„Az élettudományi-klinikai felsőoktatás gyakorlatorientált és hallgatóbarát korszerűsítése a vidéki képzőhelyek nemzetközi versenyképességének erősítésére” TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
ELLENANYAGOK ÉS SZÁRMAZÉKAIK 9. előadás PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR GYÓGYSZERÉSZI BIOTECHNOLÓGIA TANSZÉK
ANTIGÉN
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
MI AZ ANTIGÉN?
Az az anyag, ami immunválaszt indukál és ellenanyagtermelést indít meg Az epitóp az antigén determináns Az ellenanyag lehet fehérje, szénhidrát vagy egyéb természetű Antigén: haptén (5-10 kD >) – carrier natív vagy módosított molekulák, sejtek
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
AZ ANTIGÉN KLÓNOZÁSA
Plazmid DNS
Beillesztett DNS
A plazmid DNS szekvencia felnyitása endonukleázzal
A plazmid a baktériumban felszaporodik
Baktérium kolóniák
A DNS szekvencia beillesztése, ligálása
Baktériumban transzformálás
Számos DNS kópia
Fehérjetermelés és tisztítás immunizáláshoz
IMMUNIZÁLÁS
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
AZ ANTIGÉN ADMINISZTRÁLÁSI MÓDJÁNAK KIVÁLASZTÁSA
Intraperitoneális (hasba) Intravénás (vénás érbe) Intramuszkuláris (izomba) Szubkután (bőr alá) Intrakután (bőrbe) Per os (szájon át)
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
ADJUVÁNSOK
Az adjuvánsok lassítják az antigén felszívódását és az immunrendszer nem specifikus stimulációja révén fokozzák az ellenanyag termelést. Leggyakoribb típusaik: Ásványolaj-alapú, inkomplett adjuvánsok (pl.: inkomplett Freund) Komplett Freund: ásványolaj keverékben szuszpendált, hővel elölt Mycobacterium tuberculosis Aluminium-hidroxid gél Muramil-dipeptid (Mycobacterium tbc.) Bakt. vakcinák egyidejű adása fokozza az immunogénekkel szembeni antitest termelést. Pl.: Bordetella pertussis Liposzóma
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
AZ ELLENANYAG TÍPUSÁHOZ A TERMELŐ ÉLŐLÉNY KIVÁLASZTÁSA IS SZÜKSÉGES
Monoklonális antitesthez: – egér – hörcsög vagy – patkány Poliklonális antitest (leggyakoribbak): – nyúl – birka – kecske, stb.
POLIKLONÁLIS ELLENANYAG
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
POLIKLONÁLIS ELLENANYAG I.
Egy antigén felületén számos epitóp, azaz antigén determináns található, amely immunválasz kiváltására képes Az antigén determinánsok ellen egyenként egyegy B-sejt kezd el ellenanyagot termelni Az élő szervezetben egy antigén ellen az ellenanyagok keveréke található, amely számos B-sejtből, B-sejtek sok klónjából származik
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
POLIKLONÁLIS ELLENANYAG II.
több, eltérő specificitású ellenanyag keveréke több B-sejt klón termékei egy adott antigén eltérő epitópjait ismerik fel
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
POLIKLONÁLIS ELLENANYAG III.
Antigén
Epitóp 3.
Epitóp 1. Epitóp 2.
B-sejt 1.
B-sejt 2.
B-sejt 3.
MONOKLONÁLIS ELLENANYAGOK
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
MONOKLONÁLIS ELLENANYAG
Egyetlen B-sejtből származó sejtvonal (sejtklón) termeli Egyetlen epitóp felismerésére képesek
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
HOGYAN LEHETSÉGES A MONOKLÓN ELŐÁLLÍTÁSA?
A normál immunválasz poliklonális, azaz több Bsejtből származó sejtvonal (sejtklón) termeli, amely klónok mind más epitópot ismernek fel. Egyetlen epitóp (epitóp 1) felismerésére képes B-sejteket ki kell válogatni a más epitópot (epitóp 2, 3, 4, stb) felismerő B-sejtek közül.
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
HIBRIDÓMA TECHNIKA
Kiválasztott antigénnel aktivált immunsejtek (plazmasejtek) Tumorsejtek Aktivált B/plazma-sejtek és tumorsejtek in vitro fúziója A korlátozott osztódási képességű, de specifikus ellenanyagot termelő sejt korlátlan ideig fenntartható in vitro
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
HIBRIDÓMA TECHNIKA
Myeloma sejt
Plazmasejt
Ellenanyag termelés
Korlátlan osztódás
Hybridoma sejt
Korlátlan osztódás és ellenanyag termelés
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
MONOKLONÁLIS ELLENANYAG Az egér immunizálása Z ellenanyaggal
Mutáns egér myeloma sejtek (nem képesek HAT médiumban növekedni)
Egér lép sejtek keveréke; Egyes sejtek ( ) ellenanyagot termelnek az antigén epitópjai (Z2, Z3) ellen Z3
A sejtek összekeverése és fúzionáltatása
A
HAT médiumban tenyésztés A nem fúzionált sejtek ( elpusztulnak A fúzionált sejtek ( osztódnak
A sejteket egyenként (!), tenyésztjük tovább
Z3
A A
A
A
Z2
Z3
A Z3
A Z3 Z2
) )
Az ellenanyagtermelést (minőség, mennyiség, specificitás) egyenként teszteljük
ELLENANYAGOK TISZTÍTÁSA
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
OSZLOP KROMATOGRÁFIA Az oldószert folyamatosan adagoljuk az oszlopra egy megfelelő méretű tartályból
Minta
Idő
A szétválasztott molekulák frakcióit eluáljuk és összegyűjtjük
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
ION-CSERÉLŐ KROMATOGRÁFIA Oldószer áramlás
Pozitívan töltött gyöngyök
Gyöngyhöz kötődő negatív töltésű molekula
Szabadon áramló pozitívan töltött molekulák
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
GÉL SZŰRÉSES KROMATOGRÁFIA Oldószer áramlás
Lyukacsos gyöngyök
Lelassított kismolekulák
Gyorsan átfolyó nagymolekulák
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA Oldószer áramlás
Gyöngyök, melyekhez kovalens kötéssel kapcsolt szubsztrát található
Szubsztráthoz kötődött enzim molekula
A szubsztrátra nem specifikus fehérjék átfolynak az oszlopon
FLUORESZCENSEN VAGY ENZIMATIKUSAN JELZETT ELLENANYAGOK
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
ELLENANYAG KONJUGÁLÁSA
Fluroeszcens festék – pl.: FITC (zöld) Enzim – pl.: HRPO Biotin Radioaktív sugárzók Toxin (pl ricin)
TERÁPIÁS ELLENANYAGOK
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
TERÁPIÁS, ENGEDÉLYEZETT ELLENANYAGOK Termék neve
Specificitása
Típusa
Alkalmazási terület
Év
Orthoclone OKT3
CD3
egér
Transzplantátum rejekció
1986
ReoPro
GpIIb/gpIIa
kiméra Fab
Kardiovaszkuláris betegségek
1994
Rituxan (mabthera)
CD20
kiméra
Non-Hodgkin lymphoma
1997
Zenapax
CD25
humanizált
Transzplantátum rejekció
1997
Remicade
TNFα
kiméra
Crohn betegség, rheumatoid arthritis
1998
Simulect
CD25
kiméra
Transzplantátum rejekció
1998
Synagis
RSV
humanizált
Respiratorikus synctitium vírusfertőzés
1998
Herceptin
Her-2
humanizált
Metasztatikus emlőrák
1998
Mylotarg
CD33
humanizált
Akut myeloid leukémia (AML)
2000
Campath
CD52
huamnizált
B sejtes krónikus limfoid leukémia (B-CLL)
2001
Zevalin
CD20
egér
B sejtes non-Hodgkin-lymphoma
2002
Erbitux
EGFR
kiméra
Colorectális carcinoma (EGFR+ tumorok?)
2004
Avastin
VEGF
humanizált
Colorectális carcinoma
2004
Tysabri
α4β1/7 integrin
humanizált
Sclerosis multiplex
2004
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
KIMÉRA ANTITESTEK
A kiválasztott rágcsáló monoklonális antitest Fv régióját kódoló gének hozzákapcsolása humán antitest Fc régióját kódoló génhez A kiméra antitestek kb. 75%-a emberi fehérje Az antigén specificitása azonos az eredeti rágcsáló antitestével Az in vivo féléletideje és az effektor funkciói az emberi antitestével azonosak DE: Immunugének!
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
HUMANIZÁLT ANTITESTEK
A kiválasztott rágcsáló monoklonális antitestjének CDR régiója humán antitest génbe klónozva A humanizált antitestek > 90%-a emberi Az antigén specificitása azonos az eredeti rágcsáló antitestével Az in vivo féléletideje és az effektor funkciói az emberi antitestével azonosak
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
AZ ELLENANYAGOK ELNEVEZÉSE
mab xi zu li tu ci u o
Monoklonális antitest Kiméra antitest Humanizált antitest Immunomoduláns antitest Tumor ellenes antitest Kardiovaszkuláris betegségben használható antitest Humán Rágcsáló
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET
JELEN MUNKA AZ EURÓPAI UNIÓ TÁMOGATÁSÁVAL, AZ EURÓPAI SZOCIÁLIS ALAP TÁRSFINANSZÍROZÁSÁVAL VALÓSUL MEG, „AZ ÉLETTUDOMÁNYI-KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE” CÍMŰ, TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 AZONOSÍTÓSZÁMÚ PROJEKT KERETÉBEN.
