZOREK - MASNÝ VÝROBEK

NA

SFA

∑ MUFA

%

∑

∑

PUFA

MK *

vzorku)

SFA / MUFA / PUFA

Sodík

PRSCIUTTO DI PARMA

I - EU

52,6

76,6

15,1

144,3

36 / 53 / 10

13,6

KRAŠKI PRŠUT

I - EU

65,6

82,6

11,2

159,5

41 / 52 / 7

15,4

SERÁNSKÁ ŠUNKA

I - EU

62,8

92,5

22,7

178,1

35 / 52 / 13

14,8

IBERSKÁ ŠUNKA BELLOTA

I - EU

80,0

142,4

21,3

243,7

33 / 58 / 9

16,2

IBERSKÁ ŠUNKA - PATA NEGRA I.

I - EU

95,3

142,2

10,9

248,4

38 / 57 / 4

16,8

IBERSKÁ ŠUNKA RECEBO

I - EU

104,7

153,8

19,4

277,9

38 / 55 / 7

13,0

PRŠUT PEČENĚ

I - CZ

14,5

21,7

2,4

38,6

38 / 56 / 6

22,8

PRŠUT KRKOVICE

I - CZ

78,8

83,3

30,3

192,4

41 / 43 / 16

20,1

PRŠUT BOK

I - CZ

196,4

222,3

84,4

503,2

39 / 44 / 17

18,4

* Suma MK odpovídá při přepočtu na % množství tuku v analyzovaném vzorku

63

V tabulce č. 4 jsou uvedeny některé masné výrobky, nesoucí na svém obalu nutriční tvrzení, týkající se tuku – „light“, „fitness“, „se sníţeným mnoţstvím tuku“, „ s přídavkem omega 3 MK“. U všech analyzovaných výrobků s tvrzením, v porovnání s výrobky bez nich, bylo detekováno sníţené mnoţství tuku, jak bylo deklarováno na obale. Pouze u výrobku Poličan Fit bylo mnoţství tuku mírně výšší, mnoţství PUFA však odpovídalo tvrzení. Tabulka č. 4 – Zastoupení jednotlivých skupin MK a Na ve skupině výrobků s uvedeným nutričním tvrzením Naměřená koncentrace (g/kg

(g/kg

vzorku) SKUP VZOREK - MASNÝ VÝROBEK FITNESS KUŘECÍ PRSNÍ ŠUNKA

INA

∑

∑

SFA

PUFA

% ∑

MUFA

∑ MK

vzorku)

SFA / MUFA / PUFA

Sodík

III - A

3,9

13,3

4,8

21,9

18 / 22 / 61

8,1

KUŘECÍ PRSNÍ ŠUNKA

III - B

3,4

24,7

5,2

33,4

10 / 16 / 74

8,8

TYROLSKÁ "KARÉ" ŠUNKA LIGHT

III - A

21,9

6,9

28,5

57,3

38 / 50 / 12

17,2

TYROLSKÁ "KARÉ" ŠUNKA

III - B

81,2

24,5

86,8

192,6

42 / 45 / 13

20,7

FITNESS PÁRKY EXTRA

III - A

56,1

12,0

65,7

133,8

42 / 49 / 9

8,8

JEMNÉ PÁRKY

III - B

97,2

1,1

111,6 209,8

46 / 53 / 1

9,0

POLIČAN – FIT (+ omega 3 MK)

III - A

160,7

46,6

183,3 390,5

41 / 47 / 12

15,1

POLIČAN I.

III - B

159,5

41,7

185,6 386,4

41 / 48 / 11

14,2

Závěr Výsledky překvapivě ukázaly, ţe tuzemská fermentovaná masa mají podobné zastoupení MK, jako výrobky typu Iberská šunka, i kdyţ mají mírně vyšší obsah sodíku. U výrobků nesoucích nutriční tvrzení se prokázala poměrně dobrá shoda mezi tvrzením a reálným obsahem MK a sodíku.

64

Stanovení biologicky aktivních látek u vybraných produktů rostlinného původu Alexandra Tauferová, Bohuslava Tremlová, Vladimír Paţout, Martina Ošťádalová, Pavel Bartl, Jana Pokorná, Zdeňka Randulová Ústav vegetabilních potravin a rostlinné produkce, Fakulta veterinární hygieny ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Úvod Projekt byl zaměřen na analýzu významných chemických látek u vybraných druhů červených pšenic, pochutin (čaj, káva) a vybraných výrobků ze zeleniny (kečupy a zeleninové omáčky). U uvedených komodit jsme analyzovali purinové alkaloidy, polyfenolické látky a barviva přirozeně se vyskytující anebo vzniklá technologickým opracováním. Tyto látky mají aktivní vztah nejen ke zdraví spotřebitele, ale také mohou být významným indikátorem kvality surovin a výrobků, včetně respektování správnosti technologie výroby. Cílem projektu tedy bylo navrhnout vhodné metody pro detekci a identifikaci vybraných technologicky, hygienicky a zdravotně významných analytů v produktech rostlinného původu. Jednalo se zejména o přírodní a ne zcela snadno identifikovatelná barviva (flavonoidy v obilovinách, karotenoidy a flavonoidy v zeleninových výrobcích a čaji, thearubiginy a theaflaviny v čajích), purinové alkaloidy (kofein, theofylin, v čaji, kávě), polyfenolické látky (k. chlorogenová).

Metodika Při přípravě metod jsme vycházeli z informací, které byly publikovány a ověřeny v odborné literatuře. Tyto metody jsme inovovali nejen pro podmínky naší laboratoře, ale i pro jejich rutinní vyuţití pro výše uvedené suroviny a potraviny rostlinného původu. Mimo analytické metody, které jsou na ústavu pouţívané (UV-VIS spektrofotometrie) jsme vyuţili metodu TLC pro separaci a průkaz barviv, zejména v čaji. Metodu HPLC jsme zavedli v rámci spolupráce s Ústavem přírodních léčiv na Farmaceutické fakultě, zejména pro stanovení flavonoidních barviv, konkrétně antokyanů v barevných odrůdách pšenice. Částečně jsme vyuţili také metodu obrazové analýzy pro stanovení barviv v obilném zrnu za pouţití softwaru ACC, verze 6.1. V rámci našeho výzkumu jsme se tedy zaměřili na metody, kterými lze stanovit významná barviva, a to antokyany v barevných pšenicích, dále flavonoidní barviva - theaflaviny a thearubiginy v čaji, kyselinu chlorogenovou ze skupiny polyfenolů v kávě a karotenoidů v rajčatech, kečupech a čaji. Dále jsme inovovali metodu stanovení kofeinu a teofylinu v kávě a čaji (listovém i instantním). 65

Vlastní měření zahrnovalo kalibrace, analýzu standardů a následnou realizaci na vybraných rostlinných extraktech. Výsledky Výsledky projektu vyplynuly z realizace několika etap. Při předprojektové přípravě byly vybrány cílové komponenty a vhodné produkty, na základě studia tuzemské i zahraniční literatury a také dosavadních zkušeností byly navrţeny vhodné druhy metod, byla provedena jejich realizace a ověřování. Naše výsledky, získané v rámci projektu IGA 75/2010/FVHE, jsme publikovali na odborných konferencích. Citace jsou uvedeny níţe. Bartl, P., Tremlová, B., Randulová, Z., Ošťádalová, M.: Significance of anthocyanins and their determination in blue and purple coloured wheat. In Pigments in Food. Budapest, Hungary: Hungarian Chemical Society, 2010, p. 124 - 126. (IGA 75/2010/FVHE) Trojan, V., Bartl, P., Musilová, M., Vyhnálek, T., Martinek, P., Tremlová, B.: Barevné pšenice – genetika, šlechtění a potravinářské vyuţití. In Hygiena Alimentorum XXXI, Slovensko: Štrbské pleso, 2010, p. 335 – 337. (IGA 75/2010/FVHE) Bartl, P., Tremlová, B., Ţďárský, M., Randulová, Z., Ošťádalová, M.: Stanovení antokyanů v potravinách rostlinného původu. In Hygiena a technologie potravin – XL. Lenfeldovy a Höklovy dny. Česká republika: Brno, 2010, p. 67 – 70. (IGA 75/2010/FVHE) Ošťádalová, M., Paţout, V., Straka, I., Bartl, P.: Determination of basic pigments – theaflavins and thearubigins in commercial teas. In Pigments in Food. Budapest, Hungary: Hungarian Chemical Society, 2010, p. 275 - 277. (IGA 75/2010/FVHE) Ošťádalová, M., Paţout, V., Straka, I., Bartl, P.: Porovnání theaflavinů a thearubiginů u vybraných druhů sypaných a porcovaných komerčních čajů metodami UV- VIS spektrofotometrie a tenkovrstvé chromatografie. In Hygiena a technologie potravin – XL. Lenfeldovy a Höklovy dny. Česká republika: Brno, 2010, p. 131 – 134. (IGA 75/2010/FVHE) Tauferová, A., Tremlová, B., Straka, I., Pokorná, J.: Occurrence of Carotenoid Pigments in Tomato Ketchups. In Pigments in Food. Budapest, Hungary: Hungarian Chemical Society, 2010, p. 334 - 336. (IGA 75/2010/FVHE) Tauferová, A., Tremlová, B., Straka, I., Pokorná, J.: Stanovení karotenů a xanthofylů v rajčatových kečupech. (Determination of Carotenes and Xanthophylls in Tomato Ketchups). In XII. konference mladých vědeckých pracovníků s mezinárodní účastí. Brno: VFU Brno, 2010, s. 63–66. (IGA 75/2010/FVHE) 66

Pokorná, J., Straka, I., Paţout, V., Tauferová, A.: The Occurrence of Chlorogenic Acid in Green and Roasted Coffee Beans. In Pigments in Food. Budapest, Hungary: Hungarian Chemical Society, 2010, p. 286 - 288. (IGA 75/2010/FVHE) Pokorná, J., Paţout, V., Straka, I.: Výskyt diterpenů kofeolu a kofestolu v zelených a praţených kávových bobech. (The Occurence of Diterpenes Kahweol and Cafestol in Green and Roasted Coffee Beans). In Food Hygiene and Technology 40th Lenfeld´s and Hökl´s Days, 2010, Brno, s. 147 – 150. (IGA 75/2010/FVHE) Dále jsme připravili odborné články do speciálního vydání časopisu Journal of Food Composition and Analysis, které nyní čekají na vyjádření editora. Jedná se o následující publikace: BARTL, P., TREMLOVÁ, B., TAUFEROVÁ, A., OŠŤÁDALOVÁ, M., ŠMEJKAL, K., ŢĎÁRSKÝ, M., DVOŘÁK, P.: Significance of Anthocyanins and Their Determination in Blue and Purple Coloured Wheat OŠŤÁDALOVÁ, M., PAŢOUT, V., STRAKA, I., BARTL, P., POKORNÁ, J., TAUFEROVÁ, A.: Monitoring Tea Pigments of Theaflavins and Thearubigins in Dependence on the Method and Duration of Storage. POKORNÁ, J., PAŢOUT, V., STRAKA, I., TAUFEROVÁ, A., OŠŤÁDALOVÁ, M., BARTL, P. The Significance of Chlorogenic Acid in Green and Roasted Coffee Beans. TAUFEROVÁ, A., TREMLOVÁ, B., STRAKA, I., POKORNÁ, J., OŠŤÁDALOVÁ, M., BARTL, P.: Ketchup – The Source of Bioactive Carotenoids. Další výsledky, které se týkají zejména analýzy purinových alkaloidů, antokyanů a polymerů, vzniklých při Maillardově reakci při praţení kávy, nyní zpracováváme a plánujeme publikovat ve vybraných časopisech ve formě odborného článku. Závěr Hlavní náplní projektu byla realizace navrţených metod detekce a stanovení, a proto je hlavním výsledkem předloţení metod pro identifikaci vybraných součástí rostlinných produktů. Po výběru surovin a potravin jsme vytvořili modifikace metod, které umoţnily rychlejší a snadnější získání výsledků. Tyto výsledky slouţí jako kriteria k posouzení jakosti výstupních surovin či finálních produktů, včetně jejich způsobených změn v průběhu manipulace či skladování. Na základě ověření vhodnosti a pouţitelnosti našich metod, podpořené jak provedeným výzkumem, tak i publikovanými údaji z literatury, předpokládáme jejich vyuţitelnost i pro analýzu dalších komodit rostlinného původu. 67

Indikace čerstvosti kuřecího masa baleného v modifikované atmosféře prostřednictvím analýzy organických těkavých látek Jana Tománková Ústav hygieny a technologie masa, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod S ohledem na stále se zvyšující nároky spotřebitelů ve vztahu k jakosti a hygieně balených potravin, dochází k vývoji nových analytických postupů pro detekci negativních jakostních změn u těchto potravin. Jedním z moderních způsobů indikace čerstvosti syrového drůbeţího masa baleného v modifikované atmosféře je kvalitativní a kvantitativní analýza organických látek obsaţených v modifikované atmosféře obklopující balené maso. Cílem práce bylo zjištění pouţitelnosti této metody pro stanovování čerstvosti a hygienické úrovně baleného kuřecího masa a vnitřností. Materiál a metodika Materiál: Celkem bylo analyzováno 72 vzorků balených kuřecích zadních čtvrtí a 72 vzorků balených kuřecích jater. Materiál určený pro balení byl odebrán bezprostředně po vychlazení a rozporcování ve standardním zpracovatelském podniku. Polovina vzorků byla zabalena do modifikované atmosféry obsahující 70 % O2 a 30 % CO2; druhá polovina vzorků byla zabalena do modifikované atmosféry obsahující 70 % Ar a 30 % CO2. Vzorky byly baleny do obalů vyrobených z materiálu s vynikajícími bariérovými vlastnostmi - AMILEN-OX 80 EVOH EVA (VF Verpackungen GmbH, Kempten, Německo). Zabalené vzorky byly chladírensky skladovány při teplotě +4 °C ± 1 °C. Mikrobiologická analýza: U vzorků byly stanovovány následující mikrobiologické parametry: CPM (ISO 4833), psychrotrofní mikroorganismy (ISO 17410), bakterie mléčného kvašení (ISO 13721), Enterobacteriaceae (ISO 21528-2), Brochothrix thermosphacta (ISO 13722). Chemická analýza: Z chemických analýz byla prováděna stanovení pH, amoniaku dle Conwaye, čísla kyselosti, peroxidového čísla, TBARS destilační metodou. Změny v barevném profilu byly měřeny prostřednictvím spektrofotometru KonicaMinolta CM 2600d (KonicaMinolta, Japonsko). Nasnímaná data byla vyhodnocena v systému CIEL*a*b*: Koncentrace O2 a CO2 v modifikované atmosféře byla stanovována přístrojem Oximetr Model 2.00 (VEIT Electronics, Česká

republika).

Senzorické

hodnocení

vybraných

deskriptorů

probíhalo

za

pomoci

strukturovaných stupnic se slovním popisem kategorií. 68

Analýza organických těkavých látek obsažených v modifikované atmosféře: Stanovení obsahu a koncentrace organických těkavých látek v modifikované atmosféře probíhalo metodou podle operačního postu SOP BM 2002. Modifikovaná atmosféra z balíčku byla přes jehlu čerpadlem vháněna na sorpční trubičku s aktivním uhlím po dobu 10 min při průtoku 200 cm -3.min.1

. Desorpce zachycených sloučenin byla provedena 0,5 ml sirouhlíku. Vlastní analýza probíhala

pomocí GC/MS (plynový chromatograf HP 6890 s hmotnostním detektorem 5973 A). Technika nástřiku – byl vyuţit pulsní splitless, doba analýzy cca 60 min, teplotní gradient: 40 C výdrţ 5 min, nárůst po 10 °C do 300 °C a na 300 °C výdrţ 10 min, průtok mobilní fáze (He) 1 ml.min -1, nástřik 1 μl vzorku na kolonu. GC kolona pouţitá na analýzu: HP - 5 MS, délka 30 m, ID 0,25 mm, 0,25 μm film. Všechny analýzy probíhaly u čerstvého materiálu (vstupní data) a dále v šesti dnech v průběhu chladírenského skladování, které trvalo celkem 21 dní. Senzorické, chemické a mikrobiologické analýzy byly u kuřecích zadních čtvrtí prováděny jak u kůţe, tak i u svaloviny, která byla touto kůţí kryta. Statistické vyhodnocení získaných dat bylo prováděno za pouţití statistických analýz v rámci statistického software Statistica StatSoft, Inc. (2005). STATISTICA Cz [Softwarový systém na analýzu dat], verze 7.1. Výsledky Senzorické parametry: Zjistili jsme statisticky průkazné rozdíly v senzorické jakosti baleného masa a vnitřností, které statisticky průkazně korelují s délkou skladování. Při porovnání mezi pouţitými modifikovanými atmosférami byly zjištěny lepší výsledky u modifikované atmosféry obsahující 70 % Ar a 30 % CO2. Ke stejnému výsledku jsme dospěli také u balených kuřecích jater. S těmito závěry pozitivně korelují výsledky analýzy barevného profilu. Chemické parametry: Koncentrace amoniaku ve stehenní svalovině se mezi pouţitými atmosférami statisticky nelišila. Analýzy zaměřené na kvantifikaci oxidačních pochodů statisticky průkazně ukázaly vyšší hodnoty u vzorků balených v atmosféře obsahující 70 % O2 a 30 % CO2. Mikrobiologické parametry: Zjistili jsme statisticky průkazné rozdíly v počtech sledovaných mikroorganismů

v průběhu skladování

a také mezi

pouţitými

atmosférami. Výsledky

mikrobiologické analýzy negativně korelovaly s koncentrací O2 a CO2 v modifikované atmosféře. Analýza organických těkavých látek obsažených v modifikované atmosféře: Získané výsledky potvrzují výchozí předpoklady autorů. V průběhu skladování dochází ke kvalitativním a kvantitativním změnám v zastoupení a koncentraci těkavých organických látek zastoupených 69

v modifikované atmosféře. Výsledky statisticky průkazně korelují s výsledky senzorické, mikrobiologické a chemické analýzy. Obrázek č. 1 Příklad výstupu z GC/MS analýzy těkavých org. látek obsaţených v modifikované atmosféře

Osa x – retenční čas, osa y – normované spektrum. Závěr Spektrum pouţitých analýz komplexně popisuje průběh pochodů, k nimţ dochází v průběhu chladírenského skladování kuřecího masa a jater v prostředí dvou typů modifikované atmosféry. Z výsledků statistické analýzy vyplývá úzký vztah mezi sledovanými parametry a byl tak potvrzen výchozí předpoklad, ţe kvalitativní a kvantitativní analýza organických těkavých látek obsaţených v modifikované atmosféře spolehlivě indikuje jakostní a hygienické parametry balené potraviny.

Seznam literatury 1. Lovestead, T.M., Bruno, T.J.: Detection of poultry spoilage markers from headspace analysis with cryoadsorption on a short alumina PLOT column. Food Chemistry, 2010, vol. 121, iss. 4, p. 1274-1282. 2. Friedrich, L., Siro, I., Dalmadi, I., Horvath, K., Agoston, R., Balla, C.: Influence of various preservatives on the quality of minced beef under modified atmosphere at chilled storage. Meat Science, 2008, vol. 79, iss. 2, p. 332-343.

70

3. Rajamäki, T., Alakomia, H.-L., Ritvanen, T., Skyttä, E., Smolander, M., Ahvenainen, R.: Application of an electronic nose for quality assessment of modified atmosphere packaged poultry meat. Food Control, 2006, vol. 17, iss. 1, p. 5-13. 4. Boothe, D. D. H., Arnold, J. W.: Electronic nose analysis of volatile compounds from poultry meat samples, fresh and after refrigerated storage. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2002, vol. 82, iss. 3, p. 315-322.

71

Využití žluče ryb pro studium zátěže vodního ekosystému Jana Blahová, Jana Kovářová, Petr Maršálek, Alena Kirchnerová, Jitka Vrzáňová Ústav veřejného veterinárního lékařství a toxikologie, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Intenzivní antropogenní činností dochází k emisím různorodých látek, které jiţ při nízké koncentraci mohou vykazovat toxické, mutagenní případně karcinogenní účinky (Van der Oost et al., 2003). Mezi uvedené polutanty také řadíme polycyklické aromatické uhlovodíky (PAH) a degradační produkty tenzidů – alkylfenoly (AF). Při hodnocení zatíţení vodního prostředí těmito polutanty lze provádět nejen jejich stanovení v abiotické matrici, ale také jejich detekci v ţivých organismech (přímou detekcí polutantů nebo analýzou jejich metabolitů). Jako vhodné indikátorové organismy jsou vyuţívány především různé druhy ryb. V případě PAH dochází u většiny ţivých organismů k poměrně rychlé metabolizaci, při které vznikají polárnější sloučeniny, které jsou rychleji a snadněji eliminovány z organismu neţ původní sloučeniny. Proto při sledování PAH v ţivých organismech je vhodnější analyzovat jejich metabolity, které jsou deponovány ve ţluči. Nejčastěji pouţívaným metabolitem je 1-hydroxypyren (1-OHP) (Ruddock et al., 2003). Ve ţluči ryb lze také provádět sledování obsahu AF, které dává informace o aktuálním stavu výskytu těchto látek ve vodním prostředí. Alkylfenoly se ve ţluči vyskytují ve formě konjugátů, proto lze po enzymatické hydrolýze provést kvantifikaci přímo hlavních AF – nonylfenolu a oktylfenolu (MartinSkilton et al., 2006). Cílem práce bylo zavedení a validování metodik stanovení metabolitů PAH a

AF ve ţluči ryb a následné zhodnocení zatíţení řeky Bíliny těmito polutanty pomocí biologického a chemického monitoringu. Materiál a metodika Monitorování obsahu PAH a AF bylo provedeno na vybraných devíti lokalitách, které se nacházejí na toku řeky Bíliny (Obr. 1). Řeka Bílina pramení na svazích Krušných hor, severně od Chomutova nad městem Jirkov. Dříve byl celý průtok řeky vyuţíván jako technologická voda v chemických závodech Záluţí u Litvínova. Řeka byla po celém toku silně znečištěna a aţ koncem dvacátého století se začala situace zlepšovat. Na vybraných lokalitách byl proveden odlov ryb za pouţití elektrického agregátu v průběhu měsíce července roku 2010, zároveň byly na těchto lokalitách odebírány i vzorky sedimentů a instalovány pasivní vzorkovače (SPMD – semipermeable membrane device). Celkem bylo 72

odloveno 61 kusů ryb a to pouze na čtyřech z devíti lokalit (Březenec, pod ČOV Jirkov, nad VD Jiřetín, Ústí nad Labem). Na kaţdé lokalitě bylo odloveno 4 aţ 24 ks ryb. Jako indikátorové druhy ryb byly zvoleny pstruh obecný, plotice obecná a jelec tloušť. Na zbylých lokalitách nebyly ţádné ryby odloveny, byly provedeny pouze odběry abiotických matric. Po odlovení byly ryby zváţeny, změřeny a pro určení věku byly odebrány šupiny. Odběr ţluči byl proveden pomocí insulínové stříkačky ze ţlučového váčku a vzorky byly ihned po odběru skladovány v tekutém dusíku. Vzorky byly po odběru rozděleny do tří Eppendorf zkumavek pro stanovení metabolitů PAH, AF a obsahu proteinu. Pro kvantitativní stanovení obsahu metabolitů PAH a obsahu AF byla zavedena a validována HPLC vyuţívající fluorescenční detekci. Z metabolitů PAH byly sledovány 1-OHP, 1hydroxyfenantren (1-OPH) a 2-naftol (2-NAF) a z degradačních produktů tenzidů – alkylfenolů nonylfenol a oktylfenol. Vlastnímu stanovení předcházela úprava ţluči zahrnující enzymatickou hydrolýzu a extrakci na pevné fázi. Stanovení obsahu proteinu bylo provedeno spektrofotometricky s vyuţitím kyseliny bicinchoninové a získaný obsah proteinu byl vyuţit pro normalizaci obsahu polutantů ve ţluči.

Obrázek 1. Mapa sledovaných lokalit (1. Březenec, 2. pod ČOV Jirkov, 3. nad VD Jiřetín, nad Hutním potokem, poblíţ důl Vršany, 4. pod VD Jiřetín, pod Jiřetínským jezem, nad Litvínovem, 5. Záluţí, pod ČOV a Chemopetrolem Litvínov, 6. Ţelenice, 7. pod ČOV Bílina, 8. Rtyně nad Bílinou, pod ČOV Teplice, 9. Ústí nad Labem).

73

Výsledky a diskuze Byla zavedena a validována metodika pro stanovení obsahu tří metabolitů PAH (1-OHP, 1OPH, 2-NAF) ve vzorcích ţluči ryb. Pří analýze realných vzorků ovšem byl detekován pouze jeden analyt, a to 1-OHP. Obsah zbylých dvou metabolitů (1-OPH a 2-NAF) byl pod mezí detekce. Získané výsledky potvrzují i závěry ostatních autorů, kteří jako dominantní metabolit hodnotí 1OHP. Výsledky obsahu 1-OHP ve ţluči odlovených ryb se pohybovaly v rozmezí 3,6 aţ 481,2 ng/mg proteinu a jsou uvedeny v grafu 1. Nejniţší obsah 1-OHP byl zjištěn v kontrolní lokalitě Březenec, naopak nejvyšší obsah byl zaznamenán v lokalitě Ústí nad Labem, která se nachází na řece Bílině před jejím vyústěním do Labe. Při statistické analýze ovšem nebyly prokázány statisticky významné rozdíly mezi sledovanými lokalitami. Pro komplexní posouzení budou získané výsledky biologického monitoringu doplněny a následně korelovány s výsledky chemického monitoringu, který provádí VÚRH ve Vodňanech. Výsledky chemického monitoringu by měly být k dispozici začátkem roku.

35

1-OHP (ng/mg proteinu)

30 25

20

15

10 5

0 Březenec

pod ČOV Jirkov

pod VD Jiřetín

Ústí nad Labem

Graf 1. Obsah 1-OHP ve vzorcích ţluče (uvedeno v mediánových hodnotách). V případě stanovení alkylfenolů ve ţluči byla zavedena a validována metodika stanovení nonylfenolu a oktylfenolu pomocí HPLC s fluorescenční detekcí a vlastní vzorky budou teprve měřeny. Získané výsledky budou následně porovnány s výsledky z chemického monitoringu a bude provedena korelační analýza. Práce byla financována v rámci projektu IGA 89/2010/FVHE.

74

Seznam literatury 1. Van der Oost, R.; Beyer, J.; Vermeulen, NPE. Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment: a review. Environ. Toxicol. Pharmacol. 2003, 13, 57–149. 2. Ruddock, PJ.; Bird, DJ.; McEvoy, J.; Peters, LD. Bile metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in European eels Anguilla anguilla from United Kingdom estuaries. Sci. Total. Environ. 2003, 301, 105–117. 3. Martin-Skilton, R.; Lavado, R.; Thibaur, R.; Miniem, Ch.; Porte, C. Evidence of endocrine alteration in the red mullet, Mullus barbatus from the NW Mediterranean. Environ. Pollut. 2006, 141, 60–68.

75

Sledování obsahu rizikových kovů ve tkáních jelce tlouště (Leuciscus cephalus L.) z řek v okolí Brna Veronika Harkabusová, Olga Čelechovská, Alena Lavičková Ústav biochemie, chemie a biofyziky, Fakulta veterinární hygieny a ekologie , Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Uvolňování rizikových kovů do ţivotního prostředí je způsobeno zejména antropogenní činností. V důsledku nízkého stupně jejich degradace se kovy hromadí v půdě, vodních sedimentech a následně se dostávají aţ do potravního řetězce (Cornelis et al., 2005). Zvyšující se koncentrace kovů, obzvláště rtuti, kadmia a olova, byla pozorována ve sladkovodních rybách, přičemţ jejich koncentrace ve tkáních pozitivně koreluje s koncentrací těchto kovů ve vodě (Svobodová et al., 1996). Cílem práce bylo zjistit vliv uvolňování rizikových kovů do ţivotního prostředí v okolí městských aglomerací na jejich akumulaci ve tkáních jelce tlouště (Leuciscus cephalus L.). Materiál a metodika Monitoring znečištění řek Svitavy a Svratky v okolí Brna rizikovými kovy byl proveden na 6 lokalitách před přítokem do městské aglomerace a po průtoku řek městem. Z těchto lokalit bylo odebráno celkem 60 vzorků jelce tlouště (Leuciscus cephalus L.). Koncentrace jednotlivých kovů (Pb, Cd, Cu, Zn, As) byla stanovena ve svalovině, játrech, a ledvinách. Vzorky byly před analýzou rozloţeny pomocí kyseliny dusičné v laboratorních autoklávcích s mikrovlnným ohřevem (ETHOS SEL, Milestone Italy). Pro stanovení arsenu byly vzorky dále spalovány s přídavkem dusičnanu hořečnatého v muflové peci. Popel byl poté rozpuštěn v roztoku kyseliny chlorovodíkové (4,8 mol/l) a As5+ redukován na As3+ pomocí jodidu draselného (Čelechovská et al., 2005). Pro stanovení obsahu kovů byla pouţita metoda HR-CS AAS. Analýza byla provedena na spektrometru s elektrotermickou atomizací (ContrAA 700, Analytik Jena, Německo). Olovo, kadmium a měď byly stanovovány na grafitové kyvetě s platformou, pro zinek byla zvolena plamenová technika a pro stanovení arsenu byla pouţita technika generování hydridů. Přesnost a správnost analýzy byla ověřena pomocí certifikovaných referenčních materiálů. DORM-2 (dogfish muscle – NRC), BCR 186 (pig kidney) and 1577a (bovine liver – NIST). Získaná data byla vyhodnocena s vyuţitím statistického programu Unistat 5.1. 76

Výsledky Tabulka 1. Zjištěné koncentrace a standardní odchylky (SD) kovů ve tkáních jelce tlouště (Leuciscus cephalus L.). Tkáň/kov Svalovina Bílovice n Svitavou (18.0) Svitava před soutokem (0.6) Kamenný Mlýn (56.2) Svratka před soutokem (40.9) Rajhradice (35.0) Židlochovice (30.0) Játra Bílovice n Svitavou (18.0) Svitava před soutokem (0.6) Kamenný Mlýn (56.2) Svratka před soutokem (40.9) Rajhradice (35.0) Židlochovice (30.0) Ledviny Bílovice n Svitavou (18.0) Svitava před soutokem (0.6) Kamenný Mlýn (56.2) Svratka před soutokem (40.9) Rajhradice (35.0) Židlochovice (30.0)

Pb

Cd

c SD c SD c SD c SD c SD c SD

0.077 0.056 0.073 0.056 0.115 0.048 0.089 0.068 0.106 0.057 0.083 0.065

c SD c SD c SD c SD c SD c SD c SD c SD c SD c SD c SD c SD

Zn

As

0.009 0.004 0.009 0.001 0.010 0.002 0.006 0.002 0.008 0.002 0.007 0.001

Cu (mg/kg) 0.097 0.089 0.207 0.098 0.253 0.093 0.141 0.086 0.203 0.083 0.157 0.322

4.340 1.271 4.034 1.430 4.916 1.447 3.918 1.153 4.912 1.264 3.329 1.020

0.030 0.006 0.040 0.010 0.058 0.012 0.055 0.038 0.051 0.014 0.033 0.009

0.093 0.042 0.076 0.052 0.190 0.223 0.118 0.100 0.143 0.090 0.083 0.070

0.068 0.038 0.031 0.017 0.069 0.064 0.041 0.016 0.037 0.018 0.055 0.030

11.06 10.89 16.00 9.67 21.98 8.79 20.31 10.17 9.99 5.74 15.80 13.11

21.41 5.12 27.31 7.81 29.78 6.93 29.01 8.20 27.11 6.96 24.27 3.79

0.060 0.017 0.040 0.013 0.058 0.012 0.040 0.016 0.069 0.018 0.069 0.025

0.116 0.068 0.277 0.187 0.199 0.181 0.253 0.184 0.189 0.106 0.242 0.180

1.350 0.977 0.440 0.209 0.711 0.626 0.419 0.209 0.473 0.240 0.839 0.479

1.349 0.128 1.571 0.209 1.269 0.303 1.358 0.205 1.429 0.209 1.949 0.611

125.5 32.4 216.9 59.2 299.7 123.4 263.2 54.7 225.4 61.5 173.7 56.3

0.058 0.017 0.058 0.015 0.186 0.076 0.094 0.040 0.092 0.044 0.082 0.021

Výsledné koncentrace jednotlivých kovů jsou uvedeny v tab. 1. Ve všech tkáních byly ze sledovaných kovů nejvíce zastoupeny biogenní prvky Zn a Cu. Koncentrace Zn bývá obvykle vyšší neţ koncentrace jiných kovů, coţ souvisí s jejich četnými biochemickými a fyziologickými funkcemi v organismu. Naopak celkově nejniţší byly ve všech tkáních hodnoty koncentrací arsenu.

77

Svalová tkáň vykazovala nejniţší akumulaci všech analyzovaných kovů, coţ souvisí s její nízkou metabolickou aktivitou. Játra obsahovala nejvyšší koncentrace Cu ze všech analyzovaných orgánů a poměrně vysoké bylo také zastoupení Zn, coţ souvisí právě s vysokým obsahem enzymů a biologickou aktivitou. Ledviny vykazovaly nejvyšší koncentrace všech analyzovaných kovů (s výjimkou Cu). U Zn, Pb a Cd se sniţovala koncentrace v pořadí ledviny > játra > svalovina, v případě Cu bylo pořadí játra > ledviny > svalovina. Kovářová et.al. (2009) uvádí niţší koncentrace kovů v sedimentech řeky Svitavy neţ na lokalitách řeky Svratky, to odpovídá i zjištěným hodnotám ve tkáních jelců. Závěr Vyšší celkové zatíţení rizikovými kovy bylo zjištěno u řeky Svratky, přičemţ nejvyšší koncentrace rizikových kovů ve tkáních ryb vykazovala lokalita Kníničky. V důsledku samočisticí schopnosti vodního ekosystému byl se vzdáleností od Brna zaznamenán pokles koncentrací většiny kovů. Kontaminace brněnské aglomerace rizikovými kovy nepředstavuje významné znečištění a hygienické riziko.

Seznam literatury: 1. Cornelis R, Caruso J, Crews H, Heumann K, editors (2005). Handbook of Elemental Speciacion II. Species in the environment, food, medicine and occupational health. Chichester: J Wiley & Sons, Ltd. 2. Čelechovská O, Svobodová Z, Randák T (2005). Arsenic content in tissues of fish from the River Elbe. Acta Vet Brno 74: 419-425. 3. Kovářová J, Blahová J, Havelková M, Kruţíková K, Tomsejová S, Jurčíková J, Harustiaková D, Svobodová Z (2009). Assessment of POP's contamination of the Svitava and Svratka rivers using selected biochemical markers. Toxicology Letters 189: 193. 4. Svobodová Z, Beklová M, Machala M, Drabeck P, Dvořáková D, Kolářová J, et al. (1996). Evaluation of the effect of chemical substances, preparation, wastes and waste waters to organism in the aquatic environment. Bull. VÚRH Vodňany 32: 76-96.

78

Speciace rtuti z pohledu bezpečnosti potravin-ryb z významných rybářských revírů ČR Renáta Kenšová, Kamila Kruţíková, Lenka Pištěková, Jana Poláčková, Zdeňka Svobodová Ústav veřejného veterinárního lékařství a toxikologie, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Rtuť je globální polutant vyskytující se v ţivotním prostředí, který negativně ovlivňuje ţivé organismy. Nejtoxičtější formou je organická methylrtuť, která vzniká z anorganické rtuti v sedimentech dna činností mikroorganismů (Eisler, 2006). Methylrtuť má schopnost kumulovat se ve vodních organismech a přenášet se potravním řetězcem aţ ke konečnému článku, tj. člověku. Výskytu rtuti ve vodním prostředí je věnována velká pozornost (Kruţíková et al., 2008; Maršálek et al., 2006, Havelková et al., 2008). Tato pozornost je hlavně zaměřována na kontaminované lokality, ale z hlediska bezpečnosti potravin bude v dalším období potřeba soustředit se na lokality nejvíce navštěvované sportovními rybáři. Hodnota AWI (1,6 µg/kg ţ. hm.) pro methylrtuť daná WHO spolu s konkrétní hodnotou obsahu methylrtuti ve svalovině analyzovaných ryb umoţní stanovit mnoţství svaloviny, které je moţno ze sledované lokality týdně zkonzumovat. Pro produkty rybolovu je stanoven maximální obsah celkové rtuti 0,5 mg/kg a 1 mg/kg pro některé vybrané druhy ryb (Nařízení ES č. 1881/2006, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek). Cílem naší práce bylo stanovit distribuci celkové rtuti (THg) v analyzovaných tkáních, stanovit mnoţství methylrtuti (MeHg) z celkové rtuti (speciace Hg) a z hlediska bezpečnosti potravin stanovit mnoţství svaloviny ryb, které lze na jednotlivých sledovaných lokalitách konzumovat. Materiál a metodika Na šesti významně vyuţívaných rybářských lokalitách (Luţnice–Soběslav; Berounka nad soutokem s Vltavou; Tismenice–ÚN Jordán, Trnava–ÚN Trnávka, Otava–Strakonice; Otava– Sušice) byly na jaře 2010 odloveny dravé a nedravé druhy ryb. Celkem bylo odloveno 142 ks ryb náleţejících do 13 druhů (cejn velký – 25 ks, kapr obecný – 14 ks, plotice obecná – 25 ks, jelec tloušť – 10 ks, bolen dravý – 13 ks, štika obecná – 14 ks, okoun říční – 9 ks, úhoř říční – 8 ks, lín obecný – 5 ks, pstruh obecný – 5 ks, pstruh duhový – 5 ks, lipan podhorní – 4 ks a siven americký – 5 ks). Ryby byly změřeny, zváţeny a byly odebrány vzorky tkání (svalovina, játra, gonády, šupiny) k analýzám na mnoţství THg a MeHg. Zvolené lokality patří mezi významné rybářské revíry hojně navštěvované sportovními rybáři. Stanovení THg bylo prováděno pomocí atomové absorpční spektrofotometrie na analyzátoru AMA 254 (Altec, Praha), speciace rtuti MeHg byla provedena 79

pomocí plynové chromatografie s ECD detekcí na chromatografu GC2010A (Shimadzu Kyoto, Japan). Výpočet moţné konzumace rybí svaloviny vycházel z hodnoty AWI a byl následně přepočítán na počet porcí (1 porce = 170 g svaloviny). Výsledky 0,90 0,80

MeHg (mg/kg)

0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20

ÚN Trnávka

Otava 7Sušice

Lužnice

Otava 4 Strakonice

ÚN Jordán

cejn velký

plotice obecná štika obecná

cejn velký kapr obecný bolen dravý

plotice obecná okoun říční

kapr obecný bolen dravý

kapr obecný úhoř říční

štika obecná plotice obecná bolen dravý

lín obecný jelec tloušť

okoun říční plotice obecná

štika obecná cejn velký

pstruh obecný jelec tloušť

siven americký lipan podhorní pstruh duhový

kapr obecný

0,00

plotice obecná cejn velký

0,10

Berounka

Lokality

Graf 1: Mnoţství MeHg ve svalovině ryb odlovených ze sledovaných lokalit

30

Počet porcí

25

20

15

10

ÚN Trnávka

Otava 7 Sušice

Jordán

cejn velký

štika obecná

bolen dravý

plotice obecná

cejn velký

kapr obecný

okoun říční

plotice obecná

bolen dravý

úhoř říční kapr obecný

bolen dravý

Lužnice

kapr obecný

štika obecná

plotice obecná

lín obecný

Otava 4 - Strakonice

jelec tloušť

plotice obecná

cejn velký okoun říční

štika obecná

jelec tloušť

pstruh duhový

pstruh obecný

lipan podhorní

cejn velký

kapr obecný

plotice obecná

0

siven americký

5

Berounka

Lokality

Graf 2: Počet porcí svaloviny ryb, které lze z dané lokality týdně zkonzumovat Nejvyšší hodnoty obsahu THg a MeHg byly nalezeny ve svalovině ryb ve všech analyzovaných lokalitách. Nejvyšší hodnoty obsahu rtuti byly v porovnání s ostatními druhy ryb naměřeny ve 80

svalovině bolena dravého, zástupce dravého druhu ryb. Hodnoty THg u bolena dosahovaly aţ 0,7 mg/kg (řeka Berounka) zatímco u nedravých druhů nepřekročily 0,5 mg/kg. Svalovina kapra obecného vykazovala nejmenší obsah celkové rtuti a pohybovala se okolo 0,05 mg/kg. Obsah celkové rtuti v jednotlivých tkáních klesal v tomto pořadí: svalovina > játra > gonády > šupiny. Obsah MeHg byl měřen pouze ve svalovině. Zastoupení MeHg z THg bylo 55 – 100 %. Zjištěné hodnoty MeHg jsou uvedeny v grafu 1. Jedním z cílů naší práce bylo stanovit mnoţství svaloviny ryb, které lze z dané lokality týdně zkonzumovat. Graf 2 uvádí počet porcí, které můţeme z daného druhu ryb týdně zkonzumovat, aniţ by to pro nás, jako konzumenta ryb, znamenalo nějaké riziko. Závěr Ze 142 analyzovaných vzorků ryb měly pouze dva vzorky obsah THg nad povoleným limitem. Jednalo se o vzorky svaloviny bolena dravého z lokalit řek Luţnice a Berounka. Celkové výsledky potvrdily příznivou hygienickou kvalitu ryb z významných rybářských revírů ČR. Poděkování: Práce byla realizována při řešení projektu MSM 6215712402 a IGA 84/2010/FVHE.

Seznam literatury: 1. Eisler R. (2006): Mercury Hazards to Living Organisms. CRC Press, Taylor & Francis Group. 312 p. 2. Havelková, M., Dušek, L., Némethová, D, Poleszcuk, G., Svobodová, Z. (2008). Comparison of mercury distribution between liver and muscle – a biomonitoring of fish from lightly and heavily contaminated localities. Sensors 8:4095–4109. 3. Kruţíková K., Svobodová Z., Valentová O., Randák T., Velíšek J. (2008): Mercury and methylmercury in muscle tissue of chub from the elbe river main tributaries. Czech Journal of Food Science 26:65–70. 4. Maršálek P., Svobodová Z., Randák T. (2006): Total mercury and methylmercury contamination in fish from various sites along the Elbe river. Acta Veterinaria Brno 75:579– 585. 5. Nařízení Komise (ES) č. 1881/2006, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách

81

Studium akutních a subchronických účinků pesticidů na ryby Lucie Plhalová, Vladimíra Pištěková, Helena Modrá, Petra Doleţelová, Stanislava Mácová, Jana Javorská, Lucie Hryciuková, Helena Přibylová Ústav veřejného veterinárního lékařství a toxikologie, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Pesticidy na bázi azolů patří mezi moderní pesticidy široce vyuţívané v zemědělství. Azoly jsou vyuţívány jako fungicidy a jsou také pouţívány ve veterinární a humánní medicíně při léčbě mykotických onemocnění (Roberts et al., 1999). Triazinové pesticidy tvoří skupinu selektivních herbicidů působících jako inhibitory fotosyntézy rostlin (Roberts et al., 1998). Ačkoliv aplikace triazinů simazinu a atrazinu byla v mnoha zemích zakázána, jsou jejich rezidua stále detekována ve vodním prostředí (data Český hydrometorologický ústav, 2008). Základní informace o hodnocených látkách jsou získávány v testech akutní toxicity. Dlouhodobé testy pak poskytují informace z pohledu reálných koncentrací toxických látek v ţivotním prostředí. Cílem projektu bylo stanovení letálních koncentrací (96hLC50) pesticidního přípravku Bumper 25 EC na bázi azolů (účinná látka propikonazol) pro ryby a dále stanovení subchronických ůčinků simazinu a atrazinu pro ryby. Materiál a metodika Testy akutní toxicity s přípravkem Bumper 25 EC (obsahující propikonazol v mnoţství 250 g.l-1) byly provedeny na juvenilních jedincích ryb dania pruhovaného (Danio rerio) a ţivorodky duhové (Poecilia reticulata) a plůdku kapra obecného (Cyprinus carpio) dle směrnice OECD č. 203 Test akutní toxicity na rybách (Fish, Acute Toxicity Test). V kaţdé koncentraci a kontrole bylo testováno 10 ryb náhodně vybraných ze zásobní populace. Testy byly prováděny semistatickou metodou s obměnou roztoku po 24 hodinách. V průběhu testů byla zaznamenávána teplota, pH a koncentrace rozpuštěného kyslíku v testovacích nádobách a mortalita ryb. Test byl ukončen po 96 hodinách od nasazení ryb. Ze získaných hodnot (počet uhynulých jedinců v jednotlivých testovaných koncentracích) byla probitovou analýzou pomocí programu EKO-TOX 5.2 stanovena hodnota 96hLC50 propikonazolu. Stanovení subchronických účinků simazinu a atrazinu pro Danio rerio bylo provedeno dle metodiky OECD č. 215 Růstový test na juvenilních rybách (Fish, Juvenile Growth Test). V testech se simazinem byly pouţity ryby D. rerio ve věku 20 dní, v testech s atrazinem ve věku 30 dní. Ryby 82

byly vystaveny subletálním koncentracím (0,06 µg.l-1 - enviromentální koncentrace; 0,6 µg.l-1; 6 µg.l-1 a 60 µg.l-1 u simazinu; 0,3 µg.l-1 - enviromentální koncentrace; 3 µg.l-1; 30 µg.l-1 a 90 µg.l-1 u atrazinu) po dobu 28 dní a následně byl stanoven hmotnostní přírůstek (r2), hodnoty NOEC (nejvyšší koncentrace, ve které nejsou pozorovány účinky) a LOEC (nejniţší účinná koncentrace), histopatologické změny způsobené testovanými látkami. Test probíhal v průtočných nádrţích s obměnou rotoků po 12 hodinách. V průběhu testů byla zaznamenávána teplota, pH a koncentrace rozpuštěného kyslíku v testovacích nádobách a mortalita ryb. Ke statistickému zhodnocení výsledků byla pouţita neparametrická ANOVA (Kruskal-Wallisův test). Výsledky Stanovení akutní toxicity – pesticidní přípravek Bumper 25 EC Akutní toxicita přípravku Bumper 25 EC pro juvenilní stádium Danio rerio vyjadřená jako 96hLC50 byla 19,2 mg.l-1 (coţ odpovídá 4,8 mg.l-1 propikonazolu) pro Poecilia reticulata 19,4 mg.l-1 (tj. 4,85 mg.l-1 propikonazolu) a pro plůdek Cyprinus carpio 22,7 mg.l-1 (tj. 5,68 mg.l-1 propikonazolu). Na základě získaných výsledků lze přípravek Bumper 25 EC zařadit do látek škodlivých pro ryby (R52). Stanovení subchronických účinků – simazin a atrazin Srovnáním hmotnostních přírůstků jednotlivých testovaných skupin obsahujících subletální koncentrace simazinu s kontrolní skupinou nebyly zjištěny statisticky významné rozdíly. Histopatologické vyšetření však prokázalo patomorfologické změny na ţábrách, ledvinách a hepatopankreatu u ryb z testované skupiny o koncentraci 60 µg.l-1 simazinu. Nejvyšší koncentrace simazinu, u které nebyly pozorovány ţádné účinky (NOEC), byla pro D. rerio 6 µg.l-1. Nejniţší koncentrace simazinu, u které byly zjištěny účinky pro ryby (LOEC), byla pro D. rerio 60 µg.l-1. Porovnáním hmotnostních přírůstků jednotlivých testovaných skupin obsahujících subletální koncentrace atrazinu s kontrolní skupinou byl zjištěn statisticky významný rozdíl v koncentraci obsahující 90 µg.l-1 atrazinu (p < 0,01) (Graf 1.). Nejvyšší koncentrace atrazinu, u které nebyly pozorovány ţádné účinky (NOEC), byla pro D. rerio 30 µg.l-1. Nejniţší koncentrace atrazinu, u která byly zjištěny účinky pro ryby (LOEC), byla pro D. rerio 90 µg.l-1. Na základě výsledků histopatologického vyštření budou tyto hodnoty u atrazinu upřesněny. Závěry Na základě výsledků hodnot získaných z testů akutní toxicity pesticidního přípravku Bumper 25 EC na D. rerio, P. reticulata a C. carpio byla přípravku přiřazena riziková věta R52 a dále tyto výsledky slouţily pro provedení chronického testu s tímto přípravkem na plůdku kapra obecného. 83

Z výsledků subchronického působení simazinu a atrazinu vyplývá, ţe environmentální koncentrace těchto pesticidních látek neměly vliv na růst ryb ani na vznik patomorfologických změn u D. rerio.

3,5

Hmotnostní přírůstek r2

3

2,5

** 2

1,5

1

0,5

0 Kontrola

0,3 µg/l

3 µg/l

30 µg/l

90 µg/l

Koncentrace atrazinu

Graf 1. Porovnání hmotnostních přírůstků testovaných skupin s koncentracemi atrazinu od 0,3 µg.l-1 do 90 µg.l-1 (** p < 0,01). Tato práce vznikla s podporou prostředků IGA VFU 87/2010/FVHE.

Seznam literatury: 1. Roberts TR, Hutson DH, Lee PW, Nicholls PH, Plimmer JR 1998: Metabolit Pathways of Agrochemicals. Part 1: Herbicides and Plant Growth Regulators. 1st ed. Cambridge: The Royal Society of Chemistry, 849 p. 2. Roberts TR, Hutson DH, Philips JJ, Lee PW, Nicholls PH, Plimmer JR 1999: Metabolit Pathways of Agrochemicals. Part 2: Insecticides and Fungicides. 1st ed. Cambridge: The Royal Society of Chemistry, 1475 p. 3. Český hydrometeorologický ústav – oddělení jakosti vod, Na Šabatce 17, Praha – Komořany

84

Vliv účinků léčiv detekovaných v našich tocích na vodní organismy Eva Prášková, Eva Voslářová, Zuzana Široká, Radka Dobšíková, Ivana Haluzová, Naděţda Janů, Hana Cinková Ústav veřejného veterinárního lékařství a toxikologie, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod K nejčastějším kontaminantům ţivotního prostředí patří přípravky pro osobní hygienu, léčiva a detergenty, kdy zejména u léčiv je v posledních letech zaznamenáno rostoucí uţívání (aţ naduţívání), coţ se projevuje na jejich výskytu prakticky ve všech sloţkách prostředí (Kotyza et al. 2009). Tyto látky bývají většinou vysoce odolné vůči všem čistírenským procesům, a tak je lze často detekovat při kontrolách našich vod. Ternes (2001) se zabýval monitoringem výskytu léčiv v odpadních vodách a řekách v Německu, Rakousku, Polsku, Španělsku, Francii, Švýcarsku a Finsku. Výsledky monitoringu dokazují přítomnost minimálně některých ze sledovaných léčiv v povrchových vodách všech uvedených států. O jejich účincích na ţivotní prostředí je v současnosti k dispozici málo informací (Ramirez et al. 2009, Velicu and Suri 2009). Proto bylo cílem naší práce sledování účinků vybraných léčiv na vodní organismy, posouzení jejich akutní toxicity a stanovení 96h LC50. Pro testy byla vybrána léčiva, která byla detekována v povrchových vodách ČR (Prášková et al. 2010), a to sulfamethoxazol, diklofenak a ketoprofen. Sulfamethoxazol (SMX) je antibiotikum řadící se mezi sulfonamidy, pouţívá se při zánětech močových cest, bronchitidě, zánětům ucha. Diklofenak (DCF) se řadí do skupiny nesteroidních protizánětlivých látek (NSAID), pouţívá se proti bolesti a zánětům, zejména u artritid, dny, menstruační bolesti a dalších. Ketoprofen (KET) se řadí také do skupiny NSAID, pouţívá se zejména k léčbě artrózy a revmatismu. Materiál a metodika Podle metodiky OECD č. 203 (Fish, acute toxicity test) byla provedena série testů toxicity na rybách. Testy probíhaly na 2 – 3 měsíčních rybách danio pruhované Danio rerio (SMX, DCF, KET) a ţivorodka duhová Poecilia reticulata (SMX) semistaticky s výměnou roztoků po 48 hodinách. V případě diklofenaku byly roztoky měněny po 24 hodinách kvůli dodrţení validity testu, a to koncentrace testované látky neklesající pod 80 %. Testovaná léčiva (výrobce Sigma – Aldrich) bylo nutno kvůli špatné rozpustnosti ve vodě rozpouštět pomocí ultrazvuku.

85

Pro testování byly zvoleny následující koncentrace: SMX: 250, 500, 750, 1000, 1500 mg/l, DCF: 100, 130, 160, 190, 220 mg/l, KET: 550, 600, 650, 700, 750 mg/l. Do kaţdé koncentrace a kontroly bylo nasazeno po 10 kusech ryb. Pro účely statistického hodnocení byly testy opakovány. Základní fyzikální a chemické parametry ředicí vody byly následující: KNK4.5 4,2 mmol/l; CHSKMn 2,8 mg/l; BSK 0,72 mg/l; celkový amoniak pod mezí stanovitelnosti; NO3- 23,48 mg/l; NO2- pod mezí stanovitelnosti; Cl- 18,11 mg/l; Σ Ca ± Mg 14 mg/l. Teplota testovací lázně se pohybovala na úrovni 22 ± 2 °C. Koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesla pod 60 %, pH bylo v rozmezí 6,1 – 7,9 (SMX), 6,3 – 8,3 (DCF), 6,1 – 8,3 (KET). V průběhu testování byl zaznamenáván u všech testů počet uhynulých jedinců. Ze získaných hodnot (mortalita v jednotlivých koncentracích) se probitovou analýzou pomocí počítačového programu EKO-TOX 5.1 stanovila hodnota 96h LC50 pro test akutní toxicity na rybách. Testy FETAX na embryích drápatky vodní Xenopus laevis proběhly podle metodiky ASTM E1439-98. Do kaţdé koncentrace testované látky (10 ml) bylo nasazeno 25 embryí X. laevis ve stadiu 8 aţ 11. Triplicitně byla testována léčiva diklofenak, sulfamethoxazol a ketoprofen. Jednotlivé koncentrace byly připraveny ze standardního roztoku FETAX, který byl pouţit také jako negativní kontrola. Kaţdých 48 hodin byly roztoky měněny, byla odstraněna uhynulá embrya a zaznamenána jejich mortalita. V případě diklofenaku probíhala výměna testovaných roztoků po 12 hodinách. Test byl ukončen po 96 hodinách, kdy byla přeţívající embrya usmrcena CO2, část z nich byla fixována 3% formaldehydem a část zmraţena pro další vyšetření (parametry oxidačního stresu). Fixovaná embrya byla změřena prostřednictvím binokulární lupy. Získaná data byla statisticky zpracována programem Unistat 5.1 (test analýzy variance Anova – Tukey test). V průběhu testu byla chromatograficky kontrolována rozpustnost léčiv ve standardním roztoku FETAX, a také koncentrace dosahované před výměnou testovaného roztoku (tj. po 24 h, případně 12 h). Byl proveden předběţný test se sulfamethoxazolem o koncentraci 550 mg/l a kompletní test s koncentracemi: 10, 20, 35, 40, 60 mg/l. Dále bylo testováno 5 koncentrací ketoprofenu: 10, 14, 25, 35, 50 mg/l. Výsledky Souhrnné výsledky provedených testů toxicity vybraných léčiv jsou uvedeny v tabulce č. 1. Testy toxicity sulfamethoxazolu probíhaly na dvou druzích akvarijních ryb – D. rerio a P. reticulata. Výsledky u obou druhů ryb byly srovnatelné a bylo zjištěno, ţe akutní toxicita pro oba druhy je poměrně nízká. U danií nedošlo v testovaných koncentracích k ţádné mortalitě a u ţivorodek mortalita nepřekročila 45 %. Z výsledků vyplývá, ţe hodnota 96h LC50 SMX pro D. rerio a P. reticulata je vyšší neţ 1500 mg/l. 86

Testy akutní toxicity diklofenaku a ketoprofenu byly provedeny pouze na rybách D. rerio. Průměrná hodnota 96h LC50 diklofenaku pro D. rerio byla 180,4 ± 1,3 mg/l a ketoprofenu 632,3 ± 10,1 mg/l. U testů na embryích ţab byla zjištěna statisticky vysoce významná (p < 0,001) inhibice růstu v koncentraci ketoprofenu 14 mg/l. V testovaných koncentracích sulfamethoxazolu k inhibici růstu nedošlo (viz tabulka č. 2). Tabulka č. 1: Akutní toxicita vybraných léčiv na vodní organismy 96h LC50 Druh Sulfamethoxazol

Ketoprofen

Diklofenak

Danio rerio

> 1500 mg/l

632,3 ± 10,1 mg/l

180,4 ± 1,3 mg/l

Poecilia reticulata

> 1500 mg/l

x

x

Xenopus laevis

> 550 mg/l

10 – 14 mg/l

x

Vysvětlivky: x = netestováno Tabulka č. 2: Délka těla u embryí X. laevis Testovaná látka

Koncentrace (mg)

Délka těla (mm)

Kontrola

0

8,59 ± 0,36a

10

8,43 ± 0,46a

20

8,72 ± 0,36a

35

8,50 ± 0,56a

40

8,55 ± 0,33a

60

8,55 ± 0,32a

14

8,01 ± 0,58b

Sulfamethoxazol

Ketoprofen

Vysvětlivky: Rozdílná písmena indikují statisticky významný rozdíl oproti kontrole (p < 0,001) Závěr Testy akutní toxicity prokázaly poměrně velkou odolnost ryb D. rerio a P. reticulata vůči testovaným léčivům, citlivěji reagovala embrya X. laevis. Ve všech případech však zjištěná hodnota 96h LC50 výrazně převyšovala koncentrace uvedených léčiv detekované v povrchových vodách ČR, které se pohybují řádově v ng/l. I kdyţ lze tedy vyvodit, ţe riziko akutní toxicity sledovaných léčiv pro vodní organismy je v současné době nízké, jejich vliv na organismus nelze vyloučit. Působení léčiv přítomných ve vodním prostředí na organismus a zejména dopad jejich dlouhodobého působení, kterému jsou vodní organismy vystaveny, je předmětem dalšího zkoumání. Tato práce vznikla s podporou prostředků IGA VFU 68/2010/FVHE. 87

Antibiotická rezistence u kmenů Escherichia coli kolonizujících trávicí trakt psů, koček a zvířat chovaných v zoologických zahradách Kateřina Albrechtová1, Markéta Machálková1, Dagmar Janoszowská1, Monika Dolejská1, Jiří Klimeš1, Alois Číţek2 1

Ústav biologie a chorob volně žijících zvířat, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, VFU Brno 2

Ústav mikrobiologie a imunologie, Fakulta veterinárního lékařství, VFU Brno Úvod

Vzestup výskytu antibiotické rezistence bakterií je znepokojujícím fenoménem současné humánní i veterinární medicíny. Výskyt rezistentních bakterií se intenzivně monitoruje zejména ve zdravotnických zařízeních, v zemědělské výrobě u potravinových zvířat a v poslední době i u volně ţijících zvířat. Tato studie má být jednou z prvních sond do problematiky výskytu rezistentních bakterií u společenských zvířat a zoozvířat a případné rezervoárové role těchto skupin hostitelů. Důraz je kladen na aktuální problematiku plazmidově vázaných genů, které determinují širokospektré betalaktamázy (ESBL) a genů kódujících efluxní proteiny odpovědné za rezistenci k fluorochinolonům. Komenzální Escherichia coli zde slouţí nejen jako modelový organismus, ale také jako potenciální zdroj přenosných genetických determinant antibiotické rezistence na jiné bakteriální druhy včetně patogenních. Materiál a metodika Vyšetřovanými vzorky byly rektální výtěry čtyř skupin zvířat; (i) pacienti českých a slovenských veterinárních ordinací; 104 vzorků od psů a koček, u kterých od poslední antibiotické terapie uplynuly alespoň 2 měsíce, (ii) zvířata nomádských pastevců odebíraná při vakcinační kampani v severní Keni (v oblasti kde se antibiotika malým zvířatům běţně nepodávají); 302 vzorků od psů a koček, 23 vzorků od jejich majitelů, (iii) zvířata ţijící v zajetí ZOO Ostrava; celkem 65 ptáků a 91 savců, (iv) vzorky odebírané v souvislosti s klinickým případem tapíra uhynulého v ZOO Brno; stěry z trachey tapíra, z prostředí výběhu a rektální výtěry zvířat sdílejících tento výběh. Fenotypová charakterizace izolátů E. coli Výtěry byly paralelně kultivovány na MacConkey agaru (MCA) bez antibiotik, na MCA s přídavkem cefotaximu (2 mg/l, pro selekci ESBL izolátů) a na MCA s přídavkem ciprofloxacinu (0,05 mg/l, pro selekci izolátů rezistentních k chinolonům). U kaţdého izolátu byla diskovou difusní metodou testována citlivost ke dvanácti vybraným antibiotikům (ampicilin, amoxicilin-kys. klavulanová, cefalotin, ceftazidim, kyselina nalidixová, ciprofloxacin, gentamicin, směs 88

sulfonamidů, sulfametoxazol-trimetoprim, tetracyklin, streptomycin, chloramfenikol). U izolátů získaných na mediu s přídavkem cefotaximu byla ověřena produkce širokospektrých betalaktamáz „Double Disc Synergy“ testem. Izoláty s prokázanou rezistencí alespoň k jednomu z testovaných antibiotik byly na základě biochemické aktivity druhově identifikovány a zamraţeny. Genotypová charakterizace multirezistentních izolátů Multirezistentní izoláty byly testovány metodou PCR na přítomnost 27 různých genů rezistence. Širokospektré betalaktamázy byly identifikovány prostřednictvím sekvenace PCR produktů a porovnáním sekvencí s betalaktamázami nalezenými u jiných hostitelů. Mobilita genetických determinant rezistence byla posuzována na základě amplifikace genů pro integrony a jejich genových kazet, transformace buněk DH5α plazmidovou DNA izolovanou z multirezistentních izolátů (metoda tepelného šoku) a konjugace těchto izolátů s recipienty (E. coli MT 102 a Salmonella Typhimurium SL5325). Klonální diverzita izolátů byla hodnocena podle variability restrikčních profilů po štěpení enzymem XbaI a separaci fragmentů na pulsní gelové elektroforéze. Výsledky Tabulka 1: Prevalence rezistence u izolátů E. coli získaných z různých skupin zvířat Psi a kočky,

Psi a kočky,

Savci,

Ptáci,

ČR, SR

KE

ZOO Ostrava

ZOO Ostrava

(n=104)

(n=302)

(n = 91)

(n = 65)

cefalosporiny 3. generace*

6%

17 %

35 %

65 %

amoxicilin-kys. klavulanová

5%

5%

8%

2,5 %

fluorochinolony

45 %

85 %

73 %

62 %

tetracyklin

19 %

65 %

47 %

65 %

chloramfenikol

6%

30 %

0

2,5 %

streptomycin

13 %

31 %

48 %

13 %

sulfonamidy

15 %

68 %

39 %

58 %

gentamicin

1%

18 %

4%

2,5 %

ceftazidim

1%

2%

4%

2%

Antimikrobiální látky

* izoláty rezistentní k cefalosporinům 3. generace produkovaly ESBL

Specifikace izolátů produkujících ESBL pocházejících z koček a psů žijících v severní Keni

89

Izoláty produkující ESBL byly zjištěny u 54 z 325 vzorků odebraných v severní Keni (48 ze psů, 4 z lidí, 2 z koček). Analýzou jejich PFGE profilů bylo rozlišeno 16 různých pulsotypů, přičemţ 21 a 10 izolátů mělo stejný pulsotyp a ostatní typy se vyskytovaly minoritně. Pulsotypy izolátů pocházejících z lidí se shodovaly s některými pulsotypy nalezenými u psů a koček. Všechny izoláty produkovaly širokospektrou betalaktamázu typu CTXM-15, odpovědnou za rezistenci k ampicilinu a cefalotinu a dále vykazovaly rezistenci k tetracyklinům (podmíněnou geny tetB, tetA), sulfonamidům (gen sul1), ciprofloxacinu a kyselině nalidixové (aac(6‘)-lb, qnrS), gentamicinu a sulfametoxazol-trimetoprimu. Některé izoláty byly navíc rezistentní ke streptomycinu (str A a genové kazety dhfrA5-aadA5 na integronech typu 1), chloramfenikolu (cat, cmlA) a amoxicilinu potencovanému kys. klavulanovou. Geny rezistence byly neseny na plazmidech, které konjugovaly do recipientních kmenů E. coli i Salmonella Typhimurium, avšak byly obtíţně transformovatelné do kompetentních buněk DH5α Specifikace izolátů produkujících ESBL pocházejících z uhynulého tapíra a prostředí jeho výběhu Izoláty produkující ESBL byly zjištěny jak ve stěrech z trachey uhynulého tapíra, tak i v prostředí výběhu a v trusu zvířat sdílejících tento výběh. Izoláty z tapíra produkovaly širokospektrou betalaktamázu skupiny CTXM-1 a dále byly rezistentní k tetracyklinům (geny tetA, tetB), sulfonamidům (sul1), fluorochinolonům a sulfametoxazol-trimetoprimu. Plazmidy nesoucí geny rezistence nekonjugovaly do recipientních bakterií, ale jejich transformace do buněk DH5α byla úspěšná.

Závěry  Psi, kočky a lidé sdílejí klony E. coli s nebezpečným rozsahem rezistence (fluorochinolony, cefalosporiny 3. generace); prevalence těchto bakterií je vysoká a jejich genetické determinanty rezistence jsou přenosné do jiných bakterií  Psi ţijící v severní Keni jsou přenašeči rezistentních bakterií selektovaných v lidské populaci  Prevalence rezistentních bakterií u psů a koček chovaných v tuzemských domácnostech je niţší neţ u psů a koček keňských a to navzdory tomu, ţe v severní Keni se antibiotická terapie u malých zvířat prakticky neprovádí  V trávicím traktu zvířat ţijících v zoologických zahradách dochází k výrazné kumulaci rezistentních bakterií zřejmě z důvodu koncentrace těchto zvířat v omezeném prostoru výběhů a jejich fekálního znečištění

90

Seznam literatury: 1. Aarestrup FM (ed.), 2006. Antimicrobial resistance in bacteria of animal origin. ASM Press, Washington, D.C., 442 s. 2. CDC, 2010. One-day (24-28 h) standardized laboratory protocol for molecular subtyping of Escherichia coli O157:H7, non-typhoidal Salmonella serotypes, and Shigella sonnei by pulsed

field

gel

electrophoresis

(PFGE)

[online].

.http://www.cdc.gov/pulsenet/protocols/ecoli_ salmonella_ shigellaprotocols.pdf 3. CSLI, 2008. Performance standards for antimicrobial disk and dilution suspectibility tests for bacteria isolated from animals; approved standard (CLSI document M31-A3). 3. vyd. Wayne (Pennsylvania): Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2008. 116 s. ISBN 1-56238-659-x.

91

Účinky subletální expozice zajíce polního pesticidům na průběh infekce Francisella tularensis Banďouchová Hana, Damková Veronika, Pikula Jiří, Soukupová Ivana, Chumlenová Tereza Ústav veterinární ekologie a ochrany životního prostředí, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Česká republika Úvod Francisella tularensis, gramnegativní nepohyblivá kokobakterie, je původcem tularémie a v současnosti je zařazena na seznam A bioteroristy zneuţitelných agens. Jedná se o zoonózu s přírodní ohniskovostí výskytu postihující více neţ 150 druhů volně ţijících ţivočichů. Jako vektor se mohou účastnit přenosu krev sající členovci, především klíšťata. Rezervoároví drobní savci představují pravděpodobně klíčový článek v koloběhu a udrţování F. tularensis v přírodních ohniscích. V našich podmínkách je vedle přenosu klíštětem nejčastější příčinou onemocnění tularémií u lidí manipulace s ulovenými zajíci. Ročně je v ČR zjištěno okolo 100 případů tularémie u lidí (31 aţ 225 v letech 1996-2004). Někteří autoři (Palo et al., 2005) ale zpochybňují roli zajíců a drobných savců coby rezervoáru původce mezi epizoociemi tularémie. Zdůvodňují to tím, ţe u těchto druhů buď dojde k úhynu, nebo k eliminaci původce. Na druhou stranu jiní autoři popisují chronickou infekci s přeţíváním původce u hostitelů (Petersen et al., 2004). Rozporuplné údaje týkající se udrţování původce tularémie v přírodních ohniscích nás inspirovaly k experimentálnímu ověření vnímavosti hraboše polního a zajíce polního a k porovnání výsledků se standardně pouţívanou laboratorní myší domácí (Pohanka et al., 2007; Bandouchova et al., 2009a; Bandouchova et al., 2009b).

Zatímco u BALB/c myši odpovídalo LD50 na základě našich

experimentů hodnotě 1 CFU (colony forming units), u hraboše to bylo 38 CFU. Nicméně stále se jedná o vysokou citlivost těchto dvou druhů. Oproti tomu u zajíce jsme se dostali na hodnotu LD 50 odpovídající 2,6x109 CFU. Tyto výsledky jsou velmi překvapivé a nekorespondují s dřívějšími představami o citlivosti zajíce. Dle našeho názoru je tedy třeba hledat příčiny rozvoje klinické tularémie u zajíce, který je zřejmě méně vnímavý neţ se dříve předpokládalo. Jednou z příčin můţe být zátěţ prostředí polutanty. Naší hypotézou je, ţe subletální účinky environmentálních polutantů, např. pesticidů, těţkých kovů atd., představují zátěţ pro organismus, která přispívá k rozvoji tularémie i při nakaţení zajíce niţší infekční dávkou F. tularensis. Vzhledem k tomu, ţe se zajíc polní vyskytuje především v zemědělsky obhospodařované krajině, pro model koexpozice s F. tularensis jsme zvolili právě pesticidy.

92

Literární citace Bandouchova H, Sedlackova J, Hubalek M, Pohanka M, Peckova L, Treml F, Vitula F, Pikula J: Susceptibility of selected murine and microtine species to infection by a wild-strain Francisella tularensis subsp. holarctica. Veterinarni Medicina, 2009a, 54(2): 64-74. Bandouchova H, Sedlackova J, Pohanka M, Novotny L, Hubalek M, Treml F, Vitula F, Pikula J: Tularemia induces different biochemical responses in BALB/c mice and common voles. BMC Infectious Diseases, 2009b, 9:101 doi:10.1186/1471-2334-9-101 Palo TR, Ahlm C, Tärnvik A: Climate variability reveals complex events for tularemia dynamics in man and mammals. Ecology and Society, 2005, 10(1): 22-29. Petersen JM, Schriefer ME, Carter LG, Zhou Y, Sealy T, Bawiec D, Yockey B, Urich S, Zeidner NS, Avashia S, Kool JL, Buck J, Lindley C, Celeda L, Monteneiri JA, Gage KL, Chu MC: Laboratory Analysis of Tularemia in Wild-Trapped, Commercially Traded Prairie Dogs, Texas, 2002. Emerging Infectious Diseases, 2004, 10(3): 419-425. Pohanka M, Treml F, Hubalek M, Bandouchova H, Beklová M., Pikula J: Piezoelectric Biosensor for a Simple Serological Diagnosis of Tularemia in Infected European Brown Hares (Lepus europaeus). Sensors, 2007, 7: 2825-2834. Materiál a metody K infekci byl pouţit terénní kmen F. tularensis subsp. holarctica izolovaný ze zajíce polního (jiţní Morava, 2004). Experimentální zvířata byla ustájena v pokusné stáji Ústavu infekčních chorob a epizootologie, který je vybaven laboratoří se stupněm ochrany Biosecurity level 3. Pro experimentální infekci F. tularensis byl vyuţit zajíc polní z umělého chovu. Design testu zahrnoval 5 kontrolních jedinců, 5 jedinců infikovaných subletální dávkou F. tularensis (9x108 CFU), 5 jedinců vystavených působení subletální dávky pesticidu (paraoxon 100 μg/kg) a 5 jedinců s kombinovanou expozicí (F. tularensis a paraoxon, shodné dávky). Infekce byla prováděna subkutánní aplikací suspenze kultury terénního kmenu F. tularensis, paraoxon byl aplikován rovněţ s.c. V průběhu experimentu byla sledována mortalita, klinické příznaky infekce a intoxikace a průběţně (kaţdý 2. den) byla odebírána krev pro hematologické a biochemické vyšetření,

kultivaci, stanovení parametrů oxidativního stresu a hladiny acetylcholinesterázy. Bezprostředně po eutanazii/úhynu byla provedena pitva a odběr vzorků (játra, slezina, plíce, ledviny, mozek) na histopatologii, stanovení parametrů oxidativního stresu (glutathion, glutathionperoxidáza, glutathiontransferáza, glutathion-reduktáza, lipidní peroxidace, superoxid dismutáza, ferric reducing antioxidant power) a aktivity acetylcholinesterázy. Kultivací byla také ověřena 93

aplikovaná infekční dávka (stanovení CFU = colony forming units). Experiment probíhal v souladu s vyhláškou č. 207/2004 Sb., o ochraně, chovu a vyuţití pokusných zvířat a podle zákona č. 312/2008 Sb., na ochranu zvířat proti týrání a podle schváleného projektu pokusu. Výsledky V průběhu experimentu nebyla zaznamenána mortalita v kontrolní skupině zajíců. Skupina exponovaná F. tularensis i paraoxonu vykazovala velmi rychlý nástup klinických příznaků onemocnění a k úhynu došlo 2. a 3. den po infekci. Oproti tomu zajíci exponovaní jen F. tularensis hynuli statisticky vysoce průkazně později a to v rozmezí 3. aţ 10. dne po infekci. Ve skupině exponované paraoxonem došlo k úhynu u jednoho jedince a to 12. den po infekci. Ostatní přeţívali po dobu 22 dní, kdy byla následně provedena eutanazie. V současné době probíhá analýza odebraných vzorků, výsledky hematologického a biochemického vyšetření, stanovení aktivity acetylcholinesterázy, parametrů oxidativního stresu, histopatologie a sérologie tedy budou zpracovány aţ do chystaného článku. Graf 1. Křivky přeţívání v rámci tří exponovaných skupin zajíců.

Survival curves in three treatment groups of hares

Percent survival

100 75

Paraoxon-treated F. tularensis-treated Paraoxon-and-F. tularensis-treated

50 25 0 0

5

10

15

20

25

days post-exposure Závěr Předběţné výsledky potvrzují naši hypotézu o potencování účinků subletálních dávek jednotlivých stresorů. Další závěry a detailní zhodnocení bude provedeno na základě výsledků dalších prováděných analýz a vyšetření. Poděkování Tato studie vznikla za podpory Interní grantové agentury Veterinární a farmaceutické univerzity Brno (číslo grantu 78/2010/FVHE). 94

Effects of cyanotoxins and lead on avian reproduction: testicular toxicity in Japanese quails Damková Veronika, Soukupová Ivana, Pikula Jiří Department of Veterinary Ecology and Environmental Protection, Faculty of Veterinary Hygiene and Ecology, University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno, Czech Republic

Introduction Microcystins (MCs) are potent natural toxins produced by cyanobacteria in euthrophic freshwater environments. Adverse effects associated with exposure to MCs have been recognized in a wide range of species including invertebrates and vertebrates. Knowledge on avian toxicity associated with toxic algal blooms is based on both wild bird mortality events and experimental studies. Mortality as well as morbidity due to sub-lethal exposure of adult birds can exert reproductive effects on a population level. Surprising results were, however, obtained when studying effects of cyanobacterial biomass on avian reproduction. The lower weight of eggs produced by exposed parental hens was not reflected in their biological quality because the reproductive parameters such as egg viability, hatchability, and the overall effect of hatching in cyanobacterial-biomass-exposed birds were better than in the control group. Contrary to this, there is a growing body of evidence for toxic effects of MCs in the mammalian male reproductive system and testes seem to be another target organ for these biotoxins. Interestingly, xenoestrogenic potential of MC-LR has recently been recognized in cultured mammalian cells. It was, therefore, our goal to examine testicular toxicity of sub-lethal chronic exposure to cyanobacterial biomass of known microcystins.

Materials and Methods Experimental design Japanese quails (80 two-months-old birds) were randomly divided into 40 breeding pairs and kept in cages appropriate for this avian species for three weeks of acclimation. The onset of reproduction and egg laying was stimulated by increasing the photoperiod to 16 hours a day and supplying the birds with a feeding mixture for laying hens plus. A two-week pre-treatment period was started as the egg production was at its peak. Again on a random basis, 20 pairs were allocated into both control and exposure group. The pre-treatment period enabled selection of the final 16 control and 16 exposed pairs meeting the validity criteria of the OECD Avian Reproduction Toxicity Test. The parental cages were distributed in such a way that positional effects were 95

avoided. During the treatment period, the experimental pairs were exposed to cyanobacterial biomass mixed with the feed for eight weeks. The control Japanese quail pairs were fed the same diet without the cyanobacterial biomass. No mortality was observed during this experiment. At the end of the eight-week treatment period all adult birds were blood sampled, euthanized and necropsied. Histopathology Testicles were collected into 10% buffered formalin during autopsy, treated using a routine histological technique and embedded in paraffin. Sections of 5 µm of the paraffin blocks were made, and these were stained with haematoxylin and eosin. Biochemical methods In whole blood and plasma, the measurement of basic biochemical parameters was performed. Statistical analysis Statistica for Windows® 7.0 (StatSoft, Tulsa, OK, USA) was used to compare different treatment groups by one-way analysis of variance (ANOVA) and post-hoc analysis of means by the LSD test. Homogeneity of variances was tested by the Levene´s test. Non-homogenous parameters, as determined by the Levene´s test, were log-transformed prior to analysis. In these cases, the nonparametric Kruskall-Wallis test was used for comparison of treatment groups. Values of p<0.05 and p<0.01 were considered statistically significant and highly significant, respectively, for all tests.

Results A dense population of all developmental stages of spermatozoa, i.e., spermatogonia, primary and secondary spermatocytes, spermatids and spermatozoa in the seminiferous tubuli, was present in testicles of control birds (Figure 1A, not shown). Male birds treated with cyanobacterial biomass in feed were showing moderate to marked atrophy of the seminiferous tubular epithelium. There were only sparse developmental stages of spermatozoa and Sertoli cells (Figure 1B, not shown). There were no differences in testicular levels of glutathione and activities of glutathione reductase, glutathione-S-transferase and superoxide dismutase of control and cyanobacterialbiomass-exposed birds. As shown in Figures 2A and 2B biomass-exposed birds had lower levels of lipid peroxidation and decreased activities of glutathione peroxidase in testes (both about 20% lower than control birds), respectively, (p<0.05). Figure 2C shows comparison of activities of testicular catalase that are nearly twice elevated in biomass-exposed birds (p<0.01). The manuscript titled “Testicular toxicity of cyanobacterial biomass in Japanese quails“acknowledging the support by the Internal Grant Agency of the University of Veterinary 96

and Pharmaceutical Sciences Brno (Grant No. 79/2010/FVHE) has already been submitted to the Journal of Food and Chemical Toxicology on 8th November 2010. Figure 2. Comparison of testicular tissue responses of oxidative stress parameters from control and cyanobacterial-biomass-exposed Japanese quails. (2A) Lipid peroxidation assessed as total thiobarbituric acid reactive species. (2B) Activities of glutathione peroxidase. (2C) Catalase activities. Eight-week oral exposure. * = p<0.05, ** = p<0.01; n=16 males in each group.

Conclusions Many aspects of reproductive toxicology of cyanobacterial biomass and MCs remain to be evaluated in birds. Based on the evidence of this study, birds exposed to cyanobacterial biomass for a long period may be at risk of reproductive impairment. 97

Změny chemického složení těla bažantích kuřat v průběhu ontogenetického vývoje s cílem optimalizovat krmné směsi Kateřina Karásková, Márk Jámbor, Pavel Suchý, Eva Straková Ústav výživy, zootechniky a zoohygieny, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Mezi nejvýznamnější druhy pernaté zvěře u nás patří baţant obecný (Phasianus colchicus), kterého jsme pouţili jako modelový organismus v naši práci. Jeho početní stavy v přírodě jsou dnes, ve velké míře, doplňovány z tzv. odchoven pernaté zvěře. Dnešní krmné směsi pouţívané pro odchov baţantů však přesně neodráţí jejich ţivinové a energetické potřeby. Cílem práce je zpřesnit nutriční nároky organismu na základě znalosti chemického sloţení těla baţantích kuřat v průběhu jejich ontogenetického vývoje, na základě znalosti chemického sloţení prsní a stehenní svaloviny a na základě znalosti chemického sloţení doposud pouţívaných krmných směsí pro baţanta obecného a vyuţít tyto poznatky k optimalizaci pouţívaných diet, které by měly plně respektovat poţadovanou intenzitu růstu, co nejniţší spotřebu krmných směsí na jednotku produktu, při současném zachování dobrého zdravotního stavu odchovávaných zvířat. Dosaţené výsledky z řešení projektu nelze pokládat za konečné, ale za výchozí materiál pro následnou optimalizaci krmných směsí určených k odchovu baţantích kuřat. Materiál a metodika Pro realizaci biologického pokusu bylo pouţito 200 jednodenních baţantích kuřat, která byla odchovávána na hluboké podestýlce v akreditované experimentální stáji Ústavu výţivy, zootechniky a zoohygieny s řízeným světelným, teplotním, zoohygienickým a krmnětechnologickým reţimem. V průběhu výkrmu byla baţantům podávána krmná směs a voda ad libitum. Celkem byly pouţity tři krmné směsi a to, kompletní sypká krmná směs BR 1 do 15. dne odchovu, granulovaná krmná směs BR 2 do 30. dne výkrmu a směs BR 3 podávána do 90. dne výkrmu. Celková délka experimentu byla 90 dnů. Během této doby byla v pravidelných 10denních intervalech všechna kuřata váţena a jejich hmotnosti byly vyuţity k výpočtu průměrné ţivé hmotnosti baţantích kuřat. Zároveň bylo náhodně vybráno 10 jedinců, kteří byli omráčeni, a jejich celá těla byla podrobena analýze. U jedinců v 90. dnu byla také vypitvána prsní a stehenní svalovina, která byla rovněţ pouţita k chemické analýze. Od 50. dne věku bylo rozlišeno pohlaví.

98

Po homogenizaci získaných vzorků, byly odebrány vzorky pro stanovení sušiny, hrubého proteinu (N x 6.25), tuku, popele, vápníku (Ca), fosforu (P) a hořčíku (Mg). Sušina byla stanovena vysoušením vzorku za předepsaných podmínek váţkově při 103 ± 2°C do konstantní hmotnosti. Dusíkaté látky byly stanoveny analyzátorem Büchi (firma Centec automatika, spol. s.r.o.). Tuk byl stanoven analyzátorem ANKOM XT10 Fat Analyzer (firma O.K. SERVIS BioPro). Popel byl stanoven váţkově po zpopelnění vzorku při teplotě 550 °C za předepsaných podmínek. Prvky vápník, fosfor, hořčík byly stanoveny zpopelněním a vyluhováním extrakcí a následně titrací. Pro vyšší objektivitu jsou výsledky analýz vyjádřeny ve 100% sušině. Výsledky byly zpracovány za pouţití programu UNISTAT for Excel verze 5.6. Výsledky a diskuse V tabulce 1 je uvedeno zastoupení dusíkatých látek, tuku a popelovin v sušině těla baţantů. Nejvyšší obsah dusíkatých látek byl zaznamenán ve věku 70 dnů, a to 933.8 g.kg-1 sušiny. Nejvyšší obsah tuku byl zaznamenán ve věku 1 dne, a to 312.2 g.kg-1 sušiny. Nejvyšší obsah popelovin byl zaznamenán ve věku 80 dnů, a to 133.5 g.kg-1 sušiny. Tabulka 1. Nutriční sloţení sušiny baţantích těl v 10 denních intervalech g.kg-1

1.den

10.den

20.den

30.den

40.den

50.den

60.den

70.den

80.den

90.den

NL

555.6

657.9

765.5

705.1

704.4

519.3

923.7

933.8

829.5

803.5

Tuk

312.2

123.4

48.2

108.3

117.9

74.2

113.6

103.1

117.6

145.0

Popel

72.3

90.6

102.7

97.9

103.9

119.1

118.2

128.0

133.5

122.6

V tabulce 2 a 3 je uvedeno nutriční sloţení sušiny prsní a stehenní svaloviny u slepiček a kohoutků v 90. dnu věku. Sušinu prsní svaloviny lze charakterizovat vyšším obsahem hrubého proteinu a fosforu. Sušinu stehenní svaloviny lze charakterizovat vyšším obsahem tuku, popelovin, vápníku a hořčíku. Rozdíly mezi sloţením prsní a stehenní svaloviny uvádí ve své práci i Petkov (1984). Změny sloţení svaloviny v průběhu vývoje dále uvádějí ve své práci Večerek et al. (2005). V rámci pohlaví lze konstatovat, ţe výraznější rozdíly v nutričním sloţení vykazuje hlavně stehenní svalovina, která u slepiček obsahovala méně hrubého proteinu, popelovin, vápníku a více tuku. Vlivem pohlaví na nutriční sloţení svaloviny se ve své práci zabývali také Adamski et al. (2006).

99

Tabulka 2. Nutriční sloţení sušiny prsní svaloviny u slepiček a kohoutků v 90. dnu věku (g.kg-1)

n

Hrubý

Tuk

Popel

Ca

P

Mg

protein Slepičky

Kohoutci

40

40

930.57±

29.58± 45.61±

0.67±

10.16±

1.56±

26.839

24.507

0.166

0.367

0.202

937.23±

29.92± 45.78±

0.57±

9.72±

1.51±

25.732

20.570

0.066

0.370

0.141

1.401

1.243

Tabulka 3. Nutriční sloţení sušiny stehenní svaloviny u slepiček a kohoutků v 90. dnu věku (g.kg-1)

n

Hrubý

Tuk

Popel

Ca

P

Mg

protein Slepičky

Kohoutci

40

40

781.80

163.74

1.28

9.31

1.63

± 53.853 ± 56.035 ± 3.537

± 0.174

± 0.648

± 0.203

810.07

1.32

9.23

1.56

± 0.172

± 0.905

± 0.243

140.71

46.52

48.97

± 80.856 ± 84.808 ± 5.512

Závěr Z uvedených výsledků vyplývá, ţe nutriční hodnota prsní svaloviny je vyšší, neţ nutriční hodnota stehenní svaloviny. Obsah jednotlivých ţivin v těle baţantů se s věkem mění, narůstá hlavně obsah tuků a popelovin. Předloţená práce prezentuje prozatím dílčí výsledky z experimentálního sledování. Po komplexním dokončení analýz bude na základě posouzení změny chemického sloţení celého těla i svaloviny baţanta obecného, v průběhu jeho vývoje, optimalizována ţivinová a energetická potřeba organismu v jednotlivých etapách ontogenetického vývoje a těmto nárokům bude přizpůsobena (optimalizována) krmná směs s doporučením pro přesně definovanou etapu jeho vývoje (odchovu). Seznam literatury 1. Petkov R 1984: Chemical composition of pheasant meat. Veterinarno-meditsinski nauki 21: 106-110 2. Adamski M, Kuzniacka J 2006: The effect of age and sex on slaughter traits of pheasants (Phasianus colchicus L.). Aninal Science Papers and Reports 24(Suppl. 2): 11-18 3. Vecerek V, Suchy P, Strakova E, Vitula F, Mikundova M 2005: Variation in the chemical composition of muscles in young pheasants during their growth. Archiv fur TierzuchtArchives of Animal Breeding 48(3): 290-298 Práce vznikla za finanční podpory projektu IGA 88/2010/FVHE 100

Biochemistry values in the Grey Partridge (Perdix perdix): normal values and effects of mycoplasmosis Vitula František, Chumlenová Tereza, Banďouchová Hana, Soukupová Ivana, Damková Veronika, Pikula Jiří Department of Veterinary Ecology and Environmental Protection, Faculty of Veterinary Hygiene and Ecology, University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno, Czech Republic

Introduction The Grey Partridge (Perdix perdix) is one of the most important native game birds in the Czech Republic. Regretfully, there was a major population decline from the second half of the 20th century in Europe, the causes of which are not fully understood and are generally assumed to be multi-factorial because, under natural conditions, wild birds can be exposed to multiple stressors including natural toxins, anthropogenic pollutants and infectious agents. It is a legitimate endeavour of hunting ground managers to support wild game by artificially bred and released birds. Artificial breeds, however, can be limited by health problems, prevention, control and therapy of which belong to the responsibility of veterinarians. It is understandable that effective diagnostic procedures including biochemical examination are essential for these purposes. The objective of this study was to evaluate normal blood and tissue biochemical parameters as well as biochemical responses in a flock of Grey Partridges naturally infected with Mycoplasma gallisepticum.

Materials and Methods Experimental birds A total of 5 Mycoplasma gallisepticum infected pairs of birds showing pronounced clinical signs were blood sampled and then killed in order to collect organs such as the heart, brain, spleen, liver, eyes, gonads and lungs. A control group of 5 healthy pairs were also sampled. Mycoplasma gallisepticum was identified by culture and polymerase chain reaction.

Biochemical methods The biochemical analyses were performed in tissues sampled at the time of autopsy and kept at 80 ºC until use. All biochemicals, enzymes and other chemicals used for preparation of buffers were purchased from Sigma-Aldrich (Prague, CZ) and were of the highest available commercial grade. The tissue was homogenized on ice using mechanical homogenizer (100 mg of tissue in 1 mL) in 101

50mM potassium phosphate buffer (KH2PO4 with 1mM EDTA, pH 7.4) for assessment of catalase (CAT) and superoxidae dismutase (SOD) and in phosphate buffer saline (PBS, pH 7.2) for other parameters. The postmitochondrial supernatant was collected after centrifugation (30min at 30 000 g at 4C for CAT and SOD and 15 min at 10 000 g at 4C for the other parameters) and stored frozen at -80°C until biochemical analyses. Briefly, the glutathione-S-transferase (GST) activity was measured spectrophotometrically using 1-chloro-2,4-dinitrobenzene. The concentration of reduced glutathione (GSH) was determined using 5,5´-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) as a chromogen. Activities of glutathione peroxidase (GPx) and glutathione reductase (GR) were determined from the rate of NADPH oxidation. The level of lipid peroxidation in avian tissues was assessed as total thiobarbituric acid reactive species (TBARS). Activity of SOD was determined spectrophotometrically at 560 nm according to the method using nitroblue tetrazolium

as a

substrate. The reaction mixture contained 60 μM nitroblue tetrazolium, 100 μM NADH and 35 μM phenazine methosulfonate in 50 mM potassium phosphate/1 mM EDTA buffer. Activity of CAT was evaluated spectrophotometrically at 240 nm in cuvettes as a rate of hydrogen peroxide breakdown in the mixture containing 0.09% hydrogen peroxide in 50 mM TRIS/0.1 mM EDTA buffer. The protein concentrations were determined by the method using the Folin-Ciocalteu phenol reagent. The GENios spectrophotometric microplate reader (Tecan Group, Switzerland) was used to measure the absorbance in all assays and spectrophotometer VARIAN CARY 50 Bio (Varian, USA) was used for measurement of absorbance of solutions in cuvettes. The total antioxidant capacity was measured using the ferric reducing antioxidant power assay (FRAP). Plasma was analysed using an automated analyser (SPOTCHEM™ EZ SP-4430, ARKRAY, Japan) for total protein (g/l), glucose (mmol/l), creatinine (µmol/l), uric acid (µmol/l), aspartate aminotransferase (µkat/l), creatine kinase (µkat/l), lactate dehydrogenase (µkat/l), alkaline phosphatase (µkat/l), total cholesterol (mmol/l), triglycerides (mmol/l), amylase (µkat/l), phosphorus (mmol/l), potassium (mmol/l) and sodium (mmol/l). Plasma calcium (mmol/l) concentrations were analysed with an Atomspec analyser (Hilger 1550, Cambridge, UK).

Statistical analysis Statistica for Windows® 7.0 (StatSoft, Tulsa, OK, USA) was used to compare different groups by one-way analysis of variance (ANOVA) and post-hoc analysis of means by the LSD test. Values of p<0.05 and p<0.01 were considered statistically significant and highly significant, respectively, for all tests.

102

Results Compared to controls, mycoplasmosis in the Partridge caused significant differences in the level of lipid peroxidation measured as total thiobarbituric acid reactive species (TBARS) in avian lungs (Fig. 1) and plasma, ferric reducing antioxidant power (FRAP) in the heart and kidneys, reduced glutathione in the heart, liver, kidneys, gonads and plasma, glutathione reductase activity in lungs, glutathione-S-transferase activity in the liver, kidneys and eyes, and plasma lactate dehydrogenase. Figure 1. Lipid peroxidation differences in lungs from Mycoplasma gallisepticum-infected and control Grey Partridges; ** = p<0.01, n=10 in each group.

Conclusions Mycoplasma species are known to induce oxidative stress in the host. The present results clearly demonstrate modulation of oxidative stress-associated parameters during avian mycoplasmosis. In summary, the reference values obtained in this study will be useful in the clinical and laboratory examination of the Grey Partridge and will help in the evaluation of the state of health of this avian species. Acknowledgements This study was supported by the Internal Grant Agency of the University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno (Grant No. 80/2010/FVHE).

103

Morfologické změny na Artemia franciscana působením ionizujícího záření Michal Ţďárský, Petr Dvořák Ústav biochemie, chemie a biofyziky, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Důleţitým rozdílem, který odlišuje pokus na zvířeti od jiných, je sloţitost ţivých soustav, jeţ nelze zjednodušit. Pouţijeme-li k výzkumu tkáně či buňky, jde o studium dílčích systémů, nikoli o zjednodušený organizmus. Evropská konvence o ochraně obratlovců pouţívaných pro pokusné a jiné vědecké účely poţaduje omezit počet pokusů na těchto zvířatech na minimum. Poţadavkům vyhovuje různé uspořádání subakutního biotestu na Artemia franciscana (dříve uváděná jako A. salina). Podle charakteru líhnutí organismů z klidových stádií ho lze zařadit mezi testy druhé generace. Předchozí práce byly zaměřeny zejména na sledování letality Artemia franciscana v závislosti na dávce ionizujícího záření. Bylo stanoveno LD50 za 96 hodin po expozici na 600-700 Gy, coţ odpovídá i fylogenetickému zařazení druhu. Téţ v projektu Biostack byl na palubě Apolla 16 zkoumán vliv kosmického záření na klidová stádia, u nichţ vlivem kosmického záření byla sníţena líhnivost z 90 % na 10 %.

Vzhledem

k tomu,

ţe

námi

sledovaný

organismus

Artemia

franciscana prochází poměrně rychlými vývojovými stádii (instar), je moţné sledovat morfologické změny organismu v poměrně krátkém časovém období v závislosti na obdrţené dávce ionizujícího záření. Materiál a metodika V experimentu byla pouţita slaná voda ve sloţení [g·L-1] 23.9 NaCl; 10.83 MgCl2·6H2O; 2.25 CaCl2·6H20; 0.68 KCl; 9.06 Na2SO4·10 H2O; 0,20 NaHCO3; 0.04 SrCl2 · 6H2O; 0.099 KBr; 0.027 H3BO3 o salinitě 47 g·L-1 a pH 7,6  0,1. Líhnutí bylo prováděno při teplotě 26°C po dobu 36 hodin. Naupliová stádia byla přenesena do 6 polyethylenových lahví o objemu jeden litr. Pět lahví s organismy bylo vystaveno za 40 hodin od počátku líhnutí ionizujícímu záření gama (60Co) o dávce 250, 500, 1000 a 2500 Gy (dávkový příkon 1,875 kGy·h-1). Šestá lahev slouţila jako soubor kontrolních jedinců. V lahvi bylo 200 ml roztoku slané vody s přibliţně 100 jedinci. Naupliová stádia ve stáří 24, 48 a 72 h od ozáření byla přenesena na podloţní sklíčko, devitalizována a fixována formaldehydem a pozorována s následnou mikrofotodokumentací.

104

Výsledky a diskuse V průběhu vývoje pozorujeme u larev druhého instaru segmentaci v thorakální části a zakládání apendiklů, ze kterých se později formují phylopoda pro dýchání a příjem potravy. U jedinců exponovaných dávkou 250 Gy je segmentace jiţ méně znatelná a stejné je to i u jedinců exponovaných 500 Gy. U jedinců, kteří obdrţely dávku 1 000 Gy je segmentace téměř neznatelná nebo úplně chybí. Jedinci, kteří obdrţely dávku 2 500 Gy se nevyvíjejí a hynou do 72 hodin po ozáření. Naupliová stádia, která obdrţela dávku 500 a 1000 Gy se i ve stáří 96 hodin podobají larvám prvního instaru. U kontrolní skupiny je tělo protáhlé, u skupiny ozářené dávkou 500 Gy je tělo výrazně kratší a rozšířené v torakální oblasti. Další pozorovanou morfologickou odchylkou je změna utváření střevní výstelky. U kontrolní skupiny je neporušená střevní výstelka tvořena epiteliálními buňkami. Poměr výšky epitelu k lumenu střeva je přibliţně 1:1,5-2. U dávky 250 Gy je zřetelné oploštění střevního epitelu a jeho poměr je variabilní, dosahující aţ poměru 1:7. U skupiny 500 Gy pozorujeme nejen oploštění 1:71:10 ale i lokální vymizení. U skupiny ozářené 1 000 Gy jiţ není ve většině případů moţné střevní epitel rozeznat. U jedinců ozářených dávkou 2500 Gy nedochází vůbec k jeho dalšímu vývinu. Výsledky působení ionizujícího záření na vývin střevní výstelky Artemia odpovídají výsledkům u savců. Je obecně známo, ţe buňky střevního epitelu obratlovců patří vzhledem k vysoké mitotické aktivitě mezi buňky s velmi vysokou radiosenzitivitou. Závěr Morfologické změny pozorujeme u jedinců, kteří obdrţeli dávku 250 Gy a vyšší. Z tohoto pohledu by mohl biotest II. generace nahradit konvenční testy na obratlovcích.

Seznam literatury: 1. Barger, A.J. 2005: The cosmic history of the X-ray background. Philos Transact A Math. Phys. Eng. Sci. 15, 685-694. 2. Beňová, K., Dvořák, P., Falis, M., Daňová, D., 2006. Elimination of negative effects of cadmium in Artemia franciscana by exposure to ionizing radiation. Folia Vet. 50, 3, Supplementum, 21-22. 3. Beňová, K., Dvořák, P., Falis, M., Sklenář, Z., 2007. Interaction of low doses of ionizing radiation, potassium dichromate and cadmium chloride in Artemia franciscana biotest. Acta Vet. Brno 76, 35-40. 105

4. Calabrese, E. J., Baldwin, L.A. 2000: Radiation hormesis: the demise of a legitimate hypothesis. Hum. Exp. Toxicol. 19, 76-84. 5. Dvořák, P., 1999. Monitoring of low doses expositions by ionizing radiation and harmful substances using bio-test with Artemia salina. Thesis, FVHE VFU Brno, Brno, Czech Republic. 194. 6. Dvořák, P., Beňová, K., 2002. The investigation of interactions of low doses of ionizing radiation and risk factors by means of Artemia salina biotest. Folia Vet. 46, 4, 195 – 197. 7. Dvořák, P., Beňová, K., Ţďárský, M., Sklenář, Z., Havelková, A. Second-generation alternative biotests on crustaceans of genus Artemia. Acta Veterinaria Brno, 2010, vol. 79, pp 47-53 8. Dvořák, P., Šucman, E., Beňová, K. The development of a ten-day bio-test using Artemia salina naupli. Biologia 60, 2005, No. 5, pp. 593-597. 9. Dvořák, P., Ţďárský, M., Beňová, K., 2009. Possibilities of alternative generation II biotests at Artemia. Interdisc. toxicol. 2, 45-47. 10. Ohnishi, T., Takahashi, A., Ohnishi, K. 2002: Studies about space radiation promote new fields in radiation biology. J Radiat. Res. 43, 7-12. 11. Ruppert, E.E., Fox, R.S.,

Barnes, R.D., 2003. Invertebrate zoology. Itps Thompson

Learning, USA, 435 p. 12. Squire, R.D., 1973: The effects of acute gamma irradiation on the brine schrimp, Artemia. Biol. Bull. 144, 192-199. 13. Wilson, R.C., Vives i Bastlle, J., Watts, S.J., McDonald, P., Jones, S.R., Craze, A. 2009: An approach for the assessment of risk from chronic radiation to populations of phytoplankton and zooplankton. Radiat. Environ. Biophys. 49, 87-95.

This research was supported by the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (IGA VFU Brno 202112).

106

Příspěvky Farmaceutické fakulty

107

108

Mikročásticová léková forma pro řízené uvolňování léčiva PharmDr. Martina Bajerová, PharmDr. Kateřina Dvořáčková, Ph.D., Veronika Říhová Jana Tomašáková Ústav technologie léků, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita, Brno Úvod Mikročástice nabízejí ve srovnání s jednotkovými lékovými formami celou řadu výhod, mezi které patří moţnost řízeného uvolňování léčiva pro zajištění optimální terapeutické koncentrace léčiva v krevní plazmě, moţnost kombinace více účinných látek, uvolňování léčiva nezávisle na příjmu potravy, podání inkompatibilních léčiv, ochranu léčiva před neţádoucími vlivy okolního prostředí, sníţení dráţdivosti GIT sliznic působením některých léčiv, maskování nepříjemné chuti a vůně, přeměnu kapalných nebo lepkavých pevných látek na sypké prášky. Vhodnými kandidáty pro enkapsulaci jsou léčiva vyznačující se krátkým biologickým poločasem nebo omezenou biologickou dostupností po perorálním podání. Mezi léčiva s poţadovanými parametry patří analgetikum ze skupiny anodyn tramadol-hydrochlorid. Práce se zabývá optimalizací přípravy mikročástic s obsahem tramadol-hydrochloridu metodou odpaření rozpouštědla z násobné emulze v/o/v. Cílem práce byla optimalizace přípravy a sledování vlivu formulačních a procesních proměnných na jakostní parametry mikročástic připravených z dvou typů Resomeru - RG 504 H a RG 504 S. Materiál a metodika Jako stěnotvorné polymery se pouţily dva typy kopolymeru kyseliny mléčné a glykolové (PLGA) Resomer RG 504 H a Resomer RG 504 S. Vodný roztok tramadol-hydrochloridu se vemulgoval do 5% roztoku PLGA v dichlormethanu za vzniku primární emulze v/o, která se stabilizovala pomocí zařízení Ultra-turrax. Primární emulze se následně emulgovala do vnější vodné fáze při 600, 800, 1000 a 1200 otáčkách za minutu, kde se formovala násobná (sekundární) emulze typu v/o/v. Během dvou hodin došlo k odpaření rozpouštědla a vytvoření mikročástic (MP). Vzniklé mikročástice se třikrát promyly čištěnou vodou a následně se sušily při teplotě 25 °C. Sledoval se vliv typu kopolymeru PLGA a počtu otáček na enkapsulační účinnost, distribuci velikosti částic a výtěţek procesu.

109

Výsledky Enkapsulační účinnost (EE) vzorků mikročástic a výtěţky procesů jsou uvedeny v tabulce 1 pro MPH a v tabulce 2 pro MPC. Tvar a povrch mikročástic je patrný ze snímků z elektronového skenovacího mikroskopu (obr. 1 a 2). Grafické znázornění distribuce velikosti částic stanovené laserovou difrakcí je uvedeno na obrázcích 3 a 4.

110

Závěr Připravily se mikročástice s obsahem tramadol-hydrochloridu metodou odpaření rozpouštědla z násobné emulze v/o/v s pouţitím dvou typů kopolymeru PLGA Resomeru RG 504 H a Resomeru RG 504 S. Sledoval se vliv pouţitého typu polymeru a počtu otáček míchadla na velikost mikročástic, jejich enkapsulační účinnost a výtěţek procesu. U Resomeru RG 504 H neměl počet otáček míchadla výrazný vliv na EE ani na výtěţek procesu (tab. 1). U připravených mikročástic byl patrný zbrázděný povrch s četnými, nepravidelnými póry, jejichţ počet klesal při pouţití vyššího počtu otáček míchadla (obr. 1). Výrazný vliv byl pozorován u distribuce velikosti částic. S rostoucím počtem pouţitých otáček míchadla se střední velikost částic zvyšovala (obr. 3). U druhého typu PLGA kopolymeru Resomeru RG 504 S měl počet otáček míchadla vliv na EE, výtěţek procesu (tab. 2) i distribuci velikosti mikročástic. Z výsledků vyplývá, ţe s rostoucím počtem pouţitých otáček míchadla se sniţovala EE, výtěţek procesu i střední velikost částic (obr. 4). Připravené mikročástice vykazovaly hladký, kompaktní povrch s menším mnoţstvím pravidelných pórů, jejichţ počet klesal s rostoucím počtem otáček míchadla (obr. 2).

111

Ovlivnění biodostupnosti metodou přípravy polymorfů léčivé látky během výroby lékové formy Ladislava Okáčová, David Vetchý, Petr Doleţel, Jan Muselík, Marie Mrázková, Ţaneta Večeřová Ústav technologie léků, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod V současné době stále častěji dochází k vývoji léčivých látek, které jsou ve vodném prostředí prakticky nerozpustné. To představuje problém při formulaci lékové formy, která by zaručovala jejich přijatelnou biologickou dostupnost. Uvedená problematika se stává často diskutovanou i v souvislosti se zvýšenou spotřebou léků v terapii civilizačních onemocnění, protoţe léčivé látky zde pouţívané spadají často do kategorie těţce rozpustných. Nejméně 40 % současných léčiv je tvořeno těţce rozpustnými substancemi. Zvýšení biodostupnosti těţce rozpustné účinné látky při zachování její biologicky aktivní struktury lze docílit mnoha způsoby, ať uţ chemicky, fyzikálně nebo biologicky. Z hlediska snadnější taxonomie lze tyto procesy rozdělit na úpravu léčivé látky nebo na úpravu lékové formy speciálním technologickým procesem. V praxi dochází k jejich kombinacím. Jednou z moţností, jak zvýšit biologickou dostupnost, je pouţití specifického technologického postupu pro zapracování určité fyzikální formy účinné látky do lékové formy. Lze vyuţít specifických tvarů a velikostí krystalů léčiva nebo přímo vhodného polymorfu. Projekt se proto zaměřil na zpracování modelových polymorfních léčivých látek do tabletové lékové formy a na sledování vlastností připravených lékových forem. Cílem projektu bylo vyvinout technologii přípravy lékové formy pro těţce rozpustné polymorfní léčivo. Z důvodu omezeného rozsahu se příspěvek věnuje pouze experimentu s modelovým léčivem mirtazapinem. Materiál a metodika Modelovou léčivou látkou bylo ve vodě špatně rozpustné polymorfní antidepresivum mirtazapin. Tato léčivá látka se krystalizovala z nasycených roztoků různých organických rozpouštědel čistoty p. a. Methanol, dichlormethan, isopropanol a chloroform se vybral k dalším experimentům. Formulace tabletové lékové formy pro špatně rozpustnou léčivou látku jednokrokovou metodou se prováděla ve vysokootáčkovém homogenizačním zařízení Rotolab Zanchetta. Roztokem léčivé látky se impregnovala směs Dikafosu (plnivo), Avicelu PH 101 (plnivo) a koloidního oxidu křemičitého (desikátor, kluzná látka). Organické rozpouštědlo se poté odpařilo za pomocí vývěvy připojené k přístroji. Předpokládalo se, ţe se tímto technologickým postupem bude vzniklý 112

polymorf fixovat na směs pomocných látek a nebude přecházet v jinou krystalickou modifikaci. K vysušené směsi se přidal stearan hořečnatý (kluzná látka) a Ac – Di – Sol (rozvolňovadlo). Takto připravená tabletovina se vylisovala do tablet o průměru 10 mm rotačním výstředníkovým lisem Korsch EK0. Provedlo se hodnocení tabletovin (mikroskopická analýza - optický mikroskop DN 45 s ccd kamerou, sítová analýza - zařízení pro sítovou analýzu AS 200 Basic, tokové vlastnosti - přístroj na měření setřesné hustoty Erweka SVM 102) i připravených tablet (hmotnostní stejnoměrnost dle ČL 2009, výška tablet, pevnost tablet – přístroj pro stanovení pevnosti C 50, oděr tablet – přístroj pro stanovení oděru Erweka TAR 10, disoluční zkouška - disoluční přístroj SOTAX AT 7 Smart). Výsledky Obrazová analýza prokázala různé tvary krystalů mirtazapinu při krystalizaci z různých rozpouštědel. Krystalizace z chloroformu a dichlormethanu vedla ke vzniku obdobných tvarů krystalů, nejodlišnější tvar krystalů tvořil mirtazapin při krystalizaci z isopropanolu (viz obr. 1). Provedením sítové analýzy a zkoušek sypné a setřesné hustoty se u tabletovin neprokázaly významné rozdíly mezi jednotlivými šarţemi. Při zkoušce sypnosti tabletovin obsahujících mirtazapin se 100 g vzorku s dichlormethanem a chloroformem vysypaly otvorem zařízení na měření sypnosti rychleji neţ vzorky impregnované roztokem léčivé látky v methanolu a isopropanolu (viz tab. 1). Připravené tablety vyhověly lékopisným poţadavkům na hmotnostní stejnoměrnost a oděr. Zkouška disoluce tablet s mirtazapinem v prostředí 0,1M HCl neprokázala rozdíl mezi jednotlivými šarţemi, tablety se prakticky rozpadly do 10 min a léčivá látka se rozpustila v disolučním médiu (viz obr. 2). Rozdílnost jednotlivých šarţí však byla patrná při disoluci tablet ve fosforečnanovém pufru o pH 6,8. Tablety připravené z roztoku dichlormethanu a z chloroformu uvolňovaly především zezačátku disoluční zkoušky větší mnoţství léčiva neţ tablety připravené pomocí roztoku methanolu a isopropanolu (viz obr. 3). Závěr V rámci experimentu se podařilo připravit tabletové lékové formy s rozdílným disolučním profilem těţce rozpustné modelové léčivé látky mirtazapinu. V současné době probíhají analytická měření, která potvrdí, zda jsou zjištěné rozdíly důsledkem vzniku rozdílných tvarů krystalů anebo krystalických modifikací mirtazapinu během procesu impregnace.

113

Obr. 1: Různá morfologie krystalů modelového léčiva mirtazapinu způsobená krystalizací z různých organických rozpouštědel

Rozpouštědlo

Sypná

Setřesná

Hausnerův

hustota

hustota

poměr

(g/cm)

(g/cm)

Sypnost

(s)

Placebo

0,72 ± 0,01

0,90 ± 0,00

1,25 ± 0,01

2,57 ± 0,11

Bez rozpouštědla

0,66 ± 0,01

0,84 ± 0,01

1,28 ± 0,02

2,74 ± 0,10

Methanol

0,62 ± 0,00

0,80 ± 0,00

1,30 ± 0,00

1,82 ± 0,03

Dichlormethan

0,61 ± 0,00

0,78 ± 0,00

1,26 ±0,01

1,42 ± 0,03

Isopropanol

0,71 ± 0,01

0,83 ± 0,00

1,17 ± 0,02

1,81 ± 0,07

Chloroform

0,62 ± 0,01

0,81 ± 0,01

1,30 ± 0,01

1,66 ± 0,03

Tab. 1: Tokové vlastnosti tabletovin s mirtazapinem

Obr. 2: Disoluční profily jednotlivých šarţí šarţí v 0,1 M HCl

Obr. 3: Disoluční profily jednotlivých v pH 6,8

114

Hodnocení cytotoxicity a vlivu látek izolovaných z Morus alba na buněčný cyklus lidských leukemických buněk. Naděţda Strnková1, Veronika Závalová1, Karel Šmejkal2, Peter Kollár1 1

Ústav humánní farmakologie a toxikologie, Farmaceutická fakulta, Veterinární a

Farmaceutická Univerzita Brno, 2 Ústav přírodních léčiv, Farmaceutická fakulta, Veterinární a Farmaceutická Univerzita Brno Úvod Morušovník bílý – Morus alba L. (Moraceae) je strom původem ze severních oblastí Číny. Dosud byly z této rostliny izolovány flavony, stilbeny a benzofuranové deriváty (1), u nichţ byla zjištěna antioxidační, protizánětlivá nebo protivirová aktivita (2). Jiţ v minulosti jsme hodnotili cytotoxicitu přírodních látek nově izolovaných z jiných rostlin a u některých z nich jsme detailněji charakterizovali účinky na buněčný cyklus nádorových buněk (3,4). Pilotní screeningová studie s novými obsahovými látkami z kořene Morus alba (MA-12/1, MA-13 a MA-14; prenylované fenoly) ukázala na potenciální efekt jedné z látek (MA-13) na buněčnou kinetiku lidské leukemické linie THP-1. Cílem práce bylo stanovit cytotoxicitu a optimální testovací dávku u prenylovaných fenolů izolovaných z Morus alba na ÚPL VFU Brno, a dále zhodnotit vliv těchto přírodních látek na buněčný cyklus a proliferaci lidských nádorových buněk. Materiál a metodika Použité přírodní látky Prenylované fenoly MA12/1, MA13 a MA14, izolované z Morus alba na ÚPL VFU Brno, jsou velmi slabě rozpustné ve vodě. Proto byly nejdéle 1 den před testováním připraveny jejich čerstvé 10 mM roztoky v dimethylsulfoxidu (DMSO), a následně uskladněny v –20 °C. Tyto roztoky byly poté naředěny médiem pro buněčnou kultivaci na poţadované finální koncentrace (1, 2.5, 5, 10, 20 and 50 μM). Buňky V práci byly pouţity následující lidské buněčné linie: THP-1 – monocytární leukémie, metastatické buňky nádoru prostaty: LNCaP – lymfatické uzliny, LAPC-4 – lymfatické uzliny u imunodeficientních SCID myší, PC3 – kosti, DU145 – mozek. Stanovení cytotoxicity a vlivu na buněčnou kinetiku Ke stanovení vlivu testovaných látek na buněčný počet a viabilitu byla pouţita metoda barvení 0,1 % erythrosinem s vyuţitím hemocytometru. Při analýze průtokovým cytometrem byly buňky 30 min fixovány v chlazeném 70% etanolu, a následně 3x promyty PBS a inkubovány s RNasou po 115

dobu 30 min při 37ºC. Jádra buněk byla obarvena propidium iodidem a analyzována flow cytometrem CellLab Quanta SC (Beckman Coulter). Výsledky Vliv na růst a viabilitu buněk Látka MA 12/1 vykazovala po 24 h nízkou toxicitu (graf 1), přestoţe počet buněk se s rostoucí koncentrací sniţoval. Také po 72 h byla zjištěna inhibice buněčného růstu, a to bez negativního vlivu na buněčnou viabilitu (s výjimkou toxické 50 uM koncentrace MA 12/1). 300

100

No cells (x1000)

250

*

*

200

***

150

75 50

100

viability (%)

*

25 50 0

0 0

1

5

10

20

30

50

Graf 1: Vliv látky MA12/1 na buněčný růst (sloupce) a viabilitu (spojnice bodů nad sloupci) za 24h. Látka MA13 v dávce 5 μM a vyšší signifikantně sniţovala růst buněk (***, P < 0.001) (graf 2). Cytotoxicita této látky začínala u koncentrace 30 uM. 100

***

300

***

250

***

75

***

200

50

***

150 100

25

50

viability (%)

No cells (x1000)

350

***

0

0 0

1

5

10

20

30

50

Graf 2: Vliv látky MA13 na buněčný růst (sloupce) a viabilitu (spojnice bodů nad sloupci) za 24h. Výrazný pokles růstu buněk vlivem látky MA-14 v koncentracích 20 μM a vyšších (p<0,001) byl doprovázen cytotoxickým účinkem, jak je vidět z grafu 3.

116

100 75 50 25

viability (%)

No cells (x1000)

350 300 250 200 150 100 50 0

0 0

1

5

10

20

30

50

Graf 3: Vliv látky MA14 na buněčný růst (sloupce) a viabilitu (spojnice bodů nad sloupci) za 24h. Vliv na buněčný cyklus Naše výsledky ukázaly, ţe všechny testované látky (MA12/1, MA13, MA14) zastavovaly po 24 h lidské leukemické buňky v G1-fázi a bránily jejich přechodu do S-fáze. Zatímco procento buněk v S-fázi pokleslo, jejich mnoţství v G2/M-fázi cyklu bylo vlivem testovaných látek nezměněno. Tento účinek byl nejvýraznější u látky MA14 a byl zjištěn i po 72 hodinách. Látka MA 13 navíc způsobovala výraznou inhibici proliferace také u 4 typů metastatických buňky nádoru prostaty, kde byl po 24 h rovněţ patrný nárůst procenta buněk v G1-fázi na úkor S-fáze buněčného cyklu. Závěr Testy cytotoxicity látek MA 12/1, MA 13 a MA14 prokázaly na dávce závislý účinek na kinetiku THP-1 buněk jak po 24, tak 72 hodinách. Toxický vliv MA12/1 a MA13 byl patrný pouze ve vysokých koncentracích (30 a 50 uM). Nejsilnější činek na buněčnou viabilitu měla látka MA14. Výsledky analýzy na průtokovém cytometru ukázaly, ţe všechny testované látky ovlivňovaly cyklus lidských leukemických buněk. U látky MA 13 byl zjištěn také inhibiční vliv na proliferaci 4 typů metastatických buněk nádoru prostaty.

Literatura 1. Yang Y, Gong T, Liu C, Chen RY.: Four new 2-arylbenzofuran derivatives from leaves of Morus alba L. Chem Pharm Bull 2010, 58(2):257-260 2. Pawlowska AM, Oleszek W, Braca A: Quali-quantitative Analyses of Flavonoids of Morus nigra L. and Morus alba L. (Moraceae) Fruits. J Agric Food Chem 2008, 56:3377-3380 3. Šmejkal K, Svačinová J, Šlapetová T et al.: Cytotoxic activities of several geranylsubstituted flavanones. J Nat Prod 2010, 73(4):568-72 4. Kollár P, Závalová V, Bárta T, Šmejkal K, Hampl A: Geranylated flavanone tomentodiplacone B affects circuitries regulating progression of the cell cycle in human monocytic leukemia cells. Br J Pharmacol, „in press“ 117

Ověření hepatoprotektivního efektu šťávy z Ecballium elaterium na modelu tetrachlormethanem (CCl4) indukované hepatopatie u laboratorních potkanů Marta Chalupová1, Gabriela Praţanová1, Pavel Suchý1, Tomáš Parák1, El Moataz Bellah El Naggar2, Emil Švajdlenka2, Milan Ţemlička2 Ústav humánní farmakologie a toxikologie, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno1, Ústav přírodních léčiv2 Úvod Šťáva z plodů Ecballium elaterium je ve Středomoří uţívána v lidovém léčitelství v řadě indikací, především jako analgetikum, antipyretikum a antiflogistikum. Uvádí se rovněţ její pouţití jako hepatoprotektiva. Ecballium elaterium je však často spojováno s alergickými reakcemi po poţití čaje nebo sirupu. Byly popsány případy alergií, projevující se otoky laryngu, a dokonce stavy těţké dušnosti. Cílem experimentu bylo otestovat moţný hepatoprotektivní efekt Ecballium elaterium při preventivním podání na modelu tetrachlormethanem (CCl4) indukovaného poškození jater a vyloučit případné neţádoucí účinky na organismus. Materiál a metodika Experiment byl proveden na laboratorních potkanech kmene Wistar, kteří byli standardně ustájeni, krmeni komerčně dodávanou směsí a napájeni pitnou vodou ad libitum. Zvířata byla rozdělena do 5 skupin po 10, resp. 5 kusech u skupin kontrolních (III a V). I. skupina – šťáva (0,2 ml/kg p.o.) + CCl4 (1 ml/kg i.p.), II. skupina – šťáva (0,7 ml/kg p.o.) + CCl4 (1 ml/kg i.p.), III. skupina – pozitivní kontrola – CCl4 (1 ml/kg i.p.), IV. skupina – silymarin (20 mg/kg) + CCl4 (1 ml/kg i.p.) a V. skupina jako intaktní. Po dobu 3 dnů byla potkanům sondou aplikována látka ve výše uvedených mnoţstvích v celkové inhalační anestézii (isofluran), třetí den pak byl skupinám I– IV aplikován tetrachlormethan (CCl4). Anestezována byla i zvířata z intaktní skupiny. Čtvrtý den pokusu byla zvířata utracena cervikální dislokací v celkové inhalační anestézii a byly odebrány vzorky krve pro biochemická vyšetření. Získaná data byla statisticky vyhodnocena v programu Unistat 5.1 metodou ANOVA – Tukey-HSD test pro mnohonásobné porovnávání. Při následné pitvě byl aspekcí hodnocen stav dutiny břišní a odebrány vzorky jaterní tkáně pro histopatologické vyšetření.

118

Výsledky Biochemie Z biochemických parametrů byl hodnocen celkový protein, albumin, bilirubin, ALP, ALT, AST, GGT,

cholesterol

a

triacylglyceroly.

Výsledky

biochemického

vyšetření

korelovaly

s histopatologickým nálezem. Skupi na

Celk. protein g/l 62,21±3,1

Albumi n

g/l 37,68±1,

n

Bilirubi

ALP

ALT

AST

3,22±0,6

4,23±0

2,81±

11,89±3,

Cholest

TAG mmol/l 0,41±0,

+CCl4 E 0,7

6 66,60±2,9

27 39,48±1,

4** 2,75±0,4

,51 4,45±0

1,11 3,15±

69** 11,19±4,

erol 1,40±0, mmol/l 32** 1,49±0,

+CCl4 CCl4

8** 61,80±2,6

51* 37,34±2,

2** 2,52±0,6

,77 3,88±1

2,69 1,49±

41** 6,99±1,8

14** 1,44±0,

34** 0,79±0,

Silyma

5 62,62±2,5

46 38,33±1,

2 2,94±1,1

,18 4,43±0

0,62 3,63±

0 9,40±4,6

09** 1,46±0,

53** 0,64±0,

Kontro

0 58,42±4,6

90 36,55±2,

6** 1,33±0,1

,86 5,15±0

3,23 1,18±

1* 3,77±1,0

32** 0,92±0,

40** 1,89±0,

,93

0,52

E 0,2

rin la

0

44

4

0

12

17** 0,64±0,

80

Tabulka 1. Biochemické parametry (průměrné hodnoty a směrodatná odchylka). Hodnoty GGT byly pod hranicí detekce a nejsou v tabulce uvedeny. * p < 0,05 – statisticky významný rozdíl oproti kontrole ** p < 0,01 – statisticky vysoce významný rozdíl oproti kontrole Histologie Provedená pitva prokázala hepatomegalii a masivní peritonitidu u skupin, kterým byl i.p. podán CCl4. Sledované morfologické změny v řezech odebraných tkání byly hodnoceny semikvantitativně stupnicí od 0 (ţádné změny) po 10 (maximum změn). Zaznamenané histopatologické změny byly soustředěny převáţně perivenulárně. U ţádného zvířete nebyla zaznamenána systémová reakce. Histologické vyšetření jater u kontrolní skupiny vykazovalo předpokládané reakce na podanou anestézii. Histopatologický obraz pozitivní kontroly exponované anestézii a CCl4 odpovídal změnám popisovaným v literatuře – perivenulární masivní steatóze a nekrózám. Nález u skupiny exponované niţší dávce šťávy + CCl4 odpovídal silné zánětlivé reakci a znatelně redukoval poškození perivenulárních topik tetrachlormethanem. Podobný nález byl zjištěn i u skupiny, které byl aplikován silymarin a CCl4. U intaktní kontroly bylo zaznamenáno poškození cév a následné hemoragie, pravděpodobně v důsledku reakce na opakovanou anestézii.

119

Morfologické změny

E0,2+CCl4

E0,7+CCl4

CCl4

Silymarin+

Intaktní

CCl4

kontrola

Smíšená steatóza

4

4

4

4

5

Zonální, fokální nekrózy

2

3

4

3

0

Epiteloidně-granulomatózní reakce

4

5

4

4

0

Portální reakce

2

4

2

2

3

Degenerace hepatocytů

2

2

4

2

0

Aktivita Kupfferových buněk

7

7

3

7

3

Cévní dilatace

5

7

4

4

1

Intersticiální hemoragie

0

3

0

0

0

Fibróza

2

3

2

2

2

Polyjaderné a makrojaderné

0

0

0

0

0

hepatocyty Cholestáza

0

1

0

0

0

Tabulka 2. Semikvantitativní hodnocení morfologických změn jaterního parenchymu Závěr V průběhu experimentu nebyla zaznamenána akutní toxicita šťávy z plodů Ecballium elaterium, současně byl prokázán její hepatoprotektivní efekt u pouţitého modelu poškození jater.

Seznam literatury: 1. Agil A, Miró M, Jimenez J, Aneiros J, Dolores Caracuel M, García-Granados A, Concepción Navarro M. Isolation of an Anti-Hepatotoxic Principle from the Juice of Ecballium elaterium. Planta Med 1999; 65(7): 673–675 2. Raikhlin-Eisenkraft B, Bentur Y. Ecballium elaterium (Squirting Cucumber) – Remedy or Poison? Clin Toxicol 2000; 38(3): 305–308 3. Chen JC, Chiu MH, Nie RL, Cordell GA, Qiu SX. Cucurbitacins and cucurbitane glycosides: structures and biological activities. Nat Prod Rep 2005; 22(6): 386–399 4. Sezik E. Research on the Turkish medicinal plant Ecbalium elaterium. Chem Nat Compd 1997; 33(5): 541–542

120

Detekce genového polymorfismu 94C→A v genu pro inosin trifosfát pyrofosfatázu a genového polymorfismu 837C→T v genu pro xanthin dehydrogenázu, jejich vztah k výskytu nežádoucích účinků terapie azathioprinem. PharmDr. Michal Kolorz1, Jana Suchánková2, RNDr. Ladislava Bartošová, Ph.D1. 1

Ústav humánní farmakologie a toxikologie, 2 studentka MSP, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod

Thiopurinová analoga (azathioprin, 6-MP) patří mezi imunosupresiva ze skupiny antimetabolitů. Mezi jejich indikace patří prevence rejekce transplantovaného orgánu (transplantace srdce, ledvin, jater), terapie chronických zánětlivých onemocnění, kde jsou podávána většinou v kombinaci s kortikosteroidy. Přestoţe je účinek azathioprinu patrný aţ po týdnech, či měsících terapie, jeho výhodou je, obvykle jeho podání umoţní přerušit nebo omezit terapii glukokortikoidy (steroidsparing effect). Mezi chronická zánětlivá onemocnění, u kterých je azathioprin indikován, patří například, nespecifické střevní záněty, revmatoidní arthritida, systémový lupus. Terapie azathioprinem je asociována s výskytem na dávce závislého, reversibilního útlumu kostní dřeně, který se nejčastěji manifestuje jako leukopenie. Bylo prokázáno, ţe výskyt a intenzita myelosuprese je ovlivňována aktivitou enzymů, podílejících se na metabolismu azathioprinu. Jedná se především o enzym thiopurin-S-methyl-transferáza (TPMT), u něhoţ byla jiţ dříve prokázána geneticky podmíněná nízká metabolická aktivita (Sahasranaman et al. 2008; Kolorz et al. 2009). V souvislosti s výskytem neţádoucích účinků po léčbě azathioprinem je také zmiňován výskyt variantních forem genů pro metabolické enzymy ITPasu (SNP 94C→A) a XDHasu (837C→T) (Fotoohi et al. 2010, Smith et al. 2009).

Metodika Genotypizovali jsme soubor 228 pacientů s diagnózou nespecifických střevních zánětů, u kterých byl azathioprin indikován pro udrţení remise onemocnění. Sledovány byly tyto neţádoucí účinky: leukopénie, hepatotoxicita, digestivní intolerance (vyskytly se celkem u 47 pacientů). Testovali

jsme

asociaci

mezi

výskytem

těchto

neţádoucích

účinků

a

přítomností

jednonukleotidových polymorfismů C94A v genu pro ITPA a C837T v genu pro XDH. Genomová DNA byla izolována z periferní krve pomocí Quick Gene DNA whole blood kit S (FujiFilm) dle doporučení výrobce. Alelovou variantu genu pro ITPasu (SNP 94C→A) jsme určili pomocí metody PCR-REA. Sekvence primerů byly převzaty z literatury (Maeda et al. 2005). Reakce PCR a podmínky 121

restrikčního štěpení byly optimalizovány a validovány. Produkty PCR reakce byly rozděleny elektroforézou na 2% agarozovém gelu s obsahem ethidium bromidu. K vizualizaci byl pouţit UV transluminátor (312nm). Výsledky byly podrobeny statistické analyze χ2 testem dvou četností. Pro genotypizaci genu pro XDHasu (837C→T) byla pouţita metoda Real Time PCR a genotypizační souprava AppliedBiosystems. Výsledky Výskyt neţádoucích účinků (leukopénie, hepatotoxicita, digestivní intolerance), byl zaznamenán celkem u 47 z 228 pacientů (20,61 %). Nejčastěji se vyskytovala leukopénie (15,79 %). Pacienti, u kterých byla potvrzena digestivní intolerance, byli častěji nositeli nestandardní alely ITP 94A. Tento vztah byl potvrzen statistickou analýzou (P=0,0258), ovšem soubor pacientů s tímto neţádoucím účinkem byl malý. Nestandardní alela XDH 837T se signifikantně častěji vyskytovala u pacientů s neţádoucími účinky (leukopénie, hepatotoxicita, digestivní intolerance) v porovnání se souborem pacientů, u kterých nebyl manifestován ţádný neţádoucí účinek (P=0,0142). Nejčastěji se vyskytujícím neţádoucím účinkem u této skupiny pacientů - nositelů XDH 837T, byla leukopénie. Vztah mezi výskytem nestandandardní alely XDH 837T a výskytem samotné leukopénie však nebyl statisticky významný. Závěr Metabolismus azathioprinu je značně sloţitý a je do něj zapojena řada enzymů. Výskyt některých neţádoucích účinků, objevujících se během terapie azathioprinem je asociován se sníţenou aktivitou těchto enzymů a hromaděním aktivní látky v organismu. Vztah mezi alelovou variantou genu, jeho fenotypovým projevem - nízkou enzymatickou aktivitou a výskytem leukopenie po terapii azathioprinem byl jiţ potvrzen u enzymu TPMT.(P=0.0033; Kolorz et al. 2009). Nově jsme sledovali nestandardní alely genů kódujících enzymy ITPasu a XDHasu. Z našich výsledků vyplývá, ţe u pacientů - nositelů nestandardní alely XDH837T byl signifikantně častější výskyt neţádoucích účinků. U nositelů nestandardní alely ITPA 94A byl také prokázán statisticky významně vyšší výskyt digestivní intolerance k azathioprinu. Vzhledem k malému počtu pacientů v souboru však tento výsledek vyţaduje budoucí validaci.

Seznam literatury: 1. Sahasranaman S, Howard D, Roy S (2008). Clinical pharmacology and pharmacogenetics of thiopurines. Eur J Clin Pharmacol. 64: 753-767 122

2. Smith MA, Marinaki AM, Arenas M, et al (2009). Novel pharmacogenetic markers for treatment outcome in azathioprine-treated inflammatory bowel disease. Aliment Pharmacol Ther. 30: 375-384 3. Fotoohi AK, Coulthard SA, Albertioni F (2010). Thiopurines: Factors influencing toxicity and response. Biochemical Pharmacology. Biochem Pharmacol. 2010 Jan 21. [Epub ahead of print]. 4. Maeda T, Sumi S, Ueta A, et al (2005). Genetic basis of inosine triphosphate pyrophosphohydrolase deficiency in Japan population. Mol Genet and Metabol. 85: 271-279 5. Kolorz M, Bartosova L, Hosek J, et al (2009). Importance of thiopurine S-Methyltransferase gene polymorphisms for prediction of azathioprine toxicity. Neuroendocrinol Lett. 30: 153– 158

123

Pharmaceutical importance of zinc and metallothionein in cell signalling Veronika Kohoutkova1, Iva Dankova1, Ondrej Vodicka1, Monika Rzymanek2, Radka Opatrilova2, Michal Masarik3, Petr Babula1 1

Department of Natural Drugs and 2Department of chemical Drugs, Faculty of Pharmacy,

University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno, Palackeho 1/3, CZ-612 42 Brno, Czech Republic. 3

Department of Pathological Physiology, Faculty of Medicine, Masaryk University, Kamenice 753/5, CZ-625 00 Brno Introduction

Zinc is essentials for prenatal as well as postnatal normal development of cells, tissues and organs for higher organisms because control of cell proliferation, differentiation and viability (1). This fact is connected with role of zinc ions as structural components of many proteins in modulation of cell genesis, differentiation, proliferation and apoptosis, respectively with regulation of zinc-dependent enzymes, such as caspase-3 mediated by p38/MAPK involving DNA fragmentation, and signals – transcriptional factors - participating in direction of cell cycle (ERK1/2, p53, NF-kappa B) (2-6). Zinc modulates cellular signals recognition, metabolism of second messengers, activities of protein kinases and phosphatases, metabolism of cGMP, and activities of protein kinase C (1). It is obvious that each cell must have mechanisms, which are able to regulate levels of zinc ions. These mechanisms include sequestration of zinc in zinc storing vesicles, which are called zincosomes, nucleoplasmic distribution, redistribution, and elimination. Zinc ions regulate also metal transcription factor MTF-1, which controls transcription of genes for metallothioneins - MTs, proteins, which play crucial role in zinc homeostasis, and zinc transporters ZnT-1or ZIP6 connected with influx of free zinc ions and increased cytoplasmatic free zinc ions level (1, 7). LIV1 is zinc transporter gene induced by treatment by histone deacetylase inhibitors in tumour cells, but not in normal cells (8). LIV1 is connected with zinc homeostasis and activation of caspase-3 and expression of some BCL-2 family genes (9). This work was aimed at investigation of relationships between levels of zinc ions and metallothioneins (MT), which are the most important proteins regulating level of free zinc ions. As a model cell cultures, prostatic cell lines PNT1A (normal cell line) and PC-3 (tumour cell line) were used. Our choice consisted in fact that normal prostate cells are able to accumulate zinc ions in high amounts; in addition, prostate tumour cells have altered zinc metabolism, which is directed by metallothioneins.

124

Material and Methods Human prostatic cell lines and treatment by zinc ions The PNT1A immortalized human prostatic cell line and PC-3 prostate cancer cell line (derived from metastasis of advanced androgen-independent carcinoma) were cultivated in DMEM cultivation medium supplemented with 5% heat-inactivated FCS, containing penicillin (100 UI/l) 2

incubator (all chemicals Sigma-Aldrich,

USA). Firstly, cells were incubated in 96 well plates in 100 ml of cultivation medium with 10% FCS for 24 h at 37°C in a 5% CO2 atmosphere; thereafter, the cultivation medium was aspirated and cells were incubated in cultivation media supplemented by zinc as ZnSO4 (Sigma-Aldrich, USA) for 92 h. For continual determination of cell viability, xCELLigence Real-Time Cell Analysis System purchased from Roche (Roche, Germany) was used. Cell lines after treatment by zinc ions were evaluated also microscopically using method of fluorescence microscopy (microscope (Axioscop 40, Zeiss, Germany) equipped with broad spectrum UV excitation under FITS and DAPI filters. Process of cell cultivation, staining and visualization was optimized and will be published elsewhere.

Metallothionein/zinc determination Cellular zinc levels were determined using electrochemistry technique. Briefly, cells were harvested by trypsin and washed three times with Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) and cell pellets were collected for analysis. Metallothionein was analysed electrochemically. Details are described in works of Huska et al. (10) and Adam et al. (11).

Results Treatment of both normal and tumour cell lines by zinc ions led to significant affecting of cell viability and proliferation (Fig. 1).

Zinc c (uM)

PNT1A line viability 150

„control“

125 100 75 50 25 0 0

20

40

61

81

102

122

143

163

184

207

225

Time (h)

Cell index 4 3 2 245 1 0

Fig. 1. Cell viability/proliferation in dependence on concentration of zinc ions and time of treatment

PC-3 line viability

Zinc (uM)

100

„carcinoma“

85 75 65 50 25 0 0

20

40

61

81

102

122

143

Time (h)

163

184

207

225

Cell index 2,4 1,9 1,4 0,9 245 0,4 -0,1

125

Using methods of fluorescence microscopy, important changes not only in cell structure, but also in formation of cell colonies, it means cell proliferation, were detected. Changes in zinc uptake in both cell lines were determined – levels of free zinc ions and bound zinc ions were investigated. Normal – “healthy” – cell line (PNT1A) accumulated higher levels of zinc(II) in comparison with tumour cell line PC-3. Significant differences between concentration of free and bound zinc ions were detected (Fig. 2). Zinc levels in cells were highly dependent on concentration of extracellular zinc. Higher levels of metallothionein (MT) were determined in tumour cell lines. Its level was in a

6 PC-3 free Zn [nM] PNT 1A free Zn [nM]

5 4

concentration-dependent manner. In addition, MT levels in PC-3 significantly correlated with concentration of

3 2 1

supplemented zinc, with its uptake as well as with its

0 0

100

200

intracellular concentration. In conclusion, in the case of

transporter of zinc ions that play crucial role in cell proliferation.

PC-3 bound zinc (nM) PNT1A bound zinc (nM)

tumour cell line PC-3, MT serves as reservoir – pool – and

300

400

500

600

Zn added [µM]

20 18 16 14

„control“ r=0.99

12 10

„carcinoma“ r=0.89

8 6

Fig. 2. Differences between free and bound zinc ions in two cell lines – normal (PNT1A) and tumour (PC-3).

4 2 0 0

100

200

300

400

500

Added Zinc (uM)

Literature 1. D. Beyersmann, H. Haase, Biometals, Vol. No. 14, 331-341. 2. K. Li, J. Zhang, et al., J. Cell. Biochem., Vol. No. 110, 352-362. 3. F.J. Sanchez-Martin, E. Valera, et al., Brain Res. Bull., Vol. No. 81, 458-466. 4. M. Kondoh, E. Tasaki, et al., Eur. J. Biochem., Vol. No. 269, 6204-6211. 5. M. Dutsch-Wicherek, J. Sikora, et al., Front. Biosci., Vol. No. 13, 4029-4038. 6. A.M. Adamo, P.I. Oteiza, Biofactors, Vol. No. 36, 117-124. 7. W.W. Lee, D.P. Cui, et al., Rejuv. Res., Vol. No. 11, 1001-1011. 8. J. Zhou, B. Wang, et al., Blood, Vol. No. 110, 4188. 9. X.L. Ma, Q.F. Ma, et al., Mol. Cancer Ther., Vol. No. 8, 3108-3116. 10. D. Huska, O. Zitka, et al., Czech J Anim Sci., Vol. No. 52, 37-43. 11. V. Adam, J. Petrlova, et al., Plos One, Vol. No. 5, e11441

126

Antimikrobiálně aktivní prenylované polyfenoly izolované z Paulownia tomentosa. Alice Navrátilová1, Alois Číţek2, Renata Kubínová1, Daniela Veselá1, Karel Šmejkal1 Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně, Palackého 1-3, 612 43 Brno, ČR Farmaceutická fakulta, 1Ústav přírodních léčiv Fakulta veterinárního lékařství, 2Ústav mikrobiologie a imunologie Úvod Problémem antibiotické terapie je vznik rezistence bakterií k současným antibiotikům. Výzkum nových antibioticky působících látek musí pokračovat a bohatým zdrojem antibakteriálně aktivních látek jsou rostliny [1-4]. Cílem naší práce bylo izolovat nové látky z Paulownia tomentosa a dříve izolované látky (diplakon (1), 3´- O -methyl-5´-hydroxydiplakon (2), 3´- O -methyldiplakon (3), mimulon (4), 3´- O -methyldiplakol (5), akteosid (6) a isoakteosid (7) testovat na antibakteriální aktivitu dvěma metodami pro jejich metodické porovnání. Dále u nových a dříve izolovaných sloučenin testovat inhibiční účinek na effluxní proteiny. Materiál a metodika Z rostlinného materiálu, nasbíraného v areálu VFU byl připraven extrakt (80 % ethanol). Pomocí vytřepávání nemísitelnými rozpouštědly byl získán chloroformový podíl [3]. Pro separaci CHCl3 podílu byla vyuţita sloupcová chromatografie, kde mobilní fází byl benzen:aceton s rostoucím zastoupením acetonu. Získané frakce byly vyhodnoceny a spojeny dle výsledků TLC a HPLC analýzy. Tyto spojené frakce označené B, C, D byly dále separovány pomocí sloupcové chromatografie při pouţití mobilní fáze chloroform:methanol:benzen (7:0.25:2.75, v/v). Izolace a chromatografická analýza byla provedena na analytické koloně Supelcosil

TM

ABZ+Plus (15 cm × 4.6 mm, velikost zrn 3 μm) gradientovou elucí. Mobilní fází byla směs acetonitrilu, 0,2% kyseliny mravenčí a methanolu 50:50:0 (v/v/v) v 0. minutě, v 20. minutě 80:0:20 (v/v/v), 100:0:0 (v/v/v) v 23. minutě. Průtok 1 ml/min, teplota na koloně 40 °C. Detekce DAD byla prováděna při vlnových délkách 254, 280 a 350 nm. Pro izolaci jednotlivých látek byla vyuţita preparativní HPLC s analogickou stacionární a mobilní fází a preparativní TLC na silikagelu. Testy antimikrobiální aktivity byly provedeny diskovým difusním testem v Mueller-Hintonově (MH) agaru a Sabouradově agaru (SA) s vyuţitím sbírkových kultur mikroorganismů určených ke kontrole uvedené aktivity (E.c., E. coli ATCC 25922; izoláty E. coli R1 (gen tetB), E. coli HR82 (gen tetA); S.a., S. aureus ATCC 29213; P.a., P. aeruginosa ATCC 27853; E.f., E. faecalis ATCC 127

29212; S.p., S. pneumonie CCM 4424; K.p., K. pneumonie ATCC 700603; izoláty K. pneumonie KDO 14 (Producent ESBL + tetA): KDO 14 K.p; izoláty S. aureus rezistentní k meticilinu a tetracyklinu: MRSA 67755; MRSA 63718; MRSA 62059; MRSA 62097), testované látky byly rozpuštěny v methanolu. Průměr disku (Wathman 3) byl 6 mm. K ověření antibakteriální aktivity byl pouţit postup průkazu MIC diluční metodou doporučený CLSI (2006) na mikrotitrační destičce za pomoci stejných kultur jako u diskové metody. Testované látky byly rozpuštěny v DMSO, absorbance byla měřena při 600 nm. Dále byl testován inhibiční účinek látek na „effluxní“ proteiny metodou testování synergického účinku kříţovým provedením mikrodiluční metody [5]. K tomu byly pouţity kmeny bakterií vybavené funkčními geny rezistence, S. aureus s tetB. Výsledky a diskuze CHCl3 podíl extraktu plodů P. tomentosa byl separován pomocí sloupcové chromatografie. Na základě TLC a HPLC analýzy byly vybrané frakce B, C a D dále zpracovávány pomocí sloupcové chromatografie, preparativní HPLC a preparativní TLC. Z frakce B se dosud podařilo získat 4 látky. Látka s nejniţším retenčním časem má spektrum typické pro lignany. Látka s nejvyšším retenčním časem vykazuje spektrum s maximy typickými pro skelet flavanonu. Elektronová spektra dvou zbývajících sloučenin se neshodují s ţádným spektrem uloţeným v knihovně spekter ÚPL. Z frakce C byly získány 3 látky s elektronovými spektry podobnými neznámým spektrům látek frakce B. Separací frakce D byly získany tři látky, podle analýzy UV spekter flavanony. Všechny izolované sloučeniny jsou látky vysoce lipofilní a na základě této vlastnosti, retenčních časů a průzkumu literatury předpokládáme jejich prenylovou nebo geranylovou substituci. V prezentované práci se podařilo izolavat látky, u kterých v současné době probíhá identifikace struktury a které budou dále testovány na antibakteriální aktivitu. Z výsledků měření antibakteriální aktivity jiţ dříve izolovaných látek vyplývá, ţe v důsledku zhoršené difúze těchto lipofilních látek agarem je vhodnější pouţití metody diluční (Tab. 1 a Tab. 2). Dosavadní výsledky synergického účinku jsou dokumentovány formou isobologramu č. 1, který dokumentuje antagonistický efekt 3´O-methyldiplakolu (5) v kombinaci s tetracyklinem u testované kultury MRSA.

128

Tab. 1: Antibakteriální aktivita látek z P. tomentosa měřená diskovou metodou se zónou inhibice v mm, dávka vzorků 64 µg/disk. MRSA 67775 8 8 1 8 9 2 10 10 3 9 10 4 11 11 5 6 7 37 Ampicilin Tetracyklin Pozn. NT…netestováno Látka

S.a

MRSA 62059 NT NT NT NT NT NT NT NT NT

MRSA 62097 NT NT NT NT NT NT NT NT NT

MRSA 63718 8 7 8 -

S.p

E.f

E.c

P.a

K.p

7 7 7 37 -

13 14 20 23 -

27

14

-

KDO14 K.p -

Tab. 2: Hodnoty MIC (µg/ml) stanovené diluční metodou pro látky izolované z P. tomentosa

Látka

S.a

1 2 3 4 5 6 7

16 8 2 2 2 >64 >64

MRSA 67775 16 8 8 4 8 >64 >64

MRSA 62059 16 4 4 0,5 8 >64 >64

MRSA 62097 16 8 4 0,5 8 >64 >64

MRSA 63718 64 32 >64 16 8 >64 >64

E.f 8 4 4 2 4 64 64

E.c HR82 64 >64 64 64 64 64 64

E.c R1 64 >64 >64 >64 >64 >64 >64

P.a

K.p

32 64 64 64 >64 64 64

64 64 >64 64 >64 >64 64

KDO14 K.p 64 64 64 64 64 64 64

Isobologram č. 1: Vyjádření výsledků kříţového testování kombinovaného účinku tetracyklinu s 3´O-methyldiplakolem na kulturu MRSA. 64

0.03+64

0.06+64

0.125+64

0.25+64

0.5+64

1+64

2+64

4+64

8+64

16+64

32+64

32

0.03+32

0.06+32

0.125+32

0.25+32

0.5+32

1+32

2+32

4+32

8+32

16+32

32+32

16

0.03+16

0.06+16

0.125+16

0.25+16

0.5+16

1+16

2+16

4+16

8+16

16+16

32+16

8

0.03+8

0.06+8

0.125+8

0.25+8

0.5+8

1+8

2+8

4+8

8+8

16+8

32+8

4

0.03+4

0.06+4

0.125+4

0.25+4

0.5+4

1+4

2+4

4+4

8+4

16+4

32+4

2

0.03+2

0.06+2

0.125+2

0.25+2

0.5+2

1+2

2+2

4+2

8+2

16+2

32+2

1

0.03+1

0.06+1

0.125+1

0.25+1

0.5+1

1+1

2+1

4+1

8+1

16+1

32+1

KR

0.03

0.06

0.125

0.25

0.5

1

2

4

8

16

32

Pozn. červeně jsou vyjádřeny koncentrace tetracyklinu (µg/ml), modře jsou vyjádřeny koncentrace 3´-O-methyldiplakolu (µg/ml), šedé pozadí buněk vyjadřuje růst testované kultury MRSA, bílé pozadí inhibici růstu MRSA, KR – kontrola růstu v médiu bez testovaných látek.

Literatura [1] Asai et al. Phytochemistry 2008, 69, 1234-1241. [2] Šmejkal et al. Molecules. 2007, 12, 1210-1219. [3] Šmejkal et al J. Nat. Prod. 2008, 71, 706-709. [4] Cushnie et al. Int. J. Antimicrob. Agents 2005, 26, 343-356. [5] Verma P. In: Schwalbe et al. Antimicrobial susceptibility testing protocols, CRC Press Taylor & Francis Group 2007, 414. 129

HPLC-DAD metoda pro stanovení MA-13 v tělesných tekutinách a tkáních Pavla Holubová, Martina Rupčíková, Karel Šmejkal Ústav Přírodních léčiv, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Vzrůstající celosvětový zájem o farmakologicky účinné látky flavonoidního charakteru vede k logické potřebě zavádění vysoce citlivých a specifických analytických metod pro identifikaci a kvantifikaci těchto látek a jejich metabolitů v tělesných tkáních a tekutinách. Na Ústavu přírodních léčiv, FaF, VFU byl v nedávné době z kořene stromu Morus alba (Moraceae) izolován v literatuře dosud nepopsaný prenylovaný flavonoid s pracovním názvem MA-13 (Obr. 1). Zmíněný flavonoid je zkoumán pro svou potenciální antiflogistickou a cytotoxickou aktivitu.1,2 Pro optimalizaci výzkumu farmakologické aktivity látky in vivo a případné medicínské vyuţití je nezbytné zjistit biologickou dostupnost a farmakokinetické parametry látky. Cílem práce bylo vyvinout a optimalizovat extrakční metodu MA-13 z tělesných tekutin a tkání laboratorních myší a HPLC metodu pro následnou kvalitativní a kvantitativní analýzu MA-13 a jejich metabolitů. Materiál a metodika Odběr a extrakce biologických vzorků Standard MA-13 byl izolován k kořene Morus alba na Ústavu přírodních léčiv, FaF, VFU. Vzorky krve, moči a jater byly sbírány po 1, 2, 4, 8, 12, 25.5 a 48.5 hodinách po podání látky a skladovány do doby analýzy při -80°C. Ke vzorkům krve byl přidán citrátový pufr potlačující sráţení krve. Krevní plasma byla separována centrifugací plné krve při 10 000 rpm. 100 μL plasmy bylo extrahováno 300 μL směsi ethylacetát:chloroform (1:1 v/v). Extrakce byla provedena vortexováním a následnou centrifugací při 14 000 rpm po dobu 10-ti minut (2x zopakováno). Jednotlivé ultrafiltráty byly spojeny a filtrovány přes 0.45 μm membránový filtr. Filtrát (5 μL) byl injektován do HPLC systému. Vzorky moče byly extrahovány MeOH (30 μL moči extrahováno 600 μL MeOH). Směs byla vortexována a centrifugována při 14 000 rpm po dobu 10-ti minut (2x zopakováno). Spojené ultrafiltráty byly filtrovány přes 0.45 μm membránový filtr. Zbytek MeOH po extrakci byl odpařen proudem N2 a poté lyofilizován. Získaný extrakt byl rozpuštěn v 1% cremophorovém roztoku, 130

centrifugován při 14 000 rpm a sonifikován v ultrazvukové lázni. Roztok (5 μL) byl injektován do HPLC systému. Tkáně jater byly po rozmraţení homogenizovány a extrahovány MeOH (50 mg tkáně extrahováno 2.5 ml MeOH). Vzniklý homogenizát byl dále extrahován stejným postupem jako vzorek moči.

HPLC Přítomnost MA-13 v biologických vzorcích byla určena na základě HPLC-DAD metody (Agilent 1100 UV-VIS DAD, Agilent). HPLC kolony Supelcosil ABZ+Plus (15 cm × 4.6 mm, 3 μm, Supelco) a Kinetex (10 cm x 4.6 mm, 2.6 μm, Phenomenex). Gradientová eluce 0.2% HCOOH a MeOH (Scharlau). HPLC krevní plasmy Lineární gradientová eluce: 0. min 40 % HCOOH, 60 % MeOH, 12. min 100% MeOH. Celkový čas analýzy 20 min, průtok 1 mL/min, teplota kolonového bloku 40°C, UV detekce při 254 nm. HPLC moči a jater Vzhledem k přítomnosti polárních derivátu MA-13 v moči a tkáních jater bylo potřeba změnit koncentrační profil mobilní fáze. Lineární gradientová eluce: 0. min 90 % HCOOH, 10 % MeOH, 20. min 100% MeOH. Celkový čas analýzy 25 min, průtok 1 mL/min, teplota kolonového bloku 40°C, UV detekce při 254 nm.

MS Pro určení metabolitů MA-13 bylo potřeba provést MS a MS/MS fragmentační analýzu. Parametry: ionizace ESI v negativním módu, analyzátor iontová past. Výsledky Byla vyvinuta a optimalizována extrakční metoda pro stanovení MA-13 v krvi, moči a játrech laboratorních myší. Výtěţnost metody byla stanovena pro roztoky o koncentraci 0.1, 0.25 a 0.5 mg/mL MA-13 v cremophoru, výsledné hodnoty se nacházejí v rozmezí 99.55-101.20 %. Na základě HPLC metody byl stanoven koncentrační profil MA-13 v krvi (Obr.2). Metoda byla kalibrována pro dvě různé HPLC kolony (Tab. 1 a 2). Na základě metody hmotnostní spektrometrie byla prokázaná přítomnost metabolitů MA-13 v moči a játrech.

131

HPLC column

LOD (μg/mL)

Regression equation

Correlation coefficient

1,22

y=1483,3x

0,9992

Supelcosil ABZ+Plus

0,71 y=1534,1x Phenomenex Kinetex Tab.1 Hodnoty limitů detekce (LOD), hodnoty spolehlivosti (R) a rovnice regrese.

HPLC column

RSD (%) Retention time Run -to-run A B C

0,9997

Integreated area Run-to-run Day-to-day A B C A B C

Day-to-day A B C

Supelcosil ABZ+Plus

0,04 0,20 0,34

0,14

0,17 0,18 1,30 0,80 1,55 1,57 2,87 5,32

Phenomenex Kinetex

0,10 0,40 0,15

0,45

0,22 0,28 0,80 2,39 0,10 1,20 1,14 6,79

Tab.2 Hodnoty opakovatelnosti retenčních časů a ploch píků standardu MA-13 měřené v koncentracích 1.0 mg/mL (A), 0.5 mg/mL (B) a 0.25 mg/mL (C). HPLC metoda pro analýzu krevní plasmy .

18

OH O

O

OH

O

OH

Koncentrace MA-13 (mg/mL)

16 14

Koncentrační profil MA-13 v krevní plasmě

12

Supelcosil ABZ+Plus

10 8 6 4 2 0 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Časový interval odběru vzorků (hod)

Obr.1 Vzorec MA-13

Obr.2 Koncentrační profil MA-13 v krevní plasmě

Literatura 1. Du J., He Z.D., Jiang R.W., Ye W.C., Xu H.X., But P.P.H., 2003. Phytochemistry 62, 1235–1238 2. Singab A.N.B., El-Beshbishy H.A., Yonekawa M., Nomura T., Fukai T., 2005. J. Ethnopharmacol. 100, 333–338

132

Izolace obsahových látek Polygonum lapathifolium L. a stanovení jejich anticholinesterasové aktivity Radka Pořízková1, Renata Kubínová1 Ústav přírodních léčiv, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno1 Úvod Alzheimerova nemoc (AN) je závaţné neurodegenerativní onemocnění, je nejčastějším typem demence a s rostoucím podílem starších osob v populaci se její výskyt trvale zvyšuje. Dochází při ní k poškození a zániku mozkových buněk a jejich spojů a k úbytku acetylcholinu. Ten zajišťuje přenos informací mezi mozkovými buňkami a jeho deficit je zodpovědný za hlavní příznak AN, poruchu paměti. Současná medicína dosud tuto nemoc nedokáţe léčit, pouze zpomalit její postup. K tomu se nejčastěji pouţívají inhibitory acetylcholinesterasy.[1] Nejnovější poznatky ukazují i na významný vliv butyrylcholinesterasy, jehoţ aktivita u pacientů s AN narůstá.[2] Proto se pozornost vědců zaměřuje na hledání tzv. duálních inhibitorů, jeţ dokáţí inhibovat obě cholinesterasy.[3] V naší práci jsme tyto inhibitory hledali mezi obsahovými látkami Polygonum lapathifolium, které je bohatým zdrojem zejména flavonoidů, chalkonů a fenolických kyselin.[4] Materiál a metodika Extrakce a separace Droga (1,5 kg) byla extrahována metanolem (15 l) při pokojové teplotě za pomoci ultrazvuku. Po odstranění chlorofylu petroletherem byl extrakt rozsuspendován ve vodě a vytřepáván v soustavě nemísitelných rozpouštědel. Tak byl získán hexanový, chloroformový, ethylacetátový a butanolický podíl. Ethylacetátový podíl byl dále dělen pomocí sloupcové chromatografie a preparativní HPLC. HPLC Analýza byla prováděna na analytické koloně SupelcosilTM ABZ+Plus (15 cm × 4,6 mm, velikost zrn 3μm). Mobilní fází byla směs acetonitrilu a 0,2% kyseliny mravenčí (gradientová eluce). Průtok 1 ml/min, teplota na koloně 40 °C. Pro izolaci jednotlivých látek z ethylacetátového podílu byla vyuţita preparativní HPLC s upravenou polaritou a průtokem mobilní fáze. Struktura izolovaných látek byla identifikována pomocí spektrálních metod (UV, IČ, MS), analýza flavonoidních glykosidů byla doplněna o hydrolýzu a identifikaci vzniklého aglykonu a cukerné jednotky. Izolované látky byly také srovnávány společným nástřikem se standardem.

133

Testování anticholinesterasové aktivity Inhibiční aktivita na obě cholinesterasy byla stanovena pomocí Ellmanovy metody na mikrotitrační destičce. Byla pouţita acetylcholinesterasa z elektrického úhoře (AChE) [EC 3.1.1.7] a butyrylcholinesterasa z koňského séra (BChE) [EC 3.1.1.8]. Jako substrát pro reakci slouţily acetylthiocholin jodid pro AChE a butyrylthiocholin jodid pro BChE a pro detekci byla pouţita 5,5´-dithiobis-(2-nitrobenzoová kyselina) (DTNB), vše Sigma-Aldrich. Do mikrotitrační destičky bylo odpipetováno 120 μl fosfátového pufru, 20 μl DTNB, 20 μl testovaného roztoku (extrakt, nebo čistá látka rozpuštěna v metanolu) a 20 μl cholinesterasy a reakce byla odstartována přidáním 20 μl příslušného thiocholinu. Reakcí hydrolyzovaného thiocholinu s DTNB vznikal ţlutý 5-thio-2nitrobenzoátový anion a změna absorbance byla měřena při 412 nm.[2] Výsledná inhibice cholinesteras byla stanovena ze vzorce (E – S)/E × 100, kde E je absorbance kontroly (místo testovaného roztoku pouţito čisté rozpouštědlo) a S je rozdíl absorbance testovaného roztoku a slepého pokusu (místo cholinesterasy pouţit fosfátový pufr). Jednotlivé podíly byly testovány v konečné koncentraci 100 μg/ml metanolu, vyizolované látky nejprve ve 100 μM koncentraci a u flavonoidů byla poté stanovena IC50. Jako standard slouţil galantamin a kvercetin. Výsledky Z jednotlivých podílů nejlépe inhiboval cholinesterasy ethylacetátový podíl (tab. 1), ten obsahuje zejména polární látky, fenolické kyseliny a flavonoidní glykosidy. Pomocí sloupcové chomatografie a preparativní HPLC z něj bylo vyizolováno celkem sedm látek; dvě fenolické kyseliny – kyselina galová a p-OH benzoová, dva flavonoidy – flavanonol taxifolin a flavonol kempferol a flavonoidní glykosidy kvercitrin (kvercetin-3-rhamnosid), isokvercitrin (kvercetin-3-glukosid) a kempferol-3O-glukosid. U všech vyizolovaných látek byla v konečné koncentraci 100 μM prokázána inhibiční aktivita na obě cholinesterasy (tab. 2). testovaný podíl hexan chloroform ethylacetát butanol

% inhibice AChE 54,1 32,7 94,3 49,0

% inhibice BChE 42,7 66,4 98,3 55,9

Tab. 1: Inhibice testovaných enzymů jednotlivými podíly P. lapathifolium

Nejvyšší inhibiční aktivita na AChE se prokázala u standardu galantaminu (IC50 1,143 × 10-3 mM), BChE nejsilněji inhiboval kempferol (IC50 14,922 × 10-3 mM). Obě cholinesterasy také významně inhiboval druhý standard, kvercetin. BChE inhibovaly tyto flavonoly výrazně silněji neţ AChE. Liší se počtem hydroxylů na kruhu B, kempferol má jeden hydroxyl, kvercetin dva v opoloze. U BChE je tento výsledek v souladu s dostupnou literaturou, podle níţ inhibiční aktivita 134

s rostoucím počtem hydroxylů na B-kruhu klesá. U inhibice AChE byla prokázána závislost opačná, s počtem hydroxylů inhibiční aktivita na AChE mírně stoupá. [5] Ačkoliv má flavanonol taxifolin na B-kruhu také dva hydroxyly v o-poloze, jeho aktivita je mnohem menší, coţ ukazuje i na důleţitost dvojné vazby mezi druhým a třetím uhlíkem A-kruhu na inhibiční aktivitu.

Testovaná látka kys. p-OH benzoová kyselina galová taxifolin kempferol kempferol-glukosid kvercitrin isokvercitrin standard - kvercetin standard - galantamin

% inhibice AChE 12,4 ± 8,2 51,2 ± 8,9 17,6 ± 0,3 60,4 ± 5,2 21,7 ± 5,1 24,9 ± 3,5 20,9 ± 2,0 69,5 ± 2,7 95,7 ± 3,1

% inhibice BChE 9,0 ± 0,4 33,1 ± 0,4 17,8 ± 9,5 74,5 ± 7,5 45,9 ± 2,6 5,5 ± 3,2 41,5 ± 2,9 82,6 ± 2,0 57,9 ± 4,8

IC50 (mM) pro AChE N N 23,273 1,367 55,097 NI 0,916 0,124 1,143 × 10-3

IC50 (mM) pro BChE N N NI 14,922 × 10-3 0,438 1,321 0,488 26,735 × 10-3 0,168

Tab. 2: Inhibice testovaných enzymů vyizolovanými látkami, IC50 standardů a flavonoidů. (NI - IC50 se nepodařilo pro omezenou rozpustnost látky stanovit, N - IC50 nebyla stanovena)

Flavonoidní glykosidy měly v porovnání s příslušnými aglykony výrazně niţší inhibiční aktivitu. Můţe to být způsobeno buď rozdílnou polaritou aglykonu a glykosidu nebo sterickým bráněním cukru, kdy se glykosid nemůţe dostat k aktivnímu centru enzymu. Z fenolických kyselin měla výraznější aktivitu kyselina galová, coţ naznačuje opět vliv hydroxylů na inhibiční aktivitu. Závěr Polygonum lapathifolium L. je bohatým zdrojem fenolických látek, především flavonoidů. Ty vykazují celé spektrum biologických účinků, jeţ se vzájemně doplňují. Pro terapii AN je výhodný námi prokázaný duální inhibiční účinek flavonoidních aglykonů na obě cholinesterasy, dále inhibiční účinek na monoaminooxidasu A i B, antioxidační, přechodné kovy vázající a protizánětlivý účinek.

Seznam literatury: [1] Alzheimer disease, URL: http://www.alz.org/alzheimers_disease_what_is_alzheimers.asp (přístup 22.11.2010) [2] Cokugras at al. Tourkish Journal of Biochemistry 28, 54 (2003) [3] Di Giovanni at al. Europ. J. Pharm. Sciences 33, 109 (2007) [4] Smolarz et al. Naturforsch. 61, 64 (2006). [5] Katalinic et al. Europ. J. Med. Chemistry 45, 186 (2010) 135

Studium flavonoidních glykosidů po hydrolýze metodou HPLC-DAD-ELSD zaměřené na identifikaci cukerné složky Javorková Věra, Magdalena Kalinayová, Radka Pořízková, Milan Ţemlička Farmaceutická fakulta VFU Brno, Ústav přírodních léčiv, Palackého 1-3, CZ-612 43 Brno, [email protected] Cíl projektu a současný stav: Důleţitou součást analýzy látek přírodního původu představuje analýza glykosidů. Glykosidy jsou molekuly sloţené z cukerné (glykon) a necukerné sloţky (aglykon). Glykosidická vazba můţe být rozštěpena chemickou nebo enzymatickou cestou. Je známo, ţe chemická hydrolýza probíhá nespecificky na rozdíl od enzymatické hydrolýzy [1-3]. Pro určení struktury glykosidu je třeba identifikovat obě jeho sloţky, druh jejich vazby a u aglykonu s více hydroxylovými skupinami i polohu glykosidické vazby. Mezi nejčastěji pouţívané metody patří HPLC-MS nebo GC-MS (pro trifluoroacetylované deriváty). Avšak tyto metody neumoţňují rozlišení cukerných izomerů. Metody HPLC-NMR-MS či 2D NMR techniky jsou instrumentálně a finančně náročné techniky. Při detekci glykonu je problémem absence chromoforu, coţ prakticky vylučuje pouţití UV-VIS detektoru. Alternativní refraktometrický detektor je moţné pouţívat pouze v podmínkách izokratické eluce a nevýhodou je jeho nízká citlivost. Evaporative Light Scattering Detector (ELSD) je detektor velmi vhodný pro analýzu sacharidů (dostatečná citlivosti, stabilní základní linie, moţnost gradientové eluce) [4]. Cílem této práce bylo vytvořit HPLC metodu pro identifikaci sacharidových jednotek (s pouţitím ELSD) aplikovatelnou po předchozí hydrolýze glykosidu. Nástrojové vybavení a metodika: Systém HPLC YL9100 (Young Lin Instrument Co., Ltd., Korea) s DAD + ELSD (Agilent 1200 Series, Agilent, Německo), software YL-Clarity (DataApex, Praha, CZ). Kolona LiChrospher (DIOL, Merck) 5µm, 4,1 x 250 mm. Mobilní fáze: eluce isokratická, 91:9 acetonitril:voda; t=31°C, průtoku 2 ml/min. Kolona LiChrospher DIOL je schopna rozdělit i cukerné enantiomery, coţ se můţe projevit na chromatogramu více píky pro jeden sacharid [3]. Jako modelové vzorky byly zvoleny dvě řady flavonoidních glykosidů: deriváty kvercetinu (rutin, kvercetin glukosid, kvercetin galaktosid a kvercitrin) a hesperetinu (hesperidin, neohesperidin). Pro kyselou hydrolýzu byla zvolena kyselina trifluoroctová (TFA). TFA hydrolyzuje zkoumané látky bez jejich degradace a není zadrţována kolonou. 136

Enzymatická hydrolýza byla prováděna v podmínkách optimálních pro aktivitu enzymů. Glukosidasa (EC 3.2.1.21)

pH 5,0, 30 min, 37°C,

terminální (kvercetin glukosid, hesperidin a neohesperidin po glc předchozím působení hesperidinázy)

Galaktosidasa (EC 3.2.1.23)

pH 7,3, 30 min, 37°C

terminální gal

(kvercetin galaktosid)

Hesperidinasa (EC 3.2.1.40)

pH 3,8, 30 min, 40°C

terminální rha

hesperidin, neohesperidin, rutin a kvercetin rhamnosid) Výsledky

Kyselá hydrolýza byla prováděna na základě experimentálně zjištěných optimálních podmínek pro hydrolýzu rutinu. Tento postup byl aplikován i na ostatní glykosidy. Rutin byl rozpuštěn ve směsi methanolu a vody (1:1) v koncentraci 1 mg/ml a smíchán s TFA (8M, ředěná acetonitrilem) v poměru 1:1. Poté byla směs zahřívána 60 minut při 90°C a přímo analyzována pomocí systému HPLC-DAD-ELSD. Výsledek hydrolýzy viz obr.1. Obr.1: Kyselá hydrolýza rutinu. Podmínky: kolona LiChrospher 100 DIOL (Merck), eluce isokratická, MF acetonitril:voda 91:9 Kyselá hydrolýza proběhla úspěšně u všech standardů a bylo moţno separovat a identifikovat všechny sloţky glykosidů (aglykon i jednotlivé monosacharidy). Bylo prokázáno, ţe během této doby nedojde k destrukci monosacharidových jednotek (glc, gal, rha) ani aglykonu (kvercetin, hesperetin). U hydrolýzy hesperidinu byl zjišťován kvantitativní průběh reakce. Ve zkoumaných koncentracích byla zjištěna lineární závislost mezi koncentrací původního glykosidu a získanými koncentracemi uvolněných sacharidů. Během hydrolýzy dochází k velmi malým ztrátám a je zachován hmotnostní poměr hesperidinu a jeho cukrů (1 mg hesperidinu odpovídá 0,29 mg glc a 0,26 mg rha) - viz obr. 2. Enzymatická hydrolýza probíhá specificky. Pomocí hesperidinasy byla z rutinu, hesperidinu a neohesperidinu odštěpena terminální rhamnóza. Následně byla z kvercetin-7-glukosidu vzniklého 137

z hesperidinu a neohesperidinu odštěpena glukóza. Glykosidy s cukernou sloţkou v poloze 3 nebyly enzymy rozkládány [5].

hydrolýza hesperidinu

Obr.2: Závislost

koncentrace monosacharidů

0,30

hydrolýzou

y = 0,2477x R2 = 0,9953

0,25 0,20

uvolněných

y = 0,2319x R2 = 0,9946

0,15

Rha glc Lineární (glc) Lineární (Rha)

0,10

sacharidových jednotek na koncentraci hesperidinu

0,05 0,00 0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

koncentrace hesperidinu

Dále byla metoda aplikována na neznámou látku izolovanou z Polygonum lapathifolium (Polygonaceae). Na základě shody spektra a retenčního času aglykonu bylo zjištěno, ţe se jedná o glykosid kempferolu. Pomocí kyselé hydrolýzy byla látka určena jako kempferol-galaktosid. Protoţe nepodléhá enzymatické hydrolýze, lze navíc předpokládat, ţe je cukerná sloţka navázána v poloze 3. Závěr a využití metody Zavedení metody HPLC-DAD-ELSD do běţné praxe rozšíří moţnosti identifikace přírodních glykosidů. Vyvinutá metoda je, co se týče finančních a časových nároků, levná a rychlá a ve spojení s enzymatickou hydrolýzou umoţňuje získat informace o pořadí a částečně i poloze navázaných sacharidů, coţ často nedokáţe ani přímá analýza HPLC-MS.

Seznam literatury: [1] Brito-Arias M.: Synthesis and Characterization of Glycosides, ISBN 13: 978-0-387-26251-2 Springer, 2007. [2] Vystrčil A.: Rostlinné glykosidy, ČSAV, 1955, Praha. [3] Rotrekl V.: Chemické Listy 92, 883 (1998). [4] Douša M., HPLC.CZ, http://www.hplc.cz/Teorie/ELSD.htm (24.11.2010) [5] Day A.J.,et all: FEBS Letters 436, 71 (1998). Poděkování: Práce vznikla s podporou grantu IGA VFU 10/2010/FaF. 138

Využitie kapilárnej zónovej elektroforézy a nukleárnej magnetickej rezonancie pri stanovení fyzikálno-chemického profilu potenciálnych liečiv Iva Kapustíková, Jan Tengler, Anna Lišková, Zuzana Slivová Ústav chemických léčiv, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Predmetom

syntetickej

aryloxypropanolov,

časti

u ktorých

projektu

moţno

bola

očakávať

príprava vlastnosti

série

funkčných

beta-adrenolytické

analógov vďaka

arylkarbonyloxypropanolamínovému skeletu a alfa-adrenolytické vďaka fenoxyetylamínovému fragmentu. Tieto vlastnosti budú mať ultrakrátky účinok vďaka prítomnosti metabolicky nestabilnej esterovej skupiny (obr. 1). Cieľom analytickej časti bolo u týchto zlúčenín, pripravených vo forme hydrochloridov, stanoviť ich disociačné konštanty pomocou kapilárnej zónovej elektroforézy a nukleárnej magnetickej rezonancie.

OH O

O

H N

O

R1

R1 = 2-OCH3, 4-OCH3, 2,6-OCH3, 2-F, 4-F R2 = -NHCOOCH3, -NHCOOC2H5, -NHCOOC3H7, -NHCOOC4H9 -OCH3, -OC2H5, -OC3H7, -OC4H9

R2

Obrázok 1: Štruktúra študovaných látok Materiál a metodika Experimentálne stanovenie pKa metódou CZE spočívalo v meraní elektroforetickej pohyblivosti analytu ako funkcie pH separačného elektrolytu. Táto závislosť predstavovala sigmoidu, pričom pKa bola hodnota pH v jej inflexnom bode. Merania prebiehali v nasledujúcich podmienkach: -

prístroj: Agilent 3D CE (Agilent Technologies, Waldbronn, Nemecko)

-

nepokrytá kremenná kapilára: ID =75 µm, LC = 48,5 cm, LD = 40 cm

-

separačné napätie: 10, 15 a 20 kV

-

hydrodynamické dávkovanie: p = 30 – 50 mBa, t = 3 – 5 s

-

koncentrácia študovaných látok: 5.10-4 mol.dm-3 v metanole 139

-

marker elektroosmotického toku: metanol

-

detekcia (DAD detektor): λ = 214 nm, 254 nm

-

merania v systéme deviatich aţ trinástich tlmivých roztokov: pH = 3,4 – 10,5

Pri stanovení pKa pomocou 1H NMR-spektroskopie bol sledovaný chemický posun signálu protónov viazaných v blízkosti ionizovateľnej skupiny v závislosti na pH roztoku vzorky. Závislosť posunu na pH predstavovala sigmoidu, pričom pKa bola hodnota pH v jej inflexnom bode. Merania prebiehali v zmesi metanol-d4 – D2O. Hodnoty pKa vyjadrené v pH škále vodného prostredia boli prepočítané na hodnoty, ktoré sa vzťahujú k zmesi rozúšťadiel1) a následne boli odvodené disociačné konštanty pre vodné prostredie2). Stanovenie v zmesi deuterovaných rozpúšťadiel vyţadovalo následne prepočet výsledkov na H2O ekvivalent3). Ďalší spôsob prepočtu nameraných hodnôt na H2O ekvivalent spočíval v stanovení pKa štyroch beta-blokátorov, zvolených na základe ich štruktúrnej podobnosti so študovanými látkami. Hodnoty disociačných konštánt známych liečiv namerané v rovnakom prostredí ako študované látky boli porovnané s hodnotami tabuľkovými a z ich vzťahu bol odvodený prepočet. Merania prebiehali v nasledujúcich podmienkach: -

prístroj: Gemini 200 (Varian, USA)

-

elektróda: IS FET pH-mikroelektróda PH46-SS

-

merané spektrá: 1H pri operačnej frekvencii 199,9827 MHz

-

teplota: 29 °C

-

počet skenov: 16

-

akvizičný čas: 1,9998 s

-

vnútorný štandard: tetrametylsilan

-

mnoţstvo meranej vzorky: asi 10 mg na 0,7 ml rozpúšťadla (zmes metanolu-d4 a

D2O, v objemovom pomere 10:3) -

titračné roztoky: CF3COOH (c = 7µl/1ml rozpúšťadla), NaOH (c = 5mg/1ml

rozpúšťadla) -

rozsah pH: 1,5 – 13

140

Výsledky Doteraz bolo metódou CZE študovaných šestnásť zlúčenín. Získané hodnoty disociačných konštánt sú znázornené v tabuľke 1. 2MC2a 2MC2b 2MC2c 2MC2d DMC2a DMC2b DMC2c DMC2d

R2 0,9515 0,9409 0,9599 0,9422 0,9845 0,9853 0,9889 0,9861

pKa 7,99 7,94 8,04 7,96 8,39 8,33 8,37 8,29

R2 0,9890 0,9849 0,9907 0,9911 0,9792 0,9822 0,9646 ----

pKa 9,34 9,36 9,34 9,33 7,96 7,71 7,41 ----

2FT2a 2FT2b 2FT2c 2FT2d 4FT2a 4FT2b 4FT2c 4FT2d

Tabuľka 1: Výsledky CZE meraní Hodnoty disociačných konštánt ôsmich študovaných zlúčenín, získané metódou NMR sú znázorňené v tabuľke 2. Sigmoidálny priebeh závislosti chemického posunu na pH vykazovali signály dvoch vodíkov. 2MC 2MC 2a 2MC 2b 2MC 2c

N 8,4 MR1 38,0 48,3 98,4

R2 0,99 0,99 97 0,99 94 0,99 98

N 8,4 MR2 28,0 18,3 78,4

R2 0,99 0,99 93 0,99 88 0,99 95

Tabuľka 2: 9Výsledky941H NMR7meraní 89 2d Meranie pKa pomocou NMR, či uţ 1H,

13

4FT 4FT 2a 4FT 2b 4FT 2c

N 8,1 MR1 38,1 78,1 48,2

2d C alebo

15

1

R2 0,99 0,99 92 0,99 87 0,99 87 92

N 8,1 MR2 28,1 38,1 58,2 2

R2 0,99 0,99 89 0,99 80 0,99 85 90

N, je overená, ale doposiaľ nie príliš často

pouţívaná metóda. U malých molekúl bola pouţitá napr. v prípade niektorých alkaloidov 4), antibiotík alebo adenínových derivátov. V prípade potenciálnych liečiv kardiovaskulárneho systému táto metóda podľa dostupnej literatúry pouţitá nebola. Vynikala vysokou reprodukovateľnosťou meraní a osvedčila u látky 4FT2d, u ktorej nebolo moţné stanoviť pKa elektroforeticky. Zoznam literatúry: 1.

Canals I., Oumada F. Z., Rosés M., Bosch E.: J. Chromatogr. A. 911, 191-202 (2001).

2.

Rived F., Canals I., Bosch E., Rosés M.: Anal. Chim. Acta. 439, 315-333 (2001).

3.

Krezel A., Bal W.: J. Inorg. Biochem. 98, 161-166 (2004).

4.

Grycová L., Dommisse R., Pieters L., Marek R.: Magn. Reson. Chem. 47, 977-981 (2009).

141

Testování biologické aktivity látky s potenciálně cytostatickým účinkem Vančo J.2, Kubíčková Z.1, Praţanová G.1, Chalupová M.1, Parák T.1, Suchý P.1 1

Ústav humánní farmakologie a toxikologie, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

2

Ústav chemických léčiv, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod

Maligní nádory představují stále větší celospolečenský i medicínský problém. Jde o onemocnění, která jsou druhou nejčastější příčinou mortality a morbidity (1). Výzkum a vývoj nových způsobů medikamentózní intervence patří proto k jedněm z nevyšších priorit WHO, Evropské unie i národních států. V současnosti se rozvíjí několik paralelních směrů vývoje nových protinádorových léčiv. Jednak se jedná o vývoj biofarmaceutik, která mají vysokou účinnost, specificitu, nízké neţádoucí účinky a také moţnost individualizace léčby, avšak jsou pro většinu pacientů ekonomicky nedostupná. Druhou moţností je vývoj nových léčiv popřípadě syntetická optimalizace dnes jiţ zavedených cytotoxických chemoterapeutik s cílem zvýšení účinnosti, selektivity a sníţení obvykle nezanedbatelných neţádoucích účinků. Touto problematikou se zabývala například Elisângela de Paula Silviera-Lacerda a její tým, kteří popsali pozitivní účinek cis-[RuCl2(NH3)4]Cl na lymfocyty periferní krve. Kdy při vyšších koncentracích sledované látky zaznamenali inhibici proliferace buněk a inhibici produkce IL-2 a naopak v nízkých dávkách docházelo ke stimulaci proliferace a zvýšené produkci IL-2. Z toho vyplývá, ţe při úpravě dávky by se mohla tato látka vyuţít jako supresor nebo jako induktor imunity (2). V České republice se touto problematikou zabývá kolektiv prof. Trávníčka, který se zaměřil na přípravu a hodnocení komplexních sloučenin derivátů 6-benzylaminopurinu a platnatých dichlorido, oxaláto a cyklobutan-1,1'-dikarboxyláto komplexů s deriváty 6 benzylaminopurinu (3-5). V úzké spolupráci s tímto týmem byl vypracován i tento projekt. Cílem této práce bylo zavést model myší lymfocytární leukémie pro testování nově syntetizovaných látek s potenciálním cytostatickým účinkem a otestovat biologickou aktivitu jedné modelové látky (látka X) s předpokládanou proapoptickou aktivitou. Screeningové testování navazovalo na předchozí testování na tkáňových kulturách. Materiál a metodika Pro experiment bylo pouţito 31 kusů samců laboratorní myši kmene CBA/J SPF. Zvířata byla ustájena v místnosti s teplotním reţimem v rozmezí 20-24ºC, krmena komerčně dodávanou směsí a 142

napájena pitnou vodou dle potřeby. Po týdenní aklimatizaci byly myši rozděleny do pokusných skupin. První skupina: kontrolní (10ks) i.p. aplikace buněčné kultury myší lymfocytární leukémie L 1210 v dávce 1x105 buněk. Druhá skupina: (7 ks) i.p. aplikace testované látky X v dávce 70mg/kg. Třetí skupina: i.p. aplikace látky X v dávce 70mg/kg a buněčné kultury L1210. Čtvrtá skupina: i.p. aplikace látky X v dávce 35mg/kg a buněčné kultury L1210. Testovaná látka byla podávána ihned po aplikaci buněčné kultury L1210 a poté po 24 a 48 hodinách. Během pokusu byl sledován zdravotní stav zvířat a jejich hmotnost. Dále bylo třikrát (15., 22. a 29. den) provedeno orientační vyšetření krve. Krevní nátěr byl zhotoven z periferní venózní krve, odběrem z ocasní vény a obarvením dle Pappenheima. Po 29 dnech byla zvířata usmrcena cervikální dislokací, provedena pitva a odebrány orgány pro histologické vyšetření. Odebrané vzorky byly zafixovány 10 % neutrálním pufrovaným formaldehydem, odvodněny vzestupnou alkoholovou řadou (30% - 50% - 70% - 80% - 95% - 100%), projasněny xylenem, prosyceny a zality do parafínu. Z parafínových bločků zhotovené preparáty byly obarveny hematoxylinem – eosinem. Základní barvení bylo doplněno o speciální barvení Gomori, Perls a imunohistochemickou detekci apoptózy. Výsledky V krevních nátěrech byla potvrzena infiltrace krevního řečiště nádorovými buňkami. Provedená pitva odhalila u testovaných zvířat peritonitidu, zvětšené uzliny a extranodulární nádorové infiltrace stěny střevní (převáţně tenké střevo). Sledované morfologické změny v řezech odebraných tkání byly hodnoceny semikvantitativně stupnicí od 0 (ţádné změny) po 10 (maximum změn). Morfologické změny jater Smíšená steatosa Zonální, fokální nekrosy Epiteloidněgranulomatosní reakce Portální inflamatorní reakce Polyjaderné a makrojaderné hepatoc. Degenetrace hepatocytů Inkluze v hepatocytech Cholestáza Infiltrace lymfogyty Pozitivita ţeleza

Kontrola L1210

X 70 mg/kg 6 4

X 35 mg/kg + L1210 6 5

X 70 mg/kg + L 1210 7 5

0 3 2

2

3

4

0

0

1

2

8

8

7

6

0

1

2

2

0

3

2

3

1 3 0

0 0 3

1 1 1

1 1 2

143

Morfologické změny ledvin Edém tubulů Regresivní změny tubulů Zonální, fokální nekrózy Intersticiální hemoragie Kulatobuněčná infiltrace intersticia Intraglomerulární hemoragie mikrotrombotizace glomerulu Morfologické změny sleziny Splenomegalie Reaktivní změny Morfologické změny mízních uzlin Reaktivní změny B - aktivace

Kontrola L1210

X 70 mg/kg 4 2

X 35 mg/kg + L1210 3 1

X 70 mg/kg + L 1210 6 3

1 0 0

0

0

1

1

4

3

5

2

1

0

1

0

2

1

3

0

2

0

3

Kontrola L1210

X 70 mg/kg

2 3 Kontrola L1210

0 1 X 70 mg/kg

5 5

4 0

X 35 mg/kg + L1210 1 1 X 35 mg/kg + L1210 2 2

X 70 mg/kg + L 1210 1 1 X 70 mg/kg + L 1210 3 3

U extranodulární nádorových infiltrátů střeva byla hodnocena velikost, lokalizace a byla provedena imunohistochemická detekce apoptózy TdT enzymem (ApoTag Peroxidase Detection Kit – TUNEL). Hodnoceno semikvantitativně stupnicí od 0 (ţádné změny) po 10 (maximum změn). Extranodulární nádorové infiltráty (nad 1 mm) Duodenum Prox. Jejunum Term. Jejunum Ileum Colon TUNEL +

Kontrola L1210

X 70 mg/kg

X 35 mg/kg + L1210

X 70 mg/kg + L 1210

0 2 5 6 0 1

0 0 0 0 0 0

0 0 4 5 0 5

0 0 4 5 0 8

Závěr Z výsledků semikvantitativního hodnocení je patrné, ţe testovaná látka vyvolala reverzibilní polékovou reakci v játrech. V ledvinách byly změny intenzivnější, nicméně slučitelné se ţivotem. Navíc jsme jasně prokázali proapoptotickou aktivitu testované látky. Apoptóza je jedním z hlavních typů programované buněčné smrti, kdy se organismus zbavuje poškozených buněk. Látky, které mají schopnost tuto programovanou buněčnou smrt vyvolat mohou být významné v terapii nádorového bujení. Tato práce byla vypracována za podpory grantu IGA VFU 11/2010/FaF.

144

Seznam literatury: 1. World Health Statistics 2009, World Health Organisation 2009, 149p. 2. Elisângela de Paula Silviera-Lacerda at all, The Ruthenium Komplex cis-(Dichloro) Tetraammineruthenium (III) Chloride Presents Immune Stimulatory Aktivity on Human Peripheral Blood Mononuclear Cells 2009, Biol. Trace. Elem. Res. 2010, 133:270. 3. M. Maloň, Z. Trávníček, R. Marek, M. Strnad, J.Inorg. Biochem. 2005, 99:2127. 4. L. Dvořák, Z. Trávníček, I. Popa, CZ 20271 U1, 2009. 5. P. Štarha, Z. Trávníček, I. Popa, CZ 19706 U1, 2009.

145

Látky s fragmentem N-fenyl-2-(2-oxo-1-azacykloalkan-1-yl)acetamidu jako inhibitory aminopeptidas Oldřich Farsa, Lenka Holubářová, Irena Macků Ústav chemických léčiv, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Aminopeptidasy jsou peptidohydrolasy, řazené mezi exopeptidasy, tj. enzymy štěpící peptidové řetězce od konce, a na rozdíl od karboxypeptidas, aminopeptidasy katalyzují hydrolytické odštěpování zbytků N-koncových aminokyselin. Uplatňují se prakticky u všech organismů a hrají významnou roli mj. v aktivaci i degradaci peptidických hormonů a dalších tělu vlastních peptidů, z nichţ některé, slouţí prokazatelně nebo velmi pravděpodobně téţ jako neurotransmitery zejména v CNS a jsou proto označovány jako neuropeptidy. Jako příklady lze uvést např. gonadorelin (GnRH), somatostatin, oxytocin a vasopresin nebo thyreotropin-releasing hormon (TRH, protirelin). Piracetam, 2-(2-oxopyrrolidin-1-yl)acetamid, je strukturním prototypem („lead compound“) a také nejpouţívanější látkou strukturní skupiny tzv. racetamů, patřící k léčivům posilujícím kognitivní funkce. Látka pro svou nízkou lipofilitu (log Poktanol/voda= - 1,54 [1]) obtíţně proniká přes hematoencefalickou bariéru [2, 3] a pro zajištění dostatečné koncentrace v mozku vyţaduje značně vysoké dávky, coţ však vzhkedem k její velice nízké toxicitě není na závadu. Existují také její lipofilnější analogy, např. nefiracetam, N-(2,6-dimethylfenyl)-2-(2-oxopyrrolidin-1-yl)acetamid. Mechanismus účinku těchto posilovačů kognitivních funkcí není dosud uspokojivě objasněn. Jednou z moţných hypotéz je i inhibice aminopeptidas, štěpících neuropeptidy. Toto vysvětlení s zdá být o to pravděpodobnější, ţe mnohé neuropeptidy, např. TRH nebo GnRH, obsahují jako Nkoncovou aminokyselinu 5-oxoprolin, který obsahuje stejný fragment pyrrolidin-2-onu jako racetamy. Z tohoto důvodu jsme přistoupili k testování inhibiční aktivity látek, obsahujících větší fragment

N-fenyl-2-(2-oxo-1-azacykloalkan-1-yl)acetamidu, připravené na Ústavu chemických

léčiv, jeţ lze povaţovat za poměrně těsné strukturní analogy kognitivního posilovače nefiracetamu. (Obr. 1). O

NH2

N

O H N O

N H

O

N

N

NH

(CH2)n

O HN

H2N O

O

O

H3C

N

O

O HN

0
CH3 R

N TRH

piracetam

nefiracetam

testované látky

Obr. 1: TRH, piracetam, nefiracetam a obecná struktura testovaných sloučenin

146

Membránová alanyl aminopeptidáza (mAAP), označovaná také jako aminopeptidáza M (mikrozomální/membránová), psudoleucinová aminopeptidáza nebo aminopeptidáza N (APN) je dimerní integrální membránový protein, sloţený z 967 aminokyselin, poprvé izolovaný roku 1963 z mikrozomální frakce prasečích ledvin[4]. APN byla zvolena jako modelový enzym se širokou substrátovou specifitou[5, 6] pro ověření, zda uvedené testované sloučeniny mohou mít potenciál inhibovat aminopeptidasy. Materiál a metodika Aminopeptidasa N, EC 3.4.11.2, izolovaná z prasečích ledvin, byla zakoupena od fy Sigma, USA, stejně jako L-leucin-p-nitroanilid, substrát pro tento enzym. Všechny ostatní pouţité chemikálie byly v čistotě p.a. nebo pro biochemické účely. Pro inkubaci vzorků obsahujících enzym, substrát a příslušný potenciální inhibitor byl pouţit blokový termostat SBD 130D (Stuart, UK) osazený dvěma hliníkovými bloky pro mikrozkumavky; samotné vzorky byly umístěny v polypropylenových mikrozkumavkách s víčkem o objemu 1,5 ml. Hodnoty absorbance při 405 nm, coţ je absorpční maximum 4-nitroanilinu, produktu hydrolýzy výše uvedeného substrátu, byly měřeny na spektrofotometru Helios Beta (Unicam, UK) v polymethylmethakrylátových semimikrokyvetách fy Brand, Německo. Výsledky stanovení inhibiční aktivity byly vyjádřeny pomocí

konstanty

IC50

s vyuţitím

biochemického

programu

GraFit

(Erichaus,

USA).

Spektrofotometrické stanovení inhibiční aktivity bylo provedeno v podstatě ve shodě s dříve publikovanou metodikou [7] s drobnými odchylkami. Výsledky Schopnost

vybraných

7

sloučenin

s fragmentem

N-fenyl-2-(2-oxo-1-azacykloalkan-1-

yl)acetamidu inhibovat APN ve srovnání s o-fenanthrolinem, který lze povaţovat za jistý standard mezi inhibitory aminopeptidas [8 - 11] ukazuje Tabulka 1. Tabulka 1.: Inhibiční účinnost testovaných sloučenin

(CH2)n

N

O

O HN R

Látka AA005 AA315 FOK25 FOK26 FOK37 FOK45 FOK46

R H m-OCH3 oo- COOH OCH 2 m- COOH OCH 2 pOCH2COOH p- COOH OCH 2

n 1 1 1 2 3 1 2

IC50 [mmol.l1 ] 1,100 0,241 0,612 0,297 0,296 0,990 0,313

OCH2COOH 147

o-

N

-

-

0,121

fenanthrolin

N

Diskuze Z testovaných

látek

s fragmentem

N-fenyl-2-(2-oxo-1-azacykloalkan-1-yl)acetamidu

byl

nejúčinnějším inhibitorem N-(3-methoxyfenyl)-2-(2-oxopyrrolidin-1-yl)acetamid (AA315; IC50 = 0,241 mmol.-1). Substituce karboxymethyloxyskupinou se jeví jako méně výhodná, přičemţ ppoloha substituentu je zjevně méně výhodná neţ m-poloha. Nejméně výhodná pro účinek je zjevně substituce vodíkem, tj. ţádná, coţ naznačuje, ţe kyslíkový atom alkoxyskupiny by mohl hrát určitou roli ve vazbě látky na aktivní místo enzymu, patrně jako akceptor vodíkové vazby. Pokud jde o velikost kruhu, zdá se být šestičlenný -laktamový kruh (piperidin-2-on) výhodnější neţ pětia sedmičlenný kruh (pyrrolidin-2-on, resp. azepan-2-on). Vzhledem k velmi malému počtu testovaných sloučenin je však nutno tyto závěry týkající se vztahů mezi strukturou a aktivitou (SAR) povaţovat za velmi předběţné. Závěr Výsledky

inhibiční

aktivity

látek

s fragmentem

N-fenyl-2-(2-oxo-1-azacykloalkan-1-

yl)acetamidu vůči APN naznačují, ţe by takové sloučeniny mohly být poměrně účinnými inhibitory aminopeptidas. Proto bude vhodné pokračovat stanovením inhibiční aktivity vůči jiným aminopeptidasám, především takovým, jejichţ substráty mají uţší strukturní vztah ke struktuře tohoto fragmentu, především pyroglutamátové aminopeptidasy, jeţ dosti specificky štěpí mj. TRH [5]. Práce byla vypracována za finanční podpory grantu IGA VFU 26/2010/FaF.

Seznam literatury 1. Altomare C., Cellamare S. et al. J. Med. Chem. 38, 170-179 (1995) 2. Fischer H., Gottschlich R., Seelig A. J. Membrane Biol. 165, 201-211 (1998) 3. Lapka R., Rejholec V., Smolik S. Activitas Nervosa Superior 32, 58-59 (1990) 4. Pfleiderer G., Celliers P. G. Biochem. Z. 339, 186 (1963) 5. Barrett A.J., Rawlings N.D., Woessner J.F. The Handbook of Proteolytic Enzymes, 2nd ed., Elsevier Academic Press, Amsterdam, 2003 148

6. Bauvois B., Dauzonne D. Med. Res. Rev. 26, 88-130 (2006) 7. Hafkenscheid J. C. M, in Methods of Enzymatic Analysis; Vol. 5, Enzymes 3, H. U.Bergmeyer, Ed., VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, 1984 8. Matsui M., Fowler J. H., Walling L. L. Biol. Chem. 387, 1535–1544 (2006) 9. Hesp J. R., Hooper N. M. Biochemistry 36, 3000-3007 (1997) 10. Filiz G.,·Price K. A. et al.·Eur. Biophys. J. 37, 315–321(2008) 11. Sakurai Y., Inoue H. et al. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 73, 21-28 (2009)

149

Penetrace léčiv biologickými membránami a její ovlivnění látkami usnadňujícími přestup Lenka Dvořáková, Radka Opatřilová, Monika Brezovská, Kateřina Brychtová Ústav chemických léčiv, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Úvod Kaţdý z nás více či méně často uţívá léky. Stále se vyvíjí a zkoumá zvýšení dostupnosti a účinnosti léčiv a v neposlední řadě i usnadnění jejich uţívání. Jednou z moţných variant podání je transdermální aplikace, při které musí léčivá látka překonat koţní bariéru. V případě nedostatečného průchodu léčiva lze s výhodou vyuţít látky usnadňující jeho prostup. Právě takové látky jsme zkoumaly z hlediska ovlivnění penetrace léčiva. Materiál a metodika Část experimentů probíhala na Franzových difúzních celách (PermeGear, Germany). Testovaly jsme vliv průchodu léčiva z donorových prostředí, která obsahovala látky usnadňující penetraci s různou

chemickou

strukturou,

rozpuštěné,

případně

suspendované,

ve

směsi

vody

a propylenglykolu (1:1). Theofylin jako modelový penetrant procházel do fosfátového pufru buď kůţí získanou z vnější části prasečího ucha (všechny zkoumané sloučeniny), nebo epidermální tkáňovou membránou s fyziologickou bariérou a metabolismem (EpiDerm®, USA), na které byly zkoumané vybrané deriváty kyseliny cholové. V předem daných časových intervalech jsme během 24 hodin odebíraly vzorky (0,5 ml) z receptorové části. Adekvátní mnoţství čistého pufru jsme vţdy doplnily. Analýza vzorků probíhala na HPLC s DAD (Agilent 1200). Theofylin jsme stanovovaly na koloně Waters Symmetry s reverzní stacionární fází C8 (4,6 x 250 mm, 5μm) při teplotě 25°C. Jako mobilní fázi jsme pouţily směs acetonitrilu (50 %) a vody (50 %) s průtokem 0,5 ml / min a nástřikem 10 μl. Hodnoty jsme odečítaly při vlnové délce 280 nm. Deriváty kyseliny cholové jsme zkoumaly dále pomocí systému PAMPA (parallel artificial membrane permeability assays, BD Gentest), který imituje střevní membránu. Skládá se ze dvou částí s 96 jamkami, kde donorová fáze je umístěna dole a léčivo prochází fosfolipidovou membránou do horní části. Kaţdý derivát jsme testovaly ve třech různých donorových prostředích – ve fosfátovém pufru o pH 7,4, ve směsi propylenglykol : voda v poměru 1:1 a v isopropylmyristátu. Roztoky, případně suspenze, theofylinu a derivátu jsme aplikovaly do spodních jamek. Po naplnění jamek horní části fosfátovým pufrem jsme ji vsadily do dolní části. Po uplynutí 5 hodin jsme 150

odebraly vzorky z receptorové části. Stanovení mnoţství prošlého léčiva jsme provedly opět pomocí HPLC. Výsledky a závěry Série sedmi alkyl-6-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)-2-(2-oxopiperidin-1-yl)hexanoátů a sedmi s esterově

alkyl-6-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)-2-(morfolin-4-yl)hexanoátů

vázanými

lineárními

alkylovými řetězci C6 - C12 byly připraveny jako potenciální transdermální urychlovače penetrace. Testováním se ukázalo, ţe všechny zmíněné deriváty ω-laktamů vykazují vyšší penetrační aktivitu neţ kyselina olejová, která byla pouţita pro porovnání. Lze říci, ţe série s piperidin-2-onovým fragmentem, vykazuje mírně vyšší aktivitu neţ série s morfolinem1. R= -C6H13, -C7H15, -C8H17, -C9H19, -C10H21, -C11H23, -C12H25

X

O

O

N

R

O

O O

N

X= -H,

CH2

,

N

O

n

n = 1, 2, 3

obr.č.1: Struktury derivátů ω-laktamů

Druhou velkou skupinou potenciálních penetračních urychlovačů jsou deriváty kyseliny cholové. Byly nasyntetizovány nové řady. Testovaly jsme diethylenglykolovou, dekanoyldiethylenglykolovou,

bis(dekanoyl)glycerolovou,

tokoferolovou,

perfluorhexylsulfanylovou

a perfluorhexylsulfinylovou řadu. Kaţdá uvedená řada má přes hydroxylovou skupinu navázaný buď jeden příslušný substituent v poloze 3 (mono-deriváty), nebo dva v polohách 7 a 12 (bis-deriváty), nebo tři substituenty v polohách 3, 7 a 12 (tris-deriváty). Z výsledků vyplývá, ţe všechny deriváty mají pozitivní vliv na penetraci theofylinu. V kaţdé řadě nejvíce ovlivňoval penetraci derivát s jedním substituentem, pak se třemi a nejméně se dvěmi substituenty. 13 sloučenin má vyšší penetrační aktivitu neţ samotná kyselina cholová2. OH OH O 12

H H

3

HO

7

H OH

H

obr.č.2: Struktura kyseliny cholové

151

Vybrané deriváty s nejlepší penetrační aktivitou byly podrobeny měření s epidermální tkáňovou membránou. I zde se ukázalo, ţe v řadách klesá schopnost usnadňovat přestup theofylinu v pořadí mono-, tris- a bis-derivát. Zjistily jsme pozitivní vliv derivátů kyseliny cholové i na penetraci theofylinu přes membránu imitující střevní stěnu. V lipofilním prostředí isopropylmyristátu se neprojevil ţádný vliv na prostup léčiva. Ale přestup theofylinu z prostředí pufru usnadňovalo 8 derivátů (v průměru o 25 %). A v prostředí vody a propylenglykolu byla penetrace vyšší u 16 derivátů (průměrně o 50 %) neţ v soustavě bez urychlovače. Všechny studované sloučeniny zvyšují penetraci léčiva kůţí. Deriváty kyseliny cholové prokázaly pozitivní vliv na penetraci i přes membránu imitující střevní stěnu.

Seznam literatury: 1. Brychtová, K., Opatřilová, R., Raich, I., Kalinowski, D., Dvořáková, L., Plaček, L., Csöllei, J., Richardson, D. R., Jampílek, J.: Investigating the Activity of 2-Substituted Alkyl-6-(2,5dioxopyrrolidin-1-yl)hexanoates as Skin Penetration Enhancers. Bioorg. Med. Chem. 2010, 18, in press. 2. Dvořáková, L., Opatřilová, R., Mrózek, L.: Deriváty kyseliny cholové – potenciální penetrační enhancery. 39. konference Syntézy a analýzy léčiv, 2010, poster, abstrakt [ISBN 978-80-7399-986-5].

152