EVALUASI KOMPONEN BIOAKTIF TANAMAN UNTUK KESEHATAN (EVALUATION OF BIOACTIVE COMPOUNDS OF PLANTS FOR HEALTH)

MODUL

EVALUASI KOMPONEN BIOAKTIF TANAMAN UNTUK KESEHATAN (EVALUATION OF BIOACTIVE COMPOUNDS OF PLANTS FOR HEALTH) Oleh: Nurheni Sri Palupi Southeast Asian Food And Agricultural Science and Technology (SEAFAST) Center Research and Community Service Institution BOGOR AGRICULTURAL UNIVERSITY http://seafast.ipb.ac.id

DISCLAIMER This publication is made possible by the generous support of the American people through the United States Agency for International Development (USAID). The contents are the responsibility of Texas A&M University and Bogor Agricultural University as the USAID Tropical Plant Curriculum Project partners and do not necessarily reflect the views of USAID or the United States Government.

Tropical Plants Curriculum

MODUL Evaluasi Komponen Bioaktif Tanaman untuk Kesehatan (Evaluation of Bioactive Compounds of Plants for Health) Nurheni Sri Palupi Sejalan dengan meningkatnya kesadaran masyarakat akan pentingnya hidup sehat, dan berkembangnya pemikiran back to nature maka penggunakan produk-produk alami untuk mendukung kesehatan seseorang semakin meningkat. Penggunaan bahan-bahan sintetis untuk pengobatan atau pencegahan terhadap suatu penyakit selain menyebabkan ketergantungan, juga harganya relatif mahal dan kemungkinan menimbulkan bahaya bagi kesehatan. Keadaan tersebut mendorong dilakukannya eksplorasi berbagai komponen bioaktif asal tanaman. Berdasarkan Badan Kesehatan Dunia (WHO), hampir sekitar 80 persen penduduk dunia menggantungkan pengobatan secara tradisional menggunakan ekstrak utuh atau komponen bioaktifnya untuk pertolongan pertama terhadap gangguan kesehatan. Komponen bioaktif merupakan senyawa di luar zat gizi yang biasanya berada dalam jumlah kecil di dalam suatu bahan pangan. Senyawa tersebut banyak dipelajari secara intensif untuk menguji khasiatnya terhadap kesehatan. Beberapa studi epidemiologi menunjukkan bahwa mengonsumsi bahan pangan berbahan baku tanaman dapat memberikan efek pertahanan terhadap penyakit jantung koroner (cardiovascular disease/CVD) dan kanker. Hingga saat ini telah banyak ditemukan senyawa bioaktif, yang dapat dikelompokkan berdasarkan struktur kimia dan fungsinya. Senyawa fenolik yang merupakan kelompok flavonoid, banyak dijumpai hampir pada semua tanaman dan yang telah dipelajari secara ekstensif adalah yang terkandung dalam serealia, polong-polongan, kacang-kacangan, sayuran, buah-buahan, teh, dan sebagainya. Banyak senyawa fenolik menunjukkan aktivitasnya sebagai antioksidan, dan beberapa studi telah menunjukkan manfaatnya terhadap penyakit trombosis dan tumorogenesis. Meskipun beberapa studi epidemiologi telah melaporkan manfaat perlindungan dari senyawa flavonoid atau fenolat lain terhadap cardiovascular deaseas (CVD) dan kanker, namun hasil penelitian lain tidak menemukan manfaat tersebut. Berbagai fitoestrogen yang terdapat dalam kedelai, biji-bijian, buah-buahan, dan sayuran juga memiliki sifat antioksidan. Beberapa studi baik menggunakan model hewan percobaan maupun kultur sel kanker, menunjukkan efek menguntungkan terhadap faktor-faktor risiko CVD lainnya. Namun, karena fitoestrogen bertindak baik sebagai agonis estrogen secara parsial maupun antagonis, efeknya terhadap kanker cenderung kompleks. Hidroksitirosol (hydroxytyrosol) yang merupakan salah satu senyawa fenolat dalam minyak zaitun merupakan antioksidan kuat. Senyawa resveratrol yang ditemukan dalam kacangkacangan dan anggur merah, menunjukkan aktivitas antioksidan, antitrombotik, antiinflamasi, dan menghambat karsinogenesis. Likopen yang merupakan antioksidan karotenoid kuat yang terkandung dalam tomat dan buah-buahan lainnya, diperkirakan Nurheni Sri Palupi

1|Halaman


dapat melindungi terhadap penyakit kanker prostat dan kanker lainnya, serta menghambat pertumbuhan sel tumor pada hewan. Organosulfur senyawa dalam bawang putih dan bawang, isotiosianat dalam sayuran, serta monoterpen dalam buah jeruk, ceri, dan rempah-rempah memiliki aktivitas sebagai antikanker serta kardioprotektif. Singkat kata, senyawa bioaktif banyak memiliki kontribusi yang baik terhadap kesehatan. Banyak penelitian ilmiah perlu dilakukan sebelum kita dapat memberikan rekomendasi diet yang berlandaskan ilmu pengetahuan. Namun demikian, mengonsumsi bahan pangan yang banyak mengandung senyawa bioaktif terbukti dapat direkomendasikan. Dengan kata lain dapat dianjurkan untuk mengonsumsi diet yang kaya komponen bioaktif dalam berbagai buah-buahan, sayuran, biji-bijian, kacang-kacangan, minyak, dan kacang-kacangan. Komponen bioaktif yang juga dikenal sebagai komponen pangan non gizi merupakan senyawa xenobiotik yang terdapat secara alamiah dalam bahan pangan. Selain seperti yang telah disebutkan sebelumnya, khlorofil pada daun-daunan, karotenoid yang berwarna kuning jingga pada sayuran dan buah-buahan, antosianin yang berwarna ungu, komponen fenolik juga merupakan senyawa bioaktif. Senyawa alamiah ini, meskipun merupakan senyawa xenobiotik, dalam proses ekskresinya dari tubuh tidak menghasilkan senyawa metabolit reaktif dan sering menstimulir aktivitas enzim fase 2 yang bersifat melarutkan dan antikarsinogen. Komponen bioaktif dalam proses pencernaan akan terlepas dari matriks pangan dan dapat terserap kedalam darah, dibawa menuju hati. Setelah sampai di hati sebagian akan mengalami metabolisme sebagian akan terdistribusi ke sel-sel lain dalam tubuh dan menjadi tersedia (bioavailable) untuk metabolisme di tingkat seluler. Salah satu keuntungan dari senyawa-senyawa ini adalah sifatnya sebagai antioksidan yang dapat menangkal senyawa radikal sehingga mencegah kerusakan sel. Secara umum, bahan pangan baik olahan maupun segar dapat merupakan sumber komponen bioaktif yang bermanfaat bagi tubuh. Pada dasarnya aktivitas senyawa bioaktif yang secara fisologis mendukung kesehatan dihubungkan dengan tiga sistem regulasi di dalam tubuh, yaitu sistem imun, sistem hormon (endokrin) dan sistem saraf. Manfaat komponen bioaktif terhadap kesehatan dapat dievaluasi atau ditentukan dengan melakukan pengujian-pengujian, baik secara kimia, biokimia maupun biologi. Sebagian besar pengujian komponen bioaktif dikaitkan dengan kemampuannya sebagai antioksidan, antikanker, antihiper-kolesterolemia, antidiabetik, antitrombosis maupun sebagai imunomodulator. Berbagai teknik pengujian terkait dengan kemampuan komponen bioaktif dalam mendukung kesehatan tersebut akan dibahas selanjutnya.

A. Pengujian Komponen Bioaktif Sebagai Antioksidan 1. Pengujian Aktivitas Antioksidan, metode ransimat (Metrohm, 1999) Metode rancimat banyak digunakan dalam industri pangan terutama untuk mendeteksi adanya kerusakan oksidatif. Beberapa komponen bahan pangan sensitif Nurheni Sri Palupi

2|Halaman


terhadap oksidasi, misalnya vitamin, asam amino dan asam lemak tak jenuh. Selain itu, aktivitas senyawa fenol sebagai antioksidan yang terkandung banyak dalam tanaman, juga dapat diuji menggunakan metode ini. Pada prinsipnya metode rancimat menggunakan aliran udara yang dihembuskan melalui sampel pada suhu antara 50220oC, sehingga akan mengoksidasi asam lemak dalam beberapa tahap. Oksidasi akan berlangsung berdasarkan reaksi radikal berantai, yang pada akhirnya akan terbentuk produk-produk oksidasi yang bersifat mudah menguap, terutama asam formiat. Senyawa tersebut akan ditransfer oleh aliran udara ke dalam tabung yang mengandung air deionisasi, dan konduktivitas akan terukur. Plotting konduktivitas terhadap waktu menghasilkan kurva oksidasi, dan titik belok dikenal sebagai periode induksi. Sebanyak satu ml sampel ditambahkan ke dalam 10 ml minyak kedelai murni dan 3 ml tween 80 ditambahkan ke dalam campuran tersebut. Setelah campuran dikocok, lalu ditimbang 3 g dan dimasukkan ke dalam tabung ransimat untuk dianalisis menggunakan alat ransimat pada 100oC. Metode ini menggunakan kontrol negatif minyak kedelai murni dan kontrol positif campuran 200 ppm BHT dalam minyak kedelai murni. Alat ransimat akan memberikan data berupa periode induksi (PI). Aktivitas antioksidan ditentukan dengan rumus :

2. Analisis Kadar Total Fenol Metode Folin-Ciocalteu (Nantitanon et al. 2010 yang dimodifikasi) Pada prinsipnya total fenol dapat diukur berdasarkan kemampuan reagen FolinCiocalteu (campuran fosfomolibdat dan fosfotungstat) dalam mereduksi gugus hidroksi dari fenol. Inti aromatis pada senyawa fenol, yang berupa gugus hidroksi fenolik, dapat mereduksi fosfomolibdat dan fosfotungstat menjadi molibdenum yang berwarna biru. Kandungan fenolik total dalam tumbuhan dinyatakan dalam GAE (Gallic Acid Equivalent) yaitu jumlah kesetaraan miligram asam galat dalam 1 gram sampel. Ekstrak pekat sampel dilarutkan dalam etanol absolut hingga diperoleh konsentrasi akhir 0.2 mg/mL. Sebanyak 20 µL larutan ekstrak dalam etanol dicampurkan dengan 45 µL reagen Folin-Ciocalteu dan didiamkan 3 menit. Sebanyak 135 µL Na2CO3 2 g/100 mL ditambahkan ke dalam campuran, divorteks dan disimpan di tempat gelap pada suhu ruang, 2 jam dan divorteks. Absorbansinya dibaca dengan spektrofotometer pada 750 nm. Asam galat digunakan sebagai standar sehingga satuannya dinyatakan dalam mg GAE/100 mg ekstrak. Kurva standar dibuat menggunakan asam galat (0-130 µg/ml). Selain itu kurva standar juga bisa dipersiapkan dengan menggunakan asam tanat dalam etanol 95% dengan konsentrasi 0, 5, 10, 15, 20, dan 25 ppm. Kadar total polifenol dihitung berdasarkan persamaan garis yang diperoleh dari kurva standar. Absorbansi yang diperoleh diplotkan pada kurva standar. Kadar total polifenol dihitung berdasarkan rumus sebagai berikut: Nurheni Sri Palupi

3|Halaman


Keterangan: A S Fp W

= = = =

absorbansi sampel pada panjang gelombang 750 nm slope kemiringan pada kurva standar faktor pengenceran berat sampel (mg)

3. Aktivitas Antioksidan, Metode DPPH (Kubo et al. 2002 yang dimodifikasi) Pada prinsipnya pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan mereaksikan sampel dengan radikal bebas DPPH, buffer asetat dan etanol dalam methanol sehingga terbentuk warna ungu. DPPH merupakan radikal bebas yang stabil. Tingginya aktivitas antioksidan pada sampel akan ditunjukkan oleh banyaknya DPPH yang direduksi yang terlihat dengan semakin pudarnya warna ungu. Warna yang terbentuk dibaca dengan spektrofotometer pada 517 nm. Trolox digunakan sebagai standar yang merupakan analog vitamin E yang larut dalam air. Aktivitas antioksidan dinyatakan dalam satuan TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity). Analisis dilakukan dengan memasukkan 1 ml buffer asetat 100 mM (pH 5.5), 1.87 ml etanol dan 0.1 ml radikal bebas DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 3 mM dalam metanol ke dalam tabung reaksi. Kemudian sebanyak 0.03 ml larutan sampel ditambahkan ke dalam tabung tersebut, divorteks dan diinkubasi pada 25oC, selama 20 menit. Sebagai kontrol digunakan 0.03 ml aquades sebagai pengganti sampel. Kemudian absorbansinya diukur pada 517 nm. Standar digunakan adalah Trolox ® (6-Hydroxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) 0; 1.25; 2.5 dan 5 mM sehingga satuannya dinyatakan dalam TEAC. Penurunan absorbansi menunjukkan adanya aktivitas scavenging atau aktivitas antioksidan.

B. Pengujian Komponen Bioaktif sebagai Antikanker 1. Pengujian secara in vitro a. Persiapan media kultur dan pereaksi Pembuatan Larutan RPMI 1640. Media yang digunakan untuk kultur sel adalah RPMI1640. Komposisinya dapat dilihat pada Lampiran 2. Bubuk RPMI sebanyak 10.42 g dilarutkan dalam 1 liter aquabidest, kemudian ditambahkan 2 g NaHCO3 dan 1% penisilinstreptomisin. Untuk kultur 90 ml RPMI-1640 ditambahkan 10 ml Fetal Bovine Serum (FBS). Larutan tersebut disterilisasi dengan membran sterilisasi 0.20 μm. Pembuatan MTT 0.5%. Bubuk MTT sebanyak 0.25 g dilarutkan dalam 50 ml PBS dan diaduk hingga homogen. Larutan disterilisasi dengan membran sterilisasi 0.20 μm. Pembuatan Larutan HCl-isopropanol 0.04 N. Dipipet sebanyak 23.4 μl HCl 37% (pekat) dan ditambahkan 8.9766 ml isopropanol p.a, kemudian diaduk sampai homogen sehingga

Nurheni Sri Palupi

4|Halaman


didapatkan larutan HCl-isopropanol 0.04 N. Larutan ini harus dibuat segar setiap kali hendak digunakan. Pembuatan larutan Concanavalin-A. Sebanyak 1 mg Con-A dilarutkan dengan sedikit larutan RPMI-1640, diaduk hingga rata, kemudian dimasukkan dalam labu ukur 5 ml dan ditambahkan larutan RPMI-1640 hingga tanda tera. Larutan stok tersebut divorteks hingga homogen. Larutan tersebut disterilisasi dengan menggunakan membran steril 0.20 μm . Larutan stok tersebut disimpan direfrigerator. Pada saat persiapan kultur, diambil sebanyak 0.2 mg larutan Con-A, selanjutnya dilarutkan dalam 0.8 ml larutan RPMI-1640. Pembuatan larutan lipopolisakarida (LPS). Sebanyak 1 mg lipopolisakarida dilarutkan dengan sedikit larutan RPMI-1640 dan diaduk hingga rata. Selanjutnya larutan tersebut dimasukkan dalam labu ukur 5 ml dan ditambahkan larutan RPMI-1640 hingga tanda tera. Larutan stok tersebut divorteks hingga homogen. Larutan LPS disterilisasi dengan menggunakan membran steril 0.20 μm . Larutan stok tersebut disimpan di refrigerator. Pada saat persiapan kultur, diambil sebanyak 0.2 mg larutan LPS tersebut dilarutkan dalam 0.8 ml larutan RPMI-1640. b. Pengenceran larutan stok dan pemeliharaan kultur sel kanker Banyak alur sel kanker yang dapat digunakan untuk pengujian, namun pada modul ini hanya akan dijelaskan untuk sel kanker K-562, sedangkan penggunaakn sel yang lain pada prinsipnya sama, yang perlu mendapatkan perhatian adalah penggunaan media pertumbuhan yang tepat. Perlu diketahui bahwa setiap jenis sel memerlukan media pertumbuhan optimum yang berbeda-beda. Misalnya sel kanker K-562 dan hibridoma MARK-3 baik tumbuh pada media RPMI, sedangkan sel HeLa lebih cocok tumbuh pada medium DMEM. Untuk itu maka media yang digunakan untuk pertumbuhan dan pemeliharaan sel K-562 adalah media RPMI 1640 yang disuplementasi dengan 10% serum anak sapi (newborn bovine serum-NBS), serum janin sapi (fetal calf serum-FCS) atau serum janin sapi (fetal bobine serum-FBS), serta gentamycin untuk menghambat pertumbuhan bakteri (Palupi et al. 2000). Sel K-562 dalam keadaan beku diencerkan (thawing) dengan meletakkan ampul berisi sel beku di dalam penangas air (waterbath) pada suhu 37oC. Setelah mencair, dengan segera sel dipindahkan ke dalam tabung sentrifus steril kemudian ditambahkan 5 ml media pencuci (PBS), selanjutnya disentrifus pada kecepatan 1000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan ke dalam tabung sentrifus yang berisi endapan sel ditambahkan 5 ml media pertumbuhan. Suspensi sel dipindahkan ke dalam tabung kultur berukuran 10 cm2 dengan penambahan media pertumbuhan sebanyak 10 ml. Suspensi sel diinkubasi dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37oC. Pemeliharaan sel kanker dilakukan dengan mengganti media pertumbuhan, apabila telah terjadi perubahan warna media (sebagai indikator terjadinya perubahan pH), dan apabila pertumbuhan selnya sudah rapat (pengamatan menggunakan mikroskop). Nurheni Sri Palupi

5|Halaman


Penggantian media kultur dilakukan dengan memindahkan suspensi sel ke dalam tabung sentrifus steril, kemudian disentrifus pada kecepatan 1000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan endapan sel ditambah dengan media pencuci lalu disentrifus kembali pada kecepatan dan waktu yang sama. Supernatan dibuang dan endapan sel ditambah 5 ml media kultur baru lalu diaduk perlahan. Suspensi sel dimasukkan ke dalam tabung kultur dan ditambah 10 ml media pertumbuhan kemudian diinkubasi. Pemeliharaan sel dilakukan hingga diperoleh jumlah sel yang mencukupi untuk pengujian antiproliferasi sel kanker. Penghitungan sel kanker dilakukan dengan metode trifan biru. c. Kultur sel Sebanyak 850 µL media RPMI yang telah mengandung FBS 10% dimasukkan ke dalam tiap sumur pada lempeng dengan 24 sumur. Kemudian sebanyak 50 µL suspensi sel dimasukkan ke dalam tiap sumur, selanjutnya sebanyak 100 µL sampel dan kontrol dimasukkan ke dalam sumur sehingga setiap sumur berisi 1000 µL. Sebagai kontrol positif antikanker digunakan senyawa doxorubicin sebanyak 6 µL dan 94uL media standar, sedangkan kontrol negatif digunakan media standar. Inkubasi kultur dilakukan selama tiga hari (3x24 jam). d. Pemanenan dan penghitungan sel dengan metode trifan biru (trypan blue) Setelah diinkubasi selama tiga hari, suspensi sel dalam tiap sumur diaduk perlahanlahan dengan mikropipet hingga homogen. Kemudian sebanyak 90 L suspensi tersebut dipipet ke dalam salah satu sumur pada lempeng 96 sumur dan ditambahkan dengan 10 L larutan trifan biru 0,4%. Lalu campuran suspensi sel dan trifan biru tersebut dikocok hingga homogen. Larutan suspensi sel dan trifan biru tersebut kemudian diteteskan di atas hemasitometer dan ditutup secara perlahan-lahan dengan gelas penutup hingga semua bagian di bawah gelas penutup dipenuhi larutan tersebut. Penghitungan sel dilakukan dengan bantuan mikroskop cahaya menggunakan perbesaran 40X. Sel yang dihitung adalah sel berbentuk bulat yang berada dalam 25 kotak pada bagian tengah hemasitometer. Jumlah total sel adalah jumlah seluruh sel yang hidup dan mati. Sel yang hidup tidak akan berwarna, sedangkan sel yang mati akan berwarna biru. Jumlah sel per ml, persen proliferasi dan antiproliferasi dihitung dengan rumus :

Nurheni Sri Palupi

6|Halaman


e. Pengujian aktivitas antiproliferasi, metode MTT (Kubota et al. 2003) Pada pengujian ini menggunakan lempeng kultur dengan 96 sumur. Jumlah sel kanker yang digunakan dalam penelitian ini adalah 1.5 x 10 5 sel/ml dalam media RPMI steril. Sebanyak 100µL larutan sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam sumur pada lempeng kultur, sebanyak 50 µL suspensi sel ditambahkan ke dalam sumur dan selanjutnya diinkubasi selama dua hari. Pada 6 jam sebelum masa inkubasi berakhir, ditambahkan 100µl larutan MTT 0.5% (dalam PBS) ke dalam suspensi sel pada setiap sumur lempeng mikrokultur. Pada akhir masa inkubasi, sebanyak 100µl HCl-isopropanol 0.04N ditambahkan ke dalam setiap sumur, selanjutnya absorbansi diukur menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 570 nm. Jumlah sel hidup akan proposional dengan nilai OD hasil pembacaan. Indeks penghambatan proliferasi sel kanker K-562 dinyatakan sebagai berikut :

2. Pengujian secara in vivo a. Persiapan hewan percobaan Pengujian aktivitas komponen bioaktif terhadap proliferasi limfosit secara in vivo dilakukan menggunakan mencit sebagai hewan percobaan. Mencit yang digunakan adalah mencit berumur 30 hari dengan jumlah 5-7 ekor untuk masing-masing perlakuan. Mencit diadaptasikan selama dua minggu. Selama masa adaptasi mencit diberi ransum dan minuman secara ad libitum. Formulasi makanan mencit yang diberikan menurut American Institute of Nutrition (2003). Mencit yang digunakan menpunyai berat antara 23 gram hingga 28 gram Masing-masing dikelompokkan berdasarkan perlakuannya. Setiap hari mencit diberi makanan, minuman standar dan dicekok ekstrak sampel dengan dosis yang diujikan. Kelompok kontrol dicekok air minum. Setiap minggu dilakukan pembedahan terhadap masing-masing kelompok dengan masing-masing perlakuan. Pembedahan berfungsi untuk mengambil organ limfa dan selanjutnya dihitung jumlah sel limfositnya. b. Persiapan media dan pereaksi Pembuatan larutan NH4Cl 0.85%. Bubuk NH4Cl sebanyak 0.85 g dilarutkan dalam 100 ml aquabidest dan diaduk hingga homogen. Larutan tersebut selanjutnya disterilisasi dengan membran sterilisasi 0.20 μm. Pembuatan Indikator Tryphane Blue 0.20%. Sebanyak 0.05 g bubuk trifan biru dilarutkan dalam 20 ml PBS dan diaduk hingga homogen. Pembuatan Larutan RPMI 1640. Media yang digunakan untuk kultur sel adalah RPMI-1640. Komposisinya dapat dilihat pada Lampiran 2. Bubuk RPMI sebanyak 10.42 g Nurheni Sri Palupi

7|Halaman


dilarutkan dalam 1 liter aquabidest, kemudian ditambahkan 2 g NaHCO3 dan 1% penisilinstreptomisin. Larutan tersebut disterilisasi dengan membran sterilisasi 0.20 μm. Pembuatan Phosphate Buffer Saline (PBS). Komposisi PBS yang digunakan dapat dilihat pada Lampiran 3. Semua bahan tersebut dicampur dan dilarutkan dalam 500 ml aquabidest dan diatur hingga mencapai pH 7.2. Kemudian larutan tersebut disterilisasi dengan membran sterilisasi 0.20 μm. c. Pembedahan dan isolasi dan penghitungan sel limfosit Mencit diterminasi dengan cara dislokasi cervicalis dan dibedah untuk diambil limfanya secara steril (Gambar 1). Limfa dicuci dalam RPMI-1640 steril, selanjutnya limfa dipindahkan ke dalam cawan petri lain yang berisi 3 ml RPMI-1640 steril. Limfa tersebut digerus sehingga didapatkan sel limfosit. Gerusan tersebut dimasukkan ke dalam tabung sentrifus steril 15 ml, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, pelet sel diberi 2 ml NH4Cl 0.85% steril untuk melisis sel-sel darah merah selama 2 menit dan segera ditambahkan 3 ml RPMI-1640. Suspensi sel kembali di sentrifus 3000 rpm selama 10 menit.

Gambar 1. Pengambilan organ limfa serta hati Endapan mengandung sel limfosit, sedangkan supernatan yang berisi sel darah merah yang telah lisis. Selanjutnya supernatan dibuang dengan menggunakan pipet pasteur. Endapan sel limfosit dicuci kembali dengan RPMI-1640. Endapan yang sudah dicuci, diencerkan dengan 2 ml media RPMI-1640 dan selanjutnya dihitung jumlah sel yang hidup dengan bantuan pewarna tryphan blue serta hemasitometer. Jika 95% sel limfositnya hidup, maka suspensi sel limfosit dapat diencerkan dengan RPMI-1640 agar diperoleh jumlah sel (sel/ml) yang sesuai dengan yang diperlukan. Nurheni Sri Palupi

8|Halaman


Suspensi sel dalam media standar dihitung dengan bantuan hemasitometer. Suspensi sel dicampur dengan tryphan blue dengan perbandingan 1: 1. Sebanyak 50 μl campuran ditempatkan dalam hemasitometer. Penghitungan dilakukan dengan pada perbesaran mikroskop 45 kali, sel yang hidup akan tidak berwarna sedangkan sel yang mati terlihat biru seluruhnya. Jumlah sel yang hidup dihitung pada area 2 kotak besar (@ 16 kotak kecil) lalu dihitung per ml suspensi dengan rumus: Jumlah sel/ml = jumlah sel x fp x 104, dimana fp = 2 Sel yang terhitung merupakan proliferasi limfosit mencit secara in vivo. Sel limfosit yang diperoleh digunakan sebagai kultur sel. Jumlah sel minimum dalam suspensi yang digunakan untuk kultur limfosit minimal adalah 1x105 sel dengan 95% limfositnya hidup (Tejasari et al. 2000). C. Pengujian Senyawa Bioaktif sebagai Antihiperkolesterolemia Pengujian senyawa bioaktif sebagai antihiperkolesterolemia dapat dilakukan dengan mengukur total kolesterol, high density lipoprotein (HDL), trigliserida, low density lipoprotein (LDL), penetapan indeks aterogenik, dan malonaldehida (MDA) dalam serum darah sebagai parameternya. 1. Analisis Total Kolesterol (Metode CHOD-PAP) Prinsip pengujian ini adalah mengoksidasi kolesterol hasil hidrolisis secara enzimatis. Hasil oksidasi tersebut menghasilkan senyawa kuinin (quinine) yang berwarna merah, sehingga dapat dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 500 nm. Prosedur analisis disajikan pada Gambar 2. Komposisi reagen kolesterol terdapat di Tabel 1. Nilai kadar kolesterol didapat dari persamaan berikut : Kadar kolesterol (mg/dl) = (A sampel : A standar) x 200 mg/dl 0,01 ml serum/standar ditambah 1 ml reagen kolesterol Dicampur Diinkubasi pada suhu 37 oC, 5 menit Dibaca absorbansi (A) pada λ 500 nm

Gambar 2. Prosedur Analisis Total Kolesterol.

Nurheni Sri Palupi

9|Halaman


Tabel 1. Komposisi Reagen Kolesterol Komposisi Good’s buffer pH 6.7 Phenol 4-aminoantipyrine Kolesterol esterase Kolesterol oksidase Poroksidase Standar

Jumlah 50 mmol/l 5 mmol/l 0.3 mmol/l >_ 200 U/I >_50 U/I >_ 3 kU/I 200 mg/dl (5.2 mmol/l)

2. Analisis High Density Lipoprotein (HDL) (Metode CHOD-PAP) Prinsip analisis HDL adalah dengan cara mengendapkan kilomikron, VLDL, dan LDL dengan menambahkan asam fosfotungstat dan ion Mg. Proses sentrifugasi akan memisahkan HDL dalam supernatan, yang kemudian ditentukan secara enzimatis menggunakan pereaksi DSI-cholesterol-FS. Prosedur analisis disajikan pada Gambar 3. Komposisi reagen presepitasi terdapat di Tabel 2. Nilai kadar HDL didapat dari persamaan berikut : Kadar HDL (mg/dl) = (A sampel : A standar) x 200 mg/dl Tabel 2. Komposisi Reagen Presepitasi Komposisi Jumlah Asam fosfotungstat 1.4 mmol/l Magnesium klorida 8.6 mmol/l Standar kolesterol 0.3 mmol/l Standar kolesterol 200 mg/dl (5.2 mmol/l) 3. Analisis Trigliserida (Metode GPO-PAP) Tahapan pengujian kandungan trigliserida dapat dilihat pada Gambar 3. Komposisi reagen trigliserida yang digunakan tertera pada Tabel 3. Kadar trigliserida didapat dari hasil perhitungan berikut : Kadar TG (mg/dl) = (A sampel : A standar) x 200 mg/dl 4. Analisis Low Density Lipoprotein (LDL) (Friedward et al. 1972) Setelah mendapatkan kadar total kolesterol, HDL dan TG, maka kadar LDL dapat dihitung secara langsung menggunakan rumus : Kadar LDL = total kolesterol – (HDL + TG/5); dengan asumsi TG/5 merupakan VLDL.

Nurheni Sri Palupi

10 | Halaman

Tropical Plants Curriculum 200 µl serum ditambah 500 µl reagen presipitasi

Dicampur

Diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit

Disentrifuse 4000 rpm, 10 menit

Supernatan siap dianalisis

100 µl supernatan/standar ditambahkan 1 ml pereaksi kolesterol

Dicampur

Diinkubasi pada suhu 37 oC, 5 menit

Dibaca absorbansi (A) pada λ 500 nm

Gambar 3. Prosedur Analisis Total HDL.

0,01 ml Serum/standar trigliserida ditambah 1 ml reagen trigliserida Dicampur Diinkubasi pada suhu 37 oC, 5 menit Dibaca absorbansi (A) pada λ 500 nm

Gambar 4. Prosedur Analisis Total Trigliserida Standar. 5. Indeks Aterogenik (Balsinska 1998) Indeks Aterogenik (IA) dihitung dengan rumus sebagai berikut : IA = (total kolesterol – HDL)/ HDL Nurheni Sri Palupi

11 | Halaman


Tabel 3. Komposisi Reagen Trigliserida Komposisi Jumlah Good’s buffer pH 7.2 50 mmol/l 4-klorofenol 4 mmol/l ATP 2 mmol/l 2+ Mg 15 mmol/l glycerokinase >_ 0.4 kU/I peroksidase >_2 kU/I Lipoprotein lipase >_2 kU/I 4-Aminoantipyrine 0.5 mmol/l Glycerol-3-phosphate-oxidase >_ 0.5 kU/I Standar 200 mg/dl (2.3 mmol/l) 6. Analisis Malonaldehida (MDA) (Conti et al. 1999) Analisis MDA ini dilakukan pada sampel organ hati dan limpa tikus. Prinsip analisis MDA yaitu bahwa pemanasan akan menghidrolisis peroksida lipid sehingga MDA yang terikat akan dibebaskan dan akan bereaksi dengan TBA dalam suasana asam membentuk kompleks MDA-TBA yang berwarna merah. Intensitas warna merah tersebut dapat diukur pada panjang gelombang 532 nm. Prosedur analisis MDA pada hati dan limpa dapat dilihat pada Gambar 5. Sebagai standar MDA digunakan 1,1,3,3 tetraetoksipropana (TEP). Pada suasana asam, TEP terhidrolisis dan menghasilkan hemiasetal dan etanol. Hemiasetal yang terbentuk kemudian terdekomposisi menjadi etanol dan malonaldehida. Penentuan kurva standar dilakukan sama dengan penentuan sampel. Perhitungan kadar MDA sampel berdasarkan hasil ploting nilai absorbansi pada kurva standar. Konsentrasi TEP yang digunakan yaitu 0,0; 1,2; 2,4; 3,6; 4,8; 6,0; 7,2; 15,0; dan 24,0 x10-3 pmol/ml.

D. Pengujian Senyawa Bioaktif sebagai Antidiabetes Indeks glikemik adalah angka yang menunjukkan kemampuan suatu bahan pangan untuk meningkatkan kadar gula darah. Dengan kata lain merupakan tingkatan suatu bahan pangan menurut efeknya terhadap kadar glukosa darah. Dalam memilih makanan, penderita diabetes harus memilih jenis bahan pangan sumber karbohidrat yang tidak mudah meningkatkan kadar gula darah. Terdapat jenis karbohidrat yang cepat diserap tubuh sehingga dapat meningkatkan kadar gula darah secara cepat, namun akan segera merasa lapar lagi. Ada pula jenis karbohidrat yang lambat diserap, sehingga kadar glukosa darah lebih stabil dan merasa kenyang lebih lama. Pengujian indeks glikemik dilakukan untuk mengukur efek suatu bahan pangan yang mengandung karbohidrat dalam meningkatkan kadar gula darah setelah dimakan, dibandingkan dengan glukosa murni atau roti putih. Sebagai ilustrasi, bahan pangan dengan indeks glikemik tinggi adalah bahan pangan yang cepat dicerna dan diserap sehingga dapat segera Nurheni Sri Palupi

12 | Halaman


meningkatkan kadar gula darah secara signifikan. Sebaliknya, bahan pangan dengan indeks glikemik yang rendah akan lambat dicerna dan diserap, sehingga peningkatan kadar glukosa dalam darah akan terjadi secara perlahan-lahan.

Organ hati ditimbang sebanyak 1 g

Organ limpa ditimbang dan dicatat beratnya

Ditambah larutan PBS dingin sebanyak 9 ml Dihancurkan dengan cara digerus Disentrifuse pada 3000 rpm selama 15 menit Diambil supernatan 4 ml Ditambah 1 ml larutan TCA 15% Ditambah 1 ml TBA 0.37% dalam HCL 0.25 N Dipanaskan di dalam water bath pada suhu 80 oC selama 15 menit Didinginkan sampai suhu ruang arutan TCA 15% Disentrifuse pada 3000 rpm selama 15 menit Diukur absorbansi supernatan pada λ 532 nm

Gambar 5. Prosedur Analisis MDA pada Organ Hati dan Limpa. Namun demikian, bahan pangan yang mempunyai indeks glikemik tinggi belum tentu akan meningkatkan kadar gula darah secara signifikan jika dikonsumsi dalam jumlah sedikit. Untuk itu maka jumlah konsumsi karbohidrat dalam bahan pangan harus diperhitungkan karena sangat berkonstribusi menyebabkan terjadinya perubahan kadar gula darah. Perkiraan banyaknya suatu jenis bahan pangan dalam meningkatkan kadar glukosa darah seseorang setelah dimakan disebut sebagai beban glikemik (glycemic load). Untuk itu maka beban glikemik atau bobot glikemik atau glycemic load (GL) adalah perkiraan jumlah suatu jenis bahan pangan dalam meningkatkan kadar glukosa darah Nurheni Sri Palupi

13 | Halaman


seseorang setelah makan makanan tersebut. Satu satuan beban glikemik kira-kira setara dengan efek mengkonsumsi satu gram glukosa. Beban glikemik didasarkan pada indeks glikemik (IG), untuk itu maka beban glikemik adalah jumlah gram karbohidrat yang terdapat dalam bahan pangan dikalikan dengan indeks glikemik dibagi 100. Misalnya, pepaya memiliki indeks glikemik tinggi, tetapi umumnya satu takaran saji pepaya adalah satu potong sehingga tidak banyak mengandung karbohidrat, sehingga efek glikemik makan pepaya rendah.engan kata lain maka pepaya mempunyai beban glikemik rendah. Dengan demikian kalau indeks glikemik didefinisikan untuk tiap jenis makanan, maka biasanya beban glikemik didefinisikan per takaran saji, atau per hari konsumsi. Dengan konsep beban glikemik maka mudah dipahami bahwa mengonsumsi 25 gram makanan yang memiliki IG 75 memiliki efek glikemik yang sama dengan mengkonsumsi 75 gram makanan yang memilki IG 25. Pada umumnya pengujian indeks glikemik suatu bahan pangan dilaksanakan dalam tiga tahapan yaitu: seleksi subjek, pengujian IG produk dan perhitungan BG produk. 1. Seleksi Subjek Sukarelawan yang digunakan sebagai subjek pada pengujian IG harus memenuhi kriteria wanita dan laki-laki sehat berumur 20-38 tahun, tidak menderita penyakit penyerta, yaitu penyakit metabolisme yang berkaitan dengan kelainan kadar glukosa darah, seperti diabetes mellitus, hipoglisemia dan hiperglisemia; memiliki indeks massa tubuh (IMT) 18.5-24.99 kg/m2 (WHO 2006); tidak hamil dan menyusui; memiliki kadar glukosa darah normal (kadar glukosa darah puasa kurang dari 110 mg/dL dan glukosa darah 2 jam post prandial kurang dari 140 mg/dL (Mayfield 1998); memiliki pola respon kadar glukosa darah selama 2 jam pengujian yang normal yaitu naik dan kemudian turun; tidak merokok serta bersedia menjadi subjek. Sukarelawan harus mendapatkan penjelasan sesuai naskah penjelasan untuk mendapatkan persetujuan subjek dan mengisi formulir persetujuan setelah penjelasan (informed consent) untuk menjadi peserta pengujian IG. Seleksi dilakukan dengan cara wawancara, penimbangan berat dan tinggi badan subjek serta pengujian IG glukosa murni untuk melihat respon glukosa darah subjek. Seleksi ini dilakukan sampai diperoleh 12 subjek yang memenuhi kriteria tersebut. Tahap seleksi subjek dan pengujian IG dilakukan di bawah pengawasan dokter dan pengambilan darah dilakukan oleh tenaga analis kesehatan. 2. Pengujian Indeks Glikemik (IG) Setiap sukarelawan diberikan sampel (produk pangan) yang jumlahnya setara dengan 50 gram karbohidrat total. Kadar karbohidrat sampel diperoleh melalui analisis proksimat (by difference). Apabila sampel yang diuji lebih dari satu, maka pengukuran sampel diberi selang waktu setiap 2 hari untuk menstabilkan kondisi pencernaan tubuh. Nurheni Sri Palupi

14 | Halaman


Sebagai standar dapat digunakan 50 gram glukosa bubuk yang telah dilarutkan dalam 150 ml air. Pengukuran kadar gula darah dilakukan setelah periode puasa selama 12 jam. Selama dua jam pasca konsumsi bahan pangan yang diuji, diambil sampel darah sukarelawan sebanyak 0.2 µl (finger-prick capillary blood samples method) diambil setiap selang 30 menit sekali yaitu 0 menit (kadar gula darah puasa), 30 menit, 60 menit, 90 menit, dan 120 menit. Selang dua hari, hal yang sama dilakukan dengan memberikan 50 g glukosa murni (sebagai pangan acuan) kepada sukarelawan. Hal ini dilakukan untuk mengurangi efek keragaman glukosa darah dari hari ke hari. Pengukuran kadar gula darah dilakukan dengan menggunakan glukometer merk one touch ultra. Pengambilan darah dilakukan melalui pembuluh kapiler yang terdapat di jari tangan. Pembuluh darah kapiler dipilih karena berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Ragnhild et al. (2004), menunjukkan bahwa darah yang diambil dari pembuluh darah kapiler memiliki variasi kadar glukosa darah pada panelis yang lebih kecil dibandingkan darah yang diambil dari pembuluh vena. Glukosa darah akan bereaksi dengan enzim glucose oxydase (GOD) dan potasium ferosianida yang terdapat pada test strip, dan dihasilkan potasium ferosianida. Jumlah potasium ferosianida yang dihasilkan setara dengan jumlah glukosa yang terkandung pada sampel (Arkray 2001). Nilai kadar gula darah ini kemudian diplotkan menjadi sebuah grafik dengan sumbu X sebagai waktu pengukuran dan sumbu Y sebagai kadar gula darah. Indeks glisemik dihitung sebagai perbandingan antara luas kurva kenaikan kadar gula darah setelah mengkonsumsi sampel dan glukosa sebagai standar dikalikan 100 (Haliza et al, 2006). Nilai indeks glisemik akhir adalah nilai rata-rata dari 8 orang sukarelawan tersebut.

3. Perhitungan Beban Glisemik (BG) Produk Beban glisemik (BG) dihitung dengan mengalikan IG produk dengan kandungan karbohidrat tersedia atau tercerna (available carbohydrate), atau kandungan pati dalam satu takaran saji (serving size) pangan tersebut, dibagi 100 (Foster-Powell et al. 2002). Perhitungan BG dilakukan untuk takaran saji kue basah dan cookies sebanyak 100 g. Hal ini dilakukan karena kue basah dan cookies yang dijual dipasaran umumnya dikemas untuk takaran saji dengan berat kurang lebih 100 g.

E. Pengujian Senyawa Bioaktif sebagai Antitrombosis Trombosis merupakan proses koagulasi dalam pembuluh darah yang berlebihan sehingga menyebabkan terjadinya penghambatan aliran darah, atau bahkan dapat Nurheni Sri Palupi

15 | Halaman


menghentikannya. Trombosis dapat terjadi di mana saja dalam sirkulasi darah manusia sehingga dapat menyebabkan berbagai gangguan terhadap kesehatan. Pengujian senyawa bioaktif sebagai antitrombosis dilakukan dengan penentuan kandungan trombosit darah secara in vivo. Trombosit berfungsi dalam sistem pembekuan darah, dari trombosis jaringan yang rusak akan dikeluarkan tromboplastin yang bereaksi dengan protrombin dan kalsium membentuk trombin. Trombin akan bereaksi dengan fibrinogen membentuk fibrin yang akan menutupi jaringan yang terluka. Keadaan ini sering terjadi pada penderita demam berdarah dengue (DBD). 1. Persiapan sampel darah Pada pengujian ini digunakan hewan percobaan, yaitu rattus norvegicus dari galur Sparague Dawley berumur tiga bulan dan berjenis kelamin jantan. Tikus yang digunakan terdiri dari tiga kelompok perlakuan, dimana masing-masing kelompok terdiri dari enam ekor tikus. Kelompok pertama hanya diberi ransum standar tanpa pemberian sari buah jambu biji dan berfungsi sebagai kelompok kontrol. Kelompok kedua diberi ransum standar dan sari buah jambu biji yang tidak dipasteurisasi, sedangkan kelompok ketiga diberi ransum standar dan sari buah jambu yang sudah dipasteurisasi. Sari buah diberikan pada tikus dengan cara pencekokan sebanyak 3 ml untuk masing-masing tikus. Pemberian dilakukan satu kali sehari, selama 28 hari. Proses pencekokan tikus dilakukan perlahanlahan untuk mencegah agar tikus tidak terluka. Sebelum dicekok, tikus diadaptasikan terhadap kandang dan ransum yang digunakan terlebih dahulu selama 1 minggu. Ransum yang digunakan adalah ransum standar dengan komposisi sebagai berikut (AOAC, 1995) :

Nurheni Sri Palupi

16 | Halaman


Pada awal pengujian, diambil satu ekor tikus dari masing-masing kelompok untuk mengetahui jumlah trombosit awal tikus. Penghitungan jumlah trombosit dilakukan di laboratorium klinis dengan sampel darah tikus yang diambil dari bagian jantung. Kemudian tikus yang lain diberi perlakuan selama 28 hari. Setelah 28 hari, dilakukan pengujian jumlah trombosit darah tikus-tikus tersebut dengan sampel darah yang diambil dari bagian jantung. Darah yang diambil harus segera dimasukkan ke dalam tabung vacutainer yang berisi antikoagulan EDTA dan disimpan dalam wadah kedap yang diberi pendingin untuk mencegah kerusakan darah. 2. Penghitungan jumlah trombosit (Metode QBC, Becton Dickinson, 1989) Penghitungan kadar trombosit sampel darah dilakukan dengan metode semi otomatis QBC (Quantitative Buffy Coat). Sampel darah ditempatkan pada tabung kapiler yang berisi acridine orange, kalsium oksalat, agglutinating agent, dan penstabil. Tabung ini kemudian disentrifus dengan kecepatan 2000 rpm selama 5 menit. Komponenkomponen pada sampel akan terpisah berdasarkan berat jenisnya. Sel darah merah merupakan komponen terbesar, sekitar 35-50% dari total volume sampel. Bagian lain sel darah, yaitu sel darah putih dan platelet atau trombosit akan membentuk lapisan kekuningan yang disebut buffy coat dan berada diantara lapisan sel darah merah dan plasma. Tabung kapiler yang digunakan pada analisa ini adalah pipa kaca yang berisi pelampung berbentuk bola yang terbuat dari plastic. Berat jenis pelampung ini sedemikian rupa sehingga dapat mengapung diantara lapisan sel darah merah dan lapisan plasma. Adanya pelampung ini membuat ruang antara dinding tabung kapiler dengan dinding pelampung. Buffy coat yang terbentuk selama sentrifugasi akan terkumpul pada ruang tersebut, sehingga panjang lapisannya menjadi 10 kali lebih panjang dari semula. Perpanjangan ukuran lapisan ini dimaksudkan agar buffy coat lebih mudah untuk dianalisa dan diukur. Pereaksi yang ada di dalam tabung akan menyebabkan tiap lapisan menampilkan warna yang berbeda pada saat dianalisa dengan QBC Autoread. Acridine orange akan diserap oleh nukleoprotein, sehingga akan menimbulkan warna pada saat terkena cahaya ultraviolet. QBC Autoreader akan menguji intensitas warna yang dihasilkan oleh DNA dan RNA atau lipoprotein. Perbedaan intensitas warna digunakan untuk mendeteksi perbedaan antar sel pada buffy coat. Berdasarkan persamaan intensitas warna tersebut, jumlah sel tiap komponen lapisan buffy coat dapat dihitung. Platelet atau trombosit mempunyai intensitas warna yang lebih rendah dibandingkan dengan komponen sel darah lain pada lapisan buffy. Jumlah trombosit dinyatakan dalam jumlah sel/μl darah (Becton Dickinson, 1989). Perbedaan lapisan pada tabung kapiler setelah disentrifuse dapat dilihat pada Gambar 6.

Nurheni Sri Palupi

17 | Halaman


F. Pengujian Senyawa Bioaktif sebagai Imunomodulator Imunomodulator adalah kemampuan untuk meningkatkan sistem imun. Beberapa senyawa yang dapat berperan sebagai imunomodulator antara lain karbohidrat, terpenoid, steroid, flavonoid, glikoprotein, alkaloid dan beberapa senyawa organik lain yang mengandung nitrogen. Pengujian senyawa bioaktif sebagai imunomodulator dapat dilakukan melalui mekanisme peningkatan proliferasi sel-sel dalam sistem imun, khususnya sel limfosit pada manusia. Adapun tahapan pengujiannya meliputi: (1) persiapan media kultur sel; (2) isolasi sel limfosit; (3) penghitungan jumlah sel limfosit; dan (3) pengujian proliferasi sel limfosit.

Sel darah merah

Sel darah merah sekitar float Granulosit Limfosit dan monosit Trombosit Plasma

Gambar 6. Fraksi darah dalam tabung kapiler setelah sentrifugasi (Becton Dickinson, 1989). 1. Persiapan media kultur sel Bahan yang digunakan sebagai media kultur sel berupa RPMI-1640 yang telah diperkaya dengan glutamin 10mM. Larutan RPMI standar dibuat dengan melarutkan RPMI dalam bentuk bubuk sebanyak 16.2g ke dalam 1L akuabides. Selanjutnya ditambahkan 2 g HaHCO3 sebagai bufer dan 10 mL penisilin-streptomisin (1%) sebagai antibiotik untuk mencega terjadinya kontaminasi. Apabila media standar tersebut akan digunakan sebagai media perttumbuhan sel diperlukan penambahan 10% serum yang dapatberupa serum darah AB manusia atau fetal calf serum (FCS), atau fetal bovine serum (FBS). Akhirnya larutan tersebut disterilkan menggunakan membran steril 0.22um. Serum darah AB dapat diperoleh dari seorang donor darah sehat yang mempunyai golongan darah AB. Pengambilan darah dilakukan oleh tenaga medis dengan Nurheni Sri Palupi

18 | Halaman


menggunakan jarum precisionglideTM steril sekali pakai dan telah dihubungkan dengan vacutainer. Darah yang diperoleh selanjutnya disentrifus pada kecepatan 4000 rpm selama 30 menit, kemudian serum dipisahkan dari endapan sel-sel darah menggunakan mikropipet. Serum yang diperoleh kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 56oC selama 30 menit dan selanjutnya disterilisasi dengan melewatkan melalui membran steril berukuran 0.22 um. Apabila digunakan FCS atau FBS dapat dibeli atau dipesan melalui agen atau toko bahan kimia. 2. Isolasi sel limfosit Limfosit dapat diisolasi dari darah manusia. Darah diambil secara aseptis menggunakan syringe dan jarum butterfly nomor 23 sekali pakai yang telah dihubungkan dengan vacutainer yang telah berisi antikoagulan EDTA. Isolasi sel limfosit dari darah dilakukan di laboratorium dengan memisahkan dari komponen seluler menggunakan sentrifus dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit. Komponen seluler darah berupa eritrosit yang lebih berat dan berwarna merah akan berada pada bagian bawah, sedangkan serum darah yang berwarna kuning akan terpisah pada bagian atas. Kedua bagian tersebut dipisahkan oleh lapisan tipis yang disebut buffy coat, yang kaya akan sel limfosit. Sebanyak 2 ml lapisan buffy coat dimasukkan ke dalam tabung sentrifus yang berisi 3 ml larutan ficoll-hystopaque (densitas 1.77 ± 0.001 g/ml) secara perlahan-lahan melalui dinding tabung sampai terbentuk dua lapisan. Selanjutnya disentrifugasi kembali dengan kecepatan 2500 rpm selama 30 menit sehingga akan terpisah dua lapisan. Lapisan bagian atas yang mempunyai densitas lebih rendah dari larutan ficoll histopaque terdiri dari sel darah putih yang tidak bergranula atau agranulosit, seperti limfosit dan monosit. Sedangkan lapisan bagian bawah yang mempunyai densitas lebih tinggi terdiri dari sel darah merah dan sel lain yang bergranula atau granulosit. Lapisan bagian atas yang menyerupai cincin putih yang berisi sel limfosit kemudian diambil secara perlahan-lahan menggunakan mikropipet dan dipindahkan ke dalam tabung sentrifus. Selanjutnya disentrifugasi dengan menambahkan larutan RPMI standar dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit dan dilakukan sebanyak dua kali. Supernatan kemudian dibuang dan sel disuspensikan dalam larutan RPMI standar untuk dilakukan penghitungan jumlah sel sebelum sel limfosit digunakan untuk pengujian. 3. Penghitungan jumlah sel limfosit Untuk mengetahui adanya perubahan jumlah sel selama pengujian, maka terlebih dahulu harus dilakukan penghitungan jumlah sel limfosit awal. Penghitungan dapat dilakukan menggunakan pewarna trifan biru dengan perbandingan suspensi sel dan pewarna trifan biru sebesar 1:1. Sebanyak 50 µL pewarna trifan biru ditambahkan ke dalam 50 µL suspensi sel di dalam sumur pada lempeng mikrokultur dan diaduk perlahan. Sejumlah kecil suspensi sel dan pewarna diletakkan di hemasitometer (Gambar 7) dan diamati di bawah mikroskop pada perbesaran 400x. Sel limfosit yang hidup berwarna terang dan berbentuk bulat, sedangkan sel mati berwarna biru dan berkeriput. Selain itu, sel yang hidup akan berukuran relatif lebih besar Nurheni Sri Palupi

19 | Halaman


dibandingan dengan yang mati. Jumlah sel yang hidup dan mati dihitung minimal dalam dua bidang pandang. Penghitungan sel hendaknya dilakukan dalam waktu tidak lebih dari tiga menit untuk mencegah terjadinya penyerapan warna oleh sel hidup. Pewarna trifan biru mempunyai afinitas yang kuat terhadap DNA sel. Jumlah sel dalam setiap mililiter suspensi ditentukan sebagai berikut :

N V F 104

= = = =

jumlah sel/ml jumlah sel hidup atau mati rata-rata per bidang pandang faktor pengenceran (2 yang diperoleh akibat penambahan trifan biru 1:1) volume 1 bidang pandang pada hemasitometer 1 mm3 = 10-4 ml

Gambar 7. Bidang pandang hemasitometer di bawah mikroskop

4. Pengujian proliferasi sel limfosit Sebelum digunakan untuk pengujian harus dipastikan bahwa viabilitas sel harus sebesar 95%. Sebanyak 80 uL suspensi sel (2x106 sel/ml) dalam media lengkap dimasukkan ke dalam sumur lempeng mikrokultur, kemudian masing-masing ditambahkan 20uL larutan ekstrak sampel yang mengandung komponen bioaktif. Selain itu sel limfosit juga dikultur dengan 20uL lipopolisakarida (LPS) dan pokeweed (PKW) pada konsentrasi 50ug/mL (mitogen) sebagai kontrol positif. Sebagai kontrol negatif (standar), suspensi limfosit juga dikultur dalam media RPMI standar, tanpa mitogen. Semua perlakuan dan kontrol masing-masing dibuat tiga ulangan dan masing-masing dibuat catatan pemetaan perlakuannya. Selanjutnya lempeng mikrokultur diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37oC, dengan atmosfer yang mengandung CO2 5%, O2 95% dan RH Nurheni Sri Palupi

20 | Halaman


96%, selama 3x24 jam (dapat bervariasi berdasarkan aktivitas komponen bioaktif berdasarkan referensi penelitian terdahulu). Enam jam sebelum inkubasi berakhir, ditambahkan 10uL pereaksi garam tetrazolium (MTT) 5% ke dalam masing-masing sumur lempeng mikrokultur secara aseptis. Larutan MTT 5% dibuat dengan cara melarutkan 0.25g bubuk MTT ke dalam 50 ml PBS dan diaduk hingga homogen, kemudian disterilisasi dengan membran steril 0.22 um. Selanjunya lempeng mikrokultur diinkubasi kembali sampai akhir masa inkubasi 3x24 jam. Setelah masa inkubasi berakhir, ke dalam setiap sumur lempeng mikrokultur ditambah 80 μl HClisopropanol 0,04N. Larutan HCl-isopropanol 0,04N dibuat dengan cara menambahkan sebanyak 23.4 uL HCl 37% ke dalam 8.97 uL isopopanol PA. Selanjutnya dilakukan pengukuran absorbansi setiap sumur lempeng mikrokultur menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 570 nm. Nilai OD (absorbansi) hasil pembacaan bersifat proporsional terhadap jumlah sel hidup. Indeks Stimulasi (IS) dihitung dengan menggunakan persamaan berikut:

Referensi: [AIN] American Institute of Nutrition. 1993. Components of the AIN-93 diets as improvements in the AIN-76 Diet. Journal of Nutrition 127 (5): 838S-841S. [AOAC] Association of Official Analytical and Chemist. 1995. Official Methods of Analysis of AOAC International 16th edition. Airlington, Virginia. Arkray. 2001. Instruction Manual for Glucometer. Arkray Corp. Kyoto, Japan.

Balasinska B. 1998. Hypocholesterolemic effect of food dietary evening primerose (Oenothera paradoxa) cake extract in rats. Food Chemistry 63(4):453-459. Becton Dickinson. 1989. QBC Manual. Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes. Conti M, Moramd PC, Levillain P, and Lemmonier A. 1999. Improve Fluorometric Determinant of Malonaldehyde. Am J Clin Nutr 53: 314-321. Foster-Powell K, Holt SHA, Brand-Miller JC. 2002. International table of glycemic index and glycemic load values. Am J of Clin Nutr 76:5-56. Nurheni Sri Palupi

21 | Halaman


Friedward WT, Levy RJ, Fredricken DS. 1972. Estimation of HDL-c in the plasma without the use of preparative ultracentrifige. Clin. Chem 18:449. Haliza W, Purwani E Y, Yuliani S. 2006. Evaluasi Kadar Pati Tahan Cerna dan Nilai Indeks Glikemik Mi Sagu. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan. 17:149-152. Kubo I, Masuoka N, Xiao P, Haraguchi H. 2002. Antioxidant activity of deodecyl gallate. J Agric Food Chem 50:3533-3539. Kubota T, Egawa T, Otani Y, Furukawa T, Saikawa Y, Yoshida M, Watanabe M, Kumai K, dan Kitajima M. 2003. Cancer chemoteraphy chemosensitivity testing is useful in evaluating the appropiate adjuvant cancer chemoteraphy for stages iii/iv gastric cancers without peritoneal dissemination. Anticancer Res 23(1B): 583-587. Mayfield J. 1998. Diagnosis and classification of diabetes mellitus: new criteria. Am Fam Physician 58:1355-62, 1369-70. Nantitanon W, Yotsawimonwat S, Okogoni S. 2010. Factors influencing antioxidant activities and total phenolic content of guava leaf extract. LWT-Food Science and Technology XXX:1-9. Palupi NS, Franck P, Guimont C, Linden G, Dumas D, Stoltz J, Belleville-nabet F, Nabet P and and Dousset B. 2000. Bovine -lactoglobulin receptors on transformed mammalian cell (hybridomas Mark-3): characterization by flow cytometry. J Biotechnol 78:171-184. Tejasari, Zakaria FR, dan Sajuthi D. 2002. Aktivitas Stimulasi Komponen Bioaktif Rimpang Jahe (Zingiber officinale Roscoe) pada Sel Limfosit B Manusia Secara In Vitro. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan. XIII(1) : 47-52.

Nurheni Sri Palupi

22 | Halaman

EVALUASI KOMPONEN BIOAKTIF TANAMAN UNTUK KESEHATAN (EVALUATION OF BIOACTIVE COMPOUNDS OF PLANTS FOR HEALTH)

Recommend Documents