Buněčné kultury
Primární kultury - odvozené přímo z excise tkáně • • • •
buněčné linie z různých organizmů, tkání explantované kultury jednobuněčné suspense lze je udržovat jen po omezenou dobu během kultivace ztrácejí diferenciační charakteristiky, které mají in vivo
Buněčné kultury Kontinuální kultury • jednobuněčný typ kultury • jsou udržované pasážováním limitovaný počet pasáží (přibližně 30 – 50, replikativní senescence) • diploidní počet chromosomů, určitý stupeň diferenciace pasážovatelné bez omezení –transformované (nádorové buňky) • odvozené z nádorových tkání klinických případů • transformované virovým onkogenem, chemickým kancerogenem ….
Buněčné kultury Závislost na tkáni, ze které byly získané → suspense, monolayer Suspensní forma – leukemie, lymfomy Monolayer → růst na podložce; buňky k sobě přiléhají – fibroblasty, solidní nádory (viz monolayer HeLa buněk / karcinom děložního čípku – pasážované více než 50 let)
Monolayer
Buněčné kultury Kultivace normálních buněk • Kontaktní inhibice • Omezený počet generací • Typické antigenní determinenty • Aerobní metabolismus • Nutnost růstových faktorů v mediu • Diploidní počet chromosomů • Specifický buněčný tvar
Kultivace nádorových buněk • Ztráta kontaktní inhibice • Neomezený růst – kultura je nesmrtelná • Změny v povrchových antigenech (MHC, TSTA, fetální antigeny …) • Anaerobní metabolismus • Nízké nároky na růstové faktory v kultivačním mediu • Změněný počet chromosomů
Kultivace buněk • Sterilní podmínky • Nutriční požadavky • Definované typy medií – dostupné komerčně Balancovaný roztok anorganických solí - obohaceno karbohydráty, vitaminy, proteiny a peptidy, lipidy a mastnými kyselinami, stopové prvky, serum • Ph 7.2–7.4 (7.0-7.7), pufrovaný systém (indikátor bikarbonát): • CO2, atmosféra: 5-10% CO2 • chemicky (HEPES) – nepotřebují CO2 atmosféru • Teplota • Uchovávání – zmrazení (méně než –135oC – tekutý nitrogen), kryoprotektiva
Cytogenetické vyšetření
• • • • • •
Lymfocyty Fibroblasty Buňky kostní dřeně Trofoblasty Buňky plodu izolované z amniové tekutiny Nádorové buňky …..
TKÁŇOVÉ (buněčné) KULTURY Práce ve sterilním prostředí
TKÁŇOVÉ KULTURY Kultivace buněk v definovaném prostředí
HeLa buňky Proliferující buňky - monolyer
Zánik kultivovaných buněk - apoptóza
Metoda FISH FISH – spojení postupů klasické cytogenetiky a technologie molekulární genetiky • • • •
jednovláknová (denaturovaná) sonda DNA vazba k cílové sekvenci na principu komplementarity použití v interfázi i mitóze sonda označena fluorochromem (Texas Red, FITC …)
• sondy centromerické – alfa satelitní sekvence DNA přítomné v oblasti centromery (počet chromosomů) • sondy lokus-specifické – váží se na vybraný lokus (mikrodelece, translokace) • sondy malovací (celochromosomové) – směs fragmentů DNA konkrétního chromosomu, nelze použít v interfázi, pouze v metafázi (strukturní aberace – inserce, translokace, marker chromosomy, ring-chromosomy)
Karyotyp – norma, G-pruhování
FISH – mnohobarevné pruhování
Sarkom kosterního svalu-hypotetraploidie okrouhlé až vřetenovité maligní buňky
mitoticky aktivní
Multispektrální analýza - cytogenetická metoda využívající přístupy molekulární genetiky Přesná identifikace každého chromosomu, chromosomových párů • původ rekombinovaných chromosomů, které se často nacházejí v nádorových buňkách •zpracování vyžaduje použití několika technik založených na poznatcích fyziky, chemie (Fourierova spektroskopie) •přístrojové vybavení - zařízení pro zobrazení spektra barev vybuzeného elektrickým nábojem, optický mikroskop
SPEKTRÁLNÍ KARYOTYPOVÁNÍ (a) Normální lidský karyotyp - každý chromosom má odlišné zbarvení. (b) Spektrální karyotypování chromosomů otce a dítěte s mentální retardací. Translokace mezi chromosomem 1 a 11. (c) ataxia (postižení svalů), translokace mezi chromosomy 4 a 12. (d) Náhodné chromosomální přestavby v buňkách nádoru prsu.
Chromosomální přestavby v buňkách nádoru
• Nádorové buňky mívají změněný počet a strukturu chromosomů • Heteroploidní, pseudodiploidní počet chromosomů • Chromosomální přestavby - delece, translokace, marker chromosomy, ring chromosomy, isochromosomy ….. • Změny v karyotypu → náhodné, nenáhodné
Nádor plic – mnohočetné náhodné přestavby
Náhodné chromosomální přestavby - nádor prsu Vyšetření chromosomů buněk nádoru prsu – mnohočetné náhodné strukturní přestavby Karyotyp charakterizuje závažnost onemocnění, naznačuje prognózu, je vodítkem pro volbu terapie
Nenáhodné chromosomální přestavby v buňkách nádoru prsu Metoda FISH Protoonkogen Her-neu •kóduje receptor pro epidermální růstový faktor s tyrosinkinasovou aktivitou •amplifikace Her-neu Prognostický a diagnostický marker u karcinomů prsu i dalších nádorů (např. nádory močového měchýře)
Centromera – zeleně
Her-neu - červeně
N-myc - neuroblastom Amplifikace sekvence DNA • a) homogenně zbarvené oblasti (HSR) • b) samostatné útvary - double minutes • diagnostický a prognostický marker • rodina protoonkogenů myc (virus myeloblastózy kuřat) • N-myc – neuroblastom • L-myc – malobuněčné karcinomy plic
Rodina protoonkogenů myc Rodina protoonkogenů myc regulace buněčného cyklu - geny časné odpovědi • aktivace např. růstovými faktory amplifikace genu – nenáhodná změna (kvantitativní změna – zvýšené množství produktu)
Růstové faktory
Kontaktní inhibice
Nenáhodná chromosomální přestavba malobuněčný karcinom plic Diagnostika metodou FISH • Mnohočetné kopie protoonkogenu L- myc • Nepříznivá prognóza • Mnohonásobná amplifikace tvoří „oblak“, jednotlivé signály jsou nesnadno detekovatelné
Chronická a akutní myeloidní leukemie •Chromosomální diagnostika •Molekulární diagnostika •Detekce BCR-ABL fuzního genu a jeho transkriptu
Chronická myelogenní leukemie (CML) Filadelfský chromosom (Ph)
Filadelfský chromosom
Filadelfský chromosom Filadelfský (Ph) chromosom - reciproká translokace mezi chromosomem 9 a 22 Nenáhodný cytogenetický marker u 90% případů chronické myeloidní leukemie (CML) a u 5 -20%případů akutní lymfocitární leukemie (ALL) 5% Ph negativních pacientů - cryptický fuzní gen BCR-ABL detekovatelný metodami molekulární genetiky 2.5% CML pacientů - negativní pro Ph chromosom i pro BCR-ABL fuzní gen Translokace - fuzní gen BCR-ABL, zlom v BCR ("breakpoint cluster region") genu na chromosomu 22 a ABL (Abelson onkogen) genu na chromosomu 9
Produkt fuzního genu je protein 210 kD, má transformační schopnosti
Burkittův lymfom
Burkittův lymfom translokace [der(8;14), der(2;8), der(8;22)] Translokace protoonkogenu myc do oblasti s vysoce aktivním promotorem
Translokace protoonkogenu c-myc [der(8;14)]
Genetický čip • DNA čip - 1.5 x 1.5 cm křemíková nosná destička s mřížkou (v plastové kazetě) • Uměle syntetizované krátké jednovláknové řetězce DNA o známé sekvenci nukleotidů (oligonukleotidové próby); až několik milionů • Analyzovaný vzorek jednořetězcové DNA označené fluorescenčním barvivem • Snímání skenerem, počítačová analýza • Testování aktivity genů (intenzita záření jednotlivých prób po hybridizaci) • Využití: genetika, farmakologie, imunologie, mikrobiologie (genové profily virů a bakterií)
DNA čipy - microarrays • Moderní metoda analýzy DNA v několika lokusech současně • Genové čipy obsahují velké množství sond, které hybridizují s různými oblastmi genomu • Využití nanotechnologií – manipulace se vzorky probíhá převážně roboticky a vyhodnocení je softwarové Klony DNA
Testovaný vzorek
Referenční vzorek
Reverzní transkripce Fluorescenční barvivo
PCR amplifikace Purifikace
Počítačová analýza Hybridizace na mikrodestičce
