Célcsoportok Funkciós csoport
Fehérjék
Szénhidrátok
Nukleinsavak
Lipidek
-NH2
α(N), Lys
+ (N-glikozid)
-
+ Ser, etanol amin
-COOH/-PO(OH)2
α(C), Glu, Asp
-
+ 5’
+ Ser, zsírsavak
-
+
-
Ser, Thr
+ primer, szekunder (O-glikozid)
+ szekunder 3’
+ glicerin, inozitol, gangliozid
Tyr
-
-
-
SH
Cys
-
-
-
S
Met
-
-
-
-CHO -OH OH
Funkciós csoport
-CONH2
Fehérjék
Szénhidrátok
Nukleinsavak
Lipidek
Phe
-
-
-
Gln, Asn
-
-
-
Arg
-
-
-
His
-
-
-
Trp
-
-
-
-
-
+4,6 SN +2,3,4(5) SE
-
-
-
+2,6,8 SN +1,3,4,7,8 SE
-
NH NH NH2
NH N 2 N H 4
N
5
3 2
+
6
N 1
3
N
5
1 2
6
N 4
N 7
N 9
8
Miért hozunk létre funkciós csoportot? 1. 2. 3. 4.
Nincs jelen ami kell pl. –COOH –NH2 Nagyobb reaktivitásra van szükség pl. –OH –CHO Szelektivitás pl. –NH2 –SH Távolságtartás pl. „spacer” Taktika: „Trial and error” 1. 2. 3. 4. 5. 6.
-
NH2 csoport kiépítése NH-NH2 csoport kiépítése COOH csoport kiépítése CHO csoport kiépítése OH csoport kiépítése SH csoport kiépítése
Amino csoport kiépítése I. A)
O
O
+
C OH
H2N (CH2)2 NH2
C NH
etilén-diamin
(CH2)2
NH2
H2N (CH2)3 NH2
1,3-diamino propán H2N (CH2)6 NH2
1,6-diamino hexán H2N (CH2)2
NH
(CH2)2
NH2
3,3'-iminobis-propilamin
etiléndiamin
Fehérje pozitívan töltött aminokkal és negatívan töltött karboxilátokkal
Kationizált fehérje blokkolt karboxilátokkal és további pozitívan töltött aminokkal
Aktiváláshoz szükséges: = EDC; aktív észter; N,N’-karbonil-diimidazol 2. Csökkenti a – és növeli a + számot pI! pl. BSA pI 4.9 → pI 9.5-11 3. Közvetett (spacer) → hidrofób kölcsönhatás 4. Alkalmazás: fehérje pl. HRP, csak 2 NH2 van glikoprotein → sziálsav 1.
B)
O
O C
O
P OH
OH
+
H2N (CH2)2 NH2
C
O
P
OH
HN (CH2)2 NH2
foszforamidát
Alkalmazás RNS, DNS (5’-OH) Chu, BCF et al. Nucleic Acid Res 14 5591 (1986)
C)
NH
a)
+ NH3
pH 7-10
C Schiff bázis
O
H
H
N (CH2)2 NH2
C
b)
H2N (CH2)2 NH2
C
Na+CN-BH3 redukció
redukció
NH2 HC H NH (CH2)2 NH2 HC
H
Spontán, pH 7-10, 10x felesleg 2. Növeli a + számot, pI-t 3. Közvetlen: a); közvetett: b) → kiterjeszthető 4. Alkalmazás: szénhidrát, glikoprotein 1.
H
D) Lindley, H. Nature 178 647 (1956) a) SH
b)
c)
pH 8-10
Br (CH2)2 NH2
(CH2)2
tioéter
S (CH2)2 NH2
NH etilénimin I
S (CH2)2 NH2
O NH
O S
CF3
hidrolízis (spontán)
(CH2)2 NH CF3
védőcsoport N-jódetil-trifluoracetamid
Spontán, pH 8-10, 10x felesleg (DTT), reagens metanolban, 6 M guanidium.HCl 2. Növeli a + számot, pI-t 3. Közvetett 4. Alkalmazás: fehérje 1.
Hidrazid csoport kiépítése O
H2N
a)
hidrazin hidrát (MeOH) O
H2N
NH
OH
O NH
NH2
NH
karbonsav dihidrazid
c)
O H2N
H2O
NH NH2
O
b)
+
NH2 H2O
NH
hidrazon
NH
NH NH2
NH adipinsav dihidrazid
+
H2O
O O
(vízoldékony) O
NH2
NH NH
O
NH O
(vízoldékony)
1.
Nem spontán reakció, „előaktiválás” (átalakítás reaktív vegyületté) O OH
karbodiimid
komponens vízoldékony karbodiimid
2. 3. 4.
fenol
aktív észter
szerves oldószer
vizes oldószer
Csökkenti a – számot, nő pI a) közvetlen; b) közvetett (spacer) Alkalmazás: fehérjék, mikrotites lemezek (töltés mentesítés is)
NH2
N H2N
a)
+
NH2 H2O
hidrazin hidrát (MeOH) O
NH2
b)
H2N
NH
H O H2N
pl. NaBH4
H
O NH
NH2
N
karbonsav dihidrazid
c)
H2O
H
O
NH NH2
redukció
NH
NH
O
H2O
O N
NH NH2
adipinsav dihidrazid
+
H
(vízoldékony)
NH
NH2
H
NH
NH
NH2
O
(vízoldékony)
Spontán reakció 2. Nem változtatja a töltésviszonyokat 3. Alkalmazás: szénhidrátok (dextrán, affinitás krom.) glikoproteinek (ellenanyag, enzim {HPO}) 1.
HO O O
O O
O
O H2N
NH
NH
NH2
O
Fehérje molekula perjodát-oxidált poliszacchariddal (aldehid csoporttal rendelkezik)
Adipinsav dihidrazid
HO O O
O O
N
NH O
Hidrazon kötés terminális hidrazid csoporttal
O NH NH2
Ghosh, SS et al. Anal Biochem 178 43-51 (1998) O
a)
O C
O
P OH
H2N
NH
O NH
EDC
NH2
imidazol, pH 6
C
O
karbonsav dihidrazid
OH
P
OH
HN
NH
foszforamid
H2N
O NH NH2
NH
adipinsav dihidrazid
C
O
P HN
O
Zanocco J. (1993)
Előaktiválás 2. Csökkenti a – számot 3. Alkalmazás: RNS, DNS (5’-OH) 1.
NH2
O
b) O
NH
OH NH
O NH NH2
O
Karboxil csoport kiépítése O
A)
O NH2
+
O
NH
borostyánkősav anhidrid O
Klotz, IM Methods in Enzymol 11 576 (1967)
O O
COOH savamid
OH
O COOH
NH
glutár anhidrid
O O O
O NH
maleinsav anhidrid
COOH
telítetlen
O O
O
H3C
CH3 pH 3
O O
NH
citrakonsav anhidrid
COOH
NH2
+
HOOC
2-metil-maleinsav
1. 2. 3. 4.
COOH CH3
Spontán reakció Csökkenti + , növeli - , csökkenti pI Közvetett Alkalmazás: fehérjék, szénhidrát (amino)
O
B)
C
OH
+
O C
O
COOH észter
O
O O Cl
CH2
klórecetsav
1. 2. 3.
O C
O
éter
CH2
OH
OH
Plotz, PH Biochemistry 21 301 (1982)
Spontán reakció Közvetett Alkalmazás: szénhidrát, fehérjék
C) C
SH
+ (Br)I
O
O
pH 8.5 C
CH2
CH2 OH
OH H3C
S
N
SH
S N H
tioéter
NH2
OH
-I > -Br > -Cl > -F
Aldehid csoport kiépítése A) Vicinális diolok oxidációja Bobbit, JM Adv Carbohyd Chem 11 1-41 (1956) HO
HO O O
O HO
O
10 mM nátrium perjodát O
H2O, pH 7
OH
O O
β-D mannóz részlet
C - C kötés hasadás
poliszacharid láncban
oxidáció közben (aldehid képződés)
Van Lenten, L J Biol Chem 246 1889 (1971) terminális, vicinális, cisz HO
sziálsav-specificitás O
HO OH O
O
0 oC
NH CH3
-
H
1 mM nátrium perjodát
O
HO
O
OH O
N-acetil-D-neuraminic sav részlet
O
O
HO
O
NH
+ CH3
-
OH O
a sziálsav rész szelektív oxidálása
2 H2C
O
B)
Enzimatikus oxidáció Avigad, E et al. J Biol Chem 237 2736 (1962) HO
6
O O
NeuAc
O
O HO
Neuraminadáz v. galaktóz oxidáz
OH
β-D galaktóz [N-Ac-D-galaktóz]
1. 2. 3.
Spontán reakció Közvetlen Alkalmazás: szénhidrát, glikoprotein
6
H O
O
OH HO
OH
O N
+
O
O
H p-formil-benzoesav
O C
O
NH2
O
HN
H C
N-hidroxi-szukcinimid észter
H
+
O
H
O
H
NaCNBH3
O glutáraldehid
amid UV-kromofór
C
redukció
H
NH
O szekunder amin
pH 8-10
1. 2. 3.
Spontán reakció Közvetett Alkalmazás: fehérje, nukleinsav, szénhidrát (-NH2) C S
OH C
SH
+
O
H3C
100x H
α,β-telítettlen 4-hidroxi nonenal
pH 7.2
O
H3C H
Miért hozunk létre funkciós csoportot? 1. 2. 3. 4.
Nincs jelen ami kell pl. –COOH –NH2 Nagyobb reaktivitásra van szükség pl. –OH –CHO Szelektivitás pl. –NH2 –SH Távolságtartás pl. „spacer” Taktika: „Trial and error”
1. 2. 3. 4. 5. 6.
-
NH2 csoport kiépítése NH-NH2 csoport kiépítése COOH csoport kiépítése CHO csoport kiépítése OH csoport kiépítése SH csoport kiépítése
Hidroxil csoport kiépítése OH O
NaCNBH3
+
C
pH 8
H H2N O
+
C
2. 3.
HC H
szekunder amin
OH O
etanol amin EDC
OH
1.
NH
C
amid NH OH
Aktiválás/redukció Közvetett Alkalmazás: fehérje, szénhidrát
Tiol csoport kiépítése, stratégiák Előny: vonzó mert viszonylag kevés van a fehérjékben Hátrány: könnyen oxidálódik 1. 2.
A) B) C) D) E)
( –SH –S–S–)
oxigén/nitrogén atmoszféra EDTA alkalmazása (0.01 – 0.1M) fémkatalízis (pl. BSA-hoz 0.1M) Amino csoportból Hidroxi csoportból Oxo csoportból Karboxi csoportból Diszulfid kötésből
A) Aminocsoportból
R–NH2
védett –SH
c) védett –S–S– SPDP SMPT
a) egyenes láncú
b) gyűrűs
SATA SATP SAMSA
2-iminotiolán (Traut reagens) N-acetil homocisztein tiolakton
O
O
O
a)
H3C
S O
O
S O
O
tioecetsav
SATA
NH
N
H2N NH
Duncan et al. Anal Biochem 132 68 (1983) O SATP
H3C
S O
(CH2)2
O
N
S (CH2)2
NH O
CH3 O
Fuji et al. Chem Pharm Bull 33 362 (1985)
H2N
OH
O O
SH
O
tiopropionsav
SAMSA
OH
O
O
NH2
CH3
O SH (CH2)2
NH
S HOOC
O CH3
O
NH
merkapto borostyánkősav anhidrid O
Klotz et al. Arch Biochem Biophys 96 605 (1962)
S O
CH3 H2N
HOOC NH
Előny: nincs redukció → specificitás
lásd: AcCoA
SH O
OH
b)
+
NH2 Cl
-
pH 7-10
λ = 248 nm S
-1
ε = 8840 M cm
NH
SH
-1
+
NH2 Cl
-
EDTA!
2-iminotiolan vízoldékony
Traut, Biochemistry 12 3266 (1973)
NH2 O 10-20x
S
NH O
O
pH 7-7.5 CH3
AgNO3 segít
HN NH
CH3 SH
O
N-Ac-homoszerin tiolakton
Eldjarn et al. Acta Chem Scand 17 2610 (1963)
(IMMOBILIZÁLÁS)
piridilditio
c)
O S
S
(CH2)2 O
N
NH
N
(CH2)2
propionsav
N DTT
(MeOH) NH
(CH2)2
Carlsson et al. Biochem J 173 723 (1978)
NH2
O
+
CH3
SMPT
S
SH S N H
S
λ = 343 nm
O
N
O "benzoesav"
S
O
O O
SPDP
S
ε = 8880 M-1cm-1
DTT
N (ACN)
O
CH3
O
Thorpe et al. Cancer Res 47 5924 (1987)
S NH
S HN
O CH3 SH
Hátrány: redukció!
(UV!)
NH O
+
B) Hidroxi csoportból
NH2 Cl
-
O
S
OH
SH +
NH2 Cl
-
Tarentino et al. Glycobiology 3 279-285 (1993)
C) Oxo csoportból hidrazid O
+
C H
H2N
O
O (CH2)2
NH O
10x SH
EDTA
C H
NH
N
SH (CH2)2
NH O
NH
acetamido CH3 AMBH
"butánsav" (EtOH)
Taylor et al. Biochem Int 1 353 (1980)
CH3 hidrazon kötés
D) Karboxi csoportból O
O C
C OH
H2N
S
S
NH2
EDC
O
O
P
pH 4.7-7.5 OH
CH2
O
O
P
NH2
S
SH
NH
ciszteamin CH2
S
NH
NH
S
S
OH
OH
redukció (DTT)
1. 2. 3.
Előaktiválás (EDC) Áttölt Alkalmazás: RNS, DNS (5’-OH), fehérjék
NH
SH
NH2
DE:
O H3C
C
S
NH
S
NH2
Cisztaminnal módosított fehérje
+
Tiol-csoportot tartalmazó fehérje
HS
NH2
2-merkaptoetilamin
O H3C
C
NH
S
S
Diszulfid kötést tartalmazó fehérje konjugátum
Inzulin – diftéria toxin A lánc Ellenanyag – toxin
Miskimins et al. 1979 Oeltmann et al. 1981
E) Diszulfid kötésből OH
OH HS
+
SH
ditiotreitol (DTT, transz)
S
X
SH
S OH
OH
vegyes diszulfid
ditioeritrol (DTE, cisz)
Cleland WW Biochemistry 3 480 (1964) S X S X
Y S
+
HS
(CH2)2
SH
+
HS
Y
OH OH
2-merkaptoetanol
X
+
HS
SH
+
+
-
NH3 Cl
HS
Y
+
S
HO
S
OH
2-merkaptoetilamin . HCl
X
SH
+
HS
Y
+
+
H3N Cl
-
S
+
S
S
NH3 Cl
-
OH
Nincs -SH komponens
X
HOOC
+ S X
(CH2)2
(CH2)2
COOH
(CH2)2
COOH
+
P
Tris(2-karboxietil)foszfin
Y
SH
O
HOOC (CH2)2
+
NaBH4
pH 8-10, puffer
Gailit J Anal Biochem 214 334 (1993)
2. 3. 4. 5.
P
oxidált foszfin (H2C)2
S
1.
HS
Spontán Felesleg fontos! (min. 20x) Alkalmazás: fehérjék (szerkezet vizsgálat) kiépített –S–S–X kötések Denaturáló szerek: urea, guanidin, SDS Egyebek: Cys, HS-CH2-COOH (tioglikolsav)
Y
COOH (CH2)2 COOH
-SH tartalmú redukálószerek S X
Y S
+
R
SH
S X
R
+
Y
SH
R
+
X
SH
R
+
X
SH
S vegyes diszulfid
S X
R S
S X
Y S
+
R
SH
+
2R
SH
S R
S
S R
S oxidált redukálószer
+
Y
SH
Tiol csoport kiépítése immobilizált redukálószerekkel SH NH
NH
NH
NH O
spacer
COCH3 N-acetil-homocisztein (1975)
S X
Y
diamino dipropilamin
S
spacer SH NH
NH
SH
NH O
Előny: „nincs” melléktermék (oxidált redukálószer) redukálószer immobil regenerálható
dihidrolipoamid (1964)
MIBŐL? NH2
M I T ?
NH-NH2 COOH
CHO
NH2
+
+
NH-NH2
+
+
OH
SH
+
COOH
+
+
+
CHO
+
+
+
OH SH
+
+
+
+
+
+
