EXPERIMENTÁLNÍ ZKUŠENOSTI S POUŽITÍM NEUROPROTEKTIVNÍCH LÁTEK U POTKANŮ VYSTAVENÝCH OPAKOVANÉ HYPOBARICKÉ HYPOXII

5. EXPERIMENTÁLNÍ ZKUŠENOSTI S POUŽITÍM NEUROPROTEKTIVNÍCH LÁTEK U POTKANŮ VYSTAVENÝCH OPAKOVANÉ HYPOBARICKÉ HYPOXII Marešová D., Langmeier M., Pokorný J., Trojan S. Fyziologický ústav 1. LF UK, Praha 2 Souhrn Studovali jsme neuroprotektivní působení tokoferolu, kyseliny askorbové, zinku, selenu a magnezia na trvání epileptických záchvatů vyvolaných elektrickou stimulací senzorimotorické kůry u 12, 25 a 35 denních potkanů opakovaně vystavovaných hypobarické hypoxii od 1. do 11. nebo do 17. dne života. 1., 8. nebo 18. den po ukončení hypoxie bylo trvání vyvolaných korových následných výbojů prodlouženo (ve srovnání s potkany hypoxii nevystavovanými). Největší účinek (nemožnost vyvolání epileptických záchvatů) byl po podávání zincum chloratum (5 mg/kg s.c.) u 25 a 35denních potkanů. Klíčová slova: hypobarická hypoxie, vyvolané epileptické záchvaty, neuroprotekce Summary We tested the influence of tocopherol, ascorbic acid, zincum, selenium and magnesium on the duration of epileptic seizures elicited by electrical stimulation of sensorimotor cortex in 12, 25 and 35-day-old rats exposed to intermittent hypobaric hypoxia from 1 to 11 or to 17 days of life. 1, 8 and 18 days after the end of hypoxia prolongations of evoked cortical afterdischarges (in correlation with rats not exposed to hypoxia) were recorded. Maximal effect (the blockade of evoked epileptic seizures) after the application of zincum chloratum (5 mg/kg s.c.) in 25 and 35-day-old rats were measured. Key words: hypobaric hypoxia, evoked epileptic seizures, neuroprotection Úvod Neuroprotektivní, z řeckého neuron a latinského protego (ochraňovat), účinek může mít každý příznivý mechanizmus působící na nervový systém. Účinek může být nespecifický, např. fyzikální (osmotické působení podané látky při mozkovém edému) nebo chemický. Důležitější je specifický účinek, který se může uplatnit např. vazbou na buněčné elementy, zásahem do funkce DNA (různá cytostatika při léčbě nádorových onemocnění), urychlením nebo zpomalením transportních mechanizmů (ovlivnění funkce membránové ATPázy), iontových kanálů (farmakoterapie při léčbě záchvatových onemocnění), změnou aktivity enzymů (a tím i změnou množství substrátu, vitaminy), případně prostřednictvím signálních molekul vážících se na receptory (hormony, přenašeče, modulátory, růstové faktory). Přitom je důležité, že jen málokdy je primární účinek izolovaný, ale je nejen odvislý od místa působení a jeho vývojové zralosti, ale i od vztahu k dalším případným vlivům (kooperace, kompetice), senzitizace (případně desenzitizace) nebo interakce s dalšími systémy. Při úvahách o protektivním působení v nervovém systému je pak třeba mít na zřeteli schopnost neuronu přenést modalitu nejrůznějšího podnětu na modalitu vzruchu. Pro studium účinku látek, které ovlivňují buňky centrálního nervového systému, jsme zvolili model opakované hypobarické hypoxie – komplexního podnětu (nízký barometrický tlak, opakovaná hypoxie a reoxygenace, malnutrice, ovlivnění organismu matky) (3, 5). Nepříznivé působení podnětu se projevuje nižší hmotností mláďat a m.j. změnou excitability korových neuronů v porovnání se zvířaty hypoxii nevystavovanými. Jedním z možných vysvětlení změn excitability mozkové kůry potkanů (mimo zpoždění somatického vývoje a tím také pozdější vyzrávání mediátorových a modulátorových systémů) je

v působení vznikajících reaktivních forem kyslíku a dusíku (RONS), jejichž tvorba se zejména při reoxygenaci tkání zvyšuje. Navozená neenzymová peroxidace lipidů a poškození proteinů, mohou měnit funkční charakteristiku biologických membrán, včetně prostupnosti iontových kanálů, a tím navodit změny jejich elektrofyziologických vlastností. Organizmus je však vybaven mnoha antioxidačními systémy na úrovni enzymů (např. superoxiddismutázy – SOD1, SOD2), vysokomolekulárními endogenními antioxidanty (např. feritin, metathioneiny), nízkomolekulárními endogenními antioxidanty (askorbát, a-tokoferol). Při selhání jejich funkce jsou nadprodukcí RONS postiženy nejrůznější enzymové komplexy navozující biologické aktivity buňky, při transportních mechanismech a buněčné signalizaci (4). Při studiu vlivu neuroprotektivních látek na excitabilitu korových neuronů jsme proto sledovali, zda preventivní podávání vitaminů (E a C) nebo iontů, které jsou jednak součástí enzymových systémů (zinek, selen) či se podílejí na stabilizaci iontových kanálů (magnezium), ovlivní navozenou změnu funkce (1). Metodika Mláďata potkanů jsme od narození (spolu s matkou) denně 8 hodin vystavovali v barokomoře simulované výšce 7000 m (atmosférický tlak = 410 mB). Funkci mozkové kůry jsme posuzovali podle korových následných výbojů (KNV). Ty jsme vyvolávali nadprahovou stimulací senzorimotorické kůry. Parametry stimulace – bipolární pulsy, délka pulsu 1 ms, frekvence 8 Hz, intenzita nutná k vyvolání KNV 3–5 mV, trvání stimulace 15 s. Stimulaci jsme opakovali 5× vždy 1 min po ukončení předchozího KNV. Změny funkce centrálního nervového systému jsme posuzovali 1. den u 12denních mláďat, 8. den (u 25denních) nebo 18. den (u 35denních) potkanů po ukončení opakované hypoxie a výsledky jsme porovnávali s měřeními u stejně starých zvířat hypoxii nevystavovaných (obr. 1).

Látky s popsanými neuroprotektivními účinky jsme podávali opakovaně vždy 15 min před vystavením hypobarické hypoxii. Kontrolní zvířata obdržela fyziologického roztok. Použité dávky vitaminů a iontů: a) tokoferol – 150 mg/kg i.p., b) kyselina askorbová – 100 mg/kg i.p., c) zinek – ZnCl2 – 5 mg/kg s.c., d) selen – Na2 SeO4 – 0,1 mg/kg p.o., e) magnesium – MgSO4 – 300 mg/kg i.p. Hodnocení U volně pohyblivých mláďat jsme sledovali trvání KNV, typ grafoelementů a projevy chování. Pro statistické hodnocení KNV jsme používali programy GraphPadPrim – párový a nepárový t-test, ANOVA. Statisticky významné rozdíly jsou v grafech označeny hvězdičkou. Výsledky Stimulace senzorimotorické kůry mláďat potkanů nadprahovým elektrickým podnětem vyvolá korový následný výboj (epileptický záchvat), jehož trvání se s věkem zkracuje. Rozdíl v trvání KNV je nejvíce patrný mezi druhým a třetím týdnem života (12denní – 18,8 ± 1,9 s, 25denní – 6,0 ± 0,6 s, 35denní – 3,9 ± 0,7 s). U 12denních mláďat se opakovanou stimulací trvání KNV prodlužuje v závislosti na trvání

předchozího KNV. U starších potkanů se po opakované stimulaci trvání KNV (v porovnání s trváním prvního – kontrolního - KNV) zkracuje (období postiktální deprese), excitabilita se plně obnoví až po 5. stimulaci. Ve všech věkových skupinách mláďat vystavovaných opakované hypoxii trval první KNV déle než u kontrolních zvířat. Po opakované stimulaci jsme prodloužené KNV registrovali u 12 a 25denních mláďat, u 35 denních pouze po 3. stimulaci, po 6. stimulaci bylo trvání KNV kratší než u zvířat hypoxii nevystavovaných (obr. 1). Aplikace fyziologického roztoku mláďatům vystavovaným hypobarické hypoxii se projevila zkrácením KNV u 12denních potkanů a neovlivnila trvání vyvolaných epileptických záchvatů u starších zvířat. Použití jednotlivých vitaminů (E a C) se na trvání KNV u zvířat opakovaně vystavovaných hypobarické hypoxii neprojevilo. Z iontů opakovaně podávaných mláďatům vystavovaným hypobarické hypoxii měl nejvýraznější účinek zinek, kdy 8 a 18 dnů po ukončení aplikace a hypoxie (tj. u 25 a 35denních) zcela zablokoval vyvolání epileptických záchvatů po 2. a 3. stimulaci. Účinky magnezia a selenu se na trvání KNV výrazněji neprojevily. Během KNV jsme u nejmladší věkové skupiny (12denní mláďata) registrovali převážně hroty, popř. ostré vlny o frekvenci 1,5–2,5 Hz. U starších mláďat (25denních a 35denních) komplexy hrot-vlna o frekvenci 2,5–3 Hz. Aplikace vitaminů a iontů nezměnila grafoelementy charakteristické pro daný stupeň ontogenetického vývoje. Závěr Pro sledování činnosti mozku jsme použili model myoklonických záchvatů vyvolaných nadprahovou stimulací senzorimotorické kůry. Stimulací navozená synchronizace výbojů korových neuronů, vyvolá epileptický záchvat (korový následný výboj – KNV), který má charakteristické trvání i tvar grafoelementů. Příčiny změn elektrokortikografické aktivity (prodloužené trvání KNV) potkanů navozené opakovanou hypobarickou hypoxií jsou mnohočetné. Nejvíce se pravděpodobně uplatňuje malnutrice vedoucí ke opoždění somatického vývoje (2), a tím i ke zpoždění vyzrávání mozkových struktur včetně mediátorových a modulátorových systémů zapojených do excitačních a inhibičních dějů (systém excitačních aminokyselin, kyselina g-aminomáselná). Tato okolnost by mohla vysvětlovat nálezy při opakovaném vystavení mláďat hypoxii. Odolnost mladých jedinců je vůči hypoxii vysoká, ale nepříznivě působí ovlivnění krevního oběhu a ventilace. Důsledky se projeví v energetickém obratu buňky (pokles ATP, KP). Pokles efektivity oxidativní fosforylace nahrazuje nervový systém mladých jedinců vystavených hypoxii zvýšením podílu anaerobní glykolýzy na celkovém energetickém obratu, který při vysokých metabolických nárocích nervových buněk nemusí zcela pokrýt jejich energetické potřeby. Tak je tomu zejména při udržování stability buněčných membrán při opakované stimulaci senzorimotorické kůry. Zvýšení excitace (prodloužení KNV) by vysvětlovalo velké akutní změny u nejmladší věkové skupiny testované 1 den po ukončení opakované hypoxie. Neméně významná je i zvýšená aktivace sympatoadrenálního systému, která může vysvětlovat prodloužení KNV po první stimulaci mozkové kůry. V našem modelu použití neuroprotektivních dávek jednotlivých vitaminů neovlivnilo trvání vyvolaných KNV u mláďat opakovaně vystavených hypoxii. Příčinou může být i to, že změny navozené reoxygenací (např. lipoperoxidace) nejsou podstatou prodlouženého trvání KNV. Z použitých iontů nejvíce ovlivnilo trvání KNV opakované podávání zinku u starších mláďat testovaných 8 a 18 dnů po ukončení hypoxie, které se projevilo nemožností vyvolat KNV po druhé a třetí stimulaci. Zinek se uvolňuje z nervových zakončení excitačních synapsí (kolokalizace s glutamátem). Vzhledem k tomu, že se excitabilita v další sérii stimulace obnovila, nepředpokládáme jeho cytotoxické působení popisované u ischemií a těžkých záchvatů, ale spíše jeho vliv na NMDA receptor.

Práce je podporována GAUK 31/2001 a MSM 111100001.

Literatura 1. Choi DW, Koh JY. Zinc and brain injury. Annu Rev Neurosci 1998; 21: 347–75. 2. Langmeier M, Marešová D. Intermittent hypobaric hypoxia during development – Morphological

changes in the neocortex and hippocampus. Arch Physiol Biochem 1997; 105: 299–300. 3. Marešová D, Valkounová I, Jandová K, Bortelová J, Trojan S. Excitability changes of cortical neurons during the postnatal period in rats exposed to prenatal hypobaric hypoxia. Physiol Res 2001; 50: 215–219. 4. Štípek S, et al. Antioxidanty a volné radikály ve zdraví a nemoci. Grada Publishing, spol. s r.o. 2000; 314 str. 5. Trojan S. Adaptation of the central nervous system to oxygen deficiency during ontogenesis. Acta Univ Carol Medica, Monographia LXXXV, 1978.

FUNCTIONAL MORPHOLOGY OF NOS IMMUNOREACTIVE CONNECTIONS BETWEEN LUMBOSACRAL SEGMENTS AND VENTRAL MOTOR NUCLEUS OF THE CERVICAL INTUMESCENCE Maršala J.1, Lukáčová N.1, Čížková D.1, Lukáč I.2, Kuchárová K.1, Maršala M3 1 Institute of Neurobiology, Slovak Academy of Sciences, Košice, Slovak Republic, 2Department of Neurosurgery, Medical Faculty of P. J. Šafárik University, Košice, Slovak Republic, 3Anesthesiology Research Laboratory, University of California, San Diego, La Jolla CA, USA Abstract Dense punctate nitric oxide synthase immunoreactivity in the neuropil of the ventral motor nucleus in C7-Th1 segments and several small axonal bundles penetrating the gray matter of the nucleus and containing nitric oxide synthase immunoreactive axons were found on control sections. Concurrently, a fairly well circumscribed NADPHd-exhibiting and/or nitric oxide synthase immunoreactive bundle was detected on transverse sections in Th3–L2 segments located in the medial portion of the ventral column close to the ventral median fissure. Hemisection performed at Th10–Th11 segment level caused a strong upregulation of nitric oxide synthase expression in some NOS-containing neurons located in the lumbosacral segments. The bulk of retrogradely-reacting nitric oxide synthase containing neurons was found to be located in L3–L6 segments. Segmental and laminar distribution of double-labeled (FG+NOS-IR) neurons in L1–S2 segments after injections of FG into the VMN in C7–Th1 segments revealed a noticeable number of double-labeled neurons in midlumbar (L3–L4), lower lumbar (L5–L7) and sacral (S1–S2) segments. Our findings demonstrate that NOS-IR neurons in lumbar and sacral segments (L1–S2) of the dog issue NOS-IR axons that ascend contralaterally and ipsilaterally through the ventral part of the lateral funiculus and lateral and medial parts of the ventral funiculus of thoracic segments, and project as far as the VMN in C7-Th1 segments. Key words: spinal cord, ventral motor nucleus, ascending connections, nitric oxide synthase Introduction Spinal cord injuries that involve substantial gray and white matter loss in either cervical or the lumbar enlargement cause serious sensory, motor and autonomic disturbances. Multisegmental motor disorders often coupled with disturbed step cycle structure and intralimb or interlimb uncoupling are often seen in humans after partial or almost complete spinal cord lesion. It was reasoned, therefore, that the disruption of fore-and hindlimb coordination is related mainly to the extent of the spinal cord lesion and not to specific damage to one pathway (Jiang and Drew, 1996), thus suggesting that fore-and hindlimb coupling results from the contribution of many converging inputs, supraspinal, segmental, propriospinal and peripheral. Considering our previous findings the current study seeks (i) to specify the laminar location and quantitative assessment of NOS-IR neurons in the lumbosacral segments of the spinal cord in the dog with emphasis on the ventral horn and intermediate zone; and (ii) to determine whether NOS-IR neurons in the lumbosacral segments participate in the formation of an ascending premotor NOS-IR pathway directly connecting the lumbosacral segments with the VMN in C7–Th1 segments, and if so then also (iii) to identify the funicular course of NOS-IR axons in the lumbosacral and thoracic segments and their termination in the VMN. Material and methods Experimental design, tissue sampling, sectioning and staining of sections

Adult mongrel dogs (n = 13) of both sexes (weighing 8–14 kg) were used in these experiments. Experimental protocols were approved by the Institute of Neurobiology Animal Care Committee. The dogs were divided into four groups. In the first group of control animals (n = 5) the segmental and laminar distributions of nitric oxide synthase immunoreactive neurons (NOS-IR) (n = 3) and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate diaphorase (NADPHd) exhibiting neurons (n = 2) in the cervical enlargement (C5–Th2) and lumbosacral segments (L1–S2) were studied. Hemisection at Th10–Th11 segment level and axotomy-induced retrograde changes of nitric oxide synthase immunorecative neurons (RRNOS-IR) in L1–S2 segments. Double-staining for Fluorogold labeled and nitric oxide synthase immunoreactive ascending lumbosacral projections terminating in the ventral motor nucleus. Results and discussion The ventral motor nucleus (VMN) of the cervical intumescence containing NOS immunonegative motor neurons appears in the ventrolateral area of lamina IX of the caudal C7 segment. A fairly well circumscribed, bilaterally identifiable NADPHd-exhibiting and/or NOS-IR axonal bundle was detected in the Th3–L2 segments in the medial portion of the ventral columns close to the ventral median fissure. Segmental differences in the shape and extent of the area occupied by this NADPHd-exhibiting and/or NOS-IR axonal bundle in the ventral column can be seen. Hemisection performed at Th10–Th11 segment level caused a strong and sustained upregulation of nitric oxide synthase expression in some NOS-containing neurons located in the lumbosacral segments. Quantitative assessment disclosed that a high incidence of RRNOS-IR neurons could be found in L1–S2 segments after hemisection performed at Th10–Th11 segment level. The bulk of RRNOS-IR neurons was found congregated in L3–L6 segments. Segmental and laminar distribution of double-labeled (FG+NOS-IR) neurons in L1-S2 segments after injections of FG into the VMN in C7-Th1 segments indicated a noticeable number of double-labeled neurons in midlumbar (L3–L4), lower lumbar (L5–L7) and sacral (S1–S2) segments (Fig. 8 A–D). Doublelabeled (FG+NOS-IR) neurons clearly prevailed in the ventral horn (laminae VIII-IX), pericentral region (lamina X) and medial part of the intermediate zone (lamina VII) of L3–L7 and S1–S2 segments. Mediumand large-sized double-labeled (FG+NOS-IR) neurons located in the mediodorsal ventral horn (lamina VIII) and the core region of the ventral horn were among the best characterized and most frequently appearing somata. The results of the present study document the occurrence of a nitric oxide synthase immunoreactive neuronal pool in the ventral horn of the lumbar segments and the existence of an ascending premotor nitric oxide synthase immunoreactive pathway connecting the lumbar segments with the neurons of the ventral motor nucleus located in C7–Th1 segments of the cervical enlargement Conclusive evidence revealing the existence of an ascending premotor nitric oxide synthase immunoreactive pathway connecting the lumbosacral segments with the VMN was gathered from the second set of experiments based on the double-labeling technique using the retrogradely transportable fluorescent tracer Fluorogold injected directly into the VMN in C7–Th1 segments, and NOS immunoprocessing of transverse sections cut from the lumbosacral segments. The occurrence of bilateral ascending NOS-IR axons revealed in our study after unilateral injection of FG in the VMN, compared with the ipsilateral projection of this pathway seen after low thoracic hemisection, suggests that many nitrergic axons leaving the NOS-containing somata located in laminae VII, VIII and X of L1–S2 segments either pass homolaterally or cross over the ventral commissure and enter the contralateral ventral column, where they turn upwards and proceed rostrally as uncrossed and crossed components of the premotor pathway until they reach the VMNTaken together, our findings demonstrate that NOS-IR neurons in lumbar and sacral segments (L1–S2) of the dog issue NOS-IR axons that ascend ipsilaterally and contralaterally through the ventral part of the lateral funiculus and lateral and medial part of the ventral funiculus of thoracic segments and project up to the VMN in C7–Th1 segments.

The experimental work was supported by the VEGA Grants No. 2/3217/23 from the SAS, STAA Grant No. 51-013002 and by NIH grants NS 32794 and NS 40386 to M.M.

References

Barilari MG, Kuypers JM. Propriospinal fibers interconnecting the spinal enlargements in the cat. Brain Res 1969; 14: 321–330. Eidelberg E. Consequences of spinal cord lesions upon motor function, with special reference to locomotor activity. Prog Neurobiol 1981; 17: 185–202. English AW. Interlimb coordination during locomotion. Am. Zool. 1989; 29: 255–266. Grillner S, Zangger P. On the central generation of locomotion in the low spinal cat. Exp Brain Res 1979; 34: 241–261. Kato M, Murakami S, Yasuda K, Hirayama H. Disruption of fore- and hindlimb coordination during overground locomotion in cats with bilateral serial hemisection of the spinal cord. Neurosci Res, 1984; 2: 27–47. Maršala J, Čížková D, Kafka J, Lukáčová N, Lukáč I, Maršala M. Densitometric patterns of NADPH diaphorase staining in the spinal cord of dog. Biologia 2001; 56: 681–689. Matsushita M, Ueyama T. Ventral motor nucleus of the cervical enlargement in some mammals; its specific afferents from the lower cord levels and cytoarchitecture. J Comp Neurol 1973; 150: 33–52. Miller S, van der Meché FG. Coordinated stepping of all four limbs in the high spinal cat. Brain Res 1976; 109: 395–398.

MOLEKULÁRNÍ GENETIKA TARDIVNÍCH DYSKINEZÍ Maršálek Michal Psychiatrická léčebna Bohnice Souhrn V posledních letech se soustřeďuje zvýšený zájem na farmakogenetiku tardivních dyskinezí (TD). Několik publikovaných výzkumů potvrdilo významný vztah mezi gly/gly polymorfismem genu dopaminového D3 receptoru (DRD3) a TD. Nedávno byl prokázaný vztah variant 102CC a –1438GG genu serotoninového receptoru 5-HT2A (HTR2A) a TD (především abnormálních pohybů trupu). C/C polymorfismus genu CYP 1A2 významně ovlivňoval riziko TD, zvlášť v podskupině kuřáků. Kombinovaná farmakogenetická analýza farmakokinetiky a farmakodynamiky antipsychotik identifikovala vyšší riziko TD při kombinaci polymorfismu DRD3 s HTR2C, CYP 1A2 a CYP C 17. Klíčová slova: farmakogenetika, tardivní dyskineze, polymorfismus DRD3, polymorfismus HTR2A, polymorfismus CYP 1A2, polymorfismus CYP C 17, kouření Summary An increased interest is focused on pharmacogenetics of tardive dyskinesia (TD) in last years. Several published assessments confirmed significant relationship between gly/gly polymorphism of the dopamine D3 receptor gene (DRD3) and TD. An association of the 102CC and -1438GG variants of the serotonin 5-HT2A receptor gene (HTR2A) and TD (mainly trunk abnormal movements) were reported previously. Moreover, the C/C polymorphism of CYP 1A2 gene significantly influenced the risk for TD, especially in the subgroup of smokers. A combined pharamacogenetic analysis of pharmacokinetic and pharmacodynamic targets for antipsychotics identified higher risk for TD in combination of the polymorphisms of DRD3 with HTR2C, CYP 1A2, and CYP C 17, respectively. Key words: pharmacogenetics, tardive dyskinesia, polymorphism of DRD3, polymorphism of HTR2A, polymorphism of CYP 1A2, polymorphism of CYP C 17, smoking Epidemiologické studie posledních desetiletí prokázaly řadu rizikových faktorů vzniku tardivních dyskinezí (TD), nebyly však schopné vysvětlit, proč k postižení dochází jen asi u pětiny pacientů s antipsychotickou léčbou. Předpokládal se významný vliv genetické zátěže, protože několik klinických pozorování zaznamenalo konkordanci pro rozvoj nebo absenci TD u členů jedné rodiny (např. Yassa a Ananth, 1998). Systematický genetický výzkum TD se však začal rozvíjet teprve v posledních 6 letech, kdy bylo v této oblasti publikováno několik zásadních studií. Článek podává přehled nejvýznamnějších výsledků genetických studií TD. Dva základní směry farmakogenetického výzkumu se zaměřily na geneticky podmíněné varianty 1) farmakodynamiky a 2) farmakokinetiky antipsychotik ve vztahu k TD.

1) FARMAKODYNAMICKÝ GENETICKÝ VÝZKUM a) Polymorfismus dopaminového D3 receptoru Funkce dopaminového D3 receptoru není dosud plně objasněna, předpokládá se však m.j. jeho zapojení do regulace motoriky. Gen DRD3 je lokalizovaný na chromozomu 3q13.3. V kodonu 9 má polymorfní bázi umožňující substituci serinu glycinem v N-terminální extracelulární části receptorového proteinu. Homozygotní genotyp DRD3 gly/gly se vyskytuje v populaci kavkazského typu s frekvencí 5–22 %. Polymorfismus mění afinitu receptoru k dopaminu. Pět z 9 kontrolovaných studií publikovaných od roku 1997 prokázalo signifikantní vztah mezi genotypovou variantou gly/gly (ev. ser/gly) a závažností, prevalencí či perzistencí TD. V jedné studii byl naznačený pouze nesignifikantní trend k vztahu s vyšší prevalencí TD (např. Steen et al., 1997). Kombinovaná analýza souborů 6 výzkumných center (Lerer et al., 2002), provedená u 780 pacientů se schizofrenií, prokázala, že TD má signifikantní vztah k vyšší frekvenci glycinových alel (p < 0,05) a ke genotypu gly/gly DRD3 (p < 0,05), a dále, že genotyp gly/gly má vztah k těžším formám TD (p < 0,0001). Metaanalýza jiných 3 studií z uvedených pracovišť zjistila, že přítomnost glycinové alely DRD3 zvyšuje citlivost k TD (pooled OR = 1,33, p < 0,05, kumul. OR = 1,52, p < 0,0001). Polymorfismus receptoru D3 se dosud jeví jako nejvýznamnější genetický rizikový faktor rozvoje TD. b) Polymorfismus dopaminového D2 receptoru Chen et al. (1997) prokázal u 177 pacientů s chronickou schizofrenií vyšší výskyt TD při homozygositě alel. Výsledek byl významný pouze u žen. Jedná se zatím o ojedinělou studii a její výsledky proto nelze generalizovat. c) Polymorfismus serotoninového 5-HT2A receptoru Gen receptoru 5-HT2A je lokalizovaný na chromozomu 13q14.21. Tři ze 6 studií zjistily signifikantně častější výskyt TD u genotypu C-C němého lokusu T102C (102CC) a u genotypu G-G podpůrného lokusu A-1438G (-1438GG) receptoru. Významný vztah k polymorfismu kódovacího lokusu his452tyr genu receptoru nalezen nebyl. Vztah TD k receptorovému polymorfismu se projevoval jen v mladších souborech pacientů (Basile et al., 2000; Tan et al., 2001; Segman et al., 2001; Lerer, 2002). Segman et al. (2001) navíc prokázali významnou vazbu mezi oběma uvedenými genotypovými variantami a závažností i omezením tardivními dyskinezemi trupu, zatímco ve vztahu k orofaciální oblasti podobný nález potvrzený nebyl. d) Polymorfismus serotoninového 5-HT2C receptoru U žen (ale ne již u mužů) byl naopak v jedné studii zjištěn vyšší výskyt serinových alel receptoru 5-HT2C a genotypů cys/ser a ser/ser ve vztahu k přítomnosti orofaciálních TD (p<0,05) (Segman et al., 2000). Výsledek bude vyžadovat ověření v dalších studiích. 2) FARMAKOKINETICKÝ GENETICKÝ VÝZKUM a) Polymorfismus CYP 2D6 V populaci kavkazského typu se vyskytuje 7–10 % pomalých metabolizérů látek vázaných na jaterní cytochromový systém P450 2D6, mezi které patří i řada antipsychotik. Pomalé metabolizování způsobuje zvýšení hladin antipsychotik a teoreticky může zesílit riziko TD zvýšením expozice těmto látkám. Z 5 studií byl ve 2 zjištěn signifikantní vztah prevalence nebo závažnosti TD k několika variantám CYP 2D6 (např. Ohmori et al., 1998), ve zbývajících 3 studiích byl tento trend patrný, ale nedosahoval statistické významnosti. b) Polymorfismus CYP 1A2 Cytochromový systém P450 2D6 charakterizuje vysoká afinita k některým antipsychotikům, ale současně nízká vazná kapacita (jen 2 % kapacity cytochromových systémů). Cytochromový systém 1A2 naopak charakterizuje nízká afinita k antipsychotikům, ale vysoká vazná kapacita (12 %). V případě dlouhodobého podávání antipsychotik se kapacita CYP 2D6 vyčerpává a dochází k metabolizaci náhradní cestou přes CYP 1A2 (Basile et al., 2000). CYP 1A2 tedy nabývá na významu u dlouhodobě léčených psychotických pacientů, u kterých je současně vyšší riziko vzniku TD. Jednoduchý nukleotidový

polymorfismus C -> A v 1. intronu genu CYP 1A2 současně snižuje aktivaci cytochromu u kuřáků (na rozdíl od nekuřáků) o 40 %. C/C genotyp se v kavkazské populaci vyskytuje v 10 %. Basile et al. (2000) prokázali, že C/C genotyp CYP 1A2 má významný vztah k těžší TD (p<0,01), což bylo ještě nápadnější u kuřáků. Podíl genetické složky na riziku TD u části kuřáků může částečně vysvětlit starší rozporné nálezy v epidemiologických studiích zaměřených na riziko kouření při vzniku TD. 3) INTERAKCE FARMAKODYNAMICKÉHO A FARMAKOKINETICKÉHO POLYMORFISMU NEBO VÍCE FARMAKODYNAMICKÝCH POLYMORFISMŮ Přepokládá se další zvýšení rizika TD při současném výskytu polymorfismu D3 receptorů a cytochromových jaterních systémů, který zvýší expozici antipsychotikům. Dosavadní výzkumy tento předpoklad potvrzují. Těžší formy TD mají vztah k interakci genotypu gly/gly D3R s genotypem C/C CYP 1A2 (Özdemir et al., 2001) nebo s polymorfismem genotypu CYP 17 (Segman et al., 2002). Interakce receptorových genotypů gly/gly D3R a ser/ser 5-HTR2C má významný vztah k těžším TD (Segman et al., 2000).

prim. MUDr. Michal Maršálek, CSc. Psychiatrická léčebna Bohnice Ústavní 91 181 02 Praha 8 – Bohnice tel.: 284016242 fax: 283850183 e-mail: [email protected] Literatura 1. Steen VM, Lovlie R, MacEwan T, McCreadie RG. Dopamine D3-receptor gene variant and susceptability to tardive dyskinesia in schizophrenic patients. Mol Psychiatry 1997; 2: 139–145. 2. Lerer B, Segman RH, Fangerau H, et al. Pharmacogentetics of tardive dyskinesia: combined analysis of 780 patients supports association with dopamine D3 receptor gene Ser9Gly polymorphism. Neuropsychopharmacology 2002; 27: 105–119. 3. Chen CH, Wei FC, Koong FJ, Hsiao KJ. Association of TaqI A polymorphism of dopamine D2 recepor gene and tardive dyskinesia. Biol Psychiatry 1997; 41: 827–829. 4. Basile VS, Özdemir V, Masellis M, et al. A functonal polymorphism of thee cytochrome P450 1A2 (CYP1A2) gene: association with tardive dyskinesia in schizophrenia. Mol Psychiatry 2000; 5: 410–417. 5. Tan EC, Chong SA, Mahendran R, et al. Susceptibility to neuroleptic-induced tardive dyskinesia and the T102C polymorphism in the serotonin type 2A receptor. Biol Psychiatry 2001; 50: 144–147. 6. Segman RH, Heresco-Levy U, Finkel B, et al. Association between the serotonin 2A receptor gene and tardive dyskinesia in chronic schizophrenia. Mol Psychiatry 2001; 6: 225–229. 7. Ohmori O, Suzuki T, Kojima H, et al. Tardive dyskinesia and ebrisoquine 4-hydroxylase (CYP2D6) genotype in Japonese schizophrenics. Schizophr Res 1998; 32: 107–113. 8. Özdemir V, Basile VS, Masellis M, Kennedy JL. Pharmacogenetic assessment of antipsychotic-induced movement disorders: contribution of the dopamine D3 receptor and sytochrome P450 1A2 gene. J Biochem Biophys Methods 2001; 47: 151–157. 9. Segman RH, Heresco-Levy U, Yakir A, et al. Interactive effect of cytochrome P450 17a-hydroxylase and dopamine D3 receptor gene polymorphisms on abnormal involunatry movements in chronic schizophrenia. Biol Psychiatry 2002; 51: 261–263. 10. Segman RH, Heresco-Levy U, Finkel B, et al. Association between the serotonin 2C receptor gene and tardive dyskinesia in chronic schizophrenia: additive contribution of 5-HT2Cser and DRD3gly alleles to susceptability. Psychopharmacology (Berl) 2000; 152: 408–413.

PREDIKCE NESPOLUPRÁCE PŘI LÉČBĚ SCHIZOFRENIE Maršálek Michal

Psychiatrická léčebna Bohnice Souhrn Predikce nespolupráce při léčbě antipsychotiky představuje u schizofrenie první krok k účinné terapeutické intervenci. Spolupráci ovlivňuje několik faktorů: (1) vedlejší účinky medikace (extrapyramidové syndromy, dysforie, sedace, přibývání na váze nebo sexuální dysfunkce), (2) faktory související s nemocí (závažnost psychopatologie, kognitivní poškození nebo komorbidita s abusem drog), (3) faktory související s pacientem a jeho rodinou (nosognosie, přesvědčení, že medikace může redukovat příznaky, podpora rodiny) a (4) faktory související s lékařem (terapeutický vztah, strategie farmakoterapie). U pacientů s vysokým rizikem nespolupráce může spolupráci zlepšit kognitivněbehaviorální léčba a další psychosociální intervence. Užívání léků může zlepšit také volba depotních antipsychotik 1. generace nebo perorálních antipsychotik 2. generace s menším rizikem vedlejších účinků. Klíčová slova: spolupráce, nežádoucí účinky antipsychotik, schizofrenie, abusus drog, terapeutický vztah Summary Prediction of noncompliance with antipsychotic treatment is an initial step toward effective interventions in schizophrenia. Several group of factors influence compliance, including (1) side effects of medication (extrapyramidal syndromes, dysphoria, sedation, weight gain or sexual dysfunction), (2) disorder related factors (severity of psychopathology, cognitive impairment or comorbidity with substance abuse), (3) patient and family related factors (insight into illness, belief that medication can reduce symptoms, family support), and (4) physician related factors (therapeutic relationship, strategy of pharmacotherapy). Cognitive-behavioral therapies and other psychosocial intervetions can improve compliance in group with high risk of noncompliance. Treatment adherence may also be improved by use of depot antipsychotics of 1st generation or oral antipsychotics of 2nd generation with few side effects. Key words: compliance, side effects of antipsychotics, schizophrenia, substance abuse, therapeutic relationship Nespolupráce pacientů při antipsychotické léčbě vede k vyššímu výskytu relapsů onemocnění, je nejčastější příčinou rehospitalizace (50 % všech případů), je zodpovědná za delší pobyty v lůžkových zařízeních a významně prodražuje péči o pacienta. Nemocní se schizofrenií přitom nespolupracují při užívání antipsychotik v 40–60 % a s odstupem od hospitalizace se nespolupráce stává ještě častější. Nespolupráce může mít různou formu. Nemocní odmítají léčbu (nejčastěji po přijetí), vysazují zahájenou terapii (nejvíce po propuštění), užívají léky nepravidelně nebo si mění dávkování podle toho jak se právě cítí (tím někdy naopak užijí vyšší dávku a kvůli nepřiměřeným nežádoucím účinkům pak léky vysadí úplně). Nespolupráci zjistíme (1) na základě informace pacienta (přímý dotaz, speciální škály spolupráce – např. DAI-10), (2) přímým pozorováním, (3) počítáním tablet nebo (4) biologickou analýzou hladin psychofarmaka v krvi nebo moči. Na nespolupráci při léčbě schizofrenie se podílí (1) vliv medikace (vedlejší účinky, negativní subjektivní reakce na léčbu), (2) vliv schizofrenního onemocnění, (3) vliv osobnosti a postojů pacienta a jeho rodiny, (4) vliv ošetřujícího personálu. 1) VLIV MEDIKACE Jedenáct ze 12 studií v přehledu Younga et al. (1986) zjistilo přímý vztah mezi nespoluprací v léčbě a vedlejšími účinky (NÚ) farmakoterapie. Vysoké skóre škál NÚ v několika studiích predikovalo špatnou spolupráci a čtvrtina až dvě třetiny pacientů uváděly NÚ jako hlavní příčinu nespolupráce (přehled Fenton et al., 1997). Nemocní nejhůř snášeli akutní extrapyramidové příznaky, polékovou dysforii, sedaci, přibývání na váze a sexuální dysfunkce. a) Polékové extrapyramidové syndromy (EPS). EPS byly v různých studiích u 28–52 % pacientů se schizofrenií příčinou vysazení depotních antipsychotik 1. generace (Young et al., 1986) a byly zjištěny u 89 % osob odmítajících medikaci (Van Putten, 1974). Po první životní zkušenosti s polékovými EPS řada nemocných odmítala dále antipsychotika 1. generace užívat. Nejčastěji k tomu docházelo při vzniku akatizie (67 %), méně často při parkinsonských projevech (rigidita 54 %, třes 36 %) (ibid.). V některých studiích byla nepříjemně prožívána také poléková akineze. Subjektivní nepohoda z akatizie (20,2 %) a z akineze (24,7 %) převažovala v jedné práci nad kombinacemi všech dalších EPS (Weiden a Zygmunt, 1999).

b) Poléková dysforická reakce (NID). Negativní emoční odpověď na léčbu je při podávání antipsychotik 1. generace poměrně častá. Awad a Hogan (1994) ji popsali první den po nasazení medikace při akutním relapsu schizofrenie u 45 % léčených pacientů. Významný vztah mezi NID a nespoluprací potvrdilo několik studií. Úzká je vazba mezi NID a akatizií. c) Vzestup hmotnosti, sedace, sexuální dysfunkce. Vliv dalších nežádoucích účinků na spolupráci byl sledovaný méně systematicky. V jedné studii prožívali pacienti na depotní medikaci subjektivně hůř sedaci, vzestup hmotnosti, sexuální dysfunkce a akatizii, než např. akinezi, třes, rigiditu a dystonii (Buis, 1992). 2) VLIV PSYCHICKÉHO ONEMOCNĚNÍ a) Schizofrenie. Obecně se předpokládá horší spolupráce při léčbě u osob s menším náhledem onemocnění, s převahou hostility a agresivity v rámci pozitivních schizofrenních příznaků nebo při větším kognitivním poškození, které brání přiměřenému plánování spolupráce. V několika studiích byl nalezený významný vztah nespolupráce a těžší psychopatologie. Naopak vztah ke kognitivním poruchám je sice velmi pravděpodobný, ale zatím není ve studiích dostatečně prokázaný. b) Abusus drog a alkoholu. Abusus drog v posledním období před vyšetřením byl opakovaně popsaný jako jeden z nejsilnějších prediktorů nespolupráce pacienta v léčbě schizofrenie. Komorbidita abusu drog s onemocněním schizofrenií tedy představuje jedno z nejvážnějších nebezpečí pro terapeutickou prognózu. 3) VLIV OSOBNOSTI A POSTOJŮ PACIENTA A JEHO RODINY Nedostatečný náhled na chorobnost potíží a pochopení vztahu mezi léčbou a ústupem psychopatologie souvisí jen částečně se závažností onemocnění. Významnou roli hraje také nedostatečná edukace pacienta a jeho rodiny, obecné názory laické veřejnosti na původ a léčbu duševních nemocí, nebo pochopitelná neochota připustit si závažnost svého stavu a jeho rizika. Nosoagnosie a negativní názor na účinnost farmakoterapie v několika studiích patřily, kromě abusu drog, k vůbec nejsilnějším prediktorům špatné spolupráce v léčbě. V jedné studii charakterizoval schizofrenní pacienty nespolupracující po propuštění z hospitalizace abusus drog v poslední době, potíže při rozpoznávání symptomů nemoci, malá spolupráce s ošetřujícím personálem a odmítavý postoj rodiny k pomoci při zajištění léčby. Jiným významným prediktorem nespolupráce, který souvisí s osobností a s postoji nemocného je průkaz vysazování medikace v anamnéze. 4) VLIV OŠETŘUJÍCÍHO PERSONÁLU a) Vztah pacienta a ošetřujícího personálu. Opakovaně byl prokázaný významný vliv narušeného vztahu lékaře a pacienta na spolupráci při léčbě. V jedné studii např. byla zjištěna nespolupráce u nemocných se špatným vztahem k lékaři v 76 % a při dobrém vztahu jen ve 26 %. b) Léčebná strategie lékaře. Příliš vysoké dávkování, přerušovaná léčba, volba preparátů s vyšším rizikem NÚ, neindikovaná polyfarmacie nebo příliš krátká udržovací léčba mohou způsobit psychické zhoršení, vyšší výskyt NÚ nebo zhoršit vztah mezi pacientem a lékařem. Následky nevhodných terapeutických postupů opět vedou ke zhoršení spolupráce v léčbě, a tím k horší prognóze základního onemocnění. Pro spolupráci osob se schizofrenií má větší význam vnímání zisků z léčby než prožívání NÚ. Spolupráci přitom zvyšuje pouhé očekávání zisků z léčby. Pro nemocné jsou obvykle důležitější nepřímé zisky (lepší rodinná atmosféra, vyhnutí se injekcím nebo nové hospitalizaci), než vlastní zlepšení psychického stavu. Asi 20 % variance spolupráce vysvětlí komponenty hypotetického modelu důvěry v uzdravení, u chronických pacientů je však tento vztah více narušený. V přehledu 39 studií rizikových faktorů spolupráce při užívaní medikace nejkonsistentněji předpovídal nespolupráci špatný náhled nemoci, negativní postoj k léčbě, subjektivní reakce na medikaci, předchozí nespolupráce, abusus drog, kratší trvání onemocnění, nepřiměřené plány na propuštění nebo špatný terapeutický vztah (Lacro et al., 2002). U rizikové skupiny pacientů, u kterých jsme schopni předpovídat zhoršenou spolupráci při léčbě je zvlášť důležité míru spolupráce dostupnými prostředky zvýšit. Z psychosociálních intervencí se nejlépe osvědčují kognitivně behaviorální postupy zaměřené na řešení konkrétního problému a užití motivačních technik, nebo intervence zaměřené na odstranění technických bariér při braní léků. Ve farmakoterapii je kromě správné léčebné strategie nejvýznamnější volba vhodného antipsychotika. V současné době lze spolupráci podstatně zvýšit aplikací depotního antipsychotika 1. generace, jehož ordinace může snížit nespolupráci proti perorálnímu podávání klasického antipsychotika ze 46 % na 15–20 % (Weiden a Olfson, 1995).

Lepší spolupráce se však dosáhne za cenu nepříznivého spektra nežádoucích účinků a menší terapeutické účinnosti, typické pro antipsychotika 1. generace. Druhou cestou ke zvýšení spolupráce je aplikace perorálního antipsychotika 2. generace s širším spektrem působení a obecně menším výskytem NÚ, ale také s menší možností kontroly užívání. Studií zaměřených na zlepšení spolupráce při perorálním užívání antipsychotik 2. generace je zatím velmi málo. Užívání medikace bylo v dvojitě slepé studii po roce významně častější u klozapinu než u haloperidolu (57 % vs. 27 %, p<0,001) (Rosenheck et al., 1997). Metaanalýza 6 srovnávacích studií zjistila významně méně časté přerušení medikace na risperidonu než na haloperidolu (Davies et al., 1998). Předběžné výsledky potvrzují předpoklad o zlepšení spolupráce při podávání antipsychotik 2. generace. prim. MUDr. Michal Maršálek, CSc. Psychiatrická léčebna Bohnice Ústavní 91 181 02 Praha 8 – Bohnice tel.: 284016242 fax: 283850183 e-mail: [email protected] Literatura 1. Awad AG, Hogan TP. Subjective response to neuroleptics and the quality of life: implication for treatment outcome. Acta Psychiatr Scand 1994; 89 (suppl 380): 27–32. 2. Buis W. Patients‘ opinions concerning side effect of depot neuroleptics. Am J Psychiatry 1992; 149: 844–845. 3. Davies A, Adena MA, Keks NA, et al. Risperidone versus haloperidol: I Meta-analysis of efficacy and safety. Clin Ther 1998; 20: 58–71. 4. Fenton WS, Blyler CR, Heinssen RK. Determinants of medication compliance in schizophrenia: empirical and clinical findings. Schizophr Bull 1997; 23: 637–651. 5. Lacro JP, Dunn LB, Dolder CR, et al. Prevalence of and risk factors for medication nonadherence in patients with schizophrenia: a comprehensive review of recent literature. J Clin Psychiatry 2002; 63: 892–909. 6. Rosenheck R, Cramer J, Xu W, et al. A comparison of clozapine and haloperidol in hospitalized patients with refractory schizophrenia. Department of Veterans Affairs Cooperative Study Group on Clozapine in Refractory Schizophrenia. A Engl J Med 1997; 337: 809–815. 7. Young JL, Zonana HV, Shepler L. Medication noncompliance in schizophrenia: codification and update. Bull Am Acad Psychiatry Law 1986; 14: 105–122. 8. Van Putten T. Why do schizophrenic patients refuse to také their drugs? Arch Gen Psychiatry 1974; 31: 67–72. 9. Weiden P, Olfson M. Cost of relapse in schizophrenia. Schizophr Bull 1995; 21: 419–422. 10. Weiden P, Zygmunt A. Which side-effects really matter to our patients? Clear Perspectives: Management Isues in Schizophrenia. Approaches to Schizophrenia Communication 1999; 2: 5–11.

ROSTRAL MIGRATORY STREAM AND SUBVENTRICULAR ZONE DURING POSTNATAL DEVELOPMENT IN RAT Martončíková Marcela, Račeková Enikő, Orendáčová Judita, Poušová Barbora Institute of Neurobiology, Slovak Academy of Sciences, Košice Slovak Republic Abstract We have studied differences in anatomy, histochemistry and immunohistochemistry of the rat subventricular zone (SVZ) and rostral migratory stream (RMS) during early postnatal development. Our study indicates, that there are spatio-temporal changes in anatomy and morphology of the RMS among animals in different stages of the postatal development and also in the number of proliferating cells. NADPH-d positive cells appeared in the SVZ and RMS at the first time in two-weeks-old rats. This period seems to be critical in postnatal neurogenesis. After the second postnatal week neurogenesis is influenced

by nitric oxide. Key words: postnatal development, SVZ, RMS, neurogenesis Introduction The SVZ is an important germinal layer formed during development adjacent to the telencephalic ventricular zone. This layer is most prominent in the lateral wall of the lateral ventricle. The SVZ persists into adulthood and it retains the capacity to generate both neurons and glia. Cells generated in the SVZ migrate along a restricted pathway, called the rostral migratory stream – RMS, to the olfactory bulb (OB), where they differentiate into granular and periglomerular neurons. The cells in the RMS migrate as elongated aggregates of cells called chains without the aid of radial glia or axonal guides. Adult neurogenesis was initially described in rodents (Altman, 1965). Recently, neurogenesis has also been detected in adult primates and humans (Eriksson et al., 1998; Gould et al., 1998) by the most widely used molecular marker of dividing cells – BrdU, which was introduced by Grantzner (1982). Despite the fact that the neurogenesis in the forebrain has been extensively studied, the developmental changes of the SVZ and RMS in the early postnatal periods have not been fully characterized. The aim of this study was to analyze and compare anatomical, histochemical and immunohistochemical changes in these regions of postnatal day 3 (P3), P7, P14, P21, P28 rats. In order to reveal anatomical changes in the forebrain after birth, the sections were stained with Gill’s hematoxylin. To label proliferating cells in the SVZ and RMS the rats received injection of the cell proliferation marker bromdeoxyuridine (BrdU) which is incorporated to the DNA of the cells in S-phase of the cell cycle. It has been shown that the antiproliferative action of nitric oxide (NO) is a prerequisite for a cell differentiation (Peunova and Enikolopov, 1995). In order to detect NO positivity we used NADPHdiaphorase (NADPH-d) histochemistry. Materials and methods The experiments were performed on Wistar albino rat pups on postnatal day 3 (P3), P7, P14, P21 and P28 (P0 = day of birth). In order to label dividing cells the rats were anesthetized (P3 by hypothermia, P7–P28 by Halotane inhalation) and injected i. p. with BrdU (50 mg/kg dissolved in 0,007 N NAOH in 0,9% NaCl) (Sigma). Two hours after the administation of BrdU the animals were anesthetized with mixture of ketamine (0,4 ml/100g) and xylazine (0,2 ml/100g) and perfused trancardially with 0,9% saline followed by 4% paraformaldehyde in 0,1 M phosphate buffer (PB). The brains were postfixed for two days. Sagital 42µm sections were cut on a cryosat from the lateral side to the midline of the hemisphere. To describe and compare general morphology of the RMS and SVZ in early postnatal stages, the sections were stained with Gill’s hematoxylin. Some sections were processed for immunohistochemistry using anti-BrdU antibody (dilution 1:500; Accurate, NY). The slides were viewed with light microscope (Olympus BX 51). Images were processeed using PowerPoint. Alternative sections were used for NADPH-d histochemistry (Sigma Chem. Co., N-1630) and counterstained with neutral red. All sections which included the RMS were chosen for image analysis. The sections stained with NADPH-d or Gill’s hematoxylin were examined by light microscopy and also camera lucida drawings were made. Results and discussion The SVZ surrounding the lateral ventricles contains neuronal precursors that retain their proliferative capacity throughout life. These precursors migrate through the RMS to the OB, where they differentiate into interneurons. Our study characterizes the spatio-temporal changes in the SVZ and RMS at early postnatal stages in rats, i. e. during the period of conspicuous telencephalic changes. The RMS of rats in sagittal sections appeared as a thick L-shaped column composed of tightly packed cells, which spanned the anterior horn of the lateral ventricle and the olfactory bulb. The RMS was easily distinguishable from surrounding tissue because of its higher cell density. This L-shaped structure had a vertical and a horizontal arm. The vertical arm begins at the anterior part of the lateral ventricle, curves ventrally, then turns in a prominent angle and directs rostally creating the horizontal arm which penetrates the OB. There was a gradual reduction of the SVZ and RMS in thickness from P3 to P28, but the length of the RMS gradually increases. The sections stained with Gill’s hematoxylin revealed that the RMS of the P3

and P7 rats has almost the same thickness along its caudo-rostral extension. In these periods the RMS seems to be the thickest one. In contrast the thickness of the RMS varied throughout its extension in older rats (P14, P21, P28). The widening of the angle localized between the horizontal and the vertical arm of the RMS became more evident after two postnatal weeks. To compare proliferative capacity of the SVZ and RMS in the early postnatal stages in rats, cells in S phase were labeled with BrdU. There was a large number of BrdU positive cells in the RMS of threedays-old rat. The number of BrdU positive cells decrease in P7, P14, P21, but increased again in P28. Surprisingly, the number of proliferating cells was least in P14. Nitric oxide (NO) has signaling functions in the central nervous system (Garthwaite and Boulton, 1995). In the brain parenchyma, NO is synthesized by widely distributed specific neurons that express the neuronal isoform of NO synthase (NOS I) (Bredt et al., 1990; Rodrigo et al., 1994), which requires the co-substrate NADPH as an electron donor. NADPH-d is commonly used as a histological marker for NOS I. NO antiproliferative action was shown to be perequisite for differentiation (Peunova and Enikolopov,1995). Estrada et al. (1999) recently suggested that NO is an antimitotic agent in primary cultures of proliferating cells isolated from the SVZ. We observed NADPH-d positive cells in the SVZ and RMS at the first time in two-weeks-old rats. This suggest, that P14 is a critical period for postnatal neurogenesis which continues throughout the life under NO influence. Our results correspond with previous findings (Menezes et al., 1998; Bond and Farmer, 1983) that neurogenesis during first two postnatal weeks is controlled by mechanisms different from the adult. Our study indicates, that there are spatio-temporal changes in anatomy and morphology of the RMS among animals in different stages of the postatal development and also in numbers of BrdU-positive cells, but it requires additional study. We conclude that cells in the SVZ and RMS begin to differentiate in P14.

Acknowledgements. This work was supported by VEGA Grants No. 2/3218/23 and 2/2082/22. RNDr. Marcela Martončíková Neurobiologický ústav SAV Šoltésovej 4 040 01 Košice tel.:+421(55) 678 5064, fax:+421(55)678 5074 e-mail: [email protected] References Altman JJ. Comp Neurol 1965; 124: 319–335. Bond JF, Farmer SR. Mol Cell Biol 1983; 3: 1333–1342. Bredt DS, Snyder SH. Neuron 1994; 13: 301–313. Eriksson PS, Perfilieva E, Bjork-Eriksson T, Alborn AM, Nordborg C, Peterson DA, Gage FH. Nat Med 1998; 4: 1313–1317. Estrada C, Marredona ER, Murillo-Carretero M, Noval JA, Moreno-López B. Abstacts Soc Neurosci 1999; 25: 1542. Garthwaite J, Boulton CL. Annu Rev Physiol 1995; 57: 683–706. Gould E, Tanapat D, McEwen BS, Flugge G, Fuchs E. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 3168–3171. Grantzner HG. Science 1982; 218: 474–475. Menezes JRL, Dias F, Garson AVB. Anat Embryol 1998; 198: 205–211. Peunova N, Enikolopov G. Nature 1995; 375: 68–73. Rodrigo J, Springall DR, Uttenthal O, Bentura ML, Abadia-Molina F, Riveros-Moreno V, MartínezMurillo R, Polak JM, Moncada S. Phil Trans R Soc Lond B 1994; 345: 175–221.

CEREBELO-OLIVÁRNÍ ATROFIE S DEMENCÍ A CEREBELLAR-OLIVAR ATROPHY WITH DEMENTIA Masopust Jiří, Urban Aleš, Hosák Ladislav, Slabá Libuše, *Urbanová Elen

Psychiatrická klinika, *Oddělení nukleární medicíny, Lékařská fakulta Univerzity Karlovy a Fakultní nemocnice Hradec Králové Summary A progressive cerebellar syndrome with ataxia, dysartria, and adiadochokinesia is typical in spinocerebellar ataxia (SCA). A cognitive deficit is also frequently found in SCA patients. We describe a case of a thirty-seven-year-old woman patient with a progressive ataxia and dementia. She has been hospitalized at the Dpt. of Psychiatry, University Hospital in Hradec Králové from March to April 2000. Neurological symptoms as gait and speech impairment appeared in 1994 for the first time. After six years, behavioral disturbances related to dementia also became evident. The SPECT brain imaging revealed a cerebellar atrophy with a hypoperfusion, and an impaired perfusion in the parietal cortex. The results of other brain examinations (CT, MRI, EEG, neuropsychology) were concordant with the SPECT. We successfully treated the patient with a combination of psychotropics (piracetam, tiapride, alpha-tokoferol), rehabilitation, and supportive psychotherapy so that she could have been discharged from the hospital. After half a year, the clinical state significantly worsened. No effective long-term treatment for the SCA patients has been developed as yet. Because of a genetic background of SCA, a gene therapy of this serious neuropsychiatric disease could be considered in the future. Key words: cerebellar-olivar atrophy, dementia, brain imaging, therapy Klíčová slova: cerebelo-olivární atrofie, demence, zobrazování mozku, léčba Úvod Spinocerebelární ataxie (SCA) jsou heterogenní skupinou neurodegenerativních onemocnění. Ke společným projevům patří klinický obraz plíživě progredujícího mozečkového syndromu neocerebelárního a paleocerebelárního typu s ataxií, dysartrií a adiadochokinezí. Rozdíly nacházíme v hereditárním nebo sporadickém výskytu, ve věku klinické manifestace a v případném současném postižení dalších mozkových struktur (Urbánek, 2000).V posledních letech byla vyřešena řada geneticky podmíněných příčin heredofamiliárních ataxií. Modifikaci klasifikace progresivních familiárních ataxií Greenfieldové nabízejí Adams a Victor (1989). Různý stupeň kognitivního deficitu se vyskytuje prakticky u všech známých forem cerebelárních heredoataxií. Demenci nacházíme při současné atrofii mozkové kůry parietálně a frontálně. Popisujeme případ ženy s progresivní ataxií a demencí. Kazuistika Od března do dubna 2000 byla na Psychiatrické klinice v Hradci Králové (PK HK) hospitalizována sedmatřicetiletá žena. Matka pacientky se léčila pro cerebelární ataxii a bratr pro epilepsii. Nemocná po studiu na vysoké škole pracovala jako veterinární lékařka. Pacientka byla prvně vyšetřena a hospitalizována na neurologii v roce 1994 pro zhoršení chůze, zakopávání o špičku, postižení jemné motoriky horních končetin a zpomalení řeči. Závěr zněl „lehká cerebelární symptomatologie s počínající deteriorací intelektu“. Provedená vyšetření nepotvrdila podezření na neuroborreliózu nebo demyelinizační onemocnění typu roztroušené sklerózy mozkomíšní. Při vyšetření počítačovou tomografií (CT) mozku byla výrazná atrofie infratentoriálně a mírná korová atrofie supratentoriálně. Vyšetření magnetickou rezonancí (MRI) mozku ukázalo výraznou atrofii mozečku a náznak atrofie biparietálně. Opakované vyšetření MRI o tři roky později prokázalo pokračující úbytek mozkové tkáně v parietálních lalocích. Likvorologický nález byl v normě.Vyšetření evokovaných potenciálů nepřineslo nález specifický pro některou ze zvažovaných diagnóz. Oční lékař prokázal obrnu přímého zevního svalu pravého oka. Nic nesvědčilo pro degenerativní onemocnění sítnice. Při dalším pobytu na neurologii v roce 1998 byla stanovena velmi pravděpodobná diagnóza cerebelo-olivární atrofie Holmesova typu. Doporučena byla medikace cinnarizinem, piracetamem a vitaminy. Ke zhoršení stavu došlo v lednu 2000. Nemocná špatně polykala tuhá sousta, nastal váhový úbytek. Objevily se tranzitorní stavy zmatenosti a neklidu. Po nasazení tiapridu v dávce 300 mg denně byla apatická, ospalá a padala. V neurostatu byla patrná cerebelárně skandovaná řeč, třes hlavy a horních končetin, hrubý nepravidelný nystagmus 1. stupně doprava i doleva, hyporeflexie, palhypestezie, na horních i dolních končetinách byla symetrická dystaxie a adiadochokineze, hypermetrie. Chůze byla cerebelárně ataktického typu, nejistá, s naznačenými titubacemi. Při přijetí na PK HK pro poruchy chování při demenci v březnu 2000 pacientka udávala, že zapomíná, nechává puštěnou vodu a plyn, má potíže s chůzí a je zlá na syna. Vyšetřujícímu psychiatrovi odpovídala

v holých větách, časem byla dezorientována, správně orientována byla osobou, místem a situací. Emotivita byla oploštělá, místy přítomna tupá euforie a myšlení bylo zpomalené. V psychopatologii dominovaly mnestické poruchy, pokračující úbytek intelektu byl zřejmý. EEG záznam svědčil pro poruchu schopnosti mozku pracovat v různých režimech za klidu a při aktivitě. Při vyšetření SPECT mozku byla popsána atrofie a hypoperfuze mozečku včetně vermis a difúzně nehomogenní perfuze šedé kůry mozkové. V parietálních lalocích se nacházely suspektní drobnoložiskové defekty perfúze. Při neuropsychologickém vyšetření narušení kognitivních funkcí strukturálně odpovídalo difuznímu poškození mozku s maximem parietálně a pravděpodobně parieto-okcipitálně. Diagnostický závěr zněl „F02.8 Demence u ostatních chorob klasifikovaných jinde“. Z léků byl podáván piracetam 3200 mg denně, tiaprid 50 mg na noc v kapkách a a-tokoferol 100 mg pro die. Při intenzivní rehabilitační péči došlo ke zlepšení chůze. Upravily se zejména poruchy chování při demenci a spánek. Po propuštění docházela do stacionárního zařízení k rehabilitaci pracovních a sociálních schopností. V listopadu 2000 byla znovu přijata na psychiatrii pro narůstající verbální a fyzickou agresivitu vůči rodině a psychomotorický neklid. Léčba probíhala obdobně. Dále byla nemocná dvakrát hospitalizována ve spádové psychiatrické léčebně. Dlouhodobě pobývá v ústavu sociální péče. Diskuze Popsané příznaky patří do skupiny onemocnění SCA. Na základě klinického obrazu a provedených vyšetření je pravděpodobná diagnóza cerebelo-olivární atrofie Holmesova typu. Přesná klasifikace je možná pouze na podkladě molekulárně genetického vyšetření. U pacientky se jednalo o familiární výskyt onemocnění. Sporadické formy jsou řazeny k multisystémové atrofii (Rehman, 2001). Z psychiatrického hlediska je v podobných případech důležitá diferenciální diagnostika demencí. Výsledky vyšetření pomocí morfologických i funkčních zobrazovacích metod (CT, MRI, SPECT) odpovídají klinickému obrazu, psychiatrickému, neurologickému a psychologickému vyšetření a navzájem se doplňují. Autoři vysledovali dvě oblasti postižení (cerebelární a parietální symptomatologie). V popsaném případě mělo neuropsychologické vyšetření význam pro bližší specifikaci kognitivního deficitu. S demencí u cerebelárních heredoataxií se v psychiatrické praxi setkáváme zřídka. Kauzální léčba neexistuje. Kazuistika ukazuje dočasný, ale zřetelný efekt rehabilitace v kombinaci s farmakoterapií a podpůrnou psychoterapií. SCA se nacházejí na pomezí neurologickém a psychiatrickém. Genová terapie by mohla mít v budoucnu velké uplatnění v léčbě tohoto dědičného onemocnění.

MUDr. Jiří Masopust Psychiatrická klinika FN a LF UK Hradec Králové 500 05 Tel. 49 583 3376 nebo 2228 Fax 49 5511677 [email protected] Literatura Adams RA, Victor M. Principles of Neurology. New York: McGraw-Hill, Inc. 1989; 946–952. Rehman HU. Multiple system atrophy. Postgrad Med J 2001; 77: 379–382. Urbánek K. Neurodegenerativní onemocnění. Praha: Triton 2000; 223.

REHABILITATION OF MENTAL DISORDERS IN POLAND Joanna Meder, Maryla Sawicka, Katarzyna Sierosławska Department of Psychiatric Rehabilitation, Institute of Psychiatry and Neurology The meaning of term “rehabilitation” has been considerably widened in the past fithteen years. Rehabilitation includes many forms of psychotherapeutical activities, family therapy and education as well as various community actings.

Special emphasis is being put on the complex rehabilitation programs so that they take patient’s major problems into consideration. It usually requires constructing an individual activity’s program- depending on the patient’s shortcomings- which concerns 4 basic spheres (1): personal, family, professional and community (2). In the recent years forms of care over families have also gradually developed, now there are not only family outpatient clinics but also family interventions when the acute crisis occurs. Restoring and maintaining the abilities concerning socializing with people and solving the problems is one of the main goals of psychiatric rehabilitation. Many researches have shown that behavioral trainings are the most efficient forms of rehabilitation as far as mental disorders are concerned. Behavioral trainings (3) applied in rehabilitation are divided into 3 groups: 1. Self-care trainings: hygienic, cookery, budget, practical skills, professional training. 2. Social skills trainings: carry on conversation training, problems solving training. 3. Psychoeducational trainings: active participation in the pharmacological treatment training (4) and recognizing early psychotic symptoms training (5). Skilful application of the behavioral trainings in rehabilitation helps in counteracting the relapses of the illness and establishing a collaboration between medical staff and a patient as well as improves patient’s functioning in the community. Family’s role in the rehabilitation Work with the family is as crucial as work with the patient, especially at the beginning of the treatment (6). Family’s attitude influences strengthening the attained skills and applying them in everyday life. Relatives, after getting over the first shock concerning “an illness in family”, are doing their best to help the patient and that’s why they should learn how to do it skillfully. There are regular, weekly psychoeducational meetings for the families all over Poland. With the time being families take an initiative themselves and support each other. If there’s such a need group activities are supported with an individual work with the family, including some elements of family therapy. Professional and occupational rehabilitation For the last ten years great attention has been being paid to the rehabilitation programs aiming at enabling the patient to return to normal or sheltered work. The whole program of day, occupations and preparation to work is being structurally transformed as it is gradually transmitted from closed institution to community, municipality or local district. There are not only occupational rooms in the hospitals but also occupational therapy workshops, social firms and projects of the professional activity institutions. Occupational therapy Occupational therapy has always been an extremely important part of rehabilitation. It was often treated as a form of psychotherapy for persons with severe mental disorders aiming at tasks and creating opportunities for number of social and psychological actings. Ergotherapy helps to use patients’ activity in the mental disorders treatment. In most of the psychiatric hospitals in Poland there were and often still are, occupational therapy workshops or workrooms. The occupations are organized and conducted in accordance with humanistic principles. Occupational therapy workshops Occupational therapy workshops have been being established by the Ministry of Labor and Social Policy since 1992. Their aim is to prepare patients for both self-reliance and work. Patients admitted to the workshops are chronically mentally ill, don’t require treatment in mental services and their disability to work is certified by a commission. They qualify for the rehabilitation in the form of occupational therapy though. There are no limitations as for the time of rehabilitation in the workshops, except for the state of health of the participants and course of their rehabilitation. Functioning of the workshops resembles rather a working place than an outpatient clinic, which is attained through providing such elements as: signing a list, settling a working day, being on duty, preparing a meal, organizing an entertainment as well as receiving a modest salary. Occupations in the workshops can be divided into three groups: occupations aiming at enhancing psychophysical fitness, adaptation and social

functioning, artistic occupations and preparation for work. Professional rehabilitation of mentally ill persons is an urgent problem nowadays. When free- market economy was introduced in Poland in 1991, the chances of disabled persons to be employed dramatically decreased. There are no new posts, no cooperatives of the handicapped and these already existing are facing bankruptcy because of the financial problems and lack of demand. Social support system In order to obtain a complete picture of patient’s possibilities, the reality of patient’s support system is assessed (extent, intensity, variety, multidimensionality) (7). This system usually malfunctions in the course of the illness and needs to be restored during rehabilitation. Social support system is very important for every human being, especially for the ill one. 260 “self- help day houses” have been established in Poland in the past ten years in order to extend this system. These centers provide support, reference groups, day’s structure as well as self- help training for the persons who are unable to participate in more challenging and structuralized programs conducted for example within occupational therapy workshops. In order to let the most severe ill persons live in the community, programs of support in the patients’ houses were introduced. These are so called “specialized and nursing services”. The least developed program, essential for enabling the patients to live in the community is sheltered flats program. In the whole country there are 100 of them that are registered. Associations of families and patients Gradual involvement of families’ and patients’ associations in establishing rehabilitation programs was a real landmark in the nineties. It accompanied the process of coming the civil society into existence and overtaking many initiatives concerning social life by non-governmental organizations.

Joanna Meder, MD. Institute of Psychiatry and Neurology Sobieskiego 9 02-957 Warsaw Poland Literature 1. Rzewuska M. Zasady prowadzenia leczenia podtrzymującego w schizofrenii, Instytut Psychiatrii i Neurologii, Warszawa, 1992. 2. Meder J. red. Rehabilitacja przewlekle chorych psychicznie, Biblioteka Psychiatrii Polskiej, Kraków, 2000. 3. Meder J. red. (1996) Trening umiejętności społecznych w rehabilitacji zaburzeń psychicznych, Wydawnictwo Naukowe SCHOLAR, Warszawa. 4. Meder J. (1995) Aktywny udział pacjentów w leczeniu farmakologicznym, Fundacja Instytutu Psychiatrii i Neurologii, Warszawa. 5. Liberman R. (1995) Social and independent living skills. The community re-entry program, West Los Angeles. 6. Kuipers L, Leff J, Lam D. (1997) Praca z rodzinami chorych na schizofrenię. Poradnik praktyczny, Instytut Psychiatrii i Neurologii, Warszawa. 7. Shepherd G. (1999) Rehabilitacja w psychiatrii, Towarzystwo Amici di Tworki, Pruszków.

Na+-K+ stimulovaná ATPáza v CNS a adrenergní stimuly Na+-K+ dependent ATPase in the brain and adrenergic stimulation Mourek J. Fyziologický ústav 1. lékařské fakulty UK, Praha

Souhrn Na základě našich vlastních pokusů konstatujeme, že u nejmladších jedinců (laboratorní potkani) je aktivita Na+-K+ dependentní ATPázy ovlivněna adrenergními stimuly (via b receptory) přímo, u dospělých organizmů modulace (řízení) tohoto základního enzymu se pak uskutečňuje prostřednictvím katecholergních systémů. Přímý vliv adrenalinu u nejmladších jedinců chápeme jako významný fyziologický regulačně-adaptivní mechanizmus v průběhu perinatálního (a tedy vždy rizikového) období. Klíčová slova: Na+-K+-ATPáza, CNS, adrenergní stimulace, vývoj Summary It could be concluded that in the youngest rats the activity of Na+-K+ dependent ATPase in the brain (brain cortex) is modulated by adrenergic stimulation directly (via beta receptors). In adults the activity of mentioned basic enzyme for the functionning of nervous elements, is managed by means of katecholergic systems. The direct effect of adrenaline in the youngest animals could be interpreted as a important physiological and regulatory (adaptive) mechanism during the perinatal period of the development (which is always considered as a risk-peroid of the life span). Key words: Na+-K+-ATPase, brain, adrenergic stimulation, development Ouabain senzitivní ATPáza (E.C.6.1.3.) má pro funkce nervového systému naprosto klíčové postavení. Je odpovědná za iontovou kompartmentizaci a tím za základní fenomén nervové membrány, tj. polarizační napětí. Rozsah a energetickou náročnost tohoto procesu nejlépe posoudíme podle podílu spotřebovaného kyslíku (tedy aerobně získané energie – ATP) permanentně aktivní (uvedené) ATPázy. I když u člověka jsou uvedeny o něco nižší podíly, zjistili jsme, že v mozkové kůře dospělého laboratorního potkana (Wistar) se aktivita uvedeného enzymu podílí na celkové spotřebě kyslíku přibližně 45 %, ve tkáni podkorových formací (talamus, podkorová ganglia) přibližně 40 % a v tkáni prodloužené míchy něco přes 30 %. Tyto rozdíly jsou vysvětlitelné především různým podílem šedé a bílé hmoty v příslušných oddílech. Jestliže jsme tento výzkum provedli v průběhu postnatálního vývoje, potom na raných etapách ontogeneze byla naopak největší spotřeba kyslíku a tedy aerobně generované energie pro uvedený enzym v oblasti podkorových formací a prodloužené míchy (kolem 50 %). Problém adrenergní stimulace nervové tkáně je problémem letitým. Jako důležitý milník uvádím práci Leimdorfera a spol. (4), který poměrně striktně stanovil nepropustnost hematoencefalické bariéry pro katecholamíny. Je pochopitelné, že časem došlo k úpravám a doplňkům s tím, že osmotické či mechanické a tlakové stimuly tuto bariéru otevírají a dochází k průniku katecholamínů (2). Stimulace retikulární formace (RF) aplikací adrenalinu byla v minulosti již popsána (1). Intraperitoneální aplikace adrenalinu zvýšila vysoce statisticky významným způsobem aktivitu Na+-K+ -ATPázy v mozkové kůře jak u 5denních, tak u dospělých jedinců. Vůbec ale nezměnila tuto aktivitu v tkáni prodloužené míchy (5). Mechanizmus tohoto efektu u dvou rozdílných věkových skupin ale nemusí být tentýž. Víme, že na raných etapách ontogeneze hematoencefalická bariéra zdaleka není vyvinuta, a tak nemůžeme vyloučit, že tento efekt se uskutečnil u 5denních laboratorních potkanů „přímo“. Zjištění, že v mozku včetně mozkového kortexu, mozečku atd. jsou přítomny adrenergní receptory b1 a b2) a to v různé hustotě (v závislosti na věku, stavu organizmu atd.) nás vedly k tomu, že jsme uskutečnili několik sérií pokusů: V prvé sérii jsme zkoušeli vliv in vitro aplikovaného adrenergního farmaka (isoprenalinu) na aktivitu oubain-senzitivní ATPázy v tkáni mozkové kůry a prodloužené míchy u různě starých laboratorních potkanů. Ukázalo se, že izoprenalin vysoce statisticky významně zvýšil aktivitu tohoto enzymu ve tkáni mozkové kůry, a to u obou věkových skupin. Ve tkáni prodloužené míchy k významnému zvýšení došlo pouze u 5denních laboratorních potkanů, nikoliv ve skupině dospělých (7). Intraperitoneální aplikace izoprenalinu (0,15 mg/kg hmotnosti těla) vedla ke statisticky významnému zvýšení Na+-K+ stimulované ATPázy pouze v mozkové kůře 5denních laboratorních potkanů, nikoliv v mozkové kůře dospělých nebo ve tkáni prodloužené míchy. Oba pokusy svědčí nejen o přítomnosti adrenergních receptorů (b1), ale i o tom, že průnik tohoto adrenergního farmaka je do mozku možný pouze u nezralých jedinců s nedozrálou hematoencefalickou bariérou. Abychom, měli jistotu, realizovali jsme ještě další sérii, ve které jsme použili blokátoru adrenergních receptorů typu b a to propranololu. V pokusech in vitro byla inkubována tkáň mozkové kůry a to v přítomnosti isoprenalinu (10–5 mol) nebo v přítomnosti jak izoprenalinu, tak propranololu (10–5 mol).

Pokusy přesvědčivě dokázaly modulující význam beta receptorů v tkáni mozkové kůry a to jak u 5denních (!), tak u dospělých jedinců. Efekt izoprenalinu stimulující Na+-K+ ATPázu byl zcela vymazán blokátorem propranololem (8). Vlivem působení pneumooxidu dochází u dospělých jedinců k výraznému zvýšení dechové frekvence. Ukázalo se, že pobyt v prostředí obohaceném pneumoxidem (rovněž výrazným stimulátorem RF) vede k významnému zvýšení aktivity Na+-K+ dependentní ATPázy pouze ve tkáni mozkové kůry dospělých organizmů nikoliv u laboratorních potkanů starých 5 dní postnatálního života (6). Samozřejmě, že z interpretačních možností, mimo aktivační vliv pneumooxidu na RF, nemůžeme vyloučit ani např. vazodilatační účinek na mozkové cévy u dospělých jedinců s případným následným zvýšením metabolických procesů (u 5denních, resp. v průběhu vývoje průtok mozkem absolutně stoupá, ale na jednotku hmotnosti klesá). (Mimoto nejmladší laboratorní potkani vykazují v krvi vyšší pCO2.) V analyzujících úvahách nemůžeme vyloučit ani spoluúčast vnitřního prostředí na změnách aktivity Na+-K+ - ATPázy po aplikaci adrenalinu. Víme totiž z vlastních zkušeností a prací, že jeho aplikace např. průkazně zvyšuje u dospělých kalemii a rovněž obsah kalcia i po izoprenalinu se mění (stoupá – o případné zvýšené nabídce energetických substrátů nemluvě). Za zmínku stojí i náš nález (9) o tom, že po aplikaci adrenalinu signifikantně vzroste obsah kyseliny askorbové v mozkové tkáni (kortex, mesencefalon, cerebelum) u laboratorních potkanů (pouze u samců, nikoliv u samic). Tento nález lze (mimo jiné) interpretovat jako možný protektivní adaptační mechanizmus proti možné zvýšené lipoperoxidační aktivitě, kterou jsme po aplikaci katecholanimů v CNS rovněž popsali. Konstatujeme, že u nejmladších organizmů je ouabain senzitivní ATPáza ovlivněna (via adrenergní receptory b) CNS přímo, u dospělých organizmů dochází k modulaci tohoto enzymu prostřednictvím katecholergních systémů (3). Přímý vliv adrenalinu u nejmladších organizmů (event. vliv na další parametry) chápeme jako významný fyziologický regulačně-adaptivní mechanizmus v průběhu perinatálního (a tedy vždy rizikového) období. Prof. MUDr Mourek Jindřich, DrSc Fyziologický ústav 1. LF UK Albertov 5 12800 Praha 2 tel.: 224968403 e-mail: [email protected] Literatura 1. Bonvallet M, et al. J Physiol (Paris), 1955; 47: 651. 2. Hardebo JE, et al. Acta Physiol Scand 1997; 101: 342–350. 3. Langmaier M. 11. Konference Biol Psychiatrie, Luhačovice 11.–14.6. 2003. 4. Leimdorfer A, et al. Amer J Physiol 1947; 159: 588–595. 5. Mourek J. Physiol Bohemoslov 1979; 28: 573–576. 6. Mourek J. Sborník lék 1982; 84: 193–197. 7. Mourek J. Sborník lék 1985; 87: 109–115. 8. Mourek J. Sborník lék 1987; 89: 335–339. 9. Mourek, J., et al.: Sborník lék., 93, 1991, 11-18

ADRENERGNÍ RECEPTORY V CNS Mysliveček Jaromír Fyziologický ústav 1. lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Praze Souhrn: Adrenergní receptory patří do biologicky nejrozsáhlejší skupiny receptorů v organismu – mezi receptory spřažené s G proteiny. V tomto přehledném článku jsou receptory rozděleny podle sekvenční homologie, je popsána jejich lokalizace v CNS a jsou zmíněny nejdůležitější děje jimi mediované. Klíčová slova: adrenergní receptory, CNS, receptory spřažené s G proteiny Summary: Adrenoceptors belong to the broadest family of receptors in the organism – to the family of G protein-coupled receptors. In this review, there are the adrenoceptors divided into subfamilies according

to the sequence homology; the localization of adrenoceptors in central nervous system is described, and the most important events mediated via adrenopceptors in central nervous system are mentioned. Key words: adrenoceptors, central bnervous system, G protein-coupled receptors Adrenergní receptory patří do biologicky nejrozsáhlejší skupiny receptorových proteinů – do skupiny receptorů spřažených s G proteiny (Pin a Bockaert, 1999). Receptory se dělí podle shody v aminokyselinovém řetězci do několika rodin (tři hlavní a dvě vedlejší), které se dále dělí do podskupin. Z hlediska struktury jde o glykoproteinové řetězce, které procházejí 7× membránou, přičemž vytvářejí strukturu podobnou kapse, do níž se v případě podskupiny receptorů pro malé signální molekuly (podskupina 1a první rodiny receptorů) příslušný ligand zasouvá (a poté interaguje s aminokyselinovými zbytky v transmembránových oblastech). To je právě případ adrenalinu a noradrenalinu jako přirozených neurotransmiterů, které se váží na adrenergní receptory. Pokud je transmiterem peptid, váže se na dlouhý extracelulární N-konec (podskupina 1b a 1c). Podobně je tomu i u druhé rodiny (která má podobná vazebná místa), ale liší se dle sekvenční homologie výrazně od 1c podskupiny. Druhá rodina zahrnuje receptory pro ligandy o vysoké molekulové váze. Naproti tomu třetí rodina (metabotropní glutamátové receptory, GABAB receptor, receptor pro sladké) má značně dlouhý N-konec, na který se váží přirozené ligandy (uměle vytvořené látky, které receptory aktivují se váží do jiného místa). U této rodiny nemají transmembránové oblasti význam pro interakci s ligandem, mohou se však uplatnit při vazbě syntetických ligandů. Čtvrtá rodina váže feromony a pátá se uplatňuje v embryogenezi. Ve všech případech mění navázání ligandu konformaci proteinu, což vede ke změně afinity k transduceru (přepojovací molekule) – tj. ke G proteinu. Schéma receptorů spřažených s G proteiny a jejich interakce s ligandy u jednotlivých rodin je na obrázku 1. Významnou vlastností receptorů spřažených s G proteiny je multiplikace signálu, který je přenášen do intracelulárního prostředí. To je zajišťováno právě spřažením s G proteiny. Kromě toho jsou G proteiny i molekulou odpovědnou za aktivaci či inhibici jednotlivých enzymů, které vytvářejí druhého posla. Přehled interakcí receptorových podtypů adrenergních receptorů a mezi jednotlivými G proteiny, respektive jejich podjednotkami a efektorovými enzymy je v tabulce 1.

V centrálním nervovém systému se vyskytují jak a adrenergní receptory, tak receptory b-adrenergní. Tyto podtypy se liší jak distribucí v CNS, tak svými účinky a ději, do nichž se v rámci CNS zapojují. a-adrenergní receptory Jak je patrné z tabulky 1, a adrenergní receptory se dále dělí na a1 a a2 receptory, přičemž tyto podtypy existují ještě v dalších skupinách. Přestože a1 adrenergní receptory jsou predominantně zastoupeny v hladké svalovině cév, v CNS se mohou vyskytovat jednak v hipokampu, kortexu, mozkovém kmeni a míše. Právě v míše se mohou podílet na facilitaci aktivity motoneuronů. Stimulace prefrontálních a1 adrenergních receptorů vedla k symptomům zhoršení pracovní paměti, chabé pozornosti či disinhibovanému chování u neuropsychických onemocněních. Experimentálně bylo prokázáno, že stimulace a1 adrenergních receptorů snižuje pravděpodobnost výbojů i a uvolnění glutamátu v cornu ammonis hipokampu. V CNS se vyskytuje především podtyp a1A. Ostatní podtypy mohou zvýšit v CNS svou density teprve při aplikaci reserpinu, jak to platí pro a1B adrenergní receptory (pro přehled viz Calzada a de Atinano, 2001). V minimální míře se v potkaním kortexu vyskytují i a1D adrenergní receptory. Naproti tomu a2adrenergní receptory mají tkáňovou expresi spíše opačnou k a1 adrenergním receptorům: jsou poměrně bohatě zastoupeny v CNS, mimoto se vyskytují i v plicích, myometriu a na krevních destičkách. V expresi a2 adrenergních receptorů v CNS existují výrazné mezidruhové rozdíly. Hlavní funkcí centrálních a2 adrenergních receptorů je zprostředkování centrální hypotenzivní odpovědi, kromě toho působí i periferní vazokonstrikci, avšak u jedinců je tento efekt potlačit hypotenzivní účinkem zprostředkovaným centrálními a2-adrenergními receptory. Podtypově jde v CNS o a2A a a2D adrenergní receptory. V páteřní míše se podílejí na modulaci bolesti. Aktivace a2 adrenergních receptorů v paraventrikulárním jádře vede ke zvýšení příjmu potravy, naopak aktivace a1 adrenergních receptorů má opačné účinky. b-adrenergní receptory b-adrenergní receptory existují ve třech podtypech, mimoto existuje i velice zvláštní vazebné místo jako stav b1 adrenergních receptorů s nízkou afinitou k běžným antagonistům, donedávna považované za pravděpodobný podtyp b4. Podtypová lokalizace b-adrenergních receptorů je na rozdíl od a adrenergních receptorů výraznější: b1 adrenergní receptory jsou predominantně zastoupeny v srdeční tkáni, b2 adrenergní receptory v hladké svalovině bronchů a b3 adrenergní receptory jsou podtypem spojeným s tukovou tkání. V centrálním nervovém systému jsou b adrenergní receptory spojeny s řadou onemocnění: deprese, schizofrenie, alkoholizmus, Alzheimerova choroba, Huntingtonova chorea (pro přehled viz Elsinga et al., 1998). Mimoto se podílejí na proliferaci glie, respirační kontrole, zpracování zrakové informace, paměťových funkcích a adaptaci na stres. Vysoké density jsou nacházeny v kaudatu a putamen, střední v některých korových oblastech, talamu, nízké naopak v bílé hmotě. b1 adrenergní receptory predominují v putamen a kortexu, naproti tomu b2 adrenergní receptory jsou především lokalizovány v hipokampu a mozečku. Kromě toho se oba dva systémy, tj. jak systém a adrenergních receptorů, tak receptorů b adrenergních může pravděpodobně uplatňovat kontrole agrese zprostředkované katecholaminy. Zdá se, že neurony s expresí a2 adrenergních receptorů jsou odpovědné za začátek a udržování agrese, zatímco na situaci závislé dolaďování agrese je realizováno prostřednictvím b adrenergních receptorů (Haller et al., 1998). Jak je tedy vidět, adrenergní receptory se neuplatňují v CNS pouze jako statické systémy, ale i jako systémy vysoce dynamické, kdy mohou podléhat řadě regulačních dějů označovaných jako homologní regulace, tj. těch, kdy je ovlivněn pouze vlastní receptorový systém. Mimoto je také možné, že změněný intracelulární signál ovlivní i další receptorový systém, tj. jiný než ten, kterého se týkaly homologní regulace. Pokud tato eventualita nastává, jde o heterologní regulaci (cross-regulaci, vzájemné řízení).

Regulační děje a dolaďování signálu tak může být jednou z funkcí adrenergních receptorů, jak jsme o něm pojednali v našem nedávném přehledném článku (Mysliveček a Trojan, 2000).

Poděkování: Práce v naší laboratoři je podporovány granty GAUK 33/2001, GAUK 18/2003 a GAUK 19/2003.

MUDr. Jaromír Mysliveček, Ph.D. Fyziologický ústav 1. lékařské fakulty Univerzity Karlovy Albertov 5 128 00 Praha 2 e-mail: [email protected] Literatura Bockaert J, Pin JP. Molecular tinkering of G protein-coupled receptors: an evolutionary success. EMBO Journal 1999; 18(7): 1723–1729. Calzada BC, de Artunano AA. Alpha-adrenoceptor subtypes. Pharmacol Res 2001; 44(3): 195–208. Elsinga PH, van Waarde A, Visser TJ, Vaalburg W. Visualization of b-adrenoceptors using PET. Clinical Positron immaging 1998; 1(2): 81–94. Haller J, Makara GB, Kruk MR. Catecholaminergic involvment in the control of aggression: hormones, the perfieral sympathetic, and central noradrenergic systems. Neurosci Behav Rev 1998; 22(1): 85–97. Mysliveček J, Trojan S. Mechanisms of G-protein coupled receptor regulation. Sb lek 2000; 101(3): 205–213.

VPLYV NORMOVOLEMICKEJ HEMODILÚCIE NA C-FOS IMUNOREAKTIVITU V MOZGU POTKANA Némethová M., Danielisová V., Burda J. Neurobiologický ústav, Slovenská akadémia vied, Košice, Slovenská republika AbstractWe used the standard 4VO ischemic model in the rat brain to study whether normovolemic hemodilution can affect c-Fos positive immunoreactivity in the selective vulnerable regions of brain - the hippocampus and striatum. This immunohistochemical study was performed after 30 minutes of transient forebrain ischemia and different time intervals of recirculation were followed to report time course of c-Fos protein expression. Our results indicate that hemodilution may be effective to decrease c-Fos positive nuclei in the hippocampus in short time reperfusion and longer recirculation time may be beneficial in the case of striatum. Key words: hemodilution, c-Fos, cerebral ischemia, rat brain Kľúčové slová: hemodilúcia, c-Fos, ischémia mozgu, mozog potkana Úvod Mozgová ischémia prechodne, aj keď značne dramaticky, pôsobí na zvýšenie expresie génov rýchlej odpovede (IEG) a stresových génov. Účinok niektorých sa považuje za potenciálne protektívny, iné pôsobia na stav buniek nepriaznivo (1). Protektívne proteíny sa nesyntetizujú v tzv. vulnerabilných bunkách, zatiaľ čo v nevulnerabilných je ich výskyt vyšší. Mechanizmy génovej aktivácie sú extrémne komplikované a zahŕňajú množstvo signálnych a transkripčných faktorov. Veľké množstvo génov rýchlej odpovede, ako sú c-fos, c-jun, junB, krox20 alebo zif-268, je pomerne rýchlo transkribované počas prvých 30 minút po globálnej ischémii a veľa sa diskutuje o ich potenciálnej úlohe. Úloha IEGs spočíva v aktivácii ostatných sekundárne účinných génov. Napr. c-Fos a c-Jun fungujú ako transkripčné faktory viazaním a aktiváciou AP1 miesta na génoch, ktoré neskôr zvyšujú expresiu neurotropných génov (5). Hemodilúcia je považovaná za jednu z možností zlepšenia výsledku postischemického mozgu prostredníctvom zvýšenia prekrvenia a následnej reoxygenácie tkaniva a vedie k zvýšeniu perfúzie v

ischemickom mozgu (2). Z literatúry je dostatočne známe, že hemodilúcia zvyšuje cerebrálny krvný prietok ako v intaktnom, tak aj v ischemickom mozgu. Zvýšenie krvného prietoku pomocou hemodilúcie sa deje buď priamo zmenou reologických vlastností krvi alebo nepriamo redukciou kapacity kyslík prenášajúcich krvných elementov, čo následne vyúsťuje do kompenzačnej vazodilatácie. Z tohto dôvodu hemodilúciou nie je možné zvýšiť krvný prietok v ischemickej oblasti jednoducho kompenzačnou vazodilatáciou, pretože táto je už v tomto prípade maximálna. Na druhej strane, pokiaľ už je raz autoregulačná kapacita porušená, celková viskozita krvi môže nezávisle zmeniť cerebrálny krvný prietok, a teda redukcia viskozity krvi hemodilúciou by mohla zlepšiť regionálny krvný prietok v ischemickom mozgu, kde hypoxémia samotná nemá žiadny efekt (4). Materiál a metodika V experimente boli použité samce potkanov plemena Wistar hmotnosti 300–400 g, rozdelené do troch experimentálnych skupín - kontrolné zvieratá, ischemizované zvieratá s rôznymi časmi reperfúzie (30 minút, 2 hodiny a 4 hodiny) a hemodilučná skupina. Na navodenie ischémie bol použitý štandardný ischemický model (7, 8). Chirurgickým zákrokom bola zavedená do chvostovej artérie silikónová kanyla, pomocou ktorej bola prevedená hemodilúcia s hydroxyetylškrobom (10% HES 200/0,5). Na imunohistochemické stanovenie boli pokusné zvieratá intrakardiálne perfundované 500 ml 0,9% NaCl a následne fixované 4% paraformaldehydom. Fixované mozgy krájané na 40 mm hrubé transverzálne rezy a detekcia c-Fos proteínu bola prevedená flotačným spôsobom inkubáciou rezov s primárnou protilátkou anti c-Fos (Calbiochem, PC38, riedenie 1 : 10 000) a vizualizáciu pozitívnej reakcie sme vykonali inkubáciou s biotinylovanou sekundárnou protilátkou (riedenie 1 : 600) a v Avidín-Biotín-Peroxidázovom komplexe (Vectastain, Vector Lab). Trvalé preparáty boli nasnímané digitálnou kamerou. Na spracovanie výsledkov sa použilo 20 digitálnych fotografií z každej oblasti, ktorá bola predmetom nášho sledovania. Výsledky z digitálnych čiernobielych snímkach boli získané hodnotením percentuálneho podielu tmavo ofarbenej plochy, ktorý predstavoval vlastnú pozitívnu reakciu, ku celkovo hodnotenej ploche, ktorá bola štandardne určená. V prípade rezov z hipokampálnej oblasti bola vyhodnocovaná celá plocha rezu hipokampom a výsledok prepočítaný na 1 mm2. Z oblasti striata bola hodnotená plocha o veľkosti 1 mm2 z dorzolaterálneho regiónu. Na grafickú analýzu bol použitý software IMAGE TOOL. Porovnávanie štatistickej významnosti rozdielov jednotlivých pokusných skupín bolo robené analýzou variácií a TukeyKramerovým testom. Výsledky a diskusia Počet pozitívne c-Fos imunoreaktívnych jadier neurónov sa s predlžujúcim časom recirkulácie významne zvyšuje oproti kontrolným hodnotám vo všetkých nami sledovaných oblastiach mozgu potkana. V oblasti hipokampu po 30minútovom prežívaní s hemodilúciou vzrástol signifikatne počet c-Fos pozitívnych jadier, ich počet sa však s predlžujúcim časom recirkulácie znižuje a po 4 hodinách je výrazne nižší ako v prípade ischémie s následnou recirkuláciou. V oblasti nucleus caudatus sa počet pozitívnych c-Fos jadier postupne zvyšuje, ale po 4 hodinách recirkulácie s použitím hemodilúcie je ich počet signifikantne nižší ako u samotného ischemicko-repefúzneho zásahu (tab. 1). Skoré gény a ich mRNA sa objavujú v bunkách v prvých minútach a tieto ich transkribujú aj v prítomnosti inhibítorov proteosyntézy, čo naznačuje, že zásoby proteínov, potrebných pre ich vlastnú syntézu, sú v bunke zachovávané (6). Indukcia skorých génov nevyžaduje de novo syntézu transkripčných faktorov, pretože nie je blokovaná inhibítormi proteosyntézy. Zvýšenie výskytu mRNA pre expresiu skorých génov bolo zaznamenané v regiónoch, známych ako selektívne vulnerabilné oblasti. Z tohto dôvodu sme sa v našej práci zamerali práve na tieto regióny mozgu. Wessel a spol. (9) zaznamenali nárast mRNA pre c-fos gén v granulárnych bunkách gyrus dentatus, CA1 a CA3 vrstvách hipokampu, v mozgovej kôre a v cereberálnych Purkyneho bunkách po štandardnom štvorcievnom podväze u potkana. Celková ischémia spôsobuje redukciu proteosyntézy a takto následne mRNA pre skoré gény nie je uniformne prekladaná do špecifických proteínov. Veľkou zaujímavosťou sú gény c-fos a zif/268, ktorých imunoreaktivita ich produktov v CA1 vrstve hipokampu nebola detekovaná, napriek vysokému nárastu hladín ich špecifických mRNA. Táto skutočnosť bola zaznamenaná aj v našom experimente, či už išlo o ischemicko-reperfúzne zmeny po kratších resp. dlhších časových intervaloch a bez alebo s použitím normovolemickej hemodilúcie. Sledovanie c-Fos imunoreaktivity v nucleus caudatus (striatum) nepotvrdilo pozitívny účinok hemodilúcie. Po štvorhodinovej recirkulácii sa síce výrazne znižuje expresia c-Fos proteínu, ale hodnoty, namerané v prípade ischémie a reperfúzie bez hemodilúcie vykazujú vysokú variabilitu a z tohto dôvodu nie je

možné uvažovať o významnej zmene. Podobné výsledky boli získané aj u hipokampu, kde bol zaznamenaný vysoký nárast po krátkodobom prežívaní a naopak, vysoký úbytok po prežívaní dlhšom. V tomto prípade nárast v skupine bez hemodilúcie bol spôsobený výraznou expresiou c-Fos proteínu v gyrus dentatus, čo nebolo pozorované v prípade hemodilučnej skupiny zvierat. Intenzívna protonkogénovú aktiváciu v granulárnych bunkách gyrus dentatus a v pyramidálnych bunkách CA3 oblasti bola zaznamenaná u gerbilov do 1 hodiny postischemickej recirkulácie a s predlžujúcim sa časom reperfúzie gyrus dentatus prestáva produkovať zmienené protoonkogény (9). V našom prípade sledovaním výsledného imunoproduktu s časovým posunom, potrebným na expresiu génov, sme dosiahli podobné výsledky.

Práca vznikla za finančnej podpory grantu VEGA 2/3219/23. Miroslava Némethová, MVDr. Institute of Neurobiology, Slovak Academy of Sciences Šoltésovej 4 040 01 Košice Slovak Republic phone: ++421-95-6785 064 fax: ++421-95-6785 074 e-mail: [email protected] Literatúra 1. Akins PT, Liu PK, Hsu CY. Stroke, 1996; 27: 1682–1687. 2. Heros RC, Korosue K. Stroke, 1989; 20: 423–427. 3. Korosue K, Heros RC. Stroke, 1992; 23: 1487–1493. 4. Lipton P. Physiol Rev, 1999; 79: 1431–1568. 5. Morgan JI, Curran T. Annu Rev Neurosci, 1991; 14: 421–451. 6. Pulsinelli WA, Brierly J. Stroke, 1979; 10: 256–272. 7. Schmidt-Kastner R. Stroke, 1989; 20: 938–946. 8. Wessel TC, Joh TH, Volpe BT. Brain Res, 1991; 567: 231–240.

VLIV PREMEDIKACE NESELEKTIVNÍM ANTAGONISTOU 5-HT2 RECEPTORU CYPROHEPTADINEM NA PŘÍJEM METAMFETAMINU V MODELU „I.V. SELF-ADMINISTRATION“ U LABORATORNÍCH POTKANŮ

THE EFFECT OF PRETREATMENT WITH NON-SELECTIVE 5-HT2 RECEPTOR ANTAGONIST CYPROHEPTADINE ON THE INTAKE OF METHAMPHETAMINE IN THE MODEL OF „I.V. SELF-ADMINISTRATION“ IN LABORATORY RATS Nováková Jana Farmakologický ústav, Lékařská fakulta, Masarykova univerzita, Brno It is believed that serotonergic (5-HT) neurotransmitter system plays an important role in methamphetamine (METH) mechanism of action. With the discovery of the subtypes of 5-HT receptors, the stimulus properties of METH seem to be partially mediated via postsynaptic 5-HT2 receptors. Furthermore, 5-HT2 receptor antagonists are in the literature referred as agents attenuating the expression of alcohol and opiate withdrawal syndrome. Thus, the aim of the present study was to ascertain the influence of 5-HT2 antagonist cyproheptadine on METH i.v. self-administration in rats. Rat responding was maintained under the fixed-ratio schedule of METH (0.08 mg/kg/inj.) presentation during 2h experimental sessions in nose-poking operant boxes after implantation of silastic catheter into the right atrium. Following acquisition of METH-reinforced behaviour rats were randomly pre-treated with saline solution (0.1 ml/kg, intraperitoneally) or cyproheptadine (0.1 or 1.0 or 5.0 mg/kg, intraperitoneally). During the whole experiment the majority of animals passed each type of treatment. The number of the correct responses, i.e. number of self-infusions with METH was dose-dependently changed after cyproheptadine treatment. The lowest dose used increased moderately METH self-administration, the middle and the highest dose had in this respect suppressive effect. In the case of 5.0 mg/kg dose of cyproheptadine this inhibition was statistically significant (p<0.02). In summary, our results indicate that cyproheptadine should hypothetically serve in the future as a drug for the treatment of METH dependence. However, the specific mechanisms underlying the involvement of 5-HT2 receptors in the reward properties of METH are complex and remain to be more fully resolved. Key words: 5-HT2 antagonist, cyproheptadine, methamphetamine, drug dependence, „i.v. drug self-administration“ Klíčová slova: 5-HT2 antagonista, cyproheptadin, metamfetamin, látková závislost, „i.v. drug self-administration“ Úvod Metamfetamin (MET) (pervitin) je amfetaminový derivát s velice blízkou strukturální podobností s amfetaminem, od nějž jej odlišují výrazně vyšší centrálně stimulující účinky a snazší příprava. Toto jsou patrně dva hlavní důvody, v nichž lze spatřovat jeho velkou oblibu mezi závislými jedinci. Mechanismus působení amfetaminových stimulancií není jednotný, jejich behaviorální účinky, včetně vzniku závislosti, jsou zprostředkovány ovlivněním různých neurotransmiterových systémů. V tomto kontextu je v posledních letech mj. intenzívně studován vliv MET na serotonergní (5-HT) neurotransmiterový systém, zejména proto, že akutní podání MET vyvolává zvýšené uvolňování 5-HT z presynaptických nervových zakončení a vysoké dávky MET působí neurotoxicky na neurony využívající jako přenašeč 5-HT (Johnson a kol., 1994). Úloha jednotlivých 5-HT receptorových podtypů při vzniku a rozvoji MET závislosti nebyla dosud plně objasněna, avšak některé informace potvrzují mj. úlohu 5-HT2 receptorového podtypu v regulaci chování spojeného s mechanismy odměňování („reward“ mechanismus). Opakovaně byl např. v literatuře referován 5-HT2 antagonista ritanserin jako látka oslabující manifestaci alkoholových (Johnson a kol., 1996; Meert, 1994) a opiátových (Neal a Sparber, 1990; Verbitskaia a Kudriashova, 1997) abstinenčních příznaků a usnadňující tak odvykání. V souvislosti s jiným neselektivním 5-HT2 antagonistou cyproheptadinem, jenž je v humánní medicíně užíván pro léčbu nejrůznějších alergických stavů a z behaviorálních účinků je známé jeho orektické působení, jsme podobně relevantní údaje v literatuře nenalezli. Proto cílem naší práce bylo přinést nové dílčí poznatky do studia MET závislosti sledováním vlivu cyproheptadinu na behaviorální účinky MET v modelu „i. v. self-administration“ u potkanů, která umožňuje sledovat potenciál závislosti testované látky a nepřímo též potlačení symptomu „craving“. Materiál a metoda Potkaní samci outbredního kmene Wistar (Biotest s.r.o., Konárovice, ČR) o váze 300–350 g byli ustájeni po pěti v plastových standardních klecích. Konstantně byl udržován dvanáctihodinový umělý světelný režim světlo (17.00–5.00 hod) / tma (5.00–17.00 hod), teplota 23±1 °C a relativní vlhkost vzduchu 50%,

voda a potrava ad libitum. V celkové anestézii (ketamin 100 mg/kg + xylazin 16 mg/kg) aplikované i. p. byl naivním potkanům zaveden cestou vena jugularis externa do pravé srdeční síně permanentní silastický katetr. Vnější konec katetru byl vyveden přes kůži v oblasti lopatek a zajištěn proti posunu silikonovou podkožní vložkou. Sloužil k připojení na infúzní pumpu přes speciální otáčivé ložisko, které umožňuje volný pohyb zvířete po kleci. Po operaci bylo každé zvíře ustájeno individuálně a po přibližně desetidenní rekonvalescenci bylo denně na dvě hodiny v období mezi 5.00 – 17.00 hodinou umístěno do speciálního zvukově izolovaného experimentálního boxu pro „self-administration“ (Coulbourn Instruments, USA). Boxy jsou řízeny počítačem se speciálním softwarem L2T2 (Coulbourn Instruments, USA) a jsou vybaveny zařízením pro registraci behaviorálních odpovědí zvířete: dva otvory s fotobuňkami, které zaznamenávají vsunutí čenichu. Jeden otvor byl vždy naprogramován jako aktivní, tzn. že vsunutí čenichu spouštělo infúzní pumpu s MET v dávce 0,08 mg/kg/inj. Druhý otvor byl neaktivní, kdy vsunutí čenichu bylo sice zaznamenáno, avšak pumpu nespouštělo. Na začátku experimentu byla každá správná odpověď odměněna i. v. injekcí látky vyvolávající závislost (tzv. fixed ratio: FR1). Po obdržení každé injekce následoval 30 sec. trvající time-out, během něhož bylo v experimentálním boxu vypnuto světlo a odpovědi zvířete byly registrovány, avšak ne odměňovány. Po dosažení stabilního příjmu látky, alespoň ve třech po sobě jdoucích sezeních a jasné preferenci aktivního otvoru (minimálně 70 % správných odpovědí ze všech zaznamenaných) byla podmínka pro získání látky ztížena. K obdržení injekce byly nutné dvě správné odpovědi, tzn. vsunutí čenichu do aktivního otvoru 2x po sobě (FR2). Po dosažení stabilního příjmu byla opět podmínka ztížena až na tři správné odpovědi (FR3). Pokud denní příjem MET byl stabilní po dobu alespoň 5 po sobě jdoucích sezení při FR3 (hodnoceném jako vyvolaná závislost) bylo přistoupeno k vlastnímu experimentu, tj. ověřování funkční interakce MET s testovaným 5-HT2 antagonistou cyproheptadinem. Potkani byli randomizovaně 20 min před umístěním do experimentálních boxů premedikováni buď fyziologickým roztokem (1 ml/kg, i.p.) nebo cyproheptadinem (0,1, 1,0 a 5,0 mg/kg, i.p.). Při zpracování a statistickém vyhodnocení dat byly počty správných odpovědí jednotlivého zvířete vždy ze tří posledních tzv. „kontrolních tréninkových sezení“, tzn. bez jakékoliv premedikace (při FR3), zprůměrovány, aby během celého pokusu byla kontrolní hodnota aktuální, odpovídající případným změnám způsobovaným délkou doby přijímání MET. Změny v experimentálních sezeních byly pak vyjadřovány jako procento výše uvedené hodnoty. Získaná experimentální data byla statisticky zhodnocena neparametrickým nepárovým U testem dle Mann-Whitneyho. Výsledky a diskuze Cyproheptadin v našem experimentu měnil v závislosti na dávce počet správných odpovědí potkanů, a tedy příjem MET v modelu „i.v. self-administration“. Nejnižší použitá dávka cyproheptadinu 0,1 mg/kg mírně zvyšovala počet přijímaných injekcí MET, dvě vyšší použité působily v tomto smyslu naopak inhibičně. V případě nejvyšší použité dávky 5,0 mg/kg byl tento pokles vyhodnocen jako statisticky významný (p < 0,02) (tab. 1). Lze se tedy domnívat, že bude vhodné otestovat v budoucnu ještě vyšší dávky cyproheptadinu, které by mohly rezultovat ve významnější pokles příjmu MET.

Vliv farmakologické antagonistické manipulace s 5-HT2 receptorovým podtypem na operantní chování zvířat při studiu látkových závislostí je znám. V modelu „drug discrimination“ odhalujících u psychotropních látek jejich schopnost působit jako tzv. diskriminační podnět (v pokusech na zvířatech přirovnáván k subjektivnímu pocitu, jenž se objevuje u lidí) byl tento ovlivňován některými 5-HT2

antagonisty. Neselektivní 5-HT antagonisti cyproheptadin a cinanserin např. u zvířat efektivně blokovaly diskriminační podněty meskalinu a LSD (Feldman a kol., 1997); 5-HT2A/2C antagonista ketanserin v tomto smyslu částečně antagonizoval působení MET (Munzar a kol., 1999). Naše výsledky, v nichž cyproheptadin ve vyšších dávkách snižoval „self-administration“ MET do jisté míry potvrzují funkční interakční potenciál MET s 5-HT2 receptorem a naznačují jeho hypotetické budoucí využití v klinice pro léčbu MET závislosti. Přesto je třeba naše výsledky interpretovat s co nejvyšší opatrností, zejména pro nedostatek podobných údajů v dostupné literatuře. Otázkou také zůstává, jaký je mechanismus, kterým cyproheptadin výše uvedeného efektu dosahuje. Možným vysvětlením je mnohokráte referovaná „downregulace“ 5-HT2 receptorů po aplikaci jejich antagonistů (Pranzatelli a kol., 1993; Sanders-Bush, 1990; Toth a Shenk, 1994) – v rozporu se spíše očekávanou „up-regulací“. To může mít hypoteticky za následek snížení intenzity behaviorálních účinků MET zprostředkovaných cestou 5-HT2 receptorů, a tedy nižší touhu po droze. Spolu s přímým antagonistickým vlivem cyproheptadinu na 5-HT2 receptory je tak duálním mechanismem umenšen 5-HTergní účinek vyvolaný podáním MET. Tato práce vznikla za podpory grantu GAČR č. 305/02/D130/A a MŠMT CEZ: J07/98:141100001 MUDr. Jana Nováková, Ph.D. Farmakologický ústav LF MU Brno Joštova 10 662 43 Brno tel.: 542 126 380 fax: 542 126 377 e-mail: [email protected] Literatura 1. Feldman RS, et al. V: Principles of Neuropsychopharmacology, Sinauer Assoc., Inc. Publishers, Sunderland, MA, USA, 1997; 773. 2. Johnson BA, et al. Psychopharmacology (Berl.), 1996; 128(2): 206–215. 3. Johnson M, et al. J Pharmacol Exp Ther, 1994; 270(1): 97–103. 4. Meert TF, Alcohol Suppl, 1994; Suppl. 2: 523–530. 5. Munzar P. J Pharmacol Exp Ther, 1999; 291(1): 239–250. 6. Neal BS, Sparber SB. Psychopharmacology (Berl.), 1990; 100(2): 258–266. 7. Pranzatelli MR. Eur J Pharmacol, 1993; 244: 1–5. 8. Sanders-Bush E. Neuropsychopharmacology, 1990; 3: 411–415. 9. Toth M, Shenk T. Mol Pharmacol, 1994; 45: 1095–1100. 10. Verbitskaia EV, Kudriashova MF. Exp Clin Pharmacol, 1997; 60(1): 19–21.

SNÍMANIE MIECHOVÝCH EVOKOVANÝCH POTENCIÁLOV U POTKANA Ondrejčák Tomáš, Vanický Ivo Neurobiologický ústav SAV, Košice Summary The recording of evoked potentials is a powerful field of CNS research. Principally, measurements are based on commonly electrical stimulation of tissue and subsequent recording of the responses conducted within the appropriate pathways. Only few studies have described characteristics of spinal evoked potentials during more than 48 hours survival period. The present study was aimed to set up and evaluate the model of spinal cord evoked potential (SCEP) recording in the rat using chronically implanted electrodes in the epidural space of cervical and thoracic vertebras. Our results suggest suitability and reproducibility of the model in evaluation of neurophysiological changes during longer survival period. Key words: evoked potentials, rat spinal cord Kľúčové slová: evokované potenciály, miecha, potkan Úvod

Elektrofyziologické merania nervového tkaniva poskytujú užitočné informácie o jeho štruktúre a funkcii (1). Významnou oblasťou experimentálneho výskumu CNS je sledovanie evokovaných potenciálov (2, 3). Principiálne tieto merania spočívajú vo vyvolaní odpovede tkaniva elektrickou stimuláciou a v následnej registrácii vzniknutých evokovaných potenciálov v priebehu dráhy vedenia podnetu. Neexistuje dostatok prác, ktoré by uvádzali charakteristiky miechových odpovedí u potkanov v priebehu času prežívania dlhšieho ako 48 hodín. Cieľom súčasnej štúdie bolo zavedenie a vyhodnotenie spoľahlivosti modelu snímania miechových evokovaných potenciálov (SCEP) u potkana použitím dvojíc chronicky implantovaných elektród v epidurálnom priestore krčných a hrudníkových stavcov. Materiál a metódy U samcov potkanov kmeňa Wistar, vážiacich 300–330g, sme použili novú techniku implantácie bipolárnych stimulačných a snímacích elektród. Dva páry epidurálnych elektród v tvare písmena U boli nasadené na miechu a zafixované dentálnym cementom k stavcu tak, aby bola zabezpečená ich nemenná pozícia počas nasledujúcich 28 dní prežívania. Počas prežívania boli zvieratá behaviorálne testované a elektrofyziologické odpovede boli snímané v týždňových intervaloch. Zaznamenávanie SEP bipolárnym spôsobom sa uskutočňovalo v celkovej anestézii vždy z dvoch miest, a to z úrovne C3–C4 a úrovne Th11–Th12 miechy. Po utratení zvierat boli miechy podrobené histologickému a morfometrickému hodnoteniu. Výsledky a diskusia Morfológia vĺn SCEP snímaných z oblasti C3–C4 pri stimulácii miechy na úrovni Th11–Th12 bola prakticky zhodná u všetkých zvierat. Typické snímanie evokovaných potenciálov bolo vyjadrené konštantnou prítomnosťou vlny so zložkami P1 a N1–N3. Získanie takéhoto charakteristického priebehu vlny bolo závislé od napätia a frekvencie stimulácie. Meranie amplitúd jednotlivých zložiek vzhľadom k izoelektrickej čiare pred stimulom a meranie latencií vrcholov týchto zložiek nám poskytovalo obraz o správaní sa vĺn počas obdobia prežívania zvierat. Amplitúdy zložiek N1 a N2 zostávali na približne rovnakej úrovni aj po 28 dňoch po implantácii, kým pri hodnotení latencií vrcholov N1 a N2 bolo zrejmé, že dochádza k ich skracovaniu v porovnaní s prvým dňom (N1 z 0,97 ± 0,07 ms na 0,88 ± 0,06 ms a latencia N2 z 1,5 ± 0,12 ms na 1,39 ± 0,17 ms). Časť meraní bola uskutočnená spolu s intramuskulárnym podaním Arduanu (myorelaxant) v dávke 0,2 ml/kg, za účelom celkovej svalovej paralýzy. Výsledky týchto meraní pomohli identifikovať zložky SEP nasnímaných z úrovne Th11–Th12 generované svalovými vláknami. Neurologické skóre bolo vyhodnocované pomocou BBB modelu (4), ktorého 21bodová škála dovoľuje dostatočne presne zaznamenať aj mierne odchýlky od normálneho stavu motorických schopností. U všetkých sledovaných zvierat, okrem prípadov, keď pri implantácii bola miecha poškodená kompresiou v dôsledku nesprávnej pozície oblúka elektródy, nebol zaznamenaný žiaden významný motorický deficit a BBB skóre nebolo znížené o viac ako 2 body z 21stupňovej škály. Zvieratá taktiež nevykazovali pozorovateľný diskomfort v dôsledku dlhotrvajúceho umiestnenia kovových elektród v epidurálnom priestore miechy, tj. pod telom stavcov; ani v dôsledku opakovanej priamej stimulácie miechy elektrickými výbojmi. Opísaný experimentálny model je vhodný pre vyhodnocovanie neurofyziologických zmien prebiehajúcich v dlhšom časovom horizonte. V priebehu experimentu sme opakovane zaznamenali presný a stabilný dátový výstup pri snímaní SCEP, schopný zabezpečiť sledovanie abnormálnych zmien tvaru vlny SCEP po poškodení a v priebehu rekonvalescencie miechy, ktorých výskum sa stane predmetom druhej fázy experimentu. Rovnako predpokladáme, že aj pri testovaní účinnosti farmaceutických preparátov aplikovaných pred/po traume nám elektrofyziologické merania umožnia včasnú detekciu vylepšenia alebo zhoršenia funkcií miechy a rovnako dovolia predpovedať úroveň návratnosti pohybových funkcií. Sledovanie patologických procesov po traume miechy viacerými metódami súčasne môže pomôcť k ďalšiemu rozšíreniu poznatkov v oblasti výskumu poškodenia CNS. MUDr. Tomáš Ondrejčák Neurobiologický ústav SAV Šoltésovej 4–6 040 01 Košice Slovenská republika

Literatúra 1. Nuwer MR. Muscle Nerve, 1999; 22: 1620–1630. 2. Dull ST, Konrad PE, Tacker WA. Electroencephalogr Clin Neurophysiol, 1990; 77: 68–76. 3. Fehlings MG, et al. Electroencephalogr Clin Neurophysiol, 1988; 69: 65–78. 4. Basso DM, Beattie MS, and Bresnahan JC. J Neurotraum, 1995; 12: 1–21.

CEREBROSPINÁLNY LIKVOROVÝ TAU PROTEÍN AKO POTENCIÁLNY MARKER ALZHEIMEROVHO OCHORENIA TAU PROTEIN IN CEREBROSPINAL FLUID AS A POTENTIAL MARKER OF ALZHEIMER´S DISEASE Ondrkalová M., Kalnovičová T., Traubner P., Štofko J., Turčáni P. 1. neurologická klinika LF UK a FN, Bratislava Jedným z patologických rysov Alzheimerovej choroby (AD) je prítomnosť neurofibrilárnych zhlukov v mozgu pacientov. Hlavnou zložkou týchto zhlukov je abnormálne fosforylovaná forma na mikrotubuly sa viažúceho proteínu tau. Zvýšena hladina tau proteínu v cerebrospinálnom likvore (CSL) odráža zvýšenú stratu neurónov. Vychádzajúc z týchto skutočností, analyzovali sme zmeny likvorových hladín tau proteínu u pacientov s AD s cieľom využiť tento parameter ako diagnosticky marker AD. Vzorky likvoru získané lumbálnou punkciou od 76 subjektov (16 pacientov s AD) boli analyzované pomocou elektroforetického systému Paragon SPE-II. Signifikantne vyššie hladiny tau proteínu v CSL pacientov s AD, v porovnaní s kontrolným súborom a skupinou pacientov s inými neurodegeneratívnymi ochoreniami, poukazuje na možnosť využitia tohto parametra ako biochemického markera AD. Kľúčové slová: cerebrospinálny likvor, tau proteín, Alzheimerova choroba One of the pathological features in Alzheimer´s disease (AD) is neurofibrillary tangles in the brain. The main constituent of tangles is the microtubuli – associated protein tau in a hyperphosporylated state. Tau elevated presence in cerebrospinal fluid (CSF) reflects increased neuronal loss. We have analysed changes of cerebrospinal fluid concentration of tau in AD patients for the sake of evaluation its usefulness as diagnostic marker of AD. Cerebrospinal fluid samples obtained by lumbar puncture from 76 subjects (16 patients with AD) were analyzed by means of electrophoresis system Paragon SPE-II. The CSF tau level was significantly higher in patients with AD than in patients with non-AD neurological diseases and in controls. We suggest that tau may serve as a biochemical marker of Alzheimer´s disease. Key words: cerebrospinal fluid, tau protein, Alzheimer´s disease Úvod Rozvoj biochémie viedol k objaveniu bielkovín a ich fragmentov, ktoré tvoria podstatnú časť cytoskeletu. Pri rozpade neurónov sa cytoskeletálne proteíny dostávajú do extracelulárneho priestoru a sekundárne do cerebrospinálneho likvoru, čím nadobúdajú klinický diagnostický význam. Tau proteín je bielkovina cytoskeletu, ktorá podporuje polymerizáciu tubulínu. Väzbou na mikrotubuly udržuje ich stabilitu a indukuje tvorbu mikrotubulárnych zväzkov. Neurofibrilárne lézie, ktoré sa vyskytujú u Alzheimerovej choroby, obsahujú párové helikálne filamenty, ktoré sa združujú s hyperfosforylovaným tau proteínom. Abnormálne fosforylovaný tau proteín (PTP) nie je schopný sa viazať na mikrotubuly. PTP sa inkorporuje do párových helikálnych filamentov, znižuje sa množstvo asociovaných mikrotubulárnych makromolekúl tau proteínu, čo vedie k ich destabilizácii, k poruche axonálneho prenosu a vzniku degeneratívnych ložísk (1–3). Vychádzajúc z týchto skutočností, analyzovali sme likvorové zmeny tau proteínu v cerebrospinálnom likvore u pacientov s neurologickými ochoreniami, s cieľom zhodnotiť využiteľnosť tohto parametra ako diagnostického markera pre Alzheimerovu chorobu. Pacienti a metódy Analyzovaný súbor tvorilo 76 pacientov, z ktorých 16 boli pacienti s Alzheimerovou chorobou vo veku 60 do 77 rokov, s priemerným vekom 67,5 ± 5,7 rokov a 30 pacientov s neurodegeneratívnymi ochoreniami iného typu ako AD, s priemerným vekom 51,7 ± 18,7 rokov (od 14 do 80 rokov). Kontrolný súbor (n = 30) tvorili pacienti s ľahšími vertebrogennými ochoreniami s likvorovým nálezom (celkové proteíny,

albumín, chloridy, glukóza, krvné elementy, DL indexy) v rámci fyziologickej normy, bez závažných celkových ochorení (vek od 21 do 71 rokov, priemerný vek 41,0 ± 13,9 rokov). Vzorky likvoru boli získané lumbálnou punkciou a hladiny tau proteínu boli stanovené pomocou elektroforetického systému Paragon SPE-II (elektroforetický kit P/N 441760, Beckman Coulter, USA). Výsledky prezentované ako aritmetický priemer ± SD boli spracované štandardnými štatistickými postupmi (Kolmogorovov-Smirnov test). Významnosť rozdielov medzi priemermi bola testovaná pomocou t–testu. Výsledky a diskusia Likvorové hladiny tau proteínu u pacientov s Alzheimerovou chorobou v porovnaní s pacientami s kontrolnou skupinou, a skupinou pacientov s neurodegeneratívnymi ochoreniami iného typu ako AD, sú uvedené v tabulke 1. V porovnaní s kontrolným súborom, boli u oboch skupín pacientov signifikantne zvýšené likvorové hodnoty tau proteínu, a u pacientov s AD aj signifikantné zvýšenie voči skupine pacientov s neurodegeneratívnymi ochoreniami. Nezistili sme žiadne signifikantné zmeny v hladinách tau proteínu v závislosti od veku. Alzheimerova choroba je najčastejším chronickým neurodegeneratívnym ochorením, charakterizovaným progresívnym znižovaním kognitívnych funkcií. Po histopatologickoanatomickej stránke ju charakterizujú dve základné zmeny, extracelulárna tvorba početných senílnych plakov (alzheimerové plaky), tj. ložísk s vyzrážaným b-amyloidom a intraneuronálna prítomnosť neurofibrilárnych zhlukov s parovými helikálnymi filamentami, ktoré obsahujú nadmerne fosforylovaný tau proteín, tj. s degeneratívnymi zmenami vedúcimi k strate neurónov. Aj keď validita stanovenia tau proteínu pre diagnózu AD je veľmi vysoká, zvýšené hodnoty tau proteínu v likvore sa vyskytujú aj u iných ochorení, napr. meningoencefalitíde, vitamín B12-deficientnej encefalopatie, CreutzefeldJacobsovom ochorení, tj. ochorení spojených so zánikom neurónov v dôsledku zápalového poškodenia, oxidačného stresu apod. (2, 3). Špecificita tau proteinu ako diagnostickeho markera AD vzrastie, ak sa hodnotí s ďalšími biochemickými parametrami. Extracelulárne depozity proteínu amyloidu b (Ab) v mozgovom tkanive vo forme senilných plakov a kongofilná angiopatia patria k hlavným histologickým rysom Alzheimerovej choroby. Abeta, kľúčová molekula v patogenéze AD, nízkomolekulárny proteín, ktorý vzniká proteolýzou membránového prekurzora amyloidového proteínu beta (APP), môže významne prispieť v diagnostike AD. Medzi perspektívne diagnostické markery Alzheimeroveho ochorenia okrem tau proteínu, patria – likvorový pomer medzi normálnym a hyperfosforylovaným tau proteínom, stanovenie APP v CSF, NPT (nervový vláknitý proteín) a likvorový pomer Abeta 42/Abeta 40, ktorý sa považuje ako vhodný marker na monitorovanie progresie AD (3–8).

Prezentované výsledky poukazujú, že stanovenie likvorových hladín tau proteínu môžu významne prispieť k diagnostike Alzheimerovej choroby.

Literatúra 1. Katzman R, Bick KL, eds. Alzheimer Disease, Raven Press, Ltd., New York, 1994. 2. Blennow K, Wallin A, Agren H, Spenger C, Siegfried J, Vanmechellen E. Tau protein in cerebrospinal fluid. A biochemical marker for axonal degeneration in Alzheimer´s disease? Mol Chem Neuropathol 1995; 26: 231–245. 3. Arai H, Ghiguchi S, Sasaki N. Apolipoprotein E genotyping and cerebrospinal fluid tau protein:

implications for the clinical diagnosis of Alzheimer´s disease. Gerontology 1997; 43(Suppl 1): 2–10. 4. Shoji M, Kanai M, Matsubara E, Tomidokoro Y, et al. The levels of cerebrospinal fluid Abeta 40 and Abeta 42/43 are regulated age-dependently. Neurobiol Aging 2001; 22(2): 209–215. 5. Fukuyama R, Mizuno T, Mori S, Nakajima K, Fushiki S, Yanagisawa K. Age-dependent change in the levels of Abeta 40 and Abeta 42 in cerebrospinal fluid from conrol subjects and a decrease in the ratio of Abeta 42 to Abeta 40 level in cerebrospinal fluid from Alzheimer´s disease patients. Eur Neurol 2000; 43(3): 155–160. 6. Sjogren M, Blomberg M, Jonsson M, Wahlund LO, Edma Lind K, Rosengren L, Blennow K, Wallin A. Neurofilament protein in cerebrospinal fluid. A marker of white matter changes. J Neurosci Res 2001; 66(3): 510–516. 7. Ishiguro K, Ohno H, Arai H, Yamaguchi H, Urakami K, Park JM, Sato K, Kohno H, Imahori K. Phosphorylated tau in human cerebrospinal fluid is a diagnostic marker for Alzheimer´s disease. Neurosci Lett 1999; 270(2): 91–94. 8. Sjogren M, Davidsson P, Gottfries J, Vanderstichele H, Edman A, Vanmechelen E, Wallin A, Blennow K. The cerebrospinal fluid levels of tau, growth-associated protein-43 and soluble amyloid precursor protein correlate in Alzheimer´s disease, reflecting a common pathophysiological process. Dement Geriatr Cogn Disord, 2001; 12(4): 257–264.