Expressie van Nictaba in Bright Yellow-2 celculturen

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT LANDBOUWKUNDIGE EN TOEGEPASTE BIOLOGISCHE WETENSCHAPPEN ____________________

Academiejaar 2003 - 2004

Expressie van Nictaba in Bright Yellow-2 celculturen

Bram HERMAN

Promotor: Prof. dr. Els J. M. Van Damme

Scriptie voorgedragen tot het behalen van de graad van BIO-INGENIEUR IN DE CEL- EN GENBIOTECHNOLOGIE

De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze scriptie.

The author and the promotor give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified when using results from this thesis.

Gent, mei 2004

De promotor,

Prof. dr. Els J.M. Van Damme

De auteur,

Bram Herman

Woord Vooraf

Deze thesis zou niet tot stand gekomen zijn zonder de steun van een aantal mensen die ik hier graag zou willen bedankten.

 Prof. Els Van Damme, bedankt voor de kans die ik gekregen heb om ervaring op te doen over moleculaire biotechnologie en de praktische uitvoering hiervan en voor de begeleiding tijdens deze thesis.

 Nausicaä, bedankt voor de vele, vele uren die je in mij en mijn thesis geïnvesteerd hebt. Voor de ontelbare keren dat je iets aan mij uitgelegd hebt. Zonder jouw begeleiding zou deze thesis heel wat minder ‘vlot’ verlopen zijn.  De medethesisstudenten op Glyco. Willem, Anneleen en Dries, bedankt voor de hulp tijdens de drukke en de moeilijke momenten die tijdens deze thesis voorgekomen zijn en de toffe collega’s die jullie zijn. Anneleen, bedankt voor de aanwezigheid, toen we eens opgesloten waren in een labo terwijl we fragmenten uit een DNA-agarosegel aan het isoleren waren. Prof. Els Van Damme, bedankt om ons dan te komen ‘bevrijden’.  De personeelsleden van de vakgroep Moleculaire Biotechnologie. Bedankt voor de raad die jullie mij gegeven hebben en de aangename sfeer die er op het labo heerste.  Mijn ouders. Bedankt voor de warme ‘thuis’ die ik ieder weekend mocht ondervinden en voor de steun tijdens de vele moeilijke momenten die ik tijdens mijn studies en thesis gehad heb.

Bram Herman Gent, mei 2004

Samenvatting In tegenstelling tot de extracten van bladeren van onbehandelde tabaksplanten wordt een agglutinerende activiteit vastgesteld in de extracten van bladeren van tabaksplanten die gedurende 3 dagen behandeld worden met methyljasmonaat. Het Nicotiana tabacum agglutinine (Nictaba) blijkt verantwoordelijk te zijn voor deze agglutinerende activiteit. Dit lectine is één van de recent ontdekte induceerbare plantlectinen die een mogelijke endogene functie hebben. Tijdens deze thesis werd de lokalisatie en expressie van Nictaba onderzocht. De coderende sequentie (CDS) van ‘wild-type’ (WT) Nictaba en de coderende sequenties van mutante Nictaba constructen werden via het Gateway

TM

systeem in vectoren gekloneerd. Door deze klonering werden de constructen verbonden met de CDS van EGFP die reeds in de vectoren aanwezig was. Hierdoor zullen de constructen in plantencellen als een EGFP-fusie-eiwit tot expressie kunnen komen. De bekomen expressievectoren werden via ‘particle bombardment’ in ‘Bright Yellow’-2 (BY-2) of in ajuin epidermiscellen getransformeerd. Via een confocale fluorescentie laser scanning microscoop kon de expressie en lokalisatie van de EGFPfusie-eiwitten bestudeerd worden.

Een eerste construct werd opgebouwd door de CDS van WT Nictaba in een vector te kloneren. De bekomen expressievector werd in BY-2 cellen getransformeerd. Vanaf 24 h na de transformatie werd fluorescentie gedetecteerd in de kern, rond de kern en in cytoplasmatische strengen van transgene BY-2 cellen. Na 40 h werd geen fluorescentie meer gedetecteerd in de kern doch wel rond de kern en in het cytoplasma wat erop wees dat er een mogelijke migratie van het EGFP-fusieproduct plaatsvond. Een volgend construct werd aangemaakt door een mutatie in het vermoedelijke nucleair lokalisatie signaal (NLS) van Nictaba aan te brengen. Dit construct werd in een vector gekloneerd waarna de bekomen expressievector in BY-2 cellen getransformeerd werd. In de getransformeerde cellen werd fluorescentie gedetecteerd in cytoplasmatische strengen en rond de kern. Het verschil in lokalisatie tussen beide constructen bevestigde de functionaliteit van het NLS in de CDS van WT Nictaba. Vervolgens werden twee constructen aangemaakt waarbij de CDS van WT Nictaba geligeerd werd aan: 1) de signaalsequentie van sporamine voor vacuolaire ‘targeting’ of 2) de signaalsequentie van rubisco voor chloroplast ‘targeting’. Door Nictaba naar de vacuole of naar de chloroplasten te sturen kan het lectine geen invloed meer uitoefenen op het celmetabolisme. Enkel het construct met het vacuolaire ‘targeting’ signaal (VTS) vertoonde expressie in transgene BY-2 cellen. Er werd fluorescentie gedetecteerd in prevacuolaire structuren en het ER van transgene BY-2 cellen. Om de invloed van het NLS op het VTS te controleren werd een volgend construct aangemaakt waarbij de CDS van de Nictaba NLS mutant geligeerd werd aan de CDS van dit VTS. Dit construct kwam echter niet tot expressie in transgene BY-2 cellen of transgene ajuin epidermiscellen.

Summary

In contrast to the extracts of leaves of untreated tobacco plants, extracts of leaves of tobacco plants that were treated with jasmonic acid methyl ester (JAME) for 3 days clearly show agglutinating activity, due to expression of the Nicotiana tabacum agglutinin (also called Nictaba). This lectin is one of the recently discovered inducible plant lectins that possibly play a role in cell signalling in plant cells. The localisation and expression of Nictaba will be examined during this thesis. The coding sequence (CDS) of wild-type (WT) Nictaba and the coding sequences of mutant Nictaba constructs were cloned in vectors through the use of the Gateway TM technology. During this cloning, the constructs were fused with the CDS of EGFP that was already present in the vector. This makes it possible for the constructs to be expressed in transgenic plant cells as EGFP-fusion proteins. The obtained expression vectors were transformed in Bright-Yellow 2 (BY-2) cells or onion epidermal cells using particle bombardment. Confocal fluorescence laser scanning microscopy was performed to study the expression and localisation of the EGFP-fusion-proteins.

A first construct was built by cloning the WT Nictaba CDS into a vector. The obtained expression vector was then transformed in BY-2 cells. Approximately 24 h after the transformation fluorescence was detected in the cytoplasm, around the nucleus and in the nucleus of transformed BY2 cells. After 40 h no more fluorescence was detected in the nucleus though fluorescence was still clearly visible around the nucleus and in the cytoplasm what indicated a possible migration of the EGFP-fusion-product. A second construct was made by introducing a mutation in the putative nuclear localisation signal of Nictaba. This construct was then cloned into a vector whereupon the obtained expression vector was transformed in BY-2 cells. Fluorescence was detected in the cytoplasm and around the nucleus of transformed cells. The difference in localisation between these two constructs confirmed the functionality of the NLS in the CDS of WT Nictaba. Two more constructs were made by fusing the WT Nictaba CDS to: 1) the sequence of the sorting signal of sporamin for vacuolar targeting or 2) the sequence of the sorting signal of rubisco for chloroplast targeting. Expression of Nictaba in the vacuole or the chloroplast will clearly interfere with the role of Nictaba in the cytoplasm. Only the construct with the vacuolar targeting signal showed expression in transgenic BY2 cells. Fluorescence was detected in prevacuolar compartments and in the ER of transgenic BY-2 cells. Finally one construct was made by fusing the CDS of the Nictaba NLS mutant tot the CDS of this VTS to study the possible interactions of the NLS and the VTS. However, no expression was detected after transformation of this construct in BY-2 cells or in onion epidermal cells.

Inhoudsopgave DEEL 1. 1.1

LITERATUURSTUDIE................................................................ ..................................................1 L ECTINEN ...............................................................................................................................................1

1.1.1

Lectinen: definities en indeling................................ ..........................................................................1

1.1.2

Functies van lectinen .........................................................................................................................8

1.1.3 1.2

Induceerbare lectinen ......................................................................................................................10 HET JASMIJNZUUR -INDUCEERBARE TABAKSLECTINE NICTABA ............................................................11

1.2.1

Inductie en fysiologische eigenschappen van Nictaba.....................................................................11

1.2.2

Sequentie-analyse, agglutinatie eigenschappen en homologie van Nictaba in andere planten ......12

1.2.3

Mogelijke functies van Nictaba .......................................................................................................14

DEEL 2.

DOELSTELLINGEN....................................................................................................................16

DEEL 3.

MATERIAAL EN METHODEN ................................................................................................. 18

3.1

P LANTMATERIAAL................................ ................................................................................................ 18

3.1.1

De ‘Bright Yellow- 2’ celsuspensiecultuur ......................................................................................18

3.1.2

Onderhoud van de celcultuur .......................................................................................................... 18

3.1.3 3.2

Ajuin epidermiscellen ......................................................................................................................19 HET GATEWAYTM KLONERINGSSYSTEEM..............................................................................................20

3.2.1

Het GatewayTM systeem: theoretisch ...............................................................................................20

3.2.2

Het GatewayTM systeem: praktisch.................................................................................................. 24

3.3

P LASMIDE MATERIAAL, NICTABA- EN SIGNAALSEQUENTIES................................................................. 26

3.4

B ACTERIËLE STAMMEN......................................................................................................................... 27

3.5

B ACTERIËLE TRANSFORMATIE ..............................................................................................................28

3.5.1

‘Heat-shock’ transformatie..............................................................................................................28

3.5.2

Elektroporatie.................................................................................................................................. 28

3.6

OPZUIVEREN VAN PLASMIDEN UIT BACTERIËN .....................................................................................29

3.7

DNA- AGAROSEGELELEKTROFORESE ...................................................................................................30

3.8

‘P OLYMERASE CHAIN REACTION’ (PCR) ..............................................................................................30

3.9

KOLONIE - PCR .....................................................................................................................................32

3.10

‘P ARTICLE BOMBARDMENT ’................................................................................................................. 33

3.10.1

Algemeen.....................................................................................................................................33

3.10.2

Voorbereiding van de plantencellen ...........................................................................................34

3.10.3

Voorbereiding van de microcarriers...........................................................................................35

3.10.4

Coaten van DNA op de microcarriers......................................................................................... 35

3.10.5

Transformatie ..............................................................................................................................36

I

3.11

C ONFOCALE MICROSCOPIE EN FOTOBEWERKING ..................................................................................36

3.12

M EDIA, BUFFERS EN OPLOSSINGEN .......................................................................................................37

3.12.1

Murasige-Skoog medium (MS medium) ......................................................................................37

3.12.2

Vitamine stock (1000x) BY-2 celcultuur: ....................................................................................38

3.12.3

Luria Bertani (LB)- medium: ......................................................................................................38

3.12.4

Buffers voor plasmide DNA isolatie met behulp van zelf bereide oplossingen ...........................39

3.12.5

Tris-acetaat EDTA –buffer (TAE) ...............................................................................................39

3.12.6

Agarosegel ladingsbuffer ............................................................................................................39

3.12.7

DNA-referentie ladder ................................................................ ................................................39

DEEL 4.

RESULTATEN ..............................................................................................................................40

4.1

VRIJ EGFP ...........................................................................................................................................40

4.2

NICTABA -EGFP ...................................................................................................................................41

4.3

NICTABA GEMUTEERD TER HOOGTE VAN HET NUCLEAIR LOKALISATIESIGNAAL .................................. 43

4.3.1

Aanmaak van het attB-PCR product: theoretisch............................................................................45

4.3.2

Aanmaak van het attB-PCR-product: praktisch ..............................................................................47

4.3.3

De BP-reactie.................................................................................................................................. 49

4.3.4

De LR-reactie .................................................................................................................................. 52

4.3.5

De lokalisatie van Nictaba-EGFP, waarbij Nictaba gemuteerd is in de NLS sequentie................. 52

4.4

NICTABA NLS MUTANT GEKOPPELD AAN EEN VACUOLAIR ‘TARGETING’ SIGNAAL ..............................54

4.4.1


4.4.2


4.4.3

De BP-reactie.................................................................................................................................. 61

4.4.4

De LR- reactie ................................................................................................................................. 62

4.4.5

De lokalisatie van Nictaba-EGFP, voorzien van het sporamine VTS .............................................63

4.5

NICTABA GEKOPPELD AAN EEN CHLOROPLAST ‘TARGETING ’ SIGNAAL ................................................. 63

4.5.1


4.5.2


4.5.3

De BP-reactie.................................................................................................................................. 70

4.5.4

De LR-reactie .................................................................................................................................. 72

4.5.5

De lokalisatie van Nictaba-EGFP, voorzien van het rubisco CTS..................................................73

DEEL 5.

DISCUSSIE EN ALGEMEEN BESLUIT ...................................................................................74

DEEL 6.

LITERATUURLIJST ...................................................................................................................78

II

Lijst met afkortingen

bp

basenparen

BY-2

‘Bright Yellow’-2

Con A

Concanavalin A

CDS

coderende sequentie

CFLSM

confocale fluorescentie laser ‘scanning’ microscoop

CTS

chloroplast ‘targeting’ signaal

E. coli.

Escherichia coli

EDTA

ethylenediamine tetraacetic ‘acid’

ER

endoplasmatisch reticulum

Formatted: Dutch (Belgium)

Galβ(1,3)GalNAc galactoseβ (1, 3)N-acetylgalactosamine GlcNAc

N-acetylglucosamine

GNA

Galanthus nivalis agglutinine

GFP

‘green fluorescent protein’

JAME

methyljasmonaat

LB

Luria-Bertani

MS

Murashige-Skoog

NA

numerieke apertuur

Nictaba

Nicotiana tabacum agglutinine

NLS

nucleair lokalisatiesignaal

nt

nucleotiden

p35S

35S promotor

PAG

polynucleotide-adenosineglycosidase

PCR

‘polymerase chain reaction’

RIP

ribosoom inactiverend proteïne

T35S

35S terminator

TAE

Tris-acetaat EDTA

VTS

vacuolair ‘targeting’ signaal

WGA

‘wheat germ agglutinin’

Formatted: English (U.K.)

Naamgeving van de elementen in de vectoren naar Karimi et al., 2002  ∆NG

coderende sequentie van Nictaba gemuteerd ter hoogte van het NLS

 2

p35S

 7

T35S

 chl

chloroplast ‘targeting’ signaal

 F

GFP

 K

pnos-kan-tnos

 NG

CDS van WT Nictaba

 P

pPZP200

 WG

attR2, ccdB, CmR, attR1 orientatie van de recombinatie cassette

 vac

vacuolair ‘targeting’ signaal

Literatuurstudie

Deel 1. Literatuurstudie 1.1 Lectinen 1.1.1

Lectinen: definities en indeling

De geschiedenis van plantlectinen gaat terug tot 1888 toen Stillmark in zijn werk ‘Über Ricin ein giftiges Ferment aus den Samen von Ricinus communis L. Und einigen anderen Euphorbiaceen’ schreef dat de zaden van de wonderboom ( Ricinus communis) een eiwitachtige factor bevatten die rode bloedcellen kon agglutineren. Deze factor werd ricine genoemd. Deze ontdekking was een mijlpaal in de geschiedenis van de biochemie omdat ricine het eerste planteiwit was met een duidelijk gedefinieerde biologische activiteit (Stillmark, 1888). Elfstrand introduceerde in 1898 de term Blutkörperchenagglutinin (hemagglutinine) voor alle planteiwitten die rode bloedcellen konden aggregeren (Elfstrand, 1898). Toen men niet-toxische hemagglutininen vond bij onder andere Phaseolus vulgaris (boon) en Pisum sativum (erwt) werd het idee dat hemagglutininen per definitie toxisch moeten zijn verlaten. Er heerste lange tijd onduidelijkheid over de juiste naamgeving van deze eiwitten omdat men ze benoemd had voor men het eigenlijke werkingsmechanisme kende. De term hemagglutinine is wat ongelukkig gekozen omdat deze eiwitten ook andere cellen dan rode bloedcellen kunnen agglutineren indien ze bepaalde koolhydraten bevatten op hun oppervlak. Toen men merkte dat sommige hemagglutininen een duidelijke voorkeur voor een specifieke bloedgroep van menselijke erytrocyten hebben, werd de term ‘lectine’ ingevoerd. Deze benaming is afkomstig van het Latijnse ‘legere’ wat selecteren betekent. Het is pas vanaf het moment dat men inzag dat de agglutinatie-eigenschappen van lectinen gebaseerd zijn op een specifieke koolhydraat-bindende activiteit dat men deze lectinen kon onderscheiden van andere eiwitten volgens goed gedefinieerde criteria (Van Damme et al., 1998). De indeling volgens koolhydraat-bindende activiteit in plaats van (hem)agglutinerende activiteit zorgde voor veranderingen in het classificatiesysteem voor lectinen. Volgens een eerste definitie die rekening hield met de koolhydraat-bindende activiteit zijn lectinen (glyco)proteïnen van niet-immunogene oorsprong die cellen agglutineren en/of glycoconjugaten precipiteren (Goldstein et al., 1980). Deze definitie omvatte enkel de multivalente koolhydraatbindende eiwitten. In 1983 werd de definitie uitgebreid zodat ook de zwakke agglutinerende toxinen zoals ricine als lectine herkend werden. Toen bleek dat sommige lectinen ook een tweede bindingsplaats bevatten die kan reageren met niet-koolhydraatliganden werden lectinen omschreven als koolhydraat-bindende eiwitten die geen antilichamen of enzymen zijn (Barondes, 1988). Nieuwe gegevens toonden aan dat bepaalde plantenzymen zoals de type 2 ribosoom-inactiverende eiwitten en

1

Literatuurstudie de klasse I chitinasen fusie-eiwitten zijn die bestaan uit een koolhydraat-bindend domein dat in tandem gebonden is met een katalytisch domein. Daarom werd de definitie opnieuw aangepast zodat ook bepaalde enzymen tot de lectinen konden behoren (Peumans & Van Damme, 1995b). Tot nu toe zijn ongeveer 300 verschillende plantlectinen geïsoleerd en gekarakteriseerd voor hun moleculaire structuur, biochemische eigenschappen, koolhydraat-bindende eigenschappen en biologische activiteit. Op basis van de globale structuur zijn lectinen momenteel ingedeeld in vier grote klassen. Een eerste klasse bevat de merolectinen. Dit zijn eiwitten die één koolhydraat-bindend domein bevatten. Ze zijn dus monovalent, precipiteren bijgevolg geen glycoconjugaten en agglutineren geen cellen. Hololectinen bestaan uitsluitend uit koolhydraat-bindende domeinen en bevatten tenminste twee identieke of zeer homologe koolhydraat-bindende domeinen. Lectinen die tot deze tweede klasse behoren zijn per definitie divalent of multivalent, ze agglutineren cellen en/of precipiteren glycoconjugaten. Andere bevatten twee of meer koolhydraat-bindende domeinen die structureel verschillende koolhydraten herkennen. Om dit derde type van lectinen te onderscheiden van de hololectinen worden ze superlectinen genoemd. Fusie-eiwitten die één of meerdere koolhydraatbindende domeinen bevatten die in tandem gelinkt zijn met een onverwant domein worden chimerolectinen genoemd. Dit onverwante domein kan een specifieke enzymatische of andere biologische activiteit hebben, maar moet onafhankelijk van het koolhydraat-bindende domein werken. Chimerolectinen gedragen zich afhankelijk van het aantal koolhydraat-bindende domeinen als merolectinen of hololectinen (Van Damme et al., 1998). In Figuur 1.1 worden de vier verschillende klassen van lectinen schematisch weergegeven.

Figuur 1.1 Schematische voorstelling van de 4 klassen van lectinen (bron: Van Damme et al. 1998, aangepast)

2

Literatuurstudie Volgens het voorgaande classificatiesysteem worden plantlectinen ingedeeld op basis van hun koolhydraat-bindende eigenschappen. Deze aanpak geeft echter geen informatie over structurele en evolutieve verwantschappen tussen verschillende plantlectinen. Ontwikkelingen in klonering en structuuranalyse (vb. X-straal diffractie) hebben voor een classificatiesysteem gezorgd waarbij plantlectinen in zeven structureel en evolutief verwante eiwitfamilies ingedeeld worden. Binnen elke lectinefamilie is de algemene opvouwing en structuur van het koolhydraat-bindend domein geconserveerd. Deze lectinefamilies zijn de amaranthinen, de chitine-bindende lectinen met heveïne domeinen, de floëemlectinen van de Cucurbitaceae, de jacaline- verwante lectinen, de lectinen van de vlinderbloemigen, de monocotyle-mannose bindende lectinen en de type-twee ribosoom-inactiverende eiwitten. In volgende paragrafen wordt elk van de zeven families kort besproken.

-

Amaranthinen Een eerste lectine uit deze familie werd gevonden in zaden van Amaranthus caudatus

(kattenstaart, amarant) en kreeg daardoor de naam Amaranthine. Alle amaranthinen zijn homodimere eiwitten die bestaan uit identieke niet-geglycosyleerde subeenheden die ongeveer 33 kDa groot zijn. Amaranthine bestaat uit 299 aminozuurresiduen en de protomeren zijn twee homologe, in tandem herhaalde domeinen van ongeveer 150 aminozuurresiduen. Het dimere lectine bevat twee koolhydraat-bindende domeinen. De amaranthinen worden gesynthetiseerd in het cytoplasma en daarna post-translationeel gemodificeerd waarbij een tetrapeptide verwijderd wordt van de C terminus. Het Amaranthus caudatus lectine herkent specifiek het T-antigeen disaccharide galactose β(1, 3)N-acetylgalactosamine (Galβ(1, 3)GalNAc) (Rinderlé, et al., 1989). Amaranthinen zijn typische eiwitten die voorkomen in zaden in relatief hoge concentraties (tot 5% van de oplosbare eiwitfractie) en die, tenminste in vitro, reageren met menselijke en dierlijke cellen. Wegens hun hoge affiniteit voor het T-antigeen wordt verondersteld dat ze een rol hebben in de afweer van planten tegen zaadpathogenen.

-

Chitine-bindende lectinen opgebouwd uit heveïne-domeinen De familie van de chitine-bindende lectinen met heveïne-domeinen is wijdverspreid in het

plantenrijk. Een eerste chitine-bindend lectine werd in 1967 ontdekt door Burger en Goldberg en werd ‘Wheat germ agglutinin’ (tarwekiemagglutinine, WGA) genoemd. Deze familie van chitine-bindende lectinen bevat alle planteiwitten die tenminste één heveïne-domein hebben. Dit domein is genoemd naar heveïne, een 43 aminozuren groot eiwit dat in latex van Hevea brasiliensis (rubberboom) aanwezig is (Waljuno et al., 1975). Het kleine heveïne en andere homologe lectinen zijn gekenmerkt

3

Literatuurstudie door een volledig actieve chitine-bindende plaats. Er zijn ook lectinen die chitine kunnen binden, maar die geen heveïne-domein bevatten, deze lectinen worden in andere families ingedeeld (bijvoorbeeld de chitine-bindende lectinen van de vlinderbloemigen en de floëemlectinen van de Cucurbitaceae). Lectinen die tot deze familie behoren, kunnen voorkomen als merolectinen (bijvoorbeeld heveïne), hololectinen (bijvoorbeeld WGA) of als chimerolectinen (bijvoorbeeld klasse I chitinasen). De meeste chitine-bindende lectinen komen stabiel tot expressie en worden na translatie nog gemodificeerd en opgeslagen in de vacuole. WGA bindt niet enkel N-acetylglucosamine maar ook Nacetylglucosamine-oligomeren- en siaalzuur-bevattende glycoconjugaten. De rol van nietenzymatische chitine-bindende lectinen is nog niet zeker, maar door hun chitine-bindende activiteit wordt verondersteld dat enkele van deze lectinen een rol spelen in de bescherming tegen fungi of insecten.

-

Floëemlectinen van de Cucurbitaceae Deze lectinen vormen een kleine familie van chitine-bindende lectinen die tot nu toe enkel

gevonden zijn in floëemexudaten van een aantal Cucurbitaceae species (Sabnis & Hart, 1978; Hossaini, 1968). De lectinen die tot deze familie behoren vormen dimere eiwitten. Hoewel blijkt dat de twee delen van het pompoenlectine covalent verbonden zijn via twee interketen disulfidebruggen, zijn er ook lectinen zoals het Luffa acutangula (komkommer) lectine waarbij de twee delen niet verbonden zijn via disulfidebruggen (Read & Northcote, 1983; Anantharam et al., 1986). Deze lectinen worden in het cytoplasma gesynthetiseerd en ondergaan geen post-translationele verwerking. Cucurbitaceae floëemlectinen hebben gelijkaardige koolhydraat-bindende specificiteit als heveïneachtige chitine-bindende lectinen, maar ze hebben geen sequentiehomologie met deze laatste. Alle floëemlectinen van de Cucurbitaceae hebben een hoge specificiteit voor oligomeren van Nacetylglucosamine.

In

agglutinatie-inhibitie-testen

is

gebleken

dat

de

binding

aan

N-

acetylglucosamine-oligomeren sterk toeneemt met stijgende ketenlengte van het polymeer; wat erop wijst dat deze lectinen een uitgebreide bindingsplaats hebben. Sommige floëemlectinen van de Cucurbitaceae herkennen ook de interne di-N-acetylchitobiosyl sequenties van N-gelinkte glycaanketens van onder andere het sojaboonlectine (Anantharam et al., 1986; Chen et al, 2002). Er is nog geen ruimtelijke structuur bepaald van deze lectinen, ook de opbouw van bindingsplaatsen is nog niet gekend.

4

Literatuurstudie -

Jacaline-verwante lectinen De jacaline-verwante plantlectinen hebben een structure le en evolutieve overeenkomst met

jacaline, het galactose-specifieke lectine van de zaden van Artocarpus integrifolia (broodvrucht). Omwille van de voorkeur voor galactoseβ(1, 3)N-acetylgalactosamine (Galβ(1, 3)GalNAc) residuen, de specifieke IgA-bindingsactiviteit van jacaline (Roque-Barreira & Campos-Neto, 1985), de mogelijke antivirale activiteit tegen het human immunodeficiency virus (Kabir & Daar, 1994) en insecticide eigenschappen werd onderzoek naar dit soort lectinen sterk gestimuleerd (Czapla & Lang, 1990). Jacaline heeft net zoals Amaranthine een hoge specificiteit voor het T-antigeen (Bourne et al., 2002). Deze familie kan opgesplitst worden in 2 groepen: 1) een N-acetylgalactosamine/galactose specifieke subgroep die voorkomt bij bepaalde Moraceae soorten en 2) een mannose-specifieke subgroep die voorkomt in verschillende plantenfamilies, o.a. Convolvulaceae. Jacaline verwante Moraceae lectinen worden als een preproteïne met een signaalpeptide en een pro-peptide gesynthetiseerd op het endoplasmatisch reticulum (ER). Het preproteïne wordt co-translationeel verwerkt waardoor het signaalpeptide verwijderd wordt. Na of tijdens het transport naar opslagvesikels wordt het pro-peptide afgesplitst. Convolvulaceae lectinen hebben daarentegen geen signaalpeptide en worden in het cytoplasma gesynthetiseerd. Ze ondergaan geen post-translationele modificaties Alle galactose-specifieke jacaline-verwante lectinen die tot nu toe bekend zijn, bestaan uit vier identieke protomeren die een grote -keten en een kleine β-keten bevatten. Beide ketens zijn afkomstig van een gemeenschappelijke precursormolecule die een complexe co- en post-translationele maturatie ondergaan. Elk protomeer bevat één koolhydraat-bindendingsplaats. Jacaline en de galactose-specifieke lectinen van de Moraceae species reageren sterk met terminale niet-reducerende -D-galactosyl residuen en Galβ(1, 3)GalNAc. Het eerste lectine van de mannose-specifieke subgroep is gevonden in Calystegia sepium (haagwinde), daarna werden er andere lectinen gevonden in onder andere rijst en banaan. Het protomeer van Helianthus tuberosus (aardpeer) agglutinin heeft een gelijkaardige structuur en koolhydraat-bindend domein als jacaline. Er wordt verondersteld dat Jacaline-verwante lectinen een invloed hebben op de groei van bepaalde insectenlarven (Czapla & Lang, 1990). Uit observaties blijkt dat de Moraceae zaadlectinen voora l opslageiwitten zijn met een extra functie in de plantenafweer tegen vraat van dieren en/of mensen. Over de functie van Convolvulaceae lectinen is nog weinig geweten. Het zijn waarschijnlijk opslageiwitten die vooral accumuleren in rhizoomweefsel. Ze hebben ook een mogelijke rol bij de afweer na predatie door bodembewonende (in)vertebraten (Van Damme et al., 1998).

5

Literatuurstudie -

Lectinen van de vlinderbloemigen Lectinen van de vlinderbloemigen zijn voor het eerst beschreven in 1890 toen een

(vermoedelijk) toxisch lectine uit de schors van Robinia pseudoacacia (acacia), een vlinderbloemige, werd geïsoleerd (Kocourek, 1986). Vervolgens werden verschillende niet-toxische lectinen gevonden bij vlinderbloemigen zoals Phaseolus vulgaris (boon) en Pisum sativum (erwt). Er zijn tot nu toe ongeveer honderd lectinen van deze familie geïdentificeerd. Ze komen enkel voor bij de Fabaceae (Sharon & Lis, 1990).Voorbeelden waarvan de ruimtelijke structuur van het lectine werd opgehelderd zijn Concanavalin A (ConA) ( Edelman et al., 1972), PSA van Pisum sativum (Einspahr et al., 1986), favine van Vicia faba (tuinboon) (Reeke & Becker, 1986), PNA van Arachis hypogaea (pinda) (Banerjee et al., 1994) en PHA-L van Phaseolus vulgaris (Hamelryck et al., 1996). ConA was het eerste plantlectine dat men heeft kunnen opzuiveren, laten uitkristalliseren en waarvan men de ruimtelijke structuur heeft bepaald. Aan de hand van de bevindingen rond Con A heeft men voor het eerst besloten dat lectinen een koolhydraat-bindende activiteit hebben. Een groot deel van deze lectinen werd gevonden in rijpe zaden en maakt daar ongeveer 1-10% van het eiwitgehalte uit. Uit immunolokalisatiestudies blijkt dat ze voorkomen in opslagparenchymcellen van de cotyledonen (Etzler, 1986), maar ze kunnen ook in lagere concentraties voorkomen in vegetatieve weefsels zoals bladeren, schors en wortels. Lectinen van de vlinderbloemigen worden als preproteïnen gesynthetiseerd in het endoplasmatisch reticulum waarna ze via het golgi-complex naar de vacuole migreren. Voorafgaand aan deze migratie ondergaan deze lectinen co-translationele modificaties waarbij het signaalpeptide verwijderd wordt. Tijdens en na het intracellulair transport ondergaan de lectinen nog verdere modificaties (Van Driessche, 1988). Alle lectinen van de vlinderbloemigen zijn opgebouwd uit protomeren die ongeveer 30 kDa groot zijn. De meeste van deze protomeren bestaan uit een polypeptide van ongeveer 250 aminozuurresiduen, daarom worden ze soms ook de ‘één-keten’ lectinen van de vlinderbloemigen genoemd. Er bestaan ook ‘twee-keten’ lectinen waarbij het protomeer gedeeltelijk gesplitst wordt. Het valt op dat deze lectinen divalente kationen bevatten op specifieke metaal-bindende plaatsen. Elke subeenheid van het eiwit bevat Mn2+- en Ca 2+ ionen die een functie hebben bij koolhydraat-bindende activiteit. Het lectine zelf is opgebouwd uit twee tot vier protomeren die samengehouden worden door niet-covalente interacties. De vorming van dimeren en tetrameren gecombineerd met al dan niet geglycosyleerde één - of twee-keten protomeren zorgt ervoor dat lectinen van de vlinderbloemigen verschillende moleculaire vormen kunnen aannemen. Er wordt verondersteld dat deze lectinen geen endogene functie hebben. De eerste reden voor deze veronderstelling is dat er veel meer lectinen aanwezig zijn in de plant dan er receptoren voor deze lectinen aanwezig zijn. Ten tweede heeft het koolhydraat-bindend domein een voorkeur voor suikers die enkel in dierlijke glycoconjugaten voorkomen zoals siaalzuur en N-acetylglucosamine.

6

Literatuurstudie Een andere, meer duidelijke rol van deze lectinen is hun functie als opslageiwitten (Peumans & Van Damme, 1995 a,b). Lectinen van de vlinderbloemigen hebben ook een mogelijk toxische invloed op insecten. Dit bleek uit een proef met transgene tabaksplanten die het lectine uit de erwt produceerden en daardoor meer resistent waren tegen de Heliothis virescens (Boulter et al., 1990).

-

Mannose-bindende lectinen van monocotylen Het prototype van de mannose-bindende lectinen van de monocotylen is het Galanthus nivalis

agglutinine (sneeuwklokjes lectine, GNA) (Van Damme & Peumans, 1987). Tot nu toe zijn er ook mannose-bindende lectinen gevonden in verschillende families van de monocotylen zoals de Alliaceae, Araceae, Amaraylidaceae, Bromeliaceae, Liliaceae en Orchidaceae (Van Damme et al., 1995). Mannose-bindende lectinen van de monocotylen vormen een zeer heterogene groep wat hun structuur betreft. Afhankelijk van de opbouw van de protomeren worden ze ingedeeld in één-domein protomeren die 11-14 kDa groot zijn en twee-domein protomeren die ongeveer 30 kDa groot zijn. Deze groep van twee-domein protomeren wordt nog verder ingedeeld in een groep van protomeren met twee identieke of sterk gelijke domeinen en een groep met twee verschillende domeinen. Mannose-bindende lectinen van de monocotylen worden in het endoplasmatisch reticulum gesynthetiseerd waarna ze via het golgi-complex naar (vermoedelijk) de vacuole migreren. Het signaalpeptide wordt co-translationeel verwijderd. Tijdens of na het intracellulaire transport wordt het C-terminale peptide proteolytisch geknipt. Over de rol van de mannose-bindende lectinen van de monocotylen is nog veel onzekerheid, maar door de overvloedige aanwezigheid van deze lectinen in vegetatieve opslagweefsels wordt verondersteld dat ze een opslagfunctie hebben. Ook is de aanwezigheid van deze lectinen afhankelijk van het groeistadium van de plant. Dit werd aangetoond bij de gele narcis en het sneeuwklokje waar de mannose -bindende lectinen in de bloembol accumuleren en opnieuw gemetaboliseerd worden wanneer het weefsel verbruikt wordt voor groei van de nieuwe scheut (Van Damme & Peumans, 1990). Er wordt verondersteld dat deze lectinen ook een functie hebben in de afweer tegen zuigende insecten omdat sommige in het floëemsap accumuleren. Dit werd aangetoond in Allium porum (prei) (Peumans et al., 1997). Daarenboven kan de toxiciteit van deze lectinen t.o.v. zuigende insecten aangetoond worden (Rahbé et al., 1995)

-

Ribosoom-inactiverende eiwitten van het type 2 (type 2 RIPs ) Ribosoom-inactiverende eiwitten zijn enzymen die eukaryotische ribosomen katalytisch

inactiveren door de grote subunit van ribosomaal RNA te knippen ter hoogte van een specifiek adenineresidu. Splitsing op deze plaats levert belangrijke conformationele veranderingen op waardoor

7

Literatuurstudie een elongatiefactor EF2 niet meer kan binden op het ribosoom. Hierdoor kan de eiwitsynthese niet meer plaatsvinden waardoor de cel sterft. Onderzoek wijst uit dat de werking van RIP niet beperkt is tot ribosomaal RNA maar ook kan inwerken op RNA en DNA. Daarom kan ook de term polynucleotide-adenosineglycosidase (PAG) gebruikt worden (Barbieri et al., 1996). Er bestaan twee goed gekende types RIPs, namelijk type 1 en type 2. Type 1 RIPs hebben een enzymatische actieve Aketen terwijl type 2 RIPs naast die A-keten ook een koolhydraat-bindende B-keten hebben, zodat deze laatste tot de lectinen gerekend worden. Type 1 RIPs worden niet ondergebracht bij de lectinen omdat zij enkel PAG-activiteit hebben. Er zijn echter ook type 2 RIPs gevonden waarvan het koolhydraatbindende domein geïnactiveerd is (bijvoorbeeld een lectine van de gewone vlier). Lectinen die tot deze familie behoren werden in 1888 door Stillmark ontdekt en zijn daardoor de eerst beschreven lectinen. Ricine was het eerste type 2 RIP waarvan de ruimtelijke structuur opgehelderd werd (Montfort et al., 1987). Type 2 RIPs komen voor in onder andere Ricinus communis (wonderboom), Viscum album (maretak), Sambucus sp. en Iris sp. Deze lectinen komen voor in zaden en/of verschillende vegetatieve weefsels. Type 2 RIPs kunnen voorkomen als merolectinen of hololectinen. De ruimtelijke structuur van deze lectinen is zeer complex. Beide ketens ontstaan uit dezelfde precursormolecule die dan post-translationeel verwerkt wordt. Type 2 RIPs worden in het endoplasmatisch reticulum gesynthetiseerd waarna ze via het golgi complex naar vacuole-achtige vesikels migreren. Tijdens deze migratie ondergaan ze post-translationele modificaties en het toxine van bijvoorbeeld ricine wordt pas actief wanneer het lectine in een vacuole-achtig vesikel aankomt. De meeste type 2 RIPs worden geïnhibeerd door galactose, N-acetylgalactosamine of beide. De lectinen hebben een duidelijke voorkeur voor di- of oligosacchariden (Van Damme et al., 1998).

1.1.2

Functies van lectinen

Tot voor kort werd er in de lectinologie enkel onderzoek gedaan naar plantlectinen die constitutief en in hoge concentraties (ongeveer 0,1- 10% van de totale hoeveelheid eiwit in een bepaald weefsel) tot expressie komen. De lectinen worden vooral in zaden en vegetatieve weefsels gedetecteerd. Er kan aangenomen worden dat de concentratie van deze lectinen veel hoger is dan het aantal aanwezige receptoren waardoor men veronderstelt dat ze geen specifieke rol spelen in de regeling van celprocessen. Ze accumuleren meestal in de vacuole. Deze lectinen lijken vooral een opslagfunctie te hebben. Enkele van deze lectinen hebben een extra functie in de verdediging van de plant tegen schadelijke organismen. Via het koolhydraat-bindend domein kunnen ze binden op exogene glycanen zoals dierlijke N- en O-glycanen en siaalzuur. Deze glycanen zijn overvloedig aanwezig op het oppervlak van de epitheel- cellen die voorkomen in het intestinale systeem van hogere of lagere diersoorten.

8

Literatuurstudie Ook wij komen via onze voeding dagelijks in contact met plantlectinen. Planten accumuleren eiwitten zoals protease-inhibitoren, antifungale eiwitten, RIPs en koolhydraat-bindende moleculen om zich te beschermen tegen infectie door pathogene organismen of vraat van herbivoren of invertebraten. In Tabel 1.1 staat een selectie van gewassen die wij regelmatig in onze voeding terugvinden en die lectinen bevatten. Een aantal van de lectinen die we via onze voeding binnenkrijgen kunnen ook indirecte effecten in verschillende organen induceren. Deze lectinen kunnen na opname via de darm werken als groeifactoren in de pancreas. Door hun invloed op de secreterende activiteit van de pancreas kan de productie van hormonen door dit orgaan veranderen. Andere lectinen kunnen opgenomen worden door epitheliale cellen waarna ze getransporteerd worden door de darmwand naar het circulatorisch systeem. WGA is een voorbeeld van een lectine dat na opname afgezet wordt op de wand van bloed- en lymfevaten (Peumans & Van Damme, 1996).

Tabel 1.1 Overzicht van planten die wij voor onze voeding gebruiken en die lectinen bevatten (bron: Peumans & Van Damme, 1996, aangepast) Naam

Accumulatieplaats

Schadelijkheid1

Warmtestabiliteit

Lectinen van de vlinderbloemigen Arachis hypogaea (pinda)

Zaad

Onstabiel

Ja

Glycine max (sojaboon)

Zaad

Laag

Ja

Phaseolus vulgaris (prinsesseboon)

Zaad

Gemiddeld

Ja

Pisum sativum (erwt)

Zaad

Onstabiel

Mogelijk

Vicia faba (tuinboon)

Zaad

Onstabiel

Mogelijk

Mannose-bindende lectinen van de monocotylen Allium cepa (ajuin)

Bol

Gemiddeld

Nee

Allium sativum (look)

Bol

Gemiddeld

Nee

Chitine-bindende lectinen Oryza sativa (rijst)

Zaad

Hoog

Ja

Triticum vulgare (tarwe)

Zaad

Hoog

Ja

Triticum vulgare (tarwe)

Kiem

Hoog

Ja

Lycopersicon esculentum (tomaat)

Vrucht

Hoog

Mogelijk

Solanum tuberosum (aardappel)

Knol

Hoog

Nee

Type 2 RIPS 2

Ricinus communis (wonderboom)

Zaad

Onstabiel

Ja

Sambucus nigra (vlier)

Vrucht

Gemiddeld

Ja

1 2

Schadelijkheid van het lectine na opname van onverwerkt voedsel. Orale opname van dit lectine is lethaal.

9

Literatuurstudie Lectinen worden niet enkel in planten teruggevonden. Ook dieren hebben verschillende typen van lectinen. Het eerste dierlijke lectine werd in 1902 ontdekt toen een bepaalde factor uit slangengif rode bloedcellen deed agglutineren (Flexner et al., 1904). Een belangrijke groep van dierlijke lectinen omvat de selectinen. De selectinen blijken een belangrijke functie te hebben in het immunologische afweersysteem van dierlijke organismen. Dierlijke lectinen zijn dus betrokken in specifieke processen binnen het organisme zelf. Dit staat in schril contrast met de exogene rol van de (constitutieve) plantlectinen. Omdat dergelijke lectine-suiker interacties van groot belang zijn bij de normale (immunologische) ontwikkeling en het functioneren van een dierlijk organisme, is het moeilijk om te geloven dat er geen zulke lectinen met een endogene rol bestaan in planten. Recent werden dergelijke plantlectinen met een endogene rol ontdekt in rijst en tabak. Om het onderscheid te maken met de eerder beschreven lectinen wordt dit type ‘induceerbare lectinen’ genoemd. De induceerbare lectinen zijn niet constant aanwezig en ze komen in veel kleinere concentraties voor dan de klassieke plantlectinen. Deze nieuwe soort lectinen worden geïnduceerd door bijvoorbeeld biotische en/of abiotische stressfactoren.

1.1.3

Induceerbare lectinen

Het eerste induceerbare lectine dat beschreven is, is Orysata, een lectine uit Oryza sativa L. (rijst) dat door zoutstress geïnduceerd wordt. Het gen werd al in 1990 ontdekt en kreeg toen de naam SalT (Claes et al., 1990). In bladeren en scheuten van rijstplanten die een standaardnutriëntenregime kregen was er geen lectineactiviteit te merken. Wanneer deze planten gedurende twee dagen aan 0.1 M NaCl blootgesteld werden, bleek dat de bladextracten een duidelijke hemagglutinerende activiteit bezaten. Deze activiteit werd specifiek door mannose geïnhibeerd en het betreffende lectine behoort tot de subroep van de mannose-bindende jacaline-verwante lectinen. Er bestaan twee isovormen: Orysata-1 en Orysata-2. Beide rijstlectinen zijn dimere eiwitten die uit twee identieke subeenheden bestaan. De algemene koolhydraat-bindende specificiteit kan vergeleken worden met die van Calystegia sepium (haagwinde) en Helianthus tuberosus (aardpeer) lectinen. Er is ook aangetoond dat salT expressie geïnduceerd kon worden door behandeling met jasmijnzuur waarna het accumuleert in de wortels van de plant (Moons et al.,1997; Zhang et al., 2000). Deze twee isovormen van het rijstlectine verschillen duidelijk van andere chitine-bindende lectinen met heveïne-domeinen (Raikhel et al., 1993; Van Damme et al., 1998). Omdat Orysata enkel bij stress tot expressie komt en accumuleert in het cytoplasma veronderstelt men dat dit lectine een rol speelt in de plantrespons op bepaalde stressfactoren. Meer informatie is hierover nog niet beschikbaar omdat er nog niets geweten is over een cytoplasmatische of nucleaire receptor voor dit lectine.

10

Literatuurstudie Er is geen coderende sequentie voor een signaalpeptide gevonden waardoor men veronderstelde dat het eiwit niet op het endoplasmatisch reticulum, maar wel in het cytoplasma gesynthetiseerd werd. Dit lectine heeft een mitogene activiteit op T-lymfocyten (Zhang et al., 2000).

Een tweede induceerbare plantlectine werd recent ontdekt in de bladeren van Nicotiana tabacum cv. “Samsun NN” tabaksplanten wanneer die behandeld werden met het vluchtige plantenhormoon jasmijnzuur. In onbehandelde planten werd dit lectine niet gedetecteerd. Het lectine kreeg de naam ‘Nictaba’ (Nicotiana tabacum agglutinine) (Chen et al., 2002). Omdat dit eiwit het onderwerp vormt van deze thesis wordt in het volgende hoofdstuk dieper op dit lectine ingegaan.

1.2 Het jasmijnzuur-induceerbare tabakslectine Nictaba

1.2.1

Inductie en fysiologische eigenschappen van Nictaba

De extracten van onbehandelde tabaksplanten (Nicotiana tabacum,cv. Samsun NN) hebben geen detecteerbare agglutinerende activiteit. Wanneer tabaksplanten gedurende 3 tot 4 dagen blootgesteld worden aan het methyljasmonaat (JAME) wordt een sterke agglutinerende activiteit gevonden in extracten van bladeren. Deze agglutinerende activiteit wordt veroorzaakt door Nictaba.

De concentratie JAME waarbij het lectine optimaal geïnduceerd wordt is 25-125 µM. Bij hogere of lagere JAME-concentraties is de lectine-concentratie duidelijk lager. In Figuur 1.2 wordt het verband tussen de lectine-concentratie en enerzijds de inductietijd (a) of anderzijds de JAMEconcentratie (b) grafisch weergegeven. Nictaba wordt één dag na de inductie detecteerbaar en blijft daarna meer dan twee dagen aanwezig. Dit lectine is stabiel bij een pH van 5 tot 11.5. In tegenstelling tot de meeste plantlectinen is het opvallend hoe snel Nictaba geïnactiveerd wordt als de pH onder 5 zakt. Nictaba verschilt ook nog van de meeste andere plantlectinen omdat het boven 55°C zijn activiteit verliest. Het lectine wordt niet geïnactiveerd door proteïnase K of trypsine (Chen et al., 2002).

11

Literatuurstudie

Figuur 1. 2 A) Verband tussen de inductietijd (h) met JAME en de lectineconcentratie (µg/g Fresh Weight, FW) in ‘floating’ experimenten en in levende planten. B) Verband tussen de JAME-concentratie (µM) en de lectineconcentratie (µg/g FW) (bron: Chen et al., 2002).

1.2.2

Sequentie-analyse, agglutinatie eigenschappen en homologie van Nictaba in andere planten

Analyse van de coderende sequentie van Nictaba verklaarde veel over de topologie en synthese van dit lectine. Door de afwezigheid van een signaalpeptide werd verondersteld dat het eiwit op vrije polysomen gesynthetiseerd wordt en de aanwezigheid van een typisch nucleair lokalisatiesignaal (NLS) (102KKKK105) deed vermoeden dat het eiwit mogelijk naar de kern gestuurd wordt. Uit de sequentie van Nictaba werd eveneens afgeleid dat het afgeschreven eiwit met uitzondering van een acetylering van het N-terminale methionine geen co- of post-translationele verwerking ondergaat. Nictaba kan rode bloedcellen van zowel humane- en konijnoorsprong agglutineren maar vertoont een duidelijke voorkeur voor erytrocyten van konijnen. De minimale concentratie van het eiwit die noodzakelijk was om agglutinatie te veroorzaken was 0.1 en 200 µg/ml voor respectievelijk met trypsine behandelde konijnenerytrocyten en humane erytrocyten. Nictaba interageert specifiek met Nacetylglucosamine (GlcNAc) en GlcNAc-oligomeren waardoor de agglutinerende activiteit van dit lectine geïnhibeerd wordt. Chitobiose, chitotriose en chitotetraose zijn respectievelijk 50, 1.600 en 3.000 maal efficiënter als inhibitor van de agglutinatie-activiteit van Nictaba vergeleken met het monomeer, GlcNAc. Algemeen werd besloten dat het koolhydraat-bindend domein van Nictaba sterk complementair is met (GlcNAc)3. Naast deze sacchariden wordt Nictaba ook door bepaalde glycoproteïnen zoals thyroglobuline, ovomucoid en asialofetuine geïnhibeerd. Asialofetuine is ongeveer 20 maal actiever dan het originele fetuine. Hieruit werd besloten dat Nictaba het terminale siaalzuur residu van dierlijke N- of O-glycanen niet herkent. Dit is een duidelijk verschil met het chitine-bindende WGA (Goldstein & Poretz, 1986).

12

Literatuurstudie De lokalisatie van Nictaba werd gecontroleerd via immunolokalisatie. Het resultaat van deze immunolokalisatie wordt in Figuur 1.3 weergegeven. Hieruit werd afgeleid dat Nictaba exclusief in het cytoplasma en de kern van bladcellen voorkomt. Er kwam geen lectine voor in de vacuolen of chloroplasten. Nictaba was ook afwezig in de vaatbundels van het bladweefsel. Ondanks de aanwezigheid van een NLS blijft een deel van het lectine in het cytoplasma.

Figuur 1.3 Immunolokalisatie van Nictaba in tabaksbladeren. a) Controle-plant. b) Gedurende 5 dagen met JAME-behandelde plant. c) Detail van (b) waarbij ‘c’ het cytoplasma, ‘n’ de nucleus, ‘pt’ plastiden, ‘v’ de vacuole aanduiden. d) DAPI-kleuring. De schaalbalk stelt 25 µm voor in a en b, en 10 µm in c en d (bron: Chen et al., 2002).

Nictaba bleek een hoge sequentie-overeenkomst te vertonen met een eiwit van Arabidopsis thaliana (AAD55487) en met de floëem-lectinen van de Cucurbitaceae. Het arabidopsiseiwit werd geannoteerd als een vermoedelijk floëem-specifiek-lectine-achtig eiwit. Ondanks de hoge sequentiesimilariteit tussen Nictaba en floëem-lectinen van de Cucurbitaceae zijn er duidelijke verschillen. De twee belangrijkste verschillen zijn de afwezigheid van een NLS bij floëem -lectinen van de Cucurbitaceae en het ontbreken van het C-terminale pentapeptide bij Nictaba dat wel voorkomt bij de floëemlectinen van de Cucurbitaceae. Dit C-terminale pentapeptide laat toe om disulfidebruggen te vormen tussen het lectine en het floëem eiwit 1 (PP1). Andere verschillen zijn te vinden bij de lokalisatie en de expressie van het lectine: 1) Nictaba komt enkel tot expressie wanneer het geïnduceerd wordt met JAME, terwijl de synthese van floëem-lectinen van de Cucurbitaceae verbonden is met vasculaire differentiatie. 2) Nictaba komt voor in alle bladcellen (behalve in vasculair weefsel) terwijl floëemlectinen van de Cucurbitaceae enkel in floëem-cellen voorkomen. Nictaba homologen zijn geïdentificeerd in Solanum tuberosum (aardappel) (BG599036), Lycopersicon esculentum (tomaat) (AW036335), L. hirsutum (een wilde tomatensoort)

(AW616959),

Glycine

max

(sojaboon)

(AW309707), Lotus japonicus (AV412171), Gossypium hirsutum (katoen) (AI731302), Hordeum vulgare (gerst) (BE216413), Oryza sativa (rijst) (AU058265), Secale cereale (rogge) (BE438497),

13

Literatuurstudie Sorghum bicolor (sorghum) (AW679639) en Mesembryanthemum crystallinum (ijsplant) (BE035638) (Chen et al., 2002).

1.2.3

Mogelijke functies van Nictaba

Met behulp van een ‘northern blot’ werd vastgesteld dat de inductie van Nictaba niet gepaard ging met een inductie of toename in expressie van proteïnase inhibitoren of ‘pathogenesis-related proteins’ zoals PR-1 en PR-5. Dit wees erop dat de inductie van Nictaba een specifieke respons is. Zoals in 1.2.2 vermeld werd, herkent Nictaba GlcNAc en GlcNAc-oligomeren. Deze oligomeren komen voor op cytoplasmatische en nucleaire eiwitten waar GlcNAc verbonden is met serine- en threonineresiduen (Wells et al., 2001). Modificaties van de O-GlcNAc-oligomeren van cytoplasmatische of nucleaire eiwitten hebben vermoedelijk een belangrijke invloed op cellulaire processen zoals transcriptie, translatie, eiwitdegradatie en import/export van eiwitten in/uit de kern. Deze modificaties zijn reversibel en worden gecontroleerd door het O-GlcNAc-transferase en het OGlcNAcase. Men vermoedt dat deze twee enzymen samenwerken met respectievelijk eiwitkinases en transferases (Finlay & Forbes, 1990; Hanover, 2001). Deze enzymen genereren vermoedelijk verschillende isovormen van fysiologisch actieve substraten. De activiteit en/of stabiliteit van OGlcNAc-bevattende transcriptiefactoren, receptoren, enzymen en andere eiwitten kan beïnvloedt worden door de binding van Nictaba op de O-GlcNAc-oligomeren. Na de binding van het lectine op een O-GlcNAc-oligomeer kan dit oligomeer niet meer gesplitst worden door het O-GlcNAcase. Nictaba zou ook voor verbindingen tussen verschillende O-GlcNAc moleculen kunnen zorgen waardoor functionele oligomeren ontstaan. Door binding op nucleaire porie eiwitten zou Nictaba het transport van RNA en/of eiwitten tussen het nucleoplasma en het cytoplasma kunnen beïnvloeden. Deze veronderstellingen zijn gebaseerd op experimenten met WGA, een chitine -bindend lectine. Door WGA te injecteren in de nucleus van dierlijke cellen is vastgesteld dat het lectine sterk bindt aan nucleaire porie eiwitten maar dat het lectine niet in staat is om kerntransport tegen te houden. Hieruit werd besloten dat de glycanen van deze nucleaire porie eiwitten niet essentieel zijn voor nucleair transport maar dat sommige lectinen door sterische hindering kerntransport kunnen verhinderen (Chen et al., 2002). In Figuur 1.4 worden de mogelijke effecten van Nictaba op O-GlcNAc bevattende eiwitten schematisch weergegeven.

14

Literatuurstudie

Figuur 1. 4 Mogelijke interacties van Nictaba met O-GlcNAc bevattende eiwitten (bron: Chen et al., 2002).

15

Doelstellingen

Deel 2. Doelstellingen Het doel van deze thesis is een beter inzicht krijgen in het expressiepatroon en de lokalisatie van Nictaba, een JAME-induceerbaar lectine uit tabak. Hiervoor zullen in deze studie EGFPfusieconstructen met ‘wild-type’ (WT) Nictaba en met mutante varianten van Nictaba gekloneerd worden. Deze constructen zullen in de BY-2 tabaksuspensiecultuur en ajuin epidermiscellen transiënt tot expressie gebracht worden.

De ontdekking, optimalisering en ontwikkeling van het ‘green fluorescent protein’ (GFP) uit de kwal (Aequorea victoria) (Chalfie et al., 1994) was een revolutie voor de studie van cellulaire eiwitlokalisatie en transportprocessen. Wanneer GFP bestraald wordt met blauw (475 nm) of UV (395 nm) licht, dan straalt het groen licht (509 nm) uit. Expressie van het eiwit laat toe om de ontwikkeling en dynamiek van celorganellen en cellulaire eiwitten te bestuderen zonder de cel te doden (Hanson & Köhler, 2001; Hawes et al., 2001). Ondanks het feit dat GFP goed werkte bij dierlijke stalen duurde het twee jaar om het eiwit te optimaliseren voor gebruik in plantencellen. Onderzoek wees uit dat hiervoor een cryptisch intron in de sequentie van GFP verwijderd diende te worden (Chiu et al., 1996; Haseloff et al., 1997). Het is bewezen dat GFP gebruikt kan worden om organellen zoals de lytische vacuole, de pH neutrale vacuole (Di Sansebastiano et al., 2001), de chloroplasten (Lee et al., 2001) en plastiden (Köhler & Hanson, 2000) of eiwitten in deze organellen zichtbaar te maken (Brandizzi et al., 2002).

De aanmaak van de constructen van Nictaba met EGFP zal gebeuren met behulp van de TM

Gateway

technologie van Invitrogen. Dit is een nieuwe kloneringsstrategie die gebaseerd is op

homologe recombinatie in plaats van de klassieke weg met restrictie-enzymen en ligasen om de gewenste sequentie in een expressievector te kloneren. Er bestaan verschillende expressievectoren waarin de coderende sequentie (CDS) van EGFP reeds aanwezig is. Afhankelijk van de vector zal de CDS van EGFP aan het 5’ einde of aan het 3’ einde van de recombinatieplaats gekloneerd zitten. Dit heeft tot gevolg dat er zowel N- of C- terminale fusie-eiwitten met EGFP gevormd kunnen worden. Eenmaal de sequentie in een expressievector gekloneerd zit kan deze vector met behulp van ‘particle bombardment’ in BY-2 cellen getransformeerd worden. Deze techniek was op het laboratorium reeds geoptimaliseerd voor dit type cellen. Dit is een vlugge manier om transiënte expressie te bekomen in BY-2 cellen. Tenslotte zal de lokalisatie bestudeerd worden met behulp van een confocale fluorescentie laser scanning microscoop (CFLSM). Deze microscoop laat toe om de cel in zeer fijne

16

Doelstellingen schijfjes te verdelen en zo een duidelijk beeld te krijgen van de lokalisatie van het fluorochroom. Klassieke fluorescentiemicroscopen hebben veel last van fluorescentie buiten het focusvlak. De CFSLM lost dit probleem op door het gebruik van een iris die alle uit-focus fluorescentie wegfiltert.

Analyse van de Nictaba sequentie toonde de aanwezigheid van een vermoedelijk nucleair lokalisatie signaal ( 102KKKK105). De functionaliteit van dit nucleair lokalisatie signaal (NLS) zal tijdens deze thesis nagegaan worden door de lokalisatie van ‘wild-type’ Nictaba en van Nictaba mutanten. Bij de constructie van een eerste mutant zullen twee aminozuren van het vermoedelijke NLS veranderd worden met behulp van ‘polymerase chain reaction’ (PCR) (102KKKK105  102

KTAK105). Dit zal tot gevolg hebben dat de opvouwing van het NLS grondig gewijzigd zal worden.

Hierdoor zal de functionaliteit van het NLS uitgeschakeld worden. Dit construct zal via het GatewayTM systeem voorzien worden van het de CDS van EGFP. De CDS van EGFP zal aan het 5’ einde van het construct aanwezig zijn en hierdoor zal het construct in plantencellen als een EGFPfusie-eiwit tot expressie kunnen komen. Een tweede mutant zal opgebouwd worden door de CDS van Nictaba gemuteerd ter hoogte van het NLS via PCR te koppelen aan de sequenties van het vacuolaire signaalpeptide en pro-peptide van sporamine. Hierdoor zou het construct naar de vacuoles gestuurd moeten worden. In de vacuole kan het construct geen functie meer uitoefenen op het celmetabolisme. De lokalisatie van deze mutant zal vergeleken worden met de lokalisatie van een construct waarbij de CDS van WT Nictaba gekoppeld werd aan hetzelfde vacuolair ‘targeting’ signaal (VTS). Het verschil tussen beide constructen zal informatie kunnen verschaffen over de functionaliteit van het NLS. Tijdens de constructie van een derde mutant zal de CDS van WT Nictaba voorzien worden van de signaalsequentie van rubisco om het construct naar de chloroplasten te richten. Net zoals bij de constructen waarbij het EGFP-fusie-eiwit naar de vacuole gestuurd wordt, is het de bedoeling om het EGFP-fusie-product van dit construct naar de chloroplasten of plastiden te sturen zodat het geen invloed kan uitoefenen op cellulaire processen. Na recombinatie in het GatewayTM systeem zullen de mutanten waarbij de Nictaba CDS of de Nictaba NLS mutant van een ‘targeting’ signaal voorzien zijn, de CDS van EGFP aan het 3’ einde van de recombinatieplaats bevatten.

17

Materiaal en methoden

Deel 3. Materiaal en methoden

3.1 Plantmateriaal 3.1.1

De ‘Bright Yellow- 2’ celsuspensiecultuur

De ‘Bright Yellow- 2’ (BY- 2) celsuspensiecultuur is een cultuur afkomstig van een callus die geïsoleerd is uit Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow-2. De cellijn werd aangemaakt in 1972 in het ‘Tobacco Science Research Laboratory’ in Japan (Kato et al., 1972). Deze celcultuur werd oorspronkelijk opgestart voor in vitro productie van grote hoeveelheden nicotine en andere secundaire metabolieten. Tegenwoordig worden de cellen gebruikt voor studie van celdelingsprocessen en transformatie-experimenten. De BY-2 celcultuur wordt soms verkozen boven de cultuur van Arabidopsis thaliana cellen omdat ze makkelijker in cultuur te houden is, de cellen zijn makkelijk te synchroniseren wat nuttig is in celdelingsexperimenten en de cellen zijn relatief eenvoudig te transformeren (Geelen & Inzé, 2001). Daarnaast zijn BY- 2 cellen grote cellen, ongeveer 50 µm diameter, met een duidelijke kern, vacuole(s) en dunne cytoplasmatische strengen waardoor deze cellen uitermate geschikt zijn voor subcellulaire lokalisatie van GFP fusie-eiwitten in levende cellen (Nagata et al., 1992; Samuels et al., 1998; Nagata & Kumagai, 1999). De BY- 2 cellen kunnen transiënt getransformeerd worden via ‘particle bombardment’. Stabiele transformatie kan daarentegen bekomen worden door co-cultuur met Agrobacterium tumefaciens die het te transformeren plasmide bevat (Rempel & Nelson, 1995). Er zijn twee grote beperkingen aan het gebruik van deze BY- 2 cellen. Ten eerste zijn ze gevoelig aan ‘hoge’ temperaturen zoals 38-42°C waardoor hun cytoskeletair netwerk geleidelijk verandert en de celdelingcyclus beïnvloed wordt (Smertenko et al., 1997) en ten tweede zijn er geen mutante lijnen beschikbaar (Weingartner et al., 2001).

3.1.2

Onderhoud van de celcultuur

Het werken met de BY- 2 celcultuur vergt een steriele omgeving en behandeling. Daarom werd gebruik gemaakt van een microbiologische veiligheidswerkbank type 2. Wekelijks werden de cellen overgeënt in vers Murashige-Skoog (MS)-medium (zie 3.12.1) zodat er voldoende voedingsstoffen aanwezig waren om een goede groei te verzekeren. Hierbij werd 1 ml van de oude cultuur gepipetteerd in 40 ml geautoclaveerd medium (aanwezig in een 250 ml erlenmeyer). Vóór het overenten van de cellen werden vitaminen in een 1x verdunning toegevoegd vanuit een (1000x geconcentreerde) vitaminestock (zie 3.12.2). Omdat de cellen aëroob moeten groeien werden de

18

Materiaal en methoden erlenmeyers afgesloten met luchtdoorlaatbare tape. De cellen werden in het donker geïncubeerd op een schudtafel bij 150 toeren per minuut (tpm) en bij een constante temperatuur van 25 °C. De cellen worden in het donker gegroeid om de vorming van chlorofyl in de plastiden en chloroplasten te minimaliseren. Dit is nodig omdat chlorofyl autofluorescentie vertoont bij de golflengte waarmee GFP geëxciteerd wordt tijdens de fluorescentiemicroscopie. Hierdoor wordt de observatie van GFP-fusieeiwitten sterk bemoeilijkt.

3.1.3

Ajuin epidermiscellen

Epidermiscellen van Allium cepa (ajuin) worden al lang als modelsysteem voor de lichtmicroscopie gebruikt. De cellen zijn groot, relatief doorzichtig en ze komen meestal voor in één enkele cellaag. Ajuin epidermiscellen zijn bruikbaar voor de studie van cellulaire structuren zoals het cytoskelet, plasmodesmata, het endoplasmatisch reticulum (ER), e.a. met behulp van GFP. Voor de lokalisatiestudie van GFP-constructen werden de binnenste epidermale cellagen van de schillen onder steriele omstandigheden op voedingsbodems met MS-medium geplaatst (Scott et al, 1999), getransformeerd met ‘particle bombardment’ (zie 3.10) en dan afgescand met behulp van fluorescentiemicroscopie (zie 3.11) om de getransformeerde cellen te vinden.

19


3.2 Het GatewayTM kloneringssysteem Voor deze thesis werden diverse GFP-fusie-constructen in plasmide-DNA gekloneerd met behulp van het GatewayTM systeem van Invitrogen (Carlsbad, California). Deze technologie werkt via homologe recombinatie. In vergelijking met het klassieke kloneringswerk waarbij er restrictie- en ligatiestappen nodig zijn, is de GatewayTM technologie veel efficiënter3, sneller en bovendien eenvoudiger om eenzelfde sequentie in meerdere verschillende vectorsystemen te kloneren. Doordat de uiteinden van de te kloneren sequentie verschillend zijn (zie 3.2.2) blijft de oriëntatie van de sequentie behouden na de homologe recombinatie terwijl het bij het klassieke kloneringssysteem mogelijk is dat het fragment omkeert of in tandem herhaald wordt.

3.2.1

Het Gateway

TM

systeem: theoretisch De

GatewayTM

technologie

is

gebaseerd op bacteriofaag λ -plaatsspecifieke recombinatie. De bacteriofaag λkan als een lytische faag groeien in Escherichia coli (E. coli) maar de faag kan ook integreren in het genoom van E. coli. Deze integratie vindt plaats door een lysogeen proces en wordt grafisch weergegeven in Figuur 3.1. Tijdens deze gebeurtenis recombineert de attP-plaats van het bacteriofaag λplasmide met de attBplaats van het E. coli genoom. Deze integratie wordt gekatalyseerd door een Figuur 3.1 De techniek van het Gateway TM systeem is gebaseerd op de homologe recombinatie van de bacteriofaag λplasmide in het E. coli genoom (bron: Invitrogen)

enzym dat door de bacteriofaag λgecodeerd wordt en een factor die door E. coli gecodeerd wordt. Na integratie worden de attB-plaats en de attP-plaats omgevormd tot

respectievelijk een attL-plaats en een attR-plaats. De schematische voorstelling van de homologe recombinatie reacties bij het GatewayTM systeem en de opbouw van de att-plaatsen worden in Figuur 3.2 gegeven. 3

Meer dan 90% van de bekomen klonen bevat het ingebrachte gen op een correcte wijze.

20


Figuur 3.2 Schematische voorstelling van de homologe recombinatiereacties bij het Gateway TM systeem. a) de BP-reactie. b) de LR-reactie. (bron: Invitrogen, aangepast).

21


Figuur 3.3 De werking van het Gateway TM recombinatiesysteem. a) De BP-reactie. b) De LR-reactie. (bron:Invitrogen, aangepast).

Figuur 3.4 ‘Destination’-vectoren van Mansour Karimi (Karimi et al., 2002). a) pK7WGF2. b) detail van het fragment tussen de linkerborder en de rechterborder van de pK7WGF2 vector. c) pK7FWG2. d) detail van het fragment tussen de linkerborder en de rechterborder van de pK7FWG2 vector. (bron: http://www.psb.ugent.be/gateway ).

22

Materiaal en methoden De sequentie die men wil kloneren wordt via een ‘polymerase chain reaction’ (PCR) voorzien van twee attB-sequenties (zie 3.2.2). In de BP-reactie reageren deze attB-plaatsen met de attPplaatsen van een donorvector. De recombinatie leidt tot de vorming van een ‘entry’-vector. Na het uitvoeren van de BP-reactie wordt deze ‘entry’-vector in E. coli DH5α-cellen getransformeerd om de vector te laten vermeerderen. De technieken die gebruikt worden om de vectoren in bacteriën te transformeren zullen verder besproken worden in 3.5. TM

Het Gateway

systeem voorziet twee directe manieren om de BP-recombinatiereactie te

evalueren. Bij het recombineren van de sequentie in de donorvector wordt het ccdB-gen dat tussen de attP-plaatsen zit uit de donorvector verwijderd en de gewenste sequentie neemt de plaats in van het ccdB-gen. Dit gen codeert voor een eiwit dat interfereert met het E. coli gyrase. Door deze interferentie wordt de groei van E. coli DH5-αen E. coli Top-10 bacteriën (zie 3.4) verhinderd. E. coli DB 3.1- cellen (zie 3.4) worden niet geremd door de aanwezigheid van het ccdB-gen. Daarom kunnen de E. coli DB 3.1- cellen gebruikt worden om de donorvector te vermeerderen. Een tweede manier om de getransformeerde cellen te selecteren is de aanwezigheid van een selectiemerker. De donorvector die voor deze thesis gebruikt wordt is het pDONR-221 plasmide dat voorzien is van een kanamycineresistentie-gen (zie de schematische voorstelling van de donorvector in Figuur 3.3). Bacteriën die op een LB-voedingsbodem (zie 3.12.3) met kanamycine (50 µg/ml) gegroeid worden zullen enkel overleven als ze een donorvector opgenomen hebben. De donorvector bevat een bacteriële pUC oorsprong voor replicatie zodat de vector na transformatie in bacteriën vermeerderd wordt en behouden blijft. Via kolonie-PCR kunnen kolonies getest worden op de aanwezigheid van de gekloneerde sequentie (zie 3.9). Indien de kolonie-PCR positief is voor een bepaalde kolonie, dan wordt deze kolonie opgegroeid in vloeibaar LB-medium waarna de ‘entry’-vector opgezuiverd wordt via de QIAprep Spin Miniprep Kit van Qiagen (Hilden, Duitsland). Na isolatie van het plasmide DNA wordt het gekloneerde construct gesequeneerd volgens de dideoxy-nucleotide-methode. Deze sequenering

gebeurt

in

het

VIB

(Wilrijk,

België)

‘genetic

service

facility’

(http://www.vibgeneticservicefacility.be). De sequentie van het gekloneerde construct kan daarna bekeken

worden

met

behulp

van

het

‘software’

programma

Chromas

(http://www.technelysium.com.au/chromas.html). Deze bekomen sequentie wordt daarna gealligneerd met de sequentie van het construct die opgesteld werd met behulp van het ‘software’ programma Vector NTI (http://www.informaxinc.com).

23

Materiaal en methoden Indien de sequentie van het gekloneerde construct en de voorspelde sequentie (ongeveer) identiek zijn, dan wordt de LR-recombinatiereactie opgestart. Tijdens de LR-reactie vindt er homologe recombinatie plaats tussen de attL-sites van de ‘entry’-vector en de attR-sites van de ‘destination’vector zodat een expressievector gevormd wordt. Voor deze thesis wordt gebruik gemaakt van de ‘destination’-vectoren die door Dr. Mansour Karimi van het VIB (GENT) opgebouwd zijn (Karimi et al., 2002). De ‘destination’-vectoren pK7WGF2 en pK7FWG2 (zie Figuur 3.4) bevatten de CDS van EGFP respectievelijk N- of C-terminaal ten opzichte van de attR1 of attR2 recombinatieplaats. Na de recombinatie zal het gemaakte construct in plantencellen als een EGFP-fusie-eiwit tot expressie kunnen komen. De expressie van dit fusie-eiwit kan gebeuren door de aanwezigheid van de ‘Cauliflower mosaic’ virus 35S promotor (p35S) en de bijhorende terminator (T35S) in de ‘destination’-vectoren. Deze promotor functioneert optimaal in alle planten, groene algen, gist en E. coli (Assaad & Singer, 1990). Na het uitvoeren van de LR-reactie wordt de bekomen expressievector getransformeerd in DH5α-cellen. Deze cellen zullen zoals bij de BP-reactie enkel kunnen groeien als het ccdB-gen uit de ‘destination’-vector verwijderd is door de homologe recombinatie met het gekloneerde gen dat in de ‘entry’-vector zit. Een bijkomende selectie vindt plaats door de bacteriën na transformatie

te

laten

groeien

op

een

voedingsbodem

met

LB-medium

en

spectinomycine/streptomycine (50 µg/ml) als selectiemerker. Ter controle wordt kolonie-PCR uitgevoerd op enkele geselecteerde kolonies.

3.2.2

Het Gateway TM systeem: praktisch

Om de te kloneren sequentie van attB-plaatsen te voorzien zijn twee PCR-stappen nodig. In een eerste PCR wordt de te kloneren sequentie geïsoleerd en geamplificeerd (zie Figuur 3.5 a). De primers die voor deze eerste PCR gebruikt worden bevatten reeds een deel van de attB-plaatsen zodat ook het PCR-product al een deel van deze plaatsen bevat (zwarte rechthoeken in Figuur 3.5 b). In een volgende PCR worden de attB-plaatsen vervolledigd (zie Figuur 3.5 c).

24


Figuur 3.5 Schematische voorstelling van de PCRs voor de constructie van het attB-PCR-product. a) PCR om de coderende sequentie te isoleren en te amplificeren. b) PCR om de attB-plaatsen te vervolledigen. c) attB-PCR-product.

Voor een 5 µl BP-reactie werd volgende standaardmix gebruikt:  25 ng attB-PCR-product  50 ng BP donorvector (pDONR-221)  BP buffer 1x (5x stock)  BP clonase-mix 1x (5x stock)  water De BP clonase-mix bevat twee enzymen: het integrase dat door de bacteriofaag λgecodeerd wordt en de ‘integration host factor’ die door E. coli gecodeerd wordt. De BP donorvector, de BP buffer en de BP clonase-mix worden bij –80°C bewaard. Na het maken van deze mix wordt de reactie gedurende minimum 12 uur geïncubeerd bij 25°C. Daarna wordt de reactie gestopt door 1 µl proteïnase K (per 5 µl reactie) toe te voegen en het geheel gedurende 10 minuten bij 37°C te incuberen.

Voor een 5µl LR-reactie werd volgende standaardmix gebruikt:  40 ng BP ‘entry’-vector (= product uit de BP-reactie)  60 ng LR donorvector (pK7WGF2 of pK7FWG2)  LR buffer 1x (5x stock)  LR clonase-mix 1x (5x stock)  water

25

Materiaal en methoden De LR clonase-mix bevat drie enzymen: het integrase en het excisionase die door de bacteriofaag λgecodeerd worden en de ‘integration host factor’ die door E. coli gecodeerd wordt. De LR donorvector, de LR buffer en de LR clonase-mix worden bij –80°C bewaard. Na het maken van deze mix wordt de reactie gedurende minimum 12 uur geïncubeerd bij 25°C. Daarna wordt de reactie gestopt door 1 µl proteïnase K toe te voegen per 5 µl reactie en het geheel gedurende 10 minuten bij 37°C te incuberen. Algemeen werd opgemerkt dat bij een BP-reactie 5-10 % van het startmateriaal omgezet wordt naar een ‘entry’-vector terwijl de efficiëntie van een LR-reactie (omzetting naar een expressievector) 30% bedraagt.

3.3

Plasmide materiaal, Nictaba- en signaalsequenties

 Het cDNA fragment van Nictaba werd in de EcoRI-plaats van een pUC18-vector geligeerd (Chen et al, 2002). De bekomen vector, pT1.01, werd ter beschikking gesteld door Prof. dr. Els J. M. Van Damme (Laboratorium voor Biochemie en Glycobiologie, Universiteit Gent).

 Het plasmide, pUC-SPOA101, bevat het vacuolaire signaalpeptide en het pro-peptide van sporamine (Yao et al., 2001). Dit plasmide werd ter beschikking gesteld door Dr. Kai-Wun Yeh (Institute of Plant Biology, National Taiwan University, Taipei).

 Het plasmide, pSSTP, met het signaalpeptide van het kleine deel van ribulose-1,5-bifosfaat carboxylase (rubisco) voor chloroplast ‘targeting’ (Ko & Cashmore, 1989) werd ter beschikking gesteld door Dr. Kenton Ko (Department of Biology, Queen's University, Canada).

 Het EGFP CDS werd met behulp van het GatewayTM systeem in de pK7WG2 ‘destination’-vector binnengebracht (zie 3.2). De bekomen expressievector werd ter beschikking gesteld door ir. Bartel Vanholme (Laboratorium voor Toegepaste Moleculaire Genetica, Universiteit Gent).

In Figuur 3.6 wordt de coderende sequentie van Nictaba, de afgeleide aminozuursequentie van Nictaba, de signaal- en propeptidesequentie van sporamine en de signaalpeptidesequentie van rubisco weergegeven.

26


a)ATGCAAGGCCAGTGGATAGCCGCAAGAGACCTTTCAATTACATGGGTGGACAATCCTCAGTACTGGA CATGGAAAACTGTTGATCCTAATATTGAAGTGGCGGAGCTTCGTAGGGTAGCTTGGCTTGACATTTAT GGAAAGATCGAGACAAAAAATCTTATTCGAAAGACTAGTTATGCTGTATATTTAGTGTTCAAGTTAAC AGATAACCCTCGTGAACTTGAACGAGCCACAGCATCGCTAAGATTTGTGAACGAAGTGGCGGAGGGCG CTGGCATTGAGGGTACCACTGTTTTCATCTCGAAGAAAAAGAAATTACCAGGAGAACTTGGCCGGTTC CCACATCTCCGAAGTGATGGCTGGTTAGAAATCAAGCTTGGTGAGTTTTTCAACAACTTAGGAGAGGA TGGTGAAGTCGAAATGAGGTTGATGGAAATCAATGACAAAACTTGGAAATCTGGCATCATTGTTAAGG GCTTCGACATTCGTCCAAACTAA b)MQGQWIAARDLSITWVDNPQYWTWKTVDPNIEVAELRRVAWLDIYGKIETKNLIRKTSYAVYLVFKL TDNPRELERATASLRFVNEVAEGAGIEGTTVFISKKKKLPGELGRFPHLRSDGWLEIKLGEFFNNLGE DGEVEMRLMEINDKTWKSGIIVKGDIRPN c)ATGGCTTCTATGATATCCTCTTCCGCTGTGACAACAGTCAGCCGTGCCTCTAGGGGGCAATCCGCCG CAGTGGCTCCATTCGGCGGCCTCAAATCCATGACTGGATTCCCAGTGAAGAAGGTCAACACTGACATT ACTTCCATTACAAGCAATGGTGGAAGAGTAAAGTGCATGGATCC d)ATGAAAGCCTTCACACTCGCTCTCTTCTTAGCTCTTTCCCTCTATCTCCTCCCCAATCCAGCCCATT CCAGGTTCAATCCCATCCGCCTCCCCACCACACACGAACCCGCC Figuur 3.6 Sequenties van het materiaal dat voor deze thesis gebruikt is. a) de nucleotidensequentie van de CDS van WT Nictaba. b) de afgeleide aminozuursequentie van WT Nictaba. Het vermoedelijk NLS signaal is in a) en b) onderlijnd. c) nucleotidesequentie coderend voor het signaalpeptide en het propeptide van sporamine voor vacuolaire ‘targeting’. d) nucleotidesequentie coderend voor het signaalpeptide van rubisco voor chloroplast ‘targeting’.

3.4 Bacteriële stammen Voor deze thesis werd gebruik gemaakt van drie Escherichia coli (E. coli) stammen:  E. coli DH5α™-T1R F- φ80lacZ∆M15 ∆(lacZYA-argF) U169 deoR recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk +) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1 tonA  E. coli Top-10 F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ 80lacZ∆M15 ∆lacX74 deoR recA1 endA1

ara∆139 ∆(ara, leu)7697 galU galK λ - rpsL(StrR) nupG

27

Materiaal en methoden  E. coli DB-3.1 F- gyrA462 endA ∆(sr1-recA) mcrB mrr hsdS20 (rB – mB -) supE44 ara14

galK2 lacY1 proA2 rpsL20(StrR) xyl5 λ - leu mtl1

3.5 Bacteriële transformatie

De transformatie van DNA in bacteriën gebeurde met behulp van twee technieken: ‘heatshock’ en elektroporatie.

3.5.1

‘Heat-shock’ transformatie

Voor een ‘heat-shock’ transformatie werd 40 ng plasmide-DNA toegevoegd aan 40 µl ‘heatshock’-competente cellen E. coli Top-10 cellen (zie 3.4). Na incubatie op ijs gedurende 30 minuten, werd dit mengsel gedurende 42 sec bij 42°C geïncubeerd. Nadien werd het mengsel gedurende 2 minuten op ijs bewaard. Vervolgens werd 450 µl Luria-Bertani (LB) medium (zie 3.12.3) toegevoegd en werden de cellen bij 37°C geïncubeerd op een schudtafel bij 225 tpm gedurende één uur. Hierna werden de bacteriën uitgeplaat op een (selectieve) LB-voedingsbodem waarna ze overnacht geïncubeerd werden bij 37°C.

3.5.2

Elektroporatie

Voor een transformatie met behulp van elektroporatie werd 40 ng plasmide-DNA toegevoegd aan 40 µl elektroporatiecompetente E. coli DH5-αcellen. Daarna werden de cellen op ijs geplaatst. Het mengsel werd overgebracht naar een elektroporatiecuvet die in een elektroporatietoestel van Bio Rad geschoven werd. De parameters van de elektroporatie waren als volgt: 1) een weerstand van 200 ohm, 2) een elektrische capaciteit van 25 µFD en 3) een spanning van 2.5 V. De cuvet werd onmiddellijk na de elektroporatie terug op ijs geplaatst en 1 ml LB-medium (zie 3.12.3) zonder selectiemerker werd toegevoegd. De inhoud van de cuvet werd overgebracht in een 12 ml glazen buis en de cellen werden bij 37°C geïncubeerd op een schudtafel bij 225 t pm gedurende één uur. Nadien werden de cellen uitgeplaat op (selectieve) LB-platen en overnacht geïncubeerd bij 37°C.

28


3.6 Opzuiveren van plasmiden uit bacteriën Om plasmiden uit bacteriën op te zuiveren werd in eerste instantie gebruik gemaakt van zelf bereide oplossingen. Enkel wanneer zeer zuiver materiaal nodig was werd de QIAprep Spin Miniprep Kit (bijvoorbeeld voor de sequenering van een plasmide) of de Midiprep Kit (bijvoorbeeld voor het isoleren van plasmid-DNA voor ‘particle bombardment’) van Qiagen gebruikt.

Om plasmiden te isoleren met zelf bereide oplossingen (zie 3.12.4) werd de bacteriële cultuur overnacht opgegroeid bij 37°C in een glazen buis gevuld met 3 ml (selectief) medium. Na het pelleteren van de bacteriën door middel van centrifugatie bij 3,000 tpm in een Sorvall SS34 werd het supernatans afgegoten zonder de pellet te verstoren. Daarna werd 100 µl buffer I toegevoegd. Door lichtjes te vortexen werd de pellet opgelost. Het mengsel werd overgepipet teerd in een 1.5 ml eppendorfbuisje en gedurende 5 minuten op ijs geïncubeerd. Na deze 5 minuten werd 200 µl buffer II toegevoegd aan het mengsel. Nadat het buisje voorzichtig geschud was, werd het maximum 5 minuten op ijs geïncubeerd. Na deze 5 minuten werd 150 µl buffer III toegevoegd. Na het mengen werd het proefbuisje gedurende 5 minuten op ijs gezet. Hierna werd het buisje gedurende 5 minuten bij 13,000 tpm afgecentrifugeerd. Het supernatans dat het DNA bevatte, werd overgepipetteerd in een nieuw eppendorfbuisje. Het DNA werd geprecipiteerd door er 450 µl isopropanol aan toe te voegen. Na zorgvuldig mengen werd het eppendorfbuisje gedurende 10 minute n op kamertemperatuur gehouden waarna het gedurende 15 minuten bij 13,000 tpm afgecentrifugeerd werd. Het supernatans werd verwijderd. De pellet werd opnieuw gewassen met 200 µl isopropanol. Het buisje werd daarna gedurende 5 minuten bij 13,000 tpm afgecentrifugeerd waarna het supernatans verwijderd werd. Het buisje werd nogmaals kort afgecentrifugeerd en het laatste restje supernatans werd afgepipetteerd. Na 5 tot 10 minuten drogen aan de lucht kon de pellet opgelost worden in 30 µl geautoclaveerd gedistilleerd water. Na deze isolatie werd het plasmide-DNA bewaard bij -20 °C.

Om plasmiden te isoleren met behulp van de QIAprep Spin Miniprep Kit werden de opgegroeide bacteriële cellen gelyseerd. Het DNA wordt gescheiden van het celmateriaal via centrifugatie. Het lysaat met het DNA werd overgebracht naar een Qiaprep kolom waarna het DNA absorbeerde aan een silicagel membraan. Dit membraan kan tot 20 µg DNA binden. Onzuiverheden werden via een wasstap verwijderd. Daarna werd het DNA geëlueerd in een kleine hoeveelheid buffer of water. Het gebruik van deze kolommen zorgt er voor dat er geen precipitatie-, concentratie- en ontzoutingsstap nodig is zodat het geïsoleerde DNA een hoge zuiverheidsgraad heeft.

29

Materiaal en methoden Wanneer grotere hoeveelheden plasmide-DNA nodig zijn werd gebruik gemaakt van de Midiprep Kit van Qiagen. Deze kit bevat speciale Qiagen-kolommen met een anionen-uitwisselingshars. Het gebruik van deze kit zorgt ervoor dat er geen toxische substraten zoals fenol, chloroform, ethidium bromide of cesiumchloride gebruikt moeten worden, in tegenstelling tot andere DNA isolatiemethoden.

3.7 DNA- agarosegelelektroforese Voor de aanmaak van een 1.5% agarosegel werd 1.5 g agarose toegevoegd aan 100 ml (0.5 x) TAE-oplossing (zie 3.12.5). Het mengsel werd in een microgolfoven opgewarmd tot alle agarose opgelost was. Na afkoelen tot 60°C werd de oplossing in een gelhouder met een kammetje dat ruimte voor de ‘slots’ vrijhoudt gegoten. Na het gieten van de gel in een gepaste houder kon de gel stollen. Na het stollen werd deze gel overgebracht in het gelelektroforeseapparaat dat gevuld was met een (0.5 x) TAE-oplossing. Om DNA-fragmenten op grootte te scheiden werd 5 µl onverdund DNA gemengd met 2 µl ladingsbuffer (zie 3.12.6) en in een slot van de gel gepipetteerd. Als referentie voor de grootte van de fragmenten werd op de gel een DNA-ladder geladen (zie 3.12.7). De scheiding van de DNA-fragmenten gebeurde bij een spanning van 50 V of 100 V. Onder invloed van deze spanning migreerde het negatief geladen DNA naar de positieve pool van het electroforesetoestel. Na electroforese werd de gel overgebracht in 400 ml ( 0.5x) TAE waaraan 40 µl (1x) ethidiumbromide toegevoegd was. Dit ethidiumbromide intercalleert in het DNA waardoor dit complex oplicht bij belichting met ultraviolet licht.

3.8 ‘Polymerase chain reaction’ (PCR) Een PCR bestaat uit drie belangrijke stappen. In een eerste stap worden de dubbelstrengige DNA-helices gedenatureerd tot enkelstrengige DNA-moleculen (‘template’). Dit gebeurt bij een temperatuur van 94°C waardoor enzymreacties niet kunnen doorgaan. Na de denaturatie is er een ‘annealing’-stap waarvoor de temperatuur verlaagd wordt naar een waarde die tussen 50°C en 60°C ligt. Deze temperatuur moet geoptimaliseerd worden. Tijdens de ‘annealing’-stap ontstaat een fragiele binding tussen korte oligonucleotide fragmenten (‘primers’) en het ‘template’. Het DNA-polymerase dat actief wordt door de lagere temperatuur kan binden op het stukje dubbelstrengig DNA en begint de ‘template’ te kopiëren. Als er enkele basen toegevoegd zijn aan dit korte dubbelstrengig fragment wordt de binding tussen de twee strengen steviger en kan de temperatuur verhoogd worden tot de

30

Materiaal en methoden optimale werkingstemperatuur van het polymerase waarna het polymerase de ‘template’ verder kopieert. Dit wordt de elongatiestap genoemd.

Een standaard PCR wordt als volgt opgebouwd:  een denaturatiestap: 2 minuten bij 94°C;  een cyclus die 25 maal herhaald wordt: o

een denaturatiestap: 15 seconden bij 94°C;

o

een ‘annealing’-stap: 30 seconden bij een te optimaliseren temperatuur (afhankelijk van de sequentie);

o

een elongatiestap: 72°C gedurende 1 minuut per 1000 nt die men wil amplificeren;

 Een elongatiestap: 5 minuten bij 72°C.

Voor deze thesis zijn er twee soorten PCR-mengsels gebruikt, de samenstelling van deze mengsels wordt in Tabel 3.1 weergegeven. Het Taq-polymerase werd gebruikt om PCRs te optimaliseren. Het Pfx-polymerase werd gebruikt om het uiteindelijke PCR-fragment dat men wil kloneren te bekomen met behulp van het geoptimaliseerde PCR-programma. Dit laatste DNA polymerase heeft een 3’5’ exonuclease ‘proofreading’ activiteit die ‘mismatched’ baseparen verwijdert zodat er geen fouten in de geamplificeerde strengen ingebouwd worden.

Tabel 3.1 Standaard PCR-mengsels

Standaard mengsel 1:

Standaard mengsel 2:

dNTP-mix (Takara)(10 mM):

4 µl dNTP mix (Takara)(10 mM):

Thermopol buffer 1x (10x stock):

5 µl Pfx amplificatiebuffer 1x (Invitrogen) (10x stock):

primer A (5 µM stock):

2 µl

primer B (5 µM stock):

2 µl Pfx enhancerbuffer 1x (Invitrogen)(20x stock):

‘template’ (10 ng/µl):

4 µl

Taq-polymerase (1.25 U): water: totaal:

4 µl

5 µl

2.5 µl

0.25 µl MgSO4 (50 mM):

1 µl

32.75 µl primer A (5 µM): 50 µl primer B (5 µM):

2 µl

‘template’ (10 ng/µl):

2 µl 4 µl

Pfx-polymerase (1.25 U):

0.5 µl

water:

29 µl

totaal:

50 µl

31


Materiaal en methoden Bij het optimaliseren van het PCR-programma werd gestreefd om een zeer specifiek PCRproduct te bekomen. Enerzijds werd daarom de ‘annealing’-temperatuur verhoogd wanneer aspecifieke PCR-fragmenten op een DNA-agarosegel te zien waren. Anderzijds werd, wanneer de aanpassing van de ‘annealing’-temperatuur niets opleverde, de agarose DNA extractie kit van Roche (Basel, Zwitserland) gebruikt. Deze laat toe om het gewenste PCR-fragment uit de gel te recupereren. De agarose werd opgelost en het DNA dat vrijkwam kon binden op silica in de aanwezigheid van chaotrofische zouten. Deze zouten verbreken normale waterstofbindingen die moleculen in water vormen en zorgen voor een denaturatie van het DNA. Door deze effecten kan het DNA binden op silica. Dit is een specifiek bindingsproces waardoor DNA gescheiden kan worden van onzuiverheden. De sferische silica partikels kunnen 100 kb grote DNA fragmenten binden. Bij het uitvoeren van deze opzuivering gaat er veel materiaal verloren, daarom is het nodig om zoveel mogelijk materiaal te laden op een agarosegel. Indien het PCR-product een aspecifiek fragment (<200 bp) bevat dat kleiner is dan het gewenste fragment, dan kan het PCR-product opgezuiverd worden met behulp van de Qiaquick PCR ‘purification’ kit van Qiagen. Deze kit niet enkel toe om fragmenten die kleiner zijn dan het verwachte fragment te verwijderen, maar ook enzymen, primers en buffer worden verwijderd.

3.9 Kolonie- PCR Om te controleren of een bacteriële kolonie het gekloneerde plasmide bevat, kan men DNA uit de bacteriën isoleren en hierop PCR of restrictiedigest uitvoeren. Een snellere manier is om rechtstreeks PCR uit te voeren op de bacteriële cellen. Hierbij wordt bacteriekolonie opgepikt, opgelost in 10 µl geautoclaveerd gedistilleerd water en als ‘template’ gebruikt voor een PCR met het standaardmengsel 1 (zie 3.8). Om het DNA uit de bacteriële cellen te halen werd de temperatuur van de eerste denaturatiestap gedurende 10 minuten bij 94°C gehouden (in plaats van 2 minuten bij 94°C). Door deze aanpassing barsten de bacteriële cellen open. Daarna wordt het standaard PCR-programma doorlopen.

32


3.10 ‘Particle bombardment’ 3.10.1 Algemeen Voor deze thesis werd gebruik gemaakt van ‘particle bombardment’ om plantencellen op een fysische manier te transformeren met DNA. Bij deze techniek werd DNA op goudpartikels (= microcarriers) ‘gecoat’ via calciumprecipitatie. Onder invloed van heliumdruk werden deze goudpartikels afgeschoten van op een membraan (= macrocarrier) en versneld naar de plantencellen. De plantencellen werden dus letterlijk gebombardeerd met DNA. Hoe het DNA dan precies in de plantencel komt is nog onbekend. In deze thesis werd het PDS 1000/He ‘particle delivery system’ van Bio Rad gebruikt. De opstelling van het toestel en het werkingsmechanisme zijn weergegeven in Figuur 3.7.

Figuur 3.7 De apparatuur die gebruikt wordt voor de transformatie van de BY-2 cellen. a) Het PDS1000/He ‘particle delivery system’. b) Werking van het toestel, 1: de kamer waar de gasdruk kan opgebouwd worden, 2: de ‘rupture disc’, 3: de macrocarrier waarop de microcarriers geladen met het DNA gebracht zijn, 4: het ‘stopping’ screen, 5: de plaat met de te transformeren cellen.

33

Materiaal en methoden Vooraleer de beschieting werd uitgevoerd, werd een vacuüm in het toestel aangelegd. Bovenaan het toestel is er een ‘rupture disc’ (= membraan) aanwezig die de ruimte in het toestel in twee delen opsplitst: een onderste deel waar er vacuüm is en een bovenste deel waar de He-druk kan opgebouwd worden. In de onderste ruimte bevinden zich de goudpartikels (= microcarriers) die ‘gecoat’ zijn met het DNA. Deze goudpartikels vormen een laagje op de onderkant van de macrocarrier (= membraan). Onder dit membraan zit een ‘stopping screen’. Dit is een membraan die het best vergelijkbaar is met kippengaas. Op een variabele afstand (van 3- 6- 9 of 12 cm) daaronder werd de plaat met de plantencellen gezet. Wanneer de gewenste He-druk bereikt was in het bovenste deel van het toestel brak de ‘rupture disc’ en werd het vacuüm in de onderste kamer verbroken. De macrocarrier schoot daardoor los en botste op het ‘stopping screen’. De goudpartikels werden tijdens de versnelling en het bruusk afremmen van de macrocarriers losgeslagen van dit laatste membraan en konden door de gaatjes van het ‘stopping screen’ passeren en migreerden naar de plantencellen. Op die manier werden de plantencellen beschoten met het DNA. De grootte van de druk, de diameter van het goud en de afstand van de plantencellen tot het ‘stopping screen’ zijn 3 parameters die men kan variëren naargelang het staal dat men wil transformeren. Daarom kan men met dit toestel zowel enkele cellen als volledige blaadjes, callus en dierlijke cellen transformeren.

3.10.2 Voorbereiding van de plantencellen Vier dagen voor de transformatie werd per construct 4 ml BY-2 celsuspensie overgezet in 40 ml MS medium (zie 3.12.1) zodat de cellen optimaal gegroeid zouden zijn op het moment van de transformatie. Vervolgens werden twee steriele filters op een geautoclaveerde Büchnerfilter, die op een erlenmeyer geplaatst was, gelegd. De erlenmeyer was verbonden met een waterstraalpomp. De onderste filter had een diameter van ongeveer 9 cm en diende om de gaatjes van de Büchnerfilter af te dekken. Dit gebeurde door de filter te bevochtigen met geautoclaveerd water en daarna de waterstraalpomp te activeren. Hierna werd de tweede filter op de onderste filter aangebracht. Deze tweede filter had een diameter van ongeveer 7 cm en werd nat gemaakt met geauctoclaveerd water. In een microbiologische veiligheidswerkbank type 1 werd 5 ml BY-2 cellen overgepippeteerd op de bovenste filter waarna de waterstraalpomp aangeschakeld werd. Nadat het meeste vocht en medium uit de celsuspensie verwijderd was werd de bovenste filter met de BY-2 cellen overgebracht naar een plaat met 20 ml vast MS-medium (zie 3.12.1). De platen met de BY-2 cellen werden met luchtdoorlaatbare plakband afgesloten en gedurende 4 uur bij 25°C in het donker geïncubeerd.

34

Materiaal en methoden 3.10.3 Voorbereiding van de microcarriers In deze thesis werd gebruik gemaakt van goudpartikels als microcarriers. Met behulp van een microbalans werden 7.5 mg microcarriers met een diameter van 1 µm afgewogen in een 1.5 ml eppendorfbuisje. Deze hoeveelheid was voldoende voor 15 beschietingen. Daarna werd 1.5 ml (70 %) ethanol toegevoegd. Deze ethanol diende om de microcarriers te steriliseren. Het buisje werd gedurende 5 minuten grondig geschud. Vervolgens werd het buisje gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. De microcarriers werden gepelleteerd door ze 5 seconden af te draaien in een microcentrifuge bij 10,000 tpm. Het supernatans werd verwijderd. Daarna werd de volgende cyclus driemaal herhaald: één ml steriel water werd toegevoegd aan de pellet, het buisje werd gedurende één minuut geschud waarna de partikels gedurende één minuut konden uitzakken. Daarna werden de microcarriers gepelleteerd door ze gedurende 2 seconden te centrifugeren bij 7,000 toeren per minuut. Na het herhalen van die cyclus werd 125 µl van een steriele 50% glycerol oplossing toegevoegd zodat de microcarriers een concentratie van 60 mg/ml hadden. De microcarriers konden gedurende twee weken bij kamertemperatuur bewaard worden.

3.10.4 Coaten van DNA op de microcarriers Na het wassen van de microcarriers werden 25 µl aliquots van de microcarriers overgebracht in 1.5 ml eppendorfbuisjes. Elke aliquot bevatte materiaal voor 3 beschietingen omdat voor elk construct drie maal een transformatie uitgevoerd werd op drie verschillende platen. Aan elke aliquot werd 2.5 µl DNA (1µg/µl), 25 µl CaCl 2 (2.5 M) en 10 µl spermidine (0.1 M) toegevoegd. Zowel CaCl2 als spermidine zijn vers bereide oplossingen die gesteriliseerd werden met behulp van 0.2 µm filters. De buisjes werden gedurende 3 minuten geschud. Daarna liet men de microcarriers gedurende 1 minuut uitzakken. Met behulp van een microcentrifuge werden de microcarriers gepelleteerd bij 10,000 tpm gedurende twee seconden. Het supernatans werd verwijderd. In elk eppendorfbuisje werd 140 µl (70%) ethanol toegevoegd zonder de pellet te verstoren waarna het supernatans opnieuw verwijderd werd. Daarna werd 140 µl (100%) ethanol toegevoegd zonder de pellet te verstoren. De vloeistof werd verwijderd. Vervolgens werd 24 µl (100%) ethanol toegevoegd. De pellet werd opnieuw in suspensie gebracht door licht tegen de wand van het buisje te tikken en daarna zacht te schudden gedurende 3 seconden. Met een pipet werd 8 µl uit de aliquots genomen en op het midden van een macrocarrier (zie 3.10.1) gebracht.

35

Materiaal en methoden 3.10.5 Transformatie Om cellen te transformeren met het opgezuiverde plasmide DNA werd een ‘rupture disc’ (zie 3.10.1) gesteriliseerd door het schijfje kort in isopropanol te brengen. Dit schijfje mocht niet geautoclaveerd worden omdat het door de vervormingen die de warmte veroorzaakt niet meer op de juiste druk zou breken. Vervolgens werd dit schijfje in het PDS-1000/He ‘particle delivery system’ van Bio-Rad gemonteerd. De macrocarrier en het ‘stopping screen’ werden in het ‘microcarrier launch assembly’ geplaatst. Dit ‘launch assembly’ systeem werd onder de ‘rupture disc’-houder gemonteerd. De voedingsbodem met de te transformeren cellen werd 6 cm onder de ‘microcarrier launch assembly’ geplaatst. Daarna werd de kamer van het Bio-Rad toestel afgesloten en vacuüm gezogen tot 25 inch kwikdruk. Onmiddellijk daarna werd de He-druk opgebouwd. Bij ongeveer 900 psi helium-druk werden de cellen beschoten.

3.11 Confocale microscopie en fotobewerking Voor deze thesis werd gebruik gemaakt van een Bio-Rad Radiance 2000 confocale fluorescentie laser scanning microscoop om opnamen te maken van cellen die EGFP tot expressie brachten. Een confocale laser microscoop is een speciale versie van een fluorescentiemicroscoop. Een coherente Argon-ion laserbron zendt licht uit op twee golflengen, namelijk 488 nm en 514 nm. Een excitatiefilter laat enkel het licht met een welbepaalde golflengte door. Vervolgens wordt dit licht op een dichroïsche spiegel weerkaatst in een hoek van 90°. Hierdoor valt het licht op het te bekijken staal. Het licht met de golflengte van 488 nm werd gebruikt om GFP te exciteren. De gebruikte objectiven zijn: een 10x plan apochromatische lens met een numerieke apertuur (NA) van 0.45, een 40x immersie-olie plan apochromatische lens met een NA van 1.30 of een 60x immersie-olie plan apochromatische lens met een NA van 1.20. Aanwezige fluorochromen zenden na excitatie licht uit. De golflengte van dit uitgestraalde licht is hoger dan de golflengte van het ingestraalde licht. Hierdoor kan het licht door de dichroïsche spiegel passeren. Een emissiefilter filtert het licht nogmaals voor het bij het objectief komt. Een nadeel van de klassieke fluorescentiemicroscopie is dat het fluorescentielicht dat afkomstig is van boven of onder het focusvlak mee het beeld vormt. Confocale microscopen hebben dit probleem grotendeels opgelost door te werken met puntexcitatie en puntdetectie. Puntdetectie wordt gerealiseerd door net voor de detector een ‘pinhole ’(= iris) te plaatsen zodat enkel het licht dat uit het focusvlak van het bekeken object komt doorgelaten wordt. Om een 2D-beeld te registreren vanuit een puntbelichting moet een ‘scanning’ systeem aangewend worden. Dit kan gebeuren door de objecttafel te laten bewegen of door de laserstraal, met behulp van

36

Materiaal en methoden spiegels, het volledige beeld te laten aftasten. Het scansysteem bepaalt de snelheid waarmee een beeld kan opgenomen worden. Met behulp van een focusmotor is het mogelijk om het focusvlak in de z richting te verplaatsen. Hierdoor kan het bekeken object in schijfjes verdeeld worden (de z- serie). Deze schijfjes kunnen softwarematig met behulp van ImageJ omgezet worden tot een 3-dimensioneel beeld van het bekeken object. Hoe kleiner de stap die tussen elk schijfje zit, hoe correcter de ruimtelijke reconstructie van het bekeken object wordt. De detectie gebeurt door een fotomultiplier. Wanneer er fotonen op fotosensitieve kathodes vallen, worden, er foto-elektronen gevormd. Deze worden omgezet in een spanning die geamplificeerd en geconverteerd wordt naar een digitale waarde. Met behulp van het Lasersharp softwarepakket is het mogelijk opnamen te maken. Met deze software kan een methode met een bepaalde stralengang en filtercombinatie gekozen worden. Laserinte nsiteit, scansnelheid, irisdiameter (= ‘pinhole’ diameter), opbrengst (= de amplificatie van het signaal op de detector) en de compensatiefactor (= getal dat bij elke pixelwaarde bijgeteld of afgetrokken wordt) zijn variabelen die aangepast kunnen worden om een optimale opname te maken. Nadat alle variabelen ingesteld zijn en de boven- en onderzijde van het bekeken object afgebakend zijn, wordt de Kalman opnamefilter geselecteerd. Deze filter neemt een aantal opnamen van eenzelfde punt en berekent daarvan de gemiddelde waarde. Hierna kan de opname beginnen.

De opnamen die gemaakt zijn met de confocale laser scanning microscoop werden bekeken en bewerkt met ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/) en

Adobe Photoshop. ImageJ maakt het oa.

mogelijk om een z-serie van een bekeken cel samen te voegen in één figuur (de z-projectie). Hierdoor wordt een globaal beeld verkregen van de lokalisatie van het gebruikte fluorochroom in de volledige cel.

3.12 Media, buffers en oplossingen

3.12.1 Murasige-Skoog medium (MS medium) Vloeibaar MS medium bevat de volgende componenten:  Micro- en macro-elementen:

4.3 g

 sucrose:

30 g

 KH2PO4:

0.2 g

 1 M KOH gebruiken om pH aan te passen tot :

5.7-5.8

 water toevoegen tot 1 l

37

Materiaal en methoden Vast MS medium voor BY-2 cellen bevat de zelfde componenten als het vloeibaar MS medium met daarbij nog de volgende componenten:  0.5 % agar  0.2 M sorbitol  0.2 M mannitol

Sorbitol (0.2 M) en mannitol (0.2 M) geven het medium een isotone samenstelling ten opzichte van de BY-2 cellen zodat deze cellen geen osmotische stress zouden ondervinden door de transformatie methode. Het mengsel wordt gedurende 15 minuten bij 121°C geautoclaveerd en afgekoeld tot 60°C waarna (1,000x) BY-2 vitaminen (zie 3.12.2) toegevoegd werden in een 1x concentratie.

3.12.2 Vitamine stock (1000x) BY-2 celcultuur:  2,4D (auxine, oplossen in 1 ml ethanol):

0.02 g

 thiamine:

0.05 g

 myo-inositol:

5g

 water toevoegen tot 50 ml Na steriliseren met behulp van een 0.2 µm filter wordt de stock gealliquoteerd en bewaard bij -20°C.

3.12.3 Luria Bertani (LB)- medium: Vloeibaar LB- medium bestaat uit de volgende componenten:  bacto Tryptone

10 g

 gistextract

5g

 NaCl:

5g

 water toevoegen tot 1 l

Het medium moet gedurende 20 minuten bij 121°C geautoclaveerd worden. Indien men een antibioticum wil toevoegen om een selectief medium te bekomen moet men het medium laten afkoelen tot ongeveer 60°C alvorens het antibioticum toe te voegen zodat het antibioticum niet onstabiel wordt. Na de bereiding kan het medium gedurende één maand bij 4°C bewaard worden.Om vaste LB-voedingsbodems te maken moet er vóór het autoclaveren 15 g/l agar toegevoegd worden aan het mengsel. Het medium moet tot ongeveer 60°C afgekoeld worden voor er een selectiemerker kan toegevoegd worden en de voedingsbodems gegoten kunnen worden in steriele petriplaten.

38

Materiaal en methoden 3.12.4 Buffers voor plasmide DNA isolatie met behulp van zelf bereide oplossingen Buffer I voor miniprep bevat de volgende componenten:  50 mM Tris-HCL (pH 8)  50 mM Glucose  10 mM EDTA Deze producten moeten in water opgelost worden.

Buffer II voor miniprep bevat de volgende componenten:  200 mM natriumhydroxide  1% Triton Deze producten moeten in water opgelost worden.

Buffer III voor miniprep bevat de volgende componenten:  3 M Natriumacetaat (pH 4.8) Dit product moet in water opgelost worden.

3.12.5 Tris-acetaat EDTA –buffer (TAE) Voor een 50x geconcentreerde TAE oplossing wordt 242 g Tris in 500 ml water opgelost. Hierna wordt er 100 ml 0.5 M Na 2EDTA (pH 8.0) en 57.1 ml acetaat toegevoegd. De oplossing wordt met water aangelegd tot 1000 ml. Het mengsel kan op kamertemperatuur bewaard worden.

3.12.6 Agarosegel ladingsbuffer Een 6X geconcentreerde ladingsbuffer oplossing bevat 0.09% bromophenol blue, 0.09% xylene cyanol FF, 60% glycerol en 60mM EDTA (Fermentas, Burlington, Canada).

3.12.7 DNA-referentie ladder TM

Voor deze thesis werd gebruik gemaakt van de GeneRuler

DNA ladder mix (Fermentas,

#SMO331) als referentiemateriaal voor DNA fragmenten die met behulp van agarosegelelectroforese gescheiden worden. Deze mix wordt bewaard in 10 mM Tris-HCl (pH 7.6) en 1 mM EDTA.

39

Resultaten

Deel 4. Resultaten Om de cellulaire lokalisatie van Nictaba mutanten te kunnen bestuderen in levende plantencellen werden deze mutante varianten gekloneerd als fusieconstruct met vrij EGFP. De plantencellen die bij deze studie gebruikt werden zijn BY-2 cellen en ajuin epidermiscellen. Als controles bij deze lokalisatiestudies werd het vrij EGFP gebruikt alsook de ‘wild-type’ (WT) variant van Nictaba die gekloneerd was als fusieconstruct met dit EGFP. In de volgende paragrafen worden eerst de cellulaire lokalisatie van de twee controles besproken. Daarna worden de klonering en de lokalisatie van de mutante Nictaba-varianten in detail besproken. Deze mutanten zijn:  het Nictaba NLS (102KTAK105) construct;  het WT Nictaba ( KKKK ) construct met een vacuolair ‘targeting’ signaal; 102

105

 het Nictaba NLS (102KTAK105) construct met een vacuolair ‘targeting’ signaal;  het WT Nictaba (102KKKK 105) construct voorzien van een chloroplast ‘targeting’ signaal.

4.1 Vrij EGFP Als eerste controle werd de coderende sequentie (CDS) van EGFP in de pK7WG2 expressievector van Karimi Mansour gerecombineerd. Dit leverde het pK7F2 plasmide op (zie 3.3). Deze expressievector werd opgezuiverd en daarna met behulp van ‘particle bombardment’ in BY-2 cellen en ajuin epidermis cellen getransformeerd. De lokalisatie van het vrij EGFP werd met behulp van een CFLSM bestudeerd (zie 3.11). In Figuur 4.1 wordt de schematische voorstelling van het pK7F2 plasmide gegeven. In Figuur 4.2 wordt een BY-2 cel (a, b en c) en een ajuin epidermiscel (d, e en f) getoond waar vrij EGFP tot expressie komt. Voor zowel de BY-2 cel als voor de ajuin epidermiscel (respectievelijk b en e) wordt een z-projectie gegeven om een overzichtsbeeld van de EGFP lokalisatie in de cel te krijgen alsook een transmissiebeeld (respectievelijk c en d).

Figuur 4. 1 Schematische voorstelling van het pK7F2 plasmide.

40

Resultaten

Figuur 4.2 Confocale opnames van vrij EGFP in getransformeerde BY-2 cellen (a,b en c) en ajuin epidermiscellen (d, e en f) . a + d) sectie doorheen de plantencel. b+ e) z-projectie. c+ f) transmissiebeeld. De schaalbalk stelt in a, b en c 10 µm voor en in d, e en f 50 µm

De opnames zijn 20 h na de transformatie gemaakt en zijn reproduceerbaar bij elke herhaling van het transformatieprotocol. Uit Figuur 4.2 a, b, d en e bleek dat er fluorescentie gedetecteerd werd in zowel de kern als in cytoplasmatische strengen. Het vrije EGFP is klein genoeg om naar de kern te migreren. Dit komt overeen met wat verwacht werd (Hanson & Kohler, 2001). In Figuur 4.2 a is een niet gekleurde cirkel te zien in de celkern. Dit is de compacte nucleolus. Vrij EGFP kan niet in deze compacte structuur migreren en daardoor wordt er geen fluorescentie waargenomen in deze structuur. In ajuin epidermiscellen is het niet mogelijk om de nucleolus te onderscheiden (zie Figuur 4.2 d en e).

4.2 Nictaba-EGFP Als tweede controle werd de CDS van Nictaba in de pK7WGF2 expressievector van Karimi Mansour gerecombineerd. Dit leverde het pK7NGF2 plasmide op waarin de CDS van Nictaba aan het 3’ einde van de CDS van vrij EGFP geligeerd was. Het opgezuiverde pK7NGF2 werd via ‘particle bombardment’ in BY-2 cellen getransformeerd. De lokalisatie van het Nictaba -EGFP fusieproduct werd met behulp van een confocale laser scanning microscoop bestudeerd. In Figuur 4.3 wordt een schematische voorstelling van het pK7NGF2 plasmide gegeven.

41

Resultaten

Figuur 4. 3 Schematische voorstelling van het pK7NGF2 plasmide

In Figuur 4.4 worden BY-2 cellen getoond waar dit fusieproduct tot expressie komt, op verschillende tijdspunten (a en b: 24 h; c: 40 h) na de transformatie.

Figuur 4. 4 Confocale opnames van Nictaba-EGFP in getransformeerde BY-2 cellen. a,b) opnames 24 h na de transformatie. c) opname 40 h na de transformatie. De schaalbalk stelt 10 µm voor.

Uit Figuur 4.4 a en b bleek dat de lokalisatie van het Nictaba- EGFP construct sterke overeenkomst vertoonde met de lokalisatie van het vrij EGFP construct. Ongeveer 24 h na de transformatie werd fluorescentie gedetecteerd in de kern en in cytoplasmatische strengen. De compacte nucleus lichtte niet op. Uit Figuur 4.4 c bleek dat de fluorescentie 40 h na de transformatie niet meer detecteerbaar is in de kern maar wel nog rond de kern en in het cytoplasma. Hieruit kon afgeleid worden dat er mogelijk een migratie van het fusie-eiwit plaatsvond. BY-2 cellen kunnen rond of langwerpig zijn. Dit verklaarde het verschil in vorm tussen de cellen die weergegeven zijn in Figuur 4.4 a,b en c.

42

Resultaten

4.3 Nictaba gemuteerd ter hoogte van het nucleair lokalisatiesignaal Zoals in 1.2.2 werd vermeld bevat de Nictaba sequentie een vermoedelijk nucleair lokalisatiesignaal (NLS) (102 KKKK105). Om de functionaliteit van het signaal te controleren, werd er via PCR een mutatie ingebouwd in dit signaal. De CDS van deze mutanten werd in het pK7WGF2 plasmide gekloneerd met behulp van het Gateway TM systeem (zie 3.2). Door deze recombinatie werd het 5’ einde van de sequentie van de mutant verbonden met het 3’ einde van de CDS van EGFP. Dit EGFP maakt de controle en analyse van de lokalisatie van de fusie-eiwitten mogelijk. Eerdere pogingen van ir. N. Lannoo waarbij het NLS gemuteerd werd naar een KQKK en naar een deletie van het tweede en het derde lysine leverde geen expressie op van de constructen na transformatie. Daarom werd een derde construct gemaakt waarbij het tweede en het derde aminozuur van het vermoedelijke NLS vervangen werden in een threonine en een alanine ( 102 KTAK 105). Threonine en alanine zijn kleine aminozuren die de ruimtelijke structuur (opvouwing) van het NLS grondig verstoren. In Figuur 4.5 worden de chemische formules van lysine (K), threonine (T) en alanine (A) gegeven.

Figuur 4. 5 Chemische formule van lysine, threonine en alanine

Bovendien zijn deze mutaties makkelijk in te bouwen omdat het codon voor threonine of alanine niet veel verschillen met dat van lysine. Het codon ‘AAA’ (K) wordt omgezet naar ‘ACA’ (T) en het codon ‘AAG’ (K) wordt omgezet naar ‘GCG’ (A).

In Figuur 4.6 wordt een overzicht gegeven van de kloneringsstrategie die gevolgd is voor de constructie van deze mutant. In de volgende paragrafen zal elke stap verder uitgewerkt worden.

43

Resultaten

Figuur 4. 6 Overzicht van de constructie en de klonering van de Nictaba NLS mutant, gekoppeld aan EGFP

44

Resultaten 4.3.1 De

Aanmaak van het attB-PCR product: theoretisch 102

KTAK105-mutatie zal ingebouwd worden via PCR (zie Figuur 4.6 en Figuur 4.7). Bij de

PCR wordt gebruik gemaakt van primers die de mutatie bevatten en die een overlap hebben. Het construct wordt in twee stappen opgebouwd. Naast de aanpassingen aan het NLS moeten we ook de nodige signalen voorzien om dit construct tot expressie te laten komen als een EGFP -fusie-eiwit. Hiervoor moeten attB-plaatsen ingebouwd worden in het construct.

Een eerste PCR zal opgezet worden op de CDS van Nictaba, die gekloneerd zit in het pT1.01 plasmide, met de primers EVD 5 en EVD 25. De primer EVD 5 kan binden op het 5’ einde van de CDS van Nictaba. De primer EVD 25 kan binden op het 3’ einde van het NLS. De primer die overlapt met het NLS heeft een mismatch voor drie nucleotiden. Deze mismatch komt voor op de plaatsen waar we een mutatie willen aanbrengen. Door het PCR-programma aan te passen (door een daling van de ‘annealing’ temperatuur) kan de primer toch binden op het DNA. De NLS sequentie zal hierdoor veranderd worden van ‘AAG AAA AAG AAA’ naar ‘AAG ACA GCG AAA’. Om dit construct in de pK7WGF2 vector (zie Figuur 3.4 a) te kunnen inbouwen moeten er attB-plaatsen voorzien worden. De CDS van EGFP die met het 5’ einde van de Nictaba mutant verbonden is bevat een startcodon. Daarom moet het startcodon uit de CDS van Nictaba verwijderd worden. De primer EVD 5 bevat reeds een deel van de attB1-plaats. In een volgende PCR kan deze attB-1 plaats dan vervolledigd worden. In Figuur 4.7 a wordt de 5-25 PCR schematisch voorgesteld en in Figuur 4.7 b wordt het resultaat van deze 5-25 PCR weergegeven.

Figuur 4.7 Schematische voorstelling van: a) de PCR op de CDS van Nictaba met de primers EVD 5 en EVD 25 en b) het 5-25 PCR-product.

In een tweede PCR op de CDS van Nictaba zullen de primers EVD 26 en EVD 3 respectievelijk binden op de 5’ einde van het NLS en op het 3’ einde van de CDS van Nictaba. De primer die zal binden op het NLS heeft drie mismatchen zoals ook het geval was voor de primer in de eerste PCR. Door het PCR -programma te optimaliseren (door een daling van de ‘annealing’

45

Resultaten temperatuur’) is het mogelijk de primer te laten binden op de CDS van Nictaba. Na een eerste PCRcyclus is de mutatie in het NLS ingebouwd, maar zoals het 5-25 PCR-product bevat dit product ook maar een deel van de CDS van Nictaba. Ook tijdens deze PCR gebeurt er een aanpassing aan het construct om recombinatie in het GatewayTM systeem mogelijk te maken. De primer EVD 3 bevat namelijk een stukje van de attB-2 plaats. In een volgende PCR zal deze plaats vervolledigd kunnen worden. In Figuur 4.8 a wordt een schematische voorstelling van deze PCR gegeven en in Figuur 4.8 b wordt het 26-3 PCR-product getoond.

Figuur 4.8 Schematische voorstelling van: a) de PCR op de CDS van Nictaba met de primers EVD 26 en EVD 3 en b) het 26-3 PCR-product.

Tijdens een derde PCR zullen het 5-25 PCR-product en het 26-3 PCR-product aan elkaar geligeerd worden. Dit is mogelijk omdat beide constructen een overlapping hebben ter hoogte van het mutante NLS. Figuur 4.9 a toont op schematische wijze hoe deze PCR zal uitgevoerd worden en in Figuur 4.9 b wordt het resultaat van deze 5-5-25-26-3-3 PCR weergegeven.

Figuur 4.9 Schematische voorstelling van: a) de PCR op het 5-25 PCR-product en het 26-3 PCR product om deze twee producten samen te brengen en b) het 5-5-25-26-3-3 PCR-product.

Tenslotte moeten de attB-plaatsen vervolledigd worden in een vierde PCR met de primers EVD 2 en EVD 4. In Figuur 4.10 a wordt deze PCR schematisch weergegeven en in Figuur 4.10 b wordt het resultaat van deze PCR gegeven.

46

Resultaten

Figuur 4.10 Schematische voorstelling van: a) de PCR om de attB-plaatsen van het 5-5-25-26-3-3 PCRproduct te vervolledigen en b) het 2-5-5-25-26-3-3-4 PCR-product met volledige attB-plaatsen.

In Tabel 4.1 worden de sequenties van de primers die nodig zijn voor de constructie van deze NLS mutant weergegeven.

Tabel 4. 1 Sequenties van de primers die gebruikt zijn voor de constructie van de Nictaba NLS mutant EVD 5

5’ AAA AAG CAG GCT TCC AAG GCC AGT GGA TAG CCG C 3’

34 nt

EVD 25

5’ CCT GGT AAT TTC GCT GTC TTC GAG ATG AAA ACA GTG G 3’

37 nt

EVD 26

5’ CCA CTG TTT TCA TCT CGA AGA CAG CGA AAT TAC CAG G 3’

37 nt

EVD 3

5’ AGA AAG CTG GGT GTT AGT TTG GAC GAA TGT CGA AGC C 3’

37 nt

EVD 2

5’ GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CT 3’

29 nt

EVD 4

5’ GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT 3’

29 nt

4.3.2

Aanmaak van het attB-PCR-product: praktisch

De PCR op het T1.01 plasmide met de primers EVD 5 en EVD 25 leverde een specifiek fragment van ongeveer 300 bp op (334 bp verwacht). Het resultaat van deze PCR wordt in laan 1 van Figuur 4.11 a getoond. Een tweede PCR op het T1.01 plasmide met de primers EVD 26 en EVD 3 leverde een specifiek fragment van ongeveer 200 bp op (225 bp verwacht). Het resultaat van deze PCR wordt in laan 2 van Figuur 4.11 a gegeven. In een derde PCR werden de twee bekomen fragmenten aan elkaar gekoppeld met behulp van de primers EVD 5 en EVD 3. Het ‘template’ van deze PCR bestond uit 20 ng 5-25 PCR-product en 20 ng 26-3 PCR-product. Deze PCR met de primers EVD 5 en EVD 3 leverde verschillende fragmenten op waaronder een fragment van ongeveer 500 bp (522 bp verwacht). Dit laatste fragment werd uit een agarosegel geïsoleerd volgens de methode die beschreven wordt in 3.7. Het resultaat van deze isolatie wordt in laan 1 van Figuur 4.11 b gegeven. Het opgezuiverde fragment werd via een PCR met de primers EVD 5 en EVD 3 geamplificeerd. Het resultaat van deze PCR wordt in laan 1 van Figuur 4.11 c gegeven. Het PCR-mengsel dat voor deze PCRs gebruikt werd is het standaard mengsel 2 dat beschreven wordt in 3.8. De programma’s van deze PCRs worden in de Tabel 4.2 weergegeven.

47

Resultaten

Figuur 4.11 DNA gelelektroforese van de PCRs voor de aanmaak van de Nictaba NLS mutant. R: referentieladder. a) 1: 5-25 PCR-product, 2: 26-3 PCR -product. b) 1: isolatie van het 5-5-25-26-3-3 PCRproduct. c) 1: 5-5-5-25-26-3-3-3 PCR-product na opzuivering.

Tabel 4.2 De programma’s van de gevolgde PCR’ s met de primers EVD 5- EVD 25, EVD 26- EVD 3 en EVD 5-EVD 3 primers

EVD 5-25

denaturatiestap

2’

94°C

2’

94°C

2’

94°C

denaturatiestap

15”

94°C

15”

94°C

15”

94°C

annealingstap

30”

55°C

30”

55°C

30”

55°C

elongatiestap

20”

72°C

13”

72°C

31”

72°C

elongatiestap

5’

72°C

5’

72°C

5’

72°C

‘template’

pT1.01 met Nictaba pT1.01 met Nictaba 1)5-25

cyclus (25x)

CDS

EVD 26-3

CDS

EVD 5-3

PCR-product

en 26-3 PCR-product 2) opgezuiverd 5-525-26-3-3

PCR-

product verwachte lengte

334 bp

225 bp

522 bp

Het 5-5-5-25-26-3-3-3 PCR-product werd als ‘template’ gebruikt voor een vierde PCR met de primers EVD 2 en EVD 4. Deze PCR dient om de attB-plaatsen te vervolledigen. Tijdens het optimaliseren van de PCR-programma’s en het Gateway TM kloneringsysteem bleek dat de kloneringreacties beter verlopen indien een extra adapter -PCR met de primers EVD 2 en EVD 4 uitgevoerd wordt op het 2-5-5-5-25-26-3-3-3-4 PCR-product. Het resultaat van beide adapter-PCRs 48

Resultaten wordt in Figuur 4.12 weergeven. Deze PCRs leverden een fragment van ongeveer 550 bp op (556 bp

Deleted: Figuur 4.12

verwacht). Het PCR-mengsel dat voor deze PCRs gebruikt werd is het standaard mengsel 2 dat Formatted: Font: 11 pt, Not Bold

beschreven wordt in 3.8. De programma’s van deze PCRs worden in de Tabel 4.3 weergegeven.

Formatted: Font: 11 pt, Not Bold Deleted: Tabel 4.3 Formatted: Font: 11 pt, Not Bold, Do not check spelling or grammar

Figuur 4.12 DNA gelelektroforese van de PCRs voor de aanmaak van de Nictaba NLS mutant. R: referentie-ladder. 1: 2-2-5-5-5-25-26-3-3-3-4-4 PCR product. 2: 2-5-5-5-25-26-3-3-3-4 PCR-product.

Tabel 4.3 De programma’s van de adapter PCRs met de primers EVD 2 - EVD 4 primers denaturatiestap

EVD 2- EVD 4

primers

extra EVD 2-EVD 4

2’

94°C

denaturatiestap

denaturatiestap

15”

94°C

cyclus (25x)

annealingstap

30”

50°C

elongatiestap

34”

72°C

denaturatiestap

15”

94°C

annealingstap

30”

55°C

elongatiestap

34”

72°C

elongatiestap

5’

72°C

‘template’

5-5-5-25-26-3-3-3 ‘template’

2-5-5-5-25-26-3-3-

PCR-product

3-4 PCR-product

cyclus (5x)

cyclus (25x)

verwachte lengte

4.3.3

556 bp

elongatiestap

verwachte lengte

2’

94°C

denaturatiestap

15”

94°C

annealingstap

30”

55°C

elongatiestap

34”

72°C

5’

72°C

556 bp

De BP-reactie

Vervolgens werden er twee BP-reacties opgezet. Een eerste reactie gebruikte het product van de originele adapter PCR met de primers EVD 2 en EVD 4 als ‘template’. De tweede reactie maakte gebruik van extra geamplificeerd adapter PCR-product.

49

Resultaten Het 2-5-5-5-25-26-3-3-3-4 PCR-product werd gebruikt voor een BP-reactie met de donorvector pDONR-221. De reactie werd opgebouwd zoals beschreven is in 3.2.2. Het BP-product werd in bacteriële cellen getransformeerd die overnacht gegroeid werden. De aanwezigheid van de Nictaba mutant werd in een aantal geselecteerde kolonies getest met behulp van kolonie-PCR (zie 3.9). Deze PCR gebeurde met de twee primers die gebruikt zijn om de twee aparte fragmenten van dit construct aan elkaar te plaatsen, namelijk EVD 5 en EVD 3 en met het Taq-polymerase. Het is beter om deze primers te gebruiken in plaats van EVD 2 en EVD 4 omdat een deel van de attB-plaatsen die door deze primers herkend wordt verdwenen is in de homologe recombinatie. Het programma van deze kolonie-PCR wordt in Tabel 4.4 weergegeven. De DNA gelelektroforese die het resultaat van Deleted: Figuur 4.13

deze PCR visualiseert wordt in Figuur 4.13 weergegeven.

Figuur 4.13 DNA gelelektroforese van de kolonie-PCR met de primers EVD 5 en EVD 3 op 6 kolonies die met het product van de eerste BP-reactie getransformeerd zijn. R: referentie-ladder.

Tabel 4.4 Het programma dat gevolgd werd voor de kolonie-PCR op kolonies die met het BP/LR-product van het Nictaba NLS construct getransformeerd waren primers

EVD 5- EVD 3

denaturatiestap

10’

94°C

denaturatiestap

15”

94°C

annealingstap

30”

55°C

elongatiestap

31”

72°C

elongatiestap

5’

72°C

‘template’

kolonie die het BP/ LR-product bevat

verwachte lengte

522 bp

cyclus (25x)

50

Resultaten De kolonies 1, 2 en 3 in de respectievelijke lanen 1, 2 en 3 van Figuur 4.13 bevatten een fragment van ongeveer 500 bp (522 bp verwacht).

In de tweede BP-reactie werd het 2-2-5-5-5-25-26-3-3-3-4-4 PCR-product als ‘template’ gebruikt voor de reactie met de donorvector pDONR-221. Deze reactie verliep analoog aan de eerste BP-reactie van dit construct. Na overnacht groeien werden er 10 kolonies gecontroleerd met behulp van kolonie-PCR. Deze kolonie-PCR verloopt analoog met zoals die van de eerste BP-reactie en het programma wordt in Tabel 4.4 gegeven. Het resultaat van deze kolonie-PCR met de primers EVD 5 en EVD 3 wordt in Figuur 4.14 weergegeven. Na de incubatie overnacht valt het op dat er ontelbaar meer kolonies gegroeid zijn dan bij de transformatie met het product van de eerste BP-reactie.

Figuur 4.14 DNA gelelektroforese van de kolonie-PCR met de primers EVD 5 en EVD 3 op de 10 geteste kolonies die getransformeerd zijn met het product van de tw eede BP-reactie. R: referentieladder.

Alle geteste kolonies waarvan de resultaten in Figuur 4.14 weergegeven zijn, met uitzondering van de kolonie 1 (laan 1), bevatten een fragment van ongeveer 500 bp (522 bp verwacht). De ‘entry’-vector van kolonie twee (laan 2) uit Figuur 4.14 werd opgezuiverd met behulp van de Qiagen miniprep kit (zie 3.6). Daarna werd het construct (1 µg) dat in deze ‘entry’-vector gekloneerd was gesequeneerd met behulp van de primers EVD 5 en EVD 3 (zie 3.2.1). Vergelijking tussen de theoretische sequentie en de gesequeneerde sequentie bevestigde de correcte aanwezigheid van de mutatie in het NLS en de afwezigheid van het startcodon in de mutante Nictaba CDS.

51


Resultaten 4.3.4

De LR-reactie

Er werd een LR-reactie opgezet volgens de methode die beschreven wordt in 3.2.2. Tijdens deze reactie kon de opgezuiverde ‘entry’- vector van kolonie 2 (laan 2) uit Figuur 4.14 reageren met de ‘destination’-vector pK7WGF2. Het product van de LR-reactie werd in bacteriële cellen getransformeerd die overnacht gegroeid werden. De volgende dag werden 6 kolonies geselecteerd om met behulp van kolonie-PCR en de primers EVD 5 en EVD 3 te controleren of de ‘entry’-vector op een correcte manier met de ‘destination’-vector gerecombineerd had. Het resultaat van deze koloniePCR wordt in Figuur 4.15 getoond. Het programma van deze kolonie-PCR wordt in Tabel 4.4


gegeven.

Figuur 4.15 DNA gelelektroforese van de kolonie -PCR met de primers EVD 5 en EVD 3 op de 6 geteste kolonies die getransformeerd zijn met het LR- product van de Nictaba NLS mutant. R: referentieladder.

Uit Figuur 4.15 bleek dat alle geteste kolonies, met uitzondering van kolonie 1 (laan 1) een fragment van ongeveer 500 bp (522 bp verwacht) bevatten. Kolonie 5 uit de laan 5 van Figuur 4.15 werd opgegroeid in vloeibaar LB-medium met 50 µg/ml spectinomycine. De expressievector, pK7ΔNGF2, werd met behulp van de Qiagen midiprep kit opgezuiverd en via ‘particle bombardment in BY-2 cellen getransformeerd (zie 3.10).

4.3.5

De lokalisatie van Nictaba-EGFP, waarbij Nictaba gemuteerd is in de NLS sequentie

Met behulp van ‘particle bombardment’ werd een reeks BY-2 cellen getransformeerd met het pK7ΔNGF2 plasmide. Een andere reeks BY-2 cellen werd als controle getransformeerd met het vrij EGFP construct of met het WT Nictaba-EGFP construct. De lokalisatie van beide controleconstructen zijn beschreven onder deel 4.1 en 4.2. In Figuur 4.16 wordt een reeks confocale doorsneden (a) en een transmissiebeeld (b) gegeven van een getransformeerde BY-2 cel, 43 uur na de transformatie met het pK7ΔNGF2 plasmide.

52

Deleted: Figuur 4.15 Deleted: Figuur 4.15

Resultaten

Figuur 4.16 Confocale beelden van een transgene BY-2 cel, 40 uur na transformatie met het pK7ΔNGF2 plasmide. a) doorsnede van een BY-2 cel die de Nictaba NLS mutant tot expressie brengt als een fusieproduct met EGFP. b) transmissiebeeld van deze BY-2 cel.

Vrij EGFP was vanaf 40 uur na de transformatie detecteerbaar in BY-2 cellen. BY-2 cellen die getransformeerd waren met het pK7ΔNGF2 plasmide brachten het Nictaba NLS mutant-EGFP construct tot expressie vanaf 40 uur na de transformatie. Deze expressie was 60 uur na de transformatie nog steeds detecteerbaar en de lokalisatie van het fluorochroom veranderde niet in functie van de tijd, in tegenstelling tot het Nictaba CDS-EGFP construct. In tegenstelling tot het WT

53

Resultaten Nictaba-EGFP construct én het vrij EGFP construct werd er geen fluorescentie gedetecteerd in de kern van cellen die met het pK7ΔNG plasmide getransformeerd waren. Wel is er fluorescentie detecteerbaar rond de kern en in cytoplasmatische strengen. Uit de lokalisatie van dit construct blijkt ook dat de functionaliteit van het NLS uitgeschakeld is omdat er geen fluorescentie gedetecteerd wordt in de kern. In tegenstelling tot het vrij EGFP is het Nictaba NLS mutant-EGFP construct te groot om zonder signaalpeptide in de kern te kunnen migreren. De donkere vlek in de kern die op de confocale doorsneden te zien is, komt vermoedelijk overeen met door de compacte nucleolus. Op de confocale doorsneden is ook een grote, niet fluorescente ruimte te zien. Deze ruimte is vermoedelijk een grote vacuole.

4.4 Nictaba NLS mutant gekoppeld aan een vacuolair ‘targeting’ signaal De expressievector pK7FvacNG2 werd opgebouwd door N. Lannoo. Deze vector brengt een fusie-eiwit tot expressie. De sequentie van dit fusie-eiwit bevat aan het 5’ einde het signaalpeptide en het pro-peptide van sporamine. Deze signalen sturen eiwitten naar de vacuole en worden respectievelijk co- en post-translationeel afgesplitst. De CDS van WT Nictaba werd aan het 3’ einde van deze signaalsequenties gekoppeld. Na recombinatie in het GatewayTM systeem wordt het construct aan het 3’ einde verbonden met het vrij EGFP CDS. Het vrij EGFP CDS werd aan het 3’ van het construct gekoppeld, omdat de signaalsequentie aan het 5’ einde van het fusie-eiwit co-translationeel afgesplitst zal worden. De opbouw van dit construct verliep analoog aan de opbouw van het Nictaba NLS mutant construct met een vacuolair ‘targeting’ signaal (VTS). Daarom zal enkel kloneringsstrategie van het Nictaba NLS mutant construct dat gekoppeld werd aan een VTS in detail uitgewerkt worden. De expressievector pK7FvacNG2 werd via ‘particle bombardment’ (zie 3.10) in BY-2 cellen getransformeerd. In Figuur 4.17 worden confocale doorsneden van BY-2 cellen weergegeven die met het pK7FvacNG2 plasmide getransformeerd waren en die fluorescentie vertoonden. Zoals uit Figuur 4.17 a bleek, werd er vanaf 20 h na de transformatie fluorescentie opgemerkt in deze BY-2 cellen. In Figuur 4.17 b en c wordt een confocale doorsnede gegeven van transgene BY 2 cellen, 40 h na de transformatie. In Figuur 4.17 (d, e en f) worden de transmissiebeelden van deze cellen getoond. Uit de confocale opnamen bleek dat er fluorescentie gedetecteerd werd in of langs de rand van kleine vacuolaire structuren, in het ER en in het Golgi-complex. Ondanks de aanwezigheid van een NLS werd er geen fluorescentie vastgesteld in de kern. Op deze confocale opnamen is het onmogelijk om de nucleolus te lokaliseren. Dit lokalisatiepatroon varieerde niet in functie van de tijd. Deze bevindingen verschillen duidelijk met de lokalisatie van het WT Nictaba-EGFP construct

54

Resultaten waarvan er confocale opnamen getoond worden in Figuur 4.4. De lokalisatie van dit WT NictabaEGFP construct varieerde in functie van de tijd. Ongeveer 22 h na transformatie werd fluorescentie gedetecteerd in en rond de kern en in cytoplasmatische strengen die grote, niet fluorescente vacuoles afbakenden. De nucleolus kwam voor als een donkere vlek in de kern. Ongeveer 40 h na de transformatie verdween de fluorescentie in de kern waardoor ook de nucleolus niet meer te onderscheiden was.

Figuur 4.17 Confocale beelden van transgene BY-2 cellen die het vacuolair ‘getarget’ Nictaba-EGFP transiënt tot expressie brengen. a) confocale doorsnede van een BY-2 cel die Nictaba met een VTS tot expressie brengen als een fusieproduct met EGFP, 24 h na transformatie. b en c) confocale doorsneden van BY-2 cellen die Nicaba met een VTS tot expressie brengen als een fusieproduct met EGFP, 40 h na transformatie. d, e en f) transmissiebeelden. De schaalbalk stelt 10 µm voor.

Toen de lokalisatie van het WT Nictaba-EGFP met een VTS gekend was, werd een construct 102

gemaakt waarbij de mutante Nictaba NLS (

KTAK

105

) sequentie gekoppeld werd aan het VTS van

sporamine. De vergelijking in lokalisatie tussen beide constructen zou informatie kunnen opleveren over de invloed van het NLS op het VTS. De weg die gevolgd was bij het ontwerpen van de beide constructen is analoog en daarom wordt enkel het Nictaba NLS mutant-EGFP construct met een VTS in detail uitgewerkt in de volgende paragrafen. De weg die gevolgd is bij het ontwerpen van dit Nictaba mutant NLS-EGFP construct met een VTS wordt schematisch weergegeven in Figuur 4.18.

55

Resultaten

Figuur 4.18 Overzicht van de constructie van het Nictaba NLS mutant-EGFP construct aan een vacuolair ‘targeting’ signaal

56

Resultaten 4.4.1

Aanmaak van het attB-PCR product: theoretisch

De aanmaak van het attB-PCR product zal gelijkaardig verlopen aan het aanmaken van de Nictaba NLS mutant (zie 4.3). Het vacuolair signaalpeptide en het pro-peptide van sporamine zullen via PCR geïsoleerd worden uit het pUC-SPOA101 plasmide (zie 3.3). De isolatie van dit signaal wordt schematisch weergegeven in Figuur 4.19 a. Het 44-45 PCR-product wordt voorgesteld in Figuur 4.19 b. Dit product bevat aan het 5’ einde reeds een deel van de attB1-plaats en aan het 3’ einde is er een overlap met de CDS van Nictaba. Deze attB-plaats is nodig om het construct in het TM

Gateway

systeem te laten recombineren.

Figuur 4.19 Schematische voorstelling van: a) de PCR op het pUC-SPOA101 plasmide met de primers EVD 44 en EVD 45 en b) het 44-45 PCR-product.

Het Nictaba NLS mutant fragment dat nodig is voor de opbouw van dit construct zal bekomen worden via een PCR op het 5-5-5-25-26-3-3-3 PCR-product (zie 4.3.2) van de Nictaba NLS mutant. De isolatie van dit fragment met de primers EVD 46 en EVD 6 wordt schematisch weergegeven in Figuur 4.20 a. Het bekomen 46-6 PCR-product wordt voorgesteld in Figuur 4.20 b. Het startcodon was reeds uit de Nictaba NLS mutant CDS verwijderd. Het stopcodon zal tijdens deze PCR uit de sequentie verwijderd worden. Dit is nodig om het construct als een fusieproduct met EGFP tot expressie te laten komen (zie verder). Het 46-6 PCR-product zal aan het 5’ einde een overlap met het sporamine signaalfragment bevatten, zodat de twee fragmenten in een volgende PCR verbonden kunnen worden. Aan het 3’ einde zal er een overlap met de attB2-plaats gevormd zijn.

Figuur 4.20 Schematische voorstelling van: a) de PCR op de vector met de sequentie voor sporamine met de primers EVD 46 en EVD 6 en b) het 46-6 PCR-product.

57

Resultaten In een volgende PCR zal het 44-45 PCR-fragment aan het 46-6 PCR-fragment gekoppeld worden. Dit is mogelijk door de overlap tussen de twee fragmenten. In Figuur 4.21 a wordt deze PCR schematisch weergegeven en het resultaat van deze PCR wordt in Figuur 4.21 b getoond. Het sporamine signaal fragment zal aan het 5’ einde van het 46-6 PCR fragment gekoppeld worden. Na de TM

recombinatie in het Gateway

systeem zal de CDS van EGFP aan het 3’ einde van het construct

aanwezig zijn (zie Figuur 4.18). Dit is nodig omdat het signaalpeptide en het pro-peptide van sporamine respectievelijk co- en post-translationeel afgesplitst zullen worden. Indien de CSD van EGFP aan het 5’ einde van het construct aanwezig zou zijn, dan zou het post-translationeel losgekoppeld worden van het Nictaba NLS mutant fragment, waardoor we geen lokalisatie van dit construct zouden kunnen uitvoeren.

Figuur 4.21 Schematische voorstelling van: a) de PCR om het 44-45 PCR-product en het 46-6 PCRproduct aan elkaar te koppelen en b) het 44-44-45-46-6-6 PCR -product.

Vervolgens zullen de attB-plaatsen aan het 5’ einde en aan het 3’ einde van het 44-44-45-6-6 PCR-product vervolledigd worden. Dit zal gebeuren tijdens een adapter-PCR. Het 2-44-44-45-46-6-64 PCR-product zal daarna in een extra adapter-PCR vermeerderd worden. De schematische voorstelling van de eerste adapter-PCR wordt in Figuur 4.22 a geschetst. Het 2-44-44-45-46-6-6-4 PCR-product wordt in Figuur 4.22 b weergegeven.

Figuur 4.22 Schematische voorstelling van: a) de adapter-PCR om de attB-plaatsen te vervolledigen en het 2-44-44-45-46-6-6-4 PCR-product.

58

Resultaten In Tabel 4.5 worden de sequenties van de primers die gebruikt zijn voor het maken van dit construct weergegeven.

Tabel 4.5 Nucleotidensequentie van de gebruikte primers voor de constructie van de Nictaba NLS mutant met het VTS van sporamine EVD 44

5’ AAA AAG CAG GCT TCA CCA TGA AAG CCT TCA CAC TCG C 3’

37 nt

EVD 45

5’ CCA CTG GCC TTG GGC GGG TTC GTG TGT GGT 3’

30 nt

EVD 46

5’CGA ACC CGC CCA AGG CCA GTG GAT AGC CGC 3’

30 nt

EVD 6

5’AGA AAG CTG GGT GGT TTG GAC GAA TGT CGA AGC C 3’

34 nt

EVD 2


29 nt

EVD 4


29 nt

4.4.2


De PCR met de primers EVD 44 en EVD 5 op het pUC-SPOA101 plasmide wordt in laan 1 van Figuur 4.23 getoond en leverde een fragment van ongeveer 150 bp op (140 bp verwacht). Het resultaat van de PCR met primers EVD 46 en EVD 6 op het 5-5-25-26-3-3 PCR-product wordt in laan 2 van Figuur 4.23 en leverde een fragment van ongeveer 500 bp op (515 bp verwacht). De twee fragmenten werden aan elkaar geligeerd met behulp van een PCR met primers EVD 44 en EVD 6 op 20 ng 44-45 PCR-product en 20 ng 46-6 PCR- product. Het 44-44-45-46-6-6 PCR-product wordt in laan 3 van Figuur 4.23 weergegeven en leverde een fragment op van ongeveer 600 bp (627 bp verwacht). De programma’s van deze PCRs worden in Tabel 4.6 weergegeven.

Figuur 4.23 DNA gelelektroforese van de PCRs voor de aanmaak van de Nictaba NLS mutant met een VTS. R: referentieladder. 1: 44-45 PCR-product, 2: 46-6 PCR-product, 3: 44-44-45-46-6-6 PCR-product.

59

Resultaten Tabel 4.6 De programma’s van de PCR’s met de primers EVD 44 en EVD 45, de primers EVD 46 en EVD 6 en de primers EVD 44 en EVD 6 primers

EVD 44- EVD 45

EVD 46- EVD 6

EVD 44- EVD 6

denaturatiestap

2’

94°C

2’

94°C

2’

94°C

denaturatiestap

15”

94°C

15”

94°C

15”

94°C

annealingstap

30”

55°C

30”

55°C

30”

55°C

elongatiestap

cyclus (25x)

8”

72°C

32”

72°C

40”

72°C

elongatiestap

5’

72°C

5’

72°C

5’

72°C

‘template’

pUC-SPOA101

verwachte lengte

5-5-25-26-3-3

140 bp

PCR- 44-45 PCR-product

product

46-6 PCR-product

515 bp

627 bp

De resultaten van deze PCRs waren specifiek zodat een PCR op het 44-44-45-46-6-6 PCRproduct werd opgestart met de primers EVD 2 en EVD 4. Het resultaat van deze adapter-PCR wordt in laan 2 van Figuur 4.24 weergegeven en leverde een fragment van ongeveer 650 bp op (658 bp verwacht). Op het product van deze reactie werd een extra adapter-PCR gedaan omdat dit de efficiëntie waarmee het construct in het Gateway

TM

systeem recombineert bevordert. Het 2-2-44-44-

45-46-6-6-4-4 PCR-product bleek een aspecifiek bandje te hebben (kleiner dan 200 bp). Om dit bandje uit het PCR-product te verwijderen werd dit PCR-mengsel opgezuiverd met behulp van de Qiagen PCR purification kit (zie 3.8). De programma’s van deze PCRs worden in Tabel 4.7 weergegeven.

Figuur 4.24 DNA gelelektroforese van de PCRs voor de aanmaak van het Nictaba NLS mutatie met VTS construct. R: referentie -ladder. 1: 44-44-45-46-6-6 PCR product. 2: 2-44-44-45-46-6-6-4 PCR-product.

60

Resultaten Tabel 4.7 De programma’s van de gevolgde PCR’ s met de primers EVD 5- EVD 25, EVD 26- EVD 3, EVD 5-EVD 3 en EVD 2- EVD 4 primers

EVD 2- EVD 4

primers

extra EVD 2- EVD 4

denaturatiestap

2’

94°C

denaturatiestap

2’

94°C

denaturatiestap

15”

94°C

cyclus (25x)

denaturatiestap

15”

94°C

annealingstap

30”

50°C

elongatiestap

34”

72°C

annealingstap

30”

55°C

denaturatiestap

15”

94°C

annealingstap

30”

55°C

elongatiestap

48”

72°C

elongatiestap

48”

72°C

elongatiestap

5’

72°C

elongatiestap

5’

72°C

‘template’

44-44-45-46-6-6

‘template’

2-44-44-45-46-6-6-4

cyclus (5x)

cyclus (20x)

PCR-product verwachte lengte

4.4.3

658 bp

PCR-product verwachte lengte

658 bp

De BP-reactie

Vervolgens werd een BP-reactie opgestart met het opgezuiverde 2-2-44-44-45-46-6-6-4-4 PCR-product en de donorvector pDONR-221 (zie 3.2.2). Het BP-product werd met behulp van ‘heatshock’ in bacteriële cellen getransformeerd (zie 3.5.1). De aanwezigheid van het construct werd in zes geselecteerde kolonies getest. Dit gebeurde met behulp van een kolonie-PCR met de primers EVD 44 en EVD 6. Deze kolonie-PCR gebeurde volgens de methode die in 3.9 beschreven werd en het resultaat van deze PCR wordt in Figuur 4.25 weergegeven. Het gebruikte programma van deze kolonie-PCR wordt in Tabel 4.8 weergegeven.

Figuur 4.25 DNA gelelektroforese van de kolonie-PCR met de primers EVD 44 en EVD 6 op de 6 geteste kolonies die getransformeerd zijn met de ‘entry’-vector van de Nictaba NLS mutant met het VTS van sporamine. R: referentieladder.

61

Resultaten Tabel 4.8 Het programma dat gevolgd werd voor de kolonie-PCR op kolonies die met het BP/LR-product van de Nictaba NLS mutant met VTS construct getransformeerd waren

primers

EVD 44- EVD 6

denaturatiestap

10’

94°C

denaturatiestap

15”

94°C

annealingstap

30”

55°C

elongatiestap

45”

72°C

elongatiestap

5’

72°C

‘template’

kolonie die het BP/LR product bevat

verwachte lengte

627 bp

cyclus (25x)

Uit Figuur 4.25 bleek dat de kolonies 2, 3 en 5 een fragment van ongeveer 600 bp bevatten (627 bp verwacht). De ‘entry’-vector van kolonie 2 (laan 2) werd opgezuiverd en opgestuurd voor sequenering van het geïnsereerde fragment (zie 3.2.1).

4.4.4

De LR- reactie

Aangezien de sequenering op de geïsoleerde ‘entry’-vector de correcte opbouw van het construct bevestigde, werd de opgezuiverde ‘entry’-vector van kolonie 2 (zie laan 2 Figuur 4.25) gebruikt als ‘template’ voor een LR-reactie. De ‘destination’-vector die voor dit construct gekozen was, is pK7FWG2 (zie 3.2). Deze vector bevat het EGFP CDS aan het 3’ einde van de

Formatted: Dutch (Belgium) Deleted: Figuur 4.25 Formatted: Dutch (Belgium), Check spelling and grammar

recombinatieplaats. Hierdoor zal de Nictaba NLS mutant met vacuolaire ‘targeting’ , dat aan de C-

Formatted: Dutch (Belgium), Check spelling and grammar

terminus verbonden is met het EGFP CDS, als een fusie-eiwit afgeschreven worden. Het product van


de LR-reactie, het pK7FvacNG2 plasmide, werd in bacteriële cellen getransformeerd. In een kolonie-PCR werden vijf geselecteerde kolonies getest met behulp van primers EVD 44 en EVD 6. Het programma voor deze PCR wordt in Tabel 4.8 gegeven. Het resultaat van deze PCR wordt


Figuur 4.26 in


weergegeven. Uit

Figuur 4.26 bleek dat alle geteste

kolonies een bandje bij ongeveer 600 bp te vertonen. Dit komt overeen met

Deleted: Tabel 4.8

het verwachte fragment van 627 bp.

Formatted: Dutch (Belgium) Formatted: Dutch (Belgium), Check spelling and grammar

Figuur 4.26 DNA gelelektroforese van de kolonie-PCR met de primers EVD 44 en EVD 6 op 5 bacteriële kolonies die met het pvacNG plasmide getransformeerd zijn. R: referentieladder.

62

Resultaten

4.4.5

De lokalisatie van Nictaba-EGFP, voorzien van het sporamine VTS

In een volgende stap werd het pK7FvacNG2 plasmide dat opgezuiverd was uit kolonie 5 (laan 5 van Figuur 4.26) in BY-2 cellen getransformeerd. De expressievector met vrij EGFP werd in een andere reeks BY-2 cellen getransformeerd. De cellen die met het controleplasmide getransformeerd waren brachten vrij EGFP reeds 24 uur na de beschieting tot expressie. Hieruit kon besloten worden dat de transformatieprocedure correct verlopen was. De cellen die met het pK7vacNG plasmide getransformeerd waren brachten echter geen EGFP tot expressie. De sequenering van het BP-product bevestigde de correcte opbouw van het construct. De kolonie-PCR op cellen die getransformeerd waren met het pK7vacNG plasmide was positief. Er werd een extra transformatie uitgevoerd met het pK7vacNG plasmide. Tijdens deze tweede transformatie werd het plasmide in BY-2 cellen en in ajuin epidermiscellen getransformeerd. Ook deze keer kon er geen EGFP gedetecteerd worden, ondanks een positieve controle voor vrij EGFP.

4.5 Nictaba gekoppeld aan een chloroplast ‘targeting’ signaal Een van de mogelijkheden om de functionaliteit van een eiwit te bestuderen is het eiwit op een andere dan normale plaatst in de cel tot expressie te brengen. Met behulp van PCR zal de coderende sequentie van Nictaba voorzien worden van het chloroplast ‘targeting’ signaal (CTS) van rubisco. Vervolgens zullen attB-plaatsen ingebouwd worden zodat het construct in het Gateway

TM

systeem zal

kunnen recombineren. Na het uitvoeren van de BP- en de LR-reactie zal het construct als een fusieeiwit tot expressie kunnen komen met EGFP. De weg die gevolgd is bij de constructie van deze mutant is schematisch weergegeven in Figuur 4.27. In de volgende punten zullen deze stappen in detail uitgewerkt worden.

63

Resultaten

Figuur 4. 27 Schematisch overzicht van de kloneringsstrategie bij de aanmaak v an het Nictaba- EGFP fusie construct met een chloroplast ‘targeting’ signaal

64

Resultaten 4.5.1

Aanmaak van het attB-PCR product: theoretisch

De isolatie van het CTS van rubisco zal gebeuren met behulp van een PCR op het opgezuiverde pSSTP plasmide (zie 3.3). De primer EVD 27 zal binden op het 5’ einde van het CTS en zal dit 5’ einde voorzien van een deel van de attB1-plaats. De primer EVD 28 zal binden op het 3’ einde van het CTS en zal een deel van het 5’ van het Nictaba CDS aan dit fragment bevestigen. In Figuur 4.28 a wordt deze reactie schematisch voorgesteld. In Figuur 4.28 b wordt het 27-28 PCR-product geschetst..

Figuur 4.28 Schematische voorstelling van: a) de PCR op pSSTP plasmide met de primers EVD 27 en EVD 28 en b) het 27-28 PCR-product.

In een tweede PCR met de primers EVD 29 en EVD 6 zal de Nictaba CDS geïsoleerd worden uit het opgezuiverde pT1.01 plasmide (zie 3.3). De primer die op het 3’ einde van deze sequentie zal binden, bevat een deel van de attB2-plaats. Omdat het CTS reeds een startcodon bevat en aan het 5’ einde van het Nictaba fragment gekoppeld zal worden, is het nodig om het startcodon uit de Nictaba CDS te verwijderen. Dit zal gebeuren door de primer EVD 29. Tijdens de recombinatie in het GatewayTM systeem zal het EGFP CDS aan het 3’ einde van het construct geplaatst worden. Daarom is het nodig om het stopcodon uit de Nictaba CDS te verwijderen. Dit zal gebeuren met behulp van de primer EVD 6. In Figuur 4.29 a wordt deze reactie schematisch voorgesteld. In Figuur 4.29 b wordt het 29-6 PCR-product geschetst.

Figuur 4.29 Schematische voorstelling van: a) de PCR op pT1.01 plasmide met de primers EVD 29 en EVD 6 en b) het 29-6 PCR-product.

65

Resultaten De primers EVD 28 en EVD 29 hebben een gedeeltelijke overlap waardoor het mogelijk zal zijn om de twee afzonderlijke fragmenten aan elkaar te zetten in een derde PCR met behul p van de primers EVD 27 en EVD 6. De opzet van deze PCR wordt schematisch in Figuur 4.30 a gegeven. Het resultaat van deze PCR wordt in Figuur 4.30 b getoond.

Figuur 4.30 Schematische voorstelling van: a) de PCR om het 27 -28 PCR-product en het 29-6 PCRproduct samen te brengen en b) het 27-27-28-29-6-6 PCR-product.

Vervolgens zullen de attB-plaatsen van het 27-27-28-29-6-6 PCR-product in een adapter-PCR vervolledigd worden. Het product van de eerste adapter-PCR zal in een tweede adapter-PCR geamplificeerd worden. De opbouw van de adapter-PCR wordt in Figuur 4.31 a voorgesteld. Het 227-27-28-29-6-6-4 PCR-product wordt in Figuur 4.31 b getoond.

Figuur 4.31 Schematische voorstelling van: a) de adapter-PCR op het 27-27-28-29-6-6 PCR-product om de attB-plaatsen te vervolledigen en b) het 2-27-27-28-29-6-6-4 PCR-product.

In Tabel 4.9 worden de sequenties van de primes die voor dit construct ontworpen zijn weergegeven.

66

Resultaten Tabel 4. 9 Sequenties van de gebruikte primers voor de constructie van het Nictaba chloroplast ‘targeting’ construct EVD 27

5’ AAA AAG CAG GCT TCA CCA TGG CTT CTA TGA TAT CC 3’

35 nt

EVD 28

5’ TAT CCA CTG GCC TTG ATC CAT GCA CTT TAC TCT TCC ACC 3’

39 nt

EVD 29

5’ GCA TGG ATC AAG GCC AGT GGA TAG CCG C 3’

28 nt

EVD 6

5’AGA AAG CTG GGT GGT TTG GAC GAA TGT CGA AGC C 3’

34 nt

EVD 2


29 nt

EVD 4


29 nt

4.5.2



Het resultaat van de PCR met primers EVD 27 en EVD 28 op het pSSTP plasmide met de signaalsequentie van rubisco leverde een fragment van ongeveer 200 bp op (209 bp verwacht) en wordt in laan 2 van Figuur 4.32 weergegeven. Het resultaat van de PCR met primers EVD 29 en EVD 6 op het pT1.01 plasmide met de CDS van Nictaba leverde een fragment van ongeveer 500 bp op (513 bp verwacht). Dit wordt in laan 3 van Figuur 4.32 getoond. In een volgende PCR werden de twee bekomen fragmenten aan elkaar gezet. De ‘template’ van deze PCR met primers EVD 27 en EVD 6 bestond uit 20 ng 27-28 PCR-product en 20 ng 29-6 PCR-product. Deze EVD 27- EVD 6 PCR leverde een fragment van ongeveer 700 bp op (699 bp verwacht) en het resultaat van deze PCR wordt in laan 1 van Figuur 4.32 weergegeven. De programma’s van deze PCRs worden in Tabel 4.10 gegeven.

Formatted: English (U.K.) Deleted: Tabel 4.10 Formatted: English (U.K.)

Figuur 4.32 DNA gelelektroforese van de PCRs voor de aanmaak van het construct waarbij de Nictaba CDS voorzien wordt van een CTS. R: referentie-ladder. 1: 27-27-28-29-6-6 PCR product. 2: 27-28 PCRproduct. 3: 29-6 PCR-product.

67

Resultaten Tabel 4.10 De programma’s van de PCR’s met de primers EVD 27-EVD 28, EVD 29- EVD 6 en EVD 27-

Formatted: English (U.K.) Deleted: 4

EVD 6

Formatted: English (U.K.) Field Code Changed

primers

EVD 27-28

EVD 29-6

denaturatiestap

2’

94°C

2’

94°C

2’

94°C

cyclus (25x)

denaturatiestap

15”

94°C

15”

94°C

15”

94°C

annealingstap

30”

55°C

30”

55°C

30”

55°C

elongatiestap

13”

72°C

32”

72°C

45”

72°C

elongatiestap

5’

72°C

5’

72°C

5’

72°C

‘template’

pSSTP

pT1.01

EVD 27-6

Formatted: English (U.K.) Field Code Changed Deleted: 10

27-28 PCR-product 29-6 PCR-product

verwachte lengte

209 bp

513 bp

699 bp

Uit laan 1 van Figuur 4.32 bleek dat het 27-27-28-29-6-6 PCR-product specifiek was. Daarom werd op product een adapter-PCR uitgevoerd om de attB-plaatsen te vervolledigen. Het 2-27-27-2829-6-6-4 PCR-product werd in een volgende adapter-PCR geamplificeerd. Het resultaat van deze PCRs wordt in Figuur 4.33 gegeven. Het programma van deze PCRs is terug te vinden in Tabel 4.11.

Figuur 4.33 DNA gelelektroforese van de PCRs voor de aanmaak van het construct waarbij de Nictaba CDS voorzien wordt van een CTS. R: referentie-ladder. a) 1: 2-27-27-28-29-6-6-4 PCR product, 2: 27-2728-29-6-6. b) 1: 2-2-27-27-28-29-6-6-4-4 PCR product, 2: 27-27-28-29-6-6 PCR-product.

68

Resultaten Tabel 4.11 De programma’s van de PCR met de primers EVD 2 en EVD 4

primers

EVD 2- EVD 4

primers

extra EVD 2- EVD 4

denaturatiestap

2’

94°C

denaturatiestap

2’

94°C

denaturatiestap

15”

94°C

cyclus (25x)

denaturatiestap

15”

94°C

annealingstap

30”

50°C

elongatiestap

48”

72°C

annealingstap

30”

55°C

denaturatiestap

15”

94°C

annealingstap

30”

55°C

elongatiestap

48”

72°C

elongatiestap

48”

72°C

elongatiestap

5’

72°C

elongatiestap

5’

72°C

‘template’

27-27-28-29-6-6

‘template’

2-27-27-28-29-6-6-4

cyclus (5x)

cyclus (20x)

verwachte lengte

PCR-product

PCR-product

732 bp

732 bp

Uit laan 1 van Figuur 4.33 a bleek dat de eerste adapter-PCR een specifiek resultaat gaf. De amplificatie adapter-PCR leverde een fragment van ongeveer 700 bp op (732 bp verwacht). Dit fragment was echter aspecifiek (zie laan 1 van Figuur 4.33 b). Daarom werden het 27-28 PCR-product en het 29-6 PCR-product in een volgende PCR met de primers EVD 27 en EVD 6 opnieuw aan elkaar geplaatst. Het programma van deze 27-6 PCR wordt in Tabel 4.10 gegeven. Vervolgens werd het 2727-28-29-6-6 PCR-product uit een agarosegel opgezuiverd volgens de methode die beschreven is in 3.8. Op het opgezuiverde materiaal werd een PCR met de primers EVD 2 en EVD 4 uitgevoerd om de attB-plaatsen te vervolledigen. Het resultaat van deze PCR wordt in laan 1 van Figuur 4.34 getoond. Het product van deze PCR werd als ‘template’ gebruikt voor een extra adapter-PCR. De programma’s van deze PCRs worden in Tabel 4.11 gegeven.

Figuur 4.34 DNA gelelektroforese van PCRs voor de aanmaak van het construct waarbij de Nictaba CDS voorzien wordt van een CTS. R: referentie-ladder. 1: 2-27-27-28-29-6-6-4 PCR product. 2: 27-27-28-29-66 PCR-product.

69

Formatted: English (U.K.) Formatted: English (U.K.) Deleted: Tabel 4.10

Resultaten 4.5.3

De BP-reactie

Het 2-2-27-27-28-29-6-6-4-4 PCR-product werd als ‘template’ gebruikt voor een BP-reactie met het pDONR-221 plasmide als donorvector (zie 3.2). Het BP-product werd vervolgens in bacteriële cellen getransformeerd en overnacht opgegroeid. Tien geselecteerde kolonies werden getest op de aanwezigheid van de ‘entry’-vector met behulp van een kolonie-PCR. Voor deze kolonie-PCR werd gebruik gemaakt van de primers EVD 27 en EVD 6 en het Taq-polymerase. Het programma van deze PCR wordt in Tabel 4.12 gegeven. Het resultaat van deze kolonie-PCR wordt in Figuur 4.35 getoond.

Figuur 4.35 DNA gelelektroforese van de kolonie-PCR met de primers EVD 27 en EVD 6 op de 10 geteste kolonies die getransformeerd zijn met de ‘entry’-vector van het Nictaba CDS construct met een CTS

Tabel 4.12 Het programma dat gevolgd werd voor de koloniePCR op kolonies die met het BP/LR-product van het Nictaba chloroplast ‘targeting’ construct getransformeerd waren primers

EVD 27- EVD 6

denaturatiestap

10’

94°C

denaturatiestap

15”

94°C

annealingstap

30”

55°C

elongatiestap

45”

72°C

elongatiestap

5’

72°C

‘template’

kolonie met BP/LR-

cyclus (25x)

product verwachte lengte

699 bp

70

Resultaten De kolonies 1, 2 en 5 respectievelijk in de lanen 1, 2 en 5 van Figuur 4.35 werden overnacht opgegroeid. Vervolgens werd de ‘entry’-vector van deze kolonies opgezuiverd met behulp van de miniprep kit van Qiagen (zie 3.6) en opgestuurd voor sequenering van het geïnsereerde fragment door

Formatted: Dutch (Belgium) Deleted: Figuur 4.35 Formatted: Dutch (Belgium), Check spelling and grammar

de VIB ‘genetic service facility’. Deze sequenering gebeurde met behulp van de primers EVD 27 en


EVD 6. Omdat de sequenering van de ‘entry’-vector twee maal mislukte, werd op de opgezuiverde


‘entry’-vectoren van de kolonies 1, 2, 5, 9 en 10 respectievelijk in de lanen 1, 2, 5,9 en 10 van Figuur 4.35 een PCR met de primers EVD 27 en EVD 6 uitgevoerd. Deze PCR wees uit dat slechts kolonie 2 een fragment bevatte van ongeveer 650 bp (699 bp verwacht). De ‘entry’-vector van kolonie 2 werd vervolgens als ‘template’ gebruikt voor een PCR met de primers EVD 27 en EVD 6. Het programma voor deze PCR wordt in Tabel 4.10 gegeven. Het 27-6 PCR-product (laan 1 van Figuur 4.36 a) werd als ‘template’ gebruikt voor een adapter-PCR met de primers EVD 2 en EVD 4. Het 2-27-6-4 PCRproduct wordt in laan 2 van Figuur 4.36 a getoond. Dit PCR-product werd geamplificeerd in een volgende adapter-PCR. De programma’s van deze PCRs worden in Tabel 4.11 gegeven. Het 2-2-27-64-4 PCR-product werd als ‘template’ gebruikt voor een BP-reactie met de donorvector pDONR-221. Het BP-product werd in bacteriële cellen getransformeerd die overnacht gegroeid werden. De volgende dag werden 6 kolonies getest met behulp van een kolonie-PCR. Deze kolonie-PCR gebeurde volgens de methode die beschreven is in 3.9 en met de primers EVD 27 en EVD 6. Het resultaat van deze kolonie-PCR wordt in Figuur 4.36 b getoond. In Tabel 4.12 wordt het programma van de kolonie-PCR gegeven.

Figuur 4.36 DNA agarosegels waarop PCR-producten van het Nictaba CDS construct met een CTS geladen zijn. R: referentieladder. a) 1: 27-6 PCR- product, 2: EVD 2-4 PCR-product. b) 1-6: 27-6 koloniePCR-product van bacteriële kolonies die met het BP-product van dit construct getransformeerd zijn .

71

Deleted: Tabel 4.10 Formatted: English (U.K.) Formatted: English (U.K.)

Resultaten Zoals uit Figuur 4.36 b blijkt, bevatten de kolonies 1, 3, 4, 5 en 6 (respectievelijk de lanen 1, 3, 4, 5 en 6) een fragment van ongeveer 650 bp (699 bp verwacht). De ‘entry’-vector van kolonie 4 werd opgezuiverd en gesequeneerd door de VIB ‘genetic service facility’.

4.5.4

De LR-reactie

De allignering tussen het resultaat van de sequenering en de theoretisch opgestelde sequentie in Vector NTI toonde aan dat de ‘entry’-vector uit kolonie 4 (zie laan 4 van Figuur 4.36 b) correct opgebouwd was. Daarom werd deze ‘entry’ -vector als ‘template’ gebruikt voor een LR-reactie met de ‘destination’-vector pK7FWG. De recombinatie van het construct in deze ‘destination’-vector zorgt ervoor dat het construct in plantencellen afgeschreven zal worden als een EGFP-fusie-eiwit. Het EGFP zal C-terminaal van het construct aanwezig zijn. Indien het EGFP N-terminaal van het construct aanwezig zou zijn, dan zou het samen het N-terminale signaalpeptide afgesplitst worden tijdens de co-translationele modificatie. Hierdoor zou het onmogelijk zijn om een lokalisatie uit te voeren van deze Nictaba mutant. Na het uitvoeren van de LR-reactie werd het bekomen pK7FchlNG2 plasmide in bacteriële cellen getransformeerd volgens de methode die beschreven werd in 3.5.1. Na overnacht groeien werden 5 kolonies getest op de aanwezigheid van het Nictaba NLS mutant met CTS construct. Dit gebeurde via een kolonie-PCR met de primers EVD 27 en EVD 6. In Tabel 4.12 wordt het programma van de kolonie-PCR weergegeven. Het resultaat van de kolonie-PCRs wordt in Figuur 4.37 weergegeven.

Figuur 4.37 DNA agarosegel met 27-6 kolonie-PCR-product van bacteriële kolonies die met het LRproduct pK7FchlNG2 getransformeerd zijn. R: referentieladder.

72

Resultaten 4.5.5

De lokalisatie van Nictaba-EGFP, voorzien van het rubisco CTS

Uit Figuur 4.37 bleek dat alle geteste kolonies een fragment van ongeveer 700 bp (699 bp verwacht) bevatten. Daarom werd het pK7chlNG plasmide van kolonie 2 uit Figuur 4.37 opgezuiverd. Dit plasmide werd via ‘particle bombardment’ (zie 3.10) in BY-2 cellen getransformeerd. Een andere reeks BY-2 cellen werd met het pK7F2 plasmide getransformeerd. Dit pK7F2 plasmide brengt vrij EGFP tot expressie in plantencellen. Vanaf 24 uur na de transformatie werd vrij EGFP gedetecteerd. Dit wees erop dat de transformatieprocedure correct verlopen was. De BY-2 cellen die met het pK7FchlNG2 plasmide getransformeerd waren, brachten geen EGFP tot expressie. Als extra controle werd de transformatie van BY-2 cellen opnieuw uitgevoerd, maar ook deze keer was er geen EGFP signaal detecteerbaar in cellen die met het pK7FchlNG2 plasmide getransformeerd waren.

73

Discussie en algemeen besluit

Deel 5. Discussie en algemeen besluit Om de lokalisatie van Nictaba te bestuderen werd de coderende sequentie van WT Nictaba via het GatewayTM systeem gekloneerd. Ongeveer 20 h na transformatie van de expressievector pK7NG2 in BY-2 cellen werd fluorescentie gedetecteerd. Deze fluorescentie was aanwezig in de kern, rond de kern en in cytoplasmatische strengen. De nucleolus kon gelokaliseerd worden als een donkere vlek in de kern. Als controle voor deze transformaties werden BY-2 cellen getransformeerd met het pK7F2 plasmide. Vanaf ongeveer 20 h na de transformatie van de plantencellen met dit plasmide werd fluorescentie gedetecteerd rond de kern, in de kern en in cytoplasmatische strengen. Deze lokalisatie kwam overeen met de eerder beschreven resultaten van vrij EGFP (Hanson & Köhler, 2001; Grebenok et al., 1997 ). In tegenstelling tot vrij EGFP is het WT Nictaba construct te groot om zonder nucleair lokalisatiesignaal in de kern te kunnen diffunderen. De aanwezigheid van fluorescentie in de kern van BY-2 cellen die met het pK7NG2 getransformeerd waren, deed vermoeden dat het NLS in WT Nictaba functioneel is. Een eerder uitgevoerd immunolokalisatie-experiment had de aanwezigheid van Nictaba in de kern en in het cytoplasma reeds aangetoond. Uit confocale opnames van transgene BY-2 cellen bleek echter dat de lokalisatie van deze fluorescentie veranderde vanaf 40 uur na de transformatie (Doctoraatswerk van Ir. N. Lannoo). De fluorescentie was vanaf dat moment niet meer detecteerbaar in de kern maar wel nog rond de kern en in het cytoplasma. Hieruit kon afgeleid worden dat het fusie-eiwit een mogelijke migratie onderging.

Als bijkomende controle van de functionaliteit van het NLS werd de pK7ΔNGF2 expressievector in BY-2 cellen getransformeerd. Deze vector bevat de CDS van Nictaba die gemuteerd is ter hoogte van het NLS (102KKKK105  102KTAK 105). De cellen die met het controle plasmide pK7F2 getransformeerd waren brachten vrij EGFP tot expressie vanaf ongeveer 40 uur na de transformatie. Vanaf ongeveer 40 h na de transformatie van BY-2 cellen die met het pK7ΔNGF2 plasmide getransformeerd waren, werd ook in deze cellen fluorescentie gedetecteerd. Deze fluorescentie kwam voor rond de kern en in cytoplasmatische strengen. In tegenstelling tot de lokalisatie van het WT Nictaba-EGFP fusie-eiwit varieerde de lokalisatie van dit construct niet in functie van de tijd. Ongeveer 60 uur na de transformatie werd er nog steeds fluorescentie gedetecteerd in getransformeerde cellen. De afwezigheid van fluorescentie in de kern van BY-2 cellen die met het pK7ΔNGF2 plasmide getransformeerd waren bevestigde opnieuw het vermoeden dat het NLS in de CDS van WT Nictaba functioneel is.

74

Discussie en algemeen besluit De fluorescentie werd echter pas vanaf 40 h na de transformatie gedetecteerd in BY-2 cellen die met het pK7F2 plasmide of met het pK7ΔNGF2 plasmide getransformeerd waren. Bij vorige transformaties werd reeds vanaf 24 h na de transformatie fluorescentie gedetecteerd in transgene cellen. In de toekomst zouden deze transformaties herhaald kunnen worden om te controleren of de fluorescentie pas vanaf 40 h na de transformatie te detecteren is, of al vroeger aanwezig is. Als vervolg op deze thesis zou dit construct op een stabiele manier in tabaksplanten getransformeerd kunnen worden om het effect van de mutatie ter hoogte van het NLS op het celmetabolisme te bestuderen. Uit de confocale opnames is het niet duidelijk af te leiden of het fusie-eiwit in de kernmembraan aanwezig is.

Een ander doel van deze thesis was om Nictaba naar een ontoegankelijke plaats in de plantencel te sturen zodat dit lectine geen invloed meer kon uitoefenen op de mogelijke interactiepartners. De expressievector pK7vacNG2 bevat de sequentie van WT Nictaba die geligeerd werd aan de sequenties van het signaalpeptide en pro-peptide van sporamine. Deze expressievector werd in BY-2 cellen getransformeerd. Als controle op de transformatie werd een andere reeks BY-2 cellen getransformeerd met het pK7F2 plasmide. Vanaf ongeveer 20 h na de transformatie van het pK7F2 plasmide in BY-2 cellen werd in deze cellen fluorescentie opgemerkt. Hieruit kon afgeleid worden dat de transformatie correct verlopen was. Vanaf 20 h na de transformatie werd fluorescentie gedetecteerd in BY-2 cellen die met het pK7vacNG2 getransformeerd waren. Deze fluorescentie was aanwezig in de rand of langs de rand van kleine, prevacuolaire structuren en in het ER. Deze lokalisatie komt overeen met de migratie van sporamine die door Surpin & Raikhel (2004) beschreven werd. Ondanks de aanwezigheid van een NLS werd geen fluorescentie vastgesteld in de kern. De lokalisatie veranderde niet in functie van de tijd. In de toekomst zou dit construct gebruikt kunnen worden om tabaksplanten op een stabiele manier te transformeren. Zo zou het mogelijk worden om het effect van deze vacuolaire ‘targeting’ van Nictaba in de plant te bestuderen.

Omdat er bij het vorige construct twee signaalsequenties (het NLS en het VTS) aanwezig zijn die elkaar mogelijk beïnvloeden werd geprobeerd om het NLS uit te schakelen. Hiervoor werd een construct aangemaakt waarbij de CDS van Nictaba gemuteerd ter hoogte van het NLS gekoppeld werd aan het signaalpeptide en pro-peptide van sporamine. De expressievector pK7Fvac∆NG2 die dit construct bevat werd in BY-2 cellen en in ajuin epidermiscellen getransformeerd. Als controle op deze transformatie werd een andere reeks BY-2 cellen en ajuin epidermiscellen getransformeerd met het pK7F2 plasmide. De plantencellen die met dit pK7F2 plasmide getransformeerd waren vertoonden vanaf ongeveer vanaf 24 h na de transformatie fluorescentie. Hieruit kon besloten worden dat de

75

Discussie en algemeen besluit transformatie correct verlopen was. De cellen die met het pK7Fvac∆NG2 plasmide getransformeerd waren vertoonden echter geen expressie. Ook na de herhaling van de transformatie met opnieuw opgezuiverd pK7Fvac∆NG2 plasmide kon geen fluorescentie gedetecteerd worden. Verwacht werd dat de lokalisatie van dit construct vergelijkbaar zou zijn met de lokalisatie van de fluorescentie van plantencellen die met het pK7FvacNG2 construct getransformeerd waren, maar door afwezigheid van fluorescentie kon dit niet gecontroleerd worden. Tijdens het opbouwen van het construct werden geen problemen ondervonden. De sequenering van het geïnsereerde fragment toonde geen fouten aan. Om het construct in de toekomst tot expressie te laten komen zou het construct opnieuw samengesteld kunnen worden en zou er een ‘linker’-sequentie aangebracht kunnen worden tussen de sequentie van het vacuolair ‘targeting’ signaal en de CDS van Nictaba die gemuteerd is ter hoogte van het NLS. Mogelijk werd een deel van het 5’ einde van de CDS van Nictaba die gemuteerd is ter hoogte van het NLS afgesplitst wanneer het vacuolair ‘targeting’ signaal co- en post-translationeel verwijderd werd waardoor expressie van EGFP niet mogelijk was. Een andere oplossing zou kunnen zijn om een variant van GFP te gebruiken die beter afgestemd is voor gebruik in een (lytische) vacuole (Di Sansebastiano et al., 1998). Om het effect van het sporamine VTS te controleren zou de CDS van dit VTS via het GatewayTM systeem gekloneerd kunnen worden in het pK7FWG2 plasmide zodat het na transformatie in plantencellen als een EGFP-fusie tot expressie zou kunnen komen. Eventueel zou een ander vacuolair ‘targeting’ signaal gebruikt kunnen worden zoals de interne signaalsequentie van ricine. Deze signaalsequentie werd reeds in transgene tabaksprotoplasten gebruikt om GFP naar de vacuole te sturen (Frigerio et al., 2001).

Een volgend construct werd aangemaakt door de CDS van WT Nictaba te ligeren aan de signaalsequentie van rubisco. De expressievector pK7chlNG2 die dit construct bevat werd in BY-2 cellen en in ajuin epidermiscellen getransformeerd. Als controle op de transformatie werd een andere reeks BY-2 cellen en ajuin epidermiscellen getransformeerd met het pK7F2 plasmide. Ongeveer 20 h na de transformatie van plantencellen met dit pK7F2 werd fluorescentie gedetecteerd. Hieruit werd besloten dat de transformatie correct verlopen was. De plantencellen die met het pK7chlNG2 plasmide getransformeerd waren vertoonden echter geen fluorescentie. Na herhaling van de transformatie werd hetzelfde resultaat bekomen. Mogelijk is er tijdens de opbouw van het construct toch iets verkeerd gelopen en bevat het geïnseerde construct van de expressievector een fout waardoor er geen expressie waargenomen wordt in plantencellen.

76

Discussie en algemeen besluit Het gebruik van de GatewayTM systeem maakte het mogelijk om de aangemaakte constructen op een snelle manier in ‘destination’-vectoren te kloneren. In de literatuur wordt vermeld dat de LRreactie efficiënter verloopt dan de BP-reactie. Na het uitvoeren van deze reacties en na het transformeren van het BP- of het LR-product in bacteriële cellen werd opgemerkt dat deze efficiënties varieerden voor de verschillende constructen. De ‘particle bombardment’ techniek die gebruikt werd om plantencellen te transformeren was al geoptimaliseerd voor de transformatie van BY -2 cellen. Ajuinepidermiscellen daarentegen vertoonden een zeer lage transformatie-efficiëntie t.o.v. BY-2 cellen wanneer het protocol voor de transformatie van BY-2 cellen gevolgd werd. Na de transformatie van het controleplasmide pK7F2 in ajuin epidermiscellen en BY-2 cellen werd fluorescentie gedetecteerd in een drietal ajuinepidermiscellen per getransformeerde plaat. Dit was in schril contrast tot de grote hoeveelheid (>40 per getransformeerde plaat) BY-2 cellen waarin fluorescentie opgemerkt werd. Vooraleer deze ajuincellen gebruikt kunnen worden als een medium voor lokalisatiestudies zou de ‘particle bombardment’ techniek geoptimaliseerd moeten worden voor dit soort cellen. Dit zou kunnen gebeuren door bijvoorbeeld ‘rupture discs’ te gebruiken die bij een hogere He-druk breken of het plantenmateriaal zou op een andere afstand van het ‘stopping screen’ geplaatst kunnen worden.

Als vervolg op deze thesis zouden met behulp van transgene Agrobacterium tumefaciens bacteriën stabiel getransformeerde tabaksplanten gemaakt kunnen worden die Nictaba gemuteerd ter hoogte van het NLS tot expressie brengen. Het construct om de Nictaba NLS mutant naar de vacuoles te sturen zou voorzien kunnen worden van een 4 aminozuren groot (KDEL of HDEL) signaal om het fusie-eiwit in het ER te weerhouden. Door ligatie van dit signaal aan het construct zullen eiwitten die anders gesecreteerd worden deels in het ER weerhouden worden en deels naar een vacuole gestuurd worden. Door secretie van EGFP-fusie-eitwitten wordt het EGFP namelijk onstabiel en kan geen fluorescentie meer gedetecteerd worden. Gomord et al. zijn er in 1997 in geslaagd om de sporamine CDS te verbinden met de sequentie van het HDEL-signaal. Vervolgens werd dit fusie-eiwit in transgene BY-2 cellen tot expressie gebracht. Immunolokalisatie wees uit dat het fusie-eiwit in het ER bleef.

77

Literatuurlijst

Deel 6. Literatuurlijst ANANTHARAM, V., PATANJALI, S.R., SWAMY, M.J., SANADI, A.R., GOLDSTEIN, I.J., and SUROLIA, A. (1986). Isolation, macromolecular properties, and combining site of a chitooligosaccharidespecific lectin from the exudate of ridge gourd (Luffa acutangula). Journal of Biological Chemistry, 261, 14621– 14627.

ASSAAD, F.F. and SINGER, E.R. (1990). Cauliflower mosaic virus p35S promoter activity in Escherichia coli. Molecular and General Genetics, 223, 517-520.

BANERJEE, R., MANDE, S.C., GANESH, V., DAS, K., DHANARAJ, V., MAHANTA, S. K., SUGUNA, K., SUROLIA, A. and VIJAYAN, M. (1994). Crystal structure of peanut lectin, a protein with an unusual quaternary structure. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 91, 227–231.

BARBIERI, L., VALBONESI, P., GORINI, P., PESSION, A., and STIRPE, F. (1996). Polynucleotide adenosine glycosidase activity of saporin-L1: effect on DNA, RNA and poly(A). Biochemical Journal, 319, 507–513.

BARONDES, S.H. (1988). Bifunctional properties of lectins: lectins redefined. Trends in Biochemical Sciences, 13, 480–482.

BOULTER, D., EDWARDS, G.A., GATEHOUSE, A.M.R., GATEHOUSE, J.A. and HILDER, V.A. (1990). Additive protective effects of different plant-de-rived insect resistance genes in transgenic tobacco plants. Crop Protection, 9, 351–354.

BOURNE, Y. , ASTOUL, C.H., ZAMBONI, V., PEUMANS, W., MENU-BOUAOUICHE, L. , VAN DAMME, E.J.M., BARRE, A. and ROUGÉ, P. (2002). Structural basis for the unusual carbohydratebinding specificity of jacalin towards galactose and mannose. Biochemical Journal, 364,173-180.

BRANDIZZI, F., FRICKER, M. and HAWES, C. (2002). A greener world: the revolution in plant bioimaging. Nature Reviews: Molecular Cell Biology 3, 520-530.

78

Literatuurlijst CHALFIE, M., TU, Y., EUSKIRCHEN, G., WARD, W.W. and PRASHER, D.C. (1994). Green fluorescent protein as a marker for gene-expression. Science, 263, 802–805. CHEN, Y., PEUMANS, W.J., HAUSE, B., BRAS, J., KUMAR, M., PROOST, P., BARRE, A., ROUGE, P. and VAN DAMME, E.J.M. (2002). Jasmonic acid methyl ester induces the synthesis of a cytoplasmic/nuclear chitooligosaccharide-binding lectin in tobacco leaves. The FASEB Journal, 16, 905-907. CHIU, W., NIWA, Y., ZENG, W., HIRANO, T., KOBAYASHI, H. and SHEEN, J. (1996). Engineered GFP as a vital reporter in plants. Current Biology, 6, 325–330.

CLAES, D., DEKEYSER, R., VILLARROEL, R., VAN DEN BULCKE, M., BAUW, G., VAN MONTAGU, M. and CAPLAN, A. (1990). Characterization of a rice gene showing organ-specific expression in response to salt stress and drought. Plant Cell, 2, 19-27.

CZAPLA, T.H. and LANG, B.A. (1990). Effect of plant lectins on the larval development of European

corn

borer

(Lepidoptera:

Pyralidae)

and

southern

corn

rootworm

(Coleoptera:Chrysomelidae). Journal of Economical Entomology, 83, 2480–2485.

DI SANSEBASTIANO, G. P., PARIS, N., MARC-MARTIN, S. and NEUHAUS, J.M. (1998). Specific accumulation of GFP in a non-acidic vacuolar compartment via a C-terminal propeptidemediated sorting pathway. The Plant Journal, 15, 449-457.

DI SANSEBASTIANO, G. P., PARIS, N., MARC-MARTIN, S. and NEUHAUS, J.M. (2001). Regeneration of a lytic central vacuole and of neutral peripheral vacuoles can be visualised by green fluorescent proteins targeted to either type of vacuoles. Plant Physiology, 126, 78–86.

EDELMAN, G.M., CUNNINGHAM, B.A., REEKE, G. N., JR., BECKER, J.W., WAXDAL, M.J. and WANG, J. L. (1972). The covalent and three-dimensional structure of concanavalin A. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 69, 2580–2584.

EINSPAHR, H., PARKS, E. H., SUGUNA, K., SUBRAMANIAN, E. and SUDDATH, F.L. (1986). The crystal structure of pea lectin at 3.0-Å resolution. Journal of Biological Chemistry, 261, 16518– 16527.

79

Literatuurlijst

ELFSTRAND,

M.

(1898).

Über

blutkörperchenagglutinierende

Eiweisse.

GörberdorferVeröffentlichungen a. Band I. ,1–159.

ETZLER, M.E. (1986). Distribution and function of plant lectins. The Lectins: Properties, Functions, and Applications in Biology and Medicine, pp. 371–435. Academic Press, Florida, U.S.A.

FINLAY, D.R. and FORBES, D.J. (1990). Reconstitution of biochemically altered nuclear pores: transport can be eliminated and restored. Cell, 60, 17-29.

FLEXNER, S. and HIDEYO, N. (1904). Upon the production and properties of anti-crotalus venin. Journal of Medical Research.

FRIGERIO, L., JOLLIFFE, N.A., DI COLA, A., FELIPE, H.D., PARIS, N., NEUHANS, J-M., LORD, J.M., CERIOTTI, A. and ROBERTS, L.M. (2001). The internal propetide of the ricin precursor carries a sequence-specific determinant for vacuolar sorting. Plant Physiology, 126, 167175.

GEELEN, D. and INZE, D. (2001) A bright future for the Bright Yellow-2 cell culture. Plant Physiology, 127, 1375-1379.

GOLDSTEIN, I.J., HUGHES, R.C., MONSIGNY, M., OSAWA, T. and SHARON, N. (1980). What should be called a lectin? Nature, 285, 66.

GOLDSTEIN, I.J. and PORETZ, R.D. (1986). Isolation, physicochemical characterization, and carbohydrate-binding specificity of lectins. The lectins: Properties, Functions, and Applications in Biology and Medicine, pp. 33-247. Academic Press, Florida, U.S.A.

GOMORD, V., DENMAT, L.A., FITCHETTE-LAINE, A.C., SATIAT-JEUNEMAITRE, B., HAWES, C. and FAYE., L. (1997). The C-terminal HDEL sequence is sufficient for retention of secretory proteins in the endoplasmic reticulum (ER) but promotes vacuolar targeting of proteins that escape the ER. Plant Journal, 11, 313-135.

80

Literatuurlijst GREBENOK, R.J, PIERSON, E., LAMBERT, G.M., GONG, F.C., AFONSO, C.L., HALDEMANCAHILL, R., CARRINGTON, J.C. and GALBRAITH, D.W. (1997). Green fluorescent protein fusions for efficient characterization of nuclear targeting. The Plant Journal, 11,573-586

HAMELRYCK, T.W., DAO, M.H., POORTMANS, F., CHRISPEELS, M.J., WYNS, L. and LORIS, R. (1996). The crystallographic structure of phytohemagglutinin. L. Journal of Biological Chemistry, 271, 20479–20485.

HANOVER, J.A. (2001). Glycan-dependent signaling: O-linked N-acetylglucosamine. The FASEB Journal, 15, 1865-1876.

HANSON, M.R. and KOHLER, R.H. (2001). GFP imaging: methodology and application to investigate cellular compartmentation in plants. Journal of Experimental Botany, 52, 529–539.

HASELOFF, J., SIEMERING, K.R., PRASHER, D.C. and HODGE, S. (1997). Removal of a cryptic intron and subcellular localization of green fluorescent protein are required to mark transgenic Arabidopsis plants brightly. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 94, 2122– 2127.

HAWES, C., SAINT-JORE, C.M., BRANDIZZI, F., ZHENG, H., ANDREEVA, A.V. and BOEVINK, P. (2001) Cytoplasmic illuminations: in planta targeting of fluorescent proteins to cellular organelles. Protoplasma 215, 77–88.

HOSSAINI, A. (1968). Hemolytic and hemagglutinating activities of 222 plants. Vox Sanguinis, 15, 410–417.

KABIR, S. and DAAR, A. S. (1994). The composition and properties of jacalin, a lectin of diverse applications obtained from the jackfruit (Artocarpus heterophyllus) seeds. Immunological Investigations, 23, 167– 188.

KARIMI, M., INZÉ, D. and DEPICKER, A. (2002). Gateway vectors for Agrobacterium-mediated transformation. Trends in Plant Science, 5, 193-195.

81

Literatuurlijst KATO, K., MATSUMOTO, T., KOIWAI, A., MIZUSAKI, S., NISHIDA, K., NOGUCHI, M. and TAMAKI, E. (1972). Liquid suspension culture of tobaco cells. Fermentation Technology Today, 689–695.

KO, K. and CASHMORE, A.R. (1989). Targeting of proteins to the thylakoid lumen by the bipartite transit peptide of the 33 kd oxygen-evolving protein. The EMBO Journal, 8, 3187-3194.

KOCOUREK, J. (1986). Historical background. The Lectins, Properties, Functions, and Applications in Biology and Medicine, pp. 1–32. Academic Press, Florida, U.S.A.

KOHLER, R.H. and HANSON, M.R. (2000). Plastid tubules of higher plants are tissue-specific and developmentally regulated. Journal of Cell Science, 113, 81–89.

LEE, Y.J., KIM, D.H., KIM, Y.W. and HWANG, I. (2001). Identification of a signal that distinguishes between the chloroplast outer envelope membrane and the endomembrane system in vivo. Plant Cell, 13, 2175–2190.

MONTFORT, W., VILLAFRANCA, J.E., MONZINGO, A.F., ERNST, S., KATZIN, B., RUTENBER, E., XUONG, N. H., HAMLIN, R. and ROBERTUS, J. D. (1987). The threedimensional structure of ricin at 2.8 Å. Journal of Biological Chemistry, 262, 5398–5403.

MOONS, A., PRINSEN, E., BAUW, G. and VAN MONTAGU, M. (1997). Antagonistic effects of abscisic acid and jasmonates on salt stress-inducible transcripts in rice roots. Plant Cell, 9, 2243-2259.

NAGATA, T. NEMOTO, Y. and HASEZAWA, S. (1992). Tobacco by-2 cell-line as the Hela-cell in the cell biology of higher-plants. International Review of Cytology, 132, 1-30.

NAGATA, T. and KUMAGAI, F. (1999). Plant cell biology through the window of the highly synchronized tobacco BY-2 cell line. Methods in Cell Science, 21, 123-127.

PEUMANS, W.J. and VAN DAMME, E.J.M. (1995a). The role of lectins in plant defense. Histochemical Journal, 27, 253–271.

82

Literatuurlijst PEUMANS, W.J. and VAN DAMME, E.J.M. (1995b). Lectins as plant defense proteins. Plant Physiology, 109, 347–352.

PEUMANS, W.J. and VAN DAMME, E.J.M. (1996). Prevalence, biological activity and genetic manipulation of lectins in foods. Trends in Food Science and Technology, 7, 132-138. PEUMANS, W.J., SMEETS, K., VAN NERUM, K., VAN LEUVEN, F. and VAN DAMME, E.J.M. (1997). Lectin and alliinase are the predominant proteins in the nectar from leek (Allium porrum) flowers. Planta, 201, 298–302.

RAHBE, Y., SAUVION, N., FEBVAY G., PEUMANS, W.J. and GATEHOUSE, A.M.R. (1995). Toxicity of lectins and processing of ingested proteins in the pea aphid Acyrthosiphon pisum. Entomologia Experimentalis Et Applicata, 76, 143–155.

RAIKHEL, N.V., LEE, H.I. and BROEKAERT, W.F. (1993). Structure and function of chitin-binding proteins. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 44, 591–615.

READ, S.M. and NORTHCOTE, D.H. (1983). Subunit structure and interactions of the phloem proteins of Cucurbita maxima (pumpkin). European Journal of Biochemistry, 134, 561–569.

REEKE, G.N., JR. and BECKER, J.W. (1986). Threedimensional structure of favin: saccharide binding-cyclic permutation in leguminous lectins. Science, 234, 1108–1111.

REMPEL, H.C. and NELSON, L.M. (1995). Analysis of conditions for Agrobacterium-mediated transformation of tobacco cells in suspension. Transgenic Research, 4, 199-207.

RINDERLE, S.J., GOLDSTEIN, I.J., MATTA, K.L. and RATCLIFFE, R.M. (1989). Isolation and characterization of amaranthin, a lectin present in the seeds of Amaranthus caudatus, that recognizes the T- (or cryptic T)-antigen. Journal of Biological Chemistry., 264, 16123–16131.

ROQUE-BAREIRA, M.C. and CAMPOS-NETO, A. (1985). Jacalin: an IgA-binding lectin. Journal of Immunology, 134, 1740–1743.

SABNIS, D.D. and HART, J.W. (1978). The isolation and some properties of a lectin (haemagglutinin) from Cucurbita phloem exudate. Planta, 142, 97–101.

83


Literatuurlijst SAMUELS, A.L., MEEHL, J., LIPE, M. and STAEHELIN, L.A. (1998). Optimizing conditions for tobacco BY-2 cell cycle synchronization - Rapid communication. PROTOPLASMA, 202, 232-236.

SCOTT, A.C., WYATT, S., TSOU, P.,ROBERTSON, N. and ALLEN, N.S. (1999). A model system for plant cell biology: GFP imaging in living onion epidermal cells. BioTechniques, 26,1125-1132.

SHARON, N. and LIS, H. (1990). Legume lectins - a large family of homologous proteins. The FASEB Journal., 4, 3198–3208.

SMERTENKO, A., DRABER, P., VIKLICKY, V. and OPATRNY, Z. (1997). Heat stress affects the organization of microtubules and cell division in Nicotiana tabacum cells. Plant Cell and Environment, 20, 1534-1542

STILLMARK, H. (1888). Über Ricin ein giftiges Ferment aus den Samen von Ricinus communis L. und einige anderen Euphorbiaceen. Inaugural Dissertation Dorpat, Tartu.

SURPIN, M. and RAIKHEL, N. (2004). Traffic jams affect plant development and signal transduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 5, 100 -109.

TAMURA, K., SHIMADA, T., ONO, E., TANAKA, Y., NAGATANI, A., HIGASHI, S., WATANABE, M., NISHIMURA, M. and HARA-NISHIMURA, I. (2003). Why green fluorescent fusion proteins have not been observed in the vacuoles of higher plants. The Plant Journal , 35, 545555.

VAN DAMME, E.J.M. and PEUMANS, W.J. (1987). Isolectin composition of individual clones of Urtica dioica: evidence for phenotypic differences. Plant Physiology, 71, 328–334.

VAN DAMME, E.J.M. and PEUMANS, W.J. (1990). Developmental changes and tissue distribution of lectin in Galanthus nivalis L. and Narcissus cv. Carlton. Planta, 182, 605–609.

VAN DAMME, E.J.M., PEUMANS, W.J, BARRE, A. and ROUGÉ, P. (1998). Plant lectins: a composite of several distinct families of structurally and evolutionary related proteins with diverse biological roles. Critical Reviews in Plant Sciences, 17, 575–692.

84

Literatuurlijst VAN DAMME, E.J.M., SMEETS, K. and PEUMANS, W.J. (1995). The mannose-binding monocot lectins and their genes. Lectins: Biomedical Perspectives,pp. 59–80. Taylor and Francis, London, U.K.

VAN DRIESSCHE, E. (1988). Structure and function of Leguminosae lectins. Advances in Lectin Research, 1, 73–134.

WALJUNO, K., SCHOLMA, R. A., BEINTEMA, J., MARIONO, A. and HAHN, A.M. (1975). Amino acid sequence of hevein. Proceedings of the International Rubber Conference, 2,518–531.

WEINGARTNER, M., BINAROVA, P., DRYKOVA, D., SCHWEIGHOFER, A., DAVID, J.-P., HEBERLE-BORS, E., DOONAN, J. and BÖGRE, L. (2001). Dynamic recruitment of Cdc2 to specific microtubule structures during mitosis. The Plant Cell, 13, 1929-1943.

WELLS, L, VOSELER, K. and HART, G.W. (2001). Glycosylation of nucleocytoplasmic proteins: signal transduction and O-GlcNAc. Science, 291, 2376-2378

YANG, H. and CZAPLA, T. H. 1993. Isolation and characterization of cDNA clones encoding jacalin isolectins. Journal of Biological Chemistry, 268, 5905– 5910.

YAO, P.L, HWANG, M.J., CHEN, Y.M. and YEH, K.W. (2001). Site-directed mutagenesis evidence for a negatively charged trypsin inhibitory loop in sweet potato sporamin. FEBS Letters, 496, 134138.

ZHANG, W., PEUMANS, W.J., BARRE, A., HOULES ASTOUL, C., ROVIRA, P., ROUGÉ, P., PROOST, P., TRUFFA-BACHI, P., JALALI, H. A. and VAN DAMME, E.J.M. (2000). Isolation and characterization of a jacalin-related mannose-binding lectin from salt-stressed rice (Oryza sativa) plants. Planta, 210, 970-978.

85

Expressie van Nictaba in Bright Yellow-2 celculturen

Recommend Documents