Élelmiszer eredetű antioxidánsok hatása primer és szekunder prevencióban: Állatkísérletes és humán tanulmányok
Doktori értekezés
Készítette:
dr. Lugasi Andrea (Munkahely: Fodor József Országos Közegészségügyi Központ Országos Élelmezés- és Táplálkozástudományi Intézete)
Programvezető: Prof. Dr. Fehér János Témavezető: Dr. Blázovics Anna
Készült a Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kar 7. Ph.D. programjában
2001
Tartalomjegyzék Oldalszám Tartalomjegyzék……………………………………………….……………………………….………..2 Köszönetnyilvánítás……………………………………………….………………………….……….…5 Rövidítésjegyzék………………………………………………….…………………….…….………......7 Összefoglalás…………………………………………………….…………………………….……….…8 Summary……………………………………………………………………………………….…………9 1. Bevezetés…………………………………………………………………… .………… 10 2. Irodalmi áttekintés…………………………………………………………….…………12 2.1. Az étrendi flavonoidok egészségvédő hatása…………..…………………….…………..12 2.1.1. A flavonoidok kémiai szerkezete…………………………………………….…………...12 2.1.2. Élelmiszereink flavonoidtartalma…………………………..…………...…..……………14 2.1.3. Étrendi bevitel…………………………………………………………….………………15 2.1.4. A tápanyagkomponensek és a flavonoidok közötti kölcsönhatások….……..……………16 2.2. A flavonoidok biokémiai tulajdonságai…………………………………..………………17 2.2.1. A flavonoidok metabolizmusa…………………………………………....………………17 2.2.2. A flavonoidok mint antioxidánsok……………………………………….………….……19 2.2.3. A flavonoidok toxicitása, mutagenitása……………………......................….………...…23 2.3. Flavonoidok a gyógyításban……………………………………………...….….………..24 2.3.1. Antimutagén és antikarcinogén hatás…………………………………….….……………24 2.3.2. Szív- és érrendszeri betegségek……………………………………………….…………..25 2.3.3. Egyéb hatások……………………………………………….....................………………26 2.3.4. Epidemiológiai tanulmányok……………………………………………………………..27 2.4. A vörösbor egészségvédő hatása………………………………………………………….27 2.5. A fekete retek……………………………………………………………..………………33 2.5.1. A szabad gyökös reakciók és az epekő betegség közötti kapcsolat……....………………33 2.5.2. Epepanaszok csökkentése növényi hatóanyagokkal……………….........………………..34 2.5.3. A fekete retek jellemzői…………………………….……………………..…………...…35 2.5.4. A fekete retek bioaktív hatóanyagai………………………………………………………36 3. Célkitűzések, a téma indoklása…………………………………………………………40 4. Anyagok és módszerek……………………………………………….....……………….43 4.1. Kémia regensek…………………………………………………………...………………43 4.2. Antioxidáns hatású anyagok…………………………………………….………………...44 4.2.1. Fekete retek préslé……………………………………………………......……………….….44 4.2.2. Raphacol epegranulátum…………………………………………………………………44 4.2.3. Vörös- és fehérborok, szőlőlevek…… ………………………………….……………….44 4.3. Összetételi adatok meghatározása………………………………………………………...45 4.3.1. Tápanyagkomponensek…………………………………………………..…………..…...45 4.3.1.1. Szárazanyag, fehérje, zsír, szénhidrát, cukrok……………………………………………45 4.3.1.2. Makro- és mikroelemek………………………………………………….……………….45 4.3.2. Bioaktív vegyületek…………………………………………………….…………………45 4.3.2.1. Glükozinolátok……………………………………………………………………….…...45 4.3.2.2. Összes polifenoltartalom………………………………………………………………….46
2
4.3.2.3. 4.3.2.4. 4.3.2.5. 4.3.2.6. 4.4. 4.4.1. 4.4.2. 4.4.3. 4.4.4. 4.4.5. 4.4.6. 4.4.7. 4.4.8. 4.4.9. 4.5. 4.5.1. 4.5.2. 4.6. 4.6.1. 4.6.2. 4.6.3. 4.6.4. 4.7. 4.7.1. 4.7.2. 4.7.2.1. 4.7.2.2. 4.7.2.3. 4.7.2.4. 4.7.2.5. 4.7.2.6. 4.7.2.7. 4.7.2.8. 4.7.2.9. 4.7.2.10. 4.7.3. 4.7.3.1. 4.7.3.2.
Flavonoidösszetétel………………………………………………………………………47 Aszkorbinsav………………………………………………………….....……………….47 Karotin……………………………………………………………………………….……47 Tokoferol…………………………………………………………...……………………..47 In vitro módszerek…………………………………………….........…....…………..……47 Hidrogén-donor aktivitás………………………………………………………….………47 Redukálóképesség………………………………………………………………………...48 Komplexképző aktivitás…………………………………………….……………….……48 Scavenger aktivitás H2O2/·OH-luminol-mikroperoxidáz rendszerben……………………49 Citokróm c redukciójának gátlása………………………………………………………...49 Adrenalin/adrenochrom átalakulás gátlása (SOD-like aktivitás)………...……………….49 Totál antioxidáns státusz………………………………………………....……………….49 A linolsav autoxidációjának gátlása ……………………………..……………………….50 Enzimatikus úton kiváltott lipidperoxidáció máj mikroszóma frakcióban………………………………………………………...............…………….…….50 In vivo vizsgálatok………………………………………………………………………50 Állatkísérletek…...………………………………………………………………………50 Humán vizsgálatok……………………………………………………….………………51 Szubcelluláris partikulumok preparálása és egyéb biológiai minták előkészítése……………………………………………………...……………………….…...52 Májhomogenizátum készítése…………............………………………….………………52 Mikroszóma izolálása patkány májból………………………………..………………….52 Citoszol készítése patkány májból………………………………………..………………52 Szérum, plazma és eritrocita hemolizátum készítése…………………….……………….52 Biokémiai vizsgálatok…………………………………………………………………….53 Szérum paraméterek……………………………………………………...……………….53 Lipid komponensek és lipidperoxidációs jellemzők…………………………………...…53 Zsírsavösszetétel patkány májban………………………………………………………...53 Zsírés koleszterintartalom, oxidált koleszterin származékok patkány májban………………………………………………………….……........………………53 A-és E-vitamin patkány szérumban………………………………………………….…...54 Konjugált diének patkány májban………………………………………………….……..54 Konjugált diének patkány szérumban…………………………………….………………55 Tiobarbitursav reaktív anyagok patkány májban…………………………………………55 Tiobarbitursav reaktív anyagok humán és patkány zérumban…………………………………………………..……………………….……55 Szabad szulfhidril-csoportok…………………………………..................……….……..55 Biológiai minták scavenger aktivitása H2O2/·OH-luminol-mikroperoxidáz rendszerben...........................................................................................……………....….56 Enzimatikusan kiváltott lipidperoxidáció máj mikroszóma frakcióban...…………………………………………………………..…………….…….56 Enzimaktivitások meghatározása.…………………………………….......………………56 Kataláz………………………………………………………………........………….……56 Glutation-peroxidáz…………………………………………………........……………….56
3
4.7.3.3. 4.7.4.
Glutation-S-transzferáz……………………………………………...........………………57 A máj mikroszomális kevert funkciójú oxidáló enzimrendszere.................…………………………………………................…………..57 4.7.4.1. Citokróm P450 tartalom………………………………………….............……………….57 4.7.4.2. Citokróm b5 tartalom……………………………………………..............………………57 4.7.4.3. Citokróm c reduktáz aktivitása…………………………………...............……………….57 4.7.4.4. Ferricianid reduktáz aktivitása…………………………………………....………………57 4.7.5. Egyéb meghatározások…………………………………………………...……………….58 4.7.5.1. Biológiai minták fehérjetartalma………………………………………....……………….58 4.7.5.2. Vörösvérsejt hemolizátum hemoglobin tartalma…………………………………………58 4.8. Statisztikai analízis………………………………………………….........……………….58 5. Eredmények…..........………………………………………………….....……..….…….59 5.1. Az in vitro vizsgálatok eredményei…....………………………………………………….59 5.1.1. A fekete retek préslé……………………....................……………….…………………...59 5.1.1.1. A fekete retek préslé tápanyagösszetétele és bioaktív vegyületei…....………………………………………………………………………..…..59 5.1.1.2. A fekete retek préslé antioxidáns tulajdonságai…………………….......…………….…..63 5.1.2. Vörös- és fehérborok, szőlőlevek ………….………………………......…………………69 5.1.2.1. Borok és szőlőlevek polifenoltartalma………………….........................………………...69 5.1.2.2. Borok és szőlőlevek antioxidáns tulajdonságai………….........................………………..71 5.2. A fekete retek préslé hatása alimentáris hiperlipidémiában patkányokon…………….….81 5.2.1. Szérum paraméterek……………………………………………………...….……………81 5.2.2. A lipidperoxidáció és az antioxidáns védelem a szérumban, plazmában, eritrocitában …86 5.2.3. Lipidperoxidáció és antioxidáns védelem a májban…………………………………...…93 5.2.4. A fekete retek préslé hatása a máj mikroszomális kevert funkciójú oxidáz enzimrendszerére................................................................................…………………..100 5.3. A Raphacol epegranulátum hatása humán vizsgálatban...........................………………103 5.3.1. Szérum paraméterek……………………………………………………...………….…..103 5.3.2. Lipidperoxidációs mutatók………………………………………………………………109 6. Összefoglalás, az eredmények értékelése…………………………….……………….116 6.1. In vitro vizsgálatok………………………………………………..........……………….116 6.1.1. A fekete retek préslé…………………………………………………………………….116 6.1.2. Vörös- és fehérborok, szőlőlevek……………………………………………………….118 6.2. In vivo állatkísérletek……………………………………………………………………120 6.3. In vivo humán vizsgálatok……………………………………………………………….123 7. Hivatkozások …………………………………………………………………………...129 Publikációk listája
4
Köszönetnyilvánítás Ez az értekezés a Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kar 7. Ph.D. programjának keretében készült. A program vezetője prof. Dr. Fehér János, az orvostudomány doktora, akinek hasznos tanácsai, tudományos útmutatásai nélkül munkám nem készülhetett volna el. A dolgozat elkészültében témavezetőmnek Dr. Blázovics Annának, az orvostudomány kandidátusának, a Semmelweis
Egyetem
II.
Belgyógyászati
Klinika
Biokémiai
Kutatócsoportja
vezetőjének
felbecsülhetetlen érdemei vannak. Ötleteivel, hasznos tanácsaival, kitartó munkabírásával sok éve segíti munkámat, egyengeti tudományos életemet. Segítségéért, őszinte barátságáért hálás köszönet illeti. Köszönetemet fejezem ki az Országos Élelmezés- és Táplálkozástudományi Intézet korábbi és jelenlegi vezetőinek, prof. Dr. Bíró Györgynek, az orvostudomány doktorának, valamint Dr. Novotny Tibornak és Dr. Rodler Imrének, hogy lehetővé tették számomra a dolgozat elkészítését. Őszinte hálával tartozom prof. Dr. Dworschák Ernőnek, a kémiatudomány doktorának, aki oly hirtelen és oly hatalmas űrt maga után hagyva távozott közülünk. Rendíthetetlen türelemével, mérhetetlen kitartásával és tudásával irányította tudományos munkámat, értékes tanácsaival és támogatásával elősegítette dolgozatom elkészítését. Köszönet illeti az Országos Élelmezés- és Táplálkozástudományi Intézet Élelmiszerkémiai Analitikai Főosztály vezetőjét, Dr. Gaál Ödönt, a biológia tudomány kandidátusát a vizsgálataimhoz szükséges feltételek biztosításáért. Továbbá hálával tartozom Dr. Barna Évának (Ph.D.), a Fehérje és Vitamin Osztály vezetőjének, hogy türelemmel és megértéssel viselte azokat az időszakokat, mikor munkaidőm nagy részében a dolgozattal kapcsolatos munkákat végeztem. Őszinte köszönetemet fejezem ki Dr. Antal Magdának, az orvostudomány kandidátusának, az OÉTI Táplálkozásegészségügyi Főosztálya vezetőjének a folyamatos és segítőkész támogatásért, valamint munkatársainak, többek között Dr. Bíró Lajosnak, akik a TAS vizsgálatok, és a vitamin-meghatározások kivitelezésében segítséget nyújtottak. Köszönöm az OÉTI Állatháza munkatársainak, az állatkísérletek során tapasztalt lelkiismeretes munkáját. Köszönetet mondok mindazon kollégáknak, akik a kísérletek megtervezésében és kivitelezésében elméleti és gyakorlati segítséget nyújtottak: a Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kar II. Belgyógyászati Klinika adjunktusának, Dr. Somogyi Anikónak a humán vizsgálatok során nyújtott baráti segítségéért; a SE Gyógyszerésztudományi Kar Gyógynövény és Drogismereti Intézete docensének, Dr. Kéry Ágnesnek a vizsgálatok során felhasznált fekete retek présléért, valamint a kísérletek megtervezése során adott hasznos javaslataiért; Dr. Horváth Tünde főorvosnak és Dr. Kassai-Farkas Sándor főorvosnak, a Komárom Esztergom Megyei Szent Borbála Kórház I. Belgyógyászati Osztály orvosainak a humán vizsgálatok megszervezésében nyújtott segítségükért, valamint a vizsgálatokba bevont betegek lelkiismeretes gondozásáért; Dr. Fehér Erzsébetnek a SE Anatómiai, Szövet- és Fejlődéstani Intézete
5
professzorának a szövettani vizsgálatokkal kapcsolatos hasznos tanácsaiért, valamint Dr. Kovács Ágota főorvosnak a kemiluminometriás humán vizsgálatok során biztosított támogatásáért. Hálával tartozom az Országos Élelmezés- és Táplálkozástudományi Intézet Élelmiszerkémiai Analitikai Főosztálya valamennyi munkatársának támogatásukért, türelmükért és megértésükért. Külön köszönet illeti Ternóczky Miklósnét, Hóvári Juditot, Berta Jenőnét, Neszlényi Kálmánt, Kertészné dr. Lebovics Verát (Ph.D.), Mezei Évát és Menyhárt Imrénét áldozatos munkájukért és a vizsgálatok kivitelezésében nyújtott értékes segítségükért. Köszönet illeti Dr. Szentmihályi Klárát (Ph.D.), az MTA Kémiai Kutatóintézetének munkatársát az ICPvel végzett vizsgálatokért, valamint Kocsis Ibolyát a SE ÁOK II. Belgyógyászati Klinika Központi Laboratóriumának vezetőjét a humán vizsgálatok kivitelezésében nyújtott segítségéért. Rendkívüli köszönetem fejezem ki a SE ÁOK II. Belgyógyászati Klinika Biokémiai Kutatócsoportja munkatársainak: Bárkovits Saroltának, Kaján Andreának, és Pintér Edinának az állatkísérletekben és egyéb laboratóriumi vizsgálatokban nyújtott felbecsülhetetlen értékű segítségükért és őszinte barátságukért. Köszönet illeti továbbá mindazon munkatársaimat, akik a Semmelweis Egyetemen Ph.D. képzésben vettek, vagy vesznek részt: Dr. Szalecky Erikát, Dr. Fejes Szabolcsot, Dr. Hagymási Krisztinát és Dr. Sipos Pétert, mivel közösen végzett kutatómunkánk mindannyiunk ismereteit gyarapította és elősegítette a dolgozatom elkészítését. Hálásan köszönöm a Parma Produkt Kft.-nek a humán vizsgálatokhoz térítés nélkül biztosított Raphacol epegranulátumot, valamint Gere Tamásnak (Villány) a vizsgálatokhoz biztosított vörösbor mintákat. Végül, de nem utolsó sorban, végtelen hálával tartozom családomnak, szüleimnek, barátaimnak megértő türelmükért és segítségükért. A dolgozatban szereplő kutatásokat támogatta az Országos Tudományos Kutatási Alap (OTKA F 017713, OTKA T 22842), az Egészségügyi (korábban Népjóléti) Minisztérium (ETT 052/1996, ETT 02-517), valamint az Országos Műszaki Fejlesztési Bizottság (OMFB TéT P-9/95).
6
Rövidítésjegyzék
Abs ACAT ADH ALDH ALP ASE ALP cAMP CAT CHOL EDTA EDRF FRP GI GSH GSH-Px γ-GT GOT GPT GST HDL HMG-CoA reduktáz HPLC IDDM ISZB LDL MDA NIDDM RLU rpm SH-csoport SOD SOD-like aktivitás TAS TG TBARS UDP Statisztikai rövidítések: x Sx
Abszorbancia acil-koenzim A:koleszterin-aciltranszferáz alkohol dehidrogenáz aldehid dehidrogenáz alkalikus foszfatáz aszkorbinsav ekvivalens alkalikus foszfatáz ciklikus adenozin-5′-foszfát Kataláz Koleszterin Etiléndiamintetraecetsav endotélfüggő relaxációs faktor fekete retek préslé Glükozinolát redukált glutation glutation-peroxidáz gamma-glutaminsav-transzamináz glutamin-oxálecetsav-transzamináz glutamin-piroszőlősav-transzamináz glutation-S-transzferáz magas fajsúlyú lipoprotein (high density lipoprotein) 3-hidroxi-3-metilglutaril koenzim A reduktáz nagyhatékonyságú folyadékkromatográf inzulin-dependens diabetes mellitus ischaemiás szívbetegségek alacsony fajsúlyú lipoprotein (low density lipoprotein) Malondialdehid nem inzulin-dependens diabetes mellitus relative light unit (kemilumineszcenciás fényintenzitás) másodpercenkénti fordulatszám szabad szulfhidril csoport szuperoxid dizmutáz szuperoxidgyök-befogó aktivitás ismert aktivitású szuperoxid dizmutáz enzim aktivitásához viszonyítva totál antioxidáns státusz Triglicerid tiobarbitursav reaktív anyagok uridin-difoszfát Átlag Szórás
A dolgozatban ritkán előforduló egyéb rövidítéseket a szövegben magyarázom. A kémiai, biokémiai, valamint orvosi szakszavak helyesírását az „Orvosi Helyesírási Szótár” (Akadémiai Kiadó, 1992) és Elődi Pál: Biokémia (Akadémiai Kiadó, 1989) c. könyvek alapján ellenőriztem.
7
ÖSSZEFOGLALÁS Élelmiszer eredetű antioxidánsok hatása primer és szekunder prevencióban: Állatkísérletes és humán tanulmányok Készítette: dr. Lugasi Andrea Programvezető: prof. dr. Fehér János Témavezető: dr. Blázovics Anna Készítés helye: Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, Budapest, 7. Ph.D. program: A hepatológia szabadgyökös és immunológiai vonatkozásai Antioxidáns hatású vegyületek, úgymint aszkorbinsav, tokoferolok, karotenoidok és polifenolos komponensek, valamint makro- és mikroelemek jelenlétét sikerült igazolni a fekete retek gyökeréből kinyert préslében. A készítmény komplex in vitro vizsgálati rendszerben széleskörű antioxidáns tulajdonságokat -hidrogén-donor aktivitást, redukálóképességet, komplexképző és szabad gyök befogó aktivitást- mutatott. Ugyanezen vizsgálati rendszerben különböző bortermelő vidékekről származó fehérés vörösborok, valamint szőlőlevek is antioxidáns hatásúnak bizonyultak. Az antioxidáns tulajdonságok, valamint a vizsgált borok és szőlőlevek összes polifenoltartalma között szoros szignifikáns korreláció volt kimutatható. Állatkísérletes vizsgálatokban étrendi úton előidézett hyperlipidaemiában a fekete retek préslé számos kedvező hatását sikerült igazolni. A 20%napraforgóolajat, 2% koleszterint és 0.5% kolsavat tartalmazó étrend fogyasztásának hatására az állatokban zsírmáj és súlyos anyagcsere-zavar alakult ki, melyet számos, a szérumban, az eritrocitákban és a májban mért biokémiai jellemző kontroll értéktől való szignifikáns eltérése bizonyított. A zsírdús étrenddel együtt fogyasztott fekete retek préslé kedvezően befolyásolta az lipidanyagcsere-zavart, csökkentette a szérum és a máj lipid- és koleszterintartalmát, megakadályozta a májsejtek károsodását, és a lipidperoxidáció során keletkező termékek felszaporodását a szérumban és a májban, valamint a koleszterin oxidációját a májban, meggátolta az antioxidáns enzimek károsodását, továbbá megvédte a biológiai membránokat a szabad gyökös károsodásoktól. Humán vizsgálatban a fekete retek préslét és édesköményolajat tartalmazó gyógyhatású készítmény, a Raphacol epegranulátum hatásának tanulmányozása történt. A készítményt metabolikusan jól kontrollált I. és II. típusú diabetes mellitusban szenvedő, rendszeres orvosi ellenőrzés alatt álló, kimutatható epekővel nem rendelkező betegek fogyasztották hat hónapig. A szérumban és az eritrocitában végzett biokémiai vizsgálatok alapján készítmény enyhe lipidszint-csökkentő és antioxidáns hatása volt igazolható. Kúraszerű fogyasztás esetén e kedvező tulajdonságok feltételezhetően elősegítik a diabeteses szövődmények, elsősorban az epekőbetegségek és az atherosclerosis prevencióját.
8
SUMMARY Effect of dietary antioxidants in primary and secondary prevention: Animal and human studies Prepared by dr. Andrea Lugasi Supervised by prof. dr. János Fehér and dr. Anna Blázovics Semmelweis University, School of Doctors, Budapest, 7th Ph.D. program: Hepatology related to free radical reactions and immunology Significant amount of antioxidant molecules such as ascorbic acid, tocopherols, carotenoids, polyphenolic compounds, and micro- and macroelements were detected in the juice prepared from the root of black radish. According to in vitro studies the juice exhibited significant concentration-dependent antioxidant properties such as hydrogen-donating ability, reducing power, chelating property, and free radical scavenging activity. In this complex measuring system white and red wines from different origin and grape juices also showed antioxidant effects which were significantly dependent from the total polyphenol content of the samples. The beneficial effects of black radish juice in rats fed with a lipid rich diet having 20% sunflower oil, 2% cholesterol, and 0.5% cholic acid in normal chow were also examined. Changes of some biochemical characteristics in the sera, erythrocytes and liver proved the development of hyperlipidemia and steatosis as a result of lipid rich diet. Lipid and lipid peroxidation characteristics were significantly higher in the sera and in the liver of hyperlipidemic rats compared to the control group. At the same time antioxidant enzyme activities in the erythrocytes and in the liver were decreased. Supplementation of the lipid rich diet with black radish juice resulted in a significant and beneficial changes of the parameters mentioned above. Although the exact mechanism of the biologically active compounds in black radish on the lipid metabolism and lipid peroxidation is not clear yet, the antioxidant effect of the drug in alimentary hyperlipidemia could be involved. In a human study some biochemical parameters of well-controlled diabetic patients were studied during a 6 months′ intervention period while subjects consumed regularly Raphacol bile-granule preparing from black radish juice and Atheroleum foeniculi. Patients were under regular medical control and free from gallstones. Results suggest that regular consumption of Raphacol bile-granule had a weak lipid-lowering and a marked antioxidant effects. These properties supposed to be involved in the prevention of the accompanying diseases in diabetes, such as atherosclerosis and disorders related to gallbladder.
9
1.
BEVEZETÉS
Az 1985 és 1988 között végzett első magyarországi reprezentatív táplálkozási vizsgálat eredményeiből világossá vált, hogy a hazai felnőtt férfiak egynegyedénél, a nők egyharmadánál a szükségesnél jóval nagyobb az energiabevitel, mely elsősorban a zsír másodsorban a cukor túlzott fogyasztásából származik. Kevés növényi eredetű zsiradékot, azaz többszörösen telítetlen zsírsavat fogyasztunk, a koleszterinbevitel pedig az ajánlott mennyiség sokszorosa. Az utóbbi évtizedekben a szénhidrátfogyasztás is nemkívánatos irányba tolódott el. A szükségesnél több egyszerű szénhidrátot (cukrokat) és cereáliákból készített finomított élelmiszert fogyasztunk az ajánlottnál. A teljes értékű táplálkozáshoz szükséges zöldség- és főzelékfélék, cereáliák és gyümölcsök fogyasztása elégtelen, ezáltal alacsony az összetett szénhidrátok és a diétás rostok bevitele is. A lakosság egy részénél egyes vitaminok (aszkorbinsav, tiamin, riboflavin, retinol), ásványi anyagok (kálium, kalcium, magnézium) és nyomelemek (vas, réz, cink) bevitele elégtelen. Ezzel szemben a nátriumfogyasztás a kívánatos mennyiség többszöröse. Táplálkozásunkra jellemző a túlzott állati eredetű fehérje fogyasztása. Érdemes felhívni a figyelmet arra a sajnálatos tényre is, hogy az alkoholos italokból származó energia aránya egyre jelentősebb. A hazai lakosság helytelen táplálkozási szokásai hozzájárulnak az elhízás, a szív- és érrendszeri betegségek, a magas vérnyomás, a csontritkulás, az epekövesség, a májbetegségek, a daganatos elváltozások, valamint a cukorbetegség gyakoribb előfordulásához. A táplálkozással összefüggő betegségek megelőzhetők, illetve bekövetkezésük kockázata jelentősen csökkenthető az egészséges, kiegyensúlyozott táplálkozással. Az elmúlt két évtizedben a szabad gyökös károsodásokkal, valamint az antioxidáns hatású vegyületek biokémiájával kapcsolatos intenzív kutatások ahhoz a lényeges felismeréshez vezettek, hogy az étrendi antioxidánsoknak alapvető jelentősége van számos megbetegedés prevenciójában. Ezek közé tartoznak a kardio- és cerebrovaszkuláris megbetegedések, számos tumorfajta és más egyéb betegségek, melyek nagy része életkor-függő. Eddigi ismereteink szerint az egészség megőrzése és a betegségek megelőzése nagy valószínűséggel megvalósítható olyan antioxidánsok, vagy antioxidáns keverékek alkalmazásával, melyek a természetben, akár a növényi, akár az állati szervezetben megtalálhatók. Az egész populáció egészségi állapotának javítása szempontjából igen lényeges, hogy az illetékes kormányzati és egészségügyi szervek, valamint a média megfelelő, tudományos vizsgálatokkal alátámasztott, hiteles információt közöljön a lakossággal, különösen azért, mert bizonyított, hogy a prevenció az egyén és a nemzetgazdaság számára is sokkal gazdaságosabb és hatékonyabb, mint a már kialakult betegség gyógyítása. A fentiek miatt általánosan elfogadott követelmény a kutatások folytatása alapkutatás szinten éppúgy, mint széles körű randomizált klinikai vizsgálatokban.
10
Az étrendi antioxidánsok közül a vitaminok szerepe a fokozott oxidatív stresszel összefüggésbe hozható megbetegedések terápiájában és prevenciójában jól ismert. Az intenzív kutatások ellenére azonban keveset tudunk a nem-vitamin jellegű, antioxidáns hatású vegyületek, például a polifenolos komponensek, flavonoidok szerepéről a civilizációs megbetegedések visszaszorításában. Az élelmi eredetű flavonoidok élettani hatásának pontos feltérképezéséhez számos kémiai, biokémiai vizsgálatra van szükség. A megfelelő következtetések levonása, a folyamatok helyes értékelése sok esetben problémákba ütközik. A flavonoidok a gasztrointesztinális szakaszban kisebb-nagyobb szerkezet átalakuláson mennek át. Ezért a flavonoidok táplálkozásélettani hatásai nem szükségszerűen a szervezetbe bevitt molekuláknak tulajdoníthatók, hanem az enterális és posztabszorpciós interakciók és degradációs folyamatok során keletkező metabolitjaiknak. A flavonoidok élettani hatását alapvetően meghatározza, hogy milyen folyamatok mennek végbe a bélrendszerben, és a milyen kapcsolat az antioxidáns védelmi rendszer, az immunrendszer, az intesztinális baktériumok és a flavonoidok között. Hazánkban
az
elmúlt
néhány
évben
radikális
változások
zajlottak
le
az
élelmiszerekkel,
étrendkiegészítőkkel, és a gyógyszernek nem minősülő gyógyhatású készítményekkel kapcsolatos egészségügyi vizsgálati és engedélyeztetési eljárások tekintetében. Az élelmiszerekről szóló 1995. évi XC. törvény végrehajtása tárgyában kiadott 16/2000. (IV.6.) FVM-EüM-GM együttes .rendelete alapján megjelent egy új típusú élelmiszer kategória a „funkcionális készítmények”. Ezek olyan termékek, amelyek az élelmiszerekben előforduló, nem létfontosságú (nem esszenciális) anyagokat, mint például a flavonoidokat, mikroelemeket, rostokat, vitaminokat, nem esszenciális zsírsavakat és aminosavakat természetes forrásból izolált vagy dúsított formában tartalmazzák, és megjelenésük eltér a hagyományos élelmiszerektől (például tabletta, kapszula). A szokásos felhasználás mellett nincs káros mellékhatásuk és az egészségre gyakorolt jótékony hatásuk tudományosan igazolt. Nem tartalmazhatnak azonban a fogyasztók egészségét veszélyeztető anyagokat és fogyasztásuk élettani szempontból nem hátrányos. A törvény szövegéből világosan kitűnik, hogy ezen új típusú élelmiszerek emberi egészségre gyakorolt hatását tudományos vizsgálatokkal kell alátámasztani. A már meglévő tudományos eredmények alapján napjaink kutatói előtt áll a feladat, hogy olyan komplex vizsgálati rendszert dolgozzanak ki, mely segítségével a tanulmányozni kívánt nem-tápanyag jellegű, de az élelmiszerekben kimutatható mennyiségben jelenlévő komponensek élettani hatásait, kémiai szerkezetük és a biokémiai tulajdonságaik közötti összefüggéseket tanulmányozzák, valamint megállapítsák ezen anyagok helyét és szerepét az egészség megőrzésében és a betegségek megelőzésében.
11
2.
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
2.1.
AZ ÉTRENDI FLAVONOIDOK EGÉSZSÉGVÉDŐ HATÁSA
2.1.1.
A flavonoidok kémiai szerkezete
Napjainkban a flavonoidok és az egyéb polifenolos vegyületek egyre inkább a tudományos kutatások előterébe kerültek. A szerepükről, kémiai szerkezetükről, élettani hatásukról az elmúlt negyven évben rendszeresen jelentek meg összefoglaló tanulmányok (14, 106, 147, 180), de az emberi szervezetre gyakorolt hatásuk és jelentőségük még ma sem teljesen tisztázott. A flavonoidok az élelmiszerek nemtápanyag komponensei, vagyis nem jelentenek tápértéket az emberi szervezet számára. Szent-Györgyi már 1936-ban kimutatta, hogy a citrusfélékből származó rutin és a naringenin csökkenti a kapillárisok törékenységét és permeábilitását (247). Ezért a flavonoidokat P-vitaminnak nevezte el (P - permeábilitás), illetve C2 vitaminnak, mivel számos flavonoidnak C-vitamint stabilizáló hatása van (265). Az 50-es években a flavonoidok vitamintermészetével kapcsolatos elmélet megdőlt. A hetvenes években felfedezték, hogy a növényekben az egyik leggyakrabban előforduló flavonoid, a kvercetin bizonyos kísérleti körülmények között mutagén hatású, ezért nagy figyelem irányult a flavonoidok karcinogenitására, azonban egyértelmű bizonyítékok még ma sem állnak rendelkezésünkre. Napjainkban számos kísérleti munka eredménye támasztja alá a flavonoidok antioxidáns, antikarcinogén és gyulladáscsökkentő, összességében egészségvédő és betegségmegelőző hatását. A flavonoidokra a C6-C3-C6 (difenilpropán) alapszénváz jellemző, a két benzol gyűrű (A és B) egy oxigén atomot tartalmazó heterociklikus pirán, vagy piron gyűrűn (C gyűrű) keresztül kapcsolódik. Ez az alapszerkezet rendkívüli változatosságot biztosít mind a szubsztituensek, mind a C gyűrű szerkezetének tekintetében (265). Jelenleg mintegy 4000 különböző szerkezetű flavonoidot ismerünk (38). Az alapvázhoz (aglikon) különböző cukormolekulák kapcsolódhatnak és glikozidokat hoznak létre, melyek sokkal gyakrabban fordulnak elő a természetben, mint aglikonjaik. Eddigi ismereteink szerint bizonyos típusú és szerkezetű vegyületek egészségvédő szerepe nem kétséges, míg más jellegű flavonoidok és polifenolos komponensek, mint az auronok, kalkonok és kumarinok, stb. hatása kevésbé jelentős. A legjelentősebb vegyületek alapszerkezete, és a csoportok legjellemzőbb képviselői az 1. ábrán láthatók. A
flavonoidok
számos
funkciója
ismert
a
növényvilágban:
pigmentálás,
az
UV
fény,
a
mikroorganizmusok és egyéb növényi kártevők -gombák, rovarok, csigák, stb.- elleni védelem, enzimaktivitások regulációja, szignál funkció a nitrogénkötő baktériumok számára (185). Az élelmiszerként szolgáló növényi anyagokban természetes színezőanyagok, ízkomponensek, antioxidánsok (265). A flavonoidok halványsárgás vagy tejfehér
12
1. ábra A legjelentősebb flavonoid vegyületek szerkezete
13
színűek. Némelyek „színe” csak azon rovarok számára látható, melyek az emberi szem számára láthatatlan UV fényt is képesek érzékelni. 2.1.2. Élelmiszereink flavonoidtartalma Számos növényi élelmiszer flavonoidtartalmára és összetételére vonatkozóan vannak irodalmi adatok, de egyes csoportok (dinnyefélék, banán és egyéb déligyümölcsök, feldolgozott élelmiszerek) tekintetében meglehetősen hiányosak a felmérések. Az 1. táblázat néhány élelmiszer polifenol és flavonoidtartalma látható az irodalmi adatok (38, 108), valamint saját méréseink alapján (167). 1. táblázat
Növényi élelmiszerek összes polifenoltartalma és flavonoidösszetétele
Flavonok és flavonolok (mg/kg) Összes Élelmiszer Vöröshagyma
Kvercetin Kempferol
Apigenin
Luteolin
Miricetin
polifenol
284-486
24.3
nd
nd
nd
1000-20250
Póréhagyma
5.0
11-56
nd
nd
nd
200-400
Zellerlevél
nd
nd
248
111.4
43.4
940
Kelbimbó
nd
7.4-12.8
nd
6.7
nd
60-150
Brokkoli
15.4-30
30.8-72
nd
nd
nd
-
Vöröskáposzta
1.9-9.2
nd
nd
6.3
nd
-
Zöldbab
32-45
8.8-14
nd
nd
nd
340-2800
Spenót
272,2
nd
nd
66.4
nd
-
Burgonya
4.6-11
nd
nd
nd
nd
-
Retek
nd
10.5-21.1
nd
nd
nd
-
Paprika
9.4
nd
nd
7.0-14
nd
-
Fehérrépa
3.2
22.7
154.0
nd
85.4
-
Saláta
16.3
nd
nd
nd
10.2
-
Cirok
-
-
-
-
-
1700-102600
Árpa
-
-
-
-
-
12000-15000
Alma
7.7-40
2.0-16
nd
nd
nd
270-2980
13
nd
nd
nd
nd
1400-12000
Fekete ribizke
nd – nem detektálható, a kimutatási határ alatt, „-„ − nem mért összetevő A legtöbb természetes növényi alkotórészből készült (zöldség- és gyümölcslevek, gyógyteák) ital kisebbnagyobb mennyiségben tartalmazhat flavonoidokat, polifenolos vegyületeket. Például a sör, a bor és a tea
14
jellegzetes ízét a különböző biflavanok adják. A citrusfélékben a keserű ízt adó flavanonok és flavonok találhatók számottevő mennyiségben (232). Az antociánok és a flavonok számos színes gyümölcsféle, elsősorban bogyósok színét eredményezik (289). A flavonolok valamennyi gyümölcs- zöldségfélékben megtalálhatók. Számos levélzöldség, a zeller és a paprika flavonokat és antociánokat is tartalmaz. A hüvelyesek legjelentősebb vegyületei az izoflavonoidok, de esetenként flavonok, flavonolok és antociánok is kimutathatók (106, 107). Gabonafélék magjában flavonok, flavonolok, antociánok és flavanok egyaránt megtalálhatók. A gabonafélék feldolgozása során a legtöbb flavonoid elvész, mivel nagy részük a héjban és közvetlenül alatta található (250). A zöldség- és gyümölcsfélék feldolgozása során, a hámozással, a levelek eltávolításával és a hőkezeléssel a flavonoidtartalom jelentősen csökkenhet. Jóllehet a flavonoidok relatíve stabil vegyületek, a hőre, az oxigénre és az enyhe pH változásra nem érzékenyek, a különböző konyhatechnikai eljárások azonban veszteséget eredményezhetnek (224). Hertog és Franke adatai szerint az átlagos veszteség 50% körül van (84, 108). 2.1.3.
Étrendi bevitel
Kühnau a 70-es években az amerikai lakosság összes polifenol bevitelét az izoflavonoidok kivételével az 5 fő flavonoid csoportba tartozó vegyületekből 1-1.1 g/nap körüli értékben határozta meg, ebből 115 mg a flavonol és flavon volt (147). Ebben a felmérésben az élelmiszerek flavonoidtartalmának analitikai meghatározása nem volt teljesen megfelelő és számos vegyület esetén csak becsült értékekkel számoltak. 1993-ban egy holland csoport 5 vegyület (apigenin, kempferol, luteolin, miricetin, kvercetin) beviteli értékeit határozta meg a saját maguk által elvégzett analitikai vizsgálatok alapján (108, 109). A holland lakosság napi flavonoidbevitele 23 mg-nak bizonyult. Ez az érték valószínűleg alacsonyabb a valódinál, mivel nagyon kicsi volt a vizsgálatba bevont vegyületek száma. Leth és Justesen a dán lakosság flavonoidfogyasztását 28 mg/nap értéknek találta (155). Egy Finnországban végzett felmérés során több mint 370 növényi élelmiszerben határozták meg 24 féle flavonoid mennyiségét (144). A finnek 1997-es élelmiszerfogyasztási adatai alapján a lakosság flavonoidbevitele 55.2 mg/nap volt. A legújabb hazai vizsgálatok szerint a magyar lakosság flavonoidfogyasztása az eddig ismertetett adatoknál alacsonyabb. A közelmúltban elkészült egy hazai flavonoidösszetételi adatbázis, amely valamennyi jelentősebb növényi élelmiszer kvercetin, kempferol, miricetin, luteolin és apigenin koncentrációját tartalmazza. A mintegy kétszáz felnőtt fogyasztási adatai alapján a csoport flavonoidbevitele 18.8 ± 28.9 mg/nap/fő volt, a közel ötszáz gyermek adatai alapján kalkulált érték pedig 19.5 ± 26.6 mg/nap/főnek bizonyult (167, 168).
15
2.1.4.
A tápanyagkomponensek és a flavonoidok közötti kölcsönhatások
Táplálkozási szempontból a polifenolos vegyületeket, azonbelűl elsősorban a csersavakat, korábban antinutritív vegyületnek tekintették. Magas csersav tartalmú élelmiszerek rendszeres fogyasztása esetén csökken a fehérjék emészthetősége, és nő a széklettel ürülő nitrogén mennyisége (250). Jóllehet a fehérjeprecipitáló tulajdonság jellemző a legtöbb polifenolos vegyületre, a hatás elsősorban a nagy molekulasúlyú polifenolok nagyfokú hidroxilációjának köszönhető. Ezért a három molekulánál kevesebb tagú oligomer vegyületek nem képesek a fehérjéket kicsapni. A polifenolos vegyületek a bélben elsősorban nem a táplálékfehérjékhez kapcsolódnak, hanem egyéb, endogén molekulákhoz (195, 200). Például jól kötődnek a nyál prolinban gazdag fehérjéihez, és az intesztinum egyes fehérjéihez és így gátolják azok működését. (121, 188). Így nemcsak a fehérjék hasznosulása, hanem más makrotápanyagok, pl. keményítő és lipidek felszívódása is csökkenhet. A fehérjékhez való kötődés a különböző receptorokhoz, transzporter és enzim fehérjékhez való kötődést is jelenti, ezáltal csökkentve a polifenolos vegyület biológiai hasznosságát is. Az amilolítikus enzimek gátlása és az étrendi szénhidrát hidrolízisének visszaszorulása csökkenti az étkezés utáni glikémiás választ (287). A polifenolok komplexeket alkothatnak a nem-sejtfalalkotó poliszachridokkal (keményítő) is, és szintén befolyásolhatják a glikémiás és inzulin választ (65). A polifenolok lipidmetabolizmusra gyakorolt hatását kevéssé ismerjük. Mind a vízoldható, mind az oldhatatlan polifenolok növelik a széklettel történő zsírürítést (284). Koleszterinszint-csökkentő hatást írtak le állatkísérletekben szőlő tanninok, csersavak és tea katechinek fogyasztása során (202, 285, 314). Az étrendi polifenolok koleszterin-szint csökkentő hatása a megnövekedett fordított koleszterin transzporttal, valamint a csökkent koleszterin abszorpcióval és fokozott epesav kiválasztással magyarázható (153, 284). A polifenolok karboxil és hidroxil csoportjaiknak köszönhetően komplexeket hoznak létre fémionokkal, és így befolyásolják azok intesztinális abszorpcióját. Humán vizsgálatokban és állatkísérletekben is igazolták a vas csökkent abszorpcióját magas csersavtartalmú étrend fogyasztása mellett. Ez a polifenolok galloil és katechol csoportjainak köszönhető (42). Monomer flavonoidok gyógy- és fűszernövényekben, fenolsavak a kávéban, polimer komponensek a fekete teában és a kakaóban, valamint bor eredetű fenolok egyaránt csökkentik a vas felszívódását (55, 274). Csökkent réz felszívódást mutattak ki humán tanulmányban tea fogyasztása után, míg mások állatkísérletekben fokozott
64
Cu abszorpciót és a máj fokozott réztárolását
tapasztalták tea itatás hatására (136). Ugyanakkor egyes átmeneti fémionok megkötésével kapcsolatos hatás kedvező lehet az antioxidáns tulajdonságok szempontjából.
16
2.2.
A FLAVONOIDOK BIOKÉMIAI TULAJDONSÁGAI
2.2.1.
A flavonoidok metabolizmusa
Az élelmi eredetű flavonoidok abszorpcióját és metabolizmusát alapvetően kémiai szerkezetük határozza meg, mely függ többek között a glikoziláció/aciláció mértékétől, az egyéb fenolos vegyületekkel kialakított konjugációtól, a molekula méretétől, a polimerizáció fokától, és az oldhatóságtól. A polifenolos vegyületek nagy száma, valamint az a tény, hogy az élelmiszerekben komplex formában vannak jelen, meglehetősen nehézkessé teszi a felszívódási, fiziológiai és táplálkozásélettani hatások tanulmányozását. A flavonoidok általában gyengén szívódnak fel, kivéve néhány izoflavonoidot és katechint. Az eredeti szerkezetű flavonoidoknak kevesebb, mint 1%-a éri el a szisztémás keringést. A nem-abszorbeált flavonoidok a gasztrointesztinális traktusban extenzív anyagcserén mennek át a mikrobiális enzimek hatására, a folyamat végső eredményeként egyszerű fenolsavak keletkeznek (112, 113). A kvercetin vastagbélben és szövetekben végbemenő átalakulása a 2. ábrán látható (40). A fenolsavak, akár mint élelmiszeralkotók, akár mint flavonoid degradációs termékek, könnyen abszorbeálódnak. A fenolsavak a felszívódásuk után további degradáción mennek keresztül, pl. a kettős kötések telítése, dekarboxiláció, demetiláció is történhet. A flavonoidok degradációs termékei az eredeti komponenshez képest eltérő tulajdonságokkal is rendelkezhetnek, ezért a polifenolos vegyületek élettani hatása az eredeti vegyület, és a szervezetben keletkező származékainak együttes hatásaként fogható fel (39). A flavonoid aglikonok és az egyszerű fenolsavak könnyen közvetlenül felszívódhatnak a vékonybél nyálkahártyáján keresztül (176, 177, 178). A glikozidokat előbb hidrolizálni kell, de mivel az emlősökben hiányzik a β-glükozidáz, ezek felszívódása nem valószínű a vékonybélben. Ennek ellenére például a kvercetin glükozidok részleges abszorpciója megvalósulhat a terminális ileumban kolonializálódott baktériumok hatására (113). A legtöbb glikozid azonban átjut a vastagbélbe, ahol a szabad aglikonok a vastagbél baktériumok hatására felszabadulnak. A szénhidrátok bakteriális lebontása elősegíti a rostokhoz kötött flavonoidok felszabadulását. A vastagbélben a szabad aglikonok felszívódnak az epitéliumon keresztül, majd metilálódnak és/vagy glükuronidálódnak a májban. A polifenolok metabolizálódásának legfőbb helye a máj, de más szervek sem zárhatók ki, például a vese vagy a bélnyálkahártya, mivel ezek is rendelkeznek a metabolizálódáshoz szükséges enzimekkel (112). Az abszorpció után a flavonoidok konjugálódnak, azaz olyan oldalláncok épülnek be a molekulába, melyek növelik a polaritást és ezáltal elősegítik a kiürülést. A szisztémás abszorpció után az egyszerű fenolos vegyületek további módosulásokon mennek keresztül. A citokróm P450 hatására például hidroxil csoportok felvétele, vagy metoxi csoportok leadása történhet. Ez a hepatikus/mikroszomális átalakítás nagymértékben megváltoztathatja a molekula szerkezetét, ezért a biológiai
17
2. ábra
A kvercetin átalakulása a szövetekben
OH
OH
OH HO
OH
O
HO vastagbél
OH
O
OH O
3,4-dihidroxifahéjsav
kvercetin
vastagbél
vastagbél
OH
OH
OH
OH
OH
O
vastagbél
HO
HO O
HO
O
3,4-dihidroxifenilecetsav
3-(3,4-dihidroxi)-fenil-propionsav
szövet
vastagbél
szövet
OH O
OH
O
HO
3-hidroxifenilecetsav
4-hidroxi-3-metoxifenilecetsav
OH
OCH3 OH
OCH3 OH
HO
HO HO
3-hidroxifenilpropionsav
O 3-(4-hidroxi-3-metoxi)-fenilpropionsav
18
O 3-hidroxibenzoesav
hatás is jelentősen eltérhet az eredeti vegyületétől. Például a hormonhatást mutató naringeninből eriodiktiol keletkezik, ekkor a hormonhatás eltűnik. A krizin indukálni képes a citokróm P450-et, de apigeninné történő átalakulása után ez a hatás megszűnik. A krizin sokkal kevésbé citotoxikus, mint dihidroxilált származéka, a luteolin, amely ugyanakkor erőteljesebb antioxidáns (210). Az így keletkezett metabolitok mennyisége azonban elenyésző az elfogyasztott flavonoidok mennyiségéhez képest. Néhány flavonoid mikroszomális átalakulása során keletkező vegyületek a 3. ábrán láthatók (Nielsen nyomán) . Konjugált és 3′-O-metilált származékok patkány plazmában kimutathatók voltak flavanolok (katechin) és flavonolok (kvercetin, rutin, izoramnetin) fogyasztása után (38, 176). Ezek a származékok a vizelettel vagy az epével ürülnek. Ez utóbbi esetben belépnek az enterohepatikus körforgásba, ahol dekonjugálódnak, majd újra abszorbeálódnak. Teljes metabolizálódás esetén egyszerű fenolsavakká bomlanak, felszívónak, majd a vizelttel ürülnek. (112, 113, 178, 179). Humán tanulmányokban is a flavonoidok részleges abszorpcióját tapasztalták. Az orálisan bejuttatott kvercetin felszívódása ileosztomizált páciensek esetében nagy egyének közötti változatosságot mutatott. Átlagosan a kvercetin aglikon 24%-a, és a glükozid 52%-a szívódott fel. (195). A flavonoidok szervezetben kialakuló stabil plazma szintje rendkívül lényeges a megfelelő biológiai hatás kifejtése érdekében. Patkányokban az orálisan bevitt 50 µmol/tt kg luteolin elfogyasztása után 3 órával 5.1 nmol/ml volt a luteolin plazma koncentrációja, míg a 24 órás ürítés a vizelettel a bevitt mennyiség 4%-a volt. 24 órával a flavonoid elfogyasztása után a plazma HPLC profilja szerint a keringésben szabad luteolin, luteolinglükozid, luteolin-szulfát konjugátum, és O-metil-luteolin (diosmetin) volt jelen (159). A luteolin metabolizmusának feltételezett mechanizmusa a 4. ábrán látható (Shimoi szerint). Legtöbb tanulmányban nem sikerült pontosan meghatározni, hogy a glükuronid melyik helyzetben épült be molekulába. Mivel az antioxidáns aktivitás szorosan kapcsolódik az adott helyzetben lévő hidroxil csoportokhoz, a létrejött glükuronid antioxidáns aktivitása és kelátképző tulajdonságai gyengébbek lehetnek, mint az aglikoné. A diosmetin, a 4′-O-metil luteolin, hidroxil gyök scavenger kapacitással rendelkezik, ezért ha a luteolin 3′- vagy 4′- pozícióban glükuronidálódik, antioxidáns aktivitása nem vész el teljesen (36). 2.2.2.
A flavonoidok mint antioxidánsok
A flavonoidok biológiai hatásait számos vizsgálati rendszerben tanulmányozták, a részben vagy teljesen bizonyított hatások meglehetősen szerteágazóak. A flavonoidokkal kapcsolatos kutatások kezdetén a vizsgálatok nagy része in vitro körülmények között történt, de a 90-es évektől megsokszorozódott az in vivo
19
3. ábra
Egyes flavonoidok mikroszomális átalakulása
OH OH
OH HO
HO
O
O
OH O
OH O
Naringenin
Eriodiktiol OH
HO
O
HO
OH O
OH O
Krizin
4. ábra
O
Apigenin
A luteolin metabolizmusának feltételezett mechanizmusa
L = luteolin G = luteolin glikozid M-L = metilált luteolin K-l = konjugált luteolin MK-L = metilált konjugált luteolin
20
tanulmányok száma is. Az in vitro vizsgálatok alapján a következő biokémiai folyamatok köré csoportosíthatók a flavonoidok kedvező hatásai: antioxidáns hatás és/vagy szabadgyök-befogás, immunmoduláns és gyulladáscsökkentő hatás nagy valószínűséggel az arachidonsav metabolizmus módosításán keresztül (foszfolipáz A2 gátlás, ciklooxigenáz gátlás vagy aktiválás, 5-, 12-, 15-lipoxigenáz gátlás), asztmaellenes és antiallergén hatás, más enzimek aktivitásának módosítása, általában gátlása (xantinoxidáz, angiotenzin konvertáz, cAMP foszfodiészteráz), antivirális, antibakteriális hatás, ösztrogén aktivitás (izoflavonoidok), mutagenezist és karcinogenezist befolyásoló hatás, hepatoprotektív hatás, véredényrendszer működését, állapotát befolyásoló hatás, vaszkuláris permeábilitás módosítása (38, 259). A fenti tulajdonságok egymással összefüggnek: a hepatoprotektív hatás a szabad gyök scavenger tulajdonsággal, az antioxidáns hatás sok esetben a xantinoxidáz gátlással, az asztmaellenes hatás az 5lipoxigenáz gátlással, vagy más immunológiai folyamattal. A fenolos antioxidánsok szabad gyök terminátorként és fémion kelátorként funkcionálhatnak. Hidrogén atomot átadva a szabad gyököknek bekapcsolódnak a lipidek és egyéb molekulák oxidációs folyamataiba. A folyamat során a flavonoidból keletkezett átmeneti termék, a fenoxigyök relatíve stabil molekula, ezért az újabb láncreakció iniciációja nehezen következik be. Ugyanakkor a fenoxigyök más szabad gyökökkel reagálva részt vesz a láncreakció terminációjában (35). A flavonoidok antioxidáns tulajdonságainak mértéke alapvetően az adott molekula szerkezetétől függ. A fenol önmagában nem antioxidáns, de az orto és para difenolok már antioxidánsként viselkednek. A hatás erőssége fokozódik, ha a molekulák etil vagy n-butil csoportokat is tartalmaznak. Egy adott flavonoid molekula antioxidáns, amennyiben az alábbi feltételek közül egy vagy több teljesül: 1) o-difenol csoport jelenléte többnyire a B gyűrűn, 2) kettős kötés a 2-3 szénatom között és a 4-oxo csoport jelenléte, 3) hidroxil csoportok 3 és 5 szénatomon (35). A flavonoidok antioxidáns tulajdonságaihoz elengedhetetlenül szükséges kémiai szerkezet az 5. ábrán látható (178). Az antioxidáns hatás erőssége szoros pozitív összefüggést mutat a hidroxiláció mértékével, és negatív korrelációt a cukor oldalláncok számával. A flavonoidok a nagyon reaktív hidroxilgyökök hatásos scavengerei (177). A flavonoidok fémkelátorok is, ezért gátolják a Fenton és Haber-Weiss reakciókat, melyek során rendkívül reaktív szabad gyökök keletkeznek, ráadásul antioxidáns tulajdonságaikat a flavonoid - fémion komplex kialakulás után is megtartják (127, 288). A különböző szerkezetű flavonoidok fémionokkal alkotott komplex vegyületeinek szerkezete a 6. ábrán látható. Számos flavonoid hatását tanulmányozták lipidperoxidációs rendszerekben. Ezekben a tesztekben a kvercetinen és a rutinon kívül az apigenin, az eriodiktiol, a kempferol és a luteolin is antioxidáns tulajdonságokat mutatott (196). A kvercetin, a rutin, az apigenin és a naringin esetében a szuperoxid gyök
21
5. ábra
A flavonoidok antioxidáns tulajdonságait biztosító szerkezeti elemek
3'
O
7
4
4' 5'
2 3
5
3'
O O
7
4' 5' 3'
5
O
4'
O
7
5'
5
O
6. ábra
O H
O
H
Egyes flavonoid vegyületek komplexképzésének mechanizmusa
Flavonol 4 3 5
4
O
O
3
4
O
O O
O
5
5
Cu+
3
Cu Flavon
Cu+
5
4
O
O Cu
22
3
scavenger hatás is bizonyított (239, 315). A hesperidin, a naringenin és a naringin, a citrusfélék 3 fő flavonoidja viszonylag gyenge antioxidánsnak bizonyult lipidperoxidációs rendszerekben (239). Az antioxidáns hatáshoz szüksége optimális kémiai szerkezettel rendelkező flavonoidok, mint pl. a kvercetin, szuperoxid-, hidroxil-, alkoxil- és peroxilgyök scavengerek. Ugyanakkor néhány erőtejen antioxidáns hatású flavonoid nem rendelkezik a fenti szerkezettel (175). Jól ismert tény, hogy a flavonoidok C-vitamin védő hatással rendelkeznek, mely tulajdonság szintén az antioxidáns jelleggel függ össze (56). Bizonyos körülmények között a flavonoidok prooxidáns hatásúak is lehetnek. Fe3+-EDTA jelenlétében pH 7.4-en 100 µM kvercetin fokozta a hidroxilgyökök képződését H2O2-ból deoxiribóz rendszerben. A DNS bleomycinnel előidézett károsodását is fokozta a kvercetin Fe3+ jelenlétében (149). Aerob körülmények között a kempferol DNS károsodást és következményes lipidperoxidációt okozott patkányok májsejtjének magjában. Jelenlegi ismereteink szerint úgy tűnik, hogy a prooxidáns hatáshoz a Fe3+ jelenléte, a flavonoidok nagy koncentrációja és lúgos pH szükséges, amely feltételek fiziológiás körülmények között nem biztosítottak (257). Továbbá az eddigi vizsgálatok szerint a keringésben kisebb flavonoid koncentráció mutatható ki, mint a fenti vizsgálatban alkalmazott mennyiségek. 2.2.3.
A flavonoidok toxicitása, mutagenitása
A jelenleg fellelhető irodalmi adatok szerint a flavonoidok relatíve nem toxikusak a magasabb rendű állatok és az ember számára, teratogén hatást sem sikerült kimutatni (310). Mindaddig, amíg az élelmiszer a flavonoidok egyetlen forrása, az intoxikáció kockázata elhanyagolható. Az állatkísérletekben tanulmányozott flavonoidok esetében az akut LD50 1 g/nap dózis alatti értékek volt (157). Amióta 1975-ben Ames közölte az in vitro Salmonella typhimurium short-term mutagenezis tesztjét, több kutatócsoport is felhasználta ezt a flavonoidok mutagén hatásának tanulmányozására (9). Számos flavonoid mutagének bizonyult ebben a rendszerben, mikroszomális (S-9) metabolikus aktiváció mellett és annak hiányában is (40, 100, 173). A kvercetin több in vitro short-term kísérletben genotoxikus hatású volt emlős sejtvonalakon. Többek között mutációt eredményezett a fibroblaszt HG PRT lokuszon V79 tengerimalacban, kínai hörcsög és humán sejtekben is fokozta a kromoszóma abberációk és a SCE (sister chromatid exchange) gyakoriságát, megnövelte a DNS törések számát a timidinkináz lokuszon L5178Y macska limfóma sejtekben, valamint kromoszóma aberrációt indukált hörcsög petesejtekben (174, 189, 228). Jóllehet a fenti korlátozott számú vizsgálat in vitro körülmények között történt, a nem éppen kedvező eredmények nagy publicitást kaptak tudományos körökben. Ezért széles körben folytak tovább a kutatások, melyek során többek között megállapították, hogy a béltraktus baktériumai rendelkeznek glükozidáz aktivitással, így a cukormolekulák hidrolízisét katalizálják az általában nem mutagén flavonoid glükozidokról, és gyakran mutagén aglikonokat eredményeznek (170, 171). A flavonoidok szerkezete és az Ames tesztben tapasztalt hatások közötti összefüggések szerint a flavonoidok mutagenitását
23
befolyásolja a B gyűrűn 3’ és 4’ helyzetben lévő hidroxi csoport, az A gyűrűn a 7. szénatomon jelenlévő szabad hidroxi vagy metoxi csoport jelenléte vagy hiánya. Úgy tűnik, hogy a metoxi csoport jelenléte, különösen a B gyűrűn, jelentősen növelheti a molekula mutagenitását (58). Több kutatócsoport tett kísérletet a flavonoidok in vivo genotoxikus hatásának bizonyítására, de legtöbbjük nem kapott egyértelmű eredményt. Az egyik munkacsoport csontvelő sejtekben fokozott mikronukleusz képződést tapasztalt egerekben intraperitoneálisan adagolt kvercetin, kempferol, neoheszperidin és 5,3’,4’-trihidroxi-3,6,7,8-tetrametoxiflavon hatására (49, 261). In vitro körülmények között a kvercetin DNS törést okozott (231). Ezek az eredmények a flavonoidok mutagén hatásának lehetséges mechanizmusát mutatják. Aerob körülmények között, fémionok jelenlétében, a kvercetin szuperoxid gyököt és egyéb reaktív oxigén intermediereket termelhet, melyek a DNS károsodását eredményezhetik (78). Ilyen körülmények között azonban a C vitamin is in vitro mutációt okozhat (275). A reakciókhoz szükséges mennyiségű H2O2 keletkezéséhez meghosszabbított inkubációs idő szükséges. Ugyanakkor a jól működő emlős sejtekben elegendő mennyiségű és aktivitású szuperoxid-dizmutáz és glutation-peroxidáz van, melyek a keletkező hidrogén-peroxidot és szuperoxid gyököt eliminálni képesek. Jelenlegi ismereteink szerint úgy tűnik, hogy a flavonoidok in vitro mutagének, in vivo viszont nem genotoxikusak. A legtöbb in vivo vizsgálatban nem volt különbség a kontroll és a flavonoiddal kezelt csoportok között az egy állatra jutó tumorok számát és a tumor incidenciáját illetően sem, 0.1-1.0% kvercetint vagy rutint tartalmazó étrendet fogyasztó egerekben, patkányokban és hörcsögökben (115). Pamukcu és munkatársai közölték, hogy 0.1% étrendi kvercetin intesztinális és húgyhólyag karcinómát eredményezett norvég patkányokban, valamint egy másik kísérletben megnövekedett májtumor incidencia volt tapasztalható patkányokban (115, 220). Dunnick vizsgálataiban magas dózisú (5% flavonoid az étrendben) kvercetin fogyasztása 2 éven keresztül hím patkányokban a vesedaganat kialakulásának megnövekedett gyakoriságát eredményezte (67). Alacsonyabb dózis és rövidebb ideig tartó fogyasztás nem okozott kimutatható káros hatásokat. Az ezen a területen munkálkodó kutatók összegzése szerint a flavonoidok antikarcinogén hatása sokkal jelentősebb, mint azok prokarcinogén tulajdonságai. 2.3.
FLAVONOIDOK A GYÓGYÍTÁSBAN
2.3.1.
Antimutagén és antikarcinogén hatás
Számos közlemény számolt be a flavonoidok antimutagén és antikarcinogén hatásával kapcsolatosan végzett vizsgálatokról. A leggyakrabban tanulmányozott vegyület a kvercetin. Az eredmények azt jelzik, hogy a flavonoidok gátolják a fázis I. enzimeket, melyek a karcinogéneket aktiválják, visszaszorítják a rákos sejtek proliferációját, kivédik a γ-sugárzás genotoxikus hatását és gátolják a DNS-adduktok képződését a benzo(a)pirén expozíció esetén (43, 88, 254, 258, 263). Továbbá antipromotor és antiinvazív hatást tapasztaltak, valamint olyan enzimek gátlását figyelték meg, mint a protein tirozinkináz, a TPAdependens ornitin-dekarboxiláz, és a DNS topoizomeráz (71). Számos flavonoid mutat antimutagén hatást
24
in vitro körülmények között (304). Kuntz és munkatársai 30 különböző flavonoid kedvező hatását tapasztalták humán ráksejt vonalakon, mivel azok dózis-dependens módon gátolták a sejtek proliferációját, ugyanakkor citotoxikus hatásuk nem volt tapasztalható (146). Étrendi flavonoidok, mint a kvercetin és a rutin megakadályozta a H2O2-indukálta DNS károsodást humán vastagbél sejtekben (68). 2.3.2.
Szív- és érrendszeri betegségek
Az étrend összetétele bizonyítottan hatással van a szív- és érrendszeri betegségek kialakulására, és ez a hatás nemcsak a telített zsírsav- és a koleszterinbevitellel magyarázható (234). Jóllehet az atherosclerosis kialakulásának pontos mechanizmusa nem ismert, általánosan elfogadott, hogy a folyamat korai szakaszában az érfalban a makrofágok képesek felvenni a módosult szerkezetű LDL-t az LDL receptoroktól független módon az ún. scavenger receptorokon keresztül, melyek csak a módosított, oxidált LDL-t ismerik fel. Az oxidált LDL erősen atherogén, ugyanakkor visszajutása a keringésbe korlátozott. Ez a folyamat a koleszterinészterrel telített makrofágok intimához történő akkumulációját eredményezi. A makrofágok fokozatosan habos plazmájú sejtekké transzformálódnak, majd ún. „fatty streak”-ek keletkeznek. Ez utóbbiak fibrotikus plakkokat képeznek, melyek kalcifikálódnak és a lumen beszűküléséhez vezetnek (75, 76). Az oxidált LDL, akár a lipid, akár a koleszterin oxidatív modifikációja történt, citotoxikus és károsítja az endotél sejteket. Ez a károsodás a trombocita aggregációt stimuláló faktorok kiáramlását eredményezi, mely trombózis kialakulásához vezet. A trombogenezis és a csökkent intralumináris tér növeli az infarktus kockázatát. A flavonoidok kedvező hatása az ischaemiás szívbetegségek (ISZB) prevenciójában többféle mechanizmus szerint is megvalósulhat, például az LDL oxidáció, vagy a trombocitaaggregáció gátlásán keresztül. Így mindazok a tényezők, melyek meggátolják az LDL oxidációját, a koronáriás szívbetegségek prevenciójában és kezelésében hasznosak lehetnek. A legtöbb flavonoid antioxidáns, ugyanakkor számos in vitro tanulmány számolt be arról, hogy meghatározott vizsgálati rendszerekben a flavonoidok antioxidáns aktivitása erősebb volt, mint az α-tokoferolé. In vitro vizsgálatokban a flavonoidok gátolták mind a celluláris, mind a sejten kívüli tényezőkkel előidézett LDL oxidációt. A flavonoidok szabad gyök scavenger tulajdonságain túl az α-tokoferol védelme, az oxidált LDL citotoxikus hatásának gátlása, valamint a 15-lipoxigenáz gátlása is feltételezhetően szerepet játszik a kedvező folyamatban (64). A kvercetin és a rutin nagy koncentrációban megakadályozta az oxidált LDL jelenléte miatt bekövetkező sejtkárosodást, mivel mindkét flavonoid gátolta a lipoproteinek oxidációját és az abból következő citotoxicitást. Kisebb koncentrációban közvetlenül védték a sejteket az oxidált LDL citotoxikus hatásaitól (208, 209). Már az 50-es évek óta ismert a flavonoidok antitrombotikus és trombocitaaggregációt gátló hatása (205). Ez a hatás in vitro és in vivo állatkísérletekben, és humán vizsgálatokban is bizonyított. A legtöbb esetben a cAMP foszfodiészteráz gátlása miatt megnövekvő cAMP szint tehető felelőssé a kedvező hatásért (19,
25
20). Ezenkívül egyéb mechanizmusok is feltételezhetők: az arachidonsav metabolizmus módosítása a tromboxán szint csökkentésével, a tromboxán receptorokkal szembeni antagonizmus, prosztaciklinszint emelése (138, 187, 197). A legtöbb flavonoid gátolta a lipoxigenázt, de hatásuk eltérő volt a cikloxigenázra. A kvercetin gátolta a ciklooxigenáz, a lipoxigenáz és a xantinoxidáz működését (147, 241). Az apigenin, a kaempferol, a naringenin és a rutin szintén gátolta a lipoxigenáz működését (199). A kalciumszint csökkentése, a trombocita aktiváló faktor (PAF) gátlása, szabad gyök scavengelés, a proaggregációs enzimek aktivitásának csökkentése is ismert folyamatok az irodalomból (286). Az adatok alapján úgy tűnik, hogy a flavonoidok antiaggragációs hatása többféle, többé-kevésbé egymástól független folyamaton keresztül jut érvényre. Az eddig említett hatásokon kívül nem zárható ki a xantinoxidáz, a mieloperoxidáz és az angiotenzin konvertáz gátlása sem. 2.3.3.
Egyéb hatások
A vizsgált flavonoidok közül elsősorban a kvercetin gátolta a citokrom P450-dependens ösztrogénszintetázt, a dihidropiridin metabolizmust és egyéb más enzimek működését (131, 192). Az apigenin megakadályozta a különböző ágensek hatására bekövetkező hisztamin kiáramlást, míg a hesperetin, a naringin és a rutin hatástalan volt (190). Az apigenin, a hesperetin, a kvercetin és a rutin gátolta a neutrofil sejteknek az opszonizált zimozán részecskék hatására adott kemilumineszcenciás válaszát (44). Több flavonoid is gátolta az etoxikumarin-deetilázt patkányok májának és belének mikroszómáiban (297). Az apigenin és a luteolin gátolta a hialuronidáz (glükozidáz) aktivitását, amely a gyulladásos válasz egyik lehetséges formája (145). A kempferol és a kvercetin megakadályozta a stressz fehérjék indukcióját eritrofagocitózis során, valamint hősokk esetén (129). A rutin részlegesen megvédte az oxihemoglobint a H2O2-indukálta oxidációtól és hem-vesztéstől (94). Ischémia/reperfúzió során a kvercetin megóvta a szöveteket az oxidatív károsodástól (251). Vastároló patkány májsejtekben a kvercetin visszaszorította a lipidperoxidációt, valamint a laktát-dehidrogenáz kiáramlását a sejtekből (198). 2.3.4.
Epidemiológiai tanulmányok
A szív- és érrendszeri megbetegedésekből származó halálozások epidemiológiai összefüggéseinek feltárása során a flavonoid vegyületeket 1960-ban, az ún. Seven Country Study-ban vették figyelembe először (109). A tanulmányban 7 ország -Horvátország, Finnország, Olaszország, Japán, Szerbia, Görögország, Hollandia és Amerika (vasúti munkások)- lakosságának fogyasztási és halálozási adatait elemezték. A tanulmány szerzői a 25 éves követéses vizsgálat eredményei alapján arra a végső megállapításra jutottak, hogy a flavonoidbevitel inverz módon összefügg a szív- és érrendszeri megbetegedésekből eredő mortalitással. Az 1985-ben indult Zutphen (Hollandia) tanulmány 65-84 év közötti 805 férfi adatait elemezte (111, 130). A flavonoidbevitel összefüggésben volt az öt éves követéses
26
időszakban megjelenő daganatos és koronáriás megbetegedések számával. A keringési rendszer zavaraival összefüggő mortalitás 50%-kal alacsonyabb volt a legmagasabb flavonoidbevitelű csoportban a legkevesebbet fogyasztókhoz viszonyítva. Hasonló összefüggéseket tapasztaltak a welsi Caerphilly-ben végzett felmérések során is (110). Egy finn tanulmányban a korábban említett holland flavonoid összetételi adatokat, valamint a tanulmány kezdetekor rögzített finn fogyasztási adatokat figyelembe véve 5133 férfi és nő (30-69 év) adatait elemezték egy 26 éves követéses vizsgálatban (141). A nők esetében szignifikáns inverz összefüggés volt kimutatható a flavonoidbevitel és az összes, valamint a koronáriás szívbetegségekből eredő halálozások tekintetében is, amikor az adatokat korrigálták az ischémiás szívbetegségek legfőbb rizikótényezőivel. A férfiak esetében ugyanezt a trendet sikerült kimutatni, de csak az összes halálozásra vonatkozóan volt szignifikáns az összefüggés. 2.4.
A VÖRÖSBOR EGÉSZSÉGVÉDŐ HATÁSA
A nyolcvanas évek második felében epidemiológiai vizsgálatok egybehangzó adatai mutattak rá a később "Francia paradoxon" elnevezést nyert jelenségre. Franciaország egyes területein a szív- és érrendszerrel kapcsolatos megbetegedések és halálozások aránya mérsékelt és relatíve alacsonyabb, mint Európa más fejlett országaiban és Amerikában. Az alacsony ISZB mortalitás mellett azonban a zsír- és ezen belül a telített zsírsavak fogyasztása és a szérum koleszterin szint közel azonos az említett országok mindegyikében (239). Számos országban − Dániában, Amerikában, Franciaországban, és az Egyesült Királyságban − elvégzett epidemiológiai vizsgálatokból világosan kitűnik, hogy azoknál az egyéneknél, akik naponta 150-300 ml vörösbort fogyasztanak el naponta, kortól és iskolázottságtól függetlenül mintegy 50 %-al kisebb az esély arra, hogy kardiovaszkuláris megbetegedésben haljanak meg és átlagosan 10-12 évvel hosszabb ideig élnek, mint akik egyáltalán nem isznak vörösbort (57, 95, 140). Az első elemzések feltételezték, hogy az etilalkohol a kedvező hatású komponens, amely alacsony dózisban akár meg is akadályozhatja a trombózis kialakulását, csökkenti a fibrinogén és emeli a plazminogén koncentrációt, növeli a védőhatású HDL-koleszterin szintjét és kismértékben csökkenti az LDL-koleszterin koncentrációját (234, 235). Nagyobb mennyiség fogyasztása esetén azonban nem hagyható figyelmen kívül, hogy az alkoholbevitel felesleges kalóriákhoz juttatja a szervezetet, és a VLDL (nagyon alacsony fajsúlyú lipoprotein) képzés fokozásán keresztül a triglicerid szint emelkedéséhez és így a lipid paraméterek módosulásához vezet. A tartós alkoholfogyasztás alkoholos zsírmájhoz, majd cirrhosishoz, végső soron pedig májdaganat kialakulásához vezet (81). Az elváltozások létrejöttében a fokozott szabadgyök-reakciók bizonyítottan szerepet játszanak. Az alkohol első metabolitját, az acetaldehidet nemcsak az acetaldehid-dehidrogenáz, hanem kedvezőtlen metabolikus körülmények között a xantinoxidáz is képes metabolizálni. Az enzim xantin helyett szubsztrátként acetaldehidet használ, és
27
miközben ezt acetáttá oxidálja, a molekuláris oxigénből szuperoxid gyök (O2-.) képződik (79). Ezenkívül az etanol fogyasztás fokozza a máj mikroszomális enzimeinek (CYP2E1) működését és így a káros szabad gyökök képződését is (156). A felszabaduló reaktív oxigén intermedierek, akármelyik úton keletkeznek is, szerepet játszanak az alkohol májkárosító hatásában (79). A bor egyéb összetevőit megvizsgálva kitűnik, hogy a polifenolos komponensek a felelősek a kardioprotektív hatásért. A borok fenolos komponensei a borszőlőből (Vitis vinifera) származó monomer, oligomer és polimer fenolos vegyületek (300). A vörösbort a magon, a kocsányon és a héjon érlelik, ezért a bennük található proantocianidinek és antociánok az alkoholos erjedés alatt átoldódnak a vörös borba (237). A fehérbor összes fenoltartalma 170-300 mg/l, a vörösboré 1800-3000 mg/l, ez a nagyságrendbeli különbség egyrészt a két szőlőfajta eltérő összetételéből, másrészt a különböző borkészítési technológiákból adódik (74). A 2. táblázatban vörös- és fehérbor polifenolos vegyületeinek mennyisége, a 7. és 8. ábrán a monomer és oligomer komponensek kémiai szerkezete látható Singleton nyomán (305). A vörösborok erőteljesebb antioxidáns és gyökfogó tulajdonságai egyrészt a magasabb polifenol tartalomnak tulajdoníthatók. Feltételezhető azonban az is, hogy azok a polifenolos vegyületek, amelyek csak a vörösborban találhatók meg, olyan kedvező szerkezeti és kémiai tulajdonságokkal rendelkeznek, melyek lehetővé teszik, hogy antioxidánsként viselkedjenek (301). A vörösborok alkoholtartalma 10-15 % között mozog, eddigi ismereteink szerint nem tartalmaznak karcinogén vegyületeket. Étvágygerjesztő és emésztést elősegítő hatásuk régóta közismert. (74, 97). Számos munkacsoport számolt be a bor eredetű fenolos komponensek LDL oxidációt gátló hatásáról (75, 85, 86, 87, 150). Frankel és munkatársai szerint a relatív antioxidáns aktivitás szoros korrelációban van a bor összes fenoltartalmával és néhány monomer komponens -galluszsav, katechin, miricetin, kávésav, rutin-
28
7. ábra
Vörösborok monomer fenolos komponensei
O
OH OH
ClO+
HO
R2 HO O
O OH
OH
glükóz
R1
Kávésav, R1, R2 = H Szinapinsav, R1 = CH3, R2 = OCH3
Cianidin OH
O
OH HO
O
HO
R
OH
HO
OH
OH
OH O Kvercetin, R = H Miricetin, R = OH
Galluszsav
OH
OH
OH
OH HO
OH
O
HO
O H OH H
OH
(-)-Katechin
H H OH
(-)-Epikatechin
HO HO
OH HO
OH Cisz-rezveratrol
Transz-rezveratrol
29
OH
8. ábra
Vörösborok oligomer fenolos komponensei
OH
OH
OH
OH HO
HO
O
O
OH OH
R1 R2 O
OH HO
OH
OH
R1 R2 O
OH HO
R3 R4
OH
R3 R4
OH
Procianidin dimer B-3: R1, R3 = OH Procianidin dimer B-4: R1, R4 = OH
Procianidin dimer B-2: R2, R4 = OH
OH OH
OH HO
OH HO
O
OH HO
O OH
OH
OH R1 R2 O
OH HO
OH
OH HO
OH
R1 OH O
OH
R1
OH
O
R2 R3 R4
OH HO Procianidin dimer B-6: R2 = OH Procianidin dimer B-8: R1 = OH
Procianidin trimer C-1: R2, R4 = OH Procianidin trimer C-2: R2, R3 = OH
(a külön nem jelzett R csoport = H)
30
koncentrációjával (87). Azonos fenolkoncentrációra higított vörös- és fehérborokat összehasonlítva, magasabb antioxidáns aktivitást tapasztaltak a vörösboroknál, ami jelzi ez utóbbiak polifenolos vegyületeinek erőteljesebb antioxidáns hatását (87). A 10 napon át, naponta elfogyasztott 200 ml vörösbor szignifikánsan csökkentette a szérum LDL-szintjét, de nem befolyásolta a szérum koleszterin-, trigliceridés HDL-szintet, az antioxidáns státuszt és ezen belül az LDL oxidációval szembeni érzékenységét (261). A vörösbor polifenolos vegyületei között nagy mennyiségben megtalálható procianidinek fehérjékhez való kötődésének erőssége jelentősen befolyásolhatja a vegyületek antioxidáns viselkedését. A polifenolok általában jól kötődnek az LDL-hez és endogén antioxidáns (C és E vitamin) analógokként viselkednek (300). A vörösbor polifenoljai feltehetően szinergistái a tokoferolnak és az aszkorbinsavnak, ezáltal fokozottabb mértékben gátolják a lipid peroxidációt (209). 2. táblázat
Kereskedelmi borok átlagos polifenoltartalma Asztali bor
Komponens (mg/l)
Desszert bor
Fehér
Vörös
Fehér
Vörös
165
200
145
190
Illó fenolok
1
5
1
5
Tirozol
14
15
9
10
Hidroxibenzoesav származékok
10
40
5
35
Hidroxifahéjsav származékok
140
140
130
130
35
1000
60
700
Katechinek
25
75
50
80
Antociánok és származékok
0
400
0
300
Egyéb monomer flavonoidok
0
25
5
20
Dimer és polimer tanninok
5
500
5
300
200
1200
205
890
Összes nem-flavonoid, ebből
Összes flavonoid, ebből
Összes polifenol
Említést érdemel a resveratrol is, melynek jelenléte a borban hosszú ideig - egyébként minden közvetlen bizonyíték nélkül- az egyik lehetséges magyarázata volt a Francia paradoxonnak. A fitoalexin resveratrol (3,4,5-trihidroxisztilbén)
fungicid hatású komponens, amely sztilbén-szintetáz enzim jelenlétében
keletkezik patogén mikroorganizmusok hatására. Feltételezett szerteágazó terápiás hatása miatt a keleti gyógyászatban gyakran alkalmazzák anyagcsere-, gyulladásos és szívbetegségek ellen egyaránt (137). A resveratrol in vitro gátolta a tromboxán B2 keletkezését patkányok leukocitáiban, valamint csökkentette a lipidek szintézisét, és a protein tirozinkináz aktivitását. In vitro körülmények között gátolta a Cu2+-ionok által katalizált LDL oxidációt (85). Humán vizsgálatokban igazolták, hogy a tiszta resveratrol önmagában
31
és magas polifenoltartalmú borhoz adagolva csökkentette a trombocita aggregációt (216). Ugyanakkor úgy tűnik, hogy a resveratrol kevésbé hatásos antioxidáns, mint a katechin és a kvercetin (85). A resveratrol a vörösbor összes fenolos komponenseinek mintegy 0.1 %-t teszi ki, fehérborokban gyakorlatilag nem mutatható ki. Az ischémiás szívbetegségek kockázatának csökkentésében a bor eredetű fenolos komponensek kedvező hatása antitrombotikus mechanizmusokon keresztül is érvényre juthat. Kettő és négy hónapig tartó étrendi vörösbor kiegészítés gátolta a trombocitaaggregációt patkányokban, szemben a többi alkoholos itallal, melyek hatástalanok voltak. A bor megvonása után nem kezdődött meg a trombociták reaggregációja, amely jelenség embereknél összefüggésbe hozható a hirtelen halállal és a miokardiális infarktussal (245). Feltételezhető, hogy a reaggregációs effektus hiánya a vörösbor eredetű fenoloknak köszönhető, és az alkoholfogyasztás következtében fokozódó lipidperoxidáció is mérséklődik. (20). A bor fenolos vegyületei gátolták a trombociták és makrofágok cikloooxigenáz és lipoxigenáz aktivitását és így lassították a trombotikus folyamatokat (199). A kvercetin nagy valószínűséggel csökkenti a szabad intracelluláris Ca2+ hasznosulását a Ca2+-dependens ÁTP-áz gátlásával (21). Az alacsonyabb Ca2+ szint megvédheti a sejtváz aktomiozinját az aktiválástól, ami szükséges a trombocitaaggregációhoz. Egyes borkomponensek antioxidáns tulajdonságaik révén gátolják az endoteliális prosztaciklin és az endotélfüggő relaxációs faktor (EDRF) lipid peroxidáció okozta károsodását. A prosztaciklinek és az EDRF-ek gátolják a trombocita aggregációt. Pace-Asciak megfigyelései szerint a vörösbor flavonoidok közül a kvercetin, valamint a resveratrol in vitro dózisfüggően gátolták a trombin- és ADP-által indukált humán trombocitaaggregációt, valószínűleg a foszfolipáz C aktivitásának gátlásán keresztül (217). Fitzpatrick és munkatársai feltételezik, hogy a szőlő származékok értágító hatása a nitrogénoxid/guanozin 3',5'-ciklikus monofoszfát (cGMP) rendszer befolyásolásán keresztül valósul meg (82). A vörösbor fenolos vegyületeinek felszívódására csak közvetett bizonyítékok állnak rendelkezésünkre. Feltételezhető, hogy a vizes alkoholban oldott vegyületek felszívódása hatékonyabb, mint szilárd élelmiszerekből (62, 112, 282). Humán vizsgálatokban napi 5.7 ml/ttkg dózisú vörösbor fogyasztása szignifikánsan növelte a szérum (kemilumineszcenciás módszerrel mért) antioxidáns kapacitását a kontrollhoz és a fehérbort fogyasztó csoportokhoz viszonyítva (182, 309). Két hétig fogyasztott napi 400 ml vörösbor 20%-kal csökkentette a vérplazma lipidperoxidációval szembeni érzékenységét in vitro szabad gyököt generáló rendszerben, ugyanakkor gátolta az LDL rézionok jelenlétében lejátszódó oxidációját is. Számos kedvező, elsősorban in vitro eredmény ellenére azonban a vörösbor in vivo kardioprotektív hatása az eddigi ismereteink szerint nem egyértelmű, ezért további vizsgálatok elvégzése szükséges a határozott következtetések levonására.
32
2.5.
A FEKETE RETEK
2.5.1.
A szabad gyökös reakciók és az epekőbetegség közötti kapcsolat
A helytelen étkezési szokások miatt a nagyvárosi lakosság energia, zsír, koleszterin, cukor és konyhasó fogyasztása a szükségesnél több, míg a rost, vitamin, kálium, kalcium, magnézium és mikroelem bevitele kisebb, mint az a szervezet egészséges működéséhez elengedhetetlen. Mindezek következménye, hogy nő a táplálkozással összefüggő megbetegedések száma. Ebbe a csoportba sorolhatók az epebetegségek is, mivel kialakulásukban jelentős szerepet játszik a zsírbő és rostszegény táplálkozás, valamint a rendszertelen étkezés. A korábbi elképzelés szerint az epekőképződés a lipidmetabolizmus módosulásának, a májbetegségekre jellemző epekiválasztási zavaroknak és az enterohepatikus körforgásban bekövetkező rendellenességeknek tulajdonítható (53, 268). Az elmúlt évtizedben kiderült, hogy az epekőképződésében az epehólyag falában lejátszódó biokémiai folyamatok is fontos szerepet játszanak, amelyek következtében prosztaglandinok keletkeznek és a mucin szekréció is fokozódik (11, 47). Ismertté vált továbbá a szabad gyökös reakciók szerepe is az epekőképződésében. Cholecystectomián átesett betegek epehólyagjából nyert epe vizsgálata során lipidperoxidációs termékek jelenlétét igazolták (5). Kemilumineszcenciás módszerekkel végzett vizsgálatok alapján feltételezhető, hogy az epében szekretálódó szabad bilirubin koncentrációtól függően prooxidáns tulajdonságú, amely kapcsolatba hozható a barnakövek kialakulásával (27, 28, 30, 31). Eder és munkacsoportja kimutatta, hogy az epehólyag falában lejátszódó gyulladásos folyamatokban keletkező szabad gyökök elősegítik az epekőképződést (70). Feltételezték, hogy a lipidperoxidációs termékek koncentrációjának növekedése és a hidroxilgyökök keletkezése összefüggésben van az epenukleáció időbeli fokozódásával. Ismert továbbá, hogy alimentáris eredetű steatosis hepatisban a májban primer és szekunder szabad gyökös reakciók játszódnak le. A természetes prooxidáns/antioxidáns egyensúly eltolódása miatt a szabadgyök-képződés felerősödik, az antioxidáns védelem elégtelenné válik, ami a májban gyors szöveti nekrózishoz vezet. Megváltozik az epében a koleszterin/epesav és a koleszterin/foszfolipid arány. Módosul a foszfolipidek telítetlen és telített zsírsavainak aránya, az epe szekréciója és az enterohepatikus cirkuláció (27, 28, 30, 2). Az előbbiek alapján feltételezhető, hogy a szabad gyökök lipidperoxidációs folyamatokat iniciálnak az epében is, és a reakciók az epehólyagban is folytatódnak. Így megváltozik a hólyagepe konzisztenciája és a módosult reológiai viszonyok hozzájárulnak a koleszterinkövek gyors kialakulásához (70). Állatkísérletekben alimentáris úton előidézett hyperlipidaemiában a máj és az epe szabad gyökös paramétereinek szignifikáns eltérése az egészséges állatok értékeitől a lipidperoxidációs paraméterek felerősödését jelezték (24). A humán hólyagepében kimutatott többszörösen telítetlen zsírsavak és oxidációs termékeik, a konjugált diének, oxidált lipidek és a malondialdehid jelenléte alátámasztja, hogy a
33
lipidperoxidációs folyamatok szerepe nem hagyható figyelmen kívül az epekőképződés mechanizmusában (30). Az epével peroxidálható lipidek és lipidperoxidációs prekurzorok és termékek transzportálódnak a bélbe (28). Jelenlegi ismereteink szerint a diabetes patogenezisében is szerepet játszanak a patológiás szabad gyök reakciók. A hiperglikémia fokozott szabadgyök-termelődést idéz elő, és irodalmi adatok rámutatnak a szabad gyökök mediátor szerepére az endotél sejtek diabetesben kimutatható diszfunkciójára is (49). Az enzimes és/vagy nem-enzimes antioxidáns védelmi mechanizmus kedvezőtlenül megváltozott állapota is jellemző mindkét típusú diabetesben (123, 221, 229, 295, 299). Jóllehet az epekőbetegség multifaktoriálisan meghatározott eredetű –genetikai, környezeti vagy szerzett tényezők játszhatnak szerepet kialakulásában- napjainkban számos szerző hívja fel a figyelmet a diabetes és az epekőbetegségek közötti szoros összefüggésekre. A megváltozott glükóz metabolizmus fokozott rizikó faktornak tekinthető a cholelithiasis kialakulásában (13, 63, 184). Keshavarzian felmérései szerint a több mint húsz éve diabetesben szenvedő betegek 30%-ánál mutatható ki epekő, szemben az egészséges populációra jellemző 11.6%-kal (135). A diabetesben szenvedő betegek epehólyagja az esetek többségében nagy méretű, összehúzódó képessége, telítődése mérsékeltebb, mint az egészséges egyéneké, mely tényezők ismételten elősegíthetik az epekő kialakulását (135). Abdel Rahman vizsgálatai szerint a női nem és a diabetes mellitus jelentős rizikófaktorai lehetnek az epekő kialakulásának (6). A hosszan tartó diabetesben az emésztőrendszer bármely területén kialakuló gasztrointesztinális neuropathia tehető felelőssé a cukorbetegek legtöbbjénél tapasztalható kellemetlen emésztőrendszeri tünetekért, mint például a fokozott gázképződés, teltségérzés, emésztési zavarok, székrekedés, hasmenés, hányinger (221). Mivel a diabetes jelentős mértékben a befolyásolja az emésztőrendszer működését, az epekőbetegség és a diabetes közötti összefüggés nem kétséges (46). 2.5.2
Az epepanaszok csökkentése növényi hatóanyagokkal
A cholagogumok epehajtószerek, melyek kétféle mechanizmus szerint befolyásolják az epe elfolyását. A koleretikumok serkentik a máj epetermelését, a kolekinetikumok elősegítik az epehólyag kiürülését. Általában az epe kezelésében használt legtöbb szer egyidejűleg koleretikus és kolekinetikus hatású, így a duodenumba kevert epe (májepe- és epehólyag-exkrétum) kerül. A cholagog hatás feltétele a megfelelő májfunkció, a jó el- és átfolyási feltételek az epeutakban. Fontos, hogy a cholagogumnak ne legyen mellékhatása, ne legyen májtoxikus és segítségével az epeelfolyás tartósan biztosítva legyen (99, 222, 240). A koleretikumok megnövelik az epesavak, a bilirubin, a koleszterin, a lecitin, a fehérje és a bikarbonátok elválasztását. A koleretikus hatás minden olyan, epére ható anyag jellemző nem specifikus tulajdonsága, amelyet a májsejtek aktívan transzportálnak az epébe (302). Az ideális koleretikum úgy változtatja meg a litogén indexet (májepe koleszterin/epesav hányadosa), hogy a kőképződési hajlam minimalizálódjon, ill.
34
a már meglévő kövek feloldódjanak. Az eddig ismert koleretikumok ugyan nem változtatják meg a litogén indexet, sem a kőképződési hajlamot nem befolyásolják, de egyesek megemelik az enterohepatikus átfolyási rátát. A májban a koleszterinből történő epeszintézist döntően az epesav-kínálat irányítja, amely az enterohepatikus körforgáson keresztül ömlik vissza a májba. Az olyan anyagok, amelyek a béltraktusba megnövekedett epesav kiválasztást indukálnak, fokozzák az epesavból való re-szintézist, így az enterohepatikus átfolyási ráta megemelkedik. Az ilyen anyagok egyúttal csökkentik a szérum koleszterinszintet is. A megemelkedett enterohepatikus átfolyási ráta csökkenti az epekő (főleg koleszterinkő) kialakulásának veszélyét. A dehidrokólsav az egyik legerősebb koleretikus hatású anyag (240). A kolekinetika fiziológiás és patológiás epehajtó mechanizmus. Az epehajtás az epehólyag és a sphinctertonus jól összehangolt működésével jön létre (236). Amikor a táplálék a duodénumon áthalad, az epe kiáramlik, majd nyugalmi időszakban az epehólyag ismét feltöltődik. A kolekinetikus szerek növelik a simaizmok motilitását, így a gyomor- és béltraktusét is. Ennek megfelelően elősegítik a perisztaltikát, így az áthaladási idő is lerövidül. A legerősebb kolekinetikus szerek az acetilkolin és a kolecisztokinin. Az epeút kinetikájának fiziológiás stimulálója a duodenális táplálékpép áthaladásának mechanikai ingere (222). A növényi eredetű koleretikumokra jellemző a fűszerjelleg, a minimális energiatartalom. A cholagog hatás kialakulhat a szag- és ízhatás, valamint a nyálkahártya gyenge izgatása révén reflexes úton (124). Hosszú ideig tartó kezelésre is alkalmasak, mivel nem váltanak ki drasztikus szekréciót, alacsony dózisban is alkalmazhatók, és a mellékhatások rizikója alacsony. A növényi cholagogumok az epehólyag diszkinéziájának (működési vagy mozgási zavar) hosszú ideig tartó kezelésére megfelelőek (99). Általános gasztrointesztinális kórképek, mint a diabetes mellitus mellett megjelenő haspuffadás, teltségérzés, felszívódási zavar, jól reagálnak a koleretikumokra, mivel ezek ösztönzik az epe-, pancreasés duodenumnedv elválasztását (222). 2.5.3.
A fekete retek jellemzői
A fekete retek (Raphanus sativus L. var. niger) régóta ismert és használt élelmiszer és fűszernövény. A keresztesvirágúak családjába (Brassicaceae, Cruciferae) tartozó retket régi kultúrnövényként tartják számon. Diószegi Sámuel az 1813-ban megjelent Fűvészkönyvében részletesen írt a retek orvosi hasznáról, így annak vesekőoszlató, féreghajtó és légzéskönnyítő tulajdonságairól. A népi gyógyászatban a hasi puffadás, teltségérzés, elégtelen emésztés kezelésére és megelőzésére, valamint az epekő kialakulásának megakadályozására és az epetermelés fokozására használják (37, 120, 294). Azokon a területeken, ahol hagyománya van a fekete retek nagy mennyiségű fogyasztásának, az epekő betegségek normál populációhoz viszonyított kisebb prevalenciája mutatható ki (218). Gyógyhatású anyagai között mustárglikozidokat (izotiocianátokat), illóolajokat, enzimeket, enzim-inhibitorokat, mikroelemeket, B- és
35
C-vitamint tart számon az irodalom (222). Jelentős baktérium- és gombaölő hatású fitoncidot – rafaninttartalmaz. Popovic és munkatársai a fekete retek préslé hatását tanulmányozták patkányokban paracetamollal előidézett májkárosodásban (227). Jóllehet szignifikáns védőhatást nem tudtak kimutatni, néhány kedvező adat, pl. a fokozott epeelválasztás jelezte a készítmény kedvező hatását. Irodalmi adatok szerint a fekete retek koleretikus és kolekinetikus hatással is rendelkezik. Feltételezhetően közvetlen epehajtó hatása kevésbé érvényesül. Jelentősebb, bár közvetett hatásnak tekinthető a belek falát megcélzó tonizáló hatás, valamint a perisztaltika fokozása (308). Ezenkívül a fekete retek aktív hatóanyagai kapcsolatba lépnek a gyomor, az epehólyag és a pylorus túlfeszült izomzatával. Ezért az epevezeték krónikus diszkinézise és obstipációval társuló diszpepsziás bántalmak esetén rendszeresen napi 100-150 g fekete retek elfogyasztásával kiváló hatás érhető el (308). Rendszeres fogyasztása epekövességre való hajlam (pl. hyperlipidaemia, Crohn betegség, ileum reszekciót követő állapot, gluténszenzitív enteropathia, diabetes mellitus, obesitas, többszöri szülés), elégtelen epeelválasztás esetében ajánlott. Epegörcs esetén kimondottan hatásos. Egyes szerzők a fekete retek levének diuretikus és vesekőképződést gátló hatását is leírták (159, 293). 2.5.4.
A fekete retek bioaktív hatóanyagai
A fekete retek jelentős mennyiségben tartalmaz glükozinolátokat, izotiocianátokat, illóolajokat, flavonoidokat és egyéb fenoloid komponenseket. A glükozinolátok alapszerkezete és néhány, a természetben gyakran előforduló képviselőjük, valamint hidrolízisük során keletkező vegyületek szerkezete a 9. ábrán látható. Az R csoport lehet alifás (elágazás nélküli) szénlánc, aralkil vagy indol szerkezetű oldallánc. Az izotiocianátok a glükozinolátok (GI) aglikonjai, melyek a mirozináz enzim hatására keletkeznek. A glükozinolátok és az enzim-katalizált hidrozolízis során belőlük keletkező termékek a káposztafélék, mustárfélék, torma, retek, repce (keresztesvirágúak) leveleiben, magvaiban, terméseiben egyaránt nagy mennyiségben fordulnak elő (80, 242). A glükozinolátok a növényi metabolizmus másodlagos termékei, alapvető feladatuk a növényi patogének, rovarok és rovarlárvák okozta károsodások kivédése (151). A különböző növényekben több mint száz glükozinolátot azonosítottak (147). A 3. táblázat adatai szerint a káposztafélékben dominánsan az indol oldalláncú GI-k találhatók meg, addig a fekete retekben elsősorban az alifások, azon belül mintegy 97 %-ban a 4metiltiobutenil szerkezetű glükozinolát mutatható ki (52). A glükozinolátokat korábban kizárólag antinutritív komponensekként tartották számon, mivel magas glükozinoláttartalmú zöldségfélék gyakori fogyasztása jódhiányos területeken, elégtelen jódbevitel esetén a golyva kialakulásának gyakoriságát fokozta (290). A GI-k és a hidrolízisüket katalizáló mirozináz enzim az intakt sejtekben egymástól elzárt sejtorganellumokban találhatók, mechanikai hatásokra azonban e sejtalkotók falának integritása megszűnik, ezért az enzim könnyen hozzáfér a glükozinolátokhoz. A hidrolízis során a molekulában
36
egyidejűleg szerkezeti átalakulás is zajlik. A reakcióban izotiocianátok, régebbi elnevezésük szerint mustárolajok keletkeznek (290). Ezek a vegyületek okozzák a káposztafélék, a retek, a mustár jellegzetes szagát. A mustárolajok formálisan az izotiociánsavak észtereinek tekinthetők. A folyékony mustárolajok illata erőteljes, a nyálkahártyát ingerlik, a bőrön hólyagot húznak. Hosszabb tárolás során elbomolhatnak és többek között diaminok, rodanidok, xantogénsav származékok keletkezhetnek (169). A hidrolízis során nitrilek, valamint alkilrodanidok is keletkeznek (139). Az utóbbi tíz évben a GI-k és hidrolízisük során keletkező származékaik ismét a táplálkozástudományi kutatások előterébe kerültek feltételezett kedvező biológiai hatásuk miatt. Bizonyos típusú (kémiai anyagokkal indukált) daganatos megbetegedések gyakoriságának csökkenése feltételezhetően kapcsolatba hozható az indol oldalláncú glükozinolátokat tartalmazó zöldségfélék nagy mennyiségű fogyasztásával (142, 160, 306, 307). A glükozinolátok szerepe a tumor kialakulásának visszaszorításában nem teljesen ismert. A glükozinolátok antikarcinogén hatásának vizsgálatával foglalkozó kutatók egy része azt feltételezi, hogy ezek a vegyületek semlegesítik a karcinogéneket azáltal, hogy nem toxikus komponensekké való átalakulásukat elősegítik vagy visszaszorítják a neoplasztikus sejtek proliferációját (207, 219). Wattenberg és munkatársai szerint a GI-k megakadályozzák, hogy a karcinogén molekulák eljussanak a célsejtekhez (306). Más elképzelés szerint indukálják és/vagy aktiválják a máj legfontosabb antikarcinogén enzimeit, a kinon-reduktázt és a glutation-S-transzferázt, illetve módosítják a mikroszomális monooxigenáz enzimrendszer (citokrom P450) aktivitását (266, 311, 312, 313). E fentebb vázolt mechanizmusok alapján tehát a glükozinolátok koncentrációjuktól és a környezetüktől függően (pH, egyéb molekulák, antioxidánsok és pro-oxidánsok jelenléte, stb.) függően toxikus vagy "anti-toxikus" hatásúak lehetnek (291). Néhány szerző a glükozinolátok és a belőlük keletkező izotiocianátok direkt antioxidáns hatásáról is beszámolt (312). Edenharder és munkatársai kimutatták, hogy más növényi élelmiszerek mellett a retekből származó acetonos kivonat antiklasztogén hatással rendelkezik a cikloszfoszfamiddal és a benzo(a)pirénnel szemben egér csontvelőben (69).
37
9. ábra A glükozinolátok szerkezete és a hidrolízisük során keletkező vegyületek
+ X
R
O S O
OH
O N
O
S
O
OH
R: CH2=CHCH2CH2=CH(CH2)2p-HOC6H4CH2C6H5CH2CH3SOCH=CH(CH2)2-
+ X
OH
OH
Szinigrin Glükonapin Szinalbin Glükotropaeolin Glükorafenin
R
O
OH
O S
N O
O
O
S OH
OH
OH
Mirozináz/H2O OH
_
HS
SO3
N
+
O R
HSO4-+X+
Izotiocianátok
pH<6.5 és/vagy Fe2+, cisztein Nitrilek
OH
OH
D-glükóz
Tiohidroxamát-O-szulfonátok
pH>6.5
O
HO
Ciano-epitioalkánok
38
OH
A fekete retek egyéb biológiailag aktív komponensei közé tartoznak még a korábban bemutatott flavonoidok és más fenolos szerkezetű vegyületek, valamint néhány illóolaj. Eloesser TLC-s vizsgálatai szerint a retek 1-10 mg/kg mennyiségben tartalmaz kempferolt, elsősorban glükozidos formában, valamint a fenolsavak közül p-kumarinsav és ferulasav mutatható ki (73, 276). Hertog és munkatársainak HPLC-s vizsgálatai szerint a retek gumó átlagosan 1 mg/kg kvercetint és 6.2 mg/kg kempferolt tartalmaz (108). Saját vizsgálataink során a fekete retekben 21.1 mg/kg kempferolt sikerült kimutatni, a piros héjú tavaszi fajtában 10.5 mg/kg kempferol, míg a jégcsap retekben 25.7 mg/kg kempferol és 5.7 mg/kg kvercetin volt (167). 3. táblázat
Káposztafélék intakt glükozinoláttartalma (mg/100 g nedves tömeg) Glükozinolátok
Brokkoli
Kelbimbó
Fehér
Fekete retek
káposzta Alifás Glükoiberin
-
-
10.9
-
19.3
32.3
3.7
1.1
-
128.1
52.5
-
Glükorafanin
18.0
2.3
-
0.2
Glükorafenin
-
-
-
12.6
Napoleiferin
2.3
ny
0.5
2.4
Glükoallizin
-
-
-
0.8
Glükonapin
1.3
10.1
1.5
-
-
0.9
3.0
ny
2.1
ny
-
7.5
-
-
-
977.8
Tropaeolin
ny
Ny
ny
ny
Glükonasturtiin
ny
2.2
0.9
ny
4-OH-glükobrasszicin
5.5
6,3
0.8
5.3
Glükobrasszicin
80.7
100.1
16.5
8.7
4-metoxi-brasszicin
12.2
12.1
7.6
5.8
Neoglükobrasszicin
78.5
2.3
1.1
6.3
219.9
322.7
99.0
1028.5
Progoitrin Sinigrin
Glükoibervirin Glükoerucin 4-metiltio-butenil glükozinolát Arkaril
Indol
Összes
39
3.
CÉLKITŰZÉSEK, A TÉMA INDOKLÁSA
Az utóbbi években számtalan biokémiai, orvosi és táplálkozástudományi vizsgálat eredménye támasztja alá hosszú évszázadok során alkalmazott, de napjainkra feledésbe merült népi gyógymódok és egészségmegőrző eljárások létjogosultságát (22, 25, 26, 29, 134, 222, 223). Napjainkban ezek a tudományosan megalapozott természetes hatóanyagokat felhasználó eljárások bizonyos típusú betegségek primer prevenciójában is fontos szerepet kaphatnak. A zöldség- és gyümölcsfélék, fűszer- és gyógynövények táplálkozásélettani szerepének megértésére irányuló erőfeszítések egy potenciálisan antioxidáns vegyületcsoportot, a növényi polifenolokat, kiemelten a flavonoidokat hozták az érdeklődés előterébe. Az élelmiszer eredetű flavonoidok élettani hatásai jelenlegi ismereteink szerint főleg preventív (betegségmegelőző) jellegűek. Természetesen számos flavonoid hatóanyagú, terápiás célokra alkalmazott gyógyszer van forgalomban (például a Rutascorbin, a Detralex, a Legalon, a Silegon), de a prevencióban és a terápiában érvényesülő dózisok, valamint a hatás ideje között számottevő különbség van. Az étrendi flavonoidok más élelmiszeralkotókkal együtt jutnak a szervezetbe, ezért hatásukat a kísérő, ill. jelenlévő egyéb
komponensekkel
történő
kölcsönhatások
is
befolyásolják.
A
flavonoidok
széleskörű
kémia/biokémiai hatással rendelkeznek. Jelenlegi ismereteink szerint azonban nincs egy olyan kitüntetett biokémiai hatás, amelyért kizárólag a flavonoidok tehetők felelőssé. A flavonoidok humán szervezeten belüli kémiai/biokémiai reakciói és farmakokinetikai jellemzői nagyon kevéssé ismertek, ezért napjainkban a kutatások középpontjában a flavonoidok metabolizmusa áll: hogyan és milyen mértékben történik e vegyületek felszívódása és hasznosítása. Kutatásaink során arra kerestünk választ, hogy néhány kiválasztott élelmi anyag hogyan befolyásolja az élő szervezetben lejátszódó patológiás szabadgyök-reakciókat. A vizsgálatok célja az volt, hogy megállapítsuk, az adott élelmiszerek rendszeres fogyasztása elősegíti-e az egészség megőrzését és bizonyos típusú, a fokozott oxidatív stresszel összefüggésbe hozható megbetegedések megelőzését. A felmerült kérdésekre egy több szintből álló vizsgálati rendszer összeállítása vált szükségessé, melyben az egyes vizsgálati eljárások sorrendjének betartása teszi lehetővé a kapott eredmény tudományos igazolását. A kutatások során a fekete retekből készült préslé, a Raphacol epegranulátum és az ország különböző tájegységeiről származó fehér- és vörösborok vizsgálatára került sor. Napjainkban az egyre nagyobb számban megjelenő tudományos közlemények között kiemelt fontosságúnak tartottuk a vörösborok kedvező élettani hatásáról beszámoló tanulmányokat. Hazánkban az alkoholfogyasztás mértéke és ezen belül az égetett szeszesitalok mennyisége az elmúlt 30 évben jelentősen emelkedett, valamint a cirrhosisos halálozások száma az utóbbi tíz évben közel negyven százalékkal nőtt. Ezért reméljük, hogy a
40
vörösborokkal végzett kedvező vizsgálati eredmények a lakosság számára is hozzáférhetővé válnak, és hatással lesznek a rendszeres alkoholfogyasztók választására és a szervezetre kevésbé káros italokat helyezik előtérbe a tömény italokkal szemben.
Közismert, hogy Magyarországon a táplálkozással összefüggő megbetegedések aránya jóval nagyobb, mint a fejlett európai államokban. Ezen megbetegedések közé tartoznak a máj és az epe bizonyos típusú elváltozásai is. Laboratóriumi vizsgálat sokasága támasztja alá némely élelmi anyag, zöldség- és főzelékfélék előnyös tulajdonságait e megbetegedések megelőzésében. Számos esetben okunk van feltételezni, hogy a növényi hatóanyagok többféle mechanizmuson keresztül fejtik ki jótékony hatásukat. Ezért esett a választásunk a fekete retek préslére, valamint a belőle előállított, gyógyszertári forgalomban kapható Raphacol epegranulátumra. A vizsgálatok során arra is választ kerestünk, hogy a már régóta ismert kedvező hatásain túl a fekete retek hatóanyagait koncentráltan tartalmazó preparátumok egyéb kémiai-biokémiai folyamatokon keresztül is befolyásolják-e a szervezet működését. 1.
A kutatások során első feladat volt a vizsgálni kívánt élelmiszerek biológiailag aktív vegyületeinek minőségi és mennyiségi értékelése. A tanulmányozott növényi anyagokban elsősorban olyan vegyületeket kerestünk, melyek a nemzetközi irodalmi adatok szerint antioxidáns hatásúak. Ehhez a munkához
a
rendelkezésünkre
álló
analitikai
módszerek
közül
spektrofotometriás
és
nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC-s) eljárásokat választottunk. Ezek segítségével a vizsgált élelmi anyagokban igazolni tudtuk a feltételezett bioaktív anyagok jelenlétét, valamint pontos mennyiségüket meghatároztuk. 2.
A vizsgálati rendszer második szintje az in vitro hatások értékelése. Köztudomású, hogy az antioxidáns kifejezés rendkívül összetett folyamatot takar, nem megfelelő használata sok félreértést eredményezhet a kísérleti eredmények értékelése során. Ezért olyan komplex, in vitro vizsgálati rendszert állítottunk össze, melynek segítségével a vizsgált növényi anyagok össz-antioxidáns tulajdonságát eredményező különböző kémiai reakciók is tanulmányozhatóvá váltak. Így sor került többek között a hidrogén-donor és komplexképző tulajdonságok, a redukálóképesség és a szabadgyök-befogó hatások vizsgálatára. A tesztrendszer egy-egy eleme önmagában nem ad elegendő felvilágosítást a vizsgált anyag tulajdonságairól, de több módszert kombinálva hasznos információkat kaphatunk a minta hatásmechanizmusáról, hatásspektrumáról. Az eredmények alapján a bioaktív vegyületek mennyisége, valamint az egyes antioxidáns jellemzők közötti összefüggések is feltárhatóvá válnak.
3.
Az in vitro körülmények között igazoltan antioxidáns hatású növényi anyagokkal in vivo short-term állatkísérletes vizsgálatokat végeztünk az élő szervezetben lejátszódó folyamatok tanulmányozására, mivel biokémiai vizsgálatok sokasága bizonyítja, hogy az in vitro körülmények között antioxidánsként viselkedő vegyületek a szervezetben nem mindig hatásosak, vagy nem egészen úgy
41
és olyan dózisban hatnak, ahogy azt az in vitro eredmények alapján gondoltuk volna (38, 39, 112, 113). A választott állatkísérleted modell az alimentáris, étrendi úton előidézett hyperlipidaemia volt. Korábbi vizsgálatokban beigazolódott, hogy a nagy zsír- és koleszterintartalmú táppal etetett állatokban a fokozott oxidatív stresszel kapcsolatosan biokémiai és morfológiai elváltozások alakulnak ki (22, 23, 24, 29, 163). A nagy zsír- és koleszterintartalmú táppal együtt fogyasztott fekete retek présé hatását tanulmányoztuk e kedvezőtlen folyamatok alakulásában. Ez a modell napjainkban nagy jelentőséggel bír, mivel a már említett hazai populációs szintű reprezentatív táplálkozási vizsgálat szerint a lakosság energiafogyasztásának 40 %-a zsírból származik az ideálisnak tekinthető 30 % helyett. Ezért a magas zsírtartalmú tápon tartott állatokban, étrendi antioxidánsok hatására bekövetkező változások tanulmányozása segítséget nyújthat abban, hogy a lakosság számára megfelelő ajánlásokat tehessünk a szabad gyökös reakciókkal kapcsolatos megbetegedések megelőzése érdekében. 4.
Az in vitro, valamint az in vivo állatkísérletes vizsgálatok eredményei alapján humán vizsgálatokat végeztünk a fekete retek préslét, valamint édesköményolajat tartalmazó Raphacol epegranulátummal. Ismeretes, hogy a diabetes mellitus napjaink népbetegségévé vált. A diabetes az egyik leggyakoribb táplálkozással összefüggő megbetegedés, a felnőtt korban kezdődő cukorbetegség szorosan kapcsolódik a helytelen táplálkozáshoz és az elhízáshoz. A korszerű glükózszint-csökkentő készítmények, a rendszeres orvosi ellenőrzés és a jól beállított diéta következtében a diabetesben szenvedő betegek várható élettartama alig tér el az egészséges lakosságétól. Vannak azonban a betegségnek olyan szövődményei, például a gasztrointesztinális problémák, az epekőbetegség, az atherosclerosis, melyek a betegek életminőségét lényegesen ronthatják. E szövődmények nagy része összefüggésbe hozható a diabetesben fokozottabban érvényesülő szabad gyökös elváltozásokkal, valamint az antioxidáns védelmi rendszer károsodott működésével. Ezért egy hat hónapig tartó Raphacol kúra hatását vizsgáltuk meg a lipidperoxidációs folyamatok alakulására I. és II. típusú diabetes mellitusban szenvedő betegekben. Megpróbáltunk következtetéseket levonni arra vonatkozóan, hogy a tapasztalt és biokémiailag is igazolt kedvező hatások szerepet játszhatnak-e bizonyos szövődmények, elsősorban az epekő kialakulásának visszaszorításában. Az elvégzett kémiai-biokémiai vizsgálatok alapján pontos képet kaphatunk a vizsgált készítményről, kedvező hatásairól, és bizonyos megbetegedések gyógyszeres kezelése mellett adjuvánsként történő alkalmazásának lehetséges területeiről.
42
4. 4.1.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK KÉMIAI REAGENSEK
Az analitikai és laboratóriumi vizsgálatokhoz az alábbiakban felsorolt vegyszereket és standard vegyületeket használtuk: SIGMA: szulfatáz (EC. 3.1.6.1), 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil, csersav, tetrametilmurexid, galluszsav, luminol, kvercetin, mikroperoxidáz, luteolin, xantin, miricetin, citokróm c, apigenin, kempferol, koleszterin, aszkorbinsav, kolsav, DL-α-tokoferolacetát, koleszterin-észteráz (EC. 3.1.1.1.13), retinol–palmitát, retinol-acetát, terc-butilhidrokinon, koleszterin-oxidáz (EC. 1.1.3.6), glutationperoxidáz (EC. 1.11.1.9), peroxidáz (EC. 1.11.1.7), NADPH, kataláz (EC. 1.11.1.6), glutation-Stranszferáz (EC. 2.5.1.18), kumén hidroperoxid, MERCK : metanol, triklórecetsav, hexametiléntetramin, TRIS, glükóz, fruktóz, szacharóz, maltóz, laktóz, Sil G 60 F254 réteg, ciklohexán, heptán, etanol, kloroform, kénsav, salétromsav, FolinCiocalteus fenol reagens, SERVA: xantinoxidáz (EC. 1.1.3.22), linolsav, ammónium-tiocianát, n-hexán, etilacetát, izopropanol, 5,5-ditiobisz-nitrobenzoesav, redukált glutation, glükóz-6-foszfát dehidrogenáz (EC. 1.1.1.49), glükóz-6-foszfát,kristályos marha szérum albumin, 1-klór-2,4-dinitrobenzoesav, FLUKA: adrenalin, 1,1,3,3-tetraetoxipropán, retinol, α-tokoferol, ACROS Organics: Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetrametillkromán-2-karboxilsav). CALBIOCHEM: superoxid dizmutáz (EC. 1.15.1.1), Az itt nem szereplő vegyszerek és oldószerek analitikai tisztaságú Reanal készítmények voltak. Az oldatok készítéséhez minden esetben bidesztillált vizet használtunk. A pufferek pH-ját Reanal gyártmányú standard pH oldatok segítségével, Radelkis OP-264/1 laboratóriumi pH mérővel állítottuk be. A spektrofotometriás méréseket Perkin Elmer Lambda 3B típusú fotométeren végeztük el.
43
4.2.
ANTIOXIDÁNS HATÁSÚ ANYAGOK
4.2.1.
Fekete retek préslé
A fekete retek préslét a Parma Produkt Kft. megbízásából a Nagykőrösi Konzervgyár állította elő. A beérett fekete retek gumókat megtisztítva és a sérült részeket eltávolítva a feldolgozásig hűvös, sötét helyen tárolták. A feldolgozás során a gumókat kis darabokra aprították, majd egy, a rostos gyümölcslevek előállításához használt gyártósoron a levet kipréselték, majd szűrték. A préslevet a további felhasználásig fagyasztószekrényben tárolták. Az összetételi adatok és az antioxidáns tulajdonságok meghatározáshoz, valamint az állatkísérletes vizsgálatokhoz későbbiekben felhasználni kívánt friss préslét kis üvegekbe töltöttük és –18oC-on fagyasztva tároltuk a vizsgálatok megkezdéséig. Az in vitro vizsgálatok során öt, különböző időpontban előállított préslét vizsgáltunk meg. 4.2.2. Raphacol epegranulátum A Raphacol epegranulátum gyógyszertári forgalomban kapható gyógyszernek nem minősülő gyógyhatású készítmény, amely 60 g fekete retekből nyert friss préslét és 0.25 g édeskömény olajat (Aetheroleum foeniculi) tartalmaz 100 gramm inaktív hordozó granulátumra porlasztott formában. A terméket a Parma Product Kft. állítja elő, az Országos Gyógyszerészeti Intézet nyilvántartási száma: OGYI-090/1988, megújítva 1998-ban, forgalmazási engedély száma: 3386/68/89 98.07.11. A készítmény az epeműködés fokozásával javítja és gyorsítja az emésztést, megszünteti a puffadást és a teltségérzetet. Az Aetherolum foeniculi ismert és széles körben alkalmazott karminatívum, eredményesen egészíti ki a fekete retek hatásait, és teljesen elfedi annak kissé kellemetlen ízét. A készítmény enyhén sárgás színű, jellegzetes, édeskömény illatú és ízű, fekete retek préslét és édeskömény olajat tartalmazó granulátum. Fogyasztása javasolt dispepsia, cholecystopathia esetén. Mellékhatások és interakciók más vegyületekkel eddig nem ismertek. Szükség esetén min. 1 csapott adagoló kanállal, vagy kúraszerűen főétkezések után min. 1 csapott adagoló kanállal fogyasztható. 4.2.3. Vörös- és fehérborok, szőlőlevek A vörösborok antioxidáns tulajdonságainak tanulmányozására az ország különböző bortermelő vidékeiről származó 26 féle vörösbort, 1 fajta rozét, és 4 különböző fehérbort szereztünk be. A hazai borokra jellemző értékeket Európa jelentős vörösbor-termelő országaiból származó egy-egy vörösbor (összesen 4) mintával, valamint 3, kékszőlőből nyert, alkoholt nem tartalmazó gyümölcslével hasonlítottuk össze. A borok jellemző adatai: a fajta, a származási hely, a minőség, és az évjárat, valamint az alkoholmentes szőlőlevek tulajdonságai a 4. táblázatban láthatók.
44
4.3.
ÖSSZETÉTELI ADATOK MEGHATÁROZÁSA
4.3.1. Tápanyagkomponensek 4.3.1.1. Szárazanyag, fehérje, zsír, szénhidrát, cukrok A fekete retek préslé szárazanyag, fehérje, és zsírtartalmát az AOAC-ben leírt hivatalos módszerek alapján mértük meg (2). Az összes szénhidrát meghatározása Antron reakcióval spektrofotometriásan (7), a cukorösszetétel meghatározása papírkromatográfiás eljárással történt (172). 4.3.1.2. Makro- és mikroelemek Az elemtartalom meghatározása Thermo Jarrell Ash Corporation típusú AtomScan 25 ICP-vel (induktív gerjesztésű plazma emissziós spektrométer) történt. A készülékben 2kW teljesítményű rádiófrekvenciás generátor (27,12 MHz) által indukált 8-10000oK-os argonplazma gerjesztődik. Optikai rendszerében Czerny-Turner vákuummonokromátor és két fotoelektron sokszorozó (R 427 és R 889) található, optikai rács: 2400 és 1200 vonal/mm. A mérési tartomány 160 nm-től 850 nm-ig terjed. A készülék standardizálásához a mintából készített oldatokhoz hasonló összetételű és mátrixú standardokból készült oldatot használtunk. Kétpontos kalibrációt 3x3 másodperces integrálási időt, háttérkorrekciót és automatikus vakkorrekciót alkalmaztunk. A fekete retek présléből 15 ml mértünk be teflonbombába és 5 ml 65%-os salétromsav és 2 ml H2O2 jelenlétében roncsoltuk. Az így nyert mintából megfelelő hígítás után végeztük el a meghatározásokat. 4.3.2.
Bioaktív vegyületek
4.3.2.1.
Glükozinolátok
A liofilizált fekete retek préséből a glükozinolátok extrakciója forró metanollal történt. A kivonat tisztítása és a glükozinolátok deszulfatálása SEPHADEX DEAE A25 gyantán történt. A szulfát csoportok hidrolízisét szulfatáz enzimmel (SIGMA. 22.900 U/g) végeztük, Heaney és Fenwick módszerével (102). A deszulfoglükozinolátok mennyiségének meghatározását Spinks és munkatársai által leírt módszer szerint, benzil-glükozinolát (glükotropaeolin) belső standard jelenlétében végeztük el (273). A mérés Gilson 712 nagyhatékonyságú folyadékkromatográffal, fordított fázisú PhaseSep Spherisorb (SS ODS2, 25 cm x 4.3 mm) HPLC-s oszlopon, a detektálás 229 nm-en Gilson 117 UV detektorral történt. Az elválasztáshoz gradiens elúciót használtunk: A fázis - desztillált víz, B (mozgó) fázis - 20 % acetonitril. Az eluens áramlási sebessége 1.5 ml/perc, a mintamennyiség 10 µl, a nyomás 170 bar volt. A minta glükozinolát-összetételének meghatározása az alkalmazott belső standard (glükotropaeolin), valamint az ismert összetételű glükozinolát keverék által adott kromatogram segítségével történt.
45
4. táblázat
A vizsgálatok során felhasznált vörös- és fehérborok, valamint szőlőlevek jellemzői
Sorszá Név Minőség m 6 Pinot Noir száraz 33 Pinot Noir száraz 7 Oporto száraz 32 Oporto száraz 4 Oporto száraz 8 Oporto száraz 9 Merlot száraz 10 Merlot édes 12 Merlot száraz 18 Merlot félszáraz 11 Cabernet Franc félszáraz 15 Cabernet Franc száraz 13 Kékfrankos száraz 14 Kékfrankos száraz 20 Kékfrankos száraz 22 Kékfrankos száraz 21 Cabernet Sauvignon száraz 24 Cabernet Sauvignon száraz 23 Zweigelt félédes 25 Zweigelt félédes 16 Medina félédes 17 Bikavér száraz 26 Kadarka félédes 2 Desszertbor édes 19 Cuveé Boisset száraz 3 Mavrodaphne of Patras desszertbor 27 Offley Portwine 34 Mavrud félédes 5 Rozé száraz 28 Aszú (három puttonyos) édes 29 Szamorodni édes 30 Szamorodni száraz 1 Rizling száraz 31 Sárga muskotály félszáraz 1 Hey-Ho kékszőlőlé 2 Dr. Steinberger kékszőlőlé 3 Otello kékszőlőlé * közvetlenül fejtés után vett minta ** palackozás előtt vett minta a *-gal jelölt borból 4.3.2.2.
Származási hely
Évjárat
Villány (GT) Villány (GT) Villány (GT) Villány (GT) Villány (GT) Siklós Kiskőrös Balatonboglár Szekszárd Balatonboglár Tiszaug Soltszentimre Gyöngyöskalász Nagyréde Szekszárd Sopron Kiskőrös Balatonboglár Dél-Dunántúl Nagyréde Eger Eger Szekszárd Kiskőrös Franciaország Görögország Portugália Bulgária Villány (GT) Tokaj Tokaj Tokaj Balatonberény Tokaj kereskedelmi kereskedelmi frissen préselt
1997* 1997** 1997* 1997** 1996 1997* 1996 1996 1994 1996 1996 1996 1996 1996 1996 1996 1996 1995 1996 1997 1996 1995 1995 1996 1994 1997 1996 1991 1991 1991 1996 1991 -
Összes polifenoltartalom
Az összes polifenoltartalom meghatározása Folin-Denis módszerrel történt (3). A reakcióelegy abszorbanciáját 760 nm-en olvastuk le. Standardként csersavat, a borok esetében galluszsavat használtunk.
46
4.3.2.3.
Flavonoidösszetétel
A flavonoidösszetétel meghatározása Hertog és munkatársai által leírt módszer alapján történt (108). A liofilizált mintát 50%-os metanol, 2 M HCl és 0.1 mg tercier-butilhidrokinon jelenlétében 2 órán keresztül 90oC-on hidrolizáltuk. Az oldatot CHROMAFIL (O-45/25, 25 mm, 0.45 µm, Macherey-Nagel) egyszer használatos szűrőn megtisztítottuk, majd Perkin Elmer HPLC-be injektáltuk. A hidrolízis során keletkezett flavonoid aglikonok elválasztása fordított fázisú PremiSphere C18 kolonnán (150 x 3.9 mm, 5 µm, Phenomenex, USA) metanol/foszfát puffer (45/55 v/v, pH 2.4) mozgó fázis segítségével, a detektálás fotodiódasoros UV-detektorral 370 nm-en történt. A flavonol kvercetin, kempferol és miricetin, valamint a flavon apigenin és luteolin mennyiségének meghatározásához standardként flavonoid keveréket alkalmaztunk. 4.3.2.4.
Aszkorbinsav
Az aszkorbinsav meghatározása Perkin Elmer 785A típusú HPLC-vel fordított fázisú C18 oszlopon történt. A mozgófázis metanol-víz 70:30 arányú elegye volt, a metanol 10mM hexánszulfonsavat, a víz 1% ecetsavat és 0,13% trietilamint tartalmazott. A detektálási hullámhossz 254 nm, az áramlási sebesség 0.5 ml/perc, a retenciós idő 4 perc volt. Az aszkorbinsav koncentrációjának meghatározása a csúcsmagasság alapján történt, 100 µg/ml L-aszkorbinsav standard használatával. 4.3.2.5.
Karotin
A 2 N etanolos KOH-val elszappanosított, majd petroléterrel kirázott karotint Al2O3-dal töltött oszlopon tisztítottam, majd fotométeren 430 nm-en mértük az abszorbanciát (143). A karotin koncentrációja a következő képlettel számolható ki: C (mg/100g) = Abs430 x 0,5 x hígítás. 4.3.2.6.
Tokoferol
KOH-dal elszappanosított mintából desztillált vizes mosást követően HPLC technikával történő elválasztás után az összes tokoferol mennyisége 297 nm-en detektálható (4). A meghatározás LIQUOCHROM MODEL 2010 HPLC rendszerrel történt, metanol-víz 95:5 arányú elegyével DL-αtokoferolacetát belső standard jelenlétében.
47
4.4.
IN VITRO VIZSGÁLATI MÓDSZEREK
4.4.1.
Hidrogén-donor aktivitás
A minták hidrogén-donor aktivitása az 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) gyök jelenlétében értékelhető 517 nm-en (33, 101). A DPPH stabil szabad gyök, abszorbanciamaximuma 517 nm-en van. A vegyület hidrogén-donor molekulák jelenlétében hidrogént vesz fel és így abszorbanciája csökken. 1 ml metanolos DPPH oldathoz (9 mg DPPH 100 ml metanolban oldva) 4 ml növényi kivonatot adtunk, alapos összekeverés után a reakcióelegy 30 percig szobahőmérsékleten állt. Az abszorbanciát 517 nm-en olvastuk le metanol vakkal szemben. A kontroll elegy 1 ml DPPH oldatot és 4 ml metanolt, vagy a növényi kivonat oldószerét tartalmazta. A legmagasabb abszorbanciértéket a kontroll adta. A minta által eredményezett változást %-ban adtuk meg a kontrollhoz viszonyítva. A növényi kivonatok hatását különböző koncentrációban tanulmányoztuk. Ezekből az eredményekből az 50%-os gátláshoz szükséges mintamennyiség (I50) kiszámolható. Az I50 érték segítségével a különböző minták H-donor aktivitása összehasonlítható. 4.4.2.
Redukálóképesség
A redukálóképesség meghatározása a Fe3+ → Fe2+ redukciós reakció alapján történt Oyaizu módszerével (216). 1 ml különböző koncentrációjú növényi kivonatot 2.5 ml pH 6.6 foszfát puffer (0.2 M) és 2.5 ml 1 %-os K3Fe(CN)6 oldattal elegyítettünk és 20 percig 50oC-on inkubáltuk. 2.5 ml 10%-os triklórecetsav oldat hozzáadása után a reakcióelegyet 10 percig centrifugáltuk 2500 rpm-mel. A felülúszó 2.5 ml-ét 2.5 ml bidesztillált vízzel összekeverve, majd 0.5 ml 0.1%-os FeCl3 oldatot hozzáadva, a kialakult szín intenzitása 700 nm-en mérhető és arányos a minta redukálóképességével. Referencia vegyületként aszkorbinsavat használtunk. A minta redukálóképességét az aszkorbinsavhoz hasonlítva aszkorbinsav ekvivalensben (ASE) adtuk meg. 1 aszkorbinsav ekvivalens az egységnyi térfogatú minta (1 ml) redukálóképessége, ha hatása egyenértékű 1µmol aszkorbinsavval. 4.4.3.
Komplexképző aktivitás
A minták komplexképző aktivitásának tanulmányozása Cu2+ ionok jelenlétében Shimada és munkatársai által kidolgozott módszer segítségével történt (262). 2 ml hexamin pufferben (pH 5.0) Cu2+ ionokat (3 mM) tartalmazó oldathoz 2 ml vizsgálandó anyagot adtunk, majd 0.2 ml tetrametil-murexidet (1mM). A kialakult szín abszorbanciaspektrumát felvéve, a 485 és 530 nm-en mérhető értékeket rögzítettük. Amennyiben a vizsgálati rendszerhez adott anyag nem komplexképző vegyület volt (bidesztillált víz, egyéb oldószer) a rézionok a hexametilén-tetraminnal hoztak létre komplex vegyületet, amely tetrametilmurexid indikátorral 485 nm-en mutat abszorbancia maximumot. A hexametilén-tetraminnál erősebb kelátképző vegyületek (pl. EDTA, polifenolos vegyületek) jelenlétében kialakuló komplex vegyület
48
abszorbancia maximuma 530 nm-en olvasható le. Ezért a minta komplexképző aktivitása a 485 és 530 nmen leolvasott abszorbanciaértékek hányadosával jellemezhető. A kontroll -kelátképző vegyületet nem tartalmazó - reakcióelegy esetében a 485 és 530 nm-en mért abszorbanciaértékek hányadosa Cu2+ ionok jelenlétében 3.50 ± 0.01. A különböző komplexképző aktivitással rendelkező minták jelenlétében a hányadosok értéke az előzőnél kisebb. 4.4.4.
Scavenger aktivitás H2O2/·OH-luminol-mikroperoxidáz rendszerben
A kemilumineszcencia jelenségén alapuló módszer kivitelezése Heide és Bögl módszere alapján történt, Blázovics által kidolgozott módosításokkal, Berthold Lumat LB 9501 luminométerrel (32, 104). A H2O2ből a Fenton reakció során instabil szabad gyökök keletkeznek. A folyamatot a szennyeződésként jelenlévő Fe2+-ionok és hem-proteinek, így a mikroperoxidáz is katalizálja. A keletkezett gyökök a jelenlévő luminolt gerjesztik, a gerjesztett molekula alapállapotba történő visszajutásakor inaktív aminoftálsav keletkezik, miközben monokromatikus fény (λ = 425 nm) emittálódik. A kibocsátott fény intenzitása arányos a rendszerben jelenlévő szabad gyökök mennyiségével. Scavenger vegyületek jelenlétében a mérhető fény intenzitása a molekula gyökbefogó aktivitásától függően szignifikánsan csökken. A reakcióelegy összetétele a következő volt: 300 µl H2O2 (10-4 M), 300 µl mikroperoxidáz (3 x 10-7 M), 50 µl luminol (7 x 10-7 M), 50-200 µl minta vagy bidesztillált víz. Az összes térfogat 850 µl volt. A kemilumineszcenciás fény intenzitását RLU (relatív light unit) egységben adtuk meg, amely a vizsgálati idő (30 sec) alatt kibocsátott összes fénymennyiség. A standard, scavenger vegyületet nem tartalmazó reakcióelegy által kisugárzott fény százalékában fejeztük ki a tanulmányozott anyag scavenger aktivitását. 4.4.5.
Citokróm c redukciójának gátlása
A citokróm c-t a xantin/xantin oxidáz rendszerben képződő szuperoxid gyök redukálja. A reakció időbeni lezajlása 550 nm-en McCord és Fridovich által leírt vizsgálati körülmények között tanulmányozható (186). A reakcióelegy 50 mM foszfát pufferben (pH 7.4), 50 µM citokróm c-t, 100 µM xantint, 0.2 U/ml xantin-oxidázt és különböző koncentrációban a vizsgált vegyületeket tartalmazta. A reakcióelegy összes térfogata 3 ml volt. Szabad gyök befogó tulajdonsággal rendelkező vegyületek jelenlétében a citokróm c redukciójának sebessége csökken, mely az 550 nm-en mért, időegységre eső abszorbanciaváltozás csökkenésével jellemezhető. 4.4.6.
Adrenalin/adrenochrom átalakulás gátlása (SOD-like aktivitás)
Lúgos közegben az adrenalinból adrenochrom keletkezik szuperoxid-gyök felszabadulása közben (277). pH 10.2 karbonát pufferben az adrenalin (0.6 ml, 20 mM, 0.1 N HCl-ben oldva) átalakulását scavenger vegyületek gátolják. A reakcióelegy térfogata 3 ml. Az abszorbanciaváltozás 480 nm-en követhető. A
49
minta, valamint standard szuperoxid-dizmutáz enzim jelenlétében mért, időegységre eső gátlás mértékéből meghatározható a minta SOD-like aktivitása. 4.4.7.
Totál antioxidáns státusz
A mérés kivitelezése Randox TAS diagnosztikai készlettel történt. A meghatározás elve a következő: a metmioglobinból H2O2 hatására ferrilmioglobin gyök keletkezik, amely a kromogén 2,2′-azino-bisz-(3etilbenzotiazolin-6-szulfonsav)-val (ABTS) stabil, kékes-zöld színű ABTS· gyök keletkezése közben reagál (191). A vegyület abszorbanciamaximuma 660 nm-en van. Antioxidáns hatású vegyületek, kivonatok a mérhető abszorbanciát csökkentik azáltal, hogy a meggátolják a metmioglobin oxidációját, vagy scavengelik a ferrilmioglobin gyököt. A vizsgált minták TAS értékének meghatározásához Troloxot (szintetikus
E-vitamin
származék,
6-hydroxy-2,5,7,8-tetrametillkromán-2-karboxilsav)
használtunk
standardként. 7.4.5.
A linolsav autoxidációjának gátlása
A mérést Masude módszere alapján végeztük el (181). 0.5 g linolsavat oldottunk 40 ml abszolút etanolban, hozzáadtunk 40 ml pH 7.0 foszfát puffert, majd kiegészítettük 100 ml-re desztillált vízzel. Ebből az oldatból 9 ml-t 1 ml vizsgálandó mintával 40oC-os termosztátban 10-12 napig tároltunk. Naponta meghatároztuk a linolsav autoxidációja során keletkező peroxidok mennyiségét a tiocianátos színreakció (0.1 ml linolsav oldat, 0.1 ml NH4SCN /30%/ és 0.1 ml FeCl3 75 %-os etanolban 10 ml végtérfogatban) segítségével 500 nm-en. Az antioxidánssal kezelt minták abszorbanciáját a kontroll elegyéhez viszonyítottuk. 4.4.9.
Enzimatikus úton kiváltott lipidperoxidáció máj mikroszóma frakcióban
A reakcióelegy 20 mM Na-foszfát puffert (pH 7.5), 0.15 M KCl-ot, 50 µM FeCl3-ot, 50 µM Napirofoszfátot, 1 mg/ml mikroszomális fehérjét, regeneráló rendszerként 0.6 IU glukóz-6-foszfát dehidrogenázt, 10 mM glukóz-6-foszfátot, 0.5 mM NADPH-t, valamint különböző koncentrációban a fekete retek préslét tartalmazta. A reakcióelegy térfogata 0.5 ml volt. A meghatározás Jordan és Schenkman szerint történt (125). A különböző ideig 37oC-on inkubált reakcióelegyhez a 4.7.2.6. pontban leírt TBA reagenst adva a tiobarbitursav reaktív anyagok mennyiségének meghatározása az ott leírtak szerint történt. A malondialdehid moláris extinkciós koefficiense ε = 1.56 x 108 M-1cm-1 . A tiobarbitursav reaktív anyagok (TBARS) mennyiségét nmol MDA/ mg protein/ idő (perc) dimenzióban adtuk meg.
50
4.5.
IN VIVO VIZSGÁLATOK
4.5.1.
Állatkísérletek
A kísérletekhez 180-200 g-os hím Wistar patkányokat használtunk. Az állatokat random 4 csoportba osztottuk, minden csoportba 10 állat volt, és a vizsgálatok megkezdése előtt 3 napig pihentettük őket. A kísérleteket hatszor ismételtük meg, így az előkísérletekkel együtt mintegy háromszáz állatot használtunk fel. Az állatok ellátása és gondozása "az állatok védelméről és kíméletéről" c. 1998. évi XXVIII. törvény által előírtakkal összhangban történt. A dolgozatban nem részletezett előkísérletek eredményei alapján történt az antioxidáns kezelés jellegének meghatározása. A beállított négy állatcsoport jellemzői a következők voltak: ∗
A kontroll csoport állatai a normál LATI tápot és csapvizet fogyasztottak.
∗
A kontroll kezelt csoportban a LATI táp mellett a fekete retek préslét csapvízzel tízszeresre hígítva az ivóvíz helyett fogyasztották az állatok 150 ml/tt kg/nap adagban. A kimért napi adag préslé elfogyasztása után az állatok szükség szerint ivóvizet kaptak.
∗
A zsírdús tápon tartott állatok esetében a LATI tápba 20% napraforgóolajat, 2% koleszterint és 0.5% kólsavat kevertünk. Az állatok a táp mellett ivóvizet fogyasztottak.
∗
A zsírdús étrenden tartott, kezelt állatok a táp mellett a fekete retek préslét csapvízzel tízszeresre hígítva az ivóvíz helyett fogyasztották 150 ml/tt kg/nap adagban. A kimért napi adag préslé elfogyasztása után az állatok szükség szerint ivóvizet kaptak
Az állatkísérletekhez azt a fekete retek preparátumot választottuk, amelynek összetételi adatai és antioxidáns tulajdonságai legjobban megközelítették a 4.2.1. pontban említett öt vizsgált minta átlagát. Valamennyi állatkísérletet ugyanazzal a preparátummal végeztük el. Az állatok a tápot ad libitum fogyasztották, testtömegüket naponta mértük és rögzítettük. A kísérletek 9 napig tartottak. Ezután az állatokat dekapitáltuk, vérüket felfogtuk, a szervek (tüdő, máj, szív, timusz, vesék, lép) tömegét lemértük, rögzítettük. A szervek testtömeghez viszonyított arányát kiszámoltuk. A szerveket, szöveteket a későbbi vizsgálatokhoz előkészítettük és hűtőszekrényben +4oC-on, vagy fagyasztóban -18oC-on tároltuk. 4.5.2.
Humán vizsgálatok
A vizsgálatokba 26 önkéntes, metabolikusan jól kontrollált, hosszabb ideje (>5 év) diabetes mellitusban szenvedő beteget vontunk be. 8 beteg inzulin dependens, 18 beteg nem inzulin dependens beteg volt. Valamennyien rendszeres orvosi ellenőrzés alatt álltak, ennek megfelelően meghatározott időközönként a szérum laboratóriumi paramétereket meghatározták és a betegség állapotának megfelelő adekvát gyógyszeres kezelésben részesültek. Az anamnézisek és az ultrahangos vizsgálatok alapján egyikük esetében sem volt epekő kimutatható. A vizsgálatból történő kizárás okának tekintettük a kő előfordulását az epehólyagban vagy az epevezetékben, egyéb, súlyos kísérő betegségek fennállását, valamint az epekőképződést, vagy oldást befolyásoló készítmények szedését, továbbá egyéb súlyos betegségek
51
fellépését a kúra ideje alatt. A statisztikai elemzésbe bevont betegek a készítmény fogyasztásának ideje alatt nem kaptak olyan új gyógyszereket, melyek a vizsgálatok eredményét befolyásolhatták. A betegek étrendi kiegészítésként 6 hónapon keresztül naponta 3 alkalommal 0.2 g Raphacol epegranulátumot fogyasztottak a főétkezések után a termékhez csomagolt előírások szerint a mellékelt adagolókanál használatával. A kúra kezdete előtt, majd 3 és 6 hónap múlva a szokásos ellenőrzéssel egyidőben éhomi vérmintát vettünk a betegektől és meghatároztuk a szükséges laboratóriumi paramétereket, valamint a lipidperoxidáció mértékét jelző néhány komponenst. A statisztikai elemzésekhez 20 beteg adatait vettük figyelembe, mivel 6 beteg valamelyik ellenőrzési időpontban nem jelent meg a vizsgálaton, abbahagyta a készítmény szedését, vagy egyéb betegség fellépéséről számolt be. A statisztikai értékelésbe bevont 20 betegből 7 inzulin-dependens (1 férfi, 6 nő, átlagéletkor 30.0 ± 4.5 év) és 13 fő nem-inzulin dependens (9 férfi, 5 nő, átlagéletkor 56.2 ± 12.3 év) diabetes mellitusban szenvedett. A vizsgálatok megkezdése előtt a betegek tájékoztatást kaptak a kezelésről és a készítményről, a várható kedvező és esetlegesen kedvezőtlen hatásokról. Előzőek ismeretében adták beleegyezésüket, hogy a bevonjuk őket a vizsgálatokba. A vizsgálatot a Semmelweis Orvostudományi Egyetem Etikai Bizottságának engedélyével (Engedélyszám: TUKEB 24/1996) végeztük. Az együttműködő betegeket megkértük, hogy a készítmény fogyasztásának ideje alatt ne változtassanak korábbi étkezési szokásaikon, a tapasztalt kedvező és esetleges kedvezőtlen mellékhatásokat, súlycsökkenést, vagy növekedést figyeljék meg és rögzítsék. Ezekről a megfigyelésekről a kúra után kérdőívet töltettünk ki a betegekkel. Kontrollként 26 (12 férfi, 14 nő) egészséges, nem dohányzó, normolipoproteinaemiás egyén szérum és eritrocita lipidperoxidációs adatait határoztuk meg. Életkoruk 42.3 ± 12.5 év volt. 4.6.
SZUBCELLULÁRIS PARTIKULUMOK PREPARÁLÁSA ÉS EGYÉB BIOLÓGIAI MINTÁK ELŐKÉSZÍTÉSE
4.6.1.
Májhomogenizátum készítése
A patkányok dekapitálását és kivéreztetését követően az eltávolított májakat jeges hűtés mellett további aprítással és izotóniás KCl oldattal vérmentesre mostuk, majd Potter-Elvehjem készülékben homogenizáltuk. A májhomogenizátumok fehérjetartalmát 10 mg/ml-re állítottuk be 0.15 M KCl-dal. 4.6.2.
Mikroszóma izolálása patkány májból
Az előző pontban leírt módon készített patkány máj homogenizátumból ultracentrifugálással mikroszómát preparáltunk Janetzki VAC 60-as ultracentrifugával (125, 226). A mikroszomális üledéket 0.15 M KClban szuszpendáltuk, a fehérje koncentrációját 10 mg/ml-re állítottuk be.
52
4.6.3.
Citoszol készítése patkány májból
Az izotóniás KCl-dal készített 20%-os patkány máj homogenizátumot 20 percig 2000 g-vel, majd ennek a felülúszóját 100.000 g-vel 60 percig centrifugáltuk (96). A felülúszó a citoszol frakció, mely három napig -80oC-on enzimaktivitás veszteség nélkül eltartható. A fehérjetartalmat 5 mg/ml-re 0.15 M KCl-dal állítottuk be. 4.6.4.
Szérum, plazma és eritrocita hemolizátum készítése
A natív vért (humán, patkány) 10 percig 2500 rpm-mel centrifugáltuk, a sejtmentes felülúszót (szérumot) leszívtuk és a további feldolgozásig +4oC-on, vagy -18oC-on tároltuk. A heparinos antikoagulánssal kezelt vért (humán, patkány) 10 percig 2500 rpm-mel centrifugáltuk. A sejtmentes felülúszót (plazmát) leszívtuk és a további feldolgozásig +4oC-on, vagy -18oC-on tároltuk. A maradék vörösvértest masszát a trombociták, fehérvérsejtek eltávolítása érdekében háromszor mostuk jeges vízben tartott izotóniás sóoldattal, minden mosás között 10 percig 2500 rpm-mel centrifugáltuk. A tiszta masszát másfélszeres mennyiségű kétszer desztillált vízzel hemolizáltuk. A hemolizátumokat a további feldolgozásig -18oC-on tároltuk. 4.7.
BIOKÉMIAI VIZSGÁLATOK
4.7.1.
Szérum paraméterek
A humán vizsgálatok során a szokásos laboratóriumi szérum paraméterek meghatározása COBAS Integra Roche kémiai analizátorral történt, a megfelelő diagnosztikai készletek (Roche) használatával. Az állatkísérletekben a szérum paramétereket HITACHI 717 automata kémiai analizátorral Boehringer Mannheim diagnosztikai készletek segítségével mértük meg. 4.7.2.
Lipid komponensek és lipidperoxidációs jellemzők
4.7.2.1.
Zsírsavösszetétel patkány májban
A szövetnedves májhomogenizátumot vízmentesítettük vízmentes Na2SO4-tal, a zsírt Folch extrakciós oldattal (klorofrom/metanol - 2:1 v/v) extraháltuk (83). Az oldószert N2 áramban elpárologtattuk, a száraz maradékot n-hexánban feloldottuk és Na-metiláttal (2M Na oldva abszolút metanolban) átésztereztük. A kapott oldatot ecetsavval semlegesítettük, a vizet CaCl2-dal eltávolítottuk. A tiszta, vízmentes oldatot CARLO ERBA Fractovap 2400 típusú gázkromatográfba injektáltuk N2 vivőgáz jelenlétében. Az állófázis Chromosorb Q, a megoszlási fázis Gas-chrom Q volt, mely 10% silar 5 CP-t (80/100 mesh) vagy 10% silar 10C-t (10/120 mesh) tartalmazott. Az alkalmazott időprogram a következő volt: 9 perc 180oC-on, hőmérséklet-emelkedés 220oC-ra 2.5oC/perc sebességgel, majd hőntartás 220oC-on. Az injektor
53
hőmérséklete 260oC volt. A zsírsavak elválasztása az alkalmazott hőprogram segítségével, a detektálás lángionizációs detektorral történt. A minták zsírsavösszetételének értékelését a C18:0 zsírsavhoz viszonyított relatív retenciós idők alapján végeztük el (51).
4.7.2.2.
Zsír- és koleszterintartalom, oxidált koleszterin származékok patkány májban
A szövetnedves májhomogenizátum zsír és zsíroldékony komponenseit vízmentesítés után Folch extrakciós oldattal (klorofrom/metanol - 2:1 v/v) extraháltuk (83). Az oldószert vákuumban elpárologtattuk, a kioldódott zsír mennyiségét megmértük. A kivonatot 200 ml 1M metanolban oldott NaOH-dal elszappanosítottuk 60 percig, N2 áramban. A nem-elszappanosítható szerves fázist kiráztuk diizopropil éterrel, mostuk és vízmentesítettük (193). A szűrletet vákuumban bepároltuk. A maradékot kloroform/metanol (2:1, v/v) elegyében feloldottuk, a koncentrációt lehetőség szerint 0.1 g ml-1-re állítottuk be. A nem-elszappanosítható frakció vizsgálata vékonyréteg kromatográfiás eljárással történt Sil G 60 F254, koncentráló zónával rendelkező rétegen (rétegvastagság 0.25 mm, 10 x 20 cm üveglapon, Merck). A kromatogramok kifejlesztése heptán/etilacetát (1:1, v/v) rendszerben történt (269). A száraz lapokat UV fényben (251 nm) megvizsgáltuk. A kromatogramok előhívása a következők szerint történt: a lapokat rézszulfát oldattal bepermeteztük (100 g l-1 CuSO4 oldva 85 ml l-1 foszforsav oldatban), majd 8 percig 110oCon tartottuk a szín kialakulásának érdekében (21). A kromatogramon megjelenő oxidált koleszterin származékok minőségi azonosítása a mintával azonos módon kezelt és azonos lapon futtatott standardkeverék ismert összetevőire jellemző Rf értékek segítségével történt. A kimutatható mennyiségben jelenlévő oxidált koleszterin származékok mennyiségi értékeléséhez az UV fényben látható foltokat megjelölve, majd azokat az üveglapról eltávolítva az oxidált származékokat acetonban feloldottuk, centrifugáltuk, és a tiszta felülúszót leöntöttük. Az acetont bepároltuk, és 1 ml enzimkeveréket adtunk hozzá, amely koleszterin-észterázt, koleszterin-oxidázt és peroxidázt tartalmazott (152). A reakcióelegyet 5 percig 37oC-on inkubáltuk, majd az abszorbanciát 500 nm-en vakkal szemben leolvastuk. A vakmintát a szilikagél rétegről lekapart foltmentes, a mintával azonos módon kezelt anyag adta. A mennyiségi értékelés a mintával azonos módon kezelt standard vegyületek segítségével történt. 4.7.2.3.
A- és E-vitamin patkány szérumban
Patkányszérumokban az A- és az E-vitamin mennyiségének meghatározása fordított fázisú HPLC-s technikával történt Rudy módszere alapján (244). 0.2 ml szérum mintát 0.2 ml belső standard - precipitáló reagens keverékkel összeráztuk, a lipid fázist n-hexánnal extraháltuk. Az oldószert etanolra cseréltük, vízzel a szükséges térfogatra hígítottuk, majd a GILSON MODULAR típusú HPLC-be injektáltuk. Az elválasztás szobahőmérsékleten, C18-as oszlopon történt, metanol/víz 90:10 v/v (A oldat) és etilacetát/izo-
54
propanol 90:10 v/v (B oldat) segítségével lineáris gradiens használatával. Az áramlási sebesség 1.5 ml/perc volt. A detektálás Gilson UV-115 típusú detektorral λ = 300 nm-en történt. Az A- és E-vitamin koncentrációjának meghatározása az alkalmazott belső standard (retinol, retinil-palmitát, retinil-acetát és α-tokoferol keveréke) segítségével történt. 4.7.2.4.
Konjugált diének patkány májban
Szövetnedves májhomogenizátumot ötszörös mennyiségű izo-oktánnal 2 percig intenzíven ráztuk Vortex készülékkel, majd sötét helyen, szobahőmérsékleten egy éjszakán át állni hagytuk. A mintát leszűrve, az izo-oktános fázis abszorbanciáját 234 nm-en olvastuk le, és ez az érték szolgált a konjugált diének mennyiségének jellemezésére (1). 4.7.2.5.
Konjugált diének patkány szérumban
A szérum konjugált dién szintjének maghatározása Ahotupa és munkatársai által leírt módszerrel történt (8). 100 µl szérumhoz 5 ml Folch féle lipid-extrakiós oldatot (kloroform: metanol = 2:1) adtunk, 1 percig intenzíven ráztuk, majd szobahőmérsékleten 10 percig állni hagytuk. Ezután 10 percig 3000 rpm-mel centrifugáltuk. A felülúszóból ismert mennyiséget N2 áramban szárazra pároltuk. A maradékot ciklohexánban feloldottuk és felvettük a minta UV spektrumát. Az abszorbanciaértékeket 234 és 300 nmen rögzítettük. A korrigált abszorbanciérték (∆A = A234-A300), a moláris extinkciós koefficiens (ε = 2.95 x 104 M-1cm-1), valamint a hígítás alapján történt a szérum konjugált dién koncentrációjának meghatározása. 4.7.2.6.
Tiobarbitursav reaktív anyagok patkány májban
0.1 ml, 10 mg/ml fehérjekoncentrátumra beállított patkány máj homogenizátumot pH 7.4 TRIS-HCl puffer (benne 0.174 M KCl), 0.5 mM aszkorbinsav és 0.5 mM Fe2+ jelenlétében 3 ml végtérfogatban 37oC-on 60 percig inkubáltunk. Hozzáadtunk 2 ml tiobarbitursav reagenst (0.25 N sósavban 92 mM TCA és 26 mM TBA) és 15 percig forró vízfürdőben tartottuk. A meghatározás Satoh és Ohkawa módszere alapján történt (213, 253). A kialakult színt 532 nm-en reagensvakkal szemben mértük. A tiobarbitursav reaktív anyagok mennyiségét 1,1,3,3-tetraetoxipropánnal (Fluka) készült standard görbe segítségével határoztuk meg. 4.7.2.7.
Tiobarbitursav reaktív anyagok humán és patkány szérumban
A meghatározás Pyles módszerével történt (230). 0.15 ml szérumhoz 10µl 100 mM desferal oldatot adtunk, és 1.0 ml-re kiegészítettük 0.9%-os NaCl oldattal. A reakcióelegyhez 4 ml 4.7.2.6. pontban leírt TBA reagenst adtunk és 95oC-on 80 percig inkubáltuk. A kialakult színt 4 ml extrakciós oldat (nbutanol:desztillált víz:piridin, 15:3:1) hozzáadása után a szerves fázisba ráztuk ki, majd centrifugálás után
55
a felülúszó abszorbanciáját 510, 532 és 560 nm-en olvastuk le úgy, hogy a vak az extrakciós oldat volt. A mintában jelenlévő bilirubin és hemoglobin zavaró hatását a következő matematikai képlet alapján számolt abszorbanciaérték használatával küszöböltük ki: MDA532 = 1.22 x [(A532) - (0.56 x A510) + (0.44 x A560)]. A szérum malondialdehid koncentrációjának meghatározása a hígítások ismeretében a 4.7.2.5. pontban ismertetett standard segítségével történt. 4.7.2.8.
Szabad szulfhidril-csoportok
A szabad -SH csoportok mennyiségének meghatározása Ellman és Lysko módszere alapján történt Ellman (5,5-ditiobisz-nitrobenzoesav, SERVA) reagenssel pH 7.4 Na-foszfát pufferben 512 nm-en (73). Standardként redukált glutationt használtunk.
4.7.2.9.
Biológiai minták scavenger aktivitása H2O2/·OH-luminol-mikroperoxidáz rendszerben
A biológiai minták (plazma, májhomogenizátum) scavenger aktivitásának meghatározása a H2O2/·OHluminol-mikroperoxidáz rendszerben a 4.4.4. pontban leírtak szerint történt. A vizsgálatokhoz 150 µl plazmát, vagy 50 µl 10 mg/ml fehérjekoncentrációra beállított patkány máj homogenizátumot használtunk.
4.7.2.10.
Enzimatikus úton kiváltott lipidperoxidáció patkány máj mikroszóma frakcióban
A fekete retek préslé in vivo antioxidáns tulajdonságát alimentáris hiperlipidémia modellben patkány májból szeparált mikroszóma frakción tanulmányoztuk. A reakcióelegy összetétele és a meghatározás menete megegyezik a 4.4.9. pontban leírtakkal. A meghatározás Jordan és Schenkman (125) szerint történt. A különböző ideig 37oC-on inkubált reakcióelegyhez a 4.7.2.6. pontban leírt TBA reagenst adva a tiobarbitursav reaktív anyagok mennyiségének meghatározása az ott leírtak szerint történt. A malondialdehid moláris extinkciós koefficiense ε = 1.56 x 108 M-1cm-1 . A tiobarbitursav reaktív anyagok (TBARS) mennyiségét nmol MDA/ mg protein/ idő (perc) dimenzióban adtuk meg. 4.7.3.
Enzimaktivitások meghatározása
4.7.3.1.
Kataláz
Az enzim aktivitását patkány máj homogenizátumban, valamint patkány és humán eritrocitában határoztuk meg. A mérés kivitelezése Beers és Sizer módszere (18) alapján történt pH 7.0 foszfát pufferben 10 mM H2O2 jelenlétében. A hidrogén peroxid bomlását 240 nm-en 3 percig rögzítettük. Egységnyi az az enzim aktivitás (Bergmeyer egység), amely 1 g H2O2-t bont el 1 perc alatt 25oC-on egységnyi mennyiségű fehérjére vonatkoztatva.
56
4.7.3.2.
Glutation-peroxidáz
Az enzim aktivitását patkány máj homogenizátumban, valamint patkány és humán eritrocitában Chin és munkatársai által kidolgozott, valamint Sedlak és Lindsay által kiegészített módszerrel határoztuk meg (50, 255). 50 mM-os TRIS-HCl pufferben (pH 7.5) 0.2 mM redukált glutation kumén hidroperoxiddal (0.33 mM) történő oxidációját katalizálja az ismeretlen aktivitású enzimminta. A reakció során megmaradó redukált glutation mennyiségének meghatározása 412 nm-en történt Ellman reagens jelenlétében. Egy egységnyi glutation peroxidáz 1 perc alatt 1 µmol redukált glutationt bont el egységnyi mennyiségű fehérjére vonatkoztatva. 4.7.3.3.
Glutation-S-transzferáz
Az enzim aktivitásának meghatározása patkány máj citoszolból történt Habig és munkatársai módszerével (96), pH 6.5 foszfát pufferben, 5 mM redukált glutation, 1 mM 1-klór-2,4-dinitrobenzoesavval és 20 µl citoszol (1 mg protein/ml) jelenlétében 30oC-on 340 nm-en. Egységnyi az enzim aktivitása, ha 1 µmol redukált glutation alakul át percenként 1 mg fehérjére vonatkoztatva 4.7.4.
A máj mikroszomális kevert funkciójú oxidáz enzimrendszere
4.7.4.1.
Citokróm P450 tartalom
A citokróm P450 meghatározása során a mikroszomális fehérjetartalom 2 mg/ml volt. A mérést 0.1 M foszfát pufferben (pH 7.0) végeztük Omura és Sato (214, 215) módszerével. A CO-dal telített és nátrium ditionittal redukált, valamint nátrium ditionittal redukált mikroszóma spektrumát regisztráltuk 450 nm-en. A moláris extinkciós koefficiens 91 mM-1cm-1. 4.7.4.2.
Citokróm b5 tartalom
A citokróm b5 tartalom meghatározását Omura és Sato (214, 215) módszerével végeztük. A mikroszóma szuszpenzió 2 mg/ml fehérjét tartalmazott 0.1 M foszfát pufferben (pH 7.0). A NADH végkoncentrációja 0.2 mM volt. A reakcióelegy abszorbanciájának leolvasása 424 nm-en történt. A moláris extinkciós koefficiens 185 mM-1cm-1 volt. 4.7.4.3.
Citokróm c reduktáz aktivitása
A rendszer 0.1 M TRIS - HCl (pH 7.5) puffert, 60 µM citokróm c-t, 80 µg/ml mikroszomális fehérjét és 0.4 mM NADPH-t tartalmazott. A referencia küvettában nem volt NADPH. A meghatározás 550 nm-en
57
történt, a moláris extinkciós koefficiens 19.6 mM-1cm-1. A mérést Jansson és Schenkman (122) szerint végeztük. 4.7.4.4.
Ferricianid-reduktáz aktivitása
A méréshez használt reakcióelegy 0.1 M TRIS HCl puffert (pH 7.5), 200 µM K3Fe/CN/6-ot és 80 µg/ml mikroszomális fehérjét tartalmazott. A reakciót 0.4 mM NADH-val indítottuk. A ferricianid redukcióját 420 nm-en követtük Jansson és Schenkman (122) módszere alapján, az enzim aktivitást a 1.02 mM-1cm-1 moláris extinkciós koefficiens felhasználásával számoltuk ki. 4.7.5.
Egyéb meghatározások
4.7.5.1.
Biológiai minták fehérjetartalma
A májhomogenizátumok, máj mikroszóma, szérum, plazma, eritrocita hemolizátum fehérjetartalmát Lowry módszerével határoztuk meg, standardként tiszta kristályos marha szérum albumint használtunk (152). 4.7.5.2.
Vörösvérsejt hemolizátum hemoglobin tartalma
Az enzimaktivitások meghatározásához használt vörösvérsejt hemolizátumok hemoglobin tartalmát Haemisol reagens és Haemisol standard segítségével mértük meg, mindkettő a Human Oltóanyagtermelő és Gyógyszergyártó Rt. (Gödöllő) gyártmánya. 4.8.
STATISZTIKAI ANALÍZIS
A mérési eredmények matematikai-statisztikai érékeléséhez a lineáris regressziót, valamint a Student-féle egy- és kétmintás t-próbát alkalmaztuk ANOVA statisztikai programcsomag felhasználásával. Szignifikánsan különbözőnek értékeltük két mérés átlagát, ha a p < 0.05 volt. A táblázatokban szereplő értékek a mérési eredmények átlaga és szórása (x ± S.D.) Az ábrákon a mérési eredmények átlaga és szórása látható. A táblázatokban és az ábrákon különböző betűvel jelölt értékek szignifikánsan eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten.
58
5.
EREDMÉNYEK
5.1.
AZ IN VITRO VIZSGÁLATOK EREDMÉNYEI
5.1.1.
A fekete retek préslé
5.1.1.1.
A fekete retek préslé tápanyagösszetétele és bioaktív vegyületei
A fekete retek préslé (FRP) tápanyag összetétele és a benne található bioaktív vegyületek mennyisége az 5. táblázatban látható. A táblázatban és az ábrákon az öt különböző időpontban előállított preparátum mérési eredményeinek átlagát és szórását tüntettük fel. A préslé jellegéből adódóan alacsony szárazanyag tartalmú, eredeti formájában, mint energia- és tápanyagforrás nem jelentős. A mérhető cukrok kis hányada feltehetően a glükozinolátok hidrolíziséből származik. Makro- és mikroelem tartalma számottevő, legnagyobb mennyiségben, mint valamennyi növényben, a kálium található meg benne. A vizsgált FRPben a kálium-nátrium ionok aránya 10.5 : 1, a kalcium-magnézium ionoké pedig 2.1 : 1. A FRP számottevő mennyiségben tartalmaz mikroelemeket. A magnézium 10.6 mg/100 ml, a mangán 38, a cink 77 és a króm 2.43 µg/100 ml mennyiségben mutatható ki a préslében.
Megemlítendő a készítmény magas kéntartalma, amely több lényeges bioaktív vegyület alkotóeleme. Ilyen komponensek például a retek csípős ízét adó glükozinolátok, ill. hidrolizált termékeik, az izotiocianátok, a metán-tiol és az allil vegyületek, valamint az antibiotikus hatású szulfoxidok (szulforafen). A Raphacol epegranulátum készítéséhez felhasznált FRP standardizálása a kéntartalom alapján történik.
Az irodalmi adatok szerint fekete retek gyökere az egyéb glükozinolát forrásokhoz (káposztafélék) viszonyítva két-háromszoros, esetenként húszszoros mennyiségben tartalmazza ezeket a vegyületeket. A vizsgálatainkhoz felhasznált FRP-ben nem volt kimutatható mennyiségben glükozinolát. A 10. ábrán a standard glükozinolát keverék és a FRP HPLC-s kromatogramja látható. A minta analízise során csak a belső standardként hozzáadott glükotropaeolin csúcsa látható. A fekete retek flavonoidösszetételére vonatkozóan kevés irodalmi adat áll rendelkezésünkre, a legtöbb eredmény a hagyományos piros héjú változatra vonatkozik. Jelenlegi analízisünk szerint a FRP kvercetint (0.066 mg/100 ml, 1.08 mg/100g szárazanyag) és kempferolt (0.495 mg/100 ml, 8.08 mg/100 g szárazanyag) tartalmaz. A standard flavonoid keverék és a FRP minta HPLC-s kromatogramja a 11. ábrán látható. Mivel a flavonoidok mennyiségének meghatározása savas hidrolízis után történt, nincs arra vonatkozóan információnk, hogy a flavonoidok milyen glükozidok formájában vannak jelen. Jóllehet mennyiségük nem számottevő, de az egyéb jelenlévő polifenolos vegyületekkel együtt hatásuk jelentős lehet.
59
10. ábra
Standard glükozinolát keverék (a) és a fekete retek préslé (b) HPLC-s kromatogramja (a)
(b)
60
11. ábra
Standard flavonoid keverék (a) és a fekete retek préslé (b) HPLC-s kromatogramja
61
A bioaktív vegyületek mennyisége az 5. táblázatban látható. A flavonoidok mellett egyéb polifenolos vegyületek is megtalálhatók a mintában, mivel az összes polifenoltartalom nem elhanyagolható: 25.5 mg/100 ml (571.7 mg/100 g szárazanyag). A flavonoidok és egyéb polifenolos vegyületek kedvező hatásait FRP-ben kimutatható mennyiségben jelenlévő vitaminok is fokozhatják. 100 ml FRP-ben 5 mg aszkorbinsav, 0.31 mg tokoferol és 0.02 mg β-karotin található. 5. táblázat
A fekete retek préslé tápanyagkomponenseinek és bioaktív anyagainak mennyisége Komponensek
Mennyiség
Tápanyagkomponensek
100 ml-ben
Szárazanyag (g) Fehérje (g) Zsír (g) Összes szénhidrát (g), ebből glükóz (g) fruktóz (g) szacharóz (g) maltóz (g) Energia (kJ) Makro- és mikroelemek Nátrium (mg) Kálium (mg) Kalcium (mg) Magnézium (mg) Foszfor (mg) Kén (mg) Vas (µg) Mangán (µg) Cink (µg) Bárium (µg) Réz (µg) Nikkel (µg) Titán (µg) Bór (µg) Króm (µg) Bioaktív vegyületek Glükozinolátok (mg) Aszkorbinsav (mg) Karotin (mg) Tokoferolok (mg) Összes polifenol (mg) Kvercetin (mg) Kempferol (mg) n.d. – nem detektálható
62
6.13 ± 0.18 0.72 ± 0.06 0.41 ± 0.07 5.0 ± 0.2 0.9 ± 0.05 0.5 ± 0.03 0.1 ± 0.009 0.1 ± 0.009 114 ± 5
100 g szárazanyagban 100 11.7 6.7 81.6 14.7 8.2 1.63 1.63 1860
20 ± 2 210 ± 3.7 22.3 ± 0.22 10.6 ± 0.22 24.1 ± 0.28 41.9 ± 0.37 37 ± 1 38 ± 0.1 77 ± 1 0.097 ± 0.001 6.86 ± 0.03 11.2 ± 0.2 1.55 ± 0.03 89 ± 0.4 2.34 ± 0.07
326 3426 364 172.9 393 684 600 620 1260 1.6 111.8 183.4 25.3 1450 38.1
n.d. 5.0 ± 0.08 0.02 ± 0.002 0.31 ± 0.03 25.5 ± 5.2 0.066 ± 0.022 0.495 ± 0.252
n.d. 81.6 0.33 5.06 415.9 1.08 8.08
5.1.1.2.
A fekete retek préslé antioxidáns tulajdonságai
A FRP antioxidáns tulajdonságai a 6. táblázatban láthatók. A FRP 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil gyök jelenlétében erőteljes hidrogén donorként viselkedett, ez a hatás a koncentrációfüggő volt. Az eredmények a 12. ábrán láthatók. A fekete retek hidrogén-donor aktivitását a Trolox (szintetikus E-vitamin analóg) és az aszkorbinsav hatásával hasonlítottuk össze. A FRP minta 0.1-0.5 ml mennyiségben nagyságrendileg azonos hidrogén-donor aktivitást mutatott, mint a fent említett jelentős antioxidánsok 0.02 mg/ml koncentrációban. Az antioxidások I50 értéke, vagyis az adott vizsgálati rendszerben a színintenzitás 50%os csökkenését előidéző mintamennyiségek a következők: fekete retek préslé: 0.54 ml, aszkorbinsav: 0.013 mg, Trolox: 0.018 mg.
A FRP jelentős redukáló hatással rendelkezik, amely a minta növekvő koncentrációjával nő. Az adatok a 13. ábrán láthatók. A fekete retek redukálóképességét 20-120 µg/ml koncentrációjú aszkorbinsav redukáló hatásával hasonlítottuk össze. A FRP 0.1 - 1.0 ml mennyiségben nagyságrendileg azonos redukálóerővel rendelkezik, mint az aszkorbinsav a fent említett koncentrációban. 1 ml FRP 0.73 µmol aszkorbinsav redukáló hatásával egyenértékű.
A FRP kelátképző tulajdonságai a 14. és 15. ábrán láthatók. Az 14. ábrán a fekete retek préslé komplexképző vegyületeinek rézionokkal alkotott komplexeinek abszorbanciaspektrumát mutatjuk be. A FRP egyes komponensei koncentrációfüggő módon képesek az átmeneti fémionokkal stabil komplex vegyületet létrehozni és így lipidperoxidációt jelentősen visszaszorítani (15. ábra). Spektrofotometriás mérési rendszerben a FRP H2O2 scavenger tulajdonsága nem mutatható ki, mivel a minta számos, az UV tartományban jelet adó komponenst tartalmaz. Ezért kemilumineszcenciás módszerrel tanulmányoztuk a minta scavenger tulajdonságát H2O2/⋅OH-luminol-mikroperoxidáz rendszerben. Az eredmények a 16. ábrán találhatók. A hidrogén peroxidból a nyomokban mindig jelenlévő vasionok hatására a Fenton reakcióban hidroxil gyökök keletkeznek. A H2O2/.OH rendszerben a luminol gerjesztődik, majd a molekula felhasadását követően lumineszcens fényt bocsát ki. A fekete retek szignifikánsan csökkentette a rendszer által kibocsátott lumineszcens fény intenzitását. Ismeretes, hogy a lipidperoxidációs folyamatokban a H2O2 önmagában nem túl jelentős oxidáló ágens, de a Fenton reakcióban keletkező nagy reaktivitású hidroxil gyökök a lipidperoxidáció ugrásszerű fokozódását eredményezik (206).
63
12. ábra
A fekete retek préslé, az aszkorbinsav és a Trolox hidrogén-donor aktivitása
100 Fekete retek préslé
Gátlás (%)
80 60
Aszkorbinsav (0.02 mg/ml)
40 20
Trolox (0.02 mg/ml)
0 0
0,4
0,8
1,2
1,6
Mintamennyiség (ml)
13. ábra
A fekete retek préslé és az aszkorbinsav redukálóképessége
1
Abszorbancia (700 nm)
0,8
Fekete retek préslé
0,6
Aszkorbinsav 0.1 mg/ml
0,4
0,2
0 0
0,2
0,4
0,6
0,8
Mintamennyiség (ml)
64
1
1,2
14. ábra
A fekete retek préslé rézionokkal alkotott komplexének abszorbancia spektruma
A fekete retek préslé koncentrációfüggő komplexképző tulajdonsága
Komplexképzés (Abs 485/Abs530)
15. ábra
4 Kontroll
3
2 Fekete retek préslé
1
0 0
0,3
0,6
0,9
Mintamennyiség (ml)
65
1,2
A fekete retek szuperoxid gyök befogó képességét az adrenalin/adrenochrom rendszerben teszteltük. A FRP szignifikánsan gátolta az adrenalin lúgos közegben lejátszódó autooxidációját, amely folyamat során szuperoxid gyök is keletkezik Pontosan ismert aktivitású szuperoxid dizmutáz enzim felhasználásával a FRP ún. "SOD-like" (szuperoxid-dizmutázhoz hasonló) aktivitása 57.0 ± 6.3 U/ml volt (6. táblázat). Egy másik vizsgálati rendszerben, a citokróm c gátlása során is bebizonyosodott a FRP szuperoxid gyökbefogó tulajdonsága, amely a 17. ábrán látható. A szuperoxid gyökből számos egyéb szabad gyök keletkezhet, pl. szinglett oxigén, hidroxilgyök és hidrogén peroxid, melyek újabb lipid molekulákon lipidperoxidációt képesek iniciálni (59). A szuperoxid gyök indirekt és direkt módon is képes a lipidperoxidációs láncreakciók beindítására (132).
6. táblázat
Fekete retek préslé antioxidáns tulajdonságai
Tulajdonság
Mértékegység
Érték
Hidrogén-donor aktivitás I50 (ml)a 0.54 ± 0.01 Redukálóképesség ASE (ml-1)b 0.73 ± 0.08 c Komplexképzés Abs485/Abs530 (1 ml) 1.65 ± 0.01 Totál antioxidáns státusz TAS (mmol/l)d 97.8 ± 23.7 Szuperoxid gyök befogás SOD-like aktivitás (U/ml)e 57.0 ± 6.3 Linolsav autoxidáció gátlása I50 (ml)f 0.125 ± 0.028 Lipidperoxidáció gátlása I50 (ml)g 0.114 ± 0.012 a - az adott vizsgálati rendszerben a színintenzitás 50%-os csökkenéséhez szükséges mintamennyiség b - ASE: 1 ml minta ennyi µmol aszkorbinsav redukálóképeségével egyenértékű c - 1 ml minta 485 és 530 nm-em mért abszorbancia hányadosa az adott vizsgálati rendszerben; a kontroll (komplexképző vegyületet nem tartalmazó) elegy értéke 3.50 ± 0.02 d - Trolox ekvivalensben kifejezve e - adrenalin/adrenochrom átalakulás alapján, marha eritrocitából származó, ismert aktivitású szuperoxid-dizmutáz enzim segítségével kiszámolva f - a linolsav autoxidációját 50%-kal gátló minta mennyisége az 5 napos inkubációs periódus alatt g - patkánymáj mikroszómában NADPH-val indukált lipidperoxidáció 50%-os gátlásához szükséges minta mennyisége A FRP különböző koncentrációkban szignifikánsan gátolta a linolsav autooxidációját. Az eredmények a 18. ábrán láthatók. A lipidperoxidáció korai szakaszában a zsírsavakban lévő kettős kötések divinil-metán szerkezetet alkotva átrendeződnek, amely a konjugált diének mennyiségének növekedésében nyilvánul meg. A láncreakció következő folyamatai során lipidperoxidok keletkeznek, melyek mennyisége a tiocianátos színreakcióval jellemezhető. Vizsgálataink szerint a FRP 0.1-1.0 ml mennyisége szignifikánsan gátolta a linolsav autooxidációját az indukciós periódus jelentős meghosszabbodása révén. A linolsav autoxidációjának 50%-os gátlásához 0.125 ml FRP-re volt szükség az 5 napos inkubációs periódus alatt.
66
A fekete retek préslé koncentrációfüggő scavenger tulajdonsága a H2O2/·OH-luminolmikroperoxidáz rendszerben
Kemilumineszcenciás fényintenzitás (RLU)
16. ábra
1,E+09
1,E+06
1,E+03
1,E+00 0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
Mintamennyiség (ml)
A fekete retek préslé hatása a citokróm c redukciójára
0,4 Abszorbancia (550 nm)
17. ábra
Kontroll
0,3
0.025 ml FRP
0,2
0.050 ml FRP
0,1
0 0
1
2
3
Idő (perc)
67
4
18. ábra
A fekete retek préslé hatása a linolsav autooxidációjára
5 Abszorbancia (500 nm)
Kontroll 4 0.1 ml FRP 3 0.2 ml FRP 2 0.5 ml FRP 1 1.0 ml FRP 0 0
1
2
3
4
5
6
Inkubációs idő (nap)
19. ábra
A fekete retek préslé hatása a patkánymáj mikroszómában NADPH-val indukált lipid peroxidációra
16
Kontroll
MDA (nmol/mg prot.)
14 12
0.025 ml FRP
10
0.05 ml FRP
8
0.10 ml FRP
6 4
0.15 ml FRP
2
0.20 ml FRP
0 0
5
10
15
20
25
Idő (perc)
68
30
35
A FRP összes antioxidáns hatása a TAS (totál antioxidáns státusz) módszerrel is meghatározható. A minta a rendszerben mérhető abszorbanciát csökkentette azáltal, hogy aktív vegyületei meggátolták a metmioglobin oxidációját és/vagy befogták a ferrilmioglobin gyököt. A fekete retek préslé TAS értéke 97.8 ± 23.7 mmol/l volt, Trolox ekvivalensben kifejezve.
A vizsgált minta kedvező tulajdonságokat mutatott lipidperoxidációs rendszerben is. A FRP hatását a NADPH-val
enzimatikus
tanulmányoztuk.
A
úton
bemutatott
indukált vizsgálatot
lipidperoxidációra
patkánymáj
mikroszóma
három alkalommal 5-5 patkány
frakción
májából készült
homogenizátumból szeparált mikroszóma frakción végeztük. A reakcióelegy különböző mennyiségben FRP-t tartalmazott. A reakcióelegyet 37oC-on 20 percig inkubáltuk. Előkísérleteink szerint ez alatt az idő alatt jól mérhető és reprodukálható maximális mennyiségű malondialdehidben kifejezett tiobarbitursavval reagáló lipidperoxidációs termék keletkezett, és így a minta különböző koncentrációinak hatására bekövetkező változások a hibahatárokat figyelembe véve jól vizsgálhatók. A 19. ábra tanúsága szerint a FRP 0.025-0.2 ml mennyiségben koncentrációfüggő módon szignifikánsan gátolta a patkánymáj mikroszómában enzimatikus úton, NADPH-val indukált lipidperoxidációt. Az alkalmazott rendszerben a minta I50 értéke 0.114 ml volt, azaz a 20 perces inkubációs idő alatt a lipidperoxidáció 50%-os gátlásához ennyi FRP szükséges. 5.1.2.
Vörös- és fehérborok, szőlőlevek
5.1.2.1.
Borok és szőlőlevek polifenoltartalma
A vizsgált borminták és szőlőlevek polifenoltartalmát és antioxidáns tulajdonságait a 7. táblázatban foglaltuk össze. A hazai vörösborok polifenoltartalma az irodalmi adatokkal összehasonlítva nem tér el a nemzetközi piacokon megtalálható híres francia, olasz, portugál és kaliforniai borokétól (74, 305). A hazai vörösborok polifenoltartalma 1050-3310 mg/l. Legnagyobb mennyiségben a Pinot Noir, az Oporto és a Merlot fajtákban volt mérhető.
A borokban található polifenolok mennyiségét alapvetően meghatározza a kiindulási szőlő fajtája, a termőhely, az évjárat, a borkészítési technológia, valamint a bor kora. A Pinot Noir és az Oportó borokból a gyártástechnológia két időpontjában vettünk mintát. Az 6. (Pinot Noir) és 7. (Oportó) jelű minták a borkészítés első szakasza, vagyis az erjedés után mutatják be a bor tulajdonságait. A 33. (Pinot Noir) és 32. (Oportó) jelű minták a 6. és 7. mintával azonosak, de a mintavétel a többszöri fejtést követően közvetlenül a palackozás előtt történt. A 6. és 7. mintákban mért rendkívül magas polifenoltartalom jelentősen csökkent a további technológiai lépések során. A Pinot Noir fajtában 3310 mg/l-ről 2770 mg/lre, míg az Oportóban 2240 mg/l-ről 1718 mg/l-re. Az erjedt must és a kész bor közötti eltérések nemcsak
69
polifenolos komponensek mennyiségében, hanem kémiai szerkezetük különbözőségében is megnyilvánul (74). Erre vonatkozóan a bemutatott vizsgálatsorozatban nem végeztünk meghatározásokat. A 4. jelű Oportó a 7. és 32. mintával azonos borászatból származott, a felhasznált szőlő fajtája, a feldolgozási technológia és minden egyéb paraméter azonos volt, kivéve az évjáratot. A polifenoltartalom alapján a két, különböző évjáratú borminta gyakorlatilag nem tért el egymástól (1718 és 1710 mg/l).
A vörösbor gyártási technológiájától kicsit eltérő módon előállított rozé bor polifenoltartalma csak harmada a vörösborénak (630 mg/l), a fehérborok pedig még alacsonyabb értékeket mutatnak (251-557 mg/l). A különböző technológiával előállított kékszőlőlevek polifenoltartalma között jelentős eltérés tapasztalható. A garantáltan kímélő és hatékony technológiával készített Dr. Steinberger-féle kékszőlőlé literenként 980 mg polifenolt tartalmaz, az Otelló szőlőből frissen préselt lé 680 mg-t, míg a kereskedelmi forgalomban kapható, természetazonos színezékkel és ízanyagokkal készített Hey-Ho szőlőlében 560 mg található. A borkészítés során a kékszőlő alkoholos erjedése alatt a héj falából jelentős mennyiségű polifenolos vegyület oldódik ki a vörösborba, ezért a polifenolok mennyisége a borban két-háromszorosa is lehet az ugyanazon szőlőből frissen préselést levekben található értéknek. A polifenoltartalmat illetően a vizsgált szőlőlevek alulmaradtak a vörösborokhoz képest, a fehérborokhoz viszonyítva azonban közel másfélszeres a hatékony vegyületek mennyisége.
A különböző borfajták és szőlőlevek polifenoltartalma a 20. ábrán látható. Azon borok esetében, ahol egynél több minta képviselt egy bizonyos fajtát, az adatok átlagát adtuk meg. Az egyes fajták között jelentős különbségek tapasztalhatók, legmagasabb a polifenoltartalom a Pinot Noir-ban, továbbá nagyon kedvező összetételű a Cabernet Sauvignon, az Oportó, az Egri Bikavér és a Zweigelt. Az Merlot fajta átlagértéke viszonylag alacsony, ami abból adódik, hogy a két tájegységről származó mintában nagyon kevés polifenol volt mérhető, 1200-1300 mg/l, míg a másik két mintában 1800-2000 mg/l volt. A külföldi vörösborok nem tartalmaztak több polifenolos vegyületet, mint a hazaiak, a legjobb közülük a francia eredetű Cuveé Boisset volt. A szőlőlevek átlagértékeit tekintve a vörös- és fehérborok között, a rozé fajtával egy szinten állnak.
70
7. táblázat
Sorszám 6 33 7 32 4 8 9 10 12 18 11 15 13 14 20 22 21 24 23 25 16 17 26 2 19 3 27 34 5 28 29 30 1 31 1 2 3 5.1.2.2.
Vörös- és fehérborok, valamint szőlőlevek összes polifenoltartalma, hidrogén-donor aktivitása, redukálóképessége és TAS értékei
Név Pinot Noir Pinot Noir Oporto Oporto Oporto Oporto Merlot Merlot Merlot Merlot Cabernet Franc Cabernet Franc Kékfrankos Kékfrankos Kékfrankos Kékfrankos Cabernet Sauvignon Cabernet Sauvignon Zweigelt Zweigelt Medina Bikavér Kadarka Desszertbor Cuveé Boisset Mavrod. of Patras Offley, Portwine Mavrud Rozé Aszú (három puttonyos) Szamorodni Szamorodni Rizling Sárga muskotály Hey-Ho Dr. Steinberger Otello
Redukálóképesség ASE/ml
TAS mmol/l
3310 2770 2240 1718 1710 1900 1210 1790 1960 1330 810 1270 1100 1350 1780 1700 1760 1900 1890 1350 1420 1710 1370 1050 2010 1500 1530 2710 630 557
H-donor aktivitás (µl) I50 2.2 2.5 5.0 5.6 7.8 5.7 11.3 8.6 6.6 9.2 14.3 9.9 10.5 10.3 5.2 5.3 4.3 4.7 4.3 6.7 11.9 7.2 7.0 16.6 4.8 13.9 7.3 3.5 26.2 35.9
31.3 32.3 17.4 18.7 15.6 17.2 10.9 11.9 18.0 13.1 8.3 12.8 10.5 12.4 23.6 21.8 24.9 28.3 24.3 16.9 11.4 17.5 17.4 7.5 25.6 11.4 17.5 13.8 5.3 5.0
20.10 28.0 10.70 20.30 6.90 2.20 6.70 9.60 11.20 8.50 6.70 9.20 6.50 9.00 9.80 12.90 10.90 16.50 16.00 12.00 9.00 9.80 11.10 4.90 14.50 8.30 10.70 3.10 3.60
567 309 280 251 560 980 680
27.3 53.3 68.0 80.7 39.6 10.5 57.9
5. 5 3.3 2.2 2.4 2.8 7.3 5.2
4.55 2.39 1.04 1.80 1.70 5.80 0.50
Összes polifenol mg/l
Borok és szőlőlevek antioxidáns tulajdonságai
Valamennyi tanulmányozott vörösbor koncentrációfüggő módon szignifikánsan csökkentette a 1,1-difenil2-pikrilhidrazil gyök abszorbanciáját, mivel a fenolos vegyületek hidrogén adtak át a DPPH párosítatlan elektronjának. Néhány borminta koncentrációfüggő hidrogén-donor aktivitása a 21. ábrán látható.
71
20. ábra
Vörös- és fehérborok, valamint szőlőlevek összes polifenoltartalma
Összes polifenol (mg/l)
4000
3000
2000
1000
Gátlás (%)
21. ábra
Szőlőlevek
Muskotály
Rizling
Szamorodni
Tokaj Aszú
Rozé
Cab. Franc
Desszert
Kadarka
Medina
Kékfrankos
Mavrod.
Offley
Merlot
Zweigelt
Bikavér
Oportó
Cab. Sauv.
Cuveé Boisset
Pinot Noir
0
Néhány vörösbor koncentrációfüggő hidrogén-donor aktivitása
120
Pinot Noir (6)
100
Merlot (12)
80
Bikavér
60
Kadarka
40
Merlot (10)
20
Medina
0 0
0,005
0,01
0,015
0,02
Mintamennyiség (ml)
72
0,025
Cabernet Franc (11)
Előzőekből következően a bor eredetű fenolos komponensek szabad gyök inhibitorok, elsőrendű, azaz láncmegszakító antioxidánsként viselkednek elsősorban a lipid hidroperoxid gyökökkel szemben, melyek legfőbb propagátorai a lipidek autoxidációjának.
A minták I50 értéke, azaz az 50 %-os gátláshoz szükséges mintamennyiség vörösborok esetében 2.2 - 16.6 µl, fehérborokban 27.3 - 80.7 µl és szőlőlevekben 10.5 - 57.9 µl között volt (7. táblázat). Legerősebb hatást az erjesztés után közvetlenül, valamint a palackozást megelőzően vett Pinot Noir minták esetében tapasztaltunk. Az egyes borfajták értékeit összevonva, megállapítható, hogy a fajták között lehetnek eltérések, de ezek nem tekinthetők szignifikánsan jelentősnek (22. ábra). A borok hidrogén-donor aktivitását a polifenoltartalom alapvetően meghatározza, az összes polifenoltartalom és a hidrogén-donor aktivitás jellemzésére szolgáló I50 érték között erős szignifikáns korreláció mutatható ki. Az I50 érték jellegéből adódóan az összefüggés nem lineáris, hanem hatvány függvénnyel írható le: y = 149344x-1,3513, r2 = 0.9355, n = 37. A Fe3+ → Fe2+ reakcióban a vörösborok erőteljes redukálóképessége mutatható ki, a minták növekvő koncentrációjával a hatás erősödött. A 23. ábrán néhány vörösbor koncentrációfüggő redukálóképessége látható. A redukáló hatású vegyületek a lipidperoxidáció gátlásában másodrendű, preventív antioxidánsként viselkednek. Az egyik legjelentősebb redukáló hatású étrendi antioxidáns az aszkorbinsav, amely más egyéb rendkívül jelentős élettani hatásán túl másodrendű antioxidánsként képes visszaszorítani a szervezetben a különböző károsító tényezők hatására felerősödő patológiás szabad gyök reakciókat.
A vizsgálatok során a vörös- és fehérborok, valamint a szőlőlevek redukálóképességét az aszkorbinsavéhoz hasonlítottuk és aszkorbinsav ekvivalensben (ASE/ml, 1 ml minta hány µmol aszkorbinsav redukáló hatásával egyenértékű) fejeztük ki (7. táblázat). Vörösborok esetében a redukálóképesség 7.5 - 31.3 ASE/ml, fehérborokban 2.2 - 5.5, és kékszőlőlevekben 2.8 - 7.3 ASE/ml volt. Legmagasabb redukáló hatást a két Pinot Noir minta esetében tapasztaltunk, de valamennyi vörösbor minta jelentős redukálóképességet mutatott. Ez nem volt jellemző a rozé borra. A különböző bortermelő vidékekről származó, de azonos fajtájú borminták adatait összevonva megállapítható, hogy legmagasabb redukáló hatással a Pinot Noir fajta rendelkezik, kiváló tulajdonságai vannak az Oportó és a Cabernet Sauvignon fajtáknak, míg a fehérborok természetesen alacsony redukáló hatásúak (24. ábra). A kékszőlőből származó, alkoholt nem tartalmazó levek redukáló ereje a fehérborokéval közel azonos.
73
22. ábra
Különböző borfajták hidrogén-donor aktivitása
80
H-donor aktivitás (I50)
70 60 50 40 30 20 10
23. ábra
Szőlőlevek
Rizling
Szamorodni
Tokaji Aszú
Rozé
Néhány borminta koncentráció-függő redukálóképessége
Cabernet Sauvignon (24)
3,5
Redukálóképesség (A 700)
Desszertbor
Mavrodaphne
Cabernet Franc
Medina
Merlot
Kékfrankos
Offley Portwine
Bikavér
Kadarka
Oportó
Zweigelt
Cuveé Boisset
Cabernet Sauvignon
Pinot Noir
0
3
Pinot Noir (33)
2,5 2
Zweigelt (25)
1,5
Oporto (32)
1 0,5
Merlot (9)
0 0
0,04
0,08
0,12
Mintamennyiség (ml)
74
Rozé (5)
24. ábra
Különböző borfajták redukálóképessége
Redukálóképesség (ASE/ml)
40
30
20
10
25. ábra
Szőlőlevek
Riesling
Szamorodni
Tokaj Aszú
Rozé
Desszertbor
Cabernet Franc
Mavrodaphne
Medina
Merlot
Kékfrankos
Offley, Portwine
Bikavér
Kadarka
Oportó
Zweigelt
Cuveé Boisset
Cabernet Sauvignon
Pinot Noir
0
Néhány borminta koncentrációfüggő komplexképző tulajdonsága
4 3,5
Komplexképzés (A485/A530)
Merlot (12)
kontroll: 3.5
Cuvée Boisset
3 2,5
Bikavér
2
Kékfrankos (13)
1,5
Rozé
1 0,5
Tokaji Aszú
0 0
0,4
0,8
Mintamennyiség (ml)
75
1,2
Tokaji muskotály
A vörösborok összes polifenoltartalma és redukálóképessége között szoros lineáris korreláció mutatható ki, y = 0.0101x - 0.091, r2 = 0.7491, n = 37.
A vörösbor eredetű polifenolos vegyületek komplexképző tulajdonságait rézionok jelenlétében tanulmányoztuk. A kelátképző vegyületet nem tartalmazó reakcióelegy 485 és 530 nm-en mérhető abszorbanciájának hányadosa 3.5 ± 0.02 volt. Valamennyi vizsgált minta esetében szignifikánsan alacsonyabb értékeket tapasztaltunk, mint a kontrollban. Minél kisebb a 485 és 560 nm-en mért abszorbancia értékek hányadosa, annál erőteljesebb a komplexképző hatás. Néhány borminta különböző koncentrációinál mért hányadosokat a 25. ábrán mutatjuk be. A különböző tájegységekről származó borok adatait összevonva, megállapítható, hogy a komplexképző tulajdonság tekintetében nincs szignifikáns eltérés az egyes fajták között, de kiváló tulajdonságokkal rendelkezik a Pinot Noir, az Oportó, az Egri Bikavér és a Cabernet Sauvignon. (26. ábra). Jelentős eltérés csak a fehér- és vörösborokra jellemző értékek között volt tapasztalható. A komplexképző tulajdonság és az összes polifenoltartalom között szignifikáns lineáris korreláció mutatható ki, y = -0.00034x + 2.446, r2 = 0.6108, n = 22. A komplexképző tulajdonság mértékét jellemző mérőszám meghatározásából adódóan az összefüggés inverznek tűnik, de ez valójában az jelenti, hogy nagyobb polifenol koncentráció esetén a komplexképzés jelentősebb.
Az antioxidáns hatású vegyületekre az első- és másodrendű tulajdonságok mellett szabad gyökök befogása, eliminálása is jellemző lehet. Ezért a vörösbor mintákat tanulmányoztuk a H2O2/·OH-luminolmikroperoxidáz rendszerben is. Valamennyi vizsgált minta csökkentette a vizsgálati rendszerben keletkező kemilumineszcenciás fény intenzitását. (27. ábra). A vizsgálatokhoz 30 µl minta szükséges. Az egyes borminták között nem tapasztalható jelentős különbség az össz-scavenger tulajdonság tekintetében, jóllehet a rozé és fehérbor kisebb mértékben csökkentette a fényintenzitást, mint a vörösborok.
A xantin/xantin oxidáz rendszerben keletkező szuperoxid gyök a citokróm c-t redukálja, a reakció 550 nm-en követhető. Vörös- és fehérborok jelenlétében a citokróm c redukciója visszaszorul, ami a keletkező szuperoxid gyök befogásával, vagy a xantinoxidáz enzim gátlásával magyarázható. Bármelyik mechanizmus is érvényes ebben az esetben, a vörösborok kedvező tulajdonsága nem kétséges. Néhány vörösbor hatása a citokróm c redukciójára a kontrollhoz viszonyított gátlás %-ban kifejezve 28. ábrán látható. Jelentős scavenger hatás tapasztalható a Cabernet Sauvignon, a Kékfrankos és a Pinot Noir mintákban. A borok polifenoltartalma és a citokróm c redukció gátlásának mértéke között szoros lineáris korreláció mutatható ki, y = 1.0212x + 3.9416, r2 = 0.7924, n= 15.
76
77
Rizling
Desszert bor
Kadarka
Zweigelt
Oporto (4)
Cabernet Franc
Merlot (10)
Mavrodaphne
Szamorodni
Rozé
Tokaji Aszú
Kékfrankos
Cabernet Franc
Medina
Desszertbor
Merlot
Bikavér
Oportó
Mavrodaphne
Cuveé Boisset
Pinot Noir
1,5
Oporto (32)
Pinot Noir (6)
27. ábra
Oporto (7)
Kemilumineszcenciás fényintenzitás (standard fény %-ban )
Komplexképzés (A 485/A530)
26. ábra Néhány borminta 1 ml-ének komplexképző tulajdonsága
3
2,5
2
Néhány borminta 30 µl-ének scavenger tulajdonsága a H2O2/·OH-luminol rendszerben
12
10
8
6
4
2
0
78
Szőlőlevek
Rizling
Szamorodni
Tokaj Aszú
Rozé
Desszert
Cab. Franc
Mavrod.
Medina
Merlot
Kékfrankos
Offley
Bikavér
Kadarka
Oportó
Zweigelt
Cuveé
Cab. Sauv.
29. ábra
Pinot Noir
TAS (mmol/l)
Kékfrankos (13)
Cabernet F. (15)
Cuvée Boisset
Merlot (18)
Kékfrankos (14)
Medina
Pinot Noir (33)
Pinot Noir (6)
Oportó (4)
Oportó (7)
Egri Bikavér
Cabernet S. (24)
Cabernet S. (21)
Gátlás (kontroll %-ban)
28. ábra Néhány borminta 50 µl-ének hatása a citokróm c redukciójára
30
20
10
0
Vörös- és fehérborok, valamint szőlőlevek TAS értéke
35
30
25
20
15
10
5
0
A fehér- és vörösborok, valamint a kékszőlőlevek totál antioxidáns státuszát is tanulmányoztuk Randox TAS diagnosztikai készlet segítségével. A borminták jelenlétében a színes ABTS· gyök keletkezése visszaszorul. A minták antioxidáns hatását a vízoldható, szintetikus tokoferol származék, a Trolox hatásával hasonlítottuk össze, és ennek segítségével fejeztük ki a minták totál antioxidáns aktivitását. Az eredmények a 7. táblázatban láthatók. Vörösborok esetében a TAS érték 4.9 - 20.3 mmol/l, fehérborokban 1.04 - 4.55 és kékszőlőlevekben 0.50 - 5.80 volt. A kékszőlőlevek totál antioxidáns tulajdonsága a fehérborokét megközelítette, míg a vörösborokénál alacsonyabb volt (29. ábra). A borok összes polifenoltartalma és totál antioxidáns státusza között szoros lineáris összefüggés mutatható ki, y = 0.0096x – 3.0857, r2 = 0.8588, n = 36.
A vörös- és fehérborok összes antioxidáns hatását a linolsav autooxidációjára gyakorolt hatásuk segítségével is tanulmányoztuk. Valamennyi vizsgált borminta szignifikánsan gátolta a linolsav 40oC-on előidézett autooxidációját. A linolsav oxidációjának folyamatát vörösborok jelenlétében a 30. ábrán mutatja be. Az oxidáció indukciós periódusa az antioxidánsokat nem tartalmazó kontroll elegyben nagyon rövid volt, mivel a rendszerben mérhető lipidperoxidok mennyiségének ugrásszerű fokozódása már az első mintavétel alkalmával kimutatható volt. A vörösborokat tartalmazó keverékekben az első hét napban nem tapasztaltuk a lipidperoxidok mennyiségének emelkedését. A 30. ábra adatai szerint a rozé, valamint 2. jelű Kékfrankos kivételével az összes minta szignifikánsan gátolta a linolsav autooxidációját a tíz napig 40oC-on történt tárolás során.
Vizsgálataink szerint a fehér- és vörösborok, valamint a szőlőlevek antioxidáns tulajdonságai többféle kémiai reakció együttes hatásaként jutottak érvényre. A borok és szőlőlevek bioaktív vegyületei egymással szinergizálva első- és másodrendű antioxidánsként funkcionáltak, különböző szabad gyökök (hidroxil, szuperoxid) befogása képesek és az átmeneti fémionokat komplexbe kötve megakadályozzák a lipid hidroperoxidok katalitikus bomlását.
79
Néhány borminta 40 µl-ének hatása a linolsav autooxidációjára
30. ábra
2,5
Kontroll Medina
Abszorbancia (500 nm)
2
Mavrodaphne 1,5
Desszertbor Cabernet Franc (13) Oporto (8)
1
Egri Bikavér
0,5
Merlot (9) 0 0
2
4
6 o
Inkubációs idő 40 C-on (nap)
80
8
5.2. A FEKETE RETEK PRÉSLÉ HATÁSA ALIMENTÁRIS HYPER-LIPIDAEMIÁBAN PATKÁNYOKON In vivo állatkísérleteink célja az volt, hogy bizonyítsuk a fekete retek préslé (FRP) többirányú kedvező hatását kísérletesen, alimentáris úton előidézett hyperlipidaemiában. A zsírdús, és magas koleszterin tartalmú táp fogyasztásának hatására viszonylag rövid idő (9 nap) alatt súlyos májelzsírosodás mutatható ki (23, 24). A máj és ennek következtében egyéb szervek és szövetek oxidatív károsodása hisztológiai és biokémiai vizsgálatok eredményeivel is igazolható (24, 163). Saját kísérleteink során a hyperlipidaemiássá tett állatokat tízszeresre higított FRP-vel, mint in vitro körülmények között bizonyított antioxidánssal kezeltük. A zsír- és koleszterindús étrendet, valamint a FRP-t az állatok egyszerre fogyasztották. Ezért a FRP-t fogyasztásának hatására megnyilvánuló kedvező jelenségek mögött elsősorban preventív, a szabad gyökös reakciók megjelenését és fokozódását megakadályozó, megelőző mechanizmusok húzódnak meg, és a már kialakult károsodások megszüntetése kevésbé játszik szerepet a folyamatokban.
A FRP kedvező in vivo hatásainak igazolására a kezelt patkányok teljes máját és a májak mikroszóma frakcióját, szérumát, valamint eritrocitáit vizsgáltuk. Meghatároztuk a kontroll és zsírdús tápon tartott állatokban a legjellemzőbb szérumparaméterek és a lipidperoxidációval kapcsolatos komponensek mennyiségének alakulását. Tanulmányoztuk a májban lejátszódó oxidációs folyamatokat, az indukált lipidperoxidáció során bekövetkező változásokat, a membránok állapotát jelző membránhoz kötött enzimek aktivitását, valamint az antioxidáns enzimek aktivitását a májban és az eritrocitákban.
5.2.1.
Szérum paraméterek
A hyperlipidaemia kialakulását a szérum lipidparaméterek változása tükrözi (8. táblázat). A normál étrendet és FRP-t is fogyasztó állatok esetében a HDL-koleszterin érték kivételével nem tapasztaltunk eltérést a kontroll állatokhoz viszonyítva. A HDL-koleszterin szintje enyhén emelkedett a FRP-t és normál tápot fogyasztó állatokban. A magas koleszterin- és zsírtartalmú étrend fogyasztásának hatására az állatok szérumában szignifikánsan emelkedett a koleszterin, az LDL-koleszterin és a triglicerid koncentráció. Az étrend kiegészítésként fogyasztott FRP hatására a fenti komponensek mindegyikénél kedvező irányú elmozdulást tapasztaltunk a zsírdús tápon tartott állatokban. A tapasztalt változások a FRP jelentős lipidszint-csökkentő hatását jelzik hyperlipidaemiában, de a kontroll állatokban tapasztalt HDL-szint emelkedés további előnyös tulajdonságokra hívja fel a figyelmet.
81
8. táblázat
Lipid paraméterek változása patkányok szérumában a fekete retek préslé fogyasztásának hatására Minta n = 20
Koleszterin mmol/l
HDL-CHOL mmol/l
LDL-CHOL mmol/l
Triglicerid mmol/l
Normál étrend
1.65 ± 0.14a
1.04 ± 0.18a
0.32 ± 0.07a
1.49 ± 0.34a
Normál étrend + FRP
1.54 ± 0.20a
1.38 ± 0.09b
0.43 ± 0.15b,a
1.59 ± 0.25b
Zsírdús étrend
4.66 ± 0.68b
1.10 ± 0.16a
1.98 ± 0.50c
2.80 ± 0.16c
Zsírdús étrend + 1.62 ± 0.08a 1.19 ± 0.11c,a 0.46 ± 0.11b 1.33 ± 0.48a FRP a,b,c – egy oszlopon belül különböző betűvel jelölt értékek szignifikánsan eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten Alimentáris hyperlipidaemiában az étrend magas zsír- és koleszterintartalma miatt felerősödő szabad gyökös reakciók a májsejtek károsodását eredményezik, ezért a májenzimek aktivitása megnő a szérumban (29). A májenzimek aktivitásának alakulását a 9. táblázatban foglaltuk össze. Normolipidaemiás állatokban a FRP nem eredményezett változást az enzimek aktivitásában. Zsírdús étrend hatására az ALP közel 2.5-szeresére emelkedett, a GOT és a GPT értékeiben pedig 20-40%-os növekedést tapasztaltunk. A zsírdús étrend mellett FRP-t is fogyasztó állatok esetében az enzimaktivitások szignifikánsan alacsonyabb értékeit mutattuk ki a szérumban. A zsírdús étrenden tartott állatokban lecsökkent GOT/GPT arány is kedvező irányba változott a FRP hatására. Az eredmények a készítmény májvédő hatását jelzik, mivel a májkárosító hatású zsírdús étrenddel együtt fogyasztva megakadályozta a májsejtek nekrózisát és így a májenzimek kiszabadulását a sejtekből.
A karbamid, az albumin, az összes fehérje és a kreatinin koncentrációja közel azonos volt a négy csoportban. Az adatok a 10. táblázatban láthatók. Az eredmények azt jelzik, hogy a készítmény az alkalmazott koncentrációban nem volt toxikus hatású az állatokra. A kísérletek során a FRP koncentrációját az előkísérleteink eredményei, valamint a gyártó ajánlása alapján határoztuk meg.
82
9. táblázat Májenzimek aktivitásának változása patkányok szérumában a fekete retek préslé fogyasztásának hatására Minta n = 20
ALP (U/l)
GOT (U/l)
GPT (U/l)
GOT/GPT
Normál étrend
356 ± 52a
219 ± 74a
62 ± 9a
3.53
Normál étrend + FRP
399 ± 95a
229 ± 47a
56 ± 15a
4.09
Zsírdús étrend
832 ± 129b
270 ± 70b
89 ± 33b
3.03
Zsírdús étrend + 3.12 568 ± 69c 206 ± 33c,a 66 ± 11a,c FRP a,b,c – egy oszlopon belül különböző betűvel jelölt értékek szignifikánsan eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten
10. táblázat
A totál protein, az albumin a karbamid és a kreatinin mennyiségének változása patkányok szérumában a fekete retek préslé hatására Minta n = 20
Totál protein (g/l)
Albumin (g/l)
Karbamid (mmol/l)
Kreatinin (mmol/l)
Normál étrend
64.0 ± 1.9a
35.4 ± 1.1a
2.79 ± 0.09a
39 ± 2.0a
Normál étrend + FRP
66.8 ± 1.9b
37.0 ± 1.4b
2.81 ± 0.07a
40 ± 0.8b
Zsírdús étrend
64.8 ± 2.2a
36.8 ± 0.8b
2.75 ± 0.04a
40 ± 2.2b
Zsírdús étrend + 68.7 ± 2.5c,b 38.0 ± 1.7c,b 2.78 ± 0.06a 42 ± 2.1c,b FRP a,b,c – egy oszlopon belül különböző betűvel jelölt értékek szignifikánsan eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten A további szérumparaméterek a 11. táblázatban láthatók. A FRP-t fogyasztó normál étrenden tartott állatok szérumában a készítmény koleretikus hatásának köszönhetően mintegy kétszeresére nőtt az epesavak mennyisége. Ugyanakkor a koleszterin- és zsírdús étrend fogyasztásának hatására a hyperlipidaemiás állatokban a kontroll értékhez képest ötszörösére emelkedett az epesavak mennyisége. A FRP-t is fogyasztó hyperlipidaemiás állatokban a kontroll értéket megközelítő epesav koncentrációt
83
tapasztaltunk. Nagy mennyiségű koleszterin fogyasztása mellett a FRP hatására nemcsak az epesavak szérumszintje, hanem a koleszterin koncentrációja is csökkent a szérumban (lásd 8. táblázat). A FRP hatóanyagai elősegítették a koleszterin kiürülését hypercholesterinaemiában. 11. táblázat
Az epesavak, a húgysav, a glükóz és a totál bilirubin mennyiségének változása patkányok szérumában a fekete retek préslé hatására Minta n = 20
Epesavak (mmol/l)
Húgysav (mmol/l)
Glükóz (mmol/l)
Totál bilirubin (µmol/l)
Normál étrend
4.2 ± 1.3a
81 ± 9a
7.78 ± 0.29a
1.4 ± 0.9a
Normál étrend + FRP
9.6 ± 1.1b
117 ± 27b
7.81 ± 0.13a
1.5 ± 1.0a
Zsírdús étrend
22.0 ± 1.6c
103 ± 7c,b
6.59 ± 0.71b
2.4 ± 0.5b
Zsírdús étrend + 8.4 ± 1.5b 184 ± 24d 8.17 ± 0.61c,a 1.8 ± 0.4c,a FRP a,b,c – egy oszlopon belül különböző betűvel jelölt értékek szignifikánsan eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten A húgysav értékek a 11. táblázatban láthatók. A FRP hatására a normolipidaemiás állatok húgysav szintje szignifikánsan nőtt a kezeletlen kontrollhoz viszonyítva. Hyperlipidaemiában is magasabb értéket tapasztaltunk, mint a kontroll állatokban. A FRP tovább emelte a húgysavszintet a zsírdús tápon tartott állatokban, a kontroll érték közel 2.5-szeresére. Mivel állatok esetében a humán adatoktól eltérően a normáltartomány alsó és felső értéke nem ismert, nem tudjuk megmondani, hogy ez utóbbi érték még fiziológiás, vagy már kórosan magasnak tekinthető. Általában az mondhatjuk, hogy a húgysav a szérum egyik antioxidáns hatású komponense. Jóllehet fiziológiás szerepe elsősorban nem az antioxidáns védelem, megnövekedett koncentrációja növelheti a szérum antioxidáns kapacitását. Jelen esetben azonban nem lehet egyértelműen eldönteni, hogy a megemelkedett szérumszint kedvező hatású, vagy kedvezőtlen folyamatokat tükröz.
A szérum glükózszint a két normolipidaemiás csoportban azonos volt (11. táblázat). Hyperlipidaemiában enyhe glükózszint csökkenés volt tapasztalható, míg a FRP fogyasztása normál szintre emelte a glükóz koncentrációját a hyperlipidaemiás állatok szérumban. A totál bilirubin szintje a kontroll és a FRP-t fogyasztó normál étrenden tartott állatok szérumában nem tért el egymástól (11. táblázat). Hyperlipidaemiában az összes bilirubin koncentrációja szignifikánsan magasabb volt, mint a kontroll érték. Ez a májenzimek aktivitásának megemelkedéséhez hasonlóan a májsejtek károsodását és az
84
enterohepatikus körforgás enyhe zavarát jelzi. A zsír- és koleszterindús étrenddel együtt fogyasztott FRP hatására az állatok szérum totál bilirubin szintje a kontrollhoz közelített.
Hyperlipidaemiában csökkent szérum vas koncentrációt tapasztaltunk (12. táblázat). Hyperlipidaemiában nemcsak a májsejtek károsodnak, hanem a vékony- és vastagbélben is olyan változások zajlanak le, melyek következtében a vas felszívódása nagy valószínűséggel csökkent (163). A FRP normo- és hyperlipidaemiás állatokban is emelte a szérum vas szintet. A FRP nem túl nagy mennyiségben tartalmaz vasat (0.037 mg/100ml), ami az alkalmazott dózis alapján egy 200 g-os állatnak naponta átlagosan 1.11 µg vasbevitelt jelent. A kezelés ideje (9 nap) alatt rendszeresen fogyasztva a készítményt, még ez a kis mennyiség is elősegítheti a szérum vas szintjének emelését egészséges állatokban. Hyperlipidaemiában az étrendkiegészítésként fogyasztott FRP antioxidáns hatása miatt a májsejtek és a bélnyálkahártya károsodása mérsékeltebb, mint FRP-t nem fogyasztó állatokban, ezért vas felszívódása javulhat. Az elfogyasztott préslével bevitt vas mennyisége ugyanakkor nem olyan magas, hogy a lipidperoxidáció fokozódását eredményezné, mivel erre utaló változásokat nem tapasztaltunk. 12. táblázat
Az amiláz aktivitásának, valamint a vas és a foszfor koncentrációjának változása patkányok szérumában fekete retek préslé hatására Minta n = 20
Amiláz (U/l)
Fe (µmol/l)
Foszfor (mmol/l)
Normál étrend
6550 ± 972a
75 ± 7a
3.87 ± 0.20a
Normál étrend + FRP
8137 ± 813b
85 ± 4b
3.76 ± 0.02a
Zsírdús étrend
7340 ± 819b,a
51 ± 11c
3.90 ± 0.25a
Zsírdús étrend + 9116 ± 915c 63 ± 11d 3.84 ± 0.23a FRP a,b,c – egy oszlopon belül különböző betűvel jelölt értékek szignifikánsan eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten A 12. táblázat további adatai szerint az amiláz aktivitása a szérumban a FRP fogyasztásának hatására szignifikánsan nőtt normál és hyperlipidaemiás állatokban is. A foszfor koncentrációja valamennyi csoportban azonos volt. A szérum paraméterek alapján megállapítható volt, hogy a FRP egészséges állatokban nem eredményezett patológiás elváltozásokat, toxikus hatása nem volt. A magas zsír- és koleszterintartalmú étrend fogyasztásának hatására kialakult hyperlipidaemiában a FRP számos kedvező hatását sikerült bizonyítani. Legjelentősebb ezek közül a lipid és koleszterinszint csökkentő, valamint
85
májvédő tulajdonságai. A további vizsgálatok adnak felvilágosítást a készítmény egyéb kedvező tulajdonságairól. 5.2.2.
A lipidperoxidáció és az antioxidáns védelem szérumban, plazmában és eritrocitában
A lipidperoxidáció előrehaladottságának mértéke többek között a szérumban jelenlévő konjugált diének és a malondialdehid mennyiségével jellemezhető. Az állatok szérumában mért konjugált dién értékek a 31. ábrán láthatók. A FRP-vel kezelt normolipidaemiás csoportban a konjugált diének mennyisége azonos volt a kontroll értékkel, egészséges állatokban a FRP nem befolyásolta a lipidperoxidációt. Hyperlipidaemiás állatok szérumában szignifikánsan, közel kétszeresére nőtt a konjugált diének mennyisége a kontroll értékhez képest. A magas zsír- és koleszterintartalmú táppal együtt FRP-t is fogyasztó állatok szérumában a konjugált diének mennyisége nem volt magasabb, mint az egészséges állatokban mért érték.
A szérumban mért malondialdehid értékeket a 32. ábrán mutatjuk be. Az átlagok elmozdulása a konjugált diének esetében tapasztaltakkal hasonló módon változott. Normolipidaemiás állatokban a FRP nem okozott eltérést a kontrollhoz képest. Zsírdús étrend hatására a MDA mennyisége 6.5-7-szeres, szignifikáns emelkedést mutatott. Amennyiben az állatok a zsírdús táp mellett FRP-t is kaptak, a szérum MDA szintje az egészséges kontroll állatokéval azonos volt.
A lipidperoxidáció előrehaladottságát jelző két szérumkomponens, a konjugált diének és a malondialdehid mennyisége FRP-t fogyasztó hyperlipidaemiás állatok szérumában a kontroll értékkel volt azonos, ezért a FRP lipidperoxidációt gátló hatása egyértelmű.
A szérum antioxidáns védelmében a zsíroldékony vitaminok jelentős szerepet töltenek be. A patkányszérumok A- és E-vitamin szintje a 33. és 34. ábrán láthatók. FRP-t fogyasztó normolipidaemiás állatok szérumában az A- és az E-vitamin mennyisége nem tér el jelentősen a kontrolltól, jóllehet a készítmény kimutatható mennyiségben tartalmaz mind β-karotint (0.02 mg/100 ml), mind tokoferolokat (0.31 mg/100 ml). Figyelembe véve, hogy az állatok az eredeti préslé tízszeresre higított oldatát kapták, 150 ml-t testtömeg kilogrammonként, és egy állat súlya 200-240 g között volt a kísérlet ideje alatt, nagy mennyiségű karotin és tokoferol napi beviteléről nem beszélhetünk.
86
31. ábra
Fekete retek préslé hatása patkány szérumok konjugált dién szintjére
Konjugált diének ( /umol/l)
400
c kontroll
300 a,b
a
200
b in vivo fekete retek
100
0 normál étrend a, b, c
32. ábra
zsírdús étrend
a különböző betűvel jelölt értékek eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten
Fekete retek préslé hatása patkány szérumok malondialdehid tartalmára
20 b
MDA (/umol/l)
16
kontroll
12 8 4
c a
a
in vivo fekete retek
0 normál étrend a, b, c
zsírdús étrend
a különböző betűvel jelölt értékek eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten
87
Egy 200 g-os állat 0.6 µg karotint és 9.3 µg tokoferolt vett fel a FRP-ből naponta. Természetesen az alkalmazott táp is tartalmazott vitaminokat, melyek egészséges állatoknál biztosítják a szükségletet, vagyis a prooxidáns/antioxidáns egyensúlyt. Mivel egészséges állatokban nincs szükség az antioxidáns védelem fiziológiásnál magasabb szintjére, ezért a fokozott bevitel kontroll állatoknál nem jelenik meg a szérumban, hanem raktározódik vagy kiürül.
Hyperlipidaemiás állatokban a szérum E-vitamin szintje magasabb volt, mint a kontroll érték, jóllehet a különbség nem volt szignifikáns a nagy szórás miatt (33. ábra). A zsírdús étrend 20%-ban napraforgóolajat tartalmazott, melyben 600-800 mg/kg E-vitamin található, melynek 95-98%-a a biológiai hasznosulást tekintve legértékesebb α-tokoferol izomer. Ennek az E-vitaminnak egy része megjelent a szérumban. A FRP fogyasztása hyperlipidaemiában tovább növelte a szérum E-vitamin szintjét, elősegítve ezáltal a fokozott oxidatív stressz elleni védelmet. Zsírdús étrenden tartott állatok szérumában enyhén emelkedett A-vitamin szintet tapasztaltunk (34. ábra). Feltételezhető, hogy a fokozott oxidációs folyamatokra a szervezet a májban tartalékolt A-vitamin felhasználásával válaszolt, amely így megjelent a szérumban. A FRP-t fogyasztó állatok szérumában további A-vitamin növekedést tapasztaltunk a készítmény karotintartalmának köszönhetően. Továbbá az is elképzelhető, hogy a nagy zsírtartalmú táp fogyasztása elősegítette a zsíroldékony karotinoidok felszívódását.
A szérum védelmi rendszerének állapotát bemutató egyéb szérum paraméterek a 13. táblázatban láthatók. A szérumban a szulfhidril csoportokat tartalmazó vegyületek (redukált glutation, cisztin, stb.) mennyiségét jellemző mutatók valamennyi csoportban azonosan voltak. A szérum összes redukáló ekvivalenseinek (aszkorbinsav ekvivalensben kifejezve) mennyisége a FRP-t fogyasztó normolipidaemiás patkányokban szignifikánsan magasabb volt, mint a kezeletlen állatokban. Ez a megnövekedett redukálóképesség a fekete retek bioaktív vegyületeiből származik (aszkorbinsav, tokoferolok, karotin, polifenolos vegyületek), melyek a préslé rendszeres fogyasztása során felszívódtak és megjelentek a szérumban és ott stabil, állandó szinten voltak. A fentiek alapján egy 200 g-os állat a FRP-ből naponta 0.6 µg karotint, 9.3 µg tokoferolt, 0.15 mg aszkorbinsavat és 0.76 mg polifenolos vegyületet fogyasztott el.
88
33. ábra
Fekete retek préslé hatása patkány szérumok E-vitamin szintjére
25 b
E-vitamin (/umol/l)
20
a
kontroll
a a
15 10
in vivo fekete retek
5 0 normál étrend a, b, c
34. ábra
zsírdús étrend
a különböző betűvel jelölt értékek eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten
Fekete retek préslé hatása patkány szérumok A-vitamin szintjére
3 b
A-vitamin (/umol/l)
kontroll 2
a a
a in vivo fekete retek
1
0 normál étrend a, b, c
zsírdús étrend
a különböző betűvel jelölt értékek eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten
89
13. táblázat
A szabad szulfhidril csoportok és a szérum redukálóképességének változása patkányokban fekete retek préslé hatására Minta n = 20
Szabad -SH csoport (mmol/l)
Redukálóképesség (µmol AS/l)
Normál étrend
0.24 ± 0.02a
0.083 ± 0.012a
Normál étrend + FRP
0.26 ± 0.02a
0.127 ± 0.048b
Zsírdús étrend
0.22 ± 0.04a
0.130 ± 0.025b
Zsírdús étrend + 0.22 ± 0.02a 0.175 ± 0.053c FRP a,b,c – egy oszlopon belül különböző betűvel jelölt értékek szignifikánsan eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten A zsírdús tápon tartott állatok szérumában is magasabb redukálóképességet tapasztaltunk, mint az egészséges kontrollban mért érték. Ennek oka lehet a napraforgóolajban található E-vitamin felszívódása és megjelenése a szérumban és növeli annak redukálóképességét. Mivel a lipidperoxidációs paraméterek az oxidatív stressz egyértelmű növekedését jelezték, feltételezzük, hogy ez a mennyiségű E-vitamin a szervezetben lejátszódó fokozott oxidatív reakciókat nem volt képes kivédeni. A FRP-t fogyasztó hyperlipidaemiás állatok szérumában szignifikánsan a legmagasabb redukálóképességet tudtuk kimutatni, az érték közel kétszerese volt a kontrollnak. Hyperlipidaemiában mind a napraforgóolaj, mind a fekete retek redukáló hatású vegyületei részt vettek az oxidatív folyamatok visszaszorításában. Az egyes vegyületek egymással szinerg kölcsönhatásba léptek, felerősítették egymás hatását és részt vettek a már felhasznált vegyületek regenerálásában. Ezért FRP-t fogyasztó hyperlipidaemiás patkányok szérumában a lipidperoxidációs folyamatok és termékek szignifikánsan alacsonyabb szintjét lehetett kimutatni, mint a készítményt nem fogyasztó állatokban.
Az állatok plazmájának nem specifikus gyökfogó tulajdonságait kemiluminometriás technika alkalmazásával tanulmányoztuk. A H2O2/⋅OH-luminol-mikroperoxidáz rendszerhez 100 µl plazmát adva a mérhető fényintenzitás csökken a standard fényhez viszonyítva, amennyiben a mintában túlnyomórészt antioxidáns és gyökfogó vegyületek vannak. Ha a minta nagy mennyiségben tartalmaz szabad gyök prekurzorokat, a mérhető fény nagyságrendekkel nagyobb lehet, mint a standard fény. A patkányplazma kemiluminometriás technikával meghatározott gyökfogó képessége a 35. ábrán látható. A rendszer által
90
35. ábra
A fekete retek préslé hatása patkány plazma össz-scavenger kapacitására
Kemilumineszcenciás fényintenzitás (standard fény %-ban)
1000
b
kontroll 100
c a
a
in vivo fekete retek
10
1 normál étrend
a, b, c
zsírdús étrend
a különböző betűvel jelölt értékek eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten
91
kibocsátott fényintenzitások értékeit a standard fény százalékában adtuk meg és a függőleges tengelyen logaritmikus léptékben ábrázoltuk. Normolipidaemiás állatokban plazmája szignifikánsan csökkentette a H2O2/⋅OH-luminol-mikroperoxidáz rendszer által kibocsátott fény intenzitását, vagyis a plazma hatékony szabad gyök scavenger kapacitással rendelkezett. A FRP-t fogyasztó normolipidaemiás állatok plazmájának szabad gyök befogó képessége azonos volt. A szérumban tapasztalt magasabb redukálóképesség nem jelent meg a plazma fokozott gyökbefogó kapacitásában. Hyperlipidaemiás állatok plazmája több mint 5 nagyságrenddel növelte a rendszer által kibocsátott kemilumineszcenciás fény intenzitását, jelezve, hogy a plazmában nagyszámú szabad gyök prekurzor, átmeneti és instabil állapotban lévő molekula található. Ugyanakkor ez a magas érték a plazmában antioxidáns védelemi rendszer kimerülésére is utal, mely nem képes a nagyszámú szabad gyököt eliminálni. A hyperlipidaemiás és FRP-t fogyasztó állatok a plazmájának scavenger kapacitása a kontroll állatokéval közel azonos volt, mivel a készítmény bioaktív vegyületei felszívódtak és erősítették az antioxidáns védelmet, megakadályozták a szabad gyökök felszaporodását. Az antioxidáns védelem lényeges összetevője az oxidatív károsodások kivédését elősegítő enzimek rendszere. A hem-vasat tartalmazó kataláz és a szeléntartalmú glutation-peroxidáz más-más mechanizmus szerint a hidrogénperoxid bomlását katalizálja. A glutation-peroxidáz ezenkívül részt vesz a szerves hidroperoxidok bontásában is. A szuperoxid dizmutáz a szuperoxid gyökök eliminálását végzi. 14. táblázat
Fekete retek aktivitására
préslé
fogyasztásának
hatása
eritrocita antioxidáns enzimek
Minta n = 20
Kataláz (BU/g prot)
Glutation-peroxidáz (U/mg prot)
Normál étrend
0.67 ± 0.07a
21.8 ± 4.1a
Normál étrend + FRP
0.71 ± 0.06a
22.1 ± 4.4a
Zsírdús étrend
0.68 ± 0.13a
14.0 ± 2.8b
Zsírdús étrend + 0.69 ± 0.10a 19.0 ± 2.8c,b FRP a,b,c – egy oszlopon belül különböző betűvel jelölt értékek szignifikánsan eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten A patkányok eritrocitában mért enzimaktivitásokat a 14. táblázatban mutatjuk be. A kataláz aktivitása valamennyi állatban azonos volt. A glutation-peroxidáz aktivitása a normolipidaemiás, valamint a FRP-vel kezelt normál étrenden tartott állatokban azonos volt. A hyperlipidaemiában felerősödő szabad gyökös
92
reakciók hatására aktivitása jelentősen, szignifikánsan csökkent Étrendkiegészítésként fogyasztott FRP megakadályozta a felerősödött szabad gyökös reakciókból származó károsodások kialakulását, ezért ebben a csoportban az eritrocita GSH-Px aktivitása szignifikánsan magasabb volt, mint a kezeletlen hyperlipidaemiás állatokban és megközelítette a normál étrenden tartott állatokban mért értéket.
5.2.3.
Lipidperoxidáció és antioxidáns védelem a májban
Alimentáris hyperlipidaemiában fény- és elektronmikroszkópos vizsgálatok igazolták a máj hisztológiai képének lényeges eltéréseit az egészséges állatok májához képest (22, 24). Az egészséges májsejtek citoplazmájában nagy számban raktározódnak különböző anyagok, például glikogén, vagy kis cseppekben zsír. A glikogén a citoplazmában a sima felszínű endoplazmatikus retikulum közelében halmozódik fel. A zsírcseppek a citoplazmában oszlanak el. Zsírdús étrenden tartott állatok májában fénymikroszkóposan zsíros degeneráció, hólyagszerű sejtes elváltozások, centrilobuláris nekrózis volt tapasztalható. A májsejtek megduzzadtak, a sejthatárok összemosódtak, némely sejt teljesen nekrotizált. A máj parenchimájában gyulladásos reakciókat nem tapasztaltunk. Az elektronmikroszkópos metszeteken a májsejtek nagy mennyiségű világos, membránnal körülvett vakuolumot –zsírcseppet- tartalmazott. A zsírcseppek nagysága változó volt, néha szabálytalan alakú, de majdnem mindet vékony membrán határolta.
A máj zsírsavösszetétel lényeges meghatározója a májban lejátszódó lipidperoxidációs folyamatoknak. A nagy mennyiségű telítetlen kettős kötés a fokozott oxidáció leglényegesebb kiindulási pontja. A patkányok májának, valamint a napraforgóolaj zsírsavösszetétele a 15. táblázatban látható. Az állatkísérletek során alkalmazott napraforgóolaj a kereskedelmi forgalomban kapható olajsavban gazdag fajta volt. Kontroll és normál étrend mellett FRP-t fogyasztó állatok májában a zsírsavösszetétel nem különbözött egymástól. A telítetlen és telített zsírsavak aránya (P/S) a normolipidaemiás állatok májában 1.53-1.63 volt, míg hyperlipidaemiában ez az arány 4.21-4.26-re változott.
Hyperlipidaemiás állatok májában szignifikánsan alacsonyabb volt a palmitin (C16) és sztearinsav (C18) aránya, csökkent továbbá az arachidonsav (C20:4(n-6)), az eikozapentaénsav (C20:5(n-3)), a dokozapentaénsav (C22:5(n-3)), valamint az élettani szempontból nagyon kedvező hatású dokozahexaénsav (C22:6(n-3)) aránya is. Ugyanakkor jelentősen emelkedett az olajsav (C18:1), a linolsav (C18:2(n-6)), a linolénsav (C18:3(n-3)), az oktadekatetraénsav (C18:4(n-6)) és a dokozatetraénav (C22:4(n-6)) aránya hyperlipidaemiában. A máj zsírsavösszetételének eltolódása a többszörösen telítetlen zsírsavak irányába nagyobb teret enged a lipidperoxidációnak, mivel jelentősen megnövekedett az oxidációs folyamatok szubsztrátjainak mennyisége. FRP fogyasztásának hatására a patkánymájak zsírsavösszetétele nem változott jelentősen.
93
15. táblázat
Fekete retek préslé fogyasztásának hatása patkánymájak (n = 20) zsírsavösszetételére
Normál étrend
Normál étrend + FRP
Zsírdús étrend
Zsírdús étrend + FRP
Napraforgóolaj
19.5 ± 1.3a
19.0 ± 0.4a
9.5 ± 2.2b
8.9 ± 1.5b
5.5
2.1 ± 0.7a
2.1 ± 0.7a
0.8 ± 0.2b
0.9 ± 0.1b
ny.
19.1 ± 1.9a
17.8 ± 0.3a
6.4 ± 0.4b
6.1 ± 0.8b
4.7
11.5 ± 1.0a
11.1 ± 1.4a
19.4 ± 2.3b
19.3 ± 1.5b
19.5
17.3 ± 0.5a
17.1 ± 0.4a
44.3 ± 0.2b
42.7 ± 3.3b
68.5
0.5 ± 0.2a
0.4 ± 0.1a
1.8 ± 0.5b
1.9 ± 0.3b
-
0.5 ± 0.3a
0.4 ± 0.1a
1.1 ± 0.3b
1.3 ± 0.2b
-
19.6 ± 1.6a
20.1 ± 1.3a
5.6 ± 1.6b
7.2 ± 1.2c
-
0.6 ± 0.3a
0.7 ± 0.4a
0.1 ± 0.01b
0.3 ± 0.1c
-
1.5 ± 0.1a
1.5 ± 0.1a
2.0 ± 0.5b
3.6 ± 0.6c
-
0.2 ± 0.0a
0.3 ± 0.1a
0.6 ± 0.2b
1.0 ± 0.1c
-
0.8 ± 0.2a
0.9 ± 0.1a
0.5 ± 0.4a,b
0.4 ± 0.1b
-
5.9 ± 1.2a 38.6a
6.7 ± 1.0a 36.8a
1.6 ± 0.2b 17.9b
1.4 ± 0.4b 18.6b
10.2
Monoén
15.1a
14.7a
22.2b
23.8b
ny.
Polién (P)
45.4a
46.6a
55.6b
56.2b
88.0
P/S
1.57a
1.66a
4.34b
4.30b
8.63
Zsírsavak C16 Palmitinsav C16:1 Palmitolajsav C18:1 Olajsav C18:2(n-6) Linolsav C18:4(n-6) Oktadekatriénsav C18:3(n-3) Linolénsav C20:4(n-6) Arachidonsav C20:5(n-3) Eikozapentaénsav C22:1 Erukasav C22:4(n-6) Dokozatetraénsav C22:5(n-3) Dokozapentaénsav C22:6(n-3) Dokozahexaénsav Telített (S)
a,b,c – egy soron belül különböző betűvel jelölt értékek szignifikánsan eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten Szignifikáns változást a kontroll irányába csak az arachidonsav esetében tapasztaltunk, míg az eikozapentaénsav (C20:5(n-3)), és az erukasav (C22:1) aránya tovább nőtt a kontrollhoz viszonyítva. A P/S arány sem javult jelentősen a FRP fogyasztásának hatására. Megállapítható, hogy a bioaktív vegyületeket tartalmazó FRP nem befolyásolta hyperlipidaemiás állatok májának zsírsavösszetételét, nem csökkentette a peroxidálható lipidek mennyiségét a májban, ezért kedvező hatása nem a zsírsavakon keresztül jut érvényre.
94
A magas koleszterintartalmú táp fogyasztásának hatására nemcsak a szérumban, hanem a májban is megemelkedik a koleszterin mennyisége, mely fokozza a májsejtek károsodását. Ugyanakkor a fokozott koleszterin-raktározás, valamint a felerősödő szabad gyökös reakciók miatt a koleszterin oxidációja is felerősödhet. A patkány májak zsír- és koleszterintartalma, valamint a koleszterin oxidált származékainak mennyisége a 16. táblázatban látható. A kontroll és normál tápon tartott és FRP-t fogyasztó állatok májának zsírtartalma azonos volt. A normál tápon tartott és FRP-t fogyasztó állatok májában a készítmény csökkentette a koleszterin koncentrációját. Valószínűleg ennek a folyamatnak az eredménye, hogy a FRPn tartott, normál étrendet fogyasztó állatok szérumában megnőtt az epesavak mennyisége (11. táblázat), mivel a koleszterin bonyolult szerkezetű kémiai vázának kiürülése elsődlegesen az epesavakká történő átalakuláson keresztül valósulhat meg. Normolipidaemiás állatok májában a koleszterin oxidációja során keletkezett termékek közül csak a 7α- és 7β-hidroxi-koleszterin volt detektálható, viszonylag alacsony koncentrációban. A FRP hatására még normál, egészséges állatok májában is kedvező hatást tapasztaltunk, a készítmény a koleszterin oxidációját képes volt visszaszorítani.
A magas zsír- és koleszterintartalmú étrend fogyasztása következtében a hyperlipidaemiás állatok májában mintegy tízszeresre nőtt a zsírtartalom, a koleszterin koncentráció pedig több mint tizenötszörösére emelkedett. A FRP hatására a máj zsír- és koleszterintartalma jelentősen csökkent, valamint jelentősen visszaszorult a koleszterin oxidációja is. 7-ketokoleszterin nem volt kimutatható egy csoportban sem.
A lipidperoxidáció jellemzésére szolgáló komponensek mennyiségét a májakban is meghatároztuk. A 36. ábrán a konjugált diének mennyiségét, a 37. ábrán pedig a malondialdehid változását mutatjuk be. Zsírdús étrend fogyasztásának hatására szignifikánsan nőtt a májakban a lipidperoxidáció során keletkező termékek, a konjugált diének és a tiobarbitursavval reagáló anyagok mennyisége is. A bizonyítottan prooxidáns étrenddel egyidejűleg fogyasztott FRP hatására jelentősen visszaszorult az oxidáció. Ezért mind a konjugált diének, mind a malondialdehid mennyisége szignifikánsan kisebb volt, mint a hyperlipidaemiás állatok májában.
95
16. táblázat
Fekete retek préslé hatása patkánymájak (n = 10) koleszterin és oxidált koleszterin tartalmára
Normál étrend
Normál étrend + FRP
Zsírdús étrend
Zsírdús étrend + FRP
2.9
3.1
22.0
14.4
Koleszterin (mg/100g)
788 ± 100a
393 ± 58b
12240 ± 1709c
8917 ± 299d
7-α-hidroxikoleszterin (µg/100g)
8.4 ± 3.3a
2.0 ± 1.5b
69.0 ± 20.8c
26.7 ± 16.2d
7-β-hidroxikoleszterin (µg/100g)
2.8 ± 0.4a
1.0 ± 0.1b
54.6 ± 14.5c
22.2 ± 14.0d
nd
Nd
nd
nd
Komponens Zsír (g/100g)
7-keto-koleszterin (µg/100g)
a,b,c – egy soron belül különböző betűvel jelölt értékek szignifikánsan eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten nd – nem detektálható, a kimutatási határ alatt
96
36. ábra
A fekete retek préslé hatása patkány májak konjugált dién szintjére
0,6
b Konjugált diének (A233)
kontroll 0,4
c
a
0,2
in vivo fekete retek
a
0 normál étrend a, b, c
37. ábra
zsírdús étrend
a különböző betűvel jelölt értékek eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten
A fekete retek préslé hatása patkány májak malondialdehid tartalmára
1
b
MDA (nmol/g feh.)
0,8
kontroll c
0,6
in vivo fekete retek
0,4
0,2
a
a
0
normál étrend
a, b, c
zsírdús étrend
a különböző betűvel jelölt értékek eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten
97
A 17. táblázatban a májak antioxidáns védelmi rendszerének néhány elemét mutatjuk be. A szabad szulfhidril csoportok mennyiségét és a májak redukálóképességét illetően az egyes csoportok között nem volt különbség. Ugyanakkor az antioxidáns enzimek, a kataláz és a glutation-peroxidáz aktivitása a zsírdús étrend hatására jelentősen csökkent. FRP fogyasztása visszaszorította a szabad gyökös reakciókat. Ezért a FRP-vel kezelt hyperlipidaemiás állatok májában a kataláz aktivitása azonos volt a kontroll csoportban mért értékkel. A glutation-peroxidáz aktivitása szignifikánsan emelkedett a kezeletlen hyperlipidaemiás állatokhoz viszonyítva és megközelítette a kontroll értéket. 17. táblázat
A fekete retek préslé hatása patkánymájak antioxidáns védelmi rendszerére
n = 20
Szabad –SH csoport (mmol/g prot)
Redukálóképesség (ASE/g prot)
Kataláz (BU/ g prot)
Glutationperoxidáz (U/g prot)
Normál étrend
0.62 ± 0.05a
19.9 ± 2.8a
0.35 ± 0.02a
118 ± 7a
Normál étrend + FRP
0.62 ± 0.05a
22.4 ± 8.4a
0.36 ± 0.03a
118 ± 4a
Zsírdús étrend
0.52 ± 0.14a
23.3 ± 3.1a
0.18 ± 0.03b
80 ± 15b
Minta
Zsírdús étrend + 0.60 ± 0.18a 22.4 ± 2.8a 0.37 ± 0.04a 105 ± 12c FRP a,b,c – egy oszlopon belül különböző betűvel jelölt értékek szignifikánsan eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten A 38. ábrán a patkánymáj homogenizátumok H2O2/⋅OH-luminol rendszerben mért össz-scavenger kapacitását mutatjuk be a standard fény százalékában kifejezve. A normál tápon tartott állatok májmintái szignifikánsan csökkentették a rendszerben mérhető kemiluminometriás fény intenzitását, ami a máj jelentős, nem specifikus szabad gyök scavenger tulajdonságát jelzi. A FRP fogyasztásának hatására a májhomogenizátum scavenger tulajdonságai nem változtak. Zsírdús étrenden tartott állatok májában a scavenger molekulák és a luminollal reagáló vegyületek aránya eltér a kontroll állatokra jellemző értéktől. Hyperlipidaemiás állatok mája nem volt képes befogni a vizsgálati rendszerben generált szabad gyököket, ezért a fényintenzitás azonos volt a minta nélkül mért standard értékkel. FRP-t fogyasztó hyperlipidaemiás állatok májára javuló scavenger tulajdonságok jellemzők, mivel a májminták a rendszerben jelenlévő szabad gyökök 60%-át képesek voltak eliminálni.
98
38. ábra
A fekete retek préslé hatása patkány máj homogenizátum össz-scavenger kapacitására
Kemilumineszcenciás fényintenzitás (standard fény %-ban)
160
c
kontroll
120
80
a a,b
b
40
in vivo fekete retek
0 normál étrend
a különböző betűvel jelölt értékek eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten
a, b, c
39. ábra
zsírdús étrend
A fekete retek préslé hatása patkány májak mikroszómájában NADPH-val indukált lipidperoxidációra
60
Normál étrend
MDA (nmol/mg prot.)
50
30
Normál étrend + FRP
20
Zsírdús étrend
40
10
Zsírdús étrend + FRP
0 0
10
20
30
Idő (perc)
99
A FRP-t fogyasztó és nem fogyasztó kontroll állatok májának mikroszómáiban a NADPH-val indukált oxidációs folyamatok mértéke közel azonos volt (39. ábra). A zsírdús étrenden tartott állatok májában a peroxidálható lipidek nagyobb aránya miatt magasabb indukált lipidperoxidációt várhatnánk, mint a kontroll állatokban. Ennek ellenére a mért értékek alacsonyabb indukált lipidperoxidációt jeleztek. Ennek oka valószínűleg az, hogy a zsírdús étrend miatt a mikroszóma membránok károsodtak és az in vitro indukció során már nem keletkezett több szabad gyök. A mikroszomális enzimrendszer fő enzime a NADPH citokróm c reduktáz membrán- és lipidfüggő, ezért a membránok károsodása miatt aktivitása jelentősen csökken. Ugyanakkor a FRP fogyasztása esetén a mikroszómában indukált lipidperoxidáció mértéke nem tért el a kezeletlen, hyperlipidaemiás állatok májában tapasztaltaktól. 5.2.4.
A fekete retek préslé hatása a máj mikroszomális kevert funkciójú oxidáló enzimrendszerének működésére
A toxikus vegyületek szervezetből történő eltávolítása egy többszintű enzimrendszer segítségével történik. Az egyes fázisú ún. aktiváló enzimek a citokróm P450 és egyéb monooxigenázok, melyek előkészítik a toxikus, karcinogén vegyületeket a további szerkezeti átalakításokra. A második fázisú ún. konjugáló enzimek, a glutation-S-transzferázok, a glutation peroxidáz, a kinon reduktázok, a toxikus vagy mutagén komponensek szervezetből történő gyors eltávolítását végzik azáltal, hogy vízoldhatóvá teszik a vegyületeket (90).
Az állatkísérletes vizsgálatok alapján megállapítottuk, hogy a FRP nincs káros hatással az egészséges szervezetre. A FRP fogyasztása nem befolyásolta a kontroll állatok testének, májának, és egyéb létfontosságú szerveinek tömegét, valamint a szervtömeg/testtömeg arányt is a kontroll értéken tartotta. Ugyanakkor a zsírdús étrenden tartott állatok májának tömege a hepatocitákban felhalmozódott zsír miatt jelentősen megnőtt, ezért a máj és az egész test tömegének aránya is eltolódott (18. táblázat). A FRP fogyasztásának hatására nem változott a hyperlipidaemiás állatok testtömege, a májtömeg enyhén, de nem szignifikánsan csökkent és a májtömeg/testtömeg arány sem változott számottevően. Az egyéb létfontosságú szervek (szív, lép, tüdő, vesék, csecsemőmirigy) tömege hyperlipidaemiában sem a kezeletlen, sem a FRP-vel kezelt állatokban nem tért el az egészséges kontroll értéktől.
100
18. táblázat Fekete retek préslé hatása patkánymájak mikroszomális enzimrendszerére, valamint a citoszol glutation-S-transzferáz aktivitására
Minta
Normál étrend
Normál étrend + FRP
Zsírdús étrend
Zsírdús étrend + FRP
májtömeg (g) májtömeg/testtömeg n = 80 NADPH citokróm P450 reduktáz (nmol red. citokrom c mg prot. min), n = 20 NADH citokróm b5 reduktáz (nmol ferrocianid mg prot.min), n = 20
10.8 ± 1.05a 0.038 ± 0.001a
11.8 ± 1.13a 0.043 ± 0.003a
15.1 ± 1.32b 0.055 ± 0.005b
14.6 ± 2.29b 0.057 ± 0.005b
72.5 ± 9.5a
69.3 ± 13.7a
46.2 ± 9.5b
57.8 ± 9.5c
2241.3 ± 141.5a
2312.1 ± 188.7a
1698.7 ± 283.1b
1958.2 ± 359.9b
citokróm P450 tartalom (nmol/mg prot.), n = 20
0.580 ± 0.060a
0.520 ± 0.020a
0.320 ± 0.040b
0.470 ± 0.030c
citokróm b5 tartalom (nmol/mg prot.), n = 20
0.365 ± 0.071a
0.368 ± 0.036a
0.218 ± 0.036b
0.238 ± 0.010b
citoszol glutation-Stranszferáz (U/mg prot.min), n = 10
10.8 ± 2.2a
9.9 ± 2.3a
13.8 ± 3.4b
10.3 ± 2.8a
a,b,c – egy soron belül különböző betűvel jelölt értékek szignifikánsan eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten
101
A 18. táblázatból kitűnik, hogy alimentáris hyperlipidaemiában csökken a NADPH citokróm c reduktáz (NADPH citokróm P450 reduktáz) aktivitása. A FRP fogyasztásának hatására az enzim aktivitása enyhén, de szignifikánsan emelkedett. A normál tápon tartott állatokban a FRP nem eredményezett változást az enzimaktivitás tekintetében. Ugyancsak nem volt eltérés a NADH citokróm b5 reduktáz (ferricianid reduktáz) aktivitásában a kontroll, és FRP-vel kezelt normál állatok között. A zsírdús étrend következtében jelentősen, mintegy 25%-kal csökkent az enzim aktivitása. A FRP kezelés hatására az enzim aktivitása emelkedett, jóllehet ez a változás nem volt statisztikailag szignifikáns. A FRP a kontroll étrenden tartott állatokban nem indukálta a citokrom P450 és citokróm b5 enzimeket. Alimentáris hyperlipidaemiában a patkánymáj mikroszóma citokróm P450 és citokrom b5 tartalma szignifikánsan, csaknem az eredeti mennyiség felére csökkent a kontroll értékekhez viszonyítva. A FRP hatására mindkét enzim mennyisége megnőtt az állatok májában, a citokróm P450 tartalom szignifikánsan magasabb volt, mint a kezeletlen zsírmájban. A 18. táblázatban látható eredmények alapján kitűnik, hogy a patkánymáj citoszol glutation-S-transzferáz aktivitása nem változott, amikor a normál étrend mellett FRP-t is fogyasztottak állatok. Ugyanakkor alimentáris hyperlipidaemiában megnőtt az enzim aktivitása, ami arra utal, hogy a szervezetben nagyobb mennyiségben voltak jelen olyan toxikus vegyületek, melyek kiürülése a glutationnal történő konjugátum képződésén keresztül valósult meg. A FRP hatására az enzim aktivitása a normál szintre csökkent. Az állatkísérletes vizsgálatok eredményei igazolták, hogy alimentáris úton előidézett hyperlipidaemiában jelentősen felerősödtek a szabad gyökös reakciók, amit a patkányok szérumában és májában bekövetkezett biokémiai elváltozások jeleztek. A zsírmájat eredményező étrend mellett fogyasztott antioxidáns anyag, a bioaktív vegyületeket nagy mennyiségben tartalmazó FRP az elváltozások számottevő részének kialakulását meg tudta akadályozni.
102
5.3.
A RAPHACOL EPEGRANULÁTUM HATÁSÁNAK TANULMÁNYOZÁSA HUMÁN
VIZSGÁLATBAN Vizsgálataink célja volt, hogy megállapítsuk, az epekőképződés gátlására, valamint az emésztés javítására ajánlott Raphacol epegranulátum hogyan befolyásolja a lipiperoxidációs folyamatokat. Európai és északamerikai boncolási adatok szerint az epekő és a diabetes előfordulása igen gyakori, Európában megközelítőleg 20% (30, 31). Az epekőképződés folyamatában a patológiás szabad gyök reakciók kimutathatók, ugyanakkor az alapbetegség más szövődményeinek és komplikációinak kialakulásában is szerepet kap az oxidatív stressz. Ezért a készítmény kúraszerű fogyasztásának hatását a lipidperoxidációs folyamatok alakulására diabetes mellitusban szenvedő betegekben tanulmányoztuk. Inzulin dependens (I. típusú) és nem-inzulin dependens (II. típusú) diabetes mellitusban szenvedő, de metabolikusan jól kontrollált betegek étrendi kiegészítésként 6 hónapon keresztül naponta 3 alkalommal 0.2 g, fekete retek préslét és édesköményolajat tartalmazó Raphacol epegranulátumot fogyasztottak . A betegektől a kúra megkezdése előtt, majd 3 és 6 hónappal utána éhomi vérmintát vettünk és meghatároztuk a szokásos laboratóriumi paraméterek mellett a lipidperoxidációra jellemző néhány komponens értékét és antioxidáns enzimek aktivitását. A helytelenül vagy szuboptimálisan kontrollált diabetes a glükóz nem-fiziológiásan magas szintjével jellemezhető. A jó metabolikus kontroll, amely a fiziológiás vércukor értékkel, vagy a közel fiziológiás hemoglobin A1c-vel jellemezhető, elősegíti a diabeteses komplikációk elkerülését. Számos diabetesben szenvedő betegnél lép fel mikro- vagy makrovaszkuláris komplikáció: retinopathia, a kapillárisok bazális membránjainak megvastagodása, nephropathia, neuropathia, akcelerált atherosclerosis, a fertőzések megnövekedett valószínűsége. Egyes szerzők elgondolásai szerint a celluláris és vaszkuláris sérülések kialakulásának oka a hosszan tartó hiperglikémia (118). Tehát, ha a hiperglikémiát sikerül megelőzni, vagy kontrollálni, a diabeteses szövődmények kialakulásának valószínűsége kisebb lesz. Mivel számos tanulmány szerint a hiperglikémia oxidatív sejtkárosodást okozhat diabeteses betegekben és az oxidatív károsodások antioxidánsok fogyasztásával mérsékelhetők, feltételeztük, hogy az in vitro vizsgálatokban és az állatkísérletekben antioxidáns hatást mutató fekete retek humán vizsgálatok során is kedvező hatásúnak bizonyul. 5.3.1.
Szérum paraméterek
A rutin laboratóriumi jellemzők közül a fehérvérsejt, a hemoglobin, a hematokrit, a süllyedés, a nátrium, a kálium és a magnézium értékek valamennyi időpontban a normálérték alsó és felső határa között voltak, és a különböző vérvételi időpontokban mért átlagok között nem volt szignifikáns különbség.
103
19.táblázat A lipáz és az amiláz aktivitása, valamint a totál bilirubin koncentrációja cukorbetegek szérumában a Raphacol epegranulátum fogyasztása előtt és után
Normálérték
Lipáz
Amiláz
Bilirubin (totál)
23-300 U/l
270-2700 U/l
1.7-20.5 µmol/l
Mérési időpont
I. típus n=4
II. típus n = 13
I. típus n=7
II. típus n = 13
I. típus n=7
II. típus n = 13
Kúra előtt
27.2 ± 18.3
22.7 ± 10.7
1264 ± 403a
1263 ± 355a
14.6 ± 3.3a
15.2 ± 4.6a
3 hónap után
-
-
1075 ± 170a
1064 ± 547a
6.4 ± 3.3b
9.4 ± 4.4b
6 hónap után
90.5 ± 47.2
130.5 ± 102.3
1451 ± 512b
1480 ± 580b
12.7 ± 3.8a
15.4 ± 6.4a
a,b,c
Az egy oszlopon belül különböző betűvel jelölt értékek szignifikánsan eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten.
104
20. táblázat
Az albumin, a kreatinin és a karbamid koncentrációja cukorbetegek szérumában a Raphacol epegranulátum fogyasztása előtt és után
Albumin
Kreatinin
Karbamid
30-50 g/l
53-106 µmol/l
2.5-7.5 mmol/l
Normálérték Mérési időpont
I. típus n=7
II. típus n = 13
I. típus n=7
II. típus n = 13
I. típus n=7
II. típus n = 13
Kúra előtt
37.3 ± 2.9a
39.6 ± 3.5a
82 ± 9.8a
95.1 ± 12.0a
5.3 ± 1.8a
7.2 ± 1.8a
3 hónap után
40.7 ± 1.8b
41.1 ± 4.7a
75 ±5.7b
86.2 ± 15.8b
5.1 ±2.2a
5.6 ± 1.4b
6 hónap után
44.3 ± 3.0c
44.1 ± 2.2b
47 ± 8.6c
68.5 ±24.5c
6.4 ± 2.2b
7.8 ± 1.8c
a,b,c
Az egy oszlopon belül különböző betűvel jelölt értékek szignifikánsan eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten.
105
Az étrendkiegészítésként fogyasztott Raphacol készítmény nem befolyásolta a hematológiai paraméterek alakulását, és az ion-háztartásban sem eredményezett kedvezőtlen irányú eltolódást I és II típusú cukorbetegekben. A szérumban mérhető májenzimek, az alkalikus foszfatáz, a γ-GT, a GOT és a GPT értékei minden vérvételi időpontban a normáltartományban voltak. A májenzimek értékei alapján a vizsgálatba bevont betegeknél nem volt kimutatható májkárosodás sem a kúra megkezdése előtt, sem a készítmény fogyasztása alatt. A 19. és 20. táblázatban azok a laboratóriumi paraméterek láthatók, melyek a készítmény fogyasztása alatt szignifikánsan változtak, de az értékek minden esetben a normáltartományon belül maradtak. Az értékek normáltartományon belüli változásából, még ha azok statisztikailag szignifikánsak is, terápiás következtetések nem vonhatók le. Ennek ellenére néhány komponens tekintetében szükséges az értékek bemutatása, mivel információként szolgálhatnak a Raphacol készítmény hatásmechanizmusával kapcsolatosan. A pankreász enzimek közül (19. táblázat) a zsírok emésztéséhez szükséges lipáz aktivitása a készítmény fogyasztása előtt alig haladta meg a normálérték alsó határát. A Raphacol fogyasztása során az enzim aktivitása szignifikánsan emelkedett, de a normáltartományon belül maradt. A karbamid és az albumin értékek a hatodik hónapban szignifikánsan magasabb értékeket mutattak, mint a kúra kezdetekor (20. táblázat). Ezzel szemben a kreatinin a hatodik hónap után volt a legalacsonyabb, II. típusú betegek esetében az átlag, valamint hat betegből ötnél az egyéni érték is a normálérték alatt volt. (Megjegyzendő, hogy a jelzett betegeknél a következő rutin ellenőrzés során normálértékeket mértek). I. és II. típusú diabetes mellitusban szenvedő betegek átlagos szérum koleszterin és triglicerid értékei az egészséges normálérték felső határa fölött voltak a készítmény fogyasztása előtt (21. táblázat). A II. típusú betegek értékei magasabbak voltak, mint az I. típusú pácienseké. Az eltérések igazolják, hogy a diabetesben szenvedő betegek lipidanyagcseréje kisebb-nagyobb mértékben eltér a normálistól és ezért a diabetesben
leggyakrabban
előforduló
társult
komplikáció,
az
atherosclerosis
kialakulásának
valószínűsége meglehetősen nagy. A vizsgált I. típusú betegek esetében a koleszterinszint 3 hónap után szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a készítmény fogyasztása előtt. Hat hónap után enyhe emelkedést mutatott, de a nem lépte át a normáltartomány felső határát. A II. típusú betegekben három és hat hónap után is alacsonyabb koleszterin koncentrációkat tapasztaltunk, mint kúra megkezdése előtt, de egyik vérvételi időpontban kerültek az értékek a normáltartomány felső határa alá.
106
21. táblázat
A koleszterin és triglicerid koncentrációja cukorbetegek szérumában a Raphacol epegranulátum fogyasztása előtt és után
Normálérték Mérési időpont
Koleszterin
Triglicerid
3.9 - 5.2 mmol/l I. típus II. típus
0.5 - 1.9 mmol/l I. típus II. típus
n=7
n = 13
n=7
n = 13
Kúra előtt
5.62 ± 0.82a
6.82 ± 1.05a
2.02 ± 1.03a
3.6 ± 4.01a
3 hónap után
4.72 ± 1.26b
6.11 ± 1.49b,c
1.52 ± 0.70b
2.74 ± 1.92a
6 hónap után 5.07 ± 0.94a 6.24 ± 0.69c 1.30 ± 0.51b 2.02 ± 1.28b a,b,c - egy oszlopon belül különböző betűvel jelölt értékek szignifikánsan eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten. A triglicerid értékek a koleszterinszintekhez hasonlóan változtak. Az I. típusú betegek szérumában három és hat hónap után is szignifikáns csökkenést tapasztaltunk az előző vérvételi időpontban mért értékekhez viszonyítva (21. táblázat). Az átlagérték már három hónap után a normáltartományban volt. A II. típusú betegeinknél a kiindulási magas triglicerid szint három hónap után alacsonyabb volt, mint a kúra előtt, jóllehet a változás nem volt szignifikáns. A hat hónap után bekövetkező további csökkenés már szignifikáns volt a kiindulási értékhez viszonyítva. A kedvező irányú változások ellenére az átlagérték még mindig meghaladták a normáltartomány felső határát. A 22. táblázatban a betegek alapbetegségével összefüggésben lévő legjelentősebb szérum paraméterek, a glükóz, a hemoglobin A1c és a glikohemoglobin értékek láthatók. Az készítmény fogyasztása előtt mindkét cukorbeteg csoportban a normálértéknél magasabb átlagos szérum glükóz szinteket tapasztaltunk. A kúra harmadik hónap után nem tapasztaltunk változást, míg az értékek szignifikánsan csökkentek hat hónap után. Vizsgálatainkban mindkét csoport betegeire a normálértéknél magasabb hemoglobin A1c és glikohemoglobin arány volt jellemző a készítmény fogyasztása előtti vérvétel során. Három hónap után nem tapasztaltunk kedvező irányú változásokat a két paraméter tekintetében. Hat hónap után azonban mindkét érték szignifikánsan csökkent mindkét betegcsoportban és ezzel sikerült megközelíteni a normálértékek felső határát.
107
22. táblázat
Normálérték Mérési időpont
A glükóz, a hemoglobin A1c és a glikohemoglobin értékei cukorbetegek szérumában a Raphacol epegranulátum fogyasztása előtt és után
Glükóz
Hemoglobin A1c
Glikohemoglobin
3.6 - 6.2 mmol/l
4.4 - 6.4 %
4.8 - 7.8 %
I. típus n=7
II. típus n = 13
I. típus n=7
II. típus n = 13
I. típus n=7
II. típus n = 13
Kúra előtt
13.3 ± 4.3a
12.3 ± 4.8a
8.07 ± 2.80a
7.45 ± 1.50a
10.27 ± 4.17a
9.35 ± 2.23a
3 hónap után
12.5 ± 2.4a
13.1 ± 4.7a
8.24 ± 2.34b
7.91 ± 1.94b
11.01 ± 4.65a
9.91 ± 2.63a
6 hónap után
9.5 ± 4.2b
10.7 ± 3.3b
7.18 ± 2.76c
6.56 ± 1.22c
8.94 ± 4.12b
8.02 ± 1.82b
a,b,c
Az egy oszlopon belül különböző betűvel jelölt értékek szignifikánsan eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten.
108
5.3.2.
Lipidperoxidációs mutatók
A tiobarbitursav reaktív anyagok (malondialdehidben kifejezve) a lipid peroxidáció mértékét jelző egyik leggyakrabban meghatározott szérum komponens. Több munkacsoport megállapította, hogy hyper- és normolipidaemiás cukorbetegek plazma malondialdehid (MDA) és konjugált dién szintje szignifikánsan magasabb, mint az egészsége egyéneké (252). Mivel a szérum/plazma megnövekedett lipidperoxid szintje a vaszkuláris komplikációk és az atherosclerosis kialakulásban döntő szerepet játszhatnak, több kutatócsoport hívta fel a figyelmet az antioxidánsokkal megvalósítható prevenció lehetőségére (105, 126, 271). A Raphacol készítmény fogyasztása előtt a II. típusú betegek szérumában szignifikánsan magasabb MDA értéket tapasztaltunk, mint a kontroll egyénekben (23. táblázat). Az I. típusú betegek átlaga az egészséges kontroll csoportéval közel azonos volt. A készítmény fogyasztásának harmadik hónapjában mindkét cukorbeteg csoportban szignifikánsan magasabb MDA értéket mértünk, mint a készítmény fogyasztása előtt. A MDA értékek eloszlása a statisztikai elemzés szerint nem tekinthető normál eloszlásnak. A 40. és a 41. ábrán a különböző egyének MDA értékeinek változása látható. Az I. típusú csoportban kettő, a II. típusúban öt beteg reagált a készítményre pozitívan az első három hónapban, azaz a szérum MDA érték nem változott, vagy csökkent. Hat hónap után a MDA értékek normalizálódása volt tapasztalható mindkét csoportban, elérték a kontroll (egészséges) értéket, ami a II. típusú betegek esetében szignifikáns javulást is jelentett a kiindulási állapothoz képest. 23.táblázat
Tiobarbitursav reaktív komponensek mennyisége cukorbetegek szérumában a Raphacol epegranulátum fogyasztása előtt és után TBARS (µmol MDA/l) I. típus n=7
II. típus n = 13
Kontroll n = 26
39.6 ± 23.9a
99.8 ± 72.5a,*
20.3 ± 8.4
3 hónap után
88.0 ± 46.1b,*
126.0 ± 42.6a,*
6 hónap után
20.4 ± 6.3c
31.0 ± 15.0b
Mérési időpont Kúra előtt
a ,b, c Az egy oszlopon belül különböző betűvel jelölt értékek szignifikánsan eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten. A *-gal jelölt értékek szignifikánsan eltérnek a kontrolltól p < 0.05 valószínűségi szinten.
109
40. ábra
A Raphacol epegranulátum fogyasztásának hatása I. típusú cukorbetegek szérum MDA szintjére
160 TBARS (/umol MDA/l)
1. 2.
120
3. 4.
80
5. 6.
40
7. 0 0
3
6
Vérvételi időpont (hónap)
41. ábra
A Raphacol epegranulátum fogyasztásának hatása II. típusú cukorbetegek szérum MDA szintjére
TBARS (/umol MDA/l)
300
200
100
0
0
3
6
Vérvételi időpont (hónap)
110
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.
A tiol vegyületek, köztük a redukált glutation, fontos tagjai a nem-enzimes védelmi rendszernek. A 24. táblázatban a Raphacol készítményt fogyasztó betegek szérumában mért szulfhidril koncentráció láthatók. A kúra megkezdése előtt mindkét betegcsoportban alacsony értékek tapasztalhatók. A II. típusú betegek esetében ez az érték szignifikánsan alacsonyabb, mint az egészséges kontrolloké. A készítmény fogyasztásának hatására a harmadik hónapban nem változott, de a hatodik hónapban mindkét csoportban szignifikánsan emelkedett a tiol vegyületek mennyisége. Hat hónap után I típusú diabetesben jelentősen nőtt az szulfhidril csoportok mennyisége. A változás a kiindulási értékhez és a kontroll csoporthoz viszonyítva is szignifikáns volt. II típusú diabetesben is a kiindulási értékhez viszonyított szignifikáns növekedést tapasztaltunk. A húgysav a szérum antioxidáns védelmi rendszerének fontos eleme, ezért mennyiségének változásairól nem a rutin laboratóriumi paraméterek, hanem a lipidperoxidációs mutatók között számolunk be. Irodalmi adatok szerint cukorbetegek szérumában csökkent húgysav szintek tapasztalhatók, valamint a húgysavszint és a szérum antioxidáns kapacitása között szignifikáns korrelációt mutatható ki (221). 24. táblázat
Az összes szulfhidril csoport mennyisége cukorbetegek szérumában a Raphacol epegranulátum fogyasztása előtt és után Összes szulfhidril csoport (mmol/l) I. típus
II. típus
Kontroll
n=7
n = 13
n = 26
Kúra előtt
0.43 ± 0.04a
0.39 ± 0.04a,*
0.46 ± 0.07
3 hónap után
0.42 ± 0.04a
0.40 ± 0.03a,*
6 hónap után
0.55 ± 0.04b,*
0.49 ± 0.05b
Mérési időpont
a, b, c Az egy oszlopon belül különböző betűvel jelölt értékek szignifikánsan eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten. A *-gal jelölt értékek szignifikánsan eltérnek a kontrolltól p < 0.05 valószínűségi szinten. A Raphacol készítményt fogyasztó cukorbetegek szérum húgysav értékeit a 25. táblázat mutatja be. Az I. típusú nőbetegek átlagos húgysav szintje a normálérték alsó határán, két beteg esetében a normálérték alatt volt a Raphacol készítmény fogyasztása előtt. Három hónap után nem volt szignifikáns változás. Hat hónap után szignifikánsan emelkedést tapasztaltunk a szérum húgysav koncentrációban, ami az egészséges határértéken belül maradt, és mindössze 1 beteg értéke volt alacsonyabb, mint a normálérték. A II. típusú cukorbetegek férfiak és nők esetében egyaránt normál átlagértékeket tapasztaltunk minden vérvételi időpontban.
111
25. táblázat
Húgysav értékek cukorbetegek szérumában a Raphacol epegranulátum fogyasztása előtt és után Húgysav (µmol/l) I. típus férfi
nő
férfi
nő
n =1
n=6
n=9
n=4
Kúra előtt
192
143.2 ± 37.3a
304.3 ± 72.8a
213.4 ± 50.5a
3 hónap után
139
110.6 ± 22.3a
240.9 ± 45.5b
172.2 ± 37.9b
6 hónap után
246
167.6 ± 46.5b
317.0 ± 65.8a
199.6 ± 47.7a
Normálérték
210-415
140-340
210-415
140-340
Mérési időpont
a, b, c
II. típus
Az egy oszlopon belül különböző betűvel jelölt értékek szignifikánsan eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten.
A 26. táblázatban láthatók a Raphacol epegranulátumot fogyasztó betegek plazmájában mért összes gyökfogó kapacitás értékei. Az adatokat a standard fény százalékában adtuk meg a könnyebb áttekinthetőség érdekében. A száznál alacsonyabb értékek valódi gyökfogó képességet jeleznek, minél kisebb az érték, a plazma gyökbefogó képessége annál erőteljesebb. A száznál magasabb értékek a plazmában nagy mennyiségben jelenlévő szabad gyökökre és prekurzorokra utalnak. A mért értékek az egyének között nagy szórást mutattak. Mindkét betegcsoportban az egészséges egyének plazmájához viszonyítva magasabb értékeket mértünk, I. típusú betegek esetében a különbség igen jelentős volt. A készítmény fogyasztásának harmadik hónapja után meglepően magas fényintenzitás értékeket kaptunk, melyek a plazmában nagyszámú gyök jelenlétére utalnak. Hat hónapos kúra után a plazma gyökfogó képessége a kiindulási értékekkel azonos szintet ért el mindkét betegcsoportban. Ismeretes, hogy diabetes mellitusban valamennyi fehérje (enzimek, transzport és strukturális fehérjék) célpontjai a megnövekedett glükóz koncentráció miatt lejátszódó glikációnak. Az egyik lehetséges mechanizmus, amely során a hiperglikémia oxidatív stresszt eredményez, az antioxidáns enzimek aktivitásának csökkentése.
112
26. táblázat
A plazma totál scavenger kapacitása cukorbetegekben a Raphacol epegranulátum fogyasztása előtt és után Totál scavenger kapacitás (standard fény %-ban) I. típus
II. típus
Kontroll
n=7
n = 13
n =26
67.4 ± 32.8a,*
45.0 ± 27.3a
2.13 ± 1.23
3 hónap után
326 ± 87b,*
225 ± 68b,*
6 hónap után
39.0 ± 18.3a
25.0 ± 8.5a
Mérési időpont Kúra előtt
a, b, c Az egy oszlopon belül különböző betűvel jelölt értékek szignifikánsan eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten. A *-gal jelölt értékek szignifikánsan eltérnek a kontrolltól p < 0.05 valószínűségi szinten.
27. táblázat
A kataláz aktivitása cukorbetegek eritrocitáiban a Raphacol epegranulátum fogyasztása előtt és után Kataláz (BU/g Hb) I. típus
II. típus
Kontroll
n=7
n = 13
n = 26
6.4 ± 1.2a,*
6.2 ± 1.3a,*
7.0 ± 0.7
3 hónap után
6.7 ± 0.5a
7.1 ± 0.5b
6 hónap után
7.0 ± 0.7b
7.4 ± 0.7c
Mérési időpont Kúra előtt
a, b, c Az egy oszlopon belül különböző betűvel jelölt értékek szignifikánsan eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten. A *-gal jelölt értékek szignifikánsan eltérnek a kontrolltól p < 0.05 valószínűségi szinten. A 27. táblázatban a Raphacol készítményt fogyasztó cukorbetegek eritrocita kataláz aktivitása látható. Mindkét betegcsoportban alacsonyabb volt az enzim aktivitása, mint az egészséges kontroll egyének értékei. A készítmény fogyasztásának hatására nőtt az enzim aktivitása I. és II. típusú betegekben is, a hatodik hónapra a javulás szignifikáns volt és nem tért el az egészségesekben mért értékektől. A 28. táblázatban a glutation-peroxidáz aktivitás értékeit mutatjuk be. Mindkét cukorbeteg csoportban jelentősen alacsonyabb enzimaktivitások mutatkoztak a készítmény fogyasztása előtt, mint az egészséges
113
egyénekben. Három hónap után az enzimaktivitások jelentősen és szignifikánsan nőttek, megközelítve a kontroll értéket. 28. táblázat
A
glutation-peroxidáz
aktivitása
cukorbetegek
eritrocitáiban
a
Raphacol
epegranulátum fogyasztása előtt és után Glutation peroxidáz (U/g Hb) I. típus
II. típus
Kontroll
n=7
n = 13
n = 26
12.6 ± 2.6a.*
11.7 ± 1.8a,*
16.1 ± 1.2
3 hónap után
16.0 ± 2.6b
15.4 ± 2.4b,*
6 hónap után
16.1 ± 0.9b
14.9 ± 1.4b,*
Mérési időpont Kúra előtt
a, b, c Az egy oszlopon belül különböző betűvel jelölt értékek szignifikánsan eltérnek egymástól p < 0.05 valószínűségi szinten. A *-gal jelölt értékek szignifikánsan eltérnek a kontrolltól p < 0.05 valószínűségi szinten. A Raphacol epegranulátum fő összetevője a fekete retek préslé in vitro körülmények között bizonyítottan antioxidáns tulajdonságokkal rendelkezik. A készítmény rendszeres, több hónapig tartó fogyasztása során a bioaktív hatóanyagok optimális és állandó szérum szintje alakulhat ki a szervezetben. Ezért például a fehérjék oxidatív károsodása jelentősen visszaszorulhat, mely megnyilvánulhat az enzimaktivitások növekedésében. Az elvégzett biokémiai vizsgálatok alapján feltételezzük, hogy a készítményben jelenlévő antioxidáns (tokoferol, karotin, aszkorbinsav, polifenolok) és prooxidáns (átmeneti fémionok) komponenseinek vagy könnyen oxidálható vegyületeinek rendszeres fogyasztása a legtöbb beteg szervezetében megzavarta a korábban kialakult fiziológiás prooxidáns/antioxidáns egyensúlyt, és a megváltozott feltételeknek megfelelő új, stabil egyensúly kialakulása hosszabb időt vett igénybe. Ezért néhány vizsgált komponens (pl. szérum malondialdehid koncentráció, plazma össz-scavenger kapacitás) tekintetében három hónap után változatlan értékeket, vagy kedvezőtlen irányú változásokat tapasztaltunk. Ez alatt az idő alatt látszólag felszaporodtak a lipidperoxidáció termékei, ami a szabad gyökös reakciók fokozódását jelzi. Nem szabad azonban figyelmen kívül hagyni, hogy az egyéb komponensek koncentrációja és a védelmi mechanizmus aktivitása hogyan alakult ez alatt az idő alatt. A lipidperoxidáció folyamatáról és az antioxidáns védelem állapotáról a készítmény fogyasztása alatt csak az összes paraméter ismeretében lehet véleményt mondani. A harmadik hónap után mért kedvezőtlen irányú változásokat a szervezet emelkedett antioxidáns enzimaktivitással védte ki. Hat hónap után a készítmény rendszeres fogyasztásának köszönhetően a bioaktív vegyületek állandó szérumszintje alakult ki. Ennek következtében egy új, a
114
megváltozott körülményekhez alkalmazkodott prooxidáns/antioxidáns egyensúly jött létre. Ugyanakkor számos, a diabetes szövődményeinek kialakulásával kapcsolatos paraméter kedvező irányú elmozdulását is tapasztaltuk.
115
6.
ÖSSZEFOGLALÁS, AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE
Az analitikai vizsgálatok során bizonyítni kívántuk, hogy a fekete retek gumójából préseléssel nyert lé, az ország különböző bortermelő vidékeiről származó fehér és vörösborok, valamint kékszőlőlevek kimutatható mennyiségben tartalmaznak olyan bioaktív vegyületeket, melyek felelőssé tehetők az antioxidáns hatásért. In vitro körülmények között igazolni akartuk az említett anyagok antioxidáns és gyökfogó tulajdonságait. In vivo állatkísérletes vizsgálatokban tanulmányoztuk a fekete retek préslé antioxidáns, membránstabilizáló és lipidanyagcserét befolyásoló karakterét. Az orvosi etika szabályainak betartásával humán vizsgálatokban arra kerestünk választ, hogy az antioxidáns hatású fekete retek préslét tartalmazó, gyógyszernek nem minősülő gyógyhatású készítmény, a Raphacol epegranulátum rendelkezik-e olyan tulajdonságokkal melyek befolyásolni képesek a fokozott oxidatív stresszel összefüggésben kialakuló szövődmények, elsősorban az epekőbetegség, prevencióját diabetes mellitusban. 6.1.
IN VITRO VIZSGÁLATOK
6.1.1.
A fekete retek préslé
Az in vitro vizsgálatok alapján megállapítható volt, hogy a fekete retek préslében számos olyan vegyület van jelen, mely pozitív szerepet játszhat a szabad gyökös reakciókkal kapcsolatos elváltozások visszaszorításában. Jelentős mennyiségben volt kimutatható a készítményben aszkorbinsav, tokoferol, karotin, polifenolos vegyületek, ezen belül néhány flavonoid. A készítmény gazdag tárháza a különböző elemeknek, melyek közül a kálium, a kén és króm emelendő ki. Bizonyos irodalmi adatok szerint a fekete retek diuretikus hatással is rendelkezik. A kálium vegyületeinek (-acetát, -bitartarát, -citrát, -glutamát) ozmotikus hatása régóta ismert (279). Szentmihályi és munkatársainak vizsgálatai szerint a gyógyszerkönyvi hivatalos diuretikus hatású drogok (pl. Myrtilli herba, Urticae folium, Ribis nigri folium, Equiseti herba) kivonataiban a Na-K arány 150 feletti érték, a népgyógyászatban használt diuretikus drogok kivonataiban pedig 100-150 (280). Az említett vizsgálatban a kalcium-magnézium arány mindkét csoportban 1-5 között volt. Mivel az általunk vizsgált FRP-ben a nátrium-kálium arány alacsony, diuretikus hatása nem magyarázható a benne található ionokkal. Azonban egyéb vegyületek is rendelkezhetnek diuretikus hatással, például a flavonoidok, ezért a FRP vízhajtó hatása nem vethető el teljesen. Néhány fémion, mint például a magnézium, a mangán, a cink és a króm jelentősége diabetesben, illetve annak kezelésében régóta ismert (200, 229). Egyes gyógynövények, mint például a zsurlófű, a fekete áfonya levél, a babhéj, a csalán a diabetes kiegészítő terápiájában fontos szerepet játszhatnak a belőlük készített teák és tinktúrák magas fémion koncentrációja miatt (281). Diabetesben a fémionok koncentrációja megváltozhat, de azok a tényezők, melyek a fémionok homeosztázisát befolyásolhatják, kevéssé ismertek (243). A magnézium szerepet játszik a szénhidrát- és lipidanyagcserében és az inzulin
116
szekrécióban, több mint 300 enzim aktivátora és ezért az energiatermelő folyamatokban is létfontosságú (154). A magnézium hiánya általános jelenség diabetesben, mely az elégtelen Mg-bevitel és a vizelettel történő fokozott ürítés következménye (91). A hipomagnezémia a II. típusú diabetessel gyakran társuló jelenség, mely eredménye és oka is lehet az inzulin rezisztenciának (66). Cinktartalmú enzimek részt vesznek számos anyagcsere folyamatban, a szénhidrát-, zsír- és fehérjemetabolizmusban, valamint a nukleinsav szintézisben. Diabetesben szenvedő betegek plazmájában alacsonyabb cinkion koncentrációt tapasztaltak, mint egészségesekben, és étrendi cink kiegészítés kedvező hatással volt a szérum glükóz szintre és az inzulin szekréciójára (103). A krómnak fontos szerepe van a szénhidrát anyagcserében, mivel az inzulin kofaktora, és ezért hiánya inzulinrezisztenciához vezet. Feltételezhető továbbá, hogy hiánya a koszorúér-betegség, valamint a fiatalkori cukorbetegség kialakulásának egyik tényezője. A mangán a számos enzim aktivátora, részt vesz a szénhidrát- és lipidanyagcserében, szerepe van az inzulin képződésében, a DNS, az RNS és a fehérjék szintézisében. In vitro vizsgálatokban igazolták, hogy a magas glükóz koncentráció megváltoztatja az intercelluláris ionok eloszlását. Az egészségestől eltérő fémion-anyagcsere az oxidatív stressz fokozódását is előidézi, így a szabad gyökös reakciókkal kapcsolatos komplikációk kialakulásának valószínűsége diabetesben tovább nőhet. A diabetes terápiájában kiegészítő kezelésként alkalmazható, zsurlófűből, fehér babhéjból, áfonya és csalánlevélből nyert teák magnéziumtartalma 20-40-szer magasabb, mint a fekete retek préslében mért érték (281). Ugyanakkor az említett teák cinktartalma 0-500 µg/100 ml, a krómtartalma 0-9 µg/100 ml között változott. Ez utóbbi két elem vonatkozásában a fekete retek préslé nem marad el a diabetes kiegészítő kezelésére alkalmazható gyógyteákra jellemző fémelem koncentrációktól. A retekfélékre jellemző vegyületcsoport, a glükozinolátok egyetlen képviselője sem volt kimutatható a préslében, melynek feltételezhető oka a feldolgozás során aktiválódott mirozináz enzim katalitikus glükozinolát-bontó hatása. A mirozináz (α-tioglükozid glükohidroláz, EC 3.2.3.1.) enzim, mely a glükozinolátok hidrolízisét katalizálja, a glükozinolátokat tartalmazó sejtkompartmentektől különválasztva található (292). A növényi sejtfal integritásának megbomlása során azonban aktiválódik és elkezdi a glükozinolátok bontását (80). Ezért nagy a valószínűsége, hogy a préslé előállítása során az összes glükozinolát hidrolizálódik, közben izotiocianátok és nitril vegyületek keletkeznek. Az irodalmi adatok többsége a glükozinolátok hidrolízise során keletkező termékek, elsősorban az izotiocianátok kedvező élettani hatásáról számol be, ezért feltételezéseink szerint az intakt GI-k hiánya nem befolyásolja számottevően a készítmény bioaktív hatását. Jóllehet a glükozinolátok hidrolízise során keletkező termékek jelenléte a préslében nem bizonyított, de az irodalmi adatok alapján feltételezhető (165). A fekete retek préslé in vitro vizsgálati körülmények között jelentős antioxidáns hatást mutatott. Koncentrációfüggő
módon
hidrogén-donorként
viselkedett
az
1,1-difenil-2-pikrilhidrazil
gyök
jelenlétében, redukáló hatású volt a Fe(III) → Fe(II) átalakulásban. Réz(II)-ionok jelenlétében komplexképző ágensként viselkedett. Továbbá a préslé koncentrációfüggő módon gátolta a linolsav 37oC-
117
on előidézett autooxidációját. A készítmény bioaktív vegyületei gátolták a citokróm c redukcióját xantin/xantinoxidáz rendszerben, valamint az adrenalin lúgos közegben lejátszódó autooxidációját, tehát a fekete retek préslé szuperoxid gyökfogó hatással rendelkezik. Luminometriás módszerrel igazoltuk, hogy a préslé a H2O2/·OH-luminol rendszerben a Fenton reakció során keletkező szabad gyökök befogására képes koncentrációjával arányos mértékben. A préslé igen magas totál antioxidáns státusz (TAS) értéket mutatott. Feltételezhető, hogy ebben a magas érték kialakulásában szerepe van a préslében megtalálható antioxidáns vegyületek szinerg kölcsönhatásainak is. Az eredmények bizonyítják, hogy a préslében jelenlévő biológiailag aktív komponensek hidrogént képesek átadni a jelenlévő szabad gyököknek, ezáltal közömbösítik azokat. A lipidperoxid és lipid hidroperoxid gyökök befogása következtében a lipidperoxidáció propagációja gátlódik, ezért a folyamat megszakad. A fekete retek aktív hidrogén donor molekulái láncmegszakító, elsőrendű antioxidánsként viselkednek a lipid peroxidáció gátlásában. Erőteljes redukáló hatásánál fogva a fekete retek másodrendű antioxidánsként is kiváló, mert képes a lipidperoxidáció során keletkező oxidált állapotú átmeneti és végtermékek redukciójára, amely során nem toxikus vegyületek keletkeznek. Továbbá komplexképző tulajdonágai révén megakadályozza, hogy az átmeneti fémionok a lipidhidroperoxidok bomlásának katalízisén keresztül felerősítse az oxidációs folyamatokat. Az alkalmazott komplex vizsgálati rendszer eredményei alapján bizonyossá vált, hogy a fekete retek préslé különböző mechanizmusokon keresztül antioxidánsként képes viselkedni. 6.1.2.
Vörös- és fehérborok, szőlőlevek
A hazai fehér- és vörösborokkal végzett vizsgálatok alapján megállapítható volt, hogy míg a fehérborok összes polifenoltartalma 100-200 mg/l, addig a vörösboroké egy nagyságrenddel magasabb, 1400-3000 mg/l. Ez utóbbi értékek nem tértek el lényegesen a vizsgálatba bevont külföldi, jelentős bortermelő vidékekről származó vörösborokban mért adatoktól. A kékszőlőből nyert levek polifenoltartalma töredéke volt a vörösborokban tapasztalt mennyiségnek, de magasabb volt, mint a fehérboroké. Valamennyi vizsgált fehér- és vörösbor, valamint kékszőlőlé esetében koncentrációfüggő hidrogén-donor aktivitás és redukáló hatás volt kimutatható. A minták első- és másodrendű antioxidánsként funkcionáltak. A fehér- és vörösborok komplexképző ágensként viselkedtek Cu(II)-ionok jelenlétében, gátolták a citokróm c xantin/xantinoxidáz rendszerben előidézett redukcióját, valamint megakadályozták a linolsav autooxidációját, és jelentős TAS értéket mutattak. Az elsőrendű (láncmegszakító) antioxidánsok az indukciós periódusban hatnak, jelenlétükben az oxidáció jelentősen később kezdődik el és a zsírsavak oxidációs állapotában hosszú ideig nincs számottevő változás. Az indukciós periódus végén azonban a lipidek gyors károsodása kezdődik el, hidroperoxidok, illóvegyületek, aldehidek, később polimerek vegyületek keletkeznek. Az elsőrendű antioxidánsok főleg
118
fenolos szerkezetű molekulák, tokoferolok, galluszsav és származékai, flavonoidok és egyéb komponensek. A másodrendű, vagy preventív antioxidánsok az előbbitől eltérő módon gátolják a lipidek oxidációját. Megakadályozzák az iniciációt, vagy a reakciók során keletkező átmeneti és végtermékeket alakítják át nem-toxikus formává, például redukcióval. Más mikrokomponensek jelenlétében hatásosak igazán: növelik az elsőrendű antioxidánsok hatásosságát, vagy gátolják a prooxidáns hatású vegyületek működését. Az antioxidánsokra alapvetően jellemző, hogy legtöbbjük többféle hatásmechanizmuson keresztül is képes gátolni az oxidációt, és sok esetben egymással szinergizálva hatnak (92). Az átmenti fémionok, a Fe2+ és a Cu2+ katalizálják a lipidhidroperoxidok bomlását. A folyamat során exponenciálisan megnő a szabad gyökök mennyisége, és így többszörösére fokozódik a lipidperoxidáció intenzitása ( 98). A folyamat komplexképző vegyületekkel megakadályozható, ilyenek lehetnek például az EDTA, a citromsav, melyek élelmiszeripari adalékanyagok is, vagy a D-penicillamin és egyéb gyógyszerek. Vizsgálataink során bebizonyosodott a vörösbor eredetű polifenolos vegyületek jelentős komplexképző hatása is. A vörösbor kivételes antioxidáns tulajdonsága annak köszönhető, hogy a benne található polifenolos vegyületek eltérő szerkezetükből adódóan különböző redox potenciállal rendelkeznek. Ezért a vörösborok eltérő antioxidáns erősségű vegyületei részt vesznek a már oxidálódott vegyületek regenerálásában, akár boreredetű antioxidáns volt az, akár a szervezetben található más vegyület, például a tokoferol. A vörösés fehérborok, valamint a szőlőlevek esetében tapasztalt kedvező antioxidáns tulajdonságok szoros korrelációban voltak a minták összes polifenoltartalmával. Jelentős volt az antioxidáns hatás a vörösborok esetében, kisebb mértékű az alkoholt nem tartalmazó, préseléssel nyert kékszőlőlevekben, míg leggyengébb antioxidáns tulajdonságokkal a fehérborok rendelkeztek. A vizsgálataink eredményei összhangban vannak a nemzetközi szakirodalomban a vörösbor kedvező élettani hatásairól beszámoló tanulmányok adataival (85, 86, 87, 95, 150, 305). Ennek ellenére nem állíthatjuk teljes biztonsággal, hogy az adatok elegendőek határozott következtetések levonására a vörösborfogyasztás valamint a feltételezett kedvező élettani hatás közötti kapcsolatra vonatkozóan. A paradoxon más, táplálkozási, életmódbeli vagy genetikai különbségekkel is magyarázható. Az utóbbi évek intenzív kutatásai lehetővé teszik az alkohol okozta károsodások genetikai és biokémiai hátterének jobb megismerését. A különösen veszélyeztetett ADH2, ADH3 genotípusú egyéneknél, valamint az ALDH2*2 genotípusú
ALDH
2*/2*2
heterozigótáknál
már
viszonylag
kis
mennyiségű
és/vagy
tartós
alkoholfogyasztás is jelentős gasztrointesztinális károsodásokat okozhat. Míg az ADH2 hiány a kellemetlen mellékhatások miatt (hányás, fejfájás, remegés, stb.) inkább véd az alkoholizmustól, addig az ADH3-1 allél megnövelheti a felső gasztrointesztinális tumor, főleg a májrák kialakulásának esélyét. Ugyancsak veszélyeztetettek azok az egyének is, akiknek CYP2E1 2C alléljük alacsonyabb frekvenciájú. Ezekben az alkoholistákban súlyos hepatikus fibrózis, ill. nagyobb gyakorisággal májcirrhosis alakul ki. A
119
CYP450 2D izoform különösen az alkohol-gyógyszer kölcsönhatások miatt jelent nagyobb rizikót (156, 256). Fentiek miatt a vörösborral kapcsolatos, a lakosság egészére vonatkozó ajánlás nem egyértelműen pozitív hatású az egyéb veszélyek növekedésének esélye miatt. Jelenlegi ismereteink szerint mérsékelt mennyiségű, napi 150-300 ml vörösbor - férfiak esetében 2-3 egység, nők esetében 1-2 egység (1 egység 12 g alkoholnak felel meg) - kulturált, étkezéshez kapcsolódó elfogyasztása, elméletileg csökkentheti a szív- és érrendszeri megbetegedések és halálozások arányát. Mivel hazánkban az alkoholfogyasztás mértéke, valamint a cirrózisos halálozások száma az utóbbi tíz év jelentősen emelkedett, reméljük, hogy az ún. nagyivók alkoholhoz kapcsolódó érzéseiket módosítják és a megfelelő felvilágosítás hatására a számukra kevésbé ártalmas italok, nevezetesen a jó minőségű vörösborok mértékletesebb fogyasztását választják a rendkívül káros égetett szeszesitalok helyett. 6.2.
IN VIVO ÁLLATKÍSÉRLETEK
Patkánykísérletekben zsírdús étrend hatására kialakuló hyperlipidaemiában a fekete retek préslé kedvező, lipidszint-csökkentő hatását sikerült bizonyítani. A magas koleszterin- és zsírtartalmú étrend fogyasztásának hatására az állatok szérumában szignifikánsan emelkedett a koleszterin, az LDLkoleszterin, a triglicerid és az epesavak koncentrációja. Hasonló eredményekről számolt be Battacharyya munkacsoportja, akik állatkísérletes vizsgálatokban igazolták, hogy a koleszterin etetése szignifikánsan emeli a szérumban az epesavak koncentrációját, mivel nő az epesavak intesztinális pool-ja a májban felerősödött epesav képződés és ürülés miatt (15). Saját vizsgálatainkban az étrendkiegészítésként fogyasztott fekete retek préslé hatására a fenti komponensek mindegyikénél kedvező irányú változás volt tapasztalható már a 9 napig tartó kezelés során is (164). Ismeretes, hogy a növényi szterinek szérum koleszterin és LDL-koleszterin-szint csökkentő hatást mutattak számos állatkísérletes és humán vizsgálatban. A fitoszterinek a koleszterinhez nagyon hasonló szerkezetűek. A vizsgálatok azt mutatják, hogy a fitoszterinek koleszterinszint-csökkentő hatásának oka, hogy a fitoszterinek gátolják a koleszterin felszívódását, mivel helyettesítik azt a micellákban (158). Ugyanakkor a fitoszterinek képesek normalizálni a hepatikus 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reduktáz csökkent aktivitását is. (194). Állatkísérletekben 0.2%-nál magasabb étrendi szitosztanol koncentráció már szignifikánsan csökkentette a szérum koleszterin szintet (212). Egy svédországi felmérés alapján a zöldségfélékre átlagosan 14 (3.8-50) mg/kg fitoszterin-tartalom jellemző, a legjelentősebb források a brokkoli, a kelbimbó és a kelkáposzta. A fekete retek gumója mintegy 9 mg/kg-ot tartalmazott, ebből 4.4 mg β-szitoszterol volt (211). Feltételezhető, hogy az állatkísérleteinkben alkalmazott fekete retek préslében is jelen vannak ezek a vegyületek, mennyiségüket azonban pontosan nem ismerjük. Mivel a készítmény előállítása során bizonyos mértékű koncentrálódás történt, elképzelhető, hogy a fitoszterinek olyan mennyiségben voltak jelen, hogy már a 9 napig tartó kezelés során is befolyásolhatták a fent említett
120
mechanizmusok szerint a koleszterin metabolizmust, ezért befolyásolták az epesavak termelését és ürülését is. Egyes flavonoid vegyületek, például a heszperetin magas koleszterintartalmú tápon tartott állatok szérumában csökkentette a koleszterinszinet, májában a HMG-CoA reduktáz és az ACAT aktivitását, ugyanakkor szignifikánsan fokozta a széklettel ürülő neutrális szterol vegyületek mennyiségét (153). Mivel a patkánynak nincs epehólyagja, a FRP nem tud az epehólyag falára, izomzatára hatást gyakorolni, feltételezzük, hogy a fekete retek préslében található flavonoidok koleszterinszint-csökkentő hatása a HMG-CoA reduktáz és az ACAT aktivitásának gátlásán keresztül is érvényre juthat. A hyperlipidaemiában kialakuló zsírmájban a májsejtek membránjainak károsodása miatt a szérumban jelentősen emelkedik a májenzimek aktivitása. Ezt a folyamatot a zsírdús étrend mellett fogyasztott fekete retek préslé jelentősen visszaszorította. Hyperlipidaemiában a készítmény hatására a szérumban a májenzimek aktivitása, valamint a bilirubin koncentrációja a normál érték felé mozdult el. A kedvező változások a fekete retek préslé májvédő hatását jelzik. A normál anyagcsere szempontjából a lipidek zavartalan transzportja a máj és a lipid depók között rendkívül fontos. Az étrend magas zsírtartalma miatt a máj elzsírosodhat. A folyamat kezdeti szakasza még reverzibilis, így a máj és a lipid depók egyensúlyban vannak. Később a lipidek felszaporodnak a hepatocitákban. A koleszterinben gazdag étrend megváltoztatja a máj lipidmetabolizmusát, így a koleszterin bioszintézisében kulcsfontosságú HMG-CoA reduktáz aktivitását, a koleszterin-7-alfahidroxiláz aktivitását, mely az epesavak bioszintézisének meghatározó enzime, valamint a 12-alfahidroxilázt, mely a kolsav bioszintézisét szabályozó enzim (60). Így a mikroszomális citokróm P450 enzimrendszer is fontos szerepet kap a változásokban (34). A zsírdús étrend hatására a szervezetben fokozódott a lipidperoxidáció. A hyperlipidaemiás állatok szérumában nőtt a malondialdehid és a konjugált diének mennyisége, míg az eritrocitában az antioxidáns enzimek közül a glutation-peroxidáz aktivitása csökkent. A fekete retek préslé antioxidáns tulajdonságainak köszönhetően a szabad gyökös folyamatok visszaszorultak, így a malondialdehid és konjugált dién szintek a normál értékre csökkentek a szérumban, a plazma scavenger kapacitása javult, az antioxidáns enzimek aktivitása növekedett az eritrocitákban. Az antioxidáns védelem erősödését jelezte továbbá a szérumban a megemelkedett A- és E-vitamin koncentráció, valamint a fokozott redukálóképesség. A jelentős mennyiségű, számottevően telítetlen zsírsavakat (főleg linolsavat) tartalmazó napraforgóolaj fogyasztásának hatására a hyperlipidaemiás állatok májában nőtt a zsír mennyisége és a telített/telítetlen zsírsavak aránya a kontroll állatokban mért 1.5-1.6 értékről 4.2-re emelkedett. A hepatocitákban akkumulálódott nagy mennyiségű, könnyen oxidálódó telítetlen zsírsavak a szabad gyökös reakciók
121
célpontjává váltak, megnőtt az oxidatív elváltozásokat eredményező reakciók szubsztrát-kínálata. A hyperlipidaemiás állatok májában emelkedett a malondialdehid, a konjugált diének mennyisége, és az antioxidáns enzimek aktivitása csökkent. A fekete retek préslé fogyasztása nem változtatta meg a máj zsírsavösszetételét, de más mechanizmusokon keresztül érvényre jutott májvédő hatása: visszaszorult a zsír felhalmozódása a májsejtekben, a malondialdehid és konjugált diének mennyisége jelentősen csökkent, az enzimaktivitások normalizálódtak, a májhomogenizátum scavenger kapacitása javult. A 2% koleszterint tartalmazó zsírdús táp fogyasztása már 9 napos kezelés után is jelentősen, mintegy tizenötszörösére emelte a májak koleszterin tartalmát, valamint fokozta a feltételezetten atherogén hatású oxidált koleszterin származékok képződését. A fekete retek préslé koleszterin-metabolizmusra gyakorolt jótékony hatása már az egészséges állatok szervezetében is megnyilvánult, mivel csökkentette a májak koleszterintartalmát, ugyanakkor a szérumban enyhén nőtt az epesavak mennyisége. A hyperlipidaemiás állatok májában tapasztalt jelentős koleszterin felhalmozódást a fekete retek préslé mintegy harminc százalékkal visszaszorította, valamint gátolta a koleszterin oxidációját is (166). A koleszterin a telítetlen zsírsavakhoz hasonlóan igen labilis vegyület, molekuláris oxigén és fény jelenlétében szobahőmérsékleten is oxidálódik (133). Az élő szervezetben is lejátszódó autoxidáció során keletkező sokféle reakciótermék közül számos komponensnek nemkívánatos biológiai hatása van szöveti, sejt és enzim szinten is. Ezek közül a legjelentősebbek a koleszterin bioszintézis gátlása, citotoxicitás, angiotoxicitás, ill. atherogén hatás, mutagenitás. Számos tanulmány támasztja alá a koleszterin oxidációs termékek atherogén hatását (116). A szervezetben is jelenlévő egyes oxidált szterinek feltételezhetően a lipidperoxidációs reakciók és/vagy enzimatikus oxidáció során képződnek. Többféle oxidációs terméket találtak az emberi aortában, a májban és a plazmában, melyek feltételezhetően a koleszterin in vivo oxidációja során keletkeztek (270). Néhány hidroxi-szterin valószínűleg az epesav-szintézis és a szteroid hormonok szintézisének prekurzora. Ugyanakkor a májban az epesavak szintézise során is keletkezhetnek koleszterin oxidok. A táplálékkal bekerült koleszterin oxidációs származékok felszívódnak a gyomor-béltraktusba és a véráramba kerülve VLDL és LDL komponensekként jutnak el az érfalhoz, és így szerepet játszhatnak a keringési rendszer degeneratív elváltozásaiban (283). Alimentáris hyperlipidaemiában, többek között a fokozott szabad gyökös reakciókkal kapcsolatosan a mikroszomális enzimrendszer működése károsodik, melyet például a NADPH citokróm c reduktáz és a NADH citokróm b5 reduktáz aktivitásának csökkenése jelez. A drogmetabolizáló monooxidáz enzimrendszer csökkent aktivitása a sejtorganellumok membránjaiban lezajló létfontosságú biokémiai folyamatok zavart működését eredményezhetik. A fekete retek préslé fogyasztásának hatására a mikroszomális enzimek aktivitása a normál, egészsége állatokban mért értékek irányába mozdult el. Ezek
122
a kedvező irányú folyamatok a fekete retek préslé gyenge, de nem elhanyagolható membránvédő hatását is jelzik. A máj méregtelenítő folyamataiban az ún. konjugációs szakaszban a citoszolban található glutation-Stranszferáz (EC 2.5.1.18)
izoenzimek jelentős szerepet kapnak. A potenciálisan alkiláló ágensek
detoxifikálásában vesznek részt. Bizonyos növényi agyagok a glutation-S-transzferáz indukcióján keresztül elősegítik a toxikus vegyületek kiürülését a szervezetből. A káposztafélékre jellemző kéntartalmú vegyületek, a glükozinolátok és a hidrolízisük során keletkező termékek egyes szerzők eredményei szerint indukálják és/vagy aktiválják a máj legfontosabb antikarcinogén enzimeit, a kinon reduktázt és a glutation-S-transzferázt, valamint módosítják a mikroszomális citokróm P450 enzimrendszer aktivitását is (311, 312, 313). A patkánymájak citoszol glutation-S-transzferáz aktivitása nem változott, amikor a normál étrend mellett FRP-t is fogyasztottak állatok, a készítmény nem indukálta a glutation-S-transzferázt egészséges állatokban. Ugyanakkor alimentáris hyperlipidaemiában megnőtt az enzim aktivitása, ami arra utal, hogy a szervezetben nagyobb mennyiségben voltak jelen toxikus vegyületek, melyek kiürülése a glutationnal történő konjugátum képződésén keresztül valósult meg. Alimentáris hyperlipidaemiában megemelkedett GST aktivitást a fekete retek préslé a normál értékre csökkentette, ami az enzim szubsztrát kínálatának, vagyis a detoxifikálandó vegyületek mennyiségének csökkenését jelzi. 6.3.
IN VIVO HUMÁN VIZSGÁLATOK
A fekete retek préslét és édesköményolajat tartalmazó Raphacol készítményt 6 hónapig, naponta 3 x 0.2 gos adagban fogyasztották I. és II. típusú diabetes mellitusban szenvedő betegek. A kúra megkezdése előtt, majd 3 és 6 hónappal utána meghatároztuk a szokásos laboratóriumi szérum paraméterek mellett a lipidperoxidációra jellemző néhány komponens értékeit és antioxidáns enzimek aktivitását. A vizsgált cukorbetegek esetében a szérum lipid paraméterek egy részének kedvező irányú változását eredményezte a Raphacol készítmény fogyasztása. A betegek koleszterin és triglicerid értékei az egészséges normálérték felső határa fölött voltak a készítmény fogyasztása előtt. A készítmény fogyasztásának megkezdése után három és hat hónap után jelentősen csökkentek. Annak ellenére, hogy néhány beteg esetében a lipid paramétereket nem sikerült az egészséges normáltartományba szorítani, a Raphacol készítmény a benne található bioaktív vegyületeknek köszönhetően kedvező hatással van a lipidanyagcserére. Irodalmi adatok szerint bizonyos magas polifenoltartalmú élelmi anyagok, pl. tea, szőlő, jelentős koleszterinszint csökkenést eredményeztek a HDL-koleszterinszint emelése és az LDL-koleszterinszint csökkenése mellett, állatkísérletekben (202, 284, 285). Fenti szerzők feltételezték, hogy a kedvező hatás a
123
fokozott fordított koleszterin transzporttal, a csökkent intesztinális koleszterin abszorpcióval, vagy a megnövekedett epesav ürítéssel magyarázható, de a pontos mechanizmus jelenleg nem ismert. Mivel a Raphacol készítményben számos, a fekete retek présléből származó bioaktív vegyület, többek között flavonoidok is vannak, feltételezzük, hogy kedvező hatásuk a lipidanyagcsere módosításán keresztül is érvényre jut. Az készítmény fogyasztása előtt mindkét cukorbeteg csoportban a normálértéknél magasabb átlagos szérum glükóz szinteket tapasztaltunk, majd az értékek jelentősen csökkentek hat hónap után. A betegekre a normálértéknél magasabb hemoglobin A1c és glikohemoglobin arány volt jellemző a készítmény fogyasztása előtti mérés során. Hat hónap után mindkét érték szignifikánsan csökkent a két betegcsoportban és ezzel sikerült megközelíteni a normálértékek felső határát és így a fiziológiás értékeket. Ismeretes, hogy a cukorbetegség súlyosságának megítéléséhez a szérum glükóz szint mellett a hemoglobin A1c és a glikohemoglobin értékek is fontos információkat nyújtanak. Az optimálisan kontrollált diabetes a fiziológiás vércukor értékkel, vagy a közel fiziológiás hemoglobin A1c-vel jellemezhető. Mind a hemoglobin A1c, mind a glikohemoglobin patológiásan magas szintje a szérumban a fokozott fehérje glikáció következménye (117). A glükóz fiziológiás körülmények között is reagálhat a fehérjékkel stabil kovalens adduktot hozva létre, ez a glikáció. A cukorbetegséggel járó hiperglikémia magával vonja a glikációs folyamatok felerősödését, amely elsősorban az inzulin-dependens sejtekben a felszíni fehérjestruktúrákban, a keringő és a szöveti fehérjékben figyelhető meg (41, 302). A glikáció viszonylag rövid életidejű fehérjéken jön létre, pl. hemoglobin, enzimek, plazmafehérjék. A redukáló cukrok és a fehérjék váltakozva történő glikációja és oxidációja során olyan a glikációs termékek az ú.n. „advanced glycosilation products” (AGE) termelődnek, melyek természetes módon a korral, valamint előrehaladott diabetesben fokozatosan felhalmozódnak a szöveti kollagénben és biomarkerei lehetnek a glikációs és oxidatív fehérjekárosodásnak (16, 17). Számos gyógynövénnyel (Agrimony eupatoria, Silybum marianum) és magas polifenoltartalmú élelmiszerrel (pl. burgonya, gomba, koriander, kurkuma, babhéj) végzett vizsgálatokban tapasztaltak enyhe glükózszint-csökkentő hatást (61, 93, 233, 249, 272). A glükozinolátok hidrolízise során keletkező allil-izotiocianátokkal kapcsolatosan Muztar és munkacsoportja tárt fel enyhe szérum glükózszintcsökkentő hatást állatkísérletekben (203). A fekete retekben az összes glükozinolát mintegy 95%-a a 4metiltio-butenil glükozinolát, melynek hidrolízise során elsősorban nem allilizotiocianátok keletkeznek (52). Egyes szerzők feltételezései szerint a fekete retekből izolált növényi növekedési hormon (citokinin), a 6-benzilamino-3-α-D-glükopiranozil-purin játszik szerepet a vércukor szint csökkentésében (169). Fentiek miatt feltételezzük, hogy vizsgálatainkban a fekete retek préslé fentebb említett kedvező mikroelem-tartalma mellett a jelenlévő polifenolos vegyületek is kedvezően befolyásolhatták a
124
glükózanyagcserét. Ugyanakkor nem zárható ki, hogy más tényezők is szerepet játszottak, ezért a folyamatok pontos megismeréséhez további megfigyelésekre van szükség. Néhány flavonoid és izoflavonoid vegyülettel végzett állatkísérletes vizsgálatok során bebizonyosodott e vegyületek kedvező hatása a hemoglobin glikációjának megakadályozásában is (12, 296, 298). A fiziológiás tartományt megközelítő vércukor és hemoglobin A1c értékek a javuló metabolikus kontrollt jelzi. Ennek következtében a diabeteshez társuló komplikációk rizikója is lényegesen csökkenhet. Mivel a glükóz fiziológiás körülmények között autoxidálódhat, amely során hidroxilgyökök, majd azokból H2O2 és ketoaldehidek keletkeznek, a diabetes időtartama alatt a szabad gyökök növekvő mennyiségben keletkeznek egy elektroncsere során, mely a glikált fehérje cukor oldallánca és a molekuláris oxigén között játszódik le (89). A glikált fehérjék reakcióiból származó szabad gyökök megnövelik a lipidperoxidációt a linolsav/arachidonsav kettős membránokban. Ezért felerősödik a vaszkuláris fal lipidjeinek oxidatív károsodását (201), és nő az atherosclerosis kialakulásának kockázatát. Ugyanakkor a szabad gyökök képződése a glikációtól függetlenül is megvalósulhat. Például a glükóz vagy a ketoaldehidek autoxidációjakor keletkeznek, vagy a citokrom P450 megnövekedett aktivitásának eredményeként, melyet a fokozott glükóz metabolizmus miatt fokozódó NADPH termelődés vált ki (118). Ez stimulálja a különböző szövetekben, a mikroszómákban és az eritrociták hemoglobinjában a citokrom P450 aktivitást, amely felerősödött gyökképződéshez és lipidperoxidációhoz vezet (77). A három és hat hónapon keresztül fogyasztott Raphacol epegranulátum hatására a betegek többségében a lipidperoxidációs folyamatok mérséklődését tapasztaltuk. A szérumban hat hónap után csökkent a malondialdehid tartalom, a plazma scavenger kapacitása javult, valamint az antioxidáns enzimek aktivitása jelentősen növekedett. Az egyéb szérum paraméterek alakulása is a szérum antioxidáns védelmi rendszerének erősödését jelezte. A tiol vegyületek, köztük a redukált glutation, fontos tagjai a nem-enzimes védelmi rendszernek. Csökkent plazma tiol-szintet tapasztaltak I. típusú betegekben, valamint II. típusú betegekben a szulfhidril csoportok, a C- és E-vitamin, valamint a húgysav alacsony koncentrációját mutatták ki (49, 54). Diabetes mellitusban a redukált glutation (GSH) csökkent szintjét tapasztalták endotél sejtekben, retina sejtekben és más szövetekben is (45). Az alacsony redukált glutation szint kapcsolatban van a csökkent glutationperoxidáz aktivitással, ami egyik magyarázata lehet a diabetesben tapasztalt fokozott lipidperoxidációnak (161). A hiperglikémiában fölöslegben keletkező szuperoxid gyök és az alacsony GSH-Px aktivitás következtében megnő a szöveti H2O2 termelődés. Ez a folyamat szabad vas- és rézionok jelenlétében hidroxilgyök képződéséhez vezet. A metalloprotein transzferrin és szuperoxid dizmutáz glikációja a prooxidáns fémionok kiáramlását eredményezheti és ezzel tovább fokozza a lipidperoxidációs
125
károsodások valószínűségét (119). A Raphacol készítmény fogyasztásának során a szulfhidril csoportok koncentrációja a szérumban kedvező irányban mozdult el. A húgysav a szérum antioxidáns védelmi rendszerének fontos eleme. A purin nukleotidokból több lebomlási lépcső keresztül xantin jön létre, a húgysav pedig a xantinból és hipoxantinból keletkezik a xantin-oxidáz enzim segítségével. Howell és Wyngaarde 1960-ban kimutatták, hogy az oxidált hemoglobin (methemoglobin) vagy a hematin és a hidrogén-peroxid együtt képes a húgysavat allantoinná oxidálni (114). Hasonló reakció játszódik le akkor is, ha húgysav helyett aszkorbinsav van a rendszerben. A hidrogén-peroxid helyett más szerves peroxidok, a hemoglobin helyett pedig más hem-tartalmú fehérjék és enzimek (kataláz, mieloperoxidáz, citokróm c, prosztaglandin-hidroperoxdáz) is részt vehetnek a reakcióban (238). A fenti folyamat tehát a húgysav antioxidáns hatásának mechanizmusa. Az utóbbi évek megfigyelései bizonyították a húgysav lényeges szerepét az oxidatív stressz kivédésében (10). A glükozinolátokból származó allil-izotiocianátok állatkísérletekben a szérum húgysav szint csökkenését idézték elő (204). Az allil-izotiocianátok a fekete retekben is előfordulhatnak, ezért feltételezhető, hogy a készítmény fogyasztásának harmadik hónapja után tapasztalható húgysav szint csökkenésben a rendszeresen elfogyasztott Raphacol készítmény is közrejátszik. Ugyanakkor a hatodik hónapra kialakult egyensúlyi helyzet lehetővé tette a húgysav szintek normalizálódást. A plazmában számos olyan komponens van jelen, mely gyökfogó tulajdonságokkal rendelkezik, pl. albumin, vitaminok, bilirubin, húgysav, polifenolos vegyületek. Ezek mennyisége a Raphacol készítmény fogyasztásának ideje alatt jelentősen változhatott. Mivel több szérum paraméter tekintetében is kedvezőtlen irányú, de patológiásnak nem tekinthető változást tapasztaltunk a kúra harmadik hónapja után, feltételezzük, hogy a készítménnyel elfogyasztott antioxidáns hatású anyagok mellett néhány prooxidáns vegyület, és szabad gyök prekurzor (pl. fémionok) is nagyobb számban került be a szervezetbe. A szervezetnek alkalmazkodnia kellett az új helyzethez, de időre volt ahhoz szüksége, hogy egy magasabb szintű prooxidáns/antioxidáns egyensúlyt alakítson ki. Ezért a Raphacol készítmény kedvező hatásait a legtöbb beteg esetében a hat hónapos kúra után sikerült regisztrálni. Számos antioxidáns hatású vegyület kedvező hatását tapasztalták a diabeteses komplikációk megelőzésében. Például az aszkorbinsav magas koncentrációban képes a fehérjéket megvédeni a glikációtól (278). A fontos fehérjék glikációjából és fokozott oxidatív stresszből adódó toxikus hatással kapcsolatos diabeteses komplikációk megelőzhetők vagy visszaszoríthatók megfelelő antioxidánsokkal a tradicionális gyógyszeres terápia kiegészítéseként (128, 182). Ezért feltételezzük, hogy a fekete retek hatóanyagait tartalmazó Raphacol epegranulátum antioxidáns tulajdonságai révén képes visszaszorítani a fokozott lipidperoxidációt diabetesben. Ezáltal mind az alapbetegség állapotában kedvező irányú változások zajlanak le, mind a diabetes szabad gyökös reakciókkal kapcsolatos szövődményeinek, többek között az epekőképződés kockázata is csökken.
126
A vizsgálat során arra kerestünk választ, hogy a fekete retek préslét és édesköményolajat tartalmazó készítmény befolyásolja-e a lipidperoxidációs folyamatokat egy olyan betegcsoportban, ahol az alapbetegség szövődményeként több, a szabad gyökös reakciókkal kapcsolatba hozható elváltozás jön létre. Számos közvetett és közvetlen bizonyíték támasztja alá a fokozott szabad gyökös reakciók szerepét a koleszterin epekövek kialakulásában (5, 27, 28, 30, 31, 267). Különböző populációkon végzett vizsgálatok szerint a női nem és a diabetes mellitus jelentős rizikófaktorai lehetnek az epekő kialakulásának. A diabetes mellitusban megváltozott glükóz és lipid metabolizmus pedig a cholelithiasis fokozott kockázatával jár együtt. Ruhl és munkatársai szerint nem kifejezetten a diabetes, hanem az inzulin rezisztencia az epekőképződés elsődleges meghatározó tényezője. A szerzők több mint ötezer, nem ismert diabetessel rendelkező beteg adatainak elemzése alapján összefüggést mutattak ki a magas éhomi inzulinszint és az epekőbetegség fokozott rizikója között, elsősorban a nők esetében (246). Vizsgálatunk során a Raphacol epegranulátum fogyasztása alatt és utána a hasi ultrahangos vizsgálatok nem mutattak ki epekövet egyik betegnél sem, ugyanakkor a készítmény kedvező irányba befolyásolta a lipidperoxidációs folyamatokat. A Raphacol epegranulátum gyógyszernek nem minősülő gyógyhatású készítmény, melynek fő hatóanyag-komponensei élelmiszerből, a fekete retekből származnak. A hatóanyagok koncentrációja és az Országos Gyógyszerészeti Intézet által engedélyezett és a humán vizsgálatban alkalmazott dózis nem túl magas. Ennek ellenére a vizsgálati eredmények, valamint a betegek tapasztalatai alapján kedvező élettani hatása nem kétséges. A készítmény bioaktív hatóanyagai, köztük a jól ismert antioxidánsok -tokoferolok, karotinoidok, aszkorbinsav, polifenolos vegyületek- felszívódtak, egy részüket a szervezet felhasználta, a többit elraktározta, vagy kiválasztotta. A hat hónapi tartó kúra alatt e vegyületek stabil szérum szintje alakult ki, amely lehetővé tette az antioxidáns védelmi rendszer megerősödését és megakadályozta a patológiás szabad gyökök felszaporodását. Ezzel megelőzhetővé vált cukorbetegekben az epekő kialakulása, de egyéb kedvező hatások is megfigyelhetők voltak, pl. a koleszterin és triglicerid szint csökkenése, melyek a szabad gyökös reakciókkal összefüggő egyéb diabeteses komplikációk, például az atherosclerosis prevencióját is eredményezhetik. Napjainkban a cukorbetegek életkilátásai, várható élettartama jelentősen meghosszabbodott, de számos, az alapbetegséggel párosuló komplikáció zavarhatja életvitelüket. A Raphacol készítmény e tünetek nagy részét eliminálni képes, ezért rendszeres fogyasztásának hatására a cukorbetegek életminősége kedvezően alakulhat. Az eredmények értékelésekor feltétlenül figyelembe kell venni azt a tényt, hogy a vizsgálatokba bevont betegek száma, különösen I. típusú diabetesben, meglehetősen alacsony volt. Továbbá felmerült, hogy egyes betegek esetében nem csak a Raphacol eredményezte a kedvező eredményeket annak ellenére, hogy a vizsgálatok megkezdése előtt nyomatékosan felhívtuk a figyelmüket arra, hogy a készítmény fogyasztása alatt ne térjenek el korábbi megszokott étrendjüktől. Fentiek miatt a humán vizsgálatokra
127
vonatkozó eredményeket kellő fenntartással kell kezelni. A vizsgálatokba a kezelőorvosok segítségével olyan betegek bevonása történt, akik hosszabb ideje szenvedtek diabetesben és betegségük metabolikusan jól kontrolláltnak volt tekinthető, a készítmény fogyasztásának ideje alatt az alapbetegség kezelésében nem kellett jelentős változtatásokat végrehajtani. Mivel a betegek jelentős részében a diabetessel társuló kellemetlen gastrointestinalis tünetek (puffadás, fokozott gázképződés, teltségérzés) csökkenése, vagy teljes megszűnése volt tapasztalható a kúra ideje alatt, úgy gondoljuk, hogy a készítmény hatásának további tanulmányozása elengedhetetlenül szükséges. Eddigi ismereteink lehetővé teszik a további kutatások hatékonyabb megtervezését, és kijelölik a lehetséges egyéb vizsgálandó területeket.
128
7.
HIVATKOZÁSOK
1.
A.O.A.C. „Official Methods of Analysis” 14th Edition, Arlington, USA, 28054b, 1984.
2.
A.O.A.C. „Official Methods of Analysis” 15th Edition, Arlington, USA,(934.01, 954.02, 976.05), 1990a.
3.
A.O.A.C. „ Official Methods of Analysis” 15th Edition, Arlington, USA, (952.03. A-C) 1990b.
4.
A..O.A.C. „Official Methods of Analysis” 15th Edition, Arlington, USA, (971.30). 1990c.
5.
Abdel Rahman, M., Blázovics, A., Ágoston, M. és mtsai.: A chemiluminescent study for detection of free radicals in gallbladder bile in gallstone diseases. Ces. A Slov. Gastroent. 45. 7-13. 1995a.
6.
Abdel-Rahman, M.: Thesis of PhD, Semmelweis University Medical School, Budapest, Hungary. 1995b.
7.
Abidin, I., Maier, H. G.: Gleichzeitige Bestimmung von Fructose, Glucose and Saccharose mit der Anthron-Reaktion. Chem. Mikrobiol. Technol. Lebensm. 63. 121-123. 1980.
8.
Ahotupa, M., Marniemi, J., Lehtimäki, T. és mtsai: Baseline dien conjugation in LDL lipids as a direct measure of in vivo LDL oxidation. Clin. Biochem. 31. 257-261. 1998.
9.
Ames, B. N., McCann, J., Yamasaki, E.: Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/mammalian microsome mutagenecity test. Mutat. Res. 31. 347-364. 1975.
10.
Ames, B., Cathcart, R., Schwiers, E. és mtsai: Uric-acid provides and antioxidant defense in human against oxidant-caused and radical-caused aging and cancer – A hypothesis. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78. 6858-6862. 1981.
11.
Apstein, M. D., Carey, M. C.: Pathogenesis of cholesterol gallstones: parsimonious hypothesis. Eur. J. Clin. Invest. 26. 343-452. 1996.
12.
Asgary, S., Naderi, G., Sarafzadegan, N. és mtsai: Antioxidant effect of flavonoids on hemoglobin glycosilation. Pharm. Acta Helv. 73. 223-226. 1999.
13.
Attili, A. F., Capocaccia, R., Carulli, N. és mtsai.: Factors associated with gallstone disease in the MICOL experience. Multicenter Italian Study on Epidemiology of Cholelithiasis. Hepatology, 26. 809-818. 1997.
14.
Bate-Smith, E., C.: Leuco-anthocyanins I: Inhibition and identification of anthocyanidins formed from leuco-anthocyanins in plant tissues. Biochem. J. 58. 122. 1954.
15.
Battacharyya, A. K., Strong, J. P.: Serum total bile acid concentration in Rhesus monkeys: Effects of feeding cholesterol and inhibiting cholesterol absorption and synthesis. Ann. Nutr. Metab. 36. 55-60. 1992.
16.
Baynes, J. W.: Role of oxidative stress in developement of complications in diabetes. Diabetes, 40. 405-412. 1991.
17.
Baynes, J. W., Thorpe, S. R.: Role of oxidative stress in diabetic complications: a new perspective on an old paradigm. Diabetes, 48. 1-9. 1999.
18.
Beers, R. F., Sizer, I. W.: Spectrophotometry for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J. Biol. Chem. 195. 133-140. 1952.
19.
Beretz, A., Anton, R., Stoclet, J. C.: Flavonoid compounds are potent inhibitors of cyclic AMP phosphodiesterase. Experientia, 34. 1054-1055. 1978.
129
20.
Beretz, A. A., Cazenave, J. P., Anton, R.: Inhibition of aggregation and secretion of human platelets by quercetin and other flavonoids: structure-activity relationships. Agents Actions, 12. 382-387. 1982.
21.
Bitman J. Wood D. L.: An improved copper reagent for quantitative densitometric thin-layer chromatography of lipids. J. Liquid Chromatogr. 5. 1155-1162. 1982.
22.
Blázovics A., Somogyi A., Nagy É. és mtsa: Silibinin kezelés hatása a máj drog metabolizáló enzimrendszerére kísérletes hyperlipidaemiában. Kísérletes Orvostudomány, 40. 151-158. 1988.
23.
Blázovics A., Somogyi A.: Szabad gyökös reakciók szerepe kísérletes hiperlipidémiában és arterioszklerózisban. Kandidátusi értekezés. Budapest, 1988.
24.
Blázovics, A., Fehér, E., Fehér, J.: Role of free radical reactions in experimental hyperlipaemia in the pathomechanism of fatty liver. In: Free radicals and the liver (Eds.: Fehér, J., Csomós, G.), Springer-Verlag, Berlin, 95-123, 1992.
25.
Blázovics, A., Fehér, J., Fehér, E.: Természetes antioxidánsok és szöveti regeneráció. (Gyógyhatás és reakciómechanizmus), Fitoterápia, 1. 116-122. 1995a.
26.
Blázovics, A., Fehér, J.: Természetes antioxidánsok és szöveti regeneráció. (Gyógyhatás és reakciómechanizmus). II rész. Fitoterápia, 1. 171-176. 1995b.
27.
Blázovics, A., Abdel-Rahman, M., Fehér, E. és mtsai : Lipid peroxidation is fact in bile. Mansoura Medical Journal, 25. 119-128. 1995c.
28.
Blázovics, A., Fehér, E., Abdel Rahman, M. és mtsai: Free radicals in connection in bile and liver Ces. a Slov. Gastroenetrol. 50. 73-78. 1996a.
29.
Blázovics, A., Kéry, Á., Fehér, E. és mtsai: Natural antioxidants in liver therapy. Curr. Topics Biophys. 20S, 14-30. 1996b.
30.
Blázovics, A., Őrsi, F., Abdel Rahman, M. és mtsai: Szabadgyökös reakciók az epekőbetegségek patomechanizmusában. Magyar Belorvosi Archivum, 2. 221-223. 1997.
31.
Blázovics, A., Őrsi, F., Kemény, T. és mtsai: Lipids and lipid peroxidation in connection of bile and liver. Progr. in Hepato-Pharmacol. 2. 103-116. 1997.
32.
Blázovics, A., Kovács, Á., Lugasi, A. és mtsai: Antioxidant defense in erythrocytes and plasma of patients with active and quiescent Crohn disease and ulcerative colitis: A chemiluminescent study. Clin. Chem. 45. 895-896. 1999.
33.
Blois, M. S.: Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature, 4617. 1198-1200. 1958.
34.
Bogin, E., Avidar, Y., Merom, M.: Biochemical changes in liver and blood during liver fattering in rats. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 24. 621-626. 1986.
35.
Bors, W., Heller, W., Michel, C. és mtsa: Flavonoids as antioxidants: Determination of radicalscavenging efficiences. Meth. Enzymol. 186. 343-355. 1990.
36.
Boutin, J. A., Meunier, F., Lambert P-H. és mtsai: In vivo and in vitro glucuronidation of the flavonoid diosmetin in rats. Drug. Metab. Disp. 21. 1157-1166. 1993.
37.
Böhm,
K.:
Untersuchungen
über
choleretische
Arzneimittelforschung, 9. 376-378. 1959.
130
Wirkungen
einiger
Arzneipflanzen.
38.
Bravo, L.: Polyphenols: chemistry, dietary sources, metabolism, and nutritional significance. Nutr. Rev. 56. 317-333. 1998.
39.
Breinholt, V.: Desirable vs. harmful levels of intake of flavonoids and phenolic acids. In: Natural antioxidants and anticarcinogens in nutrition, health and disease. (Eds.: Kumpulainen, J. T., Salonen, J. T.), The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK, 93-105. 1999.
40.
Brown, J. P., Dietrich, P. S.: Mutagenicity of plant flavonols in the Salmonella/mammalian microsome test: activation of flavonol glycosides by mixed glycosidases from rat cecal bacteria and other sources. Mutat. Res. 66. 223-240. 1979.
41.
Brownlee, M.: Advanced protein glycosilation in diabetes and aging. Ann. Rev. Med. 46. 223-224. 1996.
42.
Brune, M., Rossander, L., Hallberg, L.: Iron absorption and phenolic compounds: importance of different phenolic structures. Eur. J. Clin. Nutr. 43. 547-558. 1989.
43.
Buening, M. K., Chang, R. L., Huang, M-T. és mtsai: Activation and inhibition of benzo(a)pirene and aflatoxin B1 metabolism in human liver microsomes by naturally occuring flavonoids. Cancer Res. 41. 67-72. 1981.
44.
Busse, W. W., Kopp, D. E., Middleton, E. J.: Flavonoid modulation of human neutrophil function. J. Allergy Clin. Immunol. 73. 801-809. 1984.
45.
Cameron, N. E., Cotter, M. A.: Metabolic and vascular factors in the pathogenesis of diabetic neuropathy. Diabetes, 46. S31-37. 1997.
46.
Camilleri, M.: Gastrointestinal problems in diabetes. Endocrinol. Metab. Clin. North Am. 25. 361378. 1996.
47.
Carey, M. C.: Formation of cholesterol gallstones: the new paradigms. In: Trends in bile acid research (Eds.: Paumgartner, G., Stiehl, A., Gerock, W.), Dordrecht, 259-281. 1988.
48.
Cea, G. F., Etcheberry, K. F., Dulot, F. N.: Inductin of micronuclei in mouse bone-marrow cells by the flavonoid 5,3’,4’-trihydroxy-3,6,7,8-tetramethoxy-flavone (THTMF). Mutat. Res. 119. 339-342. 1983.
49.
Ceriello, A.: Hyperglycaemia: the bridge between non-enzymatic glycation and oxidative stress in the pathogenesis of diabetic complications. Diab. Nutr. Metab. 12. 42-46. 1999.
50.
Chin, D. T. Y., Stults, F. H., Tappel, A. L.: Purification and properties of rat lung soluble glutathione peroxidase. Biochim. Biophys. Acta, 445. 558-566. 1976.
51.
Christie, W. W.: Lipid analysis. Pergamon Press, Oxford, 1982.
52.
Ciska, E., Piskula, M., Waszczuk, K. és mtsa: Glucosinolates in Cruciferous vegetables grown in Poland. In: Bioactive substances in food of plant origin. (Eds.: Kozlowska, H., Fornal, J., Zdunczyk, Z.) Polish Academy of Science, Olsztyn, 36-39. 1994.
53.
Cohen, S., Soloway, R. D.: Gallstones. Churchill-Livingstone, New York, 1985.
54.
Collier, A., Wilson, R., Bradley, H. és mtsai: Free radical activity in type 2 diabetes. Diabet. Med. 7. 27-30. 1990.
55.
Cook, J. D., Reddy, M. B., Hurrell, R. F.: The effect of red and white wines on non-heme iron absorptin in humans. Am. J. Clin. Nutr. 61. 800-804. 1995.
131
56.
Cotereau, H., Gabe, M., Géro, E. és mtsa: Influence of vitamin P (vitamin C2) upon the amount of ascorbic acid in the organs of guinea pig. Nature, 161. 557-558. 1948.
57.
Criqui, M. H., Ringel, B. L.: Does diet or alcohol explain the French paradox? Lancet, 344. 17191723. 1994.
58.
Czeczot, H., Tudek, B., Kusztelak, J. és mtsai: Isolation and studies of the mutagenic activity in the Ames test of flavonoids naturally occuring in medicinal herbs. Mutat. Res. 240. 209-216. 1990.
59.
Dahl, M. K., Richardson, T.: Photodegradation of superoxide anion in serum of bovine milk and in model systems containing riboflavin and amino acids. J. Dairy Sci. 61. 400-407. 1978.
60.
Danielson, H.: Cytochrom P450 and biosynthesis of bile acids. In: Bile acids and cholesterol in health and disease. (Eds.: Paumgartner, G., Stiehl, A., Gerock, W.), MTP. p. 3111. 1983.
61.
Day, C.: Traditional plant treatments for diabetes mellitus: pharmaceutical foods. Br. J. Nutr. 80. 56. 1998.
62.
De Rijke, Y. B., Demacker, P. N. M., Assen, N. A. és mtsai: Red wine consumption does not affect oxidizability of low-density lipoproteins in volunteers. Am. J. Clin. Nutr. 63. 329-334. 1996.
63.
De Santis, A., Attili, A. F., Corradini, S. G. és mtsai.: Gallstones and diabetes: a case-control study in a free-living population sample. Hepatology, 25. 787-790. 1997.
64.
De Whalley, C. V., Rankin, S. M., Hoult, J. R. S. és mtsai: Flavonoids inhibit the oxidative modification of low density lipoproteins. Biochem. Pharmacol. 39. 1743-1749. 1990.
65.
Desphande, S. S., Shalunkhe, D. K.: Interactions of tannic acid and catechin with legume starches. J. Food Sci. 47. 2080-2081. 1982.
66.
Djurhuus, H. S., Skott, P., Hother-Nielson, O. és mtsai: Insulin increases renal magnesium excretion: a possible cause of magnesium depletion in hyperinsulinaemic state. Diabet. Med. 12. 664-669. 1995.
67.
Dunnick, J., Hailey, J. R.: Toxicity and carcinogenicity studies of quercetin, a natural component of foods. Fundam. Appl. Toxicol. 19. 423-431. 1992.
68.
Duthie, S. J., Dobson, V. L.: Dietary flavonoids protect human colonocyte DNA from oxidative attack in vitro. Eur. J. Nutr. 38. 28-34. 1999.
69.
Edenharder, R., Frangart, J., Hager, M. és mtsai: Protective effect of fruits and vegetables against in vivo clastogenicity of cyclosphosphamide or benzo(a)pyrene in mice. Food Chem. Toxicol. 36. 637-645. 1998.
70.
Eder, I. M., Miquel, J. F., Jüngst, D. és mtsai: Reactive oxygen metabolites promote cholesterol crystal formation in model bile: role of lipid peroxidation. Free Rad. Biol. Med. 20. 743-749. 1996.
71.
Edwards, J. M., Raffaut, R. F., LeQuesne, P. W.: Antineoplastic activity and citotoxicity of flavones, isoflavones and flavanones. J. Nat. Prod. 42. 85-91. 1979.
72.
Ellman, G. L., Lysko, H.: Disulfide and sulfhydryl compounds in TCA extracts of human blood plasma. J. Lab. Clin. Med. 70. 518-527. 1967.
73.
Eloesser, W., Herrmann, K.: Flavonols and flavones of vegetables. V. Flavonols and flavones of root vegetables. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 159. 265-270. 1975.
74.
Eperjesi I., Kállay M., Magyar I.: Borászat, Mezőgazda Kiadó, Budapest, 1998.
132
75.
Esterbauer, H., Gebicki, J., Puhl, H. és mtsa: The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of low density lipoproteins. Free Rad. Biol. Med. 13. 341-390. 1992.
76.
Esterbauer, H., Waeg, G., Puhl, H.: Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis. Br. Med. Bull. 49. 566-576. 1993.
77.
Favreau, L. V., Schenkman, J. B.: Composition changes in hepatic microsomal cytochrom P450 during onset of streptozotocin-induced diabetes and during insulin treatment. Diabetes, 37. 577-584. 1988.
78.
Fazal, F., Rahman, A., Greensill, J. és mtsai: Strand scission in DNA by quercetin and Cu(II): identification of free radical intermediates and biological consequences of scission. Carcinogenesis, 11. 2005-2008. 1990.
79.
Fehér, J., Vereczkei, A.: A szabadgyök-reakciók jelentősége az orvostudományban. Biotéka, Debrecen, 1985.
80.
Fenwick, G. R., Heaney, R. K., Mullin, W. J.: Glucosinolates and their breakdown products in food and food plants. CRC Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 18. 123-201. 1983.
81.
Figuerdo V. M.: The effects of alcohol on the heart. Orvostovábbképző Szemle, 5. 41-47. 1998.
82.
Fitzpatrick, D. F., Hirschfield, S. L., Coffey, R. G.: Endothelium-dependent vasorelaxing activity of wine and other grape products. Am. J. Physiol. 265. H774-778. 1993.
83.
Folch J., Lees M., Stanley G. H. S.: A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue. J. Biol. Chem. 726. 497-509. 1957.
84.
Franke, A. A., Custer, L. J., Cerna, C. M. és mtsa: Quantitation of phytoestrogens in legumes by HPLC. J. Agric. Food Chem. 42. 1905-1913. 1994
85.
Frankel, E. N., Kanner, J., German, J. B. és mtsai: Inhibition of oxidation of human low-density lipoprotein by phenolic substances in red wine. Lancet, 341. 454-457. 1993a.
86.
Frankel, E. N., Waterhouse, A. L., Kinsella, J. E.: Inhibition of human LDL oxidation by resveratrol. Lancet, 341. 1103-1104. 1993b.
87.
Frankel, E. N., Waterhouse, A. L., Teissedre, P. L: Principal phenolic phytochemicals in selected Californa wines and their antioxidant activity in inhibiting oxidation of human low-density lipoproteins. J. Agric. Food Chem. 43. 890-894. 1995.
88.
Friedman, F. K., Wesr, D., Sugimura, T. és mtsa: Flavone modulators of rat hepatic aryl hydrocarbon hydroxylase. Pharmacol. 31. 203-207. 1985.
89.
Gillery, P., Monboisse, J. C., Maquart, F. X. és mtsa: Glycation of proteins as a source of superoxide. Diabetes Metab. 14. 25-30. 1988.
90.
Goeptar, A. R., Scheerens, H., Vermeulen, N. P. E.: Oxygen and xenobiotic reductase activities of cytochrome P450. Crit. Rev. Toxicol. 25. 25-65. 1995.
91.
Gonzalez Revalderia, J., Pascual Duran, T., Miravalles Gonzalez, E.: Changes in magnesium ion in insulin-dependent or non-insulin-dependent diabetes mellitus. Rev. Soc. Esp. Quim. Clin. 14. 8-11. 1995.
92.
Gordon, M. H.: Antioxidants. In: Encyclopaedia of Food Science, Technology and Nutrition (Eds.: Macrae, R., Robinson, R. K., Sadler, M. J.) Academic Press, London, 212-216. 1993.
133
93.
Gray, A. M., Flatt, P. R.: Insulin-releasing and insulin-like activity of the traditional anti-diabetic plant Coriandrum sativum (coriander). Br. J. Nutr. 81. 203-209. 1999.
94.
Grinberg, L. N., Rachmilewitz, E. A., Newmark, H.: Protective effects of rutin against hemoglobin oxidation. Biochem. Pharmacol. 48. 643-649. 1994.
95.
Groenbaeck, M., Deis, A., Sorensen, T. I. A. és mtsai: Mortality associated with moderate intakes of wine, beer or spirits. Br. Med. J. 310. 1165-1169. 1995.
96.
Habig, W. H., Pabst, M. J., Jakoby, W. B.: Glutathione-S-transferase. J. Biol. Chem. 249. 71307139. 1974.
97.
Hackett, A. M.: The metabolism of flavonoid compounds in mammals. Prog. Clin. Biol. Res. 213. 177-194. 1986.
98.
Halliwell, B.: Free radicals and antioxidants: a personal view. Nutr. Rev. 52. 253-265. 1994.
99.
Hänsel, R.: Pflanzliche Cholagoga. Dtsch. Apoth. Ztg. 125. 1373-1378. 1985.
100. Hardigree. A. A., Epler, J. L: Comparative mutagenesis of plant flavonoids in microbial system. Mutat. Res. 58. 231-239. 1978. 101. Hatano, T., Kagawa, H., Yasuhara, T. és mtsa: Two new flavonoids and other constituents in licorice root: their relative astringency and radical scavenging effects. Chem. Pharm. Bull. 36. 2090-2097. 1988. 102. Heaney, R. K., Fenwick, G. R.: Glucosinolates in Brassica vegetables. Analysis of 22 varieties of Brussels sprouts (Brassica oleracea var gemmifera). J. Sci. Food Agric. 31. 785-793. 1980. 103. Hegazi, S. M., Ahmed, S. S., Mekkawy, A. A. és mtsai: Effect of zinc supplementation on serum glucose, insulin, glucagons, glucose-6-phosphatase, and mineral levels in diabetics. J. Clin. Biochem. Nutr. 12. 209-215. 1992. 104. Heide, L., Bögl, W.: The identification of irradiated food stuffs by luminescence measurement. Food Lab. Newslett. 5. 21. 1986. 105. Heller, B., Burkart, V., Lampeter, E. és mtsai: Antioxidant therapy for the prevention of type I diabetes. In: Antioxidants in disease mechanisms and therapy, Advances in pharmacology, (Ed.: Siess, H.) Academic Press, San Diego, Vol. 38. 628-637. 106. Herrman, K.: Flavonols and flavones in food plants: a review. J. Food Technol. 11. 433-448. 1976. 107. Herrman, K.: On the occurrence of flavonol and flavone glycosides in vegetables. Z. Lebensm.Unters. Forsch. 186. 1-5. 1988. 108. Hertog, M. G. L., Hollman, P. C. H., Katan, M. B.: Content of potentially anticarcinogenic flavonoids in 28 vegetables and 9 fruits commonly consumed in the Netherlands. J. Agric. Food Chem. 40. 2379-2383. 1992. 109. Hertog, M. G. L., Kromhout, D., Aravanis, C. és mtsai: Flavonoid intake and long term risk of coronary heart disease and cancer in the Seven Countries Study. Arch. Intern. Med. 155. 381-386. 1995. 110. Hertog, M. G. L., Sweetnam, P. M., Fehily, A. M. és mtsai: Antioxidant flavonols and ischemic heart disease in a Welsh population of men: the Caerphilly Study. Am. J. Clin. Nutr. 65. 14891494.1997.
134
111. Hertog, M. G. L:, Feskens, E. J. M., Hollman, P. C. és mtsai: Dietary antioxidant flavonoids and risk of coronary heart disease: the Zutphen elderly study. Lancet, 342. 1007-1011. 1993. 112. Hollman, P. C. H., de Vries, J. H. H., van de Leeuwen, S. D. és mtsai: Absorption of dietary quercetin glycosides and quercetin in healthy ileostomy volunteers. Am. J. Clin. Nutr. 62. 12761282. 1995. 113. Hollman, P. C. H.: Bioavailability of flavonoids. Eur. J. Clin. Nutr. 51. S66-69. 1997. 114. Howell, R. R., Wyngaarden, J. B.: On the mechanism of peroxidation of uric acids by hemoproteins. J. Biol. Chem. 235. 3544-3550. 1960. 115. Huang M-T., Ferraro, T.: Phenolic compounds in food and cancer prevention. In: Phenolic compounds in food and their effects on health II. ACS Symposium Series. 507. (Eds.: Huang, M-T., Ho, C., Lee, C. Y.), New York, pp. 8-34. 1992. 116. Imai, H., Wertessen, N. T., Subramanyan, V. és mtsai: Angiotoxicity of oxygenated sterols and possible precursors. Science, 237. 651. 1980. 117. Jain, S. K., McVie, R., Duett, J. és mtsa: Erythrocyte membrane lipid peroxidation and glycosylated hemoglobin in diabetes. Diabetes, 38. 1539-1543. 1989a. 118. Jain, S. K.: Hyperglycaemia can cause membrane lipid peroxidation and osmotic fragility in human red blood cells. J. Biol. Chem. 264. 21340-21345. 1989b. 119. Jain, S. K.: Molecular mechanisms of cellular lipid peroxidation in diabetes. In: In: Natural antioxidants and anticarcinogens in nutrition, health and disease. (Eds.: Kumpulainen, J. T., Salonen, J. T.) The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK, pp. 69-73. 1999. 120. Jakobey, H., Habegger, R., Fritz, D.: Gemüse als Arzneipflanze. Sekundere Pflanzenstoffe im Gemüse mit Bedeutung für die menschliche Gesundheit. 2. Mitteilung: Gemüse aus der Familie der Brassicaceae und der Familie der Apiacae. Ernährungs-Umschau. 35. 275-279. 1988. 121. Jansman, A. J. M., Enting, H., Verstegen, M. W. A. és mtsa: Effect of condensed tannins in hulls of faba beans (Vicia faba L.) on the activities of trypsin (EC 2.4.21.4) and chymotrypsin (EC 2.4.21.1) in digesta collected from the small intestine of pigs. Br. J. Nutr. 71. 627-641. 1994. 122. Jansson, J., Schenkman, J. B.: Studies on three microsomal electron transfer system. (Specificity of electron flow pathways) Arch. Biochem. Biophys. 178. 89-107. 1977. 123. Jennings, P. E., Chirico, S., Jones, A. F. és mtsai: Vitamin C metabolites and microangiopathy in diabetes mellitus. Diabetes. Res. 6. 151-154. 1987. 124. Johji, Y., Keizo, M., Takeshi, C. és mtsai: Cholagogic effect of Ginger and its active constituents. J. Ethnopharmacol. 13. 217-225. 1985. 125. Jordan, R. A., Schenkman, J. B.: Relationship between malondialdehyde production and arachidonate consumption during NADPH-supported microsomal lipid peroxidation. Biochem. Pharmacol. 31. 1393-1400. 1982. 126. Kajanachumpol, S., Komindr, S., Mahaisiriyodom, A.: Plasma lipid peroxide and antioxidant levels in diabetic patients. J. Med. Assoc. Thai. 80. 372-377. 1997. 127. Kandaswami, C., Middleton, E.: Free radical scavenging and antioxidant activity of plant flavonoids. Adv. Exp. Med. Biol. 366. 351-376. 1994.
135
128. Kaneto, H., Kajimoto, Y., Miyagawa, J. és mtsai: Beneficial effects of antioxidants in diabetes: possible protection of pancreatic beta-cells against glucose toxicity. Diabetes, 48. 2398-2406. 1999. 129. Katengwa, S., Polla, B. S.: Flavonoids, but not protein kinase C inhibitors, prevent stress protein synthesis during erythrophagocytosis. Biochem. Biophys. Res. Comm. 180. 308-314. 1991. 130. Keli, S. O., Hertog, M. G. L., Feskens, E. J. M. és mtsa: Dietary flavonoids, antioxidant vitamins, and incidence of stroke: the Zutphen study. Arch. Int. Med. 156. 637-642. 1996. 131. Kellis, J. T., Vickery, L. E.: Inhibition of human estrogen synthetase (aromatase) by flavones. Science, 225. 1032-34. 1984. 132. Kellog, E. W., Fridovich, I.: Superoxide, hydrogen peroxide and singlet oxygen in lipid peroxidation by a xanthine oxidase system. J. Biol. Chem. 250. 8812-8817. 1975. 133. Kertészné Lebovics V., Gaál Ö.: A koleszterin oxidációs származékainak keletkezése és biológiai hatásai. Orvosképzés, 67. 269-276. 1992. 134. Kéry, Á., Blázovics, A.: Növényi antioxidánsok és jelentőségük a fitoterápiás készítményekben. Fitoterápia, 1. 21-26. 1995. 135. Keshavarzian, A., Dunne, M., Iber, F. L.: Gallbladder volume and emptying in insulin-requiring male diabetics. Dig. Dis. Sci. 32. 824-828. 1987. 136. Kies, C., Umoren, J.: Inhibitors of copper bioutilization: fiber, lead, phytate, and tannins. Adv. Exp. Med. Biol. 258. 81-93. 1989. 137. Kimura, Y. Okuda, H., Arichi, S.: Effects of stilbenes on arachidonate metabolism in leukocytes. Biochem. Biophys. Acta, 834. 275-278. 1985. 138. Kimura, Y., Okuda, T., Okuda, H.: Effects of flavonoids from licorice roots (Glycyrrhiza inflata Bat.) on arachidonic acid metabolism and aggregation in human platelets. Phytother. Res. 7. 341347. 1993. 139. Kjaer, A., Skrydstrup, T.: Selenoglucosinolates synthesis and enzymatic hydrolysis. Acta Chem. Scand. B41. 29-33. 1987. 140. Klatsky, A. L., Armstrong, M. A.: Alcoholic beverage choice and risk of coronary artery disease mortality. Do the red wine drinkers fare best? Am. J. Cardiol. 71. 467-469. 1993. 141. Knekt, P., Järvinen, R., Reunanen, A. és mtsa: Flavonoid intake and coronary mortality in Finland: a cohort study. Br. Med. J. 312. 478-481. 1996. 142. Kore, A. M., Jeffery, E. H., Wallig, M. A.: Effects of 1-isothiocyanato-3-(methylsulfinyl)-propane on xenobiotic metabolizing enzymes in rats. Food Chem. Tox. 31. 723-729. 1993. 143. Krámerné Falus Magda: Karotin meghatározása élelmiszerekben. In: Vitamin-meghatározási eljárások természetes anyagokban. (Szerk.: Szántóné Németh Éva), Magyar Élelmezésipari Tudományos Egyesület Vitamin Munkabizottság, Budapest, 22-26. 1977. 144. Kumpulainen, J. T., Lehtonen, M., Mattila, P.: Trolox equivalent antioxidant capacity of average flavonoids intake in Finland. In: Natural antioxidants and anticarcinogens in nutrition, health and disease. (Eds.: Kumpulainen, J. T., Salonen, J. T.), The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK, 141-150. 1999.
136
145. Kuppusamy, U. R., Khoo, H. E., Das, N. P.: Structure-activity studies of flavonoids as inhibitors of hyaluronidase. Biochem. Pharmacol. 40. 397-401. 1990. 146. Kuntz, S., Wenzel, U., Daniel, H.: Comparative analysis of the effects of flavonoids on proliferation, cytotoxicity and apoptosis in human colon cancer cell lines. Eur. J. Nutr. 38. 133-143. 1999. 147. Kühnau, J.: The flavonoids: a class of semi-essential food components: Their role in human nutrition. World Rev. Nutr. Diet. 24. 117-120. 1976 148. Laughton, M. J., Evans, P. J., Moroney, M. A. és mtsai: Inhibition of mammalian 5-lipoxygenase and cyclooxygenase by flavonoids and phenolic dietary additives: relationship to antioxidant activity and to iron-reducing ability. Biochem. Pharmacol. 42. 1673-1681. 1991. 149. Laughton, M. J., Halliwell, B., Evans, P. J. és mtsa: Antioxidant and pro-oxidant actions of the plant phenolics quercetin, gossypol, and myricetin. Effects on lipid peroxidation, hydroxyl radical generation and bleomycin-dependent damage to DNA. Biochem. Pharmacol. 38. 2859-2865. 1989. 150. Lavy, A., Fuhrman, B., Markel, A. és mtsai: Effect of dietary supplementation of red or white wine on human blood chemistry, hematology and coagulation: favourable effect of red wine on plasma high-density lipoprotein. Ann. Nutr. Metab. 38. 287-294. 1994. 151. Lazzeri, L., Tacconi, R., Palmieri, S.: In vitro activity of some glucosinolates and their reaction products toward a population of the nematode Heterodera schachtii. J. Agric. Food Chem. 41. 825829. 1993. 152. Lee, S. H., Jeong, T. S., Park, Y. B. és mtsai: Hypocholesterolemic effect of hesperetin mediated by inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase and acyl coenzyme A : cholesterol acyltransferase in rats fed high-cholesterol diet. Nutr. Res. 19. 1245-1258. 1999. 153. Lebovics, V. K., Antal, M., Gaál, Ö.: Enzymatic determination of cholesterol oxides. J. Sci. Agric. 71. 22-26. 1996. 154. Lefebvre, P. J., Paolisso, G., Scheen, A. J.: Magnesium and carbohydrate metabolism. Therapie, 49. 1-7. 1994. 155. Leth, T., Justesen, U.: Analysis of flavonoids in fruits, vegetables and beverages by HPLC-UV method and LC-MS and estimation of the total daily flavonoid intake in Denmark. In: Polyphenols in food. (Eds.: Amado, R., Andersson, H., Bardócz, S., Serra, F.) EU, pp. 39-40. 1998. 156. Lieber, C. S.: Ethanol metabolism, cirrhosis, and alcoholism. Clin. Chim. Acta. 257. 59-84. 1997. 157. Lina, B. A. R., Dreef-van der Meulen, H. C., Leegwater, D. C.: Subchronic (13-week) oral toxicity of neohesperidin dihydrochalcone in rats. Food Chem. Tox. 28. 507-513. 1990. 158. Ling, W. H., Jones, P. J. H.: Dietary phytosterols: A review of metabolism, benefits and side effects. Life Sci. 57. 195-206. 1995. 159. Liu, C. S., Song, Y. S., Zhang, K. J. és mtsai: Gas chromatographic/mass spectrophotometric profiling of luteolin and its metabolites in rat urine and bile. J. Pharm. Biomed. Anal. 13. 14091414. 1995. 160. Loft, S., Otte, J., Poulsen, H. E. és mtsa: Influence of intact and myrosinase-treated indolyl glucosinolates on the metabolism in vivo of metronidazole and antipyrine in the rat. Food Chem. Tox. 30. 927-935. 1992.
137
161. Low, P. A., Nickander, K. K., Trischler, H. J.: The roles of oxidative stress and antioxidant treatment diabetic neuropathy. Diabetes, 46. S38-42. 1997. 162. Lowry, A. H., Rosenbrough, N. J., Farr, A. L. és mtsa: Protein measurement with the Folin-phenol reagents. J. Biol. Chem. 193. 265-275. 1951. 163. Lugasi, A., Blázovics, A., Fehér, E. és mtsai: Effect of lipid rich diet on free radical reactions of intestine in rats. Z. für Gastroenterol. 34. 321. 1996. 164. Lugasi, A., Blázovics, A., Kocsis, I. és mtsai: Black radish: a possible antioxidant in alimentary hyperlipidaemia. Z. Gastroenterol. 36. 433. 1998a. 165. Lugasi, A., Dworschák, E., Blázovics, A. és mtsa: Antioxidant and free radical scavenging properties of squeezed juice from black radish (Raphanus sativus L. var niger) root. Phytother. Res. 12. 502-506. 1998b. 166. Lugasi, A., Lebovics, V., Kocsis, I. és mtsai: Black radish juice modifies the cholesterol metabolism in animal experiment. Z. Gastroenterol. 37. 431. 1999. 167. Lugasi, A., Hóvári, J.: Flavonoid aglycons in foods of plant origin I. Vegetables. Acta Alim. 29. 345-352. 2000. 168. Lugasi A., Hóvári J., Bíró L.: Felmérés a növényi élelmiszerek flavonoid-tartalmáról és a lakosság egyes csoportjainak flavonoid-beviteléről. TAD, 5. 39. 2000. 169. Lutomski, J., Speichert, H.: Black radish as a source of various phytopharmaceuticals. Pharm. Unserer Zeit. 11. 151-155. 1982. 170. MacDonald, I. A., Bussard, R. G., Hutchinson, D. M. és mtsa: Rutin-induced beta-glucosidase activity in Streptococcus faecium VGH-1 and Streptocossus sp. strain FRP-17 isolated from human feces: formation of the mutagen, quercetin, from rutin. Appl. Environm. Microbiol. 47. 350-355. 1984. 171. MacDonald, I. A., Mader, J. A., Bussard, R. G.: The role of rutin and quercitrin in stimulating flavonol glycosidase activity by cultured cell-free microbial preparations of human feces and saliva. Mutat. Res. 122. 95-102. 1983. 172. Macek, K.: Szénhidrátok. In: A papírkromatográfia kézikönyve. Szerk.: Hais, I. M., Macek, K. Akadémiai Kiadó, Budapest, 284-324. 1961. 173. MacGregor, J. T., Jurd, L.: Mutagenicity of plant flavonoids: structural requirements for mutagenic activity in Salmonella typhimurium. Mutat. Res. 54. 297-309. 1978. 174. MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Manners, G. D. és mtsai: In vivo exposure to plant flavonols. Influence on frequencies of micronuclei in mouse erythrocytes and sister-chromatid exchange in rabbit lymphocytes. Mutat. Res. 124. 255-270. 1983. 175. Malterud, K. E., Oanh, D. H., Sund, R. B.: C-Methylated dihydrochalcones from Myrica gale L.: Effects as antioxidants and scavengers of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl. Pharmacol. Toxicol. 78. 111-116. 1996. 176. Manach, C., Morand, C., Demigné, C. és mtsai: Bioavailability of rutin and quercetin in rats. FEBS Letter, 409. 12-6. 1997.
138
177. Manach, C., Morand, C., Texier, O. és mtsai: Quercetin metabolites in plasma of rats fed diets containing rutin and quercetin. J. Nutr. 125. 1911-1922. 1995. 178. Manach, C., Regerat, F., Texier, O. és mtsai: Bioavailability, metabolism and physiological impact of 4-oxo-flavonoids. Nutr. Res. 16. 517-544. 1996. 179. Manach, C., Texier, O., Régérat, F. és mtsai: Dietary quercetin is recovered in rat plasma as conjugated derivatives of isorhamnetin and quercetin. J. Nutr. Biochem. 7. 375-380. 1996. 180. Markham, K. R.: Flavones, flavonols and their glycosides. Meth. Plant Biochem. 1. 197-235. 1989. 181. Masude, T., Isobe, J., Jitoe, A. és mtsa: Antioxidative curcuminoids from rhizomes of Curuma xanthorrhiza. Phytochemistry, 31. 3645-3647. 1992. 182. Maxwell, M., Cruickshank, A., Thorpe, G.: Red wine and antioxidant activity in serum. Lancet, 344. 193-194. 1994. 183. Mayer-Davis, E. J., Bell, R. A., Reboussin, B. A és mtsai: Antioxidant nutrients intake and diabetic retinopathy: the San Luis Valley Diabetes Study. Ophthalmology, 105. 2264-2270. 1998. 184. Mazzoni, G., Costa, G., Lepre, L. és mtsai: Cholelithiasis and diabetes. G. Chir. 16. 117-120. 1995. 185. McClure, J.: Physiology and functions of flavonoids. In: The flavonoids (Eds.: Harborne, J. B., Mabry, H.) London, Chapmam & Hall Publ., 970-1055. 1975. 186. McCord, J. M., Fridovich, I.: The reduction of cytochrome c by milk xanthine oxidase. J. Biol. Chem. 243. 5753-5760. 1968. 187. McNicol, A.: The effects of genistein on platelet function are due to thromboxane receptor antagonism rather than inhibition of tyrosine kinase. Prostagl. Leukotr. Essent. Fatty Acids. 48. 379-384. 1993. 188. Mehanso, H. Asquith, T. N., Butler, L. G. és mtsai: Tannin-mediated induction of proline-rich proteins in mammals. J. Agric. Food Chem. 40. 93-97. 1992. 189. Meltz, M. L., MacGregor, J.T.: Activity of the plant flavanol quercetin an the mouse lymphoma L5178Y TK+/- mutation, DNA single-strand break, and Balb/c 3T3 chemical transformation assays. Mutat. Res. 88. 317-324. 1981. 190. Middleton, E. J., Drzewieczki, G.: Flavonoid inhibition of human basophil histamine release stimulated by various agents. Biochem. Pharmacol. 33. 3333-3338. 1984. 191. Miller N. J., Rice-Evans C., Davies M.J. és mtsai: A novel method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant status in premature neonates. Clin. Sci. 84. 407-412. 1993. 192. Miniscalo, A., Lundahl, J., Regardh C. G. és mtsai: Inhibition of dihydropyridine metabolism in rat and human liver microsomes by flavonoids found in grapefruit juice. J. Pharcol. Exp. Ther. 261. 1195-99. 1992. 193. Missler S. R., Wasilchuk B. A., Merrit C.: Separation and identification of cholesterol oxidation products in dried egg separation. J. Food Sci. 50. 595-598. 1985. 194. Moghadasian, M. H., Nguyen, L. B., Shefer, S. és mtsai: Histologic, hematologic, and biochemical characteristics of apo E-deficient mice: Effects of dietary cholesterol and phytosterols. Lab. Invest. 79. 355-364. 1999.
139
195. Mole, S., Rogler, J. C., Buler, L. G.: Use of 15N-labeled protein to determine the effect of dietary tannin on the relative abundance of endogenous and dietary protein in feces. Proc. Group Polyphenols XVth Int. Conf. 1990. 196. Mora, A., Payá, M., Ríos, J. L. és mtsa: Structure-activity relationship of polymethoxyflavones and other flavonoids as inhibitors of non-enzymatic lipid peroxidation. Biochem. Pharmacol. 40. 793797. 1990. 197. Morazzoni, P., Magistretti, M. J.: Effects of Vaccinum myrtillus anthocyanosides on prostacyclinlike activity in rat arterial tissue. Fitoterapia, 57. 11-14. 1986. 198. Morel, I., Lescoat, G., Cogrel, P. és mtsai: Antioxidant and iron-chelating activities of the flavonoids catechin, quercetin, and diosmetin on iron-loaded rat hepatocyte culture. Biochem. Pharmacol. 45. 13-19. 1993. 199. Moroney, M. A., Alcaraz, M. J., Forder, R. A.: Selectivity of neutrophil 5-lipoxygenase and cyclooxygenase inhibition by an anti-inflammatory flavonoid glucoside and related aglycone flavonoids. J. Pharm. Pharmacol. 40. 787-792. 1988. 200. Morris, G. S., Hasten, D. L., Hegsted, M. és mtsa: Chromium picolinate supplementation improves cardiac metabolism, but not myosin isoenzyme distribution in the diabetic heart. J. Nutr. Biochem., 7. 617-622. 1996. 201. Mullarkey, C. J., Edelstein, D., Brownlee, M.: Free radical generation by early glycation products: a mechanism for accelerated atherogens in diabetes. Biochem. Biophys. Res. Comm. 173. 932-939. 1990. 202. Muramatsu, K., Fukuyu, M., Hara, Y.: Effect of green tea catechins on plasma cholesterol level in cholesterol-fed rats. J. Nutr. Sci. Vitaminol. 32. 613-622. 1986. 203. Muztar, A. J., Ahmad, P., Huque, T. és mtsa: A study of the chemical binding of allyl isothiocyanate with thyroxine and of the effect of allyl isothiocyanates on lipid metabolism in the rat. Can. J. Physiol. Pharmacol. 57. 385-389. 1979. 204. Muztar, A. J., Huque, T., Ahmad, P. és mtsa: Effect of allyl isothiocyanates on plasma and urinary concentration of some biochemical entities in the rat. Can. J. Physiol. Pharmacol. 57. 504-509. 1979. 205. Naegeli, T., Matis, P.: Die Bedeutung einiger Vitamine für die Behandlung der thromboembolie. Int. Z. Vitaminforsch. 27. 324-333. 1957. 206. Namiki, M.: Antioxidants/antimutagens in foods. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 4. 273-300. 1990. 207. Nastruzzi, C., Cortesi, R., Esposito, E. és mtsai: In vitro cytotoxic activity of some glucosinolatederived products generated by myrosinase hydrolysis. J. Agric. Food Chem. 44. 1014-1021. 1996. 208. Négre-Salvayre, A., Affany, A., Hariton, C. és mtsa: Additional antilipoperoxidant activities of alpha-tocopherol and ascorbic acid on membrane-like systems are potentiated by rutin. Pharmacology, 42. 262-265. 1991. 209. Négre-Salvayre, A., Salvayre, R.: Quercetin prevents cytotoxicity of oxidised low density lipoproteins by macrophages. Free Rad. Biol. Med. 12. 101-106. 1992.
140
210. Nielsen, S. E., Breiholt, V., Justesen, U. és mtsai: In vitro biotransformation of flavonoids by rat liver microsomes. Xenobiotica, 28. 389-401. 1998. 211. Normen, L., Johnsson, M., Andersson, H. és mtsai: Plant sterols in vegetables and fruits commonly consumed in Sweden. Eur. J. Nutr. 38. 84-89. 1999. 212. Ntanios, F. Y., Jones, P. J. H.: Biochim. Biophys. Acta Lipids Lipid Metab. 1390. 237-244. 1998. 213. Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K.: Assay for lipid peroxides in tissue by thiobarbituric acid reaction. Anal. Biochem. 39. 351-358. 1979. 214. Omura, T., Sato, R.: The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. J. Biol. Chem. 239. 2370-2378. 1964a. 215. Omura, T., Sato, R.: The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. J. Biol. Chem. 239. 2379-2385. 1964b. 216. Oyaizu, M.: Studies on products of browning reaction: Antioxidative activities of products of browning reaction prepared from glucosamine. Jpn. J. Nutr. 44. 307-315. 1986. 217. Pace-Asciak, C. R., Hahn, S., Diamandis, E P. és mtsai: The red wine phenolics trans-resveratrol and quercetin block human platelet aggregation and eicosanoid synthesis: implications for protection against coronary heart disease. Clin. Chim. Acta. 235. 207-219. 1995. 218. Pahlow, M. In: Heilpflanze heute. Grafe und Unzer GmbH, Munchen, 249. 1989. 219. Palmieri, S: Bioactivity of some glucosinoltes and their derived breakdown products obtained using immobilized myrosinase. In: Bioactive substances in food of plant origin. (Eds.: Kozlowska, H., Fornal, J., Zdunczyk, Z.) Polish Academy of Science, Olsztyn, 40-45. 1994. 220. Pamukcu, A. M., Yalciner, S., Hatcher, J. és mtsa: Quercetin, a rat intestinal and bladder carcinogen present in bracken fern (Pteridium aquilinum). Cancer Res. 40. 3468-3472. 1980. 221. Pearl, A., Hale, A., Whitehead, T.: Serum urate as a free radical scavenger in diabetics. J. Med. Syst. 17. 233-237. 1993. 222. Petri G.: Fitoterápia az orvosi gyakorlatban. Springer Orvosi Kiadó, Budapest, 1999. 223. Petri, G., Takách, G., Szőke, É.: Medicinal plants in liver therapy. In: Role of free radicals in biological systems. (Eds.: Fehér, J., Blázovics, A., Matkovics, B., Mézes, M.) Akadémiai Kiadó, Budapest, 173-181. 1993. 224. Pierpoint, W. S.: Flavonoids in the human diet. Prog. Clin. Biol. Res. 213. 125-140. 1986. 225. Platel, K., Srinivasan, K.: Influence of dietary spices on their active principles on digestive enzymes of small intestinal mucosa in rats. I. J. Food Sci. Nutr. 47. 55-60. 1996. 226. Player, T. J., Horton, A. A.: Enzymic lipid peroxidation in the liver microsomal fraction of rat brain. J. Neurochem. 37. 422-426. 1981. 227. Popovic, M., Lukic, V., Jakovlevic, V. és mtsa: The effect of the radish (Raphanus sativus ssp. niger) juice on liver function. Fitoterapia, 64. 229-231. 1993. 228. Popp, R., Schimmer, O.: Induction of sister-chromatid exchanges (SCE), polyploidity, and micronuclei by plant flavonoids in human lymphocyte cultures. A comparative study of 19 flavonoids. Mut. Res. 246. 205-213. 1991.
141
229. Preuss, H. G., Grojec, P. L., Lieberman, S. és mtsa: Effect of different chromium compounds on blood pressure and lipid peroxidation in spontaneously hypertensive rats. Clin. Nephrol. 47. 625330. 1997. 230. Pyles, I. A., Strejskal, J., Eizing, S.: Spectrophotometric measurement of plasma 2-thiobarbituric acid reactive substances in the presence of hemoglobin and bilirubin interference. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4. 407-419. 1993. 231. Rahman, A., Fazal, F., Greensill, J. és mtsai: Strand scission in DNA induced by dietary flavonoids: role of Cu(I) and oxygen free radicals and biological consequences of scission. Mol. Cell Biochem. 111. 3-9. 1992. 232. Ranganna, S., Govindarajan, V. S., Raman, K. V. R.: Citrus fruits. Part II. Chemistry, technology, and quality evaluation. B. Technol. CRC Crit. Rev. 19. 1-98. 1983. 233. Ravikumar, P., Anuradha, C. V.: Effect of fenugreek seeds on blood lipid peroxidation and antioxidants in diabetic rats. Phytother. Res. 13. 197-201. 1999. 234. Renaud, S. C., Beswick, A. D., Fehily, A. M. és mtsai: Alcohol and platelet aggregation: The Caerphilly prospective heart disease study. Am. J. Clin. Nutr. 55. 1012-1017. 1992a. 235. Renaud, S., de Lorgeril, M.: Wine, alcohol, platelets, and the French paradox for coronary heart disease. Lancet, 339. 1523-1526. 1992b. 236. Reviczky J.: A species cholagoga értékelése. Gyógyszerész doktori értekezés, Budapest, 1992. 237. Ricardo Da Silva, J. M., Rigaud, J., Cheynier, V. és mtsai: Procyanidin dimers and trimers from grape seeds. Phytochemistry, 30. 1259-1264. 1991. 238. Rice-Evans, C., Miller, N. J.: Total antioxidant status in plasma and body fluids. Meth. Enzymol. 234. 279-293. 1994. 239. Richard, J. L.: Coronary risk factors. The French paradox. Arch. Mal. Coeur. Vaiss. 80. 17-21. 1987. 240. Ritter, U.: Therapie mit Choleretika and Cholekinetika. Med. M. Pharm. 7. 99-104. 1984. 241. Robak, J., Gryglewski, R. J.: Flavonoids are scavengers of superoxide anions. Biochem. Pharmacol., 37. 837-841. 1988. 242. Rosa, A. S. E., Heaney, R. K., Portas, C. A. M. és mtsa: Changes in glucosinolate concentrations in Brassica crops (B. oleracea and B. napus) throughout growing season. J. Sci. Food Agric. 71. 237244. 1996. 243. Rosetti, L., Giaccari, A., Klein-Robbnhaar, E. és mtsa: Insulinomimetic properties of trace elements and characterization of their in vivo mode of action. Diabetes, 39. 1243-1250. 1990. 244. Rudy J. L., Ibarra, F., Zeigler M. és mtsai.: Simultaneous determination of retinol, retinyl palmitate, and α-tocopherol in serum or plasma by reversed-phase high performance liquid chromatography. LC-GC International, 3. 36. 1989. 245. Ruf, J. C., Berger, J. L., Renaud, S.: Platelet rebound effect of alcohol withdrawal and wine drinking in rats. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 15. 140-144. 1995. 246. Ruhl, C. E., Everhart, J. E.: Association of diabetes, serum insulin, and C-peptide with gallbladder disease. Hepatology, 31. 299-303. 2000.
142
247. Rusznyák, S., Szent-Györgyi, A.: Vitamin nature of flavones. Nature, 138. 798. 1936. 248. Sahu, R. K., Basu, R., Sharma, A.: Genetic toxicoligical effect of some plant flavonoids by the micronucleus test. Mutat. Res. 89. 69-74. 1981. 249. Sajithlal, G. B., Chitra, P., Chandrakasan, G.: Effect of curcumin on the advanced glycation and cross-linking of collagen in diabetic rats. Biochem. Pharmacol. 56. 1607-1614. 1998. 250. Salunkhe, D. K., Chavan, J. K., Kadam, S. S. (Eds): Dietary tannins: consequences and remedies. CRC Press, Boca Raton, 1990. 251. Sanhueza, J., Valdes, J., Campos R. és mtsai: Changes in the xanthie dehydrogenase/xanthine oxidase ratio in the rat kidney subjected to ischemia-reperfusion stress: preventive effect of some flavonoids. Res. Comm. Chem. Pathol. Pharmacol. 78. 211-218. 1992. 252. Sato, Y., Hotta, N., Sakamoto, N. és mtsai: Lipid peroxide level in plasma of diabetic patients. Biochem. Med. 21. 104-107. 1979. 253. Satoh, K.: Serum lipid peroxide in cerebrovacular disorders determined by a new colorimetric method. Clin. Chim. Acta. 90. 37-43. 1978. 254. Scambia, G., Ranelletti, F. O., Panici, P. B. és mtsai: Type-II estrogen binding sites in a lymphoblastoid cell line and growth inhibitory effect of estrogen, anti-estrogen and bioflavonoids. Int. J. Cancer. 46. 1112-1116. 1990. 255. Sedlak, I., Lindsay, R. H.: Estimation of total protein bond and non-protein sulfhydryl groups in tissue with Ellman′s reagent. Anal. Biochem. 25. 192-205. 1985 256. Seitz, H. K.: Genetic aspects od alcoholic liver disease, Folia Hepatol. 1. (3, 1S) 5. 1998. 257. Sevanian, A., McLeod, L. L.: Catalytic properties and inhibition of hepatic cholesterol epoxide hydrolase. J. Biol. Chem. 261. 54. 1986. 258. Shah, G. M., Bhattacharya, R. K.: Modulation by plant flavonoids and related phenolics of microseme catalyzed adduct formation between benzo(a)pirene and DNA. Chem. Biol. Interact. 59. 1-15. 1986. 259. Shahidi, F., Wanasundara, P. K.: Phenolic antioxidants. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 32. 67-103. 1992. 260. Shankhalili, Y., Finot, P. A., Hurrell, R. és mtsa: Effects of foods rich in polyphenols on nitrogen excretion in rats. J. Nutr. 120. 346-352. 1990. 261. Sharpe, P. C., McGrath, L. T., McClean, E. és mtsai: Effect of red wine consumption on lipoprotein(a) and other risk factors for atherosclerosis. QJM, 88. 101-108. 1995. 262. Shimada, K., Fujikawa, K., Yahara, K. és mtsa: Antioxidant properties of xanthan on the autoxidation of soybean oil in cyclodextrin emulsion. J. Agric. Food Chem. 40. 945-948. 1992. 263. Shimoi, K., Masuda, S., Furugori, és mtsai: Radioprotective effect of antioxidative flavonoids in ∆ray irradiated mice. Carcinogen. 15. 2669-72. 1994. 264. Shimoi, K., Okada, H., Kaneko, J. és mtsai: Bioavailability and antioxidant properties of luteolin. In: Natural antioxidants and anticarcinogens in nutrition, health and disease. (Eds.: Kumpulainen, J. T., Salonen, J. T.), The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK, pp. 166-173. 1999.
143
265. Singleton, V. L.: Flavonoids. In: Advances in food research. (Eds. Childester, C. O., Mrak, E. M., Stewart, G. F.) Vol. 27. pp. 149-242. New York, Academic Press, 1981. 266. Sipes, G., Gandolfi, A. J.: Biotransformation of toxicants. In: Cassarett & Doul′s Toxicology: The Basic Science of Poisons. (Eds: Klaassen, C. D., Amdur, M. D., Doul, J.), MacMillan, New York, p. 64. 1984. 267. Sipos, P., Gamal, E. M., Blázovics, A. és mtsai: Free radical reactions in the gallbladder. Acta Chirurg. Hung. 36. 329-330. 1997. 268. Small, D. M.: The formation of gallstones. Adv. Int. Med. 16. 243-264. 1970. 269. Smith L.L., Matthews W.S., Price J.C.: Thin-layer chromatographic examination of cholesterol autoxidation. J. Chrom. 27. 187-205. 1967. 270. Smith, L. L., Van Lier, J. E.: Sterol metabolism. 9,26-hydroxycholesterol levels in the human aorta. Atherosclerosis, 12. 1. 1970. 271. Somogyi, A., Szaleczky, E., Pusztai, P. és mtsai: A plazma antioxidánsai II. típusú cukorbetegekben. Magyar Belorvosi Archivum, 50. 187-192. 1997. 272. Soto, C. P., Perez, B. L., Favari, L. P. és mtsa: Prevention of alloxan-induced diabetes mellitus in the rat by silymarin. Comp. Biochem. Physiol. C. Pharmacol. Toxicol. Endocrinol. 119. 125-129. 1998. 273. Spinks, E. A., Sones, K., Fenwick, G. R.: The quantitative analysis of glucosinolates in Cruciferous vegetables, oilseeds, and forages using high-performance liquid chromatography. Fette, Seife, Anstrichm. 86. 228-231. 1984. 274. Staub, M.: A húgysav jelentősége az antioxidáns védelemben. Orv. Hetilap, 140. 275-279. 1990. 275. Stich, H. F., Karim, J., Koropatnick, J. és mtsa: Mutagenic action of ascorbic acid. Nature, 260. 722-724. 1976. 276. Stohr, H., Herrmann, K.: On the phenolic acids of vegetables. III. Hydrocinnamic acids and hydroxybenzoic acids of root vegetables. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 159. 218-224. 1975. 277. Sun, M., Zigman, S.: An improved spectrophotometric assay for superoxide dismutase based on epinephrine autoxidation. Anal. Biochem. 90. 81-89. 1978. 278. Szaleczky, E., Prechl, J., Ruzicska, É. és mtsai: Reduction of glycated hemoglobin levels by long term, high dose ascorbic acid supplementation in healthy and diabetic patients. Med. Sci. Monit. 4. 241-244. 1998. 279. Szász Gy.: Gyógyszerészeti Kémia, Medicina Könyvkiadó, Budapest, 1983. 280. Szentmihályi K., Then M., Lakatos B. és mtsai: Kálium-nátrium arány meghatározásának jelentősége a diureticus hatású gyógynövénykivonatok jellemzésében. Fitoterápia, 4. 7-12. 1999. 281. Szentmihályi K., Then M.: Ásványi elemek és a biológiailag aktív hatóanyagok a növényekben és kioldódásuk tanulmányozása (Fitoterápia – Diabetes mellitus). Olaj, Szappan, Kozmetika, 48. 173176. 1999. 282. Szollár, L.: A bor mint olyan..., TAD,1, 3742. 1995. 283. Taylor, C. B., Peng, S. K., Werthessen, N. T. és mtsa: Spontaneously occuring angiotoxicity derivatives of cholesterol. Am. J. Clin. Nutr. 32. 40. 1979.
144
284. Tebib, K., Besancon, P., Rouanet, J. M.: Dietary grape seed tannins affect lipoproteins, lipoprotein lipases, and tissue lipids in rats fed hypercholesterolemic diets. J. Nutr. 124. 2451-2457. 1994b. 285. Tebib, K., Bitri, L., Besancon, P. és mtsa: Polymeric grape seed tannins prevent plasma cholesterol changes in high-cholesterol-fed rats. Food Chem. 49. 403-406. 1994a. 286. Thiyagarajah, P., Kuttan, S. C., Lim, S. C. és mtsai: Effect of myricetin and other flavonoids on the liver plasma membrane Ca2+ pump kinetics and structure-function relationships. Biochem. Pharmacol. 41. 669-675. 1991. 287. Thompson, L. U., Yoon, J. H., Jenkins, D. J. A. és mtsai: Relationship between polyphenol intake and blood glucose response of normal and diabetic individuals. Am. J. Clin. Nutr. 39. 745-751. 1984. 288. Thompson, M., Williams, C. R.: Stability of flavonoid complexes of copper (II) and flavonoid antioxidant activity. Anal. Chim. Acta, 1976. 375-381. 1976. 289. Timberlake, C. F., Henry, B. S.: Anthocyanins as natural food colorants. Prog. Clin. Biol. Res. 280. 107-212. 1988. 290. Tookey, H. L., Van Etten, C, H., Daxenbichler, M. E.: Glucosinolates. In: Toxic constituents of plant foddstuff. (Ed.: Liener, I. E.), Academic Press, New York, 103-142. 1980. 291. Uda, Y., Kurata, T., Arakawa, N.: Effects of pH and ferrous ion on the degradation of glucosinolates by myrosinase. Agric. Biol. Chem. 50. 2735-2740. 1986. 292. Van het Hof. K. H., Kivits, G. A. A., Westtrate, J. A. és mtsa: Bioavailability of catechins from tea: the effect of milk. Eur. J. Clin. Nutr. 52. 356-359. 1998. 293. Vargas, R., Perez, R. M., Perez, S. és mtsai: Antiurolithiatic activity of Raphanus sativus aqueous extract on rats. J. Ethnopharmacol. 68. 335-338. 1999. 294. Varró A. B.: Gyógynövények gyógyhatásai.Black & White Kiadó, Budapest, 1991. 295. Vatassery, G. T., Morley, J. E., Kuskowski, M. A.: Vitamin E in plasma and platelets of human diabetic patients and control subjects. Am. J. Clin. Nutr. 37. 641-644. 1981. 296. Vedavanam, K., Srijayanta, S., O΄Reilly, J. és mtsai: Antioxidant action and potential antidiabetic properties of an isoflavonoids-containing soybean phytochemical extract (SPE). Phytother. Res. 13. 601-608. 1999. 297. Vernet, A., Siess, M. H.: Comparison of the effects of various flavonoids on ethoxy coumarin deethylase activity of rat intestinal and hepatic microsomes. Food Chem. Tox. 24. 857-861. 1986. 298. Vertommen, J., Enden, M., Simoens, L. és mtsa: Flavonoid treatment reduces glycation and lipid peroxidation in experimental diabetic rats. Phytother. Res., 8. 430-432. 1994. 299. Vijayalingam, S., Parthiban, A., Shanmugasundaram, K. R.. és mtsa: Abnormal antioxidant status in impaired glucose tolerance and non-insulin-dependent diabetes mellitus. Diabet. Med. 13. 715719. 1996. 300. Vinson, J. A., Hontz, B. A.: Phenol antioxidant index: Comparative antioxidant effectiveness of red and white wine. J. Agric. Food Chem. 43. 401-403. 1995a.
145
301. Vinson, J. A., Jang, J., Dabbagh, Y. A. és mtsai: Plant polyphenols exhibit lipoprotein-bound antioxidant activity using an in vitro oxidation model for heart disease. J. Agric. Food Chem. 43. 2798-2799. 1995b. 302. Vlassara, H.: Recent progress in advanced glycation products and diabetic complications. Diabetes, 46. S19-S25. 1997. 303. Vogel, G.: Natural substances with effects on the liver. In: New natural products and plant drugs with pharmacological, biological or therapeutical activity. (Eds.: Wagner, H., Wolff, P.), Springer, Berlin, pp. 244-265. 1977. 304. Wall, M. E.: Antimutagenic agents from natural products. J. Nat. Prod. 55. 1561-1568. 1992. 305. Watkins, T. R. (Ed): Wine. Nutritional and therapeutic benefits. ACS Symposium Series 661. Washington, 1997. 306. Wattenberg, L. W., Loub, W. D.: Inhibition of polycyclic aromatic hydrocarbon-induced neoplasia by naturally occuring indoles. Cancer Res. 38. 1410-1413. 1978. 307. Wattenberg, L. W.: Inhibition of carcinogenesis by minor dietary constituents. Cancer Res. 52. (Suppl.) 2085s-2091s. 1992. 308. Weiss, R. F.: Lehrbuch der Phytotherapie. 4. Auflage. Hippokrates-Verlag, Stuttgart, p. 125. 1985. 309. Whitehead, T. P., Robinson, D., Allaway, S. és mtsai: Effect of red wine ingestion on the antioxidant capacity of serum. Clin. Chem. 41. 32-35. 1995. 310. Willhite, C. C.: Teratogenic potential of quercetin in the rat. Food Chem. Toxicol. 20. 75-79. 1982. 311. Williamson, G.: Effect of food components on phase I (activating), and phase II (conjugating) and antioxidant enzymes. In: Bioactive substances in food of plant origin. (Eds.: Kozlowska, H., Fornal, J., Zdunczyk, Z.) Polish Academy of Science, Olsztyn, 360-370. 1994. 312. Wortelboer, H. M., De Kruif, C. A., Van Lersel, A. A. J. és mtsai: Effect of cooked brussel sprouts on cytochrome P450 profile and phase II enzymes in liver and small intestinal mucosa of the rat. Food Chem. Tox. 30. 17-27. 1992. 313. Wortelboer, H. M., van der Linden, E. C. M., de Kruif, C. A. és mtsai: Effects of indole-3-carbinol on biotransformation enzymes in the rat: in vivo changes in liver and small intestinal mucosa in comparison with primary hepatocyte cultures. Food Chem. Tox. 30. 589-599. 1992. 314. Yugarani, T., Tan, B. K. H., Das, N. P.: The effects of tannic acid on serum and liver lipids of RAIF and RICO rats fed on high fat diet. Comp. Biochem. Physiol. 104. 339-343. 1993. 315. Yuting, C., Rongliang, Z., Zhonghan, J., Yong, J.: Flavonoids as superoxide scavengers and antioxidants. Free Rad. Biol. Med. 9. 19-21. 1990.
146
PUBLIKÁCIÓK Eredeti közlemények 1.
Lugasi, A., Dworschák, E., Hóvári, J.: Free radical scavenging activity of methanolic extract of some culinary herbs. Acta Alim., 25. 227-236. 1996. (IF: 0.138)
2.
Blázovics, A., Kéry, Á., Fehér, E., Prónai, L., Gonsales-Cabello, R., Barta, I., Lugasi, A., Gergely, P., Fehér, J.: Natural antioxidants in liver therapy, Curr. Topics in Biophysics, 20. Suppl., 14-30. 1996.
3.
Lugasi, A., Blázovics, A., Kéry, Á., Dworschák, E.: A fekete retek (Raphanus sativus L. var. niger) in vitro antioxidáns és gyökfogó tulajdonságai, Táplálkozás Allergia Diéta, 2. 30-39. 1997.
4.
Lugasi, A., Blázovics, A., Dworschák, E., Fehér, J.: A vörös bor kardioprotektív hatásáról az irodalmi adatok tükrében, Orvosi Hetilap, 138. 11. 673-678. 1997.
5.
Lugasi, A., Dworschák, E., Blázovics, A., Kéry, Á.: Antioxidant and free radical scavenging properties of squeezed juice from black radish (Raphanus sativus L. var niger) root. Phytother. Res. 12. 502-506. 1998. (IF: 0.509)
6.
Lugasi, A., Dworschák, E., Almeida, D.: Chlorogenic acid content and antioxidant activity of potatoes grown with different fertiliser rates. Acta Alim. 28. (2.) 183-195. 1999. (IF: 0.400)
7.
Lugasi, A., Horvatovich, P., Dworschák, E.: Additional information to the in vitro antioxidant activity of Ginkgo biloba L. Phytother. Res. 13.160-162. 1999. (IF: 0.509)
8.
Blázovics A., Kovács, Á., Lugasi, A., Hagymási, K., Bíró, L., Fehér, J.: Antioxidant defence in erythrocytes and plasma of patients with active and quescent Crohn′s disease and ulcerative colitis: a chemiluminescence study. Clin. Chem.45. 895-896. 1999. (IF: 3.703)
9.
Dworschák E., Lugasi A., Blázovics A.: Antioxidáns vitaminok egészségvédő hatása az újabb emberi megfigyelések tükrében. Fitoterápia, 4. (1.) 3-6. 1999.
10. Lugasi A., Blázovics J., Fehér J.: Magyar vörösborok in vitro antioxidáns tulajdonságai. Orvosi Hetilap, 140. (37). 2050-2057. 1999. 11. Blázovics A., Kéry Á., Fehér E., Prónai L., Gonsalez-Cabello R., Barta I., Lugasi A., Petri G., Fehér J.: Természetes antioxidáns és szöveti regeneráció (Gyógyhatás és reakciómechanizmus). Sempervivum tectorum. Fitoterápia, 4. 72-79. 1999. 12. Lugasi A., Dworschák E., Hóvári J., Blázovics A., Kéry Á., Fejes Sz.: Növényi antioxidánsok vizsgálata in vitro rendszerekben. Fitoterápia, 4. 80-88. 1999. 13. Czinner É., Lemberkovics, É., Kéry Á., Hagymási K, Blázovics, A., Lugasi, A., Szőke, É.: Biologically active components of Helycrisum arenarium L. Eur. J. Drug Metab. Pharm. 24. (4.) 309-313. 1999. (IF: 0.567) 14. Hagymási, K., Blázovics, A., Lugasi, A., Kristo, T. Sz., Fehér, J., Kéry, Á.: In vitro antioxidant evaluation of dandelion (Taraxacum officinale Web.) water extract. Acta Alim. 29. 1-7. 2000. (IF: 0.400)
147
15. Fejes, Sz., Blázovics, A., Lugasi, A., Lemberkovics, É., Petri, G., Kéry, Á.: In vitro antioxidant activity of Anthriscus cerefolium L. (Hoffm.) extracts. J. Ethnopharmacol. 69. 259-265. 2000. (IF: 0.578) 16. Hagymási, K., Blázovics, A., Lugasi, A., Kristó, T. Sz., Kéry, Á., Fehér, J.: The in vitro effect of dandelion’s antioxidants on microsomal lipid peroxidation. Phytother. Res. 14. 43-44. 2000. (IF: 0.509) 17. Lugasi A.: A vörösborok feltételezett preventív hatása. Komplementer Medicina. 4. (6.) 10-14. 2000. 18. Lugasi A.: Élelmiszer eredetű flavonoidok potenciális egészségvédő hatása. Orvosi Hetilap, 141. (32.) 1751-1760. 2000. 19. Lugasi, A., Hóvári, J.: Flavonoid aglycons in foods of plant origin I. Vegetables. Acta Alim. 29. 345352. 2000. (IF: 0.117) 20. Blázovics, A., Lugasi, A., Kemény, T., Hagymási, K., Kéry, Á.: Membrane stabilising effects of natural polyphenols and flavonoids from Sempervivm tectorum on hepatic microsomal mixedfunction oxidase system in hyperlipidemic rats. J. of Ethnopharmacology, 73. 479-485. 2000. (IF: 0.687) 21. Lugasi A., Blázovics A., Kéry Á., Kocsis I., Kassai-Farkas S., Horváth T.: A fekete retek hatóanyagú Raphacol epegranulátum hatása cukorbetegek szérum paramétereire. Fitoterápia, (közlésre elfogadva), 2001. 22. Lugasi A., Blázovics A., Kéry Á., Kocsis I., Kassai-Farkas S., Horváth T.: A fekete retek hatóanyagú Raphacol epegranulátum hatása cukorbetegek lipidperoxidációs paramétereire. Fitoterápia, (közlésre elfogadva), 2001. Könyvfejezetek és konferencia kiadványok (Proceedings) 1.
Lugasi, A., Dworschák, E. and Hóvári, J.: Characterization of scavenging activity of natural polyphenols by chemiluminescence technique. In: Proceedings of the International EURO FOOD CHEM VIII Conference, Bécs, 639-643. 1995.
2.
Lugasi, A., Dworschák, E., Hóvári, J.: Antioxidant property of culinary herbs and medicinal plants. In: AGRI-FOOD QUALITY. An interdisciplinary approach. (Eds. Fenwick, G.R., Headley, C., Richards, R. L. and Khokhar, S.) The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK, 372-375. 1996.
3.
Lugasi A., Almeida D. P., Dworschák E.: Antioxidant and free radical scavenging activity of potato tubers. In: Polyphenols in Food, COST 916 Workshop (Eds.: Amado, R., Andersson, H., Bardócz, S., Serra, F.) EU (EUR 18169 EN), Luxemburg, 233-238. 1998.
4.
Lugasi, A., Hóvári, J., Gasztonyi, N. M., Dworschák, E.: Flavonoid content and antioxidant properties of broccoli. In: Natural antioxidants and anticarcinogens in Nutrition, Health and Disease. (Eds. Kumpulainen, J. T., Salonen, J. T.), The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK, 291295. 1999.
148
5.
Hóvári, J., Lugasi, A., Dworschák, E.: Examination of flavonoid content in Hungarian vegetables. In: Natural antioxidants and anticarcinogens in Nutrition, Health and Disease. (Eds. Kumpulainen, J. T., Salonen, J. T.), The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK, 296-298. 1999.
6.
Almeida, D., Rodrigues, P., Lugasi, A.: Antioxidant properties of rosemary. Proceedings of the 1st International Meeting of Aromatic and Medicinal Mediterranean Plants. Conimbriga, Portugal, 6570. 1999.
Folyóiratban megjelent konferencia anyagok 1.
Lugasi, A., Blázovics, A., Fehér, E., Szaleczky, E., Dworschák, E., Fehér, J.: Effect of lipid rich diet on free radical reactions of intestine in rats. Z. für Gastroenterologie, 34. 321. 1996. (IF: 0.632)
2.
Blázovics, A., Lugasi, A., Kéry, Á., Kemény, T., Fehér, J.: Membrane stabilizing effects of natural flavonoids and polyphenols from Sempervivum tectorum on hepatic microsomal P450 system in rats. Z. für Gastroenterologie, 34. 304. 1996. (IF: 0.632)
3.
Lugasi, A., Blázovics, A., Kéry, Á., Fehér, E., Szaleczky, E., Fehér, J.: Effect of flavonoids and polyphenols from Sempervivum tectorum on antioxidant status of liver and intestine of rats. J. Int. Gastro-Surgical Groups, pp. 39. 1996. (IF: 0.713)
4.
Lelbach Á., Lugasi A., Blázovics A., Fehér E., Fehér J.: Speciesfüggő antioxidáns védelem emlősök jejunumában. Magyar Belorvosi Archivum, XLIX. Suppl. 173. 1996.
5.
Dworschák E., Lugasi A., Hóvári J., Gergely A., Barna É., Czuczy P.: Chances for health-protective foods in Hungary. Acta Alim., 26. 79-80. 1997. (IF: 0.138)
6.
Lugasi A., Dworschák E., Hóvári J.: Antioxidant and free radical scavenging properties of polyphenolic compounds of plant origin. Acta Alim., 26. 71. 1997. (IF: 0.138)
7.
Lugasi, A., Blázovics, A., Dworschák, E., Kéry, Á., Fehér, J.: Natural antioxidants strengthen antioxidant defense system in steatotic liver: a chemiluminescence study. Z. für Gastroenterologie, 35. 5. 388. 1997. (IF: 0.632)
8.
Blázovics, A., Lugasi, A., Kaján, A., Bárkovics, S., Fehér, J.: Chemiluminescent measurement for the study of tissue antioxidant state in rats. Z. für Gastroenterologie, 35. 5. 370. 1997. (IF: 0.632)
9.
Lugasi, A., Blázovics, A., Kocsis, I., Kéry, Á., Dworschák, E., Fehér, J.: Black radish: A possible antioxidant in alimentary hyperlipidaemia. Z. für Gastroenterologie, 36. 5. 433. 1998. (IF: 0.890)
10. Lugasi A., Blázovics A., Fehér J.: In vitro antioxidant activity of selected Hungarian red wines. Folia Hepatol. (3.) Suppl 1.26. 1998. 11. Hagymási K., Kocsis I., Lugasi A., Bárkovics S., Fehér J., Blázovics A.: Chemiluminescence study in experimental cholestasis. Z. für Gastroenterologie, 37. 420. 1999. (IF. 1.020) 12. Lugasi A., Lebovics V.K., Kocsis I., Hagymási K., Blázovics A.: Black radish juice modifies the cholesterol metabolism in animal experiment. Z. für Gastroenterologie, 37. 431. 1999. (IF: 1.020)
149
13. Blázovics, A., Kéry, Á., Lugasi, A., Gonzales-Cabello, R., Hagymási, K., Fehér, E., Fehér, J., Petri, G.: Natural antioxidantd and tissue regeneration (Curative effect and reaction mechanism). Fundamental Clin. Pharmacol. 13. (Suppl. 1.) 342. 1999. (IF: 1.226) 14. Lugasi A., Hóvári J., Bíró L.: Felmérés a növényi élelmiszerek flavonoid-tartalmáról és a lakosság egyes csoportjainak flavonoid-beviteléről. Táplálkozás Allergia Diéta, 5. 39. 2000. Előadások és poszterek külföldi és nemzetközi részvételű konferenciákon 1.
Lugasi, A., Dworschák, E. and Hóvári, J.: Antioxidant property of culinary herbs and medicinal plants. AGRI-FOOD Quality,95 Conference, Norwich, UK, 1995.
2.
Lugasi, A., Dworschák, E. and Hóvári, J.: Culinary herbs and medicinal plants: natural sources of antioxidants. Summer Meeting of ISFRR, Budapest, 1995.
3.
Lugasi, A., Dworschák, E. and Hóvári J.: Antioxidant effect of polyphenolic compounds of culinary herbs and medicinal plants. 9th World Conference of Food Science and Technology, Budapest, 1995.
4.
Lugasi, A., Dworschák, E. and Hóvári, J.: Characterization of scavenging activity of natural polyphenols by chemiluminescence technique. International EURO FOOD CHEM VIII Conference, Bécs, 1995.
5.
Lugasi, A., Blázovics, A., Kéry, Á., Fehér, E., Szaleczky, E., Fehér, J.: Effect of flavonoids and polyphenols from Sempervivum tectorum on antioxidant status of liver and intestine of rats. 7th World Congress of the International Gastro-Surgical Club, Budapest, 1996.
6.
Lugasi, A., Lelbach, Á., Blázovics, A., Kéry, Á., Dworschák, E., Fehér, J.: In vitro and in vivo antioxidant activity of natural flavonoids and polyphenols from Sempervivum tectorum. AustrianHungrian-Slovakian FALK Symposium, Bratislava, 1996.
7.
Lugasi, A., Blázovics, A., Kéry, Á., Lelbach, Á., Dworschák, E., Fehér, E., Fehér, J.: In vitro and in vivo antioxidant and free radical scavenging activity of black radish (Raphanus sativus L. var. niger). VIII Biennal Meeting of ISFRR, Barcelona, 1996.
8.
Lugasi, A., Almeida, D. A., Dworschák, E.: Antioxidant and free radical scavenging activity of potatoes from different varieties. COST 916 Workshop, Aberdeen, UK, 1997.
9.
Kéry, Á., Blázovics, A., Fejes, Sz., Lugasi, A.: Antioxidant activity of some medicinal plants used in gastrointestinal disorders. Second International Symposium on Natural Drugs. Maratea, Italy, 1997.
10. Almeida, D., Rodrigues, P., Lugasi, A.: Antioxidant properties of rosemary. 1st Int. Meeting of Aromatic and Medicinal Mediterranean Plants, Conimbriga, Portugal, 1998. 11. Lugasi, A., Hóvári, J., Gasztonyi, M., Dworschák, E.: Flavonoid content and in vitro antioxidant properties of broccoli. 2nd International Conference on Natural Antioxidants and Anticarcinogens in Nutrition, Health and Disease, Helsinki, Finland, 1998.
150
12. Hóvári, J., Lugasi, A., Dworschák, E.: Examination of flavonoid content in vegetables in Hungary. 2nd International Conference on Natural Antioxidants and Anticarcinogens in Nutrition, Health and Disease, Helsinki, Finland, 1998. 13. Lugasi, A., Blázovics, A., Hagymási, K., Kocsis, I., Kéry, Á., Dworschák, E., Fehér, J.: Beneficial effect of squeezed juice from balck radish (Rapahnus sativus L. var. niger) in alimentary hyperlipidaemia in rats. 2nd International Conference on Natural Antioxidants and Anticarcinogens in Nutrition, Health and Disease, Helsinki, Finland, 1998. 14. Lugasi A., Blázovics A., Fehér J.: In vitro antioxidant activity of selected Hungarian red wines. Austrian-Hungarian-Slovakian FALK Symposium, Budapest, 1998. 15. Lugasi, A., Blázovics, A., Fehér, J.: Antioxidant activity of selected Hungarian red wines in different chemical systems. 1st Congress of ISoP, Budapest, 1998. 16. Hóvári, J., Lugasi, A., Bíró, L., Sági, K., Zajkás, G., Dworschák, E.: Analysis of potentially anticarcinogenic flavonoids in vegetables and estimation of the daily flavonoid intake in some groups of Hungarian population: a preliminary study. 1st Congress of ISoP, Budapest, 1998. 17. Nemetz, A., Lugasi, A., Bíró, L., Kovács, Á., Fehér, J., Blázovics, A.: Effect of scavenger therapy on free radical and antioxidant balance in inflammatory bowel disease. 1st Congress of ISoP, Budapest, 1998. 18. Blázovics, A., Kovács, Á., Hagymási, K., Lugasi, A., Bíró, L., Fehér, J.: Plasma and erythrocyte total scavenger capacity as possible predictive factors in inflammatory bowel disease. 1st Congress of ISoP, Budapest, 1998. 19. Lugasi, A., Blázovics, A., Kassai-Farkas S., Kéry, Á., Horváth T.: Primary prevention of gallstone formation. Effect of Raphacol bile-granule on lipid peroxidation characteristics in diabetic patients. FALK Workshop, London, 1999. 20. Blázovics, A., Kéry, Á., Lugasi, A., Gonzalez-Cabello, R., Hagymási, K., Fehér, E., Fehér, J., Petri, G.: Natural antioxidants and tissue regeneration (Curative effects and reaction mechanisms). 2nd Eur. Congress of Pharmacology, Budapest, 1999. 21. Kocsis, I., Lugasi, A., Hagymási, K., Bárkovics, S., Fehér, J., Blázovics, A.: Liver protecting effect of black radish extract (Raphanus sativus L. var. niger): chemiluminescence and biochemical measurements. Summer Meeting of ISFRR, Drezda, 1999. 22. Szentmihályi, K., Lugasi, A., Blázovics, A., Kocsis, I., Kéry, Á., Vinkler, P.: Effect of black radish (Raphanus sativus L. var. niger) root extract to essential metal ion concentration of rat liver. Summer Meeting of ISFRR, Drezda, 1999. 23. Lugasi, A., Blázovics, A., Kassai-Farkas, S., Kéry, Á., Horváth, T.: Possible prevention of gallstone formation: effect of Raphacol bile-granule on lipid peroxidation characteristics in diabetic patients. Summer Meeting of ISFRR, Drezda, 1999. 24. Lugasi A.: In vitro antioxidant activity of selected Hungarian red wines. COST 916 Action, Róma, 2000.
151
25. Hóvári, J., Lugasi, A.: Flavonols and flavones in uncommon plant foods. COST 916 Action, Róma, 2000. 26. Blázovics A., Kovács Á., Lugasi A., Hagymási K., Bíró L., Fehér J.: Total scavenging capacity of erythrocytes and plasma is a good predictive factor in inflammatory bowel diseases. 5th Symposium of Free Radicals in Biology and Medicine, Lodz, 2000. 27. Szentmihályi K., Blázovics A., Lugasi A., Kéry Á., Vinkler P.: Effect of natural polyphenolic type antioxidants (Sempervivum tectorum L and Raphanus sativus L. var niger extracts) on metal ion concentration in rat bile fluid. 5th Symposium of Free Radicals in Biology and Medicine, Lodz, 2000. 28. Lugasi, A.: In vitro antioxidant properties of juices from fruits and vegetables produced with and without chemicals. COST 916 Action, Gozd Martuljek, Slovenia, 2000. 29. Szentmihályi, K., Blázovics, A., Kéry, Á., Lugasi, A., Vinkler, P.: Antioxidant activity of Sempervivum tectorum and Raphanus sativus extracts in vitro and in vivo. 10th Biennal Meeting of ISFRR, Kyoto, Japán, 2000. 30. Blázovics, A., Szilvás, Á., Lugasi, A., Hagymási, K., Dinya, E., Bíró, L., Kovács, Á.: Plasma and erythrocyte total scavenger capacity in gastrointestinal diseases and measuring techniques applying chemiluminescence. 10th Biennal Meeting of ISFRR, Kyoto, Japán, 2000. 31. Lugasi, A., Blázovics, A., Hagymási, K., Jakóczi, I.: Application of a natural antioxidant as food ingredient. 10th Biennal Meeting of ISFRR, Kyoto, Japán, 2000. Előadások és poszterek hazai konferenciákon és rendezvényeken 1.
Lugasi, A., Dworschák, E., Hóvári, J.: Növényi eredetű fenolos komponensek antioxidáns és gyökfogó tulajdonságai. XI. Élelemiszertudományi Konferencia, Budapest, 1996.
2.
Lugasi, A., Blázovics, A., Fehér, E., Szaleczky, E., Dworschák, E., Fehér, J.: Effect of lipid rich diet on free radical rections of intestine in rats. A MGT 38. Nagygyűlése, Balatonaliga, 1996.
3.
Blázovics, A., Lugasi, A., Kéry, Á., Kemény, T., Fehér, J.: Membrane stabilizing effects of natural flavonoids from Sempervivum tectorum on hepatic microsomal P450 system in rats. A MGT 38. Nagygyűlése, Balatonaliga, 1996.
4.
Lugasi, A., Dworschák, E., Kéry, Á., Blázovics A., Hóvári, J.: A fekete retek (Raphanus sativus L. var. niger) antioxidáns és gyökfogó tulajdonságai. MTT XXI. Vándorgyűlése, Sopron, 1996.
5.
Lelbach Á., Lugasi A., Blázovics A., Fehér E., Fehér J.: Species függő antioxidáns védelem emlősök jejunumában, Magyar Belgyógyász Társaság Konferenciája, Budapest, 1996.
6.
Dworschák E., Lugasi A., Blázovics A.: Antioxidánsok hatása in vitro és emberi megfigyelésekben. Pécsi Fitoterápiás Napok, Pécs, 1997.
7.
Lugasi A., Dworschák E., Blázovics A., Fejes Sz., Hóvári J.: Növényi antioxidánsok vizsgálata in vitro rendszerekben. Pécsi Fitoterápiás Napok, Pécs, 1997.
152
8.
Lugasi, A., Blázovics, A., Dworschák, E., Kéry, Á., Fehér, J.: Natural antioxidants strengthen antioxidant defense system in steatotic liver: a chemiluminescence study. MGT 39. Nagygyűlése, Balatonaliga, 1997.
9.
Blázovics, A., Lugasi, A., Kaján, A., Bárkovics, S., Fehér, J.: Chemiluminescent measurement for the study of tissue antioxidant state in rats. MGT 39. Nagygyűlése, Balatonaliga, 1997.
10. Dworschák E., Lugasi A., Blázovics A.: Antioxidáns vitaminok hatása in vitro és emberi megfigyelésekben. MTT XXII Vándorgyűlése, Gyula, 1997. 11. Lugasi A.: Növényi élelmiszerek antioxidáns tulajdonságai és szerepük az egészségmegőrzésben. “Pro Hygiéne” Alapítvány Tudományos Űlése, Budapest, 1997. 12. Hagymási K., Lugasi A., Kéry Á., Fehér J., Blázovics A.: Fitoterapeutikumok in vitro antioxidáns összehasonlító vizsgálata. “A természetes környezet és az ember” II. Országos Konferencia, Budapest, 1998. 13. Lugasi, A., Hóvári, J., Horvathovich, P., Dworschák, E.: Ginkgo biloba: egy hatékony antioxidáns. Pécsi Fitoterápiás Napok, Pécs, 1998. 14. Nemetz, A., Lugasi, A., Bíró, L., Kovács, Á., Blázovics, A.: Szabad gyök - antioxidáns egyensúly gyulladásos bélbetegségekben. XXVIII. Membrántranszport konferencia, Sümeg, 1998. 15. Blázovics, A., Lugasi, A., Hagymási, K., Kovács, Á.: Kemilumineszcencia kísérletes és klinikai vonatkozásai. XXVIII. Membrántranszport konferencia, Sümeg, 1998. 16. Lugasi, A., Blázovics, A., Kocsis, I., Kéry, Á., Dworschák, E.: Black radish: A possible antioxidant in alimentary hyperlipidaemia. MGT 40. Nagygyűlése, Balatonaliga, 1998. 17. Lugasi A., Blázovics A., Hagymási K., Fehér J.: Vörösbor antioxidáns tulajdonságainak vizsgálata kémiai rendszerekben. MTA Flavonoidkémiai Munkabizottság Tudományos Ülés, Debrecen, 1998. 18. Lugasi A., Dworschák E.: Vörösborok antioxidáns tulajdonságai. MTT XXIII. Vándorgyűlése, Pécs, 1998. 19. Blázovics A., Kovács Á., Lugasi A., Hagymási K., Bíró L., Bárkovits S., Fehér J.: Antioxidáns státusz vizsgálata ulcerativ colitisben és Crohn betegségben. “A szabad gyök kutatás aktuális kérdései” Konferencia, Budapest, 1999. 20. Hagymási K., Kocsis I., Lugasi A., Bárkovics S., Fehér J., Blázovics A.: Chemiluminescence study in experimental cholestasis. MGT 41. Nagygyűlése, Balatonaliga, 1999. 21. Lugasi A., Lebovics V.K., Kocsis I., Hagymási K., Blázovics A.: Black radish juice modifies the cholesterol metabolism in animal experiment. MGT 41. Nagygyűlése, Balatonaliga, 1999. 22. Lugasi A.: Növényi antioxidánsok tanulmányozása tekintettel a szabad gyökös reakciókkal kapcsolatba hozható egyes megbetegedések prevenciójában és regressziójában betöltött szerepükre. SOTE 7. Ph.D. Program Tudományos Nyílt Nap, Budapest, 1999. 23. Lugasi A., Kéry Á., Horváth T., Blázovics A.: A fekete retek kivonatot tartalmazó epegranulátum antioxidáns hatása in vitro és in vivo vizsgálatokban. “Tapasztalatok a gyógynövények és fitoterápiás készítmények gyakorlati felhasználásáról” Konferencia, Budapest, 2000.
153
24. Blázovics A., Lugasi A., Hagymási K., Rapavi E., Győry H., Kéry Á.: Természetes eredetű hatóanyagok jelentősége a primér prevencióban, az életminőség javításában. “Tapasztalatok a gyógynövények és fitoterápiás készítmények gyakorlati felhasználásáról” Konferencia, Budapest, 2000. 25. Lugasi A., Blázovics A., Kassai-Farkas S., Kéry Á., Horváth T.: Effect of Raphacol bile-granule on lipid peroxidation characteristics in diabetic patients. MGT 42. Nagygyűlése, Balatonaliga, 2000. 26. Sipos P., Hagymási K., Lugasi A., Blázovics A.: How can bile influence the red-ox state of colonic mucosa in hyperlipidemy. MGT 42. Nagygyűlése, Balatonaliga, 2000. 27. Lugasi A., Hóvári J., Bíró L.: Felmérés a növényi élelmiszerek flavonoidtartalmáról és a lakosság egyes csoportjainak flavonoidbeviteléről. MTT XXV. Vándorgyűlése, Szolnok, 2000.
154
TÉZISEK Ph. D. Doktori értekezés Élelmiszer eredetű antioxidánsok hatása primer és szekunder prevencióban: Állatkísérletes és humán tanulmányok Készítette: dr. Lugasi Andrea Programvezető: Prof. Dr. Fehér János Témavezető: Dr. Blázovics Anna Készült a Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, 7. Ph.D. programjában Összefoglaló Napjainkban számos laboratóriumi és epidemiológiai vizsgálat eredménye támasztja alá különböző növényi hatóanyagok szerepét a legtöbb, táplálkozással összefüggő megbetegedés prevenciójában. Ezért a szabad gyökös reakciókkal összefüggésbe hozható megbetegedések megelőzésének lehetőségét szem előtt tartva a vizsgálatok során egy komplex vizsgálati rendszerben néhány növényi eredetu élelmiszer kémiaibiokémiai
tulajdonságainak
tanulmányozása
történt.
Antioxidáns
hatású
vegyületek,
úgymint
aszkorbinsav, tokoferolok, karotinoidok és polifenolos komponensek, valamint makro- és mikroelemek jelenlétét sikerült igazolni a fekete retek gyökeréből kinyert préslében. A készítmény komplex in vitro vizsgálati
rendszerben
széleskörű
antioxidáns
tulajdonságokat
-hidrogén-donor
aktivitást,
redukálóképességet, komplexképző és szabad gyök befogó aktivitást - mutatott. Ugyanezen vizsgálati rendszerben különböző bortermelő vidékekről származó fehér- és vörösborok, valamint szőlőlevek is antioxidáns hatásúnak bizonyultak. Az antioxidáns tulajdonságok, valamint a vizsgált borok és szőlőlevek összes polifenoltartalma között szoros szignifikáns korreláció volt kimutatható. Állatkísérletes vizsgálatokban, étrendi úton előidézett hyperlipidaemiában a fekete retek préslé kedvező hatását sikerült igazolni. A zsírdús étrenddel együtt fogyasztott fekete retek préslé kedvezően befolyásolta a lipidanyagcsere-zavart, csökkentette a szérum és a máj lipid- és koleszterintartalmát, megakadályozta a májsejtek károsodását, és a lipidperoxidáció során keletkező termékek felszaporodását a szérumban és a májban, valamint a koleszterin oxidációját a májban; továbbá meggátolta az antioxidáns enzimek károsodását, és megvédte a biológiai membránokat a szabad gyökös károsodásoktól. Humán vizsgálatban a fekete retek préslét és édesköményolajat tartalmazó gyógyhatású készítmény, a Raphacol epegranulátum hatását tanulmányozása tortént. A készítményt metabolikusan jól kontrollált I. és II. típusú diabetes mellitusban szenvedő, rendszeres orvosi ellenőrzés alatt álló, ultrahanggal igazoltan epekővel nem rendelkező betegek fogyasztották hat hónapig. A szérumban és az eritrocitában végzett biokémiai vizsgálatok alapján a készítmény enyhe lipidszint-csökkentő és antioxidáns hatása volt igazolható. Kúraszerű fogyasztás esetén e kedvező tulajdonságok feltételezhetően elősegítik a diabeteses szövődmények, elsősorban az epekőbetegségek és az atherosclerosis prevencióját.
155
1.
BEVEZETÉS ÉS CÉLKITUZÉSEK
Az elmúlt két évtizedben a szabad gyökös károsodásokkal, valamint az antioxidáns hatású vegyületek biokémiájával kapcsolatos kutatások ahhoz a lényeges felismeréshez vezettek, hogy az étrendi antioxidánsoknak alapvető jelentősége van számos megbetegedés prevenciójában. Ezek közé tartoznak a kardio- és cerebrovaszkuláris megbetegedések, számos tumorfajta és más egyéb betegségek, melyek nagy része életkor-függő. Az étrendi antioxidánsok közül a vitaminok szerepe a fokozott oxidatív stresszel összefüggésbe hozható megbetegedések terápiájában és prevenciójában jól ismert. Az intenzív kutatások ellenére azonban keveset tudunk a nem-vitamin jellegű, antioxidáns hatású vegyületek, például a polifenolos komponensek, flavonoidok szerepéről a civilizációs megbetegedések visszaszorításában. Az élelmi eredetű flavonoidok élettani hatásának pontos feltérképezéséhez komplex kémiai, biokémiai vizsgálatsorozatra van szükség. Kutatásaim során arra kerestem választ, hogy néhány kiválasztott élelmi anyag képes-e befolyásolni az élő szervezetben lejátszódó patológiás szabadgyök-reakciókat. A vizsgálatok célja az volt, hogy megállapítsam, az adott élelmiszerek rendszeres fogyasztása elősegíti-e az egészség megőrzését és bizonyos típusú, a fokozott oxidatív stresszel összefüggésbe hozható megbetegedések megelőzését. A felmerült kérdések miatt egy több szintből álló vizsgálati rendszer összeállítása vált szükségessé, melyben az egyes vizsgálati eljárások komplexitása és sorrendjük betartása teszi lehetővé a vizsgált készítmények kedvező élettani hatásainak tudományos igazolását. A kutatások során a fekete retekből készült préslé, a Raphacol epegranulátum és az ország különböző tájegységeiről származó fehér- és vörösborok vizsgálatára került sor. Napjainkban az egyre nagyobb számban megjelenő tudományos közlemények között kiemelt fontosságúak a vörösborok kedvező élettani hatásáról beszámoló tanulmányok. Hazánkban az alkoholfogyasztás mértéke és ezen belül az égetett szeszesitalok mennyisége az elmúlt 30 évben jelentősen emelkedett, valamint a cirrhosisos halálozások száma az utóbbi tíz évben közel negyven százalékkal nőtt. Ezért reményeink szerint a vörösborokkal végzett kedvező vizsgálati eredmények a lakosság számára is hozzáférhetővé válnak, és hatással lesznek a rendszeres alkoholfogyasztók választására és a szervezetre kevésbé káros italokat helyezik előtérbe a tömény italokkal szemben. Közismert, hogy Magyarországon a táplálkozással összefüggő megbetegedések aránya jóval nagyobb, mint a fejlett európai államokban. E megbetegedések közé tartoznak a máj és az epe bizonyos típusú elváltozásai is. Laboratóriumi vizsgálatok sokasága támasztja alá némely élelmi anyag, zöldség- és főzelékfélék előnyös tulajdonságait e megbetegedések megelőzésében. Számos esetben okunk van feltételezni, hogy a növényi hatóanyagok többféle mechanizmuson keresztül fejtik ki jótékony hatásukat. Ezért esett a választásom a fekete retek préslére, valamint a belőle előállított, gyógyszertári forgalomban kapható Raphacol epegranulátumra. A vizsgálatok során arra kerestem a választ, hogy a már régóta ismert
156
kedvező hatásain túl a fekete retek hatóanyagait koncentráltan tartalmazó preparátumok egyéb kémiaibiokémiai folyamatokon keresztül is befolyásolják-e a szervezet működését. A kutatások során első feladat volt a tanulmányozott élelmiszerekben biológiailag aktív vegyületeinek minőségének és mennyiségének meghatározása. Ehhez a munkához a rendelkezésemre álló analitikai módszerek
közül
spektrofotometriás
és
nagyhatékonyságú
folyadékkromatográfiás
eljárásokat
választottam. A vizsgálati rendszer második szintje az in vitro hatások értékelése. Az antioxidáns kifejezés rendkívül összetett folyamatot takar. Ezért olyan komplex, in vitro vizsgálati rendszert állítottam össze, melynek segítségével a vizsgált növényi anyagok össz-antioxidáns tulajdonságát eredményező különböző kémiai reakciók is tanulmányozhatóvá váltak. A tesztrendszer egy-egy eleme önmagában nem ad elegendő felvilágosítást a vizsgált anyag tulajdonságairól, de több módszert kombinálva hasznos információkat kaphatók a minta hatásmechanizmusáról, hatásspektrumáról. Az in vitro körülmények között igazoltan antioxidáns hatású növényi készítményekkel in vivo short-term állatkísérletes vizsgálatokat végeztem az élő szervezetben lejátszódó folyamatok tanulmányozására, mivel biokémiai vizsgálatok sokasága bizonyítja, hogy az in vitro körülmények között antioxidánsként viselkedő vegyületek a szervezetben nem mindig hatásosak, vagy nem egészen úgy és olyan dózisban hatnak, ahogy azt az in vitro eredmények alapján elvárható lenne. A választott állatkísérletes modell az alimentáris, étrendi úton előidézett hyperlipidaemia volt. Korábbi vizsgálatokban beigazolódott, hogy a nagy zsír- és koleszterintartalmú táppal etetett állatokban a fokozott oxidatív stresszel kapcsolatosan biokémiai és morfológiai elváltozások alakulnak ki. A nagy zsír- és koleszterintartalmú táppal együtt fogyasztott fekete retek présé hatását tanulmányoztam e kedvezőtlen folyamatok kivédésében. Az in vitro, valamint az in vivo állatkísérletes vizsgálatok eredményei alapján humán vizsgálatokat végeztem a fekete retek préslét, valamint édesköményolajat tartalmazó Raphacol epegranulátummal. A diabetes az egyik leggyakoribb táplálkozással összefüggő megbetegedés, a felnőttkorban kezdődő cukorbetegség szorosan kapcsolódik a helytelen táplálkozáshoz és az elhízáshoz. A korszerű glükózszintcsökkentő készítmények, a rendszeres orvosi ellenőrzés és a jól beállított diéta következtében a diabetesben szenvedő betegek várható élettartama alig tér el az egészséges lakosságétól. Azonban a betegség késői szövődményei, például a gasztrointesztinális problémák, az epekőbetegség, az atherosclerosis, a betegek életminőségét lényegesen ronthatják. E szövődmények nagy része összefüggésbe hozható a diabetesben fokozottabban érvényesülő szabad gyökös elváltozásokkal, valamint az antioxidáns védelmi rendszer csökkent működésével. Ezért egy hat hónapig tartó Raphacol kúra hatását tanulmányoztam a lipidperoxidációs folyamatok alakulására I. és II. típusú diabetes mellitusban szenvedő betegekben. Megpróbáltam következtetéseket levonni arra vonatkozóan, hogy a tapasztalt és biokémiailag is igazolt kedvező hatások szerepet játszhatnak-e bizonyos szövődmények, elsősorban az epekő kialakulásának visszaszorításában.
157
2.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
2.1.
Antioxidáns hatású anyagok
A fekete retek préslét a beérett gumókból tisztítás majd aprítás után a rostos gyümölcslevek előállításához használt gyártósoron préseléssel állították elő. A préslevet szűrés után a további felhasználásig fagyasztószekrényben tároltam.
A Raphacol epegranulátum gyógyszertári forgalomban kapható
gyógyszernek nem minősülő gyógyhatású készítmény, amely 60 g fekete retekből nyert friss préslét és 0.25 g édeskömény olajat (Aetheroleum foeniculi) tartalmaz 100 gramm inaktív hordozó granulátumra porlasztott formában. A vörösborok antioxidáns tulajdonságainak tanulmányozására az ország különböző bortermelő vidékeiről származó 26 féle vörösbort, 1 fajta rozét, és 4 különböző fehérbort szereztem be. A hazai borokra jellemző értékeket Európa jelentős vörösbor-termelő országaiból származó egy-egy vörösbor mintával, valamint 3, kékszőlőből nyert, alkoholt nem tartalmazó gyümölcslével hasonlítottam össze. 2.2.
Összetételi adatok meghatározása
2.2.1.
Makro- és mikroelemek
Az elemtartalom meghatározása Thermo Jarrell Ash Corporation típusú AtomScan 25 ICP-vel (induktív gerjesztésű plazma emissziós spektrométer) történt. 2.2.2.
Bioaktív vegyületek
A fekete retek présléből a glükozinolátok extrakciója forró metanollal, a kivonat tisztítása és a glükozinolátok deszulfatálása SEPHADEX DEAE A25 gyantán történt. A deszulfoglükozinolátok mennyiségének meghatározását Spinks és munkatársai által leírt módszer szerint végeztem el Gilson 712 nagyhatékonyságú folyadékkromatográffal. A minták összes polifenoltartalmát Folin-Denis módszerrel értékeltem. A flavonoidösszetételt Hertog és munkatársai által leírt módszer alapján határoztam meg Perkin Elmer nagyhatékonyságú folyadékkromatográffal. Az aszkorbinsav meghatározása Perkin Elmer 785A típusú HPLC-vel fordított fázisú C18 oszlopon történt.
A karotin mennyiségét KOH-os
elszappanosítás után fotometriás detektáltam. Az összes tokoferol mennyiségét KOH-dal elszappanosított mintából HPLC technikával határoztam meg. 2.3.
In vitro vizsgálati módszerek
2.3.1.
Hidrogén-donor aktivitás
A minták hidrogén-donor aktivitása az 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) gyök jelenlétében értékelhető 517 nm-en. A minta által eredményezett változást %-ban adtam meg a kontrollhoz viszonyítva. Az antioxidánsok hatását különböző koncentrációban tanulmányoztam, és az 50%-os gátláshoz szükséges mintamennyiséget (I50) adtam meg.
158
2.3.2.
Redukálóképesség
A redukálóképesség meghatározása a Fe3+ → Fe2+ redukciós reakció alapján történt Oyaizu módszerével. Referenciavegyületként aszkorbinsavat használtam. 2.3.3.
Komplexképző aktivitás
A minták komplexképző aktivitásának tanulmányozása Cu2+ ionok jelenlétében Shimada és munkatársai által kidolgozott módszer segítségével történt hexamin pufferben. A komplexképző aktivitás a 485 és 530 nm-en leolvasott abszorbanciaértékek hányadosával jellemezhető. 2.3.4.
Scavenger aktivitás H2O2/·OH-luminol-mikroperoxidáz rendszerben
A kemilumineszcencia jelenségén alapuló módszer kivitelezése Heide és Bögl módszere alapján történt, Blázovics által kidolgozott módosításokkal, Berthold Lumat LB 9501 luminométerrel. 2.3.5.
Totál antioxidáns státusz
A mérés kivitelezése Randox TAS diagnosztikai készlettel történt. A vizsgált minták TAS értékének meghatározásához standardként Troloxot használtam. 2.3.6.
A linolsav autoxidációjának gátlása
A mérést Masude módszere alapján végeztem el. A linolsavat tartalmazó reakcióelegyben meghatároztam a linolsav autoxidációja során keletkező peroxidok mennyiségét a tiocianátos színreakció segítségével antioxidánsok jelenlétében és hiányában. 2.3.7.
Enzimatikus úton kiváltott lipidperoxidáció májmikroszóma frakcióban
A NADPH-val indukált, és antioxidánssal gátolt lipidperoxidáció tanulmányozása Jordan és Schenkman szerint történt. A reakció során keletkező malondialdehidet a tiobarbitursavas színreakcióval határoztam meg. 2.4.
In vivo vizsgálatok
2.4.1.
Állatkísérletek
A kísérletekhez 180-200 g-os hím Wistar patkányokat használtam. Az állatokat random 4 csoportba osztottam, a csoportok jellemzői a következők voltak: ∗
A kontroll csoportban az állatok normál LATI tápot és csapvizet fogyasztottak.
∗
A kontroll kezelt csoportban a LATI táp mellett a fekete retek préslét csapvízzel tízszeresre hígítva az ivóvíz helyett fogyasztották az állatok 150 ml/tt kg/nap adagban.
∗
A zsírdús tápon tartott állatok esetében a táp 20% napraforgóolajat, 2% koleszterint és 0.5% kólsavat tartalmazott. Az állatok a táp mellett ivóvizet fogyasztottak.
∗
A zsírdús étrenden tartott, kezelt állatok a táp mellett a fekete retek préslét csapvízzel tízszeresre hígítva az ivóvíz helyett fogyasztották 150 ml/tt kg/nap adagban.
Az állatok a tápot ad libitum fogyasztották. A kísérletek 9 napig tartottak.
159
2.4.2.
Humán vizsgálatok
A vizsgálatokban 20 önkéntes, metabolikusan jól kontrollált, hosszabb ideje (>5 év) diabetes mellitusban szenvedő beteg vett részt. A 20 betegből 7 I. típusú (1 férfi, 6 nő, átlagéletkor 30.0 ± 4.5 év) és 13 fő II. típusú (9 férfi, 5 nő, átlagéletkor 56.2 ± 12.3 év) cukorbeteg volt. A betegek étrendi kiegészítésként 6 hónapon keresztül naponta 3 alkalommal 0.2 g Raphacol epegranulátumot fogyasztottak a főétkezések után. A kúra kezdete előtt, majd 3 és 6 hónap múlva a szokásos ellenőrzéssel egyidőben éhomi vérmintát vettünk a betegektől és meghatároztuk a szokásos laboratóriumi paramétereket, valamint a lipidperoxidáció mértékét jelző néhány komponenst. Kontrollként 26 (12 férfi, 14 nő) egészséges, nem dohányzó, normolipoproteinaemiás egyén szérum és eritrocita lipidperoxidációs adatai szolgáltak. Életkoruk 42.3 ± 12.5 év volt. 2.5.
Biokémiai vizsgálatok
2.5.1.
Szérumparaméterek
A szokásos laboratóriumi szérumparaméterek meghatározása COBAS Integra Roche (patkány szérumok) és HITACHI 717 (humán minták) automata kémiai analizátorral történt. 2.5.2.
Zsírsavösszetétel
A patkány májhomogenizátumban a zsírsavösszetétel meghatározása CARLO ERBA Fractovap 2400 típusú gázkromatográffal lángionizációs detektor segítségével történt. 2.5.3.
Zsír- és koleszterintartalom, oxidált koleszterin származékok patkány májban
A szövetnedves májhomogenizátum zsír és zsíroldékony komponenseit Folch extrakciós oldattal extraháltam. A nem-elszappanosítható frakcióban a koleszterin és oxidált származékainak vizsgálata vékonyréteg kromatográfiás eljárással történt Sil G 60 F254, rétegen. A kimutatható mennyiségben jelenlévő oxidált koleszterin származékok mennyiségi értékelése spektrofotometriásan történt. 2.5.4.
A- és E-vitamin patkány szérumban
Patkányszérumokban az A- és az E-vitamin mennyiségének meghatározása fordított fázisú HPLC-s technikával történt Rudy módszere alapján. 2.5.5.
Konjugált diének patkány májban és szérumban
Szövetnedves májhomogenizátumból a konjugált diének extrahálása izooktánnal, mennyiségi értékelése spektrofotometriásan történt. A szérumok konjugált dién szintjét Ahotupa és munkatársai által leírt módszerrel értékeltem. 2.5.6.
Tiobarbitursav reaktív anyagok patkány májban és szérumban
Patkány májban a TBA reaktív anyagok mennyiségét Satoh és Ohkawa módszere alapján mértem meg. A kialakult színt 532 nm-en mértem. Humán és patkány szérumban a meghatározás Pyles módszerével történt.
160
2.5.7.
Szabad szulfhidril-csoportok
A szabad szulfhidril csoportok mennyiségét Ellman és Lysko módszere alapján Ellman reagens segítségével határoztam meg. 2.5.8.
Biológiai
minták
scavenger
aktivitása
H2O2/·OH-luminol-mikroperoxidáz
rendszerben A biológiai minták (plazma, májhomogenizátum) scavenger aktivitásának meghatározása a H2O2/·OHluminol-mikroperoxidáz rendszerben a 2.3.4. pontban leírtak szerint történt. 2.5.9.
Enzimatikus úton kiváltott lipidperoxidáció patkány májmikroszóma frakcióban
A fekete retek préslé in vivo antioxidáns tulajdonságát alimentáris hiperlipidémia modellben patkány májból szeparált mikroszóma frakción tanulmányoztam Jordan és Schenkman módszere alapján. 2.5.10.
Enzimaktivitások meghatározása
A kataláz aktivitásának meghatározása Beers és Sizer módszere alapján történt. A glutation-peroxidáz enzim aktivitását Chin és munkatársai által kidolgozott, valamint Sedlak és Lindsay által kiegészített módszerrel határoztam meg. A glutation-S-transzferáz enzim aktivitásának meghatározása patkány máj citoszolból történt Habig és munkatársai módszerével. 2.5.11.
A mikroszomális mono-oxigenáz enzimrendszer tanulmányozása
A citokróm P450 és a citokróm b5 tartalom meghatározása Omura és Sato módszerével történt. A citokróm c reduktáz és a ferricianid reduktáz aktivitását Jansson és Schenkman által leírt metodika alapján határoztam meg. 3.
ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK
3.1.
Az in vitro vizsgálatok eredményei
3.1.1.
A fekete retek préslé tulajdonságai
Az in vitro vizsgálatok alapján megállapítható volt, hogy a fekete retek préslében számos olyan vegyület van jelen, melyek pozitív szerepet játszhatnak a szabad gyökös reakciókkal kapcsolatos elváltozások visszaszorításában. A készítményben jelentős mennyiségben volt kimutatható aszkorbinsav, tokoferolok, β-karotin, polifenolos vegyületek, ezen belül néhány flavonoid. A készítmény gazdag tárháza különböző elemeknek, melyek közül a kálium, a kén és króm, cink emelendő ki. A fekete retek préslé in vitro vizsgálati körülmények között jelentős antioxidáns hatást mutatott. Koncentrációfüggő
módon
hidrogén-donorként
viselkedett
az
1,1-difenil-2-pikrilhidrazil
gyök
jelenlétében és redukáló hatású volt a Fe(III) → Fe(II) átalakulásban. Réz(II)-ionok jelenlétében komplexképző ágensként viselkedett. Továbbá a préslé koncentrációfüggő módon gátolta a linolsav 37oCon előidézett autooxidációját. A készítmény bioaktív vegyületei gátolták a citokróm c redukcióját
161
xantin/xantinoxidáz rendszerben, valamint az adrenalin lúgos közegben lejátszódó autooxidációját, tehát a fekete retek préslé szuperoxid gyökfogó hatással rendelkezik. Beigazolódott továbbá, hogy a préslé, koncentrációjával arányos mértékben, a H2O2/·OH-luminol rendszerben a Fenton reakció során keletkező szabad gyökök befogására is képes. A préslé igen magas totál antioxidáns státusz (TAS) értéket mutatott. Az eredmények bizonyítják, hogy a préslében jelenlévő biológiailag aktív komponensek hidrogént képesek átadni a szabad gyököknek, ezáltal közömbösítik azokat. A fekete retek aktív hidrogén donor molekulái láncmegszakító, elsőrendű antioxidánsként viselkednek a lipidperoxidáció gátlásában. Erőteljes redukáló hatásánál fogva a fekete retek másodrendű antioxidánsként is kiváló, mert képes a lipidperoxidáció során keletkező oxidált állapotú átmeneti és végtermékek redukciójára, amely során nem toxikus vegyületek keletkeznek. Továbbá komplexképző tulajdonágai révén megakadályozza, hogy az átmeneti fémionok a lipidhidroperoxidok bomlásának katalízisén keresztül felerősítsék az oxidációs folyamatokat. Az alkalmazott komplex vizsgálati rendszer eredményei alapján bizonyossá vált, hogy a fekete retek préslé különböző mechanizmusokon keresztül antioxidánsként képes viselkedni. 3.1.2.
Vörös- és fehérborok, valamint szőlőlevek antioxidáns tulajdonságai
A hazai fehér- és vörösborokkal végzett vizsgálatok alapján megállapítható volt, hogy míg a fehérborok összes polifenoltartalma 100-200 mg/l, addig a vörösboroké egy nagyságrenddel magasabb, 1400-3000 mg/l. A kékszőlőből nyert levek polifenoltartalma töredéke volt a vörösborokban tapasztalt mennyiségnek, de magasabb volt, mint a fehérboroké. Valamennyi vizsgált fehér- és vörösbor, valamint kékszőlőlé esetében koncentrációfüggő hidrogén-donor aktivitás és redukáló hatás volt kimutatható. A borokban és szőlőlevekben lévő polifenolos vegyületek első- és másodrendű antioxidánsként funkcionáltak. A fehér- és vörösborok komplexképző ágensként viselkedtek Cu(II)-ionok jelenlétében, gátolták a citokróm c xantin/xantinoxidáz
rendszerben
előidézett
redukcióját,
valamint
megakadályozták
a
linolsav
autooxidációját, és jelentős TAS értéket mutattak. A vörösbor kivételes antioxidáns tulajdonsága annak köszönhető, hogy a benne található polifenolos vegyületek eltérő szerkezetükből adódóan különböző redox potenciállal rendelkeznek. Ezért a vörösborok eltérő antioxidáns erősségű vegyületei részt vesznek a már oxidálódott vegyületek regenerálásában, akár boreredetű antioxidáns volt az, akár a szervezetben található más vegyület, például a tokoferol. A vörösés fehérborok, valamint a szőlőlevek esetében tapasztalt kedvező antioxidáns tulajdonságok szoros korrelációban voltak a minták összes polifenoltartalmával. Jelentős volt az antioxidáns hatás a vörösborok esetében, kisebb mértékű az alkoholt nem tartalmazó, préseléssel nyert kékszőlőlevekben, míg leggyengébb antioxidáns tulajdonságokkal a fehérborok rendelkeztek. A vizsgálataim eredményei összhangban vannak a nemzetközi szakirodalomban a vörösbor kedvező élettani hatásairól beszámoló tanulmányok adataival. Ennek ellenére nem állítható teljes biztonsággal, hogy az adatok elegendőek határozott következtetések levonására a vörösborfogyasztás, valamint a
162
feltételezett kedvező élettani hatás közötti kapcsolatra vonatkozóan.
Fentiek miatt a vörösborral
kapcsolatos, a lakosság egészére vonatkozó ajánlás nem egyértelműen pozitív hatású a bor alkoholtartalmának következtében jelentkező betegségek megnövekedett kockázata miatt. Jelenlegi ismereteink szerint mérsékelt mennyiségű, napi 150-300 ml vörösbor - férfiak esetében 2-3 egység, nők esetében 1-2 egység (1 egység 12 g alkoholnak felel meg) - kulturált, étkezéshez kapcsolódó elfogyasztása, elméletileg csökkentheti a szív- és érrendszeri megbetegedések és halálozások arányát. 3.2.
Az in vivo állatkísérletek eredményei
Patkánykísérletekben zsírdús étrend hatására kialakuló hyperlipidaemiában a fekete retek préslé kedvező, lipidszint-csökkentő hatását sikerült igazolni. A magas koleszterin- és zsírtartalmú étrend fogyasztásának hatására az állatok szérumában szignifikánsan emelkedett a koleszterin, az LDL-koleszterin, a triglicerid és az epesavak koncentrációja. A koleszterin etetése szignifikánsan emelte a szérumban az epesavak koncentrációját. Az étrendkiegészítésként fogyasztott fekete retek préslé hatására a fenti komponensek mindegyikénél a kontroll állatok szérumában mért értékek irányába történő elmozdulás volt tapasztalható már a 9 napig tartó kezelés során is. Mivel a patkánynak nincs epehólyagja, a fekete retek hatóanyagai nem az epehólyag falára és izomzatára gyakorolt tonizálóhatás révén képesek elősegíteni az epetermelődés fokozásával a koleszterin kiürülést. Feltételezhető, hogy a fekete retek préslében található flavonoidok és egyéb
bioaktív
molekulák
koleszterinszint-csökkentő
hatása
a
koleszterin
metabolizmus
két
kulcsenzimének, a HMG-CoA reduktáz és az ACAT aktivitásának gátlásán keresztül jut érvényre. A hyperlipidaemiában kialakuló zsírmájban a májsejtek membránjainak károsodása miatt a szérumban jelentősen emelkedik a májenzimek aktivitása. Ezt a folyamatot a zsírdús étrend mellett fogyasztott fekete retek préslé jelentősen visszaszorította. Hyperlipidaemiában a készítmény hatására a szérumban a májenzimek aktivitása, valamint a bilirubin koncentrációja a normál érték felé mozdult el. A kedvező változások a fekete retek préslé májvédő hatását jelzik. A zsírdús étrend hatására az állatok szervezetében fokozódott a lipidperoxidáció. A hyperlipidaemiás állatok szérumában nőtt a malondialdehid és a konjugált diének mennyisége, míg az eritrocitában az antioxidáns enzimek közül a glutation-peroxidáz aktivitása csökkent. A fekete retek préslé antioxidáns tulajdonságainak köszönhetően a szabad gyökös folyamatok visszaszorultak, így a malondialdehid és konjugált dién szintek a normál értékre csökkentek a szérumban, a plazma scavenger kapacitása javult, az antioxidáns enzimek aktivitása normalizálódott az eritrocitákban. Az antioxidáns védelem erősödését jelezte továbbá a szérumban a megemelkedett A- és E-vitamin koncentráció, valamint a fokozott redukálóképesség. A jelentős mennyiségű, számottevően telítetlen zsírsavakat (főleg linolsavat) tartalmazó napraforgóolaj fogyasztásának hatására a hyperlipidaemiás állatok májában nőtt a zsír mennyisége és a telített/telítetlen zsírsavak aránya a kontroll állatokban mért 1.5-1.6 értékről 4.2-re emelkedett. A hepatocitákban akkumulálódott nagy mennyiségű, könnyen oxidálódó telítetlen zsírsavak a szabad gyökös reakciók
163
célpontjává váltak, megnőtt az oxidációs reakciók szubsztrát-kínálata. A hyperlipidaemiás állatok májában emelkedett a malondialdehid, és a konjugált diének mennyisége, az antioxidáns enzimek aktivitása csökkent. A fekete retek préslé fogyasztása nem változtatta meg a máj zsírsavösszetételét, de más mechanizmusokon keresztül érvényre jutott májvédő hatása: visszaszorult a zsír felhalmozódása a májsejtekben, a malondialdehid és konjugált diének mennyisége jelentősen csökkent, az enzimaktivitások normalizálódtak, a máj scavenger kapacitása javult. A 2% koleszterint tartalmazó zsírdús táp fogyasztása már 9 napos kezelés után is jelentősen, mintegy tizenötszörösére emelte a májak koleszterin tartalmát, valamint fokozta a feltételezetten atherogén hatású oxidált koleszterin származékok képződését. A hyperlipidaemiás állatok májában tapasztalt jelentős koleszterin felhalmozódást a fekete retek préslé mintegy harminc százalékkal visszaszorította, valamint gátolta a koleszterin oxidációját is. Alimentáris hyperlipidaemiában, többek között a fokozott szabad gyökös reakciókkal kapcsolatosan a mikroszomális enzimrendszer működése károsodott, melyet a NADPH citokróm c reduktáz és a NADH citokróm b5 reduktáz aktivitásának csökkenése jelzett. A drogmetabolizáló monooxidáz enzimrendszer csökkent aktivitása a sejtorganellumok membránjaiban lezajló létfontosságú biokémiai folyamatok zavart működését eredményezheti. A fekete retek préslé fogyasztásának hatására a mikroszomális enzimek aktivitása a normál, egészsége állatokban mért értékek irányába mozdult el. Ezek a kedvező irányú folyamatok a fekete retek préslé gyenge, de nem elhanyagolható in vivo membránvédő hatását is jelzik.
3.3.
A humán vizsgálatok eredményei
A vizsgált I. és II. típusú cukorbetegek esetében a szérum lipid paraméterek egy részének kedvező irányú változását eredményezte a Raphacol készítmény rendszeres fogyasztása. A betegek koleszterin és triglicerid értékei a készítmény fogyasztása előtt az egészséges normálérték felső határa fölött voltak. A készítmény fogyasztásának megkezdése után három és hat hónap után ezek az értékek jelentősen csökkentek. Annak ellenére, hogy néhány beteg esetében a lipidparamétereket nem sikerült az egészséges normáltartományba szorítani, a Raphacol készítmény a benne található bioaktív vegyületeknek köszönhetően kedvező hatással volt a lipidanyagcserére. A Raphacol készítményben számos, a fekete retek présléből származó bioaktív vegyület, többek között flavonoidok is vannak, melyek feltételezhetően szerepet játszottak a lipidanyagcsere módosításban. A készítmény fogyasztása előtt mindkét cukorbeteg csoportban a normálértéknél magasabb átlagos szérum glükóz szinteket tapasztaltam, majd az értékek jelentősen csökkentek hat hónap után. A betegekre a normálértéknél magasabb hemoglobin A1c és glikohemoglobin arány volt jellemző a készítmény fogyasztása előtti mérés során. Hat hónap után mindkét érték szignifikánsan csökkent a két betegcsoportban és ezzel sikerült megközelíteni a normálértékek felső határát és így a fiziológiás értékeket.
164
Feltételezhető, hogy vizsgálatainkban a fekete retek préslé korábban említett kedvező mikroelemtartalma mellett a jelenlévő polifenolos vegyületek is kedvezően befolyásolhatták a glükózanyagcserét. Ugyanakkor nem zárható ki, hogy más tényezők is szerepet játszottak, ezért a folyamatok pontos megismeréséhez további megfigyelésekre van szükség. A fiziológiás tartományt megközelítő vércukor és hemoglobin A1c értékek a javuló metabolikus kontrollt jelzik. Ennek következtében a diabeteshez társuló komplikációk rizikója is lényegesen csökkenhet. A három és hat hónapon keresztül fogyasztott Raphacol epegranulátum hatására a betegek többségében a lipidperoxidációs folyamatok mérséklődése volt kimutatható. A szérumban hat hónap után csökkent a malondialdehidtartalom, a plazma scavenger kapacitása javult, valamint az antioxidáns enzimek aktivitása jelentősen növekedett. Az egyéb paraméterek alakulása is a szérum antioxidáns védelmi rendszerének erősödését jelezte. A plazmában számos olyan komponens van jelen, mely gyökfogó tulajdonságokkal rendelkezik, pl. albumin, vitaminok, bilirubin, húgysav, polifenolos vegyületek. Ezek mennyisége a keringésben a Raphacol készítmény fogyasztásának ideje alatt jelentősen változhatott. Mivel több szérumparaméter tekintetében is kedvezőtlen irányú, de patológiásnak nem tekinthető változást tapasztaltam a kúra harmadik hónapja után, feltételezhető, hogy a készítménnyel elfogyasztott antioxidáns hatású anyagok mellett néhány prooxidáns vegyület, és szabad gyök prekurzorok (pl. fémionok) is nagyobb számban kerültek be a szervezetbe. A szervezetnek alkalmazkodnia kellett ehhez az új helyzethez. Az adaptációhoz, vagyis a magasabb szintű prooxidáns/antioxidáns egyensúly kialakulásához, időre volt szükség. Ezért a Raphacol készítmény kedvező hatásait a legtöbb beteg esetében a hat hónapos kúra után sikerült regisztrálni. A fontos fehérjék glikációjából és fokozott oxidatív stresszből adódó toxikus hatással kapcsolatos diabeteses komplikációk megelőzhetők vagy visszaszoríthatók megfelelő antioxidánsokkal a tradicionális gyógyszeres terápia kiegészítéseként. A Raphacol készítmény bioaktív hatóanyagai, köztük a jól ismert antioxidánsok -tokoferolok, karotinoidok, aszkorbinsav, polifenolos vegyületek- felszívódtak, egy részüket a szervezet felhasználta, a többit elraktározta, vagy kiválasztotta. A hat hónapig tartó kúra alatt e vegyületek stabil szérum szintje alakult ki, amely lehetővé tette az antioxidáns védelmi rendszer megerősödését és megakadályozta a patológiás szabad gyökök felszaporodását. Ezáltal az alapbetegség állapotában kedvező irányú változások zajlottak le, ugyanakkor a szabad gyökös reakciókkal kapcsolatos kisérő betegségek, többek között az epekőképződés és az atherosclerosis kockázata is csökkenhet.
165
4.
ÖSSZEFOGLALÁS
Vizsgálataim célja volt, hogy igazoljam egyes élelmiszer eredetű, nem-tápanyagkomponensek kedvező élettani hatását, különös tekintettel a májbetegségek primer és szekunder prevenciójára. In vitro és in vivo állatkísérletes és humán vizsgálatokban, egymásra épülő analitikai módszerek segítségével igazoltam, hogy a népgyógyászatban évszázadok óta alkalmazott fekete retek és már az ősi kultúrákban is ismert vörösbor kedvező élettani hatásának hátterében az antioxidáns molekulák komplex rendszere áll. Vizsgálataim eredményei alapján messzemenően javasolható e növényi hatóanyagok célszeru beépítése napjaink étrendjébe a fokozott oxidatív stresszel összefüggésbe hozható kardiovaszkuláris, máj- és epebetegségek megelőzése ill. kialakulásuk időbeli eltolása céljából. A természetes növényi hatóanyagok optimális alkalmazása, valamint a túladagolás, az esetleges allergiás reakciók, és az egyéb gyógyszerekkel való káros interakciók elkerülése érdekében a bioaktív komponenseket koncentráltan tartalmazó készítményeket orvosi javaslatra és folyamatos ellenőrzés mellett ajánlatos alkalmazni.
166
5.
PUBLIKÁCIÓK
Eredeti közlemények 1.
Lugasi, A., Dworschák, E., Hóvári, J.: Free radical scavenging activity of methanolic extract of some culinary herbs. Acta Alim., 25. 227-236. 1996.
2.
Blázovics, A., Kéry, Á., Fehér, E., Prónai, L., Gonsales-Cabello, R., Barta, I., Lugasi, A., Gergely, P., Fehér, J.: Natural antioxidants in liver therapy, Curr. Topics in Biophysics, 20. Suppl., 14-30. 1996.
3.
Lugasi, A., Blázovics, A., Kéry, Á., Dworschák, E.: A fekete retek (Raphanus sativus L. var. niger) in vitro antioxidáns és gyökfogó tulajdonságai, Táplálkozás Allergia Diéta, 2. 30-39. 1997.
4.
Lugasi, A., Blázovics, A., Dworschák, E., Fehér, J.: A vörös bor kardioprotektív hatásáról az irodalmi adatok tükrében, Orvosi Hetilap, 138. 11. 673-678. 1997.
5.
Lugasi, A., Dworschák, E., Blázovics, A., Kéry, Á.: Antioxidant and free radical scavenging properties of squeezed juice from black radish (Raphanus sativus L. var niger) root. Phytother. Res. 12. 502-506. 1998.
6.
Lugasi, A., Dworschák, E., Almeida, D.: Chlorogenic acid content and antioxidant activity of potatoes grown with different fertiliser rates. Acta Alim. 28. (2.) 183-195. 1999.
7.
Lugasi, A., Horvatovich, P., Dworschák, E.: Additional information to the in vitro antioxidant activity of Ginkgo biloba L. Phytother. Res. 13.160-162. 1999.
8.
Blázovics A., Kovács, Á., Lugasi, A., Hagymási, K., Bíró, L., Fehér, J.: Antioxidant defence in erythrocytes and plasma of patients with active and quescent Crohn′s disease and ulcerative colitis: a chemiluminescence study. Clin. Chem.45. 895-896. 1999.
9.
Dworschák E., Lugasi A., Blázovics A.: Antioxidáns vitaminok egészségvédő hatása az újabb emberi megfigyelések tükrében. Fitoterápia, 4. (1.) 3-6. 1999.
10. Lugasi A., Blázovics J., Fehér J.: Magyar vörösborok in vitro antioxidáns tulajdonságai. Orvosi Hetilap, 140. (37). 2050-2057. 1999. 11. Blázovics A., Kéry Á., Fehér E., Prónai L., Gonsalez-Cabello R., Barta I., Lugasi A., Petri G., Fehér J.: Természetes antioxidáns és szöveti regeneráció (Gyógyhatás és reakciómechanizmus). Sempervivum tectorum. Fitoterápia, 4. 72-79. 1999. 12. Lugasi A., Dworschák E., Hóvári J., Blázovics A., Kéry Á., Fejes Sz.: Növényi antioxidánsok vizsgálata in vitro rendszerekben. Fitoterápia, 4. 80-88. 1999. 13. Lugasi A.: A vörösborok feltételezett preventív hatása. Komplementer Medicina. 4. (6.) 10-14. 2000. 14. Lugasi A.: Élelmiszer eredetű flavonoidok potenciális egészségvédő hatása. Orvosi Hetilap, 141. (32.) 1751-1760. 2000. 15. Lugasi, A., Hóvári, J.: Flavonoid aglycons in foods of plant origin I. Vegetables. Acta Alim. 29. 345352. 2000. 16. Blázovics, A., Lugasi, A., Kemény, T., Hagymási, K., Kéry, Á.: Membrane stabilising effects of natural polyphenols and flavonoids from Sempervivm tectorum on hepatic microsomal mixedfunction oxidase system in hyperlipidemic rats. J. of Ethnopharmacology, 73. 479-485. 2000.
167
17. Lugasi A., Blázovics A., Kéry Á., Kocsis I., Kassai-Farkas S., Horváth T.: A fekete retek hatóanyagú Raphacol epegranulátum hatása cukorbetegek szérum paramétereire. Fitoterápia, 5. 3-4. 72-77. 2001. 18. Lugasi A., Blázovics A., Kéry Á., Kocsis I., Kassai-Farkas S., Horváth T.: A fekete retek hatóanyagú Raphacol epegranulátum hatása cukorbetegek lipidperoxidációs paramétereire. Fitoterápia, (közlésre elfogadva), 2001. Előadások és poszterek külföldi és nemzetközi részvételű konferenciákon 1.
Lugasi, A., Dworschák, E. and Hóvári, J.: Characterization of scavenging activity of natural polyphenols by chemiluminescence technique. International EURO FOOD CHEM VIII Conference, Bécs, 1995.
2.
Lugasi, A., Lelbach, Á., Blázovics, A., Kéry, Á., Dworschák, E., Fehér, J.: In vitro and in vivo antioxidant activity of natural flavonoids and polyphenols from Sempervivum tectorum. AustrianHungrian-Slovakian FALK Symposium, Bratislava, 1996.
3.
Lugasi, A., Blázovics, A., Kéry, Á., Lelbach, Á., Dworschák, E., Fehér, E., Fehér, J.: In vitro and in vivo antioxidant and free radical scavenging activity of black radish (Raphanus sativus L. var. niger). VIII Biennal Meeting of ISFRR, Barcelona, 1996.
4.
Kéry, Á., Blázovics, A., Fejes, Sz., Lugasi, A.: Antioxidant activity of some medicinal plants used in gastrointestinal disorders. Second International Symposium on Natural Drugs. Maratea, Italy, 1997.
5.
Almeida, D., Rodrigues, P., Lugasi, A.: Antioxidant properties of rosemary. 1st Int. Meeting of Aromatic and Medicinal Mediterranean Plants, Conimbriga, Portugal, 1998.
6.
Lugasi, A., Hóvári, J., Gasztonyi, M., Dworschák, E.: Flavonoid content and in vitro antioxidant properties of broccoli. 2nd International Conference on Natural Antioxidants and Anticarcinogens in Nutrition, Health and Disease, Helsinki, Finland, 1998.
7.
Hóvári, J., Lugasi, A., Dworschák, E.: Examination of flavonoid content in vegetables in Hungary. 2nd International Conference on Natural Antioxidants and Anticarcinogens in Nutrition, Health and Disease, Helsinki, Finland, 1998.
8.
Lugasi, A., Blázovics, A., Hagymási, K., Kocsis, I., Kéry, Á., Dworschák, E., Fehér, J.: Beneficial effect of squeezed juice from balck radish (Rapahnus sativus L. var. niger) in alimentary hyperlipidaemia in rats. 2nd International Conference on Natural Antioxidants and Anticarcinogens in Nutrition, Health and Disease, Helsinki, Finland, 1998.
9.
Lugasi A., Blázovics A., Fehér J.: In vitro antioxidant activity of selected Hungarian red wines. Austrian-Hungarian-Slovakian FALK Symposium, Budapest, 1998.
10. Hóvári, J., Lugasi, A., Bíró, L., Sági, K., Zajkás, G., Dworschák, E.: Analysis of potentially anticarcinogenic flavonoids in vegetables and estimation of the daily flavonoid intake in some groups of Hungarian population: a preliminary study. 1st Congress of ISoP, Budapest, 1998. 11. Lugasi, A., Blázovics, A., Kassai-Farkas S., Kéry, Á., Horváth T.: Primary prevention of gallstone formation. Effect of Raphacol bile-granule on lipid peroxidation characteristics in diabetic patients. FALK Workshop, London, 1999.
168
12. Blázovics, A., Kéry, Á., Lugasi, A., Gonzalez-Cabello, R., Hagymási, K., Fehér, E., Fehér, J., Petri, G.: Natural antioxidants and tissue regeneration (Curative effects and reaction mechanisms). 2nd Eur. Congress of Pharmacology, Budapest, 1999. 13. Kocsis, I., Lugasi, A., Hagymási, K., Bárkovics, S., Fehér, J., Blázovics, A.: Liver protecting effect of black radish extract (Raphanus sativus L. var. niger): chemiluminescence and biochemical measurements. Summer Meeting of ISFRR, Drezda, 1999. 14. Szentmihályi, K., Lugasi, A., Blázovics, A., Kocsis, I., Kéry, Á., Vinkler, P.: Effect of black radish (Raphanus sativus L. var. niger) root extract to essential metal ion concentration of rat liver. Summer Meeting of ISFRR, Drezda, 1999. 15. Lugasi, A., Blázovics, A., Kassai-Farkas, S., Kéry, Á., Horváth, T.: Possible prevention of gallstone formation: effect of Raphacol bile-granule on lipid peroxidation characteristics in diabetic patients. Summer Meeting of ISFRR, Drezda, 1999. 16. Lugasi A.: In vitro antioxidant activity of selected Hungarian red wines. COST 916 Action, Róma, 2000. 17. Hóvári, J., Lugasi, A.: Flavonols and flavones in uncommon plant foods. COST 916 Action, Róma, 2000. 18. Blázovics A., Kovács Á., Lugasi A., Hagymási K., Bíró L., Fehér J.: Total scavenging capacity of erythrocytes and plasma is a good predictive factor in inflammatory bowel diseases. 5th Symposium of Free Radicals in Biology and Medicine, Lodz, 2000. 19. Szentmihályi K., Blázovics A., Lugasi A., Kéry Á., Vinkler P.: Effect of natural polyphenolic type antioxidants (Sempervivum tectorum L and Raphanus sativus L. var niger extracts) on metal ion concentration in rat bile fluid. 5th Symposium of Free Radicals in Biology and Medicine, Lodz, 2000. 20. Lugasi, A.: In vitro antioxidant properties of juices from fruits and vegetables produced with and without chemicals. COST 916 Action, Gozd Martuljek, Slovenia, 2000. 21. Szentmihályi, K., Blázovics, A., Kéry, Á., Lugasi, A., Vinkler, P.: Antioxidant activity of Sempervivum tectorum and Raphanus sativus extracts in vitro and in vivo. 10th Biennal Meeting of ISFRR, Kyoto, Japán, 2000. 22. Blázovics, A., Szilvás, Á., Lugasi, A., Hagymási, K., Dinya, E., Bíró, L., Kovács, Á.: Plasma and erythrocyte total scavenger capacity in gastrointestinal diseases and measuring techniques applying chemiluminescence. 10th Biennal Meeting of ISFRR, Kyoto, Japán, 2000. Előadások és poszterek hazai konferenciákon és rendezvényeken 1.
Lugasi, A., Blázovics, A., Fehér, E., Szaleczky, E., Dworschák, E., Fehér, J.: Effect of lipid rich diet on free radical rections of intestine in rats. A MGT 38. Nagygyűlése, Balatonaliga, 1996.
2.
Blázovics, A., Lugasi, A., Kéry, Á., Kemény, T., Fehér, J.: Membrane stabilizing effects of natural flavonoids from Sempervivum tectorum on hepatic microsomal P450 system in rats. A MGT 38. Nagygyűlése, Balatonaliga, 1996.
169
3.
Lugasi, A., Dworschák, E., Kéry, Á., Blázovics A., Hóvári, J.: A fekete retek (Raphanus sativus L. var. niger) antioxidáns és gyökfogó tulajdonságai. MTT XXI. Vándorgyűlése, Sopron, 1996.
4.
Dworschák E., Lugasi A., Blázovics A.: Antioxidánsok hatása in vitro és emberi megfigyelésekben. Pécsi Fitoterápiás Napok, Pécs, 1997.
5.
Lugasi A., Dworschák E., Blázovics A., Fejes Sz., Hóvári J.: Növényi antioxidánsok vizsgálata in vitro rendszerekben. Pécsi Fitoterápiás Napok, Pécs, 1997.
6.
Lugasi, A., Blázovics, A., Dworschák, E., Kéry, Á., Fehér, J.: Natural antioxidants strengthen antioxidant defense system in steatotic liver: a chemiluminescence study. MGT 39. Nagygyűlése, Balatonaliga, 1997.
7.
Blázovics, A., Lugasi, A., Kaján, A., Bárkovics, S., Fehér, J.: Chemiluminescent measurement for the study of tissue antioxidant state in rats. MGT 39. Nagygyűlése, Balatonaliga, 1997.
8.
Lugasi, A., Hóvári, J., Horvathovich, P., Dworschák, E.: Ginkgo biloba: egy hatékony antioxidáns. Pécsi Fitoterápiás Napok, Pécs, 1998.
9.
Blázovics, A., Lugasi, A., Hagymási, K., Kovács, Á.: Kemilumineszcencia kísérletes és klinikai vonatkozásai. XXVIII. Membrántranszport konferencia, Sümeg, 1998.
10. Lugasi, A., Blázovics, A., Kocsis, I., Kéry, Á., Dworschák, E.: Black radish: A possible antioxidant in alimentary hyperlipidaemia. MGT 40. Nagygyűlése, Balatonaliga, 1998. 11. Lugasi A., Blázovics A., Hagymási K., Fehér J.: Vörösbor antioxidáns tulajdonságainak vizsgálata kémiai rendszerekben. MTA Flavonoidkémiai Munkabizottság Tudományos Ülés, Debrecen, 1998. 12. Lugasi A., Dworschák E.: Vörösborok antioxidáns tulajdonságai. MTT XXIII. Vándorgyűlése, Pécs, 1998. 13. Lugasi A., Lebovics V.K., Kocsis I., Hagymási K., Blázovics A.: Black radish juice modifies the cholesterol metabolism in animal experiment. MGT 41. Nagygyűlése, Balatonaliga, 1999. 14. Lugasi A., Kéry Á., Horváth T., Blázovics A.: A fekete retek kivonatot tartalmazó epegranulátum antioxidáns hatása in vitro és in vivo vizsgálatokban. “Tapasztalatok a gyógynövények és fitoterápiás készítmények gyakorlati felhasználásáról” Konferencia, Budapest, 2000. 15. Lugasi A., Blázovics A., Kassai-Farkas S., Kéry Á., Horváth T.: Effect of Raphacol bile-granule on lipid peroxidation characteristics in diabetic patients. MGT 42. Nagygyűlése, Balatonaliga, 2000. 16. Lugasi A., Hóvári J., Bíró L.: Felmérés a növényi élelmiszerek flavonoidtartalmáról és a lakosság egyes csoportjainak flavonoidbeviteléről. MTT XXV. Vándorgyűlése, Szolnok, 2000.
170
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ez az értekezés a Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kar 7. Ph.D. programjának keretében készült. A program vezetője Prof. Dr. Fehér János, az orvostudomány doktora, akinek hasznos tanácsai, tudományos útmutatásai nélkül munkám nem készülhetett volna el.
A dolgozat elkészültében
témavezetőmnek Dr. Blázovics Annának, az orvostudomány kandidátusának, a Semmelweis Egyetem II. Belgyógyászati Klinika Biokémiai Kutatócsoportja vezetőjének felbecsülhetetlen érdemei vannak. Segítségéért, őszinte barátságáért hálás köszönet illeti. Köszönetemet fejezem ki az Országos Élelmezés- és Táplálkozástudományi Intézet korábbi és jelenlegi vezetőinek, Prof. Dr. Bíró Györgynek, Dr. Novotny Tibornak és Dr. Rodler Imrének, hogy lehetővé tették számomra a dolgozat elkészítését. Őszinte hálával tartozom Prof. Dr. Dworschák Ernőnek, a kémiatudomány doktorának, aki oly hirtelen távozott közülünk. Rendíthetetlen türelemével, mérhetetlen kitartásával és tudásával irányította tudományos munkámat, értékes tanácsaival és támogatásával elősegítette dolgozatom elkészítését. Köszönetemet fejezem ki az Országos Élelmezés- és Táplálkozástudományi Intézet Élelmiszerkémiai Analitikai Főosztály valamennyi munkatársának, akik sokat segítettek abban, hogy a dolgozatom elkészülhessen. Külön köszönet illeti Ternóczky Miklósnét, Hóvári Juditot, Berta Jenőnét, valamint a SE II. Belklinika Biokémiai Kutatócsoport munkatársait, Bárkovits Saroltát, Kaján Andreát és Pintér Edinát áldozatos munkájukért és a vizsgálatok kivitelezésében nyújtott értékes segítségükért. Köszönetet mondok mindazon kollégáknak, akik a kísérletek megtervezésében és kivitelezésében elméleti és gyakorlati segítséget nyújtottak: Dr. Somogyi Anikónak, Dr. Kéry Ágnesnek, Dr. Horváth Tündének, Dr. Kassai-Farkas Sándornak, Dr. Fehér Erzsébetnek, Dr. Kovács Ágotának, Dr. Szentmihályi Klárának és Kocsis Ibolyának.
171
