zimní semestr 2008/2009
Pěstování pokusných rostlin Přednáška 8. Metody testování osiva
A. Generativní reprodukce: opylení oplození (vznik embrya, endospermu) semeno (standardní diaspora) dormance klíčení semenáček (klíčenec) – juvenilní fáze
důsledkem je genetická diverzita
Pohlavní (generativní) rozmnožování
vznik nových jedinců je výsledkem pohlavního procesu – splynutí pohlavních buněk (gamet), dochází ke splývání cytoplasmy i jader obou gamet, pouze chromozomy nesplývají – zygota má diploidní počet chromozomů střídání jaderných fází: oplození 2n redukční dělení (meioza) n gametofyt, sporofyt krytosemenné rostliny: gametofyt potlačen, je nesamostatnou částí sporofytu
Krytosemenné rostliny
Na megasporofytu (pestík) vznikají megasporangia - vajíčka, a haploidní megaspory. Megaspora dává vznik samičímu gametofytu (zárodečnému vaku) s jednou nebo více oosférami Na mikrosporofytech (tyčinky) vznikají v mikrosporangiích (prašných pouzdrech) mikrospory. Mikrospory dávají vznik samčím gametofytům (vícebuněčným pylovým zrnům), které obsahují samčí gamety (buňky spermatické)
Témata související se vznikem semen a plodů:
podmínky přechodu do reprodukční fáze: jarovizace, fotoperiodická indukce kvetení, funkce giberelinů věk rostlin opylení, apomixis, partenokarpie
Semena
embryo (oosféra + gener. buňka pyl. láčky) – v různém stupni diferenciace (mrkev – málo, hrách – vysoce diferencované): embryonální osa + děloha plumula (embryonální vegetační vrchol), případně základy listů radikula (embryonální vegetační vrchol kořene) endosperm (2n jádro + gener. buňka pyl. láčky) semena s endospermem (mák, Poaceae) semena bez endospermu (Cucurbitaceae) např. u Poaceae – aleuronová vrstva – živé buňky perisperm z nucellu (2n) – vnitřní bílek zásobní pletivo pro výživu embrya testa – osemení (z vaječných obalů)
fytohormony
Voda v semenech vliv na všechny vývojové fáze semen: formování a zrání stav klidu bobtnání a klíčení Semena podle tolerance k vyschnutí: většina kulturních rostlin vyžaduje pro úplný vývoj fázi vyschnutí, obsah vody se ustálí v rovnováze s prostředím, mnoho druhů si udrží schopnost klíčit po dlouhé období. U nás běžně pěstované druhy plodiny – obsah vody 5 – 10 – 15 – 18% Semena procházející fází vyschnutí – ortodoxní Tropy – zralá semena obsahují 20 – 40% vody, při poklesu vlhkosti ztrácejí klíčivost – semena rekalcitrantní (Coffea arabica, citrusy, někdy Passiflora)
Dormance semen = stav, ve kterém jsou semena chráněna před klíčením v prostředí, které je normálně pro klíčení nepříznivé, jde o přirozený fyziologický stav naproti tomu quiescence = klid vynucený podmínkami prostředí (suchá semena v suchu, velmi nízká teplota)
1. dormance primární: exogenní endogenní 2. dormance sekundární
Primární exogenní dormance semen Dormance primární (vyvolána v průběhu vývinu semene): exogenní - semenu nejsou dostupné základní podmínky pro klíčení (voda, kyslík), příčina – semenné obaly: 1. zábrana příjmu vody - tzv. tvrdá semena (Fabaceae, Malvaceae, Liliaceae) – anatomická stavba semenných obalů, vliv genetický, podmínky při dozrávání, které ovlivňují rychlost vysychání (větší výskyt tvrdých semen obvykle souvisí se stresovými vláhovými podmínkami při dozrávání, i během posklizňové úpravy (rychlost a teplota sušení) 2. zábrana výměny plynů a odvodu inhibičních látek z embrya – např. u semen některých peckovin a jádrovin s obsahem amygdalinu – kyanovodík nemůže unikat a inhibuje klíčení, nebo mechanický odpor obalů, kdy semeno nemá dostatek energie k proniknutí tkáněmi obalových vrstev (salát, rajče, celer)
Způsoby odstranění primární exogenní dormance: v přírodě – činností mikroorganismů nebo fyzikálními změnami v půdě (zamrzání, rozmrzání), změnami pH úprava semen: 1. skarifikace – mechanické narušování semenných obalů, teplotními šoky, krátkým ponořením do vroucí vody, působením radiace 2. chemicky – slabý roztok H2SO4,NaCl, H2O2, po aplikaci nutno omýt a osušit 3. selektivními enzymy – celuláza, pektináza kritický faktor – délka expozice
Primární endogenní dormance semen je výsledkem vrozených vlastností semen, odpovídá druhovým a odrůdovým charakteristikám je ovlivněna podmínkami prostředí v období vývinu semen a zrání hlavní složky endogenní dormance: přítomnost inhibičních látek (ABA, kumarin, kys. ferulová, fenolové kyseliny, kys. abscisová), přítomnost org. kyselin v dužnatých plodech (např. rajče), silice – např. petržel, kmín, fenykl tvorbu a obsah inhibitorů klíčení ovlivňuje: 1. délka dne v závěru zrání semen: dlouhý den indukuje dormanci u Beta vulgaris, Amaranthus retroflexus, Lactuca sativa, vznikají také tvrdší obaly 2. vláhové podmínky – vodní deficit a doba kdy k němu dojde (např. u ječmene po kvetení dormanci aktivuje, ale ke konci zrání působí opačně) 3. pozice semene na rostlině a v květenství – např. u Apiaceae – nejsilnější dormance u okolíků 1. řádu 4. stáří mateřské rostliny v době kvetení – souvisí s výživou dusíkem a vláhovými podmínkami 5. teploty v době zrání
Metody odstranění primární endogenní dormance: 1.
2.
3.
4.
vyluhování látek – např. u řepy; také semena rajčat klíčí po jejich odstranění z plodu - šťáva působí jako osmotická inhibice teplotní ošetření – změní se poměr mezi stimulátory a inhibitory klíčení – u semen nabobtnalých za nízkých teplot, u semen suchých za vyšších teplot stratifikace semen – nabobtnalá semena jsou vystavena nízké teplotě (peckoviny, jabloně, javor, lísky, hloh, buk, jasan, smrk, borovice) ošetření fytohormony - gibereliny
Stratifikace semen peckovin
Dormance sekundární nově vyvolaný výskyt dormance u zralých, nedormantních semen v podmínkách nepříznivých pro klíčení termodormance fotodormance – vliv světla (např. salát – určité světelné spektrum) skotodormance – vliv tmy vliv vody, obsah některých plynů apod. indukce dormance může nastat i několika cyklech během skladování semen nejčastěji je dormance spojována s chováním semen plevelů a planě rostoucích druhů v půdě periodické změny v sekundární dormanci jsou vysvětlením pro postupné vzcházení některých plevelů v průběhu roku
Stárnutí (senescence), deteriorace a ztráta životaschopnosti deteriorace – postupné snižování kvality semen druhové a odrůdové rozdíly nové poznatky fyziologie – deteriorace osiva není nezvratný proces kvalitativních změn Coolbeat (1995) – při dobrých skladovacích podmínkách se může v semenech aktivovat mechanismus, který může tento proces zvrátit
Projevy deteriorace semen Abddul-Baki a Anderson (1972): snižuje se intenzita dýchání snižuje se celková aktivita enzymatické činnosti mění se poměr zásobních látek v semeni, narůstá podíl polyfenolů nastávají změny struktury buněčných membrán, které zvyšují citlivost semen na podmínky prostředí při klíčení a vzcházení dochází ke změnám v syntéze nových látek dochází ke změnám genetického aparátu – zvyšuje se podíl mutací akumulace toxických metabolitů projevy: např. tmavnutí obalových vrstev každý genotyp má kritickou mez, kolik buněk může být poškozeno, než dojde k narušení životaschopnosti obvykle nepřekračuje 15% další limitující faktor – kontaminace mikroorganismy
Symptomy projevu stárnutí
redukce klíčivosti a vzcházivosti zpomalení rychlosti klíčení nevyrovnané klíčení a vzcházení nižší vitalita, projevující se zvýšenou citlivostí na podmínky prostředí při klíčení a vzcházení méně vyvinuté klíční rostliny anomální klíční rostliny zvyšování obsahu polyfenolických látek v semenech
Dlouhověkost semen u suchých semen obecně: 1. s každým snížením vlhkosti o 1% se dvojnásobně prodlouží délka jeho životaschopnosti 2. s každým snížením teploty uskladnění o 5,6 °C se dvojnásobně prodlužuje délka jeho životaschopnosti Relativní indexy skladovatelnosti semen (doba snížení klíčivosti na polovinu: 1. (po 1 – 2 letech): kukuřice,žito, sója, slunečnice, mák, salát, cibule 2. (po 3 – 5 letech): ječmen, pšenice, oves, pohanka, řepka, bob, len, zelí, květák, mrkev, paprika 3. (po 5 a více letech): vojtěška, řepa, rajče, okurka, vikev, hrách při vlhkosti nad 30% může docházet ke klíčení semen vlhkost 18 – 30% podporuje rychlou deterioraci semen, zejména v souvislosti s rozvojem mikroorganismů vlhkost pod 8 – 9% zamezuje rozvoji hmyzu vlhkost 4 – 5% - semena jsou odolná proti napadení hmyzem a houbovými patogeny
Dlouhodobé uložení osiva
vysušení na 13 - 8% vlhkosti hermeticky uzavřené obaly - 20 °C – řada běžných druhů zemědělských plodin Fabaceae – 5 °C ultra dry seed – 3% vlhkosti, skladování při laboratorní teplotě
Klíčení semen příjem vody semenem: 1. fáze bobtání (imbibice) – podle fyzikálních zákonů, shodný průběh u všech druhů osiva (dormantních, nedormantních, živatoschopných, neživých), nezávislé na metabolické aktivitě vodní potenciál (tlakový, osmotický, hydratační) voda v.p.=0 (vysoký), suchá semena v.p. = -100 až -400 MPa 2. fáze aktivace biochemických procesů – pouze klíčivá semena (nikoliv semena neživá, semena v dormanci) 3. fáze růstu klíčku – viditelné klíčení a růst klíční rostliny, v.p. semen asi -1 MPa
vliv specifických vlastností semen, vlhkosti a složení substrátu, teploty vyspělé firmy – prehydratační úpravy semen zeleniny a květin nežádoucí rychlý příjem vody suchými semeny lze ovlivnit použitím osmotika (roztok s nižším vodním potenciálem než má voda)
Praktický význam fáze bobtnání osiva:
dochází k rychlému, ale přechodnému vyluhování anorganických i organických látek (exsudace) do okolního prostředí příčinou exsudace jsou buněčné membrány, které mohou při vyschnutí ztratit svou celistvost nadměrná exsudace cukrů a aminokyselin – ztráta substrátu pro dýchání a metabolismus, může vést ke stimulaci rozvoje kontaminující mikroflóry
Klíčení semen
začíná příjmem vody a končí startem prodlužování embryonální osy, zpravidla kořínku řada biochemických, fyzikálních a biologických procesů (hydratace protein, strukturální buněčné změny, dýchání, makromolekulární syntéza, prodlužování buněk) – embryo se transformuje z dehydratovaného stavu do stadia se životaschopným metabolismem
u vzorku osiva: a, b - rychlé a vyrovnané klíčení c – nevyrovnanost dlouhé období klíčení e – výskyt dvou odlišných skupin osiva ve vzorku
Základní podmínky klíčení voda: bobtnání – 1. fáze klíčení, až do 2. fáze semena zpravidla nereagují na přerušení tohoto pochodu a ani po vyschnutí a opakovaném bobtnání nemusí docházet k porušení klíčku; jakmile je již klíčení spojeno s buněčným dělením a růstem klíčku, k následné poruše již dochází kyslík: na počátku spotřeba prudce narůstá, po skončení hydratace pletiv stagnuje, nárůst opět ve 3. fázi; nedostatek se projevuje poklesem klíčivosti, některé druhy jsou přizpůsobené podmínkám a klíčí bez přístupu kyslíku (rýže) v půdním prostředí ovlivňuje klíčení také CO2 a etylén normální obsah kyslíku v půdě je 19%, může se snížit až na 1% (při vytvoření půdního škraloupu), inhibice klíčení při 1 – 3% kyslíku semena jsou různě citlivá na obsah kyslíku: např. mrkev – inhibice při 9 – 10%, teplota: efekt teploty se vyjadřuje existencí tři kardinálních bodů – minimum, optimum, maximum (optimum pro většinu semen je15- 30°C závisí na druhu, odrůdě, podmínkách prostředí, kvalitě osiva nízké teploty sice klíčení zpomalují, ale mohou být využity k odstranění dormance)
Specifické podmínky klíčení světlo: u většiny plodin není nezbytnou podmínkou klíčení, u některých druhů intenzita nebo spektrální složení světla klíčení ovlivňuje, např. některé odrůdy salátu klíčí jen na světle – pozitivně fotoblastické světlo působí prostřednictvím fytochromového systému fotoblastické chování semen má adaptační význam. semena stimulovaná světlem mají zpravidla nedostatek zásobních látek a klíční rostliny musí rychle dosáhnout přechodu na autotrofní výživu chemické látky
Životaschopnost osiva: je vlastnost semen, která umožňuje za vhodných podmínek prostředí jejich klíčení rozdílné hledisko fyziologické a semenářské Metodiky testování klíčivosti a vzcházivosti osiva: Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský, Odbor osiva a sadby, Brno
Doporučené metody hodnocení vitality osiva: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
test růstu a vývinu kořínků: hodnocení délky kořínků klíčních rostlin v stanovených časových intervalech Hiltnerův test: test laboratorní vzcházivosti – klíčení v substrátu, cihlové drti nebo písku v hloubce setí chladový test kukuřice konduktometrický test vodivosti výluhu test urychleného stárnutí test řízené deteriorace topografický tetrazoliový test aleuronový tetrazoliový test
1. Zkouška klíčivosti kategorie: normální klíčenci, abnormální klíčenci (poškození, deformovaní, shnilí -nejsou schopni se vyvinout v normální rostlinu v půdě dobré jakosti za optimálních podmínek) nevyklíčená semena (tvrdá, svěží nevyklíčená, mrtvá) materiál: filtrační papír (biologický test Phleum pratense, Agrostis gigantea, Festuca rubra var. commutata) písek (fytotoxicita – hořčice bílá, pšenice) zemina přístroje: Jakobsenovo klíčidlo, skříň pro klíčení, klimatizační komora pozice semen: na povrch, mezi vrstvy papíru, v písku, zemině teplo, světlo: v závislosti na testovaném druhu
4. Konduktometrické vodivostní testy
vycházejí z biologické podstaty vitality, ze změn vlastností buněčných membrán poškození semen během bobtnání v důsledku rychlého příjmu vody je monitorováno měřením konduktometrické vodivosti vody, ve které semena bobtnala vodivost exsudátu závisí na množství látek iontové povahy vyluhovaných ze semen a souvisí s integritou membrán
Postup – osivo hrachu: vzorek osiva v Erlenmayerově baňce v destilované nebo deionizované vodě o teplotě 20 °C po dobu 24 hodin předem – stanovení vlhkosti osiva, kalibrace konduktometru měření vodivosti hodnocení výsledku – osivo hrachu: do 24 µS.g-1 osivo je vhodné pro časný výsev nad 43 µS.g-1 hrách není vhodný k setí
5. Testy urychleného stárnutí (AA)
perspektivní, ale nutná standardizace podstatou je hodnocení rozdílů v klíčivosti před expozicí zvýšené teploty (zpravidla 41 – 45 °C) a vlhkosti (absolutní relativní vlhkost) a po expozici doba expozice 48 – 144 hodin semena vysoce vitální – odolnost k extrémním podmínkám semena s vysokou životností si uchovávají po zkoušce urychleného stárnutí vysokou klíčivost u semen s nízkou životností se klíčivost sníží vliv řady faktorů, např. velikosti semen, odrůdy
7. Topografický tetrazoliový test – TTC (biochemická zkouška životaschopnosti semen)
zejména pro druhy, které mají dlouhou dobu klíčení, u semen s dormancí, u vzorků s vysokým podílem svěžích nevyklíčených semen podstatou TTC testu je barevná reakce, která je důsledkem redukčních pochodů probíhajících v živých buňkách
7. Topografický tetrazoliový test – TTC (biochemická zkouška životaschopnosti semen)
indikátorem těchto reakcí je bezbarvý roztok 2,3,5trifenyltetrazolium chloridu nebo bromidu, který při bobtnání semene proniká do pletiv v živých buňkách se působením dehydrogenáz uvolňuje vodík, který reaguje s TTC za vzniku stabilní nedifundující červené látky – trifenylformazanu
tím je možné odlišit červeně zbarvená (živá) pletiva od bezbarvých (mrtvých)
Vedení řezu při přípravě semen před barvením:
1-4 obilky 5-6 Lactuca
7 Apiaceae 8 jehličnany 9 řez na obou koncích
u některých semen – určitý podíl nekrotické tkáně o jejich klasifikaci rozhoduje poloha a rozsah nekróz, nikoliv intenzita zabarvení tkáně Postup: 1. semena – předběžné vlhčení (podle druhu) 2. máčení semen ve vodě (bobtnání semen) 3. preparace pletiv, propichování, řezy, vyříznutí embrya, odstranění osemení – pro usnadnění pronikání roztoku 4. barvení 0,1 – 1,0% roztok pH 6,5 – 7,5 (pufr), někdy přídavek antibiotik (Prevenol), ve tmě
Příklad: Postup TTC Agrostis (psineček): předběžné vlhčení: při 20 ºC – VeF 16 hod, voda 2h příprava: propíchnout poblíž embrya barvení: 1,0% při 30 °C 18 hod příprava pro hodnocení: obnažit embryo max. plocha nezbarveného pletiva: 1/3 kořene
