GYÓGYSZERIPARI MIKROBIOLÓGIA
Piacképes gyógyászati és élelmiszeripari termékek előállítása a mikrovilág képviselőinek élettani tulajdonságait ismerő szakértők közreműködésével 150 ábra (2012.09.15)
Az ipari-mikrobiológia, profitot termelő alkalmazott tudomány (1870) “Il n y a pas des sciences appliquées. Mais il y a des applications de la science” Louis Pasteur 1876 If you take care of your microbial friends, they will take care of your future David Perlman 1960
KÜZDELEM A MIKROBIÁLIS KÓROKOZÓK ELLEN
antibiotikumok felfedezése Mikroorganizmus által létrehozott hatásos anyag a mikroorganizmusok szaporodásának akadályozására (antibiózis) P. Vuillemin 1889 (a szimbiózis ellentéte) Roberts 1870 Penicillium glaucum tenyészete mellett nem nő a baktérium 2500 éves kínai feljegyzés szerint, szóján növekedő penész sikerrel alkalmazható a furunkulus ellen
Kemoterápia Paul Ehrlich (1854-1915) 1906 Nobel-díj „Corpora non agunt nisi fixata” P. Ehrlich — O. Hata 606 Salvarsan — arzén származék A lues feltételezett korokozója leküzdésére Treponema pallidum Τρεπο νεµω (forgó ( fonal) mérete 0.2 µm x 5 µm!
SALVARZÁN gátolja a piruvát dehidrogenáz komplex működését, (liponsavval a hatás felfüggeszthető!) liponsav hiányt okozva akadályozza az acetil-S-CoA képződését piruvátból
A salvarzán hatásmódja
Prontosil — Mietzsch & Klarer Domagk 1935 — PAB analog
A tetrahidrofólsav képződést zavarja a szulfonamid jelenléte, a dehidrofólsav reduktáz működését pedig a trimetoprim
2,4-diamino-5(3,4,5-trimetoxibenzil)-pirimidin
pyrimetamin, a 2,4-diamino-5(p-klórfenil)-6-etil-pirimidin.
A tetrahidrofólsav kiemelkedő élettani jelentőségét igazolja többek között a timin képzésben vagy a hem bioszintézisben játszott szerepe
A szulfonamidok baktérium-spektruma Gram-pozitív és Gram-negatív mikroorganizmusokon kívül az Actinomyces, Toxoplasma és Coccidium fajok, valamint a Plasmodium malariae ellen is felhasználhatók, sőt néhány Rickettsia szaporodását is gátolja Gyenge hatású viszont az Escherichia, Pseudomonas, Proteus, Klebsiella, Brucella, Aerobacter fajokkal szemben.
PAB analógként a tetrahidrofólsav képződést akadályozza
Para-amino-szalicil sav p-amino-benzoesav analógként a tetrahidrofólsav képződést zavarja
Izo-nikotinsav-hidrazid (piridoxálfoszfát) piridoxamin, nikotinsavamid analóg
A triptofán szintetáz aktív centrumában működő piridoxál-foszfát Schiff bázist alkotva a szerinnel, képes reagálni az indol glicerofoszfáttal. Az INH zavarja ezt a reakciót.
A hatóanyag eloszlása a szevezetben
A giráz működését zavarja
az RNS magra feltekeredett DNS fellazítását végző giráz működését gátolja
PEFLOXACIN 1-etil-6-fluoro-7-(4-metil-1-piperazinil)4-oxo-1,4-dihidro-3-kinolin karbonsav
Nalidix sav
Girázgátló hatású antibiotikum! Streptomyces spheroides, S. niveus, S. griseoflavus, S. griseus, valamint több nem azonosított Streptomyces törzs termékeként is leírták. Benzoesav származékkal szubsztituált kumarin származék, amihez egy novióz kapcsolódik. Mindkét aromás komponense shikiminsavból, a cukor komponens pedig UTP-glükózból képződik. novióz
kumarin származék
benzoesav származék
A terápiás szélesség megállapítása
• • • • • • • •
Anyagfelhalmozódás szövetenként eltérő Vér-agy gát működése Placenta elkülönítő hatása Anyaglebomlás útja (mellékhatások) Köztestermékek biológiai hatása, toxicitás kiürülése A hatóanyag távozás: Vizelet, fécesz, verejték, légzőszerv
Hatóanyag bevitel • • • • • • •
Infúzióval Emésztő csatornán Intravénásan Intramuszkulárisan Subcutan Inhalálás útján Hám felszínére juttatva (kenőcs, gél, tapasz)
Antibiotikumok „aranykora” Hatásmód szerint megkülönböztethetünk baktérium sejtfalszintézist gátló, membránkárosító, fehérjeszintézist gátló, DNS képződést gátló, RNS szintézist gátló vegyületeket. Kémiai szerkezet szerint megkülönböztethetők az azetidinon (ß-laktám) szerkezetűek aminoglikozidok, tetraciklinek, makrolidok, ansa-láncúak, oligopeptidek, antraciklinek, poliéterek, spirolaktonok, ciklopentano-perhidrofenantrén vázúak, poliének, poliketid vázból épülők, antimetabolitok (anyagcsere köztestermékek, nukleotidok és aminosavak analógjai),
Különböző antibiotikumokat termelő mikroorganizmusok rendszertani csoportjai Antibiotikum Gombák Aminoglikozidok Anthraciklink Ansaláncuak Bleomycinek Chloramphenicol Cycloserin βlaktámtípusúak +++ Makrolidok Tetraciklinek Poliének Fungisztatikumok ++
Streptomyces Micromonospora Nocardia +++ +++ ++ +++ ++ +++ ++ +++ +++ ++ +++ ++ +++ +++ ++ + +++ ++ ++ +++ +++ ++ ++. +
Baktériumok +
++ +
Fonalas prokarióták által termelt hatóanyagok Ipari szempontból Jelentősebb törzsek neve Streptomyces rimosus Streptomyces griseus Streptomyces aureofaciens Streptomyces venezuelae Streptomyces noursei Streptomyces kanamyceticus Streptomyces fradiae Streptomyces erythreus Streptomyces cinnamonensis
A hatásos anyag neve Oxitetraciklin Sztreptomicin (Actidion) Aureomicin Klóramfenikol Nisztatin (Actidion) Kanamicin Neomicin (Actidion) Eritromicin Monensin
A Sermonti és Hopwood által részletesen vizsgált Streptomyces coelicolor géntérképének felderítettsége. Mai típustörzse S. violaceoruber (ATCC 14980). A Streptomyces lividans vektorgazdaként került Hopwood laboratóriumába. Escherichia coli-ban és a Streptomyces lividans--ban is jól működő, bifunkcionális plazmidjaik megalkotása Streptomyces lividans légmicéliumának átalakulása spóralánccá
A Streptomyces-plazmid restrikciós térképe. A restrikciós enzimek hasítóhelyeit. Ez a plazmid a Streptomyces coelicolor A3, a Streptomyces lividans 66 és a Streptomyces parvulus ATCC 12434 törzsekben képes replikálódni.
A penicillin bomlékonysága
• A kutató munka igazolta a fonalas gombafajok genetikai állományában a penámváz szintézisére szolgáló enzimek génjeinek jelenlétét ASCOMYCETES (perfekt) DEUTEROMYCETES (imperfekt) Emericella nidulans Aspergillus nidulans Eurotium Penicillium notatum (chrysogen Sartorya Epidermophyton Eupenicillium Trichophyton Talaromyces Microsporum Carpenteles Malbranchea Thermoascus Polypaecilum Gymnoascu Arthroderma Nanizza
Aminosavösszetétel egyezése
A fonalas gombák DNS állományában a Cephalosporin váz képzéséhez szükséges enzimek jelenlétét igazolták Az N penicillin képződéséhez szűkséges; ACV tripeptid szintetáz (ACVs), és izopenicillin N szintetáz (IPNs) enzimeken kívül; az izopenicillin epimeráz továbbá a gyűrűtágító rendszer, az expandáz, dezacetoxicephalosporin C szintetáz valamint a befejező lépéseket katalizáló hidroxiláz, aciláz karbamoil transzferáz, és a metiltranszferáz jelenléte is bizonyított.
ASCOMYCETES Emericellopsis Byssochlamys Arachnomyces Anixiopsis
DEUTEROMYCETES Cephalosporium acremonium (Acremonium chrysogenum) Paecilomyces persicinus Scopulariopsis Diheterospora Spiroidium
Penicillium notatum
Penicillium chrysogenum
A két faj között észlelhető anatómiai eltérés
Az antibiotikum képződése a
Penicillum chrysogenum fiziológiailag aktív csúcssejtjében folyik
A penám váz képződésének a szerveződése
Prökaróta és eukarióta Izopenicillin-N szintetáz kémia szerkezeztének (aminosav-szekvencia) összehasonlítása Az aminosavak bekeretezése hívja fel az olvasó figyelmét a kis mértékben eltérő szerkezetre!
Azetidinon származékok képződésének a vázlata penám és kefém termékek képződése
ß-laktám antibiotikumok képződése különböző mikroszervezetek fiziológiailag aktív sejtjeiben Penicillin-G
Cephalosporin-C
Cephamycin-C
Penicillium chrysogenum Acremonium chrysogenum Streptomyces clavuligerus
Az építő elemek (a három aminosav)
szintézise
L α-aminoadipinfélaldehid a prokariótákban a lizin metabolizmus köztes terméke
Lizin bioszintézis köztes terméke a gombákban
Folyamatábra
Magyarázó szöveg a penicillin gyártás folyamatábrájához (1) termelőképesség szempontjából "nemesített ipari törzs" (2) agar tenyészet, vagy rizs szemeken spórázó tenyészet (3) termelőképesség szempontjából minősített spóraszuszpenzió (4) oltóanyagtenyésztő bioreaktor, keverővel ellátott, aerob inokulum-fermentor (5) pH szabályozott, kevert aerob termelő fermentor prekurzor [fenilecetsav] adagolással (6) a semleges fermentlé szúrése vákuum dobszűrővel (7) hűthető tároló tartály (8,9,10) szeparátort igénylő extrakciós lépések (11) penicillin-só kristályosító (12) szűrőcentrifuga (13) vákuum szárítószekrény (14) granuláló (15) átkristályosító (16) szűrő (17) prokainsó képzés (18) penicillin-nátrium-só steril átkristályosítása (19) steril szűrők (20) vákuum szárító (liofilező) (21) steril penicillin tároló (22) Kiszerelés gyógyszertári forgalmazhatóság céljára.
Miért nem toxikus a penicillin?
A pentapeptid D-Ala—D-Ala végződésének az összehasonlítása a G-PENICILLIN szerkezetével
penicillináz
Az azetidinon származékok első kifejlesztői a létért való küzdelemben a pokarióták voltak Streptomyces clavuligerus, Nocardia lactamdurans, Lysobacter lochenigenus, Flavobacterium A fonalas gombák a prokariótáktól vették át a génállományt A Streptomyces clavuligerus Cephamycin-C termelésére képes
Cephamicin képződés
izopenicillin N-ből a prokariótákban
Streptomyces clavuligerus cefamycin mellett a penicillinázt inaktíváló hatásos vegyületet is szintetizál
Nem csekély sikert könyvelhet a két, biológiai szempontból akltív vegyület forgalmazója
A ß-laktám szerkezet jelentősége alkalmas szubsztituens jelenlétében a ß-laktám gyürű is elegendő a hatás kiváltásához
nocardicinek
monobactámok
G-penicillin kémiai szintézise 1949-ben csupán 1%-os hatásfokkal !!!
A penám és cefém váz felhasználása A félszintézis jelentősége A bakteriális spektrum szélesítése A felszívódás javítása A saválló tulajdonság javítása Penicillináz rezisztencia fokozása
6-APS A penicillin félszintézis kindulási anyaga
A képződő penám váz könnyen dimerizálódik, illetve a jelenlevő CO2 -dal reagálva inaktíválódik
A penicillináz rezisztens methicillin szerkezete
A vérszint alakulása
Ampicillin—D-fenilglicin származék előállítása
Oxacillin előállítása félszintézissel
cefoperazon
A Streptomyces orientalis törzs termékeként izolált
Vancomycin a glikopeptid antibiotikum-csoport gyógyszerként forgalomba került tagja
Az antibiotikumcsoport néhány tagja
Rezisztenciát okoz a D-Ala végződés tejsavra való cserélődése
Ezt az egyszerű szerkezetű, (D-4-amino-3-izoxazolidon) Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok növekedését gátló, főleg antituberkulotikumként felhasználásra került antibiotikumot az ötvenes évek derekán, négy egymástól független kutatócsoport, négy különböző Streptomyces törzs fermentlevében találta Harned: S. orchidaceus. Shull: S.lavendulae. Harris: S. garyphalus. Kuzikava: S. roseochromogenes
A foszfonomicin gátolja a PEP részvételét a bioszintézisben A Merck kutatói több Streptomyces törzs (S. fradiae, S.viridochromogenes, S. wedmorensis) tenyészlevében is megtalálták.
Membránt károsító cirkuláris peptidek Bacitracin
Gramicidin S cyclosporin-A
A Bacillus licheniformis tenyészlevében felszaporodó hatóanyag foszfatázgátlóként akadályozza a muraminsav-pentapeptid távozását a prokarióta citoplazmájából
Tiotempláton szintetizálódik
Gramicidin S depsipeptid szerkezete (2 pentapeptid) a termék polaritását a 2 ornitin egyirányba ható aminocsoportja képviseli L Pro – L Val – L Orn – L Leu – D Phe
D Phe – L Leu – L Orn – L Val – L Pro
A Bacillus brevis termelte decapeptid, a GRAMICIDIN-S szintézise oszlopreaktorban, rögzített enzimekkel (Wang et al. M.I.T.)
Gombák növekedését gátló hatóanyagok felhasználása más farmakológiai feladatok megoldására Immunszupressziv hatás Koleszterinszint szabályozás
A 33 tagu gyürüs peptid aminosav összetétele: 1:N-metil-γγ-butenil-γγ-metil-L-treonin, 2:aminovajsav; 3:szarkozin; 4:metilvalin; 5:valin; 6:metil-leucin; 7:alanin; 8:D-alanin; 9:metil-leucin; 10:metil-leucin; 11:metil-valin (Az egyetlen D-alanin kivételével minden aminósav L )
A Trichoderma polysporum tenyészet termelte depsipeptid, a cyclosporin-A immunszupresszív aktivitású
Immunszupresszív hatású bioaktív makrolidok Az intravénásan illetve szájon keresztül is adható vegyület Streptomyces tsukubaensis tenyészlevéből izolálható. Gátolja a T-sejtek aktíválását. A citoszolban kialakuló komplex gátolja a calcineurin aktívitását, a kalcium-függő szerin/treonin foszfatáz hatásos működését. Az intracelluláris receptora azonban nem azonos a ciklosporint kötő fehérje szakasszal,
A „-vastatin” vegyületcsoport a 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA redukcióját (már 1 nM) kompetitíven gátolva akadályozza a mevalon-sav képződését, a mevalon-sav hiány viszont akadályozza a(z ergo)szterin szintézist. Ezért gátolja a gombák növekedését
A mevalonsav oxidoreduktázt gátló "-vastatin" vegyületek a zsírsav szintézis enzimeit alkalmazva malonil-CoA építőelemek felhasználásával sztearinsav méretű ∆8,14,16-trienil-β,δ-dihidroxi-oktadecén-savon keresztül készülnek
Riboszómális fehérjeszintézist gátló biológiailag aktiv termékek
Az aminoglikozid antibiotikum csoport Waksman által elsőként talált képviselője A riboszóma 30S alegységében az S-12 fehérjéhez kötődik. Katalitikusan hidrogénezhető pl. nehézhidrogénnel, triciummal
A rezisztencia oka lehet a templát módosulása is!
Escherichia coli-ban egy 4-500 aminosavat tartalmazó peptidlánc 15-20 másodperc alatt készül el. Egy mRNS egyidőben 4-5 riboszómához kapcsolódhat egymástól 97 nukleotídnyi távolságra. A mRNS életidejét működésben létének köszönheti. Általában átlagban 50 ciklust ér meg, ha folyamatosan szolgálatban van, azaz működő riboszómákkal van kapcsolatban, mert a riboszómához kapcsolt mRNS-t a ribonukleáz nem képes bontani.
Micromonospora purpurea terméke
Streptomycin szintézis
MAKROLID SZERKEZETŰ ANTIBIOTIKUMOK
A Streptomyces erythreus által termelt makrolid szerkezetű antibiotikumok első képviselője
TETRACIKLINEK
Oxitetraciklin spontán lebomlása
α-doxycyclin előállítása oxytetracyclinből
vérszint alakulása α−doxycyclin adagolása után
Riboszómális fehérjeszintézist gátolja az eukariótákban Streptomyces törzsek tenyészlevéből izolálható
[7-klór-4,6,2’-trimetoxi-6’-metil-2’grizén-3,4’-dion] képződése Penicillium griseofulvum tenyészetében
Ansaláncú antibiotikumok
Rifamycinek a Nocardia mediterranea tenyészlevében
A rifamycinek biológiai aktivitásának összehasonlítása MIC érték in vitro Staphylococcus aureus mérőtörzs használatakor mg.ml-1
Staphylococcus aureus fertőzés kivédése egérben in vivo végzett méréssel mg/kg i.m. adva mg/kg per os adagolva
rifamycin-B
0,026
305
500
rifamycin-O rifamycin-S rifamycin-SV rifamp(ic)in
0,01 0,005 0,005 0,002
500 65 18 0,12
500 172 74 0,11
Rifamicin ansa láncú antibiotikum-csoport
A rifamycin váz szintézise tiotempláton folyik a zsírsavszintézishez hasonlóan, metilmalonil-CoA elemekből. A bioszintézis az aromás mag képződésével indul.
FUNGISZTATIKUMOK
Polién fungisztatikumok mikozamin
Streptomyces noursey által termelt polién szerkezeti képlete (C47 H75O17N) az építőelemeinek feltüntetésével
Mikózamin képződése glükózból
Fumagillin Aspergillus fumigatus
Új antibiotikum előállítás (kutatás) műveletei Talajminta, élőhelyekről populáció gyűjtése Ismételt szélesztés szilárd táptalajra, majd az önálló telepeket tartalmazó lemez fertőzése Homogén tenyészet izolálása a tesztorganizmus növekedését gátló telepről Levegőztethető tenyészet indítása nitrogén- és szénforrást tartalmazó folyékony táptalajon. A tenyészet biológiai aktivitásának meghatározása
Inokulum oltáshoz használható tenyészet előállítása, az optimális paraméterek megállapítása A termelés szempontjából optimális fizikai és kémiai körülmények keresése A hatásos aktivitás mennyiségi meghatározása, tárolhatóságának (stabilitásának) vizsgálata, az aktivitás fél-életidejének meghatározása, Biológiai homogenitásának vizsgálata. A termék kinyerése
Kromatográfiás módszerrel a biológiai aktivitás homogenitásának vizsgálata (bioautográfia) Baktérium spektrum vizsgálata (Gram+, Gram–, élesztő) A hatóanyag kémiai természetének vizsgálata, meglevő anyagokkal való összehasonlítás Toxicitás-vizsgálat, állati vagy növényi sejteken Hatásmód vizsgálata A metabolizmus vizsgálata a gazdaszervezetben és a pusztítandó baktériumban Rezisztencia kialakulásának vizsgálata A hatásos anyagot termelő törzs élettani képességeinek vizsgálata, javítása Előnyösebb hatású származékok előállítása
