FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2016

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE RADIKAL DPPH (1,1-Difenil-2-pikrilhidrazil) DAN PENETAPAN KADAR FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL DAUN BENALU (Scurrula atropurpurea (B1.) Dans) DARI POHON KEMIRI ( Aleurites moluccana (L.) Willd)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi

Diajukan Oleh: Yonas Sinseng NIM : 118114101

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2016


ii

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE RADIKAL DPPH (1,1-Difenil-2-pikrilhidrazil) DAN PENETAPAN KADAR FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL DAUN BENALU (Scurrula atropurpurea (B1.) Dans) DARI POHON KEMIRI ( Aleurites moluccana (L.) Willd)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi

Diajukan Oleh: Yonas Sinseng NIM : 118114101

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2016 i


iii

ii


iv

iii


v

iv


vi

v


vii

HALAMAN PERSEMBAHAN

Janganlah hendaknya kamu kuatir tantang

apa

pun

juga,

tetapi

nyatakanlah segala hal keinginanmu kepada Allah dalam doa dan permohonan

dengan

ucapan

syukur. Damai sejahtera Allah, yang melampaui segala akal, akan memelihara hati

dan pikiranmu

dalam Kristus Yesus . (Filipi 4: 6-7)

Kupersembahkan Skripsi ini untuk : Tuhanku Kristus Yesus penebus dosaku dan pelitaku dan penuntun jalanku. Ayah, Ibu dan sudaraku beserta teman-temanku tercinta yang telah memberikan semangat serta doanya didalam mengerjakan skripsi ini serta seluruh keluarga besarku.

vi


viii

PRAKATA

Puji syukur kepada Tuhan karena berkat rahmat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode Radikal DPPH (1,1-Difenil-2-pikrilhidrazil) Dan Penetapan Kadar Fenolik Total Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol Daun Benalu (Scurrula atropurpurea (B1.) Dans)

Dari Pohon Kemiri (Aleurites moluccana (L.)

Willd” sebagai salah satu syarat guna memperoleh gelar Sarjana Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Dalam proses penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan dukungan dari semua pihak sehingga skripsi ini dapat terselesaikan dengan baik. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada : 1. Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 2. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku Dosen Pembimbing dan Dosen Penguji yang telah memberikan kritikan , saran didalam penelitian dan penyusunan skripsi ini, sehingga skripsi ini dapat diselesaikan dengan lancar. 3. Dr. Yustina Sri Hartini, M. Si., Apt., dan Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc., selaku dosen penguji skripsi atas masukan, kritik dan juga sarannya 4. Prof. Dr. C.J.Soegihardjo, Apt., atas saran kepada penulis terhadap penelitian didalam Skripsi ini.

vii


ix

5. Agustina Setiawati, M.Sc., Apt., Selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi yang telah membrikan izin didalam penggunaan laboratorium Farmakognosi - Fitokimia dan Biokimia Fisiologi Manusia. 6. Pak Kayat selaku Laboran Laboratorium Biokimia Fisiologi Manusia dan Pak Wagiran selaku Laboran Laboratorium Farmakognosi – Fitokimia. 7. Keluarga yang selalu memberikan semangat serta dukungannya kepada penulis didalam menyelesaikan Skripsi ini. 8. Yonathan Pura Hama Nganggu selaku teman seperjuangan didalam menyelesaikan Skripsi ini 9. Irvan Septya Giantama Balrianan dan juga Dirk Victor yang memberikan hiburan serta sarannya kepada penulis serta Brian G. Hukom. 10. Teman-teman FKK B 2011, FSM C 2011 dan juga teman-teman di Fakultas Farmasi Sanata Dharma angkatan 2011 yang memberikan semangatnya didalam menyelesaikan Skripsi ini. 11. Teman-teman lain yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu. Penulis menyadari bahwa Skripsi ini masih memiliki kekurangan. Oleh sebab itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari segala pihak. Semoga Skripsi ini berguna bagi semua pembaca. Yogyakarta, 29 Januari 2016

Penulis

viii


x

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL...............................................................................

i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .....................................

ii

HALAMAN PENGESAHAN .................................................................

iii

PERYATAAN KEASLIAN PENULIS ..................................................

iv

LEMBAR PERYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA .....

v

HALAMAN PERSEMBAHAN .............................................................

vi

PRAKATA ..............................................................................................

vii

DAFTAR ISI ...........................................................................................

ix

DAFTAR TABEL ...................................................................................

xiii

DAFTAR GAMBAR ..............................................................................

xiv

DAFTAR LAMPIRAN ...........................................................................

xvi

INTISARI................................................................................................

xvii

ABSTRACT ............................................................................................

xviii

BAB I

PENGANTAR .........................................................................

1

A. Latar Belakang ..................................................................

1

1. Rumusan Permasalahan ...............................................

2

2. Tujuan penelitian .........................................................

3

3. Manfaat penelitian .......................................................

3

4. Keaslian penelitian .......................................................

3

ix


xi

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ...................................................

5

A. Benalu ................................................................................

5

1. Klasifikasi benalu ........................................................

5

2. Deskripsi benalu ..........................................................

5

3. Penyebaran benalu .......................................................

6

4. Morfologi benalu ........................................................

6

5. Kandungan kimia benalu .............................................

6

B. Senyawa Fenolik ...............................................................

7

C. Antioksidan .......................................................................

9

D. Radikal bebas ....................................................................

11

E. Metode DPPH....................................................................

12

F. Penetapan fenolik total ......................................................

13

G. Ekstraksi ............................................................................

14

H. Spektrofotometri visible ....................................................

16

I. Validasi metode analisis ....................................................

19

J. Landasan teori ...................................................................

21

K. Hipotesis ............................................................................

23

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ..............................................

24

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ........................................

24

B. Variabel .............................................................................

24

C. Definisi..............................................................................

24

D. Bahan dan Alat Penelitian .................................................

25

1.

Bahan penelitian .........................................................

x

25


xii

2.

Alat penelitian ............................................................

25

E. Metode Penelitian ..............................................................

26

1.

Determinasi Tanaman ................................................

26

2.

Pembuatan dan penyiapan bahan ...............................

26

3.

Preparasi sampel (Ekstraksi) ......................................

28

4.

Pembuatan fraksi etil asetat ........................................

28

5.

Pembuatan larutan pembanding, DPPH dan uji .........

29

6.

Uji pendahuluan .........................................................

31

7.

Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total

33

8.

Penetapan kandungan fenolik total ............................

33

9.

Optimasi metode uji aktivitas antioksidan .................

35

10. Uji aktivitas antioksidan .............................................

36

F. Analisis Hasil ....................................................................

37

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...............................................

38

A. Hasil Determinasi ..............................................................

38

B. Hasil Pengumpulan Bahan ................................................

38

C. Hasil Preparasi Sampel ......................................................

39

1.

Hasil Ekstraksi sampel ...............................................

39

2.

Hasil Fraksinasi ekstrak .............................................

42

D. Hasil Uji Pendahuluan .......................................................

44

1.

Uji pendahuluan senyawa fenolik ..............................

44

2.

Uji pendahuluan aktivitas antioksidan .......................

46

xi


xiii

E. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total .....................................................................

47

1.

Penentuan operating time (OT) ..................................

47

2.

Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ( λ maks) asam galat ...................................................

49

F. Validasi Metode Penetapan Fenolik Total ........................

50

G. Hasil Penetapan Kandungan Fenolik Total .......................

52

H. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan ...........

55

1. Penentuan panjang gelombang maksimum ...................

55

2. Penentuan operating time (OT) .....................................

57

I. Hasil Penetapan Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH ...................................................................

59

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ...............................................

67

A. Kesimpulan .........................................................................

67

B. Saran ...................................................................................

67

DAFTAR PUSTAKA .............................................................................

68

LAMPIRAN ............................................................................................

75

BIOGRAFI PENULIS ............................................................................

107

xii


xiv

DAFTAR TABEL

Tabel I.

Tingkatan Aktivitas Antioksidan terhadap DPPH ...............

10

Tabel II.

Nilai CV yang dapat diterima menurut Kingston (2004) .....

21

Tabel III. Hasil scanning panjang gelombang maksimum asam galat yang direaksikan dengan Folin-Ciocalteu ...................

50

Tabel IV. Hasil pengukuran absorbansi seri baku asam galat yang direaksikan dengan folin-Ciocalteu ............................. Tabel V.

51

Nilai presisi seri baku asam galat pada penetapan kandungan fenolik total ........................................................

52

Tabel VI. Hasil penentuan jumlah fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri ........................................

54

Tabel VII. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum pada berbagai konsentrasi ....................................................

57

Tabel VIII. Hasil aktivitas antioksidan kuersetin dengan metode DPPH....................................................................................

61

Tabel IX. Hasil aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri dengan metode DPPH .......................... Tabel X.

63

Hasil perhitungan IC50 kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri .......................

65

Tabel XI. Ukuran intensitas antioksidan ..............................................

66

xiii


xv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1.

3,3',4',5,7-pentahidroksi flavon (Kuersetin) ......................

Gambar 2.

Struktur kimia dari beberapa tipe flavonoid (Kumar et al., 2011) ...........................................................

Gambar 3.

7

8

Mekanisme pemberian satu elektron oleh Antioksidan ........................................................................

10

Gambar 4.

Asam Galat ........................................................................

13

Gambar 5.

Skema Instrumentasi Spektrofotometer .............................

17

Gambar 6.

Hasil uji pendahuluan fenolik (A = larutan blanko [air:metanol +Folin Ciocalteu + Na2CO3]; B = kontrol positif [asam galat + Folin Ciocalteu + Na2CO3]; C = larutan uji + Folin Ciocalteu + Na2CO3; D = larutan asam galat; E = larutan uji) ................................................

Gambar 7.

45

Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = larutan Kuer;setin B = larutan uji; C = larutan DPPH + Metanol; D = larutan uji + DPPH;E = larutan kuersetin + DPPH) ...

47

Gambar 8.

Grafik penentuan OT asam galat (optimasi 2) ...................

48

Gambar 9.

Grafik penentuan OT fraksi etil asetat ...............................

48

Gambar 10. Kurva seri baku asam galat (optimasi 3)............................

51

Gambar 11. Reaksi asam galat dan Reagen Folin .................................

54

Gambar 12. Gugus kromofor dan auksokrom DPPH ............................

56

xiv


xvi

Gambar 13. Grafik penentuan OT Kuersetin (optimasi 2) ....................

58

Gambar 14. Grafik penentuan OT fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri (optimasi 3) .......................................

58

Gambar 15. Perubahan DPPH akibat adanya antioksidan .....................

60

Gambar 16. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan kuersetin (optimasi 3).........................................................

62

Gambar 17. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri (optimasi 2) ........................................................................

xv

64


xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1.

Surat pengesahan determinasi benalu (Scurrula atropurpurea (B1.) Dans) .............................

75

Lampiran 2.

Kadar air serbuk uji .......................................................

76

Lampiran 3.

Gambar-gambar.............................................................

77

Lampiran 4.

Perhitungan rendemen ...................................................

80

Lampiran 5.

Penimbangan uji kandungan fenolik total .....................

81

Lampiran 6.

Optimasi penentuan kandungan fenolik total ................

82

Lampiran 7.

Data perhitungan konsentrasi asam galat dan fraksi etil asetat untuk penetapan fenolik total.............

Lampiran 8.

Data penimbangan untuk pengujian aktivitas antioksidan ......................................................

Lampiran 9.

85

91

Data perhitungan konsentrasi larutan pembanding, larutan uji dan DPPH...............................

92

Lampiran 10.

Optimasi metode uji aktivitas antioksidan ....................

97

Lampiran 11.

Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH ................................................................

Lampiran 12.

103

Perhitungan nilai IC50 kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanol benalu kemiri .........................................

xvi

105


xviii

INTISARI Sebagian besar penyakit diawali dan disebabkan oleh adanya reaksi radikal bebas yang berlebihan di dalam tubuh, maka tubuh memerlukan suatu komponen penting untuk menangkal serangan radikal bebas. Komponen penting yang mampu menyelamatkan sel-sel tubuh manusia dari bahaya radikal bebas adalah antioksidan. Oleh sebab itu peneliti perlu menemukan tanaman yang memiliki daya antioksidan. Salah satu tanaman yang ini diteliti adalah daun benalu dari pohon kemiri. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui seberapa besar aktivitas antioksidan dari fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu (Scurrula atropurpurea (B1.) Dans) dari pohon kemiri (Aleurites moluccana (L.) Willd) dengan menggunakan metode DPPH dan menetapkan kadar fenoliknya menggunakan metode Folin-Ciocalteu. Hasil uji aktivitas antioksidan dinyatakan dengan IC50, yaitu nilai konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri yang menghasilkan penangkapan 50% radikal DPPH. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu mempunyai kandungan fenolik total sebesar 44,3 ± 0,77 mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat ekstrak etanol dan nilai IC50 sebesar 13,71 ± 0,12 µg/mL, nilai IC50 tersebut termasuk dalam golongan aktivitas antioksidan sangat kuat.

Kata kunci: Antioksidan, (Scurrula atropurpurea (B1.) Dans) ,fraksi etil asetat, DPPH, IC50

xvii


xix

ABSTRACT Most disease begins and is caused by excessive free radical reactions in the body, the body requires a critical component to ward off free radical attack. Important components that are capable of saving the human body's cells from free radical damage is the antioxidant. Therefore, researchers need to find plants that have antioxidant power. One of the plants that wants to be inspected by researchers, the mistletoes leaf from pecan tree. The purpose of this study was to determine how much antioxidant activity in ethyl acetate fraction ethanolic extract of mistletoes leaf (Scurrula atropurpurea (B1.) Dans) from pecan tree (Aleurites moluccana (L.) Willd) by using DPPH method and set the total phenolic content using the Folin-Ciocalteu method. The results of this antioxidant activity assay expressed with IC50 ,thats is the concentration of ethyl acetate fraction of ethanolic extract of mistletoes leaf to capture 50% DPPH radicals. The results showed that the ethyl acetate fraction ethanolic extract of mistletoes leaf has a total phenolic content of 44.3 ± 0.77 mg Gallic Acid Equivalents (GAE) and have IC50 values of 13.71 ± 0.12 µg/mL, the IC50 values included in the class is very strong antioxidant activity.

Keywords: Antioxidants, (Scurrula atropurpurea (B1.) Dans), ethyl acetate fraction, DPPH, IC50

xviii


1

BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang Sebagian besar penyakit diawali dan disebabkan oleh adanya reaksi radikal bebas yang berlebihan di dalam tubuh. Oleh karena adanya pengaruh radikal bebas yang tidak baik bagi kesehatan tubuh, maka tubuh memerlukan suatu komponen penting yang menangkal serangan radikal bebas. Komponen penting yang mampu menyelamatkan sel-sel tubuh manusia dari bahaya radikal bebas adalah antioksidan. Berbagai penelitian telah membuktikan bahwa antioksidan berperan dalam menangkal serangan radikal bebas (Rohmatussolihat, 2009). Karakteristik utama antioksidan adalah kemampuan untuk menangkap radikal bebas. Radikal yang terkandung dalam sistem biologis dapat mengoksidasi asam nukleat, protein, lipid atau DNA dan menimbulkan penyakit degeneratif. Komponen antioksidan yang terdapat pada tanaman seperti asam fenolat, polifenol dan flavanoid akan menangkap radikal bebas seperti peroksida, hidroperoksida atau lipid peroksil, dan juga menghambat mekanisme oksidatif yang menimbulkan penyakit degeneratif (Miyerbamate, 2003). Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Devi (2011) telah diketahui adanya antivitas antioksidan pada ekstrak etanol daun Scurrula philippensis dengan hasil IC50 15,357 µg/mL yang termasuk kuat daya antioksidannya serta dengan nilai kandungan fenolik sebesar 454,40 mg ekivalen asam galat per g ekstrak serta pada penelitian Chairul (1998) bahwa hasil skrining fitokimia

1


2

menunjukkan ekstrak batang Scurrula atropurpurea (B1.) Dans dalam metanolkloroform (1 :1) mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, glikosida dan triterpena. Dan juga didalam penelitian yang dilakukan oleh Fitria (2011) terhadap benalu teh (Scurulla atropurpurea (B1.) Dans) didapatkan sebanyak 16 mg serbuk kuning dengan titik leleh 177-179˚C

yang telah berhasil diisolasi dari 20 g

ekstrak kental metanol dari benalu tersebut, kemudian dilakukan analisis spektrokopi dan uji fitokimia, berdasarkan hasil analisis serbuk kuning tersebut senyawa yang didapat adalah 3,3',4',5,7-pentahidroksi flavon (kuersetin) yang merupakan komponen antioksidan. Oleh karena penelitian antioksidan terhadap daun benalu (Scurulla atropurpurea (B1.) Dans) dari pohon kemiri (Aleurites moluccana (L.) Willd) belum dilakukan maka hal tersebut menarik minat peneliti untuk ikut meneliti seberapa besar kemampuannya untuk meredam aktivitas radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan nilai IC50. Untuk mendukung hasil aktivitas antioksidan yang didapat maka pada penelitian ini juga dilakukan penentuan jumlah fenolik total untuk mempresentasikan jumlah fenolik total yang menyebabkan aktivitas antioksidan (Patria, 2013).

1. Rumusan Permasalahan Dari latar belakang tersebut maka dirumuskan masalah dalam penelitian ini adalah: a. Berapakah kadar fenolik total daun benalu kemiri yang dinyatakan dalam mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat ekstrak etanol.


3

b. Berapakah nilai IC50 fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu dari pohon kemiri. 2. Tujuan Penelitian a. Tujuan Umum Menguji aktivitas antioksidan pada daun benalu kemiri dengan metode radikal DPPH. b. Tujuan Khusus 1. Penetapkan kadar fenolik total pada daun benalu kemiri. 2. Menentukan nilai IC50 pada daun benalu kemiri. 3. Manfaat Penelitian a. Manfaat teoritis Penelitian

ini

diharapkan

bermanfaat

bagi

pengembangan

ilmu

pengetahuan khususnya ilmu kefarmasian mengenai aktivitas antioksidan pada fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri yang diukur dengan metode radikal DPPH b. Manfaat Praktis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada masyarakat akan manfaat daun benalu kemiri yang memiliki aktivitas antioksidan. 4.

Keaslian Penelitian Penelitian tentang Penetapan kadar fenolik total fraksi etil asetat dan uji antioksidan menggunakan metode DPPH (1,1-difenil - 2- pikrilhidrazil) terhadap daun benalu dari tanaman Aleurites molucana (L.) Willd belum


4

pernah dilakukan sebelumnya. Penelitian yang berkaitan terhadap benalu (Scurrula atropurpurea (B1.) Dans) adalah sebagai berikut: 1. Pada penelitian yang dilakukan oleh Devi (2011) mengenai korelasi kadar fenolat daun dendrophthoe petandra, dendrophthoe falcata dan scurrula philippensis terhadap aktivitas antioksidan dengan metode DPPH. Hasil penelitian menunjukkan aktivitas antioksidan pada ekstrak etanol daun Dendrophthoe falcata, Dendrophthoe petandra, dan Scurrula philippensis dengan dengan nilai IC50 berturut-turut 8,212; 8,833; dan 15,357 µg/mL dibandingkan vitamin E dengan nilai IC50 8,661 µg/mL Kandungan fenolat ekstrak ekivalen dengan asam galat berturut-turut sebesar 1549,13; 878,93; dan 454,40 mg ekivalen asam galat per g ekstrak. 2. Pada penelitian Chairul (1998) bahwa hasil skrining fitokimia menunjukkan ekstrak batang Scurrula atropurpurea (B1.) Dans dalam metanol-kloroform (1 :1) mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, glikosida dan triterpena. 3. penelitian yang dilakukan oleh Fitria (2011) terhadap benalu teh (Scurulla atropurpurea (B1.) Dans) didapatkan sebanyak 16 mg serbuk kuning dengan titik leleh 177-179˚C

yang telah berhasil

diisolasi dari 20 g ekstrak kental metanol dari benalu tersebut, kemudian dilakukan analisis spektrokopi dan uji fitokimia, berdasarkan hasil analisis serbuk kuning tersebut adalah 3,3',4',5,7-pentahidroksi flavon (kuersetin).


5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Benalu 1. Klasifikasi benalu Klasifikasi benalu dalam sistematika tumbuhan adalah sebagai berikut. Divisi

: Magnoliophyta (tumbuhan berbunga)

Super divisi

: Spermatophyta (menghasilkan biji)

Kelas

: Magnoliopsida (berkeping dua/dikotil)

Ordo

: Santalales

Famili

: Loranthaceae

Genus

: Scurrula

Spesies

: Scurrula atropurpurea (Bl.) Dans. (Plantamor, 2012)

2. Deskripsi benalu Batang muda dengan indumentum rambut-rambut krem atau abu-abu padat dan menjadi jarang setelah dewasa. Daun berhadapan , lonjong bundar telur sungsang, panjang 5 – 10 cm dan lebar 2,5 – 5 cm, pangkal daun runcing dan ujung tumpul, panjang tangkai daun 6 – 12 mm, perbungaan pada ruas – ruas, tandan dengan 2 – 8 bunga. Mahkota bunga ramping, ujung mengganda dan runcing , panjang tabung 7 -15 mm. Kepala sari panjang 1 mm.


6

(Samiran, 2005). 4.

Penyebaran benalu Penyebarannya dari Thailand5 sampai Vietnam, Jawa, Nusa tenggara, Maluku dan Filipina. Habitat benalu ini tumbuh pada ketinggian 0 – 600 m dpl dan kadang – kadang sampai 2300 m dpl (Samiran, 2005).

5.

Morfologi benalu Benalu merupakan tanaman setengah parasit karena sifatnya yang dapat berfotosintesis. Pada benalu terdapat alat hisap yang disebut haustorium, yang sifatnya dapat mengambil nutrisi dari tanaman inangnya. Mekanisme tumbuhnya benalu diperantarai oleh burung. Burung akan memakan biji benalu, namun karena biji tersebut juga menghasilkan lendir yang lekat maka biji tersebut melekat pada paruh burung tersebut. Kemudian burung akan mengoleskan biji tersebut pada dahan pohon lain yang kemudian akan menjadi bibit tanaman benalu yang tumbuh pada pohon yang menjadi inangnya (Pracaya, 2007).

6.

Kandungan kimia benalu S.atropurpurea Pada penelitian Chairul (1998) bahwa hasil skrining fitokimia menunjukkan ekstrak batang Scurrula atropurpurea (B1.) Dans dalam metanol-kloroform (1 :1) mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, glikosida dan triterpena. Dan juga didalam penelitian yang dilakukan oleh Fitria (2011) terhadap benalu teh (Scurulla atropurpurea (B1.) Dans) didapatkan sebanyak 16 mg serbuk kuning dengan titik leleh 177-179˚C

yang telah berhasil

diisolasi dari 20 g ekstrak kental metanol dari benalu tersebut, kemudian


7

dilakukan analisis spektrokopi dan uji fitokimia, berdasarkan hasil analisis serbuk kuning tersebut adalah 3,3',4',5,7-pentahidroksi flavon (Kuersetin).

Gambar 1. 3,3',4',5,7-pentahidroksi flavon (Kuersetin) (Fitria, 2011)

B. Senyawa Fenolik Secara umum senyawa fenolik merupakan zat atau senyawa yang mengandung satu atau lebih cincin aromatik dengan satu atau lebih gugus hidroksil yang menempel. Senyawa fenolik dapat diklasifikasikan menjadi tiga kategori utama, yaitu (1) fenol sederhana yang meliputi asam fenolik, (2) polifenol yang dibentuk oleh flavonoid dan tanin, (3) macam-macam kelompok lainnya yang terdiri dari senyawa seperti kumarin, stilben dan lignan (Vermerris dan Nicholson, 2006). Senyawa fenolik dapat memberikan perlindungan sebagai antioksidan dikarenakan senyawa fenolik dapat bereaksi dengan reactive oxygen species (ROS) dan menghilangkan aktivitas radikalnya sehingga tidak berbahaya lagi terhadap sel tubuh manusia (Sochor et al., 2010). Salah satu antioksidan alami yaitu asam galat. Asam galat termasuk dalam senyawa fenolat dan memiliki aktivitas antioksidan yang kuat (Lee et al., 2003). Flavonoid berbeda dalam penyusunan gugus hidroksil, metoksi dan bagian gugus glikosida dan dalam konjugasi antara cincin A dan B. Variasi dalam cincin C


8

merupakan pembagian dalam subkelas. Dilihat dari struktur molekular mereka, maka dapat dibagi sebagai berikut (Kumar et al., 2011).

Gambar 2. Struktur kimia dari beberapa tipe flavonoid (Kumar et al., 2011).

Flavonoid (bagian glikosida) dapat terdegradasi oleh aksi enzim ketika diambil dari material tanaman yang masih segar atau tidak dikeringkan. Maka disarankan untuk dilakukan pengeringan ketika material akan digunakan, dan dibuat menjadi serbuk. Untuk ekstraksi, pelarut yang digunakan sesuai dengan tipe flavonoid yang terkandung. Polaritas sangat penting dibutuhkan disini. Flavanoid yang kurang polar (contoh: isoflavon, flavanon, metilasi flavon, dan flavonol) diekstraksi dengan kloroform, diklorometan, dietil eter, atau etil asetat, sedangkan flavonoids glikosida dan aglikon yang lebih polar diekstraksi dengan alkohol atau alkohol dengan campuran air. Glikosida yang mempunyai kelarutan yang tinggi di dalam air dan larutan alkohol-air yang sesuai (Andersen dan Markham, 2006).


9

C. Antioksidan Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (elektron donor) atau reduktan. Senyawa ini memiliki berat molekul kecil, tetapi mampu menginaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi, dengan cara mencegah terbentuknya radikal. Antioksidan juga merupakan senyawa yang dapat menghambat reaksi oksidasi, dengan mengikat radikal bebas dan molekul yang sangat reaktif. Akibatnya, kerusakan sel akan dihambat (Winarsi, 2007). Secara umum, antioksidan dikelompokkan menjadi 2, yaitu antioksidan enzimatis dan non-enzimatis. Antioksidan enzimatis misalnya enzim superoksida dismutase (SOD), katalase dan glutation peroksidase. Antioksidan non-enzimatis dibagi dalam dua kelompok yaitu antioksidan larut lemak, seperti tokoferol, karotenoid, flavonoid, quinon, dan bilirubin. Antioksidan non enzimatis yang kedua adalah antioksidan larut air, seperti asam askorbat, asam urat, protein pengikat logam, dan protein pengikat heme. Antioksidan enzimatis dan nonenzimatis tersebut bekerja sama memerangi aktivitas senyawa oksidan dalam tubuh. Terjadinya stres oksidatif dapat dihambat oleh kerja enzim-enzim antioksidan dalam tubuh dan antioksidan non-enzimatik (Winarsi, 2007). Antioksidan memiliki fungsi untuk menghentikan atau memutuskan reaksi berantai dari radikal bebas yang terdapat di dalam tubuh, sehingga dapat menyelamatkan sel-sel tubuh dari kerusakan akibat radikal bebas, antioksidan berperan dalam menetralkan radikal bebas dengan cara memberikan satu elektronnya

kepada

radikal

bebas,

sehingga

menjadi

non

radikal

(Rohmatussolihat, 2009). Mekanisme pemberian satu elektron oleh antioksidan ini


10

dapat berlangsung sebagai berikut:

Gambar 3. Mekanisme pemberian satu elektron oleh antioksidan (Rohmatussolihat, 2009) Salah satu contoh reaksi penetralan radikal bebas dengan antioksidan yaitu senyawa Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) (bersifat radikal bebas) beraksi dengan antioksidan yang menyumbangkan satu elektronnya sehingga membentuk senyawa

Diphenylpicrylhydrazine

(non

radical)

yang

lebih

stabil

(Rohmatussolihat, 2009). Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan nilai IC50 yang berarti konsentrasi antioksidan yang mampu menghambat radikal bebas sekitar 50% dapat digolongkan sesuai dengan tabel dibawah ini. Tabel I. Tingkatan Aktivitas Antioksidan (Blois, 1958) Nilai IC50 < 50 µg/mL IC50 < 50 - 100 µg/mL IC50 < 101 - 150 µg/mL IC50 > 150 µg/mL

Tingkatan Sangat kuat Kuat Sedang Lemah


11

D. Radikal bebas Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat tidak stabil (mempunyai satu elektron atau lebih yang tanpa pasangan), untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini sangat reaktif dan merusak jaringan. Senyawa radikal bebas timbul akibat berbagai proses kimia kompleks dalam tubuh, berupa hasil sampingan dari proses oksidasi atau pembakaran sel yang berlangsung pada waktu bernafas, metabolisme sel, olahraga yang berlebihan, peradangan atau ketika tubuh terpapar polusi lingkungan seperti asap kendaraan bermotor, asap rokok, bahan pencemar, dan radiasi matahari atau radiasi kosmis. Oleh karena itu, tubuh memerlukan suatu substansi penting yaitu antioksidan yang mampu menangkap radikal bebas tersebut sehingga tidak dapat menginduksi suatu penyakit (Kikuzaki, 2002 cit. Maulida dan Zulkarnaen, 2010). Oxigen free radicals atau lebih umum dikenal sebagai Reactive Oxigen Species (ROS), serta Reactive Nitrogen Species (RNS), adalah produk dari metabolisme sel normal. ROS dan RNS juga diakui memainkan peran ganda baik yang memberikan manfaat dan juga bisa merusak bagi sistem kehidupan. Efek menguntungkan dari ROS terjadi pada konsentrasi rendah/ sedang, misalnya dalam pertahanan terhadap agen infeksi dan fungsi dari sejumlah sistem sinyal seluler. Efek berbahaya dari radikal bebas menyebabkan potensi kerusakan biologis yang disebut oxidative stress dan nitrosative stress. Hal ini terjadi dalam sistem biologi bila produksi yang berlebihan dari ROS / RNS. Kelebihan ROS dapat merusak jaringan lipid, protein, atau DNA seluler sehingga menghambat fungsi normal mereka (Valko et al., 2006).


12

Adanya elektron yang tidak berpasangan menyebabkan senyawa tersebut sangat reaktif mencari pasangan, dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di sekitarnya. Radikal bebas tersebut dapat mengoksidasi asam nukleat, protein, lemak, bahkan DNA sel dan menginisiasi timbulnya penyakit degeneratif (Leong dan Shui, 2002).

E. Metode DPPH Prinsip metode uji antioksidan DPPH didasarkan pada reaksi penangkapan atom hidrogen oleh DPPH (reduksi DPPH) dari senyawa antioksidan. Reagen DPPH berperan sebagai radikal bebas yang diredam oleh senyawa antioksidan yang terkandung dalam sampel. Selanjutnya DPPH akan tereduksi menjadi senyawa diphenylpicrylhidrazine (DPPH-H) (Triana, 2013). Setelah bereaksi dengan senyawa peredam antioksidan, DPPH akan tereduksi dan warnanya akan berubah menjadi kuning (molyneux, 2004). Metode DPPH memberikan informasi reaktivitas senyawa yang diuji dengan suatu radikal stabil. DPPH memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 517 nm dengan warna violet gelap (Sunarni, 2005). Metode DPPH dipilih dengan pertimbangan bahwa metode ini lebih sederhana untuk menetapkan besarnya daya radikal bebas, tidak memerlukan instrumen yang rumit dan bahan yang terlalu banyak. DPPH akan berwarna ungu apabila dilarutkan dalam pelarut yang dapat melarutkannya (etanol, metanol, campuran etanol/metanol dengan air), apabila bereaksi dengan peredam radikal bebas maka akan terjadi pemudaran warna ungu.


13

Perubahan warna ini diukur menggunakan spektrofotometer yang ditunjukknan dengan pembacaan nilai absorbansi (Joyeux, 1995 cit. Valentina, 2013).

F. Penetapan Fenolik Total Prinsip dari metode Folin Ciocalteu adalah menggunakan kemampuan gugus fenol mereduksi. Reaksi terhadap redoks tersebut akan terjadi pada suasana basa. Reduksi fosfotungstanat fosfomolibdenum (reagen Folin Ciocalteu) oleh ion fenol merubah warna larutan yang diuji berwarna biru tua. Semakin tua warna yang diperoleh semakin besar absorbansinya menunjukkan semakin besar jumlah kandungan fenol (Yusoff dan Ade, 2011). Penetapan kandungan fenolik total dilakukan dengan cara memberikan reagen Folin Ciocalteu dan reaksi yang terjadi adalah oksidasi dari ion fenolat senyawa uji oleh pereaksi fenol Folin-Ciocalteu, dimana oksidasi dari senyawa fenol oleh reagen molibdotungstat menghasilkan produk dengan warna biru sekitar panjang gelombang 745-750 nm (Prior, 2005). Asam galat adalah sebuah asam organik yang dikenal sebagai 3,4,5trihydroxybenzoicacid (C6H2(OH)3COOH), asam galat ditemukan secara luas pada kerajaan tanaman. Asam galat dengan kadar yang tinggi ditemukan pada gallnuts, anggur, sumac, daun teh, hops, dan kulit kayu oak (Masoud et al., 2012).

Gambar 4. Asam Galat (Masoud et al., 2012)


14

G. Ekstraksi Ekstraksi adalah proses penarikan kandungan senyawa kimia dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai (Farmakope Indonesia ed.IV, 1995). Menurut DepKes RI (2000) ada beberapa cara ekstraksi dengan menggunakan pelarut : A.

Cara dingin 1.

Maserasi Maserasi merupakan cara penyarian sederhana. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisisa dalam cairan penyari dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruang (kamar). Cairan penyari akan menembus dinding sel atau masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif tersebut akan larut karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel. Larutan yang lebih pekat (di dalam sel) didesak keluar sel, masuk ke dalam larutan di luar sel. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Keuntungan cara penyarian dengan maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan.

2.

Perkolasi Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai sempurna (exhaustive extraction) yang umumnya dilakukan pada temperatur ruangan. Prinsip perkolasi adalah serbuk simplisisa


15

ditempatkan dalam suatu bejana silinder yang bagian bawahnya diberi sekat berpori. Cairan penyari dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk tersebut, kemudian melarutkan zat aktif dari sel-sel yang dilalui sampai mencapai keadaan jenuh. B.

Cara panas 1.

Refluks Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya, selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Umumnya dilakukan pengulangan proses pada residu pertama sampai 3-5 kali sehingga dapat termasuk proses ekstraksi sempurna.

2.

Soklet Sokletasi merupakan ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru umumnya dilakukan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik.

3.

Digesti adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu) pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan, yaitu secara umum dilakukan pada temperatur 40-50ᵒC.

4.

Infus Infus adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas air (bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih,


16

temperatur terukur 96-98ᵒC) selama waktu tertentu (15-20 menit). Infus pada umumnya digunakan untuk menarik atau mengekstraksi zat aktif yang larut dalam air dan bahan-bahan nabati. Hasil dari ekstrak ini menghasilkan zat aktif yang tidak stabil dan mudah tercemar oleh kuman dan kapang, sehingga ekstrak yang diperoleh dengan infus tidak boleh disimpan lebih dari 4 jam. 5.

Dekok Dekok adalah infus pada waktu yang lebih lama (> 30 menit) dan temperatur sampai titik didih air.

H. Spekrofotometri Visibel Spektrofotometri visibel adalah salah satu teknik analisis fisika-kimia yang mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik pada panjang gelombang 380-780 nm (Mulja dan Suharman, 1995). Menurut Molyneux (2004), absorbansi DPPH terjadi dengan baik pada daerah cahaya tampak (visible), oleh sebab itu digunakan spektrofotometri visibel untuk pengukuran absorbansinya. Interaksi antara senyawa yang mempunyai gugus kromofor dengan radiasi elektromagnetik pada daerah visible (200-800 nm) akan menghasilkan transisi elektromagnetik dan spektra absorbansi elektromagnetik. Jumlah radiasi elektromagnetik yang diserap akan sebanding dengan jumlah molekul penyerapnya, sehingga spektra absorbansi dapat digunakan untuk analisis kuantitatif (Fessenden dan Fessenden, 1995). Menurut Sastrohamidjojo, 2001 cit. Surya, 2013 bila suatu molekul senyawa organik menyerap sinar UV atau tampak


17

maka di dalam molekul tersebut terjadi perpindahan (transisi elektron) dari berbagai jenis tingkat energi orbital dari molekul tersebut. Absorbsi cahaya oleh suatu molekul merupakan suatu bentuk interaksi antara gelombang cahaya (foton) dan atom atau molekul. Proses absorbsi cahaya UV-Vis berkaitan dengan promosi elektron dari satu orbital molekul dengan tingkat energi elektronik tertentu ke orbital lain dengan tingkat energi elektronik yang lebih tinggi. Prinsip Dasar Hukum yang mendasari spektrofotometri adalah hukum “Lambert-Beer‟. Bila sebagian cahaya monokromatis melalui suatu media yang transparan maka akan bertambah turunnya intensitas cahaya yang dipancarkan sebanding dengan bertambahnya tebal dan kepekatan media (Day dan Underwood, 2002). Rumus Lambert-Beer

A = a . b . c (Keterangan: A =

Absorbansi sampel, a = Absorbtivitas molar, b = Tebal kuvet c = Konsentrasi sampel). Spektrofotometer UV-Vis pada umumnya tersusun dari dua komponen, yaitu spektrometer (mengukur dan menghasilkan spektra dengan panjang gelombang tertentu atau sinar monokromatis) dan fotometer (pengukur daya kuat sinar monokromatis yang ditransmisikan atau diabsorpsi) (Day dan Underwood, 2002). Berikut ini skema instrumentasi Spektrofotometer UV-Vis :

Gambar 5. Skema Instrumentasi Spektrofotometer UV-Vis (Day dan Underwood, 2002 cit. Wachidah, 2013)


18

a.

Sumber cahaya Sumber cahaya mempunyai fungsi untuk memberikan energi pada daerah

panjang

gelombang

yang

tepat

untuk

pengukuran

dan

mempertahankan intensitas cahaya yang tetap selama pengukuran. Spektrofotometer sinar tampak menggunakan lampu wolfarm dengan  diatas 375 nm, sedangkan spektrofotometer UV menggunakan lampu deuterium (D2) memiliki  dibawah 375 nm. Sumber cahaya pada spektrofotometer dibagi menjadi tiga bagian : 1. Sumber cahaya visibel dengan lampu Wolfram atau lampu Tungsten 2. Sumber cahaya UV dengan lampu deuterium (D2) atau lampu hidrogen 3. Sumber cahaya inframerah dengan lampu Nernst atau lampu Glowen (Day dan Underwood, 2002). b.

Monokromator Monokromator adalah suatu alat yang berfungsi untuk mengubah cahaya polikromatik menjadi cahaya monokromatik yang kemudian dilewatkan pada celah sempit atau slit agar memungkinkan pemisahan panjang gelombang yang diukur. Beberapa monokromator yang biasa digunakan adalah prisma dan grating (Willard, 1988 cit. Wachidah,2013).

c.

Kuvet Kuvet adalah tempat disimpannya larutan contoh yang akan diukur serapannya yang diletakkan pada jalan cahaya dari minokromator. Pada saat cahaya monokromatis melalui kuvet, terjadi penyerapan sejumlah tertentu cahaya, sedangkan sebagian lainnya diteruskan ke detektor (Day dan


19

Underwood, 2002). Kuvet visibel dan UV yang khas mempunyai panjang lintasan 1 cm, ada juga yang mempunyai ketebalan 0,1 cm sampai 10 cm atau bahkan lebih (Willard, 1988). d.

Detektor Detektor

berfungsi

untuk

mengubah

energi

cahaya

yang

ditransmisikan atau diteruskan oleh kuvet, yang jatuh mengenainya menjadi suatu besaran yang terukur. Detektor yang ideal harus mempunyai kepekaan tinggi, dan responnya stabil pada daerah panjang gelombang pengamatan (Day dan Underwood, 2002). e.

Rekorder Rekorder merupakan bagian akhir dalam alat ini. Sinyal listrik yang dihasilkan

pada

detektor

dapat

dibaca

pada

rekorder

dengan

mengkonversikannya ke dalam besaran absorban atau % T (Day dan Underwood, 2002).

I. Validasi Metode Analisis Validasi metode analisis merupakan penilaian terhadap parameter yang ada dalam percobaan laboratorium, yang digunakan untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan sebagai metode yang layak digunakan atau valid, parameter yang diuji dalam suatu analisis antara lain: kecermatan, keseksamaan, selektifitas, linearitas, batas deteksi dan kuantitasi, ketangguhan metode, dan ketahanan metode. Parameter yang diperlukan untuk divalidasi dapat diseleksi tergantung metode yang digunakan (Harmita, 2004)


20

Parameter validasi yang akan digunakan didalam metode penetapan fenolik total adalah: 1.

Linearitas Linearitas menunjukan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi dalam garis lurus, terlihat dari respon yang sebanding dengan jumlah analit. Target konsentrasi dari analit dalam preparasi obat dengan lima larutan standar dalam kurva linearitas dengan jarak 0,5-1,5 kali konsentrasi analit. Setiap standar harus dipreparasi dan dianalisis sebanyak tiga kali (Harris, 2010). Laporan yang dihasilkan harus termasuk kemiringan dari garis, intercept, dan koefisien korelasi data yang menunjukkan korelasi yang jelas antara respon dan analit. Hasil tidak boleh menunjukkan deviasi yang signifikan dari linearitas, yang berarti koefisien korelasi (r) > 0,99 (Kingston, 2004).

2.

Presisi Presisi dari metode analisis menunjukkan kedekatan dari suatu data (derajat persebaran) antara suatu seri pengukuran yang diperoleh dari sampling yang dilakukan berkali-kali dari sampel homogen yang sama dalam kondisi yang telah ditetapkan (Ermer, Joachim dan Miller, 2005). Presisi dapat dibagi tiga tingkatan yaitu keterulangan (repeatability), intermediate precision, dan reproducibility (Ermer, Joachim dan Miller, 2005). Sebagai parameter presisi, standar deviasi, standar deviasi relatif (coefficient of variation), dan confidence interval harus dihitung untuk tiap tingkatan presisi (Ermer, Joacim dan Miller, 2005). Dilakukan dengan cara


21

multiple preparasi sampel pada eksperimen yang sama atau menyiapkan tiga kali optimasi dengan tiga konsentrasi berbeda (Chan et al., 2004). Standar deviasi adalah parameter yang penting dalam mendeskripsikan jarak dari distribusi normal sebagai contoh derajat persebaran data (Ermer, Joacim dan Miller, 2005). Rumus mencari % CV :

% 𝐶𝑉 =

𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑑𝑒𝑣𝑖𝑎𝑠𝑖 (𝑆𝐷)𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟 𝑥 100 % 𝑟𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟 (Gandjar dan Rohman, 2012)

∑(𝑋 − 𝑋̅)2 S = (n − 1) 2

s = √s 2 Variansi (S2) dan standar deviasi (s) (Ermer, Joacim dan Miller, 2005)

Tabel II. Nilai CV yang dapat diterima menurut Kingston (2004) Kadar zat aktif (%) > 10 1-10 0,1-1 < 0,1

Nilai CV yang masih dapat diterima (%) <2 <5 < 10 < 20

J. Landasan Teori Karakteristik utama antioksidan adalah kemampuan untuk menangkap radikal bebas. Radikal yang terkandung dalam sistem biologis dapat mengoksidasi asam nukleat, protein, lipid atau DNA dan menimbulkan penyakit degeneratif. Komponen antioksidan yang terdapat pada tanaman seperti asam fenolat,


22

polifenol dan flavanoid akan menangkap radikal bebas seperti peroksida, hidroperoksida atau lipid peroksil, dan juga menghambat mekanisme oksidatif yang menimbulkan penyakit degeneratif (Miyerbamate, 2003). Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Devi (2011) telah diketahui adanya antivitas antioksidan pada ekstrak etanol daun Scurrula philippensis dengan hasil IC50 15,357 µg/mL yang termasuk kuat daya antioksidannya serta dengan nilai kandungan fenolik sebesar 454,40 mg ekivalen asam galat per g ekstrak dan juga didalam penelitian yang dilakukan oleh Fitria (2011) terhadap benalu teh (Scurulla atropurpurea (B1.) Dans) didapatkan kuersetin yang merupakan komponen antioksidan. Penetapan kandungan fenolik total dilakukan dengan cara memberikan reagen Folin Ciocalteu dan reaksi yang terjadi adalah oksidasi dari ion fenolat senyawa uji oleh pereaksi fenol Folin-Ciocalteu, dimana oksidasi dari senyawa fenol oleh reagen molibdotungstat menghasilkan produk dengan warna biru sekitar panjang gelombang 745-750 nm (Prior, 2005). Prinsip metode uji antioksidan DPPH didasarkan pada reaksi penangkapan atom hidrogen oleh DPPH (reduksi DPPH) dari senyawa antioksidan. Reagen DPPH berperan sebagai radikal bebas yang diredam oleh senyawa antioksidan yang terkandung dalam sampel. Selanjutnya DPPH akan tereduksi menjadi senyawa diphenylpicrylhidrazine (DPPH-H) (Triana, 2013). Setelah bereaksi dengan senyawa peredam antioksidan, DPPH akan tereduksi dan warnanya akan berubah menjadi kuning (molyneux, 2004). Metode DPPH memberikan informasi reaktivitas senyawa yang diuji dengan suatu radikal stabil. DPPH memberikan


23

serapan kuat pada panjang gelombang 517 nm dengan warna violet gelap (Sunarni, 2005).

K. Hipotesis Fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri memiliki kandungan fenolik yang dinyatakan dengan miligram ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat ekstrak etanol dan aktivitas antioksidan dinyatakan sebagai nilai IC50.


24

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan rancangan penelitian Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak sederhana

B. Variabel 1.

Variabel bebas berupa konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri.

2.

Variabel tergantung berupa kemampuan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri untuk menangkap radikal DPPH (% IC).

3.

Variabel pengacau terkendali berupa tempat tumbuh tanaman, waktu pemanenan, umur benalu yang dipanen, cara panen, dan jumlah (g) serbuk daun benalu yang digunakan.

4.

Variabel pengacau tak terkendali berupa cuaca atau musim.

C. Definisi 1.

Daun benalu kemiri adalah daun benalu dari pohon kemiri disekitar halaman kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta.

2.

Ekstrak etanol daun benalu kemiri adalah sari hasil proses maserasi simplisia kering daun benalu kemiri dengan menggunakan pelarut etanol 70%.

24


25

3.

Fraksi etil asetat adalah hasil fraksinasi ekstrak etanol daun benalu kemiri yang telah diekstraksi cair-cair dengan air : washbensin kemudian fase air diekstraksi cair-cair dengan etil asetat p.a.

4.

Persen inhibition concentration (% IC) adalah persen kemampuan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri untuk menangkap radikal DPPH.

5.

Inhibition concentration 50 (IC50) adalah nilai konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri yang menghasilkan penangkapan 50% radikal DPPH dilihat dengan pengurangan absorbansinya menggunakan spektofotometri visible.

D. Bahan dan alat 1.

Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah:

daun benalu

S.atropurpurea (B1.) Dans yang diambil dari pohon kemiri yang terdapat di sekitar halaman kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan ,Yogyakarta pada bulan juli 2014 ; akuades (CV. General Laboratorium); bahan kualitas p.a. E. Merck, yaitu: metanol, bahan kualitas p.a. SigmaChem. Co., USA, yaitu: DPPH, reagen Folin-Ciocalteu, asam galat, dan kuersetin; bahan kualitas teknis Brataco Chemica, yaitu: wasbensin dan etil asetat kualitas p.a ; bahan kualitas teknis CV. General Laboratorium, yaitu: etanol 70 %. 2.

Alat Penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu, Uvmini-1240), vortex (junke & kunkel), corong Buchner,


26

blender, mikropipet 10-1000 µL; 1-10 mL (Acura 825, Socorex), neraca analitik (Scaltec SBC 22, BP 160P), vacuum rotary evaporator R-3 (Butci), waterbath, tabung reaksi bertutup dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis (Pyrex-Germany dan Iwaki), aluminium foil, desikator cawan petri dan kertas timbang.

E. Metode Penelitian 1.

Determinasi tanaman dengan cara membandingkan ciri dan sifat Determinasi daun benalu dilakukan di Bagian Biologi Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta dengan cara membandingkan ciri dan sifat sampel dengan buku Flora of Java. Determinasi dilakukan oleh determinator Bapak Djoko Santosa, M.si. Determinasi tanaman ini untuk memastikan bahwa yang digunakan untuk penelitian benar-benar daun benalu S.atropurpurea (B1.) Dans.

2.

Pembuatan dan penyiapan bahan a.

Pengumpulan bahan Daun benalu kemiri diambil dari pohon kemiri yang terdapat di sekitar halaman kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan (Yogyakarta). Pengumpulan pada bulan Juli tahun 2014. Pemanenan dilakukan pagi hari pukul 09.00 WIB.


27

b.

Sortasi basah Daun benalu dipisahkan dari bahan-bahan pengganggu seperti bagian tanaman yang tidak dibutuhkan (ranting, bunga dan akar) dan bahan-bahan rusak lainnya.

c.

Pencucian Daun benalu dicuci dengan cara dialiri air mengalir sambil dibersihkan dari kotoran yang melekat.

d.

Pengeringan Daun benalu yang masih basah dikeringan dengan cara dijemur dibawah sinar matahari dan ditutupi dengan kain hitam. Akhir pengeringan ditandai dengan mudah dipatahkannya bagian per bagian daun benalu tersebut.

e.

Sortasi kering Daun benalu yang sudah kering ditandai dengan mudah hancur ketika diremas kemudian dipisahkan dari bahan-bahan penggangggu seperti bagian batang dan bahan-bahan yang rusak (tanpa pencucian).

f.

Perajangan atau pembuatan serbuk simplisia Daun benalu yang sudah kering dibuat menjadi serbuk dengan blender lalu dilakukan pengayakan dengan ayakan nomor mesh 40.

g.

Pengepakan dan penyimpanan Serbuk daun benalu kemiri kemudian disimpan diwadah yang kedap udara dan disimpan ditempat kering dan sejuk.


28

3.

Preparasi Sampel a.

Ekstraksi sampel Daun benalu kemiri yang telah menjadi serbuk ditimbang sebanyak 30,0 g dan dimasukkan ke dalam bejana maserasi ukuran 300 ml, ditambah dengan 100 ml etanol 70 % sampai terendam sempurna dan dicampur homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama tiga hari dengan alat shaker. Filtrat diperoleh melalui penyaringan menggunakan kertas saring kasar dengan bantuan corong Buchner dan pompa vakum. Ampas penyaringan diremaserasi dengan 100 ml etanol 70 % kembali selama dua hari. Kemudian filtrat yang didapat dicampur dengan filtrat terdahulu. Keseluruhan filtrat diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental etanol daun benalu kemiri. Selanjutnya ekstrak kental di letakkan di atas waterbath hingga bobot tetap.

4.

Pembuatan fraksi etil asetat Ekstrak etanol daun benalu kemiri dilarutkan dalam 300 ml air hangat dan dilakukan ekstraksi cair-cair menggunakan washbensin dengan perbandingan larutan ekstrak : wash bensin (1:1 v/v), diamkan hingga terpisah sempurna. Fase air akan berada dibawah sedangkan fase wash bensin akan berada diatas. Dari hasil ekstrasi tadi diperoleh dua fraksi yaitu air dan wash bensin. Fraksi yang diambil yaitu fraksi air untuk kemudian diekstraksi dengan menggunakan etil asetat p.a (1:1 v/v), sehingga didapatkan fraksi air dan


29

fraksi etil asetat. Ambil fraksi etil asetat. Kemudian fraksi etil asetat diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator dan selanjutnya diletakkan diatas waterbath hingga bobot tetap. Fraksi yang didapat disimpan didalam desikator hingga digunakan untuk analisis lebih lanjut.

5.

Pembuatan larutan pembanding, DPPH dan uji a.

Pembuatan larutan uji 1.

Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total Sebanyak 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang, lalu dilarutkan dengan 10,0 mL metanol p.a sehingga diperoleh konsentrasi sebesar 1000,0 µg/mL. Kemudian sebanyak 1,0 mL larutan tersebut dilarutkan dengan 10,0 mL metanol p.a sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 100,0 µg/mL.

2.

Larutan uji untuk aktivitas antioksidan Sebanyak 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang dan dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL sebagai larutan stok. Kemudian dibuat larutan intermediet, sebanyak 1,0 mL stok larutan uji dan dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi sebesar 100,0 μg/mL. Sebanyak 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75 mL larutan tersebut, kemudian dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 7,5; 10,0; 12,5; 15,0; 17,5 μg /mL.


30

3.

Pembuatan larutan baku asam galat Sebanyak 10,0 mg asam galat ditimbang, lalu dilarutkan dengan 10,0 mL akuades : metanol p.a (1:1) sehingga diperoleh konsentrasi larutan asam galat sebesar 1000,0 µg/mL. Sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 dan 1,5 mL larutan tersebut, kemudian dilarutkan dengan akuades : metanol p.a (1:1) sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat 50; 75; 100; 125; dan 150 µg/mL.

b.

Pembuatan larutan DPPH Sebanyak 0,0158 g DPPH dilarutkan dengan metanol p.a sampai 100 mL sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.

c.

Pembuatan larutan stok dan intermediet kuersetin Sebanyak 10,0 mg kuersetin dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL sebagai larutan stok. Kemudian dibuat larutan intermediet, sebanyak 1,0 mL larutan stok kuersetin dan dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi sebesar 100,0 μg/mL. Sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5 mL larutan kuersetin konsentrasi 100,0 μg/mL, kemudian dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL sehingga diperoleh konsentrasi larutan pembanding kuersetin sebesar 5,0; 7,5; 10,0 12,5; dan 15,0 μg/mL.


31

6.

Uji Pendahuluan A. Uji pendahuluan kandungan fenolik total a.

Larutan Blanko Sebanyak 10,0 mL akuades : metanol p.a (1:1) dimasukkan kedalam tabung reaksi lalu ditambahkan dengan 5 mL reagen FolinCiocalteu yang telah diencerkan dengan air (1 :10 v/v). Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan 4 mL natrium karbonat 1 M.

b.

Kontrol Positif Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian dilarutkan dengan 5 mL reagen FolinCiocalteu yang telah diencerkan dengan air (1 :10 v/v). Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan 4 mL natrium karbonat 1 M. Vortex selama 15 detik. Amati perubahan warna yang terjadi.

c.

Larutan uji Sebanyak 0,5 mL larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian dilarutkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1 :10 v/v). Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan 4 mL natrium karbonat 1 M. Vortex selama 15 detik. Amati perubahan warna yang terjadi.

d.

Larutan Asam galat Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 10,0 mL akuades : metanol p.a (1:1)


32

e.

Larutan uji Sebanyak 0,5 mL larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 10,0 mL akuades : metanol p.a (1:1)

B. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan a.

Larutan kuersetin Sebanyak 10,0 mg kuersetin dimasukkan kedalam tabung reaksi lalu dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL

b.

Larutan Uji Sebanyak 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang dan dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL di dalam tabung reaksi.

c.

Larutan DPPH Sebanyak 1 mL larutan DPPH dilarutkan dengan 3 mL metanol p.a dimasukkan kedalam tabung reaksi dan divortex selama 30 detik

d.

Larutan uji + DPPH Sebanyak 1 mL larutan uji ditambahkan 1 mL larutan DPPH dimasukkan kedalam tabung reaksi kemudian dilarutkan dengan 3 mL metanol p.a dan vortex selama 30 detik. Selama 30 menit diamati perubahan warna yang terjadi.

e.

Larutan kuersetin + DPPH Sebanyak 1 mL larutan pembanding kuersetin ditambahkan 1 mL larutan DPPH, dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian dilarutkan dengan 3 mL metanol p.a dan vortex selama 30 detik. Selama 30 menit


33

diamati perubahan warna yang terjadi. 7.

Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total a.

Penentuan operating time (OT) asam galat Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 µg/mL dilarutkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang teoritis 750 nm selama 30 menit dengan waktu pengamatan setiap 5 menit. Hasil percobaan dapat dilihat di Lampiran 6.

b.

Penentuan panjang gelombang maksimum asam galat Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 µg/mL ditambahkan dengan 5,0 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M dan diamkan selama operating time, kemudian di scanning dengan spektrofotometer visibel pada rentang panjang gelombang antara 600-800 nm. Hasilnya dapat dilihat pada lampiran 6.

8.

Penetapan kandungan fenolik total a.

Pembuatan seri baku asam galat Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 75; 100; 125; dan 150 μg/mL ditambah dengan 5,0 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v). Larutan selanjutnya


34

ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M lalu diamkan selama operating time setelah itu dibaca

pada

panjang gelombang

maksimum yang didapat 739 nm. Pengerjaan dilakukan tiga kali. b.

Pembuatan kurva baku asam galat 1. Membuat seri larutan baku asam galat dengan konsentrasi 50, 75, 100. 125 dan 150 μg/mL 2. Masing-masing seri larutan baku asam galat dengan konsentrasi diatas diukur nilai absorbansinya pada λ = 739 nm 3. Mencatat nilai absorbansi masing-masing seri larutan baku asam galat 4. Membuat kurva standar hubungan konsentrasi vs absorbansi 5. Selanjutnya masukkan ke persamaan regresi linier kurva baku Y=bx+a hasilnya dapat dilihat pada lampiran 7.

c.

Validasi metode penetapan fenolik total asam galat. Hasil dari prosedur 8a divalidasi berdasarkan presisi (%CV) dan linearitas (nilai r). % 𝐶𝑉 =

𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑑𝑒𝑣𝑖𝑎𝑠𝑖 (𝑆𝐷)𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟 𝑥 100 % 𝑟𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟

d. Penetapan kandungan fenolik total larutan uji Sebanyak 0,5 mL larutan uji dengan konsentrasi 102 μg/mL, kemudian ditambah dengan 5,0 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1M lalu diamkan selama operating time, dibaca

pada

panjang gelombang maksimum yang


35

didapat 739 nm. Pengerjaan dilakukan tiga kali Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat ekstrak etanol. Hasil penetapan kandungan fenolik total dapat dilihat di lampiran 7. 9.

Optimasi metode uji aktivitas antioksidan e.

Penentuan operating time (OT) Sebanyak 2,0 mL larutan DPPH dimasukan kedalam masingmasing tiga labu ukur 10 mL, ditambahkan masing-masing dengan 2,0 mL larutan pembanding kuersetin 5,0; 10,0 dan 15,0 μg/mL Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan hingga

tanda

batas.

dengan

metanol

p.a

Larutan tersebut kemudian digojok dengan

vortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 515 nm selama 1 jam, dan hal diatas dikerjakan juga untuk larutan uji dengan konsentrasi 7,5; 12,5; 17,5 μg/mL. Hasilnya ada di lampiran 10. f.

Penentuan panjang gelombang serapan maksimum Pada tiga labu ukur 10 mL, dimasukkan masing-masing 0,5; 1,0; 1,5 mL larutan DPPH 0,4 mM. Larutan tersebut dilarutkan dengan metanol p.a hingga tanda batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,020; 0,040; dan 0,060 mM. Larutan tersebut kemudian digojok dengan vortex selama 30 detik. Diamkan selama operating time, kemudian di

scanning

dengan

spektrofotometer

rentang panjang gelombang antara 400-600 nm.

visibel

pada


36

10. Uji aktivitas antioksidan a.

Pengukuran absorbansi larutan DPPH (kontrol) Pada labu ukur 10 mL, dimasukkan sebanyak 2,0 mL larutan DPPH lalu dilarutkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Kemudian larutan tersebut dibaca absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak tiga kali. Larutan ini digunakan sebagai kontrol untuk menguji larutan pembanding dan uji.

b.

Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji Larutan DPPH sebanyak 2,0 mL dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL kemudian ditambah dengan 2,0 mL larutan pembanding dan uji pada berbagai konsentrasi yang telah dibuat. Selanjutnya larutan tersebut dilarutkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian digojok dengan vortex selama 30 detik dan didiamkan

selama

OT.

Larutan

dibaca

absorbansinya

dengan

spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi. Pengujian dilakukan dengan tiga kali optimasi. c.

Penetapan aktivitas antioksidan Dari hasil dari pengukuran absorbansi 10 b dihitung nilai %IC dan IC50 untuk kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri.


37

F. Analisis Hasil Kandungan fenolat total dalam daun benalu kemiri dinyatakan dalam GAE (gallic acid equivalent) yaitu jumlah kesetaraan miligram asam galat dalam 1 gram sampel (Lee et al., 2003). Nilai tersebut didapatkan dari analisis regresi linier dengan data kurva baku asam galat secara intrapolasi. Untuk Menghitung kandungan fenolik total digunakan rumus : Kandungan fenolik total = X

𝑣 𝑚

X = kadar fenolik yang diperoleh dari persamaan kurva baku (mg/mL) v = volume akhir larutan dikali faktor pengenceran (mL) m = bobot fraksi (gram) (Kusumanto, 2015) Aktivitas penangkapan radikal DPPH (% IC) dihitung dengan rumus : Absorbansi larutan kontrol − Absorbansi larutan pembanding atau uji × 100% Absorbansi larutan kontrol

(Hardiana, Rudyansyah dan Zaharah, 2012) Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC50 menggunakan persamaan regresi linier dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun pembanding, sedangkan sumbu y adalah % IC.


38

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Penelitian ini dimulai dengan melakukan determinasi pada tanaman yang akan diuji dengan cara membandingkan ciri dan sifat sampel. Determinasi tanaman sangat penting untuk dilakukan yang bertujuan untuk mengetahui dan memastikan kebenaran identitas dari tanaman yang digunakan didalam penelitian ini. Oleh sebab itu determinasi merupakan langkah awal terpenting di penelitian ini. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan adalah Scurrula atropurpurea (B1.) Dans atau dikenal dengan benalu (suku loranthaceae). Hal ini dibuktikan dengan surat determinasi (lampiran 1) yang dilakukan di Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.

B. Hasil Pengumpulan bahan Daun benalu kemiri yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari pohon kemiri yang berada di sekitar halaman kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta. Daun benalu diambil dari tempat yang sama, hal tersebut bertujuan agar variasi kandungan kimia yang terkandung didalam daun benalu tidak berbeda jauh. Daun benalu dipanen dengan kriteria sebagai berikut yaitu pada saat cuaca kering dan sebelum musim hujan. Daun benalu dikumpulkan dan diambil yang masih segar. Pemanenan dilakukan pada pagi hari dengan tujuan agar benalu dalam kondisi segar dan menurut

38


39

Sahwalita dan Herdiana (2015) proses pemanenan tidak dilakukan pada siang hari karena akan mengakibatkan kandungan metabolit sekunder yang berfungsi sebagai antioksidan akan berkurang karena adanya proses metabolisme dari daun tersebut. Daun benalu yang diambil tidak terlalu tua (tidak berwarna atau cokelat) tanpa klasifikasi umur dari tanaman tersebut. Lalu proses pengeringan dilakukan setelah penyortiran dan pencucian yang bertujuan untuk mengurangi kontaminasi dari benda asing yang mungkin akan menjadi pengacau dalam penelitian baik berupa debu, atau bagian tanaman lain. Proses pengeringan dengan cara dijemur dibawah sinar matahari sambil ditutup dengan kain hitam. Menurut Hartiwi cit. Nugraha, 2010 tanaman ditutup kain hitam bertujuan untuk mengurangi UV yang mungkin dapat merusak senyawa antioksidan yang terdapat pada tanaman tersebut. Pengeringan dihentikan ketika daun sudah kering dengan tanda rapuh dan mudah dipatahkan. Daun benalu kemiri yang telah kering dibuat serbuk menggunakan blender kemudian diayak dengan menggunakan ayakan nomor mesh 40. Tujuan dari dibuat serbuk ini adalah agar didapatkannya serbuk halus yang akan meningkatkan keefektifan didalam ekstraksi sebab luas kontak antara sampel dan penyari akan semakin besar dan proses penyarian akan lebih optimum.

C. Hasil Preparasi Sampel 1.

Hasil Ekstraksi sampel Tujuan dilakukan ekstraksi sampel untuk mengumpulkan senyawa kimia yang terkandung dalam daun benalu yang kemungkinan mengandung


40

senyawa yang berperan sebagai antioksidan. Dalam proses penyarian digunakan daun benalu yang telah dikeringkan dan dibuat serbuk. Pada penelitian ini sampel yang digunakan harus dikeringkan sebab jika menggunakan sampel segar maka senyawa yang terkandung dapat mengalami kerusakan dikarenakan tanaman memiliki enzim yang dapat mendegradasi senyawa flavonoid di dalam sampel, sehingga menurut Andersen dan Markham (2006) perlu dilakukan pengeringan terlebih dahulu untuk mengurangi kerusakan senyawa yang terkandung. Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan metode maserasi. Metode maserasi adalah metode ekstraksi yang melibatkan perendaman dan pengadukan bahan tanaman dengan pelarut (Raaman, 2006). Metode ini dipilih karena maserasi sederhana sehingga mudah dilakukan. Prosedur ekstraksi ini tidak membutuhkan panas sehingga dapat mencegah degradasi senyawa yang terkandung dalam tanaman (Sarker, Zahid, dan Alexander, 2006). Proses maserasi dilakukan dengan melarutkan sampel ke dalam cairan penyari. Larutan penyari yang digunakan adalah etanol 70 % . Etanol dipilih sebagai pelarut dikarenakan menurut Ramdja et al. (2009) etanol memiliki sifat yang sama seperti metanol, tetapi tidak beracun seperti metanol. Menurut Harbone cit. Padmasari et al., 2013 flavonoid terutama berupa senyawa yang larut dalam air dan senyawa aktifnya dapat diekstraksi dengan etanol 70 %. Etanol dengan konsentrasi 70% dipilih karena menurut Vongsak et al., (2013)

saat menggunakan pelarut dengan konsentrasi 70 % saat

maserasi akan memperoleh hasil tertinggi selama 72 jam (3 hari), namun


41

metode ini memiliki kelemahan yaitu memakan waktu yang lama. Hal terpenting dalam pemilihan etanol sebagai pelarut adalah ketoksikannya yang rendah dibandingkan metanol walaupun metanol memiliki kepolaran yang lebih tinggi, namun pada metanol memiliki sifat sitotoksik yang tidak sesuai dengan tujuan penelitian mengingat akan resiko yang ditimbulkan (Tiwari et al.,2011). Proses maserasi dibantu dengan alat shaker. Alat shaker pada proses maserasi bertujuan untuk membantu agar hasil ekstraksi lebih maksimal dan efektif. Adanya bantuan shaker akan membantu penyari untuk kontak langsung dan berpenetrasi ke dalam sel-sel tanaman. Proses maserasi dilakukan selama 3 hari dengan etanol 70 % selama 72 jam (Vongsak et al., 2013). Setelah 3 hari dilakukan maserasi kemudian cairan penyari dipisahkan dari ampas serbuk daun benalu kemiri dibantu corong Buchner yang dilapisi kertas saring dengan bantuan pompa vakum, tujuannya adalah untuk mempercepat proses penyaringan dibandingkan dengan penyaringan biasa dan mendapatkan hasil yang lebih banyak. Kemudian ampas diremaserasi dengan 100 ml etanol 70 % selama 2 hari, tujuannya adalah untuk menarik senyawa yang mungkin masih tersisa. Hasil dari maserasi dan remaserasi digabung. Setelah itu, pelarut etanol diuapkan menggunakan alat vaccum rotary evaporator pada suhu 40˚C hingga diperoleh ekstrak kental etanol, penggunaan suhu 40ᵒC sebab prinsip dari vaccum rotary evaporator ialah menguapkan pelarut dibawah titik didihnya. Komponen etanol bersifat volatile dengan titik didih 78,32ᵒC (Sari, 2012). Ekstrak kental etanol selanjutnya diuapkan lagi dengan waterbath


42

hingga bobot tetap. Tujuan diletakkan diatas waterbath adalah untuk menghilangkan sisa-sisa penyari (etanol) yang mungkin masih ada. Hasil ekstrak yang berupa ekstrak kental tersebut ditutupi almunium foil lalu disimpan di desikator untuk menjaga agar estrak tetap baik selama penyimpanan dan bebas dari jamur sampai dilakukan tahap selanjutnya. 2.

Hasil Fraksinasi ekstrak Setelah didapatkan ekstrak kental etanol, maka dilanjutkan ekstraksi lagi dengan senyawa wash bensin (petroleum eter/eter minyak tanah) yang bertujuan untuk menghilangkan senyawa-senyawa yang tidak diinginkan seperti klorofil dan lipid. Menurut Zhang cit. Widyawati, 2010 petroleum eter digunakan untuk menghilangkan lemak (defatted) dan memudahkan proses ekstraksi dan fraksinasi senyawa bioaktif dengan pelarut berikutnya. Metode yang digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa diatas ialah metode ekstraksi cair-cair. Prinsip pemisahan dengan ekstraksi cair-cair adalah pemisahan senyawa berdasarkan kepolaran suatu senyawa dengan 2 pelarut yang berbeda kepolarannya. Menurut Depkes RI, 2000 berdasarkan kepolaran dan kelarutan, senyawa yang bersifat polar akan mudah larut dalam pelarut polar, sedangkan senyawa nonpolar akan mudah larut dalam pelarut nonpolar. Sebelum fraksinasi, ekstrak kental etanol daun benalu kemiri dilarutkan dengan air hangat agar mudah difraksi. Fraksinasi diawali dengan pencucian ekstrak dengan wash bensin untuk membersihkan pengotor nonpolar yang mungkin terbawa seperti lemak dengan perbandingan wash bensin : air (1:1 v/v). Pencucian dilakukan dalam corong pisah. Prinsip pemisahan larutan


43

dalam corong pisah menggunakan perbedaan berat jenis antar cairan. Wash bensin memiliki berat jenis yang lebih kecil dibandingkan air, sehingga akan berada diatas permukaan air. Fase air kemudian diambil dan fase wash bensin dibuang, dan fase air siap difraksinasi dengan etil asetat. Fase air akan menarik senyawa seperti flavonoid karena menurut Markham cit. Padmasari et al., 2013 flavonoid umumnya lebih mudah larut dalam air atau pelarut polar sedangkan wash bensin yang bersifat nonpolar akan menarik senyawa nonpolar seperti lemak dan klorofil . Air memiliki bobot jenis 0,997 (chem1 virtual textbook, 2015) dan wash bensin yaitu 0,630 g/mL (Farmakope Indonesia ed. V, 2014) sehingga fase air akan berada dibawah yang memiliki berat jenis yang lebih besar. Setelah itu, proses partisi dilanjutkan kembali dengan menggunakan pelarut yang berbeda. Dengan larutan etil asetat yang berbobot jenis 0,902 g/ml (Ekstra farmakope Indonesia, 1974) dengan perbandingan fraksi air :etil asetat (1:1 v/v). Pada partisi ini, etil asetat berada di atas karena bobot jenis air lebih besar (0,997 g/ml) dibandingkan etil asetat. Proses ekstraksi ini juga dilakukan berulang sampai pelarut etil asetat menjadi bening. Hal ini menandakan bahwa tidak ada lagi senyawa yang larut dalam pelarut etil asetat. Pada proses partisi ini, fraksi yang diambil adalah fraksi etil asetat karena sebagian besar senyawa-senyawa flavonoid larut dalam fraksi etil asetat. Menurut Andersen dan Markham (2006) jika menggunakan etil asetat sebagai pelarut, maka dapat lebih menspesifikan penyarian pada senyawa flavonoid yang kurang polar dengan golongan isoflavon, flavanon, flavon


44

termetilasi dan flavonol. Fraksi etil asetat yang didapat diuapkan menggunakan vacuum rotary evaporator selanjutnya dipindahkan ke cawan petri kemudian diletakkan diatas waterbath hingga bobot tetap. Setelah di waterbath, fraksi beserta wadah dibungkus dengan alumunium foil supaya tidak terpapar udara dan sinar UV yang mungkin dapat mendegradasi kandungan senyawa fenolik. Fraksi etil asetat yang sudah dibungkus dimasukkan didalam desikator agar tidak terpapar lembab dan ditumbuhi jamur atau mikroba. Fraksi etil asetat yang disimpan ini yang akan digunakan untuk uji aktivitas antioksidan dan ditetapkan kandungan fenolik totalnya yang dinyatakan sebagai mg ekivalen asam galat per g. Bobot ekstrak etanol yang didapat sebesar 13,8 g dan rendemen yang didapat adalah 15,4 % sedangkan fraksi bobotnya 1,0 g dan rendemen adalah 1,1 %.

D. Hasil Uji Pendahuluan 1.

Uji pendahuluan senyawa fenolik Uji pendahuluan fenolik total ini bertujuan untuk mengetahui adanya kandungan fenolik dalam fraksi etil asetat ekstrak etanol tanaman benalu secara kualitatif. Prinsip uji ini adalah reaksi oksidasi reduksi dari ion fenolat senyawa uji dengan pereaksi fenol Folin-Ciocalteu. Menurut Prior, 2005 oksidasi dari senyawa fenol oleh reagen molibdotungstat menghasilkan suatu produk yang berwarna biru disekitar panjang gelombang 745-750 nm. Hasil molar warna biru yang terbentuk sebanding dengan ion fenolik yang teroksidasi oleh kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat, juga semakin


45

pekatnya warna biru yang terbentuk juga menandakan semakin banyak kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat yang tereduksi. Pengujian fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri menunjukkan warna biru setelah direaksikan dengan Folin-Ciocalteu dan natrium karbonat yang menunjukkan bahwa fraksi etil asetat daun benalu kemiri memiliki kandungan senyawa fenolik (gambar 6 C ). Larutan blanko adalah larutan tanpa adanya analit (asam galat) (Torowati dan Galuh, 2004). Fungsi larutan blanko disini adalah sebagai kalibrasi penggunaan spektrofotometri visible didalam penetapan kandungan fenolik total. Larutan blanko (gambar A) dan merupakan kontrol negatif sedangkan gambar B, gambar C, larutan asam galat (gambar D) dan larutan uji (gambar E) merupakan kontrol positif.

Gambar 6. Hasil uji pendahuluan Keterangan Gambar 6: A = Kontrol negatif (larutan blanko = air:metanol +Folin Ciocalteu + Na2CO3) B = Kontrol positif (asam galat + Folin Ciocalteu + Na2CO3) C = larutan uji + Folin Ciocalteu + Na2CO3 D = larutan asam galat E = larutan uji


46

2.

Uji pendahuluan aktivitas antioksidan Uji pendahuluan merupakan langkah awal dalam menentukan aktivitas antioksidan yang bertujuan untuk mengetahui apakah ada aktivitas antioksidan dari fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri secara kualitatif. Uji dilakukan dengan menggunakan reaksi antara senyawa uji dan DPPH. Prinsip dari metode DPPH dalam mengetahui aktivitas antioksidan adalah didasarkan dari reaksi reduksi DPPH. DPPH merupakan radikal bebas yang stabil pada suhu ruangan dan berwarna violet dalam metanol (gambar 7 C). Radikal bebas merusak rantai yang bertanggung jawab sebagai pembuat warna violet tersebut menjadi warna kuning ketika radikal bereaksi dengan antioksidan (Badarinath, 2010). Hasil percobaan menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri ini mampu merubah warna ungu DPPH menjadi warna kuning (gambar 7 D) yang menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri positif memiliki aktivitas antioksidan. Aktivitas dibuktikan dengan dibandingkan dengan kontrol positif yang digunakan adalah kuersetin yang menunjukkan memudarnya warna ungu DPPH menjadi warna kuning (gambar 7 E). Hasil perbandingannya menunjukkan bahwa keduanya memiliki aktivitas antioksidan ditandai dengan adanya pemudaran warna ungu DPPH menjadi warna kuning. Pada percobaan ini digunakan metanol sebagai pelarutnya. Gambar C (tanpa penambahan analit berupa larutan uji maupun kuersetin) merupakan kontrol negatif sedangkan Larutan kuersetin (gambar A), Larutan uji (gambar B), gambar D, dan gambar E merupakan kontrol positif.


47

Gambar 7. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan Keterangan Gambar 7: A = Kontrol positif (larutan Kuersetin) B = larutan uji C = Kontrol negatif (larutan DPPH + larutan metanol) D = larutan uji + DPPH E = larutan kuersetin + DPPH

E. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total 1.

Penentuan operating time (OT) Penentuan OT pada penetapan fenolik total bertujuan untuk mendapatkan waktu ketika reaksi antara larutan pembanding (asam galat) atau larutan uji (fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri) dengan pereaksi Folin-Ciocalteu telah berlangsung sempurna. Penentuan operating time didasarkan dari waktu dimana absorbansi dari larutan pembanding dan larutan uji terhadap reagen mulai stabil atau selisih absorbansi mulai kecil antar selang waktu yang diujikan (Patria, 2013). Kisaran selisih absorbansi mulai kecil ditunjukkan selisih angka nya tidak terlalu jauh, hal tersebut bisa dilihat pada lampiran 6. pengukuran OT pada asam galat (gambar 8)


48

dilakukan selama tiga puluh menit dengan waktu pengamatan setiap lima menit, sedangkan pada senyawa uji dilakukan selama satu jam (Gambar 9). Operating time dilakukan dengan menggunakan panjang gelombang teoritis, yaitu 750 nm (Bajcan., 2013) dan waktu mulai dihitung setelah reagen FolinCiocalteu dicampurkan.

Gambar 8. Grafik penentuan OT asam galat (optimasi 2)

Gambar 9. Grafik penentuan OT fraksi etil asetat


49

Dari hasil yang didapatkan dengan grafik (gambar 8) OT (operating time) yang didapatkan dari asam galat ialah 20 menit yang dimana absorbansi yang dihasilkan sudah berjalan stabil yang menunjukkan reaksi sudah berjalan sempurna dengan selisih absorbansi yang kecil hasilnya bisa dilihat pada Lampiran 6. Penentuan OT asam galat cukup diwakili oleh optimasi 2 karena pada optimasi yang lain juga menunjukkan kestabilan pada absorbansi yang sama. Sementara itu, OT untuk sampel uji fraksi etil asetat yaitu 25 menit dimana absorbansi telah stabil dengan selisih absorbansi yang kecil (Gambar 9). 2.

Penentuan panjang gelombang serapan maksimum (λ maks) asam galat Tujuan dari penentuan panjang gelombang maksimum ini adalah untuk mengetahui panjang gelombang maksimal dari hasil reaksi asam galat dan reagen Folin-Ciocalteu yang menghasilkan serapan paling maksimal. Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang maksimum karena pada panjang gelombang maksimum sedikit perubahan konsentrasi akan memberikan perubahan absorbansi yang besar sehingga akan didapatkan kepekaan analisis yang maksimum. Dalam penentuan panjang gelombang serapan maksimum dilakukan pada 3 konsentrasi, yaitu 50; 100; dan 150 µg/mL. Hal ini bertujuan agar dapat mempresentasikan panjang gelombang maksimum dari setiap konsentrasi. Dalam pengerjaan, absorbansi asam galat dihitung dengan auto zero menggunakan pelarut metanol p.a : air (1:1). Hal ini dilakukan supaya tidak adanya gangguan serapan dari pelarut. Rata-rata panjang gelombang yang didapatkan dari ketiga konsentrasi tersebut adalah


50

739 nm (Tabel III). Panjang gelombang yang didapat akan digunakan untuk mengukur kurva seri baku asam galat untuk penetapan kadar fenolik total dari fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri. Tabel III. Hasil scanning panjang gelombang maksimum asam galat yang direaksikan dengan Folin-Ciocalteu

Konsentrasi larutan Asam Galat

λ maksimum hasil scanning

λ maksimum rata-rata

λ maksimum teoritis

150 µg/mL

739,0 739,5 738,5

739

750

100 µg/mL 50 µg/mL

F. Validasi Metode Penetapan Fenolik Total Tujuan dilakukan validasi metode analisis adalah untuk membuktikan bahwa metode penelitian yang digunakan memenuhi persyaratan sehingga didapatkan hasil yang sesuai dan dapat dipercaya. 1.

Linearitas Berdasarkan hasil tiga persamaan regresi linier dalam tabel dipilih satu persamaan dengan nilai r yang paling mendekati 1 atau -1 adalah Persamaan optimasi 3 yaitu y = 0,0039x+0,0860 dengan nilai r sebesar 0,9998, yang nantinya persamaan tersebut akan digunakan dalam menentukan kandungan fenolik total.


51

Tabel IV. Hasil pengukuran absorbansi seri baku asam galat yang direaksikan dengan folin ciocalteu Asam galat Optimasi 1 Optimasi 2 Konsentrasi Absorban Konsentrasi Absorban (µg/ml) terukur (µg/ml) terukur 50,0 0,283 51,0 0,287 75,0 0,385 76,5 0,385 100,0 0,470 102,0 0,479 125,0 0,577 127,5 0,576 150,0 0,685 153,0 0,695 y = 0,0039x + 0,0816 r=0,9991

y = 0,0039x + 0,0816 r = 0,9989

Optimasi 3 Konsentrasi Absorban (µg/ml) terukur 51,5 0,291 77,5 0,389 103,0 0,488 128,7 0,589 154,5 0,696 y = 0,0039x + 0,0860 r = 0,9998

Gambar 10. Kurva seri baku asam galat (optimasi 3) Kurva seri baku asam galat (Gambar 10) koefisien korelasi (r) yang diperoleh menunjukkan nilai 0,9998 dan melebihi nilai 0,99 atau mendekati 1 sehingga dapat dikatakan linear sesuai Kingston (2004). Kurva baku tersebut dipilih karena memiliki nilai r terbaik. Kesimpulan yang dapat diambil,


52

metode yang digunakan memiliki koefisien korelasi (r) atau linearitas yang baik. 2.

Presisi Berdasarkan hasil yang diperoleh dari pengukuran tiga optimasi dari kelompok tersebut didapatkan rata-rata standar deviasi dan juga CV (koefisien variansi) asam galat lima konsentrasi dari 3 kali optimasi tersebut adalah SD sebesar 0,005 % dan CV sebesar 1,172 % (Tabel V). Hal ini menunjukkan bahwa hasil yang didapatkan memenuhi persyaratan penelitian. Menurut Kingston (2004), CV yang baik memiliki nilai < 2 %. Tabel V. Nilai presisi seri baku asam galat pada penetapan kandungan fenolik total Larutan 3 kali optimasi Seri 1 Seri 2 Seri 3 Seri 4 Seri 5 𝑋̅

Rata-rata absorbansi (nm) 0,287 0,386 0,479 0,580 0,692 0,484

SD

CV

0,004 0,002 0,009 0,007 0,006 0,005

1,393 0,518 1,878 1,206 0,867 1,172

G. Hasil Penetapan Kandungan Fenolik Total Senyawa yang berperan utama dalam aktivitas antioksidan adalah senyawa fenolik. Senyawa fenolik banyak terdistribusi dalam tanaman, maka perlu dilakukan perhitungan kandungan fenolik total yang mungkin tedapat pada fraksi etil asetat ekstrak etanol pada daun benalu kemiri tersebut dengan pereaksi reagen Folin-Ciocalteau. Menurut Susanti dan Alfian (2011) Reagen Folin Ciocalteau digunakan karena senyawa fenolik dapat bereaksi dengan Folin membentuk


53

larutan berwarna yang dapat diukur absorbansinya. Prinsip dari metode folin ciocalteau adalah terbentuknya senyawa kompleks berwarna biru. Pereaksi ini mengoksidasi fenolat (garam alkali) atau gugus fenolik-hidroksi mereduksi asam heteropoli (fosfomolibdat-fosfotungstat) yang terdapat dalam pereaksi Folin Ciocalteau menjadi suatu kompleks molibdenum-tungsten. Senyawa fenolik bereaksi dengan reagen Folin Ciocalteau hanya dalam suasana basa agar terjadi disosiasi proton pada senyawa fenolik menjadi ion fenolat. Untuk menciptakan kondisi basa digunakan Na2CO3. Selama reaksi berlangsung, gugus hidroksil pada senyawa fenolik bereaksi dengan pereaksi Folin Ciocalteau, membentuk kompleks molibdenum-tungsten berwarna biru dan dapat dideteksi dengan spektrofotometer. Warna biru yang terbentuk akan semakin pekat, setara dengan konsentrasi ion fenolat yang terbentuk; artinya semakin besar konsentrasi senyawa fenolik maka semakin banyak ion fenolat yang akan mereduksi asam heteropoli (fosfomolibdatfosfotungstat) menjadi kompleks molybdenum tungsten sehingga warna biru yang dihasilkan semakin pekat. Intensitas berwarna biru kompleks tungstenmolibdenum diukur secara spektrofotometri visible pada panjang gelombang yang didapat yaitu 739 nm.


54

Gambar 11. Reaksi asam galat dan Reagen Folin (Singh, Gupta dan Verma, 2013) Menurut Mongkolsilp, Pongbupakit, Sae-Lee dan Sitthithaworn (2004) asam galat dipilih karena tersedianya asam galat dalam kemurnian yang tinggi dan stabil serta harganya yang relatif lebih murah dibandingkan dengan senyawa standar yang lain serta menurut Lee et al. (2003) Kandungan fenol asam organik ini bersifat murni dan stabil. Tabel VI. Hasil penentuan jumlah fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri fenolik total (mg Konsentrasi Absorbansi Optimasi ekivalen rata-rata SD CV (µg/mL) (nm) asam galat per g) 102 0,260 I 43,73 102 0,261 II 43,99 44,3 0,77 1,73 100 0,264 III 45,18

Berdasarkan hasil uji penetapan fenolik total fraksi etil asetat daun benalu kemiri memiliki kandungan fenolik total sebesar 44,3 ± 0,77 mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat ekstrak etanol.


55

H. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan 1.

Penentuan panjang gelombang maksimum ( λ maks) Tujuan dari penentuan panjang gelombang serapan maksimum adalah untuk mendapatkan daerah serapan maksimum DPPH atau absorbsi maksimum DPPH merupakan senyawa yang memiliki warna violet dengan panjang gelombang maksimum teoritis 517 nm. Namun dalam prakteknya, panjang gelombang yang dihasilkan tidak memberikan absorbansi maksimum pada panjang gelombang teoritis, hal ini tergantung dari instrumen pengukuran yang digunakan. Penentuan λ maksimum di scanning dengan spektrofotometer visibel pada rentang panjang gelombang antara 400-600 nm hasilnya bisa dilihat pada lampiran 10. Dalam penelitian ini yang diukur adalah absorbansi dari larutan radikal DPPH. DPPH memiliki gugus kromofor dan auksokrom pada struktur kimianya sehingga mampu memberikan serapan. Gugus kromofor adalah gugus atau atom dalam senyawa organik yang mampu menyerap sinar ultraviolet dan juga sinar tampak,

sedangkan

auksokrom

merupakan

gugus

fungsional

yang

mempunyai pasangan elektron bebas seperti –OH, -O, -NH2 dan -OCH3 Adanya gugus auksokrom yang terikat pada gugus kromofor maka akan mengakibatkan pergeseran pita absorbansi menuju panjang gelombang yang lebih besar (Gandjar, 2012).


56

Gambar 12. Gugus kromofor dan Auksokrom DPPH (Nunes et al., 2012) Keterangan : hijau = gugus kromofor; merah= gugus auksokrom Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan pada 3 konsentrasi yaitu pada konsentrasi tinggi, tengah dan rendah, 0,020; 0,040; dan 0,080 mM, tujuan dilakukannya penentuan panjang gelombang maksimum

pada

konsentrasi

yang

berbeda

yaitu

agar

dapat

mempresentasikan panjang gelombang maksimum untuk kurva baku dari setiap

konsentrasi.

Absorbansi

sampel

dihitung

dengan

auto

zero

menggunakan pelarut yang digunakan yaitu metanol. Hal ini dilakukan supaya tidak adanya gangguan serapan dari methanol. Rata-rata panjang gelombang yang didapatkan dari ketiga konsentrasi tersebut adalah 515 nm. Seperti yang telah digunakan pada penelitian Bondet (1997) tentang aktivitas antioksidan dengan radikal DPPH menggunakan panjang gelombang 515 nm.


57

Tabel VII. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum pada berbagai konsentrasi

2.

Konsentrasi larutan DPPH

λ maksimum hasil scanning (nm)

λ maksimum yang digunakan untuk pengukuran (nm)

λ maksimum teoritis (nm)

0,02 mM 0,04 mM 0,06 mM

514 515 515

515

517

Penentuan operating time Penentuan

operating

time

dilakukan

dengan

tujuan

untuk

mendapatkan waktu optimum dimana reaksi antara baku pembanding (kuersetin) dan larutan uji (fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri) terhadap reagen (DPPH) yang diberikan. Penentuan operating time dilakukan selama 1 jam untuk kuersetin dan juga larutan uji. Penentuan Operating time didasarkan dari waktu dimana absorbansi dari baku pembanding dan larutan uji terhadap reagen memperlihatkan selisih absorbansi mulai kecil antara selang waktu yang diujikan (Surya, 2013). Tiap lima menit dicatat absorbansi DPPH selama satu jam pengukuran. Waktu dihitung setelah DPPH dicampur dengan larutan uji atau pembanding. Panjang gelombang maksimum yang digunakan untuk pengukuran yaitu 515 nm.


58

Gambar 13. Grafik penentuan OT kuersetin (optimasi 2)

Gambar 14. Grafik penentuan OT fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri (optimasi 3) Dari hasil yang didapat bahwa operating time yang dimiliki baik kuersetin maupun fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri memiliki hasil yang sama yaitu 20 menit. Penyimpulan waktu operating time 20 menit dikarenakan pada waktu ini reaksi mulai stabil dikatakan stabil karena ditunjukkan dengan semakin kecil selisih absorbansinya, hasilnya


59

dapat dilihat pada lampiran 10. Digunakannya optimasi 2 dalam penentuan kuersetin (gambar 13) serta optimasi 3 didalam penentuan OT fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri (gambar 14) dikarenakan sudah mewakili kedua optimasi lain yang menunjukkan OT pada menit ke-20. Hasilnya dapat dilihat pada lampiran 10.

I.

Hasil Penetapan Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH Uji aktivias antioksidan dilakukan dengan metode penangkapan radikal

(radical scavenging) terhadap radikal 2,2-difenil-1-pikril hidrazil (DPPH). Pengukuran aktivitas antioksidan dalam penelitian ini akan mengukur besarnya IC50 dari baku kuersetin sebagai pembanding dan IC50 dari fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri. IC50 merupakan konsentrasi yang diperlukan dalam menghambat 50% aktivitas DPPH (Molyneux, 2004). Untuk memperoleh IC50 masing- masing sampel dibuatlah larutan seri dari baku kuersetin dan juga fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri. Prinsip metode DPPH adalah interaksi antioksidan dengan DPPH baik secara transfer elektron atau radikal hidrogen pada DPPH akan menetralkan karakter radikal bebas dari DPPH dan jika semua elektron pada radikal bebas DPPH menjadi berpasangan maka warna larutan berubah dari ungu tua menjadi kuning terang (Green cit. Erawati, 2012).


60

Gambar 15. Perubahan DPPH akibat adanya antioksidan, (Nunes et al., 2012) Cara mendapatkan IC50 yaitu dengan mengukur absorbansi seri larutan dari larutan uji fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri yang diukur sehingga akan diperoleh persamaan regresi dari hubungan persentase daya hambat absorbansi larutan uji dengan konsentrasi dari larutan uji yang diukur. Persamaan regresi yang diperoleh ini dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi larutan uji yang dapat menghambat radikal DPPH sebesar 50%. Baku yang digunakan sebagai pembanding adalah kuersetin. Kuersetin digunakan karena merupakan salah satu konstituen flavonoid dari tanaman yang diketahui memiliki aktivitas antioksidan. Baku pembanding ini digunakan sebagai pembanding dari kekuatan aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri. Kuersetin mampu menurunkan intensitas warna dari DPPH yang membuktikan kalau kuersetin merupakan antioksidan yang cukup poten. Kuersetin ini merupakan senyawa flavanoid yang cukup kuat sebagai senyawa antioksidan, sehingga tujuan penelitian ini untuk mengetahui seberapa besar senyawa antioksidan yang terdapat pada daun benalu kemiri.


61

Pada penelitian ini digunakan kontrol positif berupa kuersetin, yang dimaksudkan untuk melihat potensi kekuatan fraksi etil asetat ekstrak etanol dari daun benalu kemiri dibandingkan dengan senyawa kuersetin. Menurut Sofyan cit. Perwiratami et al., (2014) kuersetin digunakan sebagai pembanding karena merupakan golongan flavonoid yang sering ditemukan dalam tumbuhan dan diketahui memiliki banyak aktivitas biologis, khususnya antioksidan. Pelarut yang digunakan didalam penelitian ini adalah metanol. Digunakan metanol sebagai pelarut dikarenakan metanol terbukti tidak mengganggu (interferensi) dalam reaksi DPPH (Molyneux, 2004). Pengukuran dilakukan dalam panjang gelombang maksimum hasil scanning yaitu 515 nm. Menurut Prior (2005) Keuntungan metode DPPH ini adalah tes ini sederhana, cepat dan hanya membutuhkan spektrofotometer UV-Vis untuk melakukan uji, sehingga metode ini digunakan secara luas dalam skrining antioksidan. Tabel VIII. Hasil aktivitas antioksidan kuersetin dengan metode DPPH Optimasi

1

2

3

Konsentrasi (µg/mL)

5,05 7,58 10,10 12,63 15,15 5,10 7,65 10,20 12,75 15,30 5,0 7,50 10,0 12,5 15,0

Absorbansi kontrol

0,710

0,733

0,761

Absorbansi kuersetin

% IC

0,495 0,431 0,395 0,333 0,285 0,505 0,455 0,320 0,265 0,206 0,696 0,589 0,488 0,389 0,291

30,28 39,30 44,37 53,10 59,86 31,11 37,93 56,34 63,85 71,80 8,54 22,60 35,87 48,88 61,76

Persamaan regresi linier

y=2,8896x + 16,1909 r = 0,9973

y=4,2078x + 9,286 r = 0,9855

y=5,3088x + 17,558 r = 0,9998


62

Tabel VIII menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi kuersetin yang direaksikan dengan DPPH maka aktivitas antioksidannya semakin besar. sehingga absorbansi yang dihasilkan akan semakin kecil. Pengukuran aktivitas kuersetin dilakukan sebanyak tiga kali optimasi, masing-masing optimasi memiliki persamaan regresi linier. Persamaan ini nantinya yang akan dipakai untuk menghitung nilai IC50 dan kemudian dibuat rata-ratanya.

Gambar 16. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan kuersetin (Optimasi 3)

Grafik yang ditunjukkan (Gambar 16) merupakan hasil regresi linier dari optimasi tiga yang mewakili dua optimasi lainnya dikarenakan kedua optimasi yang lain juga menunjukkan hasil penghitungan IC50 secara intrapolasi atau berada dalam rentang konsentrasi yang digunakan dalam pengukuran seri konsentrasi kuersetin. Nilai r (0,9973) yang mendekati satu ini menandakan kevalidan dalam kurva kalibrasi yang mendekati linear.


63

Tabel IX. Hasil aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri dengan metode DPPH Optimasi

1

2

3

Konsentrai (µg/mL) 7,65 10,20 12,75 15,30 17,85 7,57 10,10 12,62 15,15 17,67 7,50 10,0 12,5 15,0 17,5

Absorbansi kontrol

0,883

0,875

0,879

Absorbansi Larutan uji 0,623 0,573 0,468 0,370 0,320 0,615 0,539 0,478 0,398 0,308 0,598 0,570 0,458 0,396 0,355

% IC 29,44 35,10 47,0 58,09 63,75 29,71 38,40 45,37 54,51 64,80 31,96 35,15 47,89 54,94 59,61

Persamaan regresi linier Y=3,5925x + 0,871 r =0,9919

Y =3,4174x + 3,423 r =0,9978

Y =3,0036x + 8,365 r =0,9829

Tabel IX menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi fraksi etil asetat yang direaksikan dengan DPPH maka aktivitas antioksidannya semakin besar. Hal ini terlihat dari nilai % IC yang semakin besar seiring dengan penambahan konsentrasi fraksi etil asetat. Pengukuran aktivitas fraksi etil asetat dilakukan sebanyak tiga kali optimasi. Persamaan regresi linier yang didapat ini nantinya yang akan dipakai untuk menghitung nilai IC50 dan kemudian dibuat rata-ratanya.


64

Gambar 17. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri (optimasi 2) Grafik yang ditunjukkan (Gambar 17) merupakan hasil regresi linier dari optimasi dua yang mewakili dua optimasi lainnya dikarenakan kedua optimasi yang lain juga menunjukkan hasil penghitungan IC50 secara intrapolasi atau berada dalam rentang konsentrasi yang digunakan dalam pengukuran seri konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri. Nilai r (0,9978) yang mendekati satu menandakan kevalidan dalam kurva kalibrasi yang mendekati linier. Nilai r yang dihasilkan dalam penelitian ini adalah 0,9973 untuk kuersetin dan 0,9978 untuk fraksi etil asetat, dimana nilai ini berada di atas nilai r yang dipersyaratkan > 0,99 (kingston, 2004).


65

Tabel X. Hasil perhitungan IC50 kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri

Optimasi I II III Optimasi I II III

Kuersetin IC50 Rata-rata (µg/mL) (µg/mL) 11,70 9,67 9,16 6,11 Fraksi etil asetat IC50 Rata-rata (µg/mL) (µg/mL) 13,67 13,62 13,71 13,86

SD 2,82

SD 0,12

Tabel X menunjukkan hasil pengukuran aktivitas antioksidan kuersetin dan fraksi etil asetat. Rata-rata IC50 kuersetin adalah 9,16 ± 2,82 µg/mL dan ratarata IC50 fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri adalah 13,71 ± 0,12 µg/mL. Berdasarkan nilai IC50 yang diperoleh dari pengukuran aktivitas antioksidan kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri dengan metode DPPH, maka kuersetin dan fraksi etil asetat digolongkan dalam senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan sangat kuat karena nilai IC50 kurang dari 50 µg/mL (Tabel XI).


66

Tabel XI. Ukuran intensitas antioksidan (Blois, 1958)

Sampel Kuersetin Fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri

IC50 (µg/mL ) 9,16 13,71

Tingkatan aktivitas antioksidan (IC50) Kuat (< Sedang (< Lemah Sangat kuat 50-100 101-150 (>150 (<50 µg/mL) µg/mL) µg/mL) µg/mL)  

-

-

-


67

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan 1.

Jumlah fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri adalah sebesar 44,3 ± 0,77 mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat ekstrak etanol.

2.

Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat dari ekstrak etanol daun benalu kemiri termasuk sangat kuat dengan nilai IC50 = 13,71 ± 0,12 µg/mL.

B. Saran 1.

Untuk penelitian selanjutnya perlu dilakukan pengujian aktivitas antioksidan terhadap batang benalu.

67


68

DAFTAR PUSTAKA Andersen, O.M., dan Markham, K.R., 2006, Flavonoids, Chemistry, Biochemistry and Applications, Taylor and Francis Group, United States of America, pp. 2, 3. Athiroh, N.AS., dan Permatasari.N., 2012, Mekanisme Kerja Benalu Teh pada Pembuluh Darah, Jurnal Kedokteran Brawijaya, Vol. 27 No. 1,1-7. Badarinath, A.V., Mallikarjuna RAo, K., , Chetty, C. Madhu Sudhana, Ramkanth, S., Rajan, T.V.S, Gnanaprakash, K., 2010, A Review on In-vitro Antioxidant Methods: Comparisions, Correlations and Considerations, Int.J. Pharm. Tech. Research, Vol 2, No 2,1276-1285. Bajcan, D., Harangozo, L., Hrabovska, D. dan Boncikova, D., 2013, Optimizing Condition for Spectrophotometric Determination of Total Polyphenols in Wines Using Folin-Ciocalteu Reagent, J of Microbio. Biotech. and Food Sci., 2 (Special issue 1), 1699-1708. Blois, M.S., 1958, Antioxidant Determinations by the Use of a Stable Free Radical, Nature Publishing Group, 181:1199-2000. Bondet, V.,Williams, B.W.,Berset, C., 1997, Kinetics And Mechanism Of Antioxidant Activity Using The DPPH·Free Radical Method, Lebensm Wiss u Technol, Prancis, 30, 609-615. Chan, C.C, Lam, H., Lee, Y.C., and Zhang, X.M., 2004, Analtytical Method Validation and Instrument Performance Verification, Jhon Wiley and Sons, Inc., New Jersey, pp.70-85. Chairul, C., 1998, Skrining Fitokimia dan Analisis Komponen Kimia Ekstrak Batang Benalu Teh, Scurrula Atropurpurea (B1.) Dans, Warta Tumbuhan Obat Indonesia, voume 4, No 4. Chem1 Virtual Textbook., 2015, http://www.chem1.com/acad/webtext/pre/pre2.html#SEC1 , diakses pada tanggal 19 nopember 2015. Dahlan, M. S., 2012, Statistik untuk Kedokteran dan Kesehatan, Salemba Medika, Jakarta, pp.4-26. Day, R. A., A. L. Underwood., 2002. Analisis Kimia Kuantitatif, Edisi VI, AB: Iis Sopyan. Erlangga. Jakarta, pp. 396. Depkes RI., 1995, Farmakope Indonesia, ed.IV, Departemen Kesehata Republik Indonesia, Jakarta, pp.7,1066.


69

Depkes RI., 1974, Ekstra Farmakope Indonesia, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp.947. Depkes RI., 1986, Sediaan Galenik, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp.10- 12. Depkes RI., 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta : Dirjen BPPOM, Jakarta, pp.5,10-11. Devi, P.A., 2011. korelasi kadar fenolat daun dendrophthoe petandra, Dendrophthoe falcata dan scurrula philippensis terhadap aktivitas antioksidan dengan metode DPPH, Skripsi, Universitas Muhammadiyah, Surakarta. Erawati., 2012, Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Garciniadaedalanthera Piere Dengan Metode DPPH (1,1-Difenil Pikrilhidrazil) Dan Identifikasi Golongan Senyawa Kmia Dari Fraksi Paling Aktif, Skripsi, Universitas Indonesia. Ermer, J dan Miller., 2005, Method Validation in Pharmaceutical Analysis: A Guide to Best Practice, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, pp. 21. Fessenden, R.J. dan Fessenden, J.S., 1995, Kimia Organik, Jilid II, diterjemahkan oleh Pudjaatmaka, A.H., edisi ke 3, Erlangga, Jakarta, pp.436-440. Fitria., 2011, Flavonoid Kuersetin dari Tumbuhan Benalu Teh (Scurulla atropurpureea BL. Dans), Jurnal Penelitian Sains, Vol. 14,No. 4,33-37. Gandjar, I.G. dan Rohman., 2012, Analisis Obat secara Spektrofotometri dan Kromatografi, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp. 70-71,475. Hardiana, R, Rudiyansyah, Zaharah, T.A., 2012, Aktivitas Antioksidan Senyawa Golongan Fenol Dari Beberapa Jenis Tumbuhan Famili Malvaceae, Jurnal JKK, Vol 1(1): 8-13. Harris, C.D., 2010, Quantitative Chemical Analysis, 8th Edition, W.H Freeman and Company, New York, pp. 101-102. Harmita., 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode Dan Cara Perhitungannya, Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol.1, No. 3, Departemen Farmasi FMIPA UI, Jakarta, pp. 117-135.


70

Kemenkes RI., 2014, Farmakope Indonesia, Ed V, Kementrian Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, Pp. 1707. Kingston., 2004, Guidelines for The Validation of Analytical methods for Active Constituent, Agricultural, and Veterinary Chemical Products, APVMA, pp. 3-8. Kumar, B., Sandhar, H.K., Prasher, S., Tiwari, P., Salhan, M., dan Sharma P., 2011, A Review Of Phytochemistry and Pharmacology Of Flavonoid, Internationale Pharmaceutica Sciencia, Vol 1(1), 25-41. Kusumanto Prasetio, E.K.Y., 2015, Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Metode Deoksiribosa Dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Pada Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol Buah Jambu Mete (Anacardium occidentale L.), Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Lee. K. W., Kim YJ., Lee HJ., Lee CY., 2003. Cocoa Has More Phenolic Phytochemical and A Higher Antioxidant Capacity than Teas and Red Wine. J. Agric. Food Chem 51 (25): 7292-7295. Leong, L.P dan Shui G., 2002. An Investigation of Antioxidant Capacity of Fruits in Singapore Markets, Food Chemistry, Elsevier Science, 76 : 69-75. Masoud, Mamdouh S., Sawsan S. Hagad, Alaa E. Ali, Nessma M. Nasr., 2012, Synthesis and spectroscopic characterization of gallic acid and some of its azo complexes, Journal of Molecular Structure, 1014 : 17–19. Maulida, D dan Zulkarnaen, N., 2010. Ekstarksi Antioksidan (LIKOPEN) Dari Buah Tomat Dengan Menggunakan Solven Campuran, n-Heksana, Aseton, dan Etanol, Jurnal Teknik Kimia, Universitas Diponegoro, Semarang. Miyerbamate., 2003, Yerba Mate ,Rich In Antioxidants, http://www.miyerbamate.com/content/Yerba%2BMate%2BRich%2Bin%2 Bantioxidants.htm , Diakses pada tanggal 19 November 2015. Mulja, M dan Suharman., 1995, Analisis Instrumental, Cetakan Pertama, Airlangga University Press, Surabaya,pp. 6-9. Mongkolsilp, S., Pongbupakit, I., Sae-Lee, N. dan Sitthithaworn, W., 2004, Radical Scavenging Activity and Total Phenolic Content of Medicinal Plants Used in Primary Health Care, SWU. J. Pharm. Sci 9: 32-35. Molyneux, P., 2004, The Use of The Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, Songklanakarin J. Sci. Technol., Vol 26, No 2, 211-219.


71

Nunes, P.,Silva, S., Almeida., J, Lima, J., Ribeiro, L., Junior, L dan Filho, J., 2012, Biological oxidation And Antioxidant Activity Of Natural Products, Universidade Federal do Vale do Sao Francisco, Brazil, pp.12. Nugraha, A.A., 2010, Kajian Kadar Kurkuminoid, Total Fenol Dan Aktivitas Antioksidan Oleoresin Temulawak (Curcuma Xanthorrhiza Roxb.) Dengan Variasi Teknik Pengeringan Dan Warna Kain Penutup, Skripsi, Fakultas Pertanian, Universitas Sebelas Maret, Surakarta. Nurhayati, Siadi, K., dan Harjono., 2012, Pengaruh Konsentrasi Natrium Benzoat Dan Lama Penyimpanan Pada Kadar Fenolat Total Pasta Tomat, Indonesia Journal of Chemical Science, 1(2) :158-163. Padmasari, P. D., Astuti, K.W., Warditiani, N. k., 2013, Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol 70% Rimpang Bangle (Zingiber purpureum Roxb.), Jurnal Farmasi Udayana, Bali,1-7. Patria, D.W., 2013, Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal 1,1-Difenil2-Pikrilhidrazil (DPPH) Dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanolik Daun Benalu (Dendrophthoe petandra L. Miq) Di Pohon Kepel (Stelechocarpus burahol (BI.) Hook.f.), Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Perwiratami, C., Suzery, M., Cahyono B., 2014, Korelasi Fenolat Total Dan Flavonoid Total Dengan Antioksidan Dari Beberapa Sediaan Ekstrak Buah Tanjung (Mimusops Elengi), Article, 34-39. Pokorny, J dan Korczak, J., 2001., Antioxidant In Food Practical Application, CRC Press. New York, Washington D.C,pp.160. Plantamor., 2012, Scurrula atropurpurea (B1.) Dans , http://www.plantamor.com/tanaman-obat/index.php?plant=1127 , diakses pada tanggal 19 november 2015. Pracaya., 2007, Hama dan Penyakit tanaman, Penebar Swadaya, Jakarta, pp.417. Prior, R, Wu, X, dan Schaich, K., 2005, Standardized Method for the Determination of Antioxidant Capacity and Phenolics in Food and Dietary Supplements, J. Agri. Food Chem, (53) 4290-4302. Raaman, N., 2006, Phytochemical Techniques, New India Publishing Agency, New Delhi, pp 9-10. Rahmawati dan Hayashi., 2012, The Effects of Batch Reactor Extraction on Antioxidant Activity from Scurulla atropurpurea, American Journal of Applied Sciences, 9 (3):337-342.


72

Ramdja, F.A., Aulia ,A.M.R., Mulya, P., 2009, Ekstraksi Kurkumin Dari Temulawak Dengan Menggunakan Etanol, No.3,Vol.6, Jurnal Teknik Kimia Fakultas Teknik Universitas Sriwijaya, Sumatera Selatan,52-58. Rohmatussolihat., 2009, Antioksidan, Penyelamat Sel-Sel Tubuh Manusia, Biotrends, Vol 4 (1): 5-7. Sahwalita dan Herdiana, N., 2015, Mengenal Nilam (Pogostemon cablin Benth.) Tanaman Perdu Penghasil Minyak Atsiri, Bioclime, Palembang,pp. 39. Samiran., 2005, Keanekaragaman Jenis Benalu dan Tumbuhan Inangnya di Kebun Raya Purwodadi, Laporan Teknik Pusat Penelitian Biologi LIPI : Daftar Isian Pelaksanaan Anggaran (DIPA) tahun anggaran 2005, Buku I, pp.274. Sarker, Satyajit D., Zahid Latif, Alexander I. Gray, Natural Products Isolation, 2006, Second edition, Humana Press Totowa, New Jersey, pp. 32. Sari, K., 2012, Data Kesetimbangan Uap-Air Dan Ethanol-Air Dari Hasil Fermentasi Rumput Gajah, Jurnal Teknik Kimia, Vol 6, No 2, Jurusan Teknik Kimia, Fakultas Teknologi Industry UPN “Veteran”, Jawa Timur, 65-69. Singh S., Gupta K., Verma A., 2013, Review On-Natural Compounds Used For Antioxidant Activity, Vol. 4, Issue.2 Research Journal of Pharmaceutical, 936-949. Sochor, J., Zitka, O., Skutkova, H., Pavlik, D., Babula, P., Krska, B., Horna, A., Adam, V., Provaznik, I., and Kizek, R., 2010, Content of Phenolic Compounds and Antioxidant Capacity in Fruits of Apricot Genotypes, Molecules, Vol 15(9), 6285-6305. Suhartono, 2008, Analisis Data Statistik dengan R, Jurusan Statistika, ITS, Surabaya, pp. 88-114. Sunarni, T., 2005, Aktivitas Antioksidan Penangkap Radikal Bebas Beberapa Kecambah Dari Biji Tanaman Familia Papilionaceae, Jurnal Farmasi Indonesia, Vol. 2, No. (2), 53-61. Surya, A.N.Y., 2013, Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal 1,1Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) Dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanolik Daun Apel Beludru (Diospyros blancoi A. DC.), Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.


73

Susanti, H dan Alfian, R., 2011, Penetapan Kadar Fenolik Total Ekstrak Metanol Kelopak Bunga Rosella Merah (Hibiscus sabdariffa Linn) Dengan Variasi Tempat Tumbuh Secara Spektrofotometri, Jurnal Ilmiah Kefarmasian, Vol.2, No.1,73-80. Triana, N.F., 2013, Uji Daya Antioksidan Menggunakan Radikal 1,1-Difenil-2Pikrilhidrazil Dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol Kulit Jeruk Nipis, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur H., 2011, Phytochemical Screening and Extraction: A Review, Vol 1, Issue.1, Int. Pharm. Sci, 1-9. Torowati dan Galuh, S.B., 2014, Penentuan Nilai Limit Deteksi dan Kuantisasi Alat Titrasi Potensiometer Untuk Analisis Uranium, Jurnal Batan, 13:915. Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M. T. D., Mazur, dan M., Telser, J., 2006, Free Radicals and Antioxidants in Normal Physiological Functions and Human Disease, Vol 39, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 39(1):44-84. Valentina, E., 2013, Daya Peredaman Radikal Bebas Ekstrak Metanol Biji Pepaya (carica papaya L.) Dengan Metode DPPH (1,1-Diphenyl-2-picryl Hydrazyl), Jurnal Ilmiah Mahasiswa,Vol 2, No 1, Universitas Surabaya, Jawa Timur. Vermerris, W., dan Nicholson, R., 2006, Phenolic Compound Biochemistry, Springer, USA, pp. 1-2. Yusoff, M.M dan Ade C.I., 2011, Comparative Evaluationof Total Phenolics and Free Radical Scavenging Activity of Aqueous Extracts of Labisia pumila var. alata from Malaysia and Indonesia, ICBFS 2011, pp. 4-8. Wachidah, N. L., 2013, Uji Aktivitas Antioksidan Serta Penentuan Kandungan Fenolat Dan Flavonoid Total Dari Buah Parijoto (Medinilla speciosa Blume), Skripsi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Program Studi Farmasi, UIN Syarif Hidayatullah, Jakarta. Widyawati, P. S, Wijaya, H. C, Harjosworo, P. S, dan Sajuthi, D., 2010, Pengaruh Ekstraksi Dan Fraksinasi Terhadap Kemampuan Menangkap Radikal Bebas DPPH (1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil) Ekstrak Dan Fraksi Daun Beluntas (Pluchea indica Less), Seminar Rekayasa Kimia Dan Proses, Jurusan Teknik Kimia Fakultas Teknik Universitas Diponegoro, Semarang ,pp.1-7.


74

Vongsak, B., Sithisarn, P., Mangmool, S., Thongpraditchote, S., Wongkrajang, Y., Gritsanapan, W., 2013. Maximizing total phenolics, total flavonoids contents and antioxidant activity of Moringa oleifera leaf extract by the appropriate extraction method, Journal of Crops and Products, 44:566-571. Willard, H. H., Lynne. L., Jhon. A., dan Frank. A., 1988. Instrumental Methods Of Analysis, edisi VII, Wadsworth Publishing Company, California,pp. 119-121. Winarsi H., 2007. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas. Yogyakarta : Kanisus, pp. 20-21.


75

Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi benalu


76

Lampiran 2. Kadar air serbuk uji


77

Lampiran 3. Gambar-gambar

Keterangan : A.)benalu, B.)pohon kemiri

Daun benalu


78

Desikator

Waterbath

Vacum rotary evaporator R-3


79

Ekstrak kental benalu kemiri. Fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri (fraksi etil asetat bagian atas/berwarna bening, fraksi air bagian bawah/berwarna cokelat).

Fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri dan wash bensin(bagian atas berupa larutan non polar seperti lemak).

etanol

daun


80

Lampiran 4 . Perhitungan Rendemen a.

Rendemen ekstral etanol Penimbangan Bobot cawan Bobot cawan+ekstrak Bobot ekstrak Bobot ekstrak total

Cawan 1 (g)

Cawan 2 (g)

65,5372

65,5411

Cawan 3 (g) 61,5412

70,5871

70,5844

65,2915

5,0438

5,0433 13,8374

3,7503

bobot daun benalu yg digunakan

Rendemen ekstrak etanol =

=90 g

Bobot ekstrak yang didapat bobot bahan yang digunakan

𝑥 100 %

b. Rendemen fraksi etil asetat Penimbangan Bobot cawan Bobot cawan+ekstrak Bobot ekstrak Bobot ekstrak total

Cawan 1 (g) 65,5372 65,9045 0,3673

Cawan 2 (g) 65,5411 65,9832 0,4421 1,024

Cawan 3 (g) 61,5412 61,7558 0,2146

bobot daun benalu yg digunakan =90 g

Bobot ekstrak yang didapat

Rendemen fraksi etil asetat = bobot bahan yang digunakan 𝑥 100 %


81

Lampiran 5 . Penimbangan uji kandungan fenolik total a.

Penimbangan asam galat

Bobot kertas kosong Bobot kertas + asam galat Bobot kertas + sisa Bobot asam galat

Optimasi 1 (g) 0,2590 0,2690 0,2590 0,0100

Optimasi 2 (g) 0,2621 0,2723 0,2621 0,0102

Optimasi 3 (g) 0,2590 0,2695 0,2592 0,0103

b. Penimbangan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri

Bobot kertas kosong Bobot kertas + fraksi Bobot kertas + sisa Bobot fraksi

Optimasi 1 (g) 0,2585 0,2688 0,2586 0,0102

Optimasi 2 (g) 0,2382 0,2485 0,2383 0,0102

Optimasi 3(g) 0,2217 0,2320 0,2219 0,0101


82

Lampiran 6. Optimasi penentuan kandungan fenolik total a. Penentuan Operating Time Asam Galat Absorbansi konsentrasi optimasi 1 pada panjang gelombang 750 nm 50 µg/mL 100 µg/mL 150 µg/mL 0,229 0,313 0,589 0,251 0,328 0,611 0,261 0,340 0,635 0,270 0,350 0,643 0,271 0,352 0,645 0,273 0,353 0,646 OT yang didapat adalah 20 menit

Waktu(menit) 5 10 15 20 25 30

Absorbansi konsentrasi optimasi 2 pada panjang gelombang 750 nm 51,0 µg/mL 102 µg/mL 153,0 µg/mL 5 0,263 0,452 0,701 10 0,284 0,484 0,711 15 0,295 0,536 0,722 20 0,300 0,539 0,730 25 0,302 0,540 0,732 30 0,303 0,543 0,734 OT yang didapat adalah 20 menit

Waktu(menit)

Absorbansi konsentrasi optimasi 3 pada panjang gelombang 750 nm Waktu(menit) 51,5 µg/mL 103,0 µg/mL 154,5 µg/mL 5 0,220 0,420 0,816 10 0,224 0,427 0,820 15 0,226 0,464 0,826 20 0,229 0,471 0,829 25 0,230 0,473 0,831 30 0,232 0,474 0,832 OT yang didapat adalah 20 menit


83

b. Penentuan Operating Time Larutan Uji Absorbansi konsentrasi 100 µg/mL pada 739 nm Optimasi 1 Optimasi 2 Optimasi 3 0,211 0,201 5 0,249 0,209 0,208 10 0,251 0,212 0,215 15 0,254 0,214 0,224 20 0,256 0,216 0,230 25 0,260 0,216 0,232 30 0,261 0,217 0,234 35 0,262 0,218 0,235 40 0,263 0,218 0,237 45 0,264 0,220 0,240 50 0,265 0,221 0,241 55 0,267 0,223 0,243 60 0,269 OT yang didapat adalah 25 menit Sampel menit

c. Penentuan λ maksimum 1. Spektra asam galat 50 μg/mL


84

2. Spektra asam galat 100 μg/mL

3. Spektra asam galat 150 μg/mL


85

Lampiran 7. Data perhitungan konsentrasi asam galat dan fraksi etil asetat untuk penetapan kandungan fenolik total A. Perhitungan konsentrasi asam galat Bobot asam galat optimasi 1 = 0,0100 g = 10,0 mg Konsentrasi larutan induk =

10,0 𝑚𝑔 10 𝑚𝑙

= 1000 µg/ml

Perhitungan seri konsentrasi optimasi 1 Seri 1 : V 1X C 1 = V 2 X C 2 0,5 mL x 1000 µg/mL = 10 mL x C 2 C 2 = 50 µg/mL Seri 2 : V 1X C 1 = V 2 X C 2 0,75 mL x 1000 µg/mL = 10 mL x C 2 C 2 = 75,0 µg/mL Seri 3 : V 1X C 1 = V 2 X C 2 1,0 mL x 1000 µg/mL = 10 mL x C 2 C 2 = 100,0 µg/mL Seri 4 : V 1X C 1 = V 2 X C 2 1,25 mL x 1000 µg/mL = 10 mL x C 2 C 2 = 125,0 µg/mL Seri 5 : V 1X C 1 = V 2 X C 2 1,5 mL x 1000 µg/mL = 10 mL x C 2 C 2 = 150,0 µg/mL


86

Konsentrasi larutan induk Optimasi 2

Optimasi 3

10,2 𝑚𝑔

10,3 𝑚𝑔

10 𝑚𝑙

= 1020 µg/ml

Seri larutan asam galat Seri 1

10 𝑚𝑙

= 1030 µg/ml

Konsentrasi larutan asam galat Optimasi 2 Optimasi 3 (µg/mL) (µg/mL) 51,0 51,5

Seri 2

76,5

77,5

Seri 3

102,0

103,0

Seri 4

127,5

128,75

Seri 5

153,0

154,5

B. Perhitungan konsentrasi fraksi etil asetat 1. Bobot fraksi etil asetat optimasi 1 = 0,0102 g = 10,2 mg Konsentrasi larutan induk =

10,2 𝑚𝑔 10 𝑚𝑙

= 1020 µg/ml

Pengenceran fraksi etil asetat optimasi 1 V 1X C 1 = V 2 X C 2 1 mL x 1020 µg/mL = 10 mL x C 2 C 2 = 102 µg/mL 2. Bobot fraksi etil asetat optimasi 2 = 0,0102 g = 10,2 mg Konsentrasi larutan induk =

10,2 𝑚𝑔 10 𝑚𝑙

= 1020 µg/ml

Pengenceran fraksi etil asetat optimasi 1 V 1X C 1 = V 2 X C 2 1 mL x 1020 µg/mL = 10 mL x C 2 C 2 = 102 µg/mL


87

3. Bobot fraksi etil asetat optimasi 3 = 0,0101 g = 10,1 mg Konsentrasi larutan induk =

10,1 𝑚𝑔 10 𝑚𝑙

= 1010 µg/ml

Pengenceran fraksi etil asetat optimasi 1 V 1X C 1 = V 2 X C 2 1 mL x 1010 µg/mL = 10 mL x C 2 C 2 = 101 µg/mL


88

1. Pengukuran seri baku konsentrasi asam galat Optimasi

1

Optimasi

2

Optimasi

3

Konsentrasi (µg/ml) 50,0 75,0 100,0 125,0 150,0 Konsentrasi (µg/ml) 51,0 76,5 102,0 127,5 153,0 Konsentrasi (µg/ml) 51,5 77,5 103,0 128,75 154,5

Absorbansi asam galat 0,283 0,385 0,470 0,577 0,685 Absorbansi asam galat 0,287 0,385 0,479 0,576 0,695 Absorbansi asam galat 0,291 0,389 0,488 0,589 0,696

a. Pengukuran sampel Digunakan persamaan y = 0,0039x+0,0860 Sampel optimasi 1 Konsentrasi sampel

= 102 µg/mL

Bobot sampel

= 0,0102 g

Absorbansi sampel

= 0,260 y = 0,0039x+0,0860 0,260 = 0,0039x+0,0860 0,260 − 0,0860 0,0039

x = 44,61 µg/mL

Persamaan regresi linier y = 0,0039x + 0,0816 r=0,9991

Persamaan regresi linier y = 0,0039x + 0,0816 r = 0,9989

Persamaan regresi linier y = 0,0039x + 0,0860 r = 0,9998


89

Kandungan fenolik total : 10 𝑚𝑙

𝑣

𝑥. 𝑚 = 0,04461 mg/mL.

0,0102 𝑔

= 43,73 mg ekivalen asam galat per g fraksi

etil asetat ekstrak etanol.

Sampel optimasi 2 Konsentrasi sampel

= 102 µg/mL

Bobot sampel

= 0,0102 g

Absorbansi sampel

= 0,261 y = 0,0039x+0,0860 0,261 = 0,0039x+0,0860 0,261−0,0860

X =

0,0039

= 44,87 µg/mL

Kandungan fenolik total : 10 𝑚𝑙

𝑣

𝑥. 𝑚 = 0,04487 mg/mL.

0,0102 𝑔


etil asetat ekstrak etanol.

Sampel optimasi 3 Konsentrasi sampel

= 101 µg/mL

Bobot sampel

= 0,0101 g

Absorbansi sampel

= 0,264 y = 0,0039x+0,0860 0,264 = 0,0039x+0,0860 x =

0,264−0,0860 0,0039

= 45,64 µg/mL


90

Kandungan fenolik total ; 𝑣

𝑥. 𝑚 = 0,04564 mg/mL etil asetat ekstrak etanol.

10 𝑚𝑙 0,0101 𝑔



91

Lampiran 8. Data penimbangan untuk pengujian aktivitas antioksidan a. Data penimbangan kuersetin

Bobot kertas kosong Bobot kertas + kuersetin Bobot kertas + sisa Bobot kuersetin

Optimasi 1 (g) 0,2633 0,2736 0,2635 0,0101

Optimasi 2 (g) 0,2667 0,2769 0,2667 0,0102

Optimasi 3(g) 0,2546 0,2647 0,2547 0,0100

b. Data penimbangan DPPH untuk penentuan OT dan pengukuran seri konsentrasi larutan uji

Bobot kertas kosong Bobot kertas + DPPH Bobot kertas + sisa Bobot DPPH

Optimasi 1 (g) 0,2482 0,2660 0,2483 0,0177

Optimasi 2 (g) 0,2480 0,2640 0,2482 0,0158

Optimasi 3(g) 0,2574 0,2734 0,2575 0,0159

c. Penimbangan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri Optimasi 1 (g) Bobot kertas kosong Bobot kertas + fraksi Bobot kertas + sisa Bobot fraksi

0,2585 0,2688 0,2586 0,0102

Optimasi 2 (g) 0,2217 0,2320 0,2219 0,0101

Optimasi 3(g) 0,2590 0,2690 0,2590 0,0100

d. Penimbangan DPPH untuk penentuan OT dan konsentrasi seri kuersetin Optimasi 1 (g) Bobot kertas kosong Bobot kertas + DPPH Bobot kertas + sisa Bobot kuersetin

0,2760 0,2920 0,2761 0,0159

Optimasi 2 (g) 0,2506 0,2664 0,2506 0,0158

Optimasi 3(g) 0,2623 0,2783 0,2623 0,0160


92

Lampiran 9. Data perhitungan konsentrasi larutan pembanding, larutan uji, dan DPPH A. Contoh perhitungan konsentrasi larutan pembanding (kuersetin) Bobot Kuersetin optimasi 1 = 0,0101 g = 10,1 mg Konsentrasi larutan induk =

10,1 𝑚𝑔 10 𝑚𝑙

= 1010 µg/ml

Perhitungan seri konsentrasi optimasi 1 Konsentrasi larutan induk intermediet : V 1X C 1 = V 2 X C 2 1 mL x 1010 µg/mL = 10 mL x C 2 C 2 = 101 µg/mL Konsentrasi larutan pembanding seri 1 : V 1X C 1= V 2 X C 2 0,5 mL x 101 µg/mL = 10 mL x C 2 C 2 = 5,05 µg/mL Konsentrasi larutan pembanding seri 2 : V 1X C 1 = V 2 X C 2 0,75 mL x 101 µg/mL = 10 mL x C 2 C 2 = 7,58 µg/mL Konsentrasi larutan pembanding seri 3 : V 1X C 1 = V 2 X C 2 1,0 mL x 101 µg/mL = 10 mL x C 2 C 2 = 10,10 µg/mL Konsentrasi larutan pembanding seri 4 : V 1X C 1 = V 2 X C 2 1,25 mL x 101 µg/mL = 10 mL x C 2


93

C 2 = 12,63 µg/mL Konsentrasi larutan pembanding seri 5 : V 1X C 1 = V 2 X C 2 1,5 mL x 101 µg/mL = 10 mL x C 2 C 2 = 15,15 µg/mL Konsentrasi larutan induk Optimasi 2

Optimasi 3

10,2 𝑚𝑔

10,0 𝑚𝑔

10 𝑚𝑙

Seri larutan kuersetin

= 1020 µg/ml

10 𝑚𝑙

= 1000 µg/ml

Konsentrasi larutan pembanding kuersetin Optimasi 2 (µg/mL)

Optimasi 3 (µg/mL)

Seri 1

51,0

5,0

Seri 2

7,65

7,5

Seri 3

10,20

10,0

Seri 4

12,75

12,5

Seri 5

15,30

15,0

B. Contoh perhitungan konsentrasi larutan uji Bobot Kuersetin optimasi 1 = 0,0102 g = 10,2 mg Konsentrasi larutan induk =

10,2 𝑚𝑔 10 𝑚𝑙

= 1020 µg/ml

Perhitungan seri konsentrasi optimasi 1 Konsentrasi larutan induk intermediet : V 1X C 1 = V 2 X C 2


94

1 mL x 1020 µg/mL = 10 mL x C 2 C 2 = 102 µg/mL Konsentrasi larutan uji seri 1 : V 1X C 1= V 2 X C 2 0,75 mL x 102 µg/mL = 10 mL x C 2 C 2 = 7,65 µg/mL Konsentrasi larutan uji seri 2 : V 1X C 1 = V 2 X C 2 1,0 mL x 102 µg/mL = 10 mL x C 2 C 2 = 10,20 µg/mL Konsentrasi larutan uji seri 3 : V 1X C 1 = V 2 X C 2 1,25 mL x 102 µg/mL = 10 mL x C 2 C 2 = 12,75 µg/mL Konsentrasi larutan uji seri 4 : V 1X C 1 = V 2 X C 2 1,5 mL x 102 µg/mL = 10 mL x C 2 C 2 = 15,30 µg/mL Konsentrasi larutan uji seri 5 : V 1X C 1 = V 2 X C 2 1,75 mL x 102 µg/mL = 10 mL x C 2 C 2 = 17,85 µg/mL


95

Konsentrasi larutan induk Optimasi 2 10,1 𝑚𝑔 10 𝑚𝑙

Optimasi 3

= 1010 µg/ml

10,0 𝑚𝑔 10 𝑚𝑙

= 1000 µg/ml

Konsentrasi larutan uji Optimasi 2 Optimasi 3 (µg/mL) (µg/mL) 7,57 7,50

Seri larutan kuersetin Seri 1 Seri 2

10,10

10,0

Seri 3

12,62

12,5

Seri 4

15,15

15,0

Seri 5

17,67

17,5

C. Konsentrasi DPPH untuk pengukuran aktivitas kuersetin 1. Optimasi 1 BM = 394,33 Mol =

M

=

massa BM Mol volume

= =

15,9 mg 394,33

= 0,0455 mmol

0,0455 mmol 0,1 L

= 0,4550 mM

2. Optimasi 2 BM = 394,33 Mol =

M

=

𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝐵𝑀 𝑀𝑜𝑙 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒

= =

15,8 𝑚𝑔 394,33

= 0,0401 mmol

0,0401 𝑚𝑚𝑜𝑙 0,1 𝐿

= 0,4010mM


96


M

=

massa BM Mol

volume

= =

16 mg 394,33

= 0,0406 mmol

0,0406 mmol 0,1 L

= 0,4060 mM

D. Konsentrasi DPPH untuk pengukuran aktivitas larutan uji 1. Optimasi 1 BM = 394,33 Mol = M

=

massa BM Mol volume

= =

15,9 mg 394,33

= 0,0403 mmol

0,0403 mmol 0,1 L

= 0,403 mM

2. Optimasi 2 BM = 394,33 Mol = M

=

massa BM Mol volume

= =

15,8 mg 394,33

= 0,0401 mmol

0,0401 mmol 0,1 L

= 0,4010 mM


M

=

massa BM Mol volume

= =

15,9 mg 394,33

= 0,0403 mmol

0,0403 mmol 0,1 L

= 0,403 mM


97

Lampiran 10. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan a.

Penentuan λ maksimum 1. Scanning DPPH 0,020 mM

2. Scanning DPPH 0,040 mM


98

3. Scanning DPPH 0,060 mM

4. Plot scanning lamda max


99

b. Penentuan Operating Time 1. Penentuan OT kuersetin Waktu (menit)

Absorbansi konsentrasi Optimasi 1 pada 515 nm 5 µg/ml

10 µg/ml

15 µg/ml

5

0,508

0,462

0,354

10

0,506

0,452

0,341

15

0,503

0,443

0,330

20

0,499

0,434

0,316

25

0,494

0,426

0,313

30

0,491

0,399

0,300

35

0,491

0,398

0,300

40

0,489

0,397

0,298

45

0,488

0,396

0,296

50

0,486

0,394

0,295

0,391 0,388

0,293 0,290

55 0,484 60 0,481 OT optimasi 1 di menit ke- 25


100

Waktu (menit)

Absorbansi OT kuersetin Optimasi 2 pada panjang gelombang 515 nm 5 µg/ml

10 µg/ml

15 µg/ml

5

0,511

0,342

0,219

10

0,508

0,331

0,218

15

0,505

0,327

0,217

20

0,501

0,324

0,216

25

0,501

0,320

0,215

30

0,501

0,317

0,213

35

0,502

0,314

0,209

40

0,502

0,313

0,209

45

0,502

0,311

0,208

50

0,501

0,308

0,208

55

0,501

0,306

0,207

0,304

0,206

60 0,501 OT optimasi 2 di menit ke- 25


101

Waktu (menit)

Absorbansi OT kuersetin Optimasi 3 pada panjang gelombang 515 nm 5 µg/ml 10 µg/ml 15 µg/ml

5

0,607

0,333

0,244

10

0,596

0,332

0,242

15

0,591

0,330

0,239

20

0,588

0,329

0,236

25

0,585

0,328

0,231

30

0,582

0,315

0,227

35

0,581

0,314

0,222

40

0,579

0,313

0,222

45

0,577

0,311

0,220

50

0,576

0,308

0,219

55

0,573

0,308

0,219

0,307

0,217

60 0,571 OT optimasi 3 di menit ke- 35

2. Penentuan OT fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri Absorbansi konsentrasi optimasi 1 pada λ 515 Sampel menit 7,65 µg/mL 12,75 µg/mL 17,85 µg/mL 5 0,643 0,480 0,434 10 0,640 0,478 0,428 15 0,638 0,474 0,415 20 0,630 0,462 0,398 25 0,631 0,463 0,399 30 0,631 0,464 0,398 35 0,629 0,463 0,397 40 0,628 0,462 0,396 45 0,630 0,462 0,395 50 0,628 0,459 0,395 55 0,627 0,459 0,393 60 0,626 0,458 0,391 OT optimasi 1 di menit ke- 20


102

Absorbansi konsentrasi optimasi 2 pada λ 515 7,65 µg/mL 12,75 µg/mL 17,85 µg/mL 5 0,542 0,448 0,359 10 0,538 0,440 0,354 15 0,528 0,435 0,349 20 0,517 0,425 0,347 25 0,515 0,424 0,345 30 0,514 0,423 0,344 35 0,512 0,422 0,343 40 0,510 0,422 0,342 45 0,509 0,420 0,340 50 0,508 0,418 0,338 55 0,506 0,416 0,337 60 0,504 0,415 0,335 OT optimasi 2 di menit ke- 20

Sampel menit

Sampel menit 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Absorbansi konsentrasi optimasi 3 pada λ 515 7,65 µg/mL 12,75 µg/mL 17,85 µg/mL 0,501 0,412 0,359 0,497 0,407 0,349 0,489 0,402 0,338 0,479 0,399 0,330 0,478 0,399 0,329 0,478 0,398 0,328 0,477 0,397 0,327 0,476 0,395 0,326 0,474 0,394 0,325 0,473 0,392 0,323 0,472 0,391 0,320 0,471

OT optimasi 3 di menit ke- 20

0,390

0,318


103

Lampiran 11. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH %IC =

Abrorbansi (larutan kontrol)−Absorbansi sampel (larutan pembanding \ uji) Absorbansi (larutan kontrol)

x 100 %

1. Kuersetin Optimasi

1

Optimasi

2

Optimasi

3

Konsentrasi (µg/mL) 5,05 7,58 10,10 12,63 15,15 Konsentrasi (µg/mL) 5,10 7,65 10,20 12,75 15,30 Konsentrasi (µg/mL) 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0

Absorbansi Absorbansi % IC control kuersetin 0,495 30,28 0,431 39,30 0,710 0,395 44,37 0,333 53,10 0,285 59,86 Absorbansi Absorbansi % IC kontrol kuersetin 0,505 31,11 0,455 37,93 0,733 0,320 56,34 0,265 63,85 0,206 71,80 Absorbansi Absorbansi % IC kontrol kuersetin 0,696 8,54 0,589 22,60 0,761 0,488 35,87 0,389 48,88 0,291 61,76

Persamaan regresi linier y =2,8896x+16,190 r = 0,9973 Persamaan regresi linier y = 4,2078x+9,286 r = 0,9855 Persamaan regresi linier y= 5,3088x+17,558 r = 0,9998

Contoh perhitungan % IC optimasi 1 % IC konsentrasi 5,05 µg/mL = % IC konsentrasi 10 µg/mL

=

0,710 0,710−0,431

% IC konsentrasi 12,5 µg/mL = % IC konsentrasi 15,5 µg/mL = % IC konsentrasi 17,5 µg/mL =

0,710−0,495

0,710 0,710−0,395 0,710 0,710−0,333 0,710 0,710−0,285 0,710

x 100 %

= 30,28 %

x 100 %

= 39,30 %

x 100 %

= 44,37 %

x 100 % = 53,10 % x 100 % = 59,86

%


104

2. Fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri

Optimasi

1

Optimasi

2

Konsentrasi Absorbansi Absorbansi % IC (µg/mL) kontrol larutan uji 7,65

0,623

29,44

10,20

0,573

35,10

0,468

47,0

12,75

0,883

3

Y =3,5925x + 0,871 r =0,9919

15,30 58,09 0,370 17,85 0,320 63,75 Konsentrasi Absorbansi Absorbansi

(µg/mL)

kontrol

larutan uji 0,615

29,71

10,10

0,539

38,40

0,478

45,37

0,398

54,51

12,62

0,875


% IC

7,57

15,15

Optimasi


Y =3,4174x + 3,423 r =0,9978

17,67 0,308 64,80 Konsentrasi Absorbansi Absorbansi

(µg/mL)

kontrol

larutan uji

7,5

0,598

31,96

10,0

0,570

35,15

0,458

47,89

0,396 0,355

54,94 59,61

12,50

0,879

15,0 17,50


% IC

Y =3,0036x + 8,365 r =0,9829

Contoh perhitungan % IC optimasi 1 % IC konsentrasi 7,65 µg/mL = % IC konsentrasi 10,2 µg/mL =

0,883−0,623 0,883 0,883−0,573

% IC konsentrasi 12,75 µg/mL = % IC konsentrasi 15,3 µg/mL = % IC konsentrasi 17,85 µg/mL =

x 100 % = 29,44 % x 100 % = 35,10 %

0,883 0,883−0,468 0,883 0,883−0,370 0,883 0,883−0,320 0,883

x 100 % = 47,0 % x 100 %

=58,09 %

x 100 % = 63,75 %


105

Lampiran 12. Perhitungan nilai IC50 kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri 1. Kuersetin Optimasi 1 Persamaan regresi linier: y = 2,8896x+16,1909 (y = aktivitas antioksidan, x = kadar kuersetin dalam µg/mL) IC50 adalah nilai x saat y = 50 50 = 2,8896x+16,1909 x =

50−16,1909 2,8896

= 11,70 µg/mL

Optimasi

Persamaan

IC50 (µg/mL)

II

y = 4,2078x+9,286

9,67 µg/mL

III

y = 5,3088x+17,558

6,11 µg/mL

2. Fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu kemiri Optimasi 1 Persamaan regresi linier : y = 3,5925x + 0,871 (y = aktivitas antioksidan, x = kadar fraksi dalam µg/mL) IC50 adalah nilai x saat y = 50 50 = 3,5925x + 0,871 𝑥=

Optimasi II III

50−0,871 3,5925

= 13,67 µ𝑔/𝑚𝐿

Persamaan y = 3,4174x + 3,423 y = 3,0036x + 8,365

IC50 ( µg/mL) 13,62 13,86


106

Optimasi I II III Optimasi I II III

Kuersetin IC50 Rata-rata (µg/mL) (µg/mL) 11,70 9,67 9,16 6,11 Fraksi etil asetat IC50 Rata-rata (µg/mL) (µg/mL) 13,67 13,62 13,71 13,86

SD 2,82

SD 0,12


107

BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode Radikal DPPH (1,1Difenil-pikrilhidrazil)

Dan

Penetapan

Kadar

Fenolik Total Fraksi Etil Asetat Benalu (Scurrula atropurpurea (B1.) Dans) Dari Pohon Kemiri (aleurites moluccana (L.) Willd)” memiliki nama lengkap Yonas Sinseng. Penulis lahir pada tanggal 9 Januari 1993, di Palangkaraya, Kalimantan Tengah. Penulis merupakan anak pertama dari pasangan Fengky Sinseng dan Elia Satriani. Penulis menyelesaikan Sekolah Dasar di SD Buntok 4 pada bulan juli tahun 1999 dan lulus pada bulan juni tahun 2005. Kemudian penulis melanjutkan pendidikan di SMP 2 Dusun Selatan pada bulan juli tahun 2005 dan tamat pada bulan juni 2008. Penulis melanjutkan pendidikannya di SMA Negeri 1 Dusun Selatan pada juli 2008 dan lulus mei 2011. Setelah tamat SMA, penulis diterima di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Selama perkuliahan, penulis mengikuti beberapa kepanitiaan tingkat fakultas, diantaranya panitia Desa mitra (2012 dan 2013), dan panitia donor darah JMKI.

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2016

Recommend Documents