Adverse Outcome Pathways (AOPs) – nový koncept v (eko)toxikologii
Pavel Babica RECETOX – Research R hC Centre t ffor T Toxic i C Compounds d iin the Environment Masaryk y Universityy Brno, Czech Republic
(Eko)toxikologie Studium škodlivých účinků chemických látek na živé organismy - symptomy, mechanismy a léčba otrav, odhady bezpečné dávky, limity pro koncentrace v prostředí Metody – Případové a epidemiologické studie (retrospektivní, prospektivní) – Experimentální metody (prediktivní) – Experimenty s živými organismy – in vivo •
Lidé
•
Zvířata
– Experimenty s částmi živých organismů – ex vivo & in vitro & in chemico •
Izolované orgány
•
Tkáňové kultury
•
Buněčné organely a extrakty
•
Purifikované biomakromolekuly
– Počítačové simulace a modelování – in silico
TOXIKOLOGIE & EXPERIMENTY NA ZVÍŘATECH • • •
(Regulatorní) toxikologie – od 20. století založena primárně na in vivo metodách – experimenty na hlodavcích OECD Test Guidelines většina metod vyvinuta před 30.-60. léty OECD TG / D i ti Description 401 402 403 404 405 406 407 408 409 410 411 412 413 414 415 416 417 418 419 …
Acute oral toxicity, LD50 Acute dermal toxicity Acute inhalation toxicity Acute dermal irritation / corrosion Acute eye irritation Skin sensitisation Repeat dose oral toxicity (28 days), rodents Repeat dose oral toxicity (90 days), rodents Repeat dose oral toxicity (90 days), non-rodents Repeat dose dermal toxicity (21/28 days), rodents Repeat dose dermal toxicity (90 days), rodents Repeat dose inhalation toxicity (28 days), rodents Repeat dose inhalation toxicity (90 days), rodents Prenatal development toxicity (teratogenicity) One generation reproduction toxicity Two generation reproduction toxicity Toxicokinetics Delayed neurotoxicity of organophosphates (acute) Delayed neurotoxicity of organophosphates (28 day repeat dose)
Etické důvody
Ne zcela N l vyhovující h jí í hl hlediska di k současných požadavků
Relevance a spolehlivost
Nutnost p přehodnocení dosavadních přístupů
Zohlednění pokroků a Pokrok v technologiích
nových objevů v biologii, biologii metodologii, instrumentaci
Ekonomická a časová náročnost
6.5%
7.8%
9.9%
8.5%
8.7%
1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
1996
1999
2002
2005
2008
EU15
EU15
EU15
EU25
EU27
Poce et zvirat na a toxikolog gii (mil.)
Ce elkový poccet zvirat ((mil.)
14 12 10 8 6 4 2 0
Toxikologický výzkum ale odpovídá až za 70% těch nejbolestivějších experimentů (dávky jedů způsobující poškození organismu)
TOTAL TOX
Liebsch et al. 2011 Arch Toxiicol; 2nd-6th Rep port from the Co ommission to the e Council and th he European Pa arliament on o the number of o animals used d for experimenta al and other scie entific purposess the Statistics on
EU 2005
TOXIKOLOGIE & EXPERIMENTY NA ZVÍŘATECH • • • • •
Eticky diskutabilní - tlak odborné i laické veřejnosti 1959: Russel & Burch: “3Rs principle” Replacement - nahrazení in vivo experimentů alternativami Reduction - snížení počtu zvířat pro zjištění požadovaných informací Refinement - snížení bolesti a utrpení
•
Direktiva 86/609/EEC (1986) „on the protection of animals used for experimental and other scientific purposes“a revidující Dir. 2010/63/EU => aktivní podpora vývoje, validace a zavádění metod v souladu s 3R principem ZEBET - Centre C t for f the th Documentation D t ti and d Evaluation E l ti off Alternatives Alt ti to t Animal A i l Experiments E i t ECVAM (1991), EURL-ECVAM (2011): European Union Reference Laboratory for alternatives to animal testing USA: ICCVAM/NICETAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods/National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods)
•
Reg. 1223/2009 (nahrazuje „Cosmetic Directive“ 76/768/EEC – 2010 AnnexIII) platí zákaz testování kosmetických produktů a přísad na zvířatech a zákaz marketingu takových produktů v EU
• •
Directive 98/8/EC (Biocides testing) Reg. EC 1107/2009 (Plant Protection Products)
Rok
TG
Název
EU
3R akce
1981
401
XXX
Acute oral toxicity, LD50
2002: Replaced by TGs 420, 423 and 425, introducing refinement and reduction)
1981
402
B3
Acute dermal toxicity
1987: Animal test introducing reduction compared to the original TG (lowering of th dose the d level) l l)
1981
403
B2
Acute inhalation toxicity
Animal test introducing potential reduction in animal usage compared to original 403, if one sex is more susceptible. Refinement by applying humane endpoints.
1981
404
B4, B40
Acute dermal irritation / corrosion
2002: Animal test with a sequential testing strategy for acute dermal irritation and g in vitro screens corrosion that introduces refinement and reduction,, including
1981
405
B5
Acute eye irritation
2002: Animal test with a sequential testing strategy for acute eye irritation and corrosion that introduces refinement and reduction, including in vitro screens
1981
406
B6
Skin sensitisation
1992: Animal test introducing reduction by 50% compared to original OECD TG
1981
407
B7
Repeat dose oral toxicity (28 days), days) rodents
1995: Animal test introducing refinement compared to original OECD TG (more information on best dosing practice, more information from the same animal)
1981
408
B26
1998: Animal test (more information from the same animal than in the original test)
1981
409
B27
Repeat dose oral toxicity (90 days), rodents Repeat dose oral toxicity (90 days), non-rodents d t
1981
410
B8
Repeat dose dermal toxicity (21/28 days), rodents
1981
411
B28
Repeat dose dermal toxicity (90 days), rodents
1981
412
B9
Repeat dose inhalation toxicity (28 days), rodents
Animal test providing more information from the same animal than in the original test method.
1981
413
B29
Repeat dose inhalation toxicity (90 days), rodents
Animal test providing more information from the same animal than in the original test method.
1981
414
B31
Prenatal development toxicity (teratogenicity)
2001: Animal test (introduces reduction compared to the original OECD TG, requiring 20% fewer animals, more information from the same animals)
1981
451
B32
Carcinogenicity
Animal test. A Guidance Document is under development addressing issues on reduction and refinement.
1981
452
Chronic toxicity
Animal test. A Guidance Document is under development addressing issues on reduction and refinement.
1981
453
Combined chronic / carcinogenicity
Animal test. A Guidance Document is under development addressing issues on reduction and refinement.
B33
1998: Animal test (more information from the same animal than in the original test)
Rok 1992
TG 420
1995
421
1996
422
1996
423
1998
EU B1
Název
3R akce
Acute oral toxicity, fixed dose method 2001: Animal test (reduction and refinement method in comparison with the conventional TG 401), less suffering, smaller number of animals Reproduction / developmental toxicity Animal test (reduction method compared to original TGs), new screening test provides essential information with a minimum number of animals screening study
Combined repeat dose with reproduction / developmental screening Acute oral toxicity, toxic class method
Animal test (reduction method compared to the individual TGs), combines the new screening test on reproduction toxicity with TG 407, and further reduces the number of animals to an absolute minimum for these combined endpoints
425
Acute oral toxicity, up and down method
2004
428
Skin absorption: p In vitro method
2001: Animal test (reduction method compared to the conventional TG 401), smaller number of animals, provides a closer estimate of the LD50 than TGs 420 and 423 In vitro alternative to the in vivo method ((TG 427))
2002
429
Skin Sensitisation: Local Lymph Node Animal test (reduction and refinement method compared to TG 406), provides more information and causes less suffering Assay
2004
430
2004
431
In vitro test method (ex vivo test) for the corrosion part of TG 404 In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance Test (TER) In vitro test method for the corrosion part of TG 404 In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test
2004
432
In Vitro 3T3 NRU phototoxicity test
In vitro test method (no OECD TG existed for an animal test)
2006
435
In Vitro Skin Corrosivity
In vitro test method for the corrosion part of TG 404 (for specific applications, only applicable to acids and bases)
2009
436
Acute Inhalation Toxicity: Acute Toxic Animal test introducing reduction in animal usage compared to TG 403, and refinement by applying humane endpoints. Class ((ATC)) Method
2009
437
Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP)
Animal test introducing reduction in animal usage compared to TG 403, and refinement by applying humane endpoints.
2009
438
Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method
An in vitro screening test for identifying potential ocular corrosives and severe irritants in a tiered-testing strategy, as part of a weight-of-evidence approach.
2009
455
In vitro test (could possibly introduce reduction if used in a testing strategy for Stably Transfected Human Estrogen Receptor-α Transcriptional Activation detection of endocrine disrupting chemicals). Assay (STTA)
B1
2001 Animal test ((reduction method compared p to the conventional TG 401), ), much smaller number of animals (10% of that required for TG 401)
TOXIKOLOGIE & EXPERIMENTY NA ZVÍŘATECH • Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (Regulation EC No No. 1907/2006) – REACH – chemikálie s produkcí více než 1 t / rok -> hodnocení toxicity – odhadem cca 30000 chemických látek (Liebsch 2011, Arch Toxicol 85) – kompletní data dnes pouze pro cca 140 látek (Breheny 2011, ATLA 39) – s použitím současných metod odhadován požadavek na 9 – 54 mil. pokusných p ý zvířat ((Rovida 2009, Altex 26) – nejen etický, ale i ekonomický a časový aspekt – Annex XI: pravidla pro standardní testování zahrnují možnost interpretace výsledků z in vitro / alternativních testů: • Validované testy • „Vhodné“ (suitable) testy – dostatečně vyvinutých z hlediska mezinárodně uznávaných á ý h kkritérií ité ií pro zahájení háj í pre-validačního lid č íh procesu (ECHA)
TOXIKOLOGIE & EXPERIMENTY NA ZVÍŘATECH
2007: Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy (US National Research Council/NAS) – Mezidruhové rozdíly – Vysoké dávky, krátké doby expozice – Hodnocené parametry (smrt, nádor) X chronická expozice, nízké dávky, neletální účinky → Předpoklady a extrapolace, extrapolace faktory nejistoty – Nespolehlivost a nerelevantnost tradičních in vivo metod Farmakologie a farmaceutická toxikologie: •Pouze 43% shoda výsledků v testů na hlodavcích s výsledky klinických studiích (ECVAM) •V klinické fázi testování selhává až 92% potenciálních léčiv (Pampaloni 2009, Rec Patents on Biotech 3) – Ekonomická a časová náročnost, zastaralost, etické problémy
TOXICITY TESTING IN THE 21ST CENTURY: A VISION AND A STRATEGY Tox21 – nově připravená strategie vycházející z aktuálních poznatků a technologií s cílem: 1) Zvýšit počet testovaných látek; 2) Snížit náklady; 3) Zlepšit výpovědní hodnotu výsledků vzhledem k predikci zdravotních rizik a environmentálním koncentracím • •
• •
Primárně lidské buňky a tkáňové kultury in vitro Vlivy na biologické procesy – mechanismy buněčné odpovědi, jejichž narušení v organismu vede ke škodlivým účinkům Biomarkery indikující narušení kritických toxických drah a procesů Toxikogenomika
Automatizované a robotizované systémy hodnocení (high throughput screening, HTS)
Bioinformatika – interpretace komplexních mnohorozměrných dat z genomických studií a HTS
T Targeted d testing i x Whole-animal Wh l i l testing i
Hodnocení rizik - minimalizace narušování toxických drah v exponované populaci
Modelování závislosti dávka-odpověď pro narušování toxických drah pomocí počítačové systémové biologie a modelů
Modelování struktura-aktivita pro predikci účinků a chování látek
Extrapolace in vitro -> in vivo - farmakokinetické modely (PBPK) pro predikci koncentrací látek v p ý expozičních p podmínek p krvi a tkáních za specifických
Tox21 a ToxCast • Tox21 - http://www.epa.gov/ncct/Tox21/ – – – – –
10 000 látek 14 koncentrací (rozsah 4 řádů), 3 replikáty 1536jj destičky, y, 2-8 uL objemy j y 50+ různých in vitro testů a endpointů Robotizace: http://www.youtube.com/watch?feature=player_embedded&v=T4K-YrqtwZA
• ToxCast - http://www.epa.gov/ncct/toxcast/ – cca 2000 látek – 700+ testů, 300 signálních drah Data dostupná na iCSS Dashboard: http://actor.epa.gov/dashboard/ http://www.epa.gov/ncct/toxcast/data.html p p g
Hodnocení toxicity chemických látek Tradičně
– Hodnocení škodlivého účinku na úrovni organismu
+ Chemikálie
„„Alternativně“
Organismus
- Hodnocení účinků na nižších úrovních biologické g organizace g - Ex vivo / in vitro / In chemico / In silico metody - Testování s vysokou propustností (HTS – high throughput screening)
+ 10^4 Látek
Škodlivé účiky Smrt Inhibice růstu Ovlivnění reprodukce Nádor Kožní iritace …
HTS
?
Chemicko-biologické C é interakce Informace o mechanismech Interakce s receptory Ovlivnění signálních drah Akti it enzymů Aktivity ů Ovlivnění buněčných procesů …
Jak spojit informace o interakcích chemikálií s biologickými systémy (makromolekulami, buňkami, tkáňemi…) s informacemi o relevantních biologických odpovědích, které vedou ke škodlivému účinku (in vivo)?
Sep 3-5, 2014, NIH Campus, Bethesda, Maryland, USA Prezentace P t a videa id ke k stažení: t ž í http://ntp.niehs.nih.gov/pubhealth/evalatm/3rs-meetings/past-meetings/aopwksp-2014/index.html
OECD: Koncept „Adverse Outcome Pathway“ Adverse O Ad Outcome t P Pathway th Mode of Action Toxicity Pathway Chemical
Chemical Property
MacroMolecular Interaction
Cellular Response
Tissue Effect
Organ Response
Molecular Initiating Event
Key Event 1
Key Event 2
Key Event 3
Receptor/Ligand Interactions DNA Binding Protein Oxidation
Gene Activation Protein Production Altered Signaling
Altered Physiology Disrupted Homeostasis Altered Development / Function
In silico, In chemico, In Vitro, Ex vivo
Organism Response
Population Response
Adverse Outcome
Lethality Impaired Development Impaired Reproduction
Altered Sex Ratio Extinction
In vivo
• Analytický konstrukt popisující sérii definovaných a kazuálně spojených událostí napříč různými úrovněmi biologické organizace, které vedou k poškození zdraví nebo ekotoxicitě • Využití existujících znalostí a informací k propojení dvou ukotvujících bodů: Molecular Initiating Event (MIE) a Adverse Outcome (AO) přes sérií mezikroků, tzv. Key Events • Zlepšit možnosti využití informací a dat o mechanismech účinku pro hodnocení rizik a regulační účely • AOPs umožňuje propojit výsledky z in vitro studií a in vitro screeningu se škodlivými účinky na úrovni organismu nebo populací
Příklad AOP – Fibróza jater
• Analytický konstrukt popisující sérii definovaných a kazuálně spojených událostí napříč různými úrovněmi biologické organizace, které vedou k poškození zdraví nebo ekotoxicitě • Využití existujících znalostí a informací k propojení dvou ukotvujících bodů: Molecular Initiating Event (MIE) a Adverse Outcome (AO) přes sérií mezikroků, tzv. Key Events • Zlepšit možnosti využití informací a dat o mechanismech účinku pro hodnocení rizik a regulační účely • AOPs umožňuje propojit výsledky z in vitro studií a in vitro screeningu se škodlivými účinky na úrovni organismu nebo populací
Vývoj AOP • Identifikace interakce látky s biologickým systémem na makromolekulární úrovni – Kotva 1 = MIE • Identifikace konečného důsledku vyvolaného MIE – Kotva 2 = AO • Identifikace jednotlivých mezikroků na základě známých / dostupných informací o AO
Poloautomatizované vyhledávání literatury (budoucnost? => semantické vyhledávací programy (např. Prof. D Wild U o IIndiana)) D.Wild, di )) Konkrétní AOP: vždy 1 MIE => 1 AOP • stejná MIE může vést k jinému AO => vždy nutno definovat jako zvláštní AOP • dvě různé MIE mohou vést ke stejnému AO => vždy nutno definovat jako zvláštní AOP • počet č t definovaných d fi ý h KE neníí omezen MIE, KE, AO – mohou být sdíleny mezi různými AOPs => syntéza & propojení informací do jednoho celku
Klíč é události Klíčové dál ti • mezikroky, které jsou toxikologicky relevantní a vedou k škodlivému účinku • jsou základem pro formulování hypotéz a testování =>musí být experimentálně kvantifikovatelné • lze je zpravidla hodnotit pomocí rychlých screeningových metod
AOP Hodnocení •
Completeness (reliability & robustness)
•
Qualitative Understanding
•
Weight-of-Evidence f supporting AOP O (Bradford-Hill ( f criteria))
•
Quantitative Understanding
AOP Framework •
Podporován a rozvíjen v rámci OECD, USEPA, EC-JCR, USFDA, WHO, US Army
• OECD Guidance document & a template for developing and assessing adverse outcome pathways (No. (No 184) •
Pravidla pro vývoj, hodnocení a schvalování AOP
•
Formální proces
• Vývoj & podpora informačních nástrojů pro rychlé, široce dostupné sdílení již vytvořených AOP a pro budování nových AOP •
=> Inspirace p sociálními médii,, crowd-sourcing g
AOP Wiki • https://aopkb.org/aopwiki/index.php/Main_Page • Platforma odvozená od Wiki- p pro vývoj ý j a sdílení AOPs • Editace možná pouze členy OECD AOP projektu
• •
• • • • • •
http://www.effectopedia.org/ htt // ff t di / -> > odkaz dk na program pro spuštění ště í Effectopedia Vizuální znázornění AOPs v biologickém g kontextu: – Druh organismu, Životní stádium, Pohlaví, Trvání expozice, … – Propojení a organizace dat a informací Kvantitativní vztahy (dávka-odpověď, hypotetické, QSAR) V budoucnu i ADME (Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion) Otevřená platforma, platforma není nutný formální souhlas pro přispěvatele Kredit pro autory i recenzenty/editory Možno vkládat i fragmenty g y informací, ne jjen celé AOPs => crowdsourcing Propojení s AOP Wiki & jinými (Export<->Import)
From Aladjov, H.: Organizing the AOPs knowledge – The Effectopedia way (In: 9th World Congress on Alternatives and Animal Use in the Life Sciences, Prague, 27 Aug 2014)
From Aladjov, H.: Organizing the AOPs knowledge – The Effectopedia way (In: 9th World Congress on Alternatives and Animal Use in the Life Sciences, Prague, 27 Aug 2014)
From Aladjov, H.: Organizing the AOPs knowledge – The Effectopedia way (In: 9th World Congress on Alternatives and Animal Use in the Life Sciences, Prague, 27 Aug 2014)
From Aladjov, H.: Organizing the AOPs knowledge – The Effectopedia way (In: 9th World Congress on Alternatives and Animal Use in the Life Sciences, Prague, 27 Aug 2014)
Další zajímavé projekty a databáze • TOXNET - http://toxnet.nlm.nih.gov/ – searching g databases on toxicology, gy, hazardous chemicals,, environmental health, and toxic releases
• ToxRefDB (Toxicity Reference Database) – in vivo toxicological data – http://actor.epa.gov/toxrefdb/faces/Home.jsp
• ExpoCast – information on human exposures – http://www.epa.gov/ncct/expocast/
• Human Toxome Project – information on human exposures p – http://www.ewg.org/sites/humantoxome/
• Agriculture Health Study – Occupational Exposure to Pesticides – a cohort study – http://aghealth.nih.gov/
Workshop venue: NIH, Bethesda, Maryland
12 km
NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH • •
•
Hlavní organizace v USA zodpovědná za vládou financovaný biomedicínský výzkum Intramural Research Program (IRP) – největší biomedicínská instituce na světě (1200 PIs, 4000 post-docs), 27 ústavů (včetně NCI, NIEHS, NLM …) Extramural Research Program (ERP) – hlavní zdroj financování biomedicínského výzkumu v USA i mimo zařízení NIH (univerzity, nemocnice…)
NIH Campus in Bethesda NIH Clinical Center
National Library of Medicine
Natcher Bldg.
