ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ Katedra přírodovědných oborů

ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ Katedra přírodovědných oborů

TÝMOVÝ PROJEKT

2012

Jaroslava Jurkaninová

ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE Fakulta biomedicínského inženýrství Katedra biomedicínské techniky

Využití moderních metod v biomedicínském výzkumu Týmový projekt

Vedoucí projektu: RNDr. Taťána Jarošíková, CSc. Student:

Jaroslava Jurkaninová

leden 2012

II

Anotace – Vyuţití moderních metod v biomedicínském výzkumu Tato práce shrnuje základní informace o vyuţití moderních metod v biomedicínském výzkumu. Práce se zajímá o metodu ELISA, nepřímou imunofluorescenci, blotovací techniku, sekvenování a PCR. První polovina teoretické části se zaměřuje na popis, princip, vyuţití a omezení jednotlivých metod. V druhé polovině teoretické části se blíţe zaměřuje na vyuţívanou laboratorní techniku (ELISA reader, promývačka, fluorescenční mikroskop, blot analyzátor a PCR termocykler). Experimentální část popisuje čtyři dílčí úseky. První úsek se zabývá metodou ELISA, tudíţ její reagencií, přípravou vzorků pacientů k pouţití, pracovní postup

metody

a

interpretaci

výsledků.

Druhý

úsek

sledoval

metodu

nepřímé

imunofluorescence, u které se opět popisuje reagencie, přípravu vzorků pacientů, pracovní postup metody a interpretace výsledků. Tyto základní vlastnosti sledují i další úseky u blotovacích technik a PCR.

Abstract – Application of modern methods in biomedical research This thesis sums up the basic information about application of modern methods in biomedical

research.

The

thesis

is

interested

in

the

method

ELISA,

indirect

imunofluorescence, blot technique, sequencing and PCR. First half of the theoretical part is focused on the description, principle, use and limitations of each method. The second half of the theoretical part is closer focused on used laboratory equipment (ELISA reader, washer, fluorescence microscope, blot analyzer and PCR thermocycler). The experimental section describes the four sub-sections. The first section deals with the ELISA method, her reagents, sample preparation of patients to use workflow methods and interpretation of results. The second section followed the method of indirect immunofluorescence, in which describes the reagents again, sample preparation of patients, workflow methods and interpretation of results. These basic properties followes other sections of blotting techniques and PCR.

III

Poděkování Ráda bych poděkovala za rady a připomínky k mé práci své konzultantce paní RNDr. Ivaně Půtové. Mé díky patří také mé vedoucí práce paní RNDr. Taťáně Jarošíkové, CSc., za odborné vedení při zpracování Týmového projektu. V neposlední řadě bych chtěla poděkovat pracovnicím Revmatologického ústavu v Praze na oddělení imunologie za všestrannou pomoc.

IV

Prohlášení

Prohlašuji, ţe jsem týmový projekt s názvem: Využití moderních metod v biomedicínském výzkumu vypracovala samostatně a pouţila k tomu úplný výčet citací pouţitých pramenů, které uvádím v seznamu přiloţeném k závěrečné zprávě.

Nemám závaţný důvod proti uţití tohoto školního díla ve smyslu §60 Zákona č.121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů (autorský zákon).

V Kladně dne 27. 12. 2011

Jaroslava Jurkaninová podpis

V

Obsah Úvod ........................................................................................................................................................ 8 1.

Laboratorní metody k diagnostice imunopatologických stavů ........................................................ 9 Vyšetřování sloţek humorální imunity ....................................................................................... 9

1.1.

ELISA...................................................................................................................................... 9

1.1.1. 1.1.1.1.

Princip metody .................................................................................................................... 9

1.1.1.2.

Vyuţití metody .................................................................................................................... 9 Nepřímá imunofluorescence .................................................................................................... 9

1.1.2. 1.1.2.1.

Princip metody .................................................................................................................. 10

1.1.2.2.

Omezení testu a očekávané hodnoty ................................................................................. 10

1.1.2.3.

Vyuţití metody .................................................................................................................. 11 Blotovací techniky ................................................................................................................. 11

1.1.3. 1.1.3.1.

Princip metody .................................................................................................................. 11

1.1.3.1.1.

Western Blot ...................................................................................................................... 11

1.1.3.1.2.

IMTEC-ANA-LIA Maxx .................................................................................................. 12

1.1.3.2.

Vyuţití metody .................................................................................................................. 13

Metody molekulární biologie .................................................................................................... 14

1.2.

Sekvenování DNA ................................................................................................................. 14

1.2.1. 1.2.1.1.

Princip metody .................................................................................................................. 14 PCR ....................................................................................................................................... 15

1.2.2. 1.2.2.1.

Princip metody .................................................................................................................. 15

1.2.2.1.1.

Vyuţití metody .................................................................................................................. 16

2.

Vyuţívaná laboratorní technika ..................................................................................................... 16

2.1.

ELISA Reader ........................................................................................................................... 16

2.2.

WELLWASH, promývačka mikrodestiček Thermo Labsystems ............................................. 17

2.3.

Fluorescenční mikroskop........................................................................................................... 18

2.3.1.

Fluorescence .......................................................................................................................... 18

2.3.2.

Konstrukce fluorescenčního mikroskopu .............................................................................. 19

2.3.2.1.

Transmisní fluorescenční mikroskop (Transmition light fluorescence microscope) ......... 19

2.3.2.2.

Epifluorescenční mikroskop (Reflected light fluorescence microscope) .......................... 20

2.3.3.

Některé pouţívané flourochromy .......................................................................................... 20

2.3.4.

Blot analyzátor - ProfiBlot 48 ............................................................................................... 21

2.4.

PCR Termocykler ...................................................................................................................... 22 VI

3.

Experimentální část ....................................................................................................................... 23 ELISA........................................................................................................................................ 23

3.1. 3.1.1.

Reagencie, vzorky a jejich příprava ...................................................................................... 23

3.1.2.

Pracovní postup ..................................................................................................................... 23

3.1.3.

Interpretace výsledků ............................................................................................................ 24 Fluorescenční nDNA test .......................................................................................................... 25

3.2. 3.2.1.

Reagencie, vzorky a jejich příprava ...................................................................................... 25

3.2.2.

Pracovní postup ..................................................................................................................... 26

3.2.3.

Interpretace výsledků ............................................................................................................ 27 Blotovací techniky ..................................................................................................................... 28

3.3.

Western Blot .......................................................................................................................... 28

3.3.1. 3.3.1.1.

Příprava gelů, pufrů a dalších roztoků k elektroforéze ...................................................... 29

3.3.1.2.

Elektroforéza ..................................................................................................................... 30

3.3.1.3.

Blotování ........................................................................................................................... 31

3.3.1.4.

Western Blot ...................................................................................................................... 31

3.3.2.

IMTEC-ANA-LIA Maxx ...................................................................................................... 33

3.3.3.

Reagencie, vzorky a jejich příprava ...................................................................................... 33

3.3.4.

Inkubace ................................................................................................................................ 33

3.3.5.

Interpretace výsledků ............................................................................................................ 34 PCR ........................................................................................................................................... 34

3.4. 3.4.1.

Příprava vzorků ..................................................................................................................... 34

3.4.2.

Elektroforéza ......................................................................................................................... 35

3.4.3.

Vyhodnocení vzorků ............................................................................................................. 36

4.

Závěr.............................................................................................................................................. 37

5.

Seznam pouţitých zkratek ............................................................................................................. 38

6.

Seznam tabulek.............................................................................................................................. 40

7.

Seznam obrázků ............................................................................................................................ 41

8.

Seznam pouţité literatury .............................................................................................................. 42

VII

Úvod Organizmus neustále čelí invazi patogenů a organizmů z okolního prostředí. Obranný systém významně zvyšuje šance na přeţití a jeho selhání můţe být pro organizmus zničující. Naproti tomu, však omezuje léčebné moţnosti moderní medicíny. V práci se zbývám moderními metodami k detekci infekčních agens, protilátek, autoprotilátek, odchylek v genomu apod. Jedná se o metody ELISA, nepřímá imunofluorescence, blotovací techniky, PCR a sekvenování. Pro aplikaci těchto imunologických metod se vyuţívá přístrojové laboratorní techniky, bez které by se tyto jiţ výše zmiňované metodynedali praktikovat. Laboratorní přístrojová technika je v moderních metodách imunologie tedy nezbytnou součástí. S příslušnou laboratorní technikou a metodami, se kterými se v práci zabývám, jsem se seznámila a praktikovala je v Revmatologickém ústavu v Praze v laboratořích oddělení klinické imunologie. Cílem naší práce v rámci Týmového projektu bylo se seznámit teoreticky a prakticky s přístrojovou technikou a metodami pouţívanými v laboratoři při zpracování materiálu k detekci infekčních agens, protilátek, autoprotilátek, odchylek v genomu apod. Seznámila jsem se s metodami ELISA, nepřímá imunofluorescence, blotovací techniky, PCR a sekvenování. Poznatky a zkušenosti, které jsem v rámci tohoto předmětu získala, vyuţiji v realizaci bakalářské práce, kde budu pomocí jiţ uvedených metod a přístrojové laboratorní techniky vyšetřovat a vyhodnocovat soubor pacientů a srovnávat jednotlivé metody.

8

1. Laboratorní metody k diagnostice imunopatologických stavů 1.1. Vyšetřování složek humorální imunity Tyto imunologické laboratorní metody jsou zaloţeny na principu reakce antigenu a protilátky. 1.1.1. ELISA Tato metoda vyuţívá reakce antigenu a protilátky k vysoce senzitivním reakcím pouţitím značených antigenů nebo protilátek. Pro svoji citlivost umoţňuje stanovení i malých koncentrací látek. Výhodou je citlivost, specifičnost a reprodukovatelnost.[10]

1.1.1.1.

Princip metody

ELISA je speciálním druhem EIA. Testy EIA pomocí imunochemické reakce s enzymatickou detekcí umoţňují stanovit v neznámém vzorku koncentraci antigenu či protilátky. Indikátorem je enzymový konjugát. Reakce se pak detekuje pomocí spektrofotometrie, nefelometricky, fluorometricky nebo

luminometricky podle povahy

substrátu. [10] Protilátka se naváţe na pevnou fázi a po kompetitivní reakci s antigenem (značeným) se v neznámém vzorku ustanoví rovnováha a inkubuje se určitou dobu. Nenavázané sloţky odstraníme vymytím. K pevné fázi s navázanými sloţkami se přidá druhá protilátka s enzymem a opět inkubujeme a promyjeme, aby se odstranil nenavázaný konjugát. Vzniklá reakce se měří fotometricky. [10]

1.1.1.2.

Využití metody

V imunologických laboratořích se těchto metod vyuţívá ke stanovení protilátek, které se vyskytují v nízkých koncentracích.

Dalším vyuţitím je stanovení specifických

autoprotilátek, specifických protilátek proti očkovacím antigenům a infekčním mikrobiálních činitelů a dále ke stanovení cytosinů a jiných látek. [10]

1.1.2. Nepřímá imunofluorescence Imunofluorescence je vizualizační metoda, která zobrazuje reakci mezi antigenem a protilátkou. Pouţívá se ke stanovení autoprotilátek. Jejím výsledkem je, zda a jak preparát 9

svítí. Tato metoda je doplňována metodami jako je ELISA a blotování. Imunofluorescenční mikroskopie je imunohistochemickou či imunocytochemickou metodou, slouţící k průkazu a lokalizaci antigenů v tkáních nebo buňkách po jejich reakci s protilátkami označenými fluorescenčními látkami.[10]

1.1.2.1.

Princip metody

Pro detekci autoprotilátek se vyuţívá substrát, na kterém se vyšetření provádí. Substrátem je cytologická nebo histologická struktura v mikrotomovém řezu z příslušné tkáně, buněčná suspenze nebo fixovaná tkáňová struktura. K substrátu se přidá vzorek séra, a tak dojde k navázání specifické protilátky k struktuře. Pomocí druhé protilátky, která často bývá zvířecí protilátka proti lidské části imunoglobulinové molekuly, konjugované s vhodným fluorochromem dojde k ozřejmění. Mezikrokem je promytí preparátu. Dosáhneme tak odstranění

protilátek,

které

se

na

cílové

struktury

neváţou.

Fluorochrom

(fluoreceinizothiokyanát, tetrametylrhodamin), který tvoří komplex s protilátkou, ve světle o vlnové délce 490 nm emituje charakteristické světlo o určité vlnové délce. Vyhodnocovač hodnotí, zda preparát svítí nebo nesvítí a musí znát histologii, by se dokázal ve strukturách orientovat. Preparát lze uchovat ve formě fotografie či v digitální počítačové podobě. [10]

1.1.2.2.

Omezení testu a očekávané hodnoty

Diagnózu nelze stanovit pouze na základě detekce nDNA protilátek. Lékař musí tyto výsledky interpretovat ve spojení s pacientovou anamnézou a symptomy, fyzickými nálezy a dalšími diagnostickými postupy. Léčba by neměla být zahájena pouze na základě pozitivního testu na protilátky nDNA. Před započetím jakékoli léčby musí lékař zváţit klinické indikace, další laboratorní výsledky a vlastní klinický dojem. Některé léky, včetně procainamidu a hydralazinu, mohou indukovat onemocnění podobné lupus erythematosus(LE). Pacienti s LE vyvolaným léky mohou vykazovat pozitivní ANA, běţně proti nukleárním histonům, avšak vyskytly se i protilátky proti nDNA. Přestoţe vysoké titry nDNA mohou ukazovat na SLE, je třeba tuto informaci nebrat jako diagnózu, ale jako součást celkové klinické anamnézy pacienta. Nízké titry nDNA protilátek se často vyskytují v séru pacientů s revmatoidní artritidou,

Sjögrenovým

syndromem,

systémovou

sklerodemii,

dermatomyositidou,

diskoidním lupus erythematosus a smíšeným onemocněním pojivých tkání. Vzhledem k řadě moţností fluorescenčních mikroskopů se doporučuje, aby byly zdroje světla, filtry a optika

10

standardizovány při porovnávání titrů pacientů mezi laboratořemi. Pacienti, kteří podstupují steroidní léčbu, mohou vykazovat negativní výsledky na nDNA protilátky. [13] Očekávaná hodnota v běţné populaci je negativní při zředění 1:10 v rámci screeningu. Některé léky, například hydralazin, mohou indukovat produkci nDNA protilátek. [13]

Využití metody

1.1.2.3.

Tato metoda se vyuţívá ke stanovení autoprotilátek, k diagnostice autoimunitního onemocnění, dále pak v cytologii, histologii a patologii pro detekci různých patologických struktur v tkáních nebo buňkách odebraných pacientovi. [10]

1.1.3. Blotovací techniky Princip metod vychází z kombinace klasických metod a to z elektroforézy a vizualizační metody (EIA, autoradiograficky, fluorescenčně apod.) s mezistupněm, který nazýváme blotting, česky otisk. V běţné laboratorní praxi přípravu materiálu zajistí výrobce elektroforézou nebo izoelektrickou fokusací antigenu včetně otisku na pevný nosič. Laboratoř pak tedy pracuje s hotovým nosičem antigenu inkubací s vyšetřovaným materiálem a vizualizační metodou. [10]

Princip metody

1.1.3.1.

1.1.3.1.1.

Western Blot

Při imunoblottingu pracujeme s antigenem, který je dobře definovaný, a reakční místa jsou příznivě uspořádána.

Ve většině případů se jedná o DNA, RNA, proteiny a

glykoproteiny.

je

Základem

polyakrylamidového

gelu.

rozdělení

Elektroforézou

antigenu

pomocí

antigenu

docílíme

agarozového

nebo

k rozdělení

podle

elektroforetické pohyblivosti, která je závislá na molekulové váze. Nadále otiskem na nitrocelulózovou membránu se uskuteční přenos, pomocí běţné difuze nebo jednosměrného proudu (electroblotting), rozdělného antigenu do pevné fáze. Zde jsou frakce fixovány.[10] Silně vyčištěná nativní antigeny nebo uměle připravené rekombinační antigeny v tekuté fázi vyuţívá dotblotting. Otisk na membránu dochází v tomto případě pomocí

11

filtrace. Při těchto metodách je moţné umístit pomocí filtrace protilátky na membrány a stanovat antigeny. [10]

1.1.3.1.2.

IMTEC-ANA-LIA Maxx

Linkový Imunologický Test (LIA) se pouţívá pro detekci antinukleárních protilátek jako dsDNA, nukelosomy, histony, SmD1, PCNA, P0, SS-A/Ro60kD, SS-A/Ro52kD, ssB/La, CENP-B, Sci70, U1-snRNP, AMAM2, Jo1, PM-Sci, Mi-2 a Ku. Jedná se o nepřímý membránový enzymatický imunologický test pro kvalitní stanovení Ig protilátek proti výše uvedeným v lidském séru či plazmě. [14] Test je zaloţen na principu linkového imunologického testu (LIA). Nukleární a asociované cytosolické antigeny jsou aplikované jako linky na nitrocelulózní membráně, viz Tabulka. V průběhu inkubace prouţků s naředěnými vzorky od pacientů se protilátky obsaţené ve vzorcích naváţí na koutované antigeny. Pro detekci navázaných protilátek se pouţívá konjugát anti-IgG konjugované anti-lidské IgG protilátky a křenová peroxidáza (HRP). Po přidání substrátu a ukončovacího roztoku se přítomnost protilátek proti příslušným antigenům prokáţe viditelnou hnědou linkou. [14]

12

antigeny

Identita

dsDNA

Nativní

nukleosomy

Nativní

histony

Nativní

SmD1

Peptidická

PCNA

Rekombinační

P0

Rekombinační

SS-A/Ro60kD

Nativní

SS-A/Ro52kD

Rekombinační

SS-B/La

Rekombinační

CENP-B

Rekombinační

Sci70

Rekombinační

U1-snRNP

Rekombinační

AMAM2

Nativní

Jo1

Rekombinační

PM-Sci

Rekombinační

Mi-2

Rekombinační

Ku

Rekombinační

Tabulka 1.1.3.1.2-1.: Aplikace antigenů jako linek na nitrocelulózní membráně [14]

1.1.3.2.

Využití metody

Pomocí blotovacích metod můţeme v jednom vzorku stanovit najednou několik protilátek proti určitým antigenům. Podle pouţitých antigenů je moţné zvýšit specifičnost testů. Bloty se vyuţívají především pro stanovení protilátek proti extrahovatelným nukleárním antigenům a proti různým antigenům borrelií, helicobactera a dalších infekčních činitelů.[10] IMTEC-ANA-LIA Maxx poskytuje srovnávací diagnostiku při pouţití sedmnácti různých autoprotilátek. Specifické skupiny jsou srovnány na kaţdém testovacím prouţku podle jejich relevance k daným onemocněním (SLE, Sjögren-Syndrom, CREST-syndrom, Sclerodemie, MCTD, PBC a Myositidy). To umoţňuje dodatečný přehled o autoimunitních onemocněních a identifikaci overlap syndromů. [14]

13

Antinukleární protilátky (ANA) jsou autoprotilátky s různou specifitou namířenou proti antigenům buněčného jádra. Detekce ANA a ENA (extrahovatelná nukleární antigeny) protilátek je důleţitá pro diagnózu kolagenózy speciálně pak pro Systémový lupus erytematodes (SLE) a Smíšené onemocnění pojiva (MCTD), které je s ním často spojeno a pro jiná revmatická onemocní. [14] Antimitochondriální protilátky (AMA) pro M2-antigeny jsou specifické pro PBC (primární biliární cirhózu) a mohou být detekovány v 90% PBC pacientů. Anti-AMA M2 protilátky se také často projevují v kolagenóze ještě před klinickými symptomy. [14] Jo1, PM-SCi, Mi-2 a Ku jsou diagnostické ukazatele poly a dermatomyositidy, s myositidou asociovaných autoimunitních onemocnění a overlap syndromů. [14]

1.2. Metody molekulární biologie Metody molekulární biologie mají uplatnění také v klinické imunologii například k detekci mikroorganizmů, mykobakterií a mutací, které mohou být příčinou poruch imunitního systému.

1.2.1. Sekvenování DNA Cílem této metody je stanovení primární struktury nukleotidů v molekulách DNA. Tato metoda se uplatňuje v analýze genomů a umoţňuje lépe porozumět molekulární podstatě základních biologických procesů. Znalost sekvence DNA se pouţívá k odvození aminokyselinové sekvence kódovaných proteinů, o regulaci jejich tvorby a umoţňuje také stanovit charakter mutací, které se projevují vznikem genetických chorob. Na sekvenci DNA je závislá metoda PCR. [12]

1.2.1.1.

Princip metody

K sekvenování DNA se pouţívají dvě metody. První metoda se nazývá MaxamovovoGilbertovo sekvencování a jedná se o chemickou metodu. Pomocí chemických sloučenin dochází ke specifické degradaci řetězců nukleových kyselin.[12] V současnosti je nejvíce pouţívanou metodou pro vyhledávání mutací metoda Sangerova. Je zaloţena na náhodném ukončování syntézy nového řetězce podle dodaného templátu v přítomnosti dideoxynukleozidtrifosfátů. Sekvenační reakce se provádí ve čtyřech 14

zkumavkách, kde je polymerizační enzym, směs všech deoxynukleozidrifosfátů s jedním dideoxynukleozidtrifosfátem.[11] U obou metod se jako vstupní materiál nejčastěji pouţívají restrikční fragmenty, naklonované ve vhodném honovacím vektoru, nebo fragmenty získané PCR. Jedná se tedy o molekulu DNA s vhodně definovanými konci. [12] Nejprve se tedy definuje jeden z konců fragmentů DNA, u něhoţ sekvenci stanovujeme. Následuje vytvoření souboru jednořetězcových molekul DNA, jejichţ vzájemná velikost se liší o jednu bázi. Dále tento soubor fragmentů rozdělíme elektroforézou s takovou rozlišovací schopností, která umoţňuje navzájem oddělit řetězce DNA lišící se svou délkou o jedinou bázi. V poslední fázi sekvencování vyhodnocujeme získané sekvence. Tuto analýzu provádíme pomocí počítačů a speciálních programů. [12]

1.2.2. PCR Principem polymerázová řetězová reakce je enzymatická amplifikace DNA in vitro syntézou mnoha kopií vybrané sekvence DNA v cyklické reakci o třech teplotních fázích.[12]

1.2.2.1.

Princip metody

PCR je zaloţena na denaturaci dvouvláknové DNA za vysoké teploty a denaturaci po sníţení teploty šacování si komplementarity bází. Tuto metodu můţeme aplikovat, kdyţ známe nukleotidové sekvence na koncích určité oblasti DNA. Podmínkou je příprava oligonukleotidových (primerů) sond, které specifický hybridizují na obou koncích cílového úseku DNA a slouţí jako základ pro tvorbu nových vláken.[10] PCR začne při teplotě 94°C, kdy se vzorek DNA denaturuje na dva jednoduché řetězce. Dále se vzorek ochladí na 35-65°C čímţ dojde k nasednutí primerů na komplementární 3´konce cílové DNA. Syntéza nových vláken je katalyzována termostabilní DNA polymerázou (Taq polymeráza) při teplotě 65-75°C. Po dokončení syntézy obou vláken se opět vzorek zahřeje na teplotu

95 ̊C a dojde opět k denaturaci a celý proces se opakuje.

Tyto reakce se provádějí v zařízení, které nazýváme termocykler. [12] Po skončení těchto tří kroků kaţdého cyklu, který se můţe opakovat několik desítek, se počet řetězců zdvojnásobí. Účelem PCR reakce je připravit dostatek amplifikátu, aby mohl být dále analyzován. Amplifikace je laboratorní obdobou replikace, a aby mohla být syntéza 15

nových řetězců DNA zahájena, jsou zapotřebí vysoce specifické primery, které zajistí aktivní reakci. [11] Způsobů aplikace PCR je velké mnoţství. Různé firmy dodávají produkty pro PCR, a to jak přístroje, tak spotřební materiál včetně polymeráz. [11]

1.2.2.1.1.

Využití metody

Tyto metody jsou základními a diagnostickými metodami v biomedicíně. Imunologický lékařský výzkum a klinická imunologie vyuţívá tyto metody pro detekci infekčních mikroorganizmů jako HIV, HBV a HCV, mykobakterií, pro detekci genetických mutací, které jsou příčinou poruch imunitního systému.[10]

2. Využívaná laboratorní technika

2.1. ELISA Reader Mikrodestičkové

readry

Molecular

Devices

představují

nový

standard

ve

spektrofotometrii pro farmaceutický průmysl, biotechnologické společnosti, výzkumné ústavy, klinické laboratoře a nemocniční zařízení. Aplikace pro řadu MAXline zahrnují detekci a analýzu biochemických reakcí v imunotestech jako např. ELISA, měření enzymatické aktivity, detekce bakteriálního růstu a testy na endotoxin. [1] Umoţňuje přesné a správné detekce při vlnové délky viditelného spektra bez pouţití filtrů, poskytují tedy bez testu flexibility. [1] Reader umoţňuje výběr aţ dvou vlnových délek současně pro detekci absorbance ve viditelném rozsahu vlnových délek (340 nm - 850 nm). Malé šířky pásma poskytuje větší přesnost a lepší maximální rozlišení. Patentovaná vícekanálové optická konstrukce napodobuje dual-beam spektrofotometr. Osmi-kanálový systém poskytuje vysokou přesnost a rychlost při čtení a 96-mikrodestičky pro jeden koncový bod měření a stanovení kinetických dat získaných v průběhu času. [1]

16

Obrázek 2.1-1: ELISA Reader [1]

2.2. WELLWASH, promývačka mikrodestiček ThermoLabsystems

Promývačka 96 jamkových mikrodestiček Wellwash od firmy ThermoLabsystem je určena pro výzkum i rutinu. Má nepatrný zbytkový objem (< 1,5 µl na jamku). Lze připojit 1 x promývací a 1 x odpadní láhev. Hladiny v lahvích s promývacími roztoky jsou hlídány s audiovizuálním alarmem. [3] Hlavu promývačky s 8, 12, nebo 16 kanály lze velmi rychle a snadno vyměnit. Software umoţňuje programování jednotlivých promývacích sekvencí, včetně objemu tekutiny na jamku, volby pufru, druhu destičky nebo počtu stripů, výšku vstřikování a odsávání roztoku, typu třepání destičky, délky prodlev. Sekvence lze spojovat do kompletních promývacích programů. Promývačku lze připojit k PC přes USB. Přístroj umoţňuje uloţení programů, orbitální třepání, mycí objem 50-1000 µl po 50 µl, dávkovací objem 50-400 µl. Vstřikovací a promývací objem 5-100 ml po 5 ml. [3]

17

Obrázek 2.2-1: WELLWASH, promývačka mikrodestiček ThermoLabsystems [3]

2.3. Fluorescenční mikroskop

2.3.1. Fluorescence Zelené řasy se jeví v denním světle jako zelené, kdyţ bychom je však v temnici osvítili ultrafialovým světlem, zbarvily by se do červena. Je to proto, ţe chlorofyl v jejich buňkách pohlcuje ultrafialové světlo a vyzařuje světlo červené, které má delší vlnovou délku. Jevu, kdy látka vysílá do prostoru světlo, říkáme luminiscence. Můţe k ní docházet při chemické reakci - enzym luciferáza oxiduje luciferin u světlušky - a potom hovoříme o chemiluminiscenci. Pokud k luminiscenci dochází po ozáření, hovoříme o fluorescenci nebo fosforescenci. Záření, které luminiscenci vyvolává, se nazývá excitační, záření vysílané látkou se nazývá emisní. Zatímco u fluorescence trvá vyzařování emisního světla krátkou dobu a po zhasnutí excitačního záření téměř okamţitě emise zhasíná (asi za 100 pikosekund), u fosforescence můţe k emisi docházet i dlouhou dobu po zhasnutí excitačního záření. Látka schopná fluorescence se nazývá fluorochrom. Fyzikální podstata fluorescence a fosforescence spočívá ve vlastnostech elektronového obalu atomů v molekulách fluorochromu. Elektrony těchto látek jsou schopny absorbovat foton excitačního světla, čímţ se zvýší jejich energie. Část této nově nabyté energie však elektron po chvíli vyzáří jako foton s niţší energií a tedy delší vlnovou délkou. Protoţe došlo ke ztrátě energie, je vlnová délka emisního světla vţdy delší neţ vlnová délka světla excitačního (Stokeovo pravidlo). Jelikoţ vlnová délka udává barvu světla, pozorujeme u emitovaného světla posun k červené části spektra. [5] 18

Abychom mohli dobře pozorovat emisní záření, jehoţ intenzita je vţdy mnohem niţší neţ intenzita excitačního záření, pouţíváme dvojici filtrů. Excitační filtr propouští z barevného spektra pouze část potřebnou pro excitaci fluorescence a zabraňuje průchodu světla o stejné či podobné vlnové délce jako světlo emisní, které by vytvářelo pozadí. Bariérový filtr propouští pouze emisní část spektra a zabraňuje průchodu excitačnímu světlu. Excitační světlo se od emisního sice liší barvou, ale je mnohem intenzivnější, takţe by v něm emisní světlo nebylo lidským okem rozlišitelné. [5]

2.3.2. Konstrukce fluorescenčního mikroskopu Jako zdroj světla se u fluorescenčního mikroskopu pouţívá rtuťová výbojka. Podle konstrukce se fluorescenční mikroskopy dělí na dvě skupiny. [5]

2.3.2.1.

Transmisní fluorescenční mikroskop

U tohoto typu mikroskopu prochází světlo excitačním filtrem a na preparát přichází zespodu jako u klasického světelného mikroskopu. Pro osvětlení preparátu se však nepouţívá klasický kondenzor, ale kondenzor zástinový, který odráţí světlo tak, ţe dopadá na preparát světlo zboku. Procházející excitační světlo tak letí mimo objektiv a do objektivu se dostane emitovaná fluorescence. [5]

Obrázek 2.3.2.1-1: Transmisní fluorescenční mikroskop [5]

19

2.3.2.2.

Epifluorescenční mikroskop

U tohoto typu mikroskopu prochází excitační světlo objektivem, dopadá na preparát svrchu a emisní světlo se vrací zpět do objektivu. Schéma tohoto typu mikroskopu je na obrázku 6. Je zřejmé, ţe u tohoto mikroskopu je potřeba pouţít zvláštní typ zrcadla, které odráţí excitační světlo do objektivu a propouští emisní světlo do okuláru. Z počátku se pouţívalo polopropustné zrcadlo (obr. 7nahoře), které polovinu světla propouští a polovinu odráţí, bez ohledu na to, o jaké světlo jde. Pochopitelně, ţe u tohoto zrcadla docházelo k velkým ztrátám světla, a proto se začalo pouţívat tzv. dichroické zrcadlo (obr. 7 dole). To propouští a odráţí světlo podle toho, jakou má vlnovou délku. Pouţívá se tedy vţdy takový typ zrcadla, který maximum excitačního světla odráţí a maximum emisního světa propouští. Vhodná kombinace dichroického zrcadla, excitačního a emisního filtru pro pouţitý druh fluorochromu se do epifluorescenčního mikroskopu se vkládá pohromadě jako tzv. kostka, jejíţ dvě stěny jsou tvořeny filtry a úhlopříčka dichroickým zrcadlem. Kostky jsou umístěny na výměníku a je moţné je vyměňovat podle potřeby. Epifluorescenční typ mikroskopu je v současnosti více oblíbený neţ transmisní typ. [5]

Obrázek 2.3.2.2-1:Epifluorescenční mikroskop [5]

2.3.3. Některé používané flourochromy FITC (fluorescein isothiokyanát) má maximum emise mezi 500-600 nm. Široce pouţíván při imunofluorescenci. Dále se pouţívá hoechst (bisbenzimid), který barví DNA, DAPI, který se váţe na DNA a RNA (barví se modře), ethidium bromid, který se váţe na 20

dvouřetězcovou DNA a RNA (svítí oranţově), propidium jodid, který barví DNA (červeně), akridinová oranţ, která se váţe na DNA (barví se zeleně) a RNA (barví se tmavě červeně), a také CongoRed, která se váţe na amyloid (barví se růţově).[5]

2.3.4. Blot analyzátor - ProfiBlot 48 Blot analyzátor pro zpracování, jako jsou časově náročné mytí a inkubační postupy. Pro optimální výkon zpracovává aţ 48 vzorků na běh a podporuje celou řadu Western Blot aplikací, například pro potvrzení infekčních chorob a autoimunitních onemocnění, stejně jako pro screening alergií. ProfiBlot 48 je určen pro zvýšení bezpečnosti a spolehlivosti v laboratoři a splnit IVD směrnice 98/79/ES, pro Evropu. Zpracovává celý test na jedno pouţití zásobníku v uzavřeném prostředí, aby se minimalizovalo vystavení člověka potenciálně infekční vzorky. [2] Produkt Mezi hlavní výhody patří [2]: -

Automatizované zpracování aţ 48 vzorků za běhu

-

Rychlé mytí 3 testu pásů současně s vysokou propustností

-

Ovládané časování i pro krátké inkubační kroky

-

Palubní Provoz a BlotWare ™ pro snadné programování

-

Barevně označené činidlo systému aţ pro 7 tekutin

-

Reagent úsporu minimalizuje mrtvé objemy a provozní náklady

-

Auto-kalibrace objemů dávkování eliminuje zdlouhavé ruční postup

-

Odděleného sběru toxických a biologicky nebezpečným odpadem minimalizuje náklady na zpracování odpadu

-

Předdefinované čištění protokolů pro snadnou údrţbu

Obrázek 2.3.4-1: Blot analyzátor - ProfiBlot 48 [2]

21

2.4. PCR Termocykler Termocykler je přístroj, umoţňují programované změny teplot v mikrozkumavkách, obsahujících reakční směs pro PCR. Mikrozkumavky jsou umístěny v jamkách v kovovém bloku ze speciální slitiny, která velmi dobře vede teplo (viz otvory v otevřené šachtě nahoře vlevo). Teplota tohoto bloku je měněna pomocí tzv. Peltierových článků, které jsou řízeny mikroprocesorem. Jednoduché programovací rozhraní umoţňuje pomocí tlačítek a displeje nastavit délku trvání určité teploty, střídání těchto teplot a cyklické opakování určitého sledu teplot. Blok se vzorky je před spuštěním nastaveného programu shora překryt víkem, které můţe být vyhřívané na teplotu 104 °C. Tím se zabrání kondenzaci par na víčku mikrozkumavky - kdyţ je reakční směs ve zkumavce zahřívána na 94 °C při denaturaci DNA, odpařuje se ze směsi voda, kdyby mělo víčko stejnou nebo niţší teploty, páry by na něm kondenzovaly a docházelo by k neţádoucímu zahušťování reakční směsi. Pokud termocykler nemá vyhřívané víku, je nutné reakční směs v mikrozkumavce převrstvit minerálním olejem, který zabrání odpařování. [4]

Obrázek 2.4-1: PCR Termocykler [4]

22

3. Experimentální část

3.1. ELISA Imunometrická enzymová zkouška pro kvantitativní stanovení IgG autoprotilátek na MCV (meancorpuscularvolume - střední objem erytrocytů).

3.1.1. Reagencie, vzorky a jejich příprava Sada obsahuje kombinované kalibrační roztoky s protilátkami třídy IgG na MCV, kontrolní roztoky Anti-MCV v sérové matrici, pozitivní a negativní, vzorkový pufr, enzymový konjugovaný roztok, substrátový roztok TMB, ukončovací roztok a promývací roztok. Vzorkový pufr obsahuje v kaţdé ampuli koncentrovaný vzorkový pufr (5x), který naředíme destilovanou nebo deionizovanou vodou na konečný objem 100 ml před pouţitím. Promývací roztok obsahuje v kaţdé ampuli koncentrovaný promývací pufr (50x), který naředíme destilovanou nebo deionizovanou vodou na konečný objem 1 000 ml před pouţitím. Jako vzorek pro tuto metodu se pouţívá pacientské sérum. Testovací sérum musí být čisté a bez rozpuštěných krvinek (hemolýza). Kontaminaci hemolýzou nebo lipemií je nejlépe se vyhnout, avšak neohrozí tento rozbor. Před rozborem naředíme všechny vzorky pacientů vzorkovým pufrem v poměru 1:100. Do 10 µl vzorku v polystyrenové zkumavce tedy přidáme 990 µl vzorkového pufru. Dobře promícháme. Kontrolní vzorky jsou připraveny k pouţití a není třeba je ředit.

3.1.2. Pracovní postup Připravili jsme si dostatečný počet mikrotitračních destiček pro příslušný počet kontrolních vzorků a vzorků odebraných pacientů. Do kaţdé jamky jsme napipetovali po 100 µl kalibračních roztoků, kontrolních roztoků a ředěných vzorků pacientů jsme pipetovali v dubletu. Vzorky jsme inkubovali po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Dále jsme odstranili obsah mikrojamek a promyli je třikrát pomocí 300 µl promývacího roztoku v promývačce jamkových mikrodestiček Wellwash. Po té jsme do kaţdé jamky přidali 100 µl enzymového konjugátu a inkubovali po dobu 15 minut při pokojové teplotě. Odstranili jsme 23

obsah mikrojamek a opět je promyli třikrát pomocí 300 µl promývacího roztoku v promývačce jamkových mikrodestiček Wellwash. Do kaţdé jamky jsme přidali 100 µl roztoku TMB substrátu a inkubovali po dobu 15 minut při pokojové teplotě. Do kaţdé jamky jsme přidali 100 µl ukončovacího roztoku a inkubovali po dobu 5 minut při pokojové teplotě.

3.1.3. Interpretace výsledků Vzorky jsme uloţili do ELISA Readeru, který výsledky odečítá pomocí optické hustoty při vlnové délce 450 nm a vypočteme výsledky. Doporučuje se bichromatické měření s referenční hodnotou 600 – 690 nm. Vzniklá barva je stabilní minimálně po dobu 30 minut. Během této doby odečteme optické hustoty. Tento test je platný, pouze pokud optická hustota při vlnové délce 450nm pro pozitivní kontrolní vzorek a negativní kontrolní vzorek i pro kalibrační roztoky A a F odpovídá příslušným rozsahům hodnot uvedených na Osvědčení kontroly jakosti přiloţeném v kaţdé sadě. Pokud kterékoliv z těchto kritérií není splněno, jsou výsledky neplatné a test je nutné opakovat. Pro tento rozbor se pouţívá postup pro čtyři parametry s lin-log souřadnicemi optické hustoty. Metoda aproximace kubickou interpolací a souřadnice log-log je rovněţ vhodná. Nejprve vypočteme průměrné optické hustoty pro kaţdou kalibrační jamku. Pouţijeme papír pro vynášení lin-log grafů a naneseme průměrnou optickou hustotu oproti koncentraci. Vyneseme nejlépe vyhovující přibliţnou křivku spojující všechny kalibrační body. Kalibrační body lze rovněţ spojit úsečkami. Koncentrace neznámých lze pak odhadnout interpolací kalibrační křivky. Interpretace výsledků: Anti-MCV IgG (U/ml) Normální:

< 20

Pozitivní:

≥ 20

24

Pozitivní výsledek je nutné ověřit vzhledem k celkovému klinickému stavu pacienta. Rovněţ je nutné přijímat jakákoli léčebná rozhodnutí individuálně.

Obrázek 3.1.3-1: ELISA Test[7]

3.2. Fluorescenční nDNA test

3.2.1. Reagencie, vzorky a jejich příprava Sada obsahuje pozitivní kontrolu, titrovatelné kontrolní sérum, negativní kontrolní sérum, fluorescenční činidlo, PBS pufr – prášek a semi-permanentní montovací médium. Roztok pufru (PBS)obsahuje v jednom balení PBS pufr do 1 litru deionizované nebo destilované vody. Ředění titrované kontroly: Zacházíme s touto kontrolou jako s neředěným vzorkem pacienta. Naředíme kontrolu 1:10 přidáním 0,1 ml kontrolního séra k 0,9 ml rozpuštěného pufru (PSB). Vytvoříme dvojí sériové ředění titrovatelné kontroly. Přednostně se pouţívají vzorky séra. Provede se centrifugace séra od sraţeniny, aby se minimalizovala hemolýza. Nepouţívají se hemolyzované, ikterické, lipemické nebo bakteriemi kontaminované vzorky, protoţe tyto podmínky by mohly přinést nesprávné výsledky.

25

Naředění vzorků pacientů: Screening: Vzorky pacientů se ředí 1: 10 tak, ţe přidáme 0,1 ml (100 µl) séra k 0,9 ml naředěného PBS. Semikvantitativní

vytitrování:

Abychom

dosáhli

dvojího

sériového

ředění

screeningových vzorků (např. 1:20, 1:40, 1:80 … 1:640), odebereme 0,5 ml z roztoku naředěného 1:10 a smícháme s 0,5 ml PBS, aby se dosáhlo ředění 1:20. Pokračujeme v sériovém ředění tímto způsobem.

3.2.2. Pracovní postup Připravili jsme skla se substrátem (20 – 25 µl / jamku). Skla jsme vyjmuli z obalu a kontrolní séra umístili do kontrolních jamek. Do očíslovaných jamek přidáme 1 kapku (20 – 25 µl) vzorku pacientů. (Přímý kontakt špičky kapací lahvičky s povrchem skla můţe vézt k poškození antigenního substrátu.)Skla jsme umístili do uzavřené vlhké komůrky (Petřino miska s navlhčenou buničitou vatou) a inkubovali uzavřené 30 minut při pokojové teplotě. Skla jsme vyjmuli z inkubačního rámečku a krátce opláchli PBS pomocí střičky. Abychom zabránili zkříţené kontaminaci na sklech s 13 jamkami, směřovali jsme proud PBS podél středu skla, naklonili jsme nejdříve směrem k jamkám 1 – 5 a poté k jamkám 6 – 10. Dále jsme skla promývali 10 minut pomocí PBS v nádobě pro barvení skel. Vyjmuli jsme vţdy jedno sklo z PBS a 3 – 5 krát ponořili do destilované vody. Okraj skla jsme přiloţili k savému papíru, abychom odstranili přebytečnou tekutinu. Sklo jsme vrátili do inkubační komůrky a jamky zcela překryli reagencií s fluorescenční protilátkou. Tento postup jsme opakovali u všech skel. Je důleţité, aby jamky skel během uvedeného postupu nevyschly. Tím by mohlo dojít k poškození substrátu. Skla jsme opět inkubovali v inkubační komůrce 30 minut při pokojové teplotě. Skla jsme vyjmuli z inkubačního rámečku a krátce opláchli pomocí PBS. Dále jsme skla promývali 10 minut pomocí PBS v nádobě pro barvení skel. Vyjmuli jsme vţdy jedno sklo z PBS a 3 – 5 krát ponořili do destilované vody. Okraj skla jsme přiloţili k savému papíru, abychom odstranili přebytečnou tekutinu. Přidali jsme 4 – 5 kapek semipermanentního montovacího média podél střední čáry preparátu. Opatrně jsme přiloţili krycí sklo.

26

3.2.3. Interpretace výsledků Správná interpretace výsledků závisí na jasném rozpoznání různých morfologických prvků organismu Crithidialuciliae ve fluorescenčním mikroskopu. Vnější povrch většiny protozoí pokrývá pelikula tvořená lipoproteiny. Pod pelikulou se nachází plazmatická membrána. Plazmatická membrána chrání cytoplazmu tvořenou vnější ektoplazmou, obsahující bazální tělísko a bičík, endoplazmou, vnitřní cytoplazmou obsahující jádro, kinetoplat a další organely. Pelikula, plazmatická membrána, bazální tělísko a bičík se obecně povaţují za pevné součásti organismu s velmi malou variabilitou mezi buňkami. Přestoţe se kinetoplast obvykle nachází blíţe bazálního tělíska neţ jádra, přesné umístění této organely se můţe u jednotlivých buněk lišit v důsledku kapalné formy endoplazmy. Abychom jasně rozlišili kinetoplast od jádra, podíváme se na jamku s pozitivní kontrolou. Kinetoplast se bude vţdy nacházet blíţe bičíku. Jamka s negativní kontrolou nebude vykazovat ţádné zbarvení kinetoplastu, zatímco pozitivní kontrola bude vykazovat zbarvení kinetoplastu. Negativní: Sérum se povaţuje za negativní na přítomnost nDNA protilátek, pokud je fluorescence kinetoplastu niţší nebo rovna jamce s negativní kontrolou. Zbarvení jádra bez současného zbarvení kinetoplastu se rovněţ povaţuje za negativní na nDNA protilátky. Pozitivní: Sérum se povaţuje za pozitivní, pokud kinetoplast vykazuje jasně rozeznatelné zbarvení s fluorescencí vyšší neţ u jamky s negativní kontrolou.

27

Obrázek 3.2.3-1: Pozitivní imunolfuorescenční test [6]

Obrázek 3.2.3-2: Negativní imunofluorescenční test [6]

3.3. Blotovací techniky

3.3.1. Western Blot Tato blotovací technika není akreditovanou metodou. Její vyuţití je spíše doplňkové a při diagnostice onemocnění se její výsledky ověřují metodami jinými. 28

3.3.1.1.

Příprava gelů, pufrů a dalších roztoků k elektroforéze

Nejprve jsme si připravili gely, pufry a další roztoky o následujícím sloţení: 

Separační pufr: 50 ml H2O 0,2 g SDS 9g TRIS 100ml 1N HCl (pH=8,8)



Zaostřovací pufr: 50 ml H2O 0,2 g SDS 3 g TRIS 100 ml 1N HCl (pH=6,8)



Elektroforézový pufr: 1 g SDS 6 g TRIS 28,8 g glycin 1000 ml H20



Pufr na blot: 72,5 g glycin 15g TRIS 1000 ml metanol 4000 ml H2O



5% GEL: 2,5 ml akrylamid (14,2 g akrylamid, 0,8 bezakrylamid, 50 ml H2O) 3,75 ml separační pufr 80 μlTemed 80 μlPersíran 8,75 ml H2O



15% GEL: 7,5 ml akrylamid (14,2 g akrylamid, 0,8 bezakrylamid, 50 ml H2O) 3,75 ml separační pufr 30 μl Temed 29

70 μl Persíran 1 ml glycerol 2,75 ml H2O 

2 hřebínkové GELY: 3,5 ml akrylamid (14,2 g akrylamid, 0,8 bezakrylamid, 50 ml H2O) 5,25 ml zaostřovací pufr 175 μl Temed 175 μl Persíran 12,25 ml H2O



PBS (pH=7,2-7,4): 80 g NaCl 2 g KH2PO4 29g Na2HPO4 · 12 H2O H2O



5% mléko v PBS: 15 g mléka 300 ml PBS



2,5% mléko v PBS: 12,5 g mléka 500 ml PBS



Amidočerň: 0,1 g amidočerň 10B 7 ml kyselina octová 100 ml H2O

3.3.1.2.

Elektroforéza

Prvním krokem western-blotu je elektroforéza. Nejprve jsme si sestavili desky, které je před tím nutné omýt vodou a následně otřít metanolem. Prostor mezi deskami jsme po tom pomocí pumpy hadičkou naplnili námi připravenými 5% a 15% gely 4 cm od horních okrajů desek. Gely se tak rozlévají gradientově, od nejhustšího po nejřidší. Zbytek jsme doplnili vodou. Gely mezi deskami jsme nechali 4 hodiny tuhnout při pokojové teplotě.

30

Po 4 hodinách jsme slili vodu a nastrčili hřebeny. Potom jsme pomocí stříkačky mezi desky nalili hřebenový gel. Po 30 minutách, po té co gel polymeroval, jsme odejmuli hřebeny a prostor mezi deskami opláchli vodou. Do elektroforetické vany jsme nalili elektroforetický pufr a skla s gely jsme nasadili na pryţové nálevky a horní vanu. Do horní vany jsme nalili elektroforetický pufr, aby byl elektrický přívod ponořený. Poté jsme do gelu nanášeli vzorky, markery (20 μl) a extrakty (250 - 300μl). Poté jsme nasadili přívod elektrického proudu. Elektroforéza probíhala 15 hodin.

3.3.1.3.

Blotování

Z desky s gelem jsme odstranili zadní sklo a odstranili jsme horní gel (hřeben) a na zbytek gelu jsme poloţili namočenou nitrocelulózu o rozměru 10 x 14 cm a uhladili jsme ji. Na nitrocelulózu jsme následně poloţili namočený filtrační papír o rozměrech 15 x 20 cm a opět vyhladili. Dále jsme si připravili desku s ţíněnkami a doprostřed poloţili gel s nitrocelulózou, sklem nahoru. Sklo jsme po té odstranili a na gel jsme umístili druhý navlhčený filtrační papír. Přiloţili jsme druhou namočenou ţíněnku s deskou a desky dohromady zacvakly. Desky jsme umístili do blotovací vany s vychlazeným blotovacím pufrem. Zdroj napětí jsme nastavili na 100V, tak aby maximální proud byl 1 A. Antigeny tak přecházejí ve směru od – k +, to znamená z gelu na nitrocelulózu. Doba blotu byla 1,5 hodiny. Poté jsme vyjmuli nitrocelulózu, oddělili markery a dali je obarvit amidočerní na 10 minut při pokojové teplotě. Následně jsme markery odbarvili 2% kyselinou octovou a nechali usušit v alobalu ve tmě. Hlavní část nitrocelulózy jsme umístili do Petriho misky společně s 5% mlékem v PBS a nechali jsme tak 4 hodiny v pokojové teplotě. Po té jsme nitrocelulózu opláchli a usušili na alobalu v lednici. Nitrocelulózu poté uchováváme v hedvábném papíru.

3.3.1.4.

Western Blot

Nejprve jsme si připravili následující reagencie: 



PBS: 50 ml koncentrovaného PBS 1 000 ml H20 Inkubační roztok: 31

12,5 g mléka 500 ml PBS 

Konjugát: 5 μl Sigma Rabbit Anti-humanIg G 1 ml 2,5% mléka v PBS



Chloronaftol: 0,15g chloronaftol 50 ml metanol



TRIS (pH=6,8): 0,242 g TRIS 200 ml H2O



Barvící roztok: chloronaftol a TRIS v poměru 1:4 2μl H202

Nastříhali jsme prouţky nitrocelulózy jaderného extraktu JA a RA33. Do jamek jsme pomocí pipety umístili 1ml naředěných sér. Vzorky jsme ředili tak ţe 20 μl vzorku jsme přidali 1 ml 2,5% mléka v PBS. Na kývačce jsem při pokojové teplotě 1,5, aţ 2 hodiny inkubovali jamky s prouţky nitrocelulózy s naředěnými séry. Po uplynutí této doby jsme odstranili obsah jamek a promyli třikrát po 5 minutách 2,5% mlékem v PBS. Do jamek jsme pomocí pipety umístili konjugát a opět inkubovali při pokojové teplotě. Po uplynutí jedné hodiny jsme obsah jamek opět odstranili a promyli třikrát po dobu 5 minut PBS. Do jamek jsme pipetou umístili 1 ml barvícího roztoku a opět inkubovali na kývačce při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Po obarvení jsme stripy opláchli destilovanou H20 a usušili jsme je na filtračním papíře. Výsledky se interpretují a odečítají dle zhotovených kontrolních vzorků. Western Blot je imunologická metoda, která není akreditovaná. Pouţívá se proto pouze jako doplňková metoda k diagnostice imunitních nemocí. Výsledky získané touto metodou nejsou spolehlivé, proto se pro ověření jejich správnosti pouţívají metody další.

32

3.3.2. IMTEC-ANA-LIA Maxx K provedení této metody jsme pouţili kompletní soupravu IMTEC-ANA-LIA Maxx (katalogové číslo ITC92005), která obsahuje 24 testů.

3.3.3. Reagencie, vzorky a jejich příprava Souprava obsahuje sušené odtučněné mléko, promývací pufr, konjugát anti-IgG, roztok TMB, ukončovací roztok a promývací roztok - 1 díl promývacího pufru + 19 dílů destilované vody. Incubation Buffer Solution: 30 ml promývacího roztoku do jedné lahvičky se sušeným mlékem. Jako

vzorky

se

pouţívají

pacientské

sérum

nebo

plazma

s EDTA

(ethylendiamintetraacetátdisodný) nebo citrátem sodným. Plazmu o objemu 10 μl jsme zředili s Incubation Buffer Solution.

3.3.4. Inkubace Na inkubační tácek jsme uloţili stripy a navlhčili je v 1ml Incubation Buffer Solution, čímţ jsme dosáhli navlhčení membrány. Po 1 minutě jsme roztok odstranili. Dále jsme pomocí pipety umístili k stripům 1 ml naředěného pacientského vzorku a inkubovali dalších 30 minut a po té jsme odstranili pacientské vzorky. Stripy jsme třikrát po dobu 5 minut promývali 1,5 ml promývacího roztoku za stálého třesení. Dále jsme pomocí pipety přidali 1 ml konjugátu ani-IgG a inkubovali 30 minut při pokojové teplotě, za jemného třesení. Po uplynutí 30 minut jsme konjugát odstranili. Opakovali jsme proces promývání a po té jsme přidali 1 ml roztoku TMB a inkubovali 10 minut při pokojové teplotě za jemného třesení. Roztok TMB jsme opět odstranili. Nyní jsme stripy promyli 1,5 ml destilované vody za jemného třesení po dobu jedné minuty a vodu jsme po té odstranili. Pipetovali jsme 1 ml ukončovacího roztoku a inkubovali 5 minut za jemného třesení. Enzymatická reakce tak ustala a vyvinutý stripy jsme osušili filtračním papírem. Tento postup inkubací jsme nechali zpracovat blot analyzátorem ProfiBlot 48 firmy Tecan.

33

3.3.5. Interpretace výsledků Na výsledkový list jsme pomocí lepícího listu připevnili stripy. Výsledek je pozitivní, pokud je pruh viditelný s významně vyšší intenzitou. Tento výsledkový list jsme uloţili do scanneru a načetli ho tak do počítače. Příslušný program nám výsledky vyhodnotil. Výsledky se zaznamenají a archivují.

Obrázek 3.3.5-1: Vyhodnocení blotovacího testu [9]

3.4. PCR Touto metodou jsme určovali pozitivitu či negativitu našeho RH faktoru z genetické informace. 3.4.1. Příprava vzorků Základem zkoumaných vzorků je PCR-mix. Připravili jsme dva typy PCR-mixu, PCRmix typu GLO a RH. PCR mix se přidává k DNA vzorku a zajišťuje tak amplifikaci DNA. Na jejich přípravu bylo potřeba 36 μl PCR roztoku, který obsahuje triadenin, tricitozin, triguanin, Mg+2 ionty, 44 μl vody a dva druhy primerů. Primery ohraničují úseky DNA z konce a ze začátku, podle toho je označujeme jako primery Forwards a Revers. Do roztoku na přípravu PCR typu GLO jsme následně přidali po 3,05 μl primeru GLO typu R a F. Obdobně tak do roztoku na přípravu PCR typu RH, kam se přidává po 3,05 primeru RH typu R a F. Na 34

odměření přesného mnoţství sloţek jsme pouţili mikropipety s výměnnými hroty. Hroty je nutné po kaţdém odpipetování nutné měnit, aby nedošlo k promíchání vzorků. Do dalších dvou zkumavek jsme umístili vzorek své genetické informace na krouţku o průměru 1,5mm, pouţívá se vzorek krve či slin, společně s 200 μl TE-pufru. Po pěti minutách převalování této směsi ve zkumavkách, jsme TE-pufr pomocí mikropipety odstranili a opět jsme do zkumavek se vzorky genetické informace přidali 200 μl TE-pufru a celý proces opakovali. TE pufr zajistí odstranění hemoglobinu. Do mikrozkumavek číslo 1- 6 jsme umístili vzorky v následném pořadí: 1) Vzorek RH+ 2) Vzorek RH3) Vzorek vlastní genetické informace + 10 μl H20 4) H2O 5) Vzorek vlastní genetické informace + 10 μl H2O 6) H2O Do zkumavek číslo 1 -4 jsme následně pomocí mikropipety odpipetovali 10 μl připraveného RH-mixu a do zkumavek číslo 5 a 6 jsme odpipetovali 10 μl připraveného GLO-mixu. Nakonec jsme do kaţdé mikrozkumavky odpipetovali 3,5 μl polymerázy, která vzorky zbarvila do fialova. Mikrozkumavky jsme uloţili do Termocykleru, kde proběhy následující tři kroky. Denaturace při 94 ̊C po dobu tří minut , kde proběhlo 40 cyklů. Ve druhém kroku probíhali po dobu jedné minuty při 50 ̊C aniling, kdy dochází k nasedání primerů a alongace po dobu jedné minuty při 72 ̊C, kdy probíhá syntéza . Třetím krokem je finální extenze po dobu deseti minut při 72 ̊ C. Mikrozkumavky jsme zavíčkovala a vzorky uloţili do mrazáku zmrazit.

3.4.2. Elektroforéza Dalším krokem je elektroforéza. Nejprve jsme připravili TBE pufr, jehoţ sloţkami je 540 g TRIS pufru, 275 kyseliny borité a 200 ml EDTA. Tento pufr se následně ředí, tak, ţe do 1l vody přidáme 50 ml tohoto pufru.

35

Dále jsme si připravili gel. 100 ml pufru jsme smíchali s 2,4 g agarózy, následně jsme tento roztok povařili v mikrovlnné troubě a přidali 10 μl GELRED. Asi po jedné hodině tato směs ztuhla a mohli jsme ji umístit do elektroforetické vany. Poté, co jsme do vany umístili gel, zalili jsme vanu po rysku TBE pufrem, který jsme si před tím připravili. Následně jsme do prvních dvou děr v obou řadách pomocí mikropipety umístila standart. Do zbylých děr jsme opět pomocí mikropipet umístili námi vytvoření PCR vzorky, které jsme mezi tím uchovali v mrazáku. Na elektroforetickou vanu jsme připojili napětí 150 V. Elektroforéza probíhá ve směru od – k +. Elektroforézu jsme prováděli asi 20min. Na gelu jsme poté mohli pozorovat oranţové a růţové prouţky.

3.4.3. Vyhodnocení vzorků Z elektroforetické vany jsme odebrali gel s našimi vzorky a vloţili ho do vizualizačního zařízení, kde jsme mohli pozorovat a tak vyhodnotit naše výsledky. Do jamek jsme odpipetovali vzorky, které obsahovali vzorek RH+ , RH- a vodu, podle nich jsme následně odečítali pozitivitu či negativitu RH našeho vzorku genetické informace.

Obrázek 3.4.3-1: Výsledky PCR testu [8]

36

4. Závěr V práci jsem se zabývala moderními metodami vyuţívaných v imunologických laboratořích. Mým úkolem bylo se seznámit teoreticky a prakticky s přístrojovou technikou a metodami pouţívanými v laboratoři při zpracování materiálu k detekci infekčních agens, protilátek, autoprotilátek, odchylek v genomu apod. Seznámila jsem se s metodami ELISA, nepřímá imunofluorescence, blotovací techniky, PCR a sekvenování a přístrojovou technikou, bez které tyto metody nelze praktikovat nebo vyhodnotit. Všechny zadané metody jsem prakticky zvládla a podílela jsem se na vyhodnocení výsledků. Seznámila jsem se s příslušnou laboratorní technikou a naučila jsem se s ní pracovat, aplikovat na zadané metody a vyhodnocovat výsledky vyšetření. Na základě poznatků, které jsem během práce v rámci Týmového projektu získala, budu nadále pokračovat v psaní bakalářské práce. Nadále budu zkoumat a porovnávat tyto imunologické metody vyuţívající přístrojovou laboratorní techniku, pomocí nichţ budu vyhodnocovat soubory pacientů. Zejména se zaměřím na metodu ELISA.

37

5. Seznam použitých zkratek AMAM2 – Antimitochondriádní protilátky (Antimitochondrial antibody) ANA – Antinukleární protilátky (antinuclear antibody) CENP-B - centromere associated protein CREST-syndrom – sklerodermie DAPI - 4'-6-diamidino-2-phenylindol DNA - deoxyribonukleová kyselina dsDNA – dvoušroubovice DNA (double-stranded DNA) EDTA - polyaminokarboxylová kyselina EIA – enzymoimunoanalýza ELISA – enzyme-liked immunosorbent assay ENA – extrahovatelné nukleární antigeny FITC – fluorescein isothiokyanát H2O – voda HBV - Hepatitis B HCl – kyselina chlorovodíková HCV - Hepatitis C HIV - virus lidské imunitní nedostatečnosti (human Immunodeficiency Virus) HRP – křenová peroxidáza (horseradish peroxidase) IgG - imunoglobulin G IVD - in vitro diagnostika KH2PO4 - dihydrogenfosforečnan draselný LE – lupus erythematosus 38

LIA – linkový imunologický test MCTD - smíšené onemocnění pojivové tkáně (Mixed Connective Tissue Disease) MCV – střední objem erytrocytů (mean corpuscular volume) NaCl – chlorid draselný nDNA - nuclear DNA PBC – primární biliární cirhóza PBS – fosfátový pufr (Phosphate Buffered Saline) PCNA - proliferating cell nuclear antigen PCR - Polymerázová řetězová reakce (Polymerase Chain Reaction) RH - Rhesus faktor RNA - Ribonukleová kyselina SDS - Dodecylsíran sodný SLE - Systemic Lupus Erythematosus TMB – tetrametylbenzidin TRIS - pentafluorofenyl

39

6. Seznam tabulek Tabulka 4.1.3.1.2-1.: Aplikace antigenů jako linek na nitrocelulózní membráně [14] ............ 13

40

7. Seznam obrázků Obrázek 5.1-1: ELISA Reader [1] ............................................................................................ 17 Obrázek 5.2-1: WELLWASH, promývačka mikrodestiček Thermo Labsystems [3] ............ 18 Obrázek 5.3.2.1-1: Transmisní fluorescenční mikroskop [5]................................................... 19 Obrázek 5.3.2.2-1:Epifluorescenční mikroskop [5] ................................................................. 20 Obrázek 5.3.4-1: Blot analyzátor - ProfiBlot 48 [2]................................................................. 21 Obrázek 5.4-1: PCR Termocykler [4] ...................................................................................... 22 Obrázek 6.1.3-1: ELISA Test [7] ............................................................................................. 25 Obrázek 6.2.3-1: Pozitivní imunolfuorescenční test [6]........................................................... 28 Obrázek 6.2.3-2: Negativní imunofluorescenční test [6] ......................................................... 28 Obrázek 6.3.5-1: Vyhodnocení blotovacího testu [9] .............................................................. 34 Obrázek 6.4.3-1: Výsledky PCR testu [8] ................................................................................ 36

41

8. Seznam použité literatury [1] moleculardevices.com[online]. 2011 [cit. 2011-21-12]. Absorbance. Dostupné z WWW: [2]

tecan.com[online].

2011

[cit.

2011-21-12].

Product.

Dostupné

z WWW:

[3] trigon-plus.cz[online]. 2011 [cit. 2011-20-12]. GoodsDetail. Dostupné z WWW:

[4] biologie.upol.cz[online]. 2011 [cit. 2011-11-12]. Termocykler. Dostupné z WWW:

[5] web.natur.cuni.cz[online]. 2011 [cit. 2011-11-12]. Mikroskopická technika. Dostupné z WWW:

[6] medweb4.bham.ac.uk[online]. 2011 [cit. 2011-10-12]. CIS image library. Dostupné z WWW: [7] google.cz[online]. 2011 [cit. 2011-10-12]. ELISA image. Dostupné z WWW:

42

[8]

mudphudder.com[online].

2011

[cit.

2011-10-12].

PCR.

Dostupné

z WWW:

[9] google.cz[online]. 2011 [cit. 2011-10-12]. Western blot. Dostupné z WWW: [10]

BARTŮŇKOVÁ, J; PAULÍK, M. Vyšetřovací metody v imunologii. Praha:

GradaPublishing, s.r.o., 2005. 176 s. [11]

BRDLIČKA, R. Lidský genom na rozhraní tisíciletí. Praha: GradaPublishing, s.r.o.,

2001. 250 s. [12]

ŠMARDA, J; DOŠKAŘ, J; PANTŮČEK, R; RŮŢIČKOVÁ, V; KOPTÍKOVÁ, J.

Metody molekulární biologie. Brno: Masarykova universita, s.r.o., 2005. 188 s. [13] biosystém-sa.com[online]. 2011 [cit. 2011-21-12]. Imunofluorescence. Dostupné z WWW:


sa.com/web/atom/autoinmunidad?maincat=REACTIVOS%20INMUNOFLUORESCENCIA &subcat=ANTICUERPOS%20ANTI%20n%20DNA> [14]

human.de[online].

2011

[cit.

2011-21-12].



43

LIA.

Dostupné

z WWW: