De expressie van botspecifieke moleculen in ontkalkt bot
Tamara DE CALUWE
Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. M. Cornelissen Begeleidster: Dr. H. Declercq Vakgroep: Medische Basiswetenschappen
Academiejaar 2009-2010
De expressie van botspecifieke moleculen in ontkalkt bot
Tamara DE CALUWE
Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. M. Cornelissen Begeleidster: Dr. H. Declercq Vakgroep: Medische Basiswetenschappen
Academiejaar 2009-2010
“De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.”
Datum: 21/05/2010
Tamara De Caluwé
Prof. Dr. M. Cornelissen
Voorwoord
Alvorens deze masterproef aan te vangen, zou ik graag een woord van dank betuigen aan enkele mensen in het bijzonder. Zij hebben namelijk op verschillende manieren bijgedragen tot het realiseren van deze scriptie: Mijn promotor, Professor Cornelissen voor haar kennis die zij mij overgedragen heeft, het ter beschikking stellen van haar labo en materialen en de uitstekende begeleiding tijdens het afgelopen anderhalf jaar. De tijd die ze nam om mijn thesis te lezen en tips voor verbetering aan te brengen apprecieerde ik ten zeerste. Mijn begeleidster, Heidi Declercq omdat zij er dagelijks voor mij was. Met iedere vraag kon ik bij haar terecht. Ze leerde me kennis maken met verschillende technieken binnen het labo en nam ruim de tijd om mij te begeleiden bij het schrijven van verslagen en mijn masterproef. Leen Pieters, omdat zij de persoon is die mij alle praktische zaken heeft aangeleerd. Geen enkele vraag was voor haar teveel. Ook al was ze druk aan het werk, ze stond altijd klaar om uitleg te geven. Het voltallige personeel van het labo histologie en mijn mede-masterproefstudente Linde De Grande voor de aangename werksfeer. Ik voelde mij dankzij jullie echt een geheel met de groep. Ten slotte gaat mijn allergrootste dank uit naar mijn ouders, grootouders, mijn zus Joyce en mijn vriend Tim, die op financieel en emotioneel vlak telkens voor mij klaarstonden. Gedurende mijn opleiding in de biomedische wetenschappen waren zij de personen aan wie ik alles kon vertellen en kon ik telkens op hen rekenen.
Inhoudsopgave
Samenvatting ............................................................................................................................. 1
1. Inleiding ................................................................................................................................ 2 1.1. Bot: samenstelling en structuur .................................................................................................. 2 1.2. Botvorming .................................................................................................................................. 4 1.2.1. Desmale botvorming.............................................................................................................. 4 1.2.2. Chondrale botvorming .......................................................................................................... 5 1.2.3. Botgroei bij botdefecten ........................................................................................................ 6 1.3. Botmerkers ................................................................................................................................... 8 1.3.1. Cbfa-1 .................................................................................................................................... 9 1.3.2. Osteocalcine (OC) ................................................................................................................. 9 1.4. Doelstellingen ............................................................................................................................ 10
2. Materiaal en methoden ....................................................................................................... 11 2.1. Materiaal .................................................................................................................................... 11 2.2. Prepareren van weefsels ............................................................................................................ 11 2.2.1. Versnijden van weefsels....................................................................................................... 11 2.2.2. Fixeren van weefsels ........................................................................................................... 11 2.2.3. Ontkalken van botweefsel .................................................................................................... 12 2.3. Dehydrateren van weefsels ........................................................................................................ 12 2.4. Inbedden van weefsels ............................................................................................................... 12 2.5. Snijden van weefsels .................................................................................................................. 13 2.6. Kleuringen ................................................................................................................................. 13 2.6.1. Deparaffineren .................................................................................................................... 13 2.6.2. Antigen retrieval .................................................................................................................. 13 2.6.3. Haematoxyline-eosine kleuring ........................................................................................... 13 2.6.4. Immunohistochemische kleuring ......................................................................................... 14 2.6.5. Dehydrateren ....................................................................................................................... 14 2.7. Evaluatie van de preparaten...................................................................................................... 14
3. Resultaten............................................................................................................................ 15 3.1. Histologisch overzicht van gebruikte embryo’s en weefsels .................................................... 15 3.1.1. Histologie varkensembryo carnegie stage 18 (24 dagen) ................................................... 15 3.1.2. Histologie varkensembryo carnegie stage 20 (27,5 dagen) ................................................ 15 3.1.3. Histologie voorpoot varkensfoetus 3 maand ....................................................................... 16 3.1.4. Histologie voorpoot big 3 maand ........................................................................................ 16 3.1.5. Histologie femurkop varken 6 maand.................................................................................. 16 3.2. Cbfa-1 expressieprofiel .............................................................................................................. 18 3.2.1. Keuze van het antilichaam en antigen retrieval .................................................................. 18 3.2.2. Cbfa-1 expressieprofiel tijdens de varkensontwikkeling .................................................... 19 3.2.2.1. Cbfa-1 in varkensembryo carnegie stage 18 ................................................................ 19 3.2.2.2. Cbfa-1 in varkensembryo carnegie stage 20 ................................................................ 20 3.2.2.3. Cbfa-1 in voorpoot varkensfoetus 3 maand .................................................................. 22 3.2.2.4. Cbfa-1 in voorpoot big 3 maand................................................................................... 23 3.2.2.5. Cbfa-1 in femurkop varken 6 maand ............................................................................ 24 3.2.3. Cbfa-1 immunohistochemische toepassingen ...................................................................... 24 3.2.3.1. Cbfa-1 in volwassen humaan bot.................................................................................. 24 3.2.3.2. Cbfa-1 in tissue engineering ......................................................................................... 26 3.2.3.2.1. Cbfa-1 in controle-celpellets ................................................................................. 26 3.2.3.2.2. Cbfa-1 in tissue-enigeered constructen.................................................................. 27 3.2.3.2.2.1. Cbfa-1 in humane beenmergstamcellen (hBMSC) op een collageenscaffold .................................. 27 3.2.3.2.2.2. Cbfa-1 in vetweefsel-afgeleide mesenchymale stamcellen (ATMSC) op microcarriers ................. 28 3.2.3.2.2.3. Cbfa-1 in pregedifferentieerde humane embryonale stamcellen (hESC-MSC) op microcarriers .... 29
3.3. Osteocalcine (OC) in ontkalkt en niet-ontkalkt bot .................................................................. 30 3.3.1. Keuze van antilichaam en voorbehandeling........................................................................ 30 3.3.2. OC expressie in varkensbot ................................................................................................. 31 3.3.2.1. OC in varkensembryo carnegie stage 18 ...................................................................... 31 3.3.2.2. OC in varkensembryo carnegie stage 20 ...................................................................... 31 3.3.2.3. OC in voorpoot varkensfoetus 3 maand ....................................................................... 32 3.3.2.4. OC in voorpoot big 3 maand ........................................................................................ 33 3.3.2.5. OC in femurkop varken 6 maand.................................................................................. 33 3.3.3. OC immunohistochemische toepassingen ........................................................................... 34 3.3.3.1. OC in volwassen humaan bot ....................................................................................... 34 3.3.3.2. OC in tissue-engineered constructen ............................................................................ 36 3.3.3.2.1. OC in humane beenmergstamcellen op een collageenscaffold ................................. 36 3.3.3.2.2. OC in vetweefse- afgeleide mesenchymale stamcellen op een collageen scaffold .... 36 3.3.3.2.3. OC in pregedifferentieerde humane embryonale stamcellen op collageenscaffold .. 37
4. Discussie.............................................................................................................................. 39 4.1 Cbfa-1 expressieprofiel ............................................................................................................... 39 4.2. Osteocalcine in ontkalkt bot ...................................................................................................... 41 4.3. Tissue engineered materiaal ..................................................................................................... 43 4.4. Algemeen besluit........................................................................................................................ 43
5. Referenties........................................................................................................................... 44
6. Bijlagen ................................................................................................................................... 6.1. Bijlage 1 (EDTA oplossing pH 4,5) .............................................................................................. 6.2. Bijlage 2 (EDTA oplossing pH 7,4) .............................................................................................. 6.3. Bijlage 3 (Dehydrateren van weefsels) ......................................................................................... 6.4. Bijlage 4 (Opstart van het automatisch kleurtoestel MICROM) ................................................. 6.5. Bijlage 5 (Haematoxyline-eosine kleuring) .................................................................................. 6.6. Bijlage 6 (Deparaffineren) ............................................................................................................ 6.7. Bijlage 7 (Proteinase K voorbehandeling) .................................................................................... 6.8. Bijlage 8 (Citraat voorbehandeling) ............................................................................................. 6.9. Bijlage 9 (Citraat voorbehandeling bij 90°C) ............................................................................... 6.10. Bijlage 10 (Immunohistochemische kleuring) ........................................................................... 6.11. Bijlage 11 (Dehydrateren) ...........................................................................................................
Samenvatting Binnen de medische basiswetenschappen wordt frequent onderzoek gedaan naar botregeneratie en degeneratie. Vaak werkt men dan ook aan een zoektocht om via tissueengineered constructen, zoals gedifferentieerde stamcellen in combinatie met een scaffold, critical size defecten op te vullen. Alvorens deze constructen in de praktijk zullen kunnen gebruikt worden, dient in het experimenteel stadium onder andere nagegaan te worden of er werkelijk botgroei plaatsgrijpt vanuit deze constructen. Een manier om dit te evalueren is via de aanwezigheid van botspecifieke merkers. In deze masterproef zullen twee mogelijke botspecifieke merkers onder de loep genomen worden, namelijk core binding factor 1 (cbfa-1) en osteocalcine (OC). Cbfa-1 is een nucleair proteïne dat als transcriptiefactor een groot aantal genen reguleert die geëxpresseerd worden door osteoblasten tijdens de osteoblastdifferentiatie. Het wordt in de literatuur aangeduid als een vroege osteogene merker. OC is een constitutief eiwit, dat afhankelijk is van vitamine K en bindt op calcium. Het wordt geproduceerd door de osteoblast en is een maat voor het botmetabolisme. Een specifieke functie is nog niet gekend. Deze merker wordt als late osteoblastspecifieke merker gebruikt. Voor cbfa-1 was nog niet duidelijk wanneer de expressie start en wanneer deze eventueel stopt. Een eerste luik van deze masterproef was dus om een expressieprofiel op te stellen tijdens de botontwikkeling. Dit deden wij via immunohistochemie met varkensembryo’s, foetussen, jong bot en volwassen bot. In een tweede luik diende nagegaan te worden of osteocalcine via immunohistochemie detecteerbaar is in ontkalkt bot. Deze molecule bevindt zich namelijk in de verkalkte matrix waardoor deze na ontkalking zou kunnen verdwijnen. Uit de resultaten blijkt dat cbfa-1 reeds tot expressie komt in carnegie stage 18. Eens de osteoblast matuur is, daalt de cbfa-1 expressie. Op sommige momenten lijkt er wel een up- en downregulatie plaats te grijpen. Over osteocalcine kunnen we met zekerheid zeggen dat deze molecule nog detecteerbaar is in ontkalkt bot. Ook in tissue-engineered constructen met gedifferentieerde cellen in de osteogene lijn hebben we met deze merkers een positieve aankleuring. 1
1. Inleiding
Binnen de medische basiswetenschappen, op de afdeling histologie, wordt de laatste jaren veel onderzoek gedaan in het kader van tissue-engineering. De focus ligt hierbij hoofdzakelijk op bot engineering. Via tal van constructen (biomaterialen gecombineerd met cellen) probeert men voor grote of irreguliere botdefecten een oplossing te vinden. Immers deze critical size defecten zijn moeilijk te genezen en indien het al gebeurt, gebeurt het zeer traag. De mogelijkheden die bot-engineering zou kunnen bieden zijn zeer ruim (1, 2). Alvorens deze constructen in de praktijk zullen kunnen gebruikt worden, dient in het experimenteel stadium onder andere nagegaan te worden of er werkelijk botgroei plaatsgrijpt vanuit deze constructen. Een manier om dit te evalueren is via de aanwezigheid van botspecifieke merkers (1, 3). Enkele van deze merkers maken dan ook deel uit van mijn masterproefonderwerp.
1.1 Bot: samenstelling en structuur Bot is een erg hard weefsel dat onder andere dient ter ondersteuning van het lichaam, vasthechting van spieren via pezen, beweging via gewrichten,… Hoewel bot heel hard is, is het toch geen dood weefsel. Dit kunnen we best aantonen aan de hand van het feit dat bot een sterk metabolisch actief weefsel is. Bot speelt immers een belangrijke rol in de opslag van calcium en fosfaten. Wanneer de calciumconcentratie in het bloed bijvoorbeeld laag is, zal de osteoclast actiever worden en zal calcium vrijgesteld worden. Op cellulair vlak bestaat bot uit osteoprogenitorcellen, osteoblasten, osteocyten en osteoclasten. De osteoprogenitorcellen zijn terug te vinden in het endost (de binnenste bindweefsellaag die het compact bot omringt), periost (de buitenste bindweefsellaag die het compact bot omringt) en in het beenmerg. Zij zijn afkomstig van de mesenchymcellen en staan in voor de vorming van osteoblasten. De osteoblasten hebben een botvormende functie. In een vroeg stadium zijn zij verantwoordelijk voor de aanmaak van de organische botmatrix, ook wel het osteoid genoemd. 2
Deze matrix bestaat voornamelijk uit collageen I en gesulfateerde glycosaminoglycanen die op hun beurt deel zullen uitmaken van proteoglycanen. In dit stadium van de osteosynthese zijn de osteoblasten kubusvormig en liggen ze rondom de gesecreteerde matrix. In een later stadium zullen de osteoblasten afplatten en celextensies vormen van waarop blaasjes zullen gesecreteerd worden in de matrix. De blaasjes bestaan uit alkalische fosfatasen, die voor een hoge concentratie aan PO43- zorgen. Samen met het Ca2+pompsysteem zal er een calciumfosfaatneerslag ontstaan die gaat binden op collageen en zo een verkalkte extracellulaire matrix zal vormen (4). Osteocyten zijn osteoblasten, die ingekapseld werden in de matrix. Hun celextensies vormen canaliculi. Tevens zijn deze osteocyten verantwoordelijk voor het onderhoud van de matrix. Osteoclasten zijn ten slotte de botafbrekende cellen. Zij behoren tot de groep van fagocyterende cellen. Zij graven holtes, ook wel de lacunen van Howship genaamd. Via een continue interactie met de werking van osteoblasten, modelleren zij het bot en passen het dus aan aan de druk die erop uitgeoefend wordt (4). Op macroscopisch vlak kan bot ingedeeld worden in compact en trabeculair bot. In een volwassen individu bestaan beide soorten bot uit lamellair bot. Dit bot bestaat uit extracellulaire matrix, die in lamellen gerangschikt is, met ertussen osteocyten. In ontwikkelend bot of bij botherstel zal eerst plexiform bot ontstaan, dat zich later omzet in lamellair bot (5). In compact bot zijn de lamellen concentrisch gerangschikt in osteonen. De osteonen zijn als het ware aan elkaar geplakt via een botcement. In het centrum van het osteon vinden we een holte, het Haverse kanaal langswaar bloedvaten en zenuwen lopen. De osteonen staan ook in horizontale richting met elkaar in contact via de kanalen van Volkman. De buitenste en binnenste lamellen worden respectievelijk omgeven door een periost en endost. In het trabeculair bot vinden we ook lamellen terug, maar niet onder de vorm van osteonen. Zolang er nog osteoid aanwezig is, zullen osteoblasten het compact bot/de bottrabekels omgeven. Eens het bot volgroeid is, platten de osteoblasten af en worden ze inactief. Men noemt ze dan lining cells (5).
3
Compact bot en trabeculair bot Lacunen met canaliculi
Osteon in compact bot
Lamellen
Trabeculair bot
Canaliculi
Osteon
Havers kanaal
Periost Kanaal van Volkman
Figuur 1: De macroscopische structuur van bot (U.S. National Cancer Institute's Surveillance, Epidemiology and End Results (SEER) Program)
1.2 Botvorming In het ontwikkelende embryo wordt bot op twee manieren aangemaakt. In beide gevallen ontstaan botcellen uit mesenchymale cellen. Dit zijn cellen die afkomstig zijn van het mesoderm van het embryo.
1.2.1. Desmale botvorming Een eerste methode is de directe of desmale botvorming. Hierbij gaan de mesenchymale cellen zich groeperen. Hieropvolgend zullen ze afplatten en spoelvormig worden. Op dit ogenblik noemt men deze cellen de osteoprogenitorcellen. Eens ze beginnen met de secretie van collageen I en proteoglycanen, worden ze osteoblasten genoemd. Dit geheel noemt men het osteoid. Tevens worden alkalische fosfatasen gesecreteerd die samen met Ca2+ voor de calcificatie van het bot zorgen. De ingekapselde osteoblasten worden nu osteocyten. Deze eerste aanleg van bot is primair of plexiform bot. Het botbalkje groeit verder doordat de osteoblasten die het botcentrum omgeven verder osteoid secreteren (5). 4
Zo ontstaan verschillende op elkaar gestapelde lamellen en wordt het bot lamellair of secundair bot genoemd. Verschillende van deze botbalkjes zullen met elkaar in contact komen te staan. Een vlechtwerk van botbalkjes ontstaat. Door de secretie van groeifactoren door osteoblasten, zullen capillairen tussen de botbalkjes ingroeien (5). Deze vorm van botvorming grijpt plaats in de platte beenderen, bijvoorbeeld het sternum, de schedel,…
1.2.2. Chondrale botvorming Een andere methode van botvorming is de indirecte of chondrale botvorming. Bij deze manier wordt
de
botstructuur
eerst
aangelegd
onder
de
vorm
van
kraakbeen.
Het kraakbeen ontstaat tevens uit mesenchymcellen. Hierbij gaan deze mesenchymcellen dicht tegen elkaar liggen, delen en extracellulaire matrix secreteren. De mesenchymcellen differentiëren daarbij tot chondroblasten en chondrocyten. Rondom de kraakbeenaanleg ontstaat dan een bindweefsel, namelijk het perichondrium (6). Mesenchymcellen uit dat perichondrium kunnen nu differentiëren tot botvormende cellen. Dit deel van de indirecte botvorming noemen we de perichondriale botvorming. Op dit moment hebben we een botmanchet rondom de kraakbenige aanleg. De binnenste laag van de perichondriale cellen, die botmatrixcomponenten secreteren, worden nu osteoblasten genoemd. Het perichondrium ligt tegen de botring van osteoid/extracellulaire matrix aan en wordt periost genoemd (6). De centraal gelegen kraakbeencellen nemen in volume toe, zetten Ca++ af, zodat de kraakbeenmatrix verkalkt en sterven ten slotte af. Dit proces vindt plaats vanaf de diafyse naar beide epifysen toe. In het deel waar nog geen verkalking begonnen is, blijven de kraakbeencellen groeien, en door de druk van de botmanchet zal het bot dus enkel groeien in de longitudinale richting. Osteoclasten maken ondertussen de beenmergholte aan. Vervolgens worden groeifactoren afgescheiden die de ingroei van bloedvaten en zenuwen toelaten. Hierbij komen ook een aantal mesenchymcellen de beenmergholte binnen en differentiëren zij onder andere in bloedvormende cellen. Tegelijk kunnen mesenchymcellen differentiëren in osteoblasten, die zich afzetten op het verkalkte kraakbeen, en secreteren zij botmatrix. Zij vormen dan de botbalkjes (6).
5
Wanneer diafysaire verbotting voltooid is, zal het kraakbeen in de epifysen hypertrofiëren en verkalken, een osteogene knop zal de epifysen binnendringen en verder zullen er grossomodo dezelfde veranderingen plaatsgrijpen als in de diafyse. Ter hoogte van de uiteinden van de epifysen blijft het kraakbeen behouden (5). Deze vorm van botvorming zien we vooral bij de lange beenderen optreden.
Figuur 2: Verschillende stadia bij de enchondrale botvorming (35).
1.2.3. Botgroei bij botdefecten Bij een botdefect zal er eerst een bloedklonter ontstaan. Er grijpt vrij vlug een ingroei van sterk gevasculariseerd bindweefsel plaats. Dit noemt men het granulatieweefsel. Stilaan zal dit ingepalmd worden door een fibreus of een fibrocartilagineus weefsel. De voorafgaande aanleg van een cartilagineuze callus is afhankelijk van de hoeveelheid aanwezige zuurstof. Vanuit het omliggende beenmerg zullen mesenchymale cellen verantwoordelijk zijn voor de vorming van een botcallus (7). In de beenmergholte bevinden zich namelijk colony forming units. Mesenchymale stamcellen zijn multipotente stamcellen. Dit betekent dat zij nog kunnen differentiëren in een beperkt aantal volwassen celtypes. In het periost en endost bevinden zich ook nog osteoprogenitorcellen, die mee verantwoordelijk kunnen zijn voor nieuwe botaanmaak (zie chondrale botvorming), zij het in mindere mate dan het beenmerg.
6
De mesenchymale cellen zullen differentiëren tot osteoprogenitorcellen en eens ze botmatrix secreteren, worden ze osteoblasten. Deze osteoblasten gaan de kraakbeencallus vervangen door een botcallus. Hierbij zullen bloedvaten vanuit de Haverse kanalen en kanalen van Volkman invaderen. Er ontstaat een netwerk van osteoid-balkjes en bloedvaten. De buitenzijde van de botmatrix wordt omgeven door osteoblasten die steeds naar binnen toe meer matrix secreteren. Er ontstaat dan een geheel van verkalkte botbalkjes (8). Osteoblasten die ingekapseld geraken worden osteocyten genoemd. Met verloop van tijd zullen ten slotte de botbalkjes vervangen worden door compact bot. Echter, deze natuurlijke genezing verloopt vaak onvolledig. Vlakbij het oorspronkelijk bot zal traag, maar zeker nieuw bot gevormd worden. Door het traag proces krijgen andere cellen (denk maar aan fibroblasten) vrij spel om bindweefsel bovenop de botlaag te gaan vormen. Dit is dus uitermate ongewenst (8).
A
B
C
D
Figuur 3: Botherstel: normaal bot, recente breuk met granulatieweefsel (A), fibrocartilagineuze callus (B), botcallus (nog botbalkjes) met ingroeiende bloedvaten (C) en volledig hersteld compact bot (D). (University of Glasgow, Bone tutorial 7)
7
1.3.
Botmerkers
Om de aanwezigheid van bot of botvormende cellen aan te tonen, kunnen we verschillende technieken gebruiken: we kunnen de aanwezigheid van een hoge hoeveelheid alkalische fosfatase (ALP) nagaan, de morfologie van de cellen bestuderen, de aanwezigheid van calciumfosfaten en collageen I beoordelen en de expressie van proteïnen zoals core binding factor alfa-1 (cbfa-1) en osteocalcine (OC) bekijken (3,9). ALP is een vroege merker van botvorming. Het is namelijk het enzyme dat zorgt voor de afsplitsing van fosfaatgroepen, waardoor de mogelijkheid ontstaat om samen met calciumionen calciumfosfaatneerslag te veroorzaken, wat leidt tot de mineralisatie van het bot. Detectie kan zowel biochemisch als immunohistochemisch. De osteoblasten zijn de botvormende cellen binnen het geheel van bot. Zij zorgen voor de secretie van de organische botmatrix en secundair zorgen zij ook voor de verkalking van de organische matrix. Zij zijn cuboidaal van vorm wanneer ze nog actief botmatrix secreteren. Na verloop van tijd kunnen ze afplatten en de botbalkjes omlijnen. Dan worden ze de lining cells genoemd. Collageen I synthese en calciumfosfaatmineralisatie vinden plaats gedurende de botgroei en remodellering door de osteoblast. Eerst worden collageen I en proteoglycanen aangemaakt die de organische botmatrix zullen uitmaken. Deze behoren dus tot de vroege merkers. Collageen I zorgt er onder andere voor dat ons bot niet te broos is. Het kan goed gevisualiseerd worden via elektronenmicroscopie, een trichroom-masson kleuring of een immunohistochemische kleuring. De mineralisatie grijpt plaats in een volgend stadium en is dus een late merker. Het is het gevolg van blaasjes die zich vormen op het membraan van de osteoblasten. In die blaasjes zullen door ALP activiteit fosfaatgroepen ontstaan, en door een calciumpomp zal calcium naar binnen gebracht worden. Hierbij ontstaat een neerslag van calciumfosfaten. De blaasjes worden afgesnoerd en hechten zich vast op collageen I. Ze zijn tevens goed zichtbaar via de elektronenmicroscoop. Men kan ze ook visualiseren via een Von Kossa-kleuring of via alizarin red. Het probleem echter met mineralisatie ligt in het feit dat dit geen botspecifiek proces is. Het grijpt namelijk ook plaats in het proces van celveroudering (10). Ten slotte kunnen we ook nog op zoek gaan naar de aanwezigheid of de expressie van botspecifieke moleculen. Zo bestaan er een aantal moleculen als OC en cbfa-1. Deze zullen we dan ook gebruiken in deze masterproef. Hun aanwezigheid kan gedetecteerd worden via immunohistochemie, RT-PCR,...(11).
8
1.3.1. Cbfa-1 Cbfa-1, ook wel runt related transcription factor 2 (runx2) genoemd, is een nucleair proteïne dat als transcriptiefactor een groot aantal genen reguleert die geëxpresseerd worden door osteoblasten. Cbfa-1 zou op deze manier de hoofdregulator zijn van alle genen die belangrijk zijn in osteoblast differentiatie. Een aantal factoren zoals het gebrek van bot in cbfa-1 deficiënte
muizen
en
een
ziekte
genaamd
cleidocraniale
dysplasie
bij
cbfa-1
haploinsufficiëntie bewijst deze stelling (12). Daarbij komt het feit dat het de expressie van nagenoeg alle proteïnen regelt die op dat moment nodig zijn voor de botontwikkeling, namelijk: bone sialoprotein (BSP), osteocalcin (OC), osteopontin (OP),… (13). Verder onderzoek doorheen de jaren heeft echter bewezen dat cbfa-1 ook een rol zou kunnen spelen in de regulatie van de botmatrixdepositie door volwassen osteoblasten (13-15). De cbfa molecules binden op osteoblast specifieke cis-acting elementen (OSE’s). Drie soorten cbfa zijn ondertussen ontdekt: cbfa-1, cbfa-2 en cbfa-3. Alleen cbfa-1 lijkt een rol te spelen bij osteoblasten. De OSE’s zijn onder andere aangetoond in de promotorregio van osteocalcine. Binding op deze promotorregio gebeurt via een runt-related DNA-bindend domein. Het DNAbindend domein bindt dus op de OSE en het activatiedomein van cbfa-1 is een Q/Arepetitieve sequentie. Ook in het proces van kraakbeenhypertrofie blijkt cbfa-1 een rol te spelen (16).
1.3.2. Osteocalcine (OC) Osteocalcine, ook wel Gla-proteïne genoemd is een constitutief eiwit, dat afhankelijk is van vitamine K en bindt met calcium. Het wordt geproduceerd door de osteoblast en is een maat voor het botmetabolisme (17). Na collageen I is het de meest abundante proteïne in het bot. Het wordt gesynthetiseerd door de osteoblasten als een 10 kilodalton (kDa) precursor. Een CO2 -en vitamine K dependent carboxylase enzyme zorgt er vervolgens voor dat osteocalcine zijn functionele vorm krijgt. De glutaminezuren worden namelijk vervangen door carboxyglutaminzuren (Gla-residus), die sterk aan calcium kunnen binden na een conformationele verandering. Hierdoor is OC detecteerbaar in de verkalkte botmatrix. Naast de aanwezigheid van vitamine K blijkt ook vitamine D (1,25(OH)2D3) een belangrijke rol te spelen in de hoeveelheid aanwezige osteocalcine. Zonder vitamine D wordt de hoeveelheid met 70% gereduceerd. Waarom vitamine D zo een grote rol speelt is nog niet volledig duidelijk. 9
De echte functie in het bot is nog niet helemaal opgehelderd. Men gaat ervan uit dat het een belangrijke rol speelt bij de mineralisatie van de organische matrix. Ook zou het kunnen functioneren als een regulator van hydroxyapatiethuishouding (17). Anderzijds wordt gezegd dat het een functie zou hebben in de botresorptie door afscheiding van chemoattractanten voor osteoclasten. Naast de aanwezigheid in het bot, wordt een kleine hoeveelheid osteocalcine ook in het bloed uitgescheiden. Het afbraakproduct Gla, kan men terugvinden in de urine.
1.4.
Doelstellingen
De doelstellingen van deze masterproef zijn tweeledig. Enerzijds weten we dat cbfa-1 een vroege merker is, maar we zijn nog niet zeker over de expressie in volwassen bot. Tevens vragen we ons af of cbfa-1 onderhevig is aan up- en downregulatie tijdens de normale ontwikkeling en levensduur van het bot. Daarom zullen we het expressieprofiel van deze transcriptiefactor nagaan. Anderzijds weten we dat osteocalcine een eiwit is dat constitutief wordt gesecreteerd in de verkalkte matrix. Daarom zullen we hier nagaan of de expressie van OC ook te detecteren is in ontkalkt bot. Ontkalkt bot kan men namelijk inbedden en snijden in paraffine. Indien de mogelijkheid dus bestaat om osteocalcine te detecteren in ontkalkt bot, zal men geen gebruik meer moeten maken van harsen of Technovit om coupes te maken, wat het hele proces vanaf het inbedden tot en met de immunohistochemische kleuring zou vergemakkelijken.
10
2. Materiaal en methoden 2.1. Materiaal In deze masterproef zullen we gebruik maken van verschillende referentieweefsels. Om het expressieprofiel van cbfa-1 uit te klaren en de osteocalcineëxpressie in ontkalkt bot na te gaan, zullen we gebruik maken van een varkensembryo uit carnegie stage 18, een varkensembryo uit carnegie stage 20, een voorpoot van een varkensfoetus van ongeveer 3 maand oud, een varkenspoot van een biggetje van 3 maand oud en een achterpoot van een varken van ongeveer zes maand oud. Dit alles met dank aan de faculteit diergeneeskunde. Tevens verkregen we een stuk femurkop van humane oorsprong met dank aan Prof. Dr. F. Almqvist. Ook werd gebruik gemaakt van een stuk bot afkomstig uit het kaakbeengewricht van humane oorsprong. Tevens werden een aantal tissue-engineered constructen gebruikt die binnen het labo vervaardigd werden, namelijk: gedifferentieerde humane mesenchymale stamcellen afkomstig uit het beenmerg, gedifferentieerde vetweefsel-afgeleide mesenchymale stamcellen en gedifferentieerde embryonale stamcellen. Deze cellen waren telkens gecombineerd met ofwel een collageen scaffold, ofwel microcarriers.
2.2. Prepareren van weefsels 2.2.1. Versnijden van weefsels Om een goede inbedding in de paraffine toe te laten en het snijden van coupes te vergemakkelijken, dienen weefselstukjes verkleind te worden tot ongeveer 1 à 2 cm3. Dit gebeurt op mechanische wijze via een scalpel, handzaagje of elektrisch zaagje.
2.2.2. Fixeren van weefsels De weefsels worden gefixeerd in neutraal gebufferde formol (NGF) 4% (VWR Prolabo) bij 4°C. Voor kleine stukken bot of embryo’s rekent men 2 dagen, voor grote stukken 1 week incubatie. 11
2.2.3. Ontkalken van botweefsel Om het bot goed versnijdbaar te laten worden in paraffine dient het ontkalkt te worden. Het pootje van de varkensfoetus van ongeveer 3 maand werd in twee stukken verdeeld. Eén stuk ging in een EDTA decalcificatie oplossing van pH 4,5 (zie bijlage 1). Het andere stuk in een EDTA oplossing van pH 7,4 (zie bijlage 2). Beide stukjes bleven voor 2 weken in de oplossing. Aangezien we de interferentie van EDTA als een eventuele voorbehandeling willen nagaan, werd ook een foetaal varkenspootje zonder ontkalking bereid. De grote stukken bot zoals de varkenspoot van een 3 maand oude big en de humane femurkop werden voor anderhalve maand ontkalkt in de twee EDTA-oplossingen. Het varkensbot van een 6 maand oud varken werd voor anderhalve maand ontkalkt in EDTA pH 7,4. Het humane kaakbeen werd drie weken ontkalkt in EDTA pH 4,5.
2.3. Dehydrateren van weefsels De weefsels werden in een recipiënt overgebracht en werden doordrongen met een stijgende reeks alcoholbaden (bijlage 3).
2.4. Inbedden van weefsels Weefsels dienen we in een houdertje te plaatsen en dit houdertje wordt in een reservoir met paraffine geplaatst (Reichert-Jung wax bath 2050). Dat reservoir wordt vervolgens vacuüm getrokken met behulp van een vacuümpomp (Nalgene). Op deze manier worden alle kleine holten in het weefsel gevuld met paraffine. Hierna brengen we het blokje in een plastic potje, opgevuld met gesmolten paraffine over. De volgende dag laten we de paraffine een halve dag opstijven in de koelkast. Om het geheel op een blokje te plaatsen “pellen” we het plastic af. Na het verkleinen van het blokje, smelten we de onderste laag paraffine en plaatsen het geheel op een blokje.
12
2.5. Snijden van weefsels Het snijden van de coupes gebeurde met een microtoom met stalen microtoommes (ReichertJung 2040 Autocut) op een dikte van 5µm. Na het spreiden van de coupes op een warme plaat (Gerhardt) door middel van een druppel gedestilleerd water (AD), worden ze minstens voor één nacht overgebracht in een incubator bij 37°C.
2.6. Kleuringen 2.6.1. Deparaffineren De coupes worden eerst gedeparaffineerd. Dit gebeurt aan de hand van een ingesteld programma in het toestel Microm HMS 740, dat opgestart wordt volgens de instructies in bijlage 4. De coupes worden hier automatisch ondergedompeld in een dalende reeks alcoholbaden (bijlage 6).
2.6.2. Antigen retrieval Gedurende de gehele masterproef zijn er meerdere antigen retrievals getest om enerzijds de antigenen meer beschikbaar te maken voor het primair antilichaam, maar anderzijds ook om het loskomen van de botcoupes te vermijden/ te minimaliseren. Eerst en vooral probeerden we de immunohistochemische kleuringen te verwezenlijken zonder enige voorbehandeling. Als effectieve voorbehandelingen werden vervolgens proteinase K (bijlage 7), citraat (100°C) (bijlage 8) en citraat bij 90°C (bijlage 9) uitgeprobeerd.
2.6.3. Haematoxyline-eosine kleuring Ieder weefsel/alle cellen waarvan we een immuunkleuring doen, dienen eerst een haematoxyline/eosine kleuring te ondergaan. Dit om de algemene histologie te kunnen bekijken.
13
De volledige kleuring gebeurt met het automatisch kleurtoestel Microm HMS 740, dat opgestart wordt volgens de instructies in bijlage 4. Alvorens de automatische kleuring te starten dienen de bakjes die voorzien zijn voor eosine en (gefilterde) haematoxyline opgevuld te worden. Het protocol voor de haematoxylineeosine kleuring bevindt zich in bijlage 5.
2.6.4. Immunohistochemische kleuring De eigenlijke immuunkleuring (zie bijlage 10) werd uitgevoerd met als primair antilichaam muis monoclonaal antilichaam tegen runx 2 van humane- en rattenoorsprong (Abcam) in een verdunning van 1/150 of 1/200. Tevens werd het geit polyclonaal antilichaam tegen cbfa-1 van muis, rat en humaan materiaal (Santa Cruz) uitgetest in een verdunning van 1:50. Voor osteocalcine werd tevens van de firma Santa Cruz gebruik gemaakt van een geit polyclonaal antilichaam tegen OC in een verdunning van 1/100 gericht tegen humane epitopen. Als secundair antilichaam werd gebruik gemaakt van respectievelijk gebiotinileerd rabbit anti-mouse en gebiotinileerd rabbit anti-goat antilichaam (Dako). Via een binding van streptavidine-horse raddish peroxidase (Dako) en DAB (Sigma-Aldrich) als chromogeen substraat worden de plaatsen met expressie van cbfa-1 of OC gevisualiseerd.
2.6.5. Dehydrateren De coupes worden gedehydrateerd. Dit gebeurt aan de hand van een ingesteld programma in het toestel Microm HMS 740. De coupes worden hier automatisch ondergedompeld in een stijgende reeks alcoholbaden (bijlage 11). Nadien worden ze met mounting medium (Richard Alan Scientific) en een dekglaasje gemonteerd.
2.7. Evaluatie van de preparaten Evaluatie gebeurt met de lichtmicroscoop. Het inscannen van de coupes gebeurt met de virtuele microscoop (Olympus BX 51) en via het programma Dotslide. Bewerkingen op de foto’s gebeurden via Photoshop PS3.
14
3. Resultaten
3.1. Histologisch overzicht van gebruikte embryo’s en weefsels Alvorens de immuunkleuringen uit te voeren, is het belangrijk een overzicht te hebben van de histologie van de preparaten. Via haematoxyline-eosine kleuringen bekeken we vooral de kraakbeen- en botaanleg van het embryo tot en met het volwassen bot.
3.1.1. Histologie varkensembryo carnegie stage 18 (24 dagen) In de kop zijn zones aanwezig van dens gepakte mesenchymale cellen, daar waar er desmale botvorming van het schedeldak zal optreden. Tevens zijn er kraakbeenzones aanwezig in de kop ter hoogte van waar de aangezichtsbeenderen zoals de mandibula zullen komen. In het lijfje zien we ter hoogte van de aanleg van de pootjes, ruggenwervels en ribben kraakbeenzones (Figuur 4A). De chondrocyten zijn licht hypertrofiërend. Rondom het kraakbeen bevindt zich een perichondrium met afgeplatte cellen.
3.1.2. Histologie varkensembryo carnegie stage 20 (27,5 dagen) Er is een regio van botvorming ter hoogte van de vormende oogkas. Bottrabekeltjes worden omgeven door osteoblasten en bevatten osteocyten. Meer naar de kaakregio toe zien we een groot aantal sterk hypertrofiërende kraakbeenzones (Figuur 4B). Verder in het lichaam vinden we ter hoogte van de ruggenwervels en de ribben hypertrofiërend kraakbeen (Figuur 4C). Een groot deel van de kraakbeencellen zijn reeds gedegenereerd, waardoor holten ontstaan in de kraakbeenmatrix. Dit vinden we ook terug in de achterpoot, waar we zelfs een beginnende aanleg van een diafyse en groeischijven zien. Verkalking treedt op en een centrale botring wordt gevormd. Alle kraakbeenzones zijn omringd door een perichondrium/periost met afgeplatte cellen.
15
3.1.3. Histologie voorpoot varkensfoetus 3 maand We zagen een aanwezigheid van een groot aantal botbalkjes. Osteocyten zijn nog maar in kleine aantallen aanwezig. Osteoblasten omlijnen de botbalkjes en verder vinden we een groot aantal beenmergcellen (rode bloedcellen, lymfocyten, megakaryocyten, mesenchymale stamcellen,…) (Figuur 4D). Op sommige coupes is tevens een periost terug te vinden. Rondom de botaanleg vinden we spier -en huidweefsel met haarvaatjes en talgkliertjes.
3.1.4. Histologie voorpoot big 3 maand Van buiten naar binnen vinden we compact bot - dense botbalkjes - ver van elkaar gelegen botbalkjes. Alle botbalkjes worden omgeven door osteoblasten/ lining cells. In de botmatrix zijn osteocyten aanwezig (Figuur 4E). Een groot aantal beenmergcellen is aanwezig tussen de ver van elkaar liggende botbalkjes.
3.1.5. Histologie femurkop varken 6 maand Aan de buitenkant van het preparaat vinden we het articulair kraakbeen. Bijna onmiddellijk daaropvolgend zien we botbalkjes. Er is slechts een kleine hoeveelheid compact bot aanwezig. De botbalkjes worden omgeven door osteoblasten/ lining cells en bevatten osteocyten. De femur bevat rood beenmerg. Er zijn enkele vetcellen te vinden met ertussen verschillende hematopoetische cellen (Figuur 4F).
16
A
B Ob M P Oc
P
C C
C
D GS
Ob BM
AC
F
E BM
BM VK
Ob Oc
Figuur 4: Haematoxyline-eosine kleuring van bot(vorming) tijdens verschillende stadia van de ontwikkeling. (A) Varkensembryo carnegie stage 18 met kraakbeenzones ter hoogte van de ruggenwervels. Perichondrium (p) en licht hypertrofe chondrocyten (c) zijn zichtbaar. (B) Varkensembryo carnegie stage 20 ter hoogte van de kop. Botbalkjes met botmatrix (M), osteocyten (Oc) en osteoblasten (Ob) zijn zichtbaar. Ook kraakbeen met perichondrium (p) en prehypertrofe chondrocyten (c) zijn aanwezig. In het lichaam van dit varkensembryo (C) vinden we ook kraakbeenregio’s terug. (D) Voorpoot van een varkensfoetus van drie maand. De groeischijf (GS) is zichtbaar. Osteoblasten (Ob) omgeven de botbalkjes en tussenin liggen heel wat beenmergcellen (BM). (E) Bot van een ulna van een varken van 3 maand. Beenmergcellen (BM) omgeven de botbalkjes. Osteoblasten (Ob) sluiten aan aan de botbalkjes en osteocyten liggen in de matrix (Oc). (F) Femurkop van een varken van 6 maand. Articulair kraakbeen (AC) omgeeft de botbalkjes die tussen het beenmerg (BM) liggen. Resten van de verkalkte kraakbeenmatrix zijn zichtbaar (VK)
17
3.2. Cbfa-1 expressieprofiel Een eerste luik van deze masterproef hield in een expressieprofiel van cbfa-1 op te stellen via immunohistochemie. We gaan via embryo’s, foetussen, jong en volwassen bot na in welke cellen cbfa-1 voorkomt en in welke stadia van de ontwikkeling deze expressie optreedt.
3.2.1. Keuze van het antilichaam en antigen retrieval De resultaten van de uitgeteste antigen retrievals, in combinatie met de verschillende antilichamen voor ontkalkt en niet-ontkalkt bot zijn voorgesteld in tabel I. Tabel I: Uitgeteste combinaties van antilichamen en antigen retrievals op weefsels.
Zonder AR
Citraat (koken)
Proteinase K
Citraat (90°C)
SC
Abc
SC
Abc
SC
Abc
SC
Abc
Zonder EDTA
-+
-+
/
++
/
--
-+
++
Met EDTA
++
-+
/
+-
/
--
++
++
SC = antilichaam van Santa Cruz; Abc = antilichaam van Abcam. Het eerste teken (+ of -) staat voor aankleuring, het tweede teken voor de morfologie: ++ = goede aankleuring en goede morfologie - + = geen aankleuring en goede morfologie + - = goede aankleuring maar verlies van weefsel - - = geen aankleuring en slechte morfologie
Er werden twee verschillende cbfa-1 antilichamen getest. Een muis-monoclonaal antilichaam gericht tegen humane- en rattenweefsels (Abcam) en een geit polyclonaal antilichaam gericht tegen muis, rat en humaan materiaal (Santa Cruz). Zonder antigen retrieval kregen we met het muis monoclonaal antilichaam (Abc) geen positieve aankleuring. Met het geit polyclonaal antilichaam (SC) in een verdunning van 1:50 konden we enkel in het adult materiaal een positieve aankleuring krijgen. Volgens de instructies van Abcam diende de immunohistochemische kleuring voorafgegaan te worden door een citraat antigen retrieval bij 100°C. Dit leverde in een verdunning van 1:150 een goede aankleuring in het embryonaal en foetaal weefsel. De coupes die veel bot bevatten, kwamen echter los door het kookproces. Door dit verlies aan weefsel, hebben we deze methode enkel getest met cbfa-1 van de firma Abcam.
18
Een antigen-retrieval methode waarbij geen kookproces nodig was (en waardoor het bot zou blijven kleven op het preparaatglaasje), was proteinase K. De Proteinase K voorbehandeling leidde echter tot een verlies van cellen. Een andere methode zonder kookproces is de citraat antigen retrieval waarin het citraat opgewarmd wordt tot 90°C. In combinatie met het antilichaam van Abcam (1:200) leidt dit tot een goede aankleuring. Met het geit polyclonaal antilichaam (SC) krijgen we terug geen aankleuring ter hoogte van het embryonaal bot. Algemeen is de voorbehandeling met citraat op 90°C in combinatie met het cbfa-1 antilichaam van Abcam het best. Deze methode werd, tenzij anders vermeld, gebruikt in de volgende experimenten.
3.2.2. Cbfa-1 expressieprofiel tijdens de varkensontwikkeling 3.2.2.1. Cbfa-1 in varkensembryo carnegie stage 18
Zowel in de kop als in de romp is er een positieve aankleuring van de chondrocyten en van het perichondrium ter hoogte van de kraakbeenaanleg (Figuur 5).
Figuur 5: Cbfa-1 immunohistochemische kleuring (1:150 met citraat AR (100°C)) van een varkensembryo carnegie stage 18. Ruggenwervels en ribben zijn te zien. Op de uitvergroting positieve (prehypertrofe) chondrocyten en perichondrium (pijltje).
19
In de voorpoot en de kop zijn er zones van positieve aankleuring van de densgepakte mesenchymale cellen van de desmale botaanleg (Figuur 6).
Figuur 6: Cbfa-1 immunohistochemische kleuring (1:150 met citraat AR (100°C) van een varkensembryo carnegie stage 18. De densgepakte mesenchymale cellen ter hoogte van het schedeldak kleuren positief aan (pijl).
3.2.2.2. Cbfa-1 in varkensembryo carnegie stage 20
Figuur 7 toont een positieve aankleuring van het perichondrium in de kop. Rondom het botbalkje kleuren enkele osteoblasten licht positief.
20
BB
Figuur 7: Cbfa-1 immunohistochemische kleuring (1:150 met citraat AR (90°C) van een kop van een varkensembryo uit carnegie stage 20. Botbalkjes zijn te zien (BB). Sommige osteoblasten zijn licht positief. Osteocyten zijn negatief. Het perichondrium is positief (pijl).
Ook is er een licht positieve aankleuring te zien ter hoogte van de kraakbeenzones in het lichaam (Figuur 8). De zone rond de kraakbeencellen is positief aangekleurd. De chondrocyten kleuren niet positief aan. Een groot aantal onder hen is zelfs verloren gegaan of reeds gedegenereerd.
Figuur 8: Cbfa-1 IHC kleuring (1:150 met citraat 90°C) van de ribben van een varkensembryo carnegie stage 20. Positieve aankleuring van het perichondrium/periost (zie pijltje). Bijna enkel de kraakbeenmatrix is nog zichtbaar.
21
3.2.2.3. Cbfa-1 in voorpoot varkensfoetus 3 maand
Figuur 9 toont een aankleuring van de osteoblasten, osteocyten,
(pre)hypertrofe
chondrocyten, cellen in de binnenste laag van het periost (de osteogene laag) en een aantal cellen binnen het beenmerg met een duidelijke kern en groot cytoplasma. Dit zijn waarschijnlijk de colony forming units (Figuur 10). Deze bevindingen vinden we zowel terug in het niet ontkalkt stukje, in het stukje dat ontkalkt is in EDTA pH 4,5 en in het stukje dat ontkalkt is in EDTA bij een pH van 7,4. Aspecifieke aankleuring grijpt plaats ter hoogte van enkele haarfollikels.
Figuur 9: Cbfa-1 immunohistochemische kleuring (1:150 met citraat AR (100°C)) van een voorpoot van een varkensfoetus van 3 maand oud. Er is een positieve aankleuring van het perichondrium/periost (pijltje). De chondrocyten in het (pre)hypertroof kraakbeen zijn positief. Ook zijn de osteoblasten positief.
22
A
B
Figuur 10: Cbfa-1 immunohistochemische kleuring (1:150 met citraat AR (100°C)) van een voorpoot van een varkensfoetus van 3 maand oud. (A) Het pijltje duidt een mogelijke colony forming unit aan. (B) De chondrocyten die niet (pre)hypertroof zijn kleuren niet aan.
3.2.2.4. Cbfa-1 in voorpoot big 3 maand
Ter hoogte van de regio waar het compact bot overgaat in de dense bottrabekels, vinden we enkele positieve osteoblasten (Figuur 11). Osteocyten zijn negatief. De lining cells ter hoogte van de centraal gelegen bottrabekels zijn negatief of heel licht positief.
Figuur 11: Cbfa-1 immunohistochemische kleuring (1:150 met citraat (90°C)) van een tibia van een big van 3 maand oud. Er is een positieve aankleuring rondom sommige (dichtgepakte) botbalkjes (pijltjes). Dit is meer te zien aan de randen van het bot dan centraal in het bot.
23
3.2.2.5. Cbfa-1 in femurkop varken 6 maand
De osteocyten binnen de botbalkjes en osteoblasten/lining cells kleuren negatief. De beenmergcellen en vooral rode bloedcellen kleuren licht positief. Colony forming untis zijn niet duidelijk aanwezig. In het articulair kraakbeen zien we plaatselijk een positieve aankleuring van enkele prehypertrofe chondrocyten (Figuur 12).
*
Figuur 12: Cbfa-1 IHC (1:150 met citraat (90°C)) van een femurkop van varken van 6 maand oud. Er is geen positieve aankleuring van osteoblasten en osteocyten (pijl). Verkalkte kraakbeenmatrix is aanwezig (ster). De inzet toont een positieve aankleuring van enkele prehypertrofe chondrocyten in het articulair kraakbeen (pijltjes).
3.2.3. Cbfa-1 immunohistochemische toepassingen 3.2.3.1. Cbfa-1 in volwassen humaan bot De coupe bevat een grote regio van compact bot met omliggend enkele vetcellen en losse botbalkjes. In de botbalkjes en het compact bot zien we osteocyten. Rondom het compact bot en de balkjes enkele osteoblasten/ lining cells. Tussen de vetcellen is er nog de aanwezigheid van enkele beenmergcellen, zoals rode bloedcellen, witte bloedcellen, cellen met een duidelijke kern en groot cytoplasma,...(Figuur 13).
24
We vinden enkel een positieve aankleuring van deze cellen met een groter cytoplasma dan de andere. Dit zijn waarschijnlijk de osteogenic colony forming units (CFU-O) (Figuur 14).
*
Figuur 13: Cbfa-1 immunohistochemische kleuring (1:50 zonder voorbehandeling (SC)) van humaan kaakbeen. Op de grote foto is compact bot te zien met er rond wit beenmerg. In de uitvergroting van het wit beenmerg zijn de colony forming untis aangeduid met pijltjes. Lining cells zijn duidelijk negatief (sterretje).
Figuur 14: Cbfa-1 IHC kleuring ( 1:150 met citraat AR (90°C)). De CFU-O’s zijn positief aangekleurd (pijltjes).
25
In het bot afkomstig van de femurkop zien we de aanwezigheid van een relatief dikke laag kraakbeen, het gewrichtskraakbeen. Onder het kraakbeen vinden we bijna geen compact bot. Hieronder beginnen een aantal botbalkjes die slechts in lichte mate met elkaar verweven zijn en zeer dun zijn. Tussen de balkjes vinden we een aantal vetcellen. Osteocyten zijn zichtbaar. Osteoblasten zijn moeilijker te vinden. Als ze er al zijn bevinden ze zich meer aan de overgang tussen het gewrichtskraakbeen en de botbalkjes. In de immunohistochemische kleuring is geen enkele positieve cel te vinden (Figuur 15).
Figuur 15: Cbfa-1 IHC kleuring (1:200 met citraat voorbehandeling (90°C)) van humane femurkop. Er is geen positieve aankleuring te zien. Rechtsboven gewrichtskraakbeen, met eronder dunne botbalkjes die door vetweefsel omgeven worden.
3.2.3.2. Cbfa-1 in tissue engineering
3.2.3.2.1. Cbfa-1 in controle-celpellets
Wanneer men een immunohistochemische kleuring uitvoert, dient men te weten of de kleuring specifiek is. Vaak is het belangrijk om referentieweefsels/cellen mee te nemen die zeker positief en zeker negatief aankleuren met het antilichaam. Hier weten we dat een humane osteosarcomacellijn (Saos-2) zeker positief is voor cbfa-1 en een cellijn van humane foreskin fibroblasten (HFF) zeker negatief is voor cbfa-1.
26
De Saos-2 cellen kleuren in een immunohistochemische kleuring sterk positief aan. De HFF’s kleuren nagenoeg niet aan in een immunohistochemische kleuring (Figuur 16).
A
B
Figuur 16: Cbfa-1 immunohistochemische kleuring (1:200 met citraat antigen retrieval (90°C)) van (A) een Saos-2 celpellet. Alle cellen zijn positief. (B) een HFF celpellet. Alle cellen zijn negatief.
3.2.3.2.2. Cbfa-1 in tissue-enigeered constructen
3.2.3.2.2.1. Cbfa-1 in humane beenmergstamcellen (hBMSC) op een collageenscaffold De hBMSC’s passage 4 (P4) (Lonza) werden statisch uitgezaaid op een collageen scaffold (Beckton Dickinson) aan een densiteit van 1.106 cellen/scaffold in osteogeen medium (α minimal essential medium (αMEM) (Gibco Invitrogen) + 10% foetal bovine serum (FBS) (Gibco Invitrogen) + 200µM L-ascorbinezuur-2-fosfaat (L-AA) (Sigma Aldrich) + 100 nM dexamethasone (Sigma Aldrich) + 10mM β-glycerofosfaat (Sigma Aldrich)). Na 24 uur werden de scaffolds overgebracht naar een dynamisch cultuursysteem (70rpm) en gedurende 38 dagen gekweekt. Een groot aantal cellen is positief aangekleurd. Enkele cellen blijven negatief en deze bevinden zich vooral aan de buitenrand van het construct (Figuur 17).
27
Figuur 17: Cbfa-1 IHC kleuring van mesenchymale stamcellen afkomstig uit humaan beenmerg, uitgezaaid op een BD-collageen scaffold (1:150 met citraat AR (90°C)).
3.2.3.2.2.2. Cbfa-1 in vetweefsel-afgeleide mesenchymale stamcellen (ATMSC) op microcarriers
ATMSC P4 (Cryosave, The Cell Factory) werden statisch uitgezaaid op microcarriers (Cultispher S) aan een concentratie van 5.106 cellen/0,09g microcarriers in osteogeen medium (αMEM + 10% FBS + 100µM L-AA + 10nM dexamethasone + 10mM β-glycerofosfaat). Na 24 uur werden de cel-geladen microcarriers overgebracht naar een dynamisch cultuursysteem (70rpm) en gedurende 34 dagen gekweekt. Een sterk positieve aankleuring treedt op van een groot aantal cellen. Toch bevinden er zich nog negatieve cellen in de microcarriers (Figuur 18).
28
Figuur 18: Cbfa-1 IHC kleuring van ATMSC’s op cultisphers (1:150 met citraat AR (90°C))
3.2.3.2.2.3. Cbfa-1 in pregedifferentieerde humane embryonale stamcellen (hESC-MSC) op microcarriers
Humane embryonale stamcellen
(hESC) (VUB02) werden
pregedifferentieerd
tot
mesenchymale stamcellen (hESC-MSC) op gelatine gecoate platen. Daarna werden de hESCMSC P4 statisch uitgezaaid op microcarriers aan een concentratie van 2.106 cellen/0,09g microcarriers in osteogeen medium (αMEM + 10% FBS + 200µM L-AA + 100nM dexamethason + 10mM β-glycerofosfaat). Na 24u werden de cel-geladen microcarriers overgebracht naar een dynamisch cultuursysteem (70rpm) en gedurende 34 dagen gekweekt. Een sterk positieve aankleuring treedt op van een groot aantal cellen. Er bevinden zich ook negatieve cellen in de microcarriers.
29
Figuur 19: Cbfa-1 IHC kleuring van gedifferentieerde hESC’s op cultisphers (1:150 met citraat AR (90°C)
3.3. Osteocalcine (OC) in ontkalkt en niet-ontkalkt bot In een tweede luik van deze masterproef was het de bedoeling via immunohistochemie na te gaan of osteocalcine in paraffine-ingebed bot kan gedetecteerd worden. Dit is niet evident aangezien bot dan ontkalkt moet worden en osteocalcine een eiwit is dat geëxpresseerd wordt door osteoblasten en in de verkalkte matrix uitgescheiden wordt.
3.3.1. Keuze van antilichaam en voorbehandeling De kleuring is in het verleden reeds uitgevoerd op niet-ontkalkt bot (ingebed in Technovit). Het osteocalcine geit polyclonaal antilichaam tegen humaan weefsel (Santa Cruz) diende volgens de instructies van de fabrikant in een verdunning van 1:100 zonder antigen retrieval gebruikt te worden. Dit antilichaam werd dan ook in die verdunning zonder antigen retrieval gebruikt.
30
3.3.2. OC expressie in varkensbot 3.3.2.1. OC in varkensembryo carnegie stage 18 Dit embryo was niet ontkalkt. Chondrocyten en perichondrium zijn negatief (Figuur 20).
Figuur 20: OC immunohistochemische kleuring (1:100 zonder voorbehandeling) van een varkensembryo carnegie stage 18. Chondrocyten en perichondrium zijn negatief (pijl). Op de foto is de kraakbeenaanleg van ruggenwervels en ribben te zien.
3.3.2.2. OC in varkensembryo carnegie stage 20 Het embryo was niet ontkalkt. Er is een positieve aankleuring van de kraakbeenmatrix en dit zowel in het lichaam als in de kop. De chondrocyten kleuren niet aan. In het botbalkje ter hoogte van de oogkas zien we geen positieve aankleuring van de osteoblasten en de extracellulaire matrix (Figuur 21).
31
d
Figuur 21: OC IHC (1:100 zonder voorbehandeling) van een kop van een varkensembryo in carnegie stage 20. De kraakbeenmatrix is positief. De chondrocyten en het perichondrium zijn negatief. Osteoblasten en osteoid rondom en in het desmaal aangelegde botbalkje (d) zijn negatief
3.3.2.3. OC in voorpoot varkensfoetus 3 maand Dit weefsel is ontkalkt voor 10 dagen. In het varkenspootje van de foetus van 3 maand zien we een positieve aankleuring van de osteoblasten. Ook de osteocyten kleuren positief aan. Ter hoogte van de overgang hypertroof kraakbeen-bottrabekels vinden we enkele positieve cellen. De kraakbeenmatrix kleurt niet positief aan (Figuur 22).
Figuur 22: OC IHC (1:100 zonder voorbehandeling) van een voorpoot van een varkensfoetus van 3 maand. Positieve osteoblasten en osteocyten. Perichondrium en hypertroof kraakbeen zijn negatief.
32
3.3.2.4. OC in voorpoot big 3 maand In figuur 23 is het materiaal anderhalve maand ontkalkt. De osteoblasten die de bottrabekels omlijnen kleuren allen positief aan. Enkele osteocyten binnen de verkalkte matrix kleuren positief aan. Het osteoid en de verkalkte botmatrix kunnen goed onderscheiden worden. Een licht positieve aankleuring van de verkalkte botmatrix grijpt plaats.
o v
Figuur 23: OC immunohistochemische kleuring (1:100 zonder voorbehandeling) van een voorpoot van een big van 3 maand. Positieve aankleuring van de osteoblasten. Licht positieve aankleuring van de verkalkte botmatrix (v). Osteoid is negatief (o). Enkele osteocyten zijn positief.
3.3.2.5. OC in femurkop varken 6maand Dit materiaal is anderhalve maand ontkalkt. Osteoblasten, osteocyten en de verkalkte botmatrix kleuren sterk positief aan. Daar waar nieuw osteoid gesecreteerd wordt, zien we geen aankleuring (Figuur 24).
33
Figuur 24: Osteocalcine IHC kleuring (1:50 zonder AR) van een botbalkje in een femurkop van een varken van 6 maand. Het balkje, de osteoblasten en osteocyten zijn sterk positief. De overige positieve zones zijn rode bloedcellen.
3.3.3. OC immunohistochemische toepassingen 3.3.3.1. OC in volwassen humaan bot De femurkop is anderhalve maand ontkalkt. Het gewrichtskraakbeen is negatief. De bottrabekels kleuren wel positief aan. De weinige osteoblasten en de osteocyten binnen de trabekels kleuren tevens positief aan (figuur 25).
34
Figuur 25: OC IHC (1:100 zonder voorbehandeling) van een humane femurkop. Positieve bottrabekels, lining cells en osteoblasten in het osteon. Het gewrichtskraakbeen is negatief
Het kaakbeen is drie weken ontkalkt. Er is een positieve aankleuring van de osteoblasten, de osteocyten en de verkalkte botmatrix. Tussen de osteoblasten en de verkalkte botmatrix is een duidelijk randje te zien van osteoid dat negatief blijft (Figuur 26).
Figuur 26: OC IHC (1:100 zonder voorbehandeling) van een humaan kaakbeen. De osteoblasten, de osteocyten en de verkalkte botmatrix zijn positief. De pijl duidt een negatief laagje osteoid aan.
35
3.3.3.2. OC in tissue-engineered constructen
3.3.3.2.1. OC in humane beenmergstamcellen op een collageenscaffold De hBMSC’s passage 4 (P4) (Lonza) werden statisch uitgezaaid op een collageen scaffold (Beckton Dickinson) aan een densiteit van 1.106 cellen/scaffold in osteogeen medium (α minimal essential medium (αMEM) + 10% foetal bovine serum (FBS) + 200µM Lascorbinezuur-2-fosfaat (L-AA) + 100 nM dexamethasone + 10mM β-glycerofosfaat). Na 24 uur werden de scaffolds overgebracht naar een dynamisch cultuursysteem (70rpm) en gedurende 38 dagen gekweekt. Nagenoeg alle cellen kleuren positief aan. De matrixsecreten kleuren tevens positief aan (Figuur 27).
Figuur 27: OC immunohistochemische kleuring (1:100 zonder voorbehandeling) van hBMSC’s op BD collageen scaffold. Cellen en matrix kleuren positief aan.
3.3.3.2.2. OC in vetweefsel-afgeleide mesenchymale stamcellen op een collageen scaffold De ATMSC’s passage 4 (P4) (Cryosave, The Cell Factory) werden statisch uitgezaaid op een collageen scaffold (Beckton Dickinson) aan een densiteit van 1.106 cellen/scaffold in osteogeen medium (αMEM + 10% foetal bovine serum (FBS) + 200µM L-ascorbinezuur-2fosfaat (L-AA) + 100 nM dexamethasone + 10mM β-glycerofosfaat).
36
Na 24 uur werden de scaffolds overgebracht naar een dynamisch cultuursysteem (70rpm) en gedurende 38 dagen gekweekt. Nagenoeg alle cellen kleuren positief aan. De gesecreteerde matrix kleurt sterk positief aan (Figuur 28).
Figuur 28: OC immunohistochemische kleuring (1:100 zonder voorbehandeling) van ATMSC’s op BD collageen scaffold. Cellen en matrix kleuren positief aan.
3.3.3.2.3. OC in pregedifferentieerde humane embryonale stamcellen op collageenscaffold hESC (VUB02) werden pregedifferentieerd tot mesenchymale stamcel (hESC-MSC) op gelatine gecoate platen. Daarna werden de hESC-MSC P4 statisch uitgezaaid op collageenscaffolds aan een concentratie van 1.106 cellen/scaffold in osteogeen medium (αMEM + 10% FBS + 200µM L-AA + 100nM dexamethason + 10mM β-glycerofosfaat). Na 24u werden de cel-geladen microcarriers overgebracht naar een dynamisch cultuursysteem (70rpm) en gedurende 38 dagen gekweekt. Een groot aantal cellen kleuren positief aan. De gesecreteerde matrix kleurt sterk positief aan. De bindweefselcellen die het construct omgeven kleuren niet aan (Figuur 29).
37
Figuur 29: OC immunohistochemische kleuring (1:100 zonder voorbehandeling) van hESC’s op BD collageen scaffold. Cellen en matrix kleuren positief aan.
38
4. Discussie 4.1 Cbfa-1 expressieprofiel Cbfa-1 is een transcriptiefactor, essentieel voor osteoblastdifferentiatie en wordt bijgevolg beschouwd als een indicator voor osteogenesis en skeletogenesis. Er bestaat echter nog onduidelijkheid over het expressieprofiel van deze merker. Algemeen wordt aanvaard dat cbfa-1 tot expressie komt bij processen gerelateerd met osteoblastdifferentiatie tijdens de embryogenese. Tevens wordt het geëxpresseerd door de mesenchymale stamcellen tijdens botherstel (18). Toch denken enkele onderzoeksgroepen dat het ook een rol zou spelen in het onderhouden van het volwassen botfenotype en bijgevolg ook in mature osteoblasten aanwezig is (13, 15). In deze masterproef werd door middel van immunohistochemie nagegaan in welke stadia van de botontwikkeling cbfa-1 geëxpresseerd wordt, gebruik makend van verschillende ontwikkelingsstadia van varkensembryo’s, -foetussen en volwassen varkensbot. In het varkensembryo (carnegie stage 18) waren de chondrocyten en het perichondrium in het prehypertroof
kraakbeen
ter
hoogte
van
de
ribben,
de
ruggenwervels
en
de
aangezichtsbeenderen positief voor cbfa-1. Deze positieve aankleuring werd reeds in heel wat onderzoeken aangetoond. Cbfa-1 zou immers noodzakelijk zijn voor de hypertrofie van het kraakbeen, een essentieel proces in de enchondrale botvorming (19, 16). Het is dan ook niet te verwonderen dat wanneer men een deficiënt cbfa-1 gen maakt in een muismodel, er een daling van de hypertrofie van het kraakbeen optreedt. (19) Ook in de dens gepakte mesenchymale cellen, centra van de desmale botvorming, vinden we een positieve aankleuring. In carnegie stage 20 is er in de kop een regio van desmaal gevormde botbalkjes. Echter, de omgevende osteoblasten expresseren in verschillende mate een kleine hoeveelheid cbfa-1. Dit verlies aan cbfa-1 expressie tijdens de desmale botvorming zou kunnen betekenen dat er een up- en downregulatie van cbfa-1 plaatsvindt (19). Ter hoogte van het hypertroof kraakbeen verdwijnt de cbfa-1 expressie van de chondrocyten. Zij zijn in aantal sterk afgenomen doordat ze in apoptose gaan (19). Vanuit het perichondrium 39
ontstaan de osteoprogenitors (6, 20) wat de positieve aankleuring verklaart. De onderzoeksgroep van Kim et al denkt echter ook aan het ontstaan van osteoprogenitors via chondrocytentransdifferentiatie. Voor deze stelling is nog niet zoveel evidentie gevonden in vivo. Het lijkt dan ook onwaarschijnlijk dat de chondrocyten eerst dedifferentiëren om vervolgens te differentiëren in de osteoblast-lijn. In de foetale botontwikkeling komt cbfa-1 tot expressie ter hoogte van de osteoblasten, enkele cellen in het beenmerg en een groot aantal chondrocyten van de groeischijf daar waar hypertrofie van het kraakbeen optreedt (6). De resting cells en de delende cellen blijven negatief (5,19). De osteoblasten rond en in de botbalkjes expresseren duidelijk cbfa-1. Zij zijn verantwoordelijk voor de aanmaak van osteoid en de mineralisatie ervan. Deze mineralisatie wordt hoogst waarschijnlijk geregeld door osteocalcine, dat geactiveerd wordt door de transcriptiefactor cbfa-1 (21). Ten slotte zijn er nog de cellen in het beenmerg. Het valt niet duidelijk uit te maken welke cellen precies positief zijn. Daarvoor zouden er nog meer analyses nodig zijn. Maar aangezien het beenmerg mesenchymale stamcellen en een aantal cellen met duidelijke kern en groot cytoplasma (de colony forming units (CFU-O)) bezit, is de kans groot dat het over deze laatste cellen gaat. Verder in de botontwikkeling kwam cbfa-1 niet in alle osteoblasten tot expressie. Op de overgang compact-spongieus bot zagen we enkele dicht op elkaar gelegen botbalkjes omringd door positieve cellen, terwijl iets verder alle cellen negatief waren. Een mogelijke verklaring voor dit fenomeen is dat appositionele botgroei plaatsgrijpt van op de grens botbalkjes/compact bot waarbij osteoblastdifferentiatie optreedt door de hoge nood aan osteoblasten. Indien men ervan uitgaat dat de cbfa-1 expressie daalt eens de osteoblast matuur is, dan kan dit een verklaring voor ons resultaat zijn. Cbfa-1 zou immers uitgeschakeld dienen te worden om onder andere de vorming van gemineraliseerd compact bot mogelijk te maken en osteoclastogenesis tegen te gaan (21). Opvallend is echter dat bijna geen enkele onderzoeksgroep erbij stilstaat dat cbfa-1 onder verschillende isovormen kan voorkomen, namelijk PEBP2αA1 en til-1, wat voor misverstanden in de literatuur kan zorgen (16, 22). Er wordt gezegd in in vitro onderzoek met celculturen dat de PEPB2αA1-isovorm tot expressie komt in de mesenchymale stamcel en 40
differentiërende osteoblast en dat de til-1 isovorm vooral nodig is voor onderhoud van het functionele osteoblast fenotype (12, 16). Aangezien niet gespecifieerd was tegen welke isovorm(en) ons antilichaam (Abcam) werkte, was het onmogelijk een expressieprofiel voor de aparte isovormen op te zetten aan de hand van immunohistochemie. Verder onderzoek om het expressieprofiel en de functie van de aparte isovormen te achterhalen met behulp van RT-PCR, zal dus nog nodig zijn. Wat we ook vinden in het jonge bot, is een korrelig aspect bij de positief aangekleurde holten. Dit kan te wijten zijn aan osteoclasten die de botbalkjes modelleren en tegelijk door fagocytose de nog positieve osteocyten en chondrocyten op de grens fagocyteren (23). Naast het varkensbot werden ook immunohistochemische kleuringen uitgevoerd op volwassen humaan bot. Zoals in het varken van 6 maand waren osteoblasten en osteocyten negatief. In het bot afkomstig van het kaakgewricht zijn enkele cellen met een duidelijke kern en groot cytoplasma wel positief aangekleurd. Het blijkt hier te gaan om colony forming units die zich in het beenmerg bevinden (24). We maakten tevens gebruik van bot uit een humane femurkop. Hier vinden we helemaal geen positieve cellen. Osteoblasten zijn zeldzaam, wat gelinked kan worden aan osteoporose (25, 26).
4.2. Osteocalcine in ontkalkt bot De varkensembryo’s (carnegie stage 18 en 20) zijn in paraffine ingebed zonder voorafgaande ontkalking. In carnegie stage 18 vinden we nog geen significante expressie van osteocalcine terug. Dit betekent dat er nog geen transcriptie gebeurd is door cbfa-1 of nog geen verkalking optreedt. In de kop en de romp van het embryo uit carnegie stage 20 zijn de chondrocyten en het perichondrium negatief, maar kleurt de kraakbeenmatrix positief aan. Een onderzoeksgroep die op kippenembryo’s werkte, kreeg in dezelfde periode van de botontwikkeling hetzelfde resultaat (27). Aangezien OC een osteoblastspecifieke merker zou zijn die enkel tot expressie komt in volledig gedifferentieerde osteoblasten (28), dachten sommige onderzoeksgroepen dat de chondrocyten transdifferentiatie ondergaan (29-31). Anderzijds kan OC ook afkomstig zijn van de differentiërende osteoblasten in het perichondrium (32, 5). Aangezien cbfa-1 tot expressie kwam in prehypertrofe chondrocyten, en aangezien deze transcriptiefactor de 41
expressie van osteocalcine reguleert, denken wij eerder dat osteocalcine ook geëxpresseerd wordt door de chondrocyten die later in apoptose gaan. Een test met RT-PCR zou uitsluitsel kunnen geven over de aanwezigheid van mRNA in deze cellen. Wanneer we het botbalkje in de kop bekijken, zijn er slechts weinig osteoblasten die licht positief aankleuren. Het osteoid is nog niet verkalkt. Een vergelijking met een muismodel toont wel aan dat verkalking van kraakbeen of enchondrale botvorming vlugger plaatsgrijpt dan de verkalking van het osteoid in de desmale botvorming (33). In het voorpootje van de varkensfoetus, dat 10 dagen ontkalkt is in EDTA, zien we een positieve aankleuring van de osteoblasten en osteocyten. Binnen de botbalkjes zien we ook een lichte aflijning tussen de verkalkte botmatrix en het osteoid. Ter hoogte van het kraakbeen van de groeischijf zien we bijna geen positieve chondrocyten en blijft de kraakbeenmatrix negatief (29, 34). Dit is waarschijnlijk het gevolg van de ontkalkingsprocedure met EDTA. In het bot van de drie maand oude big en in het volwassen humaan bot, dat anderhalve maand ontkalkt is, vinden we ten slotte ter hoogte van het kaakbeen een sterk positieve aankleuring van de osteoblasten, enkele osteocyten en een duidelijk deel van de botmatrix. Deze kleuring is specifiek aangezien we tussen de osteoblasten en de verkalkte botmatrix een lijntje “osteoid” zien dat negatief is. In het volwassen bot afkomstig van de femurkop zien we een duidelijk onderscheid met het negatieve gewrichtskraakbeen. Het ligt namelijk voor de hand dat gewrichtskraakbeen niet verkalkt. De preparaten tonen aan dat we zelfs met ontkalkt bot een goede aankleuring voor osteocalcine kunnen krijgen, en dit voornamelijk in de cellen (35). EDTA dringt namelijk niet binnen in de cellen, en aangezien EDTA een vrij trage werking heeft en het Ca2+ van buiten naar binnen verwijdert, blijft er zeker nog calcium aanwezig in het “ontkalkt” bot (36).
42
4.3. Tissue engineered materiaal Als tissue engineered materiaal hebben we gebruik gemaakt van collageen scaffolds en microcarriers waarop gedifferentieerde hBMSC’s, hESC of ATMSC’s waren uitgezaaid. Een groot aantal cellen op de scaffolds bleek positief te zijn voor osteocalcine en cbfa-1. Deze resultaten werden bij andere tests in het labo met qRT-PCR bevestigd. Wanneer we cbfa-1 echter zouden willen gebruiken als merker voor osteoblastdifferentiatie, dan zal deze enkel osteoblasten aanduiden in de skeletogenese, maar niet de functionele osteoblasten. De terminaal gedifferentieerde osteoblasten kunnen dan wel nog met osteocalcine aangeduid worden.
4.4. Algemeen besluit Cbfa-1 wordt terecht als een goede botspecifieke merker beschouwd. Uit ons expressieprofiel blijkt dat vooral vroeg in de botontwikkeling cbfa-1 tot expressie komt. Bij de enchondrale botontwikkeling zien we dit reeds gebeuren in het kraakbeen, bij de desmale botvorming in de dense op elkaar gepakte mesenchymale cellen. Frappant blijft het voorbeeld van het embryo van carnegie stage 18 en 20. In 18 zien we wel positieve expressie in de desmale botvormende regio’s en in 20 niet meer of in mindere mate. Dit kan duiden op een tijdelijk on-off schakeling van de cbfa-1 molecule, maar dit zou nog verder moeten onderzocht worden. Verder blijft gedurende de volledige botvorming de expressie van cbfa-1 aanwezig. Eens de osteoblast matuur is, daalt de cbfa-1 expressie. De expressie van osteocalcine begint pas rond carnegie stage 20. In het volwassen (ontkalkte) bot worden osteoblasten, osteocyten en verkalkte botmatrix positief, maar wordt de kraakbeenmatrix negatief door het EDTA. Op de vraag of osteocalcine nog kan aangetoond worden in ontkalkt bot kunnen we duidelijk zeggen dat dit nog mogelijk is. Osteocalcine kan nog in de osteoblasten aangetoond worden, waardoor het een goede late merker voor osteoblastdifferentiatie is.
43
5. Referenties 1) Götz W, Gerber T, Michel B, Lossdörfer S, Henkel K-O, Heinemann F (2007). Immunohistochemical characterisation of nanocrystalline hydroxyapatite silica gel (NanoBone) osteogenesis: a study on biopsies from human jaws. Clinical Oral Implants Research. 19(10):1016-26. 2) Meijer G J, de Bruijn J D, Koole R, van Blitterswijk C A (2007). Cell-based bone tissue engineering. PLoS Medicine. 4(2):260-264. 3) Arpornmaeklong P, Brown S E, Wang Z, Krebsbach P H (2009). Phenotypic Characterization, osteoblastic differentiation, and bone regeneration capacity of human embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 18(7):955-968. 4) Malluche H H, Faugere M C (1986). Bone cells. In: Atlas of mineralized bone histology. Karger, pp. 39. 5) Ham A W, Cormack D H (1979). Bone and bones. In: Histophysiology of cartilage, bone and joints. JB Lippincott Company, pp. 422-435. 6) Kronenberg H M (2003). Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423:332-336. 7) Rumi M N, Deol G S, Singapuri K P, Pellegrini V D (2005). The origin of osteoprogenitor cells responsible for heterotopic ossification following hip surgery: an animal model in the rabbit. Journal of Orthopaedic Research. 23:34-40. 8) Matsuzaka K, Shimono M, Inoue T (2001). Characteristics of newly formed bone during guided bone regeneration: observations by immunohistochemistry and confocal laser scanning microscopy. Journal of Japan Society of Oral Implantology. 42(4):225-234. 9) Declercq H, Van den Vreken N, De Maeyer E, Verbeeck R, Schacht E, De Ridder L, Cornelissen M (2004). Isolation, proliferation and differentiation of osteoblastic cells to study cell/biomaterial interactions: comparison of different isolation techniques and source. Biomaterials. 25(5):757-768. 10) Declercq H A, Verbeeck R M H, De Ridder L I F J M, Schacht E H, Cornelissen M J (2005). Calcification as an indicator of osteoinductive capacity of biomaterials in osteoblastic cell cultures. Biomaterials 26(24):4964-4974. 11) Monjo M, Lamolle SF, Lyngstadaas SP, Rønold HJ, Ellingsen JE (2008). In vivo expression of osteogenic markers and bone mineral density at the surface of fluoride- modified titanium implants. Biomaterials. 29(28):3771-80. 12) Mundlos S, Otto F, Mundlos C, Mulliken J B, Aylsworth A S, Albright S, Lindhout D, Cole W G, Henn W, Knoll J H M, Owen M J, Mertelsmann R, Zabel B U, Olsen B R (1997). Mutations involving the transcription factor cbfa-1 cause cleidocranial dysplasia. Cell. 89:773-779. 13) Ducy P (2000). Cbfa1: A molecular switch in osteoblast biology. Developmental Dynamics. 219:461471. 14) Ducy P, Starbuck M, Priemel M, Shen J, Pinero G, Geoffroy V, Amling M, Karsenty G (1999). A cbfa1-dependent genetic pathway controls bone formation beyond embryonic development. Genes & Development. 13:1025-1036. 15) Banerjee C, Javed A, Choi J, Green J, Rosen V, Van Wijnen A J, Stein J L, Lian J B, Stein G S (2001). Differential regulation of the two principal runx2/cbfa1 isoforms in response to bone morphogenic protein-2 during development of the osteoblast phenotype. Endocinology. 142(9):4026-4039.
44
16) Takeda S, Bonnamy J-P, Owen M J (2001). Continuous expression of cbfa1 in nonhypertrophic Chondrocytes uncovers its ability to induce hypertrophic chondrocyte differentiation and partially rescues cbfa-1 deficient mice. Genes & Development. 15:467-481. 17) Lian J B, Gundberg C M (1988). Osteocalcin. Biochemical Considerations and Clinical Applications. Clinical Orthopaedics and Related Research. 226:267-285. 18) Hill P A (1998). Bone Remodeling. British journal of orthodontics. 25:101-107. 19) Kim I S, Otto F, Zabel B, Mundlos S (1999). Regulation of chodrocyte differentiation by cbfa-1. Mechanisms of development. 80:159-170. 20) Kronenberg H M (2007). The role of the perichondrium in fetal bone development. Annual New York academical science. 1116:59-64. 21) Maruyama Z, Yoshida C A, Furuichi T, Amizuka N, Ito M,Fukuyama R,Miyazaki T, Kitaura H, Nakamura K, Fujita T, Kanatani N,Moriishi T,Yamana K, Liu W, Kawaguchi H, Nakamura K, Komori T (2007). Runx2 determines bone maturity and turnover rate in postnatal bone development and is involved in bone loss in estrogen deficiency. Developmental dynamics. 236:1876-1890. 22) Kojima H, Uemura T (2005). Strong and rapid induction of osteoblast differentiation by cbfa-1/til1overexpression for bone regeneration. The journal of biological chemistry. 280(4):2944-2953. 23) Bronckers A L J J, Sasaguri K, Engelse M A (2003). Transcription and immunolocalisation of runx2/cbfa-1/PEPB2A in developing rodent and human craniofacial tissues: further evidence suggesting osteoclasts phagocytose osteocytes.Microscopy research and technique. 61:540-548. 24) Giuliani N, Colla S, Morandi F, Lazzaretti M, Sala R, Bonomini S, Grano M, Colucci S, Svaldi M, Rizzoli V (2005). Myeloma cells block runx2/cbfa-1 activity in human bone marrow osteoblast progenitors and inhibit osteoblast formation and differentiation. Blood. 106 (7):2472-2483. 25) Jilka R L, Weinstein R S, Takahashi K, Parfitt A M, Manolagas S C (1996). Linkage of decreased bone mass with impaired osteoblastogenesis in a murine model of accelerated senescence. The journal of clinical investigation. 97:1732-1740. 26) Jilka R L, Shmookler Reis R J, Manolagas S C (2004). Age-related bone loss: lessons from the osteoporotic SAMP6 mouse model. International congress series. 1260:55-60. 27) Haushka P V, Frenkel J, DeMuth R, Gundberg C M (1983). Presence of osteocalcin and related higher molecular weight 4- carboxyglutamic acid-containing proteins in developing bone. The journal of biological chemistry. 258:176-182. 28) Franceschi R T (1999). The developmental control of osteoblast-specific gene expression: role of specific transcription factors and the extracellular matrix environment. Oral Biological Medicine. 10:40-57. 29) Aizawa T, Roach H I, Kokubun S, Tanaka Y (1998). Changes in the expression of Fas, osteonectin and osteocalcin with age in the rabbit growth plate. Bone joint surgery. 80:880-887. 30) Fujita I, Hirata S, Ishikawa H, Mizuno K, Itoh H (1997). Apoptosis of hypertrophic chondrocytes in rat cartilagineous growth plate. Journal of orthopaedic science. 2:328-333.
45
31) Gerstenfeld L C, Shapiro F D (1996). Expression of bone-specific genes by hypertrophic chondrocytes: Implications of the complex functions of the hypertrophic chondrocyte during endochondral bone development. Journal of cellular biochemistry. 62:1-9. 32) Colnot C, de la Fuenta L, Huang S, Hu D, Lu C, St-Jacques B, Helms J A (2005). Indian hedgehog synchronizes skeletal angiogenesis and perichondrial maturation with cartilage development. Development 132:1057-1067. 33) Cowles E A, DeRome M E, Pastizzo G, Brailey L L, Gronowicz G A (1997). Mineralization and the expression of matrix proteins during in vivo bone development. Calcified tissue international. 62:74-82. 34) McKee M D, Farach-Carson M C, Butler W T, Hauschka P V, Nanci A (1993). Ultrastructural immunolocalization of noncollagenous (osteopontin and osteocalcin) and plasma (albumin and alpha2HS –glycoprotein) proteins in rat bone. Journal of bone and mineral research. 8(4):485-496. 35) Zhang M, Wong I G, Gin J B, Ansari N H (2009). Assessment of methylsulfonylmethane as a permeability enhancer for regional EDTA chelation therapy. Drug delivery. 16(5):243-8. 36) Theunkens K (2005). Doorwerking van botweefsels voor immunohistochemische en moleculaire toepassingen. Katholieke hogeschool Kempen.
46
6. Bijlagen 6.1. Bijlage 1 (EDTA oplossing pH 4,5) -
125g EDTA-Na2 (Sigma Aldrich)/1l AD oplossen. Er zal zich een neerslag vormen.
-
Voor ieder gebruik goed schudden en direct filteren.
-
Om de twee dagen verversen.
6.2. Bijlage 2 (EDTA oplossing pH 7,4) -
In 700ml PBS 1X, 150mg EDTA-Na2 toevoegen.
-
Het geheel al roerend verwarmen tot 90°C
-
pH tot ongeveer 6,5 omhoog brengen met NaOH pellets (Vel) en PBS toevoegen tot 1l.
-
pH met behulp van pellets omhoog halen tot 7,4. Eventueel corrigeren met HCl.
-
Om de twee dagen verversen.
6.3. Bijlage 3 (Dehydrateren van weefsels) Alcohol 30% (Chem-lab)
1 uur
Alcohol 50%
1 uur
Alcohol 70%
1 uur
Gedenatureerde alcohol (alcohol 96%)
1 uur
Isopropyl alcohol (Chem-lab)
1 uur
Isopropyl alcohol / toluol 1/1
1 uur
Toluol (Chem-lab)
30 min.
6.4. Bijlage 4 (Opstart van het automatisch kleurtoestel MICROM) -
toestel aanzetten (rode knop links achteraan)
-
koud water kraan open draaien
-
op de groene knop vooraan duwen om het toestel te laten opstarten
-
gebruikersnaam: histo (geen veranderingen in de instellingen mogelijk!!)
-
wachtwoord: histo
-
de preparaatjes in de houder plaatsen en de houder overbrengen naar de ENTRY (groene pijl)
-
het gewenste protocol kiezen, met behulp van de sneltoetsen of met het touchscreen.
-
kleuring bevestigen (op OK duwen of nog eens op de sneltoets drukken)
-
de kleuring wordt gestart
-
bij einde van de kleuring bevinden de preparaatjes zich op de EXIT plaatsen (rode pijlen)
-
de baden van haematoxyline en eosine terug ledigen in de flessen
-
het toestel uitschakelen door op de groene knop te duwen en dan nog eens om te bevestigen
-
waterkraan dichtdraaien
-
toestel volledig uitschakelen door middel van de rode knop links achter (wachten tot de computer helemaal is uitgeschakeld)
Als je een kleuring wil onderbreken. Druk je op het touchscreen op “cancel” en dan op de kleuring. Je hebt nu keuze in welk station de houder zal geplaatst worden ( EXIT of de ENTRY). Indien meerdere kleuringen gelijktijdig: bad 39 opvullen met tolueen. Rood kader rond het bad in bath layout: ververs het betreffende bad. Dit kan je niet doen onder de gebruikersnaam “HISTO” . in “user settings” de” shakes” en “agit speed” op nul zetten. Deze instellingen worden maar toegepast als je het toestel opnieuw opstart. Normale waarden: Shakes = 3 Agit speed = 5
6.5. Bijlage 5 (Haematoxyline-eosine kleuring) Bad 1 tolueen
5’
Bad2 tolueen
5’
Bad3 tolueen
5’
Bad4 isopropanol
2’
Bad5 isopropanol
2’
Bad6 alcohol 96%
2’
Bad7 alcohol 96%
2’
Bad29 leidingwater
2’
Bad19 aqua dest.
1’
Bad15 haematoxyline
15”
Bad29 leidingwater
2’
Bad16 clarifier I
1’
Bad29 leidingwater
1’
Bad17 bluing reagent
1’
Bad29 leidingwater
1’
Bad19 aqua dest.
1’
Bad18 eosine+phloxine
30”
Bad29 leidingwater
2’
Bad20 alcohol 96%
2’
Bad21 alcohol 96%
2’
Bad22 isopropanol
2’
Bad8 isopropanol
2’
Bad9 tolueen
2’
Bad23 tolueen
2’
Bad38 tolueen
1’
6.6. Bijlage 6 (Deparaffineren) Bad 1 tolueen
5’
Bad2 tolueen
5’
Bad3 tolueen
5’
Bad4 isopropanol
2’
Bad5 isopropanol
2’
Bad6 alcohol 96%
2’
Bad7 alcohol 96%
2’
Bad29 leidingwater
2’
Bad19 aqua dest.
1’
Bad40 aqua dest.
1’
6.7. Bijlage 7 (Proteinase K voorbehandeling) Materiaal: Proteinase K (Dako S3004) Werkwijze: -
10 µl Proteinase K + 500ul TrisHCl 0,05M pH 7,6
15’
-
PBS 10mM pH 7,2
2x 5’
6.8. Bijlage 8 (Citraat voorbehandeling) Citraatbuffer pH 6,0: -
0,1g citroenzuur (Merck) in 400ml AD
-
Op pH brengen met 1M NaOH
-
Aanlengen tot 500ml
Citraatbuffer opwarmen in grote beker (met deksel erop) tot het kookt Preparaten in glazen preparaathouder 2x 5’ koken 20-30’ koelen Spoelen in PBS
6.9. Bijlage 9 (Citraat voorbehandeling bij 90°C) Citraatbuffer pH 6,0: -
0,02g citroenzuur in 80ml AD
-
Op pH brengen met 1M NaOH
-
Aanlengen tot 100ml
Citraatbuffer opwarmen in glazen preparaatpotje in het warmwaterbad op 90°C voor 20’ Spoelen in PBS
6.10. Bijlage 10 (Immunohistochemische kleuring) -
Afgrenzen coupes met toluolstift (Dako)
-
Immuunkleuring: Stap
Tijd
Voorbehandeling met 3% H2O2 in PBS
10’
Blokkingsserum (met NRS(Dako)) *
30’
Afnemen met een cleanex AL1 (in verdunningsbuffer **)
2h
2 x wassen met PBS
2 x 5’
AL2 gebiotinyleerd rabbit anti-mouse 1/200 in VB
30’
2 x wassen
2 x 5’
Streptavidine-peroxidase 1/200 in PBS
30’
2 x wassen met PBS
2 x 5’
wassen met TB
5’
Chromogeen-substraat***
10’
Wassen met stromend water
10’
* Blokkingsserum:
5% NRS
0,5 ml
1% BSA (Roche)
0,1 g
PBS
10 ml
0,2% Tween 20 (ICN Biomedicals Inc.)
200µl
**Verdunningsbuffer:
1deel blokkingsserum + 9 delen PBS
*** Chromogeen-substraat: 0.06% (= 6mg) DAB (DAB is sterk kanker verwekkend!) 0.03% (= 10ul) H2O2 (Vel) Trisbuffer (10ml) Het DAB-poeder afwegen in zilverpapier (zodoende is er geen statische elektriciteit)
Tegenkleuring van paraffinecoupes haematoxyline volgens Mayer 1/4
10’’
wassen met leidingwater
1’
PBS (fosfaatbuffer, 10mM pH 7,2 + NaCl) 1,78g Na2HPO4 (Vel) 0,42g KH2PO4 (UCB) 7.2g NaCl (VWR Prolabo) 1000 ml AD (voor pH-correctie: één- of tweewaardig zout bijvoegen – normaal overbodig) Tris buffer (pH 7,6) 6g tris (Sigma) 1000 ml AD HCl toevoegen tot pH 7,6
6.11. Bijlage 11 (Dehydrateren) Bad29 leidingwater
4’
Bad20 alcohol 96%
2’
Bad21 alcohol 96%
2’
Bad22 isopropanol
2’
Bad8 isopropanol
2’
Bad9 tolueen
2’
Bad23 tolueen
2’
Bad38 tolueen
1’
