EKSPRESI GEN inaZPADA BEBERAPA GALUR Bradyr Itizobilllll japolliclll1l
TOLERAN ASAM-AL
FARlDA ARlYANI
JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 1998
RINGKASAN F ARlDA ARIY ANI. Ekspresi Gen inaZ Bcberapa Galur BradyrhizobiulII japoniclIlII Toleran AsamAl (Expression of illaZ Gene in Sereral BradrrhizobiulII japonicu/Il Acid-AI Toleranl Sirains). Dibimbing oldl TEDJA IMAS dan ARIS TRI WAHY UD I. Penclitian lerdahulu yang berlallgsung di Laboraloriwn Mikrubiologi JurUSatl Biologi, F.tv1lPA, IPB, lelah berhasil menyeleksi beberapa galur Bradyrhizobium japoniclIlII loleratl aSliln-AJ yang diltarapkatl dapal ditllattfaalkatl sebagai simbion kedelai pada lattah asam. Unluk lelaall kematnpUatl hidup bakleri lerscbul di lingkwigati alatlU dibulultkatl sualu penatlda yang bersifal slabi!. Gen inaZ merupakatl salall salu pelUlllda lIIulekuler yang scring digWtakatl dati dapal dipimIaltkatl ke bakleri lain melalui lelunk kOlUugasi. Gen inaZ lerdapal pada plasnud pJLI703 Escherichia coli DH5u (dunor = D). Pemindallatl gcn ini ke B. japonicZIIn (rcsipien = R) membutultkan plasmid lain (pRK2013 E. coli HBIOI) yang bcrtindak sebagai penolong (helper = H). Konjugasi yang demikian dikenal sebagai konjugasi tiga tetua. Tujuau penelitian ini untnk mempelajari ekspresi gen inaZ pada bcbcrapa galur B. japonicum tolerdll asam-AJ pada fase sel dan bakteroid. Penentuau media seleksi dilaknkau dengan menwnbultkan enatn galur uji (OS, 09, 15, 32, 38, dan 45) B. japonim/ll loleml aSliln-AJ pada media agar Matulol Ekstrak Khalllir (MEK) dati dua galur E. coli pada media agar Luria (LA) yatlg masing-ntasing dilambalu atltibiolik rifampisill dati kattalluSlll dellgatl lingkalan konselllrasi berkisar atllard 100-250 J.ig/m!. Hasil penenluan resislensi antibiolik lllellllluukkati media seleksi hasil konjugasi adalah media MEK yang mellgandung rifatnpisin 100 J.ig/ml dan kauamisin 250 J.ig/1Il!' Konjugasi liga tetua telall bcrhasil dilaknkau pada B. japonicum dan E. coli dengan freknensi konjugasi bcrkisar antara 0.18 x 10.7 sarnpai dengan 1.27 x 10-6 per resipien. Freknensi konjugasi tertinggi ditunjukkan oleh B. japoniculII galur 45 serumgkan terendah oleh 09. Esei nukleasi es semua koloni ekskonjugan dari elllpat galur uji (05, 09, 15, 38) meuunjukkan hasil positif, sedangkan 2 galur uji lainnya (32 dan 45) menunjukkan jumiah ekskonjugan masing-masing 40% dan 60%. Sementara itu koloni taIlllP I juga digurtakau sebagai inokulau pada tauatnan siratro. Jwnlah bintil akar yang terbcntnk diketaIllli tidak bcrkaitan dengau kentampuau membentuk nukleasi es. Suspensi bintil akar (bakteroid) seluruh ekskonjugan marnpu twnbuh pada media MEK + MK+ Rif, sementara pada media seleksi MEK + MK + Rif + Kau hanya 6 ekskonjugan. Esei kualilalif nukleasi es bakteroid menyatakau bahwa galur ekskonjugan 09.1 dan 15.5 menunjukkan hasil positif. Koloni taltap II merupakau koloni B. japonicum asal bakteroid yang ditumbultkan pada media seleksi. Esei kualilalif Ilukleasi es koloni ta1tap II lllenwuukkan hanya galur ekskOluugan 09.1 dengan hasil posilif. Dengan denrikia.tl galur 09.1 lIlaHlpU mengekspresikau gen inaZ pada fase sel dati bakleroid, kolmu laltap I dan II.
SUMMARY F ARlDA AlUYANI. Expression of illaZ Gene in Several Bradyrhizobilll1l japolliclll1l Acid-AI Tolerant Stmins. Supen·ised by TEDJA llvlAS and AlUS TRI WAHYUDI. Acid-AI toienM slrains of Bradyrhizvbilllll japvlliclim have been obtained and tile next slep is to provide a genetical marker to follow lhe fate of B. japulliwlII Acid-AItolenmt stmillS as inoculum in tileir new environment. inaZ gene is k.tlO\\1l as lhe molecular marker frequently used. The gene transfer Lo another gralllnegativc bacteria such as B. japuniclillI needs plasmid pRK2013 (Escherichia cvli HBIOI) as helper and pJLl703 (E. cvli DH5u) as donor. Such cOluugation is called tilTee parental mating. TIle objective of this research is to study the expression of inaZ gene in several B. japol1iclim acid-AI strdins in free living and bacteroid slage. TIle test Strdins (OS, 09, 15,32,38, and 45) grew well in Yeast Manitol Agar (YlvlA) supplemented with 100 J-lgiml Rifampicin wltile E. coli in Luria Agar (LA) Witil 250 ~g/llll KllllaJIl)cill. TIle medium for screening lhl! exconjuganl consist ofbuUllhe antibiotics. TIle conjugation was done well with lrequency about 0.18 x 10-' to 1.27 X 10-6 per recipien_ The highest frequency shown by stmin 45 and 09 was the lowest. All exconjugant of strdins OS, 09, 15, 38 were able to fonn an ice nucleation while tile otilers 32, 45 showed a part of it such as 40% and 60% each. TIle roct noduJes fanned were not related witil tile ice nucleation ability. The bacteroid stage of all exconjugant suspensions were able to grow an )MA + CR+ Rif 100J-lgimJ but on YlvlA + CR + Rif 100 J-lgiml + Kan 250 ftgiml O!~y six of Utem. TIle figure shows out Utat tile inlroduction of inaZ gene was not completely stable. TIle conclusion of titis study shows timt Strdin 09_1 has the capability to form an ice nucleation in free living cells as well as at bacteroid stage.
EKSPRESI GEN ;llaZPADA BEBERAPA GALUR
Bradyr";zob;1l11l japOlliCll11l TOLERAN ASAM-AL
FARIDA ARIYANI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Jurusan Biologi
JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKADAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 1998
Judul
EKSPRESI GEN
Inaz
PADA BEBERAPA GALUR
Bradyrhizobium japonicum TOLERAN ASAM-AL
Nama Mahasiswa
Farida Ariyani
Nomor Pokok
G28.0443
Menyetujui:
Ir. Tedja Imas, MS
Drs. Aris Tri Wahyudi, MSi
Pembimbing I
Pembimbing II
Mengetahui:
Yusuf ua Jurusan
Tanggal Lulus :
01 SEP 1998
RIWAYAT
mnup
Pcnulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 18 September 1972 sebagai anal< bungsu dari empat bersaudard. kcluarga Moclullrutllld Badri dan Tali Srutarti. Penulis menyclesaikan Sekolah Dasar Negeri 03 Pagi pada tahun 1985, kemudian tallun 1988 lulus dari Sekolah Menengall Pertama Negcri -19. dan tallml 1991 lulus dari Sekola11 Menengall Tillgkat Alas Ncgeri 39. keliganya berlokasi di Jakarta. Pellulis lulus seleksi masuk!PB melaluijalur Undallgan Seleksi Masuk !PB pada tahun 1991. Sctahun kCllludian diterima di Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan lImu Pengetahuan Alam. Pada lahun ajardll 199-1-1995 dan 1995-1996 penulis menjadi asisten luar biasa Praktikum Mikrobiologi Dasar. uismnping lllcluaui asistcn luar biasa Praktikulll Mikrobiulogi T,mall paua tahun ajarau 1995-1996.
KATA PENGANTAR Sujud puji dan syukur penulis panjalkim ke hadiml Allah SWT alas segala nikmal yang diberikan sehingga lugas k>lf)a illlliah ini dapal discicsawm. Teriring salmn timl slmlawat kepada Rasulullall SAW yang lllelllberikml leladan dalalll bersabar di jalml-Nya. Terima kasih Y'mg sebesar-besamya penulis ucapk>m kepada Ibu Ir. Tedja Imas, MS dan Bapak Drs. Aris Tri Wall)udi, MSi
a~lS
billlbingan dan dorongml yang diberikan selmlm penelitian sampai
penyusunan skripsi. Ucapan lerima kasih juga dis<mlpaik<m kepada Ibu Dr. Ir. Gdyull
RalIa}U
sebagai wakil kOlnisi
pcndidikan Jurusan Biologi yang lelall bersedia lllenjadi ,mggola tim penguji masalall khusus dan llIelllberik
Tidak lupa terima kasih
dilujukan kcpada Mbak Emi Y wtiarli. SSi )" aug bauyak llIcllIb,mlu kegialau pcllelitian.
Tcmkhlr sc<.:ara khusus pt:llulis IIlt:ngw.:apkan terillla kasih kepada Ibu dan kakak·kakak lersayallg serla !:iuum! len..:iula alas segala tlukUlIgaIl yang diberikau.
Sellloga kary a illlliall iIti dapal benmm[aal.
Bogor, Seplember 1998
Peuulis
DAFTAR lSI Halamall DAFTAR TABEL .............................................................................................. .
viii
DAFTAR GAIv18AR
viii
DAFTAR TABELLAMPIRAN ........... .
viii
PENDAHULUAN Lalar Bclakang .................. ...........................................................................
I
Brac{rrhizubiumjapunic:um ToIcmn Asulll-Al ,., ...... ............................................. ....
2
KUIuugasi Tiga Telua .................................................................................... ... Ekspresi GCIl inaZ ... ............................................. ...... ... ... ... ... ......... ... ... ... .......
2 3
BAHAN DAt" METODE Waklu dan Tempal Penelilian ..................... ......... ...... ... ... ........................... .... .... Sumber Galur ................................................................................................ Peremujaan Galur ........................................................................................... Penenluan Penanda Antibiolik ............................................................................ Tmnsfer Gen inaZ dcngan Konjugasi Tiga Telua ... ........................ ......... ... ... ............ Esei KualilalifNukieasi Es Kololli Tallap I... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...... ..... Esei KoalilalifNukleasi Es Bakleroid dall Kolulli Talmp]] ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...... ... ... ....
5
BASIL DAN PElv18AHASAN Hasil ...... ... ...................................................... ............... ...... ... ... ... ...... ... ..... Pemballllsan ..................................................................................................
5 7
KES!t'vlPULAN DAN SARAN ..................... ... ... ... ... ...... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ........ ...
8
DAFTARPUSTAKA ..........................................................................................
8
LAlvlPlRAN .....................................................................................................
Ii
3 3
4
4 4 4
DAFTAR TABEL Halamall l. Frckucnsi konjugasi dari E. coli DH5l1. (pJLl703) dengan galur
sccara tiga tetua ...................... ,.. ,' ......... , .......... , , .. ", ... ... ... ...... .....
6
2. Hasil esci kualilalif nukleasi es ....................................................................... ...
6
B.japoniclIll1
DAFTAR GAMBAR Halaman 3
l. Diagrdlll alir kegialan
2. Ekskonjugan gator 38 yang dilulllbuhlum pada media seleksi dengan masa inkubasi 7 hari .............................................................................................
5
3. BinUI aluu lanaman simlro hasil inokulasi galur ekskul\jugan 09.1 ... ... ... ... ...... ... ..........
6
4. Hasil esci nukl""si bakleruid galllr ckskUIuugan 15.5 dengall kunlrul pusilif Escherichia coli (pJLl703) dan kunlruillegatif galur indukB. japonicum .................... ...
7
DAFTAR TABEL LAMPlRAN l.
2. 3.
Halamall KUlllpusisi larulall Aluned Evarls yallg lelall wmudiflkasi (Speidel dall WUllllll~ 1980) ... ... ... ... ... ... ... ... ...... ... ... ... ... ... ... ... ...... ... ... ... ... ... ... ... 11 KUlllpusisi lUewa agar Martilul Ekslmk KJramir (Villcen~ 1970) ... ... ............ ... ... ...... ... ... ......... ...... ... ... ... ...... ... ... ... ... ... ......... ...
11
Kompusisi media kaldu Luria yang telall dimodifikasi (Sambrook ef at., 1989) ...... ... ... ... ... ... ......... ...... ......... ...... ...... ... ...... ...... ... .......
11
1
PENDAHULUAN Latar Belakang Sejak tahun 1983, pemeTintah Indonesia telah menetapkan beberapa kebijakan dalam rangka meningkatkan produksi kedelai antara lain melalui pemanfaatan lahan asam dan teknologi tepat guna seperti penggunaan inokulum bakteri binti! akar (Sihombing, 1985). Namun menurut Ismail dan Effendi (1985) pemanfaatan lahan asam menimbulkan masalah yang kompleks baik bagi kedelai maupun bakteri bintil akar antara lain menyangkut proses fisiologis di dalam tanaman kedelai, pertumbuhan bakteri bintil akar, pembentukan dan fungsi binti! akar dalam menambat N2 molekuler , sehingga proses fiksasi N2 tidak berlangsung secara optimal. Hal tersebut didukung oleh Soepardi (1983) yang menyatakan bahwa kemasaman tanah mempengaruhi serapan unsur hara dan tanaman dengan 2 eara, yaitu secara langsung melalui ketersediaan ion H dan tidak langsung melalni ketersediaan unsur hara yang dapat bersifat racun. Dengan demikian, keberadaan bakteri bintil akar yang toleran tanah asam dan aluminium tinggi serta memiliki efektivitas yang tinggi dalam memfiksasi N2 sangat dibutuhkan. Sementara itu dari penelitian yang bedangsung di Laboratorium Mikrobiologi FMIPA IPB berhasil diperoleh galur-galur Bradyrhizobium japonicum toleran asam-A! yang diharapkan dapat dimanfaatkan sebagai simbion kedelai di tanah asam (Endarini, 1995). Namun kemampuan hidup bakteri tersebut di lingkungan alami dan kompetisinya terhadap bakteri lain belum ditelaah. Tclaah untuk membedakan bakteri introduksi ~dcngan bakteri alami memedukan suatu penanda yang bersifat stabil. Penanda yang dapat digunakan haruslah bcrSlfat spesifik, dapat diandalkan, dan dapat dllcrapkan pada bakteri introduksi (Vincent, 1'170). Beberapa penanda yang dapat digunakan antara lain dengan memanfaatkan eiri serologi, anllblotik, dan genetik. Menurut Bushby (1982), p<:nanda genetik dapat diandalkan dan p<:ncrapannya mudah. Salah satu penanda molckuler yang sering digunakan adalah gen inaZ. (;cn tcrscbut menyandikan protein yang mampu mcmbcntuk inti kristal es pada suhu di bawah titik bcku (Lindow, 1990). Lindgren, Frederick, GO\1ndrajan, PanapauIos, Stakawicz, dan Lindow
(1989) menambahkan bahwa esei gen inaZ menunjukkan sensifitas yang tinggi, dapat dilakukan tidak dengan substrat radioaktif dan peralatan yang mahal. Gen inaZ dapat dipindahkan ke bakteri lain melalni konjugasi (Ditta, Stanfield, Corbin, dan Helinski, 1980). Namun plasmid pembawa gen inaZ tidak dapat pindah sendiri (swatransfer), sehingga untuk memindahkannya ke dalam sel lain membutuhkan gen tra yang terdapat pada plasmid penolong (heiper). Pada umumnya plasmid penolong ini bersifat bunuh diri (suicide). Pemindahan gen inaZ dengan bantuan plasmid penolong ke dalam sel B. japon/cum dikenal dengan sistem konjugasi tiga tetua atilll triparenlai mating.
Bradyrhi:;obium japonicum Toleran Asam-A1 Bradyrhizobium japonicum merupakan bakteri gram negatif dengan ukuran 0.5-0.9 x 1.2-3.0 "m. Bakteri ini tidak membentuk spora, berbentuk batang, motil dengan satu flagela polar atau sub polar, dan bersifat aerobik (Jordan, 1984). Bakteri tidak mampu menyerap warna merah kongo (0.0025%) dari media Manitol Ekstrak Khamir (MEK) apabila awal iukubasi berlangsung dalam ruang gelap. Koloni B. japonicum berbentuk bundar, eembung, jarang sekali tembus eahaya, berwarna putih, tekstur cenderung granular dengan diameter koloni tidak lebih dari 1 mm dalam 5-7 hari iukubasi pada media MEK. Lebih dari 30% popuIasi bakteri ini mampu tumbuh pada pH 4.0 dan beberapa tumbuh pada pH 3,.5 (Jordan, 1984). Sementara itu 21 galur B. japonicum toleran asam-A! telah berhasil diperoleh Endarini (1995) dan Fitri (1995) melalui seleksi kemampuan tumbuh 50 galur pada media agar Ayanaba el ai. dan kaldu Keyser dan Munns dalam lingkungan pH 4.5 dan A! 50 J.1M. Galur-galur tersebut lebih mampu mengakumuIasi amonium dibandingkan galur-galur sensitif Bakteri B. japonicum diketahui memiliki resistensi terhadap antibiotik (tetrasiklin, streptomisin, penisilin G, vionusm dan vaukomisin) dan sensitif terhadap zat penghambat pertumbuhan seperti D-alanin dan ethidium bromida (Jordan, 1984). Resistensi antibiotik masing-masing galur beragam dan di pihak lain mutasi spontan terhadap antibiotik umumnya teIjadi pada galur liar B. japonicum.
