Edy Giri Rachman Putra, Bharoto, Eddy Santoso, Nadi Suparno, dan Sairun

0097: Edy Giri R.P. dkk.

KO-121

APLIKASI TEKNOLOGI HAMBURAN NEUTRON SUDUT KECIL (SANS) UNTUK INVESTIGASI ULTRASTRUKTUR DAN MEKANISME SELF-ASSEMBLY VIRUS DEMAM BERDARAH SEBAGAI DASAR PENGEMBANGAN TARGET OBAT DAN VAKSIN Edy Giri Rachman Putra∗ , Bharoto, Eddy Santoso, Nadi Suparno, dan Sairun Bidang Spektrometri Neutron, Pusat Teknologi Bahan Industri Nuklir - BATAN Gedung 40 BATAN, Kawasan Puspiptek Serpong, Tangerang 15314 Telepon (021) 7566727, 7560922 ∗

e-Mail: [email protected]

Disajikan 29-30 Nop 2012

ABSTRAK Peningkatan performa spektrometer hamburan sudut kecil (SANS) BATAN khususnya metode eksperimen SANS telah dilakukan dengan mengimplementasikan sistem kontrol baru pada sistem pengendali utama dan data akuisisi. Hal tersebut memungkinkan untuk melakukan perubahan konfigurasi alat pada spektrometer SANS secara simultan dan otomatis sehingga metode eksperimen SANS dapat dilakukan dengan efisien. Sistem data akuisisi juga telah dikembangkan sejalan dengan implementasi automatic sample changer yang mampu mengakomodasi 12 sampel (temperatur ruang) dan 6 sampel (variasi temperatur) sehingga pengambilan data eksperimen dapat dilakukan secara otomatis. Hal tersebut memungkinkan untuk melakukan eksperimen SANS secara in-situ (5∼100 ◦ C) dan real time, khususnya untuk percobaan menggunakan sampel biologi, seperti virus. Optimalisasi metode eksperimen SANS telah dilakukan dan di samping itu sistem stopped-flow cell sedang telah pula didesain dan dikembangkan dalam memahami kinetika atau mekanisme dinamika sampel protein virus dan virus like particle menggunakan spektrometer SANS BATAN. Kata Kunci: Nuklir, hamburan neutron, spektrometer, virus, struktur biomakro-molekular

I.

PENDAHULUAN

Teknologi nuklir, di mana salah satunya adalah teknik hamburan neutron pada sudut kecil (SANS) merupakan metode baru yang mampu memetakan dan memberikan informasi struktur dan dinamika secara 3-dimensi bentuk, ukuran, dan orientasi suatu inhomogenitas dalam skala nanometer, yaitu 1 ∼ 500 nm.[1–3] Perkembangan di dunia saat ini, SANS telah digunakan untuk investigasi struktur dan dinamika biologi makromolekul, seperti protein (struktur tersier maupun kuarterner), domain protein, DNA, virus dan lainnya, di lingkungan yang mendekati kondisi fisiologisnya dalam larutan.[4–7] Teknik lain yang selama ini digunakan, seperti kristalografi protein dengan difraksi sinar-X (XRD), resonansi magnetik inti (NMR) dan mikroskopi elektron (SEM/TEM) memiliki keterbatasan dalam memberikan detail informasi struktur alami (native structure) biologi makromolekul dan interaksinya, khususnya di dalam larutan. Mengingat fasilitas penelitian BATAN di Puspiptek

Serpong memiliki spektrometer SANS dengan panjang total 36 meter yang memanfaatkan berkas neutron termal dari Reaktor Serba Guna G.A. Siwabessy (RSGGAS), memberikan peluang untuk melakukan karakterisasi struktur dan dinamika biologi makromolekul. Berdasarkan keunggulan yang dimiliki neutron dibanding sinar-X atau elektron, SANS BATAN telah dimanfaatkan pula untuk studi konformasi globular protein[8] dalam larutan (diameter ∼5 nm) sebagai bagian penelitian yang didanai dari the Academy of Science for the Developing World (TWAS)[9] dan virus demam berdarah (diameter ∼60 nm).[10] Kedua kegiatan tersebut dilakukan sebagai langkah awal aplikasi teknologi hamburan neutron untuk penelitian biologi molekular di Indonesia. Untuk mencapai kegiatan tersebut, serangkaian kegiatan pendahuluan yang meliputi pengembangan performa spektrometer SANS BATAN, serta optimalisasinya dilakukan secara bertahap. Demikian pula dengan penggunaan virusnya, yang dimulai dengan karakter-

Prosiding InSINas 2012

0097: Edy Giri R.P. dkk.

KO-122 isasi protein virus, virus like particle dan virus dengue. Secara garis besar kegiatan ini dilakukan adalah meningkatkan performa spektrometer SANS BATAN untuk dapat diaplikasikan dalam menginvestigasi sampel biologi makromolekul seperti protein, virus dalam larutan; Mendapatkan metodologi eksperimen SANS yang efektif dan efisien karena dapat dilakukan secara otomatis dan simultan serta optimum untuk investigasi ultrastruktur virus; Penguasaan teknik dan analisis data secara maksimal untuk simulasi dan modeling struktur biologi makromolekul dalam larutan berdasarkan data hamburan neutron (eksperimen SANS). Tinjauan Pustaka Penelitian biologi seperti protein dan virus menggunakan teknik nuklir, khususnya hamburan neutron tidaklah mudah, mengingat kompleksitasnya struktur pada portein dan virus tersebut. Di samping itu, performa alat juga sangat menentukan kualitas data yang dihasilkan agar dapat dianalisis lebih lanjut. Untuk itu, pengembangan atau peningkatan performa alat dan metodologi percobaan menjadi hal yang sangat penting. Spektrometer SANS BATAN yang ada di Serpong telah mulai direvitalisasi secara bertahap untuk mencapai performa yang maksimum dalam beberapa tahun terakhir. Namun demikian, dengan tidak adanya fasilitas sumber neutron dingin (cold neutron source) di RSGGAS serta daya operasi reguler rata-rata hanya 15 MW setengah dari daya maksimumnya, maka berdasarkan kurva distribusi Maxwellian, intensitas neutron yang memiliki panjang gelombang besar atau berenergi rendah, menjadi sangat rendah hingga beberapa orde. Hal ini sangat tidak menguntungkan untuk melakukan penelitian bahan, khususnya biologi makromolekul dengan teknik SANS yang membutuhkan resolusi data hamburan dan intensitas neutron yang tinggi. Di samping itu metode absolut pengukuran intensitas hamburan juga harus dilakukan dengan mengembangkan sistem data akuisisinya. Hal ini juga akan terkait dengan pengembangan sistem kendali utama spektrometer SANS agar dapat bekerja secara otomatis dan simultan. Dengan memahami dualisme sifat neutron sebagai partikel dan gelombang, maka telah dikembangkan focusing SANS di beberapa fasilitas SANS di dunia menggunakan sistem lensa optik ataupun ekternal medan magnetik.[11–13] Pengembangan focusing SANS ini adalah untuk meningkatkan kualitas atau resolusi SANS konvensional (pinhole system) serta intensitas atau fluks neutron pada vektor hamburan minimum yang dapat dicapai.[4] Desain dari sistem focusing SANS sangat spesifik untuk setiap fasilitas spektrometer SANS, serta performa yang ingin dicapai. Untuk itu, perlu dilakukan penelitian untuk pengembangkan

instrumen atau spektrometer SANS BATAN dengan mendesain dan mengiplementasikan sistem devais focusing. Peningkatan performa spektrometer SANS BATAN yang meliputi peningkatan intensitas neutron, optimalisasi konfigurasi peralatan, resolusi data hamburan, metodologi eksperimen, serta reduksi dan analisis data SANS merupakan faktor penting dalam penelitian tahun pertama ini, sebelum digunakan untuk investigasi ultrastruktur dan mekanisme self-assembly virus.

II.

METODOLOGI

Optimalisasi konfigurasi peralatan SANS serta metodologi eksperimen dilakukan dengan mengganti sistem pengendali/kontrol utama spektrometer yang dapat bekerja secara simultan dan otomatis berbasis programmable motor controller PCI (Peripheral Component Interconnect) serta akuisisi data berdasarkan jumlah neutron datang (preset count). Kegiatan ini meliputi desain, pembuatan, implementasi dan pengujian sistem antar-muka baru berbasis programmable motor controller PCI untuk mengendalikan 18 motor penggerak pada spektrometer SANS, sehingga dapat dilakukan secara otomatis dan simultan. Optimalisasi percobaan secara in-situ dan real-time yang dapat dilakukan secara otomatis dan simultan dengan automatic sample changer sehingga eksperimen dapat dilakukan secara efisien dan efektif. Kegiatan ini meliputi implementasi, pengujian serta optimalisasi automatic sample changer untuk eksperimen yang dilakukan secara otomatis dan simultan pada kondisi lingkungan yang berbeda, yaitu 12 buah sampel (temperatur ruang) atau 6 buah sampel (variasi temperatur). Karakterisasi ultrastruktur virus DBD dengan metode variasi kontras yang didahului dengan kegiatan produksi, uji aktivitas, dan pemurnian virus serta elektroforesis. Kegiatan karakterisasi ini dimulai dengan karakterisasi protein virus tunggal yang identik dengan virus DBD, kemudian dilanjutkan dengan protein-ion metal untuk menguji metode variasi kontras. Karakterisasi dilanjutkan pada virus like particle (VLP) sebelum menggunakan virus DBD yang sebenarnya pada temperatur rendah, sekitar 5 ◦ C. Dengan demikian, sebelum dilakukan karakterisasi virus DBD, metode eksperimen untuk karakterisasi virus telah optimal. Analisis data serta pendalaman simulasi molekular dinamik dan data analisis ab initio refinement untuk menghasilkan fungsi distribusi pasangan (pair distribution function) dalam mengkonstruksi struktur 3dimensi protein dalam larutan.

III.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Perangkat keras dan lunak untuk sistem automatic sample changer telah diimplementasikan dan dioptiProsiding InSINas 2012

0097: Edy Giri R.P. dkk.

KO-123

malisasi, sehingga eksperimen SANS dapat dilakukan secara otomatis dengan mode in-situ dan real-time pada beberapa variasi temperatur. Pengembangan ini merupakan kelanjutan dari program pengembangan spektrometer SANS BATAN sebelumnya dengan mengganti sistem kendali utama dan juga sistem data akuisisi. Perangkat keras (hardware) dan lunak (software) untuk sistem automatic sample changer ditunjukkan pada G AMBAR 1 dan G AMBAR 2. Pada saat ini spektrometer SANS mampu untuk melakukan eksperimen secara otomatis menggunakan 12 sampel untuk kondisi temperatur ruang dan 6 sampel untuk eksperimen sebagai fungsi temperatur.

G AMBAR 2: Pengembangan perangkat lunak (software) data akuisisi pada sepektrometer SANS yang diintegrasikan dengan automatic sample changer untuk 6 buah sampel dengan variasi temperatur (5∼100 ◦ C)

tetap stabil.

G AMBAR 1: Implementasi dan optimalisasi perangkat keras (hardware) automatic sample changer untuk 6 buah sampel dengan variasi temperatur (5∼100 ◦ C) yang diintegrasikan dengan heating/cooling-circulated oil system

Untuk pengujian implementasi sistem sample changer dengan variasi temperatur, telah dilakukan eksperimen menggunakan sampel sistem koloid yang ditunjukkan pada G AMBAR 3. Dari G AMBAR 3 dapat ditunjukkan perubahan nanostruktur serta interaksinya larutan misel CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide) dengan konsentrasi 0,1 M sebagai fungsi temperatur. Protein virus dengan struktur sama dengan virus DBD, dengan ukuran diameter lebih kecil dari virus DBD digunakan sebagai karakterisasi awal. Protein ini memiliki 2 buah struktur, yaitu core-shell structure and hollow-sphere structure yang akan dikarakterisasi dengan menerapkan metode variasi kontras sebagai fungsi dari kondisi larutan, pH. Virus like particle (VLP) dari HPV, akan dicobakan dengan menerapkan metode variasi kontras untuk memetakan secara detail bagian demi bagian yang ada pada virus tersebut. Semua eksperimen dilakukan pada temperatur rendah, sekitar 5 ◦ C untuk menjaga struktur protein atau virus

G AMBAR 3: Hasil eksperimen SANS pada sampel koloid dengan variasi temperatur, dari di bawah temperatur ruang (15 ◦ C), temperatur ruang (25 ◦ C) dan di atas temperatur ruang (40 dan 60 ◦ C).

Eksperimen SANS dilakukan pada 3 posisi detektor, yaitu 1,5 m; 4 m dan 10 m sehingga memungkinkan untuk mendapatkan rentang daerah momentum yang cukup besar dalam memperoleh informasi mengenai ultrastruktur dari virus like particle dengue ini, G AM BAR 4 . Protein virus ini memiliki buah struktur, yaitu coreshell structure yang dikarakterisasi dengan menerapkan metode variasi kontras sebagai fungsi untuk memetakan secara detail bagian demi bagian yang ada pada virus tersebut. Semua eksperimen dilakukan pada temperatur rendah, sekitar 5 ◦ C untuk menjaga struktur Prosiding InSINas 2012

0097: Edy Giri R.P. dkk.

KO-124

(a1)

(b1)

(c1)

(a2)

(b2)

(c2)

(a3)

(b3)

(c3)

G AMBAR 4: Data hamburan SANS pada sampel larutan 5% protein virus dalam (a1-a3) 100% D2 O (b1-b3) 50% D2 O dan (c1-c3) 0% D2 O pada posisi detektor (a1-c1) 1,5m; (b2-c2) 4m; dan (a3-c3) 10m. Lama pengukuran sampel masing-masing antara 4 ∼ 8 jam.

protein atau virus tetap stabil. Analisis data akan dilakukan sebagai tahap terakhir dari penelitian ini. Hasil pengambilan data hamburan neutron sudut kecil ditunjukkan dalam G AMBAR 4. Dalam eksperimen SANS menggunakan 3 buah sampel dengan komposisi pelarut D2 O yang berbeda. Hal ini bertujuan untuk memetakan bagian demi bagian dari komponen makromolekul penyusun virus tersebut, yaitu protein membran (shell), material genetik (core). Salah satu hasil yang diberikan adalah hasil analisis sampel 5% dalam pelarut murni D2 O seperti yang ditunjukkan pada G AMBAR 5. Hasil fitting memberikan informasi bahwa struktur ”core-shell” dari virus like particle tersebut memiliki diameter inti (core) sebagai bagian komponen mate˚ dengan ketebalan protein membran rial genetik ∼70A, ˚ (shell) ∼28A.

IV.

KESIMPULAN

Eksperimen SANS sudah dapat dilakukan secara otomatis dan simultan menggunakan programmable motor controller PCI dan automatic sample changer. Eksperimen SANS sudah dapat dilakukan dengan variasi temperatur (5 ∼ 100 ◦ C) karena sampel changer telah terintegerasi dengan sistem heating/ coolingcirculated oil system. Sistem ”stopped-flow cell” masih dalam pengembangan dan akan diimplementasikan untuk mempelajari kinetika/mekanisme ”self-assembly” protein virus. Eksperimen SANS terhadap virus like particle (VLP) dengan konsentrasi 5% dalam 100% D2 O, 50% D2 O dan 0% D2 O telah dilakukan menggunakan spektrometer SANS BATAN dan data analisis telah dilakukan untuk memahami struktur virus like particle dengan ukuran ˚ sekitar 130A.

Prosiding InSINas 2012

0097: Edy Giri R.P. dkk.

G AMBAR 5: Data hamburan 1-dimensi SANS pada sampel larutan 5% protein virus dalam 100% D2 O yang difitting dengan model core-shell yang dikombinasikan dengan model struktur fraktal.

SARAN Pengujian sistem kendali simultan dan automatis yang baru ini harus terus menerus dilakukan untuk melihat kehandalan sistem tersebut. Eksperimen awal menggunakan sampel virus perlu dilakukan untuk menguji seluruh sistem yang telah dikembangkan dan diimplementasikan pada spektrometer SANS BATAN juga perlu dilakukan lebih lama untuk mendapat statistik cacahan yang lebih baik.

DAFTAR PUSTAKA [1] S.S. Hasnain, S. Wakatsuki, Biophysical Methods: Structure, Function and Dynamics Studies of Macromolecular Assemblies using Electrons, Lasers, Neutrons and X-rays, Curr. Opinion. Struc. Biol. 18, 2008, 577-580. [2] C. Neylon, Small Angle Neutron and X-Ray Scattering in Structural Biology: Recent Examples from the Literature, Eur. Biophys. 37, 2008, 531-541. [3] T.A. Harroun, G.D. Wignall, J. Katsaras, Neutron Scattering for Biology, in Biological and Medical Physics, Biomedical Engineering, J. Fitter, T. Gutberlet, J. Katsaras (Eds.), Springer, Heidelberg, 2006, 1-18. [4] J.K. Krueger, G.D. Wignall, Small-Angle Neutron Scattering from Biological Molecules, in Biological and Medical Physics, Biomedical Engineering, J. Fitter, T. Gutberlet, J. Katsaras (Eds.), Springer, Heidelberg, 2006, 127-160. [5] S. Krueger, U.A. Perez-Salas, S.K. Gregurick, D. Kuzmanovic, Small Angle Neutron Scattering from Proteins, Nucleic Acids, and Viruses, in Biological and Medical Physics, Biomedical Engineering, J. Fitter, T. Gutberlet, J. Katsaras (Eds.),

KO-125 Springer, Heidelberg, 2006, 161-185. [6] D.M. Engelman, P.B. Moore, Determination of Quaternary Structure by Small Angle Neutron Scattering, Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 4, 1975, 219-241. [7] D.A. Jacques, J. Trewhella, Small-Angle Scattering for Structural Biology: Expanding the Frontier While Avoiding the Pitfalls, Protein Sci. 2010, 642657. [8] A. Patriati, E.G.R Putra, Y.A. Mulyana, Structural Changes of Bovine Serum Albumin in Solution: A Small-Angle Neutron Scattering Study, presentasi Poster di the 3rd Gruber-Soedigdo Lectures, ITB, Bandung, 27 Agustus 2010. [9] Edy Giri Rachman Putra (Principle Investigator), Small-angle Neutron Scattering (SANS) Studies on Biological Macromolecules. Research Grant No. 08140 RG/PHYS/AS, disponsori oleh the Academy of Science for the Developing World (TWAS), Trieste, Itali, 2009. [10] A.B. Witarto, A. Patriati, E.G.R. Putra, Suwarti, B. Wispriyono, Biophysical Study of Dengue Virus, presentasi Poster di the 2nd AONSA Neutron School, ANSTO, Sydney, 24-28 Agustus 2009. [11] S.-M. Choi, J. G. Barker, C. J. Glinka, Y. T. Cheng and P. L. Gammel, ”Focusing cold neutrons with multiple biconcave lenses for small-angle neutron scattering”, J. Appl. Cryst. 33 (2000), 793 E796. [12] T. Okua, J. Suzuki, H. Sasao, S. Yamada, M. Furusaka, T. Adachi, T. Shinohara, K. Ikeda, H.M. Shimizu, ”A demonstration study of focusing geometry SANS using a magnetic lens”, Physica B 356 (2005), 126 E130. [13] T. Oku, S. Yamada., H. Sasao, J. Suzuki, T. Shinohara, K. Hirota, K. Ikeda, T. Tsuzaki, Y. Kiyanagi, M. Furusaka, H. M. Shimizu, ”A magnetic neutron lens based on an extended Halbach-type permanent sextupole magnet”, Physica B 385E86 (2006), 1225 E1228.

Prosiding InSINas 2012