Explantátové kultury vyšších rostlin

U N I V E R Z I TA K A R L O VA V P R A Z E Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmaceutické botaniky a ekologie

Explantátové kultury vyšších rostlin 27 diplomová práce

Autor: Jan K O S T ŘI B A Vedoucí diplomové práce: Doc. RNDr. Jiřina DU Š K O VÁ , CSc.

Odevzdáno v Hradci Králové, 15. května 2007

Na tomto místě bych rád poděkoval Doc. RNDr. Jiřině Duškové, CSc. za odborné vedení, pomoc a rady, které mi během všech činností, které se skrývají za vypracováním této diplomové práce, ochotně poskytla. Mé velké poděkování patří rovněž laborantkám Markétě Šimůnkové, Ireně Rejlové a Adéle Studené za velkou vstřícnost a trpělivost, se kterou mi pomáhaly při práci, a to jak v praktické, tak teoretické rovině.

2

O BSAH 1. Úvod .............................................................................................................................5 2. Řešená problematika .....................................................................................7 3. Teoretická část....................................................................................................8 3.1. Explantátové kultury ........................................................................................8 3.2. Odvození a udržování kultur.......................................................................10 3.2.1. Ţivná média .......................................................................................................11 3.2.1.1. Anorganické látky ............................................................................................12 3.2.1.2. Organické látky ...............................................................................................13 3.2.1.3. Látky tvořící matrix média .................................................................................16 3.2.1.4. Aktivní uhlí .....................................................................................................16 3.2.1.5. Osmotické látky ...............................................................................................17

3.2.2. Kultivační podmínky .........................................................................................17 3.2.2.1. pH.................................................................................................................17 3.2.2.2. Teplota ..........................................................................................................17 3.2.2.3. Světlo ............................................................................................................18 3.2.2.4. Provzdušňování (aerace) ...................................................................................18 3.2.2.5. Nádoby ..........................................................................................................18

3.3. Praktický význam a využití explantátových kultur ............................19 3.4. Produkce sekundárních metabolitů tkáňovými kulturami ..............21 3.5. Ovlivnění produkce sek. metabolitů tkáňovými kulturami .............23 3.5.1. Optimalizace kultivačních podmínek ................................................................24 3.5.2. Selekce buněčných linií .....................................................................................24 3.5.3. Elicitace .............................................................................................................25 3.5.4. Mutace ...............................................................................................................25 3.5.5. Morfogeneze ......................................................................................................26 3.5.6. Vliv ploidie ........................................................................................................26 3.5.7. Vliv buněčného a růstového cyklu.....................................................................27 3

3.5.8. Moţnosti genetického inţenýrství .....................................................................27 3.5.9. Imobilizace.........................................................................................................28 3.5.10. Biotransformace ...............................................................................................29

3.6. Centella asiatica (L.) URB. ............................................................................31 3.6.1. Botanické zařazení .............................................................................................31 3.6.2. Popis intaktní rostliny ........................................................................................31 3.6.3. Obsahové látky a terapeutické vyuţití ...............................................................32

3.7. Arbutin. ...............................................................................................................33 3.7.1. Biosyntéza ..........................................................................................................33 3.7.2. Výskyt v přírodě ................................................................................................34 3.7.3. Farmakologické vlastnosti .................................................................................34

4. Experimentální část ......................................................................................35 4.1. Laboratorní přístroje a vybavení...............................................................35 4.2. Chemikálie .........................................................................................................36 4.3. Použitý biologický materiál..........................................................................37 4.4. Biotransformační pokusy..............................................................................37 4.5. Analýza obsahových látek ............................................................................37 – TLC ..................................................................................................................38 – HPLC ...............................................................................................................39

5. Výsledky .................................................................................................................40 5.1. Seznam použitých zkratek............................................................................40 5.2. Výsledky TLC analýzy...................................................................................41 5.3. Výsledky HPLC analýzy ...............................................................................45

6. Diskuse ....................................................................................................................51 7. Závěr ..........................................................................................................................53 8. Abstrakt ...................................................................................................................55 9. Pouţitá literatura .............................................................................................56 4

1. Ú VOD V celé historii lidstva slouţily rostliny jako důleţitý zdroj obţivy a velké části důleţitých látek. Člověk s rostoucími znalostmi vlastností bylin dokázal vyuţívat i jejich účinku na lidský organismus. Postupně se spolu se zkušenostmi rozvíjelo i samotné účelné pouţívání rostlin. Vývoj zaznamenal značné regionální rozdíly a to nejen díky odlišnému zastoupení jednotlivých rostlinných druhů na různých místech Země. Proto se v různých částech světa začaly uţívat drogy charakteristické pro daný region a dostatečně mapující vyspělost dané kultury. Vyspělé kultury, jako například v Číně, dokázaly velmi efektivně vyuţívat účinků drog jiţ v době 3000 let před naším letopočtem. S rozvojem chemie v 19. století se podařila izolovat řada účinných látek – morfin, strychnin, kofein, kodein apod. I přes značný rozvoj chemických léčiv zastává v současné době fytoterapie v medicíně velmi důleţitou a nezastupitelnou pozici. O tom svědčí i fakt, ţe zhruba čtvrtina všech dnes uţívaných léčiv je rostlinného původu. Struktury přírodních látek se často stávají vzorem pro vývoj syntetických léčiv – příkladem můţe být skupina lokálních anestetik odvozena od kokainu. [1] Samotné rostliny představují téměř neomezený zdroj fytochemikálií, produktů primárního a sekundárního metabolismu. Zajímavé jsou především sekundární metabolity, jelikoţ plní odlišné funkce a mají působivou biologickou aktivitu a účinky – jako například antimikrobiální, antibiotické, insekticidní, hormonální,… a dají se tedy zkoumat za účelem farmakologického a farmaceutického vyuţití. [2] Sekundární metabolity jsou definovány jako látky, u nichţ doposud nebyla přesně rozpoznána úloha v udrţení základních ţivotních pochodů organismů, kterými jsou syntetizovány. Zatímco primární metabolity jsou nezbytné k zabezpečení růstu a reprodukce, sekundární metabolity jsou ve většině případů součástí adaptačních mechanismů a interakcí rostliny s prostředím. [3] I kdyţ sekundární metabolity nejsou výlučně přítomny jen v rostlinné říši, jsou to především rostliny, z nichţ byly zatím izolovány. Důleţitými skupinami sekundárních metabolitů jsou alkaloidy, steroidy, terpeny, flavonoidy, lignany a další.

5

Existují tři základní způsoby získávání rostlinných sekundárních metabolitů: 1. Extrakce z rostlin – problémem získávání sekundárních metabolitů z intaktních rostlin je fakt, ţe velká část významných léčivých rostlin v současnosti přichází o své ţivotní prostředí a s jejich úbytkem a obtíţností pěstování roste i jejich cena. [4] 2. Chemické syntézy – jsou často velice obtíţné a drahé, u sloţitějších látek mnohdy neuskutečnitelné a konečné produkty jsou obvykle směsi izomerů, které jsou obtíţně oddělitelné, zatímco buňka produkuje jediný stereoizomer. [5] 3. Tkáňové kultury – ty dokáţí za určitých podmínek produkovat sekundární metabolity s těmito výhodami: [6] a) syntéza probíhá řízeně, v umělém prostředí, nezávisle na podnebí, počasí a půdě; b) z produkčního systému jsou vyloučeny biologické vlivy (mikroorganismy, hmyz) měnící v přírodě průběh reakce; c) kultivace rostlin je uskutečnitelná nezávisle na klimatických podmínkách, na jejich výchozím areálu a výběrem z původního spektra rostlin a další selekcí tkáňové kultury lze produkci několikanásobně zvýšit; d) automatizace řízení buněčného růstu a regulace metabolických procesů můţe způsobit pokles výrobní ceny a vzrůst produkce [4]; e) biomasa je sterilní a neobsahuje zbytky insekticidů, fungicidů a herbicidů; f) bezodpadovost díky vzniklému biologicky zuţitkovatelnému odpadu [7]. Skutečný přínos produkce sekundárních metabolitů tkáňovými kulturami se však ekonomicky vyplatí pouze tehdy, bude-li tato varianta celkově méně nákladná neţ tradiční získávání těchto látek pomocí extrakce z rostlin a chemické syntézy, coţ je předmětem dalšího, finančně a časově velmi náročného výzkumu. [4]

6

3. Ř EŠENÁ P ROBLEMATIKA Úkolem této diplomové práce bylo ověření biotransformačních schopností tkáňové kultury Centella asiatica (L.) po přidání exogenních prekurzorů arbutinu (hydrochinonu, tyrosinu, kyseliny p-kumarové a 4-hydroxybenzoové, v koncentraci 200 mg/l) do ţivného média. Pokusy byly prováděny za světla, jak v suspenzních tkáňových kulturách, tak v kulturách kultivovaných v tekutém ţivném médiu na můstcích z filtračního papíru. Doba působení prekurzorů arbutinu byla 6, 12, 24, 48 a 168 hodin v případě suspenzních tkáňových kultur a 12 a 48 hodin při kultivaci na můstcích. Produkce metabolitů byla hodnocena kvalitativně pomocí tenkovrstvé chromatografie (TLC) a následně ověřena a kvantitativně doplněna pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) a to jak v kalusech, tak v ţivném médiu.

7

3. T EORETICKÁ Č ÁST 3.1. E X P L A N T Á TO V É K U LT U RY Tělo vyšších rostlin lze schematicky rozdělit na tři zóny: [9] 4. embryonální (meristematická) zóna 5. prodluţovací (prolongační) zóna 6. rozlišovací (diferenciační) zóna Embryonální zóna tvořená růstovými vrcholy, se vyznačuje intenzivně se dělícími, nediferencovanými buňkami, které nejsou rozlišeny do trvalých pletiv. Tvoří meristém, ze kterého vznikají základy orgánů. Prodlužovací zóna je charakterizována buňkami, které intenzivně rostou do délky. Po získání rozměrů charakteristických pro dané pletivo dochází v buňkách k postupné diferenciaci. V rozlišovací zóně dochází k inaktivaci genů a tím i enzymů, které však nejsou ztraceny a za určitých podmínek můţe dojít k dediferenciaci, remeristematizaci a neorganizovanému růstu. Dochází tedy k reverzibilní inaktivaci jen těch genetických znaků, které vybočují ze specializované činnosti buňky a jejich aktivita se můţe v budoucnu znovu projevit. [10] Kaţdá ţivá rostlinná buňka má tedy všechny genetické předpoklady k tomu dát základ celé nové rostlině. Tato schopnost se nazývá totipotence a je základem pro pěstování explantátových kultur. [11] Díky tomu, ţe jsou základní prvky totipotence buňky zachovány, jsou rostlinné buňky v podmínkách kultivace in vitro schopné dělení a - v závislosti na vlivech okolí dosaţení určitého stupně rediferenciace. Morfologická rediferenciace probíhá za vzniku embryoidů, kořenů, pupenů, výhonků, případně i celé rostliny shodné s výchozí, s případnou biochemickou diferenciací při zachovaných morfologických vlastnostech dané kultury. [7] Pomocí explantátových kultur lze teoreticky získat jakoukoliv látku, kterou intaktní rostlina v přírodě syntetizuje. V tomto případě se však praxe od teorie liší, coţ klade velmi velký důraz na výzkum v celé této oblasti – tj. podmínek, při kterých tyto kultury danou látku syntetizují. [12]

8

Rostlinné explantáty jsou ţivé části rostlinného těla oddělené od mateřského organismu, které jsou v umělých podmínkách in vitro schopny regenerace, morfologických procesů a neomezeného růstu. [13] Kultury rostlinných explantátů jsou pak rostlinné explantáty pěstované po určitou dobu v podmínkách in vitro. Kultury rostlinných buněk se pak podle stupně organizace, asociace a diferenciace in vitro dělí na: [10] 

Kultury orgánové – orgánové systémy, orgány nebo jejich části pěstované v podmínkách in vitro způsobem, který umoţňuje jejich diferenciaci a zachovává jejich stavbu a funkci.



Kultury tkáňové (kalusy) – do různého stupně soudrţné, morfologicky dezorganizované mnohobuněčné komplexy tkáně mnoţené buď na polotuhých nebo pevných nosičích nasycených ţivným médiem nebo v tekuté ţivné půdě.



Kultury buněčné (kultury izolovaných buněk) – tvořeny volnými, identifikovatelnými buňkami. Buňky jsou kultivovány v tekuté či polotekuté půdě nebo na nosiči nasyceném ţivnou půdou.



Kultury buněčných protoplastů a organel – představují nahé rostlinné buňky, u nichţ byla mechanicky nebo enzymaticky odstraněna buněčná stěna. Vnější plazmatická membrána je zcela odhalena a je bariérou mezi vnějším prostředím a vnitřkem buňky.

Z biotechnologického hlediska jsou nejvhodnější kultury suspenzní, které splňují podmínku přímého ovlivnění všech buněk danými kultivačními faktory, a tak u nich nedochází k neţádoucí reakci mezi vnějšími a vnitřními buňkami shluku. [6]

9

3.2. O D V O Z E N Í

A U D R Ţ O VÁ N Í K U LT U R

Buněčná kultura se dá získat z kterékoliv části rostliny, nadzemní nebo podzemní, explantací části parenchymatické tkáně. [14] Jednotlivé kroky vedoucí k odvození suspenzních explantátových kultur vyšších rostlin jsou: [3] 1. Výběr vhodné matečné rostliny, která vykazuje vysokou produkci ţádaného metabolitu. 2. Získání sterilní části rostliny (primárního explantátu) lze provést dvěma způsoby: [3, 15] 

vypěstováním rostliny ve zcela sterilních podmínkách a to tak, ţe se nejprve povrchově sterilizují semena dané rostliny a sterilní primární explantát se pak odebere z intaktních sterilních klíčních rostlin, které z těchto semen vzešly;



následnou šetrnou sterilizací části rostliny pěstované za běţných (nesterilních) podmínek.

3. Přenesení získané sterilní části rostliny – primárního explantátu na ţivnou půdu zpevněnou agarem, která obsahuje chemické komponenty vyvolávající dediferenciaci a tím následné dělení buněk. Na řezu se po několika týdnech začne tvořit hojivé pletivo, které za optimálních podmínek stále narůstá a tvoří tzv. primární kalus. V další fázi se získaný kalus zbavený zbytku výchozího orgánu pravidelně pasáţuje, coţ ho umoţňuje uchovávat na vhodném médiu neomezeně dlouho. 4. Pasážování – přenos celé kultury nebo její části z jiţ vyčerpané ţivné půdy na půdu čerstvou. Tento postup se pravidelně opakuje v intervalech závislých na vlastnostech dané kultury. Období mezi jednotlivými pasáţemi se nazývá subkultivační interval. Subkultivační číslo je pak počet provedených pasáţí od samotného zaloţení (odvození) kultury z primárního explantátu. Stáří celé kultury lze pak snadno zjistit vynásobením subkultivačního čísla a délky subkultivačního intervalu. [10]

10

5. Suspenzní kultura v jiţ tekutém médiu se z tkáně pěstované na pevné půdě získá mechanickou cestou. Stálým a intenzívním mícháním vznikne suspenzní kultura, která se skládá z jednotlivých rostlinných buněk. Opravdu intenzívní míchání je zvláště důleţité nejen pro dokonalý rozpad shluků buněk, ale i pro dostatečné provzdušnění celého ţivného média. I tyto suspenzní kultury se musí pravidelně pasáţovat. [7] 6. Třepání – Suspenzní kultury se uchovávají v malých baňkách na třepačkách. Přechod na větší objemy, který je nezbytný pro všechna biotechnologická vyuţití, je velmi náročný jednak z hlediska udrţení dokonale sterilního prostředí, zajištění dostatečného mnoţství kyslíku, tak i optimalizaci dalších faktorů. [7] Při šetrném, ale nedostatečném promíchávání suspenzní kultury mohou být metabolické procesy limitovány právě přítomností kyslíku. To pak můţe mít za následek sníţení specifické růstové rychlosti a tím i výtěţku a tedy nepříznivý vliv na ekonomický aspekt celého procesu. [14]

3 .2 .1 . Ţ I V N Á M É D I A Vzhledem k uzavřenosti prostoru, ve kterém probíhá látková výměna rostlinného materiálu pěstovaného in vitro, je nutné výběrem vhodného ţivného média dodat kulturám všechny potřebné ţiviny. Vhodná a dokonale vyváţená kombinace všech potřebných anorganických a organických látek je důleţitý předpoklad pro úspěšnou kultivaci rostlinných explantátů. Skladba látek není závislá pouze na rostlinném druhu, ale i na druhu rostlinného orgánu, ze kterého byla daná kultura odvozena. Dokonale univerzální kombinace látek obsaţených v ţivném médiu pro kultivace zatím neexistuje. Jsou však definovány receptury, které se s úspěchem dají povaţovat za univerzální. Jednotlivé produkční ţivné půdy jsou sestavovány pro jednotlivé rostlinné kultury empiricky a jsou tedy předmětem vědeckého výzkumu. Zejména se jedná o pouţívání různých rostlinných hormonů. [14] Základy dnes pouţívaných ţivných médií poloţili Heller [16] a White [17]. Ţivné médium White rozpracovali Murashige a Skoog zkoumáním vlivu jednotlivých sloţek na růst pletivové kultury tabáku. [18] Na základě toho sestavili nové ţivné médium. Tato tři ţivná média (Murashige & Skoog, White, Heller) dnes tvoří základ výţivy většiny pletivových kultur. [8] 11

Mezi jednotlivé sloţky těchto ţivných médií patří: 

anorganické látky o voda o makroprvky o mikroprvky



organické látky o vitamíny o regulátory růstu o zdroje uhlíku a dusíku



látky tvořící matrix média



aktivní uhlí



osmotické látky

3.2.1.1. ANORGANICKÉ LÁTKY

Voda Voda se pouţívá pro přípravu všech ţivných médií a zaujímá v nich více neţ 95 % celkového objemu. Nejčastěji se pouţívá voda destilovaná, dále pak voda redestilovaná či demineralizovaná. [8]

Makroprvky Mezi makroprvky patří uhlík, vodík, kyslík, dusík, draslík, vápník, hořčík, fosfor a síra. Jsou do ţivných médií dodávány ve formě solí. [8] Správné mnoţství dusíku je nutno zvolit poměrem dusičnanových a amonných anorganických látek a látek organických, ve kterých se dusík vyskytuje. Zvýšený obsah dusíku vede k poklesu produkce sekundárních metabolitů. [19] V případě, kdy samotné sekundární metabolity dusík obsahují, je jeho odstranění z média naopak kontraproduktivní a vede ke sníţení jejich produkce. [20] Při nedostatku dusíku se zvýší tvorba bezdusíkatých látek – jako například celulózy, díky níţ dochází k druhotnému tloustnutí buněčných stěn a k tvorbě vodivých elementů. [21] Vliv fosfátů na produkci sekundárních metabolitů je různý. Ve všech sledovaných případech byla však určitá koncentrace fosforečnanových aniontů pro samotný růst nezbytná. [6] 12

Mikroprvky Mezi mikroprvky patří měď, mangan, zinek, bor, ţelezo, molybden, chlor, kobalt a jod. Výjimečně pak hliník a nikl, u nichţ je efekt zcela individuální. Mikroprvky se v ţivných médiích vyskytují ve velmi nízkých koncentracích. [8]

3.2.1.2. ORGANICKÉ LÁTKY Protoţe většina explantátových kultur je heterotrofní, musejí kromě anorganických látek obsahovat ţivná média také látky organické. [8]

Zdroje dusíku a uhlíku 

Anorganické zdroje dusíku (nitrátový a amonný) jsou často nedostačující pro in-

tenzivní růst kultur. Proto se při kultivaci pouţívají jako přírodní zdroje dusíku různé extrakty rostlinného původu (rajčatový extrakt, kokosové mléko, kvasnicový extrakt, kaseinový hydrolyzát,…). [8] Stimulující účinek nemají jen samotné aminokyseliny, ale jejich dokonale vybalancovaná směs spolu s dalšími látkami, které jsou v daných komplexech obsaţeny. 

Jako zdroj organicky vázaného uhlíku a současně jako zdroj energie slouţí cukry.

[6] Ty tak jsou nedílnou součástí ţivných médií. Velmi malá část kultur je totiţ zcela autotrofní. Ve většině případů se pouţívá sacharóza, protoţe právě její pouţití ve většině případů zajistí nejvyšší produkci sekundárních metabolitů. [22] Ve zcela specifických případech se pouţívají také alternativní cukry (maltóza, rafinóza, fruktóza, galaktóza, manóza, laktóza) nebo některé alkoholy a kyseliny. [7] Nejčastější koncentrace cukrů v ţivném médiu se pohybuje mezi 2 a 3 %. [23] Vyšší koncentrace (5-7 %) většinou negativně ovlivní nejprve růst a další zvýšení pak i samotnou produkci sekundárních metabolitů. [6]

Vitamíny Intaktní rostliny jsou v produkci vitamínů soběstačné, některé explantáty však ne a je nutné je kultuře dodávat. [22] Vitamíny rostlině slouţí jako kofaktory řady enzymů a to jiţ ve stopových mnoţstvích. 13

Esenciálním vitamínem v téměř všech médiích je vit. B1 – thiamin. Dalšími jsou kyselina nikotinová, nikotinamid, vit. B6 – pyridoxin, kys. paraaminobenzoová (PABA), vit. C – kyselina askorbová, vit. H – biotin, kyselina cholová, vit. B12 – cyanokobalamin, vit. E – tokoferol a vit. B2 – riboflavin. [24]

Růstové regulátory Endogenní regulátory růstu, které si rostlina syntetizuje sama, se označují jako růstové látky – fytohormony. Ty jsou syntetizovány ve vyšších rostlinách a jsou účinné jiţ ve velmi malých koncentracích. Synteticky připravené látky se pak nazývají růstové regulátory. [8] V in vitro podmínkách ovlivňuje růst a morfogenezi kromě endogenně tvořených fytohormonů také přítomnost růstových regulátorů v samotném ţivném médiu. Jejich suplementace je nezbytná, jelikoţ endogenní syntéza v daném kultivovaném rostlinném materiálu je pro zajištění růstu nedostatečná. Účinek růstových regulátorů závisí na jejich typu, koncentraci a rostlinném druhu. [6] Hlavní význam růstových regulátorů v řadě případů asi nespočívá v přímém vlivu na samotnou produkci sekundárních metabolitů, ale v jejich působení na anatomickou diferenciaci kultivované tkáňové kultury. Právě ta je většinou podmínkou produkce sekundárních metabolitů. Růstové regulátory také zasahují do jednotlivých fází růstového cyklu (stimulačně i inhibičně) a tím rovněţ ovlivňují produkci sekundárních metabolitů. Obecné hodnocení vlivu růstových regulátorů na celý sekundární metabolismus je obtíţné, protoţe vazba mezi sekundárním metabolismem, anatomickou diferenciací a fází růstového cyklu je u jednotlivých rostlinných druhů různá. [6] Rozdělení růstových regulátorů: 

STIMULÁTORY o auxiny o cytokininy o gibereliny



INHIBITORY o kyselina abscisová o fenolické látky o kyselina jasmonová

14

Ethylen má komplikované účinky, a tak je jeho postavení někde mezi těmito dvěma skupinami. [10] Pro kultury in vitro jsou nejdůleţitější auxiny a cytokininy. Gibereliny a kyselina abscisová se pouţívá méně často. [25] A u x i n y jsou látky indolového typu, jejichţ prekurzorem při biosyntéze je aminokyselina tryptofan. [8] Jejich účinek se projevuje stimulací růstu kořenových meristémů, tvorbou kalusu, ovlivněním růstu buněk a rozpadavostí agregátů v suspenzních kulturách. Rozdělení auxinů: [25] 

PŘIROZENÉ o IAA – kyselina indolyloctová o PAA – kyselina fenyloctová



SYNTETICKÉ o IBA – kyselina indolylmáselná o 2,4-D – kyselina dichlorfenoxyoctová o NAA – kyselina naftyloctová (v in vitro kulturách se používá nejčastěji)

C y t o k i n i n y jsou látky purinového typu. [8] Stimulují dělení buněk a pozitivně ovlivňují proliferaci buněk kalusu, dále ovlivňují tvorbu pupenů – stimulují vývoj axilárních pupenů. Rozdělení cytokininů: [25] 

PŘIROZENÉ o Zeatin – hydroxymethyltransbutylenaminopurin o IPA - izopentenyladenin



SYNTETICKÉ o Kinetin – 6-furfurylaminopurin o BA – benzyladenin o PBA – benzylaminotetrahydropyranylpurin o 2Cl-4PU – chlorfenylurea o 2,6Cl-4PU – dichlorfenylurea o Thiadiazuron – fenylthiadiazolurea o Adenin 15

G i b e r e l i n y patří mezi cyklické diterpeny. Nejsou obecně v in vitro kulturách nezbytné. Jejich aplikace však v nízkých koncentracích příznivě ovlivňuje růst buněčných kultur, růst kalusu, klíční zralých embryí a iniciuje dělení buněk v meristémových kulturách. [25] V rostlinách se z giberelinů nejčastěji vyskytuje kyselina giberelová (GA3). V současné době je známo asi 65 giberelinů, které se označují GA1-GAn. Získávají se z houby Giberella fujikorii a z mikroorganismů fermentací. Tyto se ale všeobecně z důvodu jejich nízké tepelné stability při přípravě ţivných médií nepouţívají. [8] K y s e l i n a a b s c i s o v á inhibuje vývoj nezralých embryí a tvorbu akcesorických somatických embryí. Pokud se aplikuje v pozdních fázích embryogeneze, můţe pozitivně ovlivnit další vývoj embrya a omezit výskyt malformací. [25] F e n o l i c k é l á t k y jako například fluoroglucinol jsou do ţivných médií přidávány, aby inhibovaly IAA-oxidázu, která znehodnocuje auxin IAA. [6] Regulovat růst a diferenciaci kořenů, květů a pupenů mohou také o l i g o s a c h a r i d y získané fragmentací polysacharidů z buněčných stěn. Tyto oligosacharidy ochraňují rostlinu před patogeny a jinými druhy stresu. [19]

3 . 2 . 1 . 3 . L Á T K Y T V O Ř Í C Í M AT R I X M É D I A Explantátové kultury se kultivují na tuhém, polotuhém nebo tekutém médiu s pevným nosičem. Typ média volíme podle kultivovaného materiálu a záměru kultivace. Ke zpevnění média se nejčastěji pouţívá agar v koncentraci 0,6-0,8 %. Alternativou agaru jsou algináty, polymery škrobu, methylcelulosa a další. [8] Jako pevné nosiče se pouţívají filtrační papír (ve formě můstků), buničitá vata, skleněné kuličky, skleněná vata, čedičová vlákna, viskózové houby, plastikové pěny, plavený perlit a další. Pevné nosiče se pak sytí tekutým médiem. [22]

3.2.1.4. AKTIVNÍ UHLÍ Aktivní uhlí je látka s velkou adsorpční schopností. Toho se vyuţívá k odstraňování toxických a inhibičních látek, které jsou:

16



přítomny jiţ v médiu – znečištěniny agaru, HMF = hydroxymetylfurfural, který vzniká autoklávováním při mírně kyselém pH ze sacharózy;



produkovány explantátem (hnědo-černé polyfenolické látky nebo ethylen) jako reakce na poranění či při delším růstu kultury.

Nevýhodou této schopnosti aktivního uhlí je současná adsorpce i jiných organických látek (vitamínů). Takto můţe aktivní uhlí ovlivnit růst kultury i negativně. Mezi další vlastnosti aktivního uhlí patří stabilizace pH a podpora somatické embryogeneze. [22]

3.2.1.5. OSMOTICKÉ LÁTKY Osmotický potenciál ţivného média je dán součtem osmotického potenciálu agaru a dalších komponent (hlavně cukrů a solí). Jako externí osmotika se pouţívají manitol, sorbitol, sacharóza, polyethylenglykol. [19]

3 .2 .2 . K U LT I VA Č N Í P O D M Í N K Y 3.2.2.1. PH Na rozdíl od kultur ţivočišných buněk je většina kultur rostlinných buněk poměrně odolná proti kolísání pH ţivného média. Je tak schopna kultivace v širším rozmezí pH, které můţe být od 5,0 do 6,5, nejčastěji však mezi 5,6 a 5,8. [8] Během samotné kultivace hodnota pH stoupá k alkalickým hodnotám v důsledku převaţující spotřeby aniontů pletivy. [26] Vyšší (nad 7,0) nebo naopak niţší (pod 4,5) hodnota pH zastavuje růst a vývoj kultur in vitro. [19] Úprava pH média před sterilizací se provádí pomocí 0,1-1,0 M NaOH, KOH nebo HCl či kyseliny askorbové. [8]

3 . 2 . 2 . 2 . T E P L O TA Izolovaná rostlinná pletiva mají v in vitro podmínkách v porovnání s intaktní rostlinou pěstovanou v přirozených podmínkách přísnější poţadavky na stálost teploty. 17

Pro intenzivní růst vyţadují vyšší teplotu neţ samotný mateřský organismus v rozmezí mezi 20-30°C. [27]

3.2.2.3. SVĚTLO Biosyntéza a akumulace sekundárních metabolitů probíhá v závislosti na světle jak v intaktních rostlinách, tak v kultivovaných tkáňových kulturách. Světlo je také indukčním faktorem mnoha biosyntetických drah. Vysvětluje se to stimulací tvorby chloroplastů, kde probíhají některé metabolické reakce. [28] Samotný fotosyntetický účinek osvětlení je však u většiny kultur zanedbatelný, jelikoţ trvalý výskyt chlorofylu v izolovaných pletivech je spíše výjimkou. [27]

3.2.2.4. PROVZDUŠŇOVÁNÍ (AERACE) Dostatečné provzdušňování je důleţitou podmínkou růstu při kultivaci buněčných kultur. Intenzita samotného provzdušňování je pak důleţitá proto, ţe změna poměru anaerobního a aerobního dýchání můţe vyvolat různé morfologické a biochemické změny. [8] Při pouţití kultivace na pevných nebo tekutých médiích s pouţitím papírového nosiče v baňkách uzavřených hliníkovou folií je výměna plynů dostatečná pro růst buněk kultury. Problémy však nastávají při kultivaci buněčných suspenzí.

3.2.2.5. NÁDOBY Volba vhodných kultivačních nádob je velmi důleţitá. Správnou velikostí a kvalitou materiálů můţeme do značné míry ovlivnit výsledek celého kultivačního procesu. Méně kvalitní sklo totiţ můţe do médií uvolňovat stopy olova či arsenu, které jiţ i v tak malém mnoţství mohou být pro kultury velmi škodlivé. Sklo můţeme také s úspěchem nahradit některým typem průhledného syntetického materiálu. Druhým důleţitým aspektem práce s kultivačními nádobami je jejich správné uzavření, které musí zabraňovat vniknutí infekce a vysychání ţivného média. Současně však musí umoţňovat výměnu plynů a přístup světla. Nejčastěji pouţívaným materiálem bývá tenká hliníková fólie.

18

3.3. P R A K T I C K Ý V Ý Z N A M

A

VYUŢITÍ

E X P L A N T Á TO V Ý C H K U LT U R Kromě dvou hlavních ekonomických směrů vyuţití explantátových kultur tj. v zemědělství a v průmyslu, slouţí asepticky pěstované izolované orgány, pletiva a jednotlivé buňky také ke studiu problémů rostlinné fyziologie (základní výzkum). [7] V z e m ě d ě l s t v í slouţí explantátové kultury vyšších rostlin k mnoţení, šlechtění a ozdravování rostlin. Nejdůleţitější jsou: [7] 1. Vegetativní množení (mikropropagace) umoţňující rychlé získání tisíců shodných rostlinných jedinců (např. orchideje, karafiáty, gerbery). 2. Meristémové kultury, které umoţňují získání ozdravených bezvirových rostlin (brambory, karafiáty). 3. Pylové kultury umoţňující rychlé získání haploidních rostlin a od nich odvozených čistých linií pro šlechtitelské účely (rýţe, tabák, obilí,…). 4. Fúze protoplastů téhoţ nebo různého druhu umoţňují tvorbu somatických hybridů (buněk nebo celých rostlin) s vlastnostmi epigenetické povahy z jiného druhu (přenos samčí cytoplasmatické sterility, rezistence apod.). 5. Tvorba různých regenerovaných rostlin, coţ umoţňuje vyuţití polymorfismu ve šlechtitelském programu a selekce produkčních klonů na úrovni izolované buňky. 6. Genové inženýrství u izolovaných buněk nebo protoplastů pro zavedení nových vlastností do rostliny (pouţití plazmidu z Agrobacterium tumefaciens jako vektoru k přenosu cizorodé DNA). V p r ů m y s l u se očekává biotechnologické vyuţití rostlinných buněk jako producentů biomasy pro získání sloučenin primárního a hlavně sekundárního metabolismu. Explantátové kultury se v průmyslu uplatňují jako: 1. alternativní zdroje produktů získávaných dosud z rostlin v polní kultuře; 2. zdroje produktů obsaţených v nesnadno pěstovatelných rostlinách; 19

3. zdroje nových produktů v důsledku změn metabolismu rostlinných buněk in vitro. Tyto buňky totiţ mohou výrazně a často i cíleně měnit biochemické a fyziologické vlastnosti za změněných kultivačních podmínek. Takto byly z buněčných kultur izolovány látky, které nebyly zjištěny v mateřských rostlinách, z nichţ byly kultury odvozeny; 4. zdroje specifických rostlinných látek (např. enzymů, lektinů), které lze získat jen z ţivých buněk; 5. zdroje látek nepřístupných jinak, a to biotransformací z prekurzorů za vyuţití obsáhlé enzymové aktivity rostlinné říše. [14] Hlavní výhodou tohoto biotechnologického pěstování rostlinných buněk a jejich metabolitů oproti polní produkci spočívá v tom, ţe produkce je zcela nezávislá na podnebí, na výkyvech počasí, na kvalitě půdního fondu i samotných dodavatelích surovin. Toto je důleţité zejména v případě některých farmaceuticky významných sloučenin. [7]

20

3.4. P R O D U K C E S E K U N D Á R N Í C H M E TA B O L I T Ů T K Á Ň O V Ý M I K U LT U R A M I Pro sekundární metabolity jsou charakteristické tyto znaky: [1] 

nejsou rozšířeny všeobecně, ale jen v určitých skupinách organismů;



nejsou obvykle zdrojem energie;



nepatří k základnímu biochemickému vybavení buňky, jejich biologická funkce se zpravidla projevuje aţ na úrovni orgánů či organismů;



jejich rozklad a syntéza je pomalejší, ukládají se v určitých orgánech.

Rostliny produkují sekundární metabolity ve všech nebo pouze v některých orgánech. Z těch se mohou transportovat a během toho i chemicky modifikovat. Příkladem můţe být biosyntéza tropanového skeletu, která probíhá v kořenech a oxidace vytvořeného hyoscyaminu na skopolamin v nadzemních částech rostliny. [8] Rozdíly v syntéze sekundárních metabolitů v jednotlivých částech rostliny mohou být nejen kvantitativní, ale většinou i kvalitativní. Jde o výraznou změnu spektra produkovaných látek. [6] Orgánová či pletivová specifita biosyntézy se převedením do tkáňové kultury často ruší. S výjimkou některých vysoce specifických buněk je většina schopna vytvářet kalus či suspenzi a za adekvátních kultivačních podmínek v ní pak probíhá i charakteristický metabolismus dané rostliny. [6] Rostliny i tkáňové kultury syntetizují sekundární metabolity většinou jen v určitě ontogenetické fázi, v určitém období růstového cyklu. Je proto výhodné odebrat z rostliny primární explantát v produkčním období. Odvozená kultura si však produkční schopnost ne vţdy podrţí. Některé příliš specializované buňky uţ nejsou schopny dělení a odvození samo je pak nemoţné. [32] Funkce sekundárních metabolitů jsou velmi rozmanité a ne vţdy zcela přesně známy. Vedle výše zmíněných adaptačních mechanismů a interakcí rostliny 21

s prostředím hrají také významnou roli například v obranném systému rostlin proti predátorům. Vyuţívá se jejich toxicity, zápachu či barevnosti. [33] Kaţdá rostlina je totipotentní, a proto je teoreticky moţné získat z tkáňové kultury jakoukoliv látku, která je syntetizována intaktní rostlinou v přírodě. Prakticky tomu však v mnoha případech není. Sekundární metabolity jsou látky s ohraničeným výskytem a pro svoji tvorbu potřebují vysoce specifické podmínky. Spektrum sekundárních metabolitů v kultuře také závisí na aktuálním stavu výchozí rostliny. [6] V explantátu také někdy dochází ke změnám metabolických drah, jejichţ důsledkem je kvalitativní změna spektra produkovaných látek. Látky, které se akumulují v buňkách, můţeme rozdělit do tří skupin: [34] 1. vedlejší produkty metabolických drah; 2. modifikované látky výchozích rostlin; 3. látky doposud neznámé. Kromě optimální situace, kdy explantátová kultura produkuje poţadovaný metabolit v dostatečném mnoţství, mohou nastat i nepříznivé situace, kdy tkáňová kultura ţádnou látku neprodukuje nebo jen ve velmi malém mnoţství, případně kdy produkuje látku jinou. Někdy se můţe stát, ţe kultura zpočátku produkuje látky shodné s výchozí rostlinou či orgánem, po čase však syntéza ustává. [35]

22

3.5. O V L I V N Ě N Í P R O D U K C E S E K U N D Á R N Í C H M ETA B O L I T Ů T K Á Ň O V Ý M I K U LT U R A M I Sekundární metabolismus, tj. biosyntéza, transport, vzájemná přeměna, odbourávání, akumulace a případně exkrece značného počtu sekundárních metabolitů probíhá pouze během určitých omezených vývojových stádií organismu. Navíc tyto procesy podléhají v intaktní rostlině velmi sloţité regulaci. Jen zřídka jsou sekundární metabolity tvořeny ve všech orgánech a během celého ţivotního cyklu rostliny. [3] Převedením rostliny na tkáňovou kulturu představuje pro buňku značný stres. Proto pak většinou nastává některá z nepříliš příznivých situací, kdy kultura ţádanou látku neprodukuje vůbec nebo jen ve velmi nízké koncentraci, případně produkuje látku jinou. Tento poslední jmenovaný případ je poměrně častý a je důsledkem poruch v regulačním mechanismu, které vedou ke změně nebo blokádě metabolických drah. Pro překonání těchto problémů a získání vysoce produkčních kultur bylo vypracováno několik obecných postupů, zahrnujících většinou tyto části: optimalizace kultivačních podmínek, selekce vysoce produkčních rostlin a buněčných linií, elicitace, mutace, volba prekurzorů, diferenciace a další. [3] Jak jiţ bylo zmíněno, nezbytnou podmínkou produkce sekundárních metabolitů je často anatomická diferenciace. Důvodem můţe být výhodné prostorové uspořádání enzymů, kompartmentace enzymu a substrátu, existence prostoru pro ukládání produktu či přítomnost specifických organel. Kompartmentace můţe být důleţitá pro separaci degradačních enzymů od akumulovaného metabolitu. Pro mnoho sekundárních látek všeobecně platí, ţe hydrofilní sloučeniny se ukládají ve vakuolách a lipofilní v různých kanálcích (př. terpeny jehličnanů), ve specializovaných útvarech (trichomy) nebo přímo do lipofilního matrixu (lignin, kutikula). [36]

23

3 .5 .1 . O P T I M A L I Z A C E K U LT I VA Č N Í C H PODMÍNEK Pro optimalizaci kultivačních podmínek musíme brát v úvahu celou řadu faktorů, jejichţ změna můţe ovlivnit biosyntetické moţnosti tkáňových kultur poţadovaným směrem. Jedná se o optimalizaci sloţek ţivného média, pH, aerace, světla či teploty. Podrobnostem podmínek kultivace je věnována kapitola 3.2.2.. Optimalizace jednotlivých podmínek kultivace je pro kaţdý druh kultury (rostlinný druh, orgán, odvození, typ kultivace atd.) specifická. [8] Existuje rovněţ vztah mezi růstem buněk a produkcí metabolitů, které se tvoří a akumulují ke konci růstové fáze. Proto je vhodným způsobem ovlivnění produkce změna koncentrací a vzájemných poměrů cukru, dusíku a fosforu. Bylo zjištěno, ţe určitá koncentrace fosfátů spolu s cukry je limitujícím faktorem pro růst v suspenzních kulturách a produkce metabolitů je závislá na sníţení této koncentrace. [8] Důleţitým faktorem ovlivňujícím produkci je obsah regulátorů růstu v ţivném médiu. O sloţení ţivných médií pojednává kapitola 3.2.1. Významný je rovněţ vliv agaru pouţívaného ke zpevnění média na výţivné látky v něm obsaţené. [37]

3 .5 .2 . S E L E K C E B U N Ě Č N Ý C H L I N I Í Cílem je vybrat rostlinu, která produkuje co moţná největší mnoţství ţádaných látek a současně rostlinu s co největší rychlostí přeměny ţádaných metabolitů. Vzhledem k tomu, ţe přímá závislost mezi produkcí rostliny a tkáňové kultury neplatí vţdy, není tento krok sám o sobě zárukou úspěchu, ale vytváří pro něj alespoň dobré předpoklady. [3] Při selekci buněčných linií se vyuţívá těch buněčných linií, které se vyznačují vysokou produkční schopností. [6] Během celé selekce se postupuje podle selekčních schémat. Vychází se z výběru produkční rostliny, ze které se odvozuje kalus a poté suspenze, která pak umoţňuje rozsev buněk na pevnou půdu. [6] Selekce kmenů rozpoznatelných jen chemickou analýzou klade velké nároky na screeningové metody. Screening jednotlivých buněk (protoplastů) je moţný spektrofo24

tometrickými metodami, vizuální selekcí, imunologickými metodami, chemickou analýzou, biologickými testy a nejčastěji pomocí RIA – radioimunoanalýzy. [6] Buněčné linie jsou značně nestabilní. Musejí se proto při jejich delším uchovávání chránit. S úspěchem se vyuţívá kryoprezervace a uchovávání v tekutém dusíku. [8]

3 .5 .3 . E L I C I TA C E Kaţdá rostlinná buňka je schopna se bránit proti stresům vnějšího prostředí, kdyţ je například napadena fytopatogenními houbami nebo mikroorganismy. Při stresovém působení dochází k uvolňování elicitorů z buněčných stěn patogenů nebo rostlin a následně k obraně, během které se vytvářejí nízkomolekulární látky – fytoalexiny. Ty jsou charakteristické pro daný rostlinný druh. Mnohé fytoalexiny jsou odvozené z fenylalaninu. Jsou tedy podobné flavonoidům a jiným fenylpropanoidům. [38] Elicitory jsou definovány jako agens biologického původu, které vystupují v interakci rostlina-mikroorganismus. Ve vztahu k akumulaci sekundárních přírodních látek jsou označovány jako nosiče mikrobiálního stresu neboli biotické elicitory. Jako abiotické elicitory jsou pak označováni stresoví činitelé jako například UV záření, ionty těţkých kovů, změny osmotického tlaku, změny pH, … [38] Při experimentální práci se často jako elicitory pouţívají kompletní homogenáty inaktivovaných kultur mikroorganismů – hub, bakterií a jejich frakcí. [38] Elicitory mohou v rostlinných tkáňových a buněčných kulturách iniciovat aktivitu specifických genů, které vedou ke zvýšení určitých enzymů a následně k biosyntéze látek, které před tím buňka netvořila. Naskýtá se pak moţnost vyuţití elicitace k indukci tvorby přírodních látek v rostlinných buněčných kulturách. [12] Zvyšování akumulace sekundárních metabolitů v rostlinných buněčných kulturách cestou elicitace si získává značnou pozornost pro poměrnou jednoduchost procesu elicitace a dosavadní dobré výsledky dosaţené s určitými buněčnými kulturami, které po elicitaci akumulovaly zvýšené mnoţství sekundárních metabolitů. [12]

3 .5 .4 . M U TA C E Produkční heterogenitu lze u buněčné kultury zvýšit pouţitím chemických činidel či UV zářením. [6] 25

Velká genetická variabilita tkáňových kultur rostlin je současně kladem i záporem. Rozšiřuje sice spektrum reakcí a kmenů, které lze získat i bez pouţití mutagenů, na druhé straně je však nutný širší screening a udrţovací šlechtění. [14] Protoţe zásah mutagenů do metabolismu je velmi komplexní, výsledky jsou často nepředvídatelné. [3]

3 .5 .5 . M O R F O R E G U L A C E Vzhledem k neoddělitelnosti anatomické a metabolické diferenciace je nutné za účelem zvýšení produkce sekundárních metabolitů kultivovat jiţ organizovaná pletiva. V současné době lze s úspěchem pěstovat orgány a pletiva, která obsahují produkční buňky. Vysoce specializované buňky (ţláznaté trichomy, mléčnice) však zatím kultivovat nelze. [40] Řízenou morfogenezí můţeme navodit ţádané metabolické dráhy. K morforegulačním zásahům se pouţívají především rostlinné regulátory růstu v různých koncentracích a poměrech. [6] Organogeneze je vysoce energeticky náročná činnost, která probíhá pouze při dostatečné koncentraci cukrů. Samotná dodávka cukrů je pak splněna další podmínkou, kterou je zvýšená osmotická aktivita prostředí. [41]

3 .5 .6 . V L I V P L O I D I E Syntéza sekundárních metabolitů je úzce spjatá s ploidií rostliny i tkáňové kultury. U intaktních rostlin lze nalézt příklady závislosti jak kvantitativní tak i kvalitativní. Někdy je vliv stupně ploidie rozpoznatelný aţ v průběhu ontogeneze. [6] Je třeba počítat i s tím, ţe i v případech, ve kterých je explantát odebrán z rostliny o známé a pro produkci výhodné ploidii, ploidie pasáţováním kultur často kolísá a spolu s tím klesá i morfologický potenciál a produkce. [6] Hladina ploidie někdy ovlivňuje i rychlost růstu, kdy polyploidní kalus roste i při zvýšené koncentraci auxinů pomaleji neţ diploidní. [42]

26

3 .5 .7 . V L I V B U N Ě Č N É H O

A

RŮSTOVÉHO

CYKLU U tkáňových kultur je nezbytné vztahovat období produkce sekundárních metabolitů jednak k průběhu celé kultivace nebo jedné pasáţe – tedy k růstovému cyklu, ale také k průběhu buněčného cyklu. [6] Snaha podstatně zkrátit kultivační dobu zásahem do buněčného cyklu rostlinných buněk zůstala doposud bez úspěchu. Buněčný cyklus je souhrnným označením veškerých dějů, které se odehrávají od vzniku buňky, zdvojení jádra, vytvoření buněčné stěny a membrán aţ po rozmnoţení cytoplazmy a všech organel, které jsou v ní obsaţeny. Zatímco pozdrţení rostlinné buňky v některé fázi buněčného cyklu je moţné, snahy o jeho urychlení jsou zatím neúspěšné. [14] Růstový cyklus popisuje vývojové změny, které následují po inokulaci buněk. Označuje exponencionální fázi, která je konstantní a na obou stranách ohraničená dvěma fázemi přechodnými – iniciální lag-fází (buňky se v ní adaptují na nové podmínky výţivy a zahajují maximální růst) a stacionární fází (následuje po vyčerpání ţivin). [43] Délka jednotlivých fází růstového cyklu závisí na fytohormonech v ţivném médiu, hustotě populace, kultivační teplotě aj. Z ekonomického hlediska je nejdůleţitější, aby buňky co nejdříve dosáhly produkční fáze a v té setrvaly co nejdéle. [6] Znalost metabolických charakteristik jednotlivých buněčných fází přispívá k nalezení uzlového bodu daného buněčného metabolismu, ve kterém dochází k aktivaci sekundárního metabolismu. [6]

3 .5 .8 . M O Ţ N O S T I G E N O V É H O INŢENÝRSTVÍ Vnášení genů (transgeneze) do rostlinného genomu má v dnešní době široké uplatnění. Praktickým cílem je zlepšování genomu kulturních rostlin vnášením genů pro šlechtitelsky významné vlastnosti a v neposlední řadě vyuţití této metody k ovlivnění produkce farmakologicky aktivních sekundárních metabolitů produkovaných řadou farmaceuticky významných rostlin.

27

Transgeneze se vyuţívá: 

jako nástroj studia genové regulace;



ke šlechtění rostlin (vyšší odolnost k herbicidům, hmyzím škůdcům, virům, za účelem sníţení obsahu dusičnanů v zelenině, atd.);



v ovlivnění produkce sekundárních látek.

3 .5 .9 . I M O B I L I Z A C E Imobilizace je technika, která se velmi často uţívá k indukci tvorby sekundárních metabolitů. Rostlinné buňky obsahují mnoţství více či méně specifických enzymů, které umoţňují syntézu „de novo“ i biotransformaci. Enzymy jsou však v organismech vytvářeny pro regulované metabolické procesy, kdy jejich malá stabilita, úzká specifita a vyhraněné poţadavky na reakční prostředí jsou součástí jejich funkce. Proto pro průmyslovou aplikaci v chemickém nebo farmaceutickém průmyslu není většina enzymů vhodná a je výhodné je modifikovat – např. imobilizací. Tím se získá heterogenní katalyzátor, který umoţňuje vícenásobné či kontinuální vyuţití enzymů. Účinný katalyzátor lze připravit buď imobilizací čistých enzymů, nebo celých buněk. [7] Při imobilizaci se vyuţívají následující metody: [31] 1. Z a p o u z d ř e n í d o g e l u – buňky jsou výhodně chráněny před nepříznivými vlivy okolního prostředí. Nevýhodou je vytváření další difúzní bariéry mezi metabolicky aktivní protoplazmou a ţivným médiem. 2. V a z b a n a p o v r c h u p e v n é h o n o s i č e – výhodou je bezprostřední kontakt buněk s ţivným médiem. 3. I n k a p s u l a c e pomocí dialyzačních membrán. V některých případech se produkt uvolněný do ţivného média stává inhibitorem další syntézy sekundárních metabolitů. Odstraňování tohoto produktu z ţivného média je pak nezbytnou součástí úspěšné práce. Můţeme pouţít adsorpce na iontoměniče nebo aktivní uhlí. [8]

28

3 .5 .10 . B I O T R A N S F O R M A C E Tkáňové kultury rostlinných buněk jsou schopny transformovat exogenně dodané látky (prekurzory) oxidací, redukcí, hydroxylací, methylací, demethylací apod. na látku jinou (produkt). Hydroxylace a glykosylace mají velký význam, protoţe je nelze uskutečnit ani chemickým způsobem ani mikrobiálními buňkami. Nevýhodou je, ţe buňky tkáňové kultury provádějí více neţ pouze jednu biotransformační reakci. Vyuţitím selekce buněčných linií lze tomuto s úspěchem zabránit. (viz kap. 3.5.2.) [12] Kromě moţnosti produkce přírodních látek in situ můţe být tedy biosyntetická kapacita rostlinných buněk uţita i k chemickým transformacím látek. Potenciálních substrátů pro biokonverzi je velmi mnoho. Tyto látky lze rozdělit do dvou skupin: [44] 1. Látky rostlině obvykle nedostupné, např. syntetické látky, chemické analogy, sekundární metabolity jiných rostlinných druhů. Jejich transformaci lze vysvětlit jako detoxikační reakci. [45] Vzniknou látky s novými biologickými vlastnostmi, neznámé z přírody. 2. Přirozené prekurzory – látky v rostlině obvykle přítomné (rostlině vlastní), jejichţ transformací vznikne produkt, který je známou přírodní látkou. Biotransformace můţe být realizovaná i kulturou, v níţ je celá biosyntetická sekvence určité látky porušena, ale enzym schopný zprostředkovat ţádanou dílčí reakci je tvořen v dostatečném mnoţství. Tento přístup má zásadní význam pro zavádění moderních biotechnologií – zejména ve farmaceutickém průmyslu, kde v kombinaci s organickou syntézou můţe usnadnit přípravu nových analogů známých léčiv, která by měla sníţenou toxicitu nebo zvýšený terapeutický účinek. Velký význam má rovněţ pro vyuţití některých surovin, jejichţ chemické zpracování není moţné nebo je ekonomicky velmi nevýhodné. [6] V mnoha případech vede dodání exogenních prekurzorů ke zvýšení biosyntézy produktu, na druhé straně ale u mnoha kultur zůstane přidání prekurzoru bez odezvy. V případě pouţití prekurzorů je nutno ověřit jejich akceptovatelnost, zjistit jejich optimální hladinu, ve které působí a aplikovat je přesně v té růstové fázi, ve které jsou účinné, protoţe některé kultury produkují poţadované metabolity v pozdní stacionární fázi, jiné v lag-fázi nebo rané exponenciální fázi růstu. Například u tkáňové kultury medvědice lékařské (Arctostaphylos uva-ursi) bylo zjištěno, ţe aplikace hydrochinonu 29

po 14 dnech kultivace (tedy na počátku exponenciální fáze růstu kultury) částečně inhibovala růst. Jako výhodnější se ukázala aplikace hydrochinonu po 21 dnech kultivace (tedy na konci exponenciální fáze, kdy jiţ nedošlo k negativnímu ovlivnění růstu rostliny). [46] Rostlinné buňky obsahují mnoţství více či méně specifických enzymů, které umoţňují výše zmíněné reakce. Většina z nich na své vyuţití teprve čeká. Počet chemických sloučenin a struktur, které jsou rostlinné enzymy schopny tvořit a měnit, je ohromný. [6] Tkáňové kultury jsou moţným a perspektivním zdrojem sekundárních metabolitů a účinným prostředkem biotransformace různých látek. Ekonomicky aplikovatelné jsou především kultivace buněčných suspenzí (hlavně kontinuální) a zejména imobilizované buňky. Tyto kultivační systémy jsou však pouţitelné jen u buněk produkčních v morfologicky nediferencovaném stavu, zatímco u mnoha rostlinných druhů je diferenciace metabolická s diferenciací anatomickou pevně spojena. Pro získání jednotlivých sekundárních metabolitů je tedy nezbytné najít kultivační podmínky indukující anatomickou diferenciaci a pěstovat diferencované pletivo. [6]

30

3.6. C E N T E L L A A S I AT I C A (L.) URB. 3 .6 .1 . B O TA N I C K É Z A Ř A Z E N Í

[48]



říše – Plantae



oddělení – Magnoliophyta



třída – Magnoliopsida



podtřída – Cornidae



řád – Araliales



čeleď – Hydrocotylaceae



rod – Centella



druh – Centella asiatica (pupečník asijský, centela asijská)

3 .6 .2 . P O P I S I N TA K T N Í R O S T L I N Y Drobná, vytrvalá, léčivá rostlina původem z Indie, Číny, Indonésie, Austrálie, jiţního Pacifiku, Madagaskaru a jiţní nebo střední Afriky. [49] Tato tenká popínavá bylina má vláknitou lodyhu plazící se po zemi, často načervenalou, s dlouhými internodii, zakořeňující v uzlinách. Listy mají proměnlivou velikost. Jsou více široké neţ dlouhé. Tvar listu je nejčastěji ledvinovitý, okrouhlý či oválně eliptický, baze listu je dokonale srdčitá. Listy jsou uspořádané v růţici, řapík je obvykle pět aţ desetkrát delší neţ čepel. Květenství je úţlabní jednoduchý okolík sloţený z jednoho aţ tří květů. Květy jsou oboupohlavné, pětičetné, nazelenalé, růţové nebo načervenalé. Okvětních lístků je pět (vzájemně nesrostlé) a jsou většinou bílé, někdy však zbarvené lehce do červena. Kališní lístky nejsou přítomny. Tyčinek je pět, semeník je spodní. Plod je tvrdá, nepukavá dvounaţka. Drogou je nať (Centellae herba), která se sbírá nejčastěji na jaře a také na podzim. Typický je její charakteristický zápach a nepatrně sladkohořká chuť. [50]

31

3 .6 .3 O B S A H O V É L Á T K Y

A

T E R AP E U T I C K É

VYUŢITÍ Největší podíl sekundárních metabolitů Centella asiatica tvoří pentacyklické triterpenoidní saponiny asiaticosid a madecassosid. Kromě nich jsou také přítomny jejich aglykony kyselina asiaticová a kyselina madecassová. Všechny tyto triterpeny jsou odvozeny od kyseliny ursolové a mají ursanový skeleton. [51] Z názvu této skupiny látek - triterpenoidní saponiny - vyplývá, ţe tyto sekundární metabolity můţeme zařadit jak do skupiny terpenoidů (terpenů), tak do skupiny saponinů. [51] Kromě těchto hlavních obsahových látek jsou v rostlině přítomny další sekundární metabolity ze skupin monoterpenů, seskviterpenů, poloacetalů a flavonoidních glykosidů. V dnešní době vyuţívá tuto rostlinu i česká medicína. [50] V terapii se vyuţívá antirevmatických a antiartrotických účinků, dále se pouţívá k léčba hemoroidů, ovlivnění inteligence, paměti a schopnosti učení, v koţním lékařství, hojení vředů různé etiologie a mnoho dalších. Centella asiatica je uvedena ve vyhlášce Ministerstva zdravotnictví č. 343/2003 Sb., kterou se vydává seznam rostlin vyuţívaných pro farmaceutické a terapeutické účely. Článek Centellae asiaticae herba (nať centely asijské, syn. pupečníková nať) je uveden v evropském lékopise Pharmacopoea Europea 4th edition [52] a je také součástí Českého lékopisu 2002. [53] Farmakologické vlastnosti Centella asiatica jsou přisuzovány především asiaticosidu, kyselině asiaticové a madecassové. Do nejrůznějších lékových forem však bývá přidáván nejen extrakt těchto látek, ale také celá nať, aby byly přítomny i vedlejší obsahové látky, které mohou potencovat účinek těchto hlavních sekundárních metabolitů.

32

3.7. A R B UT I N Arbutin jako terapeuticky významný sekundární metabolit je obsahovou látkou drogy Uvae-ursi folium, která je vyuţívána v urologických čajovinách a působí jako močové desinficiens. Byly prokázány jeho další účinky jako antimikrobiální, antitusický atd. Získání této drogy z polních kultur je velmi obtíţné a v uplynulých letech se ho v České republice nepodařilo realizovat. Biotechnologické pokusy se proto soustředí na moţné získávání tohoto terapeuticky významného sekundárního metabolitu biotransformační přeměnou jeho prekurzorů. Znalost metabolických drah usnadňuje nalezení vhodných prekurzorů, které umoţňují syntézu ţádané látky zvýšit. [54]

3 .7 .1 . B I O S Y N T É Z A Biosyntetické pochody, z nichţ vycházela volba prekurzorů:

fenylalanin

kys. 4-hydroxybenzoová

kys. skořicová

hydrochinon

33

kys. p-kumarová

arbutin

3 .7 .2 V Ý S K Y T V P Ř Í R O D Ě Fenolický glykosid arbutin je hlavní obsahovou látkou i několika rostlin vyskytujících se na území České republiky. Podle původu rostliny a doby sběru je v mnoţství 3-12 % obsaţen v listech medvědice lékařské (Uvae-ursi folium) a v 5 % je přítomen v listech brusinky obecné (Vitis-idaeae folium). Někteří odborníci pokládají obě drogy za terapeuticky rovnocenné.

3 .7 .3 . F A R M A K O L O G I C K É V L A S T N O S T I Nejčastěji se přípravky obsahující arbutin pouţívají jako desinficiencia močových cest. Drogy obsahující arbutin jsou součástí diuretických a urologických čajových směsí. [55] Účinné jsou však patrně aţ štěpné produkty arbutinu – methylarbutin a hydrochinon, které jako metabolické produkty arbutinu opouštějí tělo močí. Arbutin sám bakteriostatickou účinnost nemá. [56] Drogy se uţívají při chronických zánětech močovodů, močového měchýře a ledvinových pánviček a při močovém písku a kaméncích. Jelikoţ je droga účinná jen při zásadité reakci moči, je vhodné její podání současně s jedlou sodou. [54] Mezi další patří účinky adstringentní a antitusický [57]. Arbutinu jako tyrosinázového inhibitoru je s úspěchem uţíváno i v kosmetice, kde figuruje jako sloţka odpovědná za zjasňující efekt. [58] Je tak součástí přípravků na zesvětlování pleti a zlepšení nejrůznějších hyperpigmentózních abnormalit. Kombinuje se i s dalšími inhibitory tyrosinázy – hydrochinonem, kyselinou kojovou, lékořicovým extraktem či kyselinou askorbovou (vitamínem C). [59] Při dlouhodobém uţívání byly zjištěny některé neţádoucí účinky arbutinu. Mezi nejzávaţnější patří vylučování cukru do moči (glukosurie) a narušení jaterních funkcí. Dlouhodobé uţívání drog s obsahem arbutinu tedy není vhodné, stejně tak jejich pouţívání těhotnými a kojícími ţenami. [55]

34

4. E XPERIMENTÁLNÍ Č ÁST 4.1. L A B O R ATO R N Í P Ř Í ST R O J E A V Y B AV E N Í 

Laboratorní analytické váhy AND Helago s.r.o.



Přesné váhy Kern 572



Horkovzdušný sterilizátor Chirana IP 21



Box s laminárním prouděním Holten LaminAir (HV MINI)



Sušárna Memmert



Silufol® UV 254 sklárny Kavalier, závod Votice



UV lampa CAM AG



UV/VIS detektor PU 4110 Philips



Multichannel detektor DAD PU 4021 Philips



Pumpa PU 4110 Philips



Předkolona 30×3 mm CGC SGX C18, velikost částic 10 µm (Tessek Praha)



Kolona 250×4 mm Purospher Star RP-18 endcapped, velikost částic 5 µm (Merck, Darmstadt)



Vakuová odparka Heidolph, LABOROTA 4001

35

4.2. C H E M I K Á L I E 

4-aminoantipyrin čistý, Chemapol



Agar noble difco laboratories, Detroit



Amoniak vodný roztok 25% p.a., Lachema



Arbutin pro laboratorní účely, Roth



Ethanol 96%



Glycin p.a., Lachemie



Hexakyanoţelezitan draselný p.a., Lachema



Hydrochinon p.a., Lachema



Hydrolyzát kaseinu, Sigma



Chloroform p.a., Lachema



Kyselina 2,4-dichlorfenoxyoctová, Merck



Kyselina 4-hydroxybenzoová krist. reinst. (cryst. research grade), Serva



Kyselina chlorovodíková, Lachema



Kyselina nikotinová čistá, Lachema



Kyselina p-kumarová, Sigma-Aldrich



L-tyrosin, Serva



Methanol gradient grade for liquid chromatography



Methanol p.a., Lachema



4-methoxyfenol, Fluka AG



Methylarbutin izolovaný na katedře farmaceutické botaniky a ekologie



Myo-inositol, Sigma



N6-benzyladenin, Merck



Pyridoxin hydrochlorid DAB 6, Loba Chemie



Sacharosa p.a., Lach-Ner



Thiamin hydrochlorid B.P., U.S.P., Koch-Light Laboratories Ltd.

36

4.3. P O U Ţ I T Ý B I O L O G I C K Ý M AT E R I Á L K biotransformačním pokusům byly pouţity tkáňové kultury z úţlabních pupenů Centella asiatica (26.-31. pasáţ) získané ze zahrady léčivých rostlin při Farmaceutické fakultě Univerzity Karlovy. Ke kultivaci kultur bylo pouţito ţivné médium dle Murashigeho a Skooga [18] s přídavkem regulátorů růstu 2,4 D (0,5 mg/l) a BA (0,5 mg/l).

4.4. B I O T R A N SF O R M A Č N Í P O K U S Y Biotransformační pokusy byly prováděny jak v suspenzních kulturách, tak v kulturách kultivovaných na můstcích z filtračního papíru v tekutém ţivném médiu. Kultivace probíhala za světla. Po 14 dnech kultivace kultur u můstkové metody a ihned po zaloţení suspenzních kultur byly do ţivného média sterilně přidány o koncentracích 200 mg/l tyto prekurzory arbutinu: 

Hydrochinon



Kyselina p-kumarová



Kyselina 4-hydroxybenzoová



Tyrosin

Odběry vzorků kalusů pro analýzu byly provedeny po 6, 12, 24, 48, 168 hodinách v případě suspenzních tkáňových kultur a po 12 a 48 hodinách při kultivaci na můstcích. Analýzy byly provedeny rovněţ u slepých pokusů (bez přidání prekurzorů) a u vzorků ţivných médií.

4.5. A N A L Ý Z A O B S A H O V Ý C H L Á T E K Příprava extraktu: Kalusy byly sušeny při pokojové teplotě na skleněných Petriho miskách, rozetřeny v třecí misce pomocí tloučku a naváţka o hmotnosti cca 0,250 g byla extrahována 5 ml ethanolu 96% za studena po dobu 48 hodin. Extrakt byl následně zfiltrován, odpařen a byla provedena zkouška ztráty sušením. [60] 37

Samotná analýza obsahových látek byla prováděna pomocí dvou chromatografických metod:

1. TLC (Thin-Layer Chromatography, Tenkovrstvá chromatografie) 

Analýza byla provedena na deskách Silufol® a Silikagel 60 Merck.

Standardy: Methanolické 0,1% roztoky 

hydrochinonu



arbutinu



methylarbutinu



4-methoxyfenolu

Vyvíjecí soustava: 

chloroform : methanol (75:25)

Detekce: Po vyvinutí chromatogramu byla před samotnou detekcí prováděna hydrolýza postřikem HCl (1 mol/l), 15 minutovým zahřátím v sušárně při 105°C, následnou alkalizací 10% amoniakem. Po uschnutí chromatogramu se k detekci provedl postupný postřik: 

4-aminoantipyrinem (0,02 M vodný roztok),



amoniakem (10% vodný roztok),



K3Fe(CN)6 (1% vodný roztok).

38

2. HPLC (High-Performance Liquid Chromatography, Vysokoúčinná kapalinová chromatografie)

Specifikace přístroje: 

pumpa: PU 4110



detektor: PU 4110 UV/VIS DAD PU 4021 multichannel detektor



nástřiková klička: 20 µl, manuální nástřik



kolona: 250×4 mm SGX C18, velikost částic 7 µm (Merck)



předkolona: 30×3 mm CGC SGX C18, velikost částic 10 µm (Merck)

Vzorky byly rozpuštěny v 1 ml methanolu.

Analý za: 

eluce gradientová, methanol:voda v poměru 5:95 s lineárně se zvyšujícím poměrem methanolu aţ na poměr 95:5 v průběhu 15 minut



průtoková rychlost mobilní fáze 1,5 ml/min



nástřik 20 µl



detektor UV/VIS PU 4110, monitorovaná vlnová délka 285 nm

39

5. V ÝSLEDKY 5.1. S E Z NA M 

P O U Ţ I T Ý C H Z K R AT E K

použité chromatografické metody:

TLC ..........................................Thin-Layer Chromatography (Tenkovrstvá chromatografie) HPLC ........................................High-Performance Liquid Chromatography (Vysokoúčinná kapalinová chromatografie)



sledované látky a prekurzory:

A ...............................................Arbutin MA............................................Methylarbutin HCh ..........................................Hydrochinon 4-MF .........................................4-methoxyfenol PHB ..........................................4-hydroxybenzoová kyselina Tyr ............................................Tyrosin



výsledky:

+ ................................................pozitivní záznam přítomnosti sledované látky na TLC chromatogramu – ................................................negativní záznam přítomnosti sledované látky na TLC chromatogramu

40

5.2. V Ý S L E D K Y TLC A N A L Ý Z Y Tab. 1: Výsledky TLC analýzy živných médií pro kultivaci suspenzních kultur Centella asiatica po přidání prekurzorů arbutinu – hydrochinonu a kyseliny p-kumarové v koncentracích 200 mg/l.

Sledované látky

Doba odběru

A

MA

HCh

4-MF

A

MA

HCh

4-MF

6h

–

–

–

–

–

–

–

–

12 h

–

–

–

–

–

–

–

–

24 h

–

–

–

–

–

–

–

–

48 h

–

–

–

–

–

–

–

–

168 h

+

–

–

–

–

–

–

–

Prekurzory:

Hydrochinon

Kyselina p-kumarová

Tab. 2: Výsledky TLC analýzy živných médií pro kultivaci suspenzních kultur Centella asiatica po přidání prekurzorů arbutinu – kyseliny 4-hydroxybenzoové a tyrosinu v koncentracích 200 mg/l.

Sledované látky

Doba odběru

A

MA

HCh

4-MF

A

MA

HCh

4-MF

6h

–

–

+

+

–

–

–

–

12 h

–

–

+

+

–

–

–

–

24 h

–

–

+

+

–

–

–

–

48 h

–

–

+

+

–

–

–

–

168 h

–

–

+

+

–

–

–

–

Prekurzory:

Kyselina 4-hydroxybenzoová

41

Tyrosin

Tab. 3: Výsledky TLC analýzy živných médií pro kultivaci můstkových kultur Centella asiatica po přidání prekurzorů arbutinu – hydrochinonu a kyseliny p-kumarové v koncentracích 200 mg/l.

Sledované látky

Doba odběru

A

MA

HCh

4-MF

A

MA

HCh

4-MF

12 h

–

–

–

–

–

–

–

–

48 h

–

–

–

–

–

–

–

–

Prekurzory:

Hydrochinon

Kyselina p-kumarová

Tab. 4: Výsledky TLC analýzy živných médií pro kultivaci můstkových kultur Centella asiatica po přidání prekurzorů arbutinu – kyseliny 4-hydroxybenzoové a tyrosinu v koncentracích 200 mg/l.

Sledované látky

Doba odběru

A

MA

HCh

4-MF

A

MA

HCh

4-MF

12 h

–

–

+

+

–

–

–

–

48 h

–

–

+

+

–

–

–

–

Prekurzory:

Kyselina 4-hydroxybenzoová

42

Tyrosin

Tab. 5: Výsledky TLC analýzy extraktů suspenzní kultury Centella asiatica po přidání prekurzorů arbutinu – hydrochinonu a kyseliny p-kumarové v koncentracích 200 mg/l.

Sledované látky

Doba odběru

A

MA

HCh

4-MF

A

MA

HCh

4-MF

6h

+

–

–

–

–

–

–

–

12 h

+

–

–

–

–

–

–

–

24 h

+

–

–

–

–

–

–

–

48 h

+

–

–

–

–

–

–

–

168 h

+

–

–

–

–

–

–

–

Prekurzory:

Hydrochinon

Kyselina p-kumarová

Tab. 6: Výsledky TLC analýzy extraktů suspenzní kultury Centella asiatica po přidání prekurzorů arbutinu – kyseliny 4-hydroxybenzoové a tyrosinu v koncentracích 200 mg/l.

Sledované látky

Doba odběru

A

MA

HCh

4-MF

A

MA

HCh

4-MF

6h

+

+

–

–

–

–

–

–

12 h

+

+

–

–

–

–

–

–

24 h

+

+

–

–

–

–

–

–

48 h

+

+

–

–

–

–

–

–

168 h

+

+

–

–

–

–

–

–

Prekurzory:

Kyselina 4-hydroxybenzoová

43

Tyrosin

Tab. 7: Výsledky TLC analýzy extraktů kalusů (můstkové kultury) Centella asiatica po přidání prekurzorů arbutinu – hydrochinonu a kyseliny p-kumarové v koncentracích 200 mg/l.

Sledované látky

Doba odběru

A

MA

HCh

4-MF

A

MA

HCh

4-MF

12 h

+

–

–

–

–

–

–

–

48 h

+

–

–

–

–

–

–

–

Prekurzory:

Hydrochinon

Kyselina p-kumarová

Tab. 8: Výsledky TLC analýzy extraktů kalusů (můstkové kultury) Centella asiatica po přidání prekurzorů arbutinu – kyseliny 4-hydroxybenzoové a tyrosinu v koncentracích 200 mg/l.

Sledované látky

Doba odběru

A

MA

HCh

4-MF

A

MA

HCh

4-MF

12 h

–

–

–

–

–

–

–

–

48 h

–

–

–

–

–

–

–

–

Prekurzory:

Kyselina 4-hydroxybenzoová

44

Tyrosin

5.3. V Ý S L E D Y HPLC A N A L Ý Z Y Obr. 1: Kalibrační křivka arbutinu

45

Obr. 2: Výsledky HPLC analýzy standardů: arbutinu, hydrochinonu, methylarbutinu a

14,53 p-hydroxy benzo ova k.

250

200

150

50

12,31

5,85 arbutin

100

m ethyl arb uti n 11,46

8,25 hyd ochi non

Vol tage [m V]

kyseliny 4-hydroxybenzoové

0 5

10

15

20 T ime [min.]

Obr. 3: Výsledek HPLC analýzy extraktů suspenzní kultury Centella asiatica po přidání

5

15

25,88

23,51

27,23

23,13 22,12

25,22

21,49

19,11 17,93 18,46

16,38

15,36

14,30

13,20 10

22,73

10,78 8,59 10,26

0

0

7,94

6,00 arbutin

100

3,22

200

9,53

400

300

19,48

11,25

6,83 6,36

500

20,25

4,78

600

1,10

Vol tage [m V]

prekurzoru arbutinu – hydrochinonu v koncentraci 200 mg/l, doba odběru 6 hodin

20

46

25

30

35 T ime [min.]

Obr. 4: Výsledek HPLC analýzy extraktů suspenzní kultury Centella asiatica po přidání

6,74

4,77

25,87 27,32 25,12

23,32

21,71

20,62

19,65

17,78 18,58

15,41

16,48

14,27

10,76 11,24

3,59

2,64

100

13,28

200

8,56

5,99 arbutin

300

28,79

400

9,52

Vol tage [m V]

prekurzoru arbutinu – hydrochinonu v koncentraci 200 mg/l, doba odběru 12 hodin

0 5

10

15

20

25

30

35 T ime [min.]

Obr. 5: Výsledek HPLC analýzy extraktů suspenzní kultury Centella asiatica po přidání

25,87

6,71

4,72

6,26

300

5

10

15

24,75

21,36

22,24 23,15

19,68 17,81

20,86

19,26

16,28 15,57

14,46

18,59

0

12,91

50

11,49

8,99

100

13,55

150

9,52

5,99 arbutin

200

10,76

250

4,35

Vol tage [m V]

prekurzoru arbutinu – hydrochinonu v koncentraci 200 mg/l, doba odběru 24 hodin

20

47

25

30

35 T ime [min.]

Obr. 6: Výsledek HPLC analýzy extraktů suspenzní kultury Centella asiatica po přidání

7,98

38,22

35,65

32,70 33,57

31,27 32,02

23,80

20,27

21,75

23,00

20,87

18,29 19,25

17,04

15,71

13,17

14,28 15,14

11,15 8,28

0

12,01

2,49 3,51

50

5,81 arbutin 6,78

100

17,60

16,17

150

6,49

200

25,88

7,53

250

4,46 4,73

Vol tage [m V]

prekurzoru arbutinu – hydrochinonu v koncentraci 200 mg/l, doba odběru 48 hodin

-50 5

10

15

20

25

30

35 T ime [min.]

Obr. 7: Výsledek HPLC analýzy extraktů suspenzní kultury Centella asiatica po přidání

25,87

6,71

4,72

6,26

300

5

10

15

24,75

20,86 21,36

17,81

22,24 23,15

19,68 19,26

16,28 14,46

15,57

18,59

0

12,91

50

11,49

8,99

100

13,55

150

9,52

5,99 arbutin

200

10,76

250

4,35

Vol tage [m V]

prekurzoru arbutinu – hydrochinonu v koncentraci 200 mg/l, doba odběru 168 hodin

20

48

25

30

35 T ime [min.]

Tab. 9: Výsledky HPLC analýzy extraktů suspenzních kultur Centella asiatica po přidání prekurzoru arbutinu – hydrochinonu v koncentraci 200 mg/l

Doba kultivace [hod]

Množství arbutinu [%]

6

0,030

12

0,038

24

0,040

48

0,043

168

0,038 *

* V čase 168 hodin bylo podrobeno analýze i živné médium a v něm zjištěna přítomnost arbutinu v mnoţství 0,096 % (obr. 9).

Obr. 8: Graf závislosti mnoţství arbutinu v extraktu suspenzní kultury Centella asiatica po přidání hydrochinonu (200 mg/l) na délce kultivace (6, 12, 24, 48 a 168 hodin)

49

Obr. 9: Výsledek HPLC analýzy živného média pro kultivaci suspenzní kultury Centella asiatica po přidání prekurzoru arbutinu – hydrochinonu v koncentraci 200 mg/l, doba

7,03

23,24

24,32

21,13

19,19

18,02 15,58

26,06

16,52 14,87

16,07

10,36

12,90

50

11,59

100

6,58

4,84

150

9,34

200

5,87 arbutin

4,38

250

2,84

Vol tage [m V]

odběru 168 hodin

0 5

10

15

20

50

25

30

35 T ime [min.]

6. D ISKUSE Jednou z moţností vyuţití rostlinných tkáňových kultur ve farmaceutickém průmyslu je produkce sekundárních metabolitů rostlin – často velmi významných terapeutických látek, jejichţ získávání je mnohdy jinými postupy značně sloţité, finančně náročné a z hlediska ekologických dopadů na danou rostlinnou populaci také často nemoţné. Výhodami takto pěstovaných tkáňových kultur jsou přesně definované a kontrolované podmínky kultivace bez závislosti na ročních obdobích, změnách klimatu či rizicích spojených se škůdci. Řízené podmínky kultivace umoţňují biotransformační přeměnu různých prekurzorů na ţádané produkty. Pro úspěšné vyuţití daného postupu v praxi je nutné získat přesné informace o odvození tkáňové kultury z rostlinného materiálu, samotných parametrech kultivace (optimalizace ţivného média, volba prekurzorů, elicitorů a nastavení dalších kultivačních podmínek), zjištění přesného spektra produkovaných metabolitů a v neposlední řadě také o převedení postupů z laboratorních podmínek do průmyslové výroby a ekonomizaci celého procesu. Všechny výše zmíněné úkoly se tak stávají předmětem velmi sloţitého, nákladného a časově náročného výzkumu. Na katedře farmaceutické botaniky a ekologie jiţ řadu let probíhá výzkum zabývající se produkcí terapeuticky významných sekundárních metabolitů pomocí tkáňových kultur různých druhů rostlin. Úkolem této diplomové práce bylo ověření biotransformačních schopností tkáňové kultury Centella asiatica (L.) po přidání exogenních prekurzorů arbutinu (hydrochinonu, tyrosinu, kyseliny p-kumarové a 4-hydroxybenzoové, v koncentracích 200 mg/l) do ţivného média. Jako moţné produkty jsme sledovali arbutin, methylarbutin, hydrochinon a 4-methoxyfenol. Ţádná z těchto látek není pokusné rostlině vlastní. Pokusy byly prováděny za světla, jak v suspenzních tkáňových kulturách, tak v kulturách kultivovaných v tekutém ţivném médiu na můstcích z filtračního papíru. Doba působení prekurzorů arbutinu byla 6, 12, 24, 48 a 168 hodin v případě suspenzních tkáňových kultur a 12 a 48 hodin při kultivaci na můstcích. Dva pouţité časové intervaly u můstkové kultury byly doplněním předchozích pokusů, které musely být v předešlých letech z technických důvodů přerušeny. [61]

51

Produkce metabolitů byla hodnocena kvalitativně pomocí tenkovrstvé chromatografie (TLC) a kvantitativně pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) a to jak v kalusech, tak v ţivném médiu. Pouţitá analytická metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) pak zároveň ověřila výsledky získané pomocí tenkovrstvé chromatografie (TLC). V extraktech kalusů byla TLC analýzou prokázána přítomnost arbutinu a to po přidání jeho prekurzoru hydrochinonu. (tab. 5) Pozitivní záznam na chromatogramu byl zaznamenán ve všech sledovaných časech. Tyto výsledky pak byly analýzovány pomocí HPLC, která přítomnost arbutinu potvrdila pouze u suspenzních kultur. (obr. 3-7) Bylo zjištěno, ţe se mnoţství arbutinu zvyšuje s délkou působení prekurzoru (hydrochinonu) během kultivace (tab. 9, obr. 8). Maximální koncentrace arbutinu (0,043 %) bylo dosaţeno při délce kultivace 48 hodin. Při delší době kultivace (168 hodin) byl pak zaznamenán pokles koncentrace arbutinu v extraktu kalusu (0,038 %) a byla detekována přítomnost arbutinu v ţivném médiu (0,096 %), do kterého se z kultury transportoval. (tab. 1, obr. 9) Při pouţití jiných prekurzorů arbutinu jejich schopnost transformace na arbutin prokázána nebyla. Přidávaný prekurzor arbutinu – hydrochinon byl kulturou zcela biotransformován, coţ dokazuje jeho nepřítomnost jak v extraktu, tak v půdě. (tab. 1, 5) Naše kultura tedy pravděpodobně veškerý hydrochinon transformovala, na rozdíl od kultur Datura meteloides a Datura innoxia, jejichţ transformační schopnosti byly předmětem zkoumání předchozích let. Při těchto pokusech byla transformována jen část přidávaného hydrochinonu. [62] Podobných výsledků bylo dosaţeno i při paralelně prováděných pokusech, při kterých byla pouţívána poloviční koncentrace hydrochinonu – 100 mg/l. [63] Při těchto pokusech koncentrace arbutinu stoupala s časem a maxima dosáhla aţ při nejvyšším sledovaném čase – 168 hodin (0,043 %). Pokles mnoţství arbutinu v kalusu a jeho přítomnost v ţivném médiu nebyla v tomto případě zaznamenána. Ani v této práci nebyla při pouţití dalších prekurzorů jejich schopnost transformovat se na arbutin prokázána. Vyšší produkce arbutinu bylo v minulosti dosaţeno na katedře farmaceutické botaniky a ekologie při pokusech s kulturou Datura meteloides, která po přidání hydrochinonu a týdenní kultivaci produkovala 7,4 % arbutinu, coţ odpovídá přibliţnému mnoţství v intaktní rostlině Arctostaphylos uva-ursi, který se pohybuje mezi 3-12 %. [64] 52

Dalších výrazně pozitivních výsledků pak bylo ve stejné práci dosaţeno i u kultury Schizandra chinensis, která rovněţ po týdenní kultivaci při pouţití hydrochinonu jako prekurzoru produkovala 5,08 % arbutinu. V této konkrétní pokusné variantě docházelo navíc i k uvolňování arbutinu do ţivného média a to v koncentraci 0,18 %. [64] Japonští vědci společnosti Shiseido s vyuţitím buněčné kultury Catharanthus roseus postupným vývojem optimálních podmínek a typu fermentoru dosáhli extracelulární koncentrace arbutinu přibliţně 1 % a navíc byl tento extracelulární arbutin i lehce extrahovatelný z filtrátu. [65] Po přidání hydrochinonu jako prekurzoru pro biotransformaci na arbutin bylo při vyuţití suspenzních kultur Catharanthus roseus v jiné práci dosaţeno výtěţku dokonce 9,2 g/l arbutinu a to jiţ po 4 dnech kultivace. [66] Při pouţití suspenzní kultury Rauwolfia serpentina pak bylo jinými vědci dosaţeno dokonce produkce arbutinu 18 g/l – po týdenní kultivaci (168 hodin) s kontinuálním přidáváním hydrochinonu. [67] Tato práce a práce mé kolegyně [63] navazovaly na o rok starší experimenty na můstkových kulturách, které ověřovaly biotransformační schopnosti Centella asiatica po přidání prekurzorů arbutinu v koncentracích 100 a 200 mg/l a časech odběrů 6, 12 a 168 hodin. [61] Během nich byla pomocí HPLC potvrzena přítomnost arbutinu jako produktu transformace hydrochinonu ve všech sledovaných časech a obou pouţitých koncentrací. Maximálního výtěţku (0,504 %) bylo dosaţeno při kultivaci 168 hodin a pouţití vyšší koncentrace hydrochinonu – tedy 200 mg/l. V porovnání se všemi výše uvedenými výsledky jsou námi nalezené hodnoty arbutinu niţší. To mohlo být způsobeno stářím kultury Centella asiatica (čísla pasáţí 2631), enzymatickou výbavou jednotlivých rostlinných druhů a podobně. Při pouţití dalších prekurzorů arbutinu – tyrosinu, kyseliny 4-hydroxybenzoové a p-kumarové tedy nebyla analytickou metodou HPLC přítomnost arbutinu prokázána. Tyrosin a kyselina 4-hydroxybenzoová však byly s úspěchem na arbutin transformovány v předchozích pokusech prováděných na našem pracovišti a to při pouţití kultur Bellis perennis, Bergenia crassifolia, Brassica oleracea, Coronilla varia, Leonurus cardiaca, Leuzea carthamoides, Rheum palmatum, Rhodiola rosea a Datura meteloides. [64] Závěrem lze konstatovat, ţe předmětem dalších pokusných variant s cílem zvýšit produkci arbutinu by mohlo být další zvýšení koncentrace hydrochinonu, pouţití nově odvozené kultury nebo změny ve sloţení ţivného média. 53

7. Z ÁVĚR 1. Byla prokázána schopnost suspenzní kultury Centella asiatica biotransformovat hydrochinon na arbutin.

2. Přítomnost arbutinu byla analyzovaná pomocí TLC a následně potvrzena pomocí HPLC při všech sledovaných časových intervalech. Maximální koncentrace byla zjištěna při odběru po 48 hodinách kultivace (0,043 %).

3. Přítomnost arbutinu byla v jednom případě zaznamenána i v ţivném médiu (0,096 %) – a to v čase odběru 168 hodin, kdy byl naopak v extraktu kultury zaznamenán jeho pokles (0,038 %).

4. Biotransformační pokusy s dalšími prekurzory arbutinu (tyrosinem, kyselinou p-kumarovou a 4-hydroxybenzoovou) nebyly úspěšné.

5. Biotransformační schopnost můstkových kultur potvrzena nebyla.

54

8. A BSTRAKT Kostřiba J.: Explantátové kultury vyšších rostlin 27. Diplomová práce, Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra farmaceutické botaniky a ekologie, 2007, s. 61

Práce byla zaměřena na biotransformaci exogenních prekurzorů arbutinu in vitro kulturou Centella asiatica (L.). Do ţivného média byly přidávány prekurzory arbutinu (hydrochinon, tyrosin, kyselina p-kumarová, kyselina hydroxybenzoová). Koncentrace prekurzorů byla 200 mg/l a doba působení prekurzorů byla 6, 12, 24, 48 a 168 hodin (1 týden). Pokusy byly prováděny za světla, jak v suspenzních tkáňových kulturách, tak v kulturách kultivovaných v tekutém ţivném médiu na můstcích z filtračního papíru. Pozitivních výsledků (jak TLC tak HPLC analýzou) v produkci arbutinu bylo získáno u všech suspenzních kultur při pouţití hydrochinonu. Maximální koncentrace arbutinu v kalusu byla zjištěna při odběru po 48 hodinách kultivace (0,043 %). Po 168 hodinové kultivaci bylo mnoţství arbutinu pouze 0,038 %. V této pokusné variantě byl arbutin uvolňován také do ţivného média, kde byla naměřena jeho koncentrace 0,096 %. Biotransformační pokusy s dalšími prekurzory arbutinu nebyly úspěšné. Moţnost efektivního pouţití můstkové kultury pro potřeby biotransformace potvrzena nebyla. Kostřiba J.: In vitro cultures of higher plants XXVII. Diploma Paper, Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, Department of Pharmaceutical Botany and Ecology, 2007, p. 61

The work aimed at biotransformation of exogenous precursors of arbutin with in vitro cultures of Centella asiatica (L.). The precursors of arbutin were added into the medium (hydroquinone, tyrosine, p-coumaric acid, hydroxybenzoic acid). The precursors were used in a concentration of 200 mg/l and the period of their action was 6, 12, 24, 48 and 168 hours (1 week). The cultivation of calluses was created by two different ways – by suspension culture and by culture cultivated on the filter-paper bridge. The cultivation was prosecuted on the light. Positive results (both TLC and HPLC analysis) in arbutin production were obtained in all suspension cultures after an addition of hydroquinone. The largest amount of arbutin in callus cultures was measured after a 48 hours cultivation (0,043 %). After a 168 hours cultivation was amount of arbutin only 0,038 %. In this experimental variant arbutin was also released into the medium (0,096 %). Biotransformation experiments with the others precursors of arbutin were not successful. The way of cultivation by the filter-paper bridges was also unsuccessful.

55

9. P OUŢITÁ L ITERATURA 1. Hubík J., Dušek J., Spilková J.: Farmakognosie – I. (Obecná část a primární látky). SPN, Praha (1989) 2. Stockigt J., Oblitz P., Falkenhagen H., Lutterbach R., Endeß S.: Natural products and enzymes from plant cell cultures. Springer Netherlands, Amsterdam (1995) 3. Vaněk T.: Produkce sekundárních metabolitů tkáňovými kulturami vyšších rostlin. Chem. listy 83, 288 (1989) 4. Tabata M.: Recent advances in the production of medicinal substances by plant cell cultures. In Barz W., Reinhard E., Zenk M. H. (eds.), Plant tissue culture and its biotechnological application, Springer-Verlag, Berlin (1977), s. 3 5. Yeoman M. M., Miedzybrodzka M. B., Lindsey K., McLauchlan W. R.: Production of some secondary products from date palm tissue cultures (semi cultivar) using some precursor 2 – Embryogenesis stage. In Sala F., Parisi B., Cella R., Cifferi O. (eds.), Plant cell cultures. Rusults and perspectives, Elsevier, Amsterdam (1980), cit. dle [6] 6. Barešová H.: Produkce sekundárních metabolitů v tkáňových kulturách rostlin. Biol. listy 51, 103 (1986) 7. Macek T.: Vyuţití explantátových kultur vyšších rostlin. Bull. Českoslov. spol. biochem. ČSAV a Sloven. biochem. spol. SAV 11, 3 (1971) 8. Partlová I.: Studium druhu Drosophyllum lusitanicum Link. v kultuře in vitro a moţnosti produkce naftochinonového derivátu plumbaginu. Disertační práce, Univerzita Komenského, Farmaceutická fakulta, Bratislava (1995) 9. Pastýrik L.: Fyziológia rastlín. SNP, Bratislava (1979), cit. dle [8] 10. Řeřábek J., Opatrný Z.: Kultury rostlinných explantátů in vitro (Historie, problematika a návrh terminologie). Biol. listy 36, 206 (1971)

56

11. Butenko R. G.: Kultura izolirovanych organov, tkanej i kletok rastenij. Izd. Nauka, Moskva (1970) 12. Nádaská M.: Vyuţitie rastlinných bunkových kultúr pre produkciu a získavanie sekundárnych prirodných látok. Biol. listy 56, 81 (1991) 13. Hudák J., Dvořák M., Herichová A., Lux A., Nátr L., Peterková J.: Biológia rastlin. Slovenské pedagogické nakladatelství, Bratislava (1991) 14. Sikyta B.: Biotechnologie ve farmacii. Avicenum, Praha (1987) 15. Blaţek J.: Nezbytné předpoklady pro práci s tkáňovými kulturami. ČSVTS ÚOCHB a ÚEB ČSAV, Praha (1985) 16. Heller R.: Recherches sur la nutrition minerale des tissue végétaux cultivés in vitro. Ann. Sci. Biol. Vég. 14, 1 (1953) 17. White P. R.: The cultivation of animal and plant cells. Ronalds Press Comp., New York (1954), cit. dle [8] 18. Murashige T., Skoog F.: A revised medium for rapid growth and bio assays tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473 (1962) 19. Pierik, R. L. M.: In Vitro Culture of Higher Plants. Martinus Nijhoff Publisher, Dordrecht (1987) 20. Mc. Carthy J. J., Ratcliffe D., Street H. E.: The effect of nutrient medium composition on the growth cycle of Catharanthus roseus G. Don cells grown in batch culture. J. Exp. Bot. 31, 1315 (1980) 21. Gamborg O. L., Shyluk J. P.: Nutrition, media and characteristics of plant cell and tissue cultures. In Thorpe T. A. (ed.), Plant tissue culture – Methods and applications in agriculture. Academic Press, New York (1981), s. 21 22. Koblitz H.: Zell und gewebezüchtung bei pflanzen. G. Fischer-Verlag, Jena (1972) 23. Dodds H., Roberts L. W.: Plant tissue culture. Cambridge University Press, New York (1985) 57

24. Huang L. C., Murashige T.: Plant tissue culture media. Tissue Culture Assoc. Manual 13, 539 (1977), cit. dle [8] 25. Procházka S., Šebánek J.: Regulátory rostlinného růstu. Academia, Praha (1997) 26. Eriksson T.: Studies on the growth requirements and growth measurement of cell cultures of Haplopappus gracilis. Physiol. Plant. 18, 976 (1965) 27. Kohno H., Yoshida F.: Cultures of chlorophylous tobacco-cell not requiring any organic additives except sucrose in the medium I. Effect of light and temperature on the growth of the cells. Plant Cell Physiol. 18, 907 (1977) 28. Wink M., Hartmann T.: In Abstr. V. Intern. Congress Plant Tissue Cell Culture. Tokyo (1982), s. 75, cit. dle [8] 29. Martin S. M.: Mass culture systems for plant cell suspensions. In Staba J. E. (ed.), Plant tissue culture as a source of biochemicals, CRC Press, Boca Raton (1980), s. 149 30. Staba J. E.: Tissue culture and pharmacy. In Reinert J., Bajaj Y. P. S. (eds.), Plant cell, tissue and organ culture, Springer-Verlag , Berlin (1977), s. 694 31. Dušek J., Dušková J., Tůmová L., Spilková J.: Biotechnologické vyuţití kultur vyšších rostlin in vitro. Čes. slov. Farm. 45, 209 (1996) 32. Luckner M., Nover L., Böhm H.: Secodary metabolism and cell differentiation. Springer-Verlag, Berlin (1977), s. 92, cit. dle [8] 33. Suchý V.: Farmakognosie – část všeobecná. Univerzita Komenského, Bratislava (1994) 34. Stohs S. J.: Metabolism of steroids in plant tissue cultures. In Barz W., Reinhard E., Zenk M. H. (eds.), Plant tissue culture and its bio-technological application. Springer-Verlag, Berlin (1977), s. 142 35. Kováč J.: Explantátové kultury rostlin. Přírodovědecká fakulta Univerzity Palackého, Olomouc (1995)

58

36. Charlwood B. V., Rhodes M. J. C.: Secondary products from plant tissue culture. Clarendon Press, Oxford (1988) 37. Hara Y., Morimoto T., Fujita Y.: Production of shikonin derivates by cell suspension cultures of lithospermum erythrorhizon. Plant Cell Rep. 6, 8 (1986), cit. dle [8] 38. Darvill A. G., Albersheim P.: Structure and function of the primary cell of plants. Ann. Rew. Plant Physiol. 35, 243 (1984) 39. Constabel F., Eilert U.: Elicitation of product accumulation. Newsletter 50, 1 (1986) 40. Seabrook J. E. A.: Organ culture. In Staba J. E. (ed.), Plant tissue culture as a source of biochemicals, CRC Press, Boca Raton (1980), s. 99, cit. dle [6] 41. Thorpe T. A.: Physiological and biochemical aspects of organogenetic in vitro. In Thorpe T. A. (ed.), Frontiers of plant tissue culture, Calgary Press, Calgary (1978), s. 49 42. Tal M.: Polyploidy in species populations. In Lewis W. H. (ed.), Polyploidy, Plenum Press, New York (1980), s. 61 43. Sikyta B., Dušek J.: Biotechnologie pro farmaceuty. Univerzita Karlova, Praha (1992) 44. Alfermann A. W., Reinherd E.: Plant cell cultures: Results and perspectives. Elsevier, Amsterdam (1980), s. 399 45. Jones A., Veliký I. A., Ozubko R. S.: Biotransformation of cardenolides by plant cell suspension culture. Biotechnologia 41, 476 (1978) 46. Dušková J., Jahodář L., Dušek J.: Arctostaphylos uva-ursi (L.), Spreng. a cv. arbuta in vitro – studium vlivu prekurzorů. Čes. slov. Farm. 39, 452 (1990) 47. Dostálová M.: Centella asiatica. Rigorózní práce, Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Hradec Králové (2005)

59

48. Takhtajan A.: Diversity and classification of flowering plants. Columbia university press, Columbia (1986), s. 588, cit. dle [47] 49. Shah C. S., Quadry J. S.: Text book of Pharmacognosy. Prakashan, Ahmedabad (1985), cit. dle [47] 50. Centella asiatica selected triterpenes. A highly standardized natural remedy for the maintenance of an healthy venous system. Propagační broţura firmy Indena (www.indena.it), Milano (1998), cit. dle [47] 51. Sukhder S. H., Deepak M., Anupam K. M.: Joint Publication of regional research laboratory (Council of scientific and industrial research, Jammu Tawi and Indian drug manufacturers Association, Mumbai). Indian Herbal Pharmacopieia 1, 47, Mumbai (1998) 52. Kolektiv autorů: Pharmacopoea Europea 4th Edition, Council of Europe, Strasbourg Cedex, Francie (2001), s. 862 53. Kolektiv autorů: Český lékopis 2002, Grada (2002), s. 1912 54. Dušková J., Dušek J., Jahodář L., Poustka F.: Arbutin, Salicin – moţnosti jejich biotechnologické produkce. Čes. slov. Farm. 54, 78 (2005) 55. Hubík J., Dušek J., Spilková J., Šícha J.: Obecná farmakognosie – II. (sekundární látky). SPN, Praha (1989), s. 14 56. Quintus J., Kovar K.A., Link P., Hamacher H.: Urinary excretion of arbutin metabolites after oral administration of bearberry leaf extracts. Planta Medica 71, 147 (2005) 57. Strapková A., Jahodář L., Nosáľová G.: Antitussive effect of arbutin. Pharmazie 46, 611 (1991) 58. Sugimoto K., Nomura K., Nishimura T., Kiso T., Sugimoto K., Kuriki T.: Syntheses of alpha-arbutin-alpha-glycosides and their inhibitory effects on human tyrosinase. J. Biosci Bioeng 99, 272 (2005)

60

59. Boissy R. E., Visscher M., DeLong M. A.: DeoxyArbutin: a novel reversible tyrosinase inhibitor with effective in vivo skin lightening potency. Exp. Dermatol. 14, 601 (2005) 60. Kolektiv autorů: Český lékopis 2002, Grada (2002), s. 399 61. Vránová M.: Explantátové kultury vyšších rostlin 25. Diplomová práce, Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Hradec Králové (2006) 62. Dušková J., Jahodář L., Dušek J.: Neue Möglichkeiten der Produktion von Arbutin durch Gewebekulturen. Pharmazie 49, 624 (1994) 63. Lukášková M.: Explantátové kultury vyšších rostlin 28. Diplomová práce, Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Hradec Králové (2007) 64. Dušková J., Dušek J., Jahodář L.: Zur Biotransformation von Hydrochinon zu Arbutin in den in vitro Kulturen. Herba Pol. 45, 23 (1999) 65. Yokoyama M., Yanagi M.: In Komamine A., Misawa M., DiCosmo F. (eds.), Plant Cell Culture in Japan, CMC Co., Tokyo, Japan (1991), s. 79 66. Inomata S., Yokoyama M., Seto S., Yanagi M.: High-level production of arbutin from hydroquinone in suspension cultures of Cataranthus roseus plant cells. Appl. Microbiol. Biotechnol. 36, 315 (1991) 67. Lutterbach R., Stöckigt J.: High-yield formulation of arbutin from hydroquinone by cell-suspension cultures of Rauwolfia serpentina. Hel. Chim. Acta 75, 2009 (1992)

61