MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav biochemie
Enzymové stanovení methanolu Bakalářská práce
Michael Ambroz
VEDOUCÍ PRÁCE: prof. RNDr. Igor Kučera, DrSc.
Brno 2015
Bibliografický záznam Autor:
Michael Ambroz Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochemie
Název práce:
Enzymové stanovení methanolu
Studijní program:
Bakalářský
Studijní obor:
Aplikovaná biochemie
Vedoucí práce:
prof. RNDr. Igor Kučera, DrSc.
Akademický rok:
2014/2015
Počet stran:
51
Klíčová slova:
Methanol, pektin, toxikologie, alkoholoxidasa, formaldehyddehydrogenasa, FerB
Bibliographic Entry Author:
Michael Ambroz Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry
Title of Thesis:
Enzymatic determination of methanol
Degree programme:
Bachelor
Field of Study:
Applied Biochemistry
Supervisor:
prof. RNDr. Igor Kučera, DrSc.
Academic Year:
2014/2015
Number of Pages:
51
Keywords:
Methanol, pectin, toxicology, alcohol oxidase, formaldehyde dehydrogenase, FerB
Abstrakt Práce se zabývá methanolem, mechanismem jeho toxicity a způsobech stanovení. V teoretické části jsou popsány fyzikální a chemické vlastnosti methanolu, jeho výroba, výskyt v přírodě a povolený obsah v alkoholických nápojích podle evropské legislativy. Je zde pojednáno o pektinu, jako hlavním zdroji methanolu v alkoholických nápojích a jeho hydrolýze pomocí pektinmethylesterasy. Pozornost je věnována i toxikologii methanolu a terapii při intoxikaci a metodám stanovení methanolu, jak pomocí technik analytických, tak enzymatických. V experimentální části práce bylo potvrzeno, že přibližně až tisícinásobný molární nadbytek ethanolu, jako kompetitivní inhibitoru, způsobuje výraznou inhibici reakce methanolu s alkoholoxidasou a tudíž i snížení fluorescence. Popsaným způsobem lze tedy methanol snadno detegovat.
Abstract This thesis deals with methanol, mechanism of toxicity and methods of determination. The theoretical part describes the physical and chemical properties of methanol, its production, natural occurrence and content in alcoholic beverages by European law. It dealt with the pectin as the main source of methanol in alcoholic beverages and its hydrolysis using pectin methylesterase. Attention is also paid to the toxicology of methanol intoxication, therapy and methods used for determination of methanol, using both analytical and enzymatic techniques. In the experimental part it was confirmed that about a thousand times molar excess of ethanol as a competitive inhibitor causes considerable inhibition of the reaction of methanol with alcohol oxidase and decrease in fluorescence. The described method allows for easy detection of methanol.
Poděkování Na tomto místě bych rád poděkoval svému vedoucímu, panu prof. RNDr. Igoru Kučerovi, DrSc., za jeho odborné vedení a možnost zapojit se do probíhajícího výzkumu. Nemalé díky patří také Mgr. Nikole Ptáčkové za pomocnou ruku a cenné rady v průběhu zpracování.
Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracoval samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.
Brno 15. května 2015
…………………….. Michael Ambroz
Obsah: 1 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ..................................................................... 9 2 TEORETICKÁ ČÁST ...................................................................................... 11 2.1 ÚVOD ........................................................................................................ 11 2.2 METHANOL................................................................................................. 11 2.2.1 Fyzikální a chemické vlastnosti .......................................................... 12 2.2.2 Průmyslová výroba a její historie ....................................................... 12 2.2.3 Využití methanolu ............................................................................. 14 2.2.4 Výskyt methanolu.............................................................................. 15 2.2.5 Odstranění methanolu při destilaci ................................................... 16 2.2.6 Legislativa obsahu v alkoholických nápojích ...................................... 16 2.3 PEKTIN....................................................................................................... 18 2.3.1 Využití pektinů .................................................................................. 20 2.3.2 Struktura ........................................................................................... 20 2.3.2.1 Homogalakturonan ........................................................................................... 21 2.3.2.2 Rhamnogalakturonan I ..................................................................................... 21 2.3.2.3 Rhamnogalakturonan II .................................................................................... 22 2.3.3 Pektinmethylesterasa (PME) ............................................................. 23 2.4 TOXIKOLOGIE METHANOLU ............................................................................. 24 2.4.1 Cesta methanolu v lidském organismu. ............................................. 25 2.4.2 Příznaky a důsledky otravy ................................................................ 26 2.4.2.1 Metabolická acidóza ......................................................................................... 27 2.4.3 Terapie .............................................................................................. 28 2.4.3.1 Ethanol .............................................................................................................. 28 2.4.3.2 Fomepizol ......................................................................................................... 28 2.4.3.3 Další možnosti terapie ...................................................................................... 29 2.4.4 Otravy methanolem v ČR a ve světě .................................................. 30 2.5 STANOVENÍ METHANOLU ............................................................................... 30 2.5.1 Plynová chromatografie .................................................................... 31 2.5.2 Důkaz oxidací na formaldehyd........................................................... 34 2.5.3 Důkaz převedením na jodid tetramethylamonný .............................. 34 2.5.4 Enzymové stanovení methanolu ....................................................... 35 2.5.4.1 Stanovení kyseliny mravenčí ............................................................................ 35 2.5.4.2 Stanovení pomocí alkoholoxidasy (EC 1.1.3.13)............................................... 35
7
2.5.4.3 Formaldehyddehydrogenasa (EC 1.2.1.46) ...................................................... 36 2.5.4.4 Enzym FerB (EC 1.16.1.7) .................................................................................. 36
3 CÍLE PRÁCE ................................................................................................ 38 4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ............................................................................. 39 4.1 MATERIÁL .................................................................................................. 39 4.1.1 Přístroje ............................................................................................. 39 4.1.2 Vyhodnocovací software ................................................................... 39 4.1.3 Chemikálie......................................................................................... 39 4.1.4 Biologický materiál ............................................................................ 39 4.2 METODY A POSTUPY ..................................................................................... 40 4.2.1 Příprava sad....................................................................................... 40 4.2.2 Měření fluorescence ......................................................................... 41 4.3 VÝSLEDKY ................................................................................................... 41 4.4 DISKUZE ..................................................................................................... 45 5 ZÁVĚR........................................................................................................ 47 6 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY .................................................................. 48
8
1 Seznam použitých zkratek BASF
Badische Anilin-und-Soda Fabrik
ICI
Imperial Chemical Industries
MTBE
2-methoxy-2-methylpropan
PMMA
Polymethylmethakrylát
MEROL
Methylester řepkového oleje
HPLC
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (z angl. High-performance liquid chromatography)
HM
Vysocemethoxylovaný (z angl. High-methoxyl)
LM
Nízkomethoxylovaný (z angl. Low-methoxyl)
DE
Stupeň esterifikace (z angl. Degree of esterification)
DM
Stupeň methylace (z angl. Degree of methylation)
GalA
Kyselina D-galakturonová
DA
Stupeň acetylace (z angl. Degree of acetylation)
PME
Pektinmethylesterasa
GIT
Gastrointestinální trakt
CNS
Centrální nervová soustava
ADH
Alkoholdehydrogenasa
FDH
Formaldehyddehydrogenasa
FTHFD
Formyl tetrahydrofolátdehydrogenasa
GC-FID
Plynová chromatografie s plamenový ionizačním detektorem (z angl. Gas chromatography – flame ionization detector)
MS
Hmotnostní spektrometrie (z angl. Mass spectrometry)
IC
Iontová chromatografie
9
IEC
Iontově výměnná chromatografie (z angl. Ion exchange chromatography)
FN
Fakultní nemocnice
AOX
Alkoholoxidasa
PAGE
Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu (z angl. Polyacrylamide gel electrophoresis)
GSH
Glutathion
FerB
Železo-reduktasa B
FMN
Flavin mononukleotid
FAD
Flavin adenindinukleotid
MALDI
Matrix-assisted laser desorption/ionization
AAA
Acetoacetanilid
DMSO
Dimethylsulfoxid
CAT
Katalasa
10
2 Teoretická část 2.1 Úvod Hromadná otrava methanolem na přelomu roku 2012 a 2013, která se ze dne na den stala mediální kauzou číslo jedna, zvedal zájem o jednoduché, levné a relativně přesné stanovení methanolu v alkoholických nápojích. Podle očekávání by takové stanovení měla provádět i nevyškolená osoba. Cílem práce je zmapovat cestu methanolu od jeho zdroje až po identifikaci koncentrace ve vzorku a prezentovat ucelený svazek informací o tomto nejjednodušším alkoholu.
2.2 Methanol Methanol (podle pravidel českého pravopisu metanol) se vzorcem CH3OH (Obr. 2.1) je nejjednodušší zástupce skupiny alifatických uhlovodíků s navázanou hydroxylovou skupinou OH. Řadí se k primárním alkoholům, přestože uhlík s OH skupinou již nenese vázaný další uhlík. Je známý také jako methylalkohol a dřívější název, dnes již téměř nepoužívaný, je dřevný či dřevitý líh. Jedná se o bezbarvou, hořlavou kapalinu lihově omamného zápachu, velice podobné ethanolu, se kterým se často snadno zaměňuje (1,2,7).
Obr. 2.1. Strukturní vzorec methanolu.
11
2.2.1 Fyzikální a chemické vlastnosti Vlastnost
Hodnota
Molární hmotnost
32,04 g/mol
Bod tání
-98°C
Bod varu
64,7°C
Bod vzplanutí
8,5°C
Teplota vznícení
464°C
Meze výbušnosti – dolní
5,5 % objemových
Meze výbušnosti – horní
44 % objemových
Index lomu
1,3288
Hustota (při 20°C)
0,79 g/cm3
Tlak par (při 20°C)
130,3 hPa
Tlak par (při 50°C)
546,6 hPa
Tab. 2.2. Přehled fyzikálních vlastností methanolu. Methanol je toxická a vysoce hořlavá kapalina, klasifikována jako I. třída nebezpečnosti. Hoří bleděmodrým plamenem, silným ochlazením tuhne v bezbarvé krystalky. Je neomezeně mísitelný s vodou. Hydroxylová skupina propůjčuje, hydroxy sloučeninám obecně, do určité míry vlastnosti vody, schopnost odštěpovat proton z hydroxylové skupiny působením silných bází nebo alkalických kovů, protonaci jednoho z nevazebných elektronových párů kyslíkového atomu a schopnost tvořit vodíkové vazby, způsobující poměrně vysokou teplotu varu a dobrou rozpustnost ve vodě (1,3-8).
2.2.2 Průmyslová výroba a její historie Methanol byl poprvé komerčně připraven destrukční destilací dřeva v roce 1830. Tento způsob výroby převládal téměř století, až do první továrny syntetického methanolu Leuna-Merseburg, která využívala metodu německého chemika Matthiase Piera. Továrna byla otevřena firmou BASF v roce 1923. Syntetickou výrobu již dříve navrhl v roce 1905 francouzský chemik Paul Sabatier. V roce 1913 zjistil německý chemik Alwin Mittasch, při výzkumu amoniaku, výskyt kyslíkatých sloučenin, tedy i methanolu. V roce 1927 byla výroba methanolu zavedena i ve Spojených státech firmou DuPont. Ve 40. letech byl, do té doby používaný, vodní plyn nahrazen
12
zemním plynem. V roce 1966 byla firmou ICI zavedena nízkotlaká výroba, založena na katalýze pomocí mědi. Tato metoda pracuje za tlaku 5-10 MPa ve srovnání s dřívější, pracující za tlaku 35 MPa. Během ropného šoku v roce 1973 se poprvé obrátil zájem na použití methanolu jako alternativního paliva pro spalovací motory. V roce 1989 administrativa amerického prezidenta George H. W. Bushe navrhla regulace pro zvýšení čistoty ovzduší a favoritem v alternativních palivech se stal methanol. Novela zákona o znečištění ovzduší, tzv. Clean Air Act, z roku 1990 požadovala snížení oxidu uhelnatého a prekurzorů ozónu, nicméně nijak nepřikazovala používání alternativních paliv. V současnosti je 2-methoxy-2methylpropan (MTBE), vzniklý syntézou methanolu a isobutenu, nejpoužívanější okysličovadlo v pohonných hmotách. Mezi lety 1970 až 1990 se tedy pohled na methanol změnil z ekonomického aspektu na ekologický (7,16,27). Jak bylo řečeno, dříve se methanol vyráběl z dřevného octa, odtud starší název dřevný líh. Byla to směs vody, methanolu, acetonu a octové kyseliny, jež se získávala suchou destilací dřeva, zvláště bukového. Kyselina octová se ze směsi odstraňovala neutralizací pomocí Ca(OH)2 a methanol se spolu s malým množstvím acetonu oddělil destilací. Tento nejdůležitější technický alkohol se nyní získává hydrogenací oxidu uhelnatého v poměru 1:2 ve prospěch vodíku CO + 2H2 → CH3OH
ΔH = -92 kJ/mol
Pracuje se za tlaku kolem 20 MPa a při teplotě 350°C na katalyzátoru tvořeném oxidem zinečnatým a oxidem chromitým na alumině nebo i křemelině. Na tomto katalyzátoru hydrogenace až na methan téměř neprobíhá. Vedlejším produktem je dimethylether. Jiný postup pracuje při teplotě 250°C a tlaku jen 5 MPa na katalyzátoru oxidu zinečnatém a měďnatém na alumině. Dnes se také používá oxid uhličitý, místo oxidu uhelnatého, na mědi jako katalyzátoru. CO2 + 3H2 → CH3OH + H2O
ΔH = - 50 kJ/mol
Tyto a další metody jsou citlivé k sirným sloučeninám. Vyžadují tedy snížení nebo úplné odstranění síry a také chlóru ze syntézního plynu. Zčásti se vyrábí i přímou oxidací methanu vzduchem při teplotě 400-500°C a tlaku 6 MPa na zeolitech,
13
obvykle se získává směs asi 50% methanolu a 10% formaldehydu. Nezreagovaný methan se recykluje. V České a Slovenské republice se nyní methanol nevyrábí, ale dováží se hlavně z Polska a Ukrajiny. Obr. 2.3 ukazuje procentuální zastoupení výroby methanolu ve světě. Největší producentem je Čína. Světová produkce se z 58 milionů tun ročně v roce 2008 zvýšila na 65 milionů tun v roce 2013. V roce 2016 se očekává nárůst produkce až na 92 milionů tun ročně z důvodů přidávání methanolu k autobenzínům (3,7,16,17,28).
Střední východ 20% Spojené státy 4% Čína 51%
Evropa 4%
Jižní Amerika 14%
Jihovýchodní Asie 7%
Obr. 2.3. Procentuální zastoupení výroby methanolu v roce 2013. Upraveno podle (28).
2.2.3 Využití methanolu Jak ukazuje Tab. 2.4, methanol má v průmyslu velmi široké využití. Nicméně jeho procentuální využití se liší stát od státu. Asi ze třetiny se zpracovává v plastikářském průmyslu na formaldehyd, a tudíž i na výrobu širokého spektra plastů a polymerů (např. polymethylmethakrylátu (PMMA)), založených na reakci s fenoly, karbamidem a melaminem. Dále se používá do nemrznoucích směsi, při denaturaci ethanolu, jako rozpouštědlo, k výrobě methylesterů a bionafty (MEROL). Je nyní hlavním zdrojem pro výrobu kyseliny octové. Nachází využití také v laboratořích pro HPLC. Nedílnou součástí využití methanolu je jeho přidávání do motorových a raketových paliv. Zatímco před lety bylo jen málo methanolu takto využíváno, nyní toto odvětví rapidně stoupá. V Číně je benzín míchán s methanolem na 15% koncentraci bez nutnosti upravovat motory vozidel. Při upraveném motoru může být
14
použita až 85% směs methanolu s benzínem. Tento důraz na použití methanolu jako paliva se odráží v globálních číslech. Aktuálně se s benzínem míchá přibližně 14% vyrobeného methanolu, ale očekává se nárůst na 16% do roku 2016. Ještě vyšší nárůst se očekává při syntéze alkenů, kde by se mělo využití methanolu, podle odhadů, až ztrojnásobit (1-3,7,10,11,28). Využití Zastoupení [%] Výroba formaldehydu 30 Směsi s benzínem 14 Výroba MTBE 13 Syntéza alkenů 10 Syntéza kyseliny octové 9 Syntéza dimethyletheru 7 Syntéza chlormethanu 3 Výroba biodieselu 2 Výroba PMMA 2 Výroba methylaminů 2 Syntéza dimethyl-tereftalátu 1 Ostatní 7 Tab. 2.4. Procentuální zastoupení při využití methanolu. Upraveno podle (28).
2.2.4 Výskyt methanolu V přírodě se methanol nachází jen vzácně volný, například v nezralých plodech bolševníku, častěji je však vázán na organické kyseliny jako ester. Odštěpuje se rovněž z éterických olejů, kde je vázán jako ester kyseliny salicylové. V potravinářském průmyslu se objevuje zejména v alkoholických nápojích, vyráběných jednak v domácích palírnách, tak ve větších výrobnách alkoholických nápojů. Do pálenek se dostává z kvasů, zvláště pak těch, které jsou připraveny ze suroviny bohaté na pektinové, popřípadě ligninové látky. Bohaté na pektinové látky jsou zejména zbytky po lisování vína a jiného ovoce, například Matolinovice může obsahovat až 4,5 objemových procent methanolu (vztaženo na absolutní alkohol) a všechny suroviny resp. kvasy, připravené z celého, nelisovaného ovoce, nebo kvasy připravené z kořenů. V nekvalitně nebo nekvalifikovaně připravených kvasech, kde mohou vznikat plísně, je řádově vyšší pravděpodobnost vzniku methanolu a dalších látek ovlivňujících konečný produkt destilace. O pektinu, jeho výskytu v ovoci a struktuře pojednává kapitola 2.3 v této práci. Další kapitola (2.2.5) je věnována odstranění methanolu při destilaci. V lidském těle je methanol produkován ve stopách také endogenně (méně než tisícina promile). Tento methanol se často cituje
15
jako tzv. sérový, i přesto že methanol je, díky své nízké molekulové hmotnosti, neomezeně mísitelný s vodou a prochází všemi membránami a do všech tkání. Není tedy nikde zkoncentrován ani úplně vyloučen z určité části. Zvýšená hladina methanolu může přetrvat v těle po vydatném pití alkoholu i několik desítek hodin a může tak být markerem pití v inkriminované době (8,9,29,41).
2.2.5 Odstranění methanolu při destilaci Výskyt methanolu při destilaci je možné pozorovat při tzv. úkapu, což je první podíl, který díky nižší teplotě par po kapkách vytéká z destilační kolony. Úkap vzniká hlavně při chybných kvašeních. Pracuje-li se nečistě, vytváří nahnilé nebo plesnivé ovoce, listy, stopky a jiné nečistoty podstatnou část úkapu. Vzniku malého množství methanolu nelze zabránit. Existují však metody, jak zabránit jeho větší tvorbě, nebo je třeba ho odstranit při zvláštní destilaci ve vakuu. Chování složek při destilaci závisí na okamžitém složení kapaliny v kotli a způsobu destilace (intenzita ohřevu, konstrukce kotle a funkci deflegmátoru, což je zařízení nad parním dómem, ve kterém dochází k částečné kondenzaci procházejících par a obohacení o těkavější složky). Bod varu methanolu je zhruba o 14°C nižší než ethanolu, a proto se částečně odstraňuje právě v úkapu. Musí být zachycen zvláště z důvodu jakosti a nemůže být přimíchán do tzv. jádra destilátu. Úkapová frakce bývá 1-2 % z celkového objemu rektifikovaného destilátu. Při dodržení správného postupu není jeho zbylé množství pro lidský organismus nebezpečné. Pro oddělení frakce je hlavním vodítkem senzorický profil vytékajícího destilátu, tedy vůně a chuť. Jako pomocná kritéria mohou sloužit teplota v kotli a v parním dómu, množství již vydestilovaného produktu a jeho stupňovitost. Zde je skutečně nezastupitelná zkušenost destilatéra zaručující, že přední frakce budou dostatečně přesně odděleny od jádra. Špatně provedená destilace způsobuje palčivou chuť a vůni. Kromě methanolu v úkapu přecházejí také estery a acetaldehyd. Úkap sám nelze dále používat při přípravě destilátů. Hodí se pouze k výrobě masážních vod, krémů nebo do roztoků na mytí oken (9,30).
2.2.6 Legislativa obsahu v alkoholických nápojích Některé evropské země jako Maďarsko, Slovinsko a Rumunsko patří mezi státy s nejvyšším počtem úmrtí spojených s cirhózou jater. Má se za to, že k tomu
16
svou mírou přispívá i vysoká produkce neevidovaného alkoholu v těchto zemích. Takový alkohol, nejen že obsahuje více nebezpečných příměsí jako je methanol, ethylkarbamát, acetaldehyd a těžké kovy, ale neodpovídá ani procentuální obsah ethanolu. Ten bývá většinou vyšší, než je deklarováno výrobcem neevidovaného alkoholu. Výsledky projektu AMPHORA (Alcohol Measures for Public Health Resach Alliance), který nashromáždil a analyzoval vzorky neevidovaného alkoholu z 16 evropských zemí, ukazují, že až polovina z přibližně 110 vzorků měla nevyhovující hladinu buď ethylkarbamátu, mědi, manganu nebo acetaldehydu. Ostatní parametry byly jen zřídka problematické. Vzhledem k efektu ethanolu na lidské zdraví je problém kontaminace jinými látkami z pozadí zájmu. I přes zvýšený obsah nebezpečných látek v neevidovaném alkoholu nedosahuje jejich denní spotřeba ani k tolerované hladině (39,40). Evropská legislativa však určuje maximální obsah methanolu v alkoholických nápojích (Tab. 2.5). Tento obsah se liší druh od druhu nápoje, a to díky specifickým vlastnostem každého z nich. Kupříkladu nejvyšší obsah methanolu je povoleno v ovocné Matolinovici, což je nápoj vyrobený ze zbytků po lisování jablek a hroznů. Obsahuje tedy vysoké procento pektinu. Naopak jedny z nepřísnějších limitů platí pro vodku a London gin, kde obsah jiných těkavých látek než ethanolu je pouze na škodu produktu a již by měnil jeho senzorický profil (19).
17
Druh alkoholického nápoje
Methanol [g/hl]
Líh zemědělského původu
30
Vinný destilát
200
Brandy
200
Weinbrand
200
Destilát z cidru a perry
1000
Matolinová pálenka
1000
Matolinovice
1000
Matolinovice ovocná
1500
Des. ze: slívy, mirabelky, švestky
1200
Des. ze: jablka, hrušky maliny, ostružiny
1200
Ostatní ovocné destiláty
1000
Vodka
10
London gin
5
Tab. 2.5. Povolený obsah methanolu na hektolitr ethanolu o 100 % obj. dle Nařízení Evropského parlamentu a rady (ES) č.110/2008. Upraveno podle (19).
2.3 Pektin Pektinové látky se nalézají jako bezdusíkaté sloučeniny hlavně v membránách rostlinných buněk. Přítomny jsou zejména v tzv. jádrovém ovoci (Tab. 2.9) a je nutné jim věnovat pozornost, poněvadž právě pektiny jsou výchozím prekurzorem pro tvorbu methanolu. Nachází se v pletivech všech vyšších rostlin, kromě jednoděložných, jako součást stěn primárních buněk a mezibuněčných prostor. Vznikají a ukládají se hlavně v raných stádiích růstu, kdy se zvětšuje plocha buněčných stěn. Přítomnost pektinů a jejich změny během růstu, zrání, skladování a zpracování mají značný vliv na texturu ovoce a zeleniny. Jsou v ovoci jednak ve formě rozpustné, jednat nerozpustné, vázané na dužninu, takže se lisováním odstraní. Pro nerozpustné nativní pektiny buněčných stěn asociované s celulosou se používá název protopektiny (dříve pektosy). Enzymovou hydrolýzou komplexem enzymů zvaných protopektinasa se přeměňují na více či méně rozpustné pektinové látky s kratšími řetězci. Obecně jsou pektinové látky rozpustné ve vodě a nerozpustné ve většině organických rozpouštědel. Rozpustnost ve vodě klesá s rostoucí molekulovou hmotností a stupněm esterifikace karboxylovými kyselinami.
18
Soli polygalakturonových kyselin jsou vesměs lépe rozpustné než volné kyseliny, disperze jsou relativně málo viskosní, a pektin se proto nevyužívá jako zahušťovadlo. Podle definice, pektiny, ve kterých je více než polovina karboxylových skupin v methylesterové formě (-COOCH3) (Obr. 2.6) a zbylé karboxylové skupiny jsou ve formě kyseliny (-COOH) (Obr. 2.7) nebo soli (-COO-Na+) (Obr. 2.8) jsou klasifikovány jako vysocemethoxylované (HM) pektiny. Pokud obsahují méně než polovinu, mluvíme o nízkomethoxylovaných (LM) pektinech. Procentuální zastoupení esterifikovaných skupin vyjadřuje stupeň esterifikace (DE) nebo stupeň methylace (DM). Viskozita HM pektinů se zvětšuje přídavkem sacharosy, u LM pektinů v přítomnosti Ca2+ iontů. V obou případech mohou vznikat gely (8,9,30-32).
Obr. 2.6. Jednotka pektinu. Kyselina galaktopyranosová v methylesterové formě.
Obr. 2.7. Jednotka pektinu. Kyselina galaktopyranosová ve formě kyseliny.
19
Obr. 2.8. Jednotka pektinu. Kyselina galaktopyranosová ve formě soli. Zdroj
Pektin [%]
Zdroj
Pektin [%]
Jablka
0,5-1,6
Cibule
0,5
Hrušky
0,4-1,3
Brambory
0,4
Broskve
0,1-0,9
Hrozny
0,1-0,9
Jahody
0,6-0,7
Banány
0,7-1,2
Angrešt
0,3-1,4
Ananas
0,04-0,13
Rybíz
0,1-1,8
Mrkev
0,2-0,5
Pomeranče
0,6
Rajčata
0,2-0,6
Slupky pomerančů
3,5-5,5
Fazole
0,5
Tab. 2.9. Obsah pektinů v čerstvém ovoci a zelenině (31).
2.3.1 Využití pektinů Komerčně využívanými pektiny jsou galakturonglykany s různým obsahem methylových skupin. Nativní molekula se nachází v buněčných stěnách a intracelulárních vrstvách rostlin, ze kterých jsou získávány. Pro komerční účely se nejčastěji využívá pektin z kůry citrusů a jablečné matoliny, což jsou pevné zbytky ovoce po vylisování. Nejkvalitnější a zároveň nejsnáze získatelný pektin je z kůry citrusů a limet, speciálně z jejich bílé části zvané albedo. Ta obsahuje až 50% pektinu v sušině. Pektiny mají unikátní schopnost formovat gely v přítomnosti cukrů, kyselin nebo vápenatých iontů (32).
2.3.2 Struktura Hlavní složkou makromolekuly jsou podjednotky α(1→4) spojených kyselin galaktopyranosových. Pektiny jsou skupina látek značně polydisperzních, komplexních, kyselých polysacharidů o proměnném složení. Molekula pektinu je 20
tvořena třemi doménami, homogalakturonanem, rhamnogalakturonanem I a rhamnogalakturonanem II. Tyto polysacharidy jsou vzájemně spojeny kovalentními vazbami (31,32). 2.3.2.1 Homogalakturonan Základní struktura homogalakturonanu je tvořena lineárním řetězcem složeném z 25-100 jednotek D-galakturonové kyseliny (GalA) spojených vazbami α(1→4). Tento polymer se často nazývá polygalakturonová kyselina. Jednotky kyseliny jsou do různého stupně esterifikovány methanolem s neutrálním nábojem, zatímco zbývající jednotky obsahují disociované karboxylové skupiny s negativním nábojem. Tyto karboxyly mohou být zesíťovány vápenatými ionty. Stupeň acetylace (DA) bývá obecně nízký (Tab. 2.10), více acetylových skupin obsahují např. pektiny cukrové řepy. Zdroj pektinu
GalA [%]
DM [%]
DA [%]
Meruňky
64
57
8
Broskve
90
79
4
Hrozny
63
69
2
Mrkev
61
63
13
Brambory
40
53
15
Řepa cukrová
65
62
35
Tab. 2.10. Obsah galakturonové kyseliny (GalA), stupeň methylace (DM) a stupeň acetylace (DA) pektinů různého původu (31). 2.3.2.2 Rhamnogalakturonan I Rhamnogalakturonan I, se stupněm polymerace přibližně 1000, obsahuje řetězce opakujících se jednotek α-D-galakturonové kyseliny ukončené α-Lrhamnopyranosou vázanou glykosidickou vazbou α(1→2). Celkový obsah rhamnosy v pektinech bývá 1-4%. Galakturonosylové a rhamnosylové zbytky jsou přibližně v poměru 2:1. Asi polovina rhamnosylových zbytků má na C-4 vázán zbytek galakturonové kyseliny. V molekule je dále značné množství větvených postranních řetězců, se značným počtem jednotek arabinosy a galaktosy. Tyto řetězce mají strukturu arabinanů a arabinogalaktanů a k hlavnímu řetězci jsou připojeny prostřednictvím rhamnosy na C-4 nebo na C-3, méně často poté na C-2 či C-3
21
galakturonové kyseliny. Tvoří tzv. vlasové oblasti molekuly, nesubstituované úseky tvořené polygalakturonovou kyselinou, které jsou vazebnými zónami. Rhamnosa je cukr nekompatibilní s pravidelnou konformací polygalakturonátů, proto její umístění v řetězci určuje velikost vazebných zón uplatňujících se při tvorbě pektinových gelů. Rhamnosylové zbytky jablečných pektinů bývají např. substituovány z 25-100 % a mrkve z 10-50 %. Galakturonosylové zbytky pektinů brambor jsou větveny přibližně z 32 %, ale pektiny řepkových semen až z 75% (31). 2.3.2.3 Rhamnogalakturonan II Rhamnogalakturonan II, se stupněm polymerace přibližně 60, má řetězec tvořený α-D-galakturonovými kyselinami spojenými vazbami α(1→4). K tomuto hlavnímu řetězci jsou připojeny různé postranní řetězce, které tvoří zbytky: α- a β-Dgalaktopyranuronové kyseliny, α- a β-D-rhamnopyranosy, α-D-galaktopyranosy, α-Lfukopyranosy, α-L-arabinopyranosy, β-L-arabinofuranosy, α-D-xylopyranosy a Dglukopyranuronové kyseliny. V postranních řetězcích jsou navíc čtyři neobvyklé cukerné zbytky: 3-C-(hydroxymethyl)-β-D-erythrofuranosy známé jako β-Dapiofuranosa, 3-C-carboxy-5-deoxy-β-L-xylofuranosy, 3-deoxy-β-D-lyxo-hept-2ulopyranarové kyseliny a 3-deoxy-β-D-manno-oct-2-ulopyranosonové kyseliny. Xylosa a částečně i fukosa se častěji vyskytují jako 2-O-methyl ethery. Řetězce rhamnogalakturanonu II jsou ještě zesítěny prostřednictvím kyseliny borité resp. boritanových iontů, kovalentně vázaných na cis-hydroxyly (v poloze C-2 a C-3) apios nacházejících se v různých řetězcích rhamnogalakturonanů II, takže tato součást pektinů je přítomna převážně jako dimer. Celkové uspořádání řetězců v pektinech je schematicky znázorněno na Obr. 2.11 (31).
22
A B
C Obr. 2.11. Zjednodušená struktura pektinu. Část A znázorňuje vazebnou oblast polygalakturonanu, část B znázorňuje rhamnosu a část C znázorňuje vlasovou oblast arabinanů a arabinogalaktanů. Upraveno podle (31).
2.3.3 Pektinmethylesterasa (PME) Hydrolytickým působením PME (EC 3.1.1.11) se z pektinů uvolňují molekuly methanolu. Jde o enzym patřící do skupiny hydroláz a byl prokázán jak v houbách, tak v rostlinných tkáních. Jedná se o skupinu isoenzymů s rozsahem velikosti 25-54 kDa. Vykazují širokou pH stabilitu (obecně od 2-10) a tepelnou stabilitu v rozmezí 4070°C. HM pektin + n H2O →
𝑃𝑀𝐸
n CH3OH + LM pektin
K hydrolýze pektinových látek dochází jednak působením enzymů, jednak v kyselém nebo alkalickém prostředí. Na enzymové hydrolýze se podílí řada nativních enzymů nebo enzymů produkovaných mikroorganismy. Rozlišují se dvě základní skupiny enzymů, pektinesterasy a pektindepolymerasy. První skupiny katalyzuje hydrolýzu methylesterů na LM pektiny. Vznikající kyseliny reagují s přítomnými bivalentními ionty a může dojít ke spontánnímu želírování, případně tuhnutí. Druhou skupinou jsou tzv. glykosidasy a lyasy. Glykosidasy, zvané polygalakturonasy, hydrolyzují α(1→4) glykosidovou a esterovou vazbu. Nachází se ve vyšších rostlinách a mikroorganismech. Lyasy jsou typické bakteriální enzymy a degradují esterifikované nebo neesterifikované pektiny odlišným mechanismem než glykosidasy, tzv. β-eliminací. Jak jde vidět na Obr. 2.12, mechanismus reakce PME s esterovou vazbou pektinu zahrnuje zbytky ASP178, ASP199 a podle literatury i ARG267.
23
Jeden zbytek ASP je deprotonovaný a slouží k aktivaci vody, jako nukleofilu. Nukleofilní molekula vody atakuje karbonyl, zatímco druhý ASP zbytek protonuje kyslík na karbonylu. Nekovalentní tetrahedrální meziprodukt kolabuje za vzniku volné kyseliny a methanolu (31,32).
Obr. 2.12. Mechanismus reakce PME s methylesterovu formu pektinu.
2.4 Toxikologie methanolu Methanol je příkladem látky, kdy jsou transformované metabolity toxičtější než látka samotná. Je velmi nebezpečný díky své pomalé biotransformaci na formaldehyd a kyselinu mravenčí v játrech. Tyto metabolity jsou výrazně jedovatější než původní methanol. Účinky na organismus jsou podobné jako u ethanolu, snad pouze s tím rozdílem, že nástup opilosti je pomalejší, díky až desetkrát pomalejší oxidaci, a omamné účinky jsou výrazně menší. Tyto skutečnosti bohužel nutí konzumenta k dalšímu, ještě silnějšímu pití. Jeho vysoká rizikovost je dána relativně dobrou dostupností, umožněnou častým používáním této látky v průmyslu i v laboratořích a snadnou zaměnitelností s ethanolem (2,10,12,41).
24
2.4.1 Cesta methanolu v lidském organismu. Alkoholy obecně se do těla mohou dostat v podstatě jakoukoliv cestou, nejvýznamnější je však perorální podání. Pro ilustraci akutní toxicita methanolu pro potkana (orální podání): LD50 = 13 mg/kg, pro myš (subkutánní aplikace): LD50 = 9800 mg/kg. Jak již bylo řečeno, methanol má malou molekulu a je dobře rozpustný ve vodě, a proto, velmi dobře prochází tělními membránami. V těle se vstřebává nejrychleji z gastrointestinálního traktu (GIT), tedy v žaludku a tenkém střevě, méně plícemi a kůží. Navíc alkohol, který pronikne přes sliznici, se dostane do kapilárního řečiště, které ústí do žaludečních žil, a ty vedou přímo do dolní duté žíly. Tím alkohol obchází portální oběh a dostává se rovnou do velkého krevního oběhu a následně do centrální nervové soustavy (CNS), kde začne působit. V dalším případě se dostává přes tenké střevo do jater, kde dochází k jeho metabolismu. Menší část (20-25 %) se pomalu vylučuje nezměněná ledvinami. Obr. 2.13 znázorňuje, jak se v játrech methanol transformuje působením alkoholdehydrogenasy (ADH) (Obr. 2.14) na formaldehyd a dále působením formaldehyddehydrogenasy (FDH) na kyselinu mravenčí, dříve než se dostane do velkého krevního oběhu. Konečným produktem je oxid uhličitý a voda, vznikající působením enzymu formyl tetrahydrofolátdehydrogenasou (FTHFD) (10,12,15,42).
CH3OH
ADH
CH2O F D H
H2O
CO2
FTHFD
HCOOH
Obr. 2.13. Biotransformační cesta methanolu a jeho metabolitů.
25
E-Zn-H2O
A
NAD+ NAD+-E-Zn-H2O H+
B
H2O
C
E-Zn-OHNAD+
H OH-C-R H
H E-Zn
-O-C-R
NAD+
H H
E-Zn
D
O=C
NADH H2O
R
H
E
O=C E-Zn-H2O
R
NADH
F
NADH-E-Zn-H2O NADH
G
E-Zn-H2O Obr. 2.14. Jednotlivé kroky mechanismu účinku ADH. A – vytvoření komplexu ENAD+. B – isomerace komplexu E-NAD+. C – vytvoření ternárního komplexu s alkoholátem. D – reorganizace vazeb vedoucí ke komplexu E-NADH s aldehydem. E – disociace aldehydu. F – isomerace, rychlost určující krok. G – disociace NADH (37).
2.4.2 Příznaky a důsledky otravy Mimo obecných příznaků opilosti je v popředí závažnosti ireversibilní poškození zraku. Začíná poruchou barvocitu, pokračuje jako porucha ostrosti vidění, světloplachost, dvojité vidění a později, někdy po 10-20 hodinách, nastupuje zcela specifický příznak zvaný sněhová vánice (uváděno také jako sněžné pole). Postižený vidí pouze hustou, neproniknutelnou, šedobílou mlhu, ve které víří světlejší skvrny
26
popisované jako sněhové vločky. Sítnice nereaguje na dopadající světlo, odborně se tento stav nazývá skotom. Dochází k rozšiřování zornic, k tzv. mydriáze. Příznaky také zahrnují prokrvení, otok a blednutí optického disku. Poškození sítnice způsobuje formaldehyd. Dalšími příznaky jsou bolesti žaludku, kdy dochází ke zvracení přibližně po 3 hodinách od požití, bolest hlavy, hypoxii tkání, křeče, kóma, zvýšená dechová frekvence (tachypnoe), snížení krevního tlaku (hypotenze), změna tepové frekvence (tachykardie, bradykardie). Kyselina mravenčí je oxidována na oxid uhličitý a vodu pomocí jaterního enzymu FTHFD. Kapacita tohoto enzymu je u lidí malá a závisí na přítomnosti folátu (kyseliny folinové nebo leukovorinu) jako kofaktoru oxidace. Jeho zásoba v lidském organismu je nízká, rychle tedy dochází k vyčerpání, což má za následek kumulaci kyseliny mravenčí. Takto kumulovaná kyselina blokuje cytochrom c oxidasu v mitochondriích a vyvolává tím buněčnou hypoxii doprovázenou hromaděním laktátu. Akumulace kyseliny mravenčí a mléčné vede k rozvoji těžké metabolické acidózy. Nejvíce citlivý k cytotoxickému účinku mravenčanu je zrakový nerv, oční sítnice a bazální ganglia mozku. Hodnota pH krve klesne pod 7,35. Akutní dávka pro člověka je asi 30 ml, celková letální dávka je 100-200 ml pro většinu dospělých. Zde záleží na tělesné hmotnosti a celkovém stavu organismu. Slepotu však může vyvolat již 7-15 ml (2,10,12-15,35). 2.4.2.1 Metabolická acidóza Udržování konstantního pH tělních tekutin je významným aspektem udržení stability vnitřního prostředí. Většina biochemických pochodů je vzhledem k enzymové katalýze na hodnotě pH prostředí přímo závislá a již nepatrné odchylky od stabilních hodnot mohou vyvolat jejich zpomalení či zástavu se závažným ohrožením životních funkcí. Na pH závisí vlastnosti bílkovin, tedy aktivita enzymů a struktura součástí buňky, a propustnost membrán při distribuci elektrolytů. Hodnota pH ˂7,0 nebo ˃7,7 není slučitelná se životem. Na udržování pH se podílí několik různých pufrů. Jejich stručný přehled znázorňuje Tab. 2.15. Kromě pufračních systému však organismus reguluje pH i odstraňováním protonů ledvinami a vylučováním oxidu uhličitého plícemi. Právě při otravách methanolem dochází ke kumulaci kyselin a porušování acidobazické rovnováhy. Metabolická acidóza je tedy hlavní příčinou úmrtí v souvislosti s otravou. Kyseliny při pH krve prakticky zcela disociují a zvýšení koncentrace H+ iontů vede k acidóze. Porucha je kompenzována urychleným, tzv.
27
Kussmaulovým dýcháním, vylučování kyselé moče a zpětnou resorpcí hydrogenuhličitanů v ledvinách (14,33,34). Pufrační systém
Zastoupení [%]
Pufrační báze
Pufrační kyselina
Hydrogenuhličitanový
50
HCO3-
H2CO3
Proteiny
45
Protein-His
Protein-His-H+
Hydrogenfosfátový
5
HPO4-
H2PO4
Tab. 2.15. Stručný přehled pufračních systému krve (33).
2.4.3 Terapie Jelikož otrava methanolem nemá okamžitý nástup, je její terapie ztížena vysokou hladinou metabolitů v krvi. Příznaky jsou také pro laika těžko rozeznatelné oproti otravě ethanolem. Léčba otravy se zakládá jednak na přerušení biotransformačních přeměn methanolu na formaldehyd a kyselinu mravenčí, jednak na průběžné odstraňování toxických metabolitů z krve. Důležitou součástí je také regulace důsledku otravy, a to vznikající acidózy. 2.4.3.1 Ethanol Jako antidotum je doporučován především ethanol ve zředěné formě. Podává se buď perorálně, popřípadě intravenózně infuzí, takto podaný působí samozřejmě okamžitě. Jedná se o antidotum s kinetickým mechanismem antagonismu, tedy snižuje množství biotransformovaného methanolu kompeticí na biotransformačním místě enzymů. Ethanol využívá stejné, ale pomalejší, metabolické cesty a přibližně dvacetkrát větší afinity k metabolizujícím enzymům. Při jeho aplikaci vytěsní z metabolického řetězce methanol, ten se nepřemění na toxické metabolity a může být z těla vyloučen v nezměněné formě. Hladina ethanolu v krvi se udržuje na cca 0,5-1,5 ‰. Pro první pomoc při otravě se podává 50-60 ml ethanolu, což odpovídá 120-150 ml 40% destilátu. Indikací je hladina methanolu v krevním séru více než 200 mg/l (10,12,15,18). 2.4.3.2 Fomepizol Dalším používaným antidotem je fomepizol (4-methylpyrazol, antizol), který účinně specificky inhibuje ADH, je však omezeně k dispozici pro vysokou cenu
28
přípravku. Původně se jednalo o antidotum otrav ethylenglykolem. Pět léčebných dávek vychází zhruba na milion korun. Výhodou však je, že nezpůsobuje opilost ani hypoglykémii, netlumí CNS a nevyžaduje monitorování hladiny antidota v séru. Jeho maximální efekt je v rozmezí 1,5-2 hodiny a může omezit potřebu hemodialýzy. Podávání fomepizolu je preferováno nad ethanolem v případech, kdy je koncentrace methanolu mezi 500-1000 mg/l (nebo kyseliny mravenčí nad 400 mg/l). Také při koncentraci methanolu 500 mg/l s pH krve pod 7,0 a koncentraci 300 mg/l s pH krve pod 7,0 s pacientem neschopným hyperventilace. Nicméně, v pozdějších fázích otrav je vhodné se řídit anamnézou, jelikož methanol může být již zmetabolizován, tudíž jeho koncentrace v krvi není vypovídající. Dalšími situacemi, kdy je vhodnější užít fomepizol, je při poruchách pacientova vědomí, současném vlivu tlumivých látek (sedativa, opioidy, antidepresiva, antikonvulziva, antihistaminika, hypnotika), jaterní onemocnění (pacienti užívající disulfiram nebo metronidazol – léčba alkoholismu), v těhotenství (zejména 1. trimestr), u dětí a při nedostupném monitorování ethanolu v krvi. Fomepizol se dávkuje intravenózně po dobu 30 minut, naředěný ve 100 ml 5% glukózy nebo fyziologickém roztoku. Úvodní dávka je 15 mg/kg (maximálně však 1 g). Další dávky jsou 10 mg/kg, maximálně 4 dávky po 12 hodinách. V případě potřeby další dávky se podává 15 mg/kg. Fomepizol je účinně odstraňován dialýzou, proto by se po každém hemodialýze měla poslední dávka zopakovat. Ukončení léčby se doporučuje při koncentraci methanolu pod 150 mg/l s acidózou a pod 300 mg/l bez acidózy. Fomepizol zpomaluje eliminaci ethanolu asi o 40 %, ethanol zpomaluje eliminaci fomepizolu asi o 50 %. Také léčiva ovlivňující jaterní systém P450 mohou měnit hladiny fomepizolu (36). 2.4.3.3 Další možnosti terapie Léčba otravy zahrnuje kombinaci více metod najednou a záleží jen na uvážení lékaře a dostupných prostředcích, který ze způsobů bude zvolen jako nejvhodnější. Kromě podávání ethanolu a fomepizolu se také intravenózně podává dávka 10 mg/den kyseliny listové, jejichž aktivní formou je kyselina folinová, leukovorin, která je kofaktorem oxidace kyseliny mravenčí na netoxické metabolity. V nemalé míře se také provádí hemodialýza (Obr. 2.16) (při hladině methanolu 500 mg/l nebo kyseliny mravenčí nad 200 mg/l), která rychle odstraňuje methanol i kyselinu mravenčí, ale i antidota, proto je potřeba zvýšit schéma podávání dávek.
29
Jak bylo řečeno, hlavní příčinou úmrtí na otravu methanolem je metabolická acidóza. Ta se koriguje podáváním roztoku hydrogenuhličitanu sodného nebo fosforečného (10,12,15,18).
G
E
A
C D B
F
Obr. 2.16. Zjednodušený princip hemodialýzy. A – přívod pacientovy krve. B – přívod nového dialyzačního roztoku. C – semipermeabilní membrána. D – prostup metabolitů přes membránu. E – odvod pacientovy krve. F – odvod znečištěného dialyzačního roztoku. G – metabolity v pacientově krvi.
2.4.4 Otravy methanolem v ČR a ve světě Na přelomu roku 2012 a 2013 v České republice proběhla hromadná otrava methanolem způsobená požitím ilegálně připraveného destilátu. Celkem bylo zaznamenáno přibližně 130 případů s nejméně 50 úmrtími (zhruba polovina osob zemřela ještě doma) a 20 otrav s poškozením CNS a zraku. Nejčastějšími byly příznaky gastrointestinální (48 %), dále poruchy zraku (42 %) a dušnost (36 %), 20 % pacientů bylo přijato do nemocnice v kómatu. Tato kauza se dostala do povědomí jako tzv. metanolová aféra. Ročně se v ČR objeví 3-4 případy otrav rozpouštědlem s obsahem methanolu. Dalšími případy v Evropě je úmrtí 68 lidí v Estonsku a 20 lidí v Istanbulu. Mimo Evropu poté v Indii, Bangladéši, Salvadoru, Keni. K největší otravě došlo ve městě Bengalúr ve státě Karnátaka v roce 1981. O život přišlo 308 lidí (15,20).
2.5 Stanovení methanolu Následující kapitola je věnována metodám pro stanovení methanolu, jak pomocí metod analytických, tak enzymových. Nejperspektivnější a dnes nejvyužívanější analytickou metodou stanovení methanolu v alkoholických nápojích je plynová chromatografie s plamenově-ionizačním detekcí (GC-FID) a jinými detektory, jako např. hmotností spektrometrií (MS). Dalšími metodami jsou HPLC Ramanova spektrometrie nebo cyklická voltametrie. V laboratoři lze využít i důkazu
30
methanolu převedením na jodid tetramethylamonný nebo oxidací na formaldehyd pomocí manganistanu draselného a následným fotometrickým měřením. Pro stanovení metabolitů, např. kyseliny mravenčí, se používá jak GC, tak iontová chromatografie (IC) či iontově-výměnná chromatografie (IEC) (21,22).
2.5.1 Plynová chromatografie Chromatografie je separační metoda, tedy metoda, při které se separují složky obsažené ve vzorku. Svým určením je to především metoda kvalitativní a kvantitativní analýzy vzorku. V chromatografii je vzorek nanášen mezi dvě vzájemně nemísitelné fáze. Stacionární fáze, jak již název napovídá, je nepohyblivá, mobilní fáze naopak pohyblivá. Plynová chromatografie (GC) je jednou z celé řady typů chromatografií. Vzorek se dávkuje do proudu plynu, který jej dále unáší kolonou. Mobilní fází je tedy nosný plyn, většinou vodík, dusík, helium nebo argon. Za tlakovou láhví s nosným plynem se nachází čistící zařízení, které zbavuje plyn vlhkosti a nečistot. Aby mohl být vzorek transportován, musí být ihned přeměněn na plyn. Dávkovač slouží právě k zavedení vzorku do proudu nosného plynu v co nejkratším čase. V koloně se složky separují na základě různé schopnosti poutat se na stacionární fázi. Kolony v GC jsou typu náplňového nebo kapilárního. První jmenovaný typ jsou trubice naplněné sorbenty nebo nosiči pokrytými kapalnou fází. Vyrobeny jsou z oceli nebo skla s vnitřním průměrem 2-3 mm a délkou 1-3 m. Mají tudíž větší kapacitu než kapilární. Jako sorbenty se používají silikagel, grafitizované saze a alumina. Jako molekulová síta poté hlinitokřemičitany. Mikronáplňové kolony jsou moderní účinné náplňové kolony, které mají malý průměr a obsahují velmi malé částice náplně, proto při stejné délce dosahují vyšší účinnosti separace. Kapilární kolony využívají jako nosiče stacionární fáze své vnitřní stěny. Vyrobeny jsou obvykle z taveného křemene s vnitřním průměrem 0,1-0,6 mm, tloušťkou filmu stacionární fáze 0,25-5 µm a délkou 15-60 m. Obecně platí, že roste-li vnitřní průměr a tloušťka stacionární fáze, účinnost separace se snižuje. Důležitou součástí GC zařízení je samozřejmě detektor. Těch je více druhů, ale pro GC analýzu alkoholických nápojů se v praxi využívají nejčastěji FID a MS. Zjednodušené schéma GC zobrazuje Obr. 2.17. Funkce FID je založena na vedení elektřiny v plynech. Základem detektoru je izolovaná nádoba, kterou proudí plyn přes dvě elektrody, mezi nimiž je elektrické 31
pole. Molekuly plynu se ionizují v O2/H2 plamenu a vedou ionizační proud mezi elektrodami. Nosný plyn je před vstupem smísen s vodíkem a vzduch je přiváděn z vnějšku. Přítomnost analyzované složky zvýší ionizaci a elektrický proud se zvětší. Jedná se o velmi citlivý detektor, jehož detekční limity jsou v pg analytu. Organické látky se teplem plamene štěpí na radikály, které s vodíkem v redukční částí plamene dávají radikály •CH. Ty se poté oxidují za vzniku iontů CHO+ a elektronů, což je rozhodující pro odezvu. Odezva detektoru roste s počtem uhlíkových atomů poskytujících CHO+, proto je detektor velmi citlivý na uhlovodíky. Nezastupitelný význam má spojení GS s MS. Ionty jsou v MS analyzovány kvadrupólovým analyzátorem nebo, ještě méně místa vyžadující, iontovou pastí, kde je prostor analýzy iontů společný s iontovým zdrojem. Pro každou složku lze získat její hmotnostní spektrum a identifikovat ji porovnáním s knihovnou spekter sloučenin. MS pracuje na principu separace vzniklých iontů podle podílu jejich hmotnosti a náboje m/z. Kvadrupólový analyzátory obsahuje alespoň čtyři rovnoběžné tyčové elektrody. Na každou je přiváděna stejnosměrná složka napětí (stovky V) a současně složka radiofrekvenčního pole. Nastavení hodnot veličin předurčují trajektorie drah, po které se mezi tyčemi budou pohybovat ionty s určitou hodnotou m/z. V danou chvíli se tedy k detektoru pohybují jen ionty o stejné hodnotě. Ostatní ionty k detektoru neprojdou. Nastavení hodnot se postupně mění. Spektrum lze takto získat poměrně rychle. Zařízení umožnuje automatizaci, je menší a má relativně levnou konstrukci. Iontová past pracuje podobně jako kvadrupól. Obsahuje však kruhovou elektrodu, uvnitř které se shromažďuje oblak iontů. Opět změnou hodnot veličin jsou shromážděné ionty odváděny k detektoru na základě m/z. Past je malá, citlivá, snadno automatizovatelná, s nižším rozlišením a omezeným dynamickým rozsahem (38).
32
G
D
K C
J E
B
F
H
I A
Obr. 2.17. Zjednodušené schéma GC. A – zdroj nosného plynu. B – čistící zařízení. C – regulační systém. D – nástřik vzorku. E – dávkovač. F – kolona. G – výstup plynů. H – detektor. I – termostat. J – signál detektoru. K – vyhodnocovací program. (38). GC se v praxi ukázala jako velmi spolehlivá a citlivá metoda pro stanovení látek v alkoholických nápojích i lidské tkáni. Výhodami je malý objem nástřiku vzorku, dobré rozlišení píků a vysoká citlivost. Získané meze detekce pro biologické materiály a buněčné kultury jsou pod 0,75 mg/l pro acetaldehyd a pod 0,85 mg/l pro ostatní látky, tedy i methanol (43).
33
Obr. 2.18. Příklad chromatografického záznamu rumu na koloně Rtx®-1301. 1 acetaldehyd, 2 - methanol, 3 - ethanol, 4-13 - vyšší alkoholy a aldehydy (44).
2.5.2 Důkaz oxidací na formaldehyd Stanovení methanolu vedle ethanolu se zakládá na jeho oxidaci na formaldehyd. Ke vzorku se přidá roztok manganistanu draselného a po 10 minutách 5% roztok kyseliny šťavelové ve zředěné kyselině sírové v poměru 1:1. K bezbarvé směsi se přidá Schiffovo činidlo (kyselina fuchsinsiřitá). Pokud je přítomen methanol, objeví se červenofialové zbarvení. Koncentraci lze poté stanovit fotometricky (21,22).
2.5.3 Důkaz převedením na jodid tetramethylamonný Methanol přechází zahřátím s kyselinou jodovodíkovou na methyjodid, který poskytuje s trimethylaminem jodid tetramethylamonný (CH3)4NI, velmi málo rozpustný v bezvodém ethanolu. Jodidy trimethylalkylamonné, vznikající z vyšších alkoholů, se rozpouštějí snadno. Lze dokázat 0,1 % methanolu v 1 ml ethanolu. Sloučeniny obsahující methoxylovou skupinu důkaz ruší, protože přecházejí rovněž na methyljodid (21).
34
2.5.4 Enzymové stanovení methanolu Využití GC není z pohledu klinického stanovování velmi praktické. Téměř v žádné laboratoři není GC využívána v nepřetržitém provozu. Proto se jako výhodnější jeví stanovení metabolitů methanolu, tedy kyseliny mravenčí nebo formaldehydu, pomocí enzymově katalyzovaných reakcí a stanovení pomocí bioanalytických přístrojů (23). 2.5.4.1 Stanovení kyseliny mravenčí Koncem roku 2012 připravil RNDr. Petr Ondráček z firmy Roche během krátké doby pro analyzátor Cobas® 6000 enzymatickou metodu ke stanovení kyseliny mravenčí v séru pacientů. Stanovení využívá kazetu c pack Multi určenou pro metody vyvinuté v laboratoři. Metoda byla otestována na Oddělení klinické biochemie FN Brno a poté zavedena do praxe. Principem stanovení je oxidace kyseliny mravenčí na CO2 pomocí formiátdehydrogenasy za současné redukce NAD+ na NADH, který je stanoven spektometricky při 340 nm. HCOO-+ NAD+ →
𝐹𝑜𝑟𝑚𝑖á𝑡𝑑𝑒ℎ𝑦𝑑𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛𝑎𝑠𝑎
CO2 + NADH
Kvalita metody se ukázala velmi dobrá. Během čtyř měsíců laboratoř FN Brno stanovila kyselinu mravenčí u 90 negativních pacientů (rozsah 0-17 mg/l) a zachytili jeden pozitivní případ (704 mg/l) (23). 2.5.4.2 Stanovení pomocí alkoholoxidasy (EC 1.1.3.13) Alkoholoxidasa (AOX) se krystalizuje z kvasinek pěstovaných na methanolu. Katalyzuje oxidaci krátkořetězcových primárních alkoholů (C1-C6), substituovaných primarních alkoholů (2-chlorethanol, 3-chlor-1-propanol, 4-chlorbutanol, isobutanol) a formaldehydu. Oxidovány nejsou sekundární, terciální, cyklické, aromatické alkoholy a aldehydy (výjimkou je formaldehyd). Gelovou filtrací byla určena molekulová hmotnost purifikovaného eznymu 300 000. Je složen ze 4 podjednotek o hmotnosti 76 000 (měřeno pomocí PAGE). Absorpční maxima jsou 460 a 380 nm. Prosthetická skupina byla indikována jako FAD. Aktivita AOX může být snížena peroxidem vodíku, což je zároveň produkt reakce, sulfhydrylovými činidly, 2-aminoethanolem a síranem měďnatým.
35
CH3OH + O2 → CH2O + O2 →
𝐴𝑙𝑘𝑜ℎ𝑜𝑙𝑜𝑥𝑖𝑑𝑎𝑠𝑎
𝐴𝑙𝑘𝑜ℎ𝑜𝑙𝑜𝑥𝑖𝑑𝑎𝑠𝑎
CH2O + H2O2 mravenčan + H2O2
Proces využívající oxidaci manganistan draselný se v praxi ukázal jako nespolehlivý. Zejména díky kroku zahrnujícím redukci nezreagovaného manganistanu arsenitanem sodným. Reakce katalyzovaná AOX eliminuje redukční krok s arsenitanem a zároveň zvyšuje citlivost stanovení na 1-20 mg/l. Doba procesu byla také snížena na méně než hodinu oproti předchozímu, až 2 hodinovému, trvání. Specifita AOX na nižší primární alkoholy a zanedbatelná produkce chromoforu poskytuje přímý postup pro stanovení methanolu. AOX z bakterie Pichia pastoris byla prokázána jako rychlý a efektivní katalyzátor oxidace methanolu na formaldehyd. Specifická aktivita bývá kolem 40 IU/mg. Bylo zjištěno, že je stejně účinná ve fosfátovém pufru od 0,01-0,25 mol/l. To poskytuje obrovskou flexibilitu v designu analýz pro stanovení (24,25). 2.5.4.3 Formaldehyddehydrogenasa (EC 1.2.1.46) Formaldehyddehydrogenasa (FDH) má molekulovou hmotnost 81 400 a skládá se z 2 podjednotek o hmotnosti 39 500. NAD a NADH chrání a stabilizují enzym během skladování a denaturace vyššími teplotami. Enzym se vyskytuje v lidských, hovězích, drůbežích a krysích játrech. Také v sítnici lidí a zvířat, v droždí a bakterii Pseudomonas methanica. FDH ze všech těchto zdrojů využívá glutathion (GSH) jako kofaktor. Přenos vodíků realizuje vratnou přeměnou thiolové skupiny zbytku cysteinu na disulfid. (26,37). CH2O + NAD+ + H2O →
𝐹𝐷𝐻
HCOOH + NADH + H+
2.5.4.4 Enzym FerB (EC 1.16.1.7) Enzymy využívající flavinové kofaktory (FMN, FAD) jsou unikátní ve schopnosti katalyzovat široké spektrum mechanicky odlišných reakcí jako je dehydrogenace, aktivace kyslíku, halogenace, neredukční konverze, reparace DNA a dalších. Bakteriální flavin dependentní enzym FerB, s aktivitou NAD(P)H:Fe(III) chelát, chromát a chinon oxidoreduktasy, redukuje mnoho sloučenin, zahrnující komplexy železa, chromanu a především chinony. Paracoccus denitrificans, v nichž
36
se enzym FerB nalézá, je běžná půdní bakterie. Sekvenční analýza řadí FerB do rodiny rozpustných flavin chinonreduktas. Samotný enzym je kódován genem Pden 4071 o délce 549 bp a obsahuje 182 aminokyselin. V roztoku existuje jako stabilní dimer o velikosti 55 kDa, složený ze dvou identických podjednotek, kde každá z nich obsahuje jednu molekulu flavinu (FMN). Kinetika redukce chinonových substrátů, jako 1,4-benzochinonu, 1,2-naftochinonu a 1,4-naftochinonu, odpovídá pingpongovému mechanismu. Kompetitivními inhibitory k oxidujícímu se NADH jsou dikumarol a Cibacron 3GA (45-47). 2 Fe(III)-siderofor + NADH →
𝐹𝑒𝑟𝐵
2 Fe(II)-siderofor + NAD+ + H+
37
3 Cíle práce -
Vypracování literární rešerše na dané téma
-
Testování enzymového stanovení methanolu využívající enzymu alkoholoxidasy v přítomnosti ethanolu
38
4 Experimentální část 4.1 Materiál 4.1.1 Přístroje Vortex TK3S
Kartell Labware (Rakousko)
Analytické Váhy Pioneer PA114C
OHAUS Corp. (USA)
Fluorimetr Synergy 2
BioTek Instrument, Inc. (USA)
Pipety
Gilson Company, Inc. (USA)
4.1.2 Vyhodnocovací software Gen5TM, verze 1.01.14
BioTek Instrument, Inc. (USA)
4.1.3 Chemikálie Acetoacetanilid (AAA)
Sigma-Aldrich s.r.o. (USA)
Dimethylsulfoxid (DMSO)
SERVA GmbH (Německo)
Ethanol
PENTA (Česká republika)
Methanol
PENTA (Česká republika)
Octan amonný
Lach-Ner (Česká republika)
4.1.4 Biologický materiál Katalasa (CAT)
Sigma-Aldrich s.r.o. (USA)
AOX z Pichia pastoris
Sigma-Aldrich s.r.o. (USA)
39
4.2 Metody a postupy Použité metody a koncentrace chemikálií vycházely z předběžných výsledků laboratoře vedoucího. Optimalizována byla teplota zahřívání při měření a množství použitého AAA v DMSO.
4.2.1 Příprava sad K měření fluorescence byly připraveny čtyři sady po 13 vzorcích směsí o celkovém objemu reakční směsi 200 µl (objem jamky) v rozmezí koncentrací methanolu 0 až 20 mM. Namíchány byly roztoky látek, které sloužily jako zásobní roztoky. Methanolu o koncentraci 10 mM a 100mM, ethanolu o koncentraci 2M a 10M a 200 mM AAA byl desetkrát zředěn pomocí DMSO, tedy na koncentraci 20 mM. Roztoky byly protřepány na vortexu a uchovávány, aby mohly být použity pro opakované měření. Navážka CAT, která katalyzuje reakci rozkladu peroxidu na kyslík a vodu, byla rozpuštěna ve fosfátovém pufru (pH 7,3) v poměru 10 mg CAT na 1 ml pufru. AOX byla připravena tak, aby výsledná směs měla přibližně 1.3 U/ml. Přehled sad: 1. Methanol + CAT 2. Methanol bez CAT + 10 µl fosfátový pufr 3. Methanol + CAT + 10 µl 2M ethanol (výsl. konc. ethanolu 100 mM) 4. Methanol + CAT + 20 µl 10M ethanol (výsl. konc. ethanolu 1 M) Pipetování do jamek probíhalo v pořadí: 1. Destilovaná voda (objem podle Tab. 4.1) 2. 50 µl 4M octan amonný (výsl. konc. 1 M) 3. 10 µl roztoku CAT (kromě 2. sady) 4. 50 µl 20 mM AAA v DMSO (výsl. konc. 5 mM) 5. Ethanol (pouze 3. sada - 10 µl a 4. sada – 20 µl) 6. Methanol (objem podle Tab. 4.1) 7. 1 µl AOX (0,252 U/jamka)
40
Voda [µl] 1. a 2. sada
3. sada
4. sada
100 mM Methanol [µl]
1
89
79
69
0
Konečná konc. methanolu [mM] 0
2
87
77
67
2 (10 mM)
0,1
3
85
75
65
4 (10 mM)
0,2
4
88,3
78,3
68,3
0,7
0,35
5
88
78
68
1
0,5
6
87,5
77,5
67,5
1,5
0,75
7
87
77
67
2
1
8
86
76
66
3
1,5
9
85
75
65
4
2
10
84
74
64
5
2,5
11
79
69
59
10
5
12
69
59
49
20
10
13
49
39
29
40
20
Pořadí
Tab. 4.1. Příprava reakčních směsí o objemu 200 µl pro měření fluorescence. Při v pořadí 2. a 3. směsi se používal 10mM methanol.
4.2.2 Měření fluorescence Měření fluorescence bylo prováděno na 96 jamkové, neprůhledné destičce přístrojem Synergy 2 a vyhodnocováno programem Gen5TM. Každé měření obsahovalo 13 vzorků o různých koncentracích methanolu (viz kapitola 3.2.1). Reakce probíhala při těchto podmínkách: Počáteční zahřátí přístroje na 30°C, první čtení hodnot fluorescence v čase 0 min při Ex=360 nm, Em=460 nm a citlivosti: 50 %, průběžné zahřívání na 30°C a protřepání nastaveno na medium, čtení hodnot fluorescence po každých 5 min při Ex=360 nm, Em=460 nm a citlivosti: 50 %, celková doba reakce: 80 min.
4.3 Výsledky Cílem dále popsaných experimentů bylo určit, jaký vliv na stanovení methanolu testovanou metodou má přítomnost ethanolu (substrát AOX kompetující s
41
methanolem) resp. katalasy (enzym odstraňující peroxid vodíku produkovaný AOX) Pomocí metody popsané v kapitole 4.2.2 byly naměřeny hodnoty fluorescence v závislosti na koncentraci methanolu ze všech čtyř sad z kapitoly 4.2.1. Příklady zjištěných časových závislostí jsou uvedeny na Obr. 4.2-4.5 14000
0 ul 100 uM
12000 0.2 mM 0.35 mM
Fluorescence [F.U.]
10000
0.5 mM 8000
0.75 mM 1 mM
6000
1.5 mM 4000
2mM 2.5 mM
2000
5 mM 0 0
20
40
Čas [min]
60
80
10 mM 20 mM
Obr. 4.2. Závislost fluorescence v čase 0-80 min reakční směsi methanolu s přídavkem katalasy (1. sada).
42
8000 0 ul 100 uM
7000
0.2 mM
Fluorescence [F.U.]
6000
0.35 mM 0.5 mM
5000
0.75 mM 4000
1 mM 1.5 mM
3000
2mM 2000
2.5 mM 5 mM
1000
10 mM 20 mM
0 0
20
40
60
80
Čas [min]
Obr. 4.3. Závislost fluorescence v čase 0-80 min reakční směsi methanolu s přídavkem katalasy a 20 µl ethanolu o jeho výsledné koncentraci 1 M (4. sada).
14000
0 ul 100 uM
12000
0.2 mM 0.35 mM
Fluorescence [F.U.]
10000
0.5 mM 8000
0.75 mM 1 mM
6000
1.5 mM 2mM
4000
2.5 mM 2000
5 mM 10 mM
0 0
20
40
60
80
20 mM
Čas [min]
Obr. 4.4. Závislost fluorescence v čase 0-80 min reakční směsi methanolu bez přídavku katalasy (2. sada).
43
14000
0 ul 100 uM
12000
0.2 mM 0.35 mM
Fluorescence [F.U.]
10000
0.5 mM 8000
0.75 mM 1 mM
6000
1.5 mM 2mM
4000
2.5 mM 5 mM
2000
10 mM 0
20 mM 0
20
40
60
80
Čas [min]
Obr. 4.5. Závislost fluorescence v čase 0-80 min reakční směsi methanolu s přídavkem katalasy a 10 µl ethanolu o jeho výsledné koncentraci 100 mM (3. sada).
25000 MeOH-CAT 20000
Fluorescence [F.U.]
MeOH+CAT MeOH+CAT+100mM EtOH
15000
MeOH+CAT+1M EtOH 10000
5000
0 0
5
10
15
20
25
MeOH [mM]
Obr. 4.6. Závislost fluorescence na koncentraci methanolu v 80. minutě analýzy.
44
10000 9000
MeOH-CAT
8000
MeOH+CAT
Fluorescence [F.U.]
7000 MeOH+CAT+100mM EtOH
6000
MeOH+CAT+1M EtOH
5000 4000 3000 2000 1000 0 0
0,5
1
1,5
2
2,5
MeOH [mM]
Obr. 4.7. Závislost fluorescence na koncentraci methanolu v 80. minutě analýzy. Výřez nižších hodnot koncentrace methanolu z Obr. 4.6.
Při srovnání naměřených hodnot z Obr. 4.2 a 4.3 je patrné, že fluorescence směsi s 1M ethanolem má výrazně nižší hodnoty. Fluorescence v této analýze byla snížena z původních 12 087 F.U. (1. sada) na 7503 F.U. (4. sada) pro methanol o koncentraci 20 mM v 80. minutě. Pro srovnání jednotlivých měření byly vytvořeny průměry několika pokusů prováděných za stejných podmínek. Z Obr. 4.6 a 4.7 je zřejmé, že největší fluorescenční vlastnosti v 80. minutě vykazuje směs methanolu bez CAT, následuje směs methanolu s CAT a směs methanolu, CAT a 100mM ethanolem. Nejmenší fluorescenci má směs, která obsahuje 1M ethanol. Z těchto dat vyplývá, že přídavek ethanolu výrazně snižuje fluorescenci a má tedy silný inhibiční vliv.
4.4 Diskuze Methanol i ethanol, jako látky strukturně podobné, jsou oba substráty AOX, soutěží o vazebné místo enzymu a vzájemně ovlivňují své přeměny jako kompetitivní inhibitory. V přítomnosti velkého nadbytku ethanolu je oxidace methanolu pomocí AOX silně potlačena. Naše výsledky ukazují, že i za těchto podmínek lze stanovení methanolu provést, pokud je následná fluorogenní neenzymová reakce dostatečně
45
selektivní pro formaldehyd (produkt oxidace methanolu) oproti acetaldehydu (produkt oxidace ethanolu). Tuto podmínku použité činidlo AAA splňuje. Ze zjištěných časových průběhů fluorescence je vidět, že samotný ethanol odezvu neposkytuje. Snižuje sice odezvu methanolu, ale pouze tehdy, je-li přítomen ve výrazném (přibližně tisícinásobném) molárním přebytku. Toxické hladiny methanolu v alkoholických nápojích odpovídají molárním poměrům ethanol/methanol podstatně nižším a rizikovost nápoje lze tímto způsobem snadno detegovat. Zjistili jsme rovněž, že přidání CAT odezvu methanolu nezvyšuje. Lze proto soudit, že hromadění peroxidu vodíku neovlivňuje aktivitu enzymu ani rychlost vzniku fluorescenčního produktu.
46
5 Závěr Teoretická část bakalářské práce pojednává o methanolu, jeho toxicitě, chemických a fyzikálních vlastnostech, výskytu a tvorbě v přírodě a evropské legislativě, která určuju maximální přípustné limity methanolu v alkoholických nápojích. V experimentální části bakalářské práce jsme zkoumali inhibiční vliv ethanolu na fluorimetrické stanovení methanolu využívající enzymu alkoholoxidasy. Na základě předběžných výsledků z laboratoře vedoucího jsme vybrali nejvhodnější stupnici koncentrací. Ukázalo se, že až přibližně tisícinásobný molární nadbytek ethanolu způsobuje výraznou inhibici reakce a tudíž i snížení fluorescence.
47
6 Seznam použité literatury 1. VACÍK, Jiří. Přehled středoškolské chemie. 3. dopl. vyd., v SPN-pedag. nakl. 1. vyd. Praha: SPN - pedagogické nakladatelství, 1995, 365 s. ISBN 8085937-08-5. 2. PELCLOVÁ, Daniela. Nejčastější otravy a jejich terapie. 2., dopl. a rozš. vyd. Praha: Galén, c2009, 163 s. ISBN 978-80-7262-603-8. 3. ČERVINKA, Otakar. Chemie organických sloučenin. 1. vyd. Praha: Státní nakladatelství technické literatury, 1985-1987, 2 sv., 1131 s. 4. VEČEŘA, Miroslav. Chemické tabulky organických sloučenin. 1. vyd. Praha: Státní nakladatelství technické literatury, 1975, 887 s. 5. RABINOVIČ, Viniamin Abramovič a Zacharij Jakovlevič CHAVIN. Stručná chemická příručka. 1. vyd. Praha: Státní nakladatelství technické literatury, 1985, 476 s. 6. Bezpečnostní list (online). (cit. 2015-01-08). Dostupný z WWW: http://www.makofoto.cz/ceniky/bezpecnostni_list_eclipse.pdf 7. KIZLINK, Juraj. Technologie chemických látek I.: chemický průmysl, koroze, konstrukční maeriály, technické plyny, anorganické a organické produkty, dřevo, zpracování uhlí, úprava paliv. 2. vyd. Brno: VUTIUM, 2001, 208 s. ISBN 80-214-1875-3. 8. MELZOCH, Karel, Mojmír RYCHTERA, Jan E DYR a Josef DYR. Výroba slivovice a jiných pálenek. 4. dopl. vyd. Praha: Maxdorf, 1999, 219 s. ISBN 8085800-80-2. 9. SCHMICKEL, Helge a Bettina MALLE. Domácí výroba lihovin. Vyd. 2., rev. Praha: Beta, 2010, 159 s., [4] s. barev. obr. příl. ISBN 978-80-7306-430-3. 10. LINHART, Igor. Toxikologie: interakce škodlivých látek s živými organismy, jejich mechanismy, projevy a důsledky. 2., upr. a rozš. vyd. Praha: Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, 2014, 410 s. ISBN 978-80-7080-877-1. 11. SCHMID, George H. Organic chemistry. St. Louis: Mosby-Year Book, 1996, xxvi, 1208 s., [36] s. příloh. ISBN 0-8016-7490-5. 12. HIRT, Miroslav. Toxikologie a jiné laboratorní metody ve forenzní praxi. 1. vyd. Brno: Masarykova univerzita, 2011, 51 s. ISBN 978-80-210-5477-6. 13. MAČÁK, Jiří a Jana MAČÁKOVÁ. Patologie. Vyd. 1. Praha: Grada, 2004, 347 s., 24 s. barev. obr. příl. ISBN 80-247-0785-3. 14. SILBERNAGL, Stefan a Florian LANG. Atlas patofyziologie. 2. české vyd.
48
Praha: Grada, 2012, x, 406 s. ISBN 978-80-247-3555-9. 15. PELCLOVÁ, Daniela. Nemoci z povolání a intoxikace. 3., dopl. vyd. Praha: Karolinum, 2014, 316 s. ISBN 978-80-246-2597-3. 16. WEISSERMEL, Klaus a Hans-Jürgen ARPE. Průmyslová organická chemie: důležité suroviny a meziprodukty. 1. vyd. Praha: Státní nakladatelství technické literatury, 1984, 419 s. 17. WITTCOFF, Harold, B REUBEN a Jeffrey S PLOTKIN. Industrial organic chemicals. 3rd ed. Hoboken: Wiley, c2013, xxxvi, 807 s. ISBN 978-0-47053743-5. 18. LÜLLMANN, Heinz, Klaus MOHR a Martin WEHLING. Farmakologie a toxikologie. Vyd. 1. české. Praha: Grada, c2002, 694 s. ISBN 80-7169-976-4. 19. Nařízení Evropského parlamentu a rady (ES) č. 110/2008 ze dne 15.1.2008 o definici, popisu, obchodní úpravě, označování a ochraně zeměpisných označení lihovin a o zrušení nařízení rady (EHS) č. 1576/89 (Úř. věst. L 39/16, 13.2.2008,) (online). (cit. 2015-01-06). Dostupný z WWW: http://eurlex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2008:039:0016:0054:CS:P DF 20. Na otravu metanolem se umírá hlavně v Indii, evropským rekordmanem je Estonsko (online). (cit. 2015-06-02). Dostupné z WWW: http://www.novinky.cz/zahranicni/svet/278473-na-otravu-metanolem-se-umirahlavne-v-indii-evropskym-rekordmanem-je-estonsko.html 21. ŠEDIVEC, Václav a Jan FLEK. Příručka analýzy organických rozpouštědel. 1. vyd. Praha: Státní nakladatelství technické literatury, 1968, 386 s. 22. ABSOLÍNOVÁ, Helena. Organická chemie: (cvičení). 2., nezměn. vyd. Brno: Mendelova univerzita v Brně, 2010, 46 s. ISBN 978-80-7375-374-0. 23. BEŇOVSKÁ, Miloslava, Ondřej WIEWIORKA a Jana TŮMOVÁ. Intoxikace metanolem a zkušenosti se stanovením jeho metabolitu – kyseliny mravenčí. Labor aktuell. 2013, č. 1, s. 8-11. 24. KLAVONS, Jerome A., Raymond D. BENNETT. Determination of methanol using alcohol oxidase and its application to methyl ester content of pectins. J. Agric. Food Chem., 1986, č.34 (4), s. 597–599. 25. PATEL, Ramesh N., C.T. HOU, A. I. LASKIN, P. DERELANKO. Microbial oxidation of methanol: Properties of crystallized alcohol oxidase from a yeast, Pichia sp. Archives of Biochemistry and Biophysics. 1981. č. 210 (2). s 481488. 26. UOTILA, Lasse. Martti KOIVUSALO. Formaldehyd dehydrogenase from human liver. Purification, proerties, and evidence for the formation of
49
glutathione thiol esters by the eznyme. The journal of biological chemistry. 1974. č. 249(23). s. 7653-7663. 27. CHENG, Wu-Hsun a Harold H KUNG. Methanol production and use. New York: M. Dekker, 1994, 329 s., ISBN 08-247-9223-8. 28. Methanol. The Essential Chemical Industry. (online) 6.4.2014 (cit. 2015-0420). Dostupné z WWW: http://www.essentialchemicalindustry.org/chemicals/methanol.html 29. PAINE, A.J. a A.D. DAYAN. Defining a tolerable concentration of methanol in alcoholic drinks. Human. 2001, vol. 20, issue 11, pp. 80-80. 30. KADLEC, Pavel, Karel MELZOCH a Michal VOLDŘICH. Co byste měli vědět o výrobě potravin?: technologie potravin. Vyd. 1. Ostrava: Key Publishing, 2009, 536 s. Monografie (Key Publishing). ISBN 978-80-7418-051-4. 31. VELÍŠEK, Jan. Chemie potravin I. Vyd. 3. upr. Tábor: OSSIS, 2009, xii, 602 s. ISBN 978-80-86659-15-2. 32. AMODARAN, Srinivasan, Kirk PARKIN a Owen R FENNEMA. Fennema's food chemistry. 4th ed. Boca Raton: CRC Press/Taylor, c2008, 1144 p. ISBN 08-493-9272-1. 33. DOSTÁL, Jiří. Biochemie: pro posluchače bakalářských oborů. 1. vyd. Brno: Masarykova univerzita, 2009, 158 s. ISBN 978-80-210-5020-4. 34. KALOUSOVÁ, Marta. Patobiochemie ve schématech. 1. vyd. Praha: Grada, 2006, 264 s. ISBN 8024715228 35. SHARMA, Ranjana, Sanjay MARASINI, Ananda Kumar SHARMA, Jeevan Kumar SHRESTHA a Bhagvat Prasad NEPAL. Methanol Poisoning: Ocular and Neurological Manifestations. Optometry and Vision Science. 2012, vol. 89, issue 2, pp. 178-182. 36. Informace k antidotu Fomepizol EUSA Pharma (online). (cit. 2015-02-12). Dostupný z WWW: http://www.tis-cz.cz/images/stories/PDFs/Fomepizolindikace-davky-dle-dr-Hovdy.pdf 37. VODRÁŽKA, Zdeněk, Jan KÁŠ a Pavel RAUCH. Enzymologie. 3. přeprac. vyd. Praha: VŠCHT, 1998, 171 s. ISBN 80-708-0330-4. 38. KLOUDA, Pavel. Moderní analytické metody: Učebnice základů instrumentálních analytických metod. 2., upr. a dopl. vyd. Ostrava: Pavel Klouda, 2003, 132 s. ISBN 80-863-6907-2.
50
39. LACHENMEIER, Dirk W., Kerstin SCHOEBERL, Fotis KANTERES, Thomas KUBALLA, Eva-Maria SOHNIUS a Jürgen REHM. Is contaminated unrecorded alcohol a health problem in the European Union? A review of existing and methodological outline for future studies. Addiction. 2011, vol. 106, pp. 20-30. 40. LACHENMEIER, Dirk W., J. LEITZ, Kerstin SCHOEBERL, Thomas KUBALLA, I. STRAUB a Jurgen REHM. Quality of illegally and informally produced alcohol in Europe: Results from the AMPHORA project. Adicciones. 2011, vol. 23(2), pp.133-40. 41. BALÍKOVÁ, Marie. Forenzní a klinická toxikologie: laboratorní toxikologická vyšetření. 1. vyd. Praha: Galén, 2004, 140 s. ISBN 978-807-2622-849. 42. MATRKA, Miroslav a Vlastimil RUSEK. Průmyslová toxikologie: úvod do obecné a speciální toxikologie. 1. vyd. Pardubice: Vysoká škola chemickotechnologická, 1991, 157 s. ISBN 80-851-1335-6. 43. PONTES, H., P. Guedes de PINHO, S. CASAL, H. CARMO, A. SANTOS, T. MAGALHAES, F. REMIAO, F. CARVALHO a M. L. BASTOS. GC Determination of Acetone, Acetaldehyde, Ethanol, and Methanol in Biological Matrices and Cell Culture. Journal of Chromatographic Science. 2009, vol. 47, issue 4, pp. 272-278. 44. Restek Chromatography Products and Solutions. Restek. [online]. [cit. 201504-18]. Dostupné z WWW: http://www.restek.com/chromatogram/view/GC_FF00110/64-17-5 45. KLUMPLER, Tomáš, Vojtěch SEDLÁČEK, Jaromír MAREK, Michaela WIMMEROVÁ a Igor KUČERA. Crystallization and initial X-ray diffraction studies of the flavoenzyme NAD(P)H. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 2010, vol. 66, issue 4. 46. SEDLÁČEK, Vojtěch, Rob J.M. van SPANNING a Igor KUČERA. Characterization of the quinone reductase activity of the ferric reductase B protein from Paracoccus denitrificans. Archives of Biochemistry and Biophysics. 2009, vol. 483, issue 1, pp. 29-36. 47. MAZOCH, Jiří, Radek TESAŘÍK, Vojtěch SEDLÁČEK, Igor KUČERA a Jaroslav TURÁNEK. Isolation and biochemical characterization of two soluble iron(III) reductases from Paracoccus denitrificans. European Journal of Biochemistry. 2004, vol. 271, issue 3, pp. 553-562.
51
