Editor: Št tina J., urda L. Vydavatel: Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Technická 5; Praha 6 Rok vydání: 2008 ISBN

Editor:

ŠtČtina J., ýurda L.

Vydavatel:

Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Technická 5; 166 28 Praha 6

Rok vydání:

2008

ISBN 978-80-7080-695-1

OBSAH Výsledky 12. roþníku Celostátních pĜehlídek sýrĤ ýurda Ladislav, ŠtČtina JiĜí................................................................................................................ 13 Optimalizace designu sýra s využitím conjoint analýzy Grosová Stanislava, Kutnohorská Olga ............................................................................................. 21 Ovþiarstvo na Slovensku Keresteš Ján........................................................................................................................................ 27 Variabilita syĜitelnosti v bazénových vzorcích kravského mléka PĜibyla Lubomír, ýejna Vladimír, Chládek Gustav........................................................................... 33 Rýchla identifikácia patogénov mastitíd, záruka výroby kvalitného surového mlieka ako suroviny pre výrobu syrov Foltys Vladimír, Kirchnerová Katarína ............................................................................................. 39 Skúsenosti s aplikáciou požiadaviek NK (ES) þ. 1664/2006 na hodnotenie mikrobiologickej kvality surového ovþieho mlieka použitím alternatívnej skúšobnej metódy Tomáška Martin, Hofericová Margita, Kološta Miroslav.................................................................. 43 Možnosti zdokonalení postupu vysokodohĜívaných sýrĤ s využitím biochemických charakteristik používaných ýMK. ýerný Vladimír, Havlíková Šárka, Kvasniþková Eva, Pufrová Eva, Švandrlík ZdenČk .................. 49 Metody pro stanovení bunČþné lýze bakterií mléþného kvašení Abrlová Magdaléna, Hlavsová Barbora, Šviráková Eva ................................................................... 53 VýbČr vhodných hydrokoloidĤ pro stabilizaci jakosti termizovaných smetanových sýrĤ Tykvartová Dagmar, HrabČ Jan, Patrovský JiĜí ................................................................................. 58 Vliv rozdílného sterilaþního záhĜevu s konstantním smrtícím úþinkem na jakost tavených sýrĤ BuĖka František, Lazárková Zuzana, BuĖková Leona, HoláĖ Felix, Kráþmar Stanislav, HrabČ Jan............................................................................................................................................ 64 Porovnání organoleptických a fyzikálnČ-chemických vlastností nápojĤ na bázi syrovátky KouĜimská Lenka, Legarová Veronika, DvoĜáková Blanka.............................................................. 71 HPLC stanovenie antimikrobiálnych látok produkovaných baktériami mlieþneho kysnutia Greif Gabriel, Krajþová Eva, Greifová Mária, Karoviþová Jolana.................................................... 75 Antimikrobiálny úþinok kyseliny fenyl mlieþnej Krajþová Eva, Greifová Mária, Greif Gabriel, Schmidt Štefan ........................................................ 81 Minoritní složky mléþného tuku, kyselina 11-cyklohexylundekanová zvláštČ Šmidrkal Jan, Karlová Tereza, Filip Vladimír, Zárubová Markéta ................................................... 85 Možnosti konzervace mléþných výrobkĤ nativními mastnými kyselinami a jejich deriváty Karlová Tereza, Poláková Lenka, Šmidrkal Jan, Filip Vladimír ....................................................... 89 Vplyv teploty a aktívnej kyslosti na rast Geotrichum candidum v mlieku a v mlieþnom agare Hudecová Anna, Liptáková Denisa, Valík ďubomír, Medvećová Alžbeta....................................... 94 Výskyt bifidobakterií v mateĜském mléce Rada VojtČch, Nevoral JiĜí, Flajšmanová KateĜina, Roþková Šárka, Šmehilová Martina, Tománková Eva ............................................................................................................................... 100 Inhibiþní úþinek lysozymu na bifidobakterie používané pĜi výrobČ mléþných kysaných výrobkĤ Šmehilová Martina, Roþková Šárka, Rada VojtČch, Tománková Eva ............................................ 103 PĜežívání bifidobakterií v kravském mléce Tománková Eva, Homutová Iva, Šmehilová Martina, Dubná SoĖa, Rada VojtČch ....................... 107 3

Plakátová sdČlení: Sledování výskytu psychrotrofních mikroorganismĤ v syrovém mléce Hoferková Petra, Košinová Marcela, Burdychová Radka ............................................................... 115 Stanovenie mezofilných a psychrotrofných aeróbnych sporulujúcich mikroorganizmov v surovom kravskom mlieku Kirchnerová Katarína, Foltys Vladimír ........................................................................................... 119 Sledování mikrobiologické kvality kozích sýrĤ z tržní sítČ jihomoravského kraje Cupáková Šárka, Necidová Lenka, Dušková Marta, Belušíková Zora, Janštová Bohumíra, Pospíšilová Markéta, Karpíšková Renáta ........................................................................................ 123 Sledování rĤstu a produkce enterotoxinĤ Staphylococcus aureus bČhem technologie výroby þerstvých sýrĤ Karpíšková Renata, Necidová Lenka, Pospíšilová Markéta, ŠĢástková-Belušíková Zora, Dušková Marta................................................................................................................................. 127 Rast mikroorganizmov poþas modelových výrob hrudkových syrov zo surového ovþieho a kozieho mlieka Medvećová Alžbeta, Liptáková Denisa, Valík ďubomír, Janovþíková Lenka, Hudecová Anna.... 131 Antimikrobiální aktivita laktobacilĤ a laktokokĤ NČmeþková Irena, Dráb Vladimír, Kleþacká Jana, Vilímková Miroslava, Roubal Petr, Rohacká Hana ................................................................................................................................. 137 Antibakteriální úþinky fosfátových tavicích solí na vybrané mikroorganizmy kontaminující tavené sýry BuĖková Leona, Pleva Pavel, BuĖka František ............................................................................... 142 Antifungální aktivita kyseliny octové a mléþné na plíseĖ rodu Fusarium Šantinová Eva, Chumchalová Jana, Ondráþková Iva, Plocková Milada ......................................... 148 Využitie metódy ramp (randomly-amplified microsatellite polymorphism) na typizáciu baktérií mlieþneho kysnutia zo slovenskej bryndze ChebeĖová Viera, Bertaová Gabriela, Kuchta Tomáš, Pangallo Domenico ................................... 152 PCR-typizácia pseudomonád izolovaných z ovþiarskych prevádzok Kostolníková Mária, Bertaová Gabriela, Pangallo Domenico, KoreĖová Janka ............................ 156 Výskyt bakterií mléþného kvašení v pasterovaných vajeþných hmotách Miller Petr, Kuþerová KateĜina, Chumchalová Jana, Míková Kamila ............................................ 160 Sledování procesu fermentace sladké syrovátky a smČsi sladké syrovátky a mléka Legarová Veronika, KouĜimská Lenka............................................................................................ 163 Sledování poþtu probiotických mikroorganismĤ ve fermentovaných mléþných výrobcích Burdychová Radka .......................................................................................................................... 168 Charakteristika rastu a produktov metabolizmu Lactobacillus reuteri poþas fermentácie glycerolu Greifová Mária, Krajþová Eva, Greif Gabriel, Pagurko Anton, Schmidt Štefan, Staruch Ladislav .............................................................................................................................. 171 Detekce bunČþné lyze u laktokokĤ Šviráková Eva, Abrlová Magdaléna, Hlavsová Barbora, Plocková Milada .................................... 177 Autolýza Lactobacillus helveticus 121 Ondráþková Iva, Kuþerová KateĜina, Šantinová Eva, Plocková Milada ......................................... 183

4

Vliv poþtu somatických bunČk na vybrané parametry mléka dojnic þeského strakatého plemene Skýpala Martin, Falta Daniel, Chládek Gustav................................................................................ 187 Vliv polymorfismu genu CSN2 na poþet somatických bunČk u þeského strakatého a holštýnského mléþného skotu. Sojková K., ěíha J., Manga I., DvoĜák J.......................................................................................... 193 Vliv syĜidla na výtČžnost sýrĤ eidamského typu RosĤlek Martin, KouĜimská Lenka, Legarová Veronika, TĤma ŠtČpán.......................................... 200 Vyhodnocení výtČžnosti eidamských sýrĤ Šustová KvČtoslava ......................................................................................................................... 203 Kontinuální, enzymová pĜíprava galaktooligosacharidĤ s þásteþnou optimalizací doby zdržení v membránovém reaktoru Hellerová Klára, ýurda Ladislav ..................................................................................................... 207 Využití blízké infraþervené reflektanþní spektroskopie v analýze kozích sýrĤ Draþková Michaela, Janštová Bohumíra, PĜidalová Hana, Vozková Lenka, Navrátilová Pavlína, Vorlová Lenka.................................................................................................................................. 212 Stanovení vitamínu B2 v mléce Nohálová Zuzana, KramáĜová Daniela, Lazárková Zuzana, Hoza Ignác........................................ 217 Separace laktoferinu za využití monolitické kolony s následnou spektrofotometrickou detekcí Horna Aleš, Zítka OndĜej, Adam VojtČch, Zeman Ladislav, Doležal Petr, Kizek René................. 221 TČkavé látky houbových smetanových omáþek Pudil František, Jenknerová Jana, Janda Václav.............................................................................. 227 StupeĖ poznania trhových druhov mlieka frekventantami špecializovaného senzorického laboratória MaĐa Pavel, Baranová Mária, Sabolová Gabriela, MaĐová Jana..................................................... 233 Senzorické hodnocení jogurtĤ a jogurtových drinkĤ s jahodovou pĜíchutí Šedivá Alena, Panovská ZdeĖka, Lukešová Dobromila .................................................................. 236 Senzorické hodnocení sýrĤ a sýrových analogĤ Panovská ZdeĖka, Šedivá Alena, Lukešová Dobromila ................................................................. 242 Využití spektrometrie pro hodnocení barvy mléþných výrobkĤ BĜenek Petr, JĤzl Miroslav, Šustová KvČtoslava ............................................................................. 248 Hodnocení reologických vlastností eidamských sýrĤ Lužová TáĖa, Šustová KvČtoslava, Povolná Šárka, Nedomová Šárka, Blašková Veronika ........... 251 Možnosti využití nízkoesterifikovaného pektinu jako substituentu fosfátových tavicích solí ve výrobČ tavených sýrĤ ýerníková Michaela, BuĖka František, Pospiech Matej, Tremlová Bohuslava, Pavlínek Vladimír, BĜezina Pavel ................................................................................................................................... 256 Vliv pĜídavku pektinu a vybraných cukrĤ na viskoelastické a senzorické vlastnosti tavených sýrĤ MackĤ Ivana, BuĖka František, Pavlínek Vladimír, HrabČ Jan....................................................... 262 Vliv karagenanĤ na fyzikální vlastnosti mléka a smetany Kováþová Renáta, ŠtČtina JiĜí, Loužecký Tomáš ........................................................................... 268 RejstĜík autorĤ.................................................................................................................................. 275 5

6

CONTENS Results of 12th National Quality Competition for Cheese. ýurda Ladislav, ŠtČtina JiĜí................................................................................................................ 13 Cheese design optimisation with use of conjoint analysis Grosová Stanislava, Kutnohorská Olga ............................................................................................. 21 The sheep farming in Slovakia Keresteš Ján........................................................................................................................................ 27 Variability of rennet coagulation time in bulk tank milk samples in cattle PĜibyla Lubomír, ýejna Vladimír, Chládek Gustav........................................................................... 33 Rapid identification of mastitis pathogens – guarantee of good quality raw milk production as raw material for chees production Foltys Vladimír, Kirchnerová Katarína ............................................................................................. 39 Experiences with application of requirements of CR (EC) 1664/2006 for assessment of microbiological quality of raw sheep milk by using routine testing method Tomáška Martin, Hofericová Margita, Kološta Miroslav.................................................................. 43 Application of biochemical characteristic pure lactic acid cultures for innovation high scalded cheese process. ýerný Vladimír, Havlíková Šárka, Kvasniþková Eva, Pufrová Eva, Švandrlík ZdenČk .................. 49 Methods for determination of cell lysis of lactic acid bacteria Abrlová Magdaléna, Hlavsová Barbora, Šviráková Eva ................................................................... 53 The selection of suitable hydrocolloids for the quality stabilisation of thermized cream cheese Tykvartová Dagmar, HrabČ Jan, Patrovský JiĜí ................................................................................. 58 Influence of different sterilation mode with the same lethal effect on processed cheese quality BuĖka František, Lazárková Zuzana, BuĖková Leona, HoláĖ Felix, Kráþmar Stanislav, HrabČ Jan............................................................................................................................................ 64 Comparison of organoleptic and physiochemical properties of whey based drinks KouĜimská Lenka, Legarová Veronika, DvoĜáková Blanka.............................................................. 71 HPLC determination of antimicrobial substances produced by lactis acid bacteria Greif Gabriel, Krajþová Eva, Greifová Mária, Karoviþová Jolana.................................................... 75 Antimicrobial effect of phenyllactic acid Krajþová Eva, Greifová Mária, Greif Gabriel, Schmidt Štefan ........................................................ 81 Minor Components of Milk Fat, particularly 11-Cyclohexylundecanoic Acid Šmidrkal Jan, Karlová Tereza, Filip Vladimír, Zárubová Markéta ................................................... 85 Preservation possibilities of native fatty acids and their derivatives in dairy products Karlová Tereza, Poláková Lenka, Šmidrkal Jan, Filip Vladimír ....................................................... 89 The Effect of Temperature and pH on the Growth of Geotrichum candidum in Milk and on the Skim Milk Agar Hudecová Anna, Liptáková Denisa, Valík ďubomír, Medvećová Alžbeta....................................... 94 Occurence of bifidobacteria in human milk Rada VojtČch, Nevoral JiĜí, Flajšmanová KateĜina, Roþková Šárka, Šmehilová Martina, Tománková Eva ............................................................................................................................... 100 Inhibition effect of lysozyme on bifidobacteria isolated from fermented milk products Šmehilová Martina, Roþková Šárka, Rada VojtČch, Tománková Eva ............................................ 103 Survival of bifidobacteria in cow milk Tománková Eva, Homutová Iva, Šmehilová Martina, Dubná SoĖa, Rada VojtČch ....................... 107 7

Posters: Monitoring occurence of psychrotrophic microorganisms in raw milk Hoferková Petra, Košinová Marcela, Burdychová Radka ............................................................... 115 Estimation of mesophylic and psychrotrophic aerobe sporulating microorganisms in raw cow's milk Kirchnerová Katarína, Foltys Vladimír ........................................................................................... 119 Monitoring of microbial quality of goat’s cheese from the retail market in the South Moravia Cupáková Šárka, Necidová Lenka, Dušková Marta, Belušíková Zora, Janštová Bohumíra, Pospíšilová Markéta, Karpíšková Renáta ........................................................................................ 123 Tracing of Staphylococcus aureus growth and enterotoxin production in soft cheeses during their technological processing Karpíšková Renata, Necidová Lenka, Pospíšilová Markéta, ŠĢástková-Belušíková Zora, Dušková Marta................................................................................................................................. 127 Growth of microorganisms during the modelled manufacture of lump cheese produced from ewe's and goat raw milk Medvećová Alžbeta, Liptáková Denisa, Valík ďubomír, Janovþíková Lenka, Hudecová Anna.... 131 Antimicrobial activity of lactobacilli and lactococci NČmeþková Irena, Dráb Vladimír, Kleþacká Jana, Vilímková Miroslava, Roubal Petr, Rohacká Hana ................................................................................................................................. 137 Antibacterial effect of phosphate-type emulsifying agents against selected microorganisms in processed cheeses BuĖková Leona, Pleva Pavel, BuĖka František ............................................................................... 142 Antifungal activity of acetic and lactic acid against Fusarium strains Šantinová Eva, Chumchalová Jana, Ondráþková Iva, Plocková Milada ......................................... 148 Application of ramp (randomly-amplified microsatellite polymorphism) method for typing of lactic acid bacteria from slovakian bryndza cheese ChebeĖová Viera, Bertaová Gabriela, Kuchta Tomáš, Pangallo Domenico ................................... 152 PCR – Typing of Pseudomonas isolates obtained from sheep plants Kostolníková Mária, Bertaová Gabriela, Pangallo Domenico, KoreĖová Janka ............................ 156 Occurrence of lactis acid bacteria in pasteurized liquid whole eggs Miller Petr, Kuþerová KateĜina, Chumchalová Jana, Míková Kamila ............................................ 160 Monitoring of fermentation process of cheese whey and mixtures of cheese whey and milk Legarová Veronika, KouĜimská Lenka............................................................................................ 163 Selective enumeration and monitoring of probiotic counts in fermented milks Burdychová Radka .......................................................................................................................... 168 Characterization of growth and metabolite production of Lactobacillus reuteri during glycerol fermentation Greifová Mária, Krajþová Eva, Greif Gabriel, Pagurko Anton, Schmidt Štefan, Staruch Ladislav .............................................................................................................................. 171 Cell lysis detection in lactococci Šviráková Eva, Abrlová Magdaléna, Hlavsová Barbora, Plocková Milada .................................... 177 Autolysis of Lactobacillus helveticus 121 Ondráþková Iva, Kuþerová KateĜina, Šantinová Eva, Plocková Milada ......................................... 183 8

The influence of somatic cell count on chosen parameters of Czech Pied Cattle Skýpala Martin, Falta Daniel, Chládek Gustav................................................................................ 187 Effects of CSN2 gene on somatic cells count in Czech Spotted and Holstein dairy cows Sojková K., ěíha J., Manga I., DvoĜák J.......................................................................................... 193 The effect of rennet on the yield of Edam cheese production RosĤlek Martin, KouĜimská Lenka, Legarová Veronika, TĤma ŠtČpán.......................................... 200 Evaluation of yield of Edam cheese Šustová KvČtoslava ......................................................................................................................... 203 Continual enzymatic preparation of galactooligosaccharides with partial optimalisation of residence time in membrane reactor Hellerová Klára, ýurda Ladislav ..................................................................................................... 207 Use of near-infrared reflectance spectroscopy for goat’s cheese analysis Draþková Michaela, Janštová Bohumíra, PĜidalová Hana, Vozková Lenka, Navrátilová Pavlína, Vorlová Lenka.................................................................................................................................. 212 Determination of vitamin B2 in milk Nohálová Zuzana, KramáĜová Daniela, Lazárková Zuzana, Hoza Ignác........................................ 217 Separation of lactoferrin by using of monolithic column coupled with spectrometric detection Horna Aleš, Zítka OndĜej, Adam VojtČch, Zeman Ladislav, Doležal Petr, Kizek René................. 221 Volatile components of mushroom cream sauces Pudil František, Jenknerová Jana, Janda Václav.............................................................................. 227 Level of knowladge of market types of milk by certificated participants of special sensorial laboratory MaĐa Pavel, Baranová Mária, Sabolová Gabriela, MaĐová Jana..................................................... 233 Sensory evaluation of strawberry yogurts and yogurt drinks Šedivá Alena, Panovská ZdeĖka, Lukešová Dobromila .................................................................. 236 Sensory evaluation of cheeses and cheese analogues Panovská ZdeĖka, Šedivá Alena, Lukešová Dobromila ................................................................. 242 Spectrometric analysing of colour of some dairy products BĜenek Petr, JĤzl Miroslav, Šustová KvČtoslava ............................................................................. 248 The evaluation of rheological qualities of Edam cheeses Lužová TáĖa, Šustová KvČtoslava, Povolná Šárka, Nedomová Šárka, Blašková Veronika ........... 251 Possibilities usage low-esterify pectin as a substituent phosphates emulsifying salts in production processed ýerníková Michaela, BuĖka František, Pospiech Matej, Tremlová Bohuslava, Pavlínek Vladimír, BĜezina Pavel ................................................................................................................................... 256 The effect of pectin and selected low molecular saccharides on viscoelastic and sensory properties of model processed cheese MackĤ Ivana, BuĖka František, Pavlínek Vladimír, HrabČ Jan....................................................... 262 The influence of carrageenans on physical properties of milk and cream Kováþová Renáta, ŠtČtina JiĜí, Loužecký Tomáš ........................................................................... 268 Author index .................................................................................................................................... 275

9

10

Celostátní pĜehlídky sýrĤ

VÝSLEDKY 12. ROýNÍKU CELOSTÁTNÍCH PěEHLÍDEK SÝRģ ýurda Ladislav, ŠtČtina JiĜí Ústav technologie mléka a tukĤ, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Results of 12th National Cheese Competition Summary: The 12th National Cheese Competition was organized traditionally by Department of Dairy and Fat Technology (ICT Prague), Czech-Moravian Dairy Association and Czech Chemical Society on the 17 and 23 of January 2008 in Prague. 56 hard, semi-hard, mould, white, fresh and processed cheeses of 16 producers competed in this year. Competitive samples of cheeses were divided into 8 categories and evaluated by a commission of experts and also by a public commission. Two commissions of experts formed from three or four members assessed each cheese. More than 175 evaluators worked in public commissions. The cheeses were evaluated according to their taste and aroma and their consistence and appearance. Cheeses from abroad (11 samples) were evaluated separately. The results are summarized in tables. Extraordinary cheeses were presented on an exhibition within the competition. The National Cheese Competition was accompanied by a conference called „Milk and Cheeses“ with a scientific programme involving 18 lectures and 34 poster presentations.

Ve dnech 17. a 23. ledna se v Praze uskuteþnil 12. roþník Celostátních pĜehlídek sýrĤ, organizovaný Ústavem technologie mléka a tukĤ Vysoké školy chemicko-technologické v Praze ve spolupráci s ýeskomoravským svazem mlékárenským a Odbornou skupinou pro potravináĜskou a agrikulturní chemii ýeské spoleþnosti chemické. PĜejímka vzorkĤ a odborné hodnocení se konalo 17. ledna. Do hodnocení bylo zaĜazeno 56 vzorkĤ od 16 tuzemských výrobcĤ; mezi zastoupenými výrobci sýrĤ letos bohužel chybČla Madeta, která patĜila k nejúspČšnČjším úþastníkĤm všech pĜedchozích 11 roþníkĤ. KromČ tuzemských sýrĤ bylo hodnoceno 11 vzorkĤ zahraniþních, které poskytlo 5 dovozcĤ sýrĤ. Sýry byly rozdČleny do 8 kategorií. NovČ vyhlášenou kategorií byly tavené sýry ochucené. Vzhledem nedostateþnému poþtu vzorkĤ bylo nutné nČkteré vyhlášené kategorie slouþit – k sýrĤm s tvorbou ok a typu moravský bochník byly pĜipojeny ochucené polotvrdé sýry z pĤvodnČ vyhlášené kategorie specialit. Do slouþené kategorie ostatních mČkkých sýrĤ byly zaĜazeny všechny plísĖové sýry, ochucené mČkké sýry a sýry s mazem na povrchu. Po této úpravČ byly kategorie rovnomČrnČ obsazeny 6 až 8 vzorky. Oznaþení kategorií a poþty sýrĤ v jednotlivých kategoriích jsou uvedeny v tab. I, zúþastnČné sýrárny a pĜihlašovatelé sýrĤ jsou pak v tab. II. PĜi odborném hodnocení posuzují každý sýr 2 paralelní komise, každá má nezávislého pĜedsedu a tĜi zástupce výrobcĤ. V pĜípadČ kategorií hodnocených neanonymnČ (napĜ. u þerstvých a termizovaných sýrĤ) je komise posílena o jednoho nezávislého odborníka. Sýry se posuzují ve dvou znacích: vzhled a konzistence (ve výsledném hodnocení tvoĜí 40 %) a chuĢ a vĤnČ (60 %). Tuzemským sýrĤm bylo na základČ tohoto hodnocení udČleno celkem 20 diplomĤ. Poþet diplomĤ v jednotlivých kategoriích závisí na poþtu pĜihlášených vzorkĤ – na jeden diplom musí být v kategorii alespoĖ 3 sýry, diplomy získávají první tĜi sýry v poĜadí. V kategoriích, které zahrnují sýry rĤzných typĤ, není urþováno poĜadí, ale diplomy byly udČleny vzorkĤm s hodnocením vyšším než 85 bodĤ. V kategorii ochucených tavených sýrĤ byla udČlena dvČ druhá místa kvĤli rovnosti bodĤ.

13

Tabulka I RozdČlení sýrĤ do kategorií. Kategorie Eidamské sýry 30 % t.v s. Eidamské sýry 40-50 % t.v s. Ostatní polotvrdé a tvrdé sýry Uzené sýry ýerstvé a termizované sýry neochucené Ostatní mČkké sýry Tavené sýry neochucené Tavené sýry ochucené (uzené maso, šunka) Celkem

Poþet vzorkĤ 7 8 6 7 6 8 8 6 56

Tabulka II PĜehled pĜihlašovatelĤ sýrĤ a jejich zastoupení v jednotlivých kategoriích. PĜihlašovatel ýeská republika A.W. s.r.o., Pravé olomoucké tvarĤžky, Lošti Agricol s.r.o., Poliþka BEL Sýry ýesko a.s., Želetava JaromČĜická mlékárna a.s. KROMILK s.r.o., KromČĜíž MILTRA B s.r.o., MČsteþko Trnávka Mlékárna Klatovy a.s. Mlékárna Otínoves s.r.o. Mlékárna Polná s.r.o. Moravia Lacto a.s., Jihlava PLASTCOM, a.s., mlékárna PĜíšovice Polabské mlékárny a.s., PodČbrady Povltavské mlékárny, a.s., Sedlþany Pribina, s.r.o., PĜibyslav TANY, s.r.o., Nýrsko TPK, s.r.o., Hodonín Vzorky z ýR celkem Dovozce zahraniþních sýrĤ NIKA s.r.o. BEL Sýry ýesko a.s., Praha Bongrain Czech Management Services Lactalis CZ, s.r.o. SEAFOOD s.r.o. Sýry z dovozu celkem

Poþet sýrĤ

1

2

3

Kategorie 4 5

6

7

8

1

2

2

2

1

1

1 2 5 4 3 4 5 1 4 3 7 4 3 2 3 5 56

1 1

1 2

1 1

1 1

1

1 1 1 1

1

1

2 1

1 3

1 1 1

1 1

2

7

8

1

1 1

6

7

6

2 2 2

8

2 3 8

1 2 6

4 1 2 2 2 11

VeĜejné hodnocení se konalo 23. ledna v kongresovém sále Masarykovy koleje. PĜehlídky osobnČ zahájil rektor VŠCHT Doc. Ing. Josef Koubek, CSc., pod jehož záštitou se pĜehlídky konají. Shoda mezi odborným a veĜejným hodnocením je pomČrnČ dobrá. NejvČtší rozdíly byly zaznamenány v kategorii þerstvých sýrĤ, þásteþnČ i u tavených sýrĤ. RozdČlení sýrĤ do kvalitativních kategorií v odborném i veĜejném hodnocení je uvedeno v tab. III, ze které je vidČt, že 59 % vzorkĤ bylo hodnoceno odbornými komisemi jako výborné nebo velmi dobré, ve veĜejném 14

hodnocení to bylo 64 %. Na rozdíl od loĖského roþníku, kdy nebyl žádný sýr hodnocen jako výborný (t. j. v rozmezí 90 až 100 bodĤ), letos odborné komise zaĜadily do této kvalitativní kategorie 4 vzorky. Pouze jeden sýr byl podprĤmČrný v odborném hodnocení. Porovnání þetností hodnocení je uvedeno na obr. 1, v obou komisích se nejþastČji objevilo hodnocení mezi 75 a 80 body. PrĤmČrné hodnocení se lišilo nepatrnČ (76,95 a 75,45 bodu). Medián je pro odborné hodnocení je 80 bodĤ, pro veĜejné se rozdíl v distribuci odpovČdí projevil snížením mediánu na 78 bodĤ. Celkové výsledky pĜehlídek jsou shrnuty v tab. IV, hodnocení vzorkĤ z dovozu je uvedeno v tab. V. TuþnČ jsou vyznaþené vzorky, které obdržely diplom. Tabulka III RozdČlení sýrĤ do kvalitativních kategorií Bodové hodnocení

Odborné hodnocení [% vzorkĤ]

VeĜejné hodnocení [% vzorkĤ]

Výborný (ideální typ)

90 - 100

7

0

Velmi dobrý

75 - 89

52

64

PrĤmČrný (standardní kvalita)

50 - 74

39

36

PodprĤmČrný (min. 30 bodĤ od každé komise)

30 - 49

2

0

< 30

0

0

Kvalitativní kategorie

Nevyhovující

30 Hodnocení expertĤ

Relativní þetnost [%]

25

VeĜejné hodnocení

20 15 10 5

Bodové hodnocení Obr. 1. Porovnání relativních þetností hodnocení expertĤ a pĜi veĜejném hodnocení.

15

0 10

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

0

2

Interval spolehlivosti

2

Eidam 30%

PLASTCOM a.s., mlékárna PĜíšovice

30

50

80,7

6,0

24,1 78,6

2

1

Eidam 30%

Agricol s.r.o.

30

50

72,7

6,4

32,4 87,3

3

4

Eidam 20%


20

50

66,7

3,3

21,5 75,9

4

5

Eidamský salámový polotvrdý sýr MILTRA B s.r.o.

30

51

65,0

4,7

16,2 71,3

5

6

Sýr Eidam 30%

30

50

59,3

1,3

13,7 67,8

30

50

55,3

6,1

9,0

30

52

53,7

6,5

23,6 78,4

5

Mlékárna Klatovy a.s.

tvs

suš

[%]

[%]

6

7

Eidamský sýr 30%

7

3

Eidamský sýr 30%

JaromČĜická mlékárna a.s., stĜ. M. BudČjovice Mlékárna Polná s.r.o.

1

1

Eidamský sýr 45%

Mlékárna Polná s.r.o.

45

56

79,0

2,0

30,5 86,0

2

3

Eidamský blok 45%

JaromČĜická mlékárna a.s.

45

55

78,0

3,0

23,8 79,7

3

7

Eidamský salámový polotvrdý sýr MILTRA B s.r.o.

62,6

40

53

72,0

*

14,3 69,4

45

55

71,7

7,2

14,9 69,9

4

6

Eidamský sýr 45%

JaromČĜická mlékárna a.s., stĜ. M. BudČjovice

5

2

Eidamský sýr

Moravia Lacto a.s.

45

55

71,0

4,3

28,0 83,3

6

5

Sýr Eidam 45%


45

56

60,0

7,2

17,2 71,3

7

4

Mandava bio sýr 40 % tvs

Polabské mlékárny a.s.

40

54

54,0

*

19,3 74,0

8

8

Eidam 45%


45

56

44,7

6,2

12,5 67,1

ýedar

Agricol s.r.o.

45

57

85,3

3,6

14,6 81,4

Gaston oregano


45

56

63,0

4,7

12,8 78,6

Gaston paprika a chilli


45

56

71,3

1,7

13,1 78,8

Gaston pepĜ a chilli


45

56

56,7

5,1

10,9 75,3

Moravský blok

Moravia Lacto a.s.

45

60

88,0

5,5

14,8 81,9

Moravský blok 45%


45

62

91,0

2,0

15,3 82,2

3

4

Výrobce (pĜihlašovatel)

PrĤmČrné hodnocení


1

Sýr

Neparametrické hodnocení

PoĜadí veĜejného hodnocení

1

Odborné VeĜejné hodnocení hodnocení

PoĜadí odborného hodnocení

Kategorie

Tabulka IV Výsledky Celostátních pĜehlídek sýrĤ

1

1

Eidamský sýr uzený 45%


45

56

84,7

2,6

17,3 81,9

2

3

Šuhaj

MILTRA B s.r.o.

45

50

79,7

1,9

15,4 78,7

3

4

Uzený eidamský sýr

Moravia Lacto a.s.

45

55

78,0

3,0

13,1 75,0

4

2

Uzený sýr Gouda 48 %

JaromČĜická mlékárna a.s., stĜ. Želetava

48

55

77,0

4,5

16,7 80,3

5

7

Uzený sýr Eidam 40%


40

55

70,7

2,8

9,0

6

5

Eidam uzený


45

56

70,7

6,3

12,2 73,0

7

6

Eidamský salámový polotvrdý sýr MILTRA B s.r.o. uzený

40

53

69,3

2,6

11,3 71,3

1

4

ýerstvý sýr pĜírodní

KROMILK s.r.o.

60

36

97,8

1,7

12,7 78,8

2

3

Luþina Jogurtina

Povltavské mlékárny a.s.

60

32

89,0

3,9

14,4 83,0

3

2

Maskar z Polné


75

48

81,5

2,2

14,8 83,4

4

1

Gervais

BEL Sýry ýesko a.s.

63

32

74,8

3,9

17,7 86,8

5

5

Krajanka

KROMILK s.r.o.

70

37

72,5

3,3

12,4 80,1

6

6

Monticremo smetanové


66

38

67,8

2,0

9,5

16

68,4

75,3

7

8

Neparametrické hodnocení

Král sýrĤ Hermelín Maxi

Pribina s.r.o.

50

46

89,8

5,0

16,6 85,4

Král sýrĤ sametový

Pribina s.r.o.

56

50

91,8

1,7

19,8 89,0

Monticremo a la BudapešĢ


65

34

85,8

4,7

8,1

72,3

Monticremo se žampiony


66

35

81,3

4,0

7,9

72,9

NIVA extra

Mlékárna Otinoves s.r.o.

52

53

81,8

2,4

13,8 81,6

Pravé olomoucké tvarĤžky

A.W. s.r.o., Pravé olomoucké tvarĤžky

2

33

83,0

3,1

13,2 80,6

Sedlþanský ModĜenín


56

53

82,5

1,9

16,1 84,7

Sedlþanský Pepin


53

45

88,0

3,0

13,0 79,3

Sýr

Výrobce (pĜihlašovatel)

tvs

suš

[%]

[%]


Interval spolehlivosti

6

Odborné VeĜejné hodnocení hodnocení PrĤmČrné hodnocení

PoĜadí veĜejného hodnocení

Kategorie

PoĜadí odborného hodnocení

Tabulka IV Výsledky Celostátních pĜehlídek sýrĤ - pokraþování

1

4

Matador smetanový


50

38

84,5

4,4

20,7 77,3

2

1

Pribina 70%

TPK s.r.o., mlékárna Hodonín

70

44

83,8

3,1

22,9 79,2

3

5

Maratonec


55

43

82,8

5,1

19,4 75,2

4

6

TANY smetanový

TANY s.r.o., Nýrsko

65

45

82,5

4,3

19,0 73,1

5

2

Smetanito smetanové


67

47

82,5

4,6

22,4 79,2

6

3

TANY DELICATO


70

48

77,0

2,7

22,2 78,0

7

7

Apetito Supercremo


60

41

70,3

9,9

16,5 72,1

8

8

Tavený sýr lahodný 70g

KROMILK s.r.o.

45

33

56,8

8,6

9,3

1

2

Uzený salámový tavený sýr se šunkou


45

50

91,5

2,4

21,5 78,2

2

3

Smetanito se šunkou


51

40

81,8

4,9

20,4 76,2

2

6

TANY šunkový


50

38

81,8

5,5

13,0 67,3

4

5

Apetito šunka


55

43

81,3

2,8

17,2 73,0

5

1

Pribina se šunkou


55

40

81,0

3,8

23,0 79,3

6

4

Matador s klobásou


40

33

78,0

6,5

19,3 74,7

17

59,8

Tabulka V Výsledky Celostátních pĜehlídek sýrĤ – zahraniþní vzorky

Dovozce

tvs

suš.

Medián

Návrhy na diplomy

Sýr

Modus

Kvalitativní kategorie

Bryndza Ramzes NIKA blue Gold Urda

NIKA spol. s r.o. NIKA spol. s r.o. NIKA spol. s r.o. NIKA spol. s r.o.

48 45 50 28

44 56 50 72

2 3 2 3

2 3 2 3

6 0 5 6

Port Salut Le Fondant Camembert de Campagne

BEL Sýry ýesko a.s. Lactalis CZ, s.r.o.

50 45

52

1 3

1 3

24 0

Président la Bûche fondante Chaumes Fol Epi Epoisses Tomme Savoie

Lactalis CZ, s.r.o. Bongrain Czech Management Services Bongrain Czech Management Services SEAFOOD s.r.o. SEAFOOD s.r.o.

45 50 50 50 50

1 1 2 2 2

1 1 2 2 2

21 18 9 7 6

Kvalitativní kategorie: 1. Vynikající 2. Výborný 3. Velmi dobrý 4. PrĤmČrný 5. PodprĤmČrný

K nejúspČšnČjším sýrárnám na letošních pĜehlídkách patĜí Agricol s. r. o., Poliþka a Pribina s. r. o., PĜibyslav, které mČly pĜihlášeny po 2 vzorcích a oba získaly diplom. Po dvou diplomech obdržely také BEL Sýry ýesko, Mlékárna Klatovy, Mlékárna Polná a Povltavské mlékárny. Na rozdíl od loĖského roþníku, kdy nebyl žádný sýr hodnocen jako výborný (t. j. v rozmezí 90 až 100 bodĤ), letos odborné komise zaĜadily do této kvalitativní kategorie 4 vzorky. Nejvyšší bodové ohodnocení (97,75 bodu) patĜí ýerstvému sýru pĜírodnímu (KROMILK s. r. o., KromČĜíž). Ve skupinČ zahraniþních sýrĤ bylo hodnoceno sedm francouzských sýrĤ, které byly získány díky úsilí pana Ladislava Liklera. Další vzorky ze Slovenska poskytla spoleþnost NIKA. Tyto sýry jsou posuzovány oddČlenČ, hodnotí je všichni þlenové odborných komisí i departážní komise. Každý hodnotitel sýr zaĜazuje do kvalitativních kategorií a navíc má právo 3 vzorky, které považuje za nejlepší, navrhnout na diplom. Nejvíce návrhĤ na diplom získal sýr zrající pod mazem Port Salut Le Fondant (BEL Sýry ýesko a.s), který získal 24 návrhĤ na diplom ze 34 možných). Diplomem byl dále ocenČn kozí sýr Président la Bûche fondante (Lactalis CZ s. r. o.) a sýr Chaumes (Bongrain Czech Management Services). Ze slovenských sýrĤ nejvíce zaujal nezrající ovþí sýr Urda, vyrábČný tepelným srážením žinþice. Výsledky hodnocení zahraniþních sýrĤ jsou uvedeny v tab. V. Hlavním bodem odborného programu pĜehlídek byla pĜednáška Ing. J. Kopáþka, CSc. (ýeskomoravský svaz mlékárenský), který úþastníky seznámil se situací v evropském a svČtovém mlékárenství, která v uplynulém roce prošla bouĜlivým vývojem. Další pĜednáška se zabývala využitím conjoint analýzy ve výrobkovém výzkumu (doc. Ing. S. Grosová, VŠCHT Praha). PĜednáška ing. J. Keresteše (NIKA, s.r.o) byla vČnována chovu ovcí na Slovensku z hlediska historie, zpracování ovþího mléka a jeho významu. Na navazující konferenci Mléko a sýry 24. ledna bylo prezentováno 18 pĜednášek a témČĜ dvojnásobný poþet posterĤ. Obou akcí se dále úþastnilo 13 firem, jejichž þinnost se dotýká laboratorního vybavení a potĜeb pro zpracování mléka. TradiþnČ byla vedle soutČžních sýrĤ prezentována Ĝada dalších výrobkĤ na doprovodné výstavce. jejich seznam uvádí tab. VI.

18

Tabulka VI Seznam sýrĤ vystavených v prĤbČhu Celostátních pĜehlídek sýrĤ a konference Mléko a sýry Spoleþnost, mlékárna, sýrárna Sýr Sušina A.W. spol. s r.o., Loštice Kousky se zeleným pepĜem 33% Kúsky s rest. cibulkou 33% Loštické kvarteto 34% Pravé olomoucké tvarĤžky 33% Pusinky z Loštic 33% Sváteþní tyþinky 33% Agricol s.r.o., Poliþka ýedar 57% Eidam 50% BEL Sýry ýesko, Želetava Gervais 32% Matador s klobásou 33% Matador s nivou 38% Matador smetanový 38% Matador tavený sýr s þesnekem 33% Matador s romadúrem 33% Kromilk s.r.o. KromČĜíž ýerstvý sýr nezrající 36% Krajanka, terminovaný smetanový sýr 37% Mlékárna Klatovy Eidam 30% 50% Eidam 45% 56% Moravský blok 61% Uzený salámový tavený sýr se šunkou 50% Uzený sýr Eidam 40% 54% Mlékárna Otinoves s.r.o. NIVA extra 53% Mlékárna Polná s. r.o. Balkánský sýr 42% Maskar z Polné 48% Zlatá Praha 58% Zlatá Praha porce 58% Moravia Lacto a.s., Jihlava Eidam sýr 45% polotvrdý plátkovaný 55% Eidam sýr 45% uzený 55% Eidamský sýr 30% plátkovaný 50% Eidamský sýr 45% plátkovaný 55% Eidamský sýr uzený 45% bloþek 55% Eidamský sýr uzený 45% plátkovaný 55% Excelent pažitka plátkovaný 55% Excelent polotvrdý sýr se zeleným 55% pepĜem a chilli plátkovaný Excelent uzený s þesnekem 55% plátkovaný Montana 45% bloþek 60% Montana 45% plátkovaný tvrdý sýr 60% Moravský blok 60% NIKA s.r.o., Povážská Bystrica, NIKA Blue Gold 50% Slovensko Ovþí syr Urda 72% Slovenská bryndza 44% Plastcom a.s., Mlékárna PĜíšovice Eidamská cihla 50% Eidamská cihla 56% Eidamský uzený sýr 56% Gaston oregano 56% Gaston paprika a chilli 56% Gaston pepĜ a chilli 56% 19

tvs 1% 1% 1% 1% 1% 1% 45% 30% 63% 40% 45% 50% 40% 40% 60% 70% 30% 45% 45% 45% 40% 52% 50% 75% 50% 50% 45% 45% 30% 45% 45% 45% 45% 45% 45% 45% 45% 45% 50% 28% 48% 30% 45% 45% 45% 45% 45%

Tabulka VI pokraþování Seznam sýrĤ vystavených v prĤbČhu Celostátních pĜehlídek sýrĤ a konference Mléko a sýry Spoleþnost, mlékárna, sýrárna Sýr Sušina Polabské mlékárny a.s., PodČbrady Monticremo a´Ďa BudapešĢ 34% Monticremo s žampiony 35% Monticremo smetanové 38% Povltavské mlékárny , a.s., Sedlþany Sedlþanský modĜenín 53% Sedlþanský pepin 45% TANY, spol. s r.o. TANY Delicato 48% TANY kapie 38% TANY klobása 33% TANY mix 38% TANY plísĖový 100g 38% TANY plísĖový 140g 38% TANY smetanový 45% TANY šunkový 38% TANY žampiony 38% TPK, spol. s r.o., Hodonín Apetito Supercremo 41% Apetito šunka 43% Maratonec 43%

20

Tvs 65% 66% 66% 56% 53% 70% 50% 50% 50% 50% 50% 65% 50% 50% 60% 55% 55%

OPTIMALIZACE DESIGNU SÝRA S VYUŽITÍM CONJOINT ANALÝZY Grosová Stanislava, Kutnohorská Olga Ústav ekonomiky a Ĝízení chemického a potravináĜského prĤmyslu VŠCHT v Praze Cheese design optimisation with use of conjoint analysis Summary: Udržení dynamiky rĤstu prodeje pĜedpokládá sledovat nákupní jednání zákazníkĤ a jeho promČny. PĜedpokladem formulace dobré výrobkové strategie každého výrobce musí být znalost toho, co zákazník považuje za kvalitu a poskytnout mu to v žádoucí podobČ. Vhodným nástrojem pro tyto úþely je software SPSS, modul Conjoint analysis. Realizovali jsme výzkum, jehož cílem bylo kvantifikovat vliv vybraných výrobkových atributĤ sýra s oky, identifikovat pĜípadné rozdíly mezi segmenty spotĜebitelĤ a nalézt optimální variantu sýra, která bude pĜedstavovat ideální mix vybraných výrobkových atributĤ. Výsledky realizované na vzorku 118 respondentĤ ukázaly, že na výbČru sýra se z 30,32% podílel vzhled (oka), znaþka z 35,49%, pĤvod sýra z 12,85% a obsah tukĤ z 21,34 %.

Úvod Optimalizace designu výrobku vzhledem k spotĜebitelským preferencím patĜí ke klíþovým cílĤm každého výrobce (16). Schopnost podniku vytváĜet a nabízet produkty, které uspokojí požadavky zákazníka, potČší ho a uþiní jej loajálním, je klíþem k úspČchu a rĤstu zisku (13). ÚspČšnost pĜijetí produktu spotĜebitelem závisí na ĜadČ faktorĤ, které se vztahují k produktu, spotĜebiteli a vnČjšímu prostĜedí (2,5). Mezi významné faktory vztahující se k potravináĜskému produktu lze zaĜadit napĜ. vzhled produktu, jeho znaþku, obal, cenu, umístČní v regálu, zpĤsob komunikace, proces vzniku (11,20,21). Výrobci by proto mČli poznat, jak tyto atributy ovlivĖují preference (vybraného segmentu) zákazníkĤ a využívat je v procesech vývoje a zavádČní nových výrobkĤ na trh. Conjoint analýza poskytuje kvantitativní mČĜení relativní dĤležitosti jedné vlastnosti oproti druhé (1). Slovo „conjoint“ vzniklo z úvahy, že relativní význam posuzovaných vČcí (consider) lze mČĜit spoleþnČ (jointly) i tehdy, když lze jen tČžko mČĜit jejich význam oddČlenČ (4). Vliv hedonických, zdravotních, convenience faktorĤ a vliv procesu vzniku na preference spotĜebitelĤ sýrĤ byly studovány Ĝadou výzkumĤ (6,10,17,18,22). PĜírodní polotvrdé sýry s oky nás zajímaly i proto, že pĜedstavují vzhledem k rĤstu prodeje zajímavý výrobkový segment (12). Cíl studie Naším cílem bylo studovat vliv vybraných výrobkových atributĤ pĜírodního polotvrdého sýra s oky na nákupní rozhodování vybraného vzorku spotĜebitelĤ, nalézt pĜípadné rozdíly mezi vybranými segmenty spotĜebitelĤ a nalézt optimální variantu sýra, která bude pĜedstavovat ideální mix vybraných výrobkových atributĤ. Sledovali jsme nČkteré vybrané faktory, u kterých jsme chtČli ovČĜit, jakým zpĤsobem ovlivĖují názor spotĜebitelĤ na výrobek. Vybranými vlastnostmi byly vzhled sýra, znaþka sýra, pĤvod sýra a obsah tuku. Použité metody Ucelený pohled na conjoint analýzu jako vícerozmČrnou statistickou metodu vyvinutou pro úþely výzkumu v 70. letech 20. století lze najít v zahraniþní literatuĜe (7). Z nejnovČjší literatury zpracované v poslední dobČ lze získat podrobný pĜehled jejího vývoje, velkého poþtu typĤ aplikací a názory na budoucí vývoj (8). Conjoint analýza je „praktický soubor metod, které lze použít pro pĜedvídání spotĜebitelských preferencí pro produkty (nabídky) charakterizované mnoha atributy (vlastnostmi) a kterou lze aplikovat u širokého spektra výrobkĤ“ (4,7). Hlavní pĜínos lze spatĜovat v získání informací o tom, jak lidé vybírají, hodnotí rĤzné výrobkové faktory (atributy) a rozhodují tak o výbČru produktu (3). PĜi hodnocení produktĤ spotĜebitelé tak þasto dochází ke kompromisĤm. Conjoint analýza umožĖuje výzkumníkĤm zkoumat tyto kompromisy, zjišĢovat relativní význam každého atributu, každé jednotlivé úrovnČ atributu a kombinace atributĤ. To lze využít pĜi navrhování produktĤ, které jsou nejvíce pĜitažlivé pro urþitý trh (segment). 21

PĜi aplikaci je tĜeba nejdĜív vytvoĜit soubor reálných þi hypotetických produktĤ pomocí kombinace vybraných úrovní každého atributu. Tyto kombinace jsou pĜedkládány respondentĤm, kteĜí je hodnotí jako celek. Tento postup velmi realisticky pĜedstavuje proces, kdy spotĜebitel hodnotí soubor nabídek produktĤ. Vzhledem k tomu, že jednotlivé hypotetické produkty jsou vytváĜeny specifickým zpĤsobem, lze stanovit vliv každého atributu a každé úrovnČ atributu z celkového hodnocení respondenta (7,8). Prvním krokem je tedy vymezení produktu pomocí atributĤ, které budou zkoumány a jednotlivých úrovní tČchto atributĤ. PĜi výbČru atributĤ a jejich úrovní je tĜeba dbát, abychom postihli pokud možno všechny atributy ovlivĖující výbČr spotĜebitele a formulovali jednotlivé úrovnČ tak, aby „dobĜe“ diferencovali mezi jednotlivými úrovnČmi. Je tĜeba rozhodnout o poþtu zkoumaných atributĤ a jejich úrovní, protože tento poþet má bezprostĜední vliv na statistickou spolehlivost a pĜesnost získaných výsledkĤ. Dalším krokem je rozhodnutí o typu conjoint analýzy. V typu, který byl použit v této studii, šlo o metodu plného profilu, kdy je všem respondentĤm pĜedkládán soubor produktĤ, které jsou popsány pomocí všech sledovaných atributĤ a u každého atributu je zvolena konkrétní úroveĖ. Naproti tomu metoda neúplného profilu umožĖuje pĜedkládat respondentĤm varianty produktĤ, které nejsou popsány pomocí všech atributĤ. Metoda plného profilu byla použita proto, že umožĖuje stanovit utilitu (užitnost) každé úrovnČ atributu a ideální kombinaci atributĤ. Utilita (užitnost) indikuje, jak každý faktor ovlivĖuje preference. Kladné hodnoty signalizují, že úroveĖ atributu pozitivnČ pĜispívá k preferenci, zatímco záporná hodnota úrovnČ indikuje, že tato úroveĖ faktoru není preferovaná. Hodnota dĤležitosti mČĜí význam atributu v preferenþním hodnocení (7,8). Pro realizaci conjoint analýzy jsme použili statistický software SPSS (verze 12.0), který má pro conjoint analýzu speciálnČ implementovaný modul. VýbČr atributĤ pro studii Pro vymezení atributĤ (výrobkových vlastností) a jejich úrovní byla využita metoda skupinových rozhovorĤ (Focus group) (1). Je to metoda kvalitativního výzkumu trhu, jejímž úþelem je zjistit názory pĜímo cílové skupiny spotĜebitelĤ. SoubČžnČ probíhající studium literatury, vztahující se k nákupnímu chování na trzích s potravináĜskými výrobky potvrdilo, že atributy uvádČné spotĜebiteli jsou významné a zajímavé i z pohledu výzkumného. Skupinový rozhovor probČhl v prosinci 2007 v Praze, zúþastnilo se ho celkem 9 úþastníkĤ (7 žen , 2 muži), scénáĜ rozhovoru navazoval na pĜedchozí realizované výzkumy (14). Vybranými atributy byly vzhled sýra, znaþka sýra, pĤvod sýra a obsah tuku. Vzhled sýra byl vybrán proto, že „zákazník kupuje oþima“ a spotĜebitelky a spotĜebitelé v rámci skupinových rozhovorĤ formulovali svĤj požadavek takto: „Když oka, ta aĢ jsou poĜádná“ (14). Vliv znaþky sýra byl zkoumán vzhledem k rostoucím výdajĤm na budování znaþek v potravináĜském prĤmyslu (9). Aktivity výrobcĤ i obchodu a v neposlední ĜadČ rĤst zájmĤ spotĜebitelĤ v EvropČ i ýR o bio produkty (24) nás vedl k zaĜazení atributu pĤvod výrobku. KoneþnČ obsah tuku byl zvažován vzhledem k rostoucímu zájmu spotĜebitelĤ o zdravý životní styl (15,23). Jednotlivé výrobkové vlastnosti (atributy a jejich úrovnČ) jsou uvedeny na Obr. 1. Realizace výzkumu Uvedený poþet atributĤ a jejich úrovní vedl k celkovému poþtu 3x3x2x2=36 výrobkových variant. Vzhledem ke zkušenostem z už realizovaných výzkumĤ jsme omezili poþet generovaných variant, což vedlo software Conjoint modulu k vytvoĜení 9 výrobkových kombinací uvedených v tab.I. Ty byly následnČ upraveny do podoby karet pĜedkládaných respondentĤm, na kterých byl vzhled sýra ilustrován pomocí obrázku, viz Obr.II.A,B. Uvedený pĜístup získávání informací je charakterizován jako „simulace podmínek v supermarketu“ (6).

22

Vlastnosti

Vzhled

a jejich úrovnČ

Znaþka

PĤvod

Obsah tuku v sušinČ

Madeta

bio

45%

Tesco

tradiþní

30%

bez znaþky Obr. I. Atributy sýra a jejich úrovnČ Respondenti, spotĜebitelé nakupující pĜírodních polotvrdých sýrĤ s oky, Ĝadili karty pĜedstavující výrobkové varianty podle svých preferencí od nejvíce po nejménČ preferovanou variantu a výsledky byly zapisovány do pĜedem pĜipraveného dotazníku. Celkem bylo osloveno 122 respondentĤ s ukonþeným stĜedoškolským vzdČláním s bydlištČm v Praze, z toho bylo 81 žen, 41 mužĤ. 70 respondentĤ bylo mladších 30 let a 52 nad 30 let. Vlastní šetĜení probíhalo v období 10.- 17.ledna 2008. PĜi zpracování údajĤ bylo nutné vyĜadit 4 dotazníky vzhledem k nevhodnému zpĤsobu jejich vyplnČní, takže celkové výsledky reprezentují preference celkem 118 respondentĤ. Tabulka I Soubor výrobkových variant Card 1

Card 2 Oka velká Znaþka Tesco PĤvod Bio Tuk 45%

Card 4

Card 3 Oka velká Znaþka Bez znaþky PĤvod Bio Tuk 30%

Card 5 Oka stĜední Znaþka Bez znaþky PĤvod tradice Tuk 45%

Card 7

Card 6 Oka stĜední Znaþka Tesco PĤvod Bio Tuk 45%

Card 8 Oka malá Znaþka Madeta PĤvod Bio Tuk 45%

Oka stĜední Znaþka Madeta PĤvod Bio Tuk 30% Oka malá Znaþka Bez znaþky PĤvod Bio Tuk 45% Card 9

Oka velká Znaþka Madeta PĤvod tradice Tuk 45%

Oka malá Znaþka Tesco PĤvod tradice Tuk 30%

Výsledky a diskuse Výstupem software CONJOINT SPSS 12.0 je soubor, ve kterém jsou vypoþtené dĤležitost a váhy atributĤ (výrobkových vlastností) a jejich úrovní pro všech 118 respondentĤ. Získané výsledky byly zpracovány do tabulky, ve které první sloupec uvádí výsledky „prĤmČrná dĤležitost“ udávající pomČr, v jakém se sledované atributy podílely na rozhodování respondenta. PomČr je uvádČn v procentech. Sloupec „Utilita“ uvádí „užitnosti“, jaké mají pro soubor respondentĤ konkrétní úrovnČ atributĤ. Pod grafem jsou uvedeny hodnoty Kendallova tau a Pearsonova koeficientu, což jsou charakteristiky tČsnosti mezi vytvoĜeným modelovým chováním a skuteþným jednáním zákazníkĤ, tudíž indikují rozdíl mezi empirickými a teoretickými hodnotami. ýím více se tyto hodnoty blíží jedné, tím je tČsnČjší shoda mezi modelem preferencí a skuteþnými preferencemi spotĜebitele (4,7). Celkový model preferencí pro všech 118 respondentĤ poskytl výsledky uvedené v Tab.II. 23

Tabulka II Výsledky celkového modelu preferencí (n= 118) Význam atributu (Averaged Importance)

Atribut

30,32

vzhled (oka)

35,49

znaþka

12,85

PĤvod

21,34

obsah tuku

Utilita (Utility) - 1,0678* 0,7147** 0,35531 1,2740** - 0,3701 - 0,9040* 0,1208** - 0,1208* - 0,2521* 0,2521**

ÚroveĖ atributu Malá stĜední velká, nepravidelná Madeta Tesco bez znaþky Bio klasický 45% 30%

Pearson's R = ,993 Significance = ,0000 Kendall's tau = ,944 Significance = ,0002 * nižší hodnoty utility pĜedstavují nižší hodnotu z pohledu zákazníka **vyšší hodnoty utility pĜedstavují vyšší (lepší) hodnotu z pohledu zákazníka

Z výstupu je patrné, že pĜi koupi výrobku se na preferencích respondentĤ podílel vzhled sýra (oka, jejich tvar, velikost i poþet) z 30,32%, znaþka z 35,49%, pĤvod sýra z 12,85% a obsah tukĤ z 21,34 %. Získané údaje byly dále zpracovány také pro dílþí segmenty respondentĤ, ženy celkem a muže celkem, do 30 let celkem a nad 30 let celkem a pro ženy do 30 let a ženy nad 30 let. Získané výsledky jsou uvedeny souhrnnČ v Tab.III. V tČchto skupinách se názory respondentĤ na význam jednotlivých atributĤ lišily. Tabulka III Výsledky v þlenČní podle segmentĤ Atribut

ÚroveĖ atributu

Segment 1 n = 79 Význam atributu

vzhled (oka) znaþka

pĤvod obsah tuku

malé stĜední velké,nepr Madeta Tesco bez znaþky bio klasický 45% 30%

Pearson´s R Kendall´s Ĳ Popis segmentu

29,67 38,20

Segment 2 n = 48

Utilita úrovnČ -1,0256* 0,6923** 0,3333 1,4188** -0,4573 -0,9615*

0,2212** -0,2212* 19,97 -0,5160* 0,5160** 0,994 1,000 ženy celkem

12,16

Význam atributu

28,12 41,49 12,04 18,35

Utilita úrovnČ -0,8865* 0,5816** 0,3050 1,4681** -0,4184 -1,0496*

0,2447** -0,2447* -0,3457* 0,3457** 0,996 1,000

ženy do 30 let


Utilita úrovnČ -1,2667* 0,8889** 0,3778 1,2889** -0,4333 -0,8556*

32,84 32,00 12,57 22,59

0,2000** -0,2000* -0,7750* 0,7750** 0,989 1,000

ženy nad 30 let


31,57 30,22 14,18 24,03

Utilita úrovnČ -1,1500* 0,7583** 0,3917 0,9917** -0,2000 -0,7917*

-0,0750* 0,0750** 0,2625** -0,2625* 0,990 0,889

muži celkem


29,17 39,14 12,59 19,11

Utilita úrovnČ -0,9227* 0,7246** 0,1981 1,3382** -0,3913 -0,9469*

0,1667** -0,1667* -0,0978* 0,0978** 0,990 0,944

do 30 let celkem


32,08 30,06 13,49 24,37

Utilita úrovnČ -1,2933* 0,7267** 0,5667 1,1667** -0,3533 -0,8133*

0,0250** -0,0250* -0,4800* 0,4800** 0,995 1,000

nad 30 celkem

* nižší hodnoty utility pĜedstavují nižší hodnotu z pohledu zákazníka **vyšší hodnoty utility pĜedstavují vyšší (lepší) hodnotu z pohledu zákazníka

ěada výstupĤ potvrdila naše pĜedstavy a oþekávání. Je zĜejmé, že vzhled sýra hraje pĜi výbČru a hodnocení významnou roli. V pĜípadČ, že spotĜebitel oþekává u sýra oka, pak vedle toho, že preferuje pravidelná, stĜednČ velká oka, akceptuje spíše velká, nepravidelná oka než nízký poþet malých ok. Ale i znaþka je pro spotĜebitele nakupujícího sýry dĤležitá. PĜi sbČru dat s respondenty jsem zjistili, že mnoho z nich doslova irituje, že neznají toho, kdo výrobek vyrobil. Obchodní znaþky, mnohdy tak nepopulární u výrobcĤ pro dopady své politiky v oblasti obchodních znaþek, jsou však preferovány víc než no-name výrobky. Z Tab.II,III je také zĜejmé, že respondenti v našem výzkumu sice oceĖovali bio pĤvod, nicménČ význam tohoto faktoru diferencoval mezi jednotlivými nabídkami ménČ než faktory znaþka þi obsah tuku. Získané výsledky rovnČž umožnily získat pĜedstavu o „ideální“ koncepci spotĜebitelĤ. Zajímavé, i když oþekávané rozdíly byly nalezeny mezi ženami a muži, viz Obr.II. A,B. 24

Muži

Ženy

Karta H

Karta C

Produkt: sýr ementálského typu

Madeta

Znaþka:

klasický

PĤvod:

Obsah tuku:

Produkt: sýr ementálského typu

S obsahem tuku 45 %

Znaþka:

Madeta

PĤvod:

BIO

Obsah tuku:

Oka:

S obsahem tuku 30 %

Oka:

Obr. II A,B: Nejvíce preferovaná varianta sýra pro segment „muži“ a „ženy“

Pro segment mužĤ pĜedstavuje ideální výrobek kombinaci atributĤ: znaþka Madeta, klasický pĤvod, obsah tuku 45% („tuþnČjší je lepší“) a rovnomČrná, pĜimČĜenČ velká oka. Oþekávání vzhledu a znaþky spojuje ve svém hodnocení muže a ženy, ovšem ženy preferovaly spíše nižší (30%) obsah tuku a bio pĤvod sýra. Srovnání námi dosažených výsledkĤ s výsledky publikovanými v studiích ( 6,10,17,18, 23) je obtížné vzhledem k existenci silných interkulturálních rozdílĤ v potravních zvyklostech (20) a v rozdílech mezi volbou modelĤ zkoumaných výrobkových atributĤ. RĤst preferencí u variant s nižším obsahem tuku a zájem o proces vzniku (pĤvod) výrobku je v souladu se zjištČními ve výše uvedených výzkumech.

ZávČry: Náš pĜíspČvek ilustruje výhody Conjoint analýzy pĜi zjištČní spotĜebitelských preferencí pĜírodního polotvrdého sýra s oky. V studii jsme pracovali zatím jenom s nČkterými, vybranými faktory (atributy) výrobku. Podle zkušeností uvedených v bohaté literatuĜe k problematice conjoint analýzy i podle našich realizovaných výzkumĤ lze v navazujících šetĜeních zkoumat napĜ. vliv informací o sledovatelnosti pĤvodu (traceability) na preference spotĜebitelĤ, vliv specifického zpĤsobu komunikace o výhodách sýra (napĜ. obsah Ca, posílení kostí þi celkovČ lepšího pocitu pohody) na preference zákazníkĤ, vliv rĤzných cenových úrovní na kupní zámČry þi podrobnČji identifikovat segmenty preferující navržené koncepce nových výrobkĤ(19). PodČkování: AutoĜi dČkují MŠMT ýR za prostĜedky uvolnČné v rámci financování výzkumného zámČru FCHI VŠCHT fakulty MSM 6046137306, které umožnily realizaci této stati. Použitá literatura: 1. AAKER, D.A., KUMAR,V., DAY,G.S.:Marketing Research . 8th Ed. John Wiley&Sons, Inc., 605-606 (2004) 2. ASSAEL H.: Consumer Behaviour and Marketing Action. 6th Ed. South-Western College Publishing (1998) 3. CATTIN P., WITTINK D.R.: Commercial use of conjoint analysis: A survey. Journal of Marketing. 4, 169-184 (1982).

25

4. ýERMÁKOVÁ, A.: Possibility of Conjoint Analysis in Course of Modeling Consumer Preference. Acta Universitatis Agriculturae et Silviculturae Mendelianae Brunensis, IL, 89-94 (2001) 5. ENGEL J.F., BLACKWELL, R.D. AND MINARD, P.W.,. Consumer behaviour. (8th Ed.), The Dryden Press, New York (1995) 6. FREWER L., HOWARD C., HEDDERLY D., SHEPHERD R.: Consumer attitudes towards different food-processing technologies used in cheese production—The influence of consumer benefit. Food Quality and Preference, 8, Iss.4,271-280 ( (1997) 7. GREEN, P.E., SRINIVASAN, V.: Conjoint analysis in consumer research. Issues and outlook. Journal of Consumer Research 5 (9), 103–123. (1978) 8. GREEN, P.E., KRIEGER, A. AND WIND, Y., "Thirty years of conjoint analysis: Reflections and prospects". Interfaces, 31,S56-S73. (2001) 9. GROSOVÁ S.: Specifika marketingu potravináĜských výrobkĤ. In: Praktické marketingové aplikace.Oeconomica, Praha 2007. 10. GRUNERT, K.G., BECH-LARSEN,T.,BREDAHL, L.: Three issues in consumer quality perception and acceptance of dairy products. Int.Dairy J., 10 ,575–584 (2000) 11. GRUNERT, K.G..: Current issues at understanding food choice. Trends in Food Science &Technology. Vol.13, Iss.8, 275-285 (2002) 12. KOPÁýEK J.: Situace v evropském a svČtovém mlékárenství v roce 2007. PĜednáška na konferenci: Celostátní pĜehlídky sýrĤ 2007, Praha. 13. Kotler P., Keller K.L.: Marketing Management. 12th Ed. Grada Publishing, str. 193,(2007) 14. KUTNOHORSKÁ O.: ZavádČní nového výrobku na trh. Diplomová práce VŠCHT, (1996) 15. Lifestyle Study 2005.TNS AISA,2005 16. McEWAN, J.A.: Preference mapping for product optimisation. In: Naes, T. and Risvik, E., Editors, 1996. Multivariate analysis of data in sensory science, Elsevier science, London, 17. 71–102 (1996) 18. MURPHY M. ET AL.: A conjoint analysis of Irish consumers preference of farmhouse cheese. British Food Journal, 2004,106,4 19. MURRAY,J.M., DELAHUNTY C. M.:Mapping consumer preference for the sensory and packaging attributes of Cheddar cheese. Food Quality and Preference 5(11),.419-435 (2000) 20. NAES T.,KUBBEROD E., SIVERTSEN H.: Identifying and interpreting market segments using conjoint analysis. Food Quality and Preference, 2(12),133-143 (2001) 21. OLSON P., GRUNERT,J.: Consumer Behaviour and Marketing Strategy. European Edition McGraw Hill(1999). 22. SHEPHERD R.: Factors influencing food preferences and choices. In: R. Shepherd, Editor, Handbook of the psychology of human eating, John Wiley and Sons, Chichester, 3–24,(1989). 23. TENDERO A., BERNABÉU R.: Preference for cheese consumers: A Spanish case study. British Food Journal, 107, 60-74 (2005) 24. Unilever: Opinion Window Research International. Unilever (2005) 25. Václavík T.: ýeský trh s biopotravinami 2005. Green marketing, Praha (2006)

Kontaktní adresa: Stanislava Grosová, Ústav ekonomiky a Ĝízení chemického a potravináĜského prĤmyslu, VŠCHT v Praze.e-mail: [email protected] Olga Kutnohorská, Ústav ekonomiky a Ĝízení chemického a potravináĜského prĤmyslu, VŠCHT v Praze.e-mail: [email protected]

26

OVýIARSTVO NA SLOVENSKU Keresteš Ján NIKA , spol. s r.o., Považská Bystrica The sheep farming in Slovakia Summary: The sheep farms, sheep milk treatment and most importantly the sheep cheese products have a long tradition in Slovakia. Nowadays, it is necessary to come back to our traditional dairy products, which can draw attention to our regional specials. The most famous Slovak sheep cheese specials are lumpy sheep cheese a, steamed/smoked, žinþica (a sheep\'s whey), and bryndza (sheep cottage cheese). In addition to the Slovak sheep specials, new dairy products are currently being developed. This contribution describes a history of sheep farms, dairy-farming in the Slovak region, a composition of sheep milk, its importance in the nourishment, and current normative principles of processing in EU setting. The operative part this contribution is concerned with is sheep dairy products made in the Slovak sheep farms, and dairy factories. The main focus of this contribution is the “bryndza” process i.e. its technology and nutritional value, in addition, its various up-to-date modifications. Nowadays, the sheep farms in Slovakia have progressively developed, particularly in agro tourism, which can help with the preservation of its present traditions, but with higher level of quality.

Ovþiarstvo na Slovensku, spracovanie ovþích produktov a zvlášĢ mlieka majú na Slovensku dlhú tradíciu. V knižnom spracovaní predstavuje þasĢ Slovenskej histórie a jej miesto v kontexte historického postavenia ovþiarstva v rozliþných stupĖoch vývoja v rôznych formách geografického a politicko – spoloþenského usporiadania. Rozsah problematiky o ovþiarstve na Slovensku, jeho histórii a technológiách môže byĢ Ģažko vyþerpávajúci, ak zahĚĖa veĐké obdobie mnohokrát s protichodnými tendenciami. Vo svojej histórii ovþiarstvo na Slovensku zasahuje do vedeckých odborov biológie, fyziky, chémie, biotechnologických vied, archeológie, histórie, poĐnohospodárstva, potravinárstva, takže svojou podstatou sa ovþiarstvo podieĐalo na akceleráciách života celej našej spoloþnosti. Možno tvrdiĢ, že ovþiarstvo a jeho využitie vo forme výživy je materializovanou filozofiou života. Ovþiarstvo, rôzne spôsoby chovu oviec a zvlášĢ chov valašským spôsobom je unikátom a špecifikom tradiþnej Đudovej kultúry Slovenska. Jeho jedineþnosĢ je v tom, že sa tu spájajú ekonomické, hospodárske, právne a kultúrne aspekty. Pastierska kultúra a chov oviec predstavovali na Slovensku od najstarších þias prínos nielen v ekonomickej oblasti ale našli odraz vo výtvarnom umení, hudobnom a taneþnom folklóre. Všetky súþasti sú vćaka rôznym okolnostiam dodnes živé, predstavujú živú kultúrnu tradíciu. Svojou odlišnosĢou od kultúr iných národov predstavujú významný vklad Slovenska do Európskych kultúrnych tradícií. Najstaršie kontakty þloveka s ovcami nám dokumentujú archeologické vykopávky na území Slovenska hlavne z doby bronzovej ( r. 1800- 1000 p. n. l. ). Chov oviec je úzko spojený s vývojovými formami poĐnohospodárstva s väzbou na spôsoby obhospodarovania pôdy, pestovania rôznych druhov plodín a kategórií hospodárskych zvierat. Medzníkom poĐnohospodárskej výroby bolo 8. storoþie n. l. keć došlo na našom území k postupnému prechodu od žiarového poĐnohospodárstva k efektívnejšiemu orebnému hospodáreniu. Archeologické nálezy potvrdzujú že nízke stavy oviec boli v 11. – 14. storoþí. Po osídĐovaní oblastí Slovenska v 12. storoþí na princípe Šoltýsovej kolonizácie najväþší vplyv na rozvoj ovþiarstva v 15. – 16. storoþí mala kolonizácia na princípe valašského práva. Rýchla dynamika rozvoja ovþiarstva bola v období 16. – 18. storoþia hlavne vplyvom priemyslovej revolúcie a osvieteneckého obdobia Rakúsko – Uhorskej panovníþky Márie Terézie a Jozefa II. Toto obdobie možno charakterizovaĢ ako veĐkovýrobné technológie chovu oviec na feudálnom princípe, oproti malochovom charakterizovaným nízkou poþetnosĢou oviec a postupným zvyšovaním stavov hovädzieho dobytka a ošípaných. 27

Ovce sa stali jedným z akcelerátorov priemyselnej revolúcie, majúce znaþný národohospodársky význam rozšírením chovov do horských oblastí, zabezpeþením výživy obyvateĐstva a opaþne, znižovaním stavov znaþnú emigráciu, ktorá sa prejavila koncom 19. storoþia a zaþiatkom 20. storoþia. Spomínaná knižná publikácia hovorí o využívaní všetkých ovþích produktov, ale aj o prvých vedecky zdôvodnených a úþelovo prispôsobených cielených plemenárskych zásahov ako formy umelého výberu. Rozvojom stavov oviec a ich plemennej príslušnosti došlo k nebývalému rozvoju plemenárskej práce, vytvoreniu systémov chovov a distribúciu najvýkonnejších plemenných zvierat do rozmnožovacích chovov. To potvrdzujú aj výsledky vedeckých zistení, archívnych dokumentov v známych feudálnych chovateĐských rodinách. Chov plemenných zvierat na Slovensku mal významný vplyv na úroveĖ plemenárskej práce v celom Rakúsko – Uhorsku. K výraznému zníženiu stavov oviec dochádza v období tesne pred I. svetovou vojnou a rozliþným stabilizáciám v období 20. storoþia a väþším þi menším úspechom prispievali štátne formy intervencií. Skutoþne vedecký základ chovu oviec na Slovensku dalo zriadenie Štátneho ovþiarsko – vlnárskeho ústavu v Turþianskom Svätom Martine v roku 1935, ktorý založil známy þeský odborník Dr. Ing. Vilém Kurz. Po 2. svetovej vojne a po rozliþných zmenách v organizaþnom þlenení výrazne prispieval ovþiarskej vede a výskumu Výskumný ústav ovþiarsky v Trenþíne a Vysoká škola poĐnohospodárska v Nitre. Zásluhou Prof. Dr. Ing. J. Laurenþíka, Vysokej školy poĐnohospodárskej v Nitre, plemenárskych a chovateĐských organizácií bolo na Slovensku vyšĐachtené nové plemenozušĐachtená valaška. Osobitným podielom je zvýraznená práca vo vede a výskume po roku 1950, kedy Slovenská veda a výskum dosiahli najväþšieho uznania. Intenzifikácia poĐnohospodárstva práve tohto obdobia s jej kooperaþnými a integraþnými prvkami prispela ku vzniku špecializovaných poĐnohospodárskych podnikov na chov oviec, hlavne v horských oblastiach. OpäĢ sa historicky potvrdilo opodstatnenie chovov oviec s vysokou koncentráciou v krátkom historickom období viackrát. Rozširovaním vedeckej základne chovu oviec a prílevom poĐnohospodárskych odborníkov do prvovýroby sa dlhodobá skúsenosĢ chovu oviec dostala na úroveĖ vedeckého riadenia výroby. Na tomto stave má nespochybniteĐnú zásluhu Vysoká škola poĐnohospodárska v Nitre a Výskumný ústav ovþiarsky v Trenþíne. Celú históriu ovþiarstva a jeho vedecký výskum je potrebné chápaĢ v kontinuite doby a danej úrovni vedeckých poznatkov, avšak najväþší vplyv na kultúrno – historické regióny, pastiersku kultúru vþítane organizovania kolektívnych salašov, stavebných objektov na salašoch, práce ovþiarov, ich stravovanie, odev ovþiarov a spôsoby zužitkovania ovþích produktov mali tradiþné formy pastierskeho hospodárenia. Doteraz zachované tradície výroby pastierskeho náradia, náþinia, výrobkov Đudovej stravy hlavne ovþieho syra a ovþieho mäsa hovorí o našich filogenetických základoch výživy a ich vplyvu na zdravotný stav obyvateĐstva. Filogenetické základy v rozsahu výživnej hodnoty a biodiverzity používanej výživy, hlavne ovþích syrov nám dali základ genetickej variability spätným dosahom najmenej 5 predchádzajúcich generácií. Pastierska kultúra nám zanechala znaþné množstvo aj živých umeleckých predmetov, špecifického odievania a všeobecnej kultúry, ktorá presahuje rámec Slovenska. Spracovanie ovþích výrobkov výrazne prispelo aj k vypracovaniu odbornej legislatívy v jednotlivých fázach vývoja, hlavne vo výžive ustanovením Uhorského potravinového kódexu. Ovþiarska história je cestou od opakovanej biedy k dostatku potravy a v dnešnom ponímaní posledných 50 rokov od kontingentov dodávok, lístkového systému po spotrebu 243 litrov mlieka na obyvateĐa a rok. V kontexte životného štýlu od drevených chalúpok, otepom pokrytých a zemou nabíjaných múrov, po moderné mestské sídelné agromelácie. Opätovne sa potvrdilo, že v štruktúre výroby a výživy treba chápaĢ ovþiarstvo ako synergický faktor mnohých vedných a výrobných odvetví. 28

Chov oviec vo svojej histórii na Slovensku stál pri základoch nových vedných poĐnohospodárskych, potravinárskych a iných odvetviach. Ale v pragmatickej þinnosti spracovanie ovþích výrobkov, hlavne mlieka dalo základ výroby Slovenských syrov, ktoré sa stali unikátnymi nielen s charakterom biodiverzity ale aj technickej vynaliezavosti . O tom už v roku 1921 napísal þeský laktológ profesor Laxa: „Slovenské parenice sú unikum syráĜských technologií vĤbec“, alebo že Slovenská bryndza obsahuje Coccus carpaticcus ako nový mikroorganizmus vyrovnávajúci sa mnohým mliekárenským mikroflóram. VzĢah ovþieho hospodárstva a dnešných 800 000 hektárov trávnych porastov na Slovensku svojej histórie determinoval životnú úroveĖ Slovákov a národností žijúcich na tomto území, stal sa bytostne spätý s demografickým rozvojom Slovenska. Vedecké poznatky získané v druhej polovici 20. storoþia urþili pre prax základy vedeckej výživy chovu oviec, ustajneniu, organizácie práce, sociálno – ekonomických aspektov chovu oviec, šĐachtiteĐskej a plemenárskej práce a podiel ovþiarstva na ekológii krajiny. K biotechnologizácii chovu oviec a jej vplyvom na biodiverzifikáciu životného prostredia výrazne prispievali vedecké objavy vo výžive, anatómii a fyziológii oviec, vplyvy frekvenþné, sekvenþné, stimulaþné a akceleraþné podmienky rozvoja chovov oviec. Uvedená kniha o ovþiarstve na Slovensku obsahuje aj historický vývoj technológií, spracovania mlieka, mäsa, vlny, þrievok, koží, rohov a paznechtov. Pre novodobé biotechnologické hĐadiská a ich využitie v eliminácii novodobých ochorení je potrebné pripomenúĢ ich nezastupiteĐné miesto, hlavne v produkcii mäsa a mlieka s vyšším obsahom selénproteínov oproti iným výrobkom. OveĐa vážnejším a menej doceneným významom je rozsiahly mikrobiálny vplyv na zdravotný stav obyvateĐstva, z dôvodov zachovania biodiverzity. Nevyužitý je potenciál vysokého obsahu nenasýtených konjugovaných mastných kyselín a štruktúra možností ich biotechnologického použitia, hlavne v stimulaþných faktoroch. V poslednom období bol venovaný vedecký výskum znaþnej þasti symbiotických a antagonistických vzĢahov mikroflóry, hlavne Slovenskej bryndze, jej vplyvu na zdravotný stav obyvateĐstva a dlhovekosĢ. Bolo potvrdené a klinicky dokázané že Slovenská bryndza je unikátny, mikrobiálne širokospektrálny a inde neopakovateĐný prírodný mäkký zrejúci syr a v tomto ponímaní ako mikrobiálny fenomén!!! Najnovšie objavy boli zamerané na možnosti využitia polyformizmu bielkovín ovþieho mlieka, laktoproteínov a ich hlavných vlastností, súvislosti medzi genetickými variantami mlieþnych proteínov, zložením mlieka, jeho spracovaním, vplyvu na výživu a zdravotný stav obyvateĐstva . K výživnej hodnote mlieka výrazne prispela modifikácia zloženia mastných kyselín, minerálnych živín, vitamínov a iných protektívnych látok. Klinicky boli overené funkcie þrevnej mikroflóry v Đudskom organizme, ich probiotické úþinky i spojitosĢ s pôsobením prebiotík a imunomodulaþnými úþinkami. Práve Slovenská bryndza a jej výskum môže pre prax vytvoriĢ vedecké predpoklady pre priemyselnú výrobu probiotických potravín. V tej súvislosti je treba uviesĢ, že v menšom rozsahu boli publikované získané probiotické úþinky ovþieho mäsa a niektorých jeho benefitov. História ovþiarstva na Slovensku nám potvrdzuje, že v rozliþných spoloþenských formáciách a v súþasnom období zvlášĢ, je možné výrazne uplatniĢ komplexné prvky efektívnej akcelerácie chovov a probiotického využívania ovþích produktov. Pre samotnú výrobu k efektívnym prvkom chovu patrí predovšetkým manažment, evidencia zvierat, selekcia, plemeníci, prevencia a výživa. Z biotechnologických metód akcelerácie, usmernenie reprodukþného cyklu, prvky organizaþné, ekonomické a legislatívne. Pre ovþiarstvo budúcnosti je potrebné vymedzenie výroby naturálnych probiotických syrov, aktívny manažment predaja jatoþných zvierat. Sezónny predaj a to spravidla na poslednú chvíĐu je po komerþnej stránke kontraproduktívny. Jeden z problémov ovþiarstva je aj vytipovaĢ spracovateĐov vlny do efektívnych výrobkov, hlavne do tradície výroby slovenských kobercov. Dnes nie je organizácia, ktorá by vlnu do týchto výrobkov spracovávala. 29

Z legislatívnych akceleraþných vplyvov treba upraviĢ kontraproduktívnosĢ 51 % - ného podielu ovþieho syra v bryndzi, keć pri dnešných kontrolných mechanizmoch je falšovanie u veĐkých výrobcov bryndze od 5 do 29 % v takom istom stave ako v roku 1921, kedy Teodor Vallo navrhol pre neobvyklé rozmery falšovania bryndze zoštátnenie bryndziarní. Akceleraþné prvky rozvoja ovþiarstva na Slovensku však vychádzajú z poznania, že nesprávnymi politickými rozhodnutiami dochádzalo k zhoršeniu úrovne kvality a množstva potravín. Probiotiká a prebiotiká sa vyznaþujú významnými funkþnými a zdravotne prospešnými úþinkami. Ich využitie vo forme funkþných potravín a liekových foriem má veĐkú budúcnosĢ. S urþitosĢou možno potvrdiĢ z doterajších klinických výskumov, že zaujmú významné postavenie v prevencii a terapii najþastejších ochorení, ktoré Đudstvo postihujú: kardiovaskulárne choroby, rakovina, hypercholesterolémia, osteoporóza, diabetes mellitus, atopické, imunodeficiencie a iné. To v pragmatickej þinnosti znamená prechod od konzerv pre dlhodobé použitie, k živej, biologicky sofistikovanej širokospektrálnej výrobe potravín. V súþasných podmienkach je problematika dodržiavania kvality mlieþnych výrobkov, ale aj potravín vôbec, priamo úmerná úrovni štátnych dotácií do poĐnohospodárstva. Ovþiarstvo, napriek všetkým problémom na Slovensku sa v súþasnosti dynamicky rozvíja a má na to veĐké možnosti a predpoklady. ZvlášĢ aktuálny je intenzívny rozvoj salašníckeho i mliekarenského spracovania ovþieho mlieka a ostatných ovþích produktov a problematika rozvoja agroturistiky, v rámci ktorej by sa mali zachovaĢ doterajšie tradície, avšak na vyššom kvalitatívnom stupni. Záverom nedá mi, aby som nespomenul že historický rozvoj ovþiarstva a jeho základu mlieþneho hospodárstva výrazne ovplyvnili mnohí vynikajúci þeskí odborníci. Preto Slovenská história nikdy nemôže zabudnúĢ na odborníkov Laxu, Rosana, Prokeša, Šebelu, KnČza, Olšanského, Formana, Kurza, HrĤzu, Horáka a ćalších, ktorí sa zapísali do Slovenského ovþiarstva a vzĢahov, ktoré prežili politiku..... . Poćakovanie : Týmto ćakujem celému autorskému kolektívu a svojím spolupracovníkom pri zostavovaní knižnej publikácie Ovþiarstvo na Slovensku. Kontaktná adresa : Ing. Ján Keresteš, NIKA , spol.s r.o. , Nová ul. þ.135, 01701 Považská Bystrica, Slovensko.

30

MLÉKO a SÝRY PĜednášky

VARIABILITA SYěITELNOSTI V BAZÉNOVÝCH VZORCÍCH KRAVSKÉHO MLÉKA PĜibyla Lubomír1, ýejna Vladimír2, Chládek Gustav3 1 Institut analytické chemie AV ýR, Brno 2 OddČlení vývoje a výzkumu, PRIBINA, spol. s r. o., 3 Ústav chovu a šlechtČní zvíĜat, Agronomická fakulta MZLU, Brno Variability of rennet coagulation time in bulk tank milk samples in cattle Summary: Rennet coagulation time is an elementary processing characteristic which greatly affects quality and quantity of cheese production in cheese-making plants. This experiment was designed to monitor changes in coagulation time over a certain observation period and find differences in rennet coagulation time of milk of different milk producers. We analysed bulk tank samples of milk of 13 producers in weekly intervals (from week 30 to 46). We found a statistically significant effect (P<0.001) of a test week on rennet coagulation time. The best rennet coagulation time (in all producers) was found in week 32 (212 s) and the worst in week 40 (304 s). The effect of producer on rennet coagulation time was also statistically significant (P<0.001). The best rennet coagulation time was found in milk coming from farms 2 and 3 (231 s) and the worst from farm 8 (343 s). Our experiment revealed a major impact of season and milk producer on milk coagulation time. It is obvious that regular milk tests for coagulation time are vital for a successful control of milk-processing in a cheesemaking line

Úvod RozšiĜující se sortiment mlékárenských výrobkĤ a zvýšení tlaku na ekonomiku jejich výroby vyvolává zvýšené nároky na kvalitu mléka. Navíc vzhledem k celosvČtovČ narĤstajícím cenám mléka je tĜeba maximální znalost zpracovávané suroviny za úþelem nastavení optimálních parametrĤ výrobních linek a tím docílení maximální ekonomiky výroby. Tyto faktory vyvolávají potĜebu poznat dokonale parametry zpracovávané suroviny. Vedle standartnČ zjišĢovaných ukazatelĤ (fyzikálnČ-chemicko-mikrobiologických) tudíž nabývají na významu i ty, které se bČžnČ nestanovují. Jedná se pĜedevším o technologické vlastnosti mléka, které se významnou mČrou podílejí na jakosti a rentabilitČ výroby. Jejich variabilita v prĤbČhu roþního období a také mezi jednotlivými dodavateli pak mĤže výraznČ ovlivnit tyto výrobní faktory. SyĜitelnost pĜedstavuje základní technologickou vlastnost mléka, která se významnou mČrou podílí na kvantitativní a kvalitativní produkci sýrárny. Vhodnost mléka k dalšímu zpracování na sýry je dána pĜedevším odpovídající výtČžností (množství vyrobeného sýra ze 100 kg mléka), která tvoĜí základ ekonomické produkce sýra ze strany výrobce. Tuto vhodnost ovlivĖují faktory jako: doba srážení (syĜitelnost), kvalita sýĜeniny, obsah bílkovin, kaseinu, ț–kaseinu B, kaseinové þíslo, obsah tuku, laktózy, vápníku a hodnota pH [1]. Také Ostersen et al. (1997) [2] uvádČjí tyto hlavní sýraĜské vlastnosti: obsah kaseinu a vápníku, pH, syĜitelnost a kvalita sýĜeniny. Mléþné koagulaþní vlastnosti velmi ovlivĖují výslednou kvalitu a kvantitu sýrĤ [3]. Mléko, které koaguluje a tvoĜí pevnou sýĜeninu brzy po pĜidání syĜidla, je schopno vyprodukovat více sýrĤ než mléko se špatnými koagulaþními vlastnostmi [4]. Také Ikonen et al. (2004) [5], poznamenávají že, pro produkci sýrĤ je žádoucí mléko, které rychle koaguluje (krátký þas syĜitelnosti) a rychle formuje pevnou sýĜeninu (vysoká kvalita sýĜeniny). U þerstvČ nadojeného mléka jsou již technologické vlastnosti dány a závisejí na celé ĜadČ faktorĤ, související s individualitou dojnice, plemenem, dČdiþným založením, poĜadím a stadiem laktace, roþní dobou a v nejvČtší míĜe s podmínkami výživy a krmení a zdravotním stavem dojnice. U skladovaného mléka mohou pĤsobit ještČ další faktory, které mohou technologické vlastnosti zlepšit nebo zhoršit. Tyto faktory souvisejí jednak se zmČnami ve složení mléka v dĤsledku rozvoje a biochemické þinnosti kontaminující mikroflóry a jednak s fyzikálnČ–chemickými zmČnami zpĤsobenými skladováním mléka pĜi nízké teplotČ [6]. ShodnČ Riddell–Lawrence a Hicks (1989) [4] uvádČjí, že následné zacházení s mlékem (doba a teplota skladování, tepelné ošetĜení, homogenizace a standartizace, typ a koncentrace srážecího enzymu, pĜídavek vápenatých solí a srážecí teplota) ovlivĖuje syĜitelnost. Také další

33

environmentální faktory, jako je sezónnost, stadium laktace a výživa ovlivĖují syĜitelnost mléka [7], pĜiþemž tyto rozdíly jsou zpĤsobeny pĜedevším vlivem zmČn chemického složení mléka [8]. Velmi významný je také vliv plemene. U kritérií jako je syĜitelnost a kvalita sýĜeniny je zĜejmá pĜevaha plemen strakatého skotu nad plemenem holštýnským. DĤvodem je výhodnČjší obsah bílkovin, pĜedevším pak zastoupení kaseinu a jeho frakcí [9]. Studie zjišĢující rozdíly v koagulaþních vlastnostech mléka mezi rĤznými plemeny byly zpracovány ve Velké Británii [10], Francii [11], Itálii [12; 13], Irsku [14] a na Novém ZélandČ [15]. V ýeské republice byly v posledních letech vypracovány tyto studie zabývající se vlivem plemenné pĜíslušnosti dojnic na technologické vlastnosti mléka: [16; 17; 18; 19]. V sýĜeninČ vzniklé z mléka s dobrou syĜitelností je zachyceno více kaseinu a tuku pĜi následném krájení. Vzhledem k tomu, že kasein a tuk pĜedstavují kolem 90 % sušiny sýrĤ, ze ztráty tČchto komponentĤ do syrovátky projeví v úrovni dosahované výtČžnosti sýrĤ [20]. ObdobnČ Aleandri et al. (1989) [21] a Riddell–Lawrence a Hicks (1989) [4] zjistili, že od mléka s dobrou syĜitelností a tvorbou kvalitní sýĜeniny lze oþekávat produkci sýrĤ s vyšší sušinou než u mléka se špatnými koagulaþními vlastnostmi. To potvrzují i Ikonen et al. (1999) [22], kteĜí z mléka s dobrou syĜitelností vyrobili sýry ementálského typu s vyšší sušinou, s nižším obsahem tuku a kaseinu v syrovátce oproti mléku se špatnou syĜitelností. PĜedpokládají, že zlepšování syĜitelnosti v bazénových vzorcích zlepší kvalitu sýraĜských procesĤ. V dĤsledku souþasných zmČn v oblasti chovu skotu (technika ustájení, výživa, plemenná skladba) je nutné vČnovat pozornost vlivu tČchto faktorĤ na zmČny v syĜitelnosti mléka. Sledování syĜitelnosti by mČlo probíhat nejen na úrovni prĤmyslového zpracování (mléko na výrobníku), ale také na úrovni prvovýroby mléka (bazénové vzorky) a šlechtČní skotu (individuální vzorky) [23]. Cílem tohoto projektu je posouzení variability syĜitelnosti u jednotlivých dodavatelĤ a také zjištČní vlivu sezóny na zmČny tohoto parametru. Znalost této problematiky je zejména dĤležitá pro sýraĜské provozy, které na tyto zmČny mohou reagovat vþasnými zásahy do technologie výroby.

Materiál a metodika Data pro tuto studii byla získána z bazénových vzorkĤ kravského mléka. Vzorky byly odebírány 1x týdnČ v rámci jednoho dne. OdbČr vzorkĤ probíhal od 30. do 46. týdne. Vzorky pĜedstavují smČs ranního a veþerního nádoje. Analýza vzorkĤ probíhala okamžitČ po pĜíjezdu svozné cisterny do mlékárny. Sledované farmy byly dodavatelé s rĤznou dodávkou mléka (80 – 20 000 litrĤ/dennČ) se zastoupením jak kombinovaných tak mléþný plemen, popĜ. s jejich rĤzným podílem ve stádČ. Sledované farmy se nacházely v severní þásti kraje Vysoþina. Celkem bylo analyzováno 212 bazénových vzorkĤ mléka. SyĜitelnost byla mČĜena pomocí turbidimetrického snímaþe koagulace mléka (obr. 1). Tento pĜístroj se vyznaþuje svojí jednoduchostí a odolností. Jako kyveta mČĜeného vzorku mléka je použita sterilní 2 ml injekþní stĜíkaþka. Optický detektor pĜístroje pĜevádí intenzitu procházejícího svČtla na elektrický signál a velikost napČtí na výstupu optického detektoru je funkcí intenzity svČtla, které na optický detektor dopadá. BČhem koagulace dochází k úbytku optického signálu, což se projeví úbytkem mČĜeného napČtí. Tento prĤbČh je okamžitČ derivován a výsledné vysrážení para–kaseinu odpovídá minimální hodnotČ derivaþní kĜivky. Vzorek mléka (25 ml) byl vytemperován na 35 °C s následným pĜídavkem 200 ȝl syĜidla (mikrobiální syĜidlo, 220 IMCU, ĜedČní 1:9) a promíchán. Poté se odebralo mČĜící sondou (injekþní stĜíkaþka) 2 ml mléka a sonda byla místČna do mČĜící cely snímaþe. Po 30 s od pĜídavku syĜidla do mléka byl zapnut start s následným záznamem analýzy. K výslednému þasu zmČĜeného snímaþem bylo poté pĜiþteno 30 s. Aktivní kyselost byla mČĜena pH-metrem WTW pH 197. Titraþní kyselost byla provádČna dle ýSN 57 0530 þl. 58.

34

Výsledky a diskuze PrĤmČrná syĜitelnost a její variabilita sledovaného souboru farem v jednotlivých kalendáĜních týdnech uvádí tab I. Grafické znázornČní zmČn prĤmČrné syĜitelnosti sledovaného souboru farem je patrné z grafu 1. PrĤmČrná syĜitelnost se ve sledovaném období pohybovala v intervalu 212 (32. týden) až 304 s. (40. týden). Rozdíl mezi nejlepší a nejhorší syĜitelností tedy þinil 92 s; þili prodloužení syĜitelnosti o 43 %. Nejvíce mČĜení se pohybovalo v intervalu 245 až 290 s. (31; 36 – 39; 41 – 46 týden). PrĤmČrná hodnota syĜitelnosti za celé sledované období byla 267 s. Nejlepší syĜitelnost mléka byla zjištČna ve 30. a 32. týdnu (238; 212 s). Naopak nejhorší syĜitelnost byla zaznamenána ve 40. a 46. týdnu (304; 286 s). ObecnČ lze Ĝíci, že ve druhé polovinČ sledovaného období byla tato vlastnost mírnČ horší než v první polovinČ období. Nejlepší syĜitelnost z 32. týdne nelze pĜímo vysvČtlit pĤsobením kyselosti mléka, i když aktivní kyselost byla ponČkud nižší (6,66) v rámci hodnot celého sledovaného období (tab. II), nicménČ hodnota titraþní kyselosti (6,33) je ponČkud nepĜíznivá pro dosažení velmi dobré syĜitelnosti. Z tohoto lze usoudit na pĤsobení nČkterého dalšího vlivu, popĜ. vlivĤ, které v této práci nebyly sledovány. Zjistili jsme vysoce statisticky prĤkazný vliv (P<0,001) sledovaného období na syĜitelnost mléka. Obdobný výsledek uvádČjí i Summer et al. (2000) [24]. PonČkud menší vliv sezóny na syĜitelnost mléka (P<0,01) publikovali Mariani et al, (1999) [25]. V rámci jednotlivých mČsícĤ roku zjistili Marchi et al. (2006) [26] nejlepší syĜitelnost v mČsících záĜí a Ĝíjen a nejhorší v mČsících leden a únor. Mariani et al. (1999) [25] zjistili nejlepší syĜitelnost v mČsících duben a þervenec (17,7; 18,8 min) a nejhorší v mČsících srpen a záĜí (20,5; 20,7 min). Variabilita syĜitelnosti se ve sledovaném období pohybovala v intervalu od 7,0 (36. týden) do 21,0 % (30. týden). Nejvíce se variabilita pohybovala v intervalu od 13 do 19 % (33. – 35; 38. – 42.; 45. a 46. týden). PrĤmČrná variabilita za celé sledované období byla 15,9 %. Nezaznamenali jsme výrazný trend zmČny variability v syĜitelnosti v prĤbČhu sledovaného období. ZjištČná variabilita syĜitelnosti bazénových vzorkĤ je nižší než variabilita syĜitelnosti v individuálních vzorcích, neboĢ v bazénových vzorcích jsou více eliminovány rozdíly v individualitČ dojnice. NapĜ. ýejna (2006) [27] uvádí variabilitu syĜitelnosti v individuálních vzorcích kravského mléka 35,4 a 26,1 %. ObdobnČ Hanuš et al. (1995) [28] uvádČjí u individuálních vzorkĤ variabilitu syĜitelnosti 36,0 %. PrĤmČrná syĜitelnost jednotlivých farem za celé období uvádí tab. III. Grafické znázornČní prĤmČrné syĜitelnosti jednotlivých farem je patrné z grafu 2. Nejlepší syĜitelnost byla zaznamenána u farem 2, 3, 11 a 12 (231; 231; 236 ; 237 s) a nejhorší syĜitelnost u farem 6, 7, 8 a 10 (304; 302; 343 a 297 s). Rozdíl mezi nejlepší syĜitelností u farem 2 a 3 (231 s) a nejhorší u farmy 8 (343 s) byl 113 s; tedy zhoršení syĜitelnosti o 49 %. Jak je patrné z grafu 2, jsou farmy, které dosahují velmi dobré syĜitelnosti a druhou stranu jsou farmy s ponČkud horší syĜitelností. Mezi hlavní faktory, které mohly zpĤsobit tyto rozdíly, patĜí zejména zootechnické a veterinární podmínky na jednotlivých farmách (plemeno, výživa, zdravotní stav). Zjistili jsme vysoce statisticky prĤkazný vliv (P<0,001) farmy na syĜitelnost mléka. Nejmenší variabilita syĜitelnosti byla zaznamenána u farmy 9 (8,3 %), nejvČtší u farmy 10 (20,3 %). Hanuš et al. (2007) [29] udávají variabilitu syĜitelnosti u bazénových vzorkĤ ze 13 ekologických farem 17,3 % s intervalem þasu syĜitelnosti od 94 – 184 s.

35

Tab. I.: PrĤmČrná syĜitelnost sledovaného souboru farem v jednotlivých kalendáĜních týdnech

týden 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46

Tab. II.: PrĤmČrná titraþní a aktivní kyselost sledovaného souboru farem v jednotlivých kalendáĜních týdnech

prĤmČr (s)

min

max

Sx

v%

týden

SH

pH

238 272

190 204

359 408

50,0 56,8

21,0 20,9

30

6,88

6,69

31

6,59

6,70

212

179

221

23,5

11,1

32

6,33

6,66

278 248 273 261 257 252 277 304 281 273 275 279 275 286

236 209 217 222 185 195 218 245 232 220 203 231 237 220

366 389 377 287 362 320 370 413 366 330 411 390 341 392

42,2 45,7 38,1 18,3 49,4 35,4 49,4 51,4 38,4 37,7 54,0 43,8 33,6 53,4

15,2 18,4 14,0 7,0 19,2 14,1 17,9 16,9 13,7 13,8 19,7 15,7 12,3 18,7

33

6,38

6,70

34

6,45

6,73

35

6,38

6,66

36

6,65

6,65

37

6,61

6,69

38

6,50

6,68

39

6,41

6,75

40

6,42

6,65

41

6,43

6,71

42

6,39

6,71

43

6,54

6,72

44

6,51

6,74

45

6,54

6,72

46

6,55

6,72

Tab. III.: PrĤmČrná syĜitelnost jednotlivých farem za sledované období farma

prĤmČr (s)

min

max

Sx

v%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

242 231 231 246 270 304 302 343 246 297 236 237

185 192 179 193 193 230 248 251 212 207 195 195

319 294 255 283 348 408 351 411 268 413 278 268

31,6 24,0 20,6 22,8 32,4 43,1 27,7 43,7 20,4 60,5 21,9 20,0

13,1 10,4 8,9 9,3 12,0 14,2 9,2 12,7 8,3 20,3 9,3 8,4

13

270

207

319

30,4

11,2

36

Obr. 1: Turbidimetrický snímaþ koagulace mléka

350

340

330

320

310 290 270

280 [s]

[s]

300

260

250 230

240

210 190

220

170

200 1

2

3

4

5

6

7 farma

8

9

10

11

12

150

13

30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 týden (2007)

syĜitelnost

Graf 1 PrĤmČrná syĜitelnost sledovaného souboru farem v jednotlivých kalendáĜních týdnech

syĜitelnost

Graf 2 PrĤmČrná syĜitelnost jednotlivých farem za sledované období

ZávČr SyĜitelnost mléka významnČ ovlivĖuje kvantitativní i kvalitativní produkci sýrárny. Zjistili jsme vysoce statisticky prĤkazný vliv (P<0,001) sledovaného období na syĜitelnost mléka. Tyto zmČny v prĤbČhu sezóny pak mohou negativnČ ovlivnit produkci sýrárny a znalost pĜípadných sezónních výkyvĤ mĤže tyto dopady úþelnČ eliminovat. Dále jsme zjistili vysoce statisticky prĤkazný vliv (P<0,001) farmy na syĜitelnost mléka. Tato skuteþnost ukazuje na významný vliv dodavatele mléka na jeho syĜitelnost. Tento experiment ukázal na dĤležitost sledování syĜitelnosti mléka jak z pohledu sezónních zmČn tak z pohledu dodavatele mléka. PodČkování: PĜíspČvek byl vypracován s podporou projektu NAZV QF4082, MZe. Použitá literatura: 1. BUCHBERGER, J. – BIECHL, CH. – MILLER, M. – UTH, M. – WILLEKE, H. Vliv plemene na vhodnost mléka ke zpracování na sýry. Zpravodaj svazu chovatelĤ a plemenné knihy þeského strakatého skotu, 2005, þ. 1, s. 15. ISSN: 1214-8016. 2. OSTERSEN, S. – FOLDAGER, J. – HERMANSEN, J. E. Effects of stage of lactation, milk protein genotype and body condition at calving on protein composition and renneting properties of bovine milk. J. Dairy Res., 1997, vol. 64, no. 2, s. 207–219. ISSN: 0022-0299. 3. WEDHOLM, A. – LARSEN, L. B. – LINDMARK-MÅNSSON, H. – KARLSSON, A. H. – ANDRÉN, A. Effect of protein composition on the cheese–making properties of milk from individual dairy cows. J. Dairy Sci., 2006, vol. 89, no. 9, s. 3296–3305. ISSN: 0022-0302. 4. RIDDELL-LAWRENCE, S. – HICKS, C. L. Effect of curd firmness on stirred curd cheese yield. J. Dairy Sci., 1989, vol. 72, no. 2, s. 313–321. ISSN: 0022-0302. 5. IKONEN, T. – MORRI, S. – TYRISEVÄ, A.-M. – ROUTTINEN, O. – OJALA, M. Genetic and phenotypic correlations between milk coagulation properties, milk production traits, somatic cell count, casein kontent and pH of milk. J. Dairy Sci., 2004, vol 87, s. 458–467. ISSN: 0022-0302. 6. GAJDģŠEK, S. Laktologie. Brno: MZLU, 2003, 84 s. ISBN: 80-7157-657-3. 7. DAVOLI, R. – DALLOLIO, S. – RUSSO, V. Effect of ț–casein genotype on the coagulation properties of milk. J. Anim. Breed. Genet., 1990, vol. 107, no. 6, s. 458–464, ISSN: 0931-2668. 8.TYRISEVÄ, A.-M. – VAHLSTEN, T. – RUOTTINEN, O. – OJALA, M. Noncoagulation of milk in finnish Ayshire and Holstein-Friesian cows and effect of herds on milk coagulation ability. J. Dairy Sci., 2004, vol. 87, no. 11, s. 3958– 3966. ISSN: 0022-0302. 9. KUýERA, J. – KRÁL, P. ýeský strakatý skot – výsledky a budoucnost. In Den mléka 2005, ýZU Praha, 2005, s. 7– 9. ISBN: 80-213-1327-7. 10. VERDIER-METZ, I. – COULON, J. B. – PRADEL, P. – VIALLON, C. – BERDAGUE, J. L. Effect of forage conservation (hay or silage) and cow breed on the coagulation properties of milks and on the characteristics of ripened cheeses. J. Dairy Res.,1998, vol. 65, no. 1, s. 9–21. ISSN: 0022-0299. 11. MACHEBOEUF, D. – COULON, J. B –DHOUR, P. Effect of breed, protein genetic–variants and feeding on cows milk coagulation properties. J. Dairy Res., 1993, vol. 60, no. 1, s. 43–45. ISSN: 0022-0299.

37

12. CHIOFALO, V. – MALDONATO, R. – MARTIN, B. – DUPONT, D. – COULON, J. B. Chemical composition and coagulation properties of Modicana and Holstein cows´ milk. Ann. Zootech., 2000, vol. 49, no. 6, s. 497–503. ISSN: 0003-424X. 13. MALACARNE, M. – SUMMER. A. – FOSSA, E. – FORMAGGIONI, P. – FRANCESCHI, P. – PECORARI, M. – MARIANI, P. Composition, coagulation and Parmigiano-Reggiano cheese yield of Italian brown and Italian friesian herd milks. J. Dairy Res., 2006, vol. 73, no. 2, s. 171–177. ISSN: 0022-0299. 14. AULDIST, M. J. – MULLINS, C. – O´BRIEN, B. – O´KENNEDY, B. T. – GUINEE. T. Effect of cow breed on milk coagulation properties. Milchwissenschaft, 2002, vol. 57, no. 3, s. 140 – 143. ISSN: 0026-3788. 15.AULDIST, M. J. – JOHNSTON, K. A. – WHITE, N. J. – FITZSIMONS, W. P. –BOLAND, M. J. A comparison of the composition, coagulation characteristics and cheese making capacity of milk form Friesian and Jersey dairy cows. J. Dairy Res., 2004, vol. 71, no. 1, s. 51–57. ISSN: 0022-0299. 16. KOŠ, J.: Porovnání mléþné užitkovosti dojnic holštýnského a montbeliardského plemene skotu na farmČ PapĤvka. Diplomová práce. AF MZLU Brno, 2006, 59 s 17. ýEJNA, V. – CHLÁDEK, G. Zhodnocení rozdílĤ v sýraĜských vlastnostech mléka mezi dojnicemi holštýnského a montbeliardského plemene. In: Mléko a sýry 2006, Praha: ýeská spoleþnost chemická, 2006, s. 53 – 58, ISBN: 807080-620-6. 18. ýEJNA, V. – MLýEK, J. – CHLÁDEK, G. Vliv plemene a poĜadí laktace na obsah kaseinu v kravském mléce. In Den mléka 2006, Praha: ýZU, 2006, s. 98–99. ISBN: 80-213-1498-2. 19. HANUŠ, O.- FRELICH, J.- ROUBAL, P.- VORLÍýEK, Z.- ěÍHA, J- POZDÍŠEK, J.- BJELKA, M. Vlivy plemenné pĜíslušnosti dojnic na nČkteré chemicko-složkové, fyzikální, zdravotní a technologické mléþné ukazatele. Výzkum v chovu skotu, 2003, roþ. 45, þ. 4, s. 1-10. ISSN: 0139-7265. 20. POLITIS, I. – NG-KWAI-HANG, K. F. Effects of somatic cell and milk composition on cheese composition and cheese making efficiency. J. Dairy Sci., 1988, vol. 71, no. 7, s. 1711-1719. ISSN: 0022-0302. 21. ALEANDRI, R. – SCHNEIDER, J. C. – BUTTAZZONI, L. G. Evaluation of milk for cheese production based on milk characteristics and Formograph measures. J. Dairy Sci., 1989, vol. 72, no. 8, s. 1967–1975. ISSN: 0022-0302. 22. IKONEN, T. – RUOTTINEN, O. – SYVAOJA, E. L. – SAARINEN, K. – PAHKALA, E. – OJALA, M. Effect of milk coagulation properties of herd bulk milks on yield and composition of Emmental cheese. Agricultural and food science in Finland., 1999, vol. 8, no. 4–5, s. 411–422. ISSN: 1239-0992. 23. ýEJNA, V. – PěIBYLA, L. Význam sledování syĜitelnosti mléka. PotravináĜská revue, 2007, roþ. 4, þ. 3, s. 91–93. ISBN neuvedeno. 24. SUMMER, A. – FORMAGGIONI, P. – TOSI, F. – FOSSA, E. – MARIANI, P. Effects of the hot-humid climate on rennet coagulation properties of milk produced during summer months of 1998 and relationships with the housing systéme in the rearing of Italian friesian cos. Annali della Facolta di Medicina Veterinaria, Universita di Parma, no. 19, vol. XX, 2000, s. 167 – 179, ISSN: 0393-4802. 25. MARIANI, P. – SUMMER, A. – FORMAGGIONI, P. – BELTRAMI, A. – SANDIR, S. Andamento mensile delle principali caratteristiche di coagulazione del latte di singoli allevamenti di vacche di razza frisona con particolare riguardo alla velocità di formazione del coagulo. Annali della Facolta di Medicina Veterinaria, Universita di Parma, no. 18, vol. XIX, 1999, s. 65 – 83, ISSN: 0393-4802. 26. MARCHI, de M. – ZOTTO, D. R. – CASSANDRO, M. – BITTANTE, G. Milk coagulation ability of five dairy cattle breeds. J. Dairy Sci., 2007, vol. 90, no. 8, s. 3986-3992. ISSN: 0022-0302. 27. ýEJNA, V.: Vliv laktace krav na vybrané technologické vlastnosti mléka. Disertaþní práce. AF MZLU Brno, 2006, 120 s 28. HANUŠ, O. – GAJDģŠEK, S. – BEBER, K. – FICNAR, J. – JEDELSKÁ, R. Složení a technologické vlastnosti mléka od dojnic ve stĜední þásti laktace a jejich vzájemné vztahy. Živoþišná výroba, 1995, roþ. 40, þ. 12, s. 555–561. ISSN: 0044-4847. 29. HANUŠ, O. – GENýUROVÁ, V. – ROUBAL, P. – JANģ, L. – ROZSYPAL, R. – VYLETċLOVÁ, M. – MACEK, A. Vybrané aspekty zdraví dojnic, kvality vody a mléka ekologicky mlékaĜících farem v ýeské republice. Výzkum v chovu skotu, 2007, roþ. 49, þ. 3, s. 1-13. ISSN: 0139-7265.

Kontaktní adresa: Ing. Lubomír PĜibyla, email: [email protected]; tel: 723 120 569

38

RÝCHLA IDENTIFIKÁCIA PATOGÉNOV MASTITÍD, ZÁRUKA VÝROBY KVALITNÉHO SUROVÉHO MLIEKA AKO SUROVINY PRE VÝROBU SYROV Foltys Vladimír, Kirchnerová Katarína Slovenské centrum poĐnohospodárskeho výskumu, Výskumný ústav živoþíšnej výroby, Nitra Rapid identification of mastitis pathogens – guarantee of good quality raw milk production as raw material for chees production Summary: Sales for milk depend on observance of specified characteristics of quality. Good state of health in mammary gland of dairy cows is the basis for production of good quality milk. Particularly the disorder of mammary gland is the greatest health problem in breeding of dairy cows nowadays. Milk from healthy herds is the guarantee of good quality cheese production. The breeder must gain milk from healthy individuals to produce milk of high quality. Identification of risk dairy cows is possible in different ways: partly visually, by stable tests, on the basis of SCC in individual dairy cows, and partly in the bulk sample. Another way are the laboratory tests of milk to detect pathogens of mastitis. It is possible to obtain information which pathogen is present in the herds in various ways, which have their advantages and disadvantages, as well as typical spheres of utilization. They are: bacteriological examination of individual cows in the herd, tests of milk bulk sample for presence of pathogens, and a new method, which we test – tests of filter on presence of pathogens. We try to base the new method also on quantitative evaluation of pathogens occurrence. Results from first experiments will be presented. They were obtained during the departmental research. The benefit consists in the possibility to estimate the prevalence of the given pathogen in stable on the basis of results from basin or filter sample analyses.

Základom výroby kvalitného mlieka je dobrý zdravotný stav mlieþnej žĐazy dojníc. Ochorenie mlieþnej žĐazy – mastitída – je v dnešnej dobe, vedĐa porúch plodnosti, najväþším zdravotným problémom v chovoch dojníc. Z pohĐadu prvovýrobcu mlieka je odhad strát len zo zníženej produkcie 10 – 30 %. Ćalšie straty však vznikajú prvovýrobcom z : - nespracovateĐného mlieka pri ošetrení vemena, - zrážok z platieb za mlieko, - nákladov na obnovu stáda, - nákladov na veterinárne ošetrenie. Mastitída – téma na odborný seminár na celý deĖ – je zápalové ochorenie mlieþnej žĐazy, spôsobené patogénnymi mikroorganizmami. Je to polyfaktoriálne ochorenie, kde riziko vzniku ovplyvĖuje dojnica, prostredie a infekþné mikroorganizmy. NajspoĐahlivejším indikátorom zdravotného stavu mlieþnej žĐazy je poþet somatických buniek (PSB) v mlieku. Zvýšený PSB je známkou ochorenia, je ukazovateĐom zdravotného stavu. Jednoznaþná hranica medzi hodnotami „zdravými“ a „dobrými“ neexistuje, prechod medzi nimi je plynulý. Bunky však v mlieku nie sú schopné sa množiĢ, preto sa ich poþet nezvyšuje. Stanovenie poþtu somatických buniek 1. V rámci stáda – bazénová vzorka udáva obraz o zdravotnom stave dojníc celého stáda. Neodhalí však dojnice so zvýšeným PSB, ktoré sú hlavne zdrojom infekcie pre ćalšie dojnice. 2. Individuálne vyšetrenia – vysoká presnosĢ a možnosĢ cieleného postupu opatrení v stáde. PSB je možné stanoviĢ : - presne – prístrojové stanovenie v laboratóriu (CSL, kontrola úžitkovosti dojníc), - odhadom – tzv. maštaĐný NK-test. - pomocou merania elektr. vodivosti PodĐa výsledkov poradenského servisu odporúþame kontrolu zdravotné stavu vemien v stáde robiĢ v dvojtýždĖových intervaloch, striedaním zisĢovania PSB v rámci kontroly úžitkovosti a vyšetrenia NK-testom. Odporúþame zaviesĢ individuálnu evidenciu o zdravotnom stave, þi už formou evidenþných kariet alebo elektronickou formou.

39

Aké sú príþiny zvýšeného PSB Ich obsah je ovplyvnený rôznymi faktormi. Každý chovateĐ vie, že aj pri zdravých dojniciach môže PSB kolísaĢ bez toho, aby nastala porucha zdravotného stavu mlieþnej žĐazy. S dĎžkou laktácie PSB stúpa, hlavne pri dojniciach krátko pred zasušením. PSB súvisí aj s plemenom a v podstate kopíruje úžitkovosĢ. So zvyšovaním úžitkovosti PSB stúpa. PSB zvyšuje nadmerne mechanické zaĢaženie, ale hlavne poruchy zdravotného stavu mlieþnej žĐazy. Škodlivé vplyvy pôsobiace na dojnicu alebo priamo na tkanivo mlieþnej žĐazy vyvolávajú obrannú reakciu organizmu. Špeciálne obranné bunky (hlavne leukocyty) vystupujú z cievneho rieþišĢa do tkaniva mlieþnej žĐazy a z neho do mlieka. Negatívne faktory môžeme rozdeliĢ do dvoch skupín : ¾ podráždenie mlieþnej žĐazy, ¾ infekcie a zápaly mlieþnej žĐazy, spôsobené mikroorganizmami. Neinfekþné príþiny Existuje veĐa faktorov, ktoré môžu zvýšiĢ PSB bez infekcie. Tieto faktory pôsobia z prostredia, ale aj v samotnej dojnici. Faktory individuálne : ¾ vrodené dispozície – plemeno – chovateĐský ukazovateĐ zdravotného stavu mlieþnej žĐazy má len stredný alebo nízky stupeĖ dediþnosti, ale genetická základĖa je široká a dá sa selekciou dosiahnuĢ pozitívny výsledok, ¾ štádium laktácie – v prvých a posledných týždĖoch laktácie, ako aj v posledných týždĖoch brezivosti je zvýšená náchylnosĢ k poruchám zdravotného stavu, ¾ tvar vemena – nízko zavesené vemeno zvyšuje nebezpeþenstvo poranenia a infekcie, ¾ úroveĖ metabolizmu - ovplyvĖuje stav imunity, metabolické záĢaže zvyšujú PSB. Faktory vonkajšieho prostredia: ¾ roþné obdobie – v letných mesiacoch PSB stúpa (tepelný stres, pastva), ¾ chyby pri dojení – nedostatoþná hygiena mlieþnej žĐazy, dlhé dojenie, ¾ chyby v technike dojenia – vysoký podtlak, zlé ukonþenie dojenia, opotrebované ceckové gumy, ¾ nedostatoþná hygiena – maštaĐ, vemeno, dojacie zariadenie, ¾ chyby v ustajnení – rošty, klzký povrch, ¾ chyby v kĚmení – nedostatok energie, vlákniny, ketózy. Infekþné príþiny Medzi najþastejších pôvodcov mastitíd patria streptokoky, stafylokoky, koliformné kmene, baktérie spôsobujúce hnisanie a hnilobné baktérie. V poslednom období dochádza najþastejšie k infekciám, ktoré sú spôsobené poslednými tromi typmi mikroorganizmov. Hlavne pri streptokokoch a stafylokokoch sa vyskytujú kmene, ktoré sú typickým pôvodcom mastitíd. Sú veĐmi dobre prispôsobené vnútornému prostrediu mlieþnej žĐazy a prenášajú sa väþšinou z jedného vemena na druhé (rukami dojiþov, ceckovými nástrþkami, utierkami). Ćalšími a v poslednom období veĐmi rozšírenými pôvodcami sú mikroorganizmy z vonkajšieho prostredia (enviromentálne). Pochádzajú z okolia dojnice a prenášajú sa kontaktom (hnoj, podstielka, muchy a pod.).

x

x

Enviromentálne mastitídy: v poslednom období obrovský nárast – sú zaznamenávané zmeny v zastúpení patogénov - zdroje vonkajšieho prostredia - extrémne rýchlo sa množia - enviromentálne streptokoky (Enterococcus, Str. uberis, coli baktérie) najþastejšia nákaza - v dobe zasušenia, - v období pôrodu.

40

Nie je však možné viesĢ boj proti nepriateĐovi, ktorého nepoznáme. Je teda potrebné zameraĢ sa na : Kontrolu mlieþnej žĐazy - pod kontrolou sa rozumie pozorovanie vemena, posúdenie mlieka a urobenie NK-testu. Laboratórne vyšetrenie mlieka – detekcia pôvodcov mastitíd Presné stanovenie pôvodcov ochorení mlieþnej žĐazy je možné len mikrobiologickým vyšetrením mlieka v laboratóriu. Informácie o tom, ktorý mikroorganizmus je v stáde prítomný, možno získaĢ v zásade tromi spôsobmi, ktoré majú svoje výhody aj nevýhody a aj typické oblasti využitia.

1. Bakteriologické vyšetrenie jednotlivých dojníc v stáde Výhody : - detailný prehĐad o infekciách jednotlivých dojníc, - možnosĢ detekcie širokého spektra patogénov v mlieþnej žĐaze, - možnosĢ stanovenia citlivosti k antibiotikám. Nevýhody : – veĐmi nákladné a prácne, veĐmi drahé. Použitie : – cielené ozdravenie dojníc v stáde aj v priebehu laktácie 2. Vyšetrenie bazénovej vzorky mlieka na prítomnosĢ patogénov Výhody : – veĐmi lacné vyšetrenie, minimálne náklady pre prvovýrobcu. Nevýhody : – praktická možnosĢ detekcie len niekoĐkých patogénov (veĐké rozptýlenie patogénov vo veĐkom množstve mlieka), ale dáva prehĐad o celkovej situácii v stáde. Použitie : – plošný screening, kontrola postupov pri mastitídnych programoch, - periodická kontrola. 3. Vyšetrenie filtra na prítomnosĢ patogénov Výhody : – lacné vyšetrenie, záchyt patogénov je vyšší nakoĐko všetko mlieko preteká filtrom Nevýhody : – zložitejšia metóda pre stanovenie patogénov v laboratóriu - ochrana pred sekundárnou kontamináciou filtra poþas dopravy do laboratória Použitie : – zistenie zastúpení hlavných patogénov v stáde, - periodická kontrola, - kontrola úþinnosti mastitídneho programu. Získavanie výsledkov bazénových vzoriek mlieka a vyšetrenie filtra je pre rýchlu a prvú informáciu veĐmi dôležité pre chovateĐa. Interpretácia výsledkov bazénových vzoriek na prítomnosĢ patogénov nie je založená len na kvalitatívnom hodnotení. Snažili sme sa metodiku založiĢ aj na kvantitatívnom hodnotení výskytov patogénov. Prínos tohto prístupu spoþíva v možnosti odhadu prevalencie (% poþtu dojníc, pri ktorých je patogén rozšírený) daného mikroorganizmu v maštali, na základe výsledkov z bazénových vzoriek. Tak ako bazénový PSB s urþitými výhradami odráža celkový zdravotný stav mlieþnych žliaz dojníc, poþty patogénov umožĖujú relatívne presný odhad prevalencie. Na základe rozsiahlych súborov výsledkov individuálnych aj bazénových vzoriek, sme sa snažili urþiĢ prevalencie jednotlivých patogénov. Výsledky je možné uviesĢ aj formou tabuĐky. Pre jednotlivé patogény sú v nej uvedené, proti hodnotám koncentrácie patogénov v bazéne (KTJ/ml), najpravdepodobnejšie prevalencie v stáde. TabuĐka obsahuje maximálne a minimálne hranice prevalencie, ktoré je možné pre dané hodnoty oþakávaĢ. Keć máme napríklad výsledok pre Staphylococcus aureus v bazéne 200 KTJ/ml (hodnota x v tabuĐke), najpravdepodobnejšia je cca 20 % prevalencia St. aureus v stáde.

41

TabuĐka I Odhad prevalencie patogénov v stáde na základe ich poþtu v bazénovej vzorke. Hodnota x Staphylococcus aureus Streptococcus agulactiae odhad odhad 0 0 0 10 2,0 1,0 50 7,0 4,5 100 12,5 7,0 200 20,5 13,5 300 26,5 17,5 500 36,0 24,5 700 43,5 30,0 1000 52,0 36,5 1500 63,0 44,5

Aké nové poznatky odporuþiĢ pre výrobcov mlieka. VeĐmi dôležitá je prevencia vzniku ochorenia. V chovoch sa lieþba infikovaných dojníc presúva do kategórie dojníc, ktoré sú podozrivé z infekcie (nerentabilná je lieþba „milionárok“), to sú dojnice, kde vidíme 50 % zvýšenie PSB oproti poslednému odberu. Dôležité je vykonávaĢ kontrolu PSB v 4. deĖ po pôrode – tzn. vychytávaĢ dojnice „otelené s infekciou“. Pozitívne pre chovateĐa je sledovanie ukazovateĐa PSB pri kontrole úžitkovosti – pre odhad plemennej hodnoty býkov pre PSB. Genetická korelácia PSB a výskytu mastitíd je 0,65. Preto zahrnutie údajov o výskyte mastitíd do šĐachtiteĐského cieĐa môže prispieĢ k zlepšeniu zdravia dojníc. Záverom treba povedaĢ, že uvedené výsledky sú súþasĢou rezortnej výskumnej úlohy MP SR a bude tvoriĢ súþasĢ komplexného ozdravovacieho programu proti mastitídam.

Kontaktná adresa: Ing. Vladimír Foltys, PhD., Slovenské centrum poĐnohospodárskeho výskumu, Hlohovská 2, SK-949 92 Nitra, [email protected]

42

SKÚSENOSTI S APLIKÁCIOU POŽIADAVIEK NK (ES) þ. 1664/2006 NA HODNOTENIE MIKROBIOLOGICKEJ KVALITY SUROVÉHO OVýIEHO MLIEKA POUŽITÍM ALTERNATÍVNEJ SKÚŠOBNEJ METÓDY Tomáška Martin, Hofericová Margita, Kološta Miroslav Výskumný ústav mliekárenský, a.s.; SL EXAMINALA Experiences with application of requirements of CR (EC) 1664/2006 for assessment of microbiological quality of raw sheep milk by using routine testing method Summary: Sheep milk is mainly utilized for production of cheese specialties in Slovakia. Laser flow cytometry (Bactoscan FC 50 H, Foss Electric, Denmark) is used for determination of bacteriological quality of the milk in laboratory EXAMINALA. As the results are used for the purpose of milk quality assessment (Regulation (EC) 853/2004), the method has to fulfill criteria required by CR (EC) 1664/2006. Establishment of the suitable conversion of the primary measured results into the scale of the anchor method (EN ISO 4833) – CFU/ml and its permanent verification is the most crucial for the laboratory, as a validation procedure of the routine method has already been performed by producer of the equipment. The representative conversion equation (model of linear regression of log transformed data) was firstly created in 2004 according recommendation of ISO 21187. Since 2005 validity of the regression has been regularly verified, using statistical tools described in ISO 8196-2. During last two years the equation was twice slightly amended, as differences between directly measured results by the anchor method and converted results from the routine method were statistically significant. However the changes were almost imperceptible. Despite of the applied testing method, the quality of raw sheep milk rises up. Presented study can be also employed on other routine microbiological methods and matrixes. The plan is to perform similar work on a new biosensor (EU project PATHOMILK) which should be able to detect (and hopefully also quantify) of S. aureus in milk.

Úvod Na Slovensku vzrastá popularita ovþiarstva vo viacerých smeroch. Chov oviec prináša úžitok po stránke produkcie mlieka, mäsa, kožušín a koží, ale aj ako krajinotvorný prvok (starostlivosĢ o pasienky, salašníctvo) a ako súþasĢ rozvíjajúceho sa ekoturizmu. Samozrejme, mliekárov zaujímajú ovce predovšetkým pre potenciál produkcie mlieka, ktoré má výrazne odlišné vlastnosti, ako mlieko kravské. Tieto rozdiely sú všeobecne známe. Ovþie mlieko sa spracováva predovšetkým na syry a rôzne syrárske špeciality, v menšej miere na tekutý program – typický kyslomlieþny nápoj žinþicu a jeho rôzne odvodeniny. Najznámejším ovþím syrom je tradiþná salašnícka hrudka a z nej vyrábaná bryndza. Spôsob spracovania ovþieho mlieka sa znaþne vyvíja, diverzifikuje a mení. Okrem malovýroby (systém salaš – bryndziareĖ), ktorá pretrváva aj naćalej, rastie výroba mlieþnych špecialít aj v tzv. priemyselných mliekárĖách. Aplikované technológie sú rôzne a samozrejme podmienené dostupným technologickým vybavením. A tak sa na Slovensku môžete stretnúĢ s bryndzou, ktorá bola napríklad vyrobená s pasterizovaného i nepasterizovaného ovþieho mlieka. Ćalšou zmenou v spracovaní je práve kladenie dôrazu na bezpeþnosĢ ovþích výrobkov. Všetky prevádzky, bez ohĐadu na kapacitu, vyrábaný sortiment, musia plniĢ základné požiadavky tzv. „hygienického balíþka“. Jeho súþasĢou sú aj kritéria na mikrobiologickú kvalitu mlieka a spôsob jej hodnotenia. Najbežnejším, ale aj najorientaþnejším znakom, ktorý vyjadruje celkovú mikrobiologickú kvalitu mlieka je celkový poþet mikroorganizmov. Urþenou metódou na jeho meranie je kultivaþná metóda pri 30°C podĐa EN ISO 48331, ktorou je možné meraĢ KTJ v jednom mililitri mlieka. V týchto jednotkách sú stanovené aj limity pre prijateĐnosĢ surového mlieka a to v nariadení (ES) þ. 853/20042. Pre surové ovþie mlieko, ktoré bude predmetom tepelného ošetrenia je hraniþná hodnota (stanovená ako kĎzavý geometrický priemer hodnôt za obdobie dvoch mesiacov pri najmenej dvoch vzorkách za mesiac) 1 500 000 KTJ/ml a pokiaĐ nebude tepelne ošetrené je to 500 000 KTJ/ml. Urþená metóda je pomerne obtiažne aplikovaná v laboratóriách, ktoré vykonávajú skúšanie surového mlieka pre úþely hodnotenia jeho kvality – pre svoju prácnosĢ a dĎžku získania výsledku 43

(až 72 h). OveĐa þastejšie sa používajú rôzne rutinné metódy – v tejto oblasti predovšetkým laserová prietoková cytometria. Jej princíp možno zjednodušene popísaĢ, ako selektívne poþítanie zafarbených mikrobiálnych buniek. Výhodou metódy je hlavne rýchlosĢ merania a možnosĢ automatizácie výkonu skúšky. Predsa však, je to metóda založená na úplne inom princípe, ako urþená metóda a preto je zrejmé, že namerané výsledky môžu byĢ rozdielne a je potrebné interpretovaĢ ich za podmienok použitej metódy3. Ako každú rutinnú metódu, aj laserovú prietokovú cytometriu je potrebné prvotne validovaĢ, napríklad pomocou normy EN ISO 161404. Pre rutinné laboratória je výhodou, že dostupné meracie zariadenia, na ktorých sa daná metóda vykonáva, sú už validované výrobcom. Úlohou laboratória je preto iba preukázaĢ, že je schopné dosiahnuĢ požadované validaþné kritéria, ako napr. parametre reprodukovateĐnosti, chyby z prenosu a pod. Samozrejme danú metódu musí zaviesĢ a vykonávaĢ presne podĐa odporúþaní výrobcu, bez akýchkoĐvek modifikácií. Pomocou laserovej prietokovej cytometrie sa však primárne merajú výsledky v iných jednotkách, ako v KTJ – v impulzoch (presný názov závisí od výrobcu zariadenia). Na to, aby takéto výsledky boli použiteĐné, to znamená aby ich bolo možné porovnaĢ s kritériami uvedenými v legislatíve, je potrebné namerané výsledky transformovaĢ do stupnice v KTJ. Postup na vytvorenie príslušného prepoþítavacieho vzĢahu je uvedený v ISO 211875. Základným princípom je, že prepoþítavací vzĢah má plne reprezentovaĢ podmienky, kde sa bude používaĢ a že jeho platnosĢ sa musí pravidelne verifikovaĢ. Vhodnou metódou na verifikáciu je aplikácia štatistických nástrojov uvedených v norme ISO 8196-26. Z uvedeného je zrejmé, že sa neodporúþa vytvoriĢ jeden všeobecný prepoþítavací vzĢah, ale naopak, každé laboratórium, resp. skupina laboratórií by si mala vytvoriĢ vlastný prepoþet a tento aj verifikovaĢ na meniace sa miestne podmienky (druh mlieka, plemeno, výživa, sezónnosĢ, spôsob dojenia a pod.). Všetky vyššie uvedené požiadavky poþnúc validáciou rutinnej metódy až po verifikáciu vytvoreného prepoþtu boli donedávna iba v rovine urþitej dobrovoĐnosti – boli popísané iba v daných normách. Až prijatím NK (ES) þ. 1664/20067 sa tieto postupy stali záväznými v tom prípade, pokiaĐ sa výsledky danej alternatívnej skúšobnej metódy využívajú pri kontrole dodržania kritérií stanovených v þasti III kapitoly I oddielu IX prílohy III k nariadeniu (ES) þ. 853/20042. V príspevku sú popísané skúsenosti akreditovaného skúšobného laboratória EXAMINALA s aplikáciou týchto požiadaviek, pri meraní mikrobiologickej kvality surového ovþieho mlieka metódou laserovej prietokovej cytometrie. Materiál a metódy Na meranie boli použité bazénové vzorky surového ovþieho mlieka, odoberané vyškolenými pracovníkmi mliekárni, ktoré takéto mlieko spracovávajú. Vzorky boli odoberané ruþne a ihneć po odbere konzervované Acidiolom (Merck, SRN)8 a uchovávané pri teplote 1°C až 10 °C až do vykonania skúšok. Skúšky boli vykonané do 48 hodín po odbere v SL EXAMINALA. Mikrobiologická kvalita bola meraná urþenou metódou podĐa EN ISO 48331 a rutinnou metódou na zariadení Bactoscan FC 50H (FOSS Electric, Dánsko) podĐa odporúþaní výrobcu zriadenia a STN 57 05399. Výsledky merania z rutinnej metódy boli primárne vyjadrené v „individuálnych bakteriálnych bunkách“ IBC. Kontrola kvality merania bola preverovaná štandardnými nástrojmi, ktoré sa uplatĖujú pri plnení akreditaþných kritérií skúšobných laboratórií. Iba tie výsledky meraní, ktoré plnili kritéria kvality, boli brané do úvahy. Prepoþítavací vzĢah na jednotky urþenej metódy bol vypoþítaný metódou lineárnej regresie z logaritmicky transformovaných dát. Výsledky a diskusia V SL EXAMINALA sa zariadenie Bactoscan používa na meranie mikrobiologickej kvality od obdobia rokov 2002 až 200310. Najprv v surovom kravskom mlieku, ktoré pochopiteĐne dominuje. Predsa však, zákazníci laboratória uvítali rýchlosĢ získavania výsledkov a spoĐahlivosĢ metódy a dožadovali sa výkonu danej skúšky aj pre iné matrice na tomto zariadení. Kým surové kozie mlieko sa v SL skúša iba ojedinele, poþet vzoriek surového ovþieho mlieka mierne vzrastá. 44

Z toho dôvodu sa SL rozhodlo zaviesĢ metódu laserovej prietokovej cytometrie aj na túto matricu. Ako už bolo spomenuté v úvode, surové ovþie mlieko sa od kravského odlišuje. Z pohĐadu aplikovanej skúšobnej metódy môžu byĢ významné predovšetkým tieto rozdiely: 1. Prirodzene vyšší poþet mikroorganizmov a možne aj odlišné druhové zastúpenie. 2. Prirodzene vyšší poþet somatických buniek. 3. Odlišné chemické zloženie, ktoré sa výraznejšie mení v priebehu sezóny a s tým súvisiace fyzikálne vlastnosti – napr. viskozita mlieka. Okrem rozdielov v zložení sú vzorky surového ovþieho mlieka odoberané takmer výluþne ruþne (odber autosamplermi nie je možné aplikovaĢ) a mlieko je dostupné iba obmedzene – zväþša od apríla do októbra, s výnimkou synchronizovaných chovov. VýznamnosĢ uvedených rozdielov na validaþné charakteristiky bola posúdená a rovnako bol vytvorený aj prepoþítavací vzĢah11. Ten bol získaný paralelným meraním (oboma metódami) bazénových vzoriek, ktoré boli v roku 2004 odoberané od apríla do októbra. 913 párov výsledkov vyhovelo kritériám kvality. Po ponížení súboru o 1% najvyšších a 1% najnižších výsledkov z oboch metód (aby sa eliminovali extrémne hodnoty12) bol vytvorený koneþný súbor vzoriek n = 877. Kvôli spomínanej obmedzenej dostupnosti vzoriek surového ovþieho mlieka bol tento menší, ako pri surovom kravskom mlieku, predsa však reprezentoval podmienky jeho budúceho použitia. Následne vypoþítaný prepoþet vo forme lineárnej regresie mal tvar: log10 KTJ/ml = 1,088 log10 IBC/ȝl + 2,292; so smerodajnou odchýlkou z regresie sy,x = 0,305 log10 KTJ/ml. Z pohĐadu skúšobníctva má pri každej kvantitatívnej metóde zmysel odhadnúĢ neistotu merania s ktorou laboratórium meria. Je to diskutabilná záležitosĢ, ako z pohĐadu samotného kvalifikovaného odhadu, niekedy aj vlastného využitia zákazníkmi laboratória (Ako narábaĢ s neistotou, pri geometrických priemeroch?). Pri klasických kultivaþných mikrobiologických metódach sa väþšinou neistota odhaduje z opakovateĐnosti merania, plus niektoré laboratória berú do úvahy aj príspevok „vychýlenia“ laboratória od „správnej“ hodnoty – napr. z analýzy medzilaboratórnych skúšok spôsobilosti. Pri laserovej prietokovej cytometrií by bol odhad neistoty merania poþítaný iba z opakovateĐnosti pravdepodobne nesprávny – jedná sa o automatizovanú metódu, ktorej ćalšou prednosĢou je veĐmi dobrá reprodukovateĐnosĢ merania – þiže takto poþítaná neistota merania by bola malá. Preto, ako neistota merania bol zvolený 1,96 násobok sy,x, þiže presnosĢ metódy6. Primárne je teda aj neistota vyjadrená v logaritmickej stupnici, þo však nebráni tento spôsob vyjadrenia transformovaĢ pri konkrétnom výsledku na hodnotu v KTJ/ml, resp. vyjadriĢ ju percentuálne. Pri diskusiách o tomto prístupe poþítania neistoty boli vznesené námietky, že takto odhadnutá neistota je príliš „veĐká“. Je potrebné si však uvedomiĢ, že laserová prietoková cytometria je metóda na úplne inom princípe ako kultivaþná metóda a že takto odhadnutá neistota „nadväzuje“ na urþenú metódu, na ktorú bola „kalibrovaná“. Predsa však odhad neistoty môže byĢ vykonaný aj iným spôsobom a prezentovaný postup nemusí byĢ jediný správny, þi komplexný. Tak þi tak, takto odhadnutá neistota, bola základným údajom, na základe ktorého bola vykonaná prvotná verifikácia prepoþtu v roku 2005. PodĐa odporúþaní ISO 211875 verifikácia spoþíva v porovnaní novo získaných výsledkov, ktoré boli namerané ako urþenou metódou, tak aj rutinnou metódou a prepoþítané podĐa aktuálneho prepoþítavacieho vzĢahu. V roku 2005 bolo preto poþas sezónnej dostupnosti surového ovþieho mlieka zmeraných paralelne 86 vzoriek. PlatnosĢ prepoþtu sa „potvrdzovala“ tak, že sa absolútne rozdiely logaritmicky transformovaných priamo nameraných1 a prepoþítaných výsledkov (z rutinnej metódy na KTJ/ml) porovnali s limitnou hodnotou 1,96 x sy,x = 0,598 log KTJ/ml. PokiaĐ by boli rozdiely poþetne väþšie, znamenalo by to, že prepoþet nie je platný a je potrebné ho modifikovaĢ. PodĐa nameraných údajov, ani jeden rozdiel výsledkov z 86 vzoriek nebol väþší, ako zvolená limitná hodnota13. Samozrejme tento prístup bol iba orientaþný. Komplexnejšiu analýza bola vykonaná v roku 2006 podĐa požiadaviek ISO 8196-26. Uvedená norma sa týka vo všeobecnosti všetkých nepriamych skúšobných metód na mlieko, predovšetkým však fyzikálno-chemických (meranie množstva tuku je zvolené ako príklad). V prípade verifikácie prepoþtu, boli ako hodnoty „y“ zvolené logaritmicky transformované priamo namerané výsledky urþenou metódou1 a ako hodnoty „x“ logaritmicky transformované výsledky namerané rutinnou metódou, ktoré boli 45

prepoþítané aktuálnym prepoþtom na KTJ/ml. Získané priemerné rozdiely a smerodajná odchýlka rozdielov sú uvedené v tabuĐke I. Testovala sa štatistická významnosĢ: ýi sa hodnota smernice líši od hodnoty „1“. ýi sa hodnota posunutia líši od hodnoty „0“. ýi sa hodnota vychýlenia d = y - x líši od hodnoty „0“. ýi je nastavenie strednej hodnoty správne. TabuĐka I Sumarizácia rozdielov výsledkov merania mikrobiologickej kvality surového ovþieho mlieka metódou podĐa EN ISO 4833 (y) a na zariadení Bactoscan FC H, po ich prepoþte na KTJ/ml (x) (po logaritmickej transformácii). d=y–x sd Rok n (log10 KTJ/ml) 2005-2006 153 -0,022 0,116 2007 100 -0,025 0,089

Pri analýze dát bolo zistené nasledovné: Dáta z roku 2005 (n = 86) ani jeden ukazovateĐ nebol štatisticky významný, prepoþítavací vzĢah zostal v platnosti v roku 2006. Dáta z roku 2006 (n = 67) ani jeden ukazovateĐ nebol štatisticky významný. Keć sa však analyzovali dáta z 2005 a 2006 spolu, štatisticky významným bolo vychýlenie a bolo potrebné zamietnuĢ hypotézu správnosti nastavenia strednej hodnoty. Preto bol prepoþítavací vzĢah pre rok 2007 aktualizovaný. Dáta z roku 2007 (n = 100) boli analyzované s obdobným výsledkom, ako dáta z rokov 2005 a 2006, preto bol prepoþítavací vzĢah pre rok 2008 aktualizovaný. Spôsob vytvorenia aktualizovaného prepoþítavacieho vzĢahu môže byĢ rôzny5. Nové dáta sa môžu pridaĢ k pôvodnému súboru, ktorý sa poníži o rovnaký poþet najskorších výsledkov. Druhou možnosĢou je iba doplnenie nových dát. Výber závisí od viacerých faktorov, najmä však od toho, þi pôvodné dáta možno stále považovaĢ za reprezentatívne. NakoĐko pôvodný dátový súbor bol menej poþetný, podobne ako aj jednotlivé novozískané súbory a podmienky získavania surového ovþieho mlieka sa výrazne na Slovensku nemenili, bol zvolený spôsob pridávania dát. Aktualizácia prepoþtu je zdokumentovaná v tabuĐke II. Z tabuĐky III, kde sú modelové primárne dáta prepoþítané podĐa meniacich sa prepoþítavacích vzĢahov, vidno, že výsledné dáta sa výrazne nemenia. Z praktického hĐadiska možno teda hovoriĢ o urþitej „stabilite“ vytvoreného prepoþítavacieho vzĢahu. TabuĐka II Aktualizácia prepoþtu výsledkov merania mikrobiologickej kvality surového ovþieho mlieka metódou laserovej prietokovej cytometrie, na zariadení Bactoscan FC 50H, na jednotky KTJ/ml, v SL EXAMINALA. sy,x Rok n Prepoþítavací vzĢah Rx,y (log10 KTJ/ml) 2005-2006 877 log10 KTJ/ml = 1,09 log10 IBC/ȝl + 2,29 0,31 0,87 2007 1024 log10 KTJ/ml = 1,08 log10 IBC/ȝl + 2,31 0,28 0,88 2008 1120 log10 KTJ/ml = 1,08 log10 IBC/ȝl + 2,33 0,27 0,88

46

TabuĐka III Prepoþet vybraných výsledkov merania mikrobiologickej kvality surového ovþieho mlieka na zariadení Bactoscan FC 50H podĐa platných prepoþítavacích vzĢahov, uvedených v tabuĐke II 2005-2006 2007 2008 IBC/Pl 3 (10 KTJ/ml) 100 29 30 30 500 169 170 173 1000 360 361 364 5000 2072 2069 2060 10000 4406 4385 4345 16000 7347 7299 7208 Niekedy je nastolená otázka, ako sa zmenila mikrobiologická kvalita po zavedení laserovej prietokovej cytometrie do rutinného merania na Slovensku. Hoci sa táto otázka môže zdaĢ na prvý pohĐad absurdná (ako môže maĢ metóda, pokiaĐ je objektívna, vplyv na výsledok?), keć si uvedomíme odlišnosĢ princípov merania, ako aj to, že sa jedná o kvantitatívnu mikrobiológiu, má daná otázka urþité opodstatnenie. V tabuĐke IV sú prezentované sumárne výsledky vzoriek surového ovþieho mlieka merané na celkový poþet mikroorganizmov v rokoch 2004 – 2007 v SL EXAMINALA. Z tabuĐky je zrejmé, že mikrobiologická kvalita sa zlepšuje a že tento trend nezaznamenal žiadnu skokovú zmenu pri zmene používanej skúšobnej metódy. Kým v roku 2004 vyhovovalo kritériu 1 500 000 KTJ/ml (skúšané boli predovšetkým vzorky mlieka, ktoré sú predmetom tepelného ošetrenia) 76 % vzoriek, v roku 2006 až 91 % vzoriek, priþom nárast bolo pomerne plynulý (76% - 84% - 87% - 91%). Vidno tu skôr tlak požiadaviek potravinovej legislatívy, nákupcov a spracovateĐov, ako aj snahu prvovýrobcov kvalitu surového ovþieho mlieka na Slovensku zlepšovaĢ. TabuĐka IV Mikrobiologická kvalita surového ovþieho mlieka v SL EXAMINALA. Aritmetický % výsledkov % výsledkov Poþet Rok priemer 500 > 500 - 1500 vzoriek (103 KTJ/ml) (103 KTJ/ml) (103 KTJ/ml) 2004 909 57 19 1289 2005 1002 69 15 1201 2006 800 75 12 1329 2007 606 80 11 1377 *LPC – Laserová prietoková cytometria – Bactoscan FC 50H

Metóda EN ISO 4833 LPC* LPC LPC

Záver Viacroþné praktické skúsenosti SL EXAMINALA v oblasti skúšania surového ovþieho mlieka ukazujú, že: 1. Jeho mikrobiologickú kvalitu možno meraĢ spoĐahlivo modernou metódou laserovej prietokovej cytometrie na zariadení Bactoscan FC 50H. 2. Prepoþet výsledkov merania na jednotky KTJ/ml je žiadúce vykonaĢ pomocou osobitného prepoþítavacieho vzĢahu. 3. Prepoþítavací vzĢah je možné pravidelne verifikovaĢ a túto verifikáciu vyhodnocovaĢ podĐa ISO 8196-26. Kećže výsledky SL EXAMINALA využívajú jeho zákazníci na hodnotenie kvality podĐa požiadaviek nariadeniu (ES) þ. 853/20042, sú výsledky získané v súlade s požiadavkami NK (ES) þ. 1664/20067. Tento prístup SL EXAMINALA je ćalším príspevkom v budovaní dôvery v tradiþné slovenské syrárske špeciality, ktoré sa vyrábajú zo surového ovþieho mlieka so zlepšujúcou sa 47

mikrobiologickou kvalitou. Navyše Výskumný ústav mliekárenský, a.s., ako materská organizácia sa podieĐa na riešení medzinárodného projektu „PATHOMILK“, ktorého cieĐom je pripraviĢ multiparametrický biosenzor na detekciu vybraných patogénov v mlieku. Jedným z nich je aj S. aureus – mikroorganizmus, ktorý sa môže bežne vyskytovaĢ v surovom ovþom mlieku a ktorý môže prežívaĢ aj vo výrobkoch z nepasterizovaného mlieka, pokiaĐ nebol dodržaný optimálny technologický postup (zrenie hrudkového syra). PokiaĐ by vyvinutá metóda bola schopná aj kvantifikovaĢ poþet a nie len prítomnosĢ stafylokokov, potom by sa mohol odskúšaĢ podobný spôsob prepoþtu primárnych výsledkov merania a jeho verifikácia aj na tomto modeli. PodČkování: Príspevok bol finanþne podporený riešením projektu EÚ „PATHOMILK“ COLL-CT-2006-30392. Použitá literatura: 1. European Committee for Standardization, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the enumeration of microorganisms – Colony-count technique at 30 °C, EN ISO 4833, Brussels, Belgium, 2003. 2. Regulation (EC) No 853/2004 of the European Parliament and of the Council of 29 April 2004 laying down specific hygiene rules for on the hygiene of foodstuffs, Official Journal of the European Union L 139/55, 30.4.2004. 3. Suhren G., Reichmuth J., Interpretation of quantitative microbiological results, Milchwissenschaft 55 (2000) 18–22. 4. European Committee for Standardization, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Protocol for the validation of alternative methods, EN ISO 16140, Brussels, Belgium, 2003. 5. International Standard Organization, Milk – Quantitative determination of bacteriological quality – Guidance for establishing and verifying a conversion relationship between routine method results and anchor method results, ISO 21187, Geneva, Switzerland, 2004. 6. International Standard Organization, Milk – Definition and evaluation of the overall accuracy of indirect methods of milk analysis – Part 2: Calibration and quality control in the dairy laboratory, ISO 8196-2, Geneva, Switzerland, 2000. 7. Commission Regulation (EC) No 1664/2006 of 6 November 2006 amending Regulation (EC) No 2074/2005 as regards implementing measures for certain products of animal origin intended for human consumption and repealing certain implementing measures, Official Journal of the European Union L 320/13, 18.11.2006. 8. Rapp M., Münch S., Neuentwicklung von flüssigen Konservierungsmitteln für Milchproben, Dtsch. Molk. Zeit. 105 (1984) 1264–1272. 9. Slovak Institute for Standardization, Automatic determination of microorganisms in raw milk by direct enumeration of bacterial cells, STN 57 0539, Bratislava, Slovakia, 2003. 10. Tomáška M., Suhren G., Experiences with introduction of the Bactoscan FC in Slovakia, Bull. Int. Dairy Fed. 383 (2003) 58–60. 11. Tomáška M., Suhren G., Hanuš O., Walte H.-G., Slottová A., Hofericová M., The application of flow cytometry in determining the bacteriological quality of raw sheep’s milk in Slovakia, Lait 86 (2006) 127–140. 12. Suhren G., Reichmuth J., Walte H.-G., Bacteriological quality of raw milk: Conversion of Bactoscan-FC counts onto the scale of the official method, Milchwissenschaft 56 (2001) 380–384. 13. Tomáška M., Hofericová M., Slottová A., Praktické skúsenosti s meraním mikrobiologickej kvality surového ovþieho mlieka prietokovou cytometriou, v: Zborník prác medzinárodnej vedeckej konferencie BezpeþnosĢ a kontrola potravín (Angeloviþová, M. et al; ed.), 273 – 276, 5. – 6. apríl 2006, Nitra, Slovenská poĐnohospodárska univerzita, Nitra.

Kontaktní adresa: Výskumný ústav mliekárenský, a.s.; Dlhá 95, 010 01 Žilina, Slovensko; [email protected] 48

MOŽNOSTI ZDOKONALENÍ POSTUPU VYSOKODOHěÍVANÝCH SÝRģ S VYUŽITÍM BIOCHEMICKÝCH CHARAKTERISTIK POUŽÍVANÝCH ýMK. ýerný Vladimír, Havlíková Šárka, Kvasniþková Eva, Pufrová Eva, Švandrlík ZdenČk MILCOM a.s., Výzkumný ústav mlékárenský Praha, pracovištČ Tábor Application of biochemical characteristic pure lactic acid cultures for innovation high scalded cheese process. Summary: Behavior of single strains and mixed strains Lactobacillus ssp. and Streptococcus spp. was tested on the laboratory models during the cultivation in thermic (temperature) cycle, corresponding to emmental type cheese production. Knowledge received were generalized and summarized to the „Recommendation for production praxis“ for making high scalded emmental type cheese. On cut of ripe experimental cheeses during checking results of solution in praxis were pure eyes. Nut eyes were predominant on the cut of control cheeses.

Úvod : PĜírodní sýry, a zejména sýry dohĜívanou sýĜeninou, pĜedstavují v rámci mlékárenského prĤmyslu jednu z nejvýznamnČjších komodit. U zralých sýrĤ se pomČrnČ þasto vyskytují problémy spojené s výskytem senzorických vad které nejsou tak výrazné, že by bylo nutno vyĜadit sýry z konzumu, ale snižují konkurenceschopnost tČchto sýrĤ na spotĜebitelském trhu. Tyto vady je možno v mnoha pĜípadech spojovat s pĤsobením pĜítomné ušlechtilé i kontaminující mikroflóry a s dynamikou probíhajících procesĤ (napĜ. tvorba hoĜkých peptidĤ, špatná tvorba ok þi výskyt prasklin v sýrech typu ementál þi maasdamer). Výroba sýrového zrna a formování mladých sýrĤ jsou základní operace, ve kterých probíhá hlavní þást mléþného kysání. Bakterie mléþného kysání (LAB) pĜemČĖují laktózu na laktát. Rostoucí koncentrace kyseliny mléþné vznikající glykolytickými pochody zpĤsobuje pokles hodnoty pH mladého sýra a jsou tak vytváĜeny optimální podmínky pro rĤst žádoucích skupin mikroorganismĤ i pro další zrání sýrĤ. Podle složení použitých kultur se mĤže mČnit nejen množství vytvoĜené kyseliny mléþné, ale také pomČr mezi její D- a L- formou. PĜípadný zbytkový obsah galaktosy má být kmeny LAB nejpozdČji bČhem pobytu sýrĤ ve studeném sklepČ zcela fermentován. Jinak hrozí nebezpeþí, že bude využíván nejen pĜítomnými hofermentativními LAB, ale i napĜ. propionovou kulturou, heterofermentativními laktobacily (NSLAB) a další nežádoucí kontaminující mikroflórou. Problematice chování þistých mlékaĜských kultur v podmínkách výroby sýrového zrna a formování mladých sýrĤ v prĤbČhu prvních 24 hodin je proto potĜeba vČnovat stálou pozornost. Materiál a metody : PĜi studiu biochemických charakteristik mikroorganismĤ dĤležitých pĜi výrobČ vysokodohĜívaných sýrĤ bylo testováno jednotlivČ nebo ve smČsích 12 izolátĤ Latobacillus helveticus, 5 izolátĤ Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis a 10 isolátĤ Streptococcus salivarius subsp. thermophilus. Kultivace ve sterilovaném obnoveném mléce pĜi konstantní teplotČ, Kultivace ve sterilovaném obnoveném mléce v teplotním cyklu. Jejím základním rysem je dlouhodobé pĤsobení vyšších teplot kultivace modelujících teplotní kĜivku na výrobníku sýrového zrna a pomalé chladnutí sýrĤ bČhem jejich lisování. Výsledky a diskuse . PĜi formulování návrhu modelového testu kultivace v teplotním cyklu byly využity zkušenosti z pĜedcházejících výzkumných prací a byly navrženy 2 teplotní kĜivky. ObČ varianty mají stejnou první fázi pĜestavující periodu pĜedkysání mléka, sýĜení, krájení a míchání sýrového zrna na výrobníku až do zaþátku dohĜívání sýrového zrna. Rychlost dohĜívání sýrového zrna byla volena cca 2-3°C za 5 minut. Rozdíl mezi teplotními kĜivkami byl v použité teplotČ dosoušení sýrového zrna ( v prĤmČru 52,5°C pro variantu „A“ a 50,5°C pro variantu „B“) a navazujícím modelu 49

poklesu teploty kultivace, který modeluje chladnutí sýrového zrna bČhem vypouštČní na lisovací vanu a chladnutí sýrĤ bČhem jejich lisování.

temperature (°C)

55 "A"

50

"B" 45 40 35 30 0

5

10

15

20

25

time (hour)

Obr. þ. 1 : Teplotní kĜivky pro modelové kultivace Výhody využití tohoto modelu kultivace v teplotním cyklu proti kultivaci pĜi konstantní teplotČ lze dokumentovat porovnáním výsledkĤ kultivací tĜí isolátĤ Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (þ. 22, 24 a 27). Pro porovnávací testy bylo vždy mléko naoþkováno pĜíslušným isolátem a rozdČleno na dvČ þásti. Jedna þást mléka byla kultivována pĜi konstantní teplotČ 37°C (Obr.þ.2), druhá þást byla kultivována v teplotním cyklu „A“ (Obr.þ.3). 4000

7

S22 S24

6,5

3000 2500

S27 6 pH (-)

Impedance (uS)

3500

2000 ST Nr. 24 ST Nr. 22 ST Nr. 27

1500 1000 500

5,5 5 4,5

0

4

0

5

10

15

20

25

0

500

time (hours)

1000

1500

time (min)

Obr. 2 : kultivace 37 °C

Obr. 3 : kultivace tepl. cyklus „A“

PĜi standardní metodČ kultivace pĜi 37°C mají všechny 3 isoláty prakticky stejnou kysací kĜivku (mČĜenou jako zmČna impedance). PĜi použití navržené metody kultivace v teplotním cyklu jsou zĜetelné rozdíly v prĤbČhu kysacích kĜivek tČchto isolátĤ ( mČĜených jako zmČna pH). Pro potĜeby Ĝešení byly pĜi modelových kultivacích v teplotním cyklu využívány obČ navržené teplotní kĜivky (Obr. þ.1). ObČ varianty teplotních kĜivek mají stejnou první fázi až do zaþátku dosoušení sýrového zrna. V dalším prĤbČhu je rozdíl mezi teplotními kĜivkami 2 °C. "B" TE2217

7,0

"A" TE2217

6,5

pH (-)

6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 0

5

10 15 time (hours)

20

25

Obr. þ. 4 : Kultivace smČsi LAB v teplotním cyklu „A“ a „B“. 50

Rozdíl v teplotách použitých pĜi kultivaci v teplotním cyklu na prĤbČh kysací kĜivky smČsi isolátu Streptococcus salivarius subsp. thermophilus þ. 22 a Lactobacillus helveticus þ. 17. je zachycen na Obr. þ. 4.. Zvýšení teploty o 2°C zpĤsobilo, že se þas do dosažení hodnoty pH = 5,5 prodloužil o nČkolik hodin. Vybrané kombinace kmenĤ LAB pro kultivace v teplotním cyklu. Pro tyto testy byly použity 3 isoláty streptokokĤ (þ. 22, 24 a 27) a 3 isoláty laktobacilĤ ( þ.3, 9 a 17). Testování bylo provedeno v modelu matice 3x3 a pro kultivace tČchto kombinací laktobacilĤ a streptokokĤ byly použity oba modely teplotního cyklu znaþené jako „A“ nebo „B“. Testy prokázaly, že se v závislosti na podmínkách kultivace i v závislosti na použité kombinaci kmenĤ streptokokĤ a laktobacilĤ se mČní pH na konci kultivace, produkce kys. mléþné, pomČr mezi poþty laktobacilĤ a streptokokĤ. Jako pĜíklad jsou v následující tabulce uvedeny rozdíly v koneþných hodnotách pH pĜi kultivaci v teplotním cyklu a pĜi kultivaci pĜi 37°C. PĜi kultivaci v termickém cyklu „A“ byla prĤmČrná hodnota pH 3,70, pĜi kultivaci v teplotním cyklu „B“ byla prĤmČrná hodnota pH o 0,09 vyšší a pĜi kultivaci pĜi 37°C byla kyselost v prĤmČru vyšší o 0,31 jednotky pH. Tab. þ. 1 : Rozdíly v dosažených hodnotách pH Str. + Lb. prĤmČr Str.þ.24+Lb. Str.þ.27+Lb. Str.þ.22+Lb.

kultivace "A" kult. 37°C 3,70 4,01 3,72 3,94 3,69 4,02 3,71 4,08

rozdíl pH 0,31 0,22 0,33 0,37

kultivace "B" 3,79 3,81 3,82 3,75

kult. 37°C 4,04 4,03 4,09 3,99

rozdíl pH 0,24 0,22 0,27 0,24

DĤležité jsou výsledky získané pĜi porovnání prĤbČhu kysacích kĜivek testovaných kombinací kmenĤ laktobacilĤ a streptokokĤ. Dále uvedený Obr.þ.5 shrnuje výsledky pČti modelových kultivací mléka zaoþkovaného vždy kombinací 1 kmene laktobacilĤ a jednoho kmene streptokokĤ pĜi kultivaci v teplotním cyklu za použití teplotní kĜivky „A“ nebo „B. A T E2717

7

A T E2409 B T E2717

6,5

B T E2409 B T E2403

pH (-)

6 5,5 5 4,5 4 3,5 3 0

5

10

15

20

25

time (hour)

Obr. þ. 5 : Kultivace kombinace kmenĤ Str. a Lb. v teplotním cyklu „A“ a „B“. Výsledky ukazují, že vhodnou volbou kombinace kmenĤ Lacobacillus sp. a Streptococcus sp. spolu s volbou teplotní kĜivky použité pĜi kultivaci je možno výraznČ ovlivnit prĤbČh kysací kĜivky. Požadovaného prĤbČhu kysací kĜivky lze dosáhnout buć použitím stejné teplotní kĜivky kultivace a vhodnČ zvolenou kombinací kultur nebo použitím stejné kombinace kultur a úpravou teplotní kĜivky kultivace. OvČĜení výsledkĤ v praxi : Výsledky laboratorních modelových kultivací na chování kmenĤ ýMK byly ovČĜeny na provozních výrobách kontrolních (n=3) a pokusných (n=3) sýrĤ ementálského typu. Pro tyto výroby bylo použito mléko z jednoho zásobního sila, byly použity stejné ýMK a byly zachovány stejné podmínky výroby až do fáze dohĜívání sýrového zrna. V další fázi technologického postupu 51

výroby byly na pokusných výrobách využity výše uvedené výsledky Ĝešení zamČĜených na chování a vlastnosti ýMK získané na laboratorních modelových pokusech a v souladu s nimi byl mírnČ modifikován postup dosoušení a formování mladých sýrĤ. Pokusné sýry mČly v prĤmČru o 1,42% vyšší sušinu, vyšší aktivní kyselost ve stĜedové þásti, stupeĖ proteolýzy byl mírnČ nižší jak do hloubky tak i šíĜky zrání a i množství vytvoĜené kyseliny propionové bylo nižší ( o 99 mg/100g sýra). Obsah kyseliny máselné byl u obou skupin sýrĤ prakticky stejný ( 40 mg/100g u kontrolních sýrĤ proti 37 mg/100g u pokusných sýrĤ). Podle výsledkĤ mikrobiologických rozborĤ pokusných a kontrolních sýrĤ ve stáĜí 91 nebyl shledán žádný výrazný rozdíl v zastoupení mesofilních a termofilních laktokokĤ, termofilních a fakultativnČ heterofermentativních laktobacilĤ, Propionobacterium ssp. ani halotolerantních mikroorganismĤ. U pokusných sýrĤ byl mírnČ vyšší poþet termoresistentních anaerobních mikroorganismĤ a Clostridium ssp. PĜi senzorickém hodnocení zralých pokusných a kontrolních sýrĤ nebyl shledán žádný výraznČjší rozdíl mezi sýry z obou skupin a sýry nevykazovaly žádné senzorické vady. Pokusné sýry mČly na skus mírnČ pevnČjší a pružnČjší konzistenci. Výrazný rozdíl byl zjištČn ve vzhledu zralých sýrĤ, pĜedevším v množství a kvalitČ vytvoĜených ok. Rozdíl v otevĜení sýrĤ je patrný z níže uvedených fotografií kontrolního (obr.7) a pokusného (obr.6) sýra.

Obr. 6 : pokusný sýr

Obr. 7 : kontrolní sýr

Shrnutí a závČr : Studium vlastností ýMK pĜi kultivaci v teplotním cyklu poskytuje, ve srovnání s kultivací pĜi konstantní teplotČ, podrobnČjší informace o jejich chování v podmínkách konkrétního technologického postupu výroby. UmožĖuje zvolit vhodnou kombinaci kultur nebo upravit teplotní kĜivku výroby sýrového zrna chladnutí sýrĤ bČhem lisování tak, aby bylo dosaženo požadovaného prĤbČhu prokysávání sýrĤ. Výsledky provozního ovČĜování signalizují, že lze oþekávat i na vliv výslednou jakost zralých sýrĤ. Hlavní zásady jsou shrnuty do „Souboru doporuþení pro výrobní praxi“, Jejich cílem je doplnit odborné informace a napomoci pĜi zdokonalování a modifikaci stávajících postupĤ výroby sýrĤ a zvyšování konkurenceschopnosti zralých sýrĤ na spotĜebitelském trhu. Na požádání bude obratem zaslán i elektronickou poštou. PodČkování: Práce byla vykonána s podporou grantu MZe NAZV QF4082. Kontakt : [email protected]

52

METODY PRO STANOVENÍ BUNċýNÉ LÝZE BAKTERIÍ MLÉýNÉHO KVAŠENÍ Abrlová Magdaléna, Hlavsová Barbora, Šviráková Eva Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT Praha Methods for determination of cell lysis of lactic acid bacteria Summary: Cell lysis is a phenomenon of large importance in semi-hard and hard cheese ripening. Cell lysis of lactic bacteria has a strong impact on cheese aroma production and fastens cheese ripening. For the purpose of this study, five Lactococcus lactis (NIZO R5, LCC 416, HMM 81, NIZO B643 and AM2) strains were chosen. Cell lysis was detected by different methods (e.g. in GM17 agar with Micrococcus lysodekticus commercial lysate, in citrate buffer and by estimation of released extracellular lactate-dehydrogenase). All used Lc. lactis (NIZO R5, LCC 416, HMM 81, NIZO B643 and AM2) strains were evaluated as lytic strains by used of all methods. The most lytic strain was assessed the Lc. lactis HMM 81 (30 % cell lysis) and the least lytic strain was assessed the Lc. lactis NIZO B643 (9 % cell lysis) during cultivation in the citrate buffer at 13°C after 12 days. Other used methods confirmed previous results. The influence of added nisin (0, 100, 250, 500, 1000, 5000 IU ml-1) to the citrate buffer on lactococci lysis was estimated. Significant increase in cell lysis in all five Lc. lactis strains was confirmed. The highest cell lysis was achieved in all tested lactococci in the citrate buffer with nisin concentrations 1000 and 5000 IU ml-1.

Úvod Výroba sýra mĤže být z hlediska technologie rozdČlena na dvČ etapy: na vlastní výrobu, která zahrnuje zpracování mléka na þerstvý sýr a jeho následné zrání ve zracím sklepČ, kde dochází k ĜadČ zmČn ve složení sýra a vzniká jeho typické aroma. Na zrání sýra je tĜeba nahlížet jako na komplexní biochemický proces, pĜi kterém se uplatĖuje celá Ĝada enzymĤ [1]. Jedním z dČjĤ, ke kterým dochází ve zrajícím sýru, je proteolýza. Probíhající proteolýza je ovlivnČna plasminem, zbytky syĜidla a enzymy zákysových a nezákysových bakterií mléþného kvašení. Pro zrání sýrĤ je dĤležitý vliv intracelulárních laktokokových proteinas a peptidas, jejichž množství v sýru je ovlivnČno bunČþnou lýzí. PĜi lýzi se intracelulární enzymy bakterií dostávají ven z bunČk a svým pĤsobením ovlivĖují kvalitu vyrobeného sýra [2]. K detekci bunČþné lýze je možno pĜistupovat rĤznými zpĤsoby. Mohou být pĜímo sledovány bakteriální buĖky, stanovovány intracelulární enzymy nebo dĤsledky bunČþné lýze v sýru. PĜi pozorování laktokokĤ lze využívat elektronového nebo fluorescenþního mikroskopu [3, 4], stanovovat poþty laktokokĤ na agarových plotnách nebo mČĜit absorbanci vodných suspenzí bakterií [5]. Stanovení bunČþné lýze pomocí celkových poþtĤ nebo absorbance mĤže být zatíženo chybou, protože lyzovaná bakteriální buĖka není totéž jako mrtvá buĖka. PĜi bunČþné lýzi mĤže dojít pouze k narušení bunČþné stČny, pĜi kterém z buĖky uniká cytoplazma, ale buĖka má zachovanou schopnost regenerace po pĜenesení do výživného média (napĜ. agaru). ýásteþnČ lyzované buĖky se proto pĜi stanovení lýze pomocí absorbance a celkových poþtĤ jeví jako nelyzující. Proto je procento bunČþné lýze vypoþítané z celkových poþtĤ nebo z absorbance podhodnocené [3, 4]. Pro pĜesnČjší stanovení bunČþné lýze se využívá mČĜení aktivit nČkterých intracelulárních enzymĤ. Podmínkou je, aby enzymy, jejichž aktivita je mČĜena, byly v médiu stabilní. NejþastČji jsou pro stanovení bunČþné lýze používány laktát-dehydrogenasa (LDH), glukosa-6-fosfát dehydrogenasa (G6PDH) a intracelulání peptidasy [3, 6, 7]. Vlivem uvolnČní intracelulárních enzymĤ do sýra dochází k intenzivnČjšímu zrání a ve vČtší míĜe vznikají tČkavé produkty. Tyto tČkavé produkty (napĜ. butanal, propanal) mohou sloužit ke stanovení dĤsledkĤ bunČþné lýze [8]. Pro stanovení bunČþné lýze mohou být použita rĤzná kultivaþní média. Nejjednodušším systémem je pufr nebo bujón, ve kterých lze stanovit bunČþnou lýzi pomocí mČĜení absorbance suspenze bunČk. Jejich nevýhodou je jiné chování než v sýru, které se u nČkterých kmenĤ projevuje a vyplývá z rozdílného složení. Dalším možným médiem pro kultivaci bakterií pĜi stanovení bunČþné lýze jsou modelové systémy sýra (napĜ. výluh sýra - cheese slurry). Lýzi bakterií lze pozorovat i pĜímo v sýru [9]. Ke stanovení lýze v sýru se používají mČĜení aktivit intracelulárních enzymĤ. V sýru je možné stanovit i tČkavé produkty, které tvoĜí aroma sýra [8]. 53

Cíl práce Cílem této práce bylo porovnání bunČþné lýze kmenĤ laktokokĤ za použití rĤzných detekþních metod. Materiál a metody Použité kmeny Pro sledování bunČþné lýze bylo použito 5 kmenĤ Lc. lactis: Lc. lactis subsp. cremoris AM2 (pĤvod: Moorepark Research Centre, Teagasc, Moorepark, Fermoy, Co Cork, Irsko), Lc. lactis subsp. lactis NIZO B643 (pĤvod: National Collection of Dairy Organisms, Reading, Velká Británie), Lc. lactis subsp. lactis HMM 81 (pĤvod: VŠCHT Praha, ýeská republika), Lc. lactis subsp. lactis NIZO R5 (pĤvod: Netherlands Institute for Dairy Research, Department of Biophysical Chemistry, Molecular Genetics Group, Ede, Nizozemí) a Lc. lactis subsp. lactis LCC 416 (pĤvod: Laktoflora® Milcom a.s., Praha, ýeská Republika). Stanovení lýze laktokokĤ na agaru GM17 s lyzátem Micrococus lysodeikticus DĤkazem bunČþné lýze, zpĤsobené laktokoky, bylo vytvoĜených lytických zón na agaru GM17 s pĜídavkem komerþního lyzátu M. lysodeikticus. (0,2 % obj.) (Sigma-Aldrich, SRN). Testované laktokoky byly oþkovány metodou roztČru (inokulum 0,1 ml) na povrch agaru GM17 a kultivovány pĜi teplotČ 30 °C po dobu 2 až 6 dnĤ [10]. Stanovení lýze laktokokĤ v citrátovém pufru s nisinem BunČþná lýze pĜedkultivovaných a promytých bunČk laktokokĤ byla mČĜena v citrátovém pufru s pĜídavkem rĤzných koncentrací nisinu (0, 100, 250, 500, 1000, 5000 IU.ml-1). Laktokoky byly nejprve pĜedkultivovány v bujónu LM17, a poté kultivovány v citrátovém pufru o pH 5 pĜi teplotČ 13 °C po dobu 12 dní. Pro stanovení bunČþné lýze byly mČĜeny absorbance suspenzí laktokokĤ (A650). BunČþné lýze byla vypoþítáno podle rovnice 1: bunČþná lýze = [(A0 – At)/A0] × 100 [%], kde A0 byla poþáteþní absorbance a At byla absorbance mČĜená v þase t [5]. Stanovení lýze laktokokĤ v citrátovém pufru detekované na mikrotitraþních destiþkách Rychlometoda pro stanovení bunČþné lýze u laktokokĤ, stanovovaná na mikrotitraþních destiþkách, které umožĖují automatické mČĜení v prĤbČhu kultivace, je podobná mČĜení lýze laktokokĤ v citrátovém pufru. Laktokoky byly pĜedkultivovány, promyty a pĜeneseny do citrátového pufru a kultivovány pĜi teplotČ 40 °C bČhem 6 h, kdy byla mČĜena absorbance bunČþných suspenzí laktokokĤ [11]. Stanovení lýze laktokokĤ detekované uvolnČním laktátdehydrogenasy (LDH) Pro stanovení lýze laktokokĤ, pomocí uvolnČné LDH, byly laktokoky kultivovány stejným zpĤsobem jako v pĜedchozích stanoveních, tedy po pĜedkultivaci byly promyty, a poté kultivovány v citrátovém pufru pĜi teplotČ 13 °C po dobu 12 dní. MČĜení aktivity LDH spoþívalo v oxidaci laktátu na pyruvát. Z rychlosti oxidace mČĜené spektrofotometricky se vypoþítala aktivita LDH v jednotkách. Jedna jednotka byla definována jako množství enzymu LDH potĜebné k oxidaci 1 ȝM NADH.min-1.ml-1 pufru [6, 7]. Výsledky Lýze laktokokĤ na agaru GM17 s lyzátem Micrococus lysodeikticus Jako dĤkaz bunČþné lýze, zpĤsobené laktokoky, byly kolem kolonií všech testovaných kmenĤ laktokokĤ pozorovány na agaru GM17 s komerþním lyzátem M. lysodeikticus vyjasnČné, lytické zóny, které mČĜily v prĤmČru od 2 do 6 mm.

54

Lýze laktokokĤ v citrátovém pufru Procento bunČþné lýze u testovaných laktokokĤ uvádí tabulka I. V pufru bez pĜídavku nisinu byl nejménČ lytický kmen Lc. lactis NIZO B643 (lyze 9 %) a nejvíce lytický kmen Lc. lactis HMM 81 (30 %). Bylo potvrzeno zvýšení bunČþné lýze vlivem pĜídavku nisinu, známé z literatury [12]. PĜídavek nisinu do citrátového pufru zvyšoval bunČþnou lýzi u všech pČti kmenĤ laktokokĤ. NejvČtší zvýšení lýze bylo pozorováno u nízkých koncentrací nisinu. PĜi vyšších koncentracích nisinu byly rozdíly v bunČþné lýzi nízké. PĜi koncentracích nisinu 1000 a 5000 IU.ml-1 byl rozdíl lýzí zanedbatelný (obr. 1). Nejvíce se bunČþná lýze zvýšila pĜídavkem nisinu u kmene Lc. lactis AM2 (lýze v citrátovém pufru bez nisinu byla 28 %, a pĜi pĜídavku nisinu o koncentraci 5000 IU.ml-1 byla 52 %). Tabulka I uvádí hodnoty bunČþné lýze dosažené po 12 dnech v citrátovém pufru a v citrátovém pufru s pĜídavkem nisinu 5000 IU.ml-1.

70,0%

60,0%

BunČþná lyze

50,0%

LCC416 R5 HMM81 R5II den10 AM2 B643

40,0%

30,0%

20,0%

10,0%

0,0% 0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

cnis (IU/ml)

Obr. 1. Závislost bunČþné lýze laktokokových kmenĤ na koncentraci pĜidaného nisinu (0, 100, 250, 500, 1000, 5000 IU.ml-1); kultivace laktokokĤ v citrátovém pufru (pH 5) pĜi teplotČ 13 °C za 12 dní.

Tabulka I BunČþná lýze laktokokĤ kultivovaných v citrátovém pufru a v citrátovém pufru s pĜídavkem nisinu (5000 IU.l-1) pĜi teplotČ 13 oC po 12 dnech Lyze v citrátovém pufru Kmen Lyze v citrátovém pufru s nisinem Lc. lactis [%] (5 000IU.ml-1) [%] NIZO R5

24

65

LCC 416

20

31

HMM 81

30

38

NIZO B 643

9

33

AM2

28

52

55

Lýze laktokokĤ v citrátovém pufru detekovaná na mikrotitraþních destiþkách Za podmínek této metody se kmeny Lc. lactis (NIZO R5 a AM2) jevily jako vysoce lytické kmeny. Ostatní testované kmeny Lc. lactis (NIZO B643, HMM 81 a LCC 416) se jevily jako nelytické kmeny. Lýze nČkterých laktokokĤ pĜi zvýšené teplotČ mĤže být zpĤsobena pĜítomností termoindukovatelného pro-fága, kterého je možno aktivovat již teplotou kolem 40 °C. U kmene Lc. lactis AM2 byla pĜítomnost termoindukovatelného profága publikována v literatuĜe [9]. Lýze laktokokĤ detekovaná uvolnČním laktátdehydrogenasy Ze stanovení lýze laktokokĤ, detekované mČĜením aktivity uvolnČné LDH vyplynulo, že k nejvyšší lýzi došlo u kmene Lc. latis HMM 81, což odpovídalo nejvyšší hodnotČ aktivity uvolnČné LDH (5,4 jednotky). Také ostatní testované kmeny laktokokĤ se jevily jako lytické kmeny. NejménČ lytický byl kmen Lc. lactis NIZO B643 (aktivita LDH 0,98 jednotky). ZávČr Pro detekci bunČþné lýze u testovaných laktokokových kmenĤ byly použity rĤzné detekþní metody. Všechny testované kmeny se chovaly jako lytické kmeny, což bylo potvrzeno tvorbou lytických zón na agaru GM17 s pĜídavkem komerþního lyzátu M. lysodeikticus. Ostatní metody (s výjimkou rychlometody na mikrotitraþních destiþkách) poskytovaly s drobnými rozdíly podobné výsledky: nejvíce lytický byl kmen Lc. lactis HMM 81 a nejménČ lytický byl kmen Lc. lactis NIZO B643. Odlišné výsledky (získané pĜi použití rychlometody a metody v citrátovém pufru) i nČkteré odchylky (zjištČné u ostatních metod) jsou dokladem toho, že získané výsledky závisí na použité metodČ. Je proto dĤležité využít i dalších možností pro stanovení bunČþné lýze u laktokokĤ, napĜ. stanovení dalších významných intracelulárních enzymĤ (napĜ. peptidas pepN & C, pep X). V sýraĜské praxi je možno získaných výsledkĤ - tj. poznatkĤ o schopnosti laktokokových kmenĤ intenzivnČ lyzovat - použít k urychlení zrání polotvrdých a tvrdých sýrĤ a ke zlepšení jejich kvality, pĜedevším aroma. PodČkování Tato práce byla podpoĜena Ministerstvem školství, mládeže a tČlovýchovy, ýeská republika (MSM 6046137305). Použitá literatura 1. Law B. A.: Flavour development in cheese. Advances in Microbiology and Biochemistry of Cheese and Fermented Milk, eds. L. Davies, B.A. Law. Elsevier Applied Science Publishers, London, pp. 187-208 (1984). 2. Sheenan A., O‘Cuin G., Fitzgerald R.J., Wilkinson M.G.: Proteolytic enzyme activities in Cheddar cheese juice made using lactococcal starters of differing autolytic properties. J. Appl. Microbiol. 100, 893-901 (2006). 3. Sheenan A., O’Loughlin C., O’Cuinn G., Fitzgerald R.F., Wilkinson M.W.: Cheddar cheese cooking temperature induces differential lactococcal cell permeabilization and autolytic responses as detected by flow cytometry: implications for intracellular enzyme accessibility. J. Appl. Microbiol. 99, 1007-1018 (2005). 4. Chapot-Chartier M.-P., Deniel C., Rousseau M., Vassal L., Gripon J.C.: Autolysis of two strains of Lactococcus lactis during cheese ripening. Int. Dairy J. 4, 251-269 (1994). 5. Boutrou R., Sepulchre A., Gripon J.C., Monnet V.: Simple tests for predicting the lytic behavior and proteolytic activity of lactococcal strains in cheese. J. Dairy Sci. 81, 2321-2328 (1998). 6. O’Donovan C.M., Wilkinson M.G., Guinee T.P., Fox P.F.: An investigation of the autolytic properties of three lactococcal strains during cheese ripening. Int. Dairy J. 6, 1149-1165 (1996). 7. Wilkinson M.G., Guinee T.P., Fox P.: Factors which may influence the determination of autolysis of starter bacteria during Cheddar cheese ripening. Int. Dairy J. 4, 141-160 (1994). 8. Hannon J.A., Kilcawley K.N., Wilkinson M.G., Delahunty C.M., Beresford T.P.: Flavour precursor development in Cheddar cheese due to lactococcal starters and the presence and lysis of Lactobacillus helveticus. Int. Dairy J. 17, 316-327 (2007).

56

9. O’Sullivan D., Ross P.R., Fitzgerald G.F., Coffey A.: Investigation of the relationship between lysogeny and lysis of Lactococcus lactis in cheese using prophage-targeted PCR. Appl. Env. Microbiol. 5, 21922198 (2000). 10. Garde S., Gaya P., Medina M., Nunez M.: Autolytic behaviour of Lactococcus lactis subsp. cremoris and Lc. lactis subsp. lactis wild isolates from ewes‘ raw milk cheeses. Milchwissenschaft 57, 143-147 (2002). 11. Kenny O.M., Fitzgerald R.J., O’Cuinn G., Beresford T.P., Jordan K.N.: Comparative analysis of the autolytic potential of Lactobacillus helveticus strains during Cheddar cheese ripening. Int. J. Dairy Tech. 4, 207-213 (2005). 12. Martínez-Cuesta M.C., Kok J., Herranz E., Pelález C., Requena T., Buist G.: Requirement of autolytic activity for bacteriocin-induced lysis. Appl. Environ. Microbiol. 8, 3174-3179 (2000).

Kontaktní adresa Magdaléna Abrlová, [email protected]

57

VÝBċR VHODNÝCH HYDROKOLOIDģ PRO STABILIZACI JAKOSTI TERMIZOVANÝCH SMETANOVÝCH SÝRģ Tykvartová Dagmar 1), HrabČ Jan 2), Patrovský JiĜí 3) 1) VOŠ potravináĜská a SPŠ mlékárenská v KromČĜíži 2) Ústav potravináĜského inženýrství, FT UTB ve ZlínČ 3) NATURA, a.s., Praha The selection of suitable hydrocolloids for the quality stabilisation of thermized cream cheese Summary: Consistency and texture are very important organoleptic properties of thermized cheese due to the expected smooth appearance of that spreadable foodstuffs. In our lab and pilot trials, we analyzed and compared the samples of thermized cream cheese prepared with addition of different hydrocolloids. The choice of suitable hydrocolloids has been made on the basic tests with the application of a generally available assortment of commercial hydrocolloids. Our cheese samples were analyzed after production and after 40 days of storage at 6r2 qC, i.e. at the end of their shelf life. After introductory trials, we have chosen two types of hydrocolloids: the mixture of modified starch, xanthan gum and guar gum (sample E) and individual high-methoxyl pectin HM (sample I), and they were subsequently used for experiments. Then, several physically-chemical and sensory analyses were applied for evaluation of finished samples of thermized cheese. Viscoelastic properties were determined by dynamic oscillatory rheometry. On the basis of comparative analysis, we have found the blended stabilizer (sample E) as the best hydrocolloids premix for our purpose its influence on viscoelastic and organoleptic properties was positive and the best applicable.

Úvod Hydrokoloidy–biopolymery pĜevážnČ rostlinného, ale i živoþišného a mikrobiálního pĤvodu, jsou látky dodávající potravinám funkþní vlastnosti. Jsou pĜidávány k nČkterým mlékárenským produktĤm s cílem stabilizovat strukturu finálního výrobku, resp. optimalizovat konzistenci a souþasnČ i celkový senzorický profil termizovaných výrobkĤ.1,2 Bylo zjištČno, že na reologické vlastnosti výrobkĤ nemá vliv pouze množství hydrokoloidu, ale pĜedevším jeho molekulová hmotnost, struktura, náboj a typy vazeb v daném biopolymeru.3 Vliv molekulové hmotnosti biopolymeru na viskozitu jogurtĤ zkoumal Tuinier a kol.4 Petry a kol5. sledovali vliv monosacharidového složení na výslednou viskozitu produktu u kmenĤ Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus a konstatovali, že þím více glukózy je v ĜetČzci biopolymeru, tím je viskozita produktu vyšší. Dalším faktorem ovlivĖujícím viskozitu je náboj biopolymeru. Bylo zjištČno, že zápornČ nabité biopolymery zvyšují elasticitu tím, že elektrostatickými silami interagují s kladnČ nabitým kaseinem a tím posilují proteinovou síĢ.6 Dalším faktorem, ovlivĖujícím viskozitu, je druh vazeb v základním ĜetČzci biopolymeru. PĜedpokládá se, že vazba E(1o4) dČlá polysacharid ménČ ohebný a tím pĜispívá ke zvýšení viskozity produktu ve srovnání s vazbami E(1o3), E(1o2), D(1o4), které poskytují pružnČjší konzistenci a pĜispívají tak ke zvýšení elasticity.7 V technologii výroby smetanových termizovaných sýrĤ našly uplatnČní hlavnČ hydrokoloidy rostlinného pĤvodu–karagenany, modifikované škroby a pektiny, dále guar a biotechnologickým postupem získávaný xanthan. V našich pokusech, z osmi druhĤ hydrokoloidĤ a jejich smČsí, obsahujících modifikované škroby (bramborový, tapiokový a kukuĜiþný) v kombinaci s pektiny nízko- i vysokoesterifikovanými, guarovou gumou, xanthanovou gumou a karagenany, byly po senzorickém a fyzikálnČ-chemickém hodnocení vybrány dva druhy, které nejlépe vyhovovaly jakostním požadavkĤm. Jednalo se o biopolymer typu vysokoesterifikovaný pektin a smČs modifikovaných škrobĤ s xanthanovou a guarovou gumou. Pektiny jsou hydrokoloidy výluþnČ rostlinného pĤvodu. Základní struktura pektinu je tvoĜena lineárním ĜetČzcem 25-100 jednotek D-D-galakturonové kyseliny spojených vazbou (1o4). Jsou þásteþnČ esterifikovány methanolem. Základní ĜetČzec je v menší míĜe pĜerušován pĜítomností L-rhamnózy a jiných neutrálních jednotek (D-galaktóza, L-arabinóza, D-xylóza aj.). Pro pektiny je 58

charakteristický stupeĖ esterifikace (DE–degree of esterification), který vyjadĜuje procentické zastoupení methylace galakturonových kyselin v methyl-esterové formČ. Vysokoesterifikované pektiny (HM) jsou definovány jako ty, které mají hodnotu DE nad 70 %, nízkoesterifikované pektiny (LM) mají DE ménČ než 50 %. Mohou být navíc ještČ amidované (LMA) nebo neamidované (LMNA). StupeĖ amidace (DA) vyjadĜuje procentické zastoupení karboxylové skupiny v amidové formČ.8,9 Mechanismus tvorby gelu závisí na stupni esterifikace pektinu. Vysokoesterifikované pektiny tvoĜí gely s cukrem v kyselém prostĜedí. Cukr váže vodu a snižuje tak stupeĖ hydratace pektinu. Molekuly pektinu s nízkým poþtem methoxylových skupin se vzájemnČ odpuzují, což brání asociaci molekul a tvorbČ gelĤ. Gely proto vznikají jen za pĜítomnosti vápenatých kationtĤ. Pektinové molekuly mají v prostĜedí neutrálním záporný elektrický náboj, a proto reagují s polymery nesoucími kladné náboje, napĜ. s proteiny. Známé jsou interakce mezi kaseinem a vysokoesterifikovaným pektinem. ObČ tyto makromolekulární složky se obvykle setkají v prĤmyslovČ vyrábČných potravních koloidech a pektin zejména je doporuþován jako stabilizátor kysaných mléþných nápojĤ. V kyselém prostĜedí pektin stabilizuje kasein.9 Ambjerg, Pedersen a Jorgensen popsali, že vazby vysokoesterifikovaného pektinu na kaseinové micely jsou elektrostatické povahy a závisejí na pH prostĜedí.10 Adsorpce pektinu na kaseinové þástice a stabilizace komplexu byly popsány Glahnem.11 Dalgleish a Hollocou udávají, že velmi nízké koncentrace pektinĤ mohou ochránit komplex kaseinátu sodného pĜed agregací pĜi pH d 5 a že pektin se váže na povrch emulze dokonce pĜi pH blízkém isoelektrickému bodu kaseinu.12 Modifikované škroby jsou škroby upravené tak, aby se omezily nežádoucí vlastnosti nativního škrobu-nerozpustnost ve vodČ, vysoká viskozita škrobových mazĤ, vznik gumovité kohézní textury a tvorba kalných a retrogradujících gelĤ.13 Xanthanová guma je hydrokoloid mikrobiálního pĤvodu. Producentem extracelulárního xanthanu jsou bakterie rodu Xanthomonas (nejþastČji Xanthomonas campestris). Jde o heteropolysacharid velké molární hmotnosti (M=2,5.106). Úplnou hydrolýzou získáme monomerní jednotky D-glukózy, D-mannózy a D-glukuronové kyseliny. Základní skelet xanthanu se podobá celulóze. Struktura je komplikovaná pĜítomností pyruvátu vázaného na koncovou jednotku E-D-mannózy. PĜítomnost aniontu zvyšuje hydrataci a zajišĢuje rozpustnost xanthanu ve studené vodČ. Samotný xanthan netvoĜí gely, ale termoreverzibilní gel vzniká ve smČsi s polysacharidy, napĜ. s galaktomannany (gumou rohovníku-mouþkou svatojánského chleba), glukomannany (konjakovou gumou) a N-karagenanem. Vznik gelu vyžaduje interakci molekul xanthanu (dihelixu) s nevČtvenou strukturou molekuly polysacharidu (s jeho vazebnou zónou). KvalitnČjší, elastické, soudržné gely vznikají z deacetylovaného xanthanu.14,15 Guarová guma je polysacharid–galaktomannan, získává se jako mouka z endospermu semen luštČniny Cyamopsis tetragonoloba. Polysacharidový ĜetČzec je tvoĜen E-D-mannózovými jednotkami spojenými (1o4) vazbami a z vedlejšího ĜetČzce D-D-galaktózy spojenými vazbami (1o6). Celkové zastoupení tČchto dvou monomerních jednotek je v pomČru asi 2:1. Galaktózové substituenty jsou pravidelnČ rozdČleny podél mannózového ĜetČzce. ýasto se využívají v kombinaci s jinými koloidy, napĜ. s karagenany.16 Karagenany jsou polysacharidy, extrakty þervených moĜských Ĝas typu Chondrus, Gigartina a Euchema. Existuje osm druhĤ frakcí, nejznámČjší jsou tĜi (kappa, iota a lambda). Liší se poþtem a polohou sulfátových skupin na 3,6-anhydro-D-D-galaktopyranóze. Sulfátové skupiny mají nejvČtší vliv na vlastnosti tČchto hydrokoloidĤ. Snadno tvoĜí gely i s jinými hydrokoloidy, napĜ. s mouþkou svatojánského chleba.16 Cílem této práce bylo vybrat vhodné druhy hydrokoloidĤ a jejich smČsí pro výrobu smetanových termizovaných sýrĤ s obsahem 60 % tuku v sušinČ (w/w) a studovat rozdíly v základních vlastnostech fyzikálnČ-chemických, organoleptických a v závČru i viskoelastických. Použité koncentrace hydrokoloidĤ byly zvoleny tak, aby byla splnČna podmínka tvorby žádané konzistence a schopnost výrobku vázat syrovátku po celou dobu trvanlivosti výrobku.17

59

Materiál a metody Vyrobeny a analyzovány byly smetanové termizované sýry s obsahem sušiny min. 25 % (w/w) a tuku min. 15 % (w/w). Termizované sýry byly vyrábČny na zaĜízení Stephan UMM/SK 80 pĜi termizaþním záhĜevu 76 qC. Po termizaci byla hmota homogenizována na homogenizátoru Sigma, zchlazena na teplotu 6r2 qC a pĜi této teplotČ byly výrobky skladovány. K výrobČ byly použity suroviny: tvaroh tuþný, máslo a vybrané druhy a smČsi dále uvedených hydrokoloidĤ. vzorek B,C a D: vzorek E:

vzorek F: vzorek G: vzorek H: vzorek I:

nízkoesterifikované pektiny E 440 v množství 0,2 % w/w. Vzorky se lišily procentickým obsahem jednotlivých složek. smČs modifikovaného tapiokového škrobu E 1442, modifikovaného bramborového škrobu E 1414, xanthanové gumy E 415 a guarové gumy E 412 v celkovém množství smČsi 0,5 % w/w smČs kappa-karagenanu E 407 a modifikovaného kukuĜiþného škrobu E 1442 v množství 0,4 % w/w smČs xanthanové gumy E 415 a mléþných bílkovin v množství 0,5 % w/w modifikovaný bramborový škrob E 1442 v množství 0,5 % w/w vysokoesterifikovaný pektin. E 440 v množství 0,2 % w/w

Organoleptické i fyzikálnČ-chemické hodnocení bylo provedeno po výrobČ a na konci doby minimální trvanlivosti, to je po 40 dnech. Na základČ výsledkĤ senzorické analýzy byly pro další blok zkoušek vybrány þtyĜi a následnČ pouze dva druhy hydrokoloidĤ. I tyto výrobky byly hodnoceny organolepticky, fyzikálnČ chemicky a navíc byly zjišĢovány i reologické vlastnosti. Senzorické hodnocení bylo provádČno skupinou 12 vybraných posuzovatelĤ, vyškolených podle ýSN ISO 8586-1.17 Vzorky byly pĜedkládány anonymnČ pĜi skladovací teplotČ. Senzorické hodnocení bylo provedeno pomocí poĜadového preferenþního testu a statistické vyhodnocení provedeno oboustranným zjednodušeným testem.18 Ve výsledkové þásti uvádíme pouze výsledky poĜadového preferenþního testu, kdy byl hodnocen celkový senzorický profil a statistické hodnocení bylo provedeno Friedmanovým testem.19 Pro fyzikálnČ-chemickou analýzu byla použita ke stanovení obsahu tuku technická acidobutyrometrická metoda van Gulikova, ke stanovení sušiny metoda pĜesná vážková, obsah tuku v sušinČ byl stanoven metodou technickou výpoþtovou, aktivní kyselost metodou potenciometrickou a titraþní kyselost alkalimetrickou titrací.20 Reologické vlastnosti vyrobených sýrĤ byly charakterizovány pomocí rotaþního viskozimetru Bohlin Gemini (Bohlin instruments, UK) v geometrii deska-deska (prĤmČr 40 mm, štČrbina 1 mm) pĜi teplotČ 20 qC. MČĜení bylo provádČno v oscilaþním režimu s amplitudou smykového napČtí 20 Pa v oblasti lineární viskoelasticity. Elastický modul pružnosti Gc a ztrátový modul pružnosti Gs byly vyhodnocovány v rozsahu frekvencí 0,1-50 Hz.21,22 Výsledky a diskuze V první fázi bylo pro výrobní experimenty použito osm výše uvedených hydrokoloidĤ. Analýzy byly provedeny po výrobČ a na konci doby minimální trvanlivosti. Z výsledkĤ chemické analýzy jsou uvedeny pouze závažnČjší odchylky od standardních hodnot (komplexní výsledky jsou k dispozici u autorĤ pĜíspČvku). U vzorkĤ B a C bylo chemickou analýzou zjištČno zvýšení obsahu sušiny v prĤbČhu skladování asi o 2-3 % (z hodnoty 37,55 % na 40,14 % u vzorku B a z 37,22 % na 39,89 % u vzorku C). PĜíþinou zvýšené sušiny bylo nedostateþné vázání syrovátky a její následné uvolĖování z výrobku. Výsledky senzorického hodnocení jsou uvedeny v tabulce I. Vzorky G a H byly pĜi senzorické analýze nejménČ preferovány, k þemuž pĜispČla i vysoká hodnota sušiny (38-39 %). Ta mohla mít souvislost se vznikem krátké, drobivé až rozpadavé konzistence, což negativnČ ovlivnilo celkový senzorický profil výrobku. Na základČ výsledkĤ senzorického hodnocení byly z dalších pokusĤ vyĜazeny vzorky pod oznaþením B, C, G a H. S vybranými 4 druhy biopolymerĤ byly provedeny opakované výroby a zpĤsob hodnocení byl totožný. Výsledky chemických analýz a senzorického hodnocení jsou uvedeny v tabulce II a III. 60

Tabulka I Výsledky poĜadového preferenþního testu (celkový senzorický profil výrobku) po 40 dnech skladování (konec DMT*) D E F vzorek B C G H souþet poĜadí 56 29 55 74 91 93 99 všech hodnotitelĤ poĜadí 4 2 3 5 6 7 8 *DMT datum minimální trvanlivosti B,C,D: nízkoesterifikované pektiny E 440 E: smČs modifikovaného tapiokového škrobu E 1442, modifikovaného bramborového E 1414, xanthanové gumy E 415 a guarové gumy E 412 F: smČs kappa-karagenanu E 407 a modifikovaného kukuĜiþného škrobu E 1442 G smČs xanthanové gumy E 415 a mléþných bílkovin H: modifikovaný bramborový škrob E 1442 I: vysokoesterifikovaný pektin. E 440

I 24 1

škrobu

Tabulka II FyzikálnČ-chemické hodnoty zjištČné u skupiny smetanových termizovaných sýrĤ vyrobených za použití þtyĜ vzorkĤ hydrokoloidĤ po 40 dnech skladování vzorek D E F I

tuk >%@ w/w 20,5 20,5 20,5 20,5

tuk v sušinČ >%@, w/w 54,3 57,1 55,0 57,0

sušina >%@ w/w 37,75 35,91 37,27 35,96

titraþní kyselost >SH@ 66 67 66 66

aktivní kyselost >pH@ 4,4 4,5 4,4 4,4

Tabulka III Výsledky senzorické analýzy poĜadovým preferenþním testem (hodnocen celkový senzorický profil sýrĤ) po 40 dnech skladování vzorek E D souþet poĜadí 18 50 všech hodnotitelĤ 1 poĜadí 3 vysvČtlení symbolĤ viz. legenda u tabulky I

F

I

56

31

4

2

Tabulka IV FyzikálnČ-chemické hodnoty zjištČné u skupiny smetanových termizovaných sýrĤ vyrobených za použití dvou vzorkĤ hydrokoloidĤ po 40 dnech skladování tuk v sušinČ titraþní aktivní tuk >%@ sušina >%@ w/w w/w >%@, w/w kyselost >SH@ kyselost >pH@ E 16,1 34,58 46,6 70 4,3 I 16,2 33,78 48,0 68 4,4 A 16,1 34,65 46,5 70 4,3 smČs modifikovaného tapiokového škrobu E 1442, modifikovaného bramborového škrobu E 1414, xanthanové gumy E 415 a guarové gumy E 412 I: vysokoesterifikovaný pektin E 440 standard-smČs karobové gumy E 410, guarové gumy E 412 a xanthanové gumy E 415

vzorek

E:

A:

61

Vzorky D a F vykazovaly zvýšený obsah sušiny. Bylo zjištČno zvýšené uvolĖování syrovátky, které se projevilo tužší konzistencí a zhoršenou roztíratelností, což se negativnČ odrazilo ve výsledcích senzorického hodnocení. Na základČ senzorického vyhodnocení byly vyĜazeny vzorky D a F a pĜikroþilo se k výrobČ s použitím hydrokoloidĤ oznaþených kódy E a I (jejich charakteristika je uvedena u tabulky IV). Výsledky analýz byly opakovanČ porovnány s tzv. standardem, to je výrobkem v souþasné dobČ vyrábČným. Tabulka V Výsledky senzorického hodnocení smetanových termizovaných sýrĤ poĜadovým preferenþním testem po 40 dnech skladování (konec DMT*) vzorek E souþet poĜadí všech 19 hodnotitelĤ poĜadí 1 *DMT datum minimální trvanlivosti

I

A

33

20

3

2

U vyrobených vzorkĤ byly dále sledovány zmČny reologických vlastností, konkrétnČ elastického modulu pružnosti Gc a ztrátového modulu pružnosti Gs, které byly vyhodnocovány v rozsahu frekvencí 0,1-50 Hz. Z namČĜených hodnot vyplývá, že sýry s hodnocenými hydrokoloidy mají na konci doby skladovatelnosti hodnoty elastického i ztrátového modulu pružnosti nižší než standard. Tyto sýry mají, podle výsledkĤ reologických mČĜení, slabší gel a jsou ménČ tuhé než standard. PĜi senzorickém hodnocení byl nejvíce preferován vzorek oznaþený kódem E (sýr vyrobený za použití smČsi modifikovaných škrobĤ, xanthanové a guarové gumy), dále vzorek pod oznaþením standard (sýr bČžnČ vyrábČný za použití smČsného stabilizátoru) a nejménČ preferovaný byl vzorek oznaþený kódem I (sýr vyrobený za použití vysokoesterifikovaného pektinu).

ZávČr V práci byly charakterizovány bČžné hydrokoloidy používané k úpravČ textury termizovaných smetanových sýrĤ a byl kvantifikován jejich vliv na mechanické vlastnosti vyrobených smetanových termizovaných sýrĤ. Byla srovnávána jakost smetanových termizovaných sýrĤ s pĜídavkem vybraných druhĤ hydrokoloidĤ a jejich smČsí. Vyhodnocení bylo provádČno fyzikálnČ-chemickou a senzorickou analýzou, posléze i reologickými metodami. Bylo zjištČno, že ze skupiny osmi navržených druhĤ a kombinací hydrokoloidĤ lze pro zajištČní požadované jakosti doporuþit dva druhy: smČsný stabilizátor, obsahující modifikovaný tapiokový škrob E 1442, modifikovaný bramborový škrob E 1414, xanthanovou gumu E 415 a guarovou gumu E 412 a jako druhý vzorek vysokoesterifikovaný pektin E 440. Tyto druhy vyhovují po stránce fyzikálnČ-chemické, senzorické i reologické. Jako ménČ vhodné se jevily pektiny nízkoesterifikované, které vytváĜely konzistenci drobivou, pĜíliš tuhou, hĤĜe roztiratelnou. Výsledky všech rozborĤ potvrdily, že dva vybrané vzorky hydrokoloidĤ lze doporuþit k použití pĜi výrobČ smetanových termizovaných sýrĤ, protože nebyly zjištČny významnČjší rozdíly v jejich jakosti pĜi porovnání se stávajícím, v souþasnosti používaným stabilizátorem. PĜi senzorické analýze byl výrobek se smČsným stabilizátorem-vzorkem E hodnocen navíc jako kvalitnČjší (viz tab. V). Získané výsledky mohou být využity pro návrh smČsí hydrokoloidĤ pro konkrétní aplikace do termizovaných smetanových sýrĤ. PodČkování: Práce vznikla za podpory projektu MŠMT: MSM 7088352101.

62

Použitá literatura: 1. SIMEONE, M., ALFANI, A., GUIDO, S. Phase diagram, rheology and interfacial tension of aqueous mixtures of Na-caseinate and Na-alginate. Food Hydrocolloids, 18, 2004, 463 – 470. 2. THAIUDOM, S., GOFF, H.D. Effect of ț-carrageenan on milk protein polysaccharide mixtures. International Dairy Journal, 13, 2003, 763 – 771. 3. MARSHALL, V.M., DUNN, H., ELVIN, M., MELAY, N., LAWS, A.P. Structural characterisation of the exopolysaccharide produced by Streptococcus thermophilus EU20. Carbohydrate Research, 2001, 413-422. 4. TUINIER, R., YOON, P., STUART, M.A.C., FLEER, G.J., de KRUIF, C.G. Concentration and shearrate dependence of the viscosity of an exocellular polysaccharide. Biopolymers, 1999, 50, 641-646. 5. PETRY, S., FURLAN, S., WAGHORNE, E., SAULNIER, L., CERNING, J., MAGUIN, E. Comparison of the thickening properties of four Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus strains and physicochemical characterization of their exopolysaccharides. FEMS Microbiology Letters, 2003, 221, 285-291. 6. DUBOC, P., MOLLET, B. Applications of exopolysaccharides in the dairy industry. International Dairy Journal, 11, 2001, 759-768 7. RAUS-MADIEDO, P., HUGENHOLTZ, J., ZOON, P. An overview of exopolysaccharide produced by lactic acid bacteria. International Dairy Journal, 12, 2002, 163-171. 8. Propagaþní materiál firmy Degussa. Texturant Systems, NČmecko 9. VELÍŠEK, J. Chemie potravin I. 1. vyd. Tábor : OSSIS, 1999. 352 s. ISBN 80-902391-3-7 10. AMBJERG, PEDERSEN, H.C., JORGENSEN,B.B (1991) Influence on the stability of casein solutions studied in dependence of varying pH and salt concentration. Food Hydrocolloids, 4, 323-328 11. GLAHN, P. Hydrocolloid stabilization of protein suspensions at low pH. Food Nutr., Sci. 1982, 6. 171177 12. DALGLEISH, D.G., HOLLOCOU, A.L. (1997) Stabilization of protein-based emulsions by means of interacting polysaccharides. In E. Dickinson, B. BergenstƗhl (Eds.), Food colloids: proteins, lipids and polysaccharides (pp. 236-244). Cambridge, UK. Royal Society of Chemistry 13. ZADRAŽIL, K., GAJDģŠEK, S. MlékaĜství. 1. vyd. Praha : ISV, 2002. 125 s. ISBN 80-86642-15-1 14. www.cargilltexturizing.com 15. www.cpkelco.com 16. IMESON, A.P. Carrageenan. In Handbook of hydrocolloids. Eds. Phillips, G.O. & Williams, P.A. Woodhead Publishing Limited and CRC Press: Boca Raton, 2000, 87 – 102. 17. ISO Standard No. 8586-1:1993 Sensory analysis – General guidance for the selection, training and monitoring of assessors – Part 1: Selected assessors. International Organization for Standardization, Geneva, 1993. 18. JAROŠOVÁ, A. Senzorické hodnocení potravin. 1. vyd. Brno : MZLU, 2001. 84 s. ISBN 80-7157-539-9 19. KěÍŽ, O., BUĕKA, F., HRABċ, J. Senzorická analýza potravin II. Statistické metody. 1. vyd. UTB Zlín. 2007. 127 s. ISBN 978-80-7318-494-0 20. INDRA, Z., MIZERA, J. Chemické kontrolní metody pro obor zpracování mléka. 1. vyd. Praha. 1992. 273 s. 21. GUNASEKARAN, S. Cheese reology and texture. Boca Raben press LLC. 2003. ISBN 1-58716-021-8 22. KRÁýALÍK, M. Reology of dispersive polymeric systems. UTB Zlín. 2006. 46 s. ISBN 80-7318-493-1

Kontaktní adresa: Ing. Dagmar Tykvartová, VOŠ potravináĜská a SPŠ mlékárenská v KromČĜíži, ŠtČchovice 1358, 767 54 KromČĜíž, tel. 774 144 913, e-mail: dagmar.tykvartova @email.cz

63

VLIV ROZDÍLNÉHO STERILAýNÍHO ZÁHěEVU S KONSTANTNÍM SMRTÍCÍM ÚýINKEM NA JAKOST TAVENÝCH SÝRģ BuĖka František 1), Lazárková Zuzana 1), BuĖková Leona 1), HoláĖ Felix 2), Kráþmar Stanislav 1), HrabČ Jan 1) 1) Ústav potravináĜského inženýrství FT UTB ve ZlínČ, 2) Pragolab s.r.o. Influence of different sterilation mode with the same lethal effect on processed cheese quality Summary: The article aims to evaluate the impact of 4 different modes of sterilization (110°C for 100min, 115°C for 32min, 120°C for 10min and 125°C for 3.17min) with the same lethal effect (F-value 7.78) on the properties of processed cheeses (38% w/w dry matter, 50% w/w fat in dry matter) depending on the addition of lactose (0; 0.5; 1.0; 1.5 and 2.0% w/w). The microbiological quality of the processed cheeses as well as their protein profile (SDS-PAGE method), colour (spectrophotometrically analyzed) and sensory properties (flavour) were evaluated. The sterilization modes tested ensured inactivation of the microflora observed (the total number of microorganisms, coliforms, aerobic and anaerobic spore-forming bacteria and colony forming units of yeasts and/or moulds). With the falling sterilization temperature and adequately prolonged period of the exposure time (in order to maintain a constant lethal effect) the processed cheeses became darker and less acceptable from the sensory point of view and more significant hydrolytic changes of proteins occurred. In comparison with the non-sterilized processed cheeses, the smallest changes were noted in products treated with a temperature of 125°C for 3.17min. The heat at a temperature of 120°C for 10min was still acceptable from sensory points of view. A decline in quality was even more significant with the increasing amount of lactose added (in the area of concentration tested, i.e. 0.5–2.0% w/w). The additions of lactose higher than 1.0 % w/w were found unsuitable for the production of sterilized processed cheeses.

Úvod Tavené sýry jsou vyrábČny zahĜíváním smČsi rĤzných druhĤ pĜírodních sýrĤ (v rĤzném stadiu zralosti) s tavicími solemi (obvykle sodné soli fosfátĤ a polyfosfátĤ, popĜ. citrátĤ) za þásteþného podtlaku a stálého míchání, až se dosáhne homogenní hmoty. KromČ tradiþních surovin (napĜ. pĜírodní sýry, tavicí soli, máslo, tvaroh, voda) se v poslední dobČ rovnČž využívá Ĝada sušených mléþných koncentrátĤ, z nichž nČkteré mají významný obsah laktózy (napĜíklad sušené odstĜedČné mléko a sušená syrovátka), která však mĤže podstatnČ ovlivnit jakost tavených sýrĤ 1–3. Tyto suroviny jsou využívány pĜedevším z ekonomických dĤvodĤ (snížení nákladĤ na surovinu). Tavené sýry patĜí mezi typické nekyselé potraviny (pH>4) a pĜedstavují prostĜedí, které vyhovuje mnohým mikroorganizmĤm vþetnČ sporulujících bakterií. BČžné tavené sýry mají trvanlivost ĜádovČ nČkolik mČsícĤ v závislosti na ĜadČ faktorĤ, napĜ. na použité surovinČ, tavicí teplotČ a dobČ jejího pĤsobení, technologii balení, obalovém materiálu a teplotČ skladování 4. Pro zabezpeþení delší trvanlivosti tavených sýrĤ je možné použít sterilaþní záhĜev hermeticky zabalených výrobkĤ. Sterilované produkty je možné využít napĜ. do bojových dávek potravin (napĜíklad armády USA, NČmecka, ýeské republiky), pro zabezpeþení stravování þlenĤ Integrovaného záchranného systému pĜi jejich operaþním nasazení, ale i v bČžném životČ v pĜípadech, kdy není k dispozici chladírenská technika 5. PĜi sterilaci je smrtící úþinek na mikroorganizmy dán pĜedevším výší teploty a dobou jejího pĤsobení. Pro numerické vyjádĜení smrtícího úþinku daného sterilaþního režimu (kombinace teploty a doby jejího pĤsobení) lze využít tzv. F–hodnotu 6. ÚroveĖ 1 F odpovídá smrtícímu úþinku teploty 121,1oC pĤsobící právČ 1 minutu (nebo ekvivalentnímu sterilaþnímu záhĜevu, který zabezpeþí stejný destrukþní úþinek na testovací mikroorganizmus). Hodnota veliþiny F se vypoþte podle vztahu: F

t 10

T 121,1 z

(1) kde: t je þas pĤsobení sterilaþní teploty (min); T je sterilaþní teplota (°C) a z je hodnota vyjadĜující potĜebný nárĤst v teplotČ, aby byl získán stejný letální úþinek pĜi 1/10 doby pĤsobení (°C). Hodnota 64

z se pro obvyklé testovací mikroorganizmy (napĜ. Bacillus stearothermophilus, Clostridium botulinum aj.) pohybuje kolem 10°C 7. Termosterilací však nejsou dotþeny pouze mikroorganizmy, ale také pĜítomné chemické látky, jejichž reakce mohou zpĤsobit snížení nutriþní hodnoty vysterilovaných výrobkĤ 8. Bezesporu nejvýznamnČjší reakcí probíhající v dĤsledku termosterilace je Maillardova reakce, jako reakce karbonylových slouþenin (zejména redukujících sacharidĤ) s aminoslouþeninami (nejþastČji aminokyselinami) 9. Proto pĜi použití surovin obsahujících vyšší množství laktózy (napĜ. sušené mléko nebo sušená syrovátka) lze pĜedpokládat zvýšení intenzity Maillardovy reakce 2,10. ěada produktĤ i meziproduktĤ tČchto reakcí jsou senzoricky aktivními látkami ovlivĖujícími aroma, konzistenci i barvu výrobku, napĜ. uhlovodíky, aldehydy, ketony, kyseliny. Komplex Maillardových reakcí mĤže rovnČž zpĤsobit ztráty nutriþnČ významných látek 9–11. Rovnice (1) mĤže být použita také pro vyjádĜení ztrát nutriþnČ významných látek, ke kterým mĤže dojít v rámci sterilaþního režimu definovaného kombinací teploty a doby jejího pĤsobení. Hodnoty z pro tyto ztráty se pohybují pĜibližnČ na úrovni 5ti až 10ti násobku ve srovnání se z-hodnotami potĜebnými pro usmrcení daných mikroorganizmĤ 12. Pro zachování vysoké nutriþní hodnoty sterilovaných potravin pĜi konstantním smrtícím úþinku na mikroorganizmy je tĜeba využít spíše vyšších sterilaþních teplot pĤsobících adekvátnČ kratší dobu. Cílem této práce bylo vyhodnotit vliv 4 rĤzných sterilaþních režimĤ daných kombinací teploty a þasu (pĜi konstantním smrtícím úþinku vyjádĜeném F-hodnotou) na vybrané chemické, mikrobiologické a senzorické vlastnosti tavených sýrĤ v závislosti na jejich obsahu laktózy. Materiál a metody Pro úþely experimentu byly vyrobeny tavené sýry (obsah sušiny 38 % w/w, obsah tuku v sušinČ 50 % w/w) s pĜídavkem laktózy (0,5; 1,0; 1,5 a 2,0 % w/w ve finálním produktu). Získán byl rovnČž tavený sýr bez pĜídavku laktózy. Surovinová smČs zahrnovala: Eidamskou cihlu, máslo, vodu a komerþní tavicí soli. Tavené sýry byly vyrobeny na laboratorním zaĜízení Vorwerk Thermomix TM 21 13. Obsah laktózy byl korigován pĜídavky vody a másla pro zachování konstantního obsahu sušiny a tuku v sušinČ. Tavicí teplota byla 90°C a celkový þas pĜípravy vzorku byl 10 minut. Vyrobená tavenina byla plnČna do 75g obalĤ z taženého hliníku uzavĜených pĜivaĜitelným hliníkovým víþkem. Malá þást vaniþek z každé výroby byla zchlazena bČhem 3 – 4 hodin na 6 r 2°C (tzv. „nesterilované tavené sýry“), zatímco zbytek byl rozdČlen na 4 þásti, které byly následnČ podrobeny þtyĜem rĤzným sterilaþním záhĜevĤm (tzv. „sterilované tavené sýry“). Pro sterilaci byl použit diskontinuální prĤmyslový autokláv SVV2AKV (Pacovské strojírny, Slovenská republika). Aplikovány byly následující sterilaþní režimy: 100°C 100 minut (A), 115°C 32 minut (B), 120°C 10 minut (C) a 125°C 3,17 minut (D). Všechny kombinace byly vybrány tak, aby bylo dosaženo konstantní F-hodnoty (F=7,78). Doba do dosažení sterilaþní teploty a doba chlazení byly prakticky stejné u všech 4 sterilaþních režimĤ. CelkovČ bylo vyrobeno 25 variant vzorkĤ: 4 skupiny lišící se kombinací sterilaþní teploty a doby jejího pĤsobení (A – D) a 1 skupina nesterilovaných tavených sýrĤ. Každá skupina obsahovala výrobek bez obsahu laktózy a dále 4 výrobky s obsahem laktózy (0,5; 1,0; 1,5 a 2,0 % w/w). Každá varianta byla vyrobena tĜikrát. Modelové tavené sýry byly charakterizovány pomocí pH, obsahu sušiny, tuku a dusíkatých látek. MČĜení byla provedena nejménČ dvakrát (u každého vzorku). Mikrobiologická jakost nesterilovaných i sterilovaných tavených sýrĤ byla posouzena pomocí stanovení celkového obsahu mikroorganizmĤ, obsahu koliformních mikroorganizmĤ a plísní a kvasinek. Dále byly zjišĢovány poþty aerobních a anaerobních sporulujících mikroorganizmĤ. Sterilované tavené sýry byly podrobeny termostatové zkoušce (10 dnĤ pĜi teplotČ 37 r 1°C). Barva tavených sýrĤ byla zjišĢována pomocí spektrofotometru CM-2600d (Konica Minolta, Tokio, Japonsko). Výsledky byly získány pro osvČtlení D65 (denní svČtlo s teplotou barvy 6500 K) a CIE 1964 10o standardního pozorovatele a vyjádĜeny ve stupnici CIE L*a*b*. Z namČĜených hodnot souĜadnic L*, a*, b* byl vypoþítán tzv. index žlutosti (YI), jehož nárĤst indikuje zvýšenou intenzitu degradaþních reakcí v mČĜeném systému. 65

U vzorkĤ byl zjišĢován proteinový profil pomocí denaturaþní polyakrylamidové elektroforézy (SDS-PAGE). Vzorky byly pĜipraveny podle metody popsané v Bütikofer et al. 14. Polyakrylamidový gel (17 %) a systém pufrĤ byl pĜipraven podle metodiky Laemmli 15 s použitím vertikálního elektroforetického systému P9DS Emperor Penguin (Owl, Portsmouth, USA). Elektroforéza probíhala 4 hodiny pĜi 15°C a 70 mA. Jako standardy pro urþení molekulové hmotnosti separovaných proteinĤ byl použit Protein Test Mixture 5 (Serva, Heidelberg, NČmecko) s proteiny s následujícími molekulovými hmotnostmi (kDa): 29,0; 21,0; 12,5; 6,5. Separované proteiny byly barveny dusiþnanem stĜíbrným podle Kirkeby et al. 16. Program Ultra QuantTM 6.0 (Ultra-Lum. Inc., Claremont, USA) byl použit pro analýzu separovaných proteinĤ. Se vzorky nesterilovaných a sterilovaných tavených sýrĤ byla provedena senzorická analýza prostĜednictvím 16 vybraných posuzovatelĤ (podle ISO 8586-1:1993). Pro sledování chuti a vĤnČ byla použita sedmibodová hedonická stupnice s charakteristikou každého bodu. Výsledky základních chemických analýz, spektrofotometrického hodnocení barvy a senzorického posouzení chuti a vĤnČ byly statisticky analyzovány pomocí Kruskal-Wallisova a Wilcoxonova testu s 5% rizikem omylu. Výsledky elektroforézy byly podrobeny shlukové analýze. Pro vyhodnocení byl využit program Unistat 5.5 (Unistat Ltd., Londýn, UK). Výsledky a diskuze PĜi mikrobiologickém vyšetĜení byly u nesterilovaných tavených sýrĤ (po 1 mČsíci skladování pĜi teplotČ 6r2°C) zjištČny následující výsledky: celkový poþet mikroorganizmĤ 3,7104 KTJ·g-1, aerobní sporulující mikroorganizmy 2,3104 KTJ·g-1, anaerobní sporulující mikroorganizmy 1,9104 KTJ·g-1 plísnČ a kvasinky 8,7103 KTJ·g-1. Koliformní mikroorganizmy nebyly u nesterilovaných tavených sýrĤ zjištČny. U sterilovaných tavených sýrĤ nebyly detekovány žádné mikroorganizmy, a to ani pĜi termostatové zkoušce. Všechny aplikované sterilaþní režimy s hodnotou F=7,78 (A – D) byly tedy dostaþující pro inaktivaci pĜítomných mikroorganizmĤ (detekovatelných použitými metodami), což koresponduje s publikovanými údaji 12. Ze základní analýzy vyplynulo, že se sledované tavené sýry signifikantnČ nelišily (P 0,05) v obsahu sušiny (37,11 – 38,46 % w/w) a obsahu tuku (18,5 – 19,0 % w/w), což je dĤležité pro zabezpeþení srovnatelnosti testovaných vzorkĤ 17,18. Zatímco sterilace obsah dusíkatých látek neovlivnila (P 0,05), s narĤstající koncentrací laktózy ve vzorcích se obsah dusíkatých látek snižoval (P < 0,05); celkovČ se pohyboval v intervalu 11,83 – 13,09 % w/w. Snižování obsahu dusíkatých látek pĜi zvyšujícím se pĜídavku laktózy bylo nezbytné pro zachování konstantního obsahu sušiny a tuku. Tento stav odpovídá prĤmyslové praxi, neboĢ pĜídavky relativnČ levnČjších surovin s vyšším obsahem laktózy mají primárnČ za cíl nahradit þást relativnČ dražší základní suroviny (pĜírodních sýrĤ – s vysokým obsahem bílkovin) pĜi nemČnném obsahu sušiny a tuku. U nesterilovaných tavených sýrĤ se pH pohybovalo v intervalu 5,97 – 6,10. Výrobky, na nČž byly aplikovány sterilaþní režimy A a B, respektive C a D, vykazovaly pH v intervalu 5,75 – 5,93, respektive 5,83 – 5,95. Sterilované tavené sýry tedy vykazovaly signifikantnČ (P < 0,05) nižší pH než výrobky nesterilované, a to v prĤmČru o cca 0,1 – 0,2. Jednu z pĜíþin poklesu pH lze hledat v hydrolýze pĜítomných polyfosfátových tavicích solí, þímž mĤže dojít ke zmČnČ jejich pufrovací schopnosti 19,20. Vliv obsahu laktózy na úroveĖ pH nebyl u nesterilovaných ani u sterilovaných tavených sýrĤ pozorován (P 0,05). Proteinové profily nesterilovaných a sterilovaných tavených sýrĤ získané metodou SDS-PAGE byly statisticky analyzovány pomocí shlukové analýzy (dendrogram na obr. 1). Nesterilované tavené sýry vytvoĜily samostatný shluk, výraznČ oddČlený od všech vzorkĤ, které byly ošetĜeny sterilací. Proteinový profil sledovaných tavených sýrĤ byl významnČ ovlivnČn jak použitým sterilaþním režimem (A – D), tak i obsahem laktózy. Tavené sýry bez pĜídavku laktózy, na které byly aplikovány sterilaþní režimy C a D, mČly ze všech sterilovaných produktĤ proteinový profil nejbližší k proteinovým profilĤm nesterilovaných výrobkĤ. Naopak pokud byla pĜidávána laktóza, pak se proteinové profily výrobkĤ C a D blížily více k proteinovým profilĤm tavených sýrĤ ošetĜeným režimy A a B než k proteinovým profilĤm nesterilovaných produktĤ. 66

ObecnČ je možné na základČ získaných výsledkĤ Ĝíci, že se snižující se sterilaþní teplotou (a adekvátním prodlužováním jejího trvání pro zachování konstantního smrtícího úþinku) docházelo k rozsáhlejší hydrolýze pĜítomných proteinĤ. V proteolytických procesech probíhajících pĜi sterilaci, prokázaných pomocí metody SDS-PAGE, lze hledat další pĜíþinu poklesu pH. VysvČtlení mĤže spoþívat ve skuteþnosti, že u vytvoĜených štČpných produktĤ dojde k nárĤstu volných karboxylových skupin ve srovnání s nezhydrolyzovaným proteinem.

Obr. 1. Výsledky shlukové analýzy proteinového profilu sledovaných tavených sýrĤ: A – 110°C 100 minut, B – 115°C 32 minut, C – 120°C 10 minut a D – 125°C 3,17 minut, None – nesterilované tavené sýry. Obsah laktózy je vyjádĜen v procentech (w/w). Výsledky spektrofotometrické analýzy barvy sledovaných tavených sýrĤ jsou uvedeny v tabulce I. V dĤsledku sterilace došlo u všech výrobkĤ k signifikantnímu nárĤstu hodnot indexu žlutosti (P < 0,05). Výrobky, na nČž byl aplikován sterilaþním režim A a B se v indexu žlutosti významnČ odlišovaly (P < 0,05) jak navzájem tak i od tavených sýrĤ podrobených sterilaþním záhĜevĤm C a D. Jedinou výjimkou byly vzorky bez pĜídavku laktózy, kde se index žlutosti u varianty B významnČ neodlišoval (P 0,05) od sterilaþních režimĤ C a D. Tavené sýry ošetĜené zpĤsobem C a D, do nichž byl aplikován pĜídavek laktózy <2,0 % w/w (vþetnČ vzorkĤ bez pĜídavku laktózy), se vzájemnČ neodlišovaly (P 0,05) v indexu žlutosti. Z výsledkĤ bylo možné vysledovat, že se snižující se teplotou sterilace docházelo k nárĤstu hodnot indexu žlutosti jako markeru intenzity degradaþních reakcí. PĜídavek laktózy zpĤsobil u nesterilovaných tavených sýrĤ u všech realizovaných koncentrací (0,5 – 2,0 % w/w) signifikantní zvýšení hodnot indexu žlutosti (P < 0,05) ve srovnání s kontrolním vzorkem bez pĜídavku laktózy. U aplikovaných sterilaþních režimĤ (A – D) byl s nárĤstem obsahu laktózy rovnČž pozorován signifikantní (P < 0,05) nárĤst hodnot indexu žlutosti. Tento trend byl patrnČjší u sterilaþních režimĤ A a B ve srovnání s C a D, kde se ve vČtšinČ pĜípadĤ odlišovaly (P < 0,05) až výrobky, kde rozdíl v obsahu laktózy þinil alespoĖ 1,0 % w/w. 67

Tabulka I Výsledky instrumentálního hodnocení barvy sterilovaných a nesterilovaných tavených sýrĤ vyjádĜené pomocí indexu žlutosti (prĤmČr r S.D.) * Obsah laktózy (% w/w) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 *

Sterilaþní teplota a doba jejího pĤsobení Nesterilované výrobky 21,5 ± 0,4 a A 23,4 ± 0,6 b A 24,2 ± 0,6 b A 23,2 ± 1,4 b A 23,6 ± 0,5 b A

110°C 100 min

115°C 32 min

120°C 10 min

125°C 3,17 min

32,6 ± 2,0 a B 50,7 ± 0,5 b B 63,5 ± 4,8 c B 75,1 ± 0,9 d B 78,9 ± 0,1 e B

25,6 ± 2,1 a C 33,9 ± 1,3 b C 42,0 ± 1,2 c C 47,8 ± 3,9 d C 55,1 ± 0,9 e C

24,0 ± 1,1 a C 27,9 ± 2,5 a,b D 30,8 ± 2,1 b,c D 31,8 ± 2,9 c D 38,7 ± 2,4 d D

23,3 ± 1,3 a C 26,7 ± 0,5 b D 28,2 ± 2,1 b,c D 28,4 ± 2,5 b,c D 30,8 ± 1,1 c E

Nemají-li prĤmČry ve sloupci (vliv obsahu laktózy) žádné spoleþné písmeno v horním indexu, pak se indexy žlutosti výrobkĤ v daném sloupci signifikantnČ liší (P < 0,05). Nemají-li prĤmČry v Ĝádku (vliv rĤzné teploty sterilace a doby jejího pĤsobení) žádné spoleþné velké písmeno, pak se indexy žlutosti výrobkĤ v daném Ĝádku signifikantnČ liší (P < 0,05).

Hodnocena byla rovnČž chuĢ a vĤnČ nesterilovaných a sterilovaných tavených sýrĤ a výsledky jsou uvedeny v tabulce II. Všechny nesterilované tavené sýry byly v chuti a vĤni hodnoceny bez ohledu na obsah laktózy (0 – 2,0 % w/w) jako velmi dobré (P 0,05). Výrobky ošetĜené režimem D vykazovaly chuĢ a vĤni dobrou až velmi dobrou, která se u vČtšiny testovaných koncentrací laktózy nelišila od nesterilovaných vzorkĤ (P 0,05). U sterilaþních režimĤ A a B se chuĢ a vĤnČ tavených sýrĤ signifikantnČ zhoršovala (P < 0,05) s narĤstající koncentrací laktózy, pĜiþemž vzorky s nejvyššími koncentracemi byly hodnoceny jako špatné až nevyhovující. Výrobky ošetĜené režimy A a B vykazovaly signifikantní zhoršení chuti a vĤnČ (P < 0,05) ve srovnání s produkty vysterilovanými zpĤsobem D a s nesterilovanými výrobky. VČtšina tavených sýrĤ ošetĜených režimem C s obsahem laktózy 1,0 % w/w se v chuti a vĤni neodlišovala (P 0,05) od výrobkĤ, na které byl aplikován režim D, ani od nesterilovaných produktĤ. VČtšina z tČchto výrobkĤ byla hodnocena jako dobrá. PĜi vyšším obsahu laktózy (>1,0 % w/w) se již chuĢ a vĤnČ výrobkĤ ošetĜených režimem C ve srovnání s nesterilovanými produkty významnČ zhoršila (P < 0,05).

Tabulka II Výsledky senzorické analýzy chuti a vĤnČ tavených sýrĤ * Obsah laktózy (% w/w) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 *

Sterilaþní teplota a doba jejího pĤsobení Nesterilované 110°C 115°C výrobky 100 min 32 min a a 2 A 5 B 4 a B,C a b 2 A 6 B 5 a,b B,C 2a A 6b B 5 a,b B,C a c 2 A 7 B 6 b,c B 3a A 7c B 7c B

120°C 10 min 3 a A,C 4 a A,C 4 a A,C 4 a,b C 5b C

125°C 3,17 min 3a A 3a A 4a A 4a C 4 a A,C

ChuĢ a vĤnČ byla hodnocena sedmibodovou ordinální stupnicí (1 – vynikající, 4 – dobrý, 7 – nevyhovující), prezentovány jsou mediány. Nemají-li mediány ve sloupci (vliv obsahu laktózy) žádné spoleþné písmeno v horním indexu, pak se chuĢ a vĤnČ výrobkĤ v daném sloupci signifikantnČ liší (P < 0,05). Nemají-li mediány v Ĝádku (vliv rĤzné teploty sterilace a doby jejího pĤsobení) žádné spoleþné velké písmeno, pak se chuĢ a vĤnČ výrobkĤ v daném Ĝádku signifikantnČ liší (P < 0,05).

68

ObecnČ nelze suroviny obsahující významnČjší podíl redukujících sacharidĤ z výše uvedených dĤvodĤ doporuþit pro výrobu sterilovaných tavených sýrĤ. V pĜípadČ, že takovéto látky producent pĜesto do surovinové skladby použije, pak by na základČ výsledkĤ této práce mČl být obsah redukujících cukrĤ ve finálním výrobku menší než 1,0 % w/w. V tomto pĜípadČ je pak tĜeba zvolit co nejvyšší sterilaþní teplotu pĤsobící adekvátnČ kratší dobu. Na druhou stranu ani nejvyšší testované sterilaþní teploty nezabránily signifikantnímu zhoršení zejména organoleptických znakĤ tavených sýrĤ v situaci, kdy obsah pĜidaných redukujících sacharidĤ (v našem pĜípadČ laktózy) byl vyšší než 1,0 % w/w. ZávČr V dĤsledku sterilace došlo k hydrolýze pĜítomných proteinĤ, k tvorbČ tmavšího odstínu a ke zhoršení chuti a vĤnČ tavených sýrĤ ve srovnání s nesterilovanými vzorky. Klesala-li sterilaþní teplota s adekvátním prodloužením doby jejího pĤsobení za úþelem zachování konstantního smrtícího úþinku, pak byly výše zmínČné procesy intenzivnČjší a došlo k rozsáhlejšímu zhoršení jakosti sterilovaných výrobkĤ. PĜídavky laktózy zpĤsobily další pokles jakosti sterilovaných tavených sýrĤ, zvláštČ pokud byly vČtší než 1,0 % w/w. U nejvyšší použité sterilaþní teploty a nejkratší doby jejího pĤsobení (125°C 3,17 min) se testované charakteristiky vysterilovaných tavených sýrĤ zhoršily oproti nesterilovaným vzorkĤm jen v malé míĜe. Jakost sterilovaných tavených sýrĤ ošetĜených režimem 120°C 10 min byla pĜi pĜídavcích laktózy pod 1,0 % w/w rovnČž dobrá a akceptovatelná, a proto lze i tento režim doporuþit pro praxi. Nižší sterilaþní teploty zejména v kombinaci s vyšším testovaným obsahem laktózy však již neposkytovaly pĜijatelné produkty. PodČkování Práce vznikla za podpory projektu MŠMT: MSM 7088352101. Použitá literatura: 1. Guinee, T. P., Cariü, M., & Kaláb, M. (2004). Pasteureized processed cheese and substitute/imitation cheese products. In Fox, P.F. et al., Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology. Volume 2: Major cheese groups. 3. ed. (pp. 349–394). London: Elsevier Applied Science. 2. Bley, M. E., Johnson, M. E., & Olson, N.F. (1984). Factors affecting nonenzymatic browning of process cheese. Journal of Dairy Science, 68, 555–561. 3. Savello, P. A., Ernstrom, C. A., & Kaláb, M. (1989). Microstructure and meltability of model processed cheese made with rennet and acid casein. Journal of Dairy Science, 72, 1–11. 4. Schär, W., & Bosset, J. O. (2002). Chemical and physico-chemical changes in processed cheese and ready-made fondue during storage. A review. Lebensmittel Wissenschaft und Technologie, 35, 15–20. 5. BuĖka, F., HrabČ, J., & Kráþmar, S. (2004). The effect of sterilisation on amino acid contents in processed cheese. International Dairy Journal, 14, 829–831. 6. Gaillard, S., Leguérinel, I., Savy, N., & Mafart, P. (2005). Quantifying the combined effects of the heating time, the temperature and the recovery medium pH on the regrowth lag time of Bacillus cereus spores after a heat treatment. International Journal of Food Microbiology, 105, 53–58. 7. Zanoni, B., Pagliarini, E., Giovanelli, G., & Lavelli V. (2003). Modelling the effects of thermal sterilization on the quality of tomato puree. Journal of Food Engineering, 56, 203–206. 8. Efigênia, M., Povoa, B., & Moraes-Santos, T. (1997). Effect of heat treatment on the nutritional quality of milk proteins. International Dairy Journal, 7, 609–612. 9. Friedman, M. (1996). Food browning and its prevention. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44, 632–653. 10. Rufián-Henares, J. A., Guerra-Hernández, E., & García-Villanova, B. (2006). Available lysine and fluorescence in heated milk proteins/dextrinomaltose or lactose solutions. Food Chemistry, 98, 685–692. 11. Contarini, G., Povolo, M., Leardi, R., & Toppino, P. M. (1997). Influence of Heat Treatment on the Volatile Compounds of Milk. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45, 3171–3177.

69

12. Bylund, G. (1995). Dairy Processing Handbook. Lund (Sweden): Tetra Pak Processing Systems. 13. BuĖka, F., Pavlínek, V., HrabČ, J., Rop, O., Janiš, R., & Krejþí, J. (2007). Effect of 1-monoglycerides on viscoelastic properties of processed cheeses. International Journal of Food Properties, 10, 819–828. 14. Bütikofer U., Rüegg M., & Ardö Y. (1993). Determination of nitrogen fractions in cheese: evaluation of a collaborative study. Lebensmittel Wissenschaft und Technologie, 26, 271–275. 15. Laemmli U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680–685. 16. Kirkeby S., Moe D., & Bog-Hansen T. C. (1993). The silver staining procedure of sodium dodecyl sulfate gels may be accelerated by shortening fixation time. Electrophoresis, 14, 51–55. 17. Lee, S. K., Anema, S., & Klostermeyer, H. (2004). The influence of moisture content on the rheological properties of processed cheese spreads. International Journal of Food Science and Technology, 39, 763– 771. 18. Dimitreli, G., & Thomareis, A. S. (2007). Texture evaluation of block-type processed cheese as a function of chemical composition and in relation to its apparent viscosity. Journal of Food Engineering, 79, 1364–1373. 19. Molins, R.A. (1991). Phosphates in food. Boca Raton: CRC Press. 20. BuĖka, F., ŠtČtina, J., HrabČ, J. ZmČny barvy sterilovaných tavených sýrĤ bČhem dvouletého skladování In Sborník Celostátní pĜehlídky sýrĤ Mléko a sýry 2006. Praha: ýeská spoleþnost chemická, 2006, s. 192–198.

Kontaktní adresa: Ing. František BuĖka, Ph.D., Ústav potravináĜského inženýrství, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve ZlínČ, nám. T. G. Masaryka 275, 762 72 Zlín, tel. +420 576 031 528, e-mail: [email protected]

70

POROVNÁNÍ ORGANOLEPTICKÝCH A FYZIKÁLNċ-CHEMICKÝCH VLASTNOSTÍ NÁPOJģ NA BÁZI SYROVÁTKY KouĜimská Lenka, Legarová Veronika, DvoĜáková Blanka Katedra kvality zemČdČlských produktĤ, FAPPZ, ýeská zemČdČlská univerzita v Praze Comparison of organoleptic and physiochemical properties of whey based drinks Summary: Recombined sweet whey and its mixture with semi-skimmed milk (25 and 50 % of milk) were used for whey drinks preparation. Drinks were fermented by liquid thermophilic yoghurt culture KAN IV (Milcom a. s., Laktoflora ®) for 3 and 4 hours. Sensory profile of non-fermented and fermented drinks was assessed using unstructured graphical scales. Organoleptic properties of drinks were correlated with titratable and active acidities. Non-fermented drinks were preferred to fermented drinks. Drinks fermented for 4 hours were more pleasant than drinks fermented for 3 hours. Correlations between sour and sweet tastes and acidity were found.

Úvod Sladká syrovátka, jako vedlejší produkt pĜi výrobČ sýrĤ, pĜedstavuje velký zdroj bílkovin a nutriþnČ cenných látek využitelných ve výživČ þlovČka. Syrovátka zahrnuje 80 až 90 % zpracovávaného objemu mléka a obsahuje asi 50 % živin z mléka: rozpustné bílkoviny, laktosu, vitaminy a minerály1. PĜi experimentech na krysách, kterým byla výživa obohacena o sušené syrovátkové 2-4 proteiny , byl zjištČn vliv tČchto proteinĤ na redoxní parametry ve svalech (snížení oxidaþního stresu), celkovou tČlesnou hmotnost, rĤst svaloviny a s tím související stavbu tČla. Krysy pĜijímající syrovátkové bílkoviny mČly silnČjší svaly a lépe zvládaly fyzickou zátČž. Syrovátkové proteiny jsou nutriþnČ cenné také proto, že obsahují více aminokyselin s rozvČtveným ĜetČzcem (BCAA) v porovnání s kaseinovými bílkovinami2. Obsahují také dĤležité rĤstové faktory napĜíklad IGF (insulin like growth factor) nebo TGF (transforming growth factor)5. Pozitivní úþinek syrovátkových bílkovin byl zjištČn pĜi léþbČ rakoviny, hepatitidy, kardiovaskulárních onemocnČní, diabetu typu II, nefropatie, osteoporosy, hypercholesterolemie a žaludeþních vĜedĤ3. PĜi štČpení ț-kaseinu chymosinem pĜechází do syrovátky kaseinmakropeptid (CMP). Bylo zjištČno, že CMP pĤsobí jako bioaktivní peptid a mohl by být použit jako funkþní potravina6. I když se þást syrovátky stále využívá jako krmivo, má v potravináĜském prĤmyslu jako aditivum široké uplatnČní syrovátka sušená, syrovátkové koncentráty nebo frakce. Syrovátka se také používá jako surovina pro výrobu laktosy1. ýerstvou syrovátku je možno použít pro výrobu nápojĤ, které se i na našem domácím trhu objevují stále þastČji a získávají si své zákazníky. Materiál a metody V experimentu byly pĜipraveny za laboratorních podmínek nefermentované a fermentované syrovátkové nápoje, kde jako surovina byla použita rekombinovaná sušená syrovátka Lactosérum (Moravia Lacto a. s.) rozmíchaná v teplé pitné vodČ v pomČru 10 g syrovátky ve 100 ml teplé pitné vody. Tato syrovátka byla pĜípadnČ obohacena o pĜídavek þerstvého polotuþného kravského mléka (Jihoþeské lahodné mléko polotuþné, vysokotepelnČ pasterované, Madeta a. s.), který pĜedstavoval 25 % nebo 50 %. Nápoje byly ošetĜeny pasterací (78 °C, 30 sekund). Polovina nápojĤ byla fermentována pĜi 43 °C a pro fermentaci byla použita komerþnČ dostupná tekutá termofilní jogurtová kultura KAN IV (Milcom a. s., Laktoflora®). Fermentace byla ukonþena po 3 a 4 hodinách. Grafickou nestrukturovanou orientovanou stupnicí byl 20ti školenými hodnotiteli posuzován senzorický profil jak fermentovaných, tak nefermentovaných nápojĤ. Organoleptické vlastnosti byly porovnány s vlastnostmi fyzikálnČ-chemickými, hlavnČ titraþní a aktivní kyselostí ýSN 57 05307. Korelaþní koeficient byl vypoþítán za použití programu EXCEL (funkce CORREL).

71

Výsledky a diskuse PĜi porovnání fermentovaných a nefermentovaných nápojĤ byla barva, vĤnČ a konzistence všech fermentovaných nápojĤ hedonicky hodnocena jako pĜíjemnČjší (výjimka: 50 % mléka, fermentace 4 h). Celková pĜíjemnost chuti fermentovaných nápojĤ byla ale ve všech pĜípadech hodnocena hĤĜe. To se promítlo i do celkového hodnocení nápojĤ (obrázky 1 a 2), kde byly jako pĜíjemnČjší hodnoceny nápoje nefermentované (F0 = nefermentované nápoje, F3 = fermentace 3 h, F4 = fermentace 4 h). PĜídavek mléka (SM0 = bez pĜídavku, SM25 = pĜídavek 25 %, SM50 = pĜídavek 50 %) bez ohledu na fermentaci zvyšoval pĜíjemnost hedonického hodnocení nápojĤ. Mezi hodnotiteli bylo ale 66 % hodnotitelĤ, kteĜí hodnotili syrovátkové nápoje bez ohledu na fermentaci a pĜídavek mléka celkovČ nepĜíznivČ (oznaþili celkové hodnocení nápoje v intervalu od 0 do 50 %). Bude proto tĜeba do budoucna výsledky posuzovat i podle toho, zdali hodnotitelé vĤbec konzumují mléþné, pĜípadnČ fermentované výrobky. Celkové hodnocení nápoje (0 % = odporný, 100 % = velmi pĜíjemný) 100 90 80 F0

70

F3

[%]

60 50

F0 F3

40 F0 30

F3

20 10 0 SM0

SM25

SM50

Obr. 1. Celkové hodnocení syrovátkových nápojĤ nefermentovaných a fermentovaných 3 hodiny Celkové hodnocení nápoje (0 % = odporný, 100 % = velmi pĜíjemný) 100 F0

90 F0

80 70

[%]

60

F4 F0 F4

50 F4

40 30 20 10 0 SM0

SM25

SM50

Obr. 2. Celkové hodnocení syrovátkových nápojĤ nefermentovaných a fermentovaných 4 hodiny

PĜi intenzitním hodnocení byla u fermentovaných nápojĤ zjištČna vyšší intenzita syrovátkové vĤnČ, celkové chuti, syrovátkové, kyselé, trpké a svíravé chuti a celkové intenzity pachutí. U nefermentovaných nápojĤ byla zjištČna vyšší intenzita mléþné vĤnČ (výjimka: 50 % mléka, fermentace 4 h), mléþné a sladké chuti. PĜídavek mléka bez ohledu na fermentaci zvyšoval intenzitu barvy, mléþné vĤnČ a chuti. ZároveĖ snižoval intenzitu chuti syrovátkové, kyselé a svíravé, jakož i celkovou intenzitu pachutí. 72

Porovnáním nápojĤ fermentovaných 3 a 4 hodiny byla vĤnČ a konzistence nápojĤ fermentovaných 3 hodiny hedonicky hodnocena jako pĜíjemnČjší (výjimka: 50 % mléka, fermentace 4 h). Celková pĜíjemnost chuti byla lépe hodnocena u nápojĤ fermentovaných 4 hodiny. V celkovém hodnocení nápojĤ byly též jako pĜíjemnČjší hodnoceny nápoje fermentované 4 hodiny (obrázek 3). PĜídavek mléka bez ohledu na dobu fermentace zvyšoval pĜíjemnost celkového hedonického hodnocení nápojĤ. Celkové hodnocení nápoje (0 % = odporný, 100 % = velmi pĜíjemný) 100 90 80

F4

70 F4

[%]

60 50

F3

40 30

F3

F4 F3

20 10 0 SM0

SM25

SM50

Obr. 3. Celkové hodnocení syrovátkových nápojĤ a fermentovaných 3 a 4 hodiny

Rozdíly hodnot intenzit mezi vzorky fermentovanými 3 nebo 4 hodiny byly v mnoha pĜípadech zanedbatelné (syrovátková vĤnČ a chuĢ, mléþná chuĢ, celkové pachutČ). U nápojĤ fermentovaných 3 hodiny byla zjištČna vyšší intenzita mléþné vĤnČ a kyselé chuti, zároveĖ s nižší intenzitou sladké chuti (výjimka: 50 % mléka, fermentace 4 h). PĜídavek mléka bez ohledu na dobu fermentace zvyšoval intenzitu barvy, mléþné vĤnČ, mléþné a sladké chuti. ZároveĖ snižoval intenzitu chuti kyselé a svíravé, jakož i celkovou intenzitu pachutí. V tabulce I jsou uvedeny korelaþní koeficienty mezi dvČma vybranými organoleptickými vlastnostmi (sladká a kyselá chuĢ) a titraþní a aktivní kyselostí. Nejužší korelace byla zjištČna mezi kyselou chutí a hodnotami pH.

Tabulka I Korelaþní koeficienty závislosti sladké a kyselé chuti na titraþní a aktivní kyselosti syrovátkových nápojĤ Korelace

SH

pH

Sladká

-0,7656

0,9194

Kyselá

0,8000

-0,9225

Na obrázku 4 je vidČt, že hodnotitelé zĜetelnČ odlišili nápoje nefermentované (pH 6,0 až 7,0) od nápojĤ fermentovaných (pH kolem 4,0 až 5,0). Mezi nápoji fermentovanými 3 nebo 4 hodiny již prĤkazné rozdíly v intenzitČ chutí nejsou. DĤvodem mĤže být dosažení horního podnČtového práhu, rozdíly v pH menší než rozdílový práh nebo ovlivnČní jinými dílþími chutČmi.

73

90

Intenzita chuti [%]

80 70 60 50

Kyselá

40

Sladká

30 20 10 0 3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

Aktivní kyselost [pH]

Obr. 4. Závislost intenzity kyselé a sladké chuti na pH

ZávČr V experimentu byly nefermentované syrovátkové nápoje v porovnání s nápoji fermentovanými hodnoceny jako pĜíjemnČjší. PĜídavek mléka k syrovátce zlepšoval hedonické hodnocení organoleptických vlastností nápojĤ. Mezi fermentovanými nápoji byly senzoricky lépe hodnoceny nápoje fermentované 4 hodiny.

Použitá literatura: 1. Bylund, G. Dairy Processing Handbook. Tetra Pak Processing Systems AB, Lund, 1995, 436 s. 2. Kerksick, C. M., Rasmussen, C. J., Lancaster, S. L., Magu, B., Smith, P., Melton, C., Greenwood, M., Almada A. L., Earnest, C. P., Kreider, R. B. The Effects of Protein and Amino Acid Supplementation on Performance and Training Adaptations During Ten Weeks of Resistance Training. Journal of strength and Conditioning Research, 2006, vol. 20, No. 3, s. 643-653. 3. Elia, D., Stadler, K., Horváth, V., Jakus. J. Effect of Soy- and Whey Protein-isolate Supplemented Diet on the Redox Parameters of Trained Mice. Eur. J. Nutr., 2006, vol. 45, No. 5, s. 259-266. 4. Morifuji, M., Sakai, K., Sanbongi, C., Sugiura, K., Dietary Whey Protein Downregulates Fatty Acid Synthesis in the Liver, but Upregulates it in Skeletal Muscle of Exercise-trained rats. Nutrition, 2005, vol. 21, s. 1052-1058. 5. Gauthier, S. F., Pouliot, Y., Maubois, J.-L. Growth Factors from Bovine Milk and Colostrum: Composition, Extraction and Biological Activities. Lait, 2006, vol. 86, s. 99-125. 6. Martín-Diana, A. B., Gomez-Guillén, M. C., Montero, P., Fontecha, J. Vicsoelastic Properties of Caseinmacropeptide Isolated from Cow, Ewe and Goat Cheese Whey. J. Sci. Food. Agric., 2006, vol. 86, s. 1340-1349. 7. ýSN 57 0530 Metody zkoušení mléka a tekutých mléþných výrobkĤ. ýeský normalizaþní institut Praha, 1972, 100 s. Kontaktní adresa: Dr. Ing. Lenka KouĜimská, Katedra kvality zemČdČlských produktĤ, FAPPZ, ýZU v Praze, Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 – Suchdol, e-mail: [email protected].

74

HPLC STANOVENIE ANTIMIKROBIÁLNYCH LÁTOK PRODUKOVANÝCH BAKTÉRIAMI MLIEýNEHO KYSNUTIA Greif Gabriel, Krajþová Eva, Greifová Mária, Karoviþová Jolana Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, STU v Bratislave, SR HPLC determination of antimicrobial substances produced by lactis acid bacteria Summary: We have developed an HPLC method for simultaneous determination of glucose and phenyllactic (PLA), lactic and acetic acids. The analytes were detected on serially connected UV and RI detectors after separation on catex column (Polymer IEX H+). This improved chromatographic method allow separation and qantification of PLA with a recovery of 98, 4%. The metod is highly reproducible with an intraday repeatability of the total peak area of 1,58%, while the intererday repeatability of 2,08%. The intraday repeatability of peak heghts was 1,1%, their intererday repeatability was 1,59%.

Organické kyseliny majú veĐmi široké spektrum úþinku a potláþajú rast grampozitívnych i gramnegatívnych baktérií, kvasiniek i plesní. Tieto látky vo všeobecnosti vytvárajú nevhodné prostredie pre rast patogénnych a kontaminujúcich mikroorganizmov. Množstvo a typ produkovanej kyseliny závisí od kmeĖa, ktorý ju produkuje, od zloženia použitej zmesnej kultúry ako aj od podmienok kultivácie (1, 2, 3). Mechanizmom ich úþinku je znižovanie pH prostredia, ovplyvnenie protónového gradientu cytoplazmatickej membrány, okyslenie cytoplazmy a zásah do transportu cez cytoplazmatickú membránu. Okrem toho, že kyslé prostredie obmedzuje rast baktérií, podporuje aj pôsobenie ostatných antimikrobiálnych komponentov. Nižšie mastné kyseliny produkované BMK sú v kyslom prostredí málo disociované. Ich antimikrobiálny úþinok nie je natoĐko závislý od nízkej hodnoty pH, ako od samotnej mikrobicídnosti málo disociovanej molekuly kyseliny. Táto difunduje cez bunkovú membránu do bunky, v ktorej zníži pH- hodnotu a významne naruší jej metabolizmus, prípadne spôsobí až jej devitalizáciu (1, 2, 3). Kyselina mlieþna je hlavným produktom BMK, ktorý vzniká pri fermentaþných procesoch. Na zaþiatku fermentácie je disociovaná forma v rovnováhe s nedisociovanou formou. Rozsah disociácie závisí od pH prostredia. Pri nižšom pH je prítomné väþšie množstvo nedisociovanej formy, tým sa zvyšuje aj jej toxicita voþi prítomným mikroorganizmom. Rozdielnu úþinnosĢ majú aj jej stereoizoméry. L-forma je úþinnejšia ako D-forma (2, 3). Úþinok kyseliny octovej spoþíva v interakcii nedisociovaných molekúl s bunkovou membránou, neutralizácii elektrochemického protónového gradientu, nasleduje okyslenie cytoplazmy a porušenie transportu cez cytoplazmatickú membránu. Dochádza aj k zníženej absorpcii aminokyselín. Jej úþinok však závisí od nízkeho pH, spôsobeného prítomnosĢou kyseliny mlieþnej (3). Kyselina fenyl mlieþna je jedným z produktov BMK, ktoré sa tvoria poþas fermentácie, ale produkuje ju aj Geotrichum candidum. Poþas fermentácie sa tvorí D- a L-forma tejto kyseliny, priþom oba stereoizoméry pôsobia porovnateĐne na nežiaduce mikroorganizmy. Kyselina pôsobí spolu s ostatnými fermentaþnými produktmi, ktoré zvyšujú jej úþinnosĢ. Jej úþinok na mikrobiálnu bunku je podobný ako u predošlých kyselín. (4, 5, 6, 7). Lavermicocca et al (2000) zistil tvorbu kyseliny fenylmlieþnej a 4-hydroxy-fenylmlieþnej pri kultivácii Lactobacillus plantarum 21B, ktorá prejavila antifungálnu aktivitu voþi niektorým vláknitým hubám. Kyselina fenylmlieþna bola izolovaná aj zo supernatantov týchto kultúr: L.plantarum MiLAB 393, L coryniformis Si3 a u kmeĖov Pediococcus pentosaceus a L. sakei (3). Produkcia aktívnych zložiek v procese fermentácie baktériami mlieþneho kysnutia (BMK) s antagonistickým efektom voþi plesniam, kvasinkám a baktériám je v posledných rokoch cieĐom vedeckého výskumu (8-13). Kyseliny fenylmlieþna (PLA) a hydroxyfenylmlieþna (4-HPLA) boli zistené ako metabolity fenylalanínu a tyrozínu v procese zrenia syrov. Avšak, PLA je efektívnym markérom voþi listériám a plesniam. 75

CieĐ práce Využitie HPLC-UV/RID metódy pre stanovenie kyseliny fenylmlieþnej, 4-hydroxyfenylmlieþnej (4-HPLA), sacharidov a organických kyselín vybranými kmeĖmi baktérií mlieþneho kysnutia v MRS bujóne pri teplote 37 °C. Materiál a metódy Chemikálie: kyselina DL-3-fenylmlieþna, octová, glukóza monohydrát,

DL-mlieþnan

lítny (Sigma-Oldrich, Nemecko), kyselina

Kultivaþné médium: MRS bujón, Mikroorganizmy: Lactobacillus rhamnosus VT 1 (ÚTMT, VSCHT Praha, ýeská republika, Lactobacillus rhamnosus LC 705 Lactobacillus plantarum ALC 01 (Danisco, Nemecko), Lactobacillus plantarum CCM 7039, Lactobacillus amylophilus CCM 7001 (CCM-MU Brno, ýeská republika), Lactobacillus reuteri Protectis (Bio Gaia, Švédsko), Lactobacillus plantarum L21 (Danisco, Nemecko), Lactobacillus sp. (izolovaný z uhoriek v slanom náleve), Lactobacillus sanfrancisco (izolovaný z kvasníc). Predanalytická úprava vzorky: MRS bujón s testovanými mikroorganizmami sa odstredil pri 9000 ot.min-1. Supernatant sa prefiltroval cez mikrofilter (0,2 Pm) a následne aplikoval na kolónu. Podmienky analýzy: Pumpa: DeltaChrom™ SDS 030, manuálny dávkovaþ Rheodyne 7725i, dávkovacia sluþka 20 Pl, kolóna: Polymer IEX H+ (250 x 8 mm), vyhrievaþ kolóny DeltaChrom™ Temperature Control Unit (50±0,1 °C), mobilná fáza: 1 mM H2SO4, prietok mobilnej fázy: 1 cm3.min-1, detekcia: UV detektor Applied Biosystems 759A (261 nm) a refraktometrický detektor RI K-2301, PC a zberaþ dát v programe Clarity. Výsledky a diskusia Hlavným kritériom pri výbere BMK ako štartovacích kultúr je schopnosĢ rastu v komplexnom médiu a rýchlosĢ prekvášania substrátu s þím je spojená produkcia kyselín (predovšetkým kyseliny mlieþnej) a pokles pH (aktívnej kyslosti). Antimikrobiálna aktivita laktobacilov je daná predovšetkým produkciou organických kyselín (mlieþnej, octovej, propionovej, valérovej) a iných inhibiþných látok H2O2, CO2, diacetylu, bakteriocínov – nízkomolekulárnych látok na báze aminokyselín. V práci sme sa zamerali na využitie HPLC-UV/RID metódy pre súþasné stanovenie kyseliny fenylmlieþnej, sacharidov a organických kyselín vybranými kmeĖmi baktérií mlieþneho kysnutia v MRS bujóne pri teplote 37 °C. Výsledky analýz sú uvedené na obr. 1 – 3. Jednotlivé analyty boli pri použití danej metódy z kolóny eluované nasledovne: glukóza (4,9 min), kyselina mlieþna (6,8 min), kyselina octová (8,2 min) a kyselina DL-3-fenylmlieþna (23 min).

76

A

800

Voltage [mV]

600

400

PLA

200

0 0

5

10

15

20

25

30

25

30

Time [min]

B

800

Voltage [mV]

600

400

PLA

200

0 0

5

10

15

20

Time [min]

Obr. 1. HPLC UV chromatogramy štandardu kyseliny vo vode (A) a kvapalnom MRS bujóne (B)

DL-3-fenylmlieþnej

(PLA) (1,22 mM)

Vyššia citlivosĢ UV detektora pri 210 nm ako RI detektora (obr. 1B a 2) dáva možnosĢ kvantitatívneho stanovenia kyseliny DL-3-fenylmlieþnej ale aj kyseliny mlieþnej a octovej. Avšak, UV detektorom nie je možné stanovenie glukózy a iných sacharidov (laktóza, galaktóza) prítomných napr. v mlieku. Separácia vybraných sacharidov, organických kyselín a etanolu je dokumentovaná na obr. 4.

77

800

Voltage [mV]

600

400

200 PLA

0 0

5

10

15

20

25

30

Time [min]

Obr. 2. HPLC UV chromatogram MRS bujónu po 72 h kultivácie pri 37 °C s Lactobacillus plantarum L2 1 300 KM 250

Voltage [mV]

200

150

100

50

Glu

KO

0 0

5

10

15

20

25

30

Time [min]

Obr. 3. HPLC - RI chromatogram MRS bujónu po 72 h kultivácii pri 37 °C s Lactobacillus plantarum L2 1; glukóza (Glu), kyselina mlieþna (KM), kyselina octová (KO) Produkcia kyseliny DL-3-fenylmlieþnej, kyseliny mlieþnej vybranými kmeĖmi BMK a zostatková koncentrácia glukózy v MRS bujóne po 72 hodinách kultivácie sú uvedené v Tab. I. Vo väþšine prípadov zostatková koncentrácia glukózy bola nižšia ako detekþný limit danej metódy.

78

60 4 3 1 Voltage [mV]

40

2 5

20 6 7 0

0

5

10

15

20

25

30

Time [min]

Obr. 4. HPLC - RI chromatogram štandardov: laktóza (1), glukóza (2), galaktóza (3), k. mlieþna (4), k. octová (5), etanol (6), k. DL-3-fenylmlieþna (7)

Tab. I Obsah organických kyselín a glukózy v MRS bujóne pri 37 °C (72 h kultivácie) K. DL-fenylmlieþna Mikroorganizmus

Glukóza

K. mlieþna

mmol.dm-3

L. rhamnosus VT 1

0,275 ± 0,009

0,003 ± 0,001

0,165 ± 0,009

Lactobacillus sp.

0,330 ± 0,008

ND

0,169 ± 0,010

L. sanfrancisco

0,659 ± 0,008

0,007 ± 0,003

0,163 ± 0,008

L. reuteri

0,647 ± 0,009

ND

0,153 ± 0,007

L. rhamnosus LC 705

0,272 ± 0,008

0,015 ± 0,006

0,135 ± 0,011

L. plantarum L2-1

0,744 ± 0,006

ND

0,169 ± 0,009

L plantarum CCM 7039

0,489 ± 0,009

ND

0,168 ± 0,010

L. amylophilus CCM 7001

0,341 ± 0,009

ND

0,169 ± 0,011

L. plantarum ALC 01

0,246 ± 0,009

ND

0,161 ± 0,012

ND – nedetekovateĐné množstvo Záver Bola vypracovaná selektívna a dostatoþne citlivá metóda pre stanovenie kyseliny fenylmlieþnej, glukózy a organických kyselín (kyselina mlieþna a octová) vybranými kmeĖmi baktérií mlieþneho kysnutia v MRS bujóne. Pri on-line zapojení detektorov UV a RI je možná súþasná detekcia kyseliny fenylmlieþnej, glukózy ale aj laktózy, galaktózy a organických kyselín (kyselina mlieþna a octová) v kultivaþnom médiu (napr. MRS). Produkcia PLA môže byĢ selekþným kritériom pri výbere BMK v potravinárskom priemysle. 79

Použitá literatúra 1. Kazatelová M.: Produkty metabolismu bakterií mléþného kvašení s antimikrobiální aktivitou. Bulletin of Food Research, 42(1-2), 2003, 67-73. 2. Görner, F.- Greifová, M.: Systémy a látky inhibujúce rast a metabolizmus mikroorganizmov v požívatinách. Bulletin potravinárskeho výskumu, 33(1-2), 1994, 7-19. 3. Schnürer, J.- Magnusson, J.: Antifungal lactic acid bacteria as biopreservatives. Trends in Food Science & Technology, 2005, 1-9. 4. Dieuleveux, V.- Lemarinier, S.- Guéguen, M.: Antimicrobial spectrum and target site of D-3phenyllactic acid. International Journal of Food Mikrobiology, 40, 1998, 177-183. 5. Lavermicocca, P.- Valerio, F.- Visconti, F.: Antifungal Activity of Phenyllactic acid against Molds Isolated from Bakery Products. Applied And Environmental Mikrobiology, 2003, 634-640. 6. Dieuleveux, V.- Van der Pyl, D.- Chataud, J.- Gueguen, M.: Purification and charakterization of AntiListeria compounds producted by Geotrichum candidum. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 800-803. 7. Ström, K.- Sjögren, J.- Broberg, A.- Schnürer, J.: Lactobacillus plantarum MiLAB 393 Produces the Antifungal Cyclic Dipeptides Cyclo(L-Phe-L-Pro) and Cyclo(L-Phe-trans-4-OH-L-Pro) and 3Phenyllactic acid. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 4322-4327. 8. Martín, R.- Olivares, M.- Marín, M.L.- Xaus, J.- Fernández, J.- Rodríguez, J.M.: Characterization of reuterin- producing Lactobacillus coryniformis strain isolated from a goat`s milk cheese. International Journal of Food Mikrobiology, 104, 2005, 267-277. 9. Cleveland, J.- Montville, T.J.- Nes, I.F.- Chikindas, M.L.: Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation. International Journal of Food Microbiology, 71, 2001, 1-20. 10. Rodríguez, E.- González, B.- Gaya, P.- NuĖez, M.- Medina, M.: Diversity of bacteriocins produced by lactic acid bacteria isolated from raw milk. International Dairy Journal, 10, 2000, 7-15. 11. Plocková M., Chumchalová J., Stiles J.: Hodnocení antifungální aktivity bakterií mléþného kvašení metodou mléþných agarových ploten. MlékaĜské listy, 62, 2000, 16-19. 12. Plocková M., Stiles J., Chumchalová J., Halfarová R.: Kontrola rĤstu plísní kmeny Lactobacillus rhamnosus VT1 a Lactobacillus reuteri CCM 3625 sledovaná metodou mléþných agarových ploten. Czech J. Food Sci., 19, 2001, 46-50. 13. Hudáþek J., Zalán Z., Štetina J., Chumchalová J., Halász A.: Sledování produkce organických kyselin kmeny Lactobacillus v rĤzných médiích. In: „Výsledky pĜehlídek a sborník pĜednášek Mléko a sýry 2006“. VŠCHT Praha, s.234-238.

Poćakovanie: Táto práca bola podporená grantom VEGA 1/3546/06 Kontaktná adresa: Ing. Gabriel Greif, PhD., FCHPT STU v Bratislave, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, SR. e-mail: [email protected]

80

ANTIMIKROBIÁLNY ÚýINOK KYSELINY FENYL MLIEýNEJ Krajþová Eva, Greifová Mária, Greif Gabriel, Schmidt Štefan Slovenská technická univerzita, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Ústav biochemickej technológie a potravinárstva, Oddelenie potravinárskej technológie, Bratislava Antimicrobial effect of phenyllactic acid Summary: The main goal of this work was to observe antifungal and antimicrobial activity of phenyllactic acid against selected filamentous fungi and bacteria and influence of different pH value. Antifungal activity of the acid decreased with increasing pH value. The most sensitive against phenyllactic acid were Alternaria alternata (83% - inhibition), Fusarium nivale (70%) and Cladosporium herbarum (79%). The smallest effect of the acid was observed against Penicilium funiculosum (28%). The best antimicrobial effect of phenyllactic acid was against Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes. The antimicrobial effect of tested acid increased with increased concentration.

Úvod Kyslomlieþne baktérie boli používané v procese fermentácie potravín a krmovín už dávno predtým, kedy ešte neboli poznatky o týchto baktériach. Používanie fermentaþního procesu sa rozvíjalo v priebehu niekoĐko storoþí a zahĚĖa veĐa rozdielnych druhov krmovín a potravín. V priebehu minulého storoþia bolo dokázané, že kyslomlieþne baktérie sú zodpovedné za fermentáciu a majú biokonzervaþný úþinok využívaný v poþetných potravinových a krmovinových procesoch. Biokonzervácia slúži na predĎženie trvanlivosti a na zvýšenie bezpeþnosti potravín použitím prirodzenej alebo pridanej mikroflóry a ich antimikrobiálnych produktov [1]. Konzervaþný úþinok je spôsobený redukciou pH v priebehu tvorby slabých organických kyselín. Antimikrobiálny úþinok KMB nie je natoĐko závislý od nízkej pH-hodnoty prostredia, ako od samotnej mikrobicídnosti nedisociovaných kyselín. Nedisociované kyseliny prenikajú buneþnou membránou a narúšajú trans-membránový potenciál [2]. Vlaknité huby a kvasinky sú hlavné organizmy, ktoré spósobujú kazenie potravín a to fermentovaných mlieþnych výrobkov, syrov, chleba,skladovaných plodín a krmovín. Nežiadúce rody húb sú Aspergillus, Cladosporium, Endomyces, Fusarium, Monilia, Mucor, Penicilium a Rhizopus. Hlavné fyzikálne metódy (zahrievanie, chladenie, sušenie, balenie, skladovanie vo vákuu, zmrazovanie) chránia výrobky pred plesĖami, ale kysnutie ako prírodný spôsob ochrany sa zdá byĢ najlepšia ochrana pred nežiadúcimi pleskami [3]. CieĐom našej práce bolo sledovaĢ antifungálny a antimikrobiálny úþinok kyseliny fenylmlieþnej voþi vybraným druhom plesní a patogénom v závislosti od rôzneho pH. Materiál a metódy Indikátorové mikroorganizmy: Aspergillus flavus CCM F-108; Penicillium fumiculosum CCM F-161; Alternaria alternata KBM 2/91; Rhizopus oryzae KBM1/90; Fusarium nivale KBM 1/89, Cladosporium herbarum KMB 2/90, Mucor racemosus KBM 1/90, Listeria monocytogenes NCTC 4886, Staphylococcus aureus CCM 3953. Príprava spórovej suspénzie rôznych vláknitých húb: 5 ml 0,1 %-ného vodného roztoku Tweenu 80 sa naleje na vyrastenú kolóniu vláknitej huby a bakteriologickým oþkom sa uvolnia spóry z mycélia. Suspenzia sa prefiltruje do skúmaviek cez 3-krát preloženú gázu. Poþet spór sa zisti priamym poþítaním v Bürkerovej komôrke [4]. Diluþná metóda stanovenia antifungálnej aktivity kyseliny fenylmlieþnej: Do Petriho misiek sa naleje 10 ml sterilného Sabouroado-glukozového agaru v ktorom je rôzna 81

koncentrácia kyseliny DL fenylmlieþnej. Použité koncentrácie uvedenej kyseliny v médiu boli 10, 7, 5, 2,5 mg/ml. Tiež sa menilo pH živnej pôdy (4, 4,5 a 5,5). Po stuhnutí živnej pôdy sa do stredu Petriho misiek umiestnia sterilné papierové disky (Whatman 1) priemeru 5 mm, ktoré sa následne inokulujú 5 Pl spórovej suspenzie (cca 103 spór/disk). Huby sa kultivujú statický pri teplote 25 °C a kinetika ich rastu v prítomnosti testovaných zlúþenín a bez nich sa sleduje meraním priemeru rastúcej kolónie v pravidelných þasových intervaloch. Zo získaných hodnôt sa zostroja rastové krivky a antifungálna úþinnosĢ sa charakterizuje pomocou hodnôt IC50 a MIC [4]. Mikrotitraþná metóda stanovenia antimikrobiálnej aktivity kyseliny fenylmlieþnej: Antimikrobiálny efekt testovanej kyseliny sa sledoval použitím mikrotitraþnej metódy v 96 jamkových mikrotitraþných platniþkách. Indikátorové mikroorganizmy sa kultivovali v BHI bujóne pĜi 37°C poþas 12 hodín. Na testovanie sa použila vždy þerstvá 12-16 hodinová noþná kultúra. Z nej sa pĜed testovaním pripravovalo inokulum so vstupnou koncentriáciou buniek 108 KTJ/ml. 20ȝl tejto suspenzie sa pridalo k 180ȝl testovanej kyseliny, ktorej pH sa upravilo na sledovanú hodnotu a kultivovalo sa 12 hodín stacionárnou kultiváciou. Následne sa v zvolených þasových intervaloch merala absrobancia pri 630nm v dvoch paralelkách. Z nametaných údajov sa vypoþítali charakteristiky rastu, ktoré reprezentujú antimikróbny efekt testovanej kyseliny [4]. Výsledky Antifungálna aktivita kyseliny fenylmlieþnej: Diluþnou metódou bola testovaná antifungálna aktivita kyseliny fenylmlieþnej voþi zvoleným vláknitým hubám: Aspergillus flavus, Penicillium fumiculosum, Alternaria alternata, Rhizopus oryzae, Fusarium nivale, Cladosporium herbarum, Mucor racemosus. Na testovanie sa použilo päĢ rôznych koncentrácií kyseliny (20; 10; 7; 5; 2,5 mg/ml). ÚþinnosĢ kyseliny sa testovala pri pH 4, 4,5 a 5,5. Ako kontrola (K1) sa použila živná pôda bez prídavku kyseliny fenylmlieþnej a bez úpravy pH a ako kontrola (K2) živná pôda bez prídavku kyseliny fenylmlieþnej s úpravou pH, aké bolo testované. Výsledky sú názorne ukázané iba pre Cladosporium herbarum (obr.1, tab. I). K1 K2 10 mg/ml 7 mg/ml 5 mg/ml 2,5 mg/ml

50

30

priemer plesne (mm)

priem er plesne (mm )

40

K1 K2 10 mg/ml 7 mg/ml 5 mg/ml 2,5 mg/ml

50

20

10

40

30

priemer plesne (mm)

K1 K2 10 mg/ml 7 mg/ml 5 mg/ml 2,5 mg/ml

50

20

2

4

6

8

þas (dni)

(A)

10

12

20

0

0

0

30

10

10

0

40

0

2

4

6

8

þas (dni)

(B)

10

12

0

2

4

6

8

10

12

þas (dni)

(C)

Obr. 1. Rastové krivky pre Cladosporium herbarum na Sabourodovom agare pri rôznej koncentrácii kyseliny fenylmlieþnej a pH 4 (A), pH 4,5 (B) a pH 5,5 (C) média, t=25 °C

82

Tabulka I Percento inhibície plesne Cladosporium herbarum kyselinou fenylmlieþnou. inhibícia (%) Cladosporium herbarum koncentrácia kyseliny pH4 pH4,5 pH5,5 fenylmlieþnej (mg/ml) 10 79,69 57,91 16,80 7 60,15 37,45 9,16 5 46,62 26,64 7,65 2,5 24,81 9,65 3,06 IC50(mg/ml) 5,8 8,6 >10

Antimikrobiálna aktivita kyseliny fenylmlieþnej: Na zistenie antimikrobiálného úþinku testovanej kyseliny na Staphylococcus aureus sa použila mikrotitraþnámetóda. Následne sa z rastovej krivky vypoþítali charakteristiky rastu pre jednotlivé pH. Ich provnaním sa zistilo, že testovaná kyselina mala najvyšší inhibiþný úþinok pri pH 4,5 a naopak najnižší pri pH 6,5. Z þoho vyplýva, že zníženie pH výrazne zvýši jej inhibiþný úþinok. Dochádza k výraznemu zníženiu rýchlosti rastu a k predĎženiu lag fázy. Pri vyššom pH sa zníži inhibiþný úþinok kyseliny fenylmlieþnej aj pri použití vyšších koncentrácií. Pri nízkom pH boli veĐmi úþinné aj nižšie koncentrácie kyseliny a výrazne inhibovali rast Staphylococcus aureus (obr.2). þistý bujón pH7,4 20mg/ml, pH6,5 10mg/ml, pH6,5 7mg/ml, pH6,5 5mg/ml, pH6,5 2,5mg/ml,pH6,5 þistý bujón pH6,5

1,6 1,4 1,2

1,4

1,2

þistý bujón pH7,4 20mg/ml, pH4,5 10mg/ml, pH4,5 7mg/ml, pH4,5 5mg/ml, pH4,5 2,5mg/ml,pH4,5 þistý bujón pH4,5

1,6 1,4

1,2

1,0

0,8 0,6

A630

1,0

A630

A630

1,0

þistý bujón pH7,4 20mg/ml, pH5,5 10mg/ml, pH5,5 7mg/ml, pH5,5 5mg/ml, pH5,5 2,5mg/ml,pH5,5 þistý bujón, pH5,5

0,8

0,6

0,8 0,6

0,4 0,4

0,4

0,2 0,2

0,2

0

2

4

6

8

10

12

0

2

4

(A)

6

8

10

12

0

2

4

þas (h)

þas (h)

(B)

6

8

10

12

þas (h)

(C)

Obr. 2. Rastové krivky pre Staphylococcus aureus pri rôznej koncentrácii kyseliny fenylmlieþnej a pH 6,5 (A), pH 5,5 (B) a pH 4,5 (C) média

Záver Kyslomlieþne baktérie majú vo fermentovaných potravinách mnoho potenciálnych využití, pretože znaþne ovplyvĖujú nutriþné a senzorické vlastnosti ako aj trvanlivosĢ produktov. Sú známe tým, že produkujú bioaktívne molekuly, ktoré majú antimikrobiálny úþinok proti nežiadúcim a patogénnym mikroorganizmom. Ström a kol. [5] sa venovali antifungálnemu úþinku KMB a dokázali, že sledovaný mikroorganizmus pôsobil inhibiþne voþi niektorým kmeĖom kvasiniek a plesní. Zistilo sa, že antmikrobiálny úþinok a antifungálny úþinok kyseliny fenylmlieþnej sa znaþne menil v závislosti od meniaceho pH. Lavernicocca a kol. [6] sa venovali vplyvu pH na antimikrobiálnu aktivitu kyseliny fenylmlieþnej o koncentrácií 20 mg/ml. Sledovali úüinnosĢ kyseliny v rozpätí pH 2,6-5,5. Dokázali, že kyselina bola najúþinejšia pri pH 2,6 a jej úüinnosĢ postupne klesala so zvýšujúcim pH.

83

Poćakovanie: Táto práca bola podporená Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy þ. APVV0310-06" a grantom VEGA þ. 1/0746/08. Použitá literatúra: 1. Carr, F. J. – Chill, D. - Maida, N.: The lactic acid bacteria: a literature survey. Critical reviews in Microbiology, 28, 2002, s. 281- 370. 2. Görner. F. – Greifová, M.: Systémy a látky inhibujúce rast a metabolizmus mikroorganizmov v poživatinách, Bulletin potravinárskeho výskumu, 33, 1994, s. 7-19. 3. Corsetti, A. – Gobebetti, M. – Rossi, J. – Damiani, P.: Antimould activity of sourdough lactic acid bacteria: Identification of a mixture of organic acids produced by Lactobacillus sanfrancisco CB1. Applied Microbiology and Biotechnology, 50, 1998, s. 253- 256. 4. Betina, V. : Mikrobiologické laboratórne metódy. Alfa Bratislava, 1987, s. 544. 5. Ström, K. – Sjögren, J. – Broberg, A. – Schnürer, J.: Lactobacillus plantarum MiLAB 393 produces the antifungal cyclic dipeptides cyclo (L-Phe-L-Pro) and cyclo (L-Phe-trans-4-OH-L- Pro) and 3-pnenyllactic acid. Applied and Enviromental Microbiology, september, 2002, s. 4322-4327. 6. Lavernicocca, P. –Valerio, F. – Visconti, F.: Antifungal activity of pheyllactic acid against molds isolated from bakery products. Applied and Enviromental Microbiology, january, 2003, s. 634-640.

Kontaktní adresa: Eva Krajþová, Slovenská technická univerzita, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Radlinského 9, 831 02 Bratislava, eva.krajcova@ stuba.sk

84

MINORITNÍ SLOŽKY MLÉýNÉHO TUKU, KYSELINA 11-CYKLOHEXYLUNDEKANOVÁ ZVLÁŠTċ Šmidrkal Jan, Karlová Tereza, Filip Vladimír, Zárubová Markéta Ústav technologie mléka a tukĤ, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Minor Components of Milk Fat, particularly 11-Cyclohexylundecanoic Acid Summary: In an ongoing discussion if it is butter (milk fat) or margarine (plant fat) that is optimal for our diet. The fact that the milk fat contains many minor fatty acids is mostly neglected. The 11- cyclohexaneundecanoic acid is contained in cow milk fat in amount 0.1-0.2%. It is also contained in human milk. This acid was synthesized and its antimicrobial properties was investigated.

1. Úvod Mléþný tuk [1] obsahuje vysoký podíl nasycených mastných kyselin (70 - 75 %), ménČ mononenasycených mastných kyselin (20 - 25 %) a malé množství polynenasycených mastných kyselin (0 - 5 %). Dále obsahuje vedle majoritních mastných kyselin, které jsou obsaženy i v rostlinných olejích, Ĝadu dalších minoritních mastných kyselin (poþet cca 40, obsah celkem cca 10 %). Jednotlivé minoritní mastné kyseliny jsou obsaženy v množstvích od 0,01 % (což je spodní mez detekovatelnosti GLC) do cca 1 %. Tyto ménČ obvyklé mastné kyseliny mají 12 – 26 uhlíkových atomĤ, jsou nasycené i nenasycené (obsahují až 6 dvojných vazeb) a jsou lineární i rozvČtvené. Zcela výjimeþné jsou v této ĜadČ dvČ oxokyseliny (8-keto16:0 a 10-keto18:0) a jediná cyklická kyselina (11-cyklohexylundekanová, 11-cyklohexyl 11:0). Strukturní vzorce nČkterých výše uvedených ménČ obvyklých minoritních karboxylových kyselin mléþného tuku jsou uvedeny na následujícím obrázku 1. Zkratka kyseliny Název kyseliny

Obsah v mléþném tuku [%]

18:1trans-11 kyselina vakcenová

Strukturní vzorec

COOH

1,04

3,7,11,15-tetramethyl 16:0 kyselina phytanová

0,05

10-keto18:0 kyselina 10-oxostearová)

0,09

COOH

COOH O

11-cyklohexyl 11:0 kyselina 11-cyklohexylundekanová

COOH

0,18

Obr.1 NČkteré minoritní mastné kyseliny mléþného tuku [1] Uvedené minoritní mastné kyseliny, zjednodušenČ Ĝeþeno, vlastnČ odlišují mléþný tuk (máslo) od emulgovaných rostlinných tukĤ (margarínĤ) a mj. pĜedstavují jeho nefalšovatelné markery. O funkci tČchto minoritních kyselin v mléce a jejich významu pro lidskou výživu je minimum informací. Výrobci emulgovaných tukĤ zdĤrazĖují, že tyto tuky jsou zdrojem omega 3 a omega 6 nenasycených mastných kyselin (ty jsou v ĜadČ nativních rostlinných olejích obsaženy ve zvýšené míĜe) a deklarují obsažená aditiva, napĜ. vitaminy. Údaj o tom že výrobek je roztíratelný rostlinný tuk je uveden na spodní stranČ drobnými písmeny. Výrobci másla na obale pouze uvádČjí, že je to máslo. O tom, že mléþný tuk obsahuje mastné kyseliny (tedy jejich acyly), které mohou mít význam pro lidské zdraví není uvedeno nic. Publikované práce se zabývají hlavnČ nutriþním významem majoritních mastných kyselin [2-4]. 85

Mezi minoritními mastnými kyselinami mléþného tuku je unikátní kyselina 11-cyklohexylundekanová (obsah v mléþném tuku 0,1 – 0,2 %), která je jedinou cyklickou mastnou kyselinou obsaženou v mléþném tuku [1,5]. Poprvé byla izolována z mléþného tuku roku 1965 holandskýcmi autory [5]. Kyselina 11-cyklohexylundekanová je rovnČž s kyselinou phytanovou složkou lidského mateĜského mléka [6]. V lipidech produkovaných bakteriemi Bacillus acidocaldarius [7] a Curtobacterium pusillum [8] se tato kyselina vyskytuje jako majoritní mastná kyselina (až 96 %, [8]). COOH

COOH kyselina hydnokarpová

kyselina chaulmugrová

COOH kyselina dihydrochaulmugrová

COOH kyselina dihydrohydnokarpová

Obr.2 Analogy kyseliny 11-cyklohexylundekanové Kyselina 11-cyklohexylundekanová je strukturnČ blízká kyselinČ chaulmoogrové a dihydrochaulmoogrové a kyselinČ hydnokarpové a dihydrohydnokarpové (obr. 2). Kyselina chaulmoogrová (její acyl) je složkou chaulmoogrového oleje (Hydnocarpus kurzii (King) Warb. (Flacourtiaceae)), který se užíval v lidové medicinČ proti lepĜe (Mycobacterium leprae) [9]. Na základČ strukturní analogie lze pĜedpokládat, že i kyselina 11-cyklohexylundekanová mĤže mít antimikrobiální vlastnosti. Rozhodli jsme se proto kyselinu 11-cyklohexylundekanovou pĜipravit a ovČĜit její pĜípadné antimikrobiální úþinky. 2. Syntéza kyseliny 11-cyklohexylundekanové Holandští autoĜi [5], kteĜí kyselinu 11-cyklohexylundekanovou izolovali z mléþného tuku, urþilili její strukturu nejen spektrálnČ, ale porovnali izolovanou látku se synteticky pĜipraveným produktem, a potvrdili tak správnost její struktury i pomocí smČsného bodu tání jak samotné kyseliny tak i jejího anilidu. PĜi totální syntéze byla výchozí látkou kyselina 10-fenyldekanová, kterou hydrogenovali (PtO2, 150 °C, 10 Mpa) na kyselinu 10-cyklohexyl-dekanovou a tu pĜevedli Arndt-Eistertovou syntézou na methyl-11-cyklohexylundekanoát, který pak hydrolyzovali na žádanou kyselinu. Kratší totální syntézu publikovali v roce 2004 nČmeþtí autoĜi [10], kteĜí kyselinu 11-cyklohexylundekanovou pĜipravili reakcí cyklohexyl-chloroformiátu a kyseliny 10-undecenové. Na našem ústavu jsme pro syntézu kyseliny 11-cyklohexylundekanové použili modifikovaný postup nČmeckých autorĤ [10], pĜi kterém byl ethylaluminium sesquichlorid použit jako hexanový roztok (0,4 mol.l-1). Problém není se samotnou reakcí, ale izolací þisté kyseliny 11-cyklohexylundekanové, kterou je nutné pracnČ pĜeþistit chromatograficky. Od výchozí nezreagované kyseliny 10-undecenové se dČlí velmi špatnČ, oba pásy jsou blízko sebe. Na TLC Kieselgel 60, hexan-ethylacetát, 7:3 v/v (detekce 5% roztokem kyseliny fosfomolybdenové v ethanolu a zahĜátím) má kyselina 11-cyklohexylundekanová Rf = 0,45 a kyselina 10-undecenová Rf = 0,40. Bod tání kyseliny 11-cyklohexylundekanové závisí na její þistotČ, 1. podíl o þistotČ 99,5 % mČl b.t. 55,5-57,0 °C, 2. podíl o þistotČ 98,4 % mČl b.t. 54,5-56,0 °C; lit. [5] uvádí 55,4-56,6 °C (syntetická), 53,4-54,0 °C (izolovaná), [11] b.t. 58-59 °C, [10] b.t. 35-37 °C. O

Cl O

cyklohecyl-chloroformiát

COOH

COOH

+

kyselina 11-cyklohexylundekanová

kyselina 10-undecenová

Obr.3 Syntéza kyseliny 11-cyklohexylundekanové 86

3. Antimikrobiální vlastnosti kyseliny 11-cyklohexylundekanové Porovnání antimikrobiálních vlastností kyseliny 11-cyklohexyludekanové a mastných kyselin C11:1 a C10:0-C16:0 je uvedeno na „mapČ“ na obr. 4, kde je inhibiþní úþinek jednotlivých kyselin vyznaþen intenzitou barvy pole.

Slouþenina

MK C11:1 C10:0 C11:0 C12:0 C13:0 C14:0 C16:0 11-Cyc

Bacillus cereus DMF 2001 c [mmol/l] 0,05 0,10 0,20 0,40

Slouþenina

0,80

MK C11:1 C10:0 C11:0 C12:0 C13:0 C14:0 C16:0 11-Cyc

c

Saccharomyces cerevisieae DMF 2880 c [mmol/l] MK 0,05 0,10 0,20 0,40 0,80 C11:1 c C10:0 c c C11:0 C12:0 C13:0 C14:0 C16:0 11-Cyc

0,80

Fusarium culmorum DMF 0103 c [mmol/l] MK 0,05 0,10 0,20 0,40 0,80 c c c C11:1 c c C10:0 c c c C11:0 C12:0 C13:0 C14:0 C16:0 11-Cyc

Slouþenina

Inhibice [%] 0 - 10 10-25 25 - 50 50 - 90 > 90 c

Escherichia coli DMF 7503 c [mmol/l] 0,05 0,10 0,20 0,40

Slouþenina

11-Cyc = kys. 11-cyklohexyundekanová

Obr. 4 Porovnání antimikrobiálních vlastností testovaných kyselin. Antimikrobiální úþinky kyseliny 11-cyklohexylundekanové byly srovnávány s úþinky nasycených mastných kyselin, které se vyskytují v mléþném tuku: kaprinové, undekanové, laurové, tridekanové, myristové a palmitové a pro srovnání ještČ s kyselinou 10-undecenovou, která není složkou lipidĤ, ale je známá svými antimikrobiálními úþinky. ýistota tČchto látek byly min.99 %. Jako testované mikroorganismy byly vybrány : Bacillus cereus DMF 2001 jako zástupce G+ baktérií, Escherichia coli DMF 7503 jako zástupce G- baktérií, jako zástupce kvasinek byl vybrán kmen Saccharomces cerevisiae DMF 2880 a z vláknitých hub kmen Fusarium culmorum DMF 0103. Ke stanovení antimikrobiální aktivity testovaných látek byla použita spektrofotometrická metoda. Inokulum, resp. suspenze spor, bylo zaoþkováno do sady zkumavek obsahujících tekuté medium (Nutriet broth pro bakterie, Malt extrakt broth pro kvasinku a plíseĖ) s danou koncentrací testovaných karboxylových kyselin (karboxylové kyseliny byly rozpuštČny v ethanolu, jehož finální koncentrace v mediu þinila 2 %. Antimikrobiální úþinek ethanolu byl eliminován slepým pokusem). Z tČchto zkumavek byly naplnČny sterilní mikrotitraþní destiþky, ve kterých probíhala kultivace i mČĜení absorbance pomocí pĜístroje PowerWave XS (650 nm - bakterie, 630 nm - kvasinka a plíseĖ). Po urþitých þasových intervalech byla promČĜována absorbance. Ke zvýšení pĜesnosti mČĜení byla absorbance v každé jamce mČĜena 25x a výsledná absorbance byla vyjádĜena jako 87

prĤmČr. Výsledky byly poté statisticky zpracovány. K vylouþení odlehlých hodnot byl použit DixonĤv test s hladinou významnosti 0,05 [13]. Data byla vyhodnocena pomocí poþítaþového programu Microsoft Excel.Výstupem byly kĜivky závislosti absorbance na þase (72 h – bakterie, 240 h – kvasinka a plíseĖ). Pro srovnání inhibiþních úþinkĤ testovaných látek byly vypoþteny plochy pod jednotlivými rĤstovými kĜivkami pro jednotlivé koncentrace použitých látek a po srovnání s kontrolou (bez pĜídavku antimikrobiální látky) byly vypoþteny procentuální inhibice rĤstu kultury. Je vidČt, že i když kyselina 11-cyklohehylundekanová, nedosahuje inhibiþní úþinnosti kyselin C11:1, C10:0 a C11 tak nepochybnČ inhibiþní úþinek má a to v celém rozsahu koncentrací na Bacillus cereus, Escherichia coli a Fusarium culmorum. 4. ZávČr Bylo zjištČno, že kyselina 11-cyklohexylundekanová má inhibiþní úþinek již od koncentrace 0,05 mmol.l-1na Bacillus cereus, Eschericia coli a Fusarium culmorum. Pozoruhodný je zejména její úþinek v celém rozsahu koncentrací na gramnegativní Escherichia coli a Fusarium culmorum.

Použitá literatura: [1]

A. Vanhatalo, K. Kuoppala, V. Toivonen, K. J. Shingfield: Effects of forage species and stage of maturity on bovine milk fatty acid composition. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2007, 109, 856-867. [2] C. M. Williams: Dietary fatty acids and human health. Ann. Zootech. 2000, 49, 165-180. [3] K. W. Wahle, S. D. Heys, D. Rotondo: Conjugated linoleic acids: Are they beneficial to human health? Prog Lipid Res. 2004, 43, 553-587. [4] A. L. Lock, D. E. Bauman: Modifying milk fat composition of dairy cows to enhance fatty acids beneficial to human health. Lipids. 2004, 39, 1197-1206. [5] J. C. M. Schogt, P. H. Begemann: Isolation of 11-cyclohexylundecanoic acid from butter. J Lipid Res. 1965, 6, 466-470. [6] H. Egge, U. Murawsky, P. Gyorgy, F. Zilliken: Minor constituents of human milk. I. Identification of cyclohexaneundecanoic acid and phytanic acid in human milk fat by a combination gas chromatograph-mass spectrometer. FEBS Letters 1969, 2, 255-258. [7] M. DeRosa, A. Gambacorta, L. Minale, J. D. Bullock: Cyclohexane fatty acids from a thermophilic bacterium. J. Chem. Soc.,Chem. Commun. 1971,1334. [8] K. Suzuki, K. Saito, A. Kawaguchi, S. Okuda; K.Komagata: Occurrence of Ȧ-cyclohexyl fatty acids in Curtobacterium pusillum strains. J. Gen. and Appl. Microbiology 1981, 27, 261-266. [9] L. Levy: The activity of chaulmoogra acids against Mycobacterium leprae. Am. Rev. Respir. Dis. 1975, 111, 703-705. [10] Biermann U., Metzger J., O.: Alkylaton of Alkenes: Ethylaluminum Sesquichloride-Mediated HydroAlkyl Additions with Alkyl Chloroformates and Di-tert-butylpyrocarbonate. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 10319-10330.

[11] G. S. Hiers, R. Adams: R. Ȧ-Cyclohexyl derivatives of various normal alipathic acids. IV. J. Am. Chem. Soc.1926, 48, 2385-2393. [12] J Boer, B. C. P. Jansen, A. Kentie, H. W Knol: The growth -promoting action of vaccenic acid. Journal of Nutrition. 1947, 33, 359-360. [13] J.Jaroš a kol.: PravdČpodobnost a statistika, VŠCHT, Praha 1998

Kontaktní adresa: Jan Šmidrkal, Ústav technologie mléka a tukĤ, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Technická 5, 166 28 Praha 6, e-mail: [email protected]

88

MOŽNOSTI KONZERVACE MLÉýNÝCH VÝROBKģ NATIVNÍMI MASTNÝMI KYSELINAMI A JEJICH DERIVÁTY Karlová Tereza, Poláková Lenka, Šmidrkal Jan, Filip Vladimír Ústav technologie mléka a tukĤ, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Preservation possibilities of native fatty acids and their derivatives in dairy products Summary: At present foodstuffs without synthetic additives are preferred. A possibility how to decrease the amount of preservatives is to substitute them with compounds based on fatty acids and their derivatives. Fatty acid esters with glycerol, glucose, fructose and sucrose are used as surfactants and have also a broad spectrum of antimicrobial activity1. These lipids are commonly found in natural products (e. g. in milk) and they are crucial for the antimicrobial properties of hydrolysed milk fat2.The mechanism by which fatty acids and their derivatives kill microorganisms is not known but electron microscope studies indicate that they disrupt cell membranes. Higher concentrations of surface active compounds cause disruption of cell membranes and change cell permeability3, 4, 5. The objective of this study was to investigate the susceptibilities of exemplary microorganisms to the antimicrobial properties of several fatty acids and their esters. In this paper we summarize the up to now results obtained at our department. Our results indicate that the addition of tested compounds decreases the number of viable microorganisms.

Cíl práce: Cílem práce bylo otestovat antimikrobiální vlastnosti vybraných mastných kyselin a jejich esterĤ na modelových kmenech mikroorganismĤ a ovČĜit jejich aktivitu v reálném prostĜedí. Byla použita Ĝada mastných kyselin, jejich pĜíslušné 1-monoacylglyceroly, monoacylglukosy, monoacylsahcarosy a monoacylfruktosy. U vybraných látek byla ovČĜena antimikrobiální aktivita v mléþných výrobcích. V pĜíspČvku jsou shrnuty dosavadní výsledky získané na ÚTMT. Úvod: Souþasným trendem v potravináĜství je snaha co nejvíce snížit obsah syntetických aditiv a nahradit je látkami pĜírodními. Jedním z možných Ĝešení je nahrazení konzervaþních látek slouþeninami na bázi mastných kyselin a jejich derivátĤ. Estery mastných kyselin s polyoly patĜí mezi neionické tenzidy a jsou bČžnČ používány v potravináĜském, kosmetickém a farmaceutickém prĤmyslu. Mají vysoké emulgaþní, stabilizaþní a detergenþní úþinky a zároveĖ projevují antimikrobiální aktivitu vĤþi širokému spektru mikroorganismĤ1. Tyto látky se bČžnČ vyskytují v pĜírodních produktech (napĜ. v mléce) a jsou to klíþové složky, které vytváĜejí antimikrobiální schopnosti hydrolyzovaného mléþného tuku2. Tyto lipidy se v lidském tČle pĤsobením hydrolas rozkládají na stejné látky jako bČžnČ konzumované potraviny. Lze je proto s úspČchem využít také v mlékárenských technologiích. Antimikrobiální vlastnosti mastných kyselin a jejich derivátĤ jsou již dlouho známé. Úþinek závisí na délce ĜetČzce, koncentraci látky a pH prostĜedí. Snížení pH prostĜedí výraznČ zvyšuje inhibiþní úþinek mastných kyselin. PĜi výbČru optimální délky mastné kyseliny musí být brán ohled nejen na její inhibiþní aktivitu proti danému mikroorganismu, ale také na její rozpustnost6. Mechanismus inhibiþních úþinkĤ mastných kyselin a jejich derivátĤ na mikroorganismy není dosud zcela objasnČn. PovrchovČ aktivní látky ve vyšších koncentracích zpĤsobují poškození cytoplazmatických membrán, které vedou až k usmrcení buĖky3. K inhibici rĤstu mikroorganismĤ dochází dĤsledkem zmČny bunČþné permeability6. Antimikrobiální efekt je zpĤsoben inkorporací mastných kyselin do bunČþných membrán, což zpĤsobuje neuspoĜádanost okolních lipidĤ a vede ke zvýšení membránové fluidity. Nespecifické zmČny fyzikálních vlastností lipidové dvojvrstvy mohou zpĤsobit zmČny membránových proteinĤ a mČnit tak jejich normální funkci. Lipidová dvojvrstva membrán mikroorganismĤ je tedy primárním cílem úþinku mastných kyselin a jejich derivátĤ4, 5.

89

Nejvyšší antimikrobiální aktivitu vykazují monoestery mastných kyselin (MK) a glycerolu - monoacylglyceroly (MAG). Existují dvČ isomerní formy (viz obr. 1).

sn-1- nebo Į-izomer

sn-2- nebo ȕ-izomer

Obr. 1. DvČ izomerní formy monoacylglycerolĤ. (R - uhlovodíkový ĜetČzec) MAG jsou intermediáty pĜi degradaci triacylglycerolĤ (TAG) nebo diacylglycerolĤ (DAG) pĜi lypolýze. TAG a následnČ DAG jsou hydrolyzovány lipasami za vzniku sn-2-MAG, jejichž významný podíl je izomerován ve dvanáctníku na sn-1-MAG a sn-3-MAG. Vzniklé sn-1-MAG a sn-3-MAG mohou být dále hydrolyzovány na rozdíl od sn-2- MAG, který je lipase rezistentní. Gastrointestinální infekce zpĤsobené patogeny z potravin jsou stále velkým problémem i v západní spoleþnosti. Helicobacter pylori je pĤvodcem chronické gastritidy a žaludeþních vĜedĤ a rizikovým faktorem pro vznik karcinomu žaludku. Tato patogenní bakterie kolonizuje žaludek a stĜeva více než poloviny lidské populace. Souþasná terapie je doprovázena vedlejšími úþinky a vznikem rezistentních kmenĤ. PodpĤrná léþba pomocí MK a MAG uvolnČných napĜ. z mléþného tuku hydrolýzou pregastrickou lipasou se jeví jako možné Ĝešení. Pregastrické lipasy uvolĖují pĜednostnČ krátké a stĜednČ dlouhé MK (C4 - C10) ze sn-3 polohy TAG mléþného tuku, které vykazují nejvČtší antimikrobiální aktivitu.Vzniká tak optimální smČs MK a MAG pro inhibici bakterií2, 7, 8, 9. Výhodou pĜi použití tČchto látek je, že si mikroorganismy nevytváĜejí vĤþi MK a MAG rezistenci, což bylo experimentálnČ prokázáno s použitím H. pylori. MK a MAG jsou díky svému pĜírodnímu pĤvodu považovány za netoxické. WHO oznaþila v roce 1996 kyselinu laurovou za GRAS (generally recognize as a safe)2, 7, 8. Mastné kyseliny a jejich deriváty lze díky jejich antimikrobiálním vlastnostem a pĜírodnímu pĤvodu použít jako konzervanty v potravinách. Jejich další využití ovšem pĜipadá v úvahu pĜi podpĤrné þi doprovodné léþbČ (v kombinaci s antibiotiky) chorob zpĤsobených Ĝadou mikroorganismĤ. Složení stravy mĤže také ovlivnit rezistenci vĤþi gastrointestinálním infekcím. Materiály a metody: Byla testována Ĝada látek: x Mastné kyseliny (MK): C10, C11, C12, C13, C14, C11:1, C16:1, C6-C11 (k. cyklohexylundekanová) x Monoacylglyceroly (MAG): C10, C11, C12, C13, C14, C16, C16:1 x Monoacylglukosy (GLU): C10, C11, C12, C13, C14, C16:1 x Monoacylfruktosy (FRU): C10, C12, C14, C16 x Monoacylsacharosy (SACH): C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16 Mastné kyseliny byly od firmy Fluka. Mastná kyselina C16:1 byla izolována z makadamiového oleje na ÚTMT, VŠCHT Praha. Estery mastných kyselin byly syntetizovány (kromČ esterĤ s fruktosou, které byly pĜipraveny enzymaticky) na ÚTMT, VŠCHT Praha. Testované kmeny: x G+ bakterie: Bacillus subtilis LCC 666, Bacillus subtilis DMF 2006, Bacillus cereus DMF 2001 x G- bakterie: Escherichia coli DBM 3104, Escherichia coli DMF 7503 x Kvasinky: Saccharomyces cerevisiae DMF 2880, Geotrichum candidum DMF 0301 x PlísnČ: Fusarium sp. DMF 0101, Fusarium culmorum DMF 0103, Penicilium rugulosum DMF 0003, Penicilium hirsutum DMF 0001, Penicilium chrysogenum DMF 0002, 90

Penicilium roqueforti DMF 0007, Penicilium nalgiovensis DMF 0010, Penicilium expansum DBM 4061, Alternaria sp. DBM 0101, Aspergilus niger DMF 0501 Ke stanovení antimikrobiální aktivity testovaných látek byla používána Ĝada metod: x Stanovení MIC (minimální inhibiþní koncentrace) pomocí agarové difusní vpichové metody10. x MČĜení prĤmČru kolonií plísní pomocí metody želatinových kazet10, 11. x Stanovení rĤstu v tekuté pĤdČ plotnovou metodou s detekcí nárĤstu kolonií na pevné pĤdČ11. x Sledování vlivu pH prostĜedí na úþinek testovaných látek12. x OvČĜení antimikrobiální aktivity v mléþných výrobcích: Ke stanovení rĤstu plísnČ Fusarium culmorum DMF 0103 v obnoveném sušeném mléce - odtuþnČném byla použita plotnová metoda s detekcí nárĤstu kolonií na pevné pĤdČ. Dále byl sledován rĤst bakterie Bacillus cereus DMF 2001 v syrovátce a polotuþném mléce pomocí pĜístroje BacTrac12. V souþasné dobČ je používáno spektrofotometrické stanovení rĤstu v tekuté pĤdČ pomocí pĜístrojĤ PowerWave XS, Bioscreen ® a ȝQUANT. Výstupem jsou rĤstové kĜivky jednotlivých mikroorganismĤ (Bacillus cereus DMF 2001, Escherichia coli DMF 7503, Saccharomyces cerevisiae DMF 2880, Fusarium culmorum DMF 0103). Popis metody: Kultivace mikroorganismĤ probíhala v tekutém mediu s pĜídavkem testovaných látek v mikrotitraþních destiþkách. Inokulum, resp. suspenze spor, bylo zaoþkováno do sady zkumavek obsahujících medium s danou koncentrací použitých látek. Z tČchto zkumavek byly naplnČny sterilní mikrotitraþní destiþky, ve kterých probíhala kultivace i mČĜení absorbance. Po urþitých þasových intervalech byla promČĜována absorbance pomocí pĜístroje PowerWave XS (650 nm - bakterie, 630 nm - kvasinka a plíseĖ). Ke zvýšení pĜesnosti mČĜení byla absorbance v každé jamce mČĜena 25x a výsledná absorbance byla vyjádĜena jako prĤmČr. Výsledky byly poté statisticky zpracovány. Pro vylouþení odlehlých hodnot byl použit DixonĤv test s hladinou významnosti 0,05. Data byla vyhodnocena pomocí poþítaþového programu Microsoft Excel. Výstupem byly kĜivky závislosti absorbance na þase (72 h – bakterie, 240 h – kvasinka a plíseĖ). Výsledky a diskuse: Byly zmČĜeny rĤstové kĜivky testovaných kmenĤ kultivovaných v tekutém mediu v mikrotitraþních destiþkách s pĜídavkem inhibiþních látek po dobu 3 dnĤ (72 h), resp. 10 dnĤ (240 h). Výsledky mČĜení byly graficky vyjádĜeny jako rĤstové kĜivky B. cereus a E. coli, resp. S. cerevisieae a F. culmorum.

0,700 0,600 K 0,05 0,10 0,20 0,40 0,80

0,500

A

0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 0

20

40

60

80

Ĳ [h] Obr 2. RĤstové kĜivky B. cereus v pĜítomnosti rĤzných koncentrací (mmol/l) MK C11. Pozn.: K – bez inhibiþní látky a rozpouštČdla 91

Z obr. 2 je patrné, že v pĜítomnosti MK C11 dochází k prodloužení lag fáze rĤstu B.cereus a ke snížení nárĤstu kultury. PĜi použití vyšších koncentrací nebyl zaznamenán žádný rĤst kultury. Obdobné kĜivky byly získány i pro ostatní kmeny použitých mikroorganismĤ. Pro srovnání inhibiþních úþinkĤ testovaných látek byly vypoþteny plochy pod jednotlivými inhibiþními kĜivkami pro jednotlivé koncentrace inhibiþních látek a po srovnání s kontrolou byly vypoþteny procentuální inhibice rĤstu kultury. Z obr. 3 je patrné, že nejvyšší koncentrace MK C11 zpĤsobila 100% inhibici, tedy nebyl zaznamenán žádný nárĤst B.cereus.

inhibice [%]

100 80 60 inh. 40 20 0 0,05

0,10

0,20

0,40

0,80

c [mmol/l] Obr. 3. Inhibice rĤstu B. cereus v pĜítomnosti rĤzných koncentrací MK C11. Pro vzájemné porovnání pĤsobení jednotlivých koncentrací testovaných látek byly výsledky zracovány do formy pĜehledných map (viz obr. 4). Je patrné, že zvýšení koncentrace vede k vyššímu inhibiþnímu efektu. Jako pĜíklad jsou uvedeny výsledky pro B. cereus kultivovaný s pĜídavkem MK a MAG C10 – C12.

Slouþenina MK C10

Bacillus cereus DMF 2001 c [mmol/l] 0,05 0,10 0,20

0,40

0,80

MK C11 MK C12 MAG C10 MAG C11 MAG C12

0 - 10 %

10 - 25 %

Inhibice 25 - 50 %

50 - 90 %

> 90 %

Obr. 4. Inhibiþní pĤsobení jednotlivých koncentrací vybraných látek na B. cereus. ZávČr: Cílem této práce bylo otestovat antimikrobiální vlastnosti vybraných mastných kyselin a jejich esterĤ na modelových kmenech mikroorganismĤ. Dále byla ovČĜena antifungální aktivita vybraných látek v mléþných výrobcích. Z výsledkĤ je patrné, že pĜídavek inhibiþních látek snižuje poþet mikroorganismĤ. PĜi použití vyšších koncentrací nebyl zaznamenán žádný rĤst kultury. V pĜítomnosti antimikrobiálních látek dochází k prodloužení lag fáze rĤstu mikroorganismĤ 92

a snížení nárĤstu kultury. Nízké koncentrace mohou podporovat rĤst kultury. Zvýšení koncentrace vede ke zvýšení inhibiþního efektu. Z dosavadních výsledkĤ vyplývá, že mezi nejvíce aktivní látky patĜí MK C10 – C12 a jejich estery, jelikož jejich úþinek je nejvíce širokospektrální v rámci použitých mikroorganismĤ. Úþinek látek roste s poþtem uhlíkĤ až k C13, poté prudce klesá. V pĜípadČ acylsacharos úþinek roste s poþtem uhlíkĤ až k C14 – C16. G+ bakterie byly citlivČjší než G-. Snížení pH prostĜedí vedlo ke zvýšení inhibiþního efektu MK. V mléþných výrobcích byl úþinek látek nižší než v syntetickém mediu. Použitá literatura: 1. Bergsson G., Arnfinnsson J., Steingrímsson Ó., Thormar H.: In vitro killing of Candida albicans by fatty acids and monoglycerides, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 45, 3209 – 3212 (2001). 2. Sprong R. C., Hulstein M.F.E., van der Meer R.: Bovine milk fat components inhibit food-borne pathogens (2002). 3. Šilhánková L.: Mikrobiologie pro potravináĜe a biotechnology. Victoria Publishing, Praha 1995. 4. Avis T. J., Bélanger R. R.: Specificity and mode of action of the antifungal fatty acid cis-9-heptadecenoic acid produced by Pseudozyma flocculosa, Apllied and Environmental Microbiology 67 (2001). 5. Gray S. N., Robinson P., Wilding N., Markham P.: Effect of oleic acid on vegetative growth of the aphid-pathogenic fungus Erynia neoaphidis, FEMS Microbiology Letters 68 (1990). 6. Kabara J. J., v knize Antimikrobial in Food (Branen A. R., Davidson P. M., Eds.), Marcel Dekker, New York 1993. 7. Bergsson G., Steingrímsson Ó., Thormar H.: Bactericidal effects of fatty acids and monoglycerides on Helicobacter pylori (2002). 8. Sun C. Q., O’Connor C. J., Roberton A. M.: Antibacterial actions of fatty acids and monoglycerides against Helicobacter pylori (2003). 9. Graham D. Y., Osato M. S.: H. pylori in the pathogenesis of duodenal ulcer: interaction between duodenal acid load, bile and H. pylori (1999). 10. ěiháková Z.: Antimikrobiální vlastnosti esterĤ kyseliny laurové s polyoly. Disertaþní práce. Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT, Praha 2000. 11. ýervenková R.: Antimikrobiální vlastnosti derivátĤ karboxylových kyselin. Disertaþní práce. Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT, Praha 2004. 12. Kolouchová E.: Syntéza a vlastnosti mikrobiálnČ aktivních lipidĤ. Disertaþní práce. Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT, Praha 2006.

Kontaktní adresa: Ing. Tereza Karlová Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT v Praze Technická 5 166 28, Praha 6 [email protected]

93

VPLYV TEPLOTY A AKTÍVNEJ KYSLOSTI NA RAST GEOTRICHUM CANDIDUM V MLIEKU A V MLIEýNOM AGARE Hudecová Anna, Liptáková Denisa, Valík ďubomír, Medvećová Alžbeta Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU v Bratislave The Effect of Temperature and pH on the Growth of Geotrichum candidum in Milk and on the Skim Milk Agar Summary: In our research, the effect of cultivation temperatures and pH on the growth dynamic of Geotrichum candidum was studied by measuring colony forming units in milk and colony diameter on the skim milk agar (SMA). The typical sigmoid growth curves were obtained from the both groups of growth data. This enabled us to calculate basic growth parameters as well as to evaluate the influence of environmental factors mentioned above. While the influence of pH on growth of G. candidum was significant in milk the rates of surface growth on solid milk agar were not affected significantly. The following equations resulted from the Ratkowsky´s model at both pH values: Gr6.7 = 0.0174T + 0.0273, (R2(P6.7) = 0.988) and Gr5.5 = 0.0115T + 0.0851, (R2(P5.5) = 0.975). Performing the Student`s t-test, no significant differences among radial growth rates at 5 pH values within the range of 5.0 and 7.1 were found. All the calculated rates of surface growth of G. candidum were included in secondary modelling by Ratkowsky´s model with the following statistically significant results:Grradial = 0.01362T + 0.12851; R2(radial) = 0.971). Except of growth description of G. candidum in fluid or solid medium, the results presented above may also provide the basis for calculation of the time that this yeast-like fungus need, e.g., to increase number by 3 log in milk or to reach 3 mm visible colony on solid milk surfaces. This time data could be important in evaluation of growth potential of G. candidum in cheese where this fungus may contribute to the ripening or on fresh cheeses or quark where acts as contaminant.

Úvod G. candidum je významná mliekarenská huba, ktorá sa používa hlavne v technológii spracovania syrov zrejúcich s plesĖou, alebo pod mazovou kultúrou. Tiež je prirodzenou súþasĢou mikroflóry þerstvých alebo krátkozrejúcich syrov z kozieho a ovþieho mlieka. V prípade ovþieho hrudkového syra sa podieĐa na jeho finálnych vlastnostiach. G. candidum sa okrem mlieka a mlieþnych výrobkoch bežne vyskytuje napríklad aj na starnúcich liberkách lisovaného droždia, v kyslej kapuste a uhorkách, na škrobe, ale aj v pôde, vo vode, v aktivovaných kaloch z odpadových vôd, na rastlinách, obilninách a pod. Je to saprofyt, ale za podmienok imunitnej nedostatoþnosti sa môže sekundárne staĢ patogénnym pre þloveka 1, 2. V závislosti od morfológie kolónií je G. candidum považované za mikroorganizmus hraniþiaci medzi typickou kvasinkou a vláknitou hubou. Vo vnútri druhu sú preto popísané dva hlavné morfotypy. Jeden je charakterizovaný kmeĖmi s krémovo sfarbenými kolóniami podobnými kvasinkovým, ktoré hojne produkujú artrospóry a vo všeobecnosti majú mierny rast, proteolytickú aktivitu a produkujú organické kyseliny. Optimálna teplota pre jej rast sa nachádza medzi 22 až 25 °C. Druhý typ tvoria biele splstené kolónie s prevahou vegetatívnych hýf s menším množstvom artrospór. Tento morfotyp vykazuje vysokú proteolytickú aktivitu, rýchly rast pri optimálnej teplote 25 až 30 °C a schopnosĢ alkalizovaĢ prostredie 3. G. candidum môže rásĢ v teplotnom rozpätí od 5 do 38 °C, a pri pH od 3 do 11 s optimom 5,5 až 6,0. Jej generaþný þas je jeden z najnižších medzi eukaryotmi, t.j. 1,1 h pri 30 °C v kvapalnom médiu. Je senzitívna na obsah NaCl, priþom citlivosĢ sa pohybuje v rozmedzí 1 % až 2,5 %. Rast tejto mliekarenskej huby v syre je limitovaný soĐou pri koncentráciách nad 1 %. Tento druh je veĐmi odolný voþi zníženej koncentrácii kyslíka a zvýšenému obsahu oxidu uhliþitého. Jej rast klesá lineárne so znižovaním koncentrácie kyslíka pri jeho obsahu pod 3 %. Avšak, rast v atmosfére ochudobnenej o kyslík vedie k predĎženiu hýf a strate boþného vetvenia 3. Na agarových pôdach tvorí G. candidum jemné kožušinkové porasty a podobné kožky vytvára aj na kvapalných pôdach. Obrovská kolónia rastie rýchlo, najrýchlejšie zo všetkých druhov geotrích. Vyskytuje sa vo vegetatívnej forme rozmnožovania artrokonídiami disartikuláciou hýf. Sexuálne rozmnožovanie nie je známe 2. Kmene G. candidum neasimilujú laktózu a dokážu rýchlo metabolizovaĢ laktát z mlieþneho agaru obsahujúceho 1 % kyseliny mlieþnej. Všetky kmene 94

G. candidum izolované z mlieka, tvarohu a syra sú schopné asimilovaĢ laktát ako zdroj uhlíka a energie 3, 4, 5. Na povrchovo zrejúcich syroch lipázy a proteázy G. candidum štiepia lipidy a proteíny na mastné kyseliny a peptidy, ktoré sa ćalej metabolizujú ostatnými mikrobiálnymi populáciami. Týmto spôsobom G. candidum prispieva k osobitným arómam a finálnym vlastnostiam syrov 4. Na zretí syrov sa podieĐa tiež prostredníctvom amino- a karboxy-peptidáz, ktoré špeciálne v mäkkých syroch uvoĐĖujú aminokyseliny. Katabolizmom aminokyselín enzýmami G. candidum dochádza k produkcii zlúþenín, ktoré sú dôležité pre rozvoj arómy a chuti 6. Metabolizmus laktátu a tvorba alkalických metabolitov vedie k deacidifikácii povrchu syra. Umožní sa tým rast baktérií citlivých na slabé organické kyseliny, ale aj proteolytickejším baktériám, akými sú mikrokoky, Brevibacterium linens, Arthrobacter a Corynebacterium. Súþasne sa umožní rozvoj aj iných dôležitých organizmov ako je Penicillium camembertii 3. Poþas zretia syra kamembertského typu sa ukázalo že G. candidum znaþne znižuje horkosĢ rozkladom horkých peptidov pomocou aminopeptidázovej aktivity, ako aj inhibíciou rastu druhu Penicillium 7. V prípade þerstvých syrov ako Cottage cheese a tvaroh je G. candidum ako aj iné mikroorganizmy považovaná za kontaminujúcu flóru 3. Zástupcovia Geotrichum sp. znehodnocujú aj niektoré smotanové syry 8. PodieĐa sa aj na kazení masla, smotany a smotanových produktov 9. V tejto práci sme sa venovali štúdiu dynamiky rastu kmeĖa G. candidum, ktorý sme izolovali z ovþieho hrudkového syra vyrobeného zo surového mlieka. CieĐom bolo popísaĢ jej základné rastové charakteristiky, ako sú rastová rýchlosĢ, trvanie lag-fázy, v závislosti od teploty, hodnoty pH, a typu kultivaþného prostredia, ako aj urþiĢ jej minimálnu teplotu rastu. Ratkowského model, ktorý patrí medzi sekundárne modely prediktívnej mikrobiológie sme použili na linearizáciu závislosti rastovej rýchlosti od teploty prostredia. Pomocou tohto modelu je možné spätne urþiĢ správanie sa danej huby v závislosti od vplyvov prostredia. Výsledky a diskusia Dynamika rastu G. candidum v UHT mlieku pri dvoch hodnotách pH v závislosti od teploty Dynamika rastu kultúry G. candidum zámerne inokulovanej do vzoriek UHT mlieka pri hodnote pH 5,5 v závislosti od teploty uchovávania je znázornená na obr. 1 a pri pH 6,7 na obr.2. Rastové parametre sú uvedené v tab. 1. Ako vidno z obrázkov (obr. 1 a 2) a nameraných rastových parametrov (tab. 1) zvyšovaním kultivaþnej teploty sa rastová rýchlosĢ zvyšovala a analogicky lag-fáza mala kratšie trvanie, pre obidve hodnoty aktívnej kyslosti prostredia. V prípade najnižšej z použitých kultivaþných teplôt 10 °C boli namerané hodnoty rastových rýchlostí pre jednotlivé pH prakticky totožné (Gr = 0,041 log KTJ.h-1). Pri teplote 15 °C nadobudla rastová rýchlosĢ v mlieku s pH 5,5 hodnotu 1,5-násobne vyššiu ako v prípade 10 °C a pri pH 6,7 bola takmer 2-násobná. Najvyššiu rastovú rýchlosĢ dosiahla huba pri 25 °C, ktorá bola pri pH 5,5 až 3,5-krát vyššia než pri 10 °C a pri pH 6,7 bol tento rozdiel skoro 5-násobný. Z rastových rýchlosti pri teplote 25 °C pri pH 5,5 a pH 6,7 vyplývajú þasy zdvojenia (generaþné þasy) 2,17 a 1,45 h, v poradí a sú v súlade s generaþným þasom 1,1 h pri 30 °C uvedeným v úvode tejto práce 3. Získané rastové hodnoty nám umožnili vypoþítaĢ aj minimálnu teplotu rastu pre tento kmeĖ dosahujúcu 7 °C pri pH 6,7. Porovnaním rastových rýchlostí pre jednotlivé pH (tab. 1) možno vidieĢ, že pri najnižších teplotách (10 a 12 °C) boli namerané hodnoty rastových rýchlostí prakticky totožné, resp. bol rozdiel menší ako 9 %, naznaþujúc tak minimálny vplyv pH na rast vláknitej huby. Ćalším zvýšením teploty dochádza k spomaleniu rastu huby v mlieþnom prostredí s nižšou hodnotou pH približne o 20 %. Pri 18 °C bol vplyv odlišného pH najvýznamnejší, priþom rozdiel medzi rastovými rýchlosĢami bol až 52 %. Pri posledných dvoch teplotách 20 °C a 25 °C to bolo približne 33 %.

95

TabuĐka , Rastové parametre G. candidum v UHT mlieku v závislosti od kultivaþnej teploty pri dvoch hodnotách pH 5,5 a 6,7 (Gr je rastová rýchlosĢ G. candidum) Gr6,7[log teplota [°C] Gr5,5[log KTJ.h-1] lag-fáza5,5[h] lag-fáza6,7[h] KTJ.h-1] 0,041 0,051 0,062 0,066 0,102 0,139

12,8 15,9 8,7 5,2 3,1 2,5

0,041 0,056 0,077 0,138 0,154 0,208

6

6

5

5

4

4

3

log KTJ.ml -1

log KTJ.ml -1

10 12 15 18 20 25

GC m ono-culture_25 GC m ono-culture_20 GC m ono-culture_18

2

3

GC m ono-culture_25 GC m ono-culture_20 GC m ono-culture_18

2

GC m ono-culture_15

GC m ono-culture_15

GC m ono-culture_12 1

23,1 15,7 11,7 14,9 13,6 3,3

GC m ono-culture_12 1

GC m ono-culture_10

0

GC m ono-culture_10

0 0

24

48

72

96

120

144

168

192

216

240

0

þas [h]

48

96

144

192

240

288

336

þas [h]

Obr. 1: Dynamika rastu G. candidum v UHT mlieku pri pH = 5,5 v závislosti od teploty uchovávania

Obr. 2: Dynamika rastu G. candidum v UHT mlieku pri pH = 6,7 v závislosti od teploty uchovávania

Dynamika rastu G. candidum na SMA platniach pri rôznych hodnotách pH v závislosti od tepoloty Povrchovou inokuláciou vláknitej huby na agarové médium a meraním radiálneho rastu sme získali jej rastové charakteristiky aj na tuhom médiu. V tab. 2 sú zaznamenané jej rastové parametre pri jednotlivých teplotách uchovávania a daných hodnotách pH, ktorých hodnoty sa pohybovali od 5,0 do 7,0. Z nameraných údajov je možné vidieĢ, že pri všetkých testovaných hodnotách pH sa so zvyšujúcou sa teplotou zvyšuje rastová rýchlosĢ G. candidum. Napríklad pri pH 5,5 nadobúda pri 10 °C najnižšiu hodnotu radiálneho rastu (Gr = 0,8 mm.d-1), ktorá je skoro 2-násobne nižšia oproti 15 °C a až 3-krát menšia v porovnaní s teplotou 25 °C dosahujúc pri nej aj najvyššiu hodnotu. Z prezentovaných výsledkov (tab. 2) vyplynulo, že rast huby významne ovplyvĖovala len kultivaþná teplota a nie zmena pH hodnôt testovaného média.

96

TabuĐka ,, Rastové parametre G. candidum na SMA platniach pri rôznych hodnotách pH v závislosti od teploty uchovávania (Grr je rastová rýchlosĢ kolónie, Dend je koneþný priemer kolónií) Teplota [°C]

10

12

15

18

20

25

pH

Grr [mm.h-1]

Grr [mm.d-1]

lag-fáza [h]

Dend [mm]

5,1 5,5 6,1 6,7 7,1 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 5,1 5,5 6,0 6,5 7,1 5,0 5,5 6,1 6,5 7,0 5,1 5,6 5,9 6,3 7,0 5,0 5.6 6.1 6.5 7,0

0,068 0,066 0,071 0,071 0,054 0,087 0,089 0,091 0,071 0,090 0,122 0,117 0,117 0,107 0,095 0,138 0,128 0,141 0,137 0,128 0,178 0,160 0,174 0,181 0,159 0,215 0,210 0,221 0,218 0,216

0,81 0,80 0,85 0,85 0,65 1,04 1,07 1,10 0,85 1,08 1,46 1,41 1,40 1,29 1,14 1,66 1,54 1,69 1,65 1,54 2,13 1,92 2,08 2,17 1,91 2,58 2,53 2,65 2,61 2,60

54,1 40,1 41,6 60,0 29,2 38,0 31,8 2,09E-06 48,3 0,3 3,08E-06 13,0 11,0 1,8 10,8 10,4 9,3 18,7 4,6 -

63,0 64,2 62,8 63,4 55,8 67,1 68,6 68,2 66,4 67,8 64,4 72,7 72,3 82,5 70,1 103,6 103,6 94,8 112,2 114,4 69,0 69,5 69,5 70,1 72,5 65,5 65,8 67,6 71,2 61,9

Ratkowského model (obr. 3) linearizuje závislosĢ druhej odmocniny rastovej rýchlosti od teploty. Vplyv teploty na rastovú rýchlosĢ G. candidum v mlieku pri pH 6,7 popisuje rovnica (1) a pri pH 5,5 rovnica (2) s nízkou pravdepodobnosĢou omylu reprezentovanou vysokými korelaþnými koeficientmi: ¥Gr = 0,0178.T + 0,0256

R2 (Gr) = 0,968

(1)

¥Gr = 0,0113.T + 0,0791

R2 (Gr) = 0,9118

(2)

kde Gr je rastová rýchlosĢ (log KTJ.h-1), T je teplota inkubácie, R je korelaþný koeficient.

97

Výsledky znázornené v obr. 3 potvrdzujú fakt, že rastová rýchlosĢ G. candidum v mlieku bola významne ovplyvnená pH hodnotou a kultivaþnou teplotou, priþom najväþšie rozdiely medzi rastovými rýchlosĢami v závislosti od pH boli namerané pri 18, 20 a 25 °C. Zníženie rastovej rýchlosti pri nižšej hodnote pH môže byĢ spôsobené prítomnosĢou väþšieho podielu nedisociovanej formy kyseliny mlieþnej prechádzajúcej pri vyššej teplote vo väþšej miere do buniek v dôsledku zvýšenej difúzie. Ćalej následnou spotrebou ATP potrebnou na vylúþenie H+ iónov ako aj príslušných aniónov, prostredníctvom ktorej si bunky udržujú homeostázu vnútorného prostredia 10. 0,5

0,45 0,4 0,35 0,3 0,25

y= 0,0178x+ 0,0256 0,2

pH 6.7

R2 = 0,968

pH 5.5 y= 0,0113x+ 0,0791 R2 = 0,9118

0,15

druhá odmocnina rastovej rýchlosti

druhá odmocnina rastovej rýchlosti

0,5

0,1

0,45

0,4

0,35

0,3

y= 0,0136x+ 0,1285 R2 = 0,9706 0,25

9

12

15

18

21

24

8

Teplota [°C]

12

16

20

24

Teplota [°C]

Obr. 3: ZávislosĢ rastovej rýchlosti od teploty uchovávania v mlieku pre dve hodnoty pH

Obr. 4: ZávislosĢ rastovej rýchlosti od teploty uchovávania na SMA agarových platniach

Aj v prípade rastu G. candidum na povrchu agarového média so sušeným odstredeným mliekom bolo možné vyjadriĢ závislosĢ rastovej rýchlosti od teploty uchovávania, ktorá je znázornená na Obr. 4. Popisuje ju rovnica (3) s vysokou koreláciou: ¥Gr = 0,0136.T + 0,1285

R2 (Gr) = 0,9706

(3)

kde Gr je rastová rýchlosĢ (mm.h-1), T je teplota inkubácie, R je korelaþný koeficient. Smernice lineárnych závislostí pre jednotlivé pH hodnoty v rozpätí od 5,0 do 7,0 mali veĐmi podobné hodnoty, z þoho možno predpokladaĢ, že tento faktor neovplyvĖoval rast sledovanej huby na tuhom médiu. Táto skutoþnosĢ sa pri jednotlivých teplotách potvrdila aj na základe Studentovho t-testu.

98

Záver CieĐom našej práce bolo urþiĢ základné rastové vlastnosti kmeĖa známej mliekárenskej huby G. candidum izolovaného z ovþieho hrudkového syra. Ako modelové médiá sa použili UHT mlieko a agar s odstredeným mliekom. Rast sme vyšetrovali pri teplotách 10 °C, 12 °C, 15 °C, 18 °C, 20 °C a 25 °C, ako aj pri rôznych hodnotách aktívnej kyslosti v prípade mlieka 5,5 a 6,7 a v agare v rozpätí od 5,0 do 7,0. Dynamika rastu mlieþnej huby sa zvyšovala úmerne so stúpajúcou teplotou uchovávania a najrýchlejší rast vykazovala pri najvyššej z aplikovaných teplôt urþujúc túto teplotu ako najoptimálnejšiu pre rast G. candidum. Vplyv pH prostredia bol významný pri kultivácii v kvapalnom médiu a to spomalením rastu vplyvom nižšej hodnoty aktívnej kyslosti. Na tuhom médiu sa tento úþinok neprejavil. Uvedené výsledky získané v uvedenej štúdii nám umožĖujú urþiĢ vhodné podmienky potrebné pre rast a rozmnožovanie tohto kmeĖa v syroch ako je napríklad ovþí hrudkový syr a predpovedaĢ jej správanie sa pri rôznych podmienkach prostredia aplikáciou Ratkowského modelu jedného zo sekundárnych nástrojov prediktívnej mikrobiológie. Poćakovanie: Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy þ. APVV-20-005605 a z grantu MŠ VEGA þ. 1/3488/06. Použitá literatúra: 1. BOUAKLINE, A., LACROIX, C., ROUX, N., GANGNEUX, J.P., DEROUIN, F. Fungal contamination of food in hematology units. Journal of Clinical Microbiology, 38, 2000, p. 4272-4273. 2. KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, A. Taxonómia kvasiniek a kvasinkovitých mikroorganizmov. Alfa, Bratislava, 1990, 673 s. 3. BOUTROU, R., GUÉGUEN, M. Interests in Geotrichum candidum for cheese technology. International Journal of Food Microbiology, 102, 2005, p. 1-20. 4. MARCELLINO, N., BEUVIER, E., GRAPPIN, R., GUÉGUEN, M., BENSON, D.R. Diversity of Geotrichum candidum strains isolated from traditional cheesemaking fabrications in France. Applied and Environmental Microbiology, 67, 2001, p. 4752-4759. 5. COSENTINO, S., FADDA, M.E., DEPLANO, M., MULARGIA, A.F., PALMAS, F. Yeasts associated with Sardinian ewe’s dairy products. International Journal of Food Microbiology, 69, 2001, p. 53-58. 6. JOLLIVET, N., CHATAUD, J., VAYSSIER, Y., BENSOUSSAN, M., BELIN, J.M. Production of volatile compounds in model milk and cheese media by eight strains of Geotrichum candidum link. Journal of Dairy Research 61, 1994, p. 241-248. 7. BEOKHOUT, T., ROBERT, V. Yeasts in food. Hamburg: Woodhead Publishing Ltd, 2003. 448 p. ISBN 185573706X 8. CHAPMAN, H.R., SHARPE, M.E. Microbiology of cheese. In ROBINSON, R.K. The microbiology of milk products. New york: Elsevier Science Publishers, 1990. ISBN 1-85166-399-1, vol. 2, p. 203-291. 9. VARNAM, A.H., SUTHERLAND, J.P. Milk and milk products. Vol. 1, London: Chapman and Hall, 1994. 451 p. ISBN 041245730X 10. PIPER, P., CALDERON, C.O., HATZIXANTHIS, K., MOLLAPOUR, M. Weak acid adaptation: the stress response that confers yeasts with resistance to organic acid food preservatives. Microbiology, 147, 2001, p. 2635-2642.

Kontaktná adresa: Ing. Anna Hudecová, Ing. Denisa Liptáková, PhD., Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovenská republika

99

VÝSKYT BIFIDOBAKTERIÍ V MATEěSKÉM MLÉCE Rada VojtČch1, Nevoral JiĜí2, Flajšmanová KateĜina2, Roþková Šárka1, Šmehilová Martina1, Tománková Eva1 1 Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky, ýZU Praha; 2 První pediatrická klinika UK Praha, FN Motol. Occurence of bifidobacteria in human milk Summary: The aim of the work was to investigate whether human milk is a primary source of bifidobacteria for infants. Two groups of human milk samples were tested: The first group (13 samples) originated from mothers with babies without bifidobacteria in faecal flora (BIF-). The second group (29 samples) originated from mothers with babies with bifidobacteria in faecal flora (BIF+). The occurrence of bifidobacteria in faeces was tested using cultivation method and FISH. For the detection of bifidobacteria in milk, the samples were subcultivated in TPY broth with mupirocin and subsequently the fructose-6-phosphate phosphoketolase activity (F6PPK) was determined. While 35% of milks from BIF+ group expressed F6PPK activity and therefore contained bifidobacteria, no bifidobacteria were detected in milks from BIF- group. It could be concluded that human milk is not the primary source of bifidobacteria for infants. It seems that bifidobacteria occur in mothers milks as a consequence of contamination from infant intestinal tract.

Úvod V poslední dobČ se ve vČdecké literatuĜe objevily zprávy o výskytu bakterií mléþného kvašení a bifidobakterií v mateĜském mléce (MM). Martín a kol. (1) testovali výskyt bakterií mléþného kvašení v mateĜském mléce a stČrech z povrchu kĤže matky a ústní dutiny kojencĤ. Jako hlavní druh nacházeli Lactobacillus gasseri. Další dvČ práce (2, 3) informují o výskytu bifidobakterií v mateĜském mléce, pĜiþemž vyslovují hypotézu, že mateĜské mléko je pĜirozeným zdrojem bifidobakterií. Tomuto tvrzení však zcela nenapovídá promČnlivý výskyt pozitivních vzorkĤ. Zatímco vzorky od matek z japonského venkova obsahovaly bifidobakterie ve 100 % pĜípadĤ, vzorky z Dánska a Švédska mČly poþty tČchto bakterií výraznČ menší a þasto byly i zcela negativní. Cílem práce bylo proto ovČĜit hypotézu nČkterých autorĤ, že MM je primárním zdrojem bifidobakterií. Materiál a metody Celkem bylo testováno 13 vzorkĤ MM od dárkyĖ, jejichž dČti nemČly pĜítomné bifidobakterie ve stolici (skupina BIF-) a dále 29 vzorkĤ od dárkyĖ, jejichž dČti mČly naopak bohaté zastoupení tČchto bakterií ve stolici (skupina BIF+). Pro testování pĜítomnosti bifidobakterií bylo 0,5 ml mléka inokulováno do 9 ml TPY bujónu (Sharlau, ŠpanČlsko) s pĜídavkem mupirocinu (100 mg/l) podle (4) a inkubovány pĜi 37oC po dobu 48 hod. PĜítomnost bakterií ve stolici byla testována kultivaþnČ a pomocí FISH (4), v MM potom pĜítomnost bifidobakterií pĜedbČžnČ pomocí fázovČ-kontrastní mikroskopie pomocí mikroskopu Nikon Eclipse E-800 a dále pomocí detekce fruktoso-6-fosfát fosfoketolázy (5), což je enzym specifický pro rod Bifidobacterium. Výsledky a diskuse Poþty bakterií u dČtí dárkyĖ MM jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2. Kojenci bez bifidobakterií mČly jako hlavní bakteriální skupinu ve stolici klostridie. Zatímco pĜítomnost bifidobakterií byla spolehlivČ prokázána jak pomocí kultivaþních metod, tak pomocí FISH, poþty klostridií lze ve stolici spolehlivČ prokázat pouze pomocí FISH, použita byla sonda specifická pro skupinu Cl. butyricum. Výskyt bifidobakterií v MM je uveden v tabulce þ. 3. Bifidobakterie byly pomČrnČ spolehlivČ prokázány již pomocí mikroskopie (Obrázek 1 a 2), kdy pozitivní vzorky obsahovaly typické nepravidelné tyþinky þasto s náznaky vČtvení a/nebo schopností autoagregace. U negativních vzorkĤ byly pozorovány pouze tukové kuliþky, k pomnožení jiných bakterií nedocházelo vzhledem k pĜítomnosti mupirocinu, který má inhibiþní úþinek vĤþi vČtšinČ bakterií vyskytujících se na kĤži (stafylokoky, mikrokoky) a rovnČž spolehlivČ zamezí pomnožení bakterií mléþného kvašení. Bifidobakterie byly nalezeny pouze ve vzorcích mlék skupiny BIF+. Celkem 100

bylo pozitivních 35 % vzorkĤ. Naprostá absence bifidobakterií u BIF- skupiny jasnČ naznaþuje, že mateĜské mléko není primárním (endogenním) zdrojem bifidobakterií pro kojence. Neexistuje ani žádné uspokojivé vysvČtlení jakou cestou by se mČly bifidobakterie, popĜ. bakterie mléþného kvašení do MM dostat. MM uvnitĜ mléþné žlázy je (u zdravých jedincĤ) sterilní jako je tomu i u ostatních savcĤ. PĜirozeným místem výskytu bifidobakterií je trávicí trakt, vþetnČ ústní dutiny. Bifidobakterie jsou v MM tedy s nejvČtší pravdČpodobností pĜítomny jako sekundární kontaminace, pĜiþemž jako hlavní zdroj se jeví sám kojenec, v pĜípadČ, že má plnČ vyvinutou stĜevní flóru s obsahem bifidobakterií. Tabulka I Poþet klostridií ve stolici dČtí negativních na bifidobakterie a výskyt bifidobakterií v mléce jejich matek (skupina BIF-). Vzorek Poþet klostridií Bifidobakterie v mléce matek MA471/2 8,24 MM486/2 9,06 MF495/2 7,88 MM587/2 ND MM607/2 8,18 ME621/2 7,53 ME626/2 ND MS693/2 7,83 MM769/2 9,64 MM853/2 9,15 MA856/2 8,64 MA860/2 9,41 MA895/2 7,83 -

Obr. 1. Bifidobakterie v kultivovaném mateĜském mléku.

Obr.2. MateĜské mléko po kultivaci bez pĜítomnosti bifidobakterií. 101

Tabulka II Poþet bifidobakterií ve stolici kojencĤ a v mléce jejich matek (skupina BIF+) mezera 3 body. Vzorek MM665/2 MA673/2 MM707/2 MM709/2 MA750/2 MA755/2 MA770/2 MM797/2 MA800/2 MF802/2 MF803/2 MM807/2 MF812/2 MA818/2 MM867/2 MM868/2 MM869/2 MM873/2 MM875/2 MM880/2 MA883/2 MA884/2 MM885/2 MA897/2 MM901/2 MM906/2 MM907/2 MA920/2 MF932/2

Bifidobakterie kultivaþnČ

Bifidobakterie FISH

7,16 10,67 9,87 10,32 8,95 9,63 ND 10,90 9,34 9,34 7,76 10,69 10,18 10,80 10,46 10,39 9,06 10,96 10,37 10,24 10,32 10,58 10,94 10,75 9,13 9,96 10,56 9,59 10,61

8,76 10,42 9,52 9,88 7,97 10,41 9,03 10,71 9,29 10,12 9,19 10,57 9,97 10,24 10,49 10,42 9,31 10,67 10,61 10,19 10,04 10,68 10,94 10,76 9,10 9,96 10,10 10,04 9,53

Bifidobakterie v mléce matek + + + + + + + + + + -

PodČkování: Práce byla sponzorována granty MSM 6046070901, IGA NR/8310-5 a GAýR 525/08/H060. Použitá literatura: 1. Martín R., Langa S., Reviriego C., Jimínez E., Marín M.L., Xaus J., Fernández L., Rodríguez J.M.: Human milk is a source of lactic acid bacteria for the infant gut. J. Pediatr. 143, 754-758, 2003 2. Gueimonde M., Laitinen K., Salminen S., Isolauri E.: Breast milk: a source of bifidobacteria for infant gut development and maturation? Neonatology 92, 64-66, 2007 3. Sin kiewicz G., Nordstrom E.A.: Occurence of Lactobacillus reuteri, lactobacilli and bifidobacteria in human breast milk. Pediatr. Res. 58, 415, 2005 4. Vlková E., Nevoral J., Jenþíková B., Kopeþný J., Godefrooij J., Trojanová I., Rada V.: Detection of infant faecal bifidobacteria by enzymatic methods. J. Microbiol. Meth. 60, 365-373, 2005 5. Orban J.I., Patterson J.A.: Modification of the phosphoketolase assay for rapid identification of bifidobacteria. J. Microbiol. Meth. 40, 221-224, 2000

Kontaktní adresa: VojtČch Rada, Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky, ýeská zemČdČlská univerzita v Praze Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 – Suchdol; [email protected] 102

INHIBIýNÍ ÚýINEK LYSOZYMU NA BIFIDOBAKTERIE POUŽÍVANÉ PěI VÝROBċ MLÉýNÝCH KYSANÝCH VÝROBKģ Šmehilová Martina, Roþková Šárka, Rada VojtČch, Tománková Eva ýeská zemČdČlská univerzita v Praze, Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky Inhibition effect of lysozyme on bifidobacteria isolated from fermented milk products Summary: The lysosyme is an allowed preservative for dairy products. The aim of this work was to compare the effects of lysosyme on bifidobacteria isolated from fermented dairy products, probiotics and other environments. We tested the addition of lysosyme (400μg/ml) in exponencial part of growth curve of 32 strains of bifidobacteria. Bifidobacteria were divided into three groups. First group – sensitive strains isolated from probiotics (12 strains, mainly B. animalis). Second group – species of 9 strains, which were resistant to lysosyme .The specific growth rate in the rest of tested strains (11 strains) was statistically lower in the presence of lysosyme. Our results can be used for the selection of new probiotics strains used in food industry.

Lysozym je povolená konzervaþní látka (E 1105) pro mléþné výrobky. PĜirozenČ se lysozym vyskytuje ve slinách, slzách, je vyluþován na sliznicích a koneþnČ je jednou z hlavních antibakteriálních látek pĜítomných v mateĜském mléce (1). Tento eznym hydrolyzuje glykosidickou ß-1,4 vazbu mezi kyselinou N-acetyl muramovou a 2-acetyl amino-2-deoxy glukosou v peptidoglykanu. Inhibiþní úþinek se proto projevuje hlavnČ na grampozitivní bakterie (2). Inhibiþní úþinek lysozymu byl testován u nČkterých bakterií mléþného kvašení. Laktobacily a laktokoky tolerují koncentraci 35μg/ml (3, 4). O úþincích lysozymu na bifidobakterie je málo známo. Gagnon a kol. (5) testovali pČt kmenĤ bifidobakerií izolovaných ze stolice kojencĤ a þtyĜi sbírkové kmeny lidských bifidobakterií. ýerstvé izoláty byly rezistentní vĤþi koncentraci 300 μg/ml, sbírkové odolávaly koncentraci 200-300 μg/ml. Koncentrace lysozymu v mateĜském mléce je však ještČ vyšší a þiní cca 400 μg/ml (6). Cílem práce bylo proto porovnat úþinky lysozymu na bifidobakterie izolované z mléþných kysaných výrobkĤ, probiotických preparátĤ a dalších prostĜedí.

Materiál a metoda PĜehled použitých bakteriálních kmenĤ je uveden v tabulce 1. Celkem bylo testováno 32 kmenĤ bifidobakterií, pĜiþemž byl testován vliv pĜídavku lysozymu (400 μg/ml). Kmeny byly izolovány a identifikovány pomocí API 50CHL, API ID32A testĤ a druhovČ specifické PCR podle Vlková a kol. (7). Kultury narostlé v TPY médiu (Sharlau, ŠpanČlko) byly pĜeoþkovány do zkumavek (6 opakování pro každý kmen) se stejným médiem a kultivovány pĜi 37oC ve vodní lázni. V hodinových intervalech byla mČĜena optická densita pĜi 540 nm (OD540) pomocí pĜístroje DensiLaMetr (Lacheme, ýR). BezprostĜednČ po zjištČní poþátku logaritmické fáze rĤstové kĜivky byl pĜidán do poloviny zkumavek lysozym (egg lysozyme, Sigma) v koncentraci 400 μg/ml. Výsledky byly vyneseny do grafĤ a byla spoþtena specifická rĤstová rychlost podle vzorce : μ = (lnx – lnx0)/t – t0, kde x a x0 jsou hodnoty OD540 v þasech t a t0 v prĤbČhu exponenciální fáze rĤstové kĜivky.

Výsledky a diskuse Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1 a 2 a na obrázcích 1-3. Na základČ výsledkĤ je možno bifidobakterie rozdČlit do tĜí skupin. První skupinu tvoĜily kmeny izolované z probiotik (12 kmenĤ), které byly vysoce citlivé a zastoupené hlavnČ druhem B. animalis (obrázek 1). Druhou skupinu (9 kmenĤ) tvoĜily kmeny lidského pĤvodu (B. breve, B. bifidum, B. adolescentis a B. longum), na jejichž rĤst nemČl lysozym vliv (obrázek 2). Specifická rĤstová rychlost tČchto kmenĤ 103

se pohybovala od 0,25 do 0,54 h-1. U zbylých kultur (11 kmenĤ) došlo po pĜídavku lysozymu ke statisticky významnému snížení specifické rĤstové rychlosti (obrázek 3, tabulka 2). Z výsledkĤ vyplývá, že existuje velká variabilita v citlivosti bifidobakterií vĤþi lysozymu. ObecnČ kmeny izolované ze zvíĜat se zdají být citlivČjší, než kmeny lidského pĤvodu. Citlivé jsou zejména kmeny izolované z probiotických mléþných kysaných výrobkĤ. Výsledky mohou být využity pro selekci nových kmenĤ bifidobakterií vhodných pro výrobu probiotik. Tabulka I Vliv lysozymu na rĤst bifidobakterií (400 μg/ml). Kmen PĤvod B. adolescentis LUR Stolice dospČlých lidí B. adolescentis H1 Stolice kojencĤ B. bifidum JKM Stolice kojencĤ B. bifidum V22 Stolice dospČlých lidí ATCC 15700 B. breve B. breve AB1 Stolice kojencĤ B. breve KL Stolice kojencĤ B. breve MJB Stolice kojencĤ ATCC 15707 B. longum CCUG 18363 B. adolescentis B. breve MV1 Stolice kojencĤ ATCC 17930 B. infantis B. longum KAM Stolice kojencĤ B. merycicum 813P2 Výkaly telat B. merycicum 813P3 Výkaly telat B. merycicum 813P4 Výkaly telat B. merycicum 23II Výkaly telat B. merycicum 805T1 Výkaly telat B. merycicum 805III2 Výkaly telat B. merycicum J3II Výkaly jehĖat CCUG 24606 B. animalis Kysané mléko B. animalis Kysané mléko B. animalis Probiotické kapsle B. animalis Kysané mléko B. animalis Kysané mléko B. animalis Kysané mléko B. animalis CCM 3762 B. bifidum B. bifidum JOV Stolice kojencĤ B. pseudolongum subsp. DSMZ 20092 globosum B. pseudolongum subsp. DSMZ 20099 pseudolongum DSMZ 6489 B. ruminantium

104

Neroste + + + + + + + + + +

Pomalejší rĤst + + + + + + + + + + + -

Roste + + + + + + + + + -

+

-

-

+

-

-

Obr. 1. RĤst B. animalis – inhibice pĜídavkem lysozymu (ANIM 1 a 2).

Obr. 2. RĤst B. breve – rezistence vĤþi lysozymu (BREVE 1 a 2).

Obr. 3. Zpomalený rĤst B. merycicum vlivem lysozymu (23II L). 105

Tabulka 2 Specifická rĤstová rychlost bifidobakterií v médiu s a bez lysozymu. U všech kmenĤ byla specifická rĤstová rychlost statisticky významnČ nižší (P < 0,01) po pĜídavku lysozymu. Kmen

PĤvod

B. adolescentis B. breve MV1 B. infantis B. longum KAM B. merycicum 813P2 B. merycicum 813P3 B. merycicum 813P4 B. merycicum 23II B. merycicum 805T1 B. merycicum 805III2 B. merycicum J3II

CCUG 18363 Stolice kojencĤ ATCC 17930 Stolice kojencĤ Výkaly telat Výkaly telat Výkaly telat Výkaly telat Výkaly telat Výkaly telat Výkaly jehĖat

Kontrola

Lysozym

0,295 ± 0,09 0,242 ± 0,05 0,138 ± 0,02 0,168 ± 0,01 0,169 ± 0,01 0,205 ± 0,05 0,162 ± 0,01 0,118 ± 0,05 0,323 ± 0,06 0,310 ± 0,08 0,368 ± 0,05

0,105 ± 0,01 0,192 ± 0,05 0,073 ± 0,02 0,060 ± 0,03 0,101 ± 0,03 0,106 ± 0,02 0,121 ± 0,03 0,078 ± 0,02 0,192 ± 0,05 0,175 ± 0,05 0,368 ± 0,05

PodČkování: Práce byla sponzorována granty MSM 6046070901 a GAýR 525/08/H060. Literatura 1. Field C.J. (2005): The immunological components of human milk and their effect on immune development in infants. Journal of Nutrition. 135, 1-4. 2. Lönnerdal B. (2003): Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. American Journal of Clinical Nutrition. 77, 1537S-1543S. 3. Kozáková D., Holubová J., Plocková M., Chumchalová J., ýurda L. (2005): Impedance measurement of growth of lactic acid bacteria in the presence of nisin and lysozyme. European Food Research and Technology. 221, 774-778. 4. Scharfen E.C., Mills D.A., Maga E.A. (2007): Use of human lysozyme transgenic goat milk in cheese making: effect on lactic acid bacteria performance. Journal of Dairy Science. 90, 4084-4091. 5. Gagnon M., Kheadr E.E., Le Blay G., Fliss I. (2004): In vitro inhibition of Escherichia coli O157:H7 by bifidobacterial strains of human origin. International Journal of Food Microbiology. 92, 69-78. 6. Clare D.E., Catignani G.L., Swaisgood H.E. (2003): Biodefense properties of milk: the role of antimicrobial proteins and peptides. Current Pharmaceutical Design. 9, 1-17. 7. Vlková E., Nevoral J., Jencikova B., Kopeþný J., Godefrooij J., Trojanová I., Rada V. (2005): Detection of infant faecal bifidobacteria by enzymatic methods. Journal of Microbiological Methods. 60, 365-373.

Kontaktní adresa: Martina Šmehilová, Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky, ýeská zemČdČlská univerzita v Praze, Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 – Suchdol [email protected]

106

PěEŽÍVÁNÍ BIFIDOBAKTERIÍ V KRAVSKÉM MLÉCE Tománková Eva, Homutová Iva, Šmehilová Martina, Dubná SoĖa, Rada VojtČch ýeská zemČdČlská univerzita v Praze, Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky Survival of bifidobacteria in cow milk Summary: New probiotic bacteria were selected by their physiological and technological properties. One of important technological characteristics is ability to survive in cow milk. Hence, the aim of our work was to test ability of human bifidobacteria to ferment cow milk and survive in this condition. Bifidobacteria were isolated from human faecal samples and commercial probiotic products by modified TPY agar, isolates were identified by biochemical test, FISH and PCR. Sensitivity to low pH and bile was tested and auto-aggregation characteristics were measured. Four human origin strains and 4 strains isolated from probiotic product (two of them were human and two animal origin) were tested for their ability to ferment cow milk and survive in fermented milk in aerobic and anaerobic condition in 4 °C. All strains tested fermented cow milk reaching counts from 7.80 to 9.63 log CFU/ml. Human origin bifidobacteria survived for 3-6 week in anaerobic and maximum for 3 week in aerobic storage condition. Animal origin strains were survived in both trials in counts higher than 106 CFU/ml for 12 weeks at least. Human origin strains showed very good physiological properties, were able to fermented cow milk, but their surviving in fermented milk products was poor. It could be concluded that human origin bifidobacteria with better technological features for probiotic use should be selected.

Úvod Trávicí trakt teplokrevných živoþichĤ vþetnČ þlovČka je osídlen velmi komplexní mikroflórou, která má zásadní vliv na zdravotní stav hostitele. Souþástí normální stĜevní mikroflóry dospČlého þlovČka je více než 500 rĤzných druhĤ bakterií (1), dominantní jsou fakultatinvČ a obligátnČ anaerobní bakterie rodĤ Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium, Clostridium, Peptococcus, Peptostreptococcus, Ruminococcus, Escherichia, Enterobacter, Enterococcus, Klebsiella a Lactobacillus (2, 3). Pro úpravu rovnováhy gastrointestinální mikroflóry napĜíklad po antibiotické léþbČ, prĤjmových a jiných onemocnČní trávicího traktu, jsou používána probiotika, þasto se jedná o bifidobakterie (4). Bifidobakterie jsou grampozitivní, nepohyblivé, sacharolytické, pleomorfní, striktnČ anaerobní, nesporulující, sacharolytické tyþinky (5), které pĜíznivČ ovlivĖují zdravotní stav svého hostitele. Produkcí silných organických kyselin snižují pH tráveniny tlustého stĜeva, þímž potlaþují hnilobné bakterie, snižují hladinu sérového cholesterolu v krvi, mají antikancerogenní aktivitu, napomáhají pĜi aktivaci imunitního systému a produkují vitamíny skupiny B (1). K tomu, aby mohlo docházet k pozitivnímu pĤsobení na pĜirozenou mikroflóru stĜeva exogenními bakteriemi, je nutné, aby tyto mikroorganizmy po požití hostitelem prošly celým trávicím traktem až do stĜeva v neporušeném stavu s vysokou vitalitou. Tzn., musí odolávat velice nízkým hodnotám pH v žaludku, úþinkĤm žluþových kyselin a pĤsobení trávicích enzymĤ. Probiotické bakterie by mČly být schopny adherovat na stĜevní epitel hostitele a dlouhodobČ pĜežívat v trávicím traktu, popĜípadČ trávicí trakt trvale kolonizovat. Používané probiotické mikroorganizmy musí být všeobecnČ uznávané jako bezpeþné a bez zdravotních rizik pro hostitele, mČly by vykazovat antagonistickou aktivitu vĤþi patogenním a potenciálnČ patogenním mikroorganizmĤm a mČly by celkovČ pozitivnČ ovlivĖovat zdraví hostitele. Probiotické bakterie musí splĖovat také technologická kritéria, musí být tedy schopné ve vysokých poþtech pĜežívat procesy, kterými prochází pĜi pĜípravČ do podoby vhodné pro konzumenta. MČly by odolávat pĤsobení kyslíku, v pĜípadČ, že jsou podávány v podobČ mléþných kysaných výrobkĤ, musí dlouhodobČ pĜežívat pĜi nízkých hodnotách pH a musí dobĜe snášet lyofilizaci. Dále by mČly mít dobré senzorické vlastnosti a musí být rezistentní k bakteriofágovým infekcím (6, 7). VČtšina druhĤ bifidobakterií je hostitelsky specifická a do výrobkĤ urþených pro lidskou výživu by tedy mČly být pĜidávány kmeny výhradnČ humánního pĤvodu. Protože Ĝada v souþasné dobČ používaných probiotik tato kritéria nesplĖuje (8), je nutné vyvinout vhodné a citlivé metody stanovení, charakterizace a identifikace bifidobakterií trávicího traktu lidí a urþit kmeny vhodné jako 107

probiotikum. Cílem naší práce bylo testování schopnosti bifidobakterií izolovaných z trávicího traktu lidí prokysávat kravské mléko a pĜežívat v tomto prostĜedí. Materiál a metody Kmeny bifidobakterií byly izolovány ze vzorkĤ stolice kojencĤ a dospČlých dobrovolníkĤ pomocí modifikovaného TPY agaru (MTPY; Sharlau, ŠpanČlsko) s pĜídavkem mupirocinu (100 mg/l) a acetátu v koncentraci 1 ml/l (9). Izoláty byly identifikovány na úroveĖ rodu na základČ detekce pro bifidobakterie specifického enzymu fruktózo-6-fosfát fosfoketolázy, metodou podle Orban a Patterson (10) v porovnání s rodovČ specifickou PCR (11) a metodou fluorescenþní in situ hybridizace (kit pro kvalitativní stanovení Bifidobacterium sp., RiboTechnologies, Holandsko). Pro druhovou identifikaci byly kmeny charakterizovány soupravami API 50 CHL a Rapid ID 32 A (BioMérieux, Francie). Vlastní identifikace byla provedena na základČ výsledkĤ tČchto testĤ poþítaþovým programem Bacter (http://kounou.lille.inra.fr:8080/Identification/index.html, Lille, Francie). Výsledky identifikace byly potvrzeny druhovČ specifickou PCR (12, 13). Vybrané izoláty bifidobakterií byly testovány na schopnost odolávat žluþi a kyselému prostĜedí podle Mättö et al. (14). Suspenze bunČk byla smíchána s fosfátovým pufrem s pH upraveným na hodnotu 3 pomocí HCl pro tetování tolerance k nízkému pH a s pufrem s pĜídavkem žluþe (1,5 %) pro testování odolnosti bifidobakterií k žluþi. Suspenze bunČk byla oþkována také do fosfátového pufru s pH 7,2 pro kontrolu. Takto pĜipravené suspenze byly anaerobnČ inkubovány ve vodní lázni pĜi teplotČ 37 °C. Poþty bunČk byly stanoveny po 1 a 2 hodinách (tolerance k nízkému pH), 2 a 3 hodinách (tolerance ke žluþi) a 0, 2, a 3 hodinách (kontrola) pomocí deskové metody s použitím TPY agaru (ADSA, ŠpanČlsko). Ze stanovených hodnot byl vypoþítán úbytek bunČk bČhem inkubace v testovaných prostĜedích. Byly sledovány autoagregaþní vlastnosti izolátĤ bifidobakterií. BuĖky schopné autoagregace vytváĜejí viditelné shluky, které se usazují na dnČ zkumavky, kultury bakterií neschopné agregace se vyznaþují trvalým zákalem. PĜes noc narostlá kultura bifidobakterií byla pĜelita do zkumavky, dobĜe promíchány a ponechány v klidu, z vrchní þásti byla po 5 hodinách odebrána suspenze a byl mČĜen její zákal (O.D.) pĜi vlnové délce 600 nm. Schopnost autoagregace byla vyjádĜena v procentech a vypoþtena z následujícího vztahu: A = [1 – (O.D./ O.D.0) x 100], kde O.D. je zákal na konci mČĜení a O.D.0 zákal na poþátku mČĜení (15). Byly vybrány 4 kmeny bifidobakterií s autoagregaþními vlastnostmi, odolávající nízkému pH a žluþi a byla testována jejich schopnost prokysávat kravské mléko a pĜežívat v kysaném mléce. Bifidobakteriemi bylo zaoþkováno kravské mléko (10 g sušeného odtuþnČného kravského mléka/100 ml vody), které bylo 20 minut vyvaĜeno ve vodní lázni a následnČ hermeticky uzavĜeno nebo pĜekryto hliníkovou folií. Kultivace probíhala 24 hodin pĜi 37 °C. Po prokysání byl kultivaþnČ stanoven poþet bifidobakterií na TPY agaru (Sharlau, ŠpanČlsko), mléko bylo skladováno v aerobních (Erlenmajerova baĖka pĜekrytá hliníkovou folií) a anaerobních (hermeticky uzavĜené vialky) podmínkách pĜi 4 °C. Poþty bifidobakterií byly stanoveny v týdenních intervalech. V porovnání s izoláty lidského pĤvodu byly na pĜežívání v kravském mléce testovány také bifidobakterie izolované z komerþnČ dostupných probiotických výrobkĤ. Tyto kmeny byly identifikovány stejným zpĤsobem jako bakterie lidského pĤvodu. Výsledky a diskuse Pro testování schopnosti bifidobakterií izolovaných z trávicího traktu lidí prokysávat kravské mléko a pĜežívání v tomto prostĜedí byly vybrány kmeny s dobrými fyziologickými vlastnostmi, u kterých pĜedpokládáme schopnost prĤchodu trávicím traktem ve vysokých poþtech. Vybrané izoláty vykazovaly vČtší citlivost k nízkému pH než ke žluþi. Po tĜech hodinách inkubace v prostĜedí s 1,5 % žluþi neklesl poþet bifidobakterií ani o jeden Ĝád. PĜi inkubaci kmenĤ v prostĜedí s pH 3 došlo k poklesu maximálnČ o dva Ĝády, u kmene B. bifidum JKM byl zaznamenán pokles pouze 0,05 log KTJ/ml. Kmeny lidského pĤvodu navíc vykazovaly silnou autoagregaþní aktivitu, která se pohybovala od 70 do 80 %. Autoagregaþní vlastnosti jsou spojovány se schopností kmenĤ 108

adherence na stĜevní epitel, existuje tedy pĜedpoklad, že tyto kmeny by mohly trvale kolonizovat trávicí trakt hostitele. Výsledky identifikace bifidobakterií izolovaných ze stolice kojencĤ a dospČlých dobrovolníkĤ a z probiotických výrobkĤ jsou uvedeny v tabulce þíslo I. Z komerþních probiotických lyofilizovaných práškĤ byly izolovány kmeny lidského pĤvodu, z jogurtĤ to byly druhy B. pseudolongum a B. animalis ssp. lactis, tedy kmeny pravdČpodobnČ pĤvodu animálního.

Tabulka I Výsledky identifikace bifidobakterií. rodová identifikace kmen

druhová identifikace

pĤvod F6PPK

FISH

PCR

API + Bacter

PCR

JOV

kojenec

+

+

+

B. bifidum

B. bifidum

EV2

dospČlý

+

+

+

B. bifidum

B. bifidum

JKM

kojenec

+

+

+

B. bifidum

B. bifidum

TP1

kojenec

+

+

+

B. longum

B. longum

BM

probiotikum

+

+

+

B. bifidum

B. bifidum

BV

probiotikum

+

+

+

B. longum

B. longum

DN

jogurt

+

+

+

B. pseudolongum

B. pseudolongum

BB

jogurt

+

+

+

B. animalis

B. lactis

Všechny testované kmeny (Tabulka I) byly schopny dobĜe prokysávat kravské mléko, poþty bifidobakterií se pohybovaly od 7,80 do 9,12 log KTJ/ml pĜi kultivaci v Erlenmajerových baĖkách pĜikrytých hliníkovou folií (aerobní prostĜedí) a od 7,69 do 9,63 log KTJ/ml pĜi kultivaci v uzavĜených vialkách (anaerobní prostĜedí). Poþty bifidobakterií stanovené v mléce po kultivaci obČma metodami se statisticky významnČ nelišily. Množství bifidobakterií stanovené bČhem skladování je znázornČno na obrázcích 1 a 2. Bifidobakterie pĜežívaly v kravském kysaném mléce déle pĜi skladování v anaerobních podmínkách (obrázek 1) než pĜi skladování v podmínkách aerobních (obrázek 2). Kmeny lidského pĤvodu izolované pĜímo ze vzorkĤ stolice i izoláty z probiotických výrobkĤ pĜežívaly v anaerobních podmínkách 3 až 6 týdnĤ. Kmeny B. pseudolongum DN a B. animalis ssp. lactis BB izolované z jogurtĤ, které byly pĤvodnČ pravdČpodobnČ izolované z trávicího traktu zvíĜat, byly detekovány v poþtech vyšších než 106 KTJ/ml po dobu 12 týdnĤ a to jak pĜi skladování v aerobních i anaerobních podmínkách. Bifidobakterie lidského pĤvodu pĜežívaly v kravském mléce maximálnČ 3 týdny pĜi aerobním skladování, poþty vyšší než 106 KTJ/ml byly zaznamenány pouze po 1 týdnĤ skladování. Jeden kmen dosahoval tČchto poþtĤ po 2 týdnech skladování.

109

Obr. 1. Poþty bifidobakterií v kysaném kravském mléce stanovené bČhem skladování v anaerobních podmínkách.

Obr. 2. Poþty bifidobakterií v kysaném kravském mléce stanovené bČhem skladování v aerobních podmínkách.

V kravském mléce pĜežívaly výraznČ lépe bifidobakterie animálního pĤvodu než kmeny pĤvodnČ izolované z trávicího traktu þlovČka. Jedná se zĜejmČ o jeden z dĤvodĤ, proþ jsou do potravin s pĜídavkem probiotických bakterií používány kmeny izolované z trávicího traktu zvíĜat (8, 16). Testované kmeny vykazovaly velmi dobré fyziologické vlastnosti, ale jejich použití do mléþných kysaných výrobkĤ je nevhodné. Testované kmeny sice dobĜe prokysávají kravské mléko, ale nejsou schopny v tomto prostĜedí dlouhodobČ pĜežívat. Vzhledem k tomu, že testované bifidobakterie vykazovaly vysokou odolnost k nízkému pH, je jejich pokles pĜi skladování zpĤsobený zejména pĤsobením vzdušného kyslíku než obsahem organických kyselin v kysaném mléce.

110

ZávČr Byla vybrána Ĝada kmenĤ bifidobakterií izolovaných z trávicího traktu lidí s vhodnými fyziologickými vlastnostmi, které by mohly být testovány jako nové probiotikum pro þlovČka. Naše výsledky ovšem ukazují, že tyto kmeny nejsou schopny dlouhodobČ pĜežívat v kysaném kravském mléce. Z technologického hlediska se tedy jedná o nevhodné kmeny a do budoucna je nutné hledat další izoláty bifidobakterií, které by splĖovaly i technologická kriteria kladená na probiotické bakterie. PodČkování: Práce byla sponzorována granty MSM 6046070901 a GAýR 525/08/H060. Použitá literatura: 1. Leahy S.C., Higgins D.G., Fitzgerald G.F., van Sinderen D.: Getting better with bifidobacteria. J Appl Microbiol. 98, 1303-1315, 2005. 2. Orrhage K., Nord C.E.: Bifidobacteria and lactobacilli in human health. Drugs Explt Clin Res. 26, 95111, 2000. 3. Vaughan E.E., Schut F., Heilig H.G., Zoetendal E.G., de Vos W.M., Akkermans A.D.: A molecular view of the intestinal ecosystem. Curr Issues Intest Microbiol. 1, 1-12, 2000. 4. Tannock G.W (ed): Probiotics and Prebiotics - where are we going? p. 333, IBT Global, Norflok, England, 2002. 5. Scardovi V.: Genus Bifidobacterium, pp. 1418-1434 in P.H.A. Sneath, N.S. Mair, M.E. Sharpe, J.G. Holt (eds.): Bergey's "Manual of Systematic Bacteriolgy". Williams and Wilkins. Baltimore, 1986. 6. Biavati B., Vescovo M., Torriani S., Bottazzi V.: Bifidobacteria: history, ecology, physiology and applications. Ann Microbiol. 50, 117-131, 2000. 7. Sheil B., Shanahan F., O’Mahony L.: Probiotic effects on inflammatory bowel disease. J Nutr. 137, 819S-824S, 2007. 8. Vlková E., Rada V., Trojanová I.: Enumeration, isolation and identification of bifidobacteria from dairy product. Acta Agriculturae Slovenica. 84, 31-36, 2004. 9. Rada V., Petr J.: A new selective medium for the isolation of glucose nonfermenting bifidobacteria from hen caeca. J Microbiol Meth. 43, 127-132, 2000. 10. Orban J.I., Patterson J.A.: Modification of the phosphoketolase assay for rapid identification of bifidobacteria. J Microbiol Meth. 40, 221-224, 2000. 11. Kok R.G., De Wall A., Schut F., Welling G.W., Weenk G., Hellingwerf K.J.: Specific detection and analysis of a probiotic Bifidobacterium strain in infant feces. Appl Environ Microbiol. 60, 3668-3672, 1996. 12. Matsuki T., Watanabe K., Tanaka R., Fukuda M., Oyaizu H.: Distribution of bifidobacterial species in human intestinal microflora examined with 16S rRNA-gene-targeted species-specific primers. Appl Environ Microbiol. 65, 4506-4512, 1999. 13. Ventura M., Reniero R., Zink R.: Specific identification and targeted characterization of Bifidobacterium lactis from different environmental isolates by a combined multiplex-PCR approach. Appl Environ Microbiol. 67, 2760-2765, 2001. 14. Mättö J., Malinen E., Suihko M.L., Alander M., Palva A., Saarela M.: Genetic heterogeneity and functional properties of intestinal bifidobacteria. J Appl Microbiol. 97, 459-470, 2004. 15. Del Re B. Sgorbati B., Miglioli M., Palenzola D.: Adhesion, autoaggregation and hydrophobicity of 13 strains of Bifidobacterium longum. Lett Appl Microbiol. 31, 438-442, 2000. 16. Salminen S.J., Gueimonde M., Isolauri E.: Probiotics that modify disease risk. J Nutr. 135, 1294-1295, 2005.

Kontaktní adresa: Eva Tománková, Katedra mikrobiologie, výživy a dietetiky, ýeská zemČdČlská univerzita v Praze, Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 – Suchdol, [email protected] 111

Plakátová sdČlení

SLEDOVÁNÍ VÝSKYTU PSYCHROTROFNÍCH MIKROORGANISMģ V SYROVÉM MLÉCE Hoferková Petra, Košinová Marcela, Burdychová Radka Ústav technologie potravin, Mendelova zemČdČlská a lesnická univerzita v BrnČ Monitoring occurence of psychrotrophic microorganisms in raw milk Summary: The group of psychrotrophic microorganisms belongs to the microorganisms representing a risk for human health as well as a risk of milk and milk products spoilage. Some genus are considered to be significant producers of proteolytic and lipolytic enzymes. In this work, we analysed raw milk samples originated from 6 diffrent suppliers from the area of North and Middle Moravia. The screening was performed from january to december 2007. For isolation and enumeration of psychrotrophic bacteria cultivation method described by ýSN ISO 6730 was used. Isolated strains were inoculated on blood agar, analysed microscopically and identified by biochemical tests and genus-specific PCR. All identified bacterial strains were tested for ability to produce proteolytic and lipolytic enzymes. Higher numbers of psychrotrophic microorganisms were detected in summer months. The most commonly identified genus in raw milk was of the genus Pseudomonas, less frequently the genus Bacillus, Flavobacterium and Alcaligenes. The ability to produce proteases and lipases was found at all identified bacterial strains.

Úvod Mezi nejvýznamnČjší zemČdČlskou a potravináĜskou komoditu patĜí mléko, které hraje významnou roli ve výživČ lidí. Kvalita mléka a výrobkĤ z mléka se zaþíná odvíjet od hygienických podmínek a technologického vybavení zemČdČlské prvovýroby, pĜes svoz mléka, pĜíjem mléka v mlékárenském závodČ až po samotný technologický proces zpracování na sortiment mléka a mléþných výrobkĤ2. Mezi mikroorganismy zpĤsobující kromČ zdravotních rizik i rizika vad mléka a mléþných výrobkĤ patĜí i skupina psychrotrofních mikroorganismĤ7. NejþastČjšími zástupci psychrotrofních mikroorganismĤ v syrovém mléce jsou gramnegativní bakterie rodĤ Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Aeromonas, Serratia, Chromobacterium a grampozitivní bakterie rodĤ Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Streptococcus, Lactobacillus a Microbacterium9. Psychrotrofní mikroorganismy se dostávají do mléka primárnČ z krmiv, prachu a z kontaminované vody. NejvýznamnČjším sekundárním zdrojem psychrotrofních mikroorganismĤ jsou nedostateþnČ þištČné a dekontaminované plochy, které se stýkají s chlazeným mlékem, potrubí a chladící nádrže, ve kterých se mléko souþasnČ chladí4. Psychrotrofní mikroorgnismy jsou schopné rĤstu a metabolických projevĤ i pĜi nízkých teplotách, kolem 4 ºC. PĜi této teplotČ je mléko uchováváno v mléþnicích, pĜi pĜepravČ ke zpracovateli i v dobČ skladování a distribuce hotových výrobkĤ. Vzhledem k tomu, že nízké teploty neinhibují tvorbu a þinnost enzymatických systémĤ proteas a lipas, mĤže dojít ke zmČnám struktur bílkovin a tukĤ, zvláštČ pak po delší dobČ skladování surovin a produktĤ13. Cílem této práce bylo sledování výskytu psychrotrofních mikroorganismĤ v syrovém mléce a jejich identifikace pomocí kultivaþních, biochemických a molekulárnČ-biologických metod. Materiál a metodika V této práci byly analyzovány vzorky syrového mléka, které pocházely od 6 rĤzných dodavatelĤ z oblasti severní a stĜední Moravy. Vzorky syrového mléka byly odebírány podle normy ýSN ISO 707. Celkový poþet mikroorganismĤ (CPM) byl stanoven podle normy ýSN ISO 6610. Pro izolaci a zjištČní poþtu psychrotrofních bakterií byla použita kultivaþní metoda, popsaná normou ýSN ISO 6730, kultivace probíhala na živné pĤdČ PCA se sušeným mlékem (NOACK, ýR) pĜi teplotČ 6,5 oC po dobu 10 dnĤ. Izolované kmeny byly vyoþkovány na krevní agar, mikroskopicky hodnoceny (Gramovo barvení) a identifikovány pomocí biochemických testĤ (kataláza test, ENTEROtest 16, NEFERMtest 24, ONP a OXI test (Lachema, ýR) a pomocí rodovČ-specifických PCR. Pro stanovení proteolytické aktivity byl použit Nutrient Gelatin agar 115

(HiMedia, Indie). Lipolytická aktivita byla stanovena na Spirit Blue agaru (HiMedia, Indie) a Tributyrin agaru (HiMedia, Indie). U statisticky významného poþtu izolátĤ byla provedena molekulárnČ biologická identifikace zastoupených rodĤ psychrotrofních mikroorganismĤ. Z dobĜe narostlých mikrobiálních kultur vybraných psychrotrofních bakterií byla izolována DNA. Standardní manipulace s DNA byla provedena podle Sambrooka a Russella8 a Ausubela a kol.1 Kvalita DNA byla ovČĜena pomocí gelové elektroforézy v agarózovém gelu, po obarvení fluorescenþním barvivem ethidium bromidem byla DNA detekována záĜením v UV svČtle. PCR byla provedena pro rod Pseudomonas podle metody, kterou uvádí Gunasekera a kol.5 a pro rod Bacillus podle návodu, který popisuje Wu a kol.15

1400000 1200000 1000000 CPM

800000 600000

CPP

400000 200000 Prosinec

Listopad

ěíjen

ZáĜí

Srpen

ýervenec

ýerven

KvČten

Duben

BĜezen

Únor

0 Leden

Poþet mikroorganismĤ [CFU/ml]

Výsledky a diskuse V období od ledna do prosince 2007 bylo vyšetĜeno celkem 72 vzorkĤ syrového mléka. Celkový poþet psychrotrofních mikroorganismĤ (CPP) byl sledován v závislosti na celkovém poþtu mikroorganismĤ, což uvádí graf þ. 1 (Obr. 1). Hodnoty CPM se pohybovaly v rozmezí od 7,0.103 do 8,3.106 CFU/ml a CPP od 1,0.103do 8,2.106 CFU/ml. Mléko získané za dobrých hygienických podmínek obyþejnČ obsahuje ménČ než 10% psychrotrofních mikroorganismĤ z celkového poþtu mikroorganismĤ, který nepĜesahuje 104 v 1 ml3. Poþet kolonií nad 105 v 1 ml signalizuje nevyhovující podmínky získávání mléka6. Vyšší poþty CPM a CPP byly stanoveny v jarních a letních mČsících, což koreluje s výsledky, které uvádí ve své studii VyletČlová a kol.14.

MČsíc

Obr. 1. Srovnání CPM a CPP v jednotlivých mČsících roku 2007

PĜevážnou vČtšinu izolátĤ CPP tvoĜil typický pĜedstavitel technologických problémĤ – bakterie rodu Pseudomonas (62%). Bakterie rodu Bacillus tvoĜily 37% izolátĤ (Obr. 2). Pseudomonády se úþastní kažení mléka a mléþných výrobkĤ tím, že produkují extracelulární termostabilní proteolytické a lipolytické enzymy10. Pseudomonas je tak z hlediska možnosti mikrobiologické kontaminace v prvovýrobČ i pĜi zpracování mléka technologicky nejvýznamnČjším potenciálním kontaminantem12, což je v kontrastu s USA, kde bývá na první místo Ĝazen spory tvoĜící druh Bacillus11. V malé míĜe byly identifikovány rody Flavobacterium a Alcaligenes.

116

70% 60%

Výskyt

50% 40% 30% 20% 10% 0% Pseudomonas

Bacillus

Rod

Obr. 2. Srovnání výskytu izolátĤ rodu Pseudomonas a Bacillus ze syrového mléka

ZávČr V prĤbČhu roku 2007 byly poþty CPM a CPP nejvyšší v jarních a letních mČsících. Pomocí rodovČ specifické PCR bylo 62% identifikovaných izolátĤ zaĜazeno do rodu Pseudomonas a 37% k rodu Bacillus.

Použitá literatura: 1. AUSUBEL, F. M., BRENT, R., KINGSTON, R. E., MOORE, D. D., SEIDMAN, J. G., SMITH, J. A., STRUHL, K. Current Protocols in Molecular Biology. 1st. ed. New York : Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, 1994. 350 p. 2. BURDOVÁ, O., BARANOVÁ, M. Sanitaþní režim v poĐnohospodárskej prvovýrobe a jeho vplyv na asociáciu mikroorganizmov mlieka. Mliekarstvo, 2005, roþ. 36, þ. 3, s. 11-15. 3. BURDOVÁ, O., BARANOVÁ, M. Vplyv technologicky nežiadúcej mikroflóry na kvalitu mlieka a mlieþnych výrobkov. Mliekarstvo, 2005, roþ. 36, þ. 2, s. 18-20. 4. GėRNER, F., VALÍK, ď. Aplikovaná mikrobiológia požívatín. 1. vyd. Bratislava : Malé centrum, 2004. 528 s. 5. GUNASEKERA, T. S., DORSCH, M. R., SLADE, M. B., VEAL, D. A. Specific detection of Pseudomonas spp. in milk by fluorescence in situ hybridization using ribosomal RNA directed probes. Journal of Applied Microbiology, 2003, vol. 94, no. 5, p. 936-945. 6. LUKÁŠOVÁ, J., HOLEC, J., RYŠÁNEK, D., OSTRÝ, V. Hygiena a technologie produkce mléka. 1.vyd. Brno : Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 1999. 101 s. 7. MARTH, E. H., STEELE, J. L. Applied Dairy Microbiology. 2nd. ed. New York : Marcel Dekkr, 2001.736 p. 8. SAMBROOK, J., RUSSELL, I. Molecular Cloning: A Laboratory Manual II., 3rd. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press : New York, 2001. 2344 p. 9. SORHAUG, T., STEPANIAK, L. Psychrotrophs and their enzymes in milk and dairy products: quality aspects. Trends in Food Science and Technology, 1997, vol. 8, no. 2, p. 35–41. 10. STEPANIAK, L. Dairy enzymology. International Journal of Dairy Technology, 2004, vol. 57, no. 2-3, p. 153-166. 11. STEVENSON, G., ROWE, M., WISDOM, B., KILPATRICK, D. Growth kinetics and hydrolytic enzyme production of Pseudomonas spp. isolated from pasteurized milk. Journal of Dairy Research, 2003, vol. 70, no. 3, p. 293-296.

117

12. VYLETċLOVÁ, M., HANUŠ, O. Vliv kontaminace Pseudomonas fluorescens na hlavní složky a technologické vlastnosti pasterizovaného mléka bČhem skladování. Czech Journal of Food Sciences, 2000, vol. 18, no. 6, p. 224-234. 13. VYLETċLOVÁ, M., BENDA, P., HANUŠ, O., KOPUNECZ, P. Stanovení celkového poþtu psychrotrofních bakterií v bazénových vzorcích mléka a jejich vztah k celkovému poþtu mikroorganismĤ. Czech Journal of Food Sciences, 1999, vol. 17, no. 6, p. 216-222. 14. VYLETċLOVÁ, M., HANUŠ, O., URBANOVÁ, E., KOPUNECZ, P. Výskyt a identifikace psychrotrofních bakterií s proteolytickou a lipolytickou aktivitou v bazénových vzorcích mléka v podmínkách technologií prvovýrobního uskladnČní. VeterináĜství, 1999, roþ. 49, þ. 11, s. 480-482. 15. WU, X. Y., WALKER, M. J., HORNITZKY, M., CHIN, J. Development of a group-specific PCR combined with ARDRA for the identification of Bacillus species of environmental significance. Journal of Microbiological Methods, 2006, vol. 64, no. 1, p. 107-119. 16. ýSN ISO 6610 Stanovení poþtu jednotek mikroorganismĤ tvoĜících kolonie. Technika poþítání kolonií vykultivovaných pĜi 30 °C. 17. ýSN ISO 6730 Stanovení poþtu jednotek tvoĜících kolonie psychrotrofních mikroorganismĤ . Technika poþítání kolonií vykultivovaných pĜi 6,5 °C. 18. ýSN ISO 707 SmČrnice pro odbČr vzorkĤ.

Kontaktní adresa: Mgr. Petra Hoferková, Ústav technologie potravin, Mendelova zemČdČlská a lesnická univerzita v BrnČ, ZemČdČlská 1, 613 00 Brno, [email protected] Ing. Radka Burdychová Ph.D., Ústav technologie potravin, Mendelova zemČdČlská a lesnická univerzita v BrnČ, ZemČdČlská 1, 613 00 Brno, [email protected]

118

STANOVENIE MEZOFILNÝCH A PSYCHROTROFNÝCH AERÓBNYCH SPORULUJÚCICH MIKROORGANIZMOV V SUROVOM KRAVSKOM MLIEKU Kirchnerová Katarína, Foltys Vladimír Slovenské centrum poĐnohospodárskeho výskumu, Výskumný ústav živoþíšnej výroby, Nitra, SR Estimation of mesophylic and psychrotrophic aerobe sporulating microorganisms in raw cow's milk Summary: The occurrence of mesophilic and psychrotrophic aerobic sporulating microorganisms (MPAS) in raw cow’s milk (RCM) was studied. 294 samples of raw cow’s milk in 14 farms were taken during one year. Basis of the method for MPAS assessment is to inactivate the milk sample at the temperature 80–82°C for 30 minutes and incubation in cultivation dishes at 30°C for 3 days – mesophilic aerobic sporulates (MAS), and at 7°C for 10 days – psychrotrophic aerobic sporulates (PAS). Results of studied microbiological parameters characterize the studied milk as complying with requirements of the EU regulation 92/46 and standard STN 57 0529. Mesophilic and psychrotrophic aerobic sporeforming microorganisms count (MPAS) ranged from 2.5 to 340 CFU.ml-1. Average value of MPAS was 59.4 CFU.ml-1 and variation coefficient 93.1 %. Count up to 50 CFU.ml-1 was in 55.4% samples, in 85% was the value not higher than 100, and in 3.1% samples was the count of MPAS higher than 200. MPAS count found in the same dishes at incubation for mesophilic and subsequently strictly psychrophilic microorganisms (MAS + SPAS) was on average 56.9 CFU.ml-1, it represents 95.8 % out of the number of sums of individual dishes at two temperatures. Correlation coefficient of these two types of results r = 0.99 gives evidence of close dependence that is expressed by linear regression equation y = x - 2.5056. Use of two incubation temperatures one after another with identical set of dishes enables to exclude overestimation of results with sporulates able to grow at both incubation temperatures.

Úvod V záujme þo najviac uchovaĢ pôvodný charakter mlieka a biologicky aktívnych látok v Ėom obsiahnutých, je snaha používaĢ þo najšetrnejšie spôsoby ošetrenia surového kravského mlieka, rôzne kombinácie teploty a þasu tak, aby sa zachovala jeho biologická hodnota, pri súþasnom zabezpeþení jeho mikrobiologickej neškodnosti a þo možno najdlhšej trvanlivosti. Platí preto, že þím menšia je kontaminácia suroviny, tým väþšia je pravdepodobnosĢ dosiahnutia požadovanej trvanlivosti mliekarenských produktov. Najvýznamnejšou súþasĢou nežiadúcich baktérií sú spórotvorné mikroorganizmy, ktoré sú vćaka schopnosti tvorby termorezistentných spór schopné prežívaĢ tepelné ošetrenie a prenikaĢ tak do finálnych výrobkov. Spórotvorné mikroorganizmy sú striktne anaeróbne, rod Clostridium, ktoré spôsobujú problémy predovšetkým pri dlhodobom zrení syrov, tzv. neskoré nadúvanie, alebo sú fakultatívne anaeróbne, teda pomnožujú sa za aeróbnych i anaeróbnych podmienok, rod Bacillus, ktorý má väþší význam pre výrobu konzumného mlieka a þerstvých mlieþnych výrobkov. V pasterizovanom mlieku a smotane psychrotrofný Bacillus cereus spôsobuje defekt sladkého zrážania, a v zahusĢovanom mlieku rast Bacillus subtilis a Bacillus coagulans spôsobuje nežiadúcu koaguláciu bielkovín. Sú to indikátory mikrobiologickej kvality balených výrobkov s dlhodobou trvanlivosĢou. Spóry prežívajúce pasterizáciu obmedzujú dobu možného skladovania a skracujú termíny spotreby mlieþnych potravín. Odber fázových vzoriek mlieka poþas celého procesu výroby trvanlivého, tzv.UHT (ultra high temperature) mlieka (tepelné ošetrenie 138°C trvajúce 4 sekundy) a identifikácia pomocou ribotypizácie, biochemických a fyziologických testov a charakteristika izolovaných kmeĖov rodu Bacillus svedþia o ich prieniku touto technológiou [7]. V mlieku ošetrenom technológiou HTST (high temperature-short time) bol v deĖ výroby zistený výskyt spór schopných revitalizácie v poþte 0,15–1,1.ml-1 [4]. Kvantitatívna analýza rastu B. cereus v pasterizovanom mlieku [1] potvrdzuje, že poþet dní potrebných na dosiahnutie hygienicky nežiaduceho limitu 104 KTJ.ml-1 závisí od chladotolerantnosti, poþtu kontaminujúcich spór a od teploty skladovania produktu, ktorá pri požadovanej trvanlivosti 5 dní nemá byĢ vyššia ako 7°C, optimálne 6 – 4°C. Podobné rastové parametre boli pozorované v ultrapasterizovanom mlieku a smotane s trvanlivosĢou 3 mesiace, kde generaþný þas B. cereus pri 8°C bol približne 30 hodín, pri 13°C okolo 3 hodín [6]. 119

Poþet spór je možné ovplyvniĢ obmedzením kontaminácie mlieka urþeného na spracovanie. V prvovýrobe mlieka a pri procese jeho získavania je preto obzvlášĢ nevyhnutné, aby sa do mlieka dostalo þo najmenej spór mikroorganizmov. Treba sa zameraĢ na kritické miesta možnej kontaminácie v procese manipulácie s mliekom a zaviesĢ takú technologickú disciplínu, aby sa riziko minimalizovalo cestou hygienického programu HACCP. Pre riešenie tohto technologického problému by mohol vyhovovaĢ nasledovný konvenþný ukazovateĐ. Tepelná inaktivácia pri stanovení mezofilných a psychrotrofných aeróbnych mikroorganizmov (MPAS), a to 82°C poþas 30 min., a kultivácia pri aeróbnych podmienkach umožĖuje užšie sa zameraĢ na pasterizáciu prežívajúce spóry spórotvorných aeróbnych mikroorganizmov, prevažne rod Bacillus. Použitím dvoch inkubaþných teplôt, 30°C a 7°C, zistíme poþet mezofilných i psychrofilných druhov. Zúženie pojmu oproti termorezistentným mikroorganizmom umožĖuje i sprísnenie tohto kritéria na navrhovaný poþet max. 200 KTJ v 1 ml mlieka.[3]. Pri monitorovaní hygienickej kvality mlieka a zisĢovaní hladín MPAS v bazénových vzorkách sme sa zaoberali aj vhodnosĢou poradia kultivaþných teplôt a vzĢahom zisteného poþtu aeróbnych sporulátov k výsledkom získaným pri postupe s oboma kultivaþnými teplotami. Materiál a metódy Práca nadväzuje na príspevok z roku 2007, ktorého cieĐom bol celoroþný monitoring bakteriálnej kontaminácie mlieka. 294 bazénových vzoriek mlieka odobratých na 14 podnikoch v priebehu celého roka sme použili na štúdium výskytu aeróbnych sporulátov. Metodický postup stanovenia poþtu MPAS [2] zaþína inaktiváciou vegetatívnych foriem mikroorganizmov, záhrevom vzorky mlieka pri teplote 80-82°C po dobu 30 min., naoþkovaním 1ml na kultivaþnú Petriho misku a zaliatím živnou pôdou GTK (agar s glukózou, tryptónom a kvasniþným extraktom), obohatenou o 0.1% škrobu. Ćalej je možné inkubovaĢ naoþkované misky pri (30 ± 1)°C 3 dni – mezofilné sporuláty (MAS), a iné misky pri (6,5 ± 0,5)°C 10 dní – psychrotrofné sporuláty (PAS), alebo použiĢ obe kultivaþné teploty pre tie isté misky za sebou, þo by malo takú výhodu, že kolónie rastúce pri oboch teplotách by neboli do koneþného výsledku zapoþítané duplicitne. V snahe riešiĢ túto metodickú otázku sme misky pre stanovenie MAS po odþítaní a oznaþení kolónií inkubovali ćalej pri 6.5°C po dobu 10 dní v chladniþke na zistenie poþtu striktne psychrotrofných aeróbnych sporulátov (SPAS), ktoré pri 30°C nevytvorili kolónie. Výsledky a diskusia Výsledky inkubácie kultivaþných misiek spórotvorných aeróbnych mikroorganizmov sú uvedené v tabuĐke I. TabuĐka I Výsledky inkubácie kultivaþných misiek spórotvorných aeróbnych mikroorganizmov KTJ.ml-1 Priemer Minimum. Maximum. Var. koef. % MAS 54.0 2 330 99,9 PAS 5.4 0 28 106 SPAS 2.9 0 28 146 MAS + PAS 59.4 2.5 341 93 MAS + SPAS 56.9 2.5 346 98 Poþet mezofilných aeróbnych spórotvorných mikroorganizmov (MAS) bol v rozmedzí od 2 do 330 KTJ.ml-1 s priemernou hodnotou 54 KTJ.ml-1 s variaþným koeficientom Vk = 99.9 %. PodĐa histogramu v tabuĐke II, poukazujúceho na 61.2 % vzoriek v kategórii s poþtom do 50 KTJ.ml-1 a iba 3.1 % vzoriek nevyhovujúcich, s poþtami nad 200 KTJ.ml-1, sa tieto výsledky javia z matematického hĐadiska ako nevýznamné poþty vo vzĢahu k celkovej mikroflóre. VzhĐadom na to, že táto skupina mikroorganizmov sa tepelným ošetrením mlieka pred spracovaním na mlieþne potraviny neeliminuje, majú aj zdanlivo nízke poþty MAS závažné negatívne dôsledky pre kvalitu a skladovateĐnosĢ mlieþnych potravín [1]. 120

Psychrotrofné aeróbne spórotvorné mikroorganizmy (PAS) mali v sledovanom súbore poþty od 0 do 28, v priemere 5.4 KTJ.ml-1. 63.6 % vzoriek malo výsledky do 5 KTJ.ml-1. Pri skladovaní chladených mlieþnych potravín v prípade nízkeho poþtu mezofilných mikroorganizmov sa však psychotrofná mikroflóra stáva dominantnou, þo môže viesĢ k jej nadmernému pomnoženiu. Následná kultivácia misiek použitých na stanovenie poþtu MAS ćalej pri 6.5°C 10 dní poskytla podmienky pre tvorbu kolónií striktne psychrotrofných aeróbnych spórotvorných mikroorganizmov (SPAS). Výsledky SPAS mali rozsah 0 – 28 KTJ.ml-1, v priemere 2.9 KTJ.ml-1, s variaþným koeficientom Vk = 146%. Z celkového poþtu samostatne kultivovaných PAS je to 53.7 %. Zvyšných 46.3 % z pôvodného poþtu psychrotrofných mikroorganizmov sú alebo mezotolerantné a vytvorili kolónie už poþas kultivácie pri 30°C, alebo pri prvej inkubácii stratili schopnosĢ revitalizácie. TabuĐka II Relatívna poþetnosĢ vzoriek (%) v jednotlivých kategóriách poþtu spórotvorných aeróbnych mikroorganizmov. Kategória KTJ.ml-1l (a) a<=50 50200 MAS 61.2 26.9 7.1 1.7 3.1 MPAS (MAS+PAS) 55.4 29.6 9.2 2.7 3.1 Kategória KTJ.ml-1 (a) a<=5 520 PAS 63.6 21.4 6.8 5.1 1.0

MAS+SPAS [KTJ.ml-1]

1000.0

y = 0.9773x R2 = 0.9865 r = 0.99

100.0

10.0

MPAS (MAS+PAS) [KTJ.ml-1] 1.0 1.0

10.0

100.0

1000.0

Obr. 1. Stanovenie MPAS inkubáciou jednej kultivaþnej misky pri dvoch po sebe nasledujúcich teplotách vo vzĢahu k súþtu dvoch misiek pri dvoch rôznych teplotách. Súþet poþtov MAS + PAS vyjadruje celkový poþet mezofilných a psychrotrofných aeróbnych spórotvorných mikroorganizmov (MPAS). Bol v rozpätí 2.5-340 KTJ.ml-1. Priemerná hodnota MPAS bola 59.4 KTJ.ml-1. Podiel z celkovej mikroflóry je 0.12%. 55.4% vzoriek bolo s poþtom do 50 KTJ.ml-1, 85% nemalo hodnotu vyššiu ako 100, a iba 3.1% vzoriek malo poþet MPAS väþší ako 200. Na základe zistených výsledkov je možné podporiĢ návrh poþiatoþného limitu pre prípadné zavedenie tohto ukazovateĐa, teda pre poþet mezofilných a psychrotrofných aeróbnych sporulujúcich baktérií (MPAS) maximálne 200 KTJ.ml-1. Podobne i Hanuš a kol. [3] potvrdili reálnosĢ tohto limitu. Celkový poþet MPAS zistený na tých istých miskách pri inkubácii na mezofilné a následne na psychrofilné mikroorganizmy (MAS + SPAS) mal priemernú hodnotu 56.9 KTJ.ml-1, þo predstavuje 95.8 % z poþtu súþtov samostatných misiek pri dvoch teplotách. 121

Korelaþný koeficient týchto dvoch typov výsledkov r = 0.99 svedþí o tesnej závislosti, ktorá je vyjadrená lineárnou regresnou priamkou s rovnicou y = x - 2.5056. Použite dvoch inkubaþných teplôt po sebe pri totožnom súbore misiek umožĖuje vylúþiĢ nadhodnotenie výsledkov o sporuláty schopné rastu pri oboch inkubaþných teplotách (obr. 1). Výsledky spórotvorných aeróbnych mikroorganizmov (MPAS) nejavili koreláciu so žiadnym zo sledovaných mikrobiologických ukazovateĐov. Z prakticko mikrobiologického hĐadiska je významné pozorovanie, že medzi CPM a MPAS nie je štatistická závislosĢ. Taktiež Rombaut a kol. [5] pozorovali nízky korelaþný koeficient r = 0.3. Vidíme, že skupinu spórotvorných mikroorganizmov má osobitný význam sledovaĢ samostatne, vzhĐadom na jej technologické a hygienické dôsledky. V priebehu roka sme pozorovali urþité kolísanie a zmeny rozptylu týchto hodnôt, avšak vplyv roþného obdobia sa štatisticky nepotvrdil. Záver: Vidíme, že skupinu aeróbnych spórotvorných mikroorganizmov, ktorá je napriek tomu, že jej hodnoty v porovnaní s hodnotami CPM sú o 3 poriadky nižšie (hovoríme o jednotkách oproti tisícom), má osobitný význam sledovaĢ samostatne, vzhĐadom na jej technologické a hygienické dôsledky. Dlhodobým skladovaním a chladením mlieþnych potravín majú þas a životný priestor pre pomnoženie i zo zdanlivo zanedbateĐných poþiatoþných poþtov KTJ. Výskyt MPAS v surovom mlieku je špecifickým, prísnejším kritériom hygieny získavania mlieka a nedá sa odhadnúĢ na základe niektorého zo základných kritérií mikrobiologickej kvality mlieka. Mliekárne, ktoré sa budú kontrolou tohto ukazovateĐa snažiĢ o zlepšenie kvality nakupovanej suroviny, môžu tak dosiahnuĢ stabilitu v trvanlivosti a skladovateĐnosti svojich výrobkov. Použitá literatura: 1. Greifová, M. – Valík, ď. – Görner, F. – Petríková, J.: Predikcia trvanlivosti pasterizovaného mlieka z hĐadiska rastu Bacillus cereus pri (5±1)°C. Bull. potrav. Výsk., 38, 1999, s. 243–250. 2. Hanuš, O. – KoláĜ, A. – VyletČlová, M. – Pur, I.: ýerstvé konzumní mléko s prodlouženou trvanlivostí – nová kvalitní potravina pro lidskou výživu. In: Nové trendy v organizaþních, technologických a hygienických postupech nákupu syrového mléka v kontextu podmínek EU (zbor. z medzinár. konf.). Šumperk, Okresní agrární komora, 2001, s. 81–104. 3. Hanuš, O. – KoláĜ, A. – Pur, I. – VyletČlová, M.: RozšíĜení spotĜebního potravinového mléþného sortimentu v ýR a lokální kvalita suroviny. In: Den mléka 2002 (zbor. z medzinár. konf.). Praha, ýZU, 2002, s. 44–48. ISBN 80-213-0900-8 4. Mayr, R. – Eppert, I. – Scherer, S.: Incidence and identification of psychrotrophic Bacillus spp. in German HTST pasteurized milk. Milchwissenschaft, 54, 1999, s. 29-30. 5. Rombaut, R. – Dewettinck, K. – de Mangelaere, G. – van Vooren, L. – Huyghebaert, A.: Raw milk microbial quality and production scale of Belgian dairy farms. Milchwissenschaft, 57, 2002, s. 625–628. 6. Lauková, D. – Valík, ď. – Görner, F. – Leskovská, L. – Martinická, L.: Dynamika rastu Bacillus cereus v mlieku a smotane. In: Mléko a sýry 2003 (zbor. z medzinár. konf.). VŠCHT Praha, 2003, s.170-174. 7. VyletČlová, M. – Švec, P. – Páþová, Z. – Sedláþek, I. – Roubal, P.: Výskyt kmenĤ Bacillus cereus a Bacillus licheniformis v procesu výroby UHT mléka. Czech J. Anim. Sci., 47, 2002, s. 200–205 8. Valík, ď. – Lauková, D. – Görner, F.: Obsah Bacillus cereus a celkový poþet mikroorganizmov v pasterizovanej smotane. In: Bull. potrav. Výsk., roþ. 40, 2001, þ. 3, s. 209–219.

Kontaktná adresa: Ing. Katarína Kirchnerová, PhD., Slovenské centrum poĐnohospodárskeho výskumu, Hlohovská 2, SK-949 92 Nitra, [email protected]

122

SLEDOVÁNÍ MIKROBIOLOGICKÉ KVALITY KOZÍCH SÝRģ Z TRŽNÍ SÍTċ JIHOMORAVSKÉHO KRAJE 1 Cupáková Šárka , Necidová Lenka1, Dušková Marta1, Belušíková Zora1, Janštová Bohumíra1, Pospíšilová Markéta2, Karpíšková Renáta1,2 1 Veterinární a farmaceutická univerzita Brno 2 Centrum hygieny potravinových ĜetČzcĤ Brno, SZÚ Praha Monitoring of microbial quality of goat’s cheese from the retail market in the South Moravia Summary: The aim of this study was to evaluate the microbial quality of goat’s cheese from retail market in the Czech Republic. Microbial characteristic was monitored as folowed: count of Enterobacteriaceae, Escherichia coli, lactic acid bacteria, enterococci, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, identification of Listeria monocytogenes, Salmonella spp. and Staphylococcus aureus. From the point of the actual EU legislation all the samples of goat’s cheese were microbiologicaly corresponding and together with other monitored parameters, can be signed as safe products.

V EvropČ se roþnČ vyprodukuje více než 2 miliony tun kozího mléka, což pĜedstavuje asi 17 % celosvČtové produkce. NejvýznamnČjší producenti kozího mléka jsou situováni do blízkosti StĜedozemního moĜe - ěecko, Francie, Portugalsko, ŠpanČlsko a Itálie3. Mimo pĜímé konzumace lidmi trpícími alergií na kravské mléko je kozí mléko používáno k výrobČ sýrĤ, které jsou pro vysoký obsah tuku a nezvyklou chuĢ velmi oblíbené2. Cílem studie bylo hodnocení mikrobiologické kvality a zdravotní nezávadnosti rĤzných druhĤ kozích sýrĤ, domácí i zahraniþní provenience, dostupných v tržní síty ýeské republiky a porovnání vybraných ukazatelĤ s kriterii stanovenými NaĜízením komise ES þ. 2073/2005 o mikrobiologických kriteriích pro potraviny. Materiál a metody: Vzorky Celkem bylo vyšetĜeno 50 vzorkĤ kozích sýrĤ odebraných z tržní sítČ v Jihomoravském kraji. Jednalo se o þerstvé sýry pĜírodní, þerstvé sýry s rĤznými druhy pĜíchutí a sýry s bílou plísní na povrchu, dva vzorky sýrĤ polotvrdých a jeden vzorek tvrdého sýru. Zastoupeny byly sýry jak zahraniþních (Francie, NČmecko, Polsko, Rakousko, Holandsko), tak tuzemských výrobcĤ. OdbČr vzorkĤ byl provádČn v období duben - þerven 2006. Metody Základní zpracování vzorkĤ bylo provedeno dle ýSN ISO 7218. Byly hodnoceny následující mikrobiologické ukazatele: poþet bakterií þeledi Enterobacteriaceae (ýSN ISO 215282), poþet Escherichia coli (ýSN ISO 16649-2), poþet bakterií mléþného kvašení (ýSN ISO 15214), poþet enterokokĤ (roztČr 0,2 ml vzorku na povrch S-B agaru s následnou aerobní kultivací 48 hod. pĜi teplotČ 37 °C), poþet Staphylococcus aureus (ýSN EN ISO 6888-1), prĤkaz S. aureus (pomnožení v PPV – aerobnČ, 24 hodin pĜi 37 °C; následnČ vyoþkování na B-P agar a aerobní kultivace 48 hodin pĜi teplotČ 37 °C), poþet Bacillus cereus (ýSN EN ISO 7932), prĤkaz a stanovení poþtu Listeria monocytogenes (ýSN EN ISO 11290-1,2), prĤkaz Salmonella spp. (ýSN EN ISO 6579). Suspektní izoláty enterokokĤ a S. aureus byly genotypovČ konfirmovány metodou PCR, zamČĜenou v pĜípadČ enterokokĤ na detekci rodovČ specifického tuf-genu1 a u S. aureus na detekci specifického DNA fragmentu SA442 a toxin specifických genĤ (sea – sej)4. Mimo kultivaþního vyšetĜení byla u vzorkĤ kozích sýrĤ také sledována pĜítomnost stafylokokových enterotoxinĤ metodou RPLA (SET-RPLA, Denka Seiken, Japonsko).

123

Interpretace výsledkĤ U þerstvých sýrĤ jsou mikrobiologická kriteria pro potraviny v tržní síti následující: poþet L. monocytogenes (m = 102 KTJ.g-1), pĜíp. stanovení stafylokokových enterotoxinĤ (negativní/25 g). U zrajících sýrĤ potom: poþet L. monocytogenes (m = 102 KTJ.g-1). Výsledky a diskuse: Stanovené poþty bakterií þeledi Enterobacteriaceae se u 17 vzorkĤ (37 %) pohybovaly v rozmezí ĜádovČ 101 – 103 KTJ.g-1 (viz. tabulka I.). Zvýšené poþty byly zaznamenány u þerstvých i plísĖových sýrĤ domácích i zahraniþních výrobcĤ. Jak dále vyplývá z tabulky I. u vČtšiny vzorkĤ (86 %) byla stanovena hodnota poþtu E. coli < 5.101 KTJ.g-1. U zbývajících sedmi vzorkĤ se záchyt E. coli pohyboval v rozmezí ĜádovČ 101 - 103 KTJ.g-1, pČt z tČchto vzorkĤ pocházelo od stejného tuzemského výrobce. PomČrnČ variabilním ukazatelem byl i poþet enterokokĤ, u témČĜ poloviny vzorkĤ (48 %) byly stanoveny hodnoty v rozmezí 101 – 104 KTJ.g-1, u zbývajících 52 % vzorkĤ potom < 5.101 KTJ.g-1. Poþet bakterií mléþného kvašení se pohyboval v širokém rozmezí ĜádovČ 104 - 108 KTJ.g-1 (viz. tabulka þ. 1). Poþet S. aureus a B. cereus nepĜesáhl u žádného vyšetĜovaného vzorku hodnotu < 5.101 KTJ.g-1. VyšetĜení kozích sýrĤ na pĜítomnost stafylokokových enterotoxinĤ SEA – SED metodou RPLA bylo ve všech pĜípadech negativní. Kvalitativní prĤkaz S. aureus byl provádČn po pĜedchozím pomnožení, S. aureus byl detekován u 6 vzorkĤ þerstvých i plísĖových sýrĤ pĜevážnČ zahraniþního pĤvodu. U 3 izolátĤ S. aureus byla metodou PCR prokázána pĜítomnost genĤ kódujících stafylokokové enterotoxiny SEG, SEI a u 1 izolátu byly pĜítomny geny sec, seg a sei. Metodou RPLA byla potvrzena schopnost tohoto izolátu produkovat SEC. U žádného z vyšetĜovaných vzorkĤ nebyla prokázána pĜítomnost salmonel. U 2 vzorkĤ þerstvého sýru a 2 vzorkĤ sýru s plísní na povrchu (vše dovoz Francie) byla prokázána pĜítomnost listerií. Ve tĜech pĜípadech se jednalo o L. monocytogenes (1x sérotyp 1/2 b, 2x sérotyp 1/2 a), u jednoho vzorku byla prokázána pĜítomnost L. innocua. Poþet L. monocytogenes byl u všech vzorkĤ stanoven < 1.102 KTJ.g-1. V tomto ukazateli tedy hodnocené sýry vyhovují požadavku NaĜízení þ. 2073/2005. Tabulka I. PĜehled vyšetĜovaných komodit, jejich pĤvodu a výsledky vybraných mikrobiologických ukazatelĤ. EB EC ENT BMK ýíslo Vzorek, lokalita 555 556 557 558 559 592 593 594 595 596 635 636 637 638 639 640 641

sýr s plísní na povrchu, Polsko sýr s plísní na povrchu, Francie þerstvý sýr, Francie sýr s plísní na povrchu, Francie sýr, ? sýr s plísní na povrchu, Polsko sýr s plísní na povrchu, Francie þerstvý sýr, Francie þerstvý sýr ob. popelem, Francie þerstvý sýr, Francie sýr s plísní na povrchu, Francie sýr, Francie* sýr s plísní na povrchu, Francie tvrdý bílý sýr, farma BĜezí pĜírodní sýr pepĜový, farma BĜezí pĜírodní sýr þesnekový, farma BĜezí pĜírodní sýr petrželkový, farma BĜezí

KTJ.g-1

KTJ.g-1

KTJ.g-1

1

1

1

< 1.10 < 1.101 < 1.101 < 1.101 < 1.101 1,2.102 4,5.101 < 1.101 < 1.101 < 1.101 < 1.101 < 1.101 < 1.101 >1,5.103 >1,5.103 1,1.103 >1,5.103 124

< 5.10 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 5,0.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 2,2.103 3,0.102 < 5.101 2,5.103

< 5.10 >7,5.104 < 5.101 3,0.103 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 3,9.104 5,5.104 >7,5.104 1,8.104 >7,5.104

KTJ.g-1

2,3.107 >7,5.107 3,5.106 6,2.107 9,5.103 9,6.105 5,7.106 4,7.107 8,2.107 < 5.103 7,4.107 3,5.106 >7,5.107 4,6.107 7,3.107 8,1.107 >7,5.107

Tabulka I. - pokraþování PĜehled vyšetĜovaných komodit, jejich pĤvodu a výsledky vybraných mikrobiologických ukazatelĤ. EB EC ENT BMK ýíslo Vzorek, lokalita KTJ.g-1

642 643 644 660 661 662 663 664 665 666 667 668 669 701 702 703 704 705 706 707 708 709 710 722 723 724 725 726 727 728 729 730 731

pĜírodní sýr bazalkový, farma BĜezí mČkký sýr (paster. ml.), Francie þerstvý sýr, Petrovice þerstvý sýr s bylinkami, Rakousko sýr s plísní na povrchu, Polsko þerstvý sýr pĜírodní, Rakousko sýr s plísní na povrchu, Francie* sýr s plísní na povrchu, Francie sýr s plísní na povrchu, Francie þerstvý sýr, Francie þerstvý sýr, Petrovice pĜírodní sýr cibulový, farma BĜezí pĜírodní sýr polotvrdý, Holandsko sýr s plísní na povrchu, Francie sýr s plísní na povrchu, NČmecko sýr s plísní na povrchu, NČmecko sýr s plísní na povrchu, Francie sýr, Holandsko sýr s plísní na povrchu, Francie sýr, Francie þerstvý sýr pĜírodní, Francie sýr s plísní na povrchu, Polsko pĜírodní sýr, Francie* sýr s plísní na povrchu, Francie pĜírodní sýr, Turnov þerstvý sýr ob. popelem, Francie þerstvý sýr pĜírodní, Francie pĜírodní sýr polotvrdý, Francie sýr s plísní na povrchu, Francie þerstvý sýr pĜírodní, Francie pĜírodní sýr horský, BrnČnec dezertní sýr, RatiboĜice þerstvý sýr pĜírodní, Francie

KTJ.g-1

3

>1,5.10 < 1.101 < 1.101 < 1.101 5,0.101 < 1.101 < 1.101 < 1.101 < 1.101 < 1.101 < 1.101 >1,5.103 >1,5.103 < 1.101 >1,5.103 >1,5.103 >1,5.103 >1,5.103 1,0.102 < 1.101 < 1.101 2,1.102 < 1.101 < 1.101 < 1.101 < 1.101 < 1.101 < 1.101 < 1.101 < 1.101 2,1.102 < 1.101 < 1.101

3

3,1.10 < 5.101 < 5.101 < 5.101 5,0.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 1,5.102 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101

KTJ.g-1

KTJ.g-1

4

>7,5.10 >7,5.104 1,3.102 7,5.101 2,7.103 5,0.101 3,8.103 4,8.103 < 5.101 < 5.101 < 5.101 >7,5.104 < 5.101 < 5.101 1,2.104 2,2.104 >7,5.104 1,0.102 2,1.103 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 >7,5.104 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 < 5.101 3,4.104 2,0.104 < 5.101

>7,5.107 >7,5.107 2,5.104 1,8.106 5,7.107 < 5.104 2,7.107 5,5.107 4,5.106 < 5.104 8,6.106 3,2.108 6,5.107 4,5.106 2,8.106 6,8.106 9,1.108 9,7.106 4,7.106 < 5.104 1,6.106 5,0.105 2,0.106 2,0.108 >7,5.107 2,6.107 < 5.104 < 5.105 1,7.107 3,6.105 5,5.107 1,7.108 < 5.104

Pozn.: * - pozitivní prĤkaz L. monocytogenes

ZávČr: Bezpeþnost potravin má být v celém potravinovém ĜetČzci zajištČna provádČním správné hygienické praxe a používáním postupĤ založených na zásadách analýzy rizika a kritických kontrolních bodĤ (HACCP). SouþasnČ musí vyrobené potraviny splĖovat mikrobiologická kritéria daná NaĜízením komise ES þ. 2073/2005. Z pohledu platné legislativy byly všechny vyšetĜované kozí sýry mikrobiologicky vyhovující a v kontextu s dalšími sledovanými parametry je lze oznaþit za bezpeþné. NicménČ v souvislosti s ojedinČlým nálezem L. monocytogenes je nutno upozornit na nezbytnost uchovávání výrobkĤ pĜi chladírenských teplotách. To platí nejen pro distribuci a prodej sýrĤ, ale také pro uchovávání v domácnostech spotĜebitelĤ. 125

PodČkování: Práce vznikla za finanþní podpory výzkumného zámČru MSM 6215712402 Veterinární aspekty bezpeþnosti a kvality potravin. Použitá literatura: 1. CUPÁKOVÁ, Š., POSPÍŠILOVÁ, M., KOLÁýKOVÁ, I., KARPÍŠKOVÁ, R. Genus-specific identification of enterococci by PCR method. Acta Veterinaria Brno, 2005, vol. 74, no. 4, p. 633-637. 2. KLINGER, I. AND ROSENTHAL, I. Public health and the safety of milk and milk products from sheep and goats. Revue scientifique et technique,1997, vol. 16, no. 2, p. 482-488. 3. MORGAN, F., MASSOURAS, T., BARBOSA, M., ROSEIRO, L., RAVASCO, F., KANDARAKIS, I., BONNIN, V., FISTAKORIS, M., ANIFANTAKIS, E., JAUBERT, G., RAYNAL-LJUTOVAC, K. Characteristics of goat milk collected from small and medium enterprises in Greece, Portugal and France. Small Ruminant Research, 2003, vol. 47, no. 1, p. 39-49. 4. POSPÍŠILOVÁ, M., KARPÍŠKOVÁ, S., KARPÍŠKOVÁ, R. Identifikace druhu Staphylococcus aureus metodou polymerázové ĜetČzové reakce. In VI. Konference mladých vČdeckých pracovníkĤ s mezinárodní úþastí. Sborník. VFU Brno, 2004, s. 52-56. 5. EUROPEAN COMMISION. NaĜízení komise þ. 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny. 2005, 26 s. 6. ýSN EN ISO 6579. Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda prĤkazu bakterií rodu Salmonella. 2003. 7. ýSN EN ISO 6888-1. Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení poþtu koagulázopozitivních stafylokokĤ (Staphylococcus aureus a další druhy) – ýást 1: Technika s použitím agarové pĤdy podle Baird-Parkera. 1999. 8. ýSN EN ISO 11290-1. Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda prĤkazu a stanovení poþtu Listeria monocytogenes – ýást 1: Metoda prĤkazu. 2005. 9. ýSN EN ISO 11290-2. Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda prĤkazu a stanovení poþtu Listeria monocytogenes – ýást 2: Metoda stanovení poþtu. 2005. 10. ýSN ISO 15214. Mikrobiologie potravin a krmiv – Horizontální metoda stanovení poþtu mezofilních bakterií mléþného kvašení – Technika poþítání kolonií vykultivovaných pĜi 30 °C. 2000. 11. ýSN ISO 16649-2. Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení poþtu betaglukuronidázopozitivních Escherichia coli - ýást 2: Technika poþítání kolonií vykultivovaných pĜi 44 °C s použitím 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-glukuronidu. 2003. 12. ýSN ISO 21528-2. Mikrobiologie potravin a krmiv – Horizontální metody pro prĤkaz a stanovení poþtu bakterií þeledi Enterobacteriaceae – ýást 2: Technika poþítání kolonií. 2006. 13. ýSN ISO 7218. Mikrobiologie potravin a krmiv – Všeobecné pokyny pro mikrobiologické zkoušení. 1998. 14. ýSN EN ISO 7932. Mikrobiologie potravin a krmiv – Horizontální metoda stanovení poþtu presumptivního Bacillus cereus – Technika poþítání kolonií vykultivovaných pĜi 30 °C. 2005.

Kontaktní adresa: MVDr. Šárka Cupáková, Ph.D. Ústav hygieny a technologie mléka, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Palackého 1/3, 612 42 Brno

126

SLEDOVÁNÍ RģSTU A PRODUKCE ENTEROTOXINģ STAPHYLOCOCCUS AUREUS BċHEM TECHNOLOGIE VÝROBY ýERSTVÝCH SÝRģ Karpíšková Renata1,2, Necidová Lenka1, Pospíšilová Markéta2, ŠĢástková-Belušíková Zora1, Dušková Marta1 1 Veterinární a farmaceutická univerzita Brno 2 Centrum hygieny potravinových ĜetČzcĤ Brno, SZÚ Praha Tracing of Staphylococcus aureus growth and enterotoxin production in soft cheeses during their technological processing Summary: S. aureus is an important etiological agent in milk and milk products, mostly capable to produce staphylococcal enterotoxins which can cause food-borne intoxications in the consumers. The aim of this study was to trace growth of S. aureus and toxin production in soft cheeses during the technological processing. Raw milk inoculated by one of the five S. aureus strains isolated from milk and milk products were used in the model experiments. All the S. aureus strains used in this study were producers of some staphylococcal enterotoxin (type A, B or C). Cheese semi-products were examined during their technological processing and final products during the 5 days storage. Enterotoxins were detected by the fluorescent immunological method ELFA (MiniVIDAS). This study showed that the amount of enterotoxins varied among tested strains and phases of the technological process. Enterotoxins were detected in soft cheese made from pasteurized milk inoculated by S. aureus in the counts 2,9.105 CFU.g-1. Prevention of S. aureus contamination and multiplication during the process plan is needed for the production of safe soft cheeses. The most important enterotoxin dose build-up factor can be regulated by strict abidance of cooling conditions during manufacturing, distribution and storage of the product.

Úvod: S. aureus je významným kontaminantem syrového mléka a jedním z nejvýznamnČjších pĤvodcĤ alimentárních intoxikací. Jeho pĜítomnost v syrovém mléce a mléþných výrobcích z nČj vyrobených je nežádoucí. V prĤbČhu výroby a skladování výrobkĤ mĤže dojít k pomnožení tČchto bakterií a již pĜi poþtech 105 KTJ.g-1 potraviny mĤže vytvoĜené množství toxinu pĜedstavovat zdravotní riziko pro konzumenta (3). PĜítomné patogenní mikroorganismy v surovinČ lze inaktivovat dostateþným tepelným záhĜevem (1), termostabilní stafylokokové enterotoxiny (SEs), které byly za vhodných podmínek naprodukovány již v surovinČ, se mohou vyskytovat i v potravinách vyrobených z tepelnČ upraveného mléka. NapĜ. Ikeda a kol. (5) popsal epidemii, která vznikla v Japonsku v roce 2000, pĜi níž bylo zaznamenáno více než 10 000 pĜípadĤ onemocnČní stafylokokovou enterotoxikózou. Vehikulem bylo sušené mléko vyrobené z pasterovaného mléka. Z hlediska bezpeþnosti potravin je nezbytné vČnovat pozornost možnému výskytu S. aureus v potravinách k pĜímé spotĜebČ, zejména v þerstvých sýrech. Požadavky pro stanovení koagulázo-pozitivních stafylokokĤ a stafylokokových enterotoxinĤ (SEs) v þerstvých sýrech zahrnuje i NaĜízení EK þ. 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny. Cílem této studie bylo zjistit chování S. aureus v prĤbČhu výroby þerstvého sýru a jeho schopnost tvoĜit v daných podmínkách enterotoxiny. Získané výsledky umožní verifikaci vytvoĜeného systému kritických bodĤ (HACCP) studované komodity. Materiál a metody: Vzorky K provedení modelových pokusĤ bylo použito syrové kravské mléko, které bylo zaoþkováno jedním z pČti kmenĤ S. aureus. Všechny kmeny byly producenty enterotoxinĤ a to typu A, B nebo C (SA843 SEC, SA1057 SEB, SA1089 SEB, SA1185 SEA a SA1200 SEB). Toxinogenní kmeny S. aureus pocházely z mléka a mléþných výrobkĤ a byly uchovávány ve sbírce mikroorganismĤ CHPě, SZÚ Praha pĜi teplotČ -75 °C. Zaoþkování mléka bylo provedeno dvČma zpĤsoby, první 12 – 16 hodin pĜed pasterací. Inokulace mléka byla provádČna pro každý vzorek ve dvou denzitách cca 103 a 105 KTJ.ml-1. 127

U druhého pokusu byla inokulace provedena až po pasteraci výchozí suroviny. Z takto upraveného mléka byly pĜipraveny modelové vzorky þerstvých sýrĤ bČžným výrobním postupem: pasterace 72 a 85 °C po dobu 15 sekund (6), pĜidání CaCl2 a smetanové kultury (Milkom a.s., Laktoflora, ýR), pĜidání syĜidla (Milkom a.s., Laktoflora, ýR) a sýĜení pĜi 30 °C po dobu 1 hodiny, zpracování sýĜeniny, lisování do tvoĜítek a okap sýrĤ pĜi pokojové teplotČ (24 °C) do druhého dne, solení, koĜenČní, balení, skladování v chladírnČ pĜi 4 a 8 °C po dobu 5 dnĤ. Metody Stanovení poþtu koagulázo-pozitivních stafylokokĤ bylo u jednotlivých fázových vzorkĤ provedeno kultivací na pĤdu podle Baird-Parkera (2). Fenotypová konfirmace charakteristických kolonií spoþívala v hodnocení rĤstu na chromogenním médiu SaSelect (Bio-Rad, Francie) a na krevním agaru, dále v provedení koagulázového testu - ITEST STAFY koaguláza (ITest, Hradec Králové, ýR) a Staphylo la Seiken (DENKA SEIKEN CO., LTD., Japonsko). K detekci stafylokokových enterotoxinĤ byla použita fluorescenþní imunologická metoda (ELFA) s využitím pĜístroje MiniVIDAS (Vitek Immuno Diagnostic Assay System, bioMérieux, Francie) umožĖující detekci sumy enterotoxinĤ SEA – SEE, s detekþním limitem 0,5 ng.g-1 potraviny pro SEA a SEB a 1,0 ng.g-1 potraviny pro SEC – SEE. Citlivost metody se pro jednotlivé SEs mĤže lišit v závislosti na druhu potraviny.

Výsledky a diskuse: Zaoþkované mléko urþené k pĜípravČ þerstvého sýra bylo pĜed pasterací skladováno pĜi chladírenské teplotČ, což odpovídá podmínkám možné kontaminace mléka pĜi veþerním dojení. První modelový pokus byl zamČĜen na sledování rĤstu S. aureus a tvorbu enterotoxinĤ v pĜirozenČ kontaminovaném mléce, které bylo následnČ pasterováno a zpracováno na þerstvý sýr. V tabulce 1 jsou uvedeny zjištČné poþty S. aureus v mléce a dále v rĤzných fázích výroby þerstvého sýru. PĜi inokulaci mléka nízkými poþty S. aureus nedošlo v prĤbČhu dalších technologických operací k jejich pomnožení. Pasteraþní teploty 72 °C i 85 °C po dobu 15 sekund bezpeþnČ eliminovaly stafylokoky v mléce. PĜi inokulaci mléka vysokými poþty S. aureus (cca 105 KTJ.ml-1) se jako bezpeþná ukázala pouze vyšší pasteraþní teplota. Nižší pasteraþní teplota eliminovala poþet stafylokokĤ cca o 3 Ĝády, v prĤbČhu technologického procesu však nedošlo u žádného vzorku k pĜekroþení kritického poþtu S. aureus 105 KTJ.ml-1. Ani v jednom pĜípadČ nebyly u modelových vzorkĤ detekovány SEs. Oba použité pasteraþní procesy byly dostateþnou zárukou snížení poþtu S. aureus na hodnoty neschopné vyprodukovat dostateþné množství stafylokokového enterotoxinu potĜebného k vyvolání alimentární intoxikace. Výsledky modelového pokusu popsaného v tabulce 2 pĜedstavují možnou sekundární kontaminaci S. aureus bČhem výroby a skladování þerstvých sýrĤ nebo výrobu þerstvých sýrĤ z nepasterovaného mléka. Mléko bylo toxinogenními kmeny zaoþkováno až po pasteraci. Pozitivní prĤkaz SEs byl zjištČn jen pĜi použití toxinogenního kmenu SA1185. Poþty S. aureus u tohoto kmenu dosáhly v prĤbČhu výrobního procesu nejvyšších hodnot ze všech pokusĤ (až 3,2.106 KTJ.g-1). První fáze výroby, pĜi které již došlo k detekci SEs byla fáze lisování, 7 hod po zaoþkování pasterovaného mléka, kdy poþet S. aureus dosahoval 4,3.105 KTJ.g-1. BČhem této doby byl vyrábČný þerstvý sýr vystaven pĜi zasýĜení teplotČ 30 °C po dobu jedné hodiny a dále následovalo lisování výrobku pĜi pokojové teplotČ 24 °C po dobu cca 12 hodin. V závČru chladírenského skladování (5. den) poþty S. aureus stagnovaly nebo mírnČ klesaly, pĜesto však produkce enterotoxinĤ byla zaznamenána. To odpovídá zjištČní, že stanovení poþtu S. aureus ve finálním výrobku je pouze orientaþní informací, která nemusí odhalovat pĜítomnost stafylokokových enterotoxinĤ. Na druhé stranČ lze na základČ získaných výsledkĤ potvrdit, že S. aureus je sice schopen pomalého rĤstu i pĜi chladniþkové teplotČ, ale neprodukuje SEs (7). Metoda ELFA neumožĖuje kvantitativní stanovení stafylokokových enterotoxinĤ, výsledek je vyjádĜen jako pozitivní þi negativní. Z tohoto dĤvodu nebylo sledováno množství naprodukovaných enterotoxinĤ v prĤbČhu výroby a pĜi skladování sledované komodity. 128

Tabulka I Poþty S. aureus (KTJ.g-1) bČhem výroby þerstvých sýrĤ (zaoþkováno kmenem SA1057 pĜed pasterací mléka) fáze výroby a skladování

past. teplota: 72 °C/15 s 3

past. teplota: 85 °C/15 s

5

1,9.103

2,4.105

pĜed pasterací (12h po zaoþkování)

2,3.10

po pasteraci

<5.101

5,0.102

<5.101

<5.101

po zasýĜení

<5.101

1,5.103

<5.101

<5.101

pĜi lisování

<5.101

4,1.103

<5.101

<5.101

pĜed solením

<5.101

1,7.104

<5.101

<5.101

1. den skladování 4 °C

<5.101

2,6.103

<5.101

<5.101


<5.101

4,1.103

<5.101

<5.101


<5.101

6,3.103

<5.101

<5.101


<5.101

6,9.103

<5.101

<5.101


<5.101

3,3.103

<5.101

<5.101


<5.101

5,9.103

<5.101

<5.101

2,5.10

Tabulka II Poþty S. aureus (KTJ.g-1) bČhem výroby þerstvých sýrĤ (zaoþkováno jednotlivými kmeny po pasteraci mléka); podtržené hodnoty pĜedstavují vzorky s pozitivním prĤkazem stafylokokových enterotoxinĤ þíslo kmene S. aureus

fáze výroby a skladování po pasteraci

1057

1057

1089

1089

843

843

1200

1200

1185

1185

3,3.103

5,3.104

4,6.103

1,8.105

4,8.103

2,5.105

< 5.101

1,3.105

3,2.103

2,9.105

po zasýĜení

3,4.103

6,5.104

4,8.103

2,4.105

4,9.103

2,4.105

< 5.101

3,6.105

3,7.103

1,4.105

pĜi lisování

2,1.103

6,6.105

5,5.103

2,0.105

5,3.103

1,5.105

< 5.101

2,4.105

3,6.104

4,3.105

pĜed solením

1,5.104

1,0.106

1,8.104

2,5.105

3,0.103

6,9.104

< 5.101

4,2.105

3,5.104

1,6.106

< 5.102

3,4.105

5,5.102

< 5.103

9,3.102

2,2.104

< 5.101

6,3.104

2,2.104

1,6.106

3,5 103

4,5.105

4,2.103

2,9.105

9,3.102

1,7.104

< 5.101

2,3.105

3,9.104

1,2.106

2,9.103

2,0.105

< 5.101

1,5.104

8,5.102

2,6.104

< 5.101

8,5.104

4,9.104

1,6.106

3,1.103

7,3.104

1,3.103

5,3.104

7,3.102

2,7.104

< 5.101

1,8.105

6,9.104

3,2.106

7,5.102

< 5.103

< 5.101

< 5.102

< 5.101

< 5.102

< 5.101

< 5.103

4,7.104

< 5.104

1,6.103

<5.104

< 5.101

3,9.104

< 5.101

< 5.102

< 5.101

< 5.103

6,0.104

< 5.104

1.den sklad. 4 °C 1.den sklad. 8 °C 2. den sklad. 4 °C 2. den sklad. 8 °C 5. den sklad. 4 °C 5. den sklad. 8 °C

VČtšina þerstvých sýrĤ z modelových pokusĤ by nevyhovČla požadavkĤm legislativy, kdy NaĜízení EK 2073/2005 pĜedepisuje limit pro koagulázo-pozitivní stafylokoky 101 – 102 KTJ.g1 . U šesti z celkových 28 výrobkĤ, kde byl poþet S. aureus >105 KTJ.g-1, by bylo dle legislativy nutné provést další vyšetĜení na pĜítomnost stafylokokových enterotoxinĤ.

129

ZávČr: Z výsledkĤ studie vyplývá, že k výrobČ þerstvých sýrĤ neobsahujících stafylokokové enterotoxiny, nelze použít mléko s poþty S. aureus vyššími než 105 KTJ.g-1. Legislativou (6) stanovená limitní hodnota CPM je u syrového nakupovaného mléka 105 KTJ.ml-1, není tedy reálné, že v syrovém mléce bude bezpeþná hranice poþtu S. aureus pĜekroþena. Dalším krokem snižujícím poþty bakterií vþetnČ stafylokokĤ, je tepelné ošetĜení (pasterace) mléka používaného k výrobČ þerstvých sýrĤ. PĜítomnost stafylokokových enterotoxinĤ v þerstvých sýrech by tedy spíše svČdþila o sekundární kontaminaci S. aureus. Základním pĜedpokladem výroby bezpeþné potraviny je tedy pĜedevším dodržování chladírenského ĜetČzce (4 - 8 °C) v prĤbČhu skladování þerstvých sýrĤ a zabránČní sekundární kontaminace bČhem výroby. Výsledky studie potvrdily, že rychlost tvorby stafylokokových enterotoxinĤ v þerstvých sýrech je u rĤzných kmenĤ S. aureus rozdílná. Získané poznatky mohou být využity pĜi stanovení kritických mezí pro kritické kontrolní body HACCP a verifikaci celého systému kontrolních kritických bodĤ technologie výroby þerstvých sýrĤ. Literatura: 1.CONTRERAS, A., LUENGO, C., SÁNCHEZ, A., CORRALES, J.C. The role of intramammary pathogens in dairy goats. Livestock Production Science, 2003, vol. 79, no. 2 – 3, p. 273-283. 2.ýSN EN ISO 6888-1. Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení poþtu koagulázopozitivních stafylokokĤ (Staphylococcus aureus a další druhy) – ýást 1: Technika s použitím agarové pĤdy podle Baird-Parkera. Praha: ýeský normalizaþní institut, 1999. 16 s. 3.ERCOLINI, D., BLALOTTA, G., FUSCO, V., COPPOLA, S. PCR-based detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in the early stages of raw milk cheese making. Journal of Applied Microbiology, 2004, vol. 96, no. 5, p. 1090-1096. 4.EUROPEAN COMMISION. NaĜízení komise þ. 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny. 2005, 26 s. 5.IKEDA, T., TAMATE, N., YAMAGUCHI, K., MAKINO, S. Quantitative analysis of Staphylococcus aureus in skimmed milk powder by real-time PCR. The Journal of Veterinary Medical Science, 2005, vol. 67, no. 10, p. 1037-1041. 6.NAěÍZENÍ KOMISE (ES) þ. 1662/2006, kterým se mČní naĜízení Evropského parlamentu a Rady (ES) þ. 853/2004, kterým se stanoví zvláštní hygienická pravidla pro potraviny živoþišného pĤvodu. 2006, 10 s. 7. ROBERTS, T. A., BAIRD-PARKER, A. C., TOMPKIN, R. B. Microorganisms in food: Characteristics of microbial pathogens. 1st printing, 1996. ISBN 0-412-47350-X.

PodČkování: Práce vznikla za finanþní podpory výzkumného zámČru MSM 6215712402 Veterinární aspekty bezpeþnosti a kvality potravin. Kontaktní adresa: MVDr. Lenka Necidová, Ph.D., Ústav hygieny a technologie mléka, FVHE, VFU Brno, Palackého 1-3, 612 42 Brno, e-mail: [email protected]

130

RAST MIKROORGANIZMOV POýAS MODELOVÝCH VÝROB HRUDKOVÝCH SYROV ZO SUROVÉHO OVýIEHO A KOZIEHO MLIEKA Medvećová Alžbeta, Liptáková Denisa, Valík ďubomír, Janovþíková Lenka, Hudecová Anna Fakulta chemickej a potravinárskej technologie, Bratislava, Slovensko Growth of microorganisms during the modelled manufacture of lump cheese produced from ewe's and goat raw milk Summary: Refer to the previous analysis of growth of Staphylococcus aureus and Escherichia coli during milk fermentation 1, 2, the growth characteristics of these contaminants were studied in model cheeses made from raw ewes´ and goats´ milk with or without addition of starter cultures. The initial concentration of E. coli in ewes´ and goats´ cheeses ranged from 102 to 104 CFU/g and its final 6d concentration reached the density from 103 to 106 CFU/g depending on type of milk and starter culture addition. The initial concentrations of S. aureus were about 104 CFU/g and reached the range from 103 to 105 CFU/g in ewes´ milk without addition of lactic acid bacteria culture finally. The growth dynamics of S. aureus and E. coli in cheeses were compared with growth parameters in milk co-culture of E. coli with Lactococcus lactis subsp. lactis and growth parameters of S. aureus with Fresco culture at 18 °C. According to our experimental data, the addition of the lactic acid bacteria culture and following pH decrease on the levels lower than 5.0 for 1 to 2 d were able inhibit growth of S. aureus and E. coli on concentration lower than 104 CFU/g.

Baktérie mlieþneho kysnutia sú prirodzenými antagonistami nežiaducich mikroorganizmov v potravinách. Hlavným inhibiþne pôsobiacim faktorom pri fermentácii je kyselina mlieþna, znižujúca hodnotu pH. Prostredníctvom kyslomlieþnych fermentácií sa predlžuje trvanlivosĢ, zvyšuje kvalita a v mnohých prípadoch zapezpeþuje aj zdravotná neškodnosĢ východiskových surovín. Okrem týchto benefitov proces fermentácie priaznivo ovplyvĖuje senzorické vlastnosti a akceptovateĐnosĢ niektorých zložiek potravín. Staphylococcus aureus je tretím najþastejším agens potravinových otráv vo svete 3, 4. ýasto býva prítomný na pokožke a slizniciach, v nosných dierkach, hltane, vo vlasoch, v gastrointestinálnom a urogenitálnom trakte Đudí. Vyskytuje sa tiež na koži, strukoch a mukóznych membránach mlieko produkujúcich zvierat, odkiaĐ sa môže šíriĢ na pokožku vemena, ruky dojiþov a podstielku. Asperger a Zangerl (2003)4 udávajú, že v prípade infikovaného vemena, je S. aureus exkrétovaný do mlieka, kde jeho poþty varírujú od 101 – 108 KTJ/ml, zvyþajne však v poþtoch 104 KTJ/ml. PodĐa Valíka a kol. (2004)5 sa v dobre nadojenom ovþom mlieku môže vyskytovaĢ v poþtoch medzi 100 až 200 KTJ/ml. Hoci väþšina kmeĖov neprodukuje enterotoxíny, sú aj také, ktoré ich produkujú a vyvolávajú stafylokokové enterotoxikózy. Preto je nevyhnutné zabrániĢ spracovávaniu surovín kontaminovaných S. aureus, nakoĐko aj keć jeho bunky môžu byĢ usmrtené, enterotoxíny prekonávajú pasterizaþné ošetrenia. V ostatnom þase boli Európskou úniou definované kritériá hygieny procesu pre poþty Staphylococcus aureus, v syroch vyrábaných zo surového mlieka (n = 5, c = 2, m = 104 a M = 105 KTJ/g)6. Tieto štandardy môžu byĢ splnené, ak sa dodržujú pravidlá správnej výrobnej praxe na farmách a mlieko na výrobu syrov sa okamžite schladí alebo ihneć spracováva 4, 7, 8. V potravinárskej praxi je E. coli kontaminantom, ktorý znehodnocuje viaceré potravinárske produkty. Pri výrobe syrov s nízkodohrievanou syrovinou (pri 36 až 40 °C) fermentáciou zbytkovej laktózy vyvoláva ich skoré nadúvanie. Niektoré toxinogénne kmene E. coli sa dokážu prichytiĢ na nerezových povrchoch technologických zariadení. Krížovou kontamináciou poþas výroby alebo manipulácie s potravinami vstupujú napríklad shiga-toxín produkujúce kmene do potravinového reĢazca 9, 10, 11. Pasterizaþné a sterilizaþné teploty E. coli devitalizujú, naopak chladenie rast E. coli iba spomalí. Technológie používané pri spracovaní mlieka, napríklad zrecie procesy, poþet E. coli þiastoþne znižujú. PodĐa Burdovej a Laukovej (2001)12 zníženie aktívnej kyslosti pH pod 5,0, rast a rozmnožovanie E. coli obmedzuje až zastavuje. S. aureus rovnako aj E. coli sú slabí kompetitítori a ich rast je þasto obmedzený inými mikroorganizmami, predovšetkým baktériami mlieþneho kysnutia. Dôvody pre slabý rast oboch testovaných mikroorganizmov v prostredí baktérií mlieþneho kysnutia sú produkcia organických 131

kyselín (pokles pH), utilizácia kyslíka kompetitívnymi mikroorganizmami (pokles redoxného potenciálu), zníženie nutriþných faktorov a produkcia špecifických antimikrobiálnych faktorov 7, 8. CieĐom práce bolo kvantitatívne analyzovaĢ rast S. aureus a E. coli v laboratórne pripravených syroch zo surového kozieho a ovþieho mlieka a ich dynamiku rastu porovnaĢ s rastom pozorovaným v UHT mlieku pri súbežnej kultivácii s þistými kultúrami baktérií mlieþneho kysnutia. Analýza rastu Staphylococcus aureus a Escherichia coli v laboratórne pripravených syroch zo surového mlieka a v UHT mlieku v prítomnosti baktérií mlieþneho kysnutia. V nadväznosti na predchádzajúce experimenty, v ktorých sme sa venovali analýze rastu S. aureus a E. coli v mlieku v prítomnosti kompetitívnych kultúr baktérií mlieþneho kysnutia, v tejto práci sme pokraþovali v charakterizácii rastu oboch kontaminantov v modelových syroch z ovþieho a kozieho mlieka. Syry boli vyrobené zo surového mlieka za laboratórnych podmienok bez prídavku a s prídavkom doplnkovej mezofilnej zákysovej kultúry. Poþiatoþné koncentrácie E. coli v syroch z ovþieho (obr. 1) a kozieho (obr. 2) mlieka sa pohybovali od 5,0.102 KTJ/g do 1,0.104 KTJ/g a koneþné poþty dosahovali hodnoty od 2,0.103 KTJ/g do 2,7.106 KTJ/g v závislosti od druhu mlieka a prídavku štartovacej kultúry. V ovþom syre s prídavkom štartovacej kultúry sme pozorovali v 24. h nárast poþtov o 2 log poriadky a následne došlo k odumieraniu buniek rýchlosĢou GrEc = -0,011 log KTJ/h. V ovþom hrudkovom syre bez prídavku štartovacej kultúry sa obsah E. coli poþas celej doby uchovávania syra zvýšil o 3 log poriadky, priþom v oboch typoch syrov došlo k prekroþeniu limitu 104 KTJ/g (log Nend = 5 až 6), ktorý je zadefinovaný Potravinovým kódexom SR pre syry vyrobené zo surového mlieka. Poþiatoþné koncentrácie S. aureus v kozom i ovþom hrudkovom syre boli poriadkovo 4 10 KTJ/g a na konci pokusov sa pohybovali v rozmedzí 103 až 105 KTJ/g. V prípade ovþieho hrudkového syra s prídavkom štartovacej kultúry zaþali bunky S. aureus po 24 h uchovávania syra pri 18 °C odumieraĢ rýchlosĢou podobnou ako v predchádzajúcom prípade GrSa = -0,01 log KTJ/h (Nend < 1,0.104 KTJ/g) a v syre bez štartovacej kultúry bol pokles živých buniek zaznamenaný po 96 h rýchlosĢou GrSa = -0,015 log KTJ/h, priþom koneþná denzita S. aureus prekroþila limit 105 KTJ/g, kedy môže v prípade enterotoxinogénnych kmeĖov dôjsĢ k produkcii enterotoxínov.

Ovþí hrudkový syr s kultúrou A (25 - 18 °C)

Ov þí hrudkov ý sy r (25 - 18 °C)

10

9

9

8 7 log KTJ/ml; pH

log KTJ/ml; pH

8 7 6 5

6 5 4

4

3

3 2

2 0

24

48

72

96

120

144

0

24

48

72

t [h] OHS_Laktokoky OHS_Laktobacily

OHS_EC OHS_pH

OHS_Laktokoky_A OHS_Laktobacily_A

OHS_SA

OHS_EC_A OHS_pH_A

96 t [h]

120

144

OHS_SA_A

Obr. 1: Dynamika rastu mikroorganizmov a zmeny hodnôt pH poþas zrenia ovþieho hrudkového syra bez a s prídavkom štartovacej kultúry A, pri teplote 18 °C

132

Obsah natívnych laktokokov (stanovených na agare M17) v kozom syre dosahoval hodnotu 6,15 log KTJ/g a laktobacilov (agar MRS) 7,20 log KTJ/g. V prípade ovþieho syra bez prídavku a s prídavkom mezofilnej zákysovej kultúry sa poþiatoþné koncentrácie laktokokov pohybovali v rozmedzí 4,6 až 4,95 log poriadkov a koncentrácie laktobacilov dosahovali 2,7 až 4,8 log poriadkov. V kozom syre dosiahol maximálnu koncentráciu S. aureus v 21. h uchovávania syra (N = 5,8.105 KTJ/g) a následne zaþal poþet životaschopných buniek klesaĢ rýchlosĢou -0,005 log KTJ/h na koneþnú hodnotu 3,8.104 KTJ/g. Koncentrácia E. coli sa poþas celého obdobia uchovávania syrov zvýšila o 1 log poriadok s maximálnou hodnotou 2,0.103 KTJ/g. U oboch sledovaných mikroorganizmov nedošlo poþas celej doby uchovávania kozieho syra k prekroþeniu limitov, ktoré by viedli k znehodnoteniu produktu alebo k produkcii toxínov ohrozujúcich zdravie konzumenta. Hodnoty aktívnej kyslosti poklesli za takmer 7 dní z 5,79 na 5,24 rýchlosĢou -0,137 h-1. Kozí hrudkový syr (25 - 18 °C)

9 8

log KTJ/ml; pH

7 6 5

4 3 2 0

24

48

72

96

120

144

168

t [h] KZ_Laktokoky

KZ_EC

KZ_SA

KZ_Laktobacily

pH

Obr. 2: Dynamika rastu mikroorganizmov a zmeny hodnôt pH poþas zrenia kozieho hrudkového syra bez prídavku štartovacej kultúry, pri teplote 18 °C

(N 0 EC = 2.2 log KTJ/ml; N 0 Lc = 7.4 log KTJ/ml; 18°C)

(N 0 EC = 2.0 log KTJ/ml; N 0 Lc = 4.5 log KTJ/ml; 18°C)

10

9

9

8

8

7

7 log KTJ/ml; pH

log KTJ/ml; pH

10

6 5 4 3

6 5 4 3

2

EC_LC co-culture

pH co-culture

LC_EC co-culture

EC mono-culture

2

1

EC_LC co-culture

pH co-culture

LC_EC co-culture

EC mono-culture

1

0

12

24

36

48

0

t [h]

24

48

t [h]

72

96

120

Obr. 3: Vplyv Lactococcus lactis subsp. lactis (N0Lc = 104 a 107 KTJ/ml) na rast Escherichia coli poþas súbežnej kultivácie v mlieku pri teplote 18 °C

133

V dobre vykysnutom ovþom alebo kozom hrudkovom syre je rozmnožovanie a prípadná tvorba stafylokokových enterotoxínov potlaþená fermentaþným metabolizmom baktérií mlieþneho kysnutia. Na zabezpeþenie správneho kysnutia nemá, podĐa Görnera a Valíka (2002)13 a Heriana (2002)14, poþas zrenia hrudkového syra po zasyrení mlieka klesnúĢ priemerná vnútorná teplota syreniny pod 18 °C. Z uvedeného dôvodu sme vykonali subkultivaþné pokusy pri tejto, v procese výroby syrov, hraniþnej teplote. Dynamika rastu E. coli a S. aureus v syroch bola porovnaná s rastovými parametrami pozorovanými v spoloþných kultiváciách E. coli s þistou kultúrou Lactococcus lactis subsp. lactis (N0Lc= 104 a 107 KTJ/ml) a S. aureus a kultúra Fresco 1010 v mlieku pri teplote 18 °C. Prídavky þistej kultúry L. lactis spôsobili zníženie dynamiky rastu E. coli v porovnaní s monokultúrou (obr. 3). Napríklad poþiatoþná denzita L. lactis 107 KTJ/ml pozastavila rast E. coli na koncentráciách nižších ako v prípade monokultúrnej kultivácie pri 18 °C, kedy koneþné poþty E. coli dosiahli hodnotu 7,1.103 KTJ/ml. Hodnota rastovej rýchlosti þistej kultúry E. coli v mlieku bez prídavku L. lactis bola pri teplote 18 °C GrEc = 0,229 log KTJ/h, kým v mlieku s vysokým prídavkom laktokoka (107 KTJ/ml) bola rastová rýchlosĢ E. coli o 47 % nižšia (0,121 log KTJ/h). Vplyv L. lactis na E. coli bol viditeĐný aj pri nižšom prídavku L. lactis (104 KTJ/ml), nakoĐko denzity E. coli v stacionárnej fáze nedosiahli svoje maximálne hodnoty. Pre ilustráciu, pri poþiatoþnej koncentrácii 104 KTJ/ml L. lactis, denzita E. coli v stacionárnej fáze dosahovala hodnotu 3,2.106 KTJ/ml pri 18 °C, kým pri mono-kultúre sa koneþné denzity E. coli pohybovali rádovo 108 KTJ/ml. Zvýšený prídavok L. lactis (104 KTJ/ml) viedol aj k zníženiu rastovej rýchlosti E. coli v mlieku z hodnoty Grmono-culture,18 °C = 0,229 log KTJ/h na Grco-culture,18 °C = 0,187 log KTJ/h o 18 %. Pri štúdiu vplyvu komerþnej kultúry baktérií mlieþneho kysnutia na rast stafylokoka sme v paralelných pokusoch k poþiatoþným poþtom S. aureus 2064 (poriadkovo 103 KTJ/ml) zámerne pridávali zvyšujúce sa prídavky kultúry Fresco 1010. Poþas ich spoloþnej kultivácie, dosiahli baktérie mlieþneho kysnutia stacionárnu fázu za 32-36h, v priemerných maximálnych poþtoch Nend_Fr = 109 KTJ/ml. Ich rast bol sprevádzaný tvorbu kyseliny mlieþnej, v dôsledku þoho v prostredí klesala hodnota pH. Z prezentovaných grafov je zrejmé, že S. aureus rástol len pri nezmenených hodnotách pH prostredia, teda len poþas tzv. lag-fázy pH, ktorá sa so zvyšujúcim poþiatoþným prídavkom kultúry Fresco prirodzene skracovala z takmer 31 hodín, pri poþiatoþnom množstve kultúry Fresco 103 KTJ/ml, až po 21 hodín pri inokule kultúry Fresco N0_Fr = 105 KTJ/ml. So skrátením dĎžky lag-fázy pH úzko súvisí aj postupný pokles maximálnych poþtov stafylokoka v stacionárnej fáze charakterizovaný jeho nárastom oproti jeho poþiatoþným poþtom. (N 0 Fr = 5.18 log KTJ/ml; N 0 Sa = 2.68 log KTJ/ml; 18°C)

(N 0 Fr = 2.91 log KTJ/ml; N 0 Sa = 2.91 log KTJ/ml; 18 °C)

9

9

8

8

7 log KTJ/ml; pH

log KTJ/ml; pH

10

7 6 5

6 5 4

4

3

3 SA 2.6

pH FR 5.18

FR 5.18

SA_FR1_18

SA_18

0

12

24

t [h]

36

48

FR1_18_pH

FR03_18

SA_18

2

2

0

60

12

24

t [h]

36

Obr. 4: Dynamika rastu Staphylococcus aureus 2064 a kultúry Fresco 1010 (No 5,18 log KTJ/ml) poþas spoloþnej kultivácie v mlieku pri teplote 18 °C

48 Fr

60

= 2,91 a

Na obr. 4 sú uvedené rastové þiary pri spoloþnej kultivácii S. aureus 2064 s poþiatoþným 134

prídavkom kultúry Fresco N0_Fr = 2,91 KTJ/ml a N0_Fr = 5,18 KTJ/ml. Ako možno z grafov vidieĢ, na kvalitu a kvantitu pomnoženia patogénneho mikroorganizmu malo vplyv množstvo prítomnej inhibiþne pôsobiacej mikroflóry baktérií mlieþneho kysnutia. Pri rovnakých poþiatoþných poþtoch obidvoch mikrooorganizmov v spoloþnej kultúre, dosiahol S. aureus v stacionárnej fáze maximálnu hodnotu svojich poþtov 5,1 log poriadku. Jeho rastová rýchlosĢ v tomto prípade bola GrSa = 0,151 log KTJ/h (Td = 1,99 h), a teda zdvojnásobenie stafylokokovej populácie nastalo za 2 h. So zvýšením poþiatoþného prídavku kultúry Fresco na hodnotu 5,18 log poriadku, sa znížila rastová rýchlosĢ S. aureus v exponenciálnej fáze takmer 4-násobne (GrSa = 0,044 log KTJ/h; Td = 6,8 h) a jeho maximálne poþty v stacionárnej fáze dosiahli nárast len o 0,7 log poriadku v porovnaní s jeho poþtom na zaþiatku. Naproti tomu, ak rástol S. aureus 2064 v prostredí neovplyvnenom prítomnosĢou, voþi nemu inhibiþne pôsobiacimi baktériami mlieþneho kysnutia, nadobudol ideálne rastové parametre. S rastovou rýchlosĢou v exponenciálnej fáze GrSa = 0,118 log KTJ/h dosiahol v stacionárnej fáze poþty o 4,7 log poriadkov vyššie oproti jeho poþiatoþným poþtom. Záver V našej práci sme zistili, že poþiatoþná koncentrácia baktérií mlieþneho kysnutia aspoĖ 106 až 107 KTJ/ml, resp. KTJ/g, dokáže udržaĢ zdravotne a technologicky nežiaduce mikroorganizmy pod kontrolou v súlade s legislatívnymi nariadeniami. Rýchly pokles aktívnej kyslosti na hodnoty nižšie ako pH 5,0 zohral významnú úlohu v parciálnej inhibícii rastu S. aureus a E. coli v mlieku i kozom syre, priþom ich koneþné denzity dosahovali poþty rovné a nižšie ako 104 KTJ/ml. Nižšie poþiatoþné koncentrácie laktokokov a laktobacilov v ovþom syre bez prídavku mezofilnej štartovacej kultúry umožnili relatívne rýchly rast S. aureus a E. coli, priþom ich koneþné denzity sa pohybovali v rozmedzí od 105 do 106 KTJ/g. Teplota fermentácie minimálne 18 °C je vhodná pre spomalenie rastu oboch sledovaných kontaminantov využitím princípov biokonzervácie, þo je v súlade s prácou Valíka a kol. (2004)5, podĐa ktorej sú teploty 18 až 21 °C veĐmi dôležité z technologického hĐadiska pri výrobe syrov zo surového ovþieho mlieka. Poćakovanie: Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy þ. APVV-20-005605 a z grantu MŠ VEGA þ. 1/3488/06. Použitá literatúra: 1. LIPTÁKOVÁ, D. – VALÍK, ď. – JANOVýÍKOVÁ, L. – HUDECOVÁ, A. Vplyv baktérií mlieþneho kysnutia na rast Escherichia coli pri súbežnej kultivácii v mlieku. In: Mikroorganismy na prahu 21. století. Liberec, 2007, s. 194. 2. MEDVEĆOVÁ, A. – VALÍK, ď. – BAJUSOVÁ, B. Kompetitívny úþinok baktérií mlieþneho kysnutia na rast Staphylococcus aureus. In: Slovak Journal of Animal Science, roþ. 40, 2007, þ. 4, s. 196-203. 3. NORMANNO, G. - LA SALANDRA, G. - DAMBROSIO, A. et al. Occurance, characterization and antimicrobial resistence of enterotoxigenic Staphylococcus aureus isolated from meat and dairy products. In: International Journal of Food Microbiology, vol. 115, 2007, no. 3, p. 290-296. 4. ASPERGER, H. - ZANGERL, P. Staphylococcus aureus. In: ROGINSKI, H. - FUQUAY, J.W - FOX, P.F.: Encyclopedia of Dairy Science. San Diego: Academic Press, 2002, vol. 4, p. 2563-2569. 5. VALÍK, ď. - GÖRNER, F. - SONNEVELD, K. - POLKA, P. Faktory ovplyvĖujúce fermentáciu ovþieho hrudkového syra na salaši. In: ŠTċTINA, J. - ýURDA, L.: Celostátní pĜehlídky sýrĤ, 2004: Výsledky pĜehlídek a sborník pĜednášek semináĜe Mléko a sýry 2004. Praha: ýeská spoleþnost chemická, 2004a, s. 85-87. ISBN 978-80-86238-42-5. 6. Nariadenie komisie (ES) þ. 2073/2005 o mikrobiologických kritériách pre potraviny. 7. JAY, J.M. Staphylococcal Gastroenteritis. In JAY, J.M. Modern Food Microbiology. 6th ed., Gaithersburg: Aspen Publisher, Inc., 2000, vol. 23. ISBN 0-8342-1671-X, p. 441-459.

135

8. BAIRD-PARKER, T.C. Staphylococcus aureus. In: LUND, B.M. - BAIRD-PARKER, T.C. - GOULD, G.W.: The Microbiological Safety and Quality of Food. Gaithersburg: Aspen Publishers, Inc., 2000, vol. 1, p. 1317-1330. 9. GÖRNER, F. - VALÍK, ď. Aplikovaná mikrobiológia požívatín. 1. vyd. Bratislava: Malé Centrum, 2004. ISBN 80-967064-9-7. 10. RIVAS, L. - FEGAN, N. - DYKES, G.A. Attachment of Shoga toxigenic Escheriachia coli to stainless steel. In: International Journal of Food Microbiology, vol. 115, 2007, no. 3, p. 89-94. 11. LIM, S.K. - LEE, H.S. - NAM, H.M. et al. Antimicrobial resistence observed in Escherichia coli strains isolated from fecal samples of cattle and pigs in Korea during 2003-2004. In: International Journal of Food Microbiology, vol. 115, 2007, p. 283-286. 12. BURDOVÁ, O. - LAUKOVÁ, A. Zdravotná neškodnosĢ mlieka a mlieþnych výrobkov. In: Mliekarstvo, roþ. 32, 2001, þ. 1, s. 22-23. 13. GÖRNER, F. - VALÍK, ď. Mikrobiologické a technologické otázky výroby ovþieho hrudkového syr a bryndze. In: Mliekarstvo, roþ. 33, 2002, þ. 4, s. 16-17. 14. HERIAN, K. Zásady správnej výroby ovþích hrudkových syrov. In: Mliekarstvo, roþ. 33, 2002, þ. 1, s. 42-45.

Kontaktná adresa: Ing. Alžbeta Medvećová, Ing. Denisa Liptáková, PhD., Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovenská republika

136

ANTIMIKROBIÁLNÍ AKTIVITA LAKTOBACILģ A LAKTOKOKģ NČmeþková Irena, Dráb Vladimír, Kleþacká Jana, Vilímková Miroslava, Roubal Petr, Rohacká Hana Výzkumný ústav mlékárenský s.r.o. Antimicrobial activity of lactobacilli and lactococci Summary: Antimicrobial activity of lactic acid bacteria was tested. 30 strains of newly isolated lactobacilli of human origin and 10 strains of lactococci from Culture Collection of Dairy Microorganisms Laktoflora® (CCDM) were used. Their ability to inhibit growth of spoilage bacteria B. cereus, B. licheniformis, P. aeruginosa and Cl. butyricum was proved. Organic acids inhibitory effect was excluded by the culture neutralization. Cleavage by catalase or proteinase K was a tool for further characterisation of inhibitory substances. There were 6 strains with strong antimicrobial activity among lactobacilli. The most effective were Lbc. helveticus RL 20-P and Lbc. rhamnosus RL 29-P, that inhibited bacilli and pseudomonases. Lactococci inhibited grampositive bacteria – antimicrobial effect other than caused by acids was found only at the control nisin positive strains Lc. lactis ssp. lactis CCDM 702 a CCDM 731.

Úvod Bakterie mléþného kvašení mají schopnost tvoĜit Ĝadu slouþenin s antimikrobiálními vlastnostmi. Fermentací cukrĤ vznikají organické kyseliny, které zpĤsobují pokles pH kultivaþního média a okyselení cytoplazmy bunČk. Nedisociované formy mČní propustnost membrány a narušují tak bunČþný transport1. Dalšími významnými látkami jsou peroxid vodíku, oxid uhliþitý a bakteriociny2, což jsou látky bílkovinné povahy, které inhibují bakterie pĜíbuzných druhĤ3. Prvním bakteriocinem produkovaným bakteriemi mléþného kvašení, který byl izolován a schválen pro použití pĜi výrobČ sýrĤ, je nisin produkovaný nČkterými kmeny Lc. lactis4. Cílem této práce je charakterizovat novČ izolované kmeny laktobacilĤ z hlediska jejich antimikrobiálních vlastností, porovnat jejich úþinnost vzhledem k laktokokĤm a vybrat kmeny se silnou antimikrobiální aktivitou, které by mohly být – po provČĜení dalších biochemických a fyziologických vlastností – využity pĜi potlaþování nežádoucí mikroflóry. Metodika Testováno bylo 30 kmenĤ laktobacilĤ izolovaných z lidských zdrojĤ a identifikovaných pomocí testĤ API 50 CHL a 10 kmenĤ laktokokĤ ze sbírky CCDM Laktoflora® (tab. I). Použity byly kultury laktobacilĤ v MRS bujónu (37 °C/16 h anaerobnČ) a laktokoĤ v LM17 bujónu (30 °C/16 h). Antimikrobiální aktivita byla testována vĤþi P. aeruginosa CCM 3955 a izolátĤm VÚM B. cereus SPA 12, B. licheniformis SPA 9, Cl. butyricum 112. Klostridia byla pomnožena v BB bujónu s resazurinem a laktátem (37 °C/48 h anaerobnČ), ostatní technologicky nežádoucí mikroorganismy na GTK agaru (30 °C/24 h) a poté setĜeny sterilním tamponem do fyziologického roztoku. Provedena byla vždy dvČ paralelní stanovení agar well-diffusion metodou a agar spot 5 testem na GTK agaru za podmínek vhodných pro daný technologicky nežádoucí kmen. Metodikou dle literatury6 byl testován inhibiþní vliv kultur bakterií mléþného kvašení v bujónu a neutralizovaných filtrátĤ tČchto kultur, vþetnČ filtrátĤ po reakci s katalasou (štČpení peroxidu vodíku) nebo proteinasou K (štČpení peptidových vazeb).

137

Tabulka I Testované kmeny bakterií mléþného kvašení RL 1-P RL 4-P RL 14-P RL 15-P RL 16-P RL 18-P RL 19-P RL 20-P RL 21-P RL 22-P RL 23-P RL 24-P RL 25-P RL 26-P RL 27-P RL 28-P RL 29-P RL 30-P CCDM 48 CCDM 416 CCDM 421 CCDM 702 CCDM 731 CCDM 823 CCDM 824 CCDM 885 CCDM 890 CCDM 946

Lbc. rhamnosus Lbc. paracasei ssp. paracasei Lbc. rhamnosus Lbc. salivarius Lbc. fermentum Lbc. rhamnosus Lbc. paracasei ssp. paracasei Lbc. helveticus Lbc. paracasei ssp. paracasei Lbc. acidophilus Lbc. fermentum Carnobacterium divergens Lbc. fermentum Lbc. plantarum Lbc. fermentum Lbc. buchneri Lbc. rhamnosus Lbc. rhamnosus Lc. lactis ssp. lactis Lc. lactis ssp. lactis Lc. lactis ssp. lactis Lc. lactis ssp. lactis, nisin produkující Lc. lactis ssp. lactis, nisin produkující Lc. lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis Lc. lactis ssp. cremoris Lc. lactis ssp. cremoris Lc. lactis ssp. cremoris Lc. lactis ssp. cremoris

Výsledky a diskuse Výchozí soubor bakterií mléþného kvašení byl na základČ testování kultur v bujónu zúžen na úþinné kmeny, jejichž kultury byly neutralizovány, sterilovány filtrací, pĜípadnČ dále ošetĜeny. Výsledky jsou shrnuty v tab. II. Pro jejich interpretaci je dĤležité zjištČní, že Cl. butyricum je inhibováno samotnou proteinasou a pro P. aeruginosa mĤže agar spot test poskytovat falešnČ pozitivní výsledky.

138

Tabulka II Antimikrobiální úþinnost filtrátĤ bakterií mléþného kvašení (+ inhibuje, - neinhibuje, +/- slabá inhibice, BC – B. cereus, BL – B. licheniformis, PA – P. aeruginosa, CB – Cl. butyricum) agar well-diffusion assay neutralizovaný

agar spot test

BC

BL

PA

CB

BC

BL

-

-

-

-

-

-

PA

CB

RL 1-P

neutr. + katalasa neutr. + proteinasa neutralizovaný

+/-

+/-

+/-

+ -

+/-

+/-

+/+/-

+ -

RL 4-P


+/+/-

+/+/+/-

+/+/+/-

+ -

+/+/-

+/+/-

+

+ -

RL 14-P


-

+/+/+/-

+/+/-

+

+/-

-

+ + +

-

RL 15-P


+/-

+/+/+/-

-

+ + -

+/+/-

-

+ + +

+/+/-

RL 16-P


+/+/-

+/+/-

+/+

-

+/-

-

+ + +/-

+/+/-

RL 18-P


-

-

+ + -

+ -

-

-

-

+ +

RL 19-P


+

+

+

+ -

+

+

+

+ -

RL 20-P


+ + +/-

+ + +/-

+ + +/-

+/-

+ -

+ + -

+ + +

+

RL 21-P


+/+/-

+/+/-

+/+/-

+ +

+

+/-

+ + +

+ + -

RL 22-P


+/+

-

-

+ + -

+ -

+/+/-

-

+ -

RL 23-P

neutr. + katalasa neutr. + proteinasa

+ +

-

+

+

-

-

-

+

139

Tabulka II – pokraþování

RL 24-P

RL 25-P

RL 26-P

RL 27-P

RL 28-P

RL 29-P

RL 30-P

CCDM 48

CCDM 416

CCDM 702

CCDM 731

agar well-diffusion assay

agar spot test

neutralizovaný

BC +

BL -

PA -

CB -

BC +

BL -

PA +

CB -

neutr. + katalasa

+

-

-

-

+

-

+

-

neutr. + proteinasa

+

-

-

+

+

-

+

+

neutralizovaný

+

-

-

+

-

-

+

+

neutr. + katalasa

+

-

-

+

-

-

+

+

neutr. + proteinasa neutralizovaný

+ -

-

-

+ +/-

-

-

+ +

+ +

neutr. + katalasa

-

-

-

+/-

-

-

+

+


+

-

-

+/-

+

+

+ +

+ +/-

neutr. + katalasa

+

-

-

-

+

-

+

+


+ -

-

-

-

+ +

-

+ +

+ -

neutr. + katalasa

+

-

-

-

+

-

+

-


+

+

+

+ -

+ -

-

+ +

+ -

neutr. + katalasa

+

+

+

-

-

-

+

-


+ -

+ -

+

+ -

-

-

+ +

+ +

neutr. + katalasa

-

-

+

+

-

-

+

+


-

-

+ -

+ -

-

-

+ +/-

+ +/-

neutr. + katalasa

-

-

-

-

-

-

+/-

-


-

-

-

+/-

-

-

+/+

+/+/-

neutr. + katalasa

-

-

-

-

-

-

+

+/-


+/-

+/-

-

+/+

+

+

+ +

+ +

neutr. + katalasa

+/-

+/-

-

+

+

+

+

+


+/+/-

+/+/-

-

+/+

+ +

+ +/-

+ +

+ +

neutr. + katalasa

+/-

+/-

-

+

+

+/-

+

+

neutr. + proteinasa

+/-

+/-

-

+/-

+

+/-

+

+

140

ZávČr Tvorba nejúþinnČjších antimikrobiálních metabolitĤ nekyselé povahy byla zjištČna u laktobacilĤ RL 20-P a RL 29-P, které inhibovaly jak testované bacily tak pseudomonády. Dalšími perspektivními kmeny jsou RL 24-P, RL 25-P, RL 26-P, RL 27-P a RL 30-P. S výjimkou nisin produkujících kmenĤ CCDM 702 a CCDM 731 byla antimikrobiální aktivita laktokokĤ zpĤsobena tvorbou organických kyselin. Nisin byl úþinný vĤþi testovaným bacilĤm a klostridiím, avšak ne vĤþi pseudomonádám.

PodČkování: Tato práce vznikla s finanþní podporou MŠMT pĜi Ĝešení výzkumného zámČru 2672286101 Mléko – významná souþást zdravé a bezpeþné výživy. Použitá literatura: 1. Ammor, S., Tauveron, G.,Dufour, E., Chevallier, I. (2006): Antibacterial activity of lactic acid bacteria against spoilage and pathogenic bacteria from the same meat small-scalle facility. 1 – Screening and characterisation of the antibacterial compounds. Food Control 17: 454 – 461. 2. Ouwehand, A.C., Vesterlund, S. (2004): v knize Lactic Acid Bacteria. Microbiological and Functional Aspects, str. 375 – 391. Marcel Dekker, New York, 2004. 3. Rodrígez, e., Gonzáles, B., Gaya, P., Nunez, m., Medina, M. (2000): Diversity of bacteriocins produced by lactic acid bacteria isolated from row milk. Int. Dairy J. 10: 7 – 15. 4. Christiansen, P., Petersen, M.H., Kask, S., Moller, P.L., Petersen, M., Nielsen, E.W., Vogensen, F.K., ArdĘ, Y. (2005): Anticlostridial activity of Lactobacillus isolated from semi-hard cheeses. Int. Dairy J. 15: 901 – 909. 5. Hernández, d., Cardell, E., Zárate, V. (2004): Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from Tenerife cheese: initial characterisation of plantacirin TF711, a bacteriocine-like substance produced by Lactobacillus plantarum TF711. J. Appl. Microbiol. 99: 77 – 84. 6. TĤma, 3., Vogensen, F.K., ArdĘ, Y. (2005): Antiklostridiální aktivita laktobacilĤ izolovaných z polotvrdých sýrĤ. MlékaĜské listy 93: 18 – 21.

Kontaktní adresa: Ing. Irena NČmeþková, Výzkumný ústav mlékárenský, s.r.o., Ke Dvoru 12a, 160 00 Praha 6, tel.: +420 235 354 551-2, fax: +420 235 358 607, [email protected]

141

ANTIBAKTERIÁLNÍ ÚýINKY FOSFÁTOVÝCH TAVICÍCH SOLÍ NA VYBRANÉ MIKROORGANIZMY KONTAMINUJÍCÍ TAVENÉ SÝRY BuĖková Leona, Pleva Pavel, BuĖka František Ústav potravináĜského inženýrství FT UTB ve ZlínČ, Antibacterial effect of phosphate-type emulsifying agents against selected microorganisms in processed cheeses Summary: The article aims to evaluate the impact of 3 different commercially available food-grade phosphate-type emulsifying agents (HBS, S9 and 690) on the 16 tested strains of gram-negative and gram-positive bacteria and on the 13 strains of bacteria, which were isolated from non-sterilized processed cheeses. Five different concentrations (0.1, 0.2, 0.3, 0.4 and 0.5 w/v) of tested salts were evaluated for their effectiveness in inhibiting the growth of tested bacteria. To determine the individual sensitivities of the selected bacterial strains liquid media were supplemented with applied phosphates and for determination of microbial growth the optical density (OD600) was measured. Results show, that emulsifying agents S9 and 690 contained orthophosphates, pyrophosphates and short-chain polyphosphates are generally ineffective against all tested bacteria. The long-chain polyphosphates (in emulsifying salts HBS) were able to inhibit all the tested gram-positives. The minimum inhibitory concentration of the HBS was between 0.2 – 0.3 w/v, which prevented growth of tested gram-positive bacteria in liquid culture. The polyphosphate (HBS) were ineffective against the tested gram-negative bacteria.

Úvod Fosfáty v potravinách významnČ ovlivĖují vlastnosti pĜítomných proteinĤ. Jejich úþinek je spojen pĜedevším s úpravou podmínek prostĜedí, kde mohou zpĤsobit zmČnu pH, iontové síly roztoku, odštČpení kationtĤ, apod.1 PĜi výrobČ tavených sýrĤ se v mlékárenské praxi fosfáty a polyfosfáty (ve formČ sodných solí) pĜidávají jako tavicí soli v koncentraci 2-3 % w/w, a to z dĤvodu zajištČní jemné a homogenní struktury taveného sýru bez separace vody, tuku a proteinĤ 2. Fosfáty mají funkci tzv. emulgujících þinidel upravujících pĜi výrobČ tavených sýrĤ prostĜedí tak, aby pĜítomné kaseiny mohly uplatnit své vlastnosti emulgátorĤ. Toho je dosaženo zejména odštČpením vápníku z kyselých aminokyselin a fosfoserylových zbytkĤ proteinové matrice, a dále prostĜednictvím peptizace, hydratace a bobtnání bílkovin nebo emulgace tukĤ 3. Schopnost chelatace kationtĤ je u fosfátĤ ovlivnČna napĜ. poþtem monomerĤ v molekule (s rostoucím poþtem fosforeþnanĤ roste afinita ke kationtĤm), konkrétním kationtem kovu, teplotou, pH apod. Tato vlastnost se uplatĖuje i pĜi výrobČ tavených sýrĤ, kdy vápenaté ionty jsou od kaseinĤ pĜitahovány k fosfátĤm vyššími elektrostatickými silami a naopak na kasein se váží sodné ionty 1,3. KromČ již zmínČných vlastností mají fosfáty pufrovací schopnost, mohou ovlivnit tvorbu gelu nebo dokonce inhibiþnČ pĤsobit na mikroorganizmy 1. Antimikrobní úþinky fosfátĤ se projevují pĜedevším na grampozitivní bakterie, nČkteré mikromycety a kvasinky 4-9. Úþinky fosfátĤ na gramnegativní bakterie bývají v literatuĜe popisovány zĜídka. V laboratorních podmínkách byl zjištČn inhibiþní efekt na Aeromonas hydrophila 10. U grampozitivních bakterií je inhibiþní efekt závislý na délce ĜetČzce fosfátĤ (fosfáty s delšími ĜetČzci mají vČtší inhibiþní úþinky než fosfáty s kratšími ĜetČzci), na teplotČ a pH prostĜedí (vyšší citlivost pĜi pH > 7,4), poþáteþní populaci mikroorganizmĤ nebo pĜídavku iontĤ kovĤ 6,11-13. U bakterií tvoĜících spory mají polyfosfáty navíc inhibiþní vliv na germinaci spor 7,12,14,15. U Bacillus cereus byl popsán vliv polyfosfátĤ na morfologii bunČk rostoucích v exponenciální fázi, což se projeví lyzí bunČk a neschopností tvorby septa pĜi jejich dČlení. Subletální koncentrace polyfosfátĤ zpĤsobují u této bakterie výrazné prodloužení délky jejich bunČk, které mohou mít až tvar vláken 12. Princip pĤsobení polyfosfátĤ s dlouhým ĜetČzcem spoþívá v chelataci pĜedevším divalentních iontĤ kovĤ (Ca2+ a Mg2+), které jsou esenciální pro udržení integrity bunČþné stČny grampozitivních bakterií tím, že vytváĜejí pĜíþné mĤstky mezi molekulami teichoových kyselin bunČþné stČny 16. Chelatace divalentních iontĤ se mĤže také projevit tak, že tyto ionty jsou nedostupné pro nČkteré nezbytné fyziologické procesy rĤstu. Bylo zjištČno, že protein zodpovČdný 142

pĜi dČlení bunČk za tvorbu septa (FtsZ protein) má GTP-ázovou aktivitu, která je striktnČ závislá na pĜítomnosti hoĜeþnatých iontĤ 12. OdštČpení výše zmínČných iontĤ pak má za následek baktericidní nebo bakteriolytický efekt 12,16. Bylo rovnČž prokázáno, že pĜídavek polyvalentních iontĤ kovĤ do kultivaþního média inhibiþní efekt polyfosfátĤ na mikroorganizmy oslabí 11-13,16. KromČ sledování vlivu polyfosfátĤ na mikroorganizmy v laboratorních podmínkách byly také studovány jejich úþinky na mikroorganizmy v reálných podmínkách. Molins et al.17 zjistili, že pĜídavek fosfátĤ mĤže snížit poþet bakterií Clostridium sporogenes na skladovaných masných výrobcích, Suarez et al.8 popsali inhibiþní úþinky komerþních fosfátĤ na mikromycety (Byssochlamys nivea, Aureobasidium pullulans a Penicillium glabrum) izolované z potravináĜských provozĤ. V literatuĜe jsou rovnČž popisovány inhibiþní úþinky polyfosfátĤ na bakterie, které mohou zpĤsobit kažení mléþných potravin, zejména roztíratelných sýrových výrobkĤ. PĜídavek polyfosfátĤ u tČchto výrobkĤ mĤže zpomalit nebo zabránit rĤstu nežádoucích bakterií tvoĜících spory (zejména klostridií), které se mohou podílet na kažení tČchto výrobkĤ tvorbou plynu, kyseliny máselné nebo produkcí toxinĤ 7,14,15,18. Cílem této práce bylo sledovat antimikrobní úþinky tĜí komerþních tavicích solí na bázi fosfátĤ v rĤzném kondenzaþním stupni na sbírkové mikroorganizmy a následnČ na bakterie, které byly izolovány z dlouhodobČ skladovaných tavených sýrĤ.

Materiál a metody Za úþelem zjištČní antibakteriálních úþinkĤ fosfátových tavicích solí byly vybrány: (i) HBS – smČs polyfosfátĤ s vysokým kondenzaþním stupnČm a orthofosfátĤ; (ii) S9 – smČs polyfosfátĤ (nižší stupeĖ polymerace než HBS) a orthofosfátĤ; (iii) 690 – smČs orthofosfátĤ a difosfátĤ. HBS a S9 vyrábí BK Ladenburg GmbH, NČmecko; 690 produkuje Chemische Fabrik Budenheim, NČmecko. Úþinky tavicích solí na rĤst mikroorganizmĤ byly sledovány na sbírkových bakteriích a na bakteriích izolovaných z tavených sýrĤ. Pro zjištČní spektra úþinku testovaných tavicích solí na mikroorganizmy byly vybrány bakterie, které mohou kontaminovat potraviny, popĜ. mohou mít i klinický význam. Zvoleno bylo 8 gramnegativních bakterií (Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Citrobacter sp., Klebsiella sp., Pseudomonas fluorescens a Flavobacterium sp.) a 8 grampozitivních bakterií (Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus cereus, B. subtilis, B. brevis, B. sphaericus a B. stearothermophilus). Pro zjištČní citlivosti vybraných bakterií k fosfátovým tavicím solím bylo použito 5 koncentrací každé z tavicích solí (0,1; 0,2; 0,3; 0,4 a 0,5 % w/v). Mikroorganizmy byly kultivovány v masopeptonovém bujonu (MPB). Tavicí soli byly v pĜíslušné koncentraci pĜidány pĜímo do tekutého kultivaþního média (pH upraveno na 7,0 pomocí 1M NaOH), které bylo následnČ autoklávováno (15 min, 121 °C). Média obohacená o pĜíslušné soli byla rozpipetována do zkumavek po 5 ml a následnČ zaoþkována 100 ȝl pĜes noc narostené kultury bakterií zĜedČné 1:100 (1,8–6,3·106 CFU/ml). Kontrolní vzorky obsahovaly MPB bez fosfátových solí. Testované bakterie byly kultivovány 24 hodin pĜi 30 °C nebo 37 °C (B. stearothermophilus pĜi 45 °C), bakterie rodĤ Bacillus a Micrococcus byly kultivovány za tĜepání. RĤst mikroorganizmĤ byl zjišĢován spektrofotometricky mČĜením optické denzity bunČk pĜi 600 nm (OD600) na spektrofotometru s diodovým polem LIBRA S6 (Biochrom, Anglie). Ve druhé fázi experimentu byly testovány inhibiþní úþinky fosfátových tavicích solí na bakterie, které byly izolovány z hermeticky uzavĜených výrobkĤ skladovaných pĜi 6 ± 2 °C po dobu 18 a 24 mČsícĤ. Výrobky obsahovaly 40% w/w sušiny a 45 % w/w tuku v sušinČ. Z vyizolovaných bakterií byly pro tento experiment vybrány grampozitivní aerobní sporulující tyþinky, kataláza pozitivní (izoláty NTS 01, NTS 02, NTS 03, NTS 04, NTS 05, NTS 06) a gramnegativní tyþinky kataláza pozitivní, oxidáza negativní (izoláty NTS 07, NTS 08, NTS 09, NTS 10, NTS 11, NTS 12, NTS 13). PĜes noc narostená kultura bakterií zĜedČná 1:100 143

(1,4–7,8·106 CFU/ml) byla zaoþkována (100 ȝl) do 5 ml MPB obsahujícího pĜíslušnou tavicí sĤl a následnČ inkubována pĜi 37 °C po dobu 24 hodin, grampozitivní tyþinky byly kultivovány za tĜepání. RĤst bakterií byl zjišĢován spektrofotometricky stejným zpĤsobem jako u sbírkových kmenĤ bakterií. Výsledky a diskuze Efekt tĜí komerþních fosfátových tavicích solí s rĤzným stupnČm kondenzace byl testován u 29 kmenĤ bakterií pomocí spektrofotometrické analýzy nárĤstu bakterií mČĜené pĜi vlnové délce 600 nm. Metoda mČĜení optické denzity bunČk pĜi 600 nm je vhodnou metodou pro rychlé zjištČní inhibiþního efektu urþené látky, v našem pĜípadČ fosfátových tavicích solí, na mikroorganizmy. Minimální inhibiþní koncentrace byla v našem pĜípadČ definována jako množství fosfátové tavicí soli nutné ke snížení optické denzity bakterií pod 0,075, což koresponduje s hodnotou uvedenou v práci Loessner et al.7 Výsledky naznaþují, že nebyl zjištČn výrazný inhibiþní efekt zvolených tavicích solí na gramnegativní bakterie, což je v souladu s našimi dĜívČjšími studiemi 19. Z tohoto dĤvodu jsou u gramnegativních bakterií uvádČny pouze úþinky nejvyšších koncentrací (0,5 % w/v) testovaných tavicích soli. Výsledky pĤsobení zvolených tavicích solí na gramnegativní bakterie jsou shrnuty v tabulce I. Z výsledkĤ je patrné, že u žádné z testovaných tavicích solí nebylo dosaženo koncentrace, která by striktnČ inhibovala rĤst testovaných gramnegativních bakterií. VČtší efekt byl pozorován pouze u gramnegativních aerobních, kataláza i oxidáza pozitivních tyþinek (Ps. fluorescens a Flavobacterium sp.), u kterých došlo k poklesu hodnoty optické denzity bunČk vĤþi kontrole o cca 55 %. U gramnegativních tyþinek z þeledi Enterobacteriaceae k výraznČjšími poklesu nárĤstu nedošlo. Prakticky zanedbatelné úþinky byly zjištČny u gramnegativních bakterií, které byly získány z tavených sýrĤ, což mĤže být vysvČtleno tím, že tyto mikroorganizmy byly izolovány z prostĜedí s tavicími solemi a mohou být k jejich pĜítomnosti lépe pĜizpĤsobeny než testované sbírkové kmeny bakterií. Uvedené výsledky jsou v souladu s prací Loessner et al.7, kteĜí také nepozorovali inhibiþní efekt tavicích solí s polyfosfáty na sledované gramnegativní bakterie. Tabulka I PĤsobení testovaných tavicích solí na gramnegativní bakterie †

†

Kontrola 0.5% HBS 0.5% S9 0.5% 690 (OD600) 0.348 0 0 0 Escherichia coli 0.788 0 + + Serratia marcescens Salmonella Typhimurium 0.308 + + + 0.976 0 0 + Proteus vulgaris Citrobacter sp. 0.632 + 0 + Klebsiella sp. 0.320 0 + 0 0.423 ++ ++ + Pseudomonas fluorescens Flavobacterium sp. 0.266 0 + ++ NTS 07 0.766 0 0 0 NTS 08 0.829 0 0 0 NTS 09 0.684 0 0 0 NTS 10 0.745 0 0 0 NTS 11 0.579 0 + 0 NTS 12 0.790 0 + + NTS 13 0.535 0 0 0 Inhibiþní efekt testovaných látek je vyjádĜen pomocí procenta optické denzity (OD600) inokulovaného bujonu obsahujícího tavicí sĤl (v uvedené koncentraci) vztažené vĤþi hodnotČ optické denzity (OD600) kontrolního vzorku bez tavicí soli inokulovaného danou kulturou; OD600 25 % +++; 25% < OD600 50 % ++; 50% < OD600 75 % +; OD600 > 75 % 0. 144

Inhibiþní efekt komerþních fosfátových tavicích solí na grampozitivní bakterie je uveden v tabulce II. Z výsledkĤ je patrné, že z testovaných tavicích solí vykazovala výraznČjší inhibiþní efekt pouze tavicí sĤl HBS. U tavicích solí S9 a 690 nebyl zaznamenán významný inhibiþní úþinek. V literatuĜe jsou publikovány práce 6,11, které zkoumaly inhibiþní úþinky fosfátových solí s rĤzným stupnČm kondenzace na mikroorganizmy. Tito autoĜi došli k závČru, že þím více obsahují tavicí soli polyfosfátĤ s vysokým kondenzaþním stupnČm, tím je vČtší jejich antibakteriální úþinek. Jejich závČry jsou v souladu s našimi výsledky, kdy na testované bakterie mČla nejvČtší inhibiþní efekt tavicí sĤl HBS, která obsahuje polyfosfáty v nejvyšším kondenzaþním stupni. Tavicí sĤl HBS byla schopna pĜi koncentraci 0,1 % w/v inhibovat rĤst bakterií druhĤ Bacillus sphaericus a B. stearothermophilus, u kterých nebyl pĜi této koncentraci pozorován prakticky žádný nárĤst. U kmenĤ Staphylococcus aureus, Corynebacterium glutamicum a izolátĤ z tavených sýrĤ NTS 01 a NTS 04 byla zaznamenána minimální inhibiþní koncentrace této tavicí soli pĜi 0,2 % w/v. U ostatních testovaných grampozitivních bakterií (M. luteus, B. cereus, B. subtilis, B. brevis) zastavovala tavicí sĤl HBS jejich rĤst v koncentraci 0,3 % w/v. K podobným závČrĤm dospČli i Loessner et al.7, kteĜí zjistili, že 0,3% w/v HBS je v laboratorních podmínkách schopna inhibovat rĤst vČtšiny testovaných grampozitivních bakterií. Maier et al.12 testovali úþinky HBS na morfologii B. cereus a dospČli k závČru, že koncentrace 0,1 % w/v a vyšší pĤsobí na tuto bakterii inhibiþnČ tím, že v logaritmické fázi rĤstu dochází k lyzi bunČk této bakterie. Jiní autoĜi 6,11 ovČĜovali efekt fosfátĤ na bakterie druhu S. aureus a zjistili, že inhibiþní koncentrace tČchto solí se pohybují v rozmezí 0,1 – 0,5 % w/v. U grampozitivních izolátĤ z dlouhodobČ skladovaných nesterilovaných tavených sýrĤ došlo rovnČž v dĤsledku pĤsobení tavicí soli HBS k zastavení rĤstu tČchto bakterií. U izolátĤ z tavených sýrĤ byla zjištČna minimální inhibiþní koncentrace soli HBS 0,3 % w/v s výjimkou dvou izolátĤ (NTS 01 a NTS 04), na které již pĤsobila inhibiþnČ koncentrace nižší (0,2 % w/v). Zajímavé je pĤsobení HBS na dva izoláty, NTS 02 a NTS 05. Nižší koncentrace této soli mČly na zmínČné bakterie minimální úþinky, zatímco koncentrace 0,3 % w/v pĤsobila už inhibiþnČ. Takové chování bakterií mĤže být zpĤsobeno tím, že tyto kmeny byly izolovány z tavených sýrĤ a lze u nich pĜedpokládat lepší pĜizpĤsobení k pĜítomnosti fosfátových tavicích solí, které tak mohou v nižších koncentracích tolerovat. Hodnoty minimální inhibiþní koncentrace HBS jsou v laboratorních podmínkách pomČrnČ nízké. Lze pĜedpokládat, že v komplexní matrici, jakou jsou napĜ. tavené sýry, bude nutno minimální koncentraci, která bude mít inhibiþní efekt na pĜítomné mikroorganizmy, zejména pak bakterie tvoĜící spory, zvýšit. Tento pĜedpoklad potvrzují i výsledky již publikovaných prací 7,15, ve kterých je pro zpomalení rĤstu nežádoucí mikroflóry tavených sýrĤ doporuþována koncentrace polyfosfátových tavicích solí alespoĖ 0,5 %. ZávČr V laboratorních podmínkách bylo zjištČno, že z fosfátových tavicích solí má výrazné antibakteriální úþinky pouze tavicí sĤl HBS obsahující smČs polyfosfátĤ s vysokým kondenzaþním stupnČm a orthofosfátĤ na testované grampozitivní bakterie. U gramnegativních bakterií nebyl pozorován výraznČjší efekt. U tavicích solí S9 a 690 nebyla zaznamenána striktní inhibice u žádného z testovaných kmenĤ bakterií. Lze tedy Ĝíci, že inhibiþní efekt tavicích solí na mikroorganizmy je závislý na kondenzaþním stupni polyfosfátĤ. PodČkování Práce vznikla za podpory projektu MŠMT: MSM 7088352101. Kontaktní adresa: Mgr. Leona BuĖková, Ph.D., Ústav potravináĜského inženýrství, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve ZlínČ, nám. T. G. Masaryka 275, 762 72 Zlín, tel. +420 576 031 511, e-mail: [email protected] 145

146

Použitá literatura: 1. Molins, R.A. (1991). Phosphates in food. Boca Raton: CRC Press, 261 s. 2. Cariü, M., Gantar, M., and Kaláb, M. (1985). Effects of emulsifying agents on the microstructure and other characteristics of process cheese – a review. Food Microstructure, 4, 297-312. 3. Guinee, T. P., Cariü, M., and Kaláb, M. (2004). Pasteureized processed cheese and substitute/imitation cheese products. In Fox, P.F. et al., Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology. Volume 2: Major cheese groups. 3. ed. (pp. 349–394). London: Elsevier Applied Science. 4. Kim, T.J., Jeong, C.J., Park, K.Y., Shin, J.W., and Lee, J.Y. (2002). Anti-candidal effect of polyphosphate. Journal of Bacteriology and Virology, 32, 381-391. 5. Knabel, S.J., Walker, H.W., and Hartman, P.A. (1991). Inhibition of Aspergillus flavus and selected Gram-positive bacteria by chelation of essential metal-cations by polyphosphates. Journal of Food Protection, 54. 360-365. 6. Lee, R.M., Hartman, P.A., Olson, D.G., and Williams, F.D. (1994). Bactericidal and bacteriolytic effects of selected food-grade phosphates, using Staphylococcus aureus as a model system. Journal of Food Protection, 57, 276-283. 7. Loessner, M.J., Maier, S.K., Schiwek, P., and Scherer, S. (1997). Long-chain polyphosphates inhibit growth of Clostridium tyrobutyricum in processed cheese spreads. Journal of Food Protection, 60, 493498. 8. Suarez, V.B., Frison, L., De Basilico, M.Z., Riveira, M., and Reinheimer, J.A. (2005). Inhibitory activity of phosphates on molds isolated from foods and food processing plants. Journal of Food Protection, 68, 2475-2479. 9. Zaika, L.L. and Kim, A.H. (1993). Effect of sodium polyphosphates on growth of Listeria monocytogenes. Journal of Food Protection, 56, 577-580. 10. Velazquez, L.D., Escudero, M.E., and de Guzman, A.M. (2001). Antibacterial effects of different foodrelated phosphates using Aeromonas hydrophila. Journal of Food Protection, 64, 195-200. 11. Jen, C.M.C. and Shelef, L.A. (1986). Factors affecting sensitivity of Staphylococcus aureus 196E to polyphosphates. Applied and Environmental Microbiology, 52, 842-846. 12. Maier, S.K., Scherer, S., and Loessner, M.J. (1999). Long-chain polyphosphate causes cell lysis and inhibits Bacillus cereus septum formation, which is dependent on divalent cations. Applied and Environmental Microbiology, 65, 3942-3949. 13. Zaika, L.L., Scullen, J., and Fanelli, J.S. (1997). Growth inhibition of Listeria monocytogenes by sodium polyphosphate as affected by polyvalent metal ions. Journal of Food Science, 62, 867-872. 14. Eckner, K.F., Dustman, W.A., and Rysrodriguez, A.A. (1994). Contribution of composition, physicochemical characteristics and polyphosphates to the microbial safety of pasteurized cheese spreads. Journal of Food Protection, 57, 295-300. 15. Varga, L. (2005). Use a long-chain polyphosphate mixture for shelf-life extension of processed cheese spreads. Acta alimentaria, 34, 493-498. 16. Lee, R.M., Hartman, P.A., Stahr, H.M., Olson, D.G., and Williams, F.D. (1994). Antibacterial mechanism of long-chain polyphosphates in Staphylococcus aureus. Journal of Food Protection, 57, 289294. 17. Molins, R.A., Kraft, A.A., Walker, H.W., and Olson, D.G. (1985). Effect of poly- and pyrophosphates on the natural bacterial flora and inoculated Clostridium sporogenes PA 3679 in cooked vacuum packaged bratwurst. Journal of Food Science, 50, 876-880. 18. Briozzo, J., de Lagarde, E.A., Chirife, J., and Parada, J.L. (1983). Clostridium botulinum type A growth and toxin production in media and process cheese spread. Applied and Environmental Microbiology, 45, 1150-1152. 19. ýechová, L., Nováková, A., and BuĖka, F. (2007). Vliv pĜídavku rĤzných druhĤ tavicích solí na rĤst vybraných mikroorganizmĤ. In Sborník XVI. konference mladých mikrobiologĤ – Tomáškovy dny 2007, Brno, LF MU, s. 9.

147

ANTIFUNGÁLNÍ AKTIVITA KYSELINY OCTOVÉ A MLÉýNÉ NA PLÍSEĕ RODU FUSARIUM Šantinová Eva, Chumchalová Jana, Ondráþková Iva, Plocková Milada Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT Praha Antifungal activity of acetic and lactic acid against Fusarium strains. Summary: The aim of this work was to observe the influence of lactic acid and acetic acid at the concentrations produced by lactobacilli strains on the growth of Fusarium culmorum 301, Fusarium culmorum 302, Fusarium graminearum 608 and Fusarium graminearum 821. The inhibitory activity of acids was detected by agar diffusion method. Organic acids were applied at concentrations between 10 and 500 mmol/l. The active acidity of acids was adjusted to pH 3. Monitoring of inhibition zones was investigated after seven days cultivation. The activity of both acids against Fusarium culmorum 301 followed the trend of increasing inhibition depending on rising value of acid concentration. In case of Fusarium culmorum 302, well – observed inhibition zones originated, too. Fusarium graminearum 608 and Fusarium graminearum 821 were more resistant against acetic acid treatment. Lactic acid showed no effect on Fusarium graminearum 608 and Fusarium graminearum 821.

Úvod Organické kyseliny jsou metabolické produkty, které vznikají zkvašováním sacharidĤ bakteriemi mléþného kvašení. Tyto kyseliny zpĤsobují pokles pH a tím potlaþují rĤst patogenních mikroorganismĤ, tedy i plísní. Mléþné bakterie, pĜedevším zástupci rodu Lactobacillus, vykazují produkci smČsi organických kyselin. V nejvyšších koncentracích jsou produkovány kyselina mléþná, octová a kapronová, a proto mají nejvČtší vliv. ZmínČné kyseliny mohou inhibovat þi stimulovat rĤst plísnČ nebo potlaþit tvorbu þi úþinnost mykotoxinu1-3. Cílem této práce bylo sledovat kultivaþní metodou vliv kyseliny mléþné a octové na rĤst plísnČ Fusarium culmorum 301, Fusarium culmorum 302, Fusarium graminearum 608 a Fusarium graminearum 821.

Materiál a metody Kmeny plísní Kmeny plísní Fusarium culmorum 301, Fusarium culmorum 302, Fusarium graminearum 608 a Fusarium graminearum 821, pocházejí z Výzkumného ústavu rostlinné výroby, OddČlení šlechtitelských metod, Praha, ýeská republika. Kyseliny Kyselina mléþná 90 %, M = 90,08 g/mol, 1210 g = 1000 ml Kyselina octová 99,5 %, M = 60,05 g/mol Byly pĜipraveny pracovní roztoky kyselin o koncentraci 10, 50, 100, 300 a 500 mmol/l. Roztoky kyselin byly upraveny na hodnotu pH 3 pomocí 10 % NaOH. Agarová difusní metoda Na každé Petriho misce obsahující vrstvu 25 ml 1 % hm. bakteriologického agaru byl vytvoĜen vrt. Do nČj se napipetovalo 450 ȝl roztoku kyseliny o pĜíslušné koncentraci. Poté byly misky pĜelity 10 ml soft PD agaru obsahujícího 105 spor pĜíšlušného kmene plísnČ. Následovala inkubace pĜi 30 °C po dobu 7 dní. Sledoval se vznik pĜípadné vyjasnČné inhibiþní zóny, tedy potlaþení rĤstu plísnČ v okolí vrtu. Kontrolou byla miska obsahující ve vrtu pouze sterilní destilovanou vodu.

148

Výsledky Na základČ sledování antifungální aktivity kyseliny mléþné a octové agarovou difuzní metodou byl zjištČn jejich inhibiþní úþinek na 4 kmeny plísnČ rodu Fusarium. Dle Tab. I popisující vliv obou kyselin na Fusarium culmorum 301 je možno sledovat trend vzrĤstající inhibice spoleþnČ s rostoucí koncentrací kyselin. Inhibice byla viditelná až od koncentrace 50 mmol/l. Kyselina mléþná potlaþovala plíseĖ ménČ než kyselina octová. Fusarium culmorum 302 bylo potlaþeno kyselinami témČĜ ve stejné míĜe jako Fusarium culmorum 301, rozdíl byl pouze v úþinku kyseliny octové o koncentraci 500 mmol/l. Tato koncentrace zpĤsobila velmi silnou inhibici této plísnČ (Tab. II). PlíseĖ Fusarium graminearum 608 vykazovala oproti dvČma pĜedešlým plísním vĤþi pĤsobení kyseliny octové již vČtší odolnost, kyselina mléþná tuto plíseĖ nepotlaþila vĤbec (Tab. III). Fusarium graminearum 821 bylo potlaþeno kyselinou octovou až od koncentrace 100 mmol/l, koncentrace 300 a 500 mmol/l zpĤsobily totální inhibici této plísnČ. Kyselina mléþná žádný úþinek na tuto plíseĖ nevykázala (Tab. IV), tak jak to bylo zaznamenáno i u kmene Fusarium graminearum 608. Kyselina octová byla úþinná proti všem þtyĜem sledovaným kmenĤm plísnČ. Kyselina mléþná inhibovala oba dva kmeny plísnČ Fusarium culmorum, zbylé dva kmeny Fusarium graminearum byly vĤþi pĤsobení této kyseliny rezistentní. Tabulka I Inhibiþní úþinek kyseliny octové a mléþné na plíseĖ Fusarium culmorum 301 Koncentrace kyseliny Aktivita kyseliny octové Aktivita kyseliny mléþné [mmol/l] 10 ++ + 50 ++ ++ 100 +++++ +++ 300 +++++ +++ 500

Tabulka II Inhibiþní úþinek kyseliny octové a mléþné na plíseĖ Fusarium culmorum 302 Koncentrace kyseliny Aktivita kyseliny octové Aktivita kyseliny mléþné [mmol/l] + + 10 + + 50 + + 100 ++ ++ 300 ++++ ++ 500 Tabulka III Inhibiþní úþinek kyseliny octové a mléþné na plíseĖ Fusarium graminearum 608 Koncentrace kyseliny Aktivita kyseliny octové Aktivita kyseliny mléþné [mmol/l] 10 50 + 100 +++ 300 +++ 500 149

Tabulka IV Inhibiþní úþinek kyseliny octové a mléþné na plíseĖ Fusarium graminearum 821 Koncentrace kyseliny Aktivita kyseliny octové Aktivita kyseliny mléþné [mmol/l] 10 50 + 100 +++++ 300 +++++ 500 -… žádná inhibiþní aktivita +… náznak inhibice ++… inhibice +++… silnČjší inhibice + + + + … velmi silná inhibice + + + + + … totální inhibice

Diskuse Bakterie mléþného kvašení jsou schopné rĤst v mléce. V mlékárenství se využívá pĜi výrobČ fermentovaných mléþných výrobkĤ mimo jiné jejich schopnosti produkovat organické kyseliny. Koncentrace naprodukovaných kyselin uvádČné ve studiích jsou rozdílné v závislosti na použitém médiu a kmeni. V MRS bujónu produkovaly kmeny laktobacilĤ kyselinu mléþnou o koncentraci 400 až 851 mM/l, kyselinu octovou o koncentraci 25 až 150 mM/l. V obnoveném odstĜedČném mléce byla kyselina mléþná naprodukována v koncentraci 13 až 127 mM/l, kyselina octová v koncentraci 8 až 100 mM/l 4. Z výsledkĤ mČĜení vyplývá, že koncentrace kyseliny octové, která mĤže být naprodukována v obnoveném odstĜedČném mléce, mĤže zpĤsobit až totální inhibici všech testovaných kmenĤ rodu Fusarium. V pĜípadČ kyseliny mléþné ani nejvyšší testovaná koncentrace (500 mmol/l), které mĤže být dosaženo kultivací kmenĤ laktobacilĤ v MRS bujónu, neinhibovala rĤst dvou plísní druhu Fusarium graminearum. Také ve studii zabývající se pĤsobením kyseliny mléþné na fusaria bylo zjištČno, že samotná kyselina mléþná použitá v koncentraci odpovídající produkci kmenem Lactobacillus plantarum, zpĤsobila pouze 6-20 % inhibici dvou kmenĤ Fusarium avenaceum ve srovnání s filtrátem získaným po kultivaci kmene v MRS bujónu. V pĜípadČ pĤsobení na Fusarium culmorum a Fusarium graminearum nebyla pozorována žádná inhibice3. Stejné výsledky byly zaznamenány také v našem pĜípadČ pĜi testování kmenĤ Fusarium graminearum. V jiné studii byla sledována produkce organických kyselin kmenem Lactobacillus sanfrancisco CB1 a jejich úþinnost na plísnČ. Bylo stanoveno, že tento kmen produkuje široké spektrum organických kyselin (napĜ. octová, kapronová), které jsou aktivní vĤþi plísni Fusarium graminearum 5. ZávČr V provedeném pokusu byly získány výsledky, které by mohly být v budoucnu zohlednČny pĜi výrobČ potravin. Aktivita testovaných kyselin by mohla být využita v kombinovaných fermentovaných výrobcích na bázi mléka a rostlinných produktĤ, protože rod Fusarium je þastým kontaminatem obilovin a kukuĜice. PodČkování: Tato práce vznikla s podporou výzkumného zámČru CEZ: MSM 6046137305 a projektu CZ – HU: 4 – 2007 – 5.

150

Použitá literatura: 1. Gourama H. and Bullerman L. B. (1995): Antimycotic and antiaflatoxigenic effect of lactic acid bacteria: a review. J. Food Prot. 57: 1275-1280. 2. Plocková M., Stiles J., Chumchalová J. and Halfarová R. (2001): Control of mould growth by Lactobacillus rhamnosus VT1 and Lactobacillus reuteri CCM 3625 on milk agar plates. Czech J. Food Sci. 19: 46-50. 3. Laitila A., Alakomi H-L., Raaska L., Mattila-Sandholm T. and Haikara A. (2002): Antifungal activities of two Lactobacillus plantarum strains against Fusarium moulds in vitro and in malting barley. J. Appl. Microbiol. 93: 566-576. 4. Hudáþek J., Zalán Z., Chumchalová J. a Halász A.: Protektivní vlastnosti vybraných kmenĤ rodu Lactobacillus. Celostátní pĜehlídky sýrĤ, Praha – leden 2007, Výsledky pĜehlídek a sborník pĜednášek semináĜe Mléko a sýry 2007, Praha, ýR, 24.-25.1.2007, str.67 – 73, vydavatel ýSCH. 5. Corsetti A., Gobetti M., Rossi J. and Daminiani P. (1998): Antimould activity of sourdough lactic acid bacteria: identification of mixture of organic acids by Lactobacillus sanfrancisco CB1: Appl. Biotechnol. 50: 253-256.

Kontaktní adresa Eva Šantinová ([email protected]), Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT, Praha, Technická 5, 16628 Praha 6

151

VYUŽITIE METÓDY RAMP (RANDOMLY-AMPLIFIED MICROSATELLITE POLYMORPHISM) NA TYPIZÁCIU BAKTÉRIÍ MLIEýNEHO KYSNUTIA ZO SLOVENSKEJ BRYNDZE ChebeĖová Viera1, Bertaová Gabriela1, Kuchta Tomáš1, Pangallo Domenico2 1 Výskumný ústav potravinársky, Bratislava; 2 Ústav molekulárnej biológie SAV, Bratislava Application of ramp (randomly-amplified microsatellite polymorphism) method for typing of lactic acid bacteria from slovakian bryndza cheese Summary: Lactid acid bacteria (LAB) belong to the predominant natural microflora of the sheep cheese Slovakian bryndza, which play an important role in its quality and safety. LAB strains were isolated by selective cultivation on MRS medium and identified on the basis of morphology and biochemical features (evaluated by test API 50CHL). From selected colonies, DNA was isolated and genotypic characterization was carried out by PCR producing randomly-amplified microsatellite polymorphism (RAMP). RAMP demonstrated a good discrimination and made it possible to differentiate genera Lactobacillus, Lactococcus and Pediococcus.

Úvod Baktérie mlieþneho kysnutia (lactic acid bacteria, LAB) predstavujú najviac zastúpenú prirodzenú mikroflóru Slovenskej bryndze, spomedzi ktorých zástupcovia rodov Lactobacillus a Lactococcus sú najviac zodpovední za jej kvalitu a zdravotnú neškodnosĢ. Metodickým problémom pri identifikácii baktérií mlieþneho kysnutia zo Slovenskej bryndze je veĐký poþet izolátov s nerozlíšiteĐnou morfológiou kolónií. Druhovú identifikáciu je možné vykonaĢ pomocou mikrobiologických a biochemických skúšok, þo je však pri spracovaní väþšieho poþtu vzoriek a kolónií þasovo resp. finanþne veĐmi nároþné. Na tento úþel je možné použiĢ viacero DNA-metód založených na polymorfizme fragmentov amplifikovaných pomocou polymerázovej reĢazovej reakcii (PCR) [1]. Kećže však je Ģažké vybraĢ metódu, ktorá by bola na danom súbore bakteriálnych druhov dostatoþne diskriminatívna a súþasne jednoduchá i reprodukovateĐná, cieĐom tejto práce bolo vyskúšaĢ v tejto aplikácii metódu RAMP (randomly-amplified microsatellite polymorphism). Táto metóda bola pôvodne vyvinutá na analýzu rastlín a je založená na PCR s jedným primérom náhodným a s druhým primérom orientovaným na sekvenciu mikrosatelitu, priþom sa používajú reakþné podmienky s nízkou selektivitou. Materiál a metódy Mikroorganizmy Vzorku Slovenskej bryndze (plnotuþná letná bryndza z Hornej Súþe) sme spracovali štandardnou mikrobiologickou technikou a analyzovali na selektívnom médiu MRS Lactobacillus agar (Merck, Darmstadt, Nemecko; anaeróbna kultivácia pri 37 ºC poþas 3 až 5 dní). Z vyrastených kolónií na MRS Lactobacillus agare sme na základe kolóniovej morfológie náhodne vybrali 20 kolónii, ktoré sme podrobili morfologickej, fyziologickej (farbenie podĐa Grama, katalázová skúška, KOH test, rast baktérií v zvislom agarovom stĎpci, tvorba plynu z glukózy) a biochemickej analýze s identifikaþným systémom API 50CHL (BioMérieux, Marcy l'Étoile, Francúzsko). Izolácia DNA DNA sme z odobratých kolónií izolovali použitím súpravy InstaGene (Bio-Rad, Hercules, California, USA) podĐa návodu výrobcu. Amplifikácia DNA PCR sme robili v objeme 25 μl reakþnej zmesi s primérmi K7 5ĆAACTCTCTCTCTCT 3á 1254 5ĆCGCAGCCAA 3´ [2]. Reakþná zmes sa skladala z 1× koncentrovaného tlmivého roztoku, MgCl2 3,5 mmol.l-1, 1,25 U HotStarTaq Plus polymerázy (Qiagen, Hilden, Nemecko), 700 mmol.l-1 priméru K7, 700 mmol.l-1 priméru 1254 a 240 mmol.l-1 každého dNTP (Applied Biosystems, Foster City, California, USA). Amplifikácia prebiehala v cykléri Personal Cycler 152

(Whatman Biometra, Göttingen, Nemecko) s teplotným programom pozostávajúcim z úvodnej denaturácie pri 95 ºC poþas 15 min a z 30 cyklov amplifikácie (denaturácia pri 94 ºC poþas 60 s, annealing pri 40 ºC poþas 90 s, polymerizácia pri 68 ºC poþas 180 s) a závereþnej polymerizácie pri 68 ºC poþas 10 min [3]. PCR produkty sa analyzovali elektroforézou v 1,5% agarózovom géli SeaKem LE (FMC Bioproducts, Rockland, Maine, USA).

Výsledky a diskusia Metódu sme použili na RAMP-typizáciu 20 izolátov zo vzorky Slovenskej bryndze z výrobne Horná Súþa, ktoré sme vopred charakterizovali na základe morfologických a biochemických vlastností (tab. I). Pre jednotlivé kmene sa získalo 7 - 16 fragmentov DNA o veĐkosti pribl. 186 bp - 2220 bp (obr. 1, obr. 2). Na základe získaných RAMP-profilov bolo možné identifikovaĢ 8 genotypov (tab. II). Získané výsledky predbežne poukazujú na dobrú diskriminatívnosĢ metódy RAMP v rámci rodov Lactobacillus, Lactococcus a Pediococcus. Na riadne posúdenie parametrov metódy je však potrebné analyzovaĢ väþší poþet ćalších kmeĖov.

Obr. 1. RAMP-profily izolátov zo Slovenskej bryndze uvedených v tab. 1.: 1 - 3 A/1, 2 - 3 A/2, 3 3 A/3, 4 - 3 A/4, 5 - 3 A/5, 6 - 3 A/6, 7 - 3 A/7, 8 - 3 A/8, 9 - 3 A/9, 10 - 3 A/10, 11 - 3 A/8, 12 - 3 B/6, L - štandard molekulových hmotnosti - n x 250 bp (Invitrogen, Carlsbad, California, USA).

153

Obr. 2. RAMP-profily izolátov zo Slovenskej bryndze uvedených v tab. 1.: 1 - 3 B/5, 2 - 3 B/6, 3 3 B/7, 4 - 3 B/3, 5 - 3 B/4, 6 - 3 B/2, 7 - 3 B/4, 8 - 3 B/1, 9 - 3 B/9, 10 - 3 B/8, L - štandard molekulových hmotnosti - n x 250 bp (Invitrogen, Carlsbad, California, USA). TabuĐka I Zoznam a popis izolovaných kmeĖov zo Slovenskej bryndze. rast rast þíslo morfológia kat. KOH tvorba pri pri kmeĖa kolónií test test plynu 15ºC 45ºC tyþinky + 3 A/1 tyþinky + + 3 A/2 tyþinky + 3 A/3 tyþinky + 3 A/4 tyþinky + 3 A/5 tyþinky + 3 A/6 tyþinky + 3 A/7 tyþinky + + 3 A/8 tyþinky + + 3 A/9 tyþinky + 3 A/10 tetrády + 3 B/1 tyþinky + + 3 B/2 tyþinky + 3 B/3 tyþinky + + 3 B/4 koky + 3 B/5 koky + 3 B/6 tetrády + 3 B/7 tyþinky + 3 B/8 tyþinky + 3 B/9 tetrády + 3 B/10 * identifikácia na úrovni 36,5% podĐa API ** identifikácia na základe þiastkových výsledkov 154

API 50 CHL Lb. plantarum Lb. fermentum Lb. plantarum** Lb. paracasei ssp. paracasei Lb. plantarum* Lb. plantarum Lb. collinoides Lb. fermentum** Lb. paracasei ssp. paracasei Lb. paracasei ssp. paracasei Lb. curvatus Lb. collinoides Lb. curvatus Lb. fermentum** Lc. lactis ssp. lactis Lc. lactis ssp. lactis** Pediococcus spp. Lb. plantarum Lb. crispatus Pediococcus spp.**

TabuĐka II Zoznam kmeĖov podĐa RAMP typov. RAMP typ Príklad (kmeĖ) 1 3 A/1, 3 A/3, 3 A/5, 3 A/6, 3 B/8 2 3 A/2, 3 A/8, 3B/4 3 3 A/4, 3 A/9, 3 A/10, 3 B/3 4 3 B/1, 3 B/7, 3 B/10 5 3 B/5, 3 B/6 6 3 A/7 7 3 B/2 8 3 B/9 Použitá literatúra: 1. Drahovská, H. - Kuchta, T.: Typizácia baktérií založená na analýze DNA. Bulletin potravinárskeho výskumu, 41, 2002, s. 149-161. 2. Wu, K. S. - Jones, R. - Danneberger, L. - Scolnik, P. A.: Detection of microsatellite polymorphism without cloning. Nucleic Acids Research, 22, 1994, s. 3257-3258. 3. Pangallo, D. - Karpíšková, R. - TurĖa, J. - Kuchta, T.: Typing of food-borne Listeria monocytogenes by the optimized repetitive extragenic palindrome-based polymerase chain reaction. New Microbiologica, 25, 2002, s. 449-454.

Kontaktná adresa: Ing. Viera ChebeĖová, Výskumný ústav potravinársky, Priemyselná 4, 824 75 Bratislava 26, Slovensko. [email protected]

155

PCR-TYPIZÁCIA PSEUDOMONÁD IZOLOVANÝCH Z OVýIARSKYCH PREVÁDZOK Kostolníková Mária1, Bertaová Gabriela2, Pangallo Domenico3, KoreĖová Janka1 1 Výskumný ústav potravinársky Bratislava, pracovisko Modra, 2 Výskumný ústav potravinársky, Bratislava, 3 Ústav molekulárnej biológie SAV, Bratislava PCR – Typing of Pseudomonas isolates obtained from sheep plants Summary: Microbial contaminants of working surfaces from sheep milk- and cheese-processing plants were isolated for purposes of surveing their adherence ability on solid surfaces and potential biofilm formation. This ability was manifested in all isolates of Pseudomonas genus, which according to the literature is relatively resistant towards the external influence and disinfectants, with a high ability of biofilm formation. Humid environments provide good conditions for the growth of cultures of this genus, in which it contaminates rubber and plastic surfaces and containers. On the basis of morphological and biochemical identification by Neferm test (Lachema), the isolates were classified to belong to Pseudomonas aeruginosa species (20 strains). Out of these, DNA was isolated and typisation was done by two methods, namely, repetetive extragenic palindrome polymerase chain reaction (REP-PCR) and the random amplified microsatellite polymorphic DNA (RAMP). Ps. aeruginosa CCM 1960, CCM 1961 and CCM 3955 were used as reference strains. The methods were optimized by the selection of the suitable temperature program. Both methods facilitated differentiation of Pseudomonas aeruginosa strains.

Úvod Zo 4 prevádzok spracúvajúcich ovþie mlieko a syry (výrobných zariadení a výrobkov) sa izolovali kontaminujúce baktérie, a to gramnegatívne a grampozitívne baktérie z rodov Staphylococcus, Enterococcus, Bacillus, Pseudomonas a z þeĐade Enterobacteriaceae za úþelom zistenia schopnosti bakteriálnych kmeĖov tvoriĢ biofilm na tuhých povrchoch. Táto vlastnosĢ baktérií je dôležitá, pretože tým sa stávajú potenciálne odolnými voþi bežným þistiacim a dezinfekþným postupom [1]. Najvyššiu schopnosĢ adherencie na testované tuhé povrchy preukázalo 20 izolátov z rodu Pseudomonas. Ide o G-, pohyblivé, striktne aeróbne paliþky, oxidáza-pozitívne aj negatívne, kataláza-pozitívne, na prostredie a živiny veĐmi prispôsobivé, psychrotrófne, tvoriace žltozeleno fluoreskujúci, modrozelený a zelený pigment. Sú veĐmi rezistentné voþi nepriaznivým vplyvom prostredia a môžu sa rozmnožovaĢ aj pri nízkej teplote a pri minimálnom obsahu živín, ale v prostredí s dostatoþnou vlhkosĢou. Ich zdrojom môže byĢ kontaminovaná pitná voda, umývadlové misy, škáry v dlážke, klimatizaþné zariadenia, zvlhþovaþ vzduchu, voda v kvetinových vázach, stroje na umývanie kuchynského a jedálenského riadu, nedostatoþne þistené a dekontaminované plochy, najmä v prvovýrobe mlieka a mlieko, ktoré s týmito plochami prišlo do styku. Pre ich rezistenciu odolávajú aj úþinkom niektorých dekontaminaþných þinidiel, a preto sa z prostredia Ģažko eliminujú. Tento rod je v prírode znaþne rozšírený a niektoré kmene z tohoto rodu sú patogénne, po rozmnožení v potravine spôsobujú alimentárnu otravu [2, 3]. CieĐom tejto práce bolo identifikovaĢ izoláty pomocou klasických fenotypických metód a navrhnúĢ ako pomerne rýchlu a jednoduchu alternatívu molekulárno-biologickú metódu REPPCR (repetitive extragenic palindrome-based polymerase chain reaction) a RAMP (random amplified microsatellite polymorphic). SúþasĢou práce bolo overenie aplikovateĐnosti týchto typizaþných metód na súbore izolovaných kmeĖov Pseudomonas sp. Materiál a metódy Izolácia a druhová identifikácia biochemickými testami: Vzorky z nerezových povrchov výrobných zariadení sme odoberali priamo v prevádzkach vatovým tampónom z plochy 100 cm2. Vzorky z ovþieho mlieka, ovþej hrudky, þerstvého ovþieho a údeného syra sme spracovali štandardnou mikrobiologickou technikou. Ako kultivaþné médium bolo pre izoláciu pseudomonád použité médium Pseudomonas Isolation Agar (HiMedia). Zo selektívneho média sa vybrali typické kolónie pseudomonád, ktoré sa inokulovali na GTK agar (HiMedia), priþom kultivácia prebiehala pri 37ºC poþas 24-48 h. Po overení þistoty kultúry, farbení podĐa 156

Grama a mikroskopickom hodnotení morfológie sa kmene identifikovali na základe biochemických testov súpravou NEFERMtest 24 (Mikrolatest, Lachema). Polymerázová reĢazová reakcia: · DNA sa izolovala použitím InstaGene Matrix (Bio-Rad, USA). · Polymerázová reĢazová reakcia prebiehala v 25 μl reakþnej zmesi s primérmi pre RAMP - K7: 5ĆAACTCTCTCTCTCT3´, 1254: 5ĆCGCAGCCAA3´ [4] a pre REP-PCR – REP 1R-I: III ICG ICG ICA TCI GGC a REP 2-I: ICG ICT TAT CIG GCC TAC [5]. · Zloženie reakþnej zmesi: tlmivý roztok - 1× koncentrovaný, MgCl2 - 2,5 mmol.l-1, HotStarTaq Plus polymeráza - 1,25 U, priméry - 700 mmol.l-1, každý dNTP - 240 mmol.l-1. · Amplifikácia prebiehala v cykléri Biometra Personal (Whatman Biometra, Göttingen, Nemecko) s teplotným programom: - úvodná denaturácia 95ºC, 15 min; - 30 cyklov amplifikácie - denaturácia: 94ºC, 60 s; - annealing: 40ºC, 90 s; - polymerizácia: 68ºC, 180 s; - závereþná polymerizácia: 68ºC, 10 min. PCR produkty sa analyzovali elektroforézou v 1,5% agarózovom géli (SeaKem LE Agarose, FMC Bioproducts) [6].

Výsledky a záver Všetky izoláty boli identifikáciou druhovo zaradené ako Pseudomonas aeruginosa (tab. I) TabuĐka I Zoznam izolovaných a identifikovaných kmeĖov rodu Pseudomonas z ovþiarskej prevádzky. oznaþenie zdroj výskytu oznaþenie kmeĖa zdroj výskytu kmeĖa 2/15/P1 ovþia hrudka 6 dní 2/13/P1 ovþia hrudka 24 h 2/15/P2 ovþia hrudka 6 dní 2/13/P2 ovþia hrudka 24 h 7/4/P1 nerez filter 2/13/P3 ovþia hrudka 24 h 7/4/P2 nerez filter 2/14/P2 ovþia hrudka 48 h 7/1M/P1 ovþie mlieko 2/14/P3 ovþia hrudka 48 h 7/1M/P2 ovþie mlieko 2/17/P1 ovþie mlieko 7/2ýS/P1 þerstvý ovþí syr 2/17/P2 ovþie mlieko 7/2ýS/P2 þerstvý ovþí syr 7/3US/P1 údený syr 7/2ýS/P3 þerstvý ovþí syr 7/3US/P2 údený syr 9/4/P1 nerez filter 7/3US/P3 údený syr 9/4/P2 nerez filter

157

PCR typizácia

Obr. 1. RAMP profily: 1 - kmeĖ 2/15/P1, 2 - 2/15/P2, 3 - 7/4/P1, 4 - 7/4/P2, 5 - 7/1M/P1, 6 -7/1M/P2, 7 - 7/2ýS/P1, 8 - 7/2ýS/P2, 9 - 7/2ýS/P3, 10 - 9/4/P1, 11 - 9/4/P2, 12 - CCM 1961, 13 - CCM 1960, 14 - CCM 3955, L - štandard molekulových hmotností 250 bp.

TabuĐka II PrehĐad RAMP typov RAMP typ (výskyt v kmeĖoch)

veĐkosĢ fragmentov DNA [bp] s relatívnou kvantitou

412 (), 390 (), 350 (), 332 (), 319 (), 300 (), 280 (), 260 (), 242 (), 233 (), 230 (), 215 (), 199 () 412 (), 389 (), 368 (), 351 (), 320 (), 280 (), 272 (), 258 (), 2 (kmene 6-9) 218 (), 200 () 477 (), 447 (), 370 (), 298 (), 280 (), 268 (), 258 (), 250 3 (kmeĖ 12) (), 232 (), 222 () 4 (kmeĖ 13) 477 (), 430 (), 408 (), 385 (), 322 (), 307 (), 290 (), 269 () () - najvyššia intenzita, () - stredne silná intenzita, () - najslabšia intenzita 1 (kmene 2-4)

158

Obr. 2. REP – PCR profily: 1 - kmeĖ 2/13/P1, 2 - 2/13/P2, 3 - 2/13/P3, 4 - 2/14/P2, 5 - 2/14/P3, 6 -2/17/P1, 7 - 2/17/P2, 8 - 7/3US/P1, 9 - 7/3US/P2, 10 - 7/3US/P3, 11 – CCM 3626 Lb. plantarum, NK – negatívna kontrola, L - štandard molekulových hmotností n x 250 bp. Pomocou REP-PCR i RAMP sa pre jednotlivé izoláty amplifikovali charakteristické profily (obr. 1, obr. 2) priþom s jednotlivými genotypmi sa získalo 8 – 13 fragmentov DNA (tab. II) o veĐkosti pribl. 125 – 2750 bp. Na základe získaných profilov bolo možné rozlíšiĢ kmene v rámci druhu. Na overenie týchto metód je nutná analýza ćalších kmeĖov.

Použitá literatúra: 1. Norwood, D. E. - Gilmour, A.: The differencial adherence capabilities of two Listeria monocytogenes strains in monoculture and multispecies biofilms as a function. Letters in Applied Microbiology, 33, 2001, s. 320-324. 2. Görner, F. - Valík, ď.: Aplikovaná mikrobiológia požívatín. Bratislava: Malé centrum, 2004, 528 s. 3. Lindsay, D. - Brözel, V. S. - Mostert, J. F. - von Holy, A. 2002. Differencial efficacy of a chlorine dioxide - containing sanitizer against single species and binary biofilms of a dairy - associated Bacillus cereus and a Pseudomonas fluorescens isolate. Journal of Applied Microbiology, 92, 2002, s. 352-361. 4. Kun - sheng, W. - Jones, R. - Danneberger, L. - Scolnik, P.: Detection of microsatellite polymorphisms without cloning. Nucleic Acids research, 22, 1994, s. 3257 - 3258. 5. Versalovic, J. - Koeuth, T. - Lupski, J. R.: Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Research, 19, 1991, s. 6823-6831. 6. Pangallo, D. - Karpíšková, R. - TurĖa, J. - Kuchta, T.: Typing of food - borne Listeria monocytogenes by the optimized repetetive extragenic palindrome - based polymerase chain reaction. New Microbiologica, 25, 2002, s. 449-454.

Kontaktná adresa: Mgr. Gabriela Bertaová, Výskumný ústav potravinársky, Priemyselná 4, 824 75 Bratislava 26, Slovensko. [email protected] 159

VÝSKYT BAKTERIÍ MLÉýNÉHO KVAŠENÍ V PASTEROVANÝCH VAJEýNÝCH HMOTÁCH 1 Miller Petr , Kuþerová KateĜina1, Chumchalová Jana1, Míková Kamila2 1 Ústav technologie mléka a tukĤ, 2Ústav chemie a analýzy potravin, VŠCHT Praha Occurrence of lactis acid bacteria in pasteurized liquid whole eggs Summary: The aim of this work was to discover occurrence of lactic acid bacteria in pasteurized liquid whole eggs and to isolate and identify typical strains and their undesirable metabolites. It was isolated 45 LAB’s strains out of which 30 were identified as Enterococcus faecium, 12 as Enterococcus faecalis and 3 as Lactobacillus paracasei. Lipolytic and proteolytic activities and exopolysacharides and biogenous amines production were determinated. These undesirable features can cause flavour changes of products and health risks for consumers. All strains showed lipolytic activity and 13 strains showed proteolytic activity. Production of biogenous amines wasn’t approved for any of tested strain. Slime production was 17 strains observed.

Úvod Bakterie mléþného kvašení jsou Gram positivní, katalasa negativní, obvykle nepohyblivé, nesporulující tyþinky þi koky. Osidlují nejrĤznČjší stanovištČ a pĜirozenČ se vyskytují také v celé ĜadČ potravin. Pro své unikátní vlastnosti je Ĝada druhĤ BMK používána jako zákysové kultury v mlékárenství. V urþitých typech potravin jsou považovány za nežádoucí mikrofloru. Tekuté vajeþné smČsi jsou pasterované vajeþné obsahy (vajeþný žloutek, bílek a vajeþná melanž, tedy homogenizovaná smČs bílku a žloutku v jejich pĜirozeném pomČru). Mezi nežádoucí mikroflóru kažení patĜí mikrokoky, pseudomonády, rĤzné sporuláty, aeromonády a houby, ale i salmonely. PatĜí sem také BMK, které se ve vejcích mohou vyskytovat pĜirozenČ þi následkem sekundární kontaminace napĜ. pĜi výtluku vajec. [1] Pasterace vajeþné melanže probíhá obvykle pĜi teplotČ 65 °C po dobu 2,5 minut. Tento záhĜev je plnČ dostaþující pro devitalizaci salmonel nikoli však pro nČkteré druhy BMK. Proto mohou tyto bakterie pĜežít a ve výrobcích, které již nejsou dále tepelnČ ošetĜeny se pomnožit a zpĤsobit senzorické a texturní vady výrobku. Metody Izolace a identifikace: Z pasterovaných vajeþných melanží bylo izolováno celkem 45 kmenĤ BMK. 15 kmenĤ z pĤdy MRS (37 °C, anaerobnČ), 15 z LM17 (30 °C, aerobnČ) a 15 z Slanetz-Bartley (37 °C, aerobnČ). Kmeny byly dle základních morfologických a fenotypických znakĤ rozdČleny do rodĤ a ty následnČ druhovČ identifikovány pomocí API CHL50 þi ENCOCCUStestu. Proteolytická aktivita: DĤkaz rozkladu bílkovin byl zjišĢován kultivací bakterií na masopeptonovém agaru s odstĜedČným mlékem. Lipolytická aktivita: DĤkaz rozkladu lipidĤ byl zjišĢován tvorbou zón v okolí kolonií bakterií rostoucích na tributyrin agaru. Produkce exopolysacharidĤ: DĤkaz tvorby exopolysacharidĤ byl zjišĢován dle Christensenovi metody a metody s agarem s kongo þervení. [2] Produkce biogenních aminĤ: DĤkaz tvorby biogenních aminĤ byl zjišĢován plotnovými metodami dle Joostena [3] a dle Bover Cida [4]. Výsledky V prĤbČhu roku 2007 bylo pĜi komerþních rozborech vajeþných melanží od þeských dodavatelĤ izolováno 45 kmenĤ BMK, z toho bylo 30 identifikováno jako Enterococcus faecium, 12 jako Enterococcus faecalis a 3 jako Lactobacillus paracasei (tabulka I). Tyto rozbory byly vedeny s cílem stanovit ve vajeþných melanžích poþet BMK se zamČĜením na rody Lactobacillus, 160

Lactococcus a Enterococcus. Kmeny 1-15 byly izolovány z misek poþítaných jako laktobacily, 31-45 jako laktokoky a 51-65 jako enterokoky. Toto zjištČní jednak vypovídá o selektivitČ pĜíslušných metod a také o fekálním zneþištČní vzorkĤ. Tabulka I Identifikace izolovaných BMK. Oznaþení kmene 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Kmen Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Lactobacillus paracasei Lactobacillus paracasei Lactobacillus paracasei

Oznaþení kmene 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

Kmen Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium

Oznaþení kmene 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Kmen Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis

U všech izolátĤ byla stanovena proteolytická a lipolytická aktivita, produkce biogenních aminĤ a exopolysacharidĤ. Vzhledem k relativnČ nízkému pasteraþnímu ošetĜení (64,5-65,5 °C, 2,5 min.), které je limitováno na jedné stranČ spolehlivým potlaþením patogenĤ (Salmonella spp.) a na druhé termostabilitou suroviny, mohou tyto produkty metabolismu pĜestát tento záhĜev a dostat se do potravin. HlavnČ v potravinách, které jsou buć vĤbec nebo jen minimálnČ tepelnČ upravovány (majonézy, cukrovinky), mohou tyto látky vyvolat nežádoucí senzorické zmČny a zdravotní rizika u konzumentĤ. Lipolytickou aktivitu vykazovaly všechny izolované kmeny. Proteolytickou aktivitu vykazovalo 13 kmenĤ (všechny kmeny E. faecalis a 1 kmen E. faecium). Produkce biogenních aminĤ (histaminu a tyrosinu) nebyla plotnovými metodami prokázána u žádného kmene. Tabulka II Charakterizace izolovaných BMK. Kmen 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Proteolytická aktivita + -

Lipolytická aktivita + + + + +/+ +/+ + + + + + + +

Kmen 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

Proteolytická aktivita + + -

+...positivní, -...negativní, +/-...nízká aktivita

161

Lipolytická aktivita +/+ +/+ + +/+ + + + + + + + +

Kmen 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Proteolytická aktivita + + + + + + + + + +

Lipolytická aktivita + + + + + + + +/+ + + + + + +

Produkce exopolysacharidĤ byla zkoumána dvČma základními metodami: Christensenovou zkumavkou a Kongo metodou. Tyto metody urþené k detekci exopolysacharidĤ jako indikátorĤ virulence u patogenních bakterií se podaĜilo aplikovat i na enterokoky (laktobacily na tČchto médiích nerostly). Ovšem díky þasové nároþnosti a subjektivitČ vyhodnocení je snaha tyto metody nahradit jinými, nicménČ díky své jednoduchosti se stále používají. Produkce exopolysacharidĤ byla potvrzena u 17 kmenĤ a u 11 nepotvrzena. Pro 3 kmeny se výsledky metod rozchází a pro 11 kmenĤ Christensenova metoda poskytuje nejednoznaþné výsledky. Tabulka III Stanovení produkce exopolysacharidĤ. Kmen 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Kongo metoda + + + + + + + + + + + N N N

Christensenova metoda + + + +/+ + +/+/+ +/N N N

Kmen 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

Kongo metoda + + + + + + + + + -

Christensenova metoda + + + + + +/+/+/+ + +/-

Kmen 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Kongo metoda + + + + + -

Christensenova metoda +/+ +/+ + + +/-

+...positivní, -...negativní, +/-... nejednoznaþné, N...neroste ZávČr Celkem bylo izolováno 45 kmenĤ BMK, z toho bylo 27 identifikováno jako Enterococcus faecium, 11 jako Enterococcus faecalis a 3 jako Lactobacillus paracasei. Lipolytickou aktivitu mČlo 45 kmenĤ, proteolytickou 14. Produkce biogenních aminĤ (histaminu a tyrosinu) nebyla pomocí dvou plotnových metod prokázána u žádného z kmenĤ. Tvorba exopolysacharidĤ byla urþována pomocí agaru s kongo þervení a Christensenovy zkumavky. Byla potvrzena u 17 kmenĤ a u 10 nepotvrzena. PodČkování: Tato práce byla podpoĜena výzkumným zámČrem MŠMT 6046137305. Použitá literatura: 1. KADLEC, P. Technologie potrravin I. 1st ed. 2002. 269 p. ISBN 80-7080-509-9. 2. FREEMAN, D.; FALKINER, F.; KEANE, C. New method for detecting slime procuction by coagulase negative staphylococci. J Clin Pathol, 1989, 42, 872-874. 3. JOOSTEN, H.M.L.J.; NORTHOLD, M.D. Detection, growth and amine-producing capacity of lactobacilli in cheese. Appl. Environ. Microbiol., 1989, 55, 2536-2359. 4. BOVER CID S., HOLZAPFELl W.H. Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria. Int. J. Food Microbiol., 1999, 53, 33-41.

Kontaktní adresa: [email protected]

162

SLEDOVÁNÍ PROCESU FERMENTACE SLADKÉ SYROVÁTKY A SMċSI SLADKÉ SYROVÁTKY A MLÉKA Legarová Veronika, KouĜimská Lenka Katedra kvality zemČdČlských produktĤ, FAPPZ, ýZU v Praze Monitoring of fermentation process of cheese whey and mixtures of cheese whey and milk Summary: Bacteria cultures, known as starters, are used in the manufacture of cultured milk products. They are added to the product and allowed to grow there under controlled conditions. In this study the cheese whey was fermented by different thermophillic bacteria starter cultures available from market cultures producer. Fermentation process was monitored by titratable acidity changes and pH value changes. The acidity change takes place when the bacteria ferment lactose to lactic acid. Fermentation curves were compared and the suitability of cultures for fermented whey drinks preparation was discussed.

Úvod Syrovátka vzniká jako vedlejší produkt pĜi výrobČ sýrĤ, tvarohu a kaseinu. Je to zĜedČný roztok laktózy, proteinĤ, tuku, solí a vitaminĤ ve vodČ. Existují dva základní druhy syrovátky – sladká a kyselá. Sladká syrovátka vzniká pĜi výrobČ tvrdého sýra. Do mléka se pĜidává buć syntetický nebo pĜírodní enzym chymosin. Tento enzym štČpí ț-kasein na kaseinomakropeptid (pĜechází do syrovátky) a para-ț-kasein, který následnČ koaguluje a je oddČlen od syrovátky. NejdĤležitČjší složkou syrovátky jsou bílkoviny, jejichž význam tkví ve vysoké biologické hodnotČ. Celkový obsah bílkovin (N–látek) v syrovátce kolísá od 14 do 24 %. Bílkoviny obsažené v syrovátce pĜedstavují jeden z nejhodnotnČjších bČžnČ dostupných bílkovinných materiálĤ. Je to pĜiþítáno vhodnému složení jejich aminokyselin s obsahem lysinu o 40 % vyšším než v kaseinu. Denní dávka aminokyselin pro þlovČka vážícího 70 kg je obsažena ve 23 g kaseinu, v 17 g vajeþných bílkovin nebo ve 14 g syrovátkových bílkovin.1 Tuk je v syrovátce pĜítomen buć jen v nepatrném množství nebo se nevyskytuje vĤbec. Obsah tuku je závislý na druhu vyrábČného sýra a jeho tuþnosti. Hlavní složkou popelovin syrovátky jsou fosforeþné a vápenaté soli. ýást vápníku pĜi sýĜení se váže s kaseinem na nerozpustný para ț-kasein a v této formČ pĜechází do sýra. Naopak pĜi výrobČ tvarohu pĜechází z kaseinu do syrovátky ve formČ nerozpustné soli. Proto syrovátka obsahuje po výrobČ tvarohu vyšší množství vápníku. Mimo fosforu a vápníku obsahuje syrovátka ještČ draslík, sodík, hoĜþík, železo, síru a chlór. Tyto prvky jsou pĜítomny v syrovátce v ionizované formČ (kationty a anionty). Syrovátka obsahuje také celou Ĝadu vitaminĤ, a to hlavnČ skupiny B (B1, B2, B6, B12), dále pak vitamin E, C i A, kyselinu pantotenovou, kyselinu listovou a biotin1. Syrovátka obsahuje 50 % všech složek mléka, je tedy hodnotným zdrojem vitaminĤ a minerálních látek5. Hlavní složkou syrovátky je laktóza, která tvoĜí 70 – 80 % z celkové sušiny. Vyskytuje se ve dvou izomerních formách: Į–laktóza a ȕ–laktóza, která je hygroskopická a je tedy pĜíþinou hygroskopiþnosti sušené syrovátky1. Tabulka þ. I: Složení syrovátky složka voda laktóza proetiny minerálie tuk kyselina mléþná 7

tekutá syrovátka (%hm) sladká kyselá 93 93,5 4,9 4,4 0,8 0,7 0,5 0,7 0,2 0,04 0,2 0,5

sušená syrovátka (%hm) sladká kyselá 4,6 3,9 73,3 68,7 12 12 7,9 11,5 1,3 0,8 1,7 4,6

Zdroj: PrĤmysl potravin, 1993, þ.5

163

Syrovátkové bílkoviny Syrovátkové bílkoviny jsou pĜirozenou souþástí mléka. PĜi výrobČ sýrĤ, tvarohĤ a kaseinu se nesráží a odchází v podobČ syrovátky. Hlavní komponenty syrovátkových bílkovin jsou E-laktoglobulin (ȕ-LG), Į-laktalbumin (Į-LA), sérový albumin, imunoglobuliny a proteoso– peptonová frakce. Význam syrovátkových bílkovin spoþívá v jejich vysoké nutriþní hodnotČ, která je vyšší než u kaseinu1. Syrovátkové bílkoviny jsou termolabilní, pĜi tepelném ošetĜení mléka nad 60 ºC, na rozdíl od kaseinu, denaturují. NejcitlivČjší na teplotu jsou v prvé ĜadČ imunoglobuliny, dále sérový albumin, E-laktoglobulin a D-laktalbumin. GajdĤšek2 uvádí, že pĜi 15 sekundové výdrži pĜi 74 ºC se projeví první známky denaturace u imunoglobulinĤ, u sérum albuminu a E-laktoglobulinu pĜi 84 – 86 ºC a D-laktalbuminu až pĜi teplotČ 100 ºC po nejménČ 5 minutové výdrži. PĜi záhĜevu se rozbalí globulární struktura, a tím dojde k odkrytí funkþních skupin aminokyselin, pĜedevším thiolových, þímž se zpĜístupní chemickým reakcím. ProstĜednictvím thiolové skupiny se syrovátkové proteiny váží s dalšími mléþnými proteiny (ț-kaseinem, Į-laktalbuminem) za vzniku dimerĤ spojených disulfidickou vazbou. Spojením s ț-kaseinem disulfidickým mĤstkem pak mČní vlastnosti kaseinových micel. ZvČtšují jejich objem a hydrataþní obal, neboĢ váží vodu. PĜi srážení se tak vytváĜí mČkþí sraženina s menším sklonem k uvolĖování syrovátky. To je pozitivnČ hodnoceno pĜi výrobČ fermentovaných mléþných výrobkĤ, naopak pĜi výrobČ Ĝady sýrĤ je tento jev nežádoucí, protože nízká tuhost sýĜeniny zpĤsobuje technologické problémy. Významné jsou reakce SH skupin (degradací methioninu vznikají sulfidy a bisulfidy), které zpĤsobují po vysokém tepelném ošetĜení (nad 75 ºC) tzv. vaĜivou chuĢ mléka. Syrovátkové bílkoviny nevratnČ denaturují nejen pĜi záhĜevu, ale i v pĜítomnosti vápenatých iontĤ a v prostĜedí o pH vČtším než 8,6. Denaturované mléþné bílkoviny mají ponČkud vyšší nutriþní hodnotu ve srovnání s bílkovinami syrového mléka2. Využití syrovátky Syrovátka je využívána pĜedevším v potravináĜském a farmaceutickém prĤmyslu a ke krmným úþelĤm. Stále se hledají nové zpĤsoby využití a technologie zpracování, neboĢ se zvyšující se výrobou sýrĤ roste i výroba syrovátky. PĜes vysokou nutriþní a biologickou hodnotu je ekonomicky efektivní využití syrovátky velkým problémem mlékárenského prĤmyslu na celém svČtČ. I na tomto úseku mlékárenské výroby však bylo dosaženo znaþných úspČchĤ. PrĤmyslové zpracování syrovátky je koncentrováno do nČkolika velkých závodĤ, které vyrábČjí Ĝadu produktĤ v sušené nebo zahuštČné formČ3. V EvropČ se používá syrovátka hlavnČ pro výrobu dČtské výživy, dietetických výrobkĤ, mléþných výrobkĤ, peþiva, þokolády a krmiv. KromČ toho existují další možnosti využití k výrobČ Ĝady výrobkĤ jako napĜ. výroba laktoferrinu, sfingomyelinu, osteopontinu, které mají použití v kosmetice a ve farmaceutickém prĤmyslu4. Aplikace syrovátky patĜí jednoznaþnČ k trendĤm pĜi výrobČ funkþních, konvenientních a wellness potravin a potravin pro potČšení. Dodává vysokou výživovou hodnotu a širokou paletu fyzikálnČ-chemických vlastností, které jsou pĜedností novČ vyvíjených produktĤ. UmožĖuje nejrĤznČjší inovace v sortimentu mléþných výrobkĤ, dezertĤ, pomazánek, dresinkĤ, mražených krémĤ, pekaĜských výrobkĤ, nápojĤ (i v prášku), tyþinek, snackĤ a cukrovinek. SpotĜebiteli jsou pĜíznivČ hodnoceny: dobré jemné mléþné aroma a chuĢ, a také textura6. Syrovátka nebo upravené produkty v tekutém, zahuštČném nebo i sušeném stavu se používají v rĤzných odvČtvích potravináĜského prĤmyslu. Pro své vlastnosti jsou produkty využívány pĜi výrobČ sušenek a peþiva (strukturaþní vlastnosti bílkovin, hnČdnutí peþiva), þokolády a cukrovinek (regulované hnČdnutí, modifikace krystalizace sacharózy), uzenin a solených výrobkĤ 164

(emulgaþní vlastnosti bílkovin, schopnost želatinace), pĜi výrobČ rĤzných krémĤ, tavených sýrĤ, hotových jídel, pĜíp. energetických a vitalizaþních nápojĤ apod.3 Syrovátkové nápoje jsou neopomenutelným artiklem všech svČtových potravináĜských veletrhĤ. Velmi vhodnými produkty jsou nápoje z fermentované pĜírodní syrovátky, v nichž je laktóza mléþnými bakteriemi þásteþnČ nebo plnČ hydrolyzována. K fermentaci se používají mléþné bakterie, nČkdy v kombinaci s kvasinkami. Surovinou mĤže být jak syrovátka s obsaženými bílkovinami, tak i deproteinovaný produkt, s obsahem solí i þásteþnČ demineralizovaný. PĜedností fermentovaných nápojĤ je, že obsahují nejen cenné složky syrovátky, ale i cenné produkty vytvoĜené mikroorganismy (kyselina mléþná, tČkavé kyseliny, enzymy, aromatické látky). Nevýhodou mĤže být pĜíliš vysoký obsah solí a kyselin, nebo napĜ. nestabilita bílkovinného zákalu6. Zájem o syrovátkové nápoje stoupá pĜedevším u žen, které je konzumují hlavnČ kvĤli nízkému obsahu energie, pĜíznivému úþinku na trávicí trakt a ĜadČ fyziologických úþinkĤ jednotlivých složek6. Metodika V práci byly sledovány zmČny složení sladké syrovátky a smČsi mléka a syrovátky pĜi fermentaci termofilními mlékaĜskými kulturami. Pro fermentaci byly použity 4 typy jogurtových kultur. Byla hodnocena kysací schopnost, vhodnost použité suroviny a použitých mikroorganismĤ, podmínky fermentace i organoleptické vlastnosti nápoje. Hlavní surovinou byla pĜi všech experimentech sušená syrovátka Lactosérum z Jihlavské mlékarny Moravia Lacto a. s. Pro pĜípravu nefermentovaných syrovátkových nápojĤ a nefermentovaných nápojĤ na bázi smČsi syrovátky a mléka byla použita rekombinovaná syrovátka (sušená syrovátka rozmíchaná v teplé pitné vodČ, a to vždy 10 g syrovátky ve 100 ml teplé pitné vody) nebo smČs rekombinované syrovátky a mléka v pomČru 75 % syrovátky a 25 % mléka a 50 % syrovátky a 50 % mléka. Po celou dobu experimentĤ byl používán stejný typ mléka a to Jihoþeské lahodné mléko polotuþné, vysokotepelnČ pasterované od mlékárny Madeta a. s. U všech typĤ vzorkĤ následovala pasterace pĜi teplotČ 78 °C po dobu 30 sekund. Pro pĜípravu fermentovaných syrovátkových nápojĤ byly použity stejné suroviny ve shodných pomČrech. Na základČ konzultací s odborníky z Výzkumného ústavu mlékárenského (VÚM) byly vybrány 4 nejbČžnČjší typy jogurtové kultury a to WV2, J2, RX a KAN IV. Ve všech pĜípadech se jedná o smČsné jogurtové kultury, které jsou tvoĜeny kmeny: Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus a Streptococcus thermophilus. Samotná syrovátka byla za aseptických podmínek oþkována jednotlivými typy kultur (1% zákys) a kultivována pĜi 43 °C po dobu 6 hodin. Doba kultivace je výrobcem (VÚM) doporuþena u tČchto typĤ jogurtové kultury 3,5 až 4,5 hodiny. V našem experimentu jsme však dobu kultivace protáhli, aby bylo docíleno úplného sražení obsahu jednotlivých vzorkĤ. V pĜesných hodinových intervalech (0 – 6 hodin) byly zjišĢovány hodnoty SH a pH a z tČchto hodnot byly následnČ vytvoĜeny kysací kĜivky. BČhem doby kultivace byly také posuzovány organoleptické vlastnosti jednotlivých vzorkĤ s danou kulturou po každé hodinČ. Ze získaných hodnot byl vybrán jednoznaþnČ nejvhodnČjší typ jogurtové kultury pro pĜípravu fermentovaných syrovátkových nápojĤ a nápojĤ na bázi smČsi syrovátky a mléka v pomČrech 75 % syrovátky a 25 % mléka a 50 % syrovátky a 50 % mléka. BČhem páté a šesté hodiny kultivace došlo k úplnému sražení vzorkĤ a zhoršení jejich organoleptických vlastností. ZamČĜili jsme se proto na hodnoty vzorkĤ po uplynutí tĜí a þtyĜ hodin kultivace. Hlavními ukazateli pro výbČr nejvhodnČjšího typu kultury, byly jednoznaþnČ organoleptické vlastnosti, rychlost prokysání, hodnoty pH a SH, kterých vzorky s danými kulturami dosáhly po 3 a 4 hodinách kultivace.

165

Výsledky Samotná rekombinovaná syrovátka bez pĜidané kultury mČla prĤmČrnou titraþní kyselost 6,34 SH a hodnotu pH 6,37, po pĜidání (0+) jednotlivých typĤ jogurtové kultury (KAN IV, RX, J2, WV2) se hodnoty výraznČ nelišily do tĜetí hodiny kultivace. Poté zaþalo docházet k výraznému rĤstu hodnost SH a snižování hodnot pH u kultury KAN IV. 35

7

30

6 KAN IV (SH)

25

5

20

4

15

3

10

2

5

1

0

0

RX (SH)

SH

pH

W V2 (SH) J2 (SH) KAN IV (pH) RX (pH)

0

0+

1

2

3

4

5

W V2 (pH) J2 (pH)

6

þa s (h)

Obr. 1. Kysací kĜivky syrovátkových nápojĤ bez kultury a po pĜidání jogurtové kultury Pro pĜípravu fermentovaných syrovátkových nápojĤ a nápojĤ na bázi smČsi syrovátky a mléka, které byly dále testovány, byla použita jogurtová kultura typ KAN IV, která vykazovala optimální hodnoty kyselosti (Obr. 1.) v nejkratším þase a vzorky s touto kulturou byly nejlépe hodnoceny v pĜedbČžné senzorické analýze. V následující þasti práce byly sledovány kysací kĜivky fermentovaných syrovátkových nápojĤ (bez pĜidání mléka, 0 %mléka) a fermentovaných nápojĤ na bázi smČsi syrovátky a mléka v pomČru: 25 % mléka a 75 % syrovátky a 50 % mléka a 50 % syrovátky s použitím jogurtové kultury KAN IV. PrĤmČrné hodnoty aktivní kyselosti mČĜené pHmetrem byly u všech typĤ syrovátkových nápojĤ témČĜ shodné a nevykazovaly výrazné rozdíly (Obr. 2.). V pĜípadČ prĤmČrných hodnot titraþní kyselosti (SH), byly rozdíly mezi vzorky výrazné. Nejvyšších hodnot SH v nejkratším þase dosáhl syrovátkový nápoj s obsahem 50 % syrovátky a 50 % mléka. Z grafu (Obr. 2.) je patrné, že hodnoty SH v þase stoupaly se stoupajícím podílem mléka ve vzorku nápoje. Na základČ získaných hodnot z kysacích kĜivek byly syrovátkové nápoje dále senzoricky posuzovány a byl vyhodnocen finální produkt s nejpĜíznivČjšími vlastnostmi viz pĜíspČvek: „Porovnání organoleptických a fyzikálnČ-chemických vlastností nápojĤ na bázi syrovátky“ (KouĜimská, L., Legarová, V., DvoĜáková, B., Sborník pĜednášek semináĜe Mléko a sýry 2008).

166

7

35

6,5

30

6

25

5,5

20

5

15

4,5

25%mléka (pH)

10

4

50%mléka (pH)

5

3,5

0

3 0

0+

1

2

3

4

5

0%mléka (SH) 25%mléka (SH) pH

SH

40

50%mléka (SH) 0%mléka (pH)

6

þa s (h)

Obr. 2. Kysací kĜivky fermentovaných syrovátkových nápojĤ ZávČr Celkovým cílem práce bylo sledování zmČn sladké syrovátky bČhem fermentace, posouzení vhodnosti dané mlékaĜské kultury a vyhodnocení výsledkĤ výzkumu zamČĜeného na kvalitu fermentovaných syrovátkových nápojĤ a nápojĤ na bázi smČsi syrovátky a mléka. Byly sledovány kysací kĜivky vzorkĤ syrovátky s pĜídavkem 4 typĤ jogurtové kultury, ze získaných hodnot byla vybrána jedna kultura, která byla nejlépe senzoricky hodnocena a vzorky s touto kulturou KAN IV dosáhly za nejkratší þas kultivace požadovaných hodnot SH, což je dĤležitým kritériem i z hlediska ekonomického. NáslednČ byla tato kultura testována pro pĜípravu vzorkĤ syrovátkových nápojĤ s pĜídavkem mléka, kde byl nejlépe hodnocen vzorek s obsahem 50 % mléka a 50 % syrovátky. ZávČry této práce by mohly kromČ vČdeckého pĜínosu být uplatitelné v praxi, neboĢ mohou pomoci našim mlékárenským podnikĤm rozšíĜit sortiment výrobkĤ ze syrovátky, která je vedlejším produktem pĜi výrobČ sýrĤ, a jejíž úprava na nČkteré finální produkty vhodné pro konzumenty je energeticky, finanþnČ i technologicky pomČrnČ nároþná a složitá. Použitá literatura: 1. FORMAN, L., MERGL, M. a kol. Syrovátka – její využití v lidské výživČ a ve výživČ hospodáĜských zvíĜat. 1. vyd. Praha: StĜedisko technických informací potravináĜského prĤmyslu – Výzkumného ústavu potravináĜského prĤmyslu v Praze, 1959. 343 s. 2. GAJDģŠEK, S. Laktologie. 1. vydání. Brno: Mendelova zemČdČlská a lesnická univerzita v BrnČ, 2003. 84 s., ISBN 80-7157-657-3. 3. GAJDģŠEK, S., MlékaĜství II, 1. vyd., Mendelova zemČdČlská a lesnická univerzita v BrnČ, 2002, 142 s., ISBN 80-7157-342-6. 4. HRUDKOVÁ, A. (2001) ýl.: 4378; Vyd.: 28. 2. 2002 dostupné z http://www.agronavigator.cz. 5. SIENKIEWICZ, T., RIEDEL, C. L. Whey and whey utilization. 2. edit. Verlag Th. Mann, Gelsenkirchen-Buer, Germany, 1990. 379 s. ISBN 3-7862-0086-6. 6. SUKOVÁ, I., Syrovátka v potravináĜství. Ústav zemČdČlských a potravináĜských informací, Praha, 2006, 60 s., ISBN 80-7271-173-3. 7. TOMÁŠKA, M., ŠTURDÍK, E. Srvátka ako biotechnologická surovina. PrĤmysl potravin, 1993, roþ. 44, þ. 5, s. 208-209, ISSN 0033-1988.

Kontaktní adresa: Ing. Veronika Legarová, Katedra kvality zemČdČlských produktĤ, FAPPZ, ýZU v Praze, Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 – Suchdol, e-mail: [email protected] 167

SLEDOVÁNÍ POýTU PROBIOTICKÝCH MIKROORGANISMģ VE FERMENTOVANÝCH MLÉýNÝCH VÝROBCÍCH Burdychová Radka Ústav technologie potravin, Mendelova zemČdČlská a lesnická univerzita v BrnČ Selective enumeration and monitoring of probiotic counts in fermented milks Summary: In this study, the selective enumeration and monitoring of survival of probiotic bacteria Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium lactis in fermented milks was carried out. MRS - vancomycine agar was used for selective enumeration of L. rhamnosus, MRS – clindamycine for selective detection of Lactobacillus acidophilus and BSM (Bifidus selective medium) agar for selective enumeration of Bifidobacterium lactis. To reach health benefits, the concentration of probiotics have to be 106 CFU/g of a product which is complicated with different grow characteristics of probiotic mixtures and low viability of probiotics in milk conditions. With the aim to select the probiotic mixture with optimal grow characteristic to reach required counts, two fermented milks with the same probiotic mixture (Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium lactis) but from two different producers of probiotics (A and B) were analyzed for their bacterial populations using the above described selective bacteriological media. All milk products contained probiotic microorganisms claimed to be present in declared quantity (at least 106/g). The number of probiotics from producer B was higher than from producer A and showed better grow characteristics. The counts of all probiotic strains from producer B grow in fermented milks, which was not the case of probiotics of producer A, where the numbers of L. acidophilus and B. lactis were reduced during ripening.

Úvod Souþasným trendem je používat pĜi výrobČ fermentovaných potravin spolu se startovacími kulturami probiotické mikroorganismy1. Pro dosažení pĜíznivých úþinkĤ pro lidské zdraví je spotĜebitelĤm doporuþována denní konzumace alespoĖ 100 g mléþného výrobku s minimálním obsahem 10 miliónĤ (106) probiotických bakterií v 1 g nebo 1 ml výrobku2. VýbČr probiotických kultur závisí nejen na schopnosti tvoĜit vhodné organoleptické vlastnosti konkrétního výrobku, ale také na typu použité startovací kultury. Je totiž známo, že se nČkteré probiotické kultury vlivem negativního pĤsobení startovací mikroflóry (a podmínek prostĜedí) pouze minimálnČ pomnožují a je proto potĜebné použít dostateþný poþet živých bunČk pĜímo pĜi výrobČ tak, aby byl po celou dobu trvanlivosti výrobku zaruþen požadovaný poþet živých bunČk v 1 g nebo 1 ml výrobku3. Cílem této práce bylo sledování zastoupení a poþtu probiotických mikroorganimsĤ Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium lactis a Lactobacillus rhamnosus v mléþných výrobcích s jejich deklarovaným zastoupením, a to s použitím startovacích kultur od dvou rĤzných výrobcĤ (A a B). Použité probiotické kultury mČly stejné druhové zastoupení.

Materiál a metody Probiotické a startovací kultury Probiotické buĖky Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus a Bifidobacterium lactis byly získány pĜímo od výrobcĤ kultur (A, B). Startovací kultury S. thermophilus byly dodány výrobci startovacích kultur (Chr. Hansen, Dánsko; Sacco, Itálie) v lyofilizovaném stavu. PĜíprava médií Streptococcus thermophilus (ST) agar4. Médium bylo pĜipraveno smícháním následujících komponent: 10,0 g tryptonu, 1,0 g sacharosy, 5,0 g kvasniþného extraktu a 2,0 g K2HP04. Komponenty byly rozpuštČny v 1 l destilované vody. pH média bylo upraveno na 6,8 r 0,1, do média bylo pĜidáno 6 ml 0,5 % bromkresolové þervenČ a 12 g agaru. MRS – vankomycin agar 168

byl pĜipraven pĜídavkem vankomycinu (2 mg/l, Sigma-Aldrich, NČmecko). MRS – clindamycin agar byl pĜipraven pĜídavkem 0,5 mg/l clindamycinu (Sigma-Aldrich, NČmecko). BSM (Bifidus selektivní agar; Fluka, USA) byl pĜipraven dle návodu výrobce. Podmínky kultivace jsou popsány v této práci5. Mikrobiologický rozbor fermentovaných mléþných nápojĤ Výrobky byly analyzovány v den výroby a 7, 14, 21, 28 a 35 dnĤ po výrobČ. PĜíprava vzorkĤ pro analýzu a pĜíslušná ĜedČní byla provedena dle ýSN EN ISO 8261. Pro kultivaci S. thermophilus byl použit ST agar. Petriho misky se vzorky byly kultivovány aerobnČ pĜi 37 °C po dobu 72 h. Pro kultivaci probiotických bunČk L. rhamnosus byl použit MRS – vankomycin agar, pro kultivaci L. acidophilus MRS – clindamycin agar a pro kultivaci B. lactis BSM agar. StupeĖ ĜedČní byl volen tak, aby výsledný poþet KTJ na jedné plotnČ byl 15 až 100. Petriho misky se vzorky byly kultivovány anaerobnČ pĜi 37 °C po dobu 72 h.

Výsledky a diskuse Mikrobiologickým rozborem mléþných výrobkĤ byly stanoveny poþty životaschopných probiotických bunČk L. rhamnosus, L. acidophilus a B. lactis. Poþty uvedených mikroorganismĤ, stanovované po celou dobu trvanlivosti výrobkĤ jsou uvedeny na Obr. 1 a 2. Bylo zjištČno, že požadované celkové množství probiotických kultur (106) bylo dodrženo u všech sledovaných výrobkĤ. Poþet jednotlivých probiotických kultur od výrobce kultur B byl vyšší než poþet jednotlivých probiotik od výrobce kultur A. Poþty jednotlivých probiotických bakterií výrobce B se po celou dobu trvanlivosti mléþných výrobkĤ zvyšovaly. Poþet probiotických bakterií L. acidophilus a B. lactis pocházejících od výrobce A se bČhem trvanlivosti mléþných výrobkĤ prokazatelnČ snižovaly. Analýzou byla prokázána nutnost výbČru vhodných probiotických kultur pro konkrétní aplikaci ve fermentovaných mléþných výrobcích.

KTJ/g.106

Zastoupení probiotických bakterií v mléþném nápoji, výrobce A 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0

1

2

3

4

5

6

týdny

Obr. 1: Poþty probiotických bakterií (výrobce A) v mléþných výrobcích bČhem skladování (i) Bifidobacterium lactis, (Ŷ) Lactobacillus acidophilus, (Ÿ) Lactobacillus rhamnosus

169

KTJ/g.10

6

Zastoupení probiotických bakterií v mléþném nápoji, výrobce B 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0

1

2

3

4

5

6

týdny

Obr. 2: Poþty probiotických bakterií (výrobce B) v mléþných výrobcích bČhem skladování (i) Bifidobacterium lactis, (Ŷ) Lactobacillus acidophilus, (Ÿ) Lactobacillus rhamnosus

ZávČr Bylo zjištČno, že požadované celkové množství probiotických kultur (106) bylo dodrženo u všech sledovaných výrobkĤ. RĤstové charakteristiky jednotlivých probiotických druhĤ pocházejících od výrobcĤ A a B se bČhem doby trvanlivosti mléþných výrobkĤ znaþnČ lišily. Analýzou byla prokázána nutnost výbČru vhodných probiotických kultur pro konkrétní aplikaci ve fermentovaných mléþných výrobcích.

Použitá literatura: 1. TANNOCK, G. W.: Probiotics and Prebiotics: Where are We Going? Norwitch: Caister Academic Press. 2002, 333 p. ISBN-10: 0-9542464-1-1. 2. SHAH, N. P.: Probiotic bacteria: Selective enumeration and survival in dairy foods. J. Dairy Sci. 2000, 83: 894–907. 3. TAMINE, A. Y., MARSHALL, M. E., ROBINSON, R. K.: Microbiological and technological aspects of milks fermented by bifidobacteria . J. Dairy Res. 1995, 62: 151. 4. DAVE, R. I., SHAH, N. P.: Evaluation of media for selective enumeration of Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus and Bifidobacteria. J Dairy Sci. 1996, 79: 1529–1536. 5. BURDYCHOVÁ, R.: Mikrobiologická detekce probiotických mikroorganismĤ ve fermentovaných mléþných výrobcích. Acta Universitatis Agriculturae et Silviculturae Mendelianae Brunensis. 2007. sv. LV, þ. 2, s. 15--20. ISSN 1211-8516.

Kontaktní adresa: Ing. Radka Burdychová, Ph.D., Mendelova zemČdČlská a lesnická univerzita v BrnČ, Ústav technologie potravin, ZemČdČlská 1, 613 00 Brno. email:[email protected]

170

CHARAKTERISTIKA RASTU A PRODUKTOV METABOLIZMU LACTOBACILLUS REUTERI POýAS FERMENTÁCIE GLYCEROLU Greifová Mária, Krajþová Eva, Greif Gabriel, Pagurko Anton, Schmidt Štefan, Staruch Ladislav Fakulta chemickej a potravinárskej technologie, STU v Bratislave, Radlinského 9, Bratislava, SR. Characterization of growth and metabolite production of Lactobacillus reuteri during glycerol fermentation Summary: This work characterises the growth of L. reuteri in MRS broth at the temperatures 18, 25, 30, 37 °C as well as its growth in milk at 37 °C. L. reuteri is able to ferment saccharides with exception of erythritol, arabinose, xylose, adonitol, xylopyranoside, dulcitol, mannopyranoside, inulin and xylitol. The stain is resistent to vancomycine, gentamicine, netilmicine and nalidixic acid, while having highest sensitivity to penicillin a piperacillin. Production of 1,3-propandiol and lactic and acetic acids during anaerobic cultivation (37 °C) of L. reuteri in MRS broth comprising various starting concentrations of glycerol (0,5; 1 a 2 %) was monitored by HPLC. Moreover, antimicrobial activity of L. reuteri growing in MRS broth (neat or contaning glycerol) against L. monocytogenes, S. aureus, B. cereus, E.coli, B. subtilis and Ps. fluorescens was tested. Larger inhibition zones were observed on media containing glycerol.

Lactobacillus reuteri má trvalé miesto v gastrointestinálnom ekosystéme Đudí, hydiny, ošípaných a iných zvierat. Predpokladá sa, že má úlohu symbionta v þrevnom ekosystéme produkciou antimikrobiálnych zložiek voþi celej rade G+ a G- patogénov, kvasiniek a plesní [1,2]. Poþas anaerobnej fermentácie glycerolu produkuje reuterin (E-hydroxypropionaldehyd), 1,3-propandiol, etanol, kyselinu mlieþnu a CO2. Magnusson [3] zistil, že náhodný prídavok glycerolu spôsobil dramatické zvýšenie inhibiþného efektu u L. coryniformis Si3 proti niekoĐkým vláknitým hubám a kvasinkám. Poþas izolácie metabolitov glycerolu z L. coryniformis Si3 detekoval rovnaké množstvo 3-hydroxypropionovej kyseliny a 1,3- propandiolu, ale len stopové množstvo 3-HPA (E-hydroxypropionaldehyd).

H2C OH

H2O

HC O

H2C OH Reduktáza

HC OH Dehydratáza H2C OH

H2C

H2C

H2C OH

NADH

+ +

NADH H

H2C OH

3-hydroxypropionaldehyd (O)

O H2C

Obr. 1. Metabolická cesta pre produkciu reuterinu

OH

H2C H2C OH kyselina 3-hydroxypropiónová

Reuterín, širokospektrálna antimikrobiálna zložka, opísaná z Lactobacillus reuteri, je jedna z najintenzívnejšie študovaných nízko molekulových inhibiþných zložiek [4,5]. Reuterín je produkovaný z glycerolu hladujúcimi bunkami za anaeróbnych podmienok a aktívna zložka reuterín je rovnováhou zmesi monomernej, hydratovanej monomernej a cyklickej dimernej formy 3-HPA [6] (obr. 1,2). Je aktívny proti niekoĐkým rozliþným typom mikroorganizmov vrátane G+ a Gbaktériám, kvasinkám a plesniam [7]. Antifungálna aktivita bola ukázaná voþi rodom Candida, Torulopsis, Saccharomyces, Aspergillus a Fusarium. 171

Produkcia reuterínu bola skôr pozorovaná u L. brevis, L. buchneri [8], L. collinoides [9] a L. coryniformis [5]. HC O H2C H2C OH 3-hydroxypropionaldehyd

OH HC OH O

O

OH OH

dimér

H2C

Obr. 2. Dimerizácia reuterinu

H2C OH hydrátovaná forma

CieĐ práce ª charakteristika rastu a zmien pH L. reuteri v MRS médiu pri 18, 30, 37 °C a v mlieku pri 37 °C, ª schopnosĢ L. reuteri fermentovaĢ rôzne sacharidy pomocou API testu, ª odolnosĢ, resp. citlivosĢ L. reuteri voþi 14 antibiotikám - disková metóda ª tvorba kyseliny mlieþnej, octovej, etanolu a 1,3-propandiolu pri 37 °C anaerobnej kultivácii L. reureri v MRS bujóne s rôznym obsahom glycerolu (0,5; 1; 2 %) - HPLC - RID metódou, ª antimikrobiálna aktivita L. reuteri voþi L. monocytogenes, S. aureus, Ps. aeruginosa , E.coli, B. cereus, B. subtilis - dvojvrstvovou platĖovou metódou v MRS médiu s a bez glycerolu Materiál a metódy Testovaný mikroorganizmus: L. reuteri Protectis (BioGaia, Švédsko) Indikátorové mikroorganizmy Listeria monocytogenes NCTC 4886 (National Collection of Type Cultures, UK), Escherichia coli CCM 3988 (Czechoslovak collection of microorganisms Brno, ýR), Pseudomonas aeruginosa CCM 3955, Staphylococcus aureus CCM 3953, Bacillus cereus (izolovaný na KPT, FCHPT STU Bratislava), Bacillus subtilis CCM 2216 Rast Lactobacillus reuteri v MRS médiu a mlieku, zmena pH Na posúdenie rastu a výpoþet rastových charakteristík bola robená stacionárna kultivácia v MRS bujóne pri 37 °C za aeróbnych podmienok. Rastové charakteristiky boli vypoþítané z rovnice: log N(t) = A + Dexp [- exp (-B (t - M))] (10). Test utilizácie sacharidov mikroorganizmami Test skvasovania sacharidov sledovaným mikroorganizmom sa vykonal pomocou API 50 CH (BIOMÉRIEUX, Marcy - lÉtoile, Francúzsko ) podĐa autorov Rada & Petr [11]. Test citlivosti na vybrané antibiotiká Noþná kultúra L. reuteri sa testovala podĐa nami upraveného postupu autorov Cebecci & Gürakan [11] na citlivosĢ resp. vnímavosĢ na vybrané antibiotiká (MAST DISKY, Mast Group Ltd., Merseyside, UK): netilmycín (30 ȝg) – NET30, gentamycín (10 ȝg) – GM10, vankomycín (30 ȝg) – VA30, ceftriaxon (30 ȝg) – CRO30, cefotaxím (30 ȝg) – CTX30, cefuroxím (30 ȝg) – CXM 30, cefazolín (30 ȝg) – CZ30, piperacilín (100 ȝg) – PRL100, ampicilín (10 ȝg) – AP10, penicilín G (10 U) – PG10, kyselina nalidixová (30 ȝg) – NA30, klindamycín (2 ȝg) – CD2, erytromycín (15 ȝg) E15, tetracyklín (30 ȝg) –T30. Metóda je modifikáciou agarovej difúznej metódy [12].

172

Tvorba metabolitov pri anaerobnej kultivácii L. reureri v MRS bujóne s rôznym obsahom glycerolu pri 37 °C [2] Poþas 48 h anaeróbnej kultivácie L. reuteri v MRS bujone s rôznym obsahom glycerolu (0,5 %, 1% a 2 %) boli v dvojhodinovom intervale vyšetrované vzorky na obsah kyseliny mlieþnej, octovej a 1,3-propandiolu pomocou HPLC-RID. Predanalytická úprava vzorky: MRS bujón po kultivácii L. reuteri sa odstredil pri 9000 ot.min-1. Supernatant sa prefiltroval cez mikrofilter 0.22 Pm Chromafil AO filters (Macherey-Nagel, Düren, Germany) a následne aplikoval na kolónu. Podmienky analýzy: Pumpa: DeltaChrom™ SDS 030 (Watrex, Bratislava, Slovenská republika), manuálny dávkovaþ Rheodyne 7725i, dávkovacia sluþka 20 Pl, kolóna: Polymer IEX H+ (250 x 8 mm) (Watrex, Bratislava, Slovenská republika), vyhrievaþ kolóny DeltaChrom™ Temperature Control Unit (50±0,1 °C), mobilná fáza: 1 mM H2SO4, prietok mobilnej fázy: 0,5 cm3.min-1, detekcia: refraktometrický detektor RI K-2301 (Knauer, Berlin, Germany), PC a zberaþ dát v programe Clarity (DataApex, Praha, ýeská republika). Antimikrobiálna aktivita L. reuteri voþi vybraným indikátorovým baktériám – dvojvrstvovou platĖovou metódou v MRS agare bez a s glycerolom Antimikrobiálna aktivita bola uskutoþnená dvojvrstvovou difúznou metódou podĐa Magnusona et al. [3]. L. reuteri bol inokulovaný asi v 2,5 cm linií na MRS agar a následne kultivovaný pri 37 °C 48 h za anaerobnych podmienok. PM boli po vyrastení laktobacila preliate mäkkym maltozovým agarom (Merck, Germany) s koncentráciou indikátorového kmeĖa cca 106 KTJ/ml. Po 24 h aerobnej kultivácií pri 37 °C bola vypoþítaná plocha inhibície. Test sa uskutoþnil v paralelkách.

Výsledky a diskusia Rast Lactobacillus reuteri v MRS médiu a mlieku, zmena pH

9

6.0

37 °C 30 °C 18 °C

7

37 °C 30 °C 18 °C

8.0 7.5

5.5

8

6

4.5 6

6.5

5

6.0 5.5

4.0

5.0

5 40

80

þas [h]

120

3

4.5

3.5 0

4

0

40

80

0

120

10

20

30

40

50

þas [h]

þas [h]

Obr. 3. Charakteristika rastu L. reureri v MRS médiu pri teplotách 18, 30, 37 °C a v mlieku pri 37 °C a zmena pH poþas rastu

173

pH

log(KTJ/ml)

5.0

7 pH

log(KTJ/ml)

7.0

TabuĐka I Rastové charakteristiky a v mlieku pri 37 °C Charakteristiky rastu

L.

reureri

v MRS

médiu

MRS bujón 30 °C 0,211 0,7

18°C 0,060 11,6

Pm [log (KTJ/ml). h-1] O [h]

pri

teplotách

18,

30,

37

°C

mlieko 37 °C 0,252 2,3

37 °C 0,335 2,5

Test utilizácie sacharidov mikroorganizmami Dôležitou vlastnosĢou baktérií je ich schopnosĢ utilizovaĢ jednotlivé sacharidy. Pre zistenie schopnosti utilizovaĢ rôzne sacharidy sa využili testy API 50 CH. L. reuteri bol schopný fermentovaĢ po 48 hodinách 40 sacharidov z celkového poþtu 49 okrem erytritolu, arabinozy, xylózy, adonitolu, xylopyranozidu, dulcitolu, manopyranozidu, inulínu a xylitolu.

Tvorba metabolitov pri anaerobnej kultivácii L. reureri v MRS bujóne s rôznym obsahom glycerolu pri 37 °C

[V] E:\DP2007\KM+GLYCEROL+1,3PD

0,20

0.5% Gly 1.0% Gly 2.0% Gly

0,16

0.20 Gly

cGly [mmol/L]

0.15 Napätie

0,12

0.10

0,08

KM

0.05

1,3-PD

0,04 0.00 0

0,00

5

10

15

20

25

þas

c1,3-PD [mmol/L]

3

2

1

0 0

10

20

30

40

50

ýas kultivácie [h]

Obr.4. Zužitkovanie glycerolu a tvorba 1,3-PD

Obr.5. Chromatografický záznam štandardov(A) a reálnej vzorky(B):Glu glukóza, KM - kyselina mlieþna, Gly glycerol, KO -kyselina octová, 1,3-PD - 1,3 propandiol, Et-OH - etanol

174

[min.]

Test citlivosti na vybrané antibiotiká Významnou vlastnosĢou laktobacilov je ich odolnosĢ a naopak citlivosĢ na rôzne antibiotiká. Celkovo zo 14 použitých antibiotík L. reuteri bol odolný na 4 z nich, vankomycinu, gentamicínu, netilmicinu a k.nalidixovej. V ich prípade nevznikla žiadna inhibiþná zóna. Naopak najväþšia inhibiþná zóna a teda najväþšiu citlivosĢ vykazal voþi penicilinu a piperacilinu Z viacerých štúdií vyplýva, že odolnosĢ na antibiotiká je u každého mikroorganizmu, aj v rámci kmeĖov mikroorganizmov, jedineþná. Antimikrobiálna aktivita L. reuteri voþi vybraným indikátorovým baktériám - dvojvrstvovou platĖovou metódou v MRS agare bez a s glycerolom L. reuteri poþas rastu za anaerobných podmienok tvorí fermentáciou glycerolu viaceré antimikrobiálne zložky, okrem iných aj reuterín. Sauvageot et al.(13) popísali mechanizmus rozkladu glycerolu laktobacilmi tak, že dochádza k dehydratácií glycerolu na 3-HPA, ktorý môže byĢ oxidovaný na kyselinu 3-hydroxypropionovú alebo redukovaný na 1,3-propandiol (obr.1.). Reuterín je rovnováhou zmesi monomernej, hydratovanej monomernej a cyklickej dimernej formy 3-HPA (obr.2). Na jeho antimikrobiálny úþinok sme poukázali dvojvrstvovou platĖovou metódou pri ktorej L. reuteri rastol na MRS agare bez a s glycerolom za anaerobnych podmienok. Vyjasnená zóna okolo testovaných mikroorganizmov bola u každého väþšia na PM s glycerolom. Pre porovnanie bola pre každú baktériu vypoþítaná plocha inhibície, ktorá sa vyjadrila v % oproti celkovej ploche PM. Taktiež na PM s glycerolom bol pozorovaný slabší porast baktérie oproti PM bez glycerolu (tabuĐka II). TabuĐka II Antimikrobiálna aktivita L. reuteri voþi vybraným indikátorovým baktériám vyjadrená ako % vyjasnenej plochy z celkovej plochy PM % vyjasnenej plochy z celkovej plochy PM Mikroorganizmus MRS bez glycerolu MRS s glycerolom 13,1 20,7 L. monocytogenes 16,2 24,7 S. aureus 18,4 22,9 P. aeruginosa 24,7 38,8 E. coli 22,2 24,4 B. cereus 29,1 39,3 B. subtilis

Záver ª Boli testované rastové rastové podmienky pre L.reuteri v MRS médiu a v mlieku ª L. reuteri je schopný fermentovaĢ sacharidy okrem erytritolu, arabinozy, xylózy, adonitolu, xylopyranozidu, dulcitolu, manopyranozidu, inulínu a xylitolu ª L. reuteri je odolný voþi vankomycinu, gentamicínu, netilmicinu a k.nalidixovej, najväþšiu citlivosĢ vykazal voþi penicilinu a piperacilinu. ª L. reuteri poþas rastu v MRS bujóne s glycerolom pri 37 °C utilizoval glukózu na kyselinu mlieþnu, octovú a etanol (CO2-nestanovené) a glycerol na 1,3-propandiol ª L. reuteri pri raste na MRS médiu tvorí antimikrobiálne látky úþinné voþi všetkým testovaným baktériám; na MRS s glycerolom tvorí väþšie množstvo antimikrobiálnych metabolitov, þo dokazuje väþšia vyjasnená plocha okolo L. reuteri a slabší nárast baktérií oproti PM s MRS agarom bez glycerolu

175

Použitá literatúra: 1. Rodríquez, E., Arqués, J.L., Rodríquez, R., NuĖez, M., Medina, M.: Reuterin production by lactobacilli isolated from pig faeces and evaluation of probiotic traits. Letters in Applied Microbiology, 2003, 37, 259-263 2. El-Ziney, M.G., Arneborg, N., Uyttendaele, M., Debevere, J., Jakobsen, M.: Characterization of growth and metabolite production of Lactobacillus reuteri during glucose/glycerol cofermentation in batch and continuos cultures. Biology Letters, 20(10), 1998, s. 913-916. 3. Magnusson, J.,Ström, K., Ross, S., Sjögren, J., Schnürer, J.: Broad and complex antifungal activity among environmental isolates of lactic acid bacteria. FEMS Microbiology Letters, 2003, 219, s. 129135. 4. Chung, T.C., Axelsson, L., Lindgren, S.E., Dobrogosz, W.J. : In vitro studies on reuterin synthesis by Lactobacillus reuteri. Microbial Ecology in Health and Disease 1989, 2, s.137-144. 5. Nakanishi, K., Tokuda, H., Ando, T., Yajima, M., Nakajima, T., Tanaka, O., Ohmomo, S. : Screening of lactic acid bacteria having the ability to produce reuterin. Japanese Journal of Lactic Acid Bacteria 2002, 13, s. 37-45. 6. Talarico, T.L., Casas, I.A., Chung, T.C., Dobrogosz, W.J. 1988. Production and isolation of reuterin, a growth inhibitor produced by Lactobacillus reuteri. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1988, 32, s. 1854-1858. 7. Plocková M., Stiles J., Chumchalová J., Halfarová R.: Control of Mould Growth by Lactobacillus rhamnosus VT1 and Lactobacillus reuteri CCM 3625 on Milk Agar Plates. Czech J. Food Sci.2002, 19, s. 46-50 8. Schütz, H., Radler, F.: Anaerobic reduction of glycerol to propanediol-1,3 by L. brevis and L. buchneri. Systematic and Applied Microbiology 1984, 5, s.169-178. 9. Claisse, O., Lonvaud-Funel, A.: Assimilation of glycerol by a strain of Lactobacillus collinoides isolated from cider. Food Microbiology 2000,17, s.513-519. 10. Gibson, A.M.- Bratchell, N.- Roberts, T.A.: Predicting microbial growth of salmonellae in a laboratory medium as afeected by pH, sodium chloride and storage temperature. International Journal of Food Microbiology, 6, 1988, s.155-178 11. Rada, V., Petr, J.: A new selective medium for the isolation of glucose non-fermenting bifidobacteria from hen caeca. Journal of Microbiological Methods, 43, 2000, s. 127-132. 12. Cebecci, A., Gürakan, C.: Properties of potential probiotic Lactobacillus plantarum strains. Food Microbiology, 20, 2003, s. 511-518. 13. Sauvageot, N., Muller, C., Hartke, A., Auffray, Y. & Laplace, J.M.: Characterisation of the diol dehydratase pdu operon of Lactobacillus collinoides. FEMS Microbiology Letters 2002a, 209, s.69-74.

Poćakovanie: Práca bola podporená projektom APVV-0310-06 a grantom VEGA 1/0746/08. Kontaktná adresa: Ing.Mária Greifová, PhD., e-mail: [email protected] FCHPT-STU Bratislava, Ústav biotechnológie a potravinárstva, technológie, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, SR.

176

Oddelenie potravinárskej

DETEKCE BUNċýNÉ LYZE U LAKTOKOKģ Šviráková Eva, Abrlová Magdaléna, Hlavsová Barbora, Plocková Milada Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT Praha Cell lysis detection in lactococci Summary: This work was aimed at the determination of lytic properties of chosen Lactococcus lactis strains (AM2, NIZO B643, HMM 81, NIZO R5 and LCC 416) by three different methods (determination of cell lysis in citrate buffer; activation of cell lysis by mitomycin C in LM17 broth; determination of cell lysis on GM17 agar with Micrococcus lysodeikticus lysate). Evaluation of lactococci lyses was dependent on used method, however, four Lc. lactis strains (AM2, NIZO B643, HMM 81 and NIZO R5) were assessed as lytic strains and one Lc. lactis LCC 416 strain was assessed as non-lytic strain by usage of all three methods.

Úvod O lyzi bakterií mléþného kvašení, vþetnČ laktokokĤ, je projevován mimoĜádný zájem v souvislosti s jejich použitím ve formČ zákysových kultur v mlékárenských fermentaþních technologiích. Kontrola a zvyšování lyze zákysových kultur jsou považovány za základní parametry pro kontrolu a urychlení zrání pĜedevším polotvrdých a tvrdých sýrĤ1. Lyze bakterií vychází z degradace peptidoglykanu bunČþné stČny endogenními peptidoglykanovými hydrolasami, nazývanými lyziny2. BunČþné lyze byly zjištČny u mnoha gramnegativních i grampozitivních bakterií3. Lyze bakteriálních bunČk mĤže být stanovena rĤznými zpĤsoby. Jde napĜ. o stanovení lytické aktivity bunČk na agaru obsahujícího degradované bunČþné stČny4; aktivaci bunČþné lyze mutagenními þinidly (napĜ. mitomycinem )5; zjištČní úbytku živých bunČk v þase za konstantního pH stanovením celkových poþtĤ bakterií plotnovou metodou6; enzymatickou detekci produktĤ bunČþné lyze (napĜ. vnitrobunČþné vysokomolekulární komponenty - DNA) vyplavených z bunČk po lyzi6; elektronovou mikroskopii bunČk po lyzi6; zjištČní lyze bunČk v systému pufrĤ7; stanovení enzymatické aktivity proteolytických enzymĤ vyplavených z bunČk po lyzi8 a jiné metody. Cíle práce Práce byla zamČĜena na stanovení lytických vlastností vybraných kmenĤ Lactococcus lactis (AM2, NIZO B643, HMM 81, NIZO R5 a LCC 416) tĜemi rĤznými metodami (stanovení bunČþné lyze v citrátovém pufru, aktivace bunČþné lyze mutagenním þinidlem mitomycinem C v bujónu LM17 a stanovení bunČþné lyze na agaru GM17 s lyzátem bunČk Micrococcus lysodeikticus). Materiál a metody Použité kmeny Použité bakteriální kmeny byly uloženy ve Sbírce bakterií, plísní a kvasinek (Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT v Praze, Praha, ýR): x Lc. lactis subsp. cremoris AM2 (pĤvod: Moorepark Research Centre, Fermoy, Co. Cork, Irsko; znaky: autolytický kmen), x Lc. lactis subsp. cremoris NIZO B643 (pĤvod: Netherlands Institute for Dairy Research (NIZO), Department of Biophysical Chemistry and Genetics, Ede, NL; znaky: autolytický kmen), x Lc. lactis subsp. cremoris HMM 81 (pĤvod: Sbírka bakterií, kvasinek a plísní, Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT v Praze, Praha, ýR; izolát ze syrového mléka - mastitidní dojnice, kravín Hostomice, ýR; znaky: autolytický kmen), x Lc. lactis subsp. lactis NIZO R5 (pĤvod: Netherlands Institute for Dairy Research (NIZO), Department of Biophysical Chemistry and Genetics, Ede, NL; znaky: autolytický kmen, produkce nisinu typu A), 177

x

Lc. lactis subsp. lactis LCC 416 (pĤvod: Laktoflora® Sbírka kultur mlékaĜských mikrorganismĤ, Milcom a.s., Praha, ýR; znaky: neautolytický kmen, produkce nisinu typu A).

Kultivace laktokokĤ Laktokoky byly kultivovány (inokulum 1 % obj.) v bujónu LM17 pĜi teplotČ 30 °C po dobu 16 h za aerobních podmínek. Stanovení poþtu laktokokĤ Poþet laktokokĤ byl stanoven plotnovou metodou9. Kultivace laktokokĤ probíhala v agaru 10 M17 s laktosou (agar LM17) pĜi teplotČ 30 °C po dobu 72 h za aerobních podmínek. Stanovení lyze laktokokĤ v citrátovém pufru Lytické schopnosti laktokokĤ byly zjišĢovány na základČ zmČn absorbancí (A650) bunČk kultivovaných v citrátovém pufru (citrát sodný 0,05 mol.l-1, pH 5) s pĜídavkem NaCl (15 g.l-1) pĜi teplotČ 13 °C po dobu 12 dnĤ7. BunČþná lyze = [(A0 - At)/A0] × 100 [%], kde: A0 byla absorbance bunČk mČĜená v 0.dni kultivace a At byla absorbance bunČk mČĜená ve 12.dni kultivace. Stanovení lyze laktokokĤ v bujónu LM17 s mitomycinem C Lytické schopnosti laktokokokĤ byly zjišĢovány na základČ zmČn absorbancí (A615) bunČk kultivovaných v bujónu LM17 s mitomycinem C (2,0 ȝg.ml-1) pĜi teplotČ 30 °C po dobu 8 h5. Stanovení lyze laktokokĤ s lyzátem bunČk M. lysodeikticus Lytické schopnosti laktokokĤ stanoveny plotnovou metodou11,4 na agaru GM17 s lyofilizovanými buĖkami M. lysodeikticus (0,2 % hm.). Výsledky Lyze laktokokĤ v citrátovém pufru Výsledky bunČþných lyzí testovaných laktokokĤ v citrátovém pufru (pH 5) s pĜídavkem NaCl (15 g·l-1) pĜi teplotČ kultivace 13 °C v þasech kultivace 0. a 12.dne jsou uvedeny v Tab. I. Výsledky pĜedstavují prĤmČr ze tĜí paralelních stanovení. Tabulka I Lyze laktokokĤ v citrátovém pufru s pĜídavkem NaCl (15 g·l-1) pĜi teplotČ kultivace 13 °C po dobu 12 dnĤ Kmen Lc. lactis BunČþná lyze [%] Kultivace [den] 0 12 AM2 0 34 NIZO B643 0 46 HMM 81 0 62 NIZO R5 0 67 LCC 416 0 0 V citrátovém pufru docházelo k lyzi všech kmenĤ, kromČ kmene Lc. lactis LCC 416. BunČþná lyze se u þtyĜ kmenĤ Lc. lactis (AM2, NIZO B643, HMM 81 a NIZO R5) po 12 dnech kultivace individuálnČ lišila a pohybovala se v rozmezí od 34 do 67 %. Všechny þtyĜi kmeny byly zaĜazeny mezi vysoce lytické kmeny (bunČþná lyze více než 15 %). Literatura7 Ĝadila laktokoky podle lytických vlastností na vysoce lytické (bunČþná lyze více než 15 %), mírnČ lytické 178

(bunČþná lyze v rozmezí 10 až 15 %) a nelytické (bunČþná lyze do 10 %). Námi použitá teplota kultivace 13 oC byla odvislá od zvolené metodiky7. Z technologického hlediska se jednalo o horní hranici teploty zrání sýrĤ s nízkodohĜívanou sýĜeninou (v praxi se používají spíše nižší teploty do 10 oC). PĜi vyšších teplotách zrání dochází ke vniku intenzivnČjší chutí sýra, ale i k vyššímu riziku vzniku vad. Sledováním spontánních bunČþných lyzí u laktokokĤ v systému pufru nebo médiu M17 (za podmínek optimálních bunČþných lyzí) se v minulých letech zabývaly rĤzné výzkumné skupiny12,11. Za hlavní výhodu použití pufrového testu byl považován fakt, že bunČþné lyze mohly být hodnoceny jednoduše pĜi rĤzných podmínkách prostĜedí (pH, teplota, aktivita vody atd.). PĜi použití složitČjších systémĤ, které více pĜipomínaly prostĜedí reálného sýra (napĜ. sýrový výluh nebo pseudosýĜenina), bylo stanovení bunČþné lyze obtížnČjší13. Lyze laktokokĤ v bujónu LM17 s mitomycinem C Výsledky bunČþných lyzí testovaných laktokokĤ v citrátovém pufru (pH 5) s pĜídavkem mitomycinu C (2,0 ȝg.ml-1) pĜi teplotČ 30 °C po dobu 8 h jsou uvedeny na Obr. 1a-e. Výsledky pĜedstavují prĤmČr z pČti paralelních stanovení.

Obr. 1a-d. Závislost absorbance kmenĤ: Lc. lactis AM2 (a), Lc. lactis NIZO B643 (b), Lc. lactis HMM 81 (c), Lc. lactis NIZO R5 (d) na dobČ kultivace v bujónu LM17 s mitomycinem C (2,0 ȝg.ml-1) pĜi teplotČ 30 °C po dobu 8 h.

179

Obr. 1e Závislost absorbance Lc. lactis LCC 416 na dobČ kultivace v bujónu LM17 s mitomycinem C (2,0 ȝg.ml-1) pĜi teplotČ 30 °C po dobu 8 h. PĜi kultivaci laktokokĤ v bujónu LM17 s mitomycinem C bylo zjištČno, že pĜi použití mitomycinu C (2,0 ȝg.ml-1) byly u všech þtyĜ kmenĤ Lc. lactis (AM2, NIZO B643, HMM 81 a NIZO R5), kromČ kmene Lc. lactis LCC 416, po 8 h kultivace zjištČny vysoké bunČþné lyze od 89 do 98 %. Mitomycin C zde pĤsobil jako aktivátor bunČþné lyze. Úþinky mutagenních þinidel (napĜ. mitomycinu C) þi stresu prostĜedí (napĜ. teplotní šok) na aktivaci lyze u bakterií mléþného kvašení jsou popsány v literatuĜe1. Námi použitá teplota kultivace 30 oC byla odvislá od zvolených metodik11,4. Z mikrobiologického hlediska se jednalo o optimální teplotu rĤstu testovaných laktokokĤ. BČhem našich experimentĤ byly lyze u lyzujících laktokokĤ zpĤsobeny aktivací a uvolnČním profágĤ z DNA laktokokĤ. Všechny laktokoky, kromČ kmene Lc. lactis LCC 416, obsahovaly profágy. Procesy aktivace a uvolnČní profágĤ z laktokokĤ byly popsány v literatuĜe5. Fágy se v sýraĜských technologiích mohou využívat k omezení vývoje hoĜké chuti, napĜ. u sýrĤ s nízkodohĜívanou sýĜeninou14. Lyze laktokokĤ na agaru GM17 s lyzátem bunČk M. lysodeikticus Výsledek bunČþné lyze vybraného kmene Lc. lactis NIZO R5 kultivovaného v agaru GM17 pĜi teplotČ 30 °C po dobu 2 dnĤ s pĜídavkem lyzátu bunČk M. lysodeikticus (0,2 % hm.) je uveden na obr. 2.

Obr. 2. Lytické zóny kolem kolonií kmene Lc. lactis NIZO R5. 180

Testované laktokoky byly kultivovány na povrchu agaru GM17, který obsahoval komerþní lyzát (lyofilizovaných) bunČk M. lysodeikticus4. Lyzát bunČk obsahující m.j bunČþné stČny M. lysodeikticus sloužil jako substrát pro endogenní peptidoglykanové hydrolasy, tzv. lyziny laktokokĤ1. PĜi našich experimentech bylo zjištČno, že pĜi difúzi lyzinĤ agarem docházelo k rozpouštČní bunČþných stČn M. lysodeikticus, což se projevilo tvorbou jasných lytických zón v okolí kolonií laktokokĤ. PrĤmČry lytických zón se po 2 dnech kultivací pohybovaly od 1,5 do 3,0 mm. Po 6 dnech kultivace došlo ke zvČtšení prĤmČru vzniklých zón v okolí kolonií laktokokĤ; nejvČtší prĤmČr mČĜil 12,0 mm. Nejmenší a nejhĤĜe viditelné zóny byly detekovány u kmene Lc. lactis AM2. U kmene Lc. lactis LCC 416 nebyly detekovány žádné lytické zóny. ZávČry x Všechny laktokoky, kromČ kmene Lc. lactis LCC 416, kultivované v citrátovém pufru pĜi teplotČ 13 °C za 12 dní byly vysoce lytické; bunČþné lyze se pohybovaly od 34 do 67 %. x Všechny laktokoky, kromČ kmene Lc. lactis LCC 416, kultivované v bujónu LM17 s pĜídavkem mitomycinu C (2,0 ȝg.ml-1) pĜi teplotČ 30 °C po dobu 8 h, byly vysoce lytické; bunČþné lyze se pohybovaly od 89 do 98 %. Mytomycin C pĤsobil jako aktivátor lyzí. x V okolí kolonií všech laktokokĤ, kromČ kmene Lc. lactis LCC 416, kultivovaných na agaru GM17 obsahujícího komerþní lyzát bunČk M. lysodeikticus (0,2 % hm.) pĜi teplotČ 30 °C po dobu 2 dnĤ, byly detekovány lytické zóny o prĤmČru od 1,5 do 3,0 mm. x Za použití všech tĜech detekþních metod byly þtyĜi kmeny Lc. lactis (AM2, NIZO B643, HMM 81 a NIZO R5) hodnoceny jako lytické a jeden kmen Lc. lactis LCC 416 jako nelytický. Hodnocení lyzí BMK je závislé na použité metodČ15,1. K vytvoĜení jednoznaþných závČrĤ by bylo tĜeba provČĜit lytické schopnosti testovaných laktokokĤ pomocí dalších metod (napĜ. detekce laktátdehydrogenasy, rĤzných peptidas pepN, pepC a pepI)16. PodČkování: Tato práce byla podpoĜena Ministerstvem školství, mládeže a tČlovýchovy ýeské republiky (výzkumný zámČr MSM 6046137305) . Použitá literatura: 1. Lortal S., Chapot-Chartier M.P.: Role, mechanisms and control of lactic acid bacteria lysis in cheese. Int. Dairy J. 15, 857-871 (2005). 2. Smith T.J., Blackman S.A., Foster S.J.: Autolysins of Bacillus subtilis: multiple enzymes with multiple functions Microbiology 146, 249-262 (2000). 3. Shockman G.D., Höltje J.-V.: Microbial peptidoglycan (murein) hydrolases. V knize: Bacterial Cell Wall (Ghuysen J.-M., Hakenbeck R., eds.), s. 131-166. Elsevier, Amsterdam 1994. 4. Garde S., Gaya P., Medina M., Nuñez M.: Autolytic behaviour of Lactococcus lactis subsp. cremoris and Lactococcus lactis subsp. lactis wild isolates from ewes´ raw milk cheeses. Milchwissenschaft 57 (3), 143-147 (2002). 5. O‘Sullivan, D., Ross, R. P., Fitzgerald, G. F., Coffey, A.: Investigation of the relationship between lysogeny and lysis of Lactococcus lactis in cheese using prohage-targeted PCR. Appl. Environ. Microbiol. 66, 2192-2198 (2000). 6. Chapot-Chartier M.-P., Daniel C., Rousseau M., Vasal L., Gripon J.-C.: Autolysis of two strains of Lactococcus lactis dutiny cheese ripening. Int. Dairy J. 4, 251-269 (1994). 7. Boutrou R., Sepulchre A., Gripon J.C., Monnet V.: Simple tests for predicting the lytic behavior and proteolytic activity of lactococcal strains in cheese. J. Dairy Sci. 81, 2321 - 2328 (1998). 8. Bie R., Sjoström G.: Autolytic properties of some lactic acid bacteria used in cheese production: Part I.: Material and method. Milchwissenshaft 30, 653-657 (1975). 9. ýSN ISO 7218 (560103): Mikrobiologie potravin a krmiv - Všeobecné pokyny pro mikrobiologické zkoušení. ýNI, Praha 1998.

181

10. Terzaghi B.E., Sandine W.E.: Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophages. Appl. Environ. Microbiol. 29, 807-813 (1975). 11. Østlie H.M., Vegarud G., Langsrud T.: Autolysis of lactococci: Detection of lytic enzymes by polyacrylamise gel electrophoresis and characterization in buffer systems. Appl. Environ Microbiol. 61, 3598-3603 (1995). 12. Niskasaari K.: Characteristics of the autolysis of variants of Lactococcus lactis subsp. cremoris. J. Dairy Res. 56, 639-649 (1989). 13. Roberts M., Wijesundera C., Bruinenberg P.G., Limsowtin G.K.Y.: Development of an aseptic cheese curd slurry system for cheese ripening studies. Austr. J. Dairy Technol. 50, 66-69 (1995). 14. Crow V.L., Martley F.G., Coolbear T., Roundhill S.J.: The influence of phage-assisted lysis of Lactococcus lactis subsp. lactis ML8 on Cheddar cheese ripening. Int. Dairy J. 5, 451-472 (1995). 15. Hannon J.A., Wilkinson M.G., Delahunty C.M., Wallace J.M., Morrissey P.A., Beresford T.P.: Use of autolytic starter systeme to accelerate the ripening of cheddar cheese. Int. Dairy J. 13, 313-323 (2003). 16. Kilcawley K.N., Wilkinson M.G., Fox P.F.: Determination of key enzyme activities in commercial peptidase and lipase preparations from microbial or animal sources. Enzyme Mikrob. Technol. 31(3), 310-320 (2002).

Kontaktní adresa: Eva Šviráková, Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT v Praze, Technická 5, 166 28 Praha 6, ýR, tel: +420 220 443 271, fax: +420 220 443 285, e-mail: [email protected]

182

AUTOLÝZA LACTOBACILLUS HELVETICUS 121 Ondráþková Iva, Kuþerová KateĜina, Šantinová Eva, Plocková Milada Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT Praha Autolysis of Lactobacillus helveticus 121 Summary: The Lactobacillus helveticus strain 121 used in this study was confirmed to be helveticus species by API-test and by PCR with species-specific primers. Autolysis of this strain was evaluated by an assay using three different buffers, followed by observation of Gram staining by optical microscopy. Using these techniques we compared two methods: i) cultivation during 12 days at a controlled temperature of 13 °C and ii) cultivation for 4 hours at 42 °C using a BioTek cell. The strongest autolysis achieved using the 12 day assay in a phosphate buffer with pH 6 was 28.9%. Whereas, when the 4-hours method at 42 °C in a phosphate buffer with pH 7 was used, the maximal autolysis was 1.5%. It was able to evaluate the autolysis by light microscopy. The lysed / damaged cells were red in contrast to no-lysed cells colored in blue-violet. Lactobacillus helveticus 121 is therefore considered as a medially autolytic strain.

Úvod: Klíþovým faktorem pĜi zrání sýru, bČhem kterého se definuje jeho senzorický profil, je proteolýza. Rozpad bakteriální buĖky zpĤsobený vlastními enzymy, neboli autolýza, umožĖuje i intracelulárním enzymĤm, dostat se do matrice sýra a zapojit se do procesu zrání (7). Na zrání sýrĤ má nejvČtší vliv hydrolytické štČpení proteinĤ, zejména oligopeptidĤ, které se senzoricky projevuje zmČnou textury, chuti a vĤnČ sýrĤ v prĤbČhu zrání. Proteolytický systém laktobacilĤ je z funkþního hlediska velice podobný proteolytickému systému laktokokĤ, je ovšem mnohem bohatší co se týþe zastoupení a aktivit proteinas a peptidas. Vzhledem ke vztahu mezi rozsahem autolýzy a rychlostí proteolýzy je tendence vybírat pro výrobu sýrĤ kmeny s vysokou autolytickou a souþasnČ proteolytickou aktivitou (3). Pro zkrácení doby zrání sýrĤ a zvýšení organoleptických vlastností produktĤ je proto dĤležité se pĜedevším soustĜedit na výbČr vhodných zákysových kultur (4). Jednou z možností jak zvýšit míru proteolýzy je pĜídavek vysoce autolytických laktobacilĤ, a to zejména druhu Lactobacillus helveticus. Sýry s pĜídavky autolytických laktobacilĤ jsou totiž hodnoceny jako lahodnČjší a ménČ hoĜké (3,4). Nejjednodušší metodou zvýšení autolytické schopnosti je použití plasmidových konstruktĤ nesoucích geny pro produkci rĤzných enzymĤ, jak peptidoglykanových hydrolas tak peptidas, proteinas i popĜ. lipas. Bohužel, souþasný legislativní rámec tyto prostĜedky nepovoluje, a proto se pozornost obrací na izolaci nových vhodných kmenĤ s vysokou enzymatickou aktivitou (7). Cíle práce: Cílem této práce bylo pro kmen Lb. helveticus 121 zjistit: x fenotypickou a genotypickou charakteristiku, x autolytickou aktivitu pomocí dvou kultivaþních metod v pufrových systémech, x autolytickou aktivitu pomocí optického mikroskopu. Materiál a metody: Použité kmeny x Lb. helveticus 121 (Laktoflora, CR) x Lb. helveticus 466 (Laktoflora, CR)

183

Fenotypizace a genotypizace laktobacilĤ Zkoumané kmeny byly fenotypicky charakterizovány pomocí API-testu (Biomerieux, France) s použitím CHL50 kultivaþního média dle instrukcí výrobce (5,6). Genotypické potvrzení druhu bylo provedeno pomocí PCR s využitím druhovČ specifických primerĤ MC10 (5‘CATTATAGGCTCCTTTCTCATG-3‘) a MC13 (5‘-CAACCTTGTTAGCAGGCTTC-3‘) (8). Screening autolytické aktivity v pufrových systémech BČhem kultivace v pufrech byla mČĜena absorbance pĜi 650 nm pomocí dvou metod: 1) Klasická metoda (1): kultivace po dobu 12 dní pĜi 13 °C v termostatu s využitím 0,1 M citátového, fosfátového a McIlvainova pufru s pĜídavkem 15 g/l NaCl o rĤzném pH. 2) Kontinuální metoda: kultivace po dobu 4 hodin pĜi 42 °C v cele pĜístroje Biotek s využitím 0,1 M fosfátového pufru s pĜídavkem 15 g/l NaCl o pH 7. Procento autolýzy bylo vypoþítáno dle rovnice 1: Rovnice 1:

% autolýzy = [ (A0 – At)/ A0] x 100

kde A0 je poþáteþní stav absorbance a At je absorbance mČĜená v þase t (1). Mikroskopie Fixní preparáty bunČk odebraných v þase 0h a 4h bČhem kontinuální screeningové metody byly barveny dle Grama a pozorovány optickým mikroskopem pĜi tisíci násobném zvČtšení. Výsledky a diskuse: Fenotypizace a genotypizace Lactobacillus helveticus 121 zkvašuje pouze glukosu, galaktosu a laktosu a tvoĜí PCR produkt o velikosti 1269 bp (Obr. 1) což jsou specifické znaky pro kmeny Lb. helveticus.

Obr. 1. PCR s druhovČ specifickými primery, sloupec: 1, 4 – 1 kb ladder, 2 – Lb. paracasei ST68 (negativní kontrola), 3 – Lb. helveticus 121 Autolytická aktivita PĜi 12ti denní kultivaci v 0,1 M pufrech pĜi pH 6 vykazoval kmen 121 nejvyšší autolýzu ve fosfátovém pufru, a to 28,9 % (Tabulka I).

184

Tabulka I % autolýzy u kmene Lb. helveticus 121 po kultivaci v rĤzných pufrech pH 6 o koncentracích 0,1 M s pĜídavkem 15 g/l NaCl pĜi 13 °C po dobu 12 dní. Pufr

citrátový

fosfátový

McIlvaine

% autolýzy

12,7

28,9

17,3

Ve fosfátovém pufru o pH 7 u þtyĜhodinové kontinuální kultivace pĜi 42 °C v cele Biotek bylo u kmene 121 1,5 % autolyzovaných bunČk, kdežto u srovnávacího kmene Lb. helveticus 466 dosáhla autolýza po þtyĜech hodinách 50ti procent (Graf.1).

Graf. 1. Porovnání autolýz Lb.helveticus 121(-) a Lb.helveticus 466 (Ŷ) pomocí mČĜení absorbance pĜi 650 nm pĜístrojem BioTek bČhem 16h. Z mikroskopických záznamĤ pro kmen Lb.helveticus 121 bylo patrno, že bunČþná stČna byla jen þásteþnČ narušena, buĖky lyzovaly jen ojedinČle a byly zbarveny modĜe (Obr.2) na rozdíl od Lb. helveticus 466, kde došlo k jednoznaþnému odlišení modĜe zbarvených nelyzovaných bunČk pĜed kultivací v pufru a þervenČ zbarvených zlyzovaných bunČk po kultivaci v pufru (Obr.3). a)

b)

Obr. 2. Mikroskopický obraz a) Lb.helveticus 121 pĜed kultivací ve fosfátovém pufru, b) Lb. helveticus 121 po 4h kultivace pĜi 42 °C.

185

c)

d)

Obr. 3. Mikroskopický obraz c) Lb.helveticus 466 pĜed kultivací ve fosfátovém pufru, d) Lb.helveticus 466 po 4h kultivace pĜi 42 °C. ZávČr: x Barvení dle Grama umožnilo názorné rozlišení zlyzovaných a nezlyzovaných bunČk a dobĜe korelovalo s výsledky namČĜenými v pufrových systémech pomocí kontinualní metody. x Využití pĜístroje BioTek se zvýšením kultivaþní teploty na 42 °C je jednoduchá a rychlá metoda ke screeningu autolytické aktivity. Výsledky však nejsou srovnatelné s klasickou metodou. x Kmen Lactobacillus helveticus 121 považujeme za stĜednČ autolytický PodČkování: Tato práce byla podpoĜena Ministerstvem školství, mládeže a tČlovýchovy ýeské republiky (výzkumný zámČr MSM 6046137305) . Použitá literatura: 1. Boutrou R., Sepulchre A., Gripon J.-C., Monnet V.: Simple tests of predicting the lytic behaviour and proteolytic activity of lactococcal strains in cheese. J. Of Dairy Sci. 81, 2321-2328 (1998). 2. Delcour J., Ferain T., Hols P.: Advances in the genetics of thermophilic lactic acid bacteria, Current Opinion in Biotechnol. 11, 497–504, (2000) 3. Hannon J.A., Kilcawley K.N., Wilkinson M.G., Delahunty C.M., Beresford T.P.: Flavour precursor development in Cheddar cheese due to lactococcal starters end presence and lysis of Lactovacillus helveticus. Int. Dairy J. (2005). 4. Hannon J.A., Wilkinson M.G., Delahunty C.M., Wallace J.M., Morrissey P.A., Beresford T.P.: Use of autolytic starter systems to accelerate the ripening of Cheddar cheese. Int. Dairy J. 13, 313-323 (2003). 5. Hébert E.M., Raya R.R., Tailliez P.,G.S. de Giori: Characterization of natural isolates of Lactobacillus strains to be used as starter cultures in dairy fermentation, Int. J. of Food Microbiol. 59, 19–27, (2000) 6. Fitzsimons N.A.,,1 Cogan T.M.,,1 Condon S.,,2 Beresford T.: Phenotypic and Genotypic Characterization of Non-Starter Lactic Acid Bacteria in Mature Cheddar Cheese, Appl. and Envir. Microbiol. 65, 3418–3426, (1999) 7. Lortal S., Chapot-Chartier M.-P.: Role, mechanisms and control of lactic acid bacteria lysis in cheese. Int. Dairy J. 15, 857-871 (2005). 8. Ventura M., Callegari M.L., Morelli L.: S-layer gene as a molecular marker for identification of Lactobacillus helveticus, FEMS Microbiology Letters 189, 275-279, (2000)

Kontaktní adresa: Iva Ondráþková, VŠCHT Praha, Technická 5, 16628 Praha 6, ýeská republika, e-mail: [email protected] 186

VLIV POýTU SOMATICKÝCH BUNċK NA VYBRANÉ PARAMETRY MLÉKA DOJNIC ýESKÉHO STRAKATÉHO PLEMENE Skýpala Martin, Falta Daniel, Chládek Gustav Ústav chovu a šlechtČní zvíĜat, Mendelova zemČdČlská a lesnická univerzita v BrnČ The influence of somatic cell count on chosen parameters of Czech Pied Cattle Summary: The somatic cell count (SCC) in bovine milk is an indicator of udder health and milk quality and can be related to the cellular immune response after an inflammatory stimulus. The aim of our experiment was verified the higher somatic cell count have an efficient on the milk yield, milk components and technological properties of milk. The object of observation was 28 cows of Czech Pied Cattle on the 4th lactation to the 100-day of lactation. The cows were divided to 2 groups according to the somatic cell count (SCC): group 1 (G1; n = 14; SCC up to 400 000/1 mL) and group 2 (G2; n = 14; SCC above 400 000/ 1 mL). It was evaluated milk yield (kg), milk components (milk protein content, milk fat content, milk lactose content, solidsnot-fat content) and technological properties of milk (active acidity, rennet coagulation time, quality of curd, freezing point of milk). It was found significant difference (P<0.05) only in milk yield. No significant differences (P>0.1) were found in rest monitored parametrs. There was lower milk yield in G1 (13.6 kg) than in G2 (15.8 kg). Lower values of active acidity, renet coagulation time, milk fat content and freezing point of milk were found in cow´s milk from the G1. On the other hand values of milk protein content, milk lactose content, solids-not-fat content and quality of curd were lower in the milk from the G2.

Úvod Poþet somatických bunČk (PSB) v mléce je jako pĜedmČt výzkumných publikací zaznamenáván od roku 1910 [6]. Podle [8] je poþet somatických bunČk v mléce užíván jako mČĜítko zdraví mléþné žlázy a kvality mléka. V mnoha zemích je poþet somatických bunČk používán jako parametr hygienické kvality mléka a zpenČžování syrového mléka [14]. Obsah somatických bunČk v mléce má své fyziologické opodstatnČní. Jedná se o kolostrální a epiteliální tČlíska, buĖky z krve a mléþné žlázy [18]. Somatické buĖky existují v mnoha typech, vþetnČ neutrofilĤ, makrofágĤ, lymfocytĤ, eosinofilĤ a rĤzných typĤ epiteliálních bunČk mléþné žlázy [6]. Ve zdravé mléþné žláze jsou pĜevládajícím typem makrofágy (35-79 %), následují lymfocyty (16-28 %), polymorfonukleární neutrofily (3-26 %) a epiteliální buĖky (2-15 %) [9]. Zvýšení poþtu somatických bunČk (SB) mĤže být vyvoláno zmČnou vnČjších podmínek chovu (vážení dojnic, zooveterinární opatĜení), které mohou zpĤsobit vČtší zatížení organismu dojnic (stress). Dalším faktorem, který ovlivĖuje zvýšení obsahu SB v mléce je výživa a krmení. V neposlední ĜadČ se na zmČnČ obsahu SB podílí i zmČna vnitĜního prostĜedí mléþné žlázy - vznik mastitid [16]. Mastitida je zánČtlivá reakce tkánČ vemene jako odpovČć na infekci. Tento zánČt je charakterizován pĜísunem bílých krvinek do mléþné žlázy a poté následuje zvýšení endogenních mléþných proteináz [7]. [17] udávají, že mastitidní mléko vykazuje vyšší proteolytickou aktivitu než mléko normální, což má za následek zvýšení proteinázy plasminu, který hydrolyzuje kasein. Podle [12] mastitida snižuje v mléce obsah tuku, kaseinu, laktózy a sušiny a naopak se zvyšuje obsah sérových proteinĤ a chloridĤ. Také [10] uvádí, že mléko s vyšším poþtem somatických bunČk inhibuje rĤst startovacích kultur, zatímco mléko s nižším poþtem je dobré medium pro rĤst bakterií mléþného kvašení.

187

Materiál a metodika Objektem sledování bylo 28 krav þeského strakatého plemene na 4. laktaci do 100. laktaþního dne. Dojnice byly rozdČleny do 2 skupin podle poþtu somatických bunČk (PSB): skupina 1 (G1; n = 14; PSB do 400 tis./1 ml) a skupina 2 (G2; n = 14; PSB nad 400 tis./1 ml). Byl hodnocen nádoj (kg), obsahové složky (obsah bílkovin, obsah tuku, obsah laktózy, obsah tukuprosté sušiny) a technologické ukazatele (aktivní kyselost, syĜitelnost, kvalita sýĜeniny, bod mrznutí mléka). V laboratoĜi pro rozbor mléka (Brno-Chrlice) byly stanoveny tyto ukazatele: obsah tuku, bílkovin, laktózy a tukuprostá sušina infraþerveným absorpþním analyzátorem BENTLEY 2000, poþet somatických bunČk pomocí fluoro-opto-elektronické metody pĜístrojem SOMACOUNT 500, bod mrznutí byl stanoven pĜístrojem kryoskop CRYOSTAR. Ostatní ukazatele byly zjištČny v laboratoĜi Ústavu chovu a šlechtČní zvíĜat MZLU v BrnČ. SyĜitelnost mléka byla stanovena pomocí "Nefelo-turbidimetrického snímaþe koagulace mléka" mČĜící principem popsaným v [1]. Bylo použito syĜidlo Laktochym 1:5000 (Milcom Tábor) v množství 1 ml na 50 ml mléka po zĜedČní syĜidla 1:4. Kvalita byla hodnocena po 60 minutové inkubaci 50 ml zasýĜeného mléka pĜi 35 0C a posouzena dle tabulky v [2] hodnotící vzhled sýĜeniny a syrovátky (tĜída 1 = nejlepší, tĜída 5 = nejhorší). Aktivní kyselost byla mČĜena pH-metrem CyberScan PC 510 (Eutech Instruments). Výsledky a diskuze Tabulka I Základní statistické charakteristiky sledovaných ukazatelĤ u jednotlivých skupin Ukazatel Nádoj (kg) Bílkoviny (%) Tuk (%) Laktóza (%) Tps (%) Aktivní kyselost (pH) SyĜitelnost (s) Kvalita sýĜeniny (tĜ.) BM (-m 0C)

skupina 1 (G1) skupina 2 (G2) Sx Vx(%) Sx Vx (%) x x 13,6 2,33 17,20 15,8 3,25 20,61 3,30 0,28 8,35 3,27 0,33 10,09 4,21 0,68 16,25 4,62 1,96 42,46 4,99 0,15 3,04 4,90 0,20 3,99 8,67 0,36 4,10 8,51 0,79 9,28 6,70 0,07 0,98 6,72 0,12 1,73 169 32,60 19,30 199 75,19 37,88 1,87 0,70 37,49 1,46 0,84 57,66 534,1 7,59 1,42 534,3 8,61 1,61

SP * NS NS NS NS NS NS NS NS

SP - statistická prĤkaznost, * - statisticky prĤkazný vliv (P<0,05), NS - statisticky neprĤkazný vliv

Zjistili jsme statisticky prĤkaznČ (P<0,05) nižší prĤmČrný denní nádoj (13,6 kg) u krav s poþtem somatických bunČk do 400 000 v 1 ml (G1) než v mléce dojnic s poþtem somatických bunČk nad 400 000 v 1 ml (G2), kde bylo namČĜeno prĤmČrné množství mléka 15,8 kg. Naše výsledky u tohoto parametru jsou v rozporu s pracemi uvádČnými napĜ. autory [11], kteĜí popisují pokles množství mléka se zvyšujícím se poþtem somatických bunČk v mléce, jakožto výsledek zhoršené syntetické aktivity mléþné žlázy. Také [5] konstatují, že krávy trpící klinickou mastitidou mají denní nádoj o 0,5 kg nižší ve srovnání se zdravými dojnicemi. Pokud jde o obsah tuku v mléce, u skupiny G1 bylo zjištČno 4,21 % tuku, tedy ménČ, než v mléce skupiny G2 (4,62 %). Vyšší obsah tuku v mléce s vČtším poþtem somatických bunČk zjistil i [4, 7].

188

18

6,0

17

5,5

16

15

tuk (%)

nádoj (kg)

5,0

14

4,5

4,0 13

3,5

12

11

3,0 G1

G2

G1

skupiny

G2

skupiny

Obr. 1 Rozdíly prĤmČrných hodnot mezi skupinami u nádoje (kg).

Obr. 2 Rozdíly prĤmČrných hodnot mezi skupinami v obsahu tuku (%).

Obsah bílkovin v mléce u G1 byl 3,3 %, což je hodnota statisticky neprĤkaznČ vyšší oproti dojnicím ze skupiny G2, kde prĤmČrný obsah bílkovin byl 3,27 %. [3] zjistil, že pĜi zvýšeném poþtu leukocytĤ v mléce klesá obsah bílkovin. Naproti tomu fakt, že pĜi zvýšeném poþtu somatických bunČk je obsah bílkovin v mléce vyšší popisují [7, 11]. Obsah laktózy v mléce skupiny G1 byl 4,99 %, tato hodnota je vyšší, než-li obsah laktózy v mléce dojnic skupiny G2, který byl 4,9 %. Námi zjištČné údaje jsou ve shodČ s [7, 13].

5,15

3,6

5,10 3,5 5,05

5,00

laktóza (%)

bílkoviny (%)

3,4

3,3

4,95

4,90 3,2 4,85 3,1 4,80

4,75

3,0 G1

G1

G2

G2

skupiny

skupiny

Obr. 3 Rozdíly prĤmČrných hodnot mezi skupinami u obsahu bílkovin (%).

Obr. 4 Rozdíly prĤmČrných hodnot mezi skupinami v obsahu laktózy (%).

189

Obsah tukuprosté sušiny u skupiny G1 byl 8,67 %, tedy o 0,16 % více než u skupiny G2, kde byl namČĜen obsah tukuprosté sušiny 8,51 %. StejnČ tak [4] ve své práci uvádČjí vyšší obsah tukuprosté sušiny u mléka s nižším poþtem somatických bunČk. Aktivní kyselost (pH) byla zjištČna u skupiny G1 6,70 a u skupiny G2 hodnota 6,72. PodobnČ [7] zjistili vyšší pH mléka s vČtším poþtem somatických bunČk. Nepatrné zvýšení pH u mléka s vyšším poþtem somatických bunČk uvádí též [9].

6,80

9,2 9,1

6,78

9,0 6,76

Aktivní kyselost (pH)

Tukuprostá sušina (%)

8,9 8,8 8,7 8,6 8,5 8,4 8,3

6,74

6,72

6,70

6,68

6,66

8,2 6,64 8,1 6,62

8,0 G1

G1

G2

G2

skupiny

skupiny

Obr. 5 Rozdíly prĤmČrných hodnot mezi skupinami u obsahu tukuprosté sušiny (%).

Obr. 6 Rozdíly prĤmČrných hodnot mezi skupinami v aktivní kyselosti (pH).

SyĜitelnost byla u mléka z 1. skupiny 169 s, zatímco mléko z 2. skupiny se sráželo déle (199 s). Rozdíl mezi tČmito dvČma skupinami je statisticky neprĤkazný. Delší dobu srážení mléka s vyšším poþtem somatických bunČk uvádČjí také [8, 15, 17]. Mnoho prací uvádí, že mléko s vyšším poþtem somatických bunČk vykazuje pomalejší rychlost tvorby sýĜeniny a také sýĜenina je kĜehþí. Je možné, že rĤst bakterií mléþného kvašení je inhibován antibakteriálními látkami produkovanými bílými krvinkami [7], které nejvíce zvyšují poþet somatických bunČk v mléce. Z výsledkĤ uvedených v tabulce I vyplývá, že sýĜenina mléka z G1 je ménČ kvalitní (tĜ. 1,87) než sýĜenina z G2 (tĜ. 1,46). Naproti tomu [3] tvrdí, že u mléka s vyšším poþtem somatických bunČk klesá pevnost sýĜeniny. Bod mrznutí mléka byl u sledovaných skupin prakticky totožný; u skupiny G2 (-534,3 m C) a u skupiny G1 (-534,1 m 0C). RovnČž [13] zjistili vyšší bod mrznutí u mléka s vyšším poþtem somatických bunČk.

0

190

2,4

250 240

2,2 230 220

Kvalita sýĜeniny (tĜída)

2,0

SyĜitelnost (s)

210 200 190 180 170 160

1,8

1,6

1,4

1,2

150 140

1,0

130 0,8

120 G1

G1

G2

G2

skupiny

skupiny

Obr. 7 Rozdíly prĤmČrných hodnot mezi skupinami u syĜitelnosti (s).

Obr. 8 Rozdíly prĤmČrných hodnot mezi skupinami v kvalitČ sýĜeniny (tĜída).

ZávČr Poþet somatických bunČk v kravském mléce slouží jako indikátor zdraví mléþné žlázy a kvality mléka a mĤže souviset s bunČþnou imunitní odezvou po zánČtlivém procesu. PĜedmČtem našeho experimentu bylo ovČĜit, zda vyšší poþet somatických bunČk má vliv na nádoj, obsahové složky a technologické ukazatele mléka. Zjistili jsme statisticky prĤkaznČ (P<0,05) nižší nádoj u skupiny 1 (G1; 13,6 kg) oproti skupinČ 2 (G2; 15,8 kg). Dále byla u G1 zjištČna nižší aktivní kyselost (pH), syĜitelnost (s) a obsah tuku (%) než ve G2. Naopak u obsahu bílkovin (%), obsahu laktózy (%), obsah tukuprosté sušiny (%), kvality sýĜeniny (tĜída) a bod mrznutí (- 0C) byly hodnoty u G1 vyšší oproti G2. Tyto uvedené rozdíly však nebyly statisticky prĤkazné.

PodČkování PĜíspČvek byl zpracován s podporou Výzkumného zámČru þ. MSM6215648905 „Biologické a technologické aspekty udržitelnosti Ĝízených ekosystémĤ a jejich adaptace na zmČnu klimatu“ udČleného Ministerstvem školství, mládeže a tČlovýchovy ýeské republiky. Použitá literatura [1] ýEJNA, V., CHLÁDEK, G.: A coagulation time of individual milk samples and its relationship with a number and phase of lactation in Holstein cows. [in Czech] Sborník: Mléko a sýry. 1. vyd. Praha: ýeská spoleþnost chemická, 2005, s. 3 [2] GAJDģŠEK, S.: MlékaĜství II (cviþení). Brno: MZLU. 1999, 92 s. [3] HAENLEIN, G. F. W., SCHULTZ, L. H., ZIKAKIS, J. P.: Composition of proteins in milk with varying leucocyte contents. J. Dairy Sci., 1973, 56: 1017-1024

[4] HAMPTON, O., RANDOLPH, H. E.: Influence of mastitis on properties of milk. II. Acid production and curd firmness. J. Dairy Sci., 1969, 52: 1562-1565 [5] JONES, G. M., PEARSON, R. E., CLABAUGH, G. A., HEALD, C. W.: Relatioships between somatic cell counts and milk production. J. Dairy Sci., 1984, 67:1823-1831 [6] KEHRLI, M. E., SHUSTER, D. E.: Factors affecting milk somatic cells and their role in health of the bovine mammary gland. J.Dairy Sci., 1994, 77:619-627 [7] KLEI, L., YUN, J., SAPRU, A., LYNCH, J., BARBANO, D., SEARS, P., GALTON, D.: Effects of milk somatic cell count on cottage cheese yield and quality. J. Dairy Sci., 1998, 81:1205-1213

191

[8] LINDMARK-MÅNSSON, H., BRÄNNING, C., ALDÉN, G., PAULSSON, M.: Relatioship between somatic cell count, individua leukocyte populations and milk components in bovine udder quarter milk. International Dairy Journal, 2006, 16:717-727

[9] LANE, H. L. RICHTER, R. L. RANDOLPH, H. E.: Influence of mastitis on properties of milk. VI. Buffer capacity. J. Dairy Sci., 1970, 53: 1389-1390 [10] LINDMARK-MÅNSSON, H., SVENSSON, U., PAULSSON, M., ALDÉN, G., FRANK, B., JOHNSSON, G.: Influence of milk components, somatic cells and supplemental zinc on milk processability. International Dairy Journal, 2000, 10:423-433 [11] NG-KWAI-HANG, K. F., HAYES, J. F., MOXLEY, J. E., MONARDES, H. G.: Variability of test-day milk production and composition and relation of somatic cell counts with yield and compositional changes of bovine milk. J. Dairy Sci., 1984, 67:361-366 [12] RANDOLPH, H. E., ERWlN, R. E., RICHTER, R. L. Influence of Mastitis on Properties of Milk.VII. Distribution of Milk Proteins 1. J. Dairy Sci., 1974, 57: 15-18 [13] RASMUSSEN, M., D., LARSEN, L. B.: Milking hygiene: new issues and opportunities from automatic milking. Ital.J.Anim.Sci., 2003, 2:283-289 [14] SURYIASATHAPORN, W., VINITKETKUMNUEN, U., CHEWONARIN, T., BOONYAYATRA, S., KREAUSUKON, K., SCHUKKEN, Y.H.: Higher somatic cell counts resulted in higher malondialdehyde concentrations in raw cows' milk. International Dairy Journal, 2006, 16: 1088-1091 [15] TEPLÝ M. et al.: Mléko a jeho produkce k prĤmyslovému zpracování. Praha: SNTL, 1979, 376 s. [16] TOUŠOVÁ, R., STÁDNÍK, L.: Sledování obsahu somatických bunČk mléka v závislosti na rĤzných þinitelích u holštýnsko - fríských krav. Sborník: Den mléka, Praha, 1999 [17] VERDI, R. J., BARBANO, D. M., DELLAVALLE, M. E., SENYK, G.F.: Variability in true protein, casein, nonprotein nitrogen, and proteolysis in high and low somatic cell milks. J. Dairy Sci., 1987, 70:230_242 [18] ŽIŽLAVSKÝ, J., MIKŠÍK, J., GAJDģŠEK, S., KUCHTÍK, J.: Somatické buĖky v mléce krav v prvních 100 dnech laktace. Živoþ. Výr., 34, 1992, 1:359-363

Kontaktní adresa [email protected], [email protected], [email protected] Mendelova zemČdČlská a lesnická univerzita v BrnČ, ZČmČdČlská 1, 613 00 Brno

192

VLIV POLYMORFISMU GENU CSN2 NA POýET SOMATICKÝCH BUNċK U ýESKÉHO STRAKATÉHO A HOLŠTÝNSKÉHO MLÉýNÉHO SKOTU. Sojková K.1, ěíha J.2, Manga I.3, DvoĜák J.3 1 VÚCHS Rapotín, s. r. o., 2Agrovýzkum Rapotín, s.r.o. 3 Ústav morfologie, fyziologie a genetiky živoþichĤ MZLU v BrnČ Effects of CSN2 gene on somatic cells count in Czech Spotted and Holstein dairy cows Summary: We analyzed effects of CSN2 gene on somatic cells count in milk recording. The CSN2 gene is one of the most tested genes in marker assisted selection breeding programmes. It is also important as marker usable for milk production and quality parameters. Somatic cells count is one of the key attributes in milk quality and health problems indicators. We selected 225 individuals of Holstein and Czech Spotted Cattle breeds for testing association. Distributions of genotypes was calculated in these subpopulations. For data analysis we use GLM procedure with effects of lactation number, breed and genotype of the CSN2 gene. Significant associations were found in somatic cells count. Individuals with A1A1 genotype have significant higher somatic cells count than other groups in several tests. Linear trend of somatic cells count in A1A2 genotype was also detected. The positive findings is that valuable A2A2 genotype is associated with the lowest number of somatic cells. This offers new possibilities in selection of dairy cattles. This work was supported by the projet MZe ýR 1G58073 and MSM 2678846201.

Souhrn V práci hodnotíme vliv genu CSN2 na poþet somatických bunČk v mléce na údajích vztahujících se k mléþné užitkovosti. Gen CSN2 je jedním z nejvíce testovaných genĤ v chovatelských programech s využitím genetických markerĤ. Je také dĤležitý jako marker pro parametry mléþné produkce a zpracovatelské kvality mléka, vþetnČ mléþných výrobkĤ. Poþet somatických bunČk je jedním z klíþových atributĤ indikujících kvalitu mléka a zdravotní problémy zvíĜat. Experimentální soubor tvoĜí 225 jedincĤ holštýnského a þeského strakatého skotu. V tČchto subpopulacích byla vyhodnbocena frekvence sledovaného genotypu. K samotné datové analýze jsme použili metodu GLM, s efekty aktuální laktace, plemene a genotypu genu CSN2. Ve sledované veliþinČ – poþtu somatických bunČk – byla zjištČna na základČ statistického zpracování celá Ĝada signifikantních rozdílĤ. Dojnice s genotypem A1A1 vykazují výzmnamnČ vyšší poþet somatických bunČk než ostatní skupiny ve vČtšinČ provedených testĤ. Byl rovnČž potvrzen lineární trend nárĤstu poþtu somatických bunČk pro jedince s genotypem A1A2. Pozitivním výsledkem je zjištČní, že genotyp A2A2 je spojen s nejnižším poþtem somatických bunČk pro obČ plemena. Tento výsledek nabízí nové možnosti v selekci mléþného skotu s využitím selekce podle genu CSN2.

Úvod Genetické markery (mikrosatelitní markery, SNPs, atd.) jsou díky své vazbČ na užitkové þi kvalitativní znaky produkce hospodáĜských zvíĜat ve velké míĜe používány ve šlechtitelských programech. ýasto bývají využívány jako QTL (Quantitave Trait Loci), ETL (Economic Trait Loci) a tvoĜí tak spolu s ostatními metodami kontroly užitkovosti v chovatelském procesu šlechtČní na oþekáváné hodnoty sledovaných znakĤ (Meuwissen, 2003). Je nutné, aby chovatelé ve spolupráci s metodami molekulární biologie a genetiky byli schopni tyto markery identifikovat v chovaných populacích, prokázat jejich vazbu na požadované znaky a této vazby vhodnČ využít. PĜíkladem takovýchto markerĤ jsou v mléþné produkci skotu napĜíklad rĤzné mutaþní markery pro polymorfizmy genĤ DGAT1, kapa kasein (CSN3), beta kasein (CSN2), laktoglobulin LGB (Tsiaras, 2005), PIT-1 – specifický transkripþní faktor regulující expresi rĤstového hormonu (GH) (Renaville, 2005), IGF-2 a další. Jejich vliv na parametry mléþné produkce byl vyhodnocen množstvím autorĤ (Renaville, 2005, Kucerova, 2004, Walawski, 1997, Van den Berg, 1990, Hill, 1993). 193

Gen pro beta kasein je, mimo své primární vazby na pĜítomnost požadované formy beta kaseinu jako potenciálnČ využitelné látky prospČšné lidskému zdraví (Wong et al., 1996, Swinburn, 2004), ve vazbČ k mnoha dalším kvantitaivním znakĤm mléþné produkce skotu. Vazbou polymorfizmu beta kaseinu na znaky mléþné užitkovovsti u lokálnČ chovaných plemen skotu se v minulosti zabývala napĜ. práce (Caroli et al, 2003; ). V této práci se zabýváme vlivem polymorfizmĤ genu pro beta kasein na jeden z klíþovým parametrĤ syrového kravského mléka – poþet somatických bunČk. V souþasné dobČ se ve vztahu k tomuto parametru testují napĜ. také markery pro geny CGIL4, CCL2, IL8, CCR2 a IL8RA. (Sharma et al., 2006; Leyva-Baca et al., 2007). Poþet somatických bunČk je hlavním faktorem urþujícím bezpeþnost mléka jako potravinového zdroje, je jedním z indikátorĤ zdravotního stavu zvíĜat, taktéž je urþujícím faktorem pro zpracovatelskou kvalitu mléka a jedním z parametrĤ sledování mléþné užitkovosti (Ingalls, 2002; Ma et al., 2000). AutoĜi poukazují na snížení výtČžnosti u zpracování sýrĤ; po zniþení bakterií se uvolĖují enzymy, které jsou rezidentní k procesu pasterizace a mohou zpĤsobit poškození mléþného tuku a proteinĤ. To mĤže vést ke zmČne chuĢových vlastností mléka, které mĤže konzument považovat za objektivnČ problematické. Navíc to mĤže negativnČ ovlivnit trvanlivost mléka, a to i když je ĜádnČ chlazeno. Vzhledem k hypotézám o zdraví prospČšném vlivu beta kaseinu (Clarke, 2007) v práci testujeme jeho vazbu k poþtu somatických bunČk v syrovém kravském mlévce. Pro zachycení specifických faktorĤ podmínek chovu krav s mléþnou užitkovostí v ýR jsme vybrali pro naši studii jedince z chovĤ podobných parametrĤ (výživa, mléþná produkce) tak, aby byla zastoupena v ýR nejvíce chovaná plemena s mléþnou užitkovostí – þeské þervenostrakaté a holštýnské. Materiál a metody Datový soubor obsahoval 225 jedincĤ. Izolace DNA z biologických vzorkĤ byla provedena pomocí Jet Quick Blood and Cell Culture DNA Spin Kit (Genomed). Urþení polymorfizmu beta kaseinu bylo provedeno pomocí PRC-RFLP metody (McLachlan, 2003). Po ošetĜení datového souboru na odlehlé a chybČjící hodnoty bylo do následující analýzy zahrnuto 198 jedincĤ. V takto ošetĜeném datovém souboru je zahrnuto 134 jedincĤ plemene þeské þervenostrakaté a 64 jedincĤ plemene holštýn. U 157 sledovaných jedincĤ byl sledován logaritmovaný poþet somatrických bunČk na první laktaci, u 41 jedincĤ na páté a vyšší laktaci. Pro hodnocení vlivu genu CSN2 na logaritmovaný poþet somatických bunČk (logSB) byl použit lineární model s pevnými efekty plemeno, laktace a genotyp CSN2 v úplném schématu porovnání (se všemi možnými smíšenými efekty). log SB ijkl = m + CSN 2 j + laktacek + plemenol + + CSN 2 j * laktacek + CSN 2 j * plemenol + laktacek * plemenol + CSN 2 j * laktacek * plemenol + eijkl

Všechny sledované efekty splĖují pro logaritmovaný poþet somatických bunČk pĜedpoklady homogenity rozptylĤ (LeveneĤv test) a testy normálního rozdČlení uvnitĜ skupin efektĤ, logaritmovaný poþet somatických bunČk splĖuje test normálního rozdČlení. Post-hoc testy jsou provedeny pomocí Tukeyho HSD testu pro nestejný poþet pozorování.

Výsledky a diskuze Základní parametry datového souboru pro promČnou logSB a efekty plemeno a laktace obsahuje tabulka I. V tabulce II jsou uvedeny základní popisné statistiky pro jednotlivé genotypy genu CSN2 vzhledem k poþtu somatických bunČk.

194

Tabulka I Základní charakteristiky datového souboru pro logaritmický poþet somatických bunČk v mléce. laktace plemeno logSB logSB logSB logSB logSB prĤmČr N min max stddev 1 CSTR 4.145 104 1.099 7.731 1.305 5 CSTR 4.927 30 2.079 7.608 1.246 1 H 5.002 53 2.639 7.585 1.156 5 H 6.126 11 4.997 7.954 1.065 Všechny skupiny 4.603 198 1.098 7.954 1.352 Tabulka II Logaritmické poþty somatických bunČk a základní statistické charakteristiky vzhledem ke genotypĤm CSN2. CSN2 logSB logSB logSB logSB prĤmČr min max stddev A1A2 4.616 2.708 7.620 1.078 A2 4.365 1.099 7.731 1.433 A1 5.732 2.079 7.954 1.414 Všechny skupiny 4.612 1.099 7.954 1.340

Tabulka III ukazuje zjištČné frekvence genotypĤ genu CSN2 v námi vybrané subpopulaci. Výsledky korespondují napĜ. s pracemi (Thompson et al., 1964; Bech, Kristiansen, 1990).

Tabulka III Logaritmické poþty somatických bunČk a základní statistické charakteristiky vzhledem ke genotypĤm CSN2. Frekvence genotypĤ CSN2 u obou sledovaných plemen. N=198 Plemeno ýSTR Plemeno H A2 51.24% 36.21% A1A2 41.32% 48.28% A1 7.44% 15.52%

Testovaný model má pro datový soubor parametry, které jsou shrnuty v tabulce IV. Nulová hypotéza o rovnosti variability modelu a reziduí je tČmito výsledky vyvrácena (p<0.001).

Tabulka IV Parametry lineárního modelu. Kvalita proložení. model

R

R^2

Upravené R^2

F

p

logSB

0.502

0.252

0.203

0.115

0.001

Tabulka V obsahuje výsledky analýzy celého modelu pro všechny sledované efekty. Efekt laktace je prĤkazný vzhledem k poþtu somatických bunČk (p=0.022). Taktéž efekt plemene se ukázal jako vysoce prĤkazný na této úrovni analýzy (p=0.00097). Zajímavý je trend naznaþený u efektu beta kaseinu (p=0.724). Tento trend ukazuje, že v rámci nČkterých skupin jednotlivých genotypĤ dochází pravdČpodobnČ k diferenciaci poþtu somatických bunČk. Proto je efekt podrobnČji analyzován pomocí post-hoc testĤ. 195

Tabulka V Hodnocení jednotlivých efektĤ lineárního modelu. Efekt Sý StupnČ Abs. þlen 1598.844 1 CSN2 7.633 2 Laktace 7.635 1 Plemeno 16.149 1 CSN2*laktace 1.632 2 CSN2*plemeno 6.373 2 laktace*plemeno 0.820 1 CSN2*laktace*plemeno 0.762 2 Chyba 238.897 167 .

Pý 1598.844 3.816 7.635 16.149 0.816 3.187 0.820 0.381 1.431

F 1117.664 2.668 5.337 11.289 0.570 2.228 0.573 0.266

p 0.000 0.072 0.022 0.001 0.566 0.111 0.450 0.766

Grafy 1, 2, 3 ukazují množství somatických bunČk v rámci sledovaných efektĤ. Krávy na páté a vyšší laktaci mají signifikantnČ vyšší poþet somatických bunČk než krávy na nižších laktacích. RovnČž krávy plemene holštýn mají vysoce prĤkaznČ vyšší poþet somatických bunČk než dojnice plemene þeské þervenostrakaté.

Souþasný efekt: F(1, 167)=5.3372, p=.02210 Vertikály oznaþují 0.95 intervaly spolehlivosti

Souþasný efekt: F(1, 167)=11.289, p=.00097 Vertikály oznaþují 0.95 intervaly spolehlivosti

6.4

6.4

6.2

6.2 6.0

6.0

5.8 5.8

5.6 5.4 logSB

logSB

5.6 5.4

5.2 5.0

5.2

4.8

5.0

4.6 4.8

4.4 4.6

4.2 4.0

4.4 1

CST R

5

H plemeno

laktace

Graf 1, 2 Grafická reprezentace poþtu somatických bunČk v závislosti na poĜadí laktace a plemenné pĜíslušnosti.

Genotyp A2A2 je ve sledovaném souboru zvíĜat asociován s nejnižším poþtem somatických bunČk. Naopak genotyp A1A1je asociován s nejvyšším poþtem somatických bunČk. Lineární trend nárustu poþtu somatických bunČk s výskytek alely A1potvrzují i výsledky pro genotyp A1A2. Aþkoliv není efekt genotypu beta kaseinu prĤkazný celkovČ a výsledkem je pouze statistický trend, provedené pos-hoc testy ukazují, existenci prĤkazného rozdílu v poþtu somatických bunČk mezi genotypy A1A2 a A1A1, a vysoce prĤkazný rozdíl mezi genotypy A2A2 a A1A1 (tabulka VI). Podle výsledkĤ je tedy zĜejmé, že genotyp A2A2 je asociován s nižším poþtem somatických bunČk v mléce sledovaných jedincĤ. RovnČž vliv alely A2 na poþet somatických bunČk ve sledovaném souboru je prĤkazný (tabulka VI).

196

Souþasný efekt: F(2, 167)=2.6679, p=.07236 Vertikály oznaþují 0.95 intervaly spolehlivosti 7.0

6.5

logSB

6.0

5.5

5.0

4.5

4.0 A2

A1A2

A1

CSN2

Graf 3 Poþet somatických bunČk v závislosti na genotypu CSN2. Tabulka VI Post-hos TukeyĤv HSD test pro nestejná N. Rozdíly v poþtu somatických bunČk v závislosti na genotypu CSN2. TukeyĤv HSD test CSN2 {1} {2} {3} 1 A2 0.389 0.002 2 A1A2 0.389 0.014 3 A1 0.002 0.014

Graf 4 ukazuje graficky rozdíly v poþtu somatických bunČk v rámci všech sledovaných efektĤ (smíšený efekt CSN2*laktace*plemeno). gen.CSN2*laktace*plemeno 9 8

logSB

7 6 5 4 3

gen. CSN2: A2

gen. CSN2: A1A2

H

CSTR

plemeno:

H

CSTR

plemeno:

H

CSTR

plemeno:

2

gen. CSN2: A1

Graf 4 Grafická analýza efektu CSN2*laktace*plemeno.

197

laktace 1 laktace 5

PĜedevším u dojnic na první laktaci se projevují popsané výsledky. U plemene holštýn se výsledky potvrzují také pro dojnice na páté a vyšší laktaci. Nehomogenita výsledkĤ u plemene þeské þervenostrakaté na páté a vyšší laktaci mĤže být zpĤsobena dvojí užitkovostí plemene, špatným zdravotním stavem stáda þi efektem chovu a také malou þetností skupiny. ZávČr Pro sledovaný soubor zvíĜat byl vyhodnocen vliv polymorfizmu genu CSN2 na poþet somatických bunČk v mléce. Soubor byl tvoĜen jedinci plemene holštýn a þeské þervenostrakaté. Soubor 225 (resp. 198) jedincĤ byl analyzován pomocí lineárního modelu s pevnými efekty laktace, plemene a genotypu. Výsledky ukazují signifikantní rozdíly v poþtu somatických bunČk v závislosti na plemenné pĜíslušnosti a poĜadí laktace dojnic. Statisticky významné rozdíly se však projevily i v post-hoc testech provedených podle genotypĤ genu CSN2, což se potvrdilo i pĜi rozboru efektĤ interakcí. Asociace menšího poþtu somatických bunČk s genotypem A2A2 (resp. alelou A2) u obou plemen je pozitivním výsledkem. UmožĖuje využít selekci na alelu A2 þi její zvýšení v populacích pro snížení poþtu somatických bunČk v mléce a tím pomoci zaruþit jeho požadovanou kvalitu. PodČkování: Práce vznikla za podpory projektĤ MZe ýR 1G58073 and MSM 2678846201. Použitá literatura: 1. Bech, A. M. & Kristiansen, K. R. (1990). Milk protein polymorphism in Danish dairy cattle and the influence of genetic variants on milk yield. J. Dairy Res 57, 53-62. 2. Caroli, A., Chessa, S., Bolla, P., Budelli, E. & Gandini, G. C. (2004). Genetic structure of milk protein polymorphisms and effects on milk production traits in a local dairy cattle. Journal of Animal Breeding and Genetics 121, 119-127. 3. Clark A. J. (2007). a2 Milk™ Overview of Technology. In proceedings of Milk Technology Conference 2007. June 5-6. Denver, CO. 4. Hill, J. P. (1993). The relationship between ȕ-lactoglobulin phenotypes and milk composition in New Zealand dairy cattle. J. Dairy Sci. 76:281–286. 5. Leyva-Baca, I., Schenkel, F., Sharma, B. S., Jansen, G. B. & Karrow, N. A. (2007). Identification of single nucleotide polymorphisms in the bovine CCL2, IL8, CCR2 and IL8RA genes and their association with health and production in Canadian Holsteins. Animal Genetics 38, 198-202. 6. Ma, Y., Ryan, C., Barbano, D. M., Galton, D. M., Rudan, M. A. & Boor, K. J. (2000). Effects of Somatic Cell Count on Quality and Shelf-Life of Pasteurized Fluid Milk. Journal of Dairy Science 83, 264-274. 7. McLachlan C.,N.,S., : Breeding and milking cows for milk free of beta-casein A1, 2003-11-27, US2003221200. 8. Meuwissen, T. (2003) Genomic selection: the future of marker assisted selection and animal breeding. In: MAS: A fast track to increase genetic gain in plant and animal breeding?, FAO , electronic forum on biotechnology in food and agriculture, 17-18 october 2003, Turin. 9. Ingalls W. (2002). Somatic Cells, Mastitis and Milk Quality. Electronic material: http://www.moomilk.com/archive/u-health-20.htm. Kansas City, MO. 10. Kuþerová, J., et. al. (2004). The influence of markers CSN3 and ETH10 on milk production parameters in The Czech pied cattle. Journal of central european agriculture, vol 5, no2, 303-308. 11. Renaville R, Gengler N. (2005) Method for identifying animals for milk production qualities by analysing the polymorphism of the Pit-1 and kappa-casein genes, 2005-06-23, US2005136440. 12. Sharma, B. S., Jansen, G. B., Karrow, N. A., Kelton, D. & Jiang, Z. (2006). Detection and Characterization of Amplified Fragment Length Polymorphism Markers for Clinical Mastitis in Canadian Holsteins. Journal of Dairy Science 89, 3653. 13. Swinburn, B. (2004). Beta Casein A1 and A2 in Milk and Human Health. Report to New Zealand Food Safety Authority, Jul 13.

198

14. Thompson, M. P., Kiddy, C. A., Johnston, J. O. & Weinberg, R. M. (1964). Genetic Polymorphism in Caseins of Cows' Milk. II. Confirmation of the Genetic Control of {beta}-Casein Variation. Journal of Dairy Science 47, 378. 15. Tsiaras, A. M., Bargouli, G. G., Banos, G. & Boscos, C. M. (2005). Effect of Kappa-Casein and BetaLactoglobulin Loci on Milk Production Traits and Reproductive Performance of Holstein Cows. Journal of Dairy Science 88, 327. 16. Van Den Berg G (1993). Genetic polymorphism of ț-caseinand ȕ-lactoglobulin in relation to milk composition and cheesemaking properties. International Dairy Federation. Proceedings of the IDF Seminar Held in Palmerston North. New Zealand: 123–133. 17. Walawski et al. (1997). Association between beta-lactoglobulin (BLG) polymorphism and diagnostic indicators of subclinical mastitis in Black and White cows. Roczniki naukowe Zootechniki 24 (4), 9 – 22. 18. Wong W. C. , Heng S. F., Liu A. H., Husband A. J., Smithers G. W., Watson D. L. (1996). Modulation of immune responses by bovine –casein. Immunology and Cell Biology 74, 323–329.

Kontaktní adresa: Mgr. Kamila Sojková, Rapotín, Výzkumný ústav pro chov skotu, s.r.o., VýzkumníkĤ 267, 788 13, VikýĜovice, [email protected]

199

VLIV SYěIDLA NA VÝTċŽNOST SÝRģ EIDAMSKÉHO TYPU RosĤlek Martin1, KouĜimská Lenka1, Legarová Veronika1, TĤma ŠtČpán2 1 Katedra kvality zemČdČlských produktĤ, FAPPZ, ýeská zemČdČlská univerzita v Praze 2 Plastcom a. s., Mlékárna PĜíšovice The effect of rennet on the yield of Edam cheese production Summary: Edam cheese was produced using three different kinds of rennet. The amount of cheese from each batch was weighed. The yield of production differs according to the used type of rennet and was also affected by the composition of the final product (fat in dry matter content). The effect of rennet on the sensory quality of cheese was not found.

Úvod Pojmem sýr oznaþujeme výrobek obsahující pĜedevším mléþnou bílkovinu, mléþný tuk a v malé míĜe ostatní souþásti mléka (cukr, minerální látky)1. Sýry obsahují podle druhu až 30 % bílkovin, do 30 % tuku, stopové množství mléþného cukru a minerální látky, vitamíny a celou Ĝadu biologicky dĤležitých látek, jako jsou napĜ. esenciální aminokyseliny2. Sýr, jako výrobek, je v þerstvém stavu nebo v urþitém stupni prozrání, který získáváme srážením mléka, smetany, podmáslí nebo jejich rĤzných smČsí syĜidlem nebo kyselinou mléþnou vzniklou kysáním a dalším zpracováním takto získané sraženiny.1 Síla syĜidla je vyjádĜením jeho srážecí mohutnosti. Hlavním þinidlem urþujícím jakost a charakter sýĜeniny je doba syĜidlového srážení mléka. Doba srážení je nepĜímo úmČrná dávce syĜidla, množství syĜidla je pĜi stejné dobČ sýĜení pĜímo úmČrné množství zpracovaného mléka. ýím je kratší doba srážení, tím ménČ syrovátky sýĜenina obsahuje3. Sýry a jejich výroba jsou neoddČlitelnČ spojené s dČjinami lidstva. Samotné sýry se zaþaly vyrábČt z mléka od okamžiku, kdy þlovČk pĜed mnoha tisíci lety zaþal chovat a využívat mléko od rĤzných domácích zvíĜat jako jsou ovce, kozy, hovČzí dobytek a jiné2. SpotĜeba a obliba sýrĤ u nás i ve svČtČ má rostoucí tendenci4. Vyrábí se nejen s rĤzným obsahem tuku v sušinČ, ale i s množstvím nejrĤznČjších pĜíchutí. V souþasnosti výroba sýrĤ nabyla již moderní velkoprĤmyslový charakter, kde se sýry vyrábČjí ve velkých množstvích na automatických linkách a vyrábČjí se pĜi tom sýry ve vyrovnané kvalitČ, zdravotnČ nezávadné a za dostupné ceny. Na druhou stranu se však udržuje i tzv. malovýroba v malých soukromých mlékárnách, þi jen v domácnostech, kde mají mléko z vlastního chovu hospodáĜských zvíĜat1. VýtČžnost výroby sýrĤ je závislá nejen na složení vstupní suroviny, (hlavnČ obsahu kaseinu) ale zároveĖ na technologickém procesu výroby. Cílem pĜedložené práce bylo zmapování možnosti zvýšení výtČžnosti výroby sýrĤ eidamského typu. Experimentální þást byla vČnována výrobČ sýrĤ eidamského typu za použití nČkolika druhĤ syĜidel pĜi jednotlivých výrobách v návaznosti na senzorické posouzení kvality vyrobených sýrĤ. Materiál a metody PĜi experimentu bylo použito tĜech druhĤ syĜidel (XA), (XB) a (XC) od rĤzných výrobcĤ v bČžném technologickém postupu výroby eidamu schválenou technology Mlékárny PĜíšovice. Bližší specifikace syĜidel není uvedena z dĤvodu pokraþujícího technologického výzkumu v mlékárnČ. Receptura výroby se odchýlila pouze od množství daného syĜidla v závislosti na jeho síle. Všechny výroby v rámci jednoho dne byly ze spoleþného zásobníku na mléko. Byly vyrábČny sýry typu eidamská cihla (EC) a eidamský blok (EB) s obsahem tuku v sušinČ 30 a 45 %. VýtČžnost byla zjišĢována vážením prázdných i plných klecí se sýry z výrob. Senzorický profil vzorkĤ byl posuzován školenými hodnotiteli za použití grafické nestrukturované orientované stupnice.

200

Výsledky a diskuse V tabulce I jsou uvedeny celkové hmotnosti sýrĤ z jednotlivých výrob pĜi použití syĜidel XA, XB a XC. Vliv syĜidla na výtČžnost je znázornČn i na obr. 1.

Tabulka I Celkové hmotnosti sýrĤ z jednotlivých výrob Oznaþení výroby Výroba þ. 1/ Výroba þ. 2/ hmotnost sýrĤ hmotnost sýrĤ 9.10.EC-12-30 % 1246,5 kg (XA) 1255,5 kg (XA) 9.10.EB-8-30 % 723,0 kg (XA) 730,5 kg (XA) 10.10.EC-12-45 % 1207,0 kg (XA) 1227,0 kg (XB) 10.10.EB-8-45 % 720,5 kg (XA) 743,0 kg (XB)

Výroba þ. 3/ hmotnost sýrĤ 1199,0 kg (XB) 698,0 kg (XB) 1206,5 kg (XC) 747,0 kg (XC)

Výroba þ. 4/ hmotnost sýrĤ 1135,5 kg (XC) 665,5 kg (XC)

06

,5

,5

12

35

27

11

12

99

55

07

11

1200

12

12

12

46

,5

,5

Vliv syĜidel na výtČžnost sýrĤ

1100 H m otnost sýrĤ v K g

1000 900 800

72

3

72

0,

5

73

0,

5

74

3

69

700

8

74

7

66

5,

5

600 500 400 300 200 100 0 1

2

3

4

ýíslo výroby 9.10.EC-12-30%

10.10.EC-12-45%

9.10.EB-8-30%

10.10.EB-8-45%

Obr. 1. Vliv syĜidel na výtČžnost sýrĤ z jednotlivých výrob

V 1. a 2. výrobČ sýrĤ s tuþností 30 % t.v.s. bylo použito stejné syĜidlo (XA). PrĤmČrná hmotnost vyrobených sýrĤ byla 1251 kg (cihla) a 726,75 kg (blok). Ve 3. výrobČ (syĜidlo XB) je znatelný pokles ve výtČžnosti o 4,2 % (cihla) a 4,0 % (blok). Ve 4. výrobČ (syĜidlo XC) je ztráta na výtČžnosti oproti syĜidlu XA znatelných 9,2 % (cihla) a 8,4 % (blok), což reprezentuje 115,5 kg resp. 61,25 kg! PĜi výrobČ sýrĤ s tuþností 45 % t.v.s. byla pĜi použití syĜidla XB ve 2. výrobČ zjištČna vyšší výtČžnost o 1,7 % (cihla) resp. o 3,1 % (blok) v porovnání se syĜidlem XA. PĜi použití syĜidla XC byla pĜi výrobČ cihly zjištČna témČĜ stejná výtČžnost. PĜi výrobČ bloku (syĜidlo XC) byla výtČžnost v porovnání se syĜidlem XA o 3,7 % vyšší.

201

ZávČr Použitím rĤzných syĜidel ve výrobČ bylo prokázáno, že mohou mít výrazný vliv na výnos koneþného produktu a s tím související finanþní ztráty mlékárny pĜi používání nevhodných syĜidel. VýtČžnost sýrĤ v závislosti na použitém syĜidle souvisí i se složením finálního výrobku (obsahem tuku v sušinČ). DĤležité je také dodržení potĜebných technologických parametrĤ jako jsou doba dosoušení, doba dohĜívání a lisování sýrového zrna bez pĜístupu vzduchu, které mají za následek nedokonalé spojení jednotlivých sýrových zrn za vzniku nepravidelné struktury (trhliny v sýrové hmotČ). Toto má pak vliv i na tvorbu sýrového prachu, který je nezachytitelný a odchází jako ztráta výtČžnosti do odpadu. Posouzením senzorické jakosti vyrobených sýrĤ nebyla v experimentu zaznamenána zmČna organoleptických vlastností v závislosti na syĜidle.

Použitá literatura: 1. ýerná, E., Mergl, M. Laboratorní kontrolní metody v mlékaĜství. SNTL – Nakladatelství technické literatury Praha, 1974, 216s. 04-821-74. 2. Keresteš, J. Syry, výživa a zdravie. Otava v.o.s, 2007, 156 s. ISBN 80-969693-6-4. 3. Prokš, J. MlékaĜství díl II., SNTL – Nakladatelství technické literatury Praha, 1965, 365 s. ISBN 04-80265. 4. Hrubá, M., Veselá, Z. Situaþní a výhledová zpráva mléko. MZe Praha, 2007, 115 s. ISBN 978-80-7084611-7.

Kontaktní adresa: Bc. Martin RosĤlek, Katedra kvality zemČdČlských produktĤ, FAPPZ, ýZU v Praze, Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 – Suchdol, e-mail: [email protected].

202

VYHODNOCENÍ VÝTċŽNOSTI EIDAMSKÝCH SÝRģ Šustová KvČtoslava Ústav technologie potravin, MZLU v BrnČ Evaluation of yield of Edam cheese Summary: Dairy norm required for produced 1 kg Edam cheese with 30 % dry fat matter 11.2 l of milk in winter and 11.4 l of milk in summer months. Dairy norm required for produced 1 kg Edam cheese with 45 % dry fat matter 10.20 l of milk in winter and 10.40 l of milk in summer months. The lowest milk consumption was in July (11.50 l/kg) and the highest milk consumption was in February (10.70 l/kg) on the Edam cheese with 30 % dry fat matter. The lowest milk consumption was in July too (10.70 l/kg) and the highest milk consumption again was in February (9.98 l/kg) on the Edam cheese with 45 % dry fat matter. The lowest concentration of milk protein was monitored in July (3.25 %) and the highest concentration of milk protein was monitored in December (3.49 %).

Cílem práce bylo zhodnocením výtČžností eidamských sýrĤ ve vztahu k bílkovinám. K hodnocení výtČžnosti byly vybrány sýry s obsahem tuku v sušinČ (TVS) 30 % a 45 %. V prĤbČhu celého roku bylo sledováno v každém mČsíci množství zpracovávaného mléka a kilogramy vyrobených sýrĤ v mlékárnČ. Na základČ tČchto hodnot byla vypoþtena spotĜeba mléka v litrech na výrobu 1 kg sýra. Výsledky zjištČné spotĜeby mléka na 1 kg eidamského sýru jsou znázornČny v grafech 2 až 5. Podniková norma ve sledované mlékárnČ rozlišovala pĜi výrobČ eidamských sýrĤ spotĜebu mléka podle roþního období. V zimním období (Ĝíjen až bĜezen) platila norma 11,2 l/kg 30 % eidamu a 10,2 l/kg 45 % eidamu. V letním období (duben až záĜí (platila norma pro spotĜeba mléka 11,4 l/kg u 30 % eidamu a 10,4 l/kg u 45 % eidamu. U 30 % eidamĤ se nejvČtší spotĜeba mléka na kg sýra zjistila v þervenci (11,5 l/kg) a nejnižší spotĜeba byla zjištČna v únoru (10,7 l/kg). ObdobnČ i u eidamĤ se 45 % TVS byla nejvyšší spotĜeba mléka na 1 kg sýru zjištČna v þervenci (10,7 l/kg) a nejnižší opČt v únoru (9,98 l/kg). U tČchto eidamĤ však byla spotĜeba mléka þastČji vyšší než požadovala norma, a to i v zimních mČsících listopad až leden. V zimním období byla spotĜeba mléka na výrobu 1 kg obou druhĤ eidamských sýrĤ nižší než v období letním. To je dáno pĜedevším obsahem bílkovin v tČchto mČsících. Nejnižší obsah bílkovin byl zaznamenán v letních mČsících, þemuž odpovídala také nejvČtší spotĜeba mléka na výrobu sýrĤ (viz grafy 6 a 7). Variabilita obsahu bílkovin je uvedena v grafu 1. Nejnižší mČsíþní prĤmČr bílkovin byl namČĜen v þervenci (3,25 %) a nejvyšší v prosinci (3,49 %). Vyšší hodnoty bílkovin byly namČĜeny také v mČsících Ĝíjen a listopad. Maximální obsah bílkovin byl zjištČn v mČsíci záĜí (3,96 %) a minimální v dubnu (2,88 %). Nejnižší variabilita bílkovin byla zjištČna v listopadu (2,36 %) a nejvyšší v záĜí (5,90 %). Výsledky hodnocení složení a jakosti mléka vykazovaly sezónní charakter. Nejlepší složení mléka pro výrobu sýrĤ bylo zjištČno v podzimních a zimních mČsících, kdy byl zaznamenán vyšší obsah bílkovin a tuku. Stanovenou podnikovou normu na spotĜebu mléka na výrobu obou typĤ eidamských sýrĤ se podaĜilo splnit jen v nČkterých mČsících. V letních mČsících byla spotĜeba mléka vyšší, v zimních mČsících spotĜeba mléka klesala. Je tĜeba vzít v úvahu, že spotĜebu mléka, kromČ bílkovin, mĤže ovlivĖovat také zpĤsob ošetĜení mléka pĜed sýĜením, zpĤsob zpracování sýĜeniny, únik tuku a bílkovin do syrovátky. NicménČ problém s rozdílnou výtČžností sýrĤ v prĤbČhu roku byl ovlivnČn pĜedevším obsahem bílkovin, který v letních mČsících klesal. Variabilita obsahu bílkovin v mléce se následnČ projevila i ve variabilitČ složení sýrĤ. Bylo by vhodné standardizovat obsah tuku v mléce používaném na výrobu eidamských sýrĤ s ohledem na obsah bílkovin, a tím þásteþnČ eliminovat sezónní rozdíly ve složení sýrĤ a únik nadbyteþného tuku do syrovátky.

203

5 4 3 2 1

Variaþní koeficient v %

6

prĤmČr

zá Ĝí Ĝí je lis n to pa pr d os in ec

0

le de n ún or bĜ ez en du be n kv Čt en þe rv þe en rv en ec sr pe n

Bílkoviny v %

7

3,5 3,45 3,4 3,35 3,3 3,25 3,2 3,15 3,1

var. koef.

Obr. 1. Variabilita obsahu bílkovin v mléce v % v prĤbČhu roku

SpotĜeba mléka v l/kg

11,6 11,5 11,4 11,3 11,2 11,1 11

duben

kvČten

þerven

Skuteþná spotĜeba mléka

þervenec

srpen

záĜí

SpotĜeba mléka podle normy

Obr. 2. SpotĜeba litrĤ mléka na 1 kg eidamu 30 % TVS v letním období


11,4 11,3 11,2 11,1 11 10,9 10,8 10,7 10,6

Ĝíjen

listopad prosinec


leden

únor

bĜezen


Obr. 3. SpotĜeba litrĤ mléka na 1 kg eidamu 30 % TVS v zimním období 204


10,8

10,6

10,4

10,2

10

duben

þerven

kvČten


þervenec

srpen

záĜí


Obr. 4. SpotĜeba litrĤ mléka na 1 kg eidamu 45 % TVS v letním období

10,8


10,6 10,4 10,2 10 9,8

Ĝíjen

listopad prosinec


leden

únor

bĜezen


Obr. 5. SpotĜeba litrĤ mléka na 1 kg eidamu 45 % TVS v zimním období

3,5

11,2 11

3,4

10,8

3,3

10,6 3,2

10,4

spotĜeba m léka (l/kg)

prosinec

listopad

Ĝíjen

záĜí

srpen

þervenec

þerven

kvČten

duben

bĜezen

3,1

únor

10,2

leden


11,4

Obsah bílkovin v %

3,6

11,6

Obsah bílkovin v m léce v %

Obr. 6. Porovnání spotĜeby mléka a obsahu bílkovin v mléce u eidamĤ 30 % TVS

205

10,6

3,5

10,4

3,4

10,2

spotĜeba mléka (l/kg)

prosinec

listopad

Ĝíjen

záĜí

srpen

þervenec

þerven

kvČten

3,2 duben

9,8 bĜezen

3,3 únor

10

Obsah bílkovin v %

3,6

leden


10,8

Obsah bílkovin v mléce v%

Obr. 7. Porovnání spotĜeby mléka a obsahu bílkovin v mléce u eidamĤ 45 % TVS

Kontaktní adresa: Ing. KvČtoslava Šustová, Ph.D., Ústav technologie potravin, Agronomická fakulta, Mendelova zemČdČlská a lesnická univerzita v BrnČ, ZemČdČlská 1, 613 00 Brno, ýeská republika, [email protected]

206

KONTINUÁLNÍ, ENZYMOVÁ PěÍPRAVA GALAKTOOLIGOSACHARIDģ S ýÁSTEýNOU OPTIMALIZACÍ DOBY ZDRŽENÍ V MEMBRÁNOVÉM REAKTORU Hellerová Klára, ýurda Ladislav Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT Praha, Continual enzymatic preparation of galactooligosaccharides with partial optimalisation of residence time in membrane reactor Summary: The galactooligosaccharides (GOS) were prepared by transgalactosylation reaction. Many factors influence this reaction, e.g. substrate concentration, enzyme origin, and temperature. Reaction can be carried out in batch or continual reactor. We used stirred batch reactor and membrane reactor with ultrafiltration membrane (150 KDa) for continuous synthesis. Lactose (584 mmol.L-1) in phosphate buffer was used as substrate. Concentration of used enzyme (Maxilact LX 5000) was 2 g.L-1. Higher yield of GOS was achieved by batch hydrolysis, in comparison with continual hydrolysis. GOS concentration was in the batch mode over 20 mmol.L-1 higher than concentration in continuous experiment under the same conditions. Due to 10 mmol.L-1 decrease of GOS after prehydrolysis in continuous experiment, it was necessary to optimize reaction conditions. We used various residence times from 35 to 75 min. In conclusion, it is evident that for stable production of GOS it is proper to use 65 min long residence time. Content of GOS in the product is in this case increased by 5 – 10 mmol.L-1.

Úvod: Galaktooligosacharidy (GOS) patĜí vedle glukooligosacharidĤ, fruktooligosacharidĤ mezi nejdĤležitČjší oligosacharidy 1. Biologicky významná je jejich prebiotická funkce. GOS tak pĜispívají k nárĤstu stĜevní mikroflory bifidobakterií a laktobacilĤ, postnatální stimulaci imunitního systému a také poskytují obranu vĤþi bakteriálním a virovým infekcím díky zabránČní pĜilnutí bakterií na epitelárním povrchu 3. Další biologickou funkcí GOS je zlepšení absorpce vápníku a hoĜþíku, pĜispívají k detoxikaci tČla, dále redukují cholesterol a zlepšují syntézu vitaminĤ skupiny B 4. Sladivost oligosacharidĤ je 0,3 – 0,6 krát nižší než sladivost sacharosy v závislosti na chemické struktuĜe a molekulové hmotnosti pĜítomných oligosacharidĤ 2.

Obr. 1. PĜíklad struktury GOS; n = poþet galaktosových jednotek 1 VyrábČjí se z laktosy, enzymovou syntézou. Tato reakce, jejíž mechanismus je znázornČn níže, mĤže probíhat jak vsádkovČ tak kontinuálnČ. enzym + laktosa Æ enzym-laktosa enzym-laktosa Æ galaktosyl-enzym + glukosa galaktosyl-enzym + akceptor Æ galaktosyl-akceptor + enzym Touto reakcí vznikají hlavnČ disacharidy, dále tri- a tetra- , vyšší oligosacharidy vznikají v mnohem menší míĜe. Vedle základní struktury GOS na obr. 1 vzniká pĜi transgalaktosylaþní

207

reakci Ĝada dalších GOS, ve kterých se galaktosa váže na glukosový zbytek nČkolika typy vazeb, hlavnČ 5: ȕ-D-Galp-(1ĺ 3)-D-Glcp ȕ-D-Galp-(1ĺ 4)-D-Glcp ȕ-D-Galp-(1ĺ 2)-D-Glcp Na glukosovém zbytku mĤže docházet rovnČž k vČtvení, molekuly galaktosy jsou obvykle spojeny vazbami (1ĺ 4) a (1ĺ 6). To jaké GOS vzniknou a v jakém množství je ovlivĖováno celou Ĝadou faktorĤ, jedná se napĜ. o: pH (lit 6), pĤvod a koncentrace enzymu, koncentrace substrátu 7. PĜi kontinuální syntéze mĤže být využito ultrafiltrace þi nanofiltrace. Materiál : Substrátem pro reakce byla laktosa (Promil, PML a.s., ýR) ve fosfátovém pufru (pH = 6,75, složení: 0,01 mol.L-1 K2HPO4 (Penta, ýR), 0,015 mol.L-1 KCl (Lachema, ýR), 0,012 mol.L-1 MgCl2 . 6 H2O (Penta, ýR)) o koncentraci 584 mmol.L-1. Koncentrace použitého kvasinkového enzymu Maxilact LX 5000 (DMS Food Specialities, Nizozemí) byla 2 g.L-1. Metodika: Vsádkový pokus Vsádková reakce probíhala v reaktoru pĜi teplotČ t = 37 ˚C, po dobu 3 hodin. Množství substrátu bylo 100 g. Vzorky byly prĤbČžnČ odebírány a následnČ inaktivovány v termostatovém bloku pĜi t = 95 ˚C po dobu 10 minut. Množství vznikajících sacharidĤ bylo analyzováno pomocí HPLC s ELS detekcí. Kontinuální pokus Kontinuální reakce probíhala na laboratorní stanici ARNO 700 s keramickou membránou o NMWCO 150 kDa. Do nerezového reaktoru se nalily 2 L substrátu, následovala temperace na 37 ˚C, poté se pĜidal enzym a reakce se nechala probíhat 45 minut. Po tomto þase se spustila filtrace a zároveĖ s tím byl do reaktoru pĜivádČn þerstvý substrát. BČhem celé doby reakce se prĤbČžnČ odebíraly vzorky, které se následnČ analyzovaly na HPLC s ELS detekcí. Optimalizace kontinuálního pokusu Metoda byla optimalizována za použití rĤzných prĤtokĤ, úpravou tlaku na stanici ARNO 700. Použité tlaky byly 0,1; 0,112; 0,14 a 0,4 MPa. K optimalizaci byly pĜipraveny 2 L laktosy v pufru, které se nechaly 15 minut pĜedhydrolyzovat za konstantní teploty t = 37 °C. Po tomto þase se spustila filtrace a zároveĖ s tím se do reaktoru zaþal pĜivádČt þerstvý substrát. Doba kontinuální reakce byla 60 minut. Vzorky byly odebírány každých 15 minut a následnČ analyzovány na HPLC. Stanovení cukrĤ pomocí HPLC na vápenaté, iontovČ – výmČnné kolonČ K 1 mL vzorku naĜedČného destilovanou vodou v pomČru 1:1 byl pĜidán 1 mL vnitĜního standardu (fruktosa c = 100 g.L-1(Penta, ýR)). Z této smČsi byly odebrány 0,2 mL, k nim bylo následnČ pĜidáno 0,1 mL destilované vody a 1,1 mL potravináĜského ethanolu. SmČs se nechala 30 minut stát pĜi laboratorní teplotČ a poté se odstĜedila pĜi 5000 min-1 . Odebral se 1 mL supernatantu, ze kterého se na termostatovém bloku odpaĜil pĜi 78 ˚C ethanol. K odparku byly pĜidány 2 mL demineralizované vody. Vzorek byl pĜed nástĜikem na kolonu pĜefiltrován pĜes mikrofiltr a kolonu Chromafix C18 na zachycení polárních látek 8.

208

Výsledky: Vsádkový a kontinuální pokus: Vsádková hydrolýza laktosy v pufru byla provedena za využití enzymu Maxilact LX 5000. Nejvyšší koncentrace vznikajících GOS 52 mmol.L-1 (viz obr. 2) bylo dosaženo po 30. minutách.

700

60

600

50

500

40

400

30

300

20

200

c2 [mmol.L-1]

c1 [mmol.L-1]

A

10

100 0 0

50

100

0 200

150

laktosa glukosa galaktosa GOS

Ĳ [min]

Obr. 2. Zastoupení sacharidĤ pĜi vsádkové hydrolýze laktosy v pufru; koncentrace enzymu 2 g.L-1, uvedené výsledky jsou prĤmČrem ze dvou stanovení C1 koncentrace glukosa, galaktosa, laktosa; C2 koncentrace GOS

600

60

500

50

400

40

300

30

200

20

100

10

0 0

50

100

150

200

Ĳ [min]

250

0 300

c2 [mmol.L-1]

c1 [mmol.L-1]

PĜi kontinuální hydrolýze laktosy v pufru o stejné koncentraci substrátu jako u vsádkového pokusu bylo získáno 30 mmol.L-1. Tato hodnota je tedy nižší než v pĜípadČ vsádkového procesu, což je v rozporu se studií 9 . Reakce probíhala za konstantního tlaku 0,22 MPa, prĤmČrný tok permeátu byl 38,8 g/ min.

laktosa glukosa galaktosa GOS

Obr. 3. Zastoupení sacharidĤ pĜi kontinuální hydrolýze laktosy v pufru (prodloužený pokus); koncentrace enzymu 2 g.L-1, pH = 6,75 C1 koncentrace glukosa, galaktosa, laktosa; C2 koncentrace GOS

209

Optimalizace doby zdržení: Jak je vidČt z obr. 3 došlo po zaþátku pĜidávání nového substrátu k naĜedČní koncentrace vzniklých oligosacharidĤ, proto bylo nutno pĜistoupit k optimalizaci stávající metodiky. Byly zkoušeny 4 rĤzné tlaky a tím tedy doby zdržení (viz obr. 4). Doby zdržení se pohybovaly od 35 do 75 minut. Doba pĜedhydrolýzy byla v tČchto experimentech zkrácena na 15 min, protože ve 45. min již zaþíná rozklad GOS a pokraþuje ještČ v první fázi pĜidávání þerstvého substrátu pĜibližnČ do 60. min, než dojde k ustálení produkce GOS. Z obr. 5 a 6, kde je znázornČno zastoupení GOS a laktosy pĜi tČchto kontinuálních pokusech, je vidČt, že nejmenší pokles koncentrace GOS byl získán pro dobu zdržení 65 minut.

60

Q [g/min]

50 40 30 20 10

55 min 65 min

0 0

10

20

30

40

50

60

75 min 35 min

Ĳ [min]

Obr. 4. Hodnoty toku permeátu pro rĤzné doby zdržení.

50

-1

c [mmol.L ]

40 30 20 10 55 min

0 0

20

40

60

80

65 min 75 min

Ĳ [min]

35 min

Obr. 5. Vliv doby zdržení na koncentraci GOS.

700 c [mmol.L-1]

600 500 400 300 200 55 min

100

65 min

0 0

20

40

60

80

Ĳ [min]

Obr. 6. Vliv doby zdržení na koncentraci laktosy. 210

75 min 35 min

ZávČr: Zkrácení doby pĜedhydrolýzy ze 45 na 15 min se pozitivnČ projevilo na koncentraci GOS v permeátu. Optimální doba zdržení se pohybuje v rozmezí 55 – 65 min. Doba zdržení 35 min je pĜíliš krátká pro enzymovou reakci, dochází proto k nárĤstu obsahu laktosy a k poklesu obsahu GOS v permeátu. Zdržení 75 min je naopak pĜíliš dlouhé – zaþíná docházet k rozkladu GOS, vedle GOS se mírnČ snižuje i koncentrace laktosy v permeátu, naopak narĤstá obsah monosacharidĤ. Výsledky ukazují, že je nutné optimalizovat též dobu pĜedhydrolýzy, respektive v kombinaci s dobou zdržení; pĜesto i provedená þásteþná optimalizace pĜinesla zvýšení obsahu GOS z pĤvodních 30 mmol.L-1 na 35 – 40 mmol.L-1. PodČkování: Práce byla podpoĜená MŠMT ýR (MSM 6046137305). Použitá literatura: 1. Velíšek J.(ed.): Chemie potravin, díl 1, kap.4, str. 182 - 196, OSSIS, Tábor 1999. 2. Crinttenden R. G., Playne M. J.: Production, properties and applications of food – grade oligosaccharides. Trends in Food Science & Technology 7, 353 – 361 (1996). 3. Kunz C., Rudloff S.: Health promoting aspects of milk oligosaccharides. International Dairy Journal 16, 1341–1346 (2006). 4. Czermak P., Ebrahimi M., Grau K., Netz S., Sawatzki G., Pfromm P.H.: Membrane-assisted enzymatic production of galactosyl-oligosaccharides from lactose in a continuous process. Journal of Membrane Science 232 , 85–91 (2004). 5. Van Laere K. M. J., Abee T., Schols H. A., Beldman G., Voragen A. G. J.: Characterization of a Novel b-Galactosidase from Bifidobacterium adolescentis DSM 20083 Active towards Transgalactooligosaccharides. Applied and enviromental microbiology 66, 1379 – 1384 (2000). 6. Mahoney R. R.: Galactosyl-oligosaccharide formation during lactose hydrolysis: a review. Food Chemistry 63, 147-154 (1998). 7. Boon M.A., Nanesen A.E.M., van ‘t Riet K.: Effect of temperature and enzyme origin on the enzymatic synthesis of oligosaccharides. Enzyme and Microbial Technology 26 , 271–281 (2000). 8. Šípalová O.(2005): Diplomová práce, Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT, Praha 9. Chockchaisawasdee S., Anthanasopoulos V. I., Niranjan K., Rastall R. A.: Synthesis of Galactooligosaccharide From Lactose Using h-Galactosidase From Kluyveromyces lactis: Studies on Batch and Continuous UF Membrane-Fitted Bioreactors. Biotechnology and Bioengineering 89, 434 – 443 (2005).

Kontaktní adresa: Hellerová Klára, Ústav technologie mléka a tukĤ, VŠCHT Praha, Technická 5, 166 28 Praha 6 e- mail: [email protected]

211

VYUŽITÍ BLÍZKÉ INFRAýERVENÉ REFLEKTANýNÍ SPEKTROSKOPIE V ANALÝZE KOZÍCH SÝRģ Draþková Michaela, Janštová Bohumíra, PĜidalová Hana, Vozková Lenka, Navrátilová Pavlína, Vorlová Lenka Ústav hygieny a technologie mléka, Fakulta veterinární hygieny a ekologie VFU Brno Use of near-infrared reflectance spectroscopy for goat’s cheese analysis Summary: The aim of this study was to determine the physical and chemical properties of goat’s cheese by nearinfrared reflectance spectroscopy. Samples (n = 81) were obtained from a Czech farm. Sampling was done after the kids have been weaned, in a period from May 2006 to July 2007 in regular time intervals. Fat content, total solids, fat in solids, NaCl content, titratable acidity, water activity and pH were analysed by reference method. Spectra were measured in the reflectance mode with a compressive cell between 10000 and 4000 cm-1, averaging 100 scans. The instrument was calibrated by partial least squares (PLS) method and cross validation was applied to avoid overfitting. The calibration models were developed using region 4081 – 8667 cm-1 and evaluated by statistical values. The best calibration models were obtained for pH (R = 0.959, SEC = 0.053; R = 0.898, SECV = 0.083), water activity (R = 0.935, SEC = 0.003; R = 0.864, SECV = 0.004) and titratable acidity (R =0.821, SEC = 3.48; R = 0.777, SECV = 3.85). The results demonstrate that near-infrared spectroscopy is a useful method to evaluate physico-chemical composition of goat’s cheese samples.

Úvod Chov koz má v ýeské republice bohatou tradici. Ke zvýšenému zájmu o chov došlo u nás zaþátkem devadesátých let minulého století. DĤvodem rostoucího zájmu o výrobky z kozího mléka je stoupající poptávka po zdravotnČ nezávadných a dietetických potravinách. K nejþastČjšímu využití kozího mléka patĜí zpracování na výrobu sýrĤ. Kozí sýry patĜící do skupiny þerstvé sýry nezrající pĜedstavují nejbČžnČjší vyrábČné sýry z kozího mléka.1,2 Sýry Ĝadíme mezi nejhodnotnČjší potraviny z pohledu svého složení. Jsou významným zdrojem bílkovin, vápníku, fosforu aj. Dále mají nízký obsah laktózy, takže sýry mohou konzumovat i lidé s intolerancí.3,4 V dnešní dobČ je tendence získat vyšší kvalitu u kontrolovaných výstupních surovin i finálních produktĤ, proto se výzkum zamČĜuje na vývoj pĜesných, rychlých a úþinných metod pro stanovení fyzikálnČ-chemických vlastností potravin.5 Metoda NIR spektroskopie umožĖuje multikomponentní analýzu rĤzných produktĤ od kapalných k pevným látkám a osvČdþila se jako metoda pro rutinní technologickou kontrolu, kde je rychlost analýzy (napĜ. kontrola meziproduktĤ) þasto dĤležitČjší než vysoká pĜesnost. Klasické analytické metody nemohou v souþasné dobČ splnit nároky na rychlost a množství provádČných rozborĤ pĜi provozní kontrole. Cílem práce bylo vytvoĜit kalibraþní modely pro stanovení fyzikálnČ-chemických parametrĤ kozích sýrĤ pomocí FT-NIR spektroskopie. Materiál a metodika Vzorky sýrĤ byly získány na farmČ v Jihomoravském kraji. Pro vytvoĜení kalibraþních modelĤ bylo odebráno 81 vzorkĤ pĜírodních nezrajících kozích sýrĤ. OdbČr vzorkĤ byl realizován po odstavu kĤzlat v období kvČten 2006 až þervenec 2007 v pravidelných þasových intervalech. Na farmČ bylo chováno 75 koz plemene Bílá krátkosrstá koza na 1. až 8. laktaci, prĤmČrná denní dojivost byla 2-3 l mléka, prĤmČrná roþní dojivost 600-800 l mléka. V období od poloviny kvČtna do poloviny listopadu byla kozám k dispozici pastva. Krmná dávka byly doplnČna 0,5 kg sena, maximálnČ 1 kg jádra, vitaminovou minerální smČsí a solí k lizu. V zimním období krmná dávka zahrnující 3 kg travní senáže, 1 kg cukrovkové siláže, 1 kg sena a maximálnČ 1 kg jádra, vitaminovou minerální smČs a sĤl k lizu. Dojení bylo provádČno strojnČ 2x dennČ. Ve vzorcích byly stanoveny obsah tuku, tuk v sušinČ, sušina, titraþní kyselost, pH (ýSN 570107, 1965)6 a obsah NaCl (ýSN 570107-þást 12, 1980)7. Aktivita vody byla stanovena pomocí aw-metru Thermoconstanter TH 200 (Novasina, Švýcarsko). 212

Vzorky byly pĜed stanovením homogenizovány nastrouháním. Vzorky sýrĤ byly promČĜeny na spektrometru NIR Nicolet Antaris (Thermo electron Corporation, Madison, USA) ve spektrálním rozsahu 10000 – 4000 cm-1 se 100 scany. ýas snímání jednoho spektra se pohyboval okolo 1,5 min. Spektra byla mČĜena na integraþní sféĜe v režimu reflektance s kompresní kyvetou. NamČĜená data byla zpracována pomocí programu TQ Analyst verze 6.2.1.509 (Thermo Elektron Corporation, Madison, USA) metodou PLS (þásteþných nejmenších þtvercĤ). Stejné vzorky byly použity pro kĜížovou validaci. Výsledky byly vyhodnoceny pomocí statistického a grafického softwaru STAT Plus. Pro srovnání hodnot namČĜených pomocí FT-NIR s hodnotami zjištČnými v laboratoĜi byl použit párový T-test.8 Signature: Not signed 1,7 1,6 1,5 1,4

Absorbance

1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 10000

9000

8000

7000

6000

5000

Wavenumbers (cm-1)

Obr. 1. PrĤmČrné spektrum vzorku kozího sýru Výsledky a diskuse Obrázek 1 zobrazuje prĤmČrné spektrum vzorku kozího sýru. V tabulce I jsou uvedeny referenþní hodnoty sledovaných parametrĤ, jejichž rozpČtí jsou vyjádĜena jako smČrodatné odchylky prĤmČru. Hodnocení kalibraþních modelĤ bylo provedeno na základČ posouzení smČrodatné odchylky kalibrace (SEC), smČrodatné odchylky validace (SECV) a korelaþních koeficientĤ (R) (tabulka II). Tabulka I Referenþní hodnoty x parametr n min max SD Tuk (%) 80 24,47 19,86 30,83 2,64 Sušina (%) 81 47,35 44,08 67,07 3,56 Tuk v sušinČ (%) 80 51,83 31,64 63,76 5,72 NaCl (%) 76 1,93 1,06 2,78 0,47 Titraþní kyselost (ºSH) 76 96,4 83,0 107,5 5,3 Aktivita vody 75 0,974 0,934 0,990 0,012 pH 81 4,90 4,66 5,68 0,18 n – poþet vzorkĤ, x - prĤmČr, min a max – minimální a maximální hodnota, SD – smČrodatná odchylka Kalibraþní modely pro všechny sledované parametry byly vytvoĜeny pomocí PLS algoritmu a metoda byla ovČĜena pomocí cross validace. DobĜe fungující model by nemČl mít více jak 15 PLS faktorĤ.9 Uvedení autoĜi získali PLS faktory pro: sušinu 5, pH 4, SH 6, NaCl 10 a tuk 4. V naší práci jsem získali obdobné výsledky (tabulka II). Kalibraþní modely byly získány bez derivace spekter s výjimkou parametrĤ sušiny a pH, kde byla použita 1. derivace (tabulka II).

213

Tabulka II Kalibraþní a validaþní výsledky parametr

kalibrace

derivace

PLS faktory

R

SEC

1 1

7 5 6 7 3 12 5

0,773 0,751 0,751 0,879 0,821 0,935 0,959

1,66 0,861 3,19 0,224 3,48 0,003 0,053

Tuk (%) Sušina (%) Tuk v sušinČ (%) NaCl (%) Titraþní kyselost (ºSH) Aktivita vody pH

validace CCV (%) 6,78 1,84 6,11 11,58 3,57 0,293 1,07

R

SECV

0,681 0,633 0,668 0,826 0,777 0,864 0,898

1,94 1,03 3,63 0,267 3,85 0,004 0,083

PCV (%) 7,92 2,21 6,96 13,81 3,95 0,422 1,68

R – korelaþní koeficient, SEC – smČrodatná odchylka kalibrace, SECV – smČrodatná odchylka validace, CCV – kalibraþní variaþní koeficient, PCV – predikþní variaþní koeficient

Nejlepší kalibraþní modely byly získány pro pH (R = 0,959, SEC = 0,053; R = 0,898, SECV = 0,083), aktivitu vody (R = 0,935, SEC = 0,003; R = 0,864, SECV = 0,004) a titraþní kyselost (R =0,821, SEC = 3,48; R = 0,777, SECV = 3,85) (graf 1-3). Využití FT-NIR pro stanovení jakostních ukazatelĤ þerstvých kozích sýrĤ využili i další 9 autoĜi, kteĜí dosáhli nejlepší výsledky pro titraþní kyselost (R = 0,951, SEC = 0,849, R 0,901, SECV = 1,12).

predikované hodnoty

5,3

y = 0,9249x + 0,3734 R = 0,9594

5,2 5,1 5,0 4,9

y = 0,8746x + 0,6221 R = 0,8984

4,8 4,7 4,6 4,7

4,8

4,9

5,0

5,1

5,2

5,3

laboratorní hodnoty kalibrace

validace

kalibrace

validace

Graf. 1. Kalibraþní a validaþní model pro pH

predikované hodnoty

0,995

y = 0,8665x + 0,1303 R = 0,9353

0,990 0,985 0,980 0,975 0,970 0,965

y = 0,8266x + 0,1693 R = 0,8639

0,960 0,955 0,955

0,960

0,965

0,970

0,975

0,980

0,985

0,990

0,995

laboratorní hodnoty kalibrace

validace

kalibrace

validace

Graf. 2. Kalibraþní a validaþní model pro aktivitu vody 214

predikované hodnoty (SH)

110

y = 0,6735x + 31,85 R = 0,8212

105 100 95 90

y = 0,645x + 34,596 R = 0,7775

85 80 80

85

90

95

100

105

110

laboratorní hodnoty (SH) kalibrace

validace

kalibrace

validace

Graf. 3. Kalibraþní a validaþní model pro titraþní kyselost

predikované hodnoty (%)

U modelu pro obsah NaCl byly získány výsledky pro kalibraci R = 0,879 a SEC = 0,224, pro validaci R = 0,826 a SECV = 0,267 (graf 4). Tento model byl podle posouzení parametrĤ CCV a PCV mimo rozsah spolehlivé kalibrace. Obdobné výsledky pro obsah soli v kozích sýrech získali i jiní autoĜi.9 Obsah soli byl také sledován modifikovanou PLS metodou.11 Uvedení autoĜi se zamČĜili na rĤznou úpravou spekter a výbČr regionĤ o rozdílné vlnové délce. Pro obsah soli získali R = 0,90 a SECV = 0,26 v rozsahu 1100 – 2500 nm a korekci na rozptyl. Námi zjištČné výsledky byly statisticky zhodnoceny pomocí programu STAT Plus.8 Mezi referenþními hodnotami a vypoþítanými hodnotami pomocí FT-NIR nebyly nalezeny statisticky významné rozdíly (p = 0,05). 3,0

y = 0,7718x + 0,4416 R = 0,8794

2,5 2,0 y = 0,7318x + 0,5245 R = 0,8260

1,5 1,0 1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

laboratorní hodnoty (%) kalibrace

validace

kalibrace

validace

Graf. 4. Kalibraþní a validaþní model pro NaCl ZávČr Byly vytvoĜeny kalibraþní modely pro stanovení obsahu tuku, sušiny, tuku v sušinČ, obsahu NaCl, titraþní kyselost, aktivitu vody a pH. Tyto modely byly ovČĜeny pomocí kĜížové validace a posouzeny na základČ korelaþních koeficientĤ (R) kalibrace a validace mezi referenþními a predikovanými hodnotami, a také na základČ smČrodatných odchylek kalibrace (SEC) a validace (SECV). Dalším kritériem pro zhodnocení použitelnosti byly kalibraþní variaþní koeficient (CCV) a predikþní variaþní koeficient (PCV). Pro sledované parametry obsah sušiny, aktivita vody, titraþní kyselost a pH byly vytvoĜeny velmi spolehlivé kalibraþní modely. Pro parametry obsah tuku a tuk v sušinČ byly modely spolehlivé. Model pro obsah NaCl byl mimo rozsah spolehlivé kalibrace. Výsledky ukazují, že blízká infraþervená reflektanþní spektroskopie pĜedstavuje vhodnou metodu pro vyhodnocení fyzikálnČ-chemického složení kozích sýrĤ. 215

PodČkování: Práce vznikla za podpory výzkumného zámČru MSM6215712402 Veterinární aspekty bezpeþnosti a kvality potravin. Použitá literatura: 1. Vyhláška Ministerstva zemČdČlství þ. 77/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro mléko a mléþné výrobky, mražené krémy a jedlé tuky a oleje. Sbírka zákonĤ, 2003, þástka 32, s. 2488-2516. 2. FANTOVÁ, M. A KOL. Chov koz. 1. vyd. Praha: Nakladatelství Brázda, s. r. o., 2000. 192 s. 3. KOPÁýEK, J. Jak vhodnČ komunikovat na téma sýr? (1. þást). PotravináĜský Revue, 2005, þ. 3, s. 2932. 4. KOPÁýEK, J. Jak vhodnČ komunikovat na téma sýr? (2. þást). PotravináĜský Revue, 2005, þ. 4, s. 2326. 5. BLAZQUEZ, C., DOWNEY, G., O'DONNELL, C., O'CALLAGHAN, D., HOWARD, V. Prediction of moisture, fat and inorganic salts in processed cheese by near infrared reflectance spectroscopy and multivariate data analysis. J. Near Infrared Spectrosc., 2004, vol. 12, no. 3, p. 149-157. 6. ýSN 570107. Metody zkoušení sýrĤ, tvarohĤ, krémĤ a pomazánek. Vydal ÚĜad pro normalizaci a mČĜení, Praha, 1965, s. 28. 7. ýSN 570107, þást 12. Metody zkoušení pĜírodních a tavených sýrĤ. Stanovení obsahu chloridu sodného. Vydal ÚĜad pro normalizaci a mČĜení, Praha, 1980, s.4. 8. MATOUŠKOVÁ, O., CHALUPA, J., CÍGLER, M., HRUŠKA, K. STAT-Plus uživatelská pĜíruþka, verse 1.01., 1992. Veterinary Research institute, Brno, CR., s. 168. 9. LUŽOVÁ, R., ŠUSTOVÁ, K., HORÁKOVÁ, R. Stanovení jakostních ukazatelĤ þerstvých kozích sýrĤ pomocí NIR spektroskopie. Mléko a sýry 2007, 2007, s. 195-197. 10. ALBANELL, E. CÁCERES P., CAJA G., MOLINA E., GARGOURI A. Determination of fat, protein and total solids in ovine milk by near-infrared spectroscopy. J. AOAC Int., 1999, vol. 82, p. 753-758. 11. BLAZQUEZ, C., DOWNEY, G., O’DONNELL, C., O’CALLAGHAN, D., HOWARD, V. Prediction of moisture, fat and inorganic salts in processed cheese by near infrared reflectance spectroscopy and multivariate data analysis. J. Near Infrared Spectrosc., 2004, vol. 12, p. 149-157.

Kontaktní adresa: MVDr. Michaela Draþková, Ph.D., Ústav hygieny a technologie mléka, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Palackého 1/3, 612 42 Brno, e-mail: [email protected]

216

STANOVENÍ VITAMÍNU B2 V MLÉCE Nohálová Zuzana, KramáĜová Daniela, Lazárková Zuzana, Hoza Ignác Univerzita Tomáše Bati ve ZlínČ, Fakulta technologická, Ústav potravináĜského inženýrství Determination of vitamin B2 in milk Summary: Riboflavin is a water soluble vitamin forming yellow solution in aqueous solution. Considering its photolability, it is necessary to perform the isolating procedure in the absence of light to avoid its conversion to lumiflavine which is biologically inactive. In natural material is usually bound as a part of flavine cofactors participating in many metabolic pathways. These cofactors are important for saccharide, lipid and amino acid metabolisms. Human body converts riboflavine into FAD serving as a coenzyme for glutathionreductase and other enzymes. Glutathionreductase enables reduction of glutathione which plays an essential role in protection of organisms from reactive oxygen. Milk sample was hydrolyzed with HCl and proteins were precipitated with TCA. Subsequently, the sample was quantitatively transferred into volumetric flask, filtered and applied to column under the following conditions: inject volume 20 μl, column SUPELCOSIL - LC8 (15 cm x 4,6 mm; 5 ȝm), temperature 30°C, mobile phase methanol:CH3COONa with the flow 0,8 ml.min-1, gradient elution. Analysis was performed using chromatographic equipment Hewlett Packard 1100 with UV detection at 270 nm.

Úvod Vitamín B2 (riboflavin) se Ĝadí do skupiny vitamínĤ B, kterou nazýváme B-komplex. Jde o vitamín rozpustný ve vodČ, který se vyskytuje v mnoha potravinách živoþišného a rostlinného pĤvodu. Riboflavin byl poprvé objeven v mléce. Jde o žlutozelenou krystalickou látku, jejíž vodné roztoky mají schopnost fluorescence. V biochemických systémech se vyskytuje ve formČ koenzymĤ, flavinmononukleotidu (FMN) a flavinadenindinukleotidu (FAD)1,2. Podporuje uvolĖování energie, dobrou kondici a vitalitu, rĤst a plodnost. Dále je dĤležitý pro metabolismu cukrĤ, tukĤ a aminokyselin. Jako souþást enzymĤ v dýchacím ĜetČzci je nezbytný pro základní bunČþný metabolismus. SpoleþnČ s vitaminem A zlepšuje vidČní za šera. Riboflavin se varem neniþí, ale rozkládá se pĤsobením svČtla. UV paprsky riboflavin rozkládají za vzniku lumichromu (kyselé nebo neutrální pH) nebo lumiflavinu (zásadité pH). V neutrálních a slabČ kyselých roztocích je prakticky stálý, je odolný vĤþi vysoké teplotČ i atmosférickému kyslíku. V alkalickém prostĜedí je labilní a rozkládá se na fyziologicky neúþinné rozkladné produkty1,3,4. PĜíznaky nedostatku vitamínu B2 jsou popraskané rty v koutcích úst, zánČty sliznice jazyka, bolesti a tlak v oþích, oþní zákal, bolesti hlavy, olupování pokožky v obliþeji, poruchy chrupu, chudokrevnost a poruchy srdce. K nejlepším zdrojĤm vitamínu B2 patĜí játra, mléko a mléþné výrobky, ryby a vejce, pivovarské kvasnice a v menší míĜe obilná zrna5,6. Denní doporuþená dávka je pro prĤmČrnČ fyzicky pracující osobu 1,7 mg.den-1 a pro dČti 1 mg.den-1. Mléko obsahuje živiny potĜebné pro rostoucí organismus dítČte a mladého þlovČka i látky potĜebné pro výživu v dospČlosti. Význam kravského mléka spoþívá pĜedevším v obsahu hodnotných bílkovin (3,2 %). Obsahuje tuk, který je velmi lehce stravitelný, mléþný cukr laktózu (4,6 %), která má nejen energetickou hodnotu, ale též pĜíznivČ podporuje þinnost nČkterých stĜevních mikroorganismĤ a tím i využitelnost nČkterých živin. Mléko je naším hlavním zdrojem vápníku, který je zde velmi dobĜe využitelný, dále obsahuje fosfor, draslík, hoĜþík, sodík, chlór, síru i Ĝadu stopových prvkĤ. Mléko má velmi málo železa, proto dlouhodobá výhradnČ mléþná strava by vedla vždy k chudokrevnosti. Mléko obsahuje i Ĝadu vitamínĤ jako B2 nebo A (i provitamín karoten), vitamín B1, B6, E, K i malé množství vitamínu D a C. Jejich obsah závisí na zpĤsobu krmení dojnic a zpĤsobu jejich života. Kozí mléko nemĤže konkurovat kravskému a produkuje se prakticky výhradnČ v rámci malochovu pro domácí spotĜebu þi pĜímý prodej. Mezi dva hlavní dĤvody patĜí vyšší produkþní schopnost krav a fakt, že kvalita kozího mléka více závisí na kvalitČ krmiva, než je tomu u mléka kravského. Koza má totiž vČtší tendenci pĜevádČt do svého mléka jedy a choroboplodné organismy, které se do ní dostanou (byly zaznamenány otravy z kozího mléka, která sežrala Rulík zlomocný) apod. V podstatČ totéž by se dalo Ĝíci o mléku ovþím. Ovþí mléko

217

obsahuje v prĤmČru 6 % tuku a sacharidĤ kolem 5,1 %. NicménČ, ovþí mléko je obzvláštČ výborným zdrojem proteinĤ (cca 5,4 %)4,6. Cílem naší práce bylo stanovit obsah vitaminu B2 syrovém mléce krav, ovcí a koz a vzájemnČ toto množství porovnat. Pro vlastní stanovení obsahu riboflavinu byla zvolena chromatografická separaþní technika HPLC (High Performance Liquid Chromatography) s UV detekcí. Materiál a metody Základním principem všech chromatografických metod je opakované ustalování rovnováhy rozpuštČné látky mezi dvČma fázemi, z nichž jedna je pohyblivá (mobilní) a druhá zakotvená (stacionární). HPLC neboli vysoce úþinná kapalinová chromatografie má stacionární fázi polární a mobilní fázi nepolární. U reverzní HPLC neboli RP-HPLC, která se používá pro stanovení vitamínu B2, je tomu právČ naopak, mobilní fáze je polární a stacionární fáze je nepolární. HPLC HP 1100 na pracovišti UPI, UTB ve ZlínČ je sestaven ze zásobníkĤ mobilní fáze, degaseru, pump, vstĜikovacího ventilu, termostatované kolony a detektoru. ObecnČ se nejþastČji používají dva zpĤsoby dávkování mobilní fáze: gradientovČ, tj. s mČnícím se vzájemným pomČrem mobilních fází a izokraticky, tj. po celou dobu analýzy je složení mobilní fáze stejné. Pro stanovení vitamínu B2 v mléce bylo použito gradientové eluce mobilních fází: methanolu a 0,12 M CH3COONa. Pro detekci je používán detektor s UV detekcí. Riboflavin byl stanovován v ovþím, kozím a kravském syrovém mléce. Vzorky byly odebrány do tmavých lahví na soukromé farmČ, byly uloženy v lednici pĜi teplotČ 6-8°C a druhý den analyzovány. Pro stanovení riboflavinu v mléce bylo použito metody RP-HPLC s UV detekcí. Nejprve bylo nutno riboflavin z mléka izolovat. Vzorek mléka byl zhomogenizován a poté bylo odebráno 20 ml k vlastnímu stanovení. Vzorek mléka byl odpipetován do 250 ml erlenmayerovy baĖky, která byla obalena hliníkovou folií. PostupnČ bylo ke vzorku pĜidáno 80 ml 0,2 mol.l-1 HCl. Poté byl vzorek zahĜíván 60 minut ve vodní lázni o teplotČ 97°C. V 50 minutČ byl pĜidán 1 ml 60% TCA a v 60 minutČ taktéž. Po ochlazení byl obsah erlenmayerovy baĖky kvantitativnČ pĜeveden do 100 ml odmČrné baĖky a ta byla doplnČna redestilovanou vodou po znaþku. Celý obsah byl zfiltrován dvoustupĖovČ. Po celou dobu stanovení byl vzorek chránČn pĜed svČtlem, protože vitamin B2 je fotolabilní. Chromatografické podmínky pro následnou separaci vzorku byly následující: pĜíprava vzorku: filtrace (0,45 Pm, nylon) objem dávkovací smyþky: 20 Pl kolona: Supelcosil LC-8, 15 x 4,6 mm, 5 ȝm mobilní fáze: methanol : 0,12 mol.l-1 CH3COONa, gradientová eluce prĤtok mobilní fáze: 0,8 ml.min-1 teplota kolony: 30°C detektor: UV (270 nm) retenþní þas: 9,6 min Výsledky a diskuse Každý vzorek mléka byl mČĜen pČtkrát, poté byla vypoþítána prĤmČrná plocha píkĤ z pČti stanovení a z této prĤmČrné plochy píkĤ byla dle kalibraþní kĜivky vypoþítána koncentrace vitamínu B2 v jednotlivých vzorcích mléka. Kalibraþní kĜivka byla sestrojena jako závislost plochy píku na koncentraci riboflavinu (ȝg.ml-1). Kalibraþní Ĝada byla sestrojena v koncentracích 0,5; 1,0; 1,5 a 2 ȝg.ml-1). Výsledky byly zpracovány na hladinČ významnosti 0,05.

218

140

plocha píku [mA.V.s -1]

120

100

80

y = 54,323x + 4,0756 R2 = 0,9901

60

40

20

0 0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

-1

koncentrace [ȝg.m l ]

Obr. 1. Kalibraþní kĜivka s regresní rovnicí pro stanovení riboflavinu metodou HPLC Tabulka I Výsledky mČĜení stanovení riboflavinu v mléce kravském, kozím a ovþím. PrĤmČrná plocha píkĤ Obsah riboflavinu Název vzorku -1 mA.V.s (μg.100ml-1) kravské mléko 19,40 5,66 kozí mléko 38,82 12,54 ovþí mléko 12,70 3,18

riboflavin

Obr. 2. Chromatogram: stanovení riboflavinu v kravském mléce Jak je na první pohled z Tabulky I patrné, nejvyšší obsah riboflavinu byl v mléce kozím, pak kravském a nejnižší v mléce ovþím. Vzhledem k tomu, že u koz se jedná o chov volný, nikoliv stájový, je jasné, že vyšší hladina riboflavinu je ovlivnČna stravou. Bohužel toto se nepotvrdilo z hlediska stanovení riboflavinu u ovþího mléka. Literatura3,4 udává obecnČ vyšší množství riboflavinu u mléka kravského, než bylo námi namČĜeno. Toto mĤže být ovlivnČno charakterem stravy a sezónními podmínkami u chovu skotu. 219

ZávČr Pomocí RP-HPLC bylo stanoveno množství riboflavinu v mléce kravském (5,66 μg.100 ml-1), kozím (12,54 μg.100 ml-1) a ovþím (3,18 μg.100 ml-1). Jak je patrno z tabulky I., nejvyšší obsah riboflavinu a tudíž i nejlepším zdrojem riboflavinu z testovaných vzorkĤ je mléko kozí, kde je v porovnání s mlékem kravským až dvojnásobek vitaminu B2. Literatura 1. HLÚBIK, P., OPLTOVÁ, L. Vitaminy. 1. vydání. Praha: Grada Publishing, 2004 2. VELÍŠEK, J. Chemie potravin 2. VŠCHT Praha, Tábor: OSSIS, 1999 3. HENRY, C.J.K., CHAPMAN, C. Nutrition Handbood for Food Processors. Woodhead Publishimg, 2002. 416 p. ISBN 1-85573-665-9 4. CABALLERO, B., ALLEN, L. Encyclopedia of Human Nutriton. Oxford, UK: Elsevier, 2005 5. RYLEY, J., KAJDA, P. Vitamins in thermal processing, Food Chemistry, 1994, vol. 49, p.119-129 6. JAKOBSEN, J. Optimisation of the determination of thiamin, 2-(1-hydroxyethyl)thiamin, and riboflavin in food samples by use of HPLC. Food chemistry, 2008, vol. 106, p.1209-1217

Kontaktní adresa Ing. Daniela KramáĜová, Ústav potravináĜského inženýrství, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve ZlínČ, nám. T.G.Masaryka 275, 762 72 Zlín; email: [email protected]

220

SEPARACE LAKTOFERINU ZA VYUŽITÍ MONOLITICKÉ KOLONY S NÁSLEDNOU SPEKTROFOTOMETRICKOU DETEKCÍ 1 Horna Aleš , Zítka OndĜej2, Adam VojtČch2,3, Zeman Ladislav3, Doležal Petr3, Kizek René2 1 Ústav potravináĜského inženýrství, Univerzita Tomáše Bati ve ZlínČ, 2Ústav chemie a biochemie, a 3 Ústav výživy zvíĜat a pícnináĜství, Mendelova zemČdČlská a lesnická univerzita v BrnČ Separation of lactoferrin by using of monolithic column coupled with spectrometric detection Summary: Lactoferrin is a glycoprotein with iron-binding properties. It is consisted of about 700 aminoacid residues. Its molecular weight is of about 77 000 Da. Owing to its iron-binding properties, lactoferrin is thought to play a role in iron uptake by the intestinal mucosa of the suckling neonate. Thus it appears to be the source of iron for breast-fed infants. It also appears to have antibacterial, antiviral, antifungal, anti-inflammatory, antioxidant and immunomodulatory activities. The main aim of this work was to suggest a method to distinguish structure of lactoferrin easily and with low demanding on instruments and costs and to determine this protein in colostrum. As structural distinguishing method we used flow injection analysis with electrochemical detection (FIA-ED). Based on the results obtained it can be concluded that electrochemical analysis enables to distinguish a change of protein structure easily and rapidly. For separation of lactoferrin from colostrum samples monolithic column and pH and ionic gradient was used. The lactoferrin separated was consequently measured by optimized UV-VIS spectrometry at 280 nm. The content of lactoferrin in colostrum samples varied from subunits to unit of gram per litre.

Protein laktoferin, jiným názvem laktotransferin, byl objeven v roce 1939 v kravském mléce. Jméno proteinu je odvozeno od jeho nejvýznamnČjší biologické role a tou je schopnost vázat ionty železa. Až v roce 1960 byl laktoferin izolován z lidského mléka. Relativní molekulová hmotnost laktoferinu je podobná dalším železo vázajícím proteinĤm a experimentálnČ byla urþena jako 74 817 u buvola a 76 165 u þlovČka. Bylo zjištČno, že laktoferin je glykoprotein složený z konzervativního poþtu aminokyselin (691 þlovČk a 685 prase). NejménČ obsahují laktoferiny methioninu (okolo 0.6 %), histidinu (okolo 1.3 %) a trpytofanu (okolo 1.5 %). Nejvyšší zastoupení má alanin okolo 10 %, leucin okolo 9 % a glycin kolem 7 %. Porovnání aminokyselinového složení u lidského laktofeinu je ukázáno na obrázku 1. Hololaktoferin (protein bez navázaného kovu) je formován z jednoho lineárního polypeptidového ĜetČzce vytváĜející dvČ kulovité domény. Každá z tČchto domén obsahuje vazebné místo pro železo. 10

Aminokyselinové složení (%)

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Ala ArgAsnAspCys Gln Glu Gly His Ile LeuLys MetPhe Pro Ser Thr Trp Tyr Val

Obr. 1. Aminokyselinové složení lidského laktoferinu. Upraveno podle expasy.ch.

221

Mezi doposud známé biologické funkce laktoferinu patĜí udržování stálé a rovnomČrné hladiny železa v organismu. Vlastní Ĝízení této rovnováhy železa se odehrává pĜevážnČ v tenkém stĜevČ, kde je železo pĜijímáno z potravy. Bylo objeveno, že kromČ iontĤ železa je laktoferin schopný do stejného místa vázat i další kovy, ale s nižší silou. Význam této vazby je však stále nejasný. Vedle tak životnČ dĤležité funkce laktoferinu, jako je chránit a udržovat koncentraci železa, bylo studováno, že pĜítomnost laktoferinu ve stĜevech ovlivĖuje také druhové zastoupení bakterií. A nejen to, je dokonce schopen výrazným zpĤsobem chránit stĜeva pĜed pĤsobením nebezpeþných choroboplodných bakterií. A navíc byl pozorován zajímavý vztah k Ĝízení bunČþného rĤstu, diferenciaci bunČk a protizánČtlivé aktivitČ. Všechna tato fakta ukazují na možný vztah laktoferinu ke zhoubným nádorĤm a procesu nebezpeþného rozšiĜování nemoci (metastazování). NáslednČ se také ukázal velmi významným železo vázajícím proteinem dalších exokrinních sekretĤ, jako jsou žluþ, pankreatická šĢáva a stĜevní sekrety. V krevní plazmČ je laktoferin pravdČpodobnČ syntetizován bílými krvinkami (leukocyty). Nejvyšší hladina až 7 g/l je pozorována v prvotním mléce (kolostru). V mléce se v prĤbČhu tvorby mléka sníží jeho koncentrace oproti kolostru pĜibližnČ asi desetkrát. Dále ho mĤžeme v nižším množství najít v slzách, nosních tekutinách, slinách a sekretech pohlavních orgánĤ. I pĜesto, že byl laktoferin objeven i v dalších lidských sekretech, jeho nejvýznamnČjším zdrojem je mléko. Je ovšem známo, že mnoho lidí není schopno mléko pít, což souvisí se schopností rozštČpit mléþný cukr. Tito lidé však pĜichází o významný zdroj biologicky velmi dobĜe dostupného železa. Takový problém u malých dČtí mĤže pomoci vyĜešit genové inženýrství. Jedním z velmi slibných produktĤ tohoto biotechnologického odvČtví je rýže, která produkuje lidský laktoferin. Rekombinantní protein se zĜejmČ nejdĜíve stane souþástí mléþných pĜípravkĤ pro pĜedþasnČ narozené dČti. Brzké využití se pĜedpokládá také u dČtí od HIV pozitivních matek, kterým SvČtová zdravotnická organizace nedoporuþuje kojit. Zjistilo se, že laktoferin má u zvíĜat výrazný protivirový, protibakteriální, protiplísĖový a protizánČtlivý úþinek. PĜi podání laktoferinu telatĤm bylo pozorováno výrazné zlepšení jejich zdravotního stavu. Je však potĜebné zajistit, aby podávaný protein byl v jeho pĜirozené struktuĜe. Všechny pozitivní úþinky a vlastnosti proteinu laktoferinu jsou podmínČny jeho biologicky aktivní strukturou. Pokud pĜi pĜípravČ mléka þi mléþných výrobkĤ dojde ke zmČnČ jeho struktury, ztrácí vČtšinu biologicky významných vlastností. Materiály a metody: Standard laktoferinu (DMW) byl získán od NATURA ingredients (Holandsko). Všechny ostatní použité chemikálie byly od Sigma-Aldrich (USA). Zásobní roztok standardu laktoferinu (1 mg/ml) byl pĜipraven rozpuštČním v pracovním fosfátovém pufru (5 mM, pH = 7,25) a skladován ve tmČ pĜi 4 °C. Izolace laktoferinu Vzorky kravského kolostra byly skladovány pĜi -20 °C a po rozmražení byly zamíchány a z homogenního roztoku bylo odebráno 100 ȝl a zĜedČno 10 × do pracovního fosfátového pufru. NáslednČ byly vzorky 30 sekund míchány a centrifugovány pĜi 14 000 rpm po dobu 20ti minut (Hettich, NČmecko). Byl odebrán supernatant a ten filtrován pĜes 0,45 ȝm filtr. Získaný vzorek byl následnČ 10 × zĜedČn pracovním fosfátovým pufrem. PĜipravený vzorek o objemu 1 ml byl dávkován do separaþního systému jenž byl sestaven z peristaltické pumpy Minipuls 3 (Gilson, Francie), katexového CIM disk v monolitické kolonČ (BIA separations, Slovinsko) a UV/VISdetektorem (ESA, USA). Vzorek byl dávkován kontinuálnČ peristaltickou pumpou od 0 do 1 minuty, následnČ po dobu od 1 do 21 minuty probíhalo promývání separaþního disku. Proteiny s nižším pI než 7,25 zaþaly být vymývány pĜi prĤtoku 0,75 ml/min. Laktoferin tak byl zkoncentrován na disku. Od 21. minuty byl prĤtok snížen na 0,25 ml/min a probíhala eluce pomocí 1,5 M NaCl v 5 mM fosfátovém pufru. Po 35 minutách byla separace laktoferinu z kolostra ukonþena. Získané chromatogramy byly vyhodnoceny pomocí programu Clarity Data Apex.

222

Separace laktoferinu na SDS-PAGE Laktoferin byl ĜedČn v pracovním fosfátovém pufru, hmotnostní marker (Biorad) a vzorky byly nanášeny do jamek v gelu (PLB s pĜídavkem 2-mercaptoethanolu). Vertikální elektroforéza SDS-PAGE byla dodána firmou Biometra (NČmecko). Elektroforetické podmínky byly následující: 120 V v prĤbČhu 5 hodin (systém byl chlazen tekoucí vodou). Separace probíhala na 12.5% polyakrylamidovém gelu pĜipraveném podle standardního protokolu. Po separaci byl gel barven coomassie blue.

Schéma separaþního system CIM disk sSO3 skupinami

UV detektor

Peristaltická pumpa vzorek

výstup

Data

Obr. 2. Zjednodušené schéma postupu izolace laktoferinu z kravského kolostra. Výsledky a diskuze Detekce laktoferinu probíhala pomocí UV/VIS detektoru spojeného on-line s vyhodnocovacím programem. Byla snímána vlnová délka 280 nm, která je vhodná pro urþování koncentrace proteinĤ. PĜi aplikaci známých koncentrací laktoferinu v mobilní fázi byla za pomoci detektoru získána striktnČ lineární závislost (R2 0.9985). Minimální pozorované množství laktoferinu se pohybovalo okolo 20 ng/ml. Je známo, že izolace proteinĤ z kolostra je pomČrnČ obtížná. V našem pĜípadČ nejdĜíve probČhlo odstranČní tukĤ pomocí intenzivní centrifugace. Získaný vzorek byl dále ĜedČn v pracovním fosfátovém pufru tak, aby koncentrace majoritních proteinĤ (kaseiny, globuliny) byla výraznČ snížena. laktoferin

100 Pg

50 Pg

50 AU

10 Pg 5 Pg 1 Pg tok mobilní fáze

Obr. 3. UV/VIS chromatografický záznam laktoferinu eluovaného z monolitické kolony. 223

Takto upravený vzorek byl separován za využití novČ zavádČných technik monolitických kolon. Separace proteinĤ na CIM disku obsahujícího –SO3 skupiny probíhala na základČ zmČny náboje proteinĤ pĜi rĤzném pH a iontové síle. Jak je známo pI (isoelektrický bod) je hodnota pH, pĜi které je molekula peptidu nebo proteinu elektricky neutrální. Pokud je však hodnota pH vyšší než je pI proteinu, má protein celkový záporný náboj. kDa 250 150 100 75 50 37

25 20

15

Laktoferin 500 ng

Ladder

Mléko

Obr. 4. SDS-PAGE izolovaného laktoferinu a vzorku ĜedČného mléka.

1.2

Množství laktoferinu (g/l)

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0 1

6

12

24

36

48

60

72

ýas odbČru (h)

Obr. 5. ZmČna množství laktoferinu ve vzorcích kravského kolostra odebíráno ihned po otelení.

224

Tohoto efektu je využito pĜi kationtovČ výmČnné chromatografii na monolitické kolonČ. Další výhodou samotného monolitického disku je vysoká poréznost a tedy pomČrnČ nízký pracovní tlak, kterému je kolona i látky v ní vystaveny. Laktoferin v koncentraci 100 μg/ml byl nanesen na monolitickou kolonu v pracovním 5 mM fosfátovém pufru. Nízká iontová síla a fyzikálnČ-chemické vlastnosti laktoferinu vedly k jeho zadržení na monolitické kolonČ. V pĜípadČ, že byla iontová síla zvyšována (od 1 M NaCl), docházelo k uvolnČní laktoferinu do mobilní fáze. Navíc se ukázalo, že v promývacím kroku je výhodnČjší vyšší rychlost toku mobilní fáze v porovnání s vymýváním, kde je výhodnČjší snížení rychlosti mobilní fáze. Laktoferin je z monolitické kolony uvolĖován kvantitativnČ a velmi selektivnČ (Obr. 3). CelkovČ jde o velmi šetrný zpĤsob separace. Tento fakt byl potvrzen i v pĜípadČ, že jednotlivé odebrané frakce byly naneseny na polyakrylamidový gel. Po optimalizování parametrĤ separace bylo možné separovat laktoferin z reálného vzorku kravského kolostra. Vzorek mléka byl odebírán v prĤbČhu 72 h po porodu. PrĤmČrná koncentrace laktoferinu se pohybovala kolem 0.6 g/l. Ve sledovaných vzorcích byl pozorovatelný postupný vzestup hladiny laktoferinu do 24 h. Poté se hodnota laktoferinu postupnČ snižovala (Obr. 5).

PodČkování: Práce na tomto projektu byla podporována spoleþností RADANAL s.r.o. Pardubice.

Použitá literatura: 1. ADAM, V.; HRDINOVA, V.; KRIZKOVA, S.; ZITKA, O.; HORNA, A.; ZEMAN, L.; KIZEK, R. Laktoferin, vyznamny zelezotransportni protein. Náš Chov, 2007, roþ. LXVII. þ. 7, s. 22-23. 2. ADAM, V.; KIZEK, R. Laktoferin: Nova zbran na rakovinu? 21. Stoleti, 2007, roþ. 4. þ. 9, s. 107-108. 3. HORNA, A.; HUSKA, D.; STEJSKAL, K.; KRIZKOVA, S.; SUPALKOVA, V.; BABULA, P.; ADAM, V.; HAVEL, L.; BEKLOVA, M.; KIZEK, R. Use of electrochemical techniques for lactoferrin determination. In STRLIC, M.; BUCHBERGER W. (eds.). 12th International Symposium on Separation Sciences, Lipica 2006: Sept 27 - 29, Section for Analytical Chemistry of the Slovenian Chemical Society and Austrian Society for Analytical Chemistry. Lipica, Slovenia, 2006, s. 122-124, P12. 4. HORNA, A.; ZITKA, O.; KRIZKOVA, S.; HRDINOVA, V.; NAKIELNA, J.; ADAM, V.; TRNKOVA, L.; ZEMAN, L.; KIZEK, R. Coupling of monolithic column sample preparation and flow injection analysis - Electrochemical detection for determination of lactoferrin: easy, low cost and structural distuinguishing. In SANDRA, T.; DUMONT E.; SANDRA P. (eds.). 31st International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques, HPLC 2007: June 17 - 21, I.O.P.M.S. vzw, Belgium. International Convention Centre, Ghent, Belgium, 2007, s. 775-775, P19.45. 5. KUKACKA, J.; ZITKA, O.; HORNA, A.; STEJSKAL, K.; ZEHNALEK, J.; ADAM, V.; HAVEL, L.; ZEMAN, L.; PRUSA, R.; TRNKOVA, L.; KIZEK, R. A new tool for distinguishing of different structural forms of lactoferrin. Faseb J., 2007, roþ. 21. þ. 5, s. A635-A635. 6. KUKACKA, J.; ZITKA, O.; HORNA, A.; STEJSKAL, K.; ZEHNALEK, J.; ADAM, V.; HAVEL, L.; ZEMAN, L.; PRUSA, R.; TRNKOVA, L.; KIZEK, R. A new tool for distinguishing of different structural forms of lactoferrin. In BALES, C. W. (eds.). Experimental Biology 2007: April 28 - May 2, The Federation of American Societies for Experimental Biology. Washington, DC, USA, 2007, s. A635A635. 7. STEJSKAL, K.; HORNA, A.; HUBALEK, J.; ADAM, V.; KIZEK, R. Investigation of lactoferrin by means of electrochemical techniques. In KRACMAR, S.; VAVRECKA J.; BUNKA F.; VYSKOCIL I. (eds.). Vyziva zvirat 2006 - PROTEINY: June 6, Mendel University of Agriculture and Forestry in Brno. Brno, Czech republic, 2006, s. 230-233. 8. ZITKA, O.; ADAM, V.; KRIZKOVA, S.; HORNA, A.; DOLEZAL, P.; ZEMAN, L.; KIZEK, R. An analysis of lactoferrin using monolithic column coupled with UV-VIS and electrochemical detector. In TUKIENDORF, M. (eds.). V Medzynarodowe Warsztaty Akademickie w Naukach Rolniczych i Medycznych: November 8-10, Centrum Onkologii. Rejviz, Czech Republic, 2007, s. 24-25.

225

9. ZITKA, O.; HORNA, A.; STEJSKAL, K.; ZEHNALEK, J.; ADAM, V.; HAVEL, L.; ZEMAN, L.; KIZEK, R. Suggestion and optimization of method for study of structural changes of lactoferrin. In SKARPA, P.; FRYSCAKOVA E.; RYANT P.; CERKAL R.; STREDA T. (eds.). MendelNet06 Agro: Nov 29, Mendel University of Agriculture and Forestry in Brno. Brno, Czech Republic, 2006, s. 136136. 10. ZITKA, O.; HORNA, A.; STEJSKAL, K.; ZEHNALEK, J.; ADAM, V.; HAVEL, L.; ZEMAN, L.; KIZEK, R. Study of structural changes of lactoferrin using flow injection analysis with electrochemical detection on the surface of glassy carbon electrode. Acta Chim. Slov., 2007, roþ. 54. þ. 1, s. 68-73. 11. ZITKA, O.; HORNA, A.; STEJSKAL, K.; ZEHNALEK, J.; ADAM, V.; HAVEL, L.; ZEMAN, L.; TRNKOVA, L.; KIZEK, R. Flow injection analysis with electrochemical detection as a tool for distinguishing of structural changes of lactoferrin. In TRNKOVA, L.; JANDERKA P. (eds.). VII. Pracovni setkani fyzikalnich chemiku a elektrochemiku: January 29-30, Masarykova univerzita. Brno, Czech Republic, 2007, s. 142-143. 12. ZITKA, O.; KRIZKOVA, S.; HRDINOVA, V.; NAKIELNA, J.; ADAM, V.; HORNA, A.; TRNKOVA, L.; ZEMAN, L.; KIZEK, R. Coupling of monolithic column sample preparation and flow injection analysis – electrochemical detection for determination of lactoferrin: easy, low cost and structural distinguishing. In BLATTNA, J.; HORNA A.; MACKA M.; ZIMA T. (eds.). Vitamins 2007 - Nutrition and Diagnostics: September 19-21, University of Pardubice. Prague, Czech Republic, 2007, s. 235-236.

Kontaktní adresa: Ing. Aleš Horna, CSc., Ústav potravináĜského inženýrství, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve ZlínČ, T.G. Masaryka 275, CZ-762 72 Zlín, ýeská republika

226

TċKAVÉ LÁTKY HOUBOVÝCH SMETANOVÝCH OMÁýEK Pudil František1, Jenknerová Jana1, Janda Václav2 1 Ústav chemie a analýzy potravin, 2 Ústav technologie vody a prostĜedí, VŠCHT Praha Volatile components of mushroom cream sauces Summary: In the laboratory conditions, three different mushroom cream sauces were prepared. Fresh shiitake mushrooms (Lentinus edodes), champions (Agaricus bisporus) and dried boletus (Boletus reticulatus) were added to the basis of cream and onion, respectively. Isolation of volatiles was done by SPME method at 50o C and the main components were identified by GC-MS method. The mixed sample with added caraway seeds and a sample of commercially produced mushroom sauce were also analysed.

Souhrn V laboratorních podmínkách byly pĜipraveny neochucené základy omáþek ze smetany, cibule a z þerstvČ sklizených plodnic Houževnatce jedlého (Lentinus edodes), dále ze zakoupených plodnic Žampionu krémového (Agaricus bisporus) a ze sušených plodnic HĜibu dubového (Boletus reticulatus). Z omáþek byly pĜi teplotČ 50o C metodou SPME izolovány tČkavé látky a analyzovány plynovou chromatografií s hmotnostnČ spektrometrickou detekcí. Pro srovnání byl analyzován též smČsný vzorek pĜipravených omáþek po dochucení kmínem a vzorek komerþnČ dodávané houbové omáþky. Byly identifikovány hlavní aromatické složky. Úvod Cílem práce bylo porovnání složení houbových omáþek pĜipravených z rĤzných druhĤ hub a houbové omáþky komerþnČ vyrábČné. Materiál a metody Pro pĜípravu omáþek byly využity následující houby. Houževnatec jedlý(Lentinus edodes) –houba shiitake byl vypČstován v laboratoĜi z komerþnČ dostupných blokĤ firmy Damycel, Praha 10, Malešice (http://www.shopware.cz/shiitake/). ýerstvé plodnice žampionu krémového (Agaricus bisporus) byly zakoupeny v obchodní síti Tesco (Národní tĜída, Praha) od firmy ýeské houby a.s.,SobČslav (http://www.ceskehouby.cz). HĜib dubový (Boletus reticulatus) pocházel z vlastního sbČru v okolí Brd, který byl uskuteþnČn v létČ roku 2007. Sklizené plodnice hĜibu dubového byly usušeny v domácí sušárnČ pĜi teplotČ 35 °C a následnČ namlety. KomerþnČ dodávaná Apetito omáþka – tavená sýrová omáþka s houbami byla zakoupena v obchodní síti Tesco (Zliþín, Praha) od výrobce TPK, spol.s.r.o., Hodonín. Jako základ pro pĜípravu omáþek bylo použito Jihoþeské máslo 82% firmy Madeta (http://www.madeta.cz), smetana 12 % rovnČž od firmy Madeta (Mlékárna Kunín) a cibule. SmČsná omáþka byla dochucena kmínem firmy Kotányi, Praha 6 (http://koreni.kotanyi.cz ). PĜedchozí þtyĜi suroviny byly zakoupeny v obchodní síti Tesco (Národní tĜída, Praha). PČstování houby shiitake Substrátový blok byl umístČn do pĜepravky pĜekrytou plastovou fólií a ponechán v laboratoĜi u otevĜeného okna, kde byl zaruþen dostatek svČtla a teplota byla udržována na cca 15 °C. Blok byl každý den nČkolikrát mlžen vodou pomocí rozprašovaþe. K vývinu plodnic shiitake došlo za týden od zaþátku pČstování. Zralé plodnice byly sklizeny 10 dní po zahájení kultivace. PĜíprava omáþek Byl pĜipraven neochucený základ omáþek z cibule, smetany a þerstvých plodnic. Malá oloupaná a na kostiþky nakrájená cibule byla zpČnČna na asi 10g másla po dobu 3 minut. Poté bylo pĜidáno 100 g nakrájených þerstvých hub nebo 20 g mletých sušených hub. SmČs byla dušena pod poklicí po dobu 10 minut. Nakonec bylo pĜidáno 100 ml smetany a vzniklá omáþka byla ještČ bČhem dalších 10 minut povaĜena. Po odebrání vzorkĤ k analýze (cca 10 ml) byl pĜipraven smČsný vzorek všech tĜí omáþek a dochucen pĜídavkem 1g kmínu. 227

Identifikace tČkavých látek Analýza tČkavých látek omáþek byla provádČna plynovou chromatografií ve spojení s hmotnostní spektrometrií na pĜístroji Fisons Instruments GC 8000 s hmotnostním detektorem MSD 800 (Fisons Instruments, Itálie). Pro separaci tČkavých látek byla zvolena kapilární kolona 30 m × 0,32 mm se stacionární fází TR-5 s tloušĢkou filmu 1 ȝm (Thermo Fisher Scientific, USA). Teplota kolony byla programována od 50 °C (2 min izotermní prodleva) do 220 °C rychlostí 5 °C/min. Teplota nástĜiku byla 230 °C. Nosným plynem bylo helium. Energie ionizujících elektronĤ byla 70eV. Vzorek byl nastĜikován technikou SPME po adsorpci na vlákno se zakotvenou fází 65 ȝm CarbowaxTM – divinylbenzene (Supelco Park, USA). TČkavé látky z pĜipravených omáþek umístČných v uzavĜených vialkách byly izolovány pĜi teplotČ 50 °C po dobu 60 min. Pro identifikaci látek byla využita knihovna hmotnostních spekter NIST (NIST, Velká Británie). Výsledky a diskuse

Obr. 1. GC-MS analýza extraktu tČkavých látek z omáþky z þerstvých plodnic houževnatce jedlého, identifikace viz tab.I. Tabulka I Identifikované látky analýzy extraktu z omáþky z þerstvých plodnic houževnatce jedlého, chromatogram viz obr.1. Rt (min) Identifikovaná látka 8,992 2-heptanon 9,616 alken 10,927 sirný derivát 11,505 silikon 12,238 1-okten-3-ol 12,449 3-oktanon 13,155 oktanal 14,026 alifatický derivát 16,162 2-nonanon 16,639 silikon 16,923 dipropyldisulfid 17,216 1,2-dithiacyklopentan 18,592 alken 19,499 2-methylheptan 20,031 dekanal 21,801 silikon 22,681 derivát pyranu 24,129 2-methyl-3-pentanthiol 25,532 2,4,6-trimethyloktan 26,458 silikon 28,292 2-methyldodekan ? – nejistá identifikace

Poznámka ? kontaminant

kontaminant

?

kontaminant ?

kontaminant

228

Obr. 2. GC-MS analýza extraktu tČkavých látek z omáþky z þerstvých plodnic žampionu krémového, identifikace viz tab.II.

Tabulka II Identifikované látky analýzy extraktu z omáþky z þerstvých plodnic žampionu krémového, chromatogram viz obr.2. Rt (min) 9,093 12,091 12,531 15,007 16,235 16,703 16,996 17,281 21,865 22,763 24,203 26,513

Identifikovaná látka 2-heptanon benzaldehyd 3-oktanon 2-fenylacetaldehyd 2-nonanon silikon dipropyldisulfid dithiacyklopentan silikon 2-undekanon neidentifikováno silikon

Poznámka

kontaminant

kontaminant

kontaminant

Obr. 3. GC-MS analýza extraktu tČkavých látek z omáþky ze sušených plodnic hĜibu dubového, identifikace viz tab.III.

229

Tabulka III Identifikované látky analýzy extraktu z omáþky ze sušených plodnic hĜibu dubového, chromatogram viz obr.3. Rt (min) Identifikovaná látka 9,066 2-heptanon 9,607 neidentifikováno, smČsný pík 16,199 2-nonanon 16,685 silikon 16,969 dipropyldisulfid 17,263 dithiacyklopentan 19,399 alken 21,856 silikon 22,718 2-undekanon 22,874 neidentifikováno 24,166 3-pentanthiol 26,513 silikon 28,512 2-undekanon ? – nejistá identifikace

Poznámka

kontaminant

kontaminant

kontaminant

Obr. 4. GC-MS analýza extraktu tČkavých látek z omáþky ze smČsi vybraných hub, identifikace viz tab.IV. Tabulka IV Identifikované látky analýzy extraktu z omáþky ze smČsi vybraných hub, chromatogram viz obr.4 Rt (min) Identifikovaná látka 9,057 2-heptanon 12,312 1-okten-3-ol 12,504 2-ethylhexanal 14,081 cykloalkan 15,007 1,3,5-cykloheptatrien 16,217 2-oktanon 16,694 silikon 16,978 dipropyldisulfid 17,262 3,3´-thiobis-1-propen 21,617 cykloalken 22,727 2-undekanon 24,175 (1-methylethyl)thiooctová kyselina 26,504 silikon 28,539 2-tridekanon ? – nejistá identifikace 230

Poznámka

?

kontaminant

?

kontaminant

Obr. 5. GC-MS analýza extraktu tČkavých látek z omáþky ze vzorku komerþnČ dodávané houbové omáþky, identifikace viz tab.V.

Tabulka V Identifikované látky analýzy extraktu ze vzorku komerþnČ dodávané houbové omáþky, chromatogram viz obr.5. Rt (min) 8,947 12,174 16,492 18,830 21,718 22,553 23,919 26,367 28,347

Identifikovaná látka 2-heptanon 1-okten-3-ol sorbová kyselina hexanová kyselina alifatický uhlovodík 2-undekanon sorbová kyselina silikon 2-undekanon

Poznámka

kontaminant

ZávČry Ve všech laboratornČ pĜipravených vzorcích byly nalezeny deriváty methylketonĤ, pocházejících zĜejmČ ze smetany. Sirné látky detegované ve všech vzorcích pocházely z cibule, což potvrdila i analýza omáþkového základu bez pĜídavku hub. Celkový obsah tČkavých látek byl nízký a ve smČsném vzorku po ochucení kmínem pĜevažoval mezi tČkavými látkami karvon a další látky terpenického charakteru. V houbové omáþce z þerstvČ sklizené houby Houževnatce jedlého byl detegován jako významná složka tzv. „houbový alkohol“ 1-okten-3-ol, který se ve významnČjším množství v ostatních pĜipravených omáþkách neobjevil. Pro omáþku ze Žampionu krémového byl charakteristický výskyt 3-oktanonu, benzaldehydu a 2-fenylacetaldehydu. V omáþce ze sušeného HĜibu dubového byl obsah tČkavých látek extrémnČ nízký a pĜevažovaly složky pĤvodem ze smetany a cibule. Mezi tČkavými látkami komerþnČ dodávané houbové omáþky pĜevažoval 1-okten-3-ol (pravdČpodobnČ syntetický) a kyselina sorbová. PĜestože složení tČkavých látek houbových omáþek z rĤzných surovin bylo významnČ rozdílné, všechny vzorky se vyznaþovaly typickým „houbovým“ charakterem aroma.

231

Literatura 1. Zawirska-Wojtasiak, R.: Optical purity of (R)-(-)-1-octen-3-ol in the aroma of various species of edible mushrooms, Food Chemistry 86, str. 113-118, (2004). 2. Lanzotti V.: The analysis of onion and garlic, Journal of Chromatography A 1112, str. 3-22, (2006). 3. Schulz H., Krüger H., Liebmann J., Peterka H.: Distribution of Volatile Sulfur Compounds in an Interspecific Hybrid between Onion (Allium cepa L.) and Leek (Allium porrum L.), J. Agric. Food Chem. 46, str. 5220-5224, (1998). 4. Peterson D. G., Reineccius G. A.: Characterization of the volatile compounds that constitute fresh sweet cream butter aroma 18, 215-220, (2003). 5. Peterson D. G., Reineccius G. A.: Determination of the aroma impact compounds in heated sweet cream butter, Flavour and Fragrance Journal 18, 320-324, (2003). 6. Masada Y.: Analysis of Essentials Oils by Gas Chromatography and Mass Spectrometry, str. 83-87, (1976).

Kontaktní adresy Jana Jenknerová, Ústav chemie a analýzy potravin, [email protected] Ing. František Pudil, CSc., Ústav chemie a analýzy potravin, [email protected] Prof. Ing. Václav Janda, CSc., Ústav technologie vody a prostĜedí, [email protected] Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Technická 5, Praha 6 Dejvice, 16628

232

STUPEĕ POZNANIA TRHOVÝCH DRUHOV MLIEKA FREKVENTANTAMI ŠPECIALIZOVANÉHO SENZORICKÉHO LABORATÓRIA. MaĐa Pavel, Baranová Mária, Sabolová Gabriela *, MaĐová Jana Katedra hygieny a technológie potravín UVL,IVVL Košice Level of knowladge of market types of milk by certificated participants of special sensorial laboratory Summary: The quality of food products is very important to human health. All food products should be tested by professional workers. For this reason the special senzory laboratory was opened at UVM and SVS in Kosice. The basic of senzory analysis in the perception of food atributes with direct use of human senses. The selection and training of personal used for the assesment of senzory characteristics (assesors) has been standardised but it is necessary to check, refresh and up-date the performance of assessors.

Úvod Spotreba mlieka a mlieþnych výrobkov na Slovensku v posledných rokoch neustále klesá, a to aj napriek jeho významnej úlohe, ktorú zohráva pri zdravom stravovaní. V priemere sa za minulý rok vypilo a skonzumovalo len cca 150 kg mlieka a mlieþnych výrobkov na jedného obyvateĐa, þo je najmenej za posledných 15 rokov. Spomedzi krajín EÚ je Slovensko v konzumácii mlieka na spodku tabuĐky. Pre porovnanie predstavuje spotreba v krajinách únie cca 300 kg na osobu, priþom sa spotrebúva približne trojnásobné množstvo mlieþnych nápojov a dvojnásobné množstvo syrov ako u nás. PodĐa prieskumov uskutoþnených medzi malými Slovákmi, však nekonzumuje mlieko ani produkty z neho asi 12 % školákov a takmer 50 % iba obþas. Mlieko má bohužiaĐ najmä medzi mladými Đućmi všeobecne veĐmi nízky imidž a aj jeho spotreba je nízka. Ak chce výrobca, alebo aj predajca potravín byĢ u spotrebiteĐov úspešný, mal by vedieĢ objektívne urþiĢ senzorické vlastnosti vyrábaných alebo ponúkaných výrobkov a takisto odhadnúĢ ich hedonické pôsobenie. ýasto sa stáva, že konzumenti odmietnu potraviny, ktoré by pre nich mohli byĢ nutriþne prospešné, pretože nechutia dobre alebo preto, že s ich konzumáciou nemali skúsenosti. Skúsený senzorický analytik môže na základe posúdenia výsledkov skúšok vykonaných vyškoleným panelom hodnotiteĐov odhadnúĢ možné technologické chyby, þi prítomnosĢ urþitých nežiadaných deskriptorov a navrhnúĢ prípadné chemické alebo mikrobiologické skúšky na ich odhalenie. A práve preto v tejto oblasti by mohli preukázateĐne skúsené a erudované senzorické laboratóriá poskytovaĢ výrobcom a podnikateĐom užitoþné služby.

Výsledky V našej štúdii boli porovnávané dve rozdielne skupiny hodnotiteĐov za úþelom zistenia úrovne poznania jednotlivých kvalít niektorých výrobkov a modelových substancií . Prvú skupinu reprezentovalo 40 študentov 3. roþníka študijného odboru Hygiena potravín UVL v Košiciach s minimálnymi znalosĢami o systéme a spôsobe hodnotenia potravín, kým druhá skupina pozostávala zo 40 pracovníkov, ktorí vykonávajú profesionálne senzorické hodnotenie potravín na rôznych stupĖoch kontroly. Testy boli vykonávané v Špecializovanom senzorickom laboratóriu na IVVL v Košiciach. Prvá þasĢ prieskumného testu spoþívala v hodnotení jednotlivých trhových druhov mlieka s ich následným hodnotením vybranými senzorickými metódami v rôznych kombináciách a to nasledovne: - párovou metódou (mlieko plnotuþné/ nízkotuþné, trvanlivé/ sáþkové) -

duo-trio metódou (mliekoUHT Tami/mliekoUHT Rajo)

ÚspešnosĢ hodnotenia je uvedená v tabuĐke I a II. 233

TabuĐka I Porovnanie úspešnosti hodnotenia jednotlivých trhových druhov mlieka študentmi (v %) Výrobok Párová metóda Duo-trio metóda Mlieko 87,5 66,4 plnotuþné / nízkotuþné Mlieko 75,8 47,7 trvanlivé/sáþkové Mlieko 32,3 26,8 UHT Tami/UHT Rajo TabuĐka II Porovnanie úspešnosti hodnotenia jednotlivých trhových druhov mlieka odbornými hodnotiteĐmi (v %) Výrobok Párová metóda Duo-trio metóda Mlieko 96,7 71,9 plnotuþné / nízkotuþné Mlieko 93,1 85,0 trvanlivé/sáþkové Mlieko 79,2 77,6 UHT Tami/UHT Rajo V druhej þasti práce sme overovali u hodnotiteĐov-študentov schopnosti urþenia pachových kvalít modelových substancií skupiny aróm urþených pre aplikáciu do zmrzlín a mlieþnych produktov a to: Lieskový orech, BroskyĖa I, BroskyĖa II, Karamel, ýokoláda, Vanilka I, Malina, ýierne ríbezle TabuĐka III Aplikácia do zmrzlín a mlieþnych produktov A B Vzorka arómy % %

C %

D %

CH %

SPOLU %

Lieskový orech

66,7

25,0

87,5

65,0

40,0

60,0

BroskyĖa I

55,6

62,5

75,0

65,0

60,0

64,0

BroskyĖa II

11,1

75,0

87,5

55,0

60,0

56,0

Karamel

33,3

25,0

100,0

60,0

20,0

52,0

ýokoláda

100,0

100,0

100,0

100,0

100,0

100,0

Vanilka I

77,8

75,0

87,5

85,0

60,0

80,0

Malina

77,8

50,0

37,5

55,0

60,0

56,0

ýierne ríbezle

22,2

87,5

25,0

45,0

40,0

44,0

Baza

88,9

25,0

87,5

70,0

60,0

68,0

Vanilka II

88,9

87,5

87,5

85,0

100,0

88,0

234

Pri posudzovaní aróm boli dosiahnuté nasledujúce výsledky: vo všetkých paneloch bol dosiahnutý najvernejší výsledok pri þokoládovej aróme, kde všetky skupiny dosiahli maximum, tj. 100 %. Ćalšou najlepšie hodnotenou vzorkou bola aróma Vanilka I a II s 80 resp. 88% rozlíšiteĐnosĢou, priþom úroveĖ hodnotenia sa pohybovala v rozsahu 85 až 100 % (Vanilka II). Najslabšie hodnotenou arómou bola aróma ýierne ríbezle, ktorú správne urþilo len 44 % hodnotiteĐov s frekvenciou správnosti od 22,2 % (skupina A) po 87,5 % (skup. B). Naopak hodnotitelia v tejto skupine mali zjavné problémy pri charaktere arómy Bazy a Lieskového orecha pri správnosti urþenia len u 25 % hodnotiteĐského panelu. Pri hodnotení v rámci skupín D (dievþatá) a CH (chlapci) nedošlo k výraznejším rozdielom v hodnotení, s výnimkou arómy Karamel, ktorú správne urþilo len 20 % chlapcov (dievþatá 60 %).

Záver V práci sme sledovali prostredníctvom základných skúšok úrovne poznania jednotlivých chutí a substancií aróm. Dosiahnuté výsledky poukazujú na to, že úroveĖ poznania jednotlivých kvalít aj u základných potravín je na nižšej úrovni ako sa oþakávalo. VeĐkým problémom sa javí aj problematika neznalosti senzorických pojmov, ako aj nepoznania širšej škály pachov. Na základe dosiahnutých výsledkov testu a celkového hodnotenia môžeme konštatovaĢ, že je potrebné neustále nielen vychovávaĢ nových posudzovateĐov, ale formou udržiavacích testov na rôznych úrovniach zdokonaĐovaĢ okrem teoretických znalostí aj fyziologicko-psychologické parametre senzorických orgánov potenciálnych hodnotiteĐov posudzovateĐov. Práca bola riešená v rámci projektu Vega 1/ 4380/07

Kontaktná adresa: Doc. MVDr. Pavel MaĐa, PhD., Ústav hygieny a technológie mlieka, UVL, Košice, Komenského 73, 040 81 Košice, e-mail: [email protected]

235

SENZORICKÉ HODNOCENÍ JOGURTģ A JOGURTOVÝCH DRINKģ S JAHODOVOU PěÍCHUTÍ Šedivá Alena, Panovská ZdeĖka, Lukešová Dobromila Ústav chemie a analýzy potravin, VŠCHT Praha Sensory evaluation of strawberry yogurts and yogurt drinks Summary: Objectives of this study were to determine panel ratings for strawberry yogurts and yogurt drinks and to observe differences in specific hedonic and intensity parameters among eight strawberry yogurts and two yogurt drinks made by different producers. Ranking test was used for evaluation of yogurt samples, sensory profile were used for evaluation of both yogurts and yogurt drinks. The sensory evaluations of yogurts were done in cooperative with 20 trained assessors in age between 19-27 years. Differences in sensory perception of yogurts were not significant for most of tested samples. Most of assessors preferred sample appropriately thick, with pieces of fruit and lower strawberry aroma and nature strawberry taste. The sensory evaluations of yogurt drinks were done in cooperative with 115 assessors (32 assessors with age between 50-80 years and 83 assessors with age between 19-27 years). The assessors mostly preferred the sample with sweeter taste and more pronounced strawberry aroma.

Úvod: Na þeském trhu je možné najít široký sortiment mléþných výrobkĤ. LaboratoĜ senzorické analýzy se dlouhodobČ zabývá senzorickým hodnocením rĤzných druhĤ mléþných výrobkĤ. Presentovali jsem již výsledky preferencí v kategorii bílých jogurtĤ, kde se prokázalo, že obsah tuku má vliv na hodnocení pĜíjemnosti chuti a rovnČž, že hodnotitelé mají vČtšinou znaþné problémy odhadnout správnČ obsah tuku u tČchto výrobkĤ. U kategorie ochucených jogurtĤ byla zjišĢována preference jednotlivých pĜíchutí. Také vČtšina zahraniþních senzorických studií týkajících se mléþných výrobkĤ se hlavnČ vČnovala senzorickým vlastnostem a pĜijatelnosti jogurtĤ a jejich vhodným ochucením. Barnes et al. (1991a) ve své práci uvádí, že celková pĜijatelnost výrobkĤ koreluje s pomČrem sladké a kyselé chuti. NČkolik studií se vČnovalo pĜijatelnosti jogurtĤ pro rĤzné skupiny spotĜebitelĤ napĜ. Ward et al. (1999). Kalvianinen et al. (2003) zkoumal vztah textury, chuti a aroma na preference jogurtĤ u starších a mladých lidí. Bogue and Ritson (2005) propojili znalosti marketingu se senzorickou metodologií, aby pochopili preference konzumentĤ pro výbČr jahodového jogurtu s rĤzným obsahem tuku. Zjistili, že konzumenti preferují jahodový jogurt s nižším obsahem tuku a že využití senzorické analýzy propojené s marketingem dává komplexnČjší pohled na tuto problematiku [1]. NČkteré práce, ale není jich mnoho, se zabývají také senzorickým hodnocením jogurtových drinkĤ, které patĜí k rychle se rozvíjející skupinČ nových výrobkĤ v mléþném prĤmyslu. Jogurtové nápoje se velice rychle staly vyhledávanými výrobky, protože si zachovávají výhody jogurtĤ tj. mají pĜínos pro zdraví þlovČka, navíc se snadnČji konsumují a jednoduše se s nimi manipuluje [2, 3]. PotravináĜská vyhláška tyto výrobky pĜesnČ nedefinuje. U jogurtu, kefíru, acidofilní mléka atd. vypisuje požadavky, které musí tyto výrobky splĖovat, napĜ. jejich obsah tuku a sušiny, poþet živých mikroorganismĤ atd. Ostatní výrobky nejsou tak pĜesnČ definovány, platí však, že pokud je výrobek oznaþený jako "jogurtový", musí nejménČ polovinu tvoĜit jogurt, u mléþného musí být víc než polovinou zastoupeno mléka nebo syrovátka. Výrobce je pak povinen ostatní složky popsat na etiketČ. Má-li mít nový výrobek úspČch na trhu je vždy nutné zjistit, þím se ze senzorického hlediska odlišuje a také konzumentské preference. Thompson et al. (2007) se zabýval rozdíly v preferencích rĤznČ ochucených drinkĤ mezi bČlošskou, španČlskou, afroamerickou populací. PĜijatelnost jogurtových drinkĤ, jejich specifická chuĢ a fyzikální vlastnosti se pro každou skupiny lišily[1].

236

Cíl práce: Jedním z cílĤ naší dlouhodobé práce zamČĜené na sledování senzorických vlastností mléþných výrobkĤ bylo sledovat rozdíly v pĜíjemnosti chuti a intenzitČ nČkterých vybraných parametrĤ u jogurtĤ a jogurtových nápojĤ s jahodovou pĜíchutí. ZamČĜily jsme se na chuĢové charakteristiky jahodových jogurtĤ bČžnČ dostupných na našem trhu. Vzorky byly vybírány ve spolupráci se spotĜebitelským 4asopisem Q magazín. V další þásti práce jsme podrobnČji studovali senzorické charakteristiky jogurtových nápojĤ s jahodovou pĜíchutí. Formou dotazníku jsme zjišĢovali preference hodnotitelĤ k jogurtovým nápojĤm a jim podobným výrobkĤm. Hodnotitelé se pĜi hodnoceních mČli možnost seznámit s rozdíly mezi senzorickým posuzováním jogurtĤ a jogurtových nápojĤ. Vzorky: Popis jogurtĤ Tabulka I Popis testovaných jogurtĤ s jahodovou pĜíchutí Oznaþení Název Složení (opsáno z obalu výrobce) mléko, ochucená složka 15 % hm., cukr, jahody, 1 Cremi jahoda-Yoplait jableþné pyré, barvivo karmín, jahodové aroma, tuk 5,5 %, sušina 23,5 % 2,5 % tuku, mléko, 18 % ovoc. složky (50 % jahody, cukr, zahušĢovadla, modifikovaný kukuĜiþný škrob, 2 Jogurt plus - Ehrmann pektin a guma guar, glukózo-fruktózový sirup, barvivo koncentrát šĢávy þervené Ĝepy, aroma), cukr, sušené odtuþnČné mléko, jogurtové kultury smetana, jahod. složka 16 % (cukr, 22%, jahody, glukózo-fruktózový sirup, zahušĢovadla: modif. Jogurt jahoda 3 smetanový- PROMIL kukuĜiþný škrob a pektin, jableþný koncentrát, aroma), živé jogurtové kultury ChoceĖský smetanový smetana, jahod. složka 16 % (cukr, jahody, barvivo), 4 jogurt – Surfáþek Ĝep. koncentrát, živé jogurtové kultury, pĜírodní a jahodový pĜírodnČ identické aroma Smetanový jogurt tuk min. 8 %, smetana, jahod.složka 17 % (cukr, jahod. 5 JahĤdka dĜeĖ, aroma), jogurtová kultura tuk 4 % hm.,mléko, jahodová složka 8 % (jahody 60%, cukr,cukr,glukózo-fruktózový sirup), zahušĢovadla (karagenan, kukuĜ. modif.škrob E1142), regulátory 6 Dobrá máma krémová kyselosti: sodné a vápenaté, barvivo: karmín, aroma, cukr, mléþ. bílkoviny, zahušĢovadlo: želatina, jogurt. kultura Smetanový jogurt smetana, ovoc. složka 14 % (cukr, jahody, aroma), 7 z Valašska - Jahoda jogurt. kultura

Popis jogurtových nápojĤ i Vzorek 1. – Activia nápoj - kysaný mléþný výrobek s bifidokulturou, pĜíchuĢ jahoda s kiwi, Danone a.s., Benešov a.s., ýR i Vzorek 2. - Revital active - probiotický kysaný nápoj se sníženým obsahem tuku a s aktivními složkami, pĜíchuĢ jahoda, Olma a.s., Olomouc, ýR

237

Experimentální podmínky: Hodnocení probíhala v senzorické laboratoĜi, která svým vybavením odpovídá normČ ISO 8589. Veškeré práce probíhaly v souladu s metodikami danými mezinárodní normami ISO. Senzorické hodnocení jahodových jogurtĤ probíhalo za následujících podmínek: množství testovaného vzorku bylo 100 ml, teplota pĜi podávání vzorku byla 5 °C, hodnocení se úþastnil panel 20 vyškolených hodnotitelĤ. KromČ poĜadové zkoušky (ISO8587), kterou byla hodnocena celková pĜíjemnost vzorkĤ, byl u všech vzorkĤ sledován senzorický profil, pĜi kterém byla mimo jiné porovnávána intenzita jahodové vĤnČ, intenzita kyselé a jahodové chuti, hustota a tuþnost vzorku. Vzorky byly testovány pomocí grafických nestrukturovaných stupnic 100 mm dlouhých a orientovaných popisky na jejich koncích. PĜi hodnocení vzorkĤ byl využit rovnČž volný slovní popis. Jogurtové nápoje s pĜevažující jahodovou pĜíchutí posuzovaly tĜi skupiny hodnotitelĤ, skupina B (studenti-1. roþník bakaláĜského studia), M (studenti-1. roþník magisterského studia) a S (studenti University tĜetího vČku). Pomocí grafické nestrukturované stupnice (100 mm dlouhé) byly hodnoceny vybrané deskriptory u dvou jogurtových nápojĤ od dvou rĤzných výrobcĤ. Všichni hodnotitelé pĜed vlastním hodnocením vyplnili dotazník týkající se konzumace jogurtových drinkĤ a jejich preferencí. Výsledky: Hodnocení jahodových jogurtĤ: U skupiny sedmi zakoupených jogurtĤ bylo sledováno poĜadí výrobkĤ dle celkové pĜíjemnosti a intenzity vybraných parametrĤ. a) Výsledky poĜadové zkoušky PoĜadovou zkouškou byly vzorky Ĝazeny podle pĜíjemnost chuti tj. od nejlepšího k nejhoršímu. Výsledky byly statisticky zpracovány Friedmanovým testem na hladinČ pravdČpodobnosti 0,05. PoĜadí vzorkĤ od nejchutnČjšího k nejménČ chutnému vzorku bylo následující: za nejchutnČjší byl vČtšinou hodnotitelĤ považován vzorek oznaþený 6 (Dobrá máma krémová), následovaly vzorky 3 a 7, dále skupina vzorkĤ 4, 5 a 2. Za nejménČ chutný byl hodnotiteli považován vzorek s oznaþením 1 (Cremi Jahoda –Yoplait). PĜi porovnání rozdílĤ mezi vzorky byl významný rozdíl pouze mezi prvním a posledním vzorkem, ostatní vzorky se v chutnosti vzájemnČ významnČ nelišily. Ze statistiky vyplynulo, že vČtšina testovaných vzorkĤ se v pĜíjemnosti chuti lišila pouze minimálnČ. b) Intenzity vybraných parametrĤ u jogurtĤ s jahodovou pĜíchutí PrĤmČrné hodnoty intenzit parametrĤ sledovaných u jahodových jogurtĤ jsou uvedeny v tabulce II. Tabulka II Hodnocení intenzit vybraných parametrĤ u jogurtĤ [%] Oznaþení vzorku 1 2 3 56 38 36 Intenzita jahodové vĤnČ 52 32 52 Intenzita kyselé chuti 42 36 42 Intenzita jahodové chuti 52 34 44 Hustota 52 42 62 Tuþnost

4 54 56 48 40 64

5 56 44 56 42 58

6 38 56 36 48 36

7 48 68 46 48 52

NejvČtší rozdíly mezi vzorky byly nalezeny v intenzitČ jahodové chuti. Intenzita jahodové vĤnČ byla nejvyšší u vzorkĤ þíslo1 a 5 a nejnižší u vzorku 3. Vzorek 2 byl hodnocen jako pĜíliš Ĝídký. 238

c) Slovní popis jogurtĤ s jahodovou pĜíchutí V tabulce III jsou uvedeny nejþastČji zmínČné termíny, kterými hodnotitelé popisovali jednotlivé testované vzorky. Tabulka III NejþastČji citované slovní popisy u jednotlivých výrobkĤ ýíslo vzorku Volný slovní popis testovaných vzorkĤ 1 dobrá konzistence, svČtlý, málo jahod, umČlá vĤnČ 2 málo sladký, zvláštní kyselá chuĢ, umČlá pĜíchuĢ, horší textura, 3 málo smetanový, umČlá pĜíchuĢ, 4 nevýrazný, hrudky v textuĜe, 5 krupiþkový, jemnČ nakyslý, 6 hustý, ovocné kousky, vĤnČ jahod 7 prázdná chuĢ, našlehaný, umČlá chuĢ.

Hodnocení jogurtových nápojĤ: TĜi skupiny hodnotitelĤ porovnávaly jogurtové nápoje, od dvou výrobcĤ, s pĜevažující jahodovou chutí. Cílem bylo zjistit, zda lze pro senzorické hodnocení jogurtových drinkĤ použít stejné deskriptory a zda se nČkterý deskriptor výraznČ liší (zda se jejich prĤmČrné intenzity nČjak liší). Dále jsme chtČli porovnat práce panelĤ, pro porovnání byl vybrán deskriptor vĤnČ, ale metodicky stejnČ by se porovnaly i ostatní deskriptory).

a) Dotazníkový prĤzkum Dotazníkového prĤzkumu se zúþastnilo 115 dotazovaných (67% žen a 33% mužĤ) ve vČku od 19 do 80 let. Celkový soubor dotazovaných byl rozdČlen na dvČ skupiny. První skupina byla tvoĜena studenty Fakulty potravináĜské a biochemické technologie, druhá skupina byla tvoĜena seniory z University tĜetího vČku. VČtšina dotazovaných studentĤ uvedla, že jogurtové nápoje konzumují a že preferují pĜevážnČ nápoje ochucené (76 %) pĜevážnČ s ovocnou pĜíchutí. Panel seniorĤ byl tvoĜen 32 hodnotiteli (75 % žen a 19 % mužĤ, 6 % hodnotitelĤ pohlaví v dotazníku neuvedlo). PĜi výbČru typu nápoje 31 % seniorĤ uvedlo, že preferuje jogurtové nápoje bez pĜíchuti, 50 % seniorĤ preferovalo jogurtové nápoje ochucené (pĜevážnČ ovocné). Zbytek hodnotitelĤ (19 %) si nevybral ani jeden z typĤ jogurtových nápojĤ. Dále bylo zjištČno, že pĜi výbČru jogurtového nápoje hrála nejvČtší roli cena výrobku (42 % dotazovaných), a to jak u studentĤ, tak u seniorĤ. Za cenou následovaly faktory jako výrobce nebo obsah tuku ve výrobku.

b) Senzorický profil jogurtových nápojĤ Panel hodnotitelĤ byl rozdČlen na tĜi skupiny. Písmenem S byl oznaþen panel seniorĤ, písmenem B panel studentĤ 1. roþníku bakaláĜského studia a písmenem M studenti 1. roþníku magisterského studia. Hodnotitelský panel S se skládal ze 32 hodnotitelĤ, panel B byl složen z 60 hodnotitelĤ a panel M mČl 23 þlenĤ. Výsledky posouzení dvou jogurtových nápojĤ s pĜevažující jahodovou pĜíchutí jsou uvedeny v tabulce IV a na obrázku 1.

239

Tabulka IV Výsledky hodnocení jogurtových nápojĤ, prĤmČrné hodnoty v % Hodnotitelská skupina B M Testované vzorky VZ 1 VZ 2 VZ 1 VZ 2 PĜíjemnost chuti 68 50 61 59 Konzistence 52 59 56 48 Intenzita sladké chuti 69 41 64 48 Intenzita kyselé chuti 23 53 32 54 Intenzita jahodové chuti 64 33 62 45 Intenzita vĤnČ 52 37 56 41 Tuþnost 36 34 48 26

S VZ 1 72 53 54 29 56 21 37

VZ 2 44 49 33 44 27 29 33

Výsledky hodnocení ukázaly, že všechny skupiny hodnotitelĤ preferovaly vzorek více sladký, s výraznČjší jahodovou chutí (vzorek 1 - Activia). Ukázalo se, že kombinace pĜíchutí jahoda s kiwi byla kladnČ hodnocena kvĤli svČží chuti a vĤni exotického ovoce výrobku. NejvČtší rozdíly v hodnocení mezi skupinami hodnotitelĤ byly pozorovány pĜi hodnocení intenzity vĤnČ. Vnímaná intenzita vĤnČ byla u seniorĤ výraznČ nižší než u studentĤ. Pro tento parametr byly vypoþteny u jednotlivých skupin smČrodatné odchylky. Podle hodnot smČrodatných odchylek lze usoudit, jaká byla variabilita v hodnocení v každé testované skupinČ. Nejmenší smČrodatná odchylka byla vypoþítána pro skupinu hodnotitelĤ typu S.

Hodnocení jogurtových nápojĤ- senioĜi pĜíjemnost chuti

tuþná chuĢ

80 70 60 50 40 30 20 10 0

konzistence vzorku

intenzita vĤnČ

intenzita jahodové chuti

vzorek þ. 1 Activia Danone vzorek þ. 2 Revital active

intenzita sladké chuti

intenzita kyselé chuti

Obr. 1. Graf hodnocení jogurtových nápojĤ

240

ZávČr: Senzoricky byly posuzovány vzorky jogurtĤ s jahodovou pĜíchutí a vzorky jogurtových nápojĤ s pĜevažující jahodovou chutí. Mezi testovanými vzorky jogurtĤ nebyly obecnČ nalezeny veliké rozdíly. PĜi porovnání celkové pĜíjemnosti chuti jogurtĤ byl statisticky významný rozdíl zjištČn pouze mezi vzorkem nejlepším a vzorkem nejhorším, ostatní vzorky se v chutnosti vzájemnČ významnČ nelišily. Za nejchutnČjší z testovaných byl považován vzorek Dobrá máma od firmy Danone. Tento jogurt byl hodnocen jako pĜimČĜenČ hustý, s kousky ovoce, pĜíjemnou a pĜimČĜenou (spíš nižší) intenzitou jahodové vĤnČ a chuti. Jogurt, který byl považován za nejménČ chutný byl popisován jako hustý, pĜíliš svČtlý, s dosti vysokou intenzitou jahodové vĤnČ i chuti. Ze senzorického hodnocení jogurtových nápojĤ vyplynulo, že hodnotitelé (všechny skupiny) preferovaly vzorek více sladký, s výraznČjší jahodovou chutí i vĤní (vzorek 1 – Activia jahoda kiwi). PĜíchuĢ kiwi dodávalo nápoji pĜíjemnČ nakyslou a osvČžující chuĢ.

PodČkování: Práce byla vytvoĜena za podpory grantu MSM 6046137305. Použitá literatura: 1. Thompson J. L., Lopetcharat K., Drake M. A. Preferences for Commercial Strawberry Yogurts among Africa America, Caucasian, and Hispanic Consumers in the United States. Journal of Dairy Science (2007) 90:4974-4987. 2. Janhøj T. Sensory and Rheological Characterization of Acidified Milk Drinks. Food Hydrocolloids (2007), doi:10.1016/j.foodhyd.2007.03.006. 3. Barnes D.L., Harper S.J., Bodyfelt F.W., McDaniel M.R. Correlation of Descriptive and Consumer Panel Flavor Ratings for Commercial Prestirred Strawberry and Lemon Yogurts. Journal of Dairy Science (1991) 74:2089-2099.

Kontaktní adresa: Ing. Alena Šedivá, Ph.D., Ústav chemie a analýzy potravin, VŠCHT v Praze, Technická 5, 166 28, Praha 6; [email protected]

241

SENZORICKÉ HODNOCENÍ SÝRģ A SÝROVÝCH ANALOGģ Panovská ZdeĖka, Šedivá Alena, Lukešová Dobromila Ústav chemie a analýzy potravin, VŠCHT Praha Sensory evaluation of cheeses and cheese analogues Summary: The aim of the study was to compare sensory attributes of cheeses (with different fat content) with cheeses analogues. Cheeses analogues are made by using non dairy fats or proteins to produce a cheese like products. They are being used increasingly due to their cost effectiveness because milk ingredients are replaced by cheaper vegetable products. A panel of 35 assessors evaluated different sensory characteristics of these products. Sensory evaluation was performed by a Ranking Test and Sensory Profile Test which can explain the main differences in samples. Firstly four samples of processed cheeses were compared with cheeses analogue and then five samples of different processed cheese slices individually wrapped in plastic were evaluated. There were statistical significant differences among samples but there were not significant differences between the analogue Javor in term of pleasantness, sour or salty flavour and texture characteristics.

Úvod: Mezi oblíbené mléþné výrobky patĜí v ýR tavené sýry, kterých se napĜ. v roce 2006 spotĜebovalo zhruba 2,6 kilogramu na osobu roþnČ. Tavené sýry jsou oblíbené hlavnČ pro svou konzistenci, neboĢ se dají dobĜe roztírat, a dále také rozsáhlou škálou rĤzných pĜíchutí. PĜi jejich výrobČ se za teploty 80-90°C zahĜívá rozemletá sýrová hmota, k níž se pĜidávají tavicí soli, voda a pĜípadnČ i chuĢové pĜísady. Pro výrobu je možné použít všechny druhy pĜírodních sýrĤ a rozlišujeme zda se použije jenom jeden druh sýra pak vzniká tzv. tavený sýr druhový, nebo smČs tvrdých a mČkkých sýrĤ (pĜípadnČ i tvarohu). Na obalu výrobku je pak výrobce povinen seznámit spotĜebitele se všemi užitými surovinami, jež jsou vyjmenovány sestupnČ podle jejich množství. Vždy je kromČ jiného uveden obsah sušiny (v %) a obsah tuku (v %) nebo obsah tuku v sušinČ (v %). PrávČ obsah tuku stále více zajímá i zákazníky. NČkteĜí konzumenti se snaží vyhledávat výrobky s nižší energickou hodnotou, tzn. s nižším obsahem tuku. Na tyto požadavky reagovaly firmy tím, že se snaží vyrábČt výrobky s rĤzným obsahem tuku a nČkteré firmy tím, že vyvinuly výrobky, které by mohly sýry nahradit. Sýrové analogy, nebo také alternativní sýry neboli imitace sýrĤ se nejþastČji vyrábČjí z kaseinĤ (hlavní protein v kravském mléce), dále pak z rostlinného tuku, soli a vody. Mléþná bílkovina mĤže být nahrazena rostlinnou (sója) anebo škroby. Technologie výroby analogových výrobkĤ jsou rĤzné, nČkdy velmi podobné technologiím výroby tradiþních mléþných výrobkĤ, jindy zcela odlišné. NapĜ. byla vyvinuta technologie výroby analogĤ tj. výrobkĤ vyrábČných rozpuštČním tuku, do kterého se pĜidá stabilizátor a voda, aby se vytvoĜila emulze. NáslednČ se pĜimíchává bílkovina, která pomáhá vytvoĜit texturu výrobku. Na závČr se pĜidává sĤl, aromatické látky a kyseliny. Prodej a výroba analogĤ je celosvČtovou záležitostí a sýrové analogy se velmi þasto používají napĜ. u pizz a pizzových výrobkĤ, jejichž nejdražší souþástí je právČ sýr. U tČchto výrobkĤ se také nČkdy objevují problémy s klamavým znaþením. Z platné potravináĜské legislativy jednoznaþnČ vyplývá, že v pĜípadČ, kdy byla nČkterá ze základních složek mléka (mléþný tuk, mléþná bílkovina, mléþný cukr) nahrazena jinou nemléþnou složkou, nesmí být takovýto výrobek oznaþován za mléþný výrobek, ale jedná se o náhražku/analog/imitaci. Výrobci to vČtšinou Ĝeší tak, že slovo sýr na obalu vynechají a uvádí pouze jemný tavený atd. SpotĜebitel, který není s touto problematikou seznámen, si vČtšinou neuvČdomí, že nekupuje sýr. Výzkum na analozích sýra vyrobených z rĤzných bílkovin a tukĤ ukázal, že celkové chemické složení je podobné plno- a nízko-tuþným prĤmyslovČ vyrábČným sýrĤm. Literatura uvádí, že sýrové analogy jsou snadno odlišitelné. Vzhledem k tomu, že mléþné výrobky mají charakteristickou mléþnou, smetanovou a sýrovou chuĢ je pro výrobce analogu nejtČžší zamaskovat pĜíchuĢ po margarínech a zvýraznit jejich fádnČjší chuĢ. Problémy jsou v pĜípadČ analogĤ taky s texturními charakteristikami jako je konzistence, elasticita, drobivost apod. 242

Cíl práce: V senzorické laboratoĜi pĜi Ústavu chemie a analýzy potravin byly skupinou zasvČcených posuzovatelĤ porovnány organoleptické a texturní vlastnosti tavených sýrĤ a tavených plátkových sýrĤ s rĤzným obsahem tuku se sýrovými analogy. U všech výrobkĤ byl porovnán senzorický profil, který zahrnoval hodnocení celkové pĜíjemnosti chuti a hodnocení dílþích chutí napĜ. slané, nasládlé, mléþné, máselné, smetanové, palþivé, nakyslé, oĜíškové, žluklé a tuþné. Výrobky byly také porovnány poĜadovou zkouškou. Experiment: Panel 35 hodnotitelĤ posuzoval organoleptické vlastnosti tavených a plátkových sýrĤ s rĤzným obsahem tuku se sýrovými analogy. Pro hodnocení celkové pĜíjemnosti chuti testovaných vzorkĤ byla použita poĜadová zkouška. Pro sledování dílþích smyslových vlastností vzorkĤ byl použit senzorický profil. Hodnocení bylo provedeno pomocí grafických nestrukturovaných stupnic 100 mm dlouhých orientovaných na obou koncích popisky a metodou volného slovního popisu. PĜíprava senzorického hodnocení tavených sýrĤ a sýrových analogĤ Tabulka I Testované vzorky tavených sýrĤ a jejich analogu Vorek Název Výrobce Složení Obsah tuku Pilos, vyrobeno tuk v sušinČ voda, sýry, tvaroh, suš. Nízkotuþný v ýR pro LIDL 28 %, sušina syrovátka, máslo, tav. soli 1 tavený sýr ýeská republika 31 %, 645 kJ/ (E450, E339), stabilizátor E407 v.o.s. 155 kcal/100 g voda, máslo, sýry, suš. mléko, tuk v sušinČ Pilos, vyrobeno mléþné bílkoviny, sĤl jedlá, 53 %, sušina Jemný tavený v ýR pro LIDL tavící soli (E452, E450, E331), 41 %, 1080 kJ/ 2 sýr ýeská republika stabilizátor E407, regulátor 260 kcal/ v.o.s. kyselosti E330, 100 g Maratonec Linie – voda, sýry, tvaroh, suš. tuk v sušinČ tavený syrovátka, máslo, rozpustná 26 %, 30 % TPK, nízkotuþný vláknina (3%), tavící soli sušina, 568 kJ/ 3 spol. s r.o. sýrový (E331, E339, E450, E452), 137 kcal/ výrobek, stabilizátor karagenan 100 g s vlákninou voda, rostlinný tuk, sýry, suš. tuk v sušinČ mléko, mléþné bílkoviny, tavicí 48 %, sušina Javor jemný TPK, soli (E452, E450), škrob, jedlá 38 %, 4 tavený spol. s r.o. sĤl, stabilizátor E407, regulátor 960 kJ/230,8 k kyselosti E330., cal/ 100 g Nové Lipno sýry voda, smetana(10%), tuk v sušinČ smetanové máslo tav.soli 45 %, sušina smetanový Madeta a.s. (E339,E450,E452, suš. 38 %, 5 roztíratelná Syrovátka, suš. podmáslí, 1130 kJ/270 k tavený sýr kaseinát vápenatý cal/ 100 g

243

Tabulka II Testované vzorky tavených plátkĤ a tavených plátkových sýrĤ Obsah Váha/cena Vzorek Znaþka Výrobce tuku Kþ

1

2

3

4

5

Složení

90 g/16,90

TPK, spol. s r.o.

43 % tuku v sušinČ, 49 % sušina

Maratonec 144g /24,90

TPK, spol. s r.o.

43 % tuku v sušinČ, 49 % sušina

voda, sýry (þedar 10%), rostlinný tuk, sušené mléko, mléþné bílkoviny, tavící soli (E452, E339, E331), škrob, sýrové aroma, stabilizátor E407, barvivo betakaroten

35 % Toast ACCOM tuku v tavený sýr 100 g/12,50 Czech sušinČ, plátkový a.s. 46 % sušina 43 % TPK, tuk v Tavené 140 g spol. s sušinČ, plátky r.o. 48 % sušina 28 % TPK, tuk v Apetito 114 g/25,30 spol. s sušinČ, linie r.o. 44 % sušina

pĜírodní sýry, voda, máslo, mléþné bílkoviny, sušená syrovátka, bramborový škrob, tavící sĤl E331, jedlá sĤl, kys. citrónová E330, pĜírodní aroma

Apetito single

odstĜedČné mléko, sýry, rostlinný tuk, suš. mléko, mléþné bílkoviny, tav. soli (E331, E339, E452), modifikovaný bramborový škrob, ementálové aroma, stabilizátor E407, barvivo beta-karoten

voda, sýry, rostlinný tuk, sušené mléko odtuþnČné, mléþné bílkoviny, tavící soli (E331, E339, E452), škrob, stabilizátor E407 sýry, suš. mléko, máslo, odstĜedČné mléko, sĤl jedlá, tavící soli (E331, E339, E452)

Výsledky: a) Senzorické hodnocení tavených sýrĤ a sýrových analogĤ Panel 35 hodnotitelĤ srovnával vlastnosti klasických tavených sýrĤ s vlastnostmi sýrového analogu dostupného na našem trhu. PĜíjemnost chuti testovaných vzorkĤ byla zjišĢována jednak poĜadovou zkouškou a jednak pomocí grafické nestrukturované stupnice. PoĜadovou zkouškou bylo zjištČno, že mezi testovanými vzorky existují statisticky významné rozdíly v pĜíjemnosti chuti. HodnotitelĤm nejvíce chutnaly vzorky 2 a 5. NejhĤĜe byl hodnocen vzorek 3. Podobné výsledky byly získány i z hodnocení pĜíjemnosti chuti na grafické stupnici. Na grafických stupnicích byly hodnoceny rovnČž intenzity vybraných chutí a vybrané texturní parametry. Výsledky hodnocení jsou patrné na obrázku 1 a 2. Volným slovním popisem byly sledovány charakteristiky tavených sýrĤ. NejþastČji zmínČné negativní charakteristiky jsou uvedeny v tabulce III.

244

Profil chuti tavených sýrĤ vzorek 1

cizí, netypická tvarohovitá tuþná

nasládlá 60 50 40 30 20 10 0

vzorek 2 vzorek 3 vzorek 4 vzorek 5

slaná mléþná

žluklá

máselná palþivá

hoĜká oĜíšková

smetanová nakyslá

Obr. 1. Profil chuti tavených sýrĤ a sýrových analogĤ

Vybané vlastnosti hodnocené u tavených sýrĤ vzorek 1 vzorek 2 vzorek 3 vzorek 4 vzorek 5

celková pĜíjemnost chuti 80 60 40 20

roztíratelnost sýra

krájení sýra

0

lepivost na nĤž

Obr. 2. Vybrané vlastnosti tavených sýrĤ a sýrových analogĤ 245

Tabulka III Negativní charakteristiky u testovaných vzorkĤ tavených sýrĤ a sýrových analogĤ Oznaþení vzorkĤ

NejþetnČji zmiĖované charakteristiky

vzorek 1

velmi mČkký a hrudkovitý

vzorek 2

lepivý, tužší

vzorek 3

nejtužší, mouþnatý, hrudkovitý

vzorek 4

lepivý, mazlavý, velmi mČkký

vzorek 5

tužší, bez výrazných vad

b) Senzorické hodnocení tavených plátkových sýrĤ a tavených plátkĤ PĜíjemnost chuti tavených plátkĤ byla hodnocena opČt poĜadovou zkouškou. Bylo zjištČno, že mezi testovanými vzorky 1 a 3 a 3 a 5 existují statisticky významné rozdíly v pĜíjemnosti chuti. Za velmi chutné byly považovány vzorky 1 a 5, za nejménČ chutný vzorek 3. Dílþí vlastnosti plátkĤ byly hodnoceny pomocí 100 mm grafických nestrukturovaných stupnic. Výsledky hodnocení jsou znázornČny na obrázku 3. PĜi sledování smyslových vlastností tavených plátkĤ byla využity rovnČž metoda volného slovního popisu. NejþastČji zmínČné negativní charakteristiky jednotlivých vzorkĤ jsou uvedeny v tabulce IV. Vzorky 1 (Apetito single) a 5 (Apetito linie) byly hodnoceny jako vzorky se smetanovou chutí, pĜipomínající chuĢ sýru. Vzorek 3 (Toast tavený sýr plátkový) mČl nevyhovující texturu a byla u nČj rovnČž nalezena netypická chuĢ.

Profil tavených plátkĤ nasládlá 60 cizí, netypická

50

slaná

40

tvarohovitá

mléþná

30 20 10

tuþná

máselná

0

žluklá

palþivá

hoĜká

smetanová oĜíšková

nakyslá

Obr. 3. Senzorický profil tavených plátkĤ a tavených plátkových sýrĤ

246

vzorek 1 vzorek 2 vzorek 3 vzorek 4 vzorek 5

Tabulka IV NejþastČji zmínČné negativní charakteristiky u tavených plátkĤ a tavených plátkových sýrĤ Oznaþení vzorkĤ

NejþetnČji zmiĖované charakteristiky

vzorek 1

lepivý, pĜíliš kyselý, mouþnatý, pĜíliš žlutá barva

vzorek 2

tuhý, tvarohovitý, kyselý

vzorek 3

lepivý, pĜíliš mČkký, mouþnatý, cizí pachuĢ

vzorek 4

nevýrazná chuĢ

vzorek 5

tužší, gumovitý

ZávČr: Zkoumaný vzorek analogu taveného sýru Javor se v celé ĜadČ testovaných parametrĤ významnČ nelišil od klasických tavených sýrĤ. Urþité rozdíly byly pozorovány v textuĜe tohoto výrobku. Za negativní byla považována jeho mazlavá, lepivá a velmi mČkká konzistence. Za nejhorší ze skupiny tavených sýrĤ byl považován vzorek 3. Nejedná se o klasický tavený sýr, nýbrž o tavený sýr s vlákninou. Jeho negativní hodnocení vyplývá pravdČpodobnČ z pĜídavku vlákniny, která tomuto výrobku dodává specifickou netypickou chuĢ i texturu. V pĜípadČ tavených plátkĤ byly sýrové analogy hodnoceny pozitivnČ. Hodnotitelé jsou totiž v tomto pĜípadČ zvyklí na chuĢ a texturu sýrových analogĤ, které jsou v tržní síti mnohem þastČji zastoupeny než tavené plátkové sýry. I když je v literatuĜe þasto zmiĖováno, že texturní vlastnosti sýrových analogĤ jsou horší než u sýrĤ, naše studie to neprokázala. PodČkování: Práce byla vytvoĜena za podpory grantu MSM 6046137305.

Použitá literatura: 1. Bachman, H.P. 2001. Cheese analogues: a review. International Dairy Journal 11: 505-515 2. Muir, D.D., Tamime, A.Y., Shenana, M.E., Dawood, A.H. 1999. Processed Cheese Analogues Incorporating Fat-Substitutes 1. Composition, Microbiological Quality and Flavour Changes During Storage at 5°C. Lebensm.-Wiss. U.-Technol. 32: 41-49 3. http://www.viotros.gr/home.htm (internet, nalezeno 28.8.2007) 4. http://data.idnes.cz/soubory/test/A051104_PLZ_EIDAM.HTM (internet, nalezeno 28.8.2007) 5. http://www.szpi.gov.cz/cze/pristupy/stanoviska/article.asp?id=59917&cat=2488&ts=2ec3 (internet, nalezeno 29.8.2007) 6. http://www.tpk.cz/?menu_page=3&menu_parent=1&menu_lang=cz&menu_id=124 (internet, nalezeno 29.8.2007)

Kontaktní adresa: Dr. Ing. ZdeĖka Panovská, Ústav chemie a analýzy potravin, VŠCHT v Praze, Technická 5, 166 28, Praha 6; [email protected]

247

VYUŽITÍ SPEKTROMETRIE PRO HODNOCENÍ BARVY MLÉýNÝCH VÝROBKģ BĜenek Petr, JĤzl Miroslav ,Šustová KvČtoslava Ústav technologie potravin, MZLU v BrnČ Spectrometric analysing of colour of some dairy products Summary: Aim of this study was find out a new possibilities of spectrometric analysing of colour. In this part of study we compared a few groups of fats- butter, vegetable fats and butterine. At the beginning we had to create new methods to preparing samples. Subsequently it was analysed in L*a*b* colour system. Statistically, significant diferences were found beetwen each group of fat.

Úvod Tak jako se otevírají hranice státĤ tak se prolínají svČtové trhy. Celý svČt je globalizován. PrĤmČrná potravina putuje ke svému prĤmČrnému konzumentu v prĤmČru asi 2500 km. ýeho je nadbytek, popĜípadČ co umíme vyrobit levnČ exportujeme do zahraniþí, naopak co schází na tuzemském trhu není problém dovést odjinud. PrávČ tato výhoda relativnČ volného trhu v sobČ skýta nejedno úskalí. Velmi se rozšíĜil sortiment potravin. S nárustem sortimentu narostla i konkurence a mnozí producenti se uchylují k tzv. klamání spotĜebitele, kdy potravina nebo její složení je v rozporu s legislativními požadavky na senzorickou, nutriþní a hygienickou kvalitu. Je proto vČnována velká pozornost vývoji nových metod pro posouzení kvality potravin. Ideální metoda je rychlá, relativnČ levná a není k jejímu provedení zapotĜebí specielnČ vyškolený personál. Jednou z tČchto metod se jeví vyhodnocování vlastností potraviny na základČ spektrofotometrického posouzení barvy. V rámci našeho projektu jsme se snažili vytvoĜit metodiky pro hodnocení barvy u vybraných mléþných výrobkĤ a následnČ potvrdit hypotézu, zda se dají na základČ barevnosti od sebe rozpoznat jednotlivé skupiny výrobkĤ jako jsou máslo þerstvé, máslo stolní, smČsné tuky a rostlinné tuky. MČĜení barvy Výraz barva je pojmem velmi mnohoznaþným, jeho význam je spojován nejþastČji s psychosenzorickým vnímáním, který zprostĜedkovává lidské oko. Pojem barva se tak pĜenáší i na vlastnost svČtla. Ovšem barva není totéž co svČtlo. SvČtlo je souþástí mnoha druhĤ záĜení, která dohromady vytváĜí elektromagnetické spektrum. Nelze pĜesnČ urþit hranice, kde urþitá oblast elektromagnetického záĜení zaþíná a konþí. Viditelné záĜení zabírá oblast mezi 720-380 nm a dČlí na svČtlo þervené barvy (720-627nm), oranžové barvy(627-589nm), zelené barvy (566-495nm), modré barvy (495-436nm) a fialové barvy (436-380nm). Barvu samotnou urþuje jas, odstín a sytost. Všechny barvy lze rozdČlit na chromatické a achromatické. K achromatickým patĜí þerná, šedá a bílá, jejich spektrální prĤbČh má podobu pĜímky. Chromatické barvy mají naopak spektrum charakteru kĜivky s jedním nebo více vrcholy a lze je dále rozdČlit na jednoduché a složené. Jednoduché (monochromatické) jsou vyvolány záĜením jedné vlnové délky. Naopak složené chromatické barvy mají prĤbČh pĜes více vlnových délek. Spektrálním záznamem, který charakterizuje urþitou barvu, v našem pĜípadČ pĜi sledování odrazu, je remisní kĜivka (remisní spektrum).

Pokusy o numerické popsání barvy se datují již do dob Issaca Nevtona (1642-1727). Jako základ moderního mČĜení lze ale datovat až rok 1924, kdy byla CIE ustanovena pracovní skupina pro kolorimetrii. Základem objektivního mČĜení bylo definování tĜí základních faktorĤ: zdroj svČtla, pozorovaný pĜedmČt a pozorovatel. PĜi zmČnČ jedné z tČchto tĜí komponent se zmČní i celkový

248

barevný dojem. Jedním z Ĝady výsledkĤ bylo i vytvoĜení jednotného barevného prostoru X,Y,Z jakožto základ systému CIELab (L*a*b*) Barevný prostor L*a*b* je jedním z neþastČji používaných barevných prostorĤ pro mČĜení barvy napĜíþ všemi odvČtvími..Hodnota L* oznaþuje jas a hodnoty a*,b* jsou souĜadnice barevnosti v chromatickém diagramu. V tomto diagramu hodnota +a* oznaþuje smČr do þervena, -a* je smČr do zelena,+b* je smČr do žluta a -b* je smČr do modra. StĜed je achromatický, jestliže se hodnoty a*a b* vzdalují od stĜedu roste sytost barvy.

Materiál a metody PromČĜeny byly kromČ dvou druhĤ stolního a dvou druhĤ þerstvého másla také dva druhy ztužených rostlinných tukĤ a jeden druh smČsného tuku. Od každého druhu byly promČĜeny þtyĜi vzorky v pČti opakováních. Obr.2 Prostorové znázornČní L*a*b* systému Optický systém spektrofotometru využívá difĤzní osvČtlení a odražené svČtlo je mČĜeno pod úhlem 8°(d/8) s využitím funkce SCE (Specular Component Excluded) svČtelné pasti pro eliminaci zrcadlového lesku. PrĤmČr šterbiny je 30mm. PĜístrojem je promČĜeno celé viditelné spektrum, tj. od 380-780nm a barva je pak definována vedle numerických dat i remisním spektrem v L*a*b* barevném prostoru.

MČĜení Vzorky byly pĜipraveny z materiálu vychlazeného na teplotu v rozmezí 4-8°C, zvláštČ z dĤvodu snadnČjší manipulace. Samotné mČĜení pak probíhalo pĜi bČžné laboratorní teplotČ. Velikost vzorku musí být dostaþující pro pĜekrytí štČrbiny spektrofotometru. Na pĜesné tloušĢce vzorku nezáleží. Potvrdily to pokusné mČĜení v rámci hledání správného metodického postupu mČĜení a pĜípravy vzorkĤ. Tabulka I. Tabulka prĤmČrĤ namČĜených hodnot: prĤmČry

Vzorek

L*

a*

b*

1 2 3 4 5 6 7

89,0415 90,3880 91,3295 91,1815 91,2165 91,3790 91,7300

5,6465 3,1025 3,0070 4,3750 4,2840 2,8550 2,4350

34,3715 26,5860 24,3175 28,4290 28,5295 25,1225 23,9750

Mnohonásobné porovnávání skupin produktĤ je statisticky vysoce prĤkazné (P<0,01) pouze pro hodnoty a*. Nejvyššího prĤmČru dosáhla skupina smČsných tukĤ (a*= 5,65 ± 0,05), naopak nejnižší vykazovala skupina stolních másel (a*= 2,77 ± 0,35) viz graf níže. PrávČ tato þást remisního spektra se tedy jeví jako zásadní pro posuzování pĤvodu tuku v produktech. 249

6,0000 5,0000

a (-)

4,0000 3,0000 2,0000 1,0000 0,0000 1

2

3

4

5

6

7

skupiny výrobkĤ

Graf I. Graf a* hodnot (-) pro jednotlivé skupiny (sk.1- smČsné tuky, sk.2,3- þerstvé máslo, sk.4,5-rostlinné tuky, sk.6,7- stolní máslo)

ZávČr MČĜení potvrdilo základní hypotézu, že tyto produkty s rozdílným pĤvodem tuku, popĜ. jeho skladováním lze od sebe rozeznat na základČ hodnocení barvy. Ovšem na základČ hodnocení barvy spektrofotometricky, neboĢ zde, na rozdíl od kolorimetrických metod, se jasnČ dokázala dĤležitost mČĜení celého remisního spektra. Aþkoli se produkty bČžnému spotĜebiteli jeví v rĤzné míĜe a sytosti jako žluté, jejich charakteristická oblast záĜení, podle které je lze od sebe rozdČlit,je oblast þerveného svČtla. Toto zjištČní by mohlo v budoucnu najít uplatnČní v kontrolních metodách dozorþích orgánĤ. Nakalibrovaný pĜenosný spektrofotometr by byl schopen ihned urþit pĤvod tuku v produktek ve spotĜebitelské síti. Dalším cíle zkoumání se smČĜují dvČma smČry: jednak je to rozšíĜení hodnocení tČchto produktĤ a vlivy , které je ovlivĖují - tj. zmČna barvy v závislosti na dobČ skladování, sezónní zmČny v barevnosti mléþného tuku v závislosti na krmení skotu aj. Druhým smČrem je pak ovČĜit zda lze po pĜedchozím nakalibrování urþit z barvy i pĜípadné složení produktu a to zejména pomČr vody a mléþného tuku u másla.

Použitá literatura: 1. VIK, M.,Základy mČĜení barevnosti, I.díl, Skriptum TU Liberec 1995 2. VIK, M.,MČĜení barevnosti a vzhledu- barevnostní odchylky, TU Liberec 2002 3. DUFEK, J. Biometrika. VŠZ v BrnČ, 1992

Kontaktní adresa: Ing.Petr BĜenek, Ústav technologie potravin, Mendelova zemČdČlská a lesnická univerzita v BrnČ, ZemČdČlská 1, 613 00 Brno, [email protected]

250

HODNOCENÍ REOLOGICKÝCH VLASTNOSTÍ EIDAMSKÝCH SÝRģ Lužová TáĖa, Šustová KvČtoslava, Povolná Šárka, Nedomová Šárka, Blašková Veronika Ústav technologie potravin, MZLU v BrnČ The evaluation of rheological qualities of Edam cheeses Summary: For analysis were used Edam cheeses (30% and 45% fat) during 6 months of ripening. The cheeses were made in two dairies (A, B) with two different started cultures (LL, YY). The compression test of instrument TIRA test 27025 were use for evaluation texture qualities. It was found that the most decrease of the force needed for compression of the sample was after three months of ripening in both cheeses with 30% and 45% w/w fat from producer A. Both cheeses from producer B were less firm after 6 months of ripening than after 3 months. The instrument TIRA test 27025 was able to intercept differences between started cultures (LL, YY) even sensory analyse could not.

Úvod Doba zrání se pohybuje podle druhu a velikosti sýra a je rozhodujícím faktorem jakosti sýrĤ (ZIMÁK, 1998). Zatímco v ýeské republice jsou bČžnČ distribuovány sýry staré jen nČkolik týdnĤ, pro plné rozvinutí požadovaných senzorických znakĤ je nutné sýry eidamského typu nechat zrát alespoĖ 40 dní (BERTOLA et al., 2000). Zrání eidamských sýrĤ se pĜevážnČ zúþastĖují bakterie þeledi Lactobacteriaceae, a þasto jsou pĜítomny bakterie þeledi Bacillaceae, v nČkterých pĜípadech þeledi Bacteriaceae, ojedinČle nČkteré druhy kvasinek a plísní (OLŠANSKÝ, KNċZ, 1971). Nevýhodou delšího prozrávání pro výrobce je, že dlouhodobČjším zráním se zvyšuje cena sýrĤ, protože vzrĤstají náklady na temperaci zracích sklepĤ a prodlužuje se také doba, za kterou se produkty dostanou do obČhu a vklady se navrátí výrobci. Na druhou stranu sýry získávají výraznČjší senzorické vlastnosti a jejich textura je spotĜebitelem lépe pĜijímána (YATES a DRAKE, 2007). Cílem projektu bylo zhodnotit zmČny konzistenþních vlastností sýrĤ Eidamského typu v prĤbČhu 6 mČsícĤ zrání vzhledem k typu použité startovací kultury a rĤznému obsahu tuku v sušinČ sýra na pĜístroji Tira-test a urþit optimální délku zrání sýrĤ Eidamského typu vzhledem k jejich konzistenci. Materiál K analýze byly použity vzorky eidamských sýrĤ s 30% a 45% tuku v sušinČ v prĤbČhu 5 mČsíþního zrání. Hodnotily se dvČ skupiny sýrĤ, které byly vyrobeny v mlékárnách A, B za použití dvou rĤzných startovacích kultur (LL, YY). ZvlášĢ se hodnotil okraj a stĜed sýrĤ. Sýry zrály za standardních podmínek ve zracích sklepech mlékáren, pĜiþemž testovány byly každý mČsíc v laboratoĜích ústavu technologie potravin MZLU. Metody K hodnocení texturních vlastností kompresním testem bylo použito pĜístroje TIRA test 27025. Ze sýrĤ byly pĜipraveny válcovité vzorky (prĤmČr 20 mm, výška 11 mm) pomocí korkovrtu z 11 mm plátku sýra. Vzorek byl stlaþován mezi dvČma deskami konstantní rychlostí pĜi mČĜení prĤbČhu síly. Tento proces je napodobením skousnutí vzorku na stoliþkách. PĜi mČĜení byla zaznamenána závislost síly potĜebné ke kompresi vzorku v þase. Výsledky analýz byly hodnoceny programem Unistat 4.53 a Microsoft Excel 2000. Rozdíly mezi sledovanými parametry byly testovány Tukeovým HSD testem. Výsledky a diskuse U eidamského sýra o 30 % tuþnosti z mlékárny A obou startovacích kultur je v prvním mČsíci zrání vysoký rozdíl mezi tvrdostí stĜedové a okrajové þásti sýra (vetší síla byla potĜeba na stlaþení okraje). V druhém mČsíci zrání již neexistoval statisticky prĤkazný rozdíl mezi okrajem a stĜedem sýra, ani mezi kulturou YY a LL (tab. I a II). 251

Tabulka I Síla (N) potĜebná ke stlaþení vzorku 30% sýrĤ mlékárny A bČhem zrání zrání v mČsících 30% YY stĜed 30% YY okraj 30% LL stĜed 30% LL okraj 0 39.04 62.73 30.53 57.23 1 32.37 68.03 40.71 75.59 2 50.56 49.08 52.95 59.05 3 30.96 34.88 37.70 34.68 4 37.23 37.95 44.68 36.79 5 32.62 29.73 43.14 33.54 6 43.73 39.68 50.37 40.77

Tabulka II Rozdíl mezi tvrdostí na okraji a ve stĜedu sýrĤ u mlékárny A s 30% obsahem tuku v sušinČ vyrobených se zákysovou kulturou LL a YY (mnohonásobné porovnání Tukeovým HSD testem , * statisticky prĤkazný rozdíl P 0,05, ** vysoce statisticky prĤkazný rozdíl P 0,01) rozdíl okraj stĜed 1 mČsíc zrání 1 2 3 4 1 ** ** 2 ** ** 3 ** 4 ** ** 2 mČsíce zrání 1 2 3 4 1 2 3 4 5 mČsícĤ zrání 1 2 3 4 1 ** 2 ** 3 ** ** ** 4 ** 1 - sýr mlékárny A 30% YY stĜed, 2 - sýr mlékárny A 30% YY okraj,3 - sýr mlékárny A 30% LL stĜed, 4 - sýr mlékárny A 30% LL okraj

Nejlépe prozrálé z pohledu textury byly sýry pĜi mČĜení ve tĜetím mČsíci zrání, kdy hodnoty stlaþování dosahovaly minimálních hodnot. Z hlediska textury byly v této fázi sýry nejvíce pĜijatelné pro konzumenty. Po této dobČ se tvrdost opČt zvyšuje, pĜiþemž statisticky vysoce prĤkazné diference byly zaznamenány v pátém mČsíci zrání (vzorek 3). Obdobná situace je u sýrĤ s 45 % tuku v sušinČ od mlékárny A. Textura se první dva mČsíce výraznČ mČní, tvrdost sýra je promČnlivá. Nebyly prokázány rozdíly mezi okrajem a stĜedem, ale existují statisticky vysoce prĤkazné rozdíly mezi prozráváním sýrĤ se startovací kulturou YY a LL. PevnČjší texturu mČl sýr vyrábČný startovací kulturou YY (tab. III). Výrazný pokles kompresní síly nastává mezi druhým a tĜetím mČsícem zrání. Celá hmota obou sýrĤ je homogenní, sýr tedy prozrál a má pro spotĜebitele pĜijatelné senzorické vlastnosti. V dalších fázích zrání je opČt zaznamenáno zvýšení tvrdosti eidamĤ. Po 4 mČsících zrání se objevuje statisticky vysoce prĤkazný rozdíl mezi sýry s odlišnou zákysovou kulturou, pĜiþemž kultura YY je tvrdší než kultura LL, jak vyplývá z tab. III. Tento trend je zachován i v následujících mČsících.

252

Tabulka III Síla (N) potĜebná ke stlaþení vzorku 45% sýrĤ mlékárny A bČhem zrání zrání v mČsících 30% YY stĜed 30% YY okraj 30% LL stĜed 30% LL okraj 0 32,89 56,72 21,29 42,09 1 43,46 66,81 30,63 45,49 2 63,23 59,73 48,00 42,69 3 36,51 33,39 33,83 26,92 4 44,58 40,60 33,61 25,00 5 42,22 35,99 33,84 26,80 6 47,36 37,81 34,20 27,01

Texturní vlastnosti odlišné od všech ostatních zkoušených sýrĤ vykazovaly 30% eidamy mlékárny B (tab. IV) obou startovacích kultur. Jejich textura byla výraznČ tvrdší, dokonce i po 3 mČsících zrání. Ostatní sýry byly již dostateþnČ prozrálé, avšak tyto sýry mČly tvrdost témČĜ dvakrát vyšší s vysokou statistickou prĤkazností. V rámci jednotlivých vzorkĤ tČchto typĤ sýra bylo zjištČno, že se bČhem prvních dvou mČsícĤ ustalovaly vlastnosti a za pĜibližnČ 3 mČsíce již neexistoval statisticky prĤkazný rozdíl mezi stĜedem a okrajem sýrĤ a mezi sýry se startovací kulturou YY a LL. U tČchto sýrĤ ovšem dále nastávaly texturní zmČny, patrné obzvláštČ po 6 mČsících zrací doby, kdy mČly sýry statisticky prĤkaznČ mČkþí konzistenci než ve tĜetím mČsíci zrání.

Tabulka IV Síla (N) potĜebná ke stlaþení vzorku 30% sýrĤ mlékárny B bČhem zrání zrání v mČsících 30% YY stĜed 30% YY okraj 30% LL stĜed 30% LL okraj 0 32.82 57.24 35.36 56.90 1 77.13 85.70 75.03 91.30 2 82.00 81.93 69.07 71.50 3 56.42 62.29 58.17 57.08 4 80.36 70.54 65.85 65.87 5 60.60 63.91 61.26 57.00 6 57.64 49.10 51.29 45.44

Eidamy o obsahu 45% tuku v sušinČ vyrobené producentem B mČly velmi malou tvrdost od poþátku do konce zrací doby (tab. V). Tabulka V Síla (N) potĜebná ke stlaþení vzorku 30% sýrĤ mlékárny B bČhem zrání zrání v mČsících 30% YY stĜed 30% YY okraj 30% LL stĜed 30% LL okraj 0 29.43 42.36 25.16 33.23 1 38.65 61.79 33.62 48.33 2 42.87 41.19 42.18 39.79 3 32.51 29.49 35.49 32.27 4 40.57 35.2 35.15 32.76 5 36.83 34.49 30.95 33.56 6 25.71 19.16 27,12 23.95

253

Již v druhém mČsíci byly sýry texturnČ homogenní, nebyl tedy patrný statisticky prĤkazný rozdíl mezi stĜedem a okrajem sýra a také nebyl pozorovatelný vliv zákysové kultury na reologické vlastnosti (tab.VI). Sýry prozrály již za dva mČsíce. V šestém mČsíci zrací doby sýry dosáhly nejnižší úrovnČ tvrdosti ze všech mČĜení provedených bČhem studie.

Tabulka VI Rozdíl mezi tvrdostí na okraji a ve stĜedu sýrĤ u mlékárny B s 45% obsahem tuku v sušinČ vyrobených se zákysovou kulturou LL a YY (mnohonásobné porovnání Tukeovým HSD testem , * statisticky prĤkazný rozdíl P 0,05, ** vysoce statisticky prĤkazný rozdíl P 0,01)) rozdíl okraj stĜed 1 mČsíc zrání 13 14 15 16 2 mČsíce zrání 13 14 15 16

13

14 **

**

15

16

** **

13

14

15

16

13 - sýr mlékárny B 30% YY stĜed, 14 - sýr mlékárny B 30% YY okraj, 15 - sýr mlékárny B 30% LL stĜed, 16 - sýr mlékárny B 30% LL okraj

Naše výsledky jsou shodné s výsledky KUBIŠE et al. (2001), kteĜí uvádí pĜedevším u eidamu s 45% tuku v sušinČ se zvyšování elasticita a stlaþitelnost vzorku v prĤbČhu zrání.

ZávČr V práci byly hodnoceny sýry eidamského typu o obsahu 30% a 45% tuku v sušinČ vyrobených dvČma mlékárnami (A, B) za použití dvou rĤzných startovacích kultur YYa LL bČhem šesti mČsícĤ zrání. Byl porovnáván vliv zrání na texturu eidamu k urþení optimální doby zrání. Textura sýrĤ byla analyzována kompresním testem za použití pĜístroje TIRA test 27025. SouhrnnČ výsledky potvrdily, že doba zrání mČla výrazný vliv na reologické vlastnosti eidamských sýrĤ. Zlepšení textury souviselo se zvyšující se dobou zrání. Bylo zjištČno, že nejvČtší pokles síly potĜebné ke stlaþení vzorku sýra nastal po 3 mČsících zrání u sýrĤ od producenta A u sýrĤ s tuþností 30% i 45%. U obou sýrĤ z mlékárny B byl zaznamenána nižší tvrdost po 6 mČsících zrání než po 3 mČsíþní dobČ. Statisticky prĤkazné byly rozdíly mezi tvrdostí sýrĤ s použitím rozdílných kultur, i když senzorická analýza tento rozdíl nezaznamenala. TČmito výsledky se potvrdila vhodnost zvolené metodiky mČĜení tvrdosti sýrĤ pĜístrojem Tira-test 27025. Z porovnání výsledkĤ se závČry jiných autorĤ lze usoudit, že je nevhodné uvádČt na trh eidamské sýry o tuþnosti 30% i 45% dĜíve než tĜi mČsíce po výrobČ. Do této doby nejsou uniformní texturní vlastnosti výrobku a není možné zaruþit stálou kvalitu. Teprve po cca 90 dnech zrání je textura z pohledu spotĜebitele nejvhodnČjší ke konzumaci.

254

Použitá literatura: 1. ZIMÁK, E. Technologie pro 4. roþník SPŠ studijního oboru zpracování mléka. Praha: SNTL, 1998, 363 2. BERTOLA, N. C., CALIFANO, A. N.,. BEVILACQUA, A. E, ZARITZKY, N. E.: Effects of ripening conditions on the texture of Gouda Cheese, Journal of Food Science and Technology 2000, 35: 207–214. 3. OLŠANSKÝ, ý., KNċZ, V. Výroba tvrdých sýrĤ eidamského a ementálského typu. ýAZ-VÚPP, Praha, 1971, 289s. 4. YATES, M.D., DRAKE, M.A. Texture Properties of Gouda Cheese, Journal of Sensory Studies, 2007, 22, 493–506 5. DUFEK, J. Biometrika. VŠZ v BrnČ, 1992, 152s. 6. KUBIŠ I., KěIVÁNEK I., GAJDģŠEK S. The relationships between the chemical, dielectric and sensory properties of Edam cheese during ripening. Czech J. Food Sci., 2001a, 19, 3, p. 85-89 , ISSN 1212-1800

Kontaktní adresa: Ing. TáĖa Lužová, Ústav technologie potravin, Mendelova zemČdČlská a lesnická univerzita v BrnČ, ZemČdČlská 1, 613 00 Brno, [email protected]

255

MOŽNOSTI VYUŽITÍ NÍZKOESTERIFIKOVANÉHO PEKTINU JAKO SUBSTITUENTU FOSFÁTOVÝCH TAVICÍCH SOLÍ VE VÝROBċ TAVENÝCH SÝRģ ýerníková Michaela 1), BuĖka František 1), Pospiech Matej 2), Tremlová Bohuslava 2), Pavlínek Vladimír 3), BĜezina Pavel 1) 1) Ústav potravináĜského inženýrství, FT UTB ve ZlínČ, 2) Ústav vegetabilních potravin a rostlinné produkce, FVHE VFU Brno, 3) Centrum polymerních materiálĤ FT UTB ve ZlínČ Possibilities usage low-esterify pectin as a substituent phosphates emulsifying salts in production processed Summary: Processed cheese with addition of phosphate emulsifying agents shows typical consistence properties, especially spreadability. Chelating ability of phosphate emulsifying agents causes low calcium bioavailability from processed cheeses in human diet. This work is focused on a possibility to replace phosphate emulsifying agent types by other substance in production of processed cheeses. Low-esterificated pectin was used at the first part of experiments. In next phase, lecithin was added as emulsifier to improve emulsification system. Main attention was paid to homogeneity of prepared process cheese samples investigation. The transverse cut of the product (cca 1.2 cm) was divided into layers (2 – 5), properties of which were further evaluated by dynamic oscillatory rheometry and image analysis. Results showed that it is possible to prepare processed cheese without addition of emulsifying agents, however homogeneity of products is still limited for industrial application.

Úvod Tavené sýry se svou spotĜebou v ýeské republice Ĝadí k hojnČ konzumovaným potravinám. VyrábČny jsou z pĜírodních sýrĤ, másla, pitné vody a tavicích solí. PĜi výrobČ se dále mohou používat i suroviny jako tvaroh, sušené odstĜedČné mléko, zelenina, masné výrobky, koĜení, pĜíchutČ apod. V procesu výroby se smČs surovin za mírného podtlaku zahĜívá a míchá do vytvoĜení homogenní hmoty, která se plní do obalĤ1,2. Legislativa ýeské republiky rozumí pod pojmem tavený sýr, sýr, který byl tepelnČ upraven za pĜídavku tavicích solí3. Literatura uvádí, že pokud by se tavicí soli pĜi výrobČ tavených sýrĤ nepoužily, došlo by k rozdČlení systému na tĜi nemísitelné fáze – vysráženou bílkovinu na dnČ nádoby, stĜední vodnou fázi a povrchovou tukovou vrstvu. Tavicí soli jsou pĜi výrobČ tavených sýrĤ dĤležité pro odštČpení kalcia z proteinového systému pĜírodních sýrĤ, dále pro peptizaci, hydrataci, botnání, rozpustnost a dispergaci proteinĤ. PĜi výrobČ se oddČluje volný tuk, který je reemulgován právČ prostĜednictvím pĜidaných tavicích solí, které vlivem teploty zpĤsobují rĤst emulgaþních vlastností mléþných proteinĤ4. Vápenaté ionty vázané na karboxylové skupiny kyselých aminokyselin anebo na fosfoserylové zbytky jsou pĜi tavení nahrazovány ionty sodnými, þímž se pĤvodnČ nerozpustný parakaseinan vápenatý pĜírodního sýru mČní na rozpustnČjší parakaseinan sodný v sýru taveném. NejþastČji se používají fosfátové a polyfosfátové eventuelnČ citrátové tavicí soli. Fosfáty jsou soli obsahující (PO4)3-aniont, odvozují se od kyseliny trihydrogenfosforeþné a existují ve formČ monomerĤ, dimerĤ i polymerĤ, pĜiþemž s rostoucí délkou ĜetČzce fosfátĤ roste jejich afinita k vápenatým iontĤm a tudíž peptizace kaseinu. Klesá však jejich pufraþní kapacita5,6. Na stabilitu a konzistenci výrobku mají vliv též emulgaþní a stabilizaþní þinidla7. Sýry pĜedevším pĜírodní jsou pro þlovČka bohatým zdrojem vápníku. Samotná pĜítomnost vápníku je dĤležitá, neménČ dĤležitý je ovšem pomČr vápník:fosfor v pĜijímané potravinČ. Optimální pomČr Ca:P v potravČ konzumované þlovČkem je 1:1. V tavených sýrech se díky pĜítomnosti fosfátových a polyfosfátových tavicích solí mČní pomČr Ca:P ve prospČch fosforu a dosahuje hodnot 1:1,8-3,5. Vyšší obsah fosforu resp. fosfátĤ, zpĤsobuje snížení využitelnosti vápníku z tavených sýrĤ. Proto jsou lepším zdrojem vápníku napĜ. mléko a pĜírodní sýry. Pluta et al.8 uvádí možnost nahrazení fosfátových tavicích solí pĜi výrobČ tavených sýrĤ hydrokoloidy nízkometylovanými pektiny, modifikovanými škroby, xantanem, guarovou a lokustovou gumou. Hydrokoloidy se v potravináĜství používají jako zahušĢovadla, stabilizátory, gelující þinidla, dále pro zlepšení strukturních a texturních vlastností potravin. Hydrokoloidy používané 256

v potravináĜství se Ĝadí mezi dvČ skupiny biopolymerĤ - polysacharidy a proteiny9. Jedním z bČžnČ používaných hydrokoloidĤ je i pektin. Pektiny patĜí mezi vysokomolekulární heteropolysacharidy, jejichž základní stavební jednotku tvoĜí nejménČ z 65 % hmotnosti kyselina Į-D-galakturonová vázaná Į(1,4) glykosidickou vazbou. Karboxylová skupina kyseliny galakturonové se vyskytuje ve formČ volné (nebo jako sĤl sodná, draselná, vápenatá nebo amonná), ve formČ amidu nebo mĤže být v rĤzné míĜe esterifikována metylovou skupinou10,11. Podle podílu metylových skupin lze pektiny dČlit na vysoko- a nízkoesterifikované. Nedosahuje-li poþet metylových skupin 50 % hovoĜí se o nízkometylovaném pektinu12. Reaktivita k vápníku je dána pomČrem a uspoĜádáním karboxylových skupin v pektinovém ĜetČzci, pĜiþemž vzrĤstá se snižujícím se stupnČm esterifikace. Tvorba gelu nízkometylovaným pektinem je dána pĜedevším interakcí pektinu s vápenatými ionty, pĜiþemž velmi dĤležitá je nejen koncentrace, ale také dostupnost kalciových iontĤ 12. Nutnou pĜítomnost vápenatých iontĤ z technologického hlediska pro tvorbu stabilního gelu (interakce protein-polysacharid) potvrzuje i práce Matia-Merino et al.13. Gelace je snazší se vzrĤstající rozpustností pektinu, ale snižována se vzrĤstajícím pH. Nízkometylované pektiny tvoĜí gel v kyselé nebo slabČ kyselé oblasti pH. Maroziene & de Kruif14 uvádí, že pektin neadsorbuje na kaseinové micely pĜi pH 6,7 pĜi experimentech provádČných v odstĜedČném mléce. PĜi velmi nízkém pH (pH < 2) se adsorpce pektinu na kaseinové micely také výraznČ snižuje. Optimální pH pro adsorpci pektinu na kaseinové micely se obecnČ pohybuje v rozmezí 2,0 až 5,0. Lecitin patĜí mezi fosfolipidy, deriváty fosfatidylu jejichž základem je 1,2-diacylglycerol, v nČmž je na tĜetím uhlíku vázána kyselina fosforeþná12. V potravinách se používá jako emulgátor, který je schopen díky svému negativnČ nabitému ĜetČzci tvoĜit bČhem homogenizace malé olejové kapiþky15. DrobnČjší tukové kuliþky pak z proteinové nebo protein-polysacharidové matrice vyvstávají pomaleji než vČtší tukové kuliþky a výrobek se stává homogennČjší v celém svém objemu. Cílem práce bylo využití nízkometylovaného pektinu jako možné náhrady tavicích solí pĜi výrobČ tavených sýrĤ. Pro zvýšení emulgaþní schopnosti systému se pektin používal v kombinaci s lecitinem. U modelových vzorkĤ byla rĤznými metodami studována pĜedevším homogenita výrobku. Materiál a metodika Tavené sýry s obsahem 40 % (w/w) sušiny a 45 % (w/w) tuku v sušinČ byly vyrábČny na pĜístroji Vorwerk Thermomix TM 31-1 blender cooker (Vorwerk & Co. Thermomix; NČmecko). Obdobné zaĜízení již bylo námi pro výrobu tavených sýrĤ použito16. K výrobČ modelových tavených sýrĤ se používaly následující suroviny: eidamská cihla (30 % w/w tuku v sušinČ), máslo, deionizovaná voda a pĜídatné látky - pektin (Sigma Aldrich, USA) v koncentraci 0,1 % w/w a lecitin (Lucas Mayer, USA) v koncentracích 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 a 1,0 % w/w. Koncentrace pektinu 0,1 % w/w byla stanovena na základČ pĜedcházejících experimentĤ17. Kontrolní vzorek byl vyroben standardnČ tj. s pĜídavkem 2 % (w/w) fosfátových tavicích solí. Do modelových vzorkĤ se místo tavicích solí pĜidávaly kombinace pektinu a lecitinu ve výše znČných koncentracích. Modelové vzorky se tavily pĜi 90°C s výdrží jedné minuty, pĜiþemž celková doba tavení byla 10-13 minut. Vyrobeno tak bylo šest šarží modelových vzorkĤ ve dvou opakováních. Po výrobČ byly modelové vzorky zchlazeny a skladovány pĜi teplotČ 6±2 °C. Sloupec (pĜíþný Ĝez) výrobku (cca 1,2 cm) byl rozdČlen na nČkolik vrstev - 2 pro reometrii a 5 pro obrazovou analýzu. Jednotlivé vrstvy byly následnČ analyzovány a srovnávány pomocí senzorické analýzy, analýzy obrazu a dynamické oscilaþní reometrie, pĜiþemž sledována byla pĜedevším homogenita. Senzorická analýza byla provedena skupinou tĜí expertĤ školených podle ISO 8586-2. Hodnocen byl vzhled, konzistence a homogennost výrobku. Vzorky pro analýzu obrazu byly pĜipravovány na pĜístroji Microm HM 550, síla Ĝezu byla nastavena na 7ȝm. ěezy byly pĜichyceny na podložní skla a po uschnutí byly barveny dle metodiky Gistingrové18 selektivním barvením pro zvýraznČní tukových kuliþek olejovou þervení. Pro vlastní analýzu obrazu byl použit mikroskop Jenaval 250-CF (zvČtšení 10x12,5), fotoaparát Canon PowerShot A620, software na snímání obrazu 257

PSRemote Version 1.5.2. a program pro analýzu obrazu ACC scientific image analyzer Version 6.0 (SOFO, CZ). Sledován byl poþet a prĤmČrná velikost (plocha) tukových kuliþek v jednotlivých vrstvách modelových vzorkĤ. Výsledky obrazové analýzy byly vyhodnocovány pomocí programu Unistat Version 5.5 Mann-Whitneyovým U testem. Hladina statistické významnosti byla stanovena na P < 0,01. Oscilaþní dynamická reometrie byla provádČna na pĜístroji Bohlin Gemini (Malvern Instruments, UK) v geometrii deska-deska, o prĤmČru 40 mm a šíĜce štČrbiny 1 mm. Experiment byl provádČn v oblasti lineární viskoelasticity s amplitudou smykového napČtí 20 Pa, v rozsahu frekvencí 0,1 - 50 Hz a pĜi teplotČ mČĜení 20°C. Sledovány byly parametry elastický (G´) a ztrátový (G´´) modul pružnosti. Oscilaþní dynamická reometrie byla zamČĜena na detekci rĤzné síly gelu vrstev výrobku, jejichž odlišnost by indikovala nehomogenitu materiálu. Výsledky a diskuze Senzorickým hodnocením se zjistilo, že modelové vzorky vyrobené bez pĜídavku tavicích solí nebily v celém svém objemu homogenní. Docházelo pĜedevším k oddČlování horní vrstviþky, která byla Ĝidší, mČkþí a zpravidla svČtlejší než vrstva spodní. PĜi koncentracích lecitinu 0,2-0,8 % w/w vykazovala spodní vrstva ve své konzistenci urþitý stupeĖ krupiþkovitosti. Rostoucí obsah lecitinu zlepšoval emulgaci tuku. Výška horní pravdČpodobnČ tukové fáze se pĜi zvyšující se koncentraci lecitinu snižovala a spodní vrstva se stávala ménČ krupiþkovitou. Vzorky s obsahem 1 % (w/w) lecitinu byly pĜi senzorickém hodnocení homogenní. Výše zmínČný teoretický pĜedpoklad, že horní oddČlená vrstviþka je tvoĜena pĜedevším tukem, byl ovČĜen provedením dalších analýz. Analýza obrazu, jakožto objektivní nedestruktivní metoda, zaujímá v analýze potravin významnou roli19, neboĢ kvantitativní charakteristiky získané touto metodou pro jednotlivé souþásti potravin je možné využít pĜi posuzování jejich kvality resp. nČkterých zpĤsobĤ jejich falšování. U modelových vzorkĤ bez tavicích solí s nižším obsahem lecitinu, bylo na Ĝezech barvených olejovou þervení, která barví tukové kuliþky pomeranþovČ, makroskopicky patrné nahromadČní tuku v horní vrstviþce výrobku. S rostoucí koncentrací lecitinu se tato vrstviþka snižovala. Výsledky obrazové analýzy uvádí tabulky I a II. Tabulka I uvádí poþet tukových kuliþek v jednotlivých vrstvách jednotlivých šarží modelových vzorkĤ a tabulka II zahrnuje prĤmČrnou velikost tukových kuliþek v jednotlivých vrstvách modelových vzorkĤ. Výsledky v tabulkách jsou uvádČny jako prĤmČr ± smČrodatná chyba. Poþet tukových kuliþek se v jednotlivých vrstvách vzorku kontroly statisticky významnČ neliší, pĜesto dochází k mírnému poklesu poþtu tukových kuliþek. U modelových vzorkĤ bez tavicích solí pouze s pektinem a lecitinem dochází k postupné zmČnČ. Zatímco u vzorku s obsahem lecitinu 0,2 % w/w dochází ještČ k mírnému poklesu poþtu tukových kuliþek (obdobnČ jako u kontroly), u vzorku s obsahem lecitinu 0,4 % w/w se nejvíce tukových kuliþek nachází ve stĜední tĜetí vrstvČ výrobku. Od koncentrace lecitinu 0,6 % w/w dochází k postupnému zvyšování poþtu tukových kuliþek od vrstvy první k páté. Tento trend je vysvČtlitelný emulgací tuku a koreluje s výsledky druhé tabulky. Námi získané výsledky prĤmČrné velikosti tukových kuliþek ve vzorku kontroly byly srovnatelné se závČry práce Awad et al.4, kteĜí studovali texturu a mikrostrukturu resp. poþet a velikost tukových kuliþek v tavených sýrech vyrobených s rĤznými tavicími solemi. Zatím co u vzorku kontroly byla prĤmČrná velikost tukových kuliþek v jednotlivých vrstvách témČĜ stejná a dosahovala hodnot 54 ± 2 až 65 ± 2 ȝm2, u ostatních vzorkĤ docházelo v rámci jednotlivých vrstev k postupnému zmenšování prĤmČrné plochy tukových kuliþek. NejvČtší tukové kuliþky se nacházely v první vrstvČ (nejblíže víþku) a nejmenší ve vrstvČ páté (u dna výrobku). Tento trend byl patrný u všech modelových vzorkĤ bez obsahu tavicích solí. Z uvedeného vyplývá, že þím vČtší jsou tukové kuliþky, tím ménČ jsou vazebnými interakcemi drženy v matrici sýra a dochází k jejich vyvstávání na povrch, kterému nezabrání ani 1% obsah lecitinu. Obrazová analýza tedy prokázala, že vzorky kontroly se ve sloupci výrobku statisticky významnČ neliší a to v žádném ze zkoumaných parametrĤ, což znamená, že vzorek je homogenní, na rozdíl od ostatních šarží modelových vzorkĤ, které se více þi ménČ v jednotlivých parametrech ve sloupci výrobku liší a nejsou tedy plnČ homogenní.

258

Tabulka I Poþet tukových kuliþek v jednotlivých vrstvách jednotlivých šarží tavených sýrĤ; (prĤmČr ± smČrodatná chyba) vzorek/ vrstva 1.vrstva 2.vrstva 3.vrstva 4.vrstva 5.vrstva 722 ± 100a

465 ± 69a

452 ± 29a

426 ± 52a

572 ± 57a

+

821 ± 75a,c

799 ± 32a

651 ± 28c,d

549 ± 34b,d

586 ± 51b,c

+

721 ± 105a,b

657 ± 50a

836 ± 65a,b

768 ± 32b

692 ± 38a,b

+

700 ± 39a

748 ± 28a,b

755 ± 28a,b

895 ± 47b,c

1038 ± 69c

+

645 ± 41a

728 ± 40a

723 ± 40a

672 ± 30a

846 ± 67a

+

377 ± 23a

374 ± 28a

434 ± 30a

440 ± 27a

507 ± 43a

kontrola pektin 0,1% (w/w) lecitin 0,2 % (w/w) pektin 0,1% (w/w) lecitin 0,4 % (w/w) pektin 0,1% (w/w) lecitin 0,6 % (w/w) pektin 0,1% (w/w) lecitin 0,8 % (w/w) pektin 0,1% (w/w) lecitin 1,0 % (w/w)

Tabulka II Plocha tukové kuliþky [ȝm2] v jednotlivých vrstvách jednotlivých šarží tavených sýrĤ; (prĤmČr ± smČrodatná chyba) vzorek/ vrstva 1.vrstva 2.vrstva 3.vrstva 4.vrstva 5.vrstva 65 ± 2a

54 ± 2a

55 ± 2a

58 ± 2a

64 ± 2a

+

525 ± 20a

207 ± 7b

150 ± 5b,c

124 ± 3c

114 ± 2c

+

441 ± 64a,c

531 ± 19a

393 ± 16a,c

314 ± 8c

200 ± 4b

+

462 ± 13a

364 ± 10a,b

303 ± 7b

179 ± 4c

141 ± 2c

+

371 ± 12a

278 ± 8b

267 ± 7b

246 ± 7b

136 ± 2c

+

468 ± 16a

290 ± 10b

267 ± 8b

211 ± 6b

107 ± 2c

kontrola pektin 0,1% (w/w) lecitin 0,2 % (w/w) pektin 0,1% (w/w) lecitin 0,4 % (w/w) pektin 0,1% (w/w) lecitin 0,6 % (w/w) pektin 0,1% (w/w) lecitin 0,8 % (w/w) pektin 0,1% (w/w) lecitin 1,0 % (w/w)

Oscilaþní dynamická reometrie byla vzhledem k charakteru modelových vzorkĤ provádČna pouze u kontroly a u šarže vzorku s obsahem pektinu 0,1 % w/w a 1,0 % w/w lecitinu. U ostatních vzorkĤ s nižším obsahem lecitinu, nebylo možno ĜádnČ od sebe jednotlivé vrstvy oddČlit. Horní vrstvy byly pĜíliš Ĝídké a bez podstatného narušení struktury by nebylo možné je pĜenést do mČĜící geometrie. NadmČrnou manipulací s matricí totiž dochází k zmČnám jejich viskoelastických vlastností. Obr. 1. znázorĖuje u modelových vzorkĤ (kontroly a vzorku s obsahem pektinu 0,1 % w/w a 1,0 % w/w lecitinu) závislost elastického (G´) a ztrátového (G´´) modulu pružnosti na frekvenci. Z grafu je patrno, že elastický modul pružnosti je vždy vyšší než ztrátový modul pružnosti, což svČdþí o gelovitém charakteru vzorku. U vzorku kontroly se moduly jednotlivých vrstev nelišily a je tedy možno konstatovat, že vzorek je homogenní. Pro pĜehlednost obr. 1 byla použita pouze jedna prĤmČrná kĜivka pro elastický a jedna pro ztrátový modul pružnosti. Oba moduly pružnosti dosahují nejvyšších hodnot u kontroly, z þehož vyplývá, že kontrola je ze zkoumaných vzorkĤ nejtužší. Elastický i ztrátový modul pružnosti se v jednotlivých vrstvách modelového vzorku s pektinem a lecitinem lišil. Hodnoty modulĤ spodní vrstvy se pohybovaly ve vyšších hodnotách než moduly horní vrstvy. Spodní vrstva vzorku s pektinem a lecitinem je pak mnohem tužší než vrstva horní. Vzorek s obsahem pektinu 0,1 % w/w a lecitinu 1,0 % w/w se v tuhosti jednotlivých vrstev lišil a vzorek tedy není homogenní. 259

Elastický G` a ztrátový G`` modul pruznosti [Pa]

4

10

3

10

0,1

1

10

Frekvence f [Hz]

Obr. 1. Závislost elastického G´ (plné symboly) a ztrátového G´´ (prázdné symboly) modulu pružnosti na frekvenci ( – kontrola; z { – spodní vrstva (modelový vzorek s obsahem 0,1 % w/w pektinu a 1% w/w lecitinu); S U – horní vrstva (modelový vzorek s obsahem 0,1 % w/w pektinu a 1% w/w lecitinu)

ZávČr V práci byl použit nízkometylovaný pektin (0,1 % w/w) v kombinaci s lecitinem (0,2-1,0 % w/w) jako možná náhrada fosfátových tavicích solí pĜi výrobČ tavených sýrĤ. U vyrobených modelových vzorkĤ byla sledována jejich homogennost. Z výsledkĤ vyplývá, že uvedenými kombinacemi pektinu a lecitinu je možno vyrobit roztíratelný sýrový výrobek, který se stává homogennČjší s rostoucí koncentrací lecitinu. Bez použití tavicích solí však nebylo možno žádnou z výše uvedených kombinací vyrobit plnČ homogenní produkt. Další experimenty však ukazují, že pĜi použití jiných pĜídatných látek z Ĝady hydrokoloidĤ je možno dosáhnout lepších výsledkĤ a vyrobit produkt akceptovatelný spotĜebitelem. PodČkování: Práce vznikla za podpory projektu MŠMT: 6215712402 Použitá literatura: 1. GUINEE, T.P., CARIû, M. KALÁB, M. Pasteurized processed cheese and substitute/imitation cheese products. In Fox, P.H. (Ed.) Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology. vol. 2, Major Cheese Groups, 3.ed. Elsevier Applied Science, London and New York, 2004, p. 349-394. 2. LUKÁŠOVÁ, J. Hygiena a technologie mléþných výrobkĤ. VFU Brno, 2001, 181 s. 3. VYHLÁŠKA þ. 77/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro mléko a mléþné výrobky, mražené krémy a jedlé tuky a oleje, v platném znČní. 4. AWAD, R.A., ABDEL-HAMID, L.B., EL-SHABRAWY, S.A., SINGH, R.K. Texture and microtexture of block type processed cheese with formulated emulsifying salt mixtures. Lebensmittel - Wissenschaft und Technologie, 2002, vol. 35, no. 1, p. 54-61. 5. FOX, P.F., GUINEE, T.P., COGAN, T.M., McSWEENEY, P.L.H. Fundamentals of Cheese Science. Aspen Publication, 2000, 559 p.

260

6. MOLINS, R.A. Phosphates in food. Boca Raton: CRC Press, 1991, 261 p. 7. AWAD, R.A., ABDEL-HAMIC, L.B., EL-SHABRAWY, S.A., SINGH, R.K. Physical and sensory properties of block processed cheese with formulated emulsifying salt mixtures. International Journal of Food Properties, 2004, vol. 7, p. 429-448. 8. PLUTA, A., ZIARNO, M., SMOLIēSKA, A. MoĪliwoĞci zastosowania hydrokoloidów w produkcji serów topionych. Przemysl SpoĪywczy, 2000, vol. 5, p. 42-44. 9. SMEWING, J. Hydrocolloids. In Food texture: measurement and perception. Eds. Rosenthal, A.J., Aspen Publishers, 1999, p. 282-303. 10. MAY, C.D. Pectins. In Handbook of hydrocoloids. Eds. Phillips, G.O.& Williams, P.A., Woodhead Publishing Limited and CRC Press: Boca Raton, 2000, p. 169-188. 11. TUINIER, R., ROLIN, C., de KRUIF, C.G. Electrosorption of pectin onto casein micelles, Biomacromolecules, 2002, vol. 3, p. 632-638. 12. VELÍŠEK, J., Chemie potravin, OSSIS, 1999, 352 s. 13. MATIA-MERINO, L., LAU, K., DICKINSON, E. Effects of low-methoxyl amidated pectin and ionic calcium on rheology and microstructure of acid-induced sodium caseinate gels. Food Hydrocolloids, 2004, vol. 18, p. 271-281. 14. MARAZIONE, A., de KRUIF, C.G. Interaction of pectin and casein micelles. Food Hydrocolloids, 2000, vol. 14, p. 391-394. 15. OGAVA, S., DECKER, E. A., McCLEMENTS D.J. Production and characterization of O/W emulsions containing droplets stabilized by lecithin-chitosan-pectin multilayered membranes. Journal of agricultural and food chemistry, 2004, vol. 52, p. 3595-3600. 16. ýERNÍKOVÁ, M., BUĕKA, F., PAVLÍNEK, V., BěEZINA, P. , HRABċ, J., VALÁŠEK, P. Effect of carrageenan type on viscoelastic properties of processed cheese. Food Hydrocolloids (2007), doi:10.1016/j.foodhyd.2007.05.020 17. ýERNÍKOVÁ, M., BUĕKA, F., HLADKÁ, K., BěEZINA, P. , HRABċ, J. Pectin in emulsifiyng agents replacing during processed cheese production, In Sborník konference: Bezpeþnost a kontrola potravín, II diel, Slovenská poĐnohospodárska univerzita v Nitre, 2007, p. 267-270. 18. GISTINGROVÁ, Z. VytvoĜení postupu pro stanovení velikosti tukových kuliþek ve vzorcích taveného sýry pomocí analýzy obrazu. BakaláĜská práce, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 2005, 47 p. 19. DU, CH.J., SUN, D.W. Recent developments in the applications of image processing techniques for food quality evaluation. Trends in Food Science and Technology, 2004, vol. 15, p.230-249.

Kontaktní adresa: Michaela ýerníková, MVDr., Ústav potravináĜského inženýrství, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve ZlínČ, nám. T.G.Masaryka 275, 762 72 Zlín, tel. 576 031 511, e-mail: [email protected]

261

VLIV PěÍDAVKU PEKTINU A VYBRANÝCH CUKRģ NA VISKOELASTICKÉ A SENZORICKÉ VLASTNOSTI TAVENÝCH SÝRģ MackĤ Ivana 1, BuĖka František 1, Pavlínek Vladimír 2, HrabČ Jan 1 1 Ústav potravináĜského inženýrství, Univerzita Tomáše Bati ve ZlínČ, 2 Centrum polymerních materiálĤ, Univerzita Tomáše Bati ve ZlínČ The effect of pectin and selected low molecular saccharides on viscoelastic and sensory properties of model processed cheese Summary: The scope of this study was to examine the effect of selected low molecular solid cosolutes (D-glucose, Dfructose, D-galactose and lactose) combined with pectin addition (0.2% w/w, 0.4 % w/w) on the consistency of model processed cheese with 40% w/w dry matter and 50% w/w fat in dry matter. The samples were evaluated by dynamic oscillation rheometry with plate-plate geometry (gap 1 mm, diameter 40 mm) and by sensory analysis. Rheological measurements were performed after 14 days of storage at 6±2°C in the linear viscoelastic region of samples in the frequency sweep mode (0.1 – 50.0 Hz). The values of the storage modulus (G´), loss modulus (G´´), complex modulus (G*) and loss tangent (tan G) were used for evaluation of rigidity of model processed cheese. In the present work it was found that all applied low molecular saccharides caused the decrease in the firmness of model processed cheese with or without pectin. The rigidity of three-dimensional network in processed cheese was declined by these cosolutes mostly to the similar level regardless of their steric arrangement (two epimers D-glucose and D-galactose) and chemical structure (mono- and disaccharide, aldose and ketose). Flavour of model processed cheese was not worse by pectin or low molecular saccharide addition.

Úvod Tavené sýry patĜí mezi mlékárenské výrobky pĜipravované tepelnou úpravou pĜírodních sýrĤ (napĜ. Eidamská cihla, Eidamský blok) za pĜídavku tavicích solí1,2. Jako tavicí soli se obvykle používají sodné soli fosfátĤ, polyfosfátĤ þi citrátĤ. KromČ tČchto základních složek se mohou do tavené smČsi pĜidávat další suroviny, jako napĜ. voda, máslo, tvaroh, krém (sýr již utavený), pĜísady ovlivĖující chuĢ a barvu, konzervaþní látky, hydrokoloidy aj. Velice dĤležitým organoleptickým znakem tavených sýrĤ kromČ chuti a vĤnČ, na který kladou výrobci i spotĜebitelé velký dĤraz, je jejich konzistence. Konzistence mĤže být ovlivnČna Ĝadou rĤzných faktorĤ napĜ. obsahem sušiny, tuku bílkovin, zralostí pĜírodního sýra, hodnotou pH, pĜítomností iontĤ (Ca2+, Na+, K+), zpĤsobem zpracování taveniny apod.2–5. V dnešní dobČ se objevuje snaha vyrábČt tavené výrobky s nižšími náklady na suroviny, tzv. analogy, se sníženým obsahem nákladnČjších mléþných složek (bílkovin þi mléþného tuku), které jsou nahrazovány levnČjšími rostlinnými zdroji (sojová bílkovina, palmový olej, sojový olej, pĜírodní þi modifikované škroby)3,6. Pojem „analog tavených sýrĤ“ se v þeské legislativČ nevyskytuje, avšak na trhu jsou dostupné produkty oznaþené napĜ. jako tavený výrobek þi tavené plátky (napĜ. VintíĜ tavený výrobek, Javor jemný tavený). Náhrada mléþných komponent rĤznými hydrokoloidy þi rostlinnými tuky mĤže mít velký vliv na konzistenci výsledného výrobku3,7. PĜídavek hydrokoloidĤ mĤže pĜispČt k tvorbČ požadované struktury výrobku (napĜ. zvyšováním vazby vody), a tím ke zvýšení jeho atraktivity pro zákazníka. Hydrokoloidy lze tedy využít napĜ. jako stabilizátory v tavených sýrech s vysokým obsahem vlhkosti7,8. Mezi hydrokoloidy bČžnČ používané v potravináĜském prĤmyslu patĜí polysacharid pektin (želírující þinidlo, emulgátor, stabilizátor). Základní struktura pektinu je tvoĜena lineárním ĜetČzcem, který je složen z 25-100 jednotek kyseliny D-galakturonové spojených vazbami D-(1ĺ4). Hlavní ĜetČzec bývá pĜerušován ramnozylovými zbytky, k nimž jsou þasto pĜipojeny neutrální cukry (napĜ. arabinóza, galaktóza) tvoĜící postranní ĜetČzce. DĤležitou charakteristikou ovlivĖující technologické vlastnosti pektinu, zejména mechanizmus tvorby gelu, je tzv. stupeĖ esterifikace (DE). Ten udává pomČr mezi jednotkami kyseliny polygalakturonové ve formČ methylesteru a celkovým poþtem jednotek kyseliny galakturonové v ĜetČzci. Podle DE se pektiny dČlí na vysokoesterifikované (HMP; DE > 50 %) a nízkoesterifikované (LMP; DE < 50 %). Zatímco HMP tvoĜí gely v pĜítomnosti vysokého obsahu nízkomolekulárních cukrĤ (> 55%) a pĜi pH 3,5, 262

LMP vyžaduje k tvorbČ gelu pouze pĜítomnost Ca2+ iontĤ9,10. Studiem vlivu nízkomolekulárních sacharidĤ na tvorbu gelu LMP v definovaných tĜísložkových systémech 11,12 (pektin+voda+monosacharid) se zabývá velké množství autorĤ napĜ. Tsoga a kol. , Evageliou a kol.13. V dostupné literatuĜe není však dostatek informací o vlivu nízkomolekulárních sacharidĤ na pevnost gelu LMP v reálných potravinách (napĜ. tavených sýrech). Monosacharidy þi disacharidy se mohou do taveného sýra þi do tavených výrobkĤ dostat prostĜednictvím rĤzných ingrediencí (pĜísady ovlivĖující chuĢ, pĜírodní nebo modifikované škroby, sušená syrovátka, sušené mléko), kterých mohou být souþástí3. Cílem této studie bylo pomocí dynamické oscilaþní reometrie posoudit vliv vybraných nízkomolekulárních sacharidĤ (D-fruktóza, D-glukóza, D-galaktóza, laktóza) na konzistenci a senzorické vlastnosti tavených sýrĤ s pĜídavkem neesterifikovaného pektinu. Bylo sledováno, zda je konzistence vzorkĤ ovlivnČna všemi vybranými nízkomolekulárními sacharidy (pĜi stejné koncentraci) stejnou mČrou þi zda se rĤzné nízkomolekulární sacharidy (rozdílné prostorové uspoĜádání, pĜítomnost rĤzné funkþní skupiny v molekule) liší ve velikosti jejich úþinku. Srovnáván byl také úþinek pĜídavku monosacharidu a disacharidu na konzistenci modelových tavených sýrĤ. Materiál a metody Jako základní suroviny pro výrobu modelových tavených sýrĤ byly použity následující suroviny: (i) Eidamská cihla (30 % tuk v sušinČ, 50 % sušina), (ii) þerstvé máslo (iii) deionizovaná voda, (iv) komerþní tavicí soli. Dále byly použity nízkomolekulární sacharidy, tj. D-glukóza (Glc), D-fruktóza (Fru), D-galaktóza (Gal) a laktóza (Lak), a nízkoesterifikovaný pektin (CP). Modelové tavené sýry (40 % w/w sušina, 50 % w/w tuku v sušinČ) byly vyrobeny pomocí zaĜízení Vorwerk Thermomix TM 31 blender cooker (Vorwerk & Co. Thermomix; GmbH, Wuppertal, Germany). Nízkoesterifikovaný pektin v práškové formČ byl nejprve hydratován ve vodČ zahĜáté na 60 °C (10 minut). Nízkomolekulární sacharidy byly pĜed pĜidáním do smČsi surovin rozpuštČny ve vodČ. Tavení pĜipravené smČsi surovin se provádČlo pĜi tavicí teplotČ 90 °C po dobu 1 min. Vzorky byly až do analýz uchovávány v lednici pĜi teplotČ 6 ± 2 °C. Výše uvedeným zpĤsobem byly pĜipraveny 4 skupiny modelových tavených sýrĤ (skupina I, II, III a IV). První dvČ skupiny obsahovaly 15 následujících šarží: (i) kontrolní vzorek, (ii) vzorek obsahující 0,2 % w/w pektinu, (iii) vzorek obsahující 0,4 % w/w pektinu, (iv) vzorky obsahující 1 % w/w nízkomolekulárního sacharidu (4 šarže s pĜídavkem Glc, Fru, Gal, Lak), (v) vzorky obsahující 0,2 % w/w pektinu a 1 % w/w nízkomolekulárního sacharidu (4 šarže s pĜídavkem Glc, Fru, Gal, Lak), (vi) vzorky obsahující 0,4 % w/w pektinu a 1 % w/w nízkomolekulárního sacharidu (4 šarže s pĜídavkem Glc, Fru, Gal, Lak). U skupin III a IV nebyly vyrobeny vzorky obsahující laktózu; každá z tČchto skupin obsahovala tedy pouze 12 šarží. Eidamská cihla byla charakterizována prostĜednictvím pH, obsahu sušiny, tuku, hrubé bílkoviny. Vyrobené tavené sýry byly charakterizovány pomocí obsahu sušiny, tuku, popela a pH. Obsah sušiny byl urþen gravimetricky podle ýSN EN ISO 553414, obsah tuku byl stanoven acidobutyrometricky podle van Gulika, pH bylo zjištČno pomocí pH-metru se sklenČnou elektrodou, popel byl stanoven žíháním vzorku v muflové peci pĜi teplotČ 650±5 °C po dobu minimálnČ 4 hodin a množství hrubé bílkoviny (N × 6,38) bylo urþeno Kjeldahlovou metodou. Konzistence tavených sýrĤ byla hodnocena pomocí dynamické oscilaþní reometrie (reometr Bohlin GEMINI, Malvern Instruments Ltd., Velká Británie) s mČĜící geometrií deskadeska (prĤmČr 40 mm, štČrbina 1 mm). Ze získaných hodnot elastického (G´) a ztrátového (G´´) modulu byly pro referenþní frekvenci 1 Hz byly vypoþteny hodnoty tangentu úhlu fázového posunu (tan G = G´´/G´) a hodnoty komplexního modulu pružnosti G* = [(G´)2 + (G´´)2]0,5. Reologická mČĜení vzorkĤ byla provádČna pĜi konstantní teplotČ 20 °C v rozsahu frekvencí 0,1–50,0 Hz v oblasti lineární viskoelasticity (amplituda smykového napČtí 40 Pa). Všechny vzorky byly analyzovány po 14 dnech skladování pĜi teplotČ 6±2 °C. Získaná reologická data byla podrobena statistické analýze pomocí parametrického Studentova t-testu (Unistat 5.5, hladina významnosti 5%). Dále byla provedena senzorická analýza modelových tavených sýrĤ s využitím stupnicových testĤ, kterými byly hodnoceny chuĢ a vĤnČ vzorku. Výsledky senzorického hodnocení 263

byly statisticky zpracovány pomocí neparametrického Kruskall-Wallisova testu (Unistat 5.5, hladina významnosti 5%). Výsledky a diskuze Jednotlivé skupiny tavených sýrĤ (I, II, III a IV) byly pĜipravené v rĤzné dny stejným technologickým postupem a na stejném zaĜízení. Základní surovinou pro jejich výrobu byla Eidamská cihla, jejíž základní chemické parametry (sušina, tuk, pH, hrubá bílkovina) jsou uvedeny v Tabulce I. RĤzná surovina byla použita z dĤvodu vyšší vypovídací schopnosti výsledkĤ pro prĤmyslovou praxi, kde je velmi obtížné zajistit surovinu konstantních vlastností v delším þasovém období, zejména surovinu s konstantním stupnČm zralosti. Výsledky základní chemické analýzy modelových tavených sýrĤ se v rámci urþité skupiny signifikantnČ nelišily, a proto mohly být jejich reologické a senzorické vlastnosti vzájemnČ porovnány. Agregované výsledky chemické analýzy pro jednotlivé skupiny tavených sýrĤ jsou uvedeny v Tabulce II. Tabulka I Výsledky chemických analýz Eidamských cihel použitých pro výrobu modelových tavených sýrĤ skupin I, II, III a IV (prĤmČr ± smČrodatná odchylka). Eidamská cihla

Sušina (% w/w)

Tuk (% w/w)

I II III IV

51,14 ± 0,22 51,09 ± 0,39 53,33 ± 0,30 53,41 ± 0,96

18,1 ± 0,5 17,0 ± 0,0 15,6 ± 0,5 16,5 ± 0,4

Hrubá bílkovina (% w/w) 29,6 ± 0,5 30,3 ± 0,0 32,8 ± 0,3 32,5 ± 0,0

pH 5,80 ± 0,01 5,91 ± 0,01 5,63 ± 0,01 5,76 ± 0,01

Tabulka II Výsledky chemické analýzy pro jednotlivé skupiny tavených sýrĤ (prĤmČr ± smČrodatná odchylka). Skupina tavených sýrĤ I II III IV

Sušina (% w/w)

Tuk (% w/w)

Popel (% w/w)

pH

42,60 ± 0,48 41,17 ± 0,55 42,25 ± 0,57 42,38 ± 0,50

22,4 ± 0,5 22,9 ± 0,3 22,5 ± 0,4 21,6 ± 0,3

4,2 ± 0,2 4,3 ± 0,2 4,2 ± 0,2 4,2 ± 0,1

5,94 ± 0,02 6,17 ± 0,03 5,87 ± 0,08 5,94 ± 0,02

V následujících tabulkách III a IV jsou znázornČny hodnoty elastického a ztrátového modulu a hodnoty tangentu úhlu fázového posunu pro referenþní frekvenci 1 Hz pro þtyĜi sledované skupiny modelových tavených sýrĤ. Zvyšující se hodnoty elastického, resp. ztrátového modulu pružnosti indikují rostoucí elastickou, resp. viskozitní složku vzorku. Tangens úhlu fázového posunu znázorĖuje podíl viskózní a elastické složky, kdy s jeho klesající hodnotou roste elasticita vzorku. Z výsledkĤ uvedených v Tabulkách III a IV vyplývá, že pĜídavek 0,2 a 0,4 % w/w pektinu zpĤsobil zvýšení hodnot elastického a ztrátového modulu u vČtšiny sledovaných tavených sýrĤ ve srovnání s kontrolním vzorkem (P < 0.05). Ve všech pĜípadech došlo vlivem pĜídavku 0,2 þi 0,4 % w/w pektinu k poklesu tangentu úhlu ztrátového posunu, což znaþí zvýšení elasticity vzorkĤ ve srovnání s kontrolou téže skupiny tavených sýrĤ. PĜídavek nízkomolekulárního sacharidu (1 % w/w) do taveného sýru bez pektinu zpĤsobil vždy pokles elastického modulu ve srovnání s kontrolou. U vzorkĤ s pĜídavkem pektinu byl rovnČž pozorován pokles elastického modulu v pĜípadČ, že byl aplikován nízkomolekulární sacharid. U ztrátového modulu byl zjištČn obdobný trend; pouze u skupiny I a II nebyl pokles hodnot ztrátového modulu vlivem pĜídavku nízkomolekulárního sacharidu vždy statisticky významný (viz Tabulka III). Hodnoty elastického a ztrátového modulu poklesly pĜídavkem nízkomolekulárního sacharidu ve vČtšinČ pĜípadĤ na stejnou hodnotu (P 0,05). D-glukóza (aldohexóza) snížila tuhost sýra stejnČ jako D-fruktóza (ketohexóza), D-glukóza zpĤsobila stejný pokles tuhosti vzorkĤ jako její 264

C-4 epimer D-galaktóza. Také testované monosacharidy (D-glukóza, D-fruktóza, D-galaktóza) snížily tuhost taveného sýra obdobnČ jako disacharid (laktóza). Tabulka III Hodnoty elastického (G´) a ztrátového (G´´) modulu pružnosti a hodnoty tangentu úhlu fázového posunu (tan G) pro referenþní frekvenci 1 Hz pro I. a II. skupinu tavených sýrĤ (prĤmČr ± smČrodatná odchylka). Rozdílné písmenné indexy znaþí signifikantní rozdíl (P < 0,05) mezi hodnotami v rámci jednoho sloupce. Vzorek Kontrola Lak Gal Fru Glc 0,2CP 0,2CP;Lak 0,2CP;Gal 0,2CP;Fru 0,2CP;Glc 0,4CP 0,4CP;Lak 0,4CP;Gal 0,4CP;Fru 0,4CP;Glc

Skupina tavených sýrĤ I G´ [Pa] G´´ [Pa] 6084 r 314 a,f 3691 r 173 b 3623 r 218 b 3491 r 204 b 3568 r 451 b 8896 ± 453 c 5957 ± 166 a 5812 ± 526 a,e,g,h 5955 ± 166 a 5864 ± 397 a,g 10353 r 631 c 6878 r 177 d,e 6689 r 258 d,f,g 6983 r 186 d 6826 r 211 d,f,h

3723 r 314 a 2853 r 173 b 2844 r 218 b 2674 r 204 b 2776 r 351 b 4537 ± 253 a,c 4044 ± 166 a 3964 ± 326 a 4115 ± 166 a 4022 ± 297 a 4969 r 331 c 4361 r 177 a,c 4341 r 258 a,c 4385 r 186 a,c 4348 r 211 a,c

tan G [-] 0,612 0,773 0,785 0,766 0,778 0,510 0,679 0,682 0,691 0,686 0,480 0,634 0,649 0,628 0,637

II G´ [Pa]

G´´ [Pa]

4381 r 470 a,e 1779 r 293 b 1854 r 115 b 1870 r 74 b 1894 r 41 b 6118 ± 318 c 4528 ± 166 a,g 4333 ± 475 a,e 4570 ± 156 a,g 4344 ± 132 a 8570 r 354 d 5003 r 108 e 5428 r 42 f 5101 r 143 e 5354 r 453c,e,f,g

3071 r 370 a,d 1558 r 293 b 1577 r 115 b 1666 r 74 b 1684 r 41 b 3738 ± 218 a,d 3210 ± 166 a 3167 ± 375 a,d 3281 ± 156 a 3154 ± 132 a 4482 r 234 c 3407 r 108 a,d 3637 r 42 d 3377 r 143 a,d 3651 r 253 a,d

tan G [-] 0,701 0,876 0,851 0,891 0,889 0,611 0,709 0,731 0,718 0,726 0,523 0,681 0,670 0,662 0,682

Tabulka IV Hodnoty elastického (G´) a ztrátového (G´´) modulu pružnosti a hodnoty tangentu úhlu fázového posunu (tan G) pro referenþní frekvenci 1 Hz pro III. a IV. skupinu tavených sýrĤ (prĤmČr ± smČrodatná odchylka). Rozdílné písmenné indexy znaþí signifikantní rozdíl (P < 0,05) mezi hodnotami v rámci jednoho sloupce. Vzorek Kontrola Gal Fru Glc 0,2CP 0,2CP;Gal 0,2CP;Fru 0,2CP;Glc 0,4CP 0,4CP;Gal 0,4CP;Fru 0,4CP;Glc

Skupina tavených sýrĤ III G´ [Pa] G´´ [Pa] a 4850 r 255 3404 r 155 a 2947 r 237 b 2296 r 237 b 2984 r 253 b 2471 r 253 b 3017 r 357 b 2456 r 357 b 7574 ± 3 c 4703 ± 13 c 5481 ± 260 d 3968 ± 170 d,f 5066 ± 245 a,e 3617 ± 245a 5188 ± 208 d,e 3953 ± 208 d 8612 r 60 f 5055 r 160 e 6560 r 211 g 4192 r 181 d,f 6635 r 735 g 4107 r 235 d,f 6748 r 188 g 4251 r 188 f

IV tan G [-] G´ [Pa] 0,702 6353 r 568 a 0,779 4229 r 186 b,d 0,828 4085 r 89 b 0,814 4291 r 0 c,d 0,621 8949 ± 132 e 0,724 5369 ± 397 f 0,714 5605 ± 372 f 0,762 5439 ± 347 f 0,587 11760 r 382 g 0,639 8984 r 139 e 0,619 8430 r 559 e 0,630 8724 r 471 e 265

G´´ [Pa] 4149 r 217 a 3202 r 115 b 3269 r 141 b 3312 r 0 b 4765 ± 146 c 3644 ± 183 d 3694 ± 154 d 3717 ± 147 d 5424 r 216 e 4600 r 157 c 4612 r 254 c 4643 r 235 c

tan G [-] 0,653 0,757 0,800 0,772 0,532 0,679 0,659 0,683 0,461 0,512 0,547 0,532

Obr. 1. Závislost komplexního modulu pružnosti (G*) na frekvenci (f) pro rĤzné skupiny modelových tavených sýrĤ. Skupina I (A), skupina II (B), skupina III (C), skupina IV (D); kontrolní vzorek (z), pĜídavek 1 % w/w D-galaktózy (), pĜídavek 0,2 % w/w pektinu (U), pĜídavek 1 % w/w D-galaktózy a 0,2 % w/w pektinu (), pĜídavek 0,4 % w/w pektinu (T), pĜídavek 1 % w/w D-galaktózy a 0,4 % w/w pektinu (u). Pro názornost byly vytvoĜeny grafy závislosti komplexního modulu na frekvenci pro všechny skupiny modelových tavených sýrĤ, které jsou znázornČny na Obr. 1. Protože všechny nízkomolekulární sacharidy zpĤsobily obdobné snížení tuhosti vzorkĤ oproti kontrole, pro pĜehlednost byla do grafĤ vybrána pouze D-galaktóza jako jejich zástupce. I tyto grafy potvrzují, že pĜídavek pektinu ke vzorku zpĤsobil zvýšení jeho tuhosti, zatímco pĜídavek nízkomolekulárního sacharidu do taveného sýra se projevil opaþným úþinkem. ZávČry této práce korespondují se studií Nilsson a kol.15, který zkoumal rĤzné možnosti snížení tuhosti systému prostĜednictvím oslabení vzájemných interakcí biopolymerĤ. Zjistil, že interakce mezi nízkomolekulárním sacharidem a polymerem mohou konkurovat vzájemným interakcím biopolymerĤ, které jsou pro tvorbu a tuhost gelu dĤležité. RovnČž zvýšení tuhosti systému vlivem pĜídavku pektinu je v souladu s dostupnou literaturou9,10,16. Výsledky získané senzorickou analýzou modelových tavených sýrĤ byly statisticky zpracovány a bylo zjištČno, že jejich chuĢ a vĤnČ nebyly pĜídavkem pektinu þi nízkomolekulárního sacharidu negativnČ ovlivnČny. ZávČr Cílem této práce bylo zhodnotit vliv pĜídavkĤ nízkoesterifikovaného pektinu (0,2 a 0,4 % w/w) v kombinaci s 1 % (w/w) pĜídavkem vybraných monosacharidĤ (D-glukóza, D-fruktóza, D-galaktóza) a laktózy na konzistenci modelových tavených sýrĤ. Tavené sýry s pĜídavkem pektinu byly tužší než kontrolní vzorky. Pokles tuhosti vzorku vlivem pĜídavku nízkomolekulárního 266

sacharidu nebyl závislý na prostorovém uspoĜádání nízkomolekulárního sacharidu ani na pĜítomnosti aldo- þi ketoskupiny v molekule sledovaných mono- þi disacharidĤ. Taktéž použité monosacharidy i disacharid zpĤsobily shodné snížení tuhosti taveného sýra. PodČkování: Práce vznikla za podpory projektu MŠMT (MSM 7088352101). Použitá literatura: 1. Vyhláška þ. 77/2003, kterou se stanoví požadavky pro mléko a mléþné výrobky, mražené krémy a jedlé tuky a oleje (v platném znČní). 2. BUĕKA, F. Vliv sterilaþního záhĜevu na jakost tavených sýrĤ urþených pro krizové situace. 2004. 111 s. Dizertaþní práce. 3. GUINEE, T.P.; CARIû, M.; KALÁB, M. Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology. Volume 2: Major cheese groups. 2004, ISBN 0-1226-3653-8. 4. BOWLAND, E.L.; FOEGEDING, E.A. Small strain oscillatory shear and microstructural analyses of a model processed cheese. Journal of Dairy Science. 2001, vol. 84, no. 11, s. 2372 – 2380. 5. DIMITRELI, G.; THOMAREIS, A.S. Texture evaluation of block-type processed cheese as a function of chemical composition and in relation to its apparent viscosity. Journal of Food Engineering. 2007, vol. 79, no. 4, s. 1364 – 1373. 6. BACHMANN, H.P. Cheese analogues: a review. International Dairy Journal. 2001, vol. 11, s. 505 – 515. 7. BENNETT, R.J.; TRIVEDI, D.; HEMAR, Y.; REID, D.C.W.; ILLINGWORTH, D.; LEE, S.K. The effect of starch addition on the rheological and microstructural properties of model processed cheese. The Australian Journal of Dairy Technology. 2006, vol. 61, no. 2, s. 157 –159. 8. LU, Y.; SHIRASHOJI, N.; LUCEY, J.A. Rheological, textural and melting properties of commercial samples of some of the different types of pasteurized processed cheese. International Journal of Dairy Technology. 2007, vol. 60, no. 2, s. 74–80. 9. EL-NAWAWI, S.A.; HEIKAL, Y.A. Factors affecting the production of low-ester pectin gels. Carbohydrate Polymers, 1995, vol. 26, no. 3, s. 189–193. 10. LOOTENS, D.; CAPEL, F.; DURAND, D.; NICOLAI, T.; BOULENGUER, P.; LANGENDORFF, V. Influence of pH, Ca concentration, temperature and amidation on the gelation of low methoxyl pectin. Food Hydrocolloids. 2003, vol. 17, no. 3, s. 237–244. 11. TSOGA, A.; RICHARDSON, R.K.; MORRIS, E.R. Role of cosolutes in gelation of high-methoxy pectin. Part 1. Comparison of sugars and polyols. Food Hydrocolloids. 2004a, vol. 18, no. 6, s. 907–919. 12. TSOGA, A.; RICHARDSON, R.K.; MORRIS, E.R. Role of cosolutes in gelation of high-methoxy pectin. Part 2. Anomalous behaviour of fructose: Calorimetric evidence of site-binding. Food Hydrocolloids. 2004b, vol. 18, no. 6, s. 921–932. 13. EVAGELIOU, V.; RICHARDSON, R.K.; MORRIS, E.R. Effect of pH, sugar type and thermal annealing on high-methoxy pectin gels. Carbohydrate Polymers. 2000, vol. 42, no. 3, s. 245-259. 14. ýSN EN ISO 5534. Sýry a tavené sýry – stanovení obsahu celkové sušiny (referenþní metoda). ýeský normalizaþní institut, 2005. 15. NILSSON, S.; PICULELL, L.; MALMSTEN, M. Nature of macromolecular denaturation by urea and other cosolutes: experiments on agarose interpreted within a lattice model for adsorption from a mixed solvent. Journal of Physical Chemistry. 1990, vol. 94, no. 12, s.5149-5154. 16. MACKģ, I.; BUĕKA, F.; PAVLÍNEK, V.; KRÁýMAR, S.; HRABċ, J. Viscoelastic properties of processed cheese as a function of pectin concentration. In Risk factors of food chain VII. Nitra: SPU, October 11, 2007, s. 25. ISBN 978-80-8069-948-2.

Kontaktní adresa: Ing. Ivana MackĤ, Ústav potravináĜského inženýrství, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve ZlínČ, nám. T.G.Masaryka 275, 762 72 Zlín, email: [email protected] 267

VLIV KARAGENANģ NA FYZIKÁLNÍ VLASTNOSTI MLÉKA A SMETANY Kováþová Renáta, ŠtČtina JiĜí, Loužecký Tomáš Ústav technologie mléka a tukĤ, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze The influence of carrageenans on physical properties of milk and cream Summary: The influence of kappa-, iota- and lambda-carrageenan on viscosity and particle size distribution of reconstituted skimmed milk was determinated. It was shown by determining of size distribution measured by laser diffraction that aggregates with size distribution in range 10 – 100 ȝm were formed when adding kappa-carrageenan. Less intensive production of aggregates was observed when adding iota- or lambdacarrageenan. The influence of carrageenans on viscosity of milk was characterised under temperatures ranging from 10 to 60 °C. The biggest influence on viscosity was observed for kappa-carrageenan at lower temperature whereas at higher temperature was this influence comparable to iota-carrageenan (for content of carrageenan 0.04 % w/w the viscosity was increased 6.5; 2.2 or 1.5 times by adding kappa-, iotaor lambda-carrageenan at temperature 10 °C, whereas at temperature 60 °C only 1.4; 1.5 or 1.2 times). Furthermore the influence of 0.04 % w/w additive of kappa-carrageenan on rheological properties and particle size distribution of milk and cream with fat content 0.3; 2; 10; 20 a 30 % w/w was observed. The additive of kappa-carrageenan to samples was resulted in both increasing of the viscosity and formation of evidential dependence on shear rate (flow behaviour index 0.51 - 0.62) and thixotropy (relative viscosity was decreased in 10 - 30 % upon shear rate 100 s-1). When adding carrageenan the final apparent viscosity at shear rate 100 s-1 increased more for samples of milk and cream with lower fat content. It was confirmed by determining of size distribution both with and without dissolution of casein micelles that aggregates with size distribution in range 10 – 100 μm were formed, which are taken the responsibility for a formation of both thixotropy and viscoplastical behaviour of milk and cream when adding kappa-carrageenan.

ÚVOD Karagenany jsou pĜírodní vysokomolekulární sulfatované polysacharidy extrahované z þervených moĜských Ĝas tĜídy Rhodophycae. Lineární ĜetČzec je tvoĜen pravidelnČ se opakujícími molekulami D-galaktosy a 3,6-anhydro-D-galaktosy spojenými stĜídavČ Į (1ĺ3) a ȕ (1ĺ4) glykosidickou vazbou. Existují tĜi základní typy karagenanĤ (kappa, iota a lambda), které se liší poþtem a umístČním sulfátových skupin na jednotce galaktosy [1]. Karagenany si pro své pozitivní úþinky zejména na texturu výrobku již našly široké uplatnČní v mlékárenské technologii. Zvyšují viskozitu výrobku, vážou vodu a kappa- a iotakaragenan tvoĜí gel, þímž pĜispívají k zlepšení stability koloidního systému mléka. Vlivem elektrostatických interakcí karagenanu s kaseinem vznikají v mléce agregáty s velikostí úmČrnou koncentraci pĜidaného karagenanu [2] a jeho schopností tvoĜit gel [3]. Nízké koncentrace karagenanĤ jsou vhodné pro aplikaci do tekutých mléþných výrobkĤ, protože vytváĜí velice jemný mČkký gel [4]. Cílem práce bylo stanovit vliv konkrétních vzorkĤ karagenanĤ na viskozitu mléka a smetan o rĤzné tuþnosti a porovnat tvorbu agregátĤ tČchto karagenanĤ s kaseinem. MATERIÁL A METODY Sušené odtuþnČné mléko Laktino (tuk 1,3 hm.%) - Promil a.s., Nový Bydžov Syrové mléko - Pragolaktos a.s., Praha Karagenany kappa, iota, lambda (komerþní preparáty) - TRUMF International s.r.o., Dolní Újezd PĜíprava obnoveného mléka Obnovené mléko je 10% roztok sušeného odstĜedČného mléka v destilované vodČ. Bylo pĜipraveno rozpuštČním sušeného mléka v destilované vodČ v hmotnostním pomČru 1:9. RozpouštČní probíhalo ve vodním termostatu za míchání 30 minut pĜi otáþkách 1500 rpm (míchadlo Silversonem L4RT, Silverson Machines Ltd., UK) a teplotČ vzorku 60 °C. Poté bylo mléko pĜelito do zásobní láhve, ochlazeno pod proudem vody a uloženo do lednice. 268

PĜíprava odstĜedČného mléka a smetany Syrové mléko bylo pĜedehĜáto na trubkovém modulu pasteraþního zaĜízení FT74 (Armfield, UK) na teplotu 65 °C a odstĜedČno na laboratorní odstĜedivce Disc Bowl Centrifuge (Armfield UK). Teplota odstĜećovaného mléka byla 50 °C. Získaná smetana a odstĜedČné mléko byly zchlazeny ve vodní lázni a uschovány v lednici. PĜíprava vzorkĤ s karagenany Obnovené nebo odstĜedČné mléko bylo naváženo do kádinky a ohĜáto na 70°C a za intenzivního míchání Silversonem L4RT (pĜes 3000 rpm) bylo pĜi této teplotČ pĜidáno navážené množství karagenanu. Pak byly otáþky sníženy (pro 0,5 l vzorku na 1500 rpm a pro 1 l vzorku na 2000 rpm) a karagenan ponechán k dalšímu rozpouštČní 30 minut pĜi teplotČ mléka 70 °C. Poté byl vzorek pĜelit do sklenČné zásobní láhve, ochlazen pod proudem vody (na 16-18°C do 15 minut) a uložen do lednice. U vzorkĤ s obsahem tuku 2 - 30 %hm. byl pĜed ochlazením upraven obsah tuku pĜídavkem smetany, která prošla stejnou tepelnou zátČží jako odstĜedČné mléko (70 °C, 30min). MČĜení distribuce velikosti þástic MČĜení velikosti þástic bylo provedeno metodou laserové difrakce na pĜístroji MasterSizer 2000 s dispergaþní jednotkou Hydro 2000G (Malvern Instuments, UK). PĜi mČĜení byla rychlost míchadla 350 rpm a rychlost þerpadla 950 rpm. Vlastní mČĜení probíhalo 12 s a bylo pĜi nČm provedeno 12000 odeþtĤ. Na jedno dávkování vzorku byly provedeny tĜi mČĜení a každý vzorek byl dávkován dvakrát. Hodnota refrakþního indexu pro mléþný tuk byla zvolena 1,46 s absorpþním koeficientem 0,01 a pro vodu byl refrakþní index 1,33 [5]. Pro vyhodnocení výsledkĤ v softwaru Mastersizer 2000 verze 5.13 (Malvern Instuments, UK) byl vybrán obecný model rozdČlení (General purpose). MČĜením byla získána distribuce velikosti þástic podle jejich objemu. Pro mČĜení jednotlivých vzorkĤ byly použity dva zpĤsoby mČĜení [6]: a. velikost agregátĤ kaseinových micel - mČĜeno v prostĜedí destilované vody b. velikost tukových kuliþek - vzorek smíchán s pufrem EDTA (35 mM, pH 7) v objemovém pomČru 1:1 (rozpuštČní kaseinových micel) a mČĜen v prostĜedí 0,1 % SDS (desintegrace shlukĤ) Stanovení viskozity kapilárním viskozimetrem Pro vzorky s nízkou viskozitou (v rozmezí 0,8 - 5 mm2/s) byla viskozita stanovena kapilárním viskozimetrem Ubbelohde podle normy DIN 55 350 s kapilárou typu 0a s prĤmČrem 0,53 ± 0,01 mm (SCHOTT-Instruments, NČmecko). Viskozimetr byl vložen do sklenČného temperaþního válce (SCHOTT-Instruments, NČmecko), ve kterém cirkulovala chladící kapalina Fridex G Plus (Velana, ýR) vytemperována na požadovanou teplotu v termostatu DC5 (Haake, NČmecko) s pĜesností na 0,1 °C. Stanovení viskozity rotaþním viskozimetrem Vzorky s vyšší kinematickou viskozitou (nad 5 mm2/s) byly hodnoceny rotaþním viskozimetrem RS 80 v systému dvou souosých válcĤ Z40 se softwarem Rheowin 3.30 (Haake, NČmecko). Ke chlazení viskozimetru byl použit termostat DC 30 (Haake, NČmecko).Vzorky byly mČĜeny pĜi teplotČ 10 °C v CR-modu (controled rate). Byla sledována závislost smykového napČtí, na smykové rychlosti, resp. zdánlivé viskozity na dobČ pĤsobení smykové rychlosti 100 s-1, podle následujícího programu: 1) vzestupná vČtev tokové kĜivky - zvyšování smykové rychlosti z 0,1 na 100 s-1 za 30 s 2) þasová závislost - pĤsobení konstantní smykové rychlosti 100 s-1 po dobu 10 min 3) sestupná vČtev tokové kĜivky - snižování smykové rychlosti ze 100 na 0,1 s-1 za 300 s Sestupná vČtev byla vyhodnocena Herschel-Bulkleyovým modelem ( Ĳ Ĳ 0 K Ȗ n ), kde Ĳ0 je mez toku, K viskozitní koeficient, n index tokového chování a Ȗ smyková rychlost. 269

VÝSLEDKY A DISKUSE Viskozita obnoveného odstĜedČného mléka byla sledována kapilárním viskozimetrem v rozmezí teplot 10 až 60 °C pro všechny tĜi typy karagenanĤ. V práci Marcotte et al. byla prokázána významná závislost viskozity na teplotČ pro vzorky s 1, 2, a 3 % karagenanu [7]. Pro tekuté mléþné výrobky jsou vhodné spíše nižší koncentrace karagenanu [8]. Závislost viskozity na teplotČ byla pozorována i pro vzorky s nízkým pĜídavkem karagenanu (0,02 - 0,06 %hm.) (obr. 1). Viskozita vzorkĤ mléka pĜi nižší teplotČ byla nejvíce ovlivnČna kappa-karagenanem, zatímco pĜi vysoké teplotČ byl jeho vliv srovnatelný s iota-karagenanem (pĜi obsahu 0,04 % karagenanu se viskozita pĜi teplotČ 10 °C zvýšila vlivem kappa, iota resp. lambda karagenanu 6,5; 2,2 resp. 1,5 krát, zatímco pĜi teplotČ 60 °C jen 1,4; 1,5 resp. 1,2 krát) (obr. 2). B 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

dynamická viskozita (mPa.s)


A SOM

0

Kappa 0,02%

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

10 20 30 40 50 60

Kappa 0,04%

0

10 20 30 40 50 60

teplota (°C)

teplota (°C)

D Iota 0,02%

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0



C Iota 0,04%

0

Lambda 0,04%

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

10 20 30 40 50 60

Lambda 0,06%

0

10 20 30 40 50 60

teplota (°C)

teplota (°C)

relativní viskozita (-)

Obr. 1. Viskozita obnoveného odstĜedČného mléka bez karagenanu (A) a s karagenanem (B-D) v závislosti na teplotČ vzorku Kappa 0,04% Iota 0,04% Lambda 0,04%

7 6 5 4 3 2 1 0 0

10

20

30

40

50

60

teplota (°C)

Obr. 2. Viskozita mléka s rĤznými karagenany vztažená na viskozitu mléka bez karagenanu 270

SOM Particle Size Distribution

14 12 Volume (%)

10 8 6 4 2 0 0.01

0.1

1

10

100

1000

3000

Particle Size (μm)

Kappa 0,02 %

Iota 0,02 % Particle Size Distribution

12

10

10

8 6 4 2 0 0.01

Particle Size Distribution

14

12 Volume (%)

Volume (%)

14

8 6 4 2

0.1

1

10

100

1000

0 0.01

3000

0.1

1

Particle Size (μm)

Kappa 0,04 %

100

1000

3000

100

1000

3000

Lambda 0,04 % Particle Size Distribution

14

12

10

10

8 6 4

8 6 4

2

2

0 0.01

0 0.01

0.1

1

10


14

12 Volume (%)

Volume (%)

10 Particle Size (μm)

100

1000

3000

Particle Size (μm)

0.1

1

10 Particle Size (μm)

Obr. 3. Distribuce velikostí þástic v obnoveném odstĜedČném mléce bez pĜídavku karagenanu (SOM) a s rĤzným pĜídavkem 3 typĤ karagenanu

V obnoveném odstĜedČném mléce byl dále stanoven vliv kappa, iota a lambda karagenanu na velikost þástic metodou laserové difrakce. V pĤvodním mléce lze pozorovat pouze kaseinové micely o malé velikosti. Všechny vzorky s pĜídavkem karagenanu mČli vČtší stĜední velikost þástic oproti pĤvodnímu mléku, þímž byl potvrzen vznik agregátĤ s kaseinem. NejvýraznČjší vliv vykazoval kappa-karagenan, zatímco iota a lambda vykazovaly tvorbu agregátĤ v podstatnČ menší míĜe. Je patrné, že koncentrace 0,02 % pro kappa-karagenan oproti koncentraci 0,04 % pĜi obsahu kaseinu 3,08 %hm. ještČ není dostateþná k tomu, aby do agregátĤ byly zahrnuty všechny pĜítomné kaseinové micely (obr. 3). Mechanismus vzniku agregátĤ karagenanu s kaseinem závisí na koncentraci pĜidaného karagenanu, protože agregáty mĤžou vzniknout buć pouze interakcemi mezi kaseinem a karagenanem, nebo i utvoĜením gelu [2]. Z tČchto poznatkĤ lze usoudit, že právČ vznik agregátĤ pĜídavkem karagenanu zpĤsobuje výše uvádČný nárĤst viskozity vzorkĤ. Pro sledování vlivu karagenanĤ na þerstvé odstĜedČné mléko byl podle výraznosti vlivu na obnovené mléko vybrán kappa-karagenan a koncentrace 0,04 %hm. (nejvyšší koncentrace vhodná do tekutých mléþných výrobkĤ). Byly posuzovány vzorky mléka a smetan o tuþnosti 0,3; 2; 10; 20 a 30 %hm. V odstĜedČném mléce byl pozorován vznik agregátĤ o velikosti 10 - 100 μm, kterých se úþastnily všechny pĜítomné kaseinové micely (Obr. 4). Stanovení distribuce velikosti þástic pĜed a po rozpuštČní kaseinových micel potvrdilo vznik agregátĤ i pro vzorky s vyšším obsahem tuku (Obr.5). Tyto agregáty jsou vČtší než pĜítomné tukové kuliþky a mĤžou tak bránit jejích vyvstávání. Výsledky z mČĜení distribuce velikostí þástic jsou ovlivnČny množstvím obsažených tukových kuliþek (metodou laserové difrakce nelze mČĜit samostatnČ jeden typ þástic v pĜítomnosti jiných). Dále byl pozorován vliv pĜídavku 0,04 %hm. kappa-karagenanu na reologické vlastnosti mléka a smetan o tuþnosti 0,3; 2; 10; 20 a 30 %hm. mČĜením vzorkĤ na rotaþním viskozimetru. Z hodnot koeficientĤ, získaných vyhodnocením dat pomocí Herschel-Bulkleyového modelu, uvedených v tabulce I a hodnot viskozit na zaþátku a po 10 minutách pĤsobení smykové rychlosti 100 s-1 (obr. 6) lze Ĝíct, že pĜídavek kappa-karagenanu mČl za následek zvýšení viskozity spolu se vznikem prĤkazné závislosti na smykové rychlosti (index toku 0,51 až 0,62) a tixotropie (vlivem pĤsobení smykové rychlosti 100 s-1 došlo ke snížení zdánlivé viskozity o 10 až 30 %). Zvýšení 271

koneþné zdánlivé viskozity pĜi smykové rychlosti 100 s-1 oproti viskozitČ mléka a smetan bez karagenanu bylo vČtší pĜi nižší tuþnosti vzorkĤ(obr. 7), tixotropie naopak s tuþností mléka stoupá a na tokovou kĜivku má rĤzný obsah tuku v mléce s karagenanem jen nepatrný vliv (Obr.8). Particle Size Distribution

Volume (%)

16 14 12 10 8 6 4 2 0 0.01

0.1

1

10

100

1000

3000

Particle Size (μm)

Obr. 4. Distribuce velikostí þástic odstĜed. mléka (vlevo) a její zmČna pĜídavkem 0,04 %hm. kappa-karagenanu (vpravo). A Particle Size Distribution

Volume (%)

16 14 12 10 8 6 4 2 0 0.01

0.1

1

10

100

1000

3000

Particle Size (μm)

B

C Particle Size Distribution

16 14 12 10 8 6 4 2 0 0.01

Volume (%)

Volume (%)

16 14 12 10 8 6 4 2 0 0.01

0.1

1

10

100

1000

3000


0.1

Particle Size (μm)

1

10

100

1000

3000

Particle Size (μm)

Obr. 5. Distribuce velikostí þástic mléka s kappa-karagenanem (0,04 %hm. v plazmČ) s obsahem tuku 2 (A), 20 (B) a 30 (C) %hm. Distribuce vlevo – velikost tukových kuliþek mČĜena po rozpuštČní kaseinových micel; distribuce vpravo – velikost agregátĤ kaseinových micel. 10

140

zmČna viskozity koneþná viskozita

8

100

relativní viskozita (-)

zdánlivá viskozita (mPa.s)

120

80

60

6

4

40

2 20

0

0 0,3

2

10

20

10

30

20

30

obsah tuku (%)

obsah tuku (%)

Obr. 6. Viskozita mléka (tuk 0,3 - 30 %hm.) Obr. 7. Vliv obsahu tuku na zvýšení viskozity s kappa-karagenanem (0,04 %hm.). smetany vlivem pĜídavku kappa-karagenanu Koneþná viskozita – zdánlivá viskozita po 10 min (0,04 % v mléþné plazmČ) -1 pĤsobení smykové rychlosti 100 s , zmČna viskozity – rozdíl mezi viskozitou na zaþátku pĤsobení smykové rychlosti a koneþnou viskozitou.

272

Tabulka I Vliv pĜídavku kappa-karagenanu na reologické vlastnosti mléka s obsahem tuku 2 - 30 %hm. Ĳ0-mez toku, n-index tokového chování, K-viskozitní koeficient, N-nestanoveno (nízká viskozita).

Tuk (%) 2 10 20 30

Ĳ0 (mPa)

bez karagenanu n (-) K (mPa.sn)

N

N

N

0,4 ± 0,3 8,2 ± 4,1 7,5 ± 7,3

1,07 ± 0,00 1,13 ± 0,02 1,02 ± 0,01

3,8 ± 1,3 5,0 ± 2,0 15,4 ± 5,4

Ĳ0 (mPa)

kappa 0,04% n (-) K (mPa.sn)

483 ± 176 542 ± 152 717 ± 155 583 ± 240

0,51 ± 0,02 0,51 ± 0,03 0,54 ± 0,00 0,62 ± 0,01

418 ± 108 473 ± 100 536 ± 144 465 ± 160

10

napČtí (Pa)

1

0,1

0,01

0,001 0,1

1

10

100

-1

smyková rychlost (s )

Obr. 8. Tokové kĜivky odstĜedČného mléka (Ÿ) a smetany (tuk 30 %hm.) (Ɣ) s kappa-karagenanem (0,04 % v mléþné plazmČ) a stejné smetany bez karagenanu (Ŷ). Vzestupná þást kĜivky (plná znaþka) a sestupná þást kĜivky (prázdná znaþka).

ZÁVċR

Byl hodnocen vliv tĜí komerþních vzorkĤ karagenanĤ (kappa, iota a lambda) na vlastnosti obnoveného odstĜedČného mléka a þerstvého mléka a smetan o tuþnosti 0,3; 2; 10; 20 a 30 %hm. V tČchto systémech byl stanoven vliv karagenanĤ na distribuci velikosti þástic, viskozitu a reologické vlastnosti. Byl prokázán vznik agregátĤ karagenanu s kaseinem obnoveného odstĜedČného mléka u všech tĜí komerþních vzorkĤ karagenanĤ, pĜiþemž nejvČtší vliv na velikost agregátĤ mČl kappa-karagenan. V þerstvém odstĜedČném mléce vytváĜel pĜi koncentraci 0,04 % agregáty o velikosti 10 - 100 μm. PĜi vyšším obsahu tuku byly zaznamenány agregáty s velikostí vČtší nČž byla velikost pĜítomných tukových kuliþek. Karagenany prokazatelnČ zvyšují viskozitu mléka, rĤznČ dle typu karagenanu, pĜiþemž nejvČtší vliv mČl kappa-karagenan pĜi 10 °C. PĜi 60 °C je vliv všech 3 typĤ srovnatelný. Zvýšení viskozity pĜídavkem 0,04 % kappa-karagenanu je spojené se vznikem tixotropie a viskoplastického chování. NárĤst viskozity mléka vlivem karagenanu klesá s rostoucím obsahem tuku, tixotropie naopak stoupá a na tokovou kĜivku má rĤzný obsah tuku v mléce s karagenanem jen nepatrný vliv. 273

PodČkování: Tato práce byla finanþnČ podpoĜena z projektu Ministerstva prĤmyslu a obchodu ýR: MPO þ.FTTA/069 Standardizace hydrokoloidĤ a jejich aplikace pro potravináĜský prĤmysl. Projekt je Ĝešen ve spolupráci se spoleþností TRUMF International s.r.o., Dolní Újezd. Použitá literatura: 1. Imeson A.P.: Carrageenan. V knize: Handbook of hydrocolloids (ed. Philips G.O., Wiliams P.A., ed.), kap.5, s. 87-102. Cambrige 2000. 2. Ji S., Corredig M., Goff H.D.: Aggregation of casein micelles and ț-carrageenan in reconstituted skim milk. Food Hydrocolloids 22, 56-64 (2008). 3. Martin A.H., Goff H.D., Smith A., Dalgleish D.G.: Immobilization of casein micelles for probing their structure and interactions with polysaccharides using scanning electron microscopy SEM. Food Hydrocolloids 20, 817–824 (2006). 4. Chen Y., Liao M. L., Dunstan D. E.: The reology of K+-kappa-carrageenan as a weak gel. Carbohydrate polymer 50, 109-116 (2002). 5. Michalski M.C., Briard V., Michel F.: Optical parameters of milk fat globules for laser light scattering measurements. Lait 81, 787-796 (2001). 6. Michalski M.C. et al.: Appearance of submicronic particles in the milk fat globule size distribution upon mechanical treatments. Lait 82, 193-208 (2002). 7. Marcottea M., Hoshahilia A. R. T., Ramaswamy H.S.: Rheological properties of selected hydrocolloids as a function of concentration and temperature. Food Research International 34, 695–703 (2001). 8. Bixler H.J., Johndro K., Falshaw R.: Kappa-2 carrageenan: structure and performance of commercial extracts: II. Performance in two simulated dairy applications. Food Hydrocolloids 15, 619-630 (2001).

Kontaktní adresa: Ing. Renáta Kováþová, Ústav Technologie mléka a tukĤ, VŠCHT, Technická 5, 166 28, Praha 6 - Dejvice e-mail: [email protected]

274

REJSTěÍK AUTORģ Karoviþová Jolana......................................... 75 Karpíšková Renáta.............................. 123, 127 Keresteš Ján .................................................. 27 Kirchnerová Katarína............................ 39, 119 Kizek René ................................................. 221 Kleþacká Jana ............................................. 137 Kološta Miroslav........................................... 43 KoreĖová Janka .......................................... 156 Kostolníková Mária ................................... 156 Košinová Marcela ....................................... 115 KouĜimská Lenka ......................... 71, 163, 200 Kováþová Renáta ....................................... 268 Kráþmar Stanislav......................................... 64 Krajþová Eva .................................. 75, 81, 171 KramáĜová Daniela .................................... 217 Kuþerová KateĜina ............................. 160, 183 Kuchta Tomáš ............................................ 152 Kutnohorská Olga ......................................... 21 Kvasniþková Eva .......................................... 49 Lazárková Zuzana ................................ 64, 217 Legarová Veronika ...................... 71, 163, 200 Liptáková Denisa .................................. 94, 131 Loužecký Tomáš ........................................ 268 Lukešová Dobromila .......................... 236, 242 Lužová TáĖa .............................................. 251 MackĤ Ivana .............................................. 262 MaĐa Pavel ................................................. 233 MaĐová Jana ............................................... 233 Manga I. . .................................................... 193 Medvećová Alžbeta ............................. 94, 131 Míková Kamila .......................................... 160 Miller Petr .................................................. 160 Navrátilová Pavlína .................................... 212 Necidová Lenka .................................. 123, 127 Nedomová Šárka ........................................ 251 NČmeþková Irena ........................................ 137 Nevoral JiĜí ................................................. 100 Nohálová Zuzana ....................................... 217 Ondráþková Iva .................................. 148, 183 Pagurko Anton ........................................... 171 Pangallo Domenico ............................ 152, 156 Panovská ZdeĖka ............................... 236, 242 Patrovský JiĜí ................................................ 58 Pavlínek Vladimír .............................. 256, 262 Pleva Pavel ................................................. 142 Plocková Milada ........................ 148, 177, 183 Poláková Lenka............................................. 89 Pospiech Matej ........................................... 256 Pospíšilová Markéta............................ 123, 127 Povolná Šárka ............................................ 251

Abrlová Magdaléna .............................. 53, 177 Adam VojtČch ............................................ 221 Baranová Mária .......................................... 233 Belušíková Zora .......................................... 123 Bertaová Gabriela .............................. 152, 156 Blašková Veronika ..................................... 251 BĜenek Petr ................................................. 248 BĜezina Pavel ............................................. 256 BuĖka František ................... 64, 142, 256, 262 BuĖková Leona .................................... 64, 142 Burdychová Radka ............................. 115, 168 Cupáková Šárka .......................................... 123 ýejna Vladimír.............................................. 33 ýerníková Michaela ................................... 256 ýerný Vladimír ............................................. 49 ýurda Ladislav ..................................... 13, 207 Doležal Petr ................................................ 221 Dráb Vladimír ............................................. 137 Draþková Michaela .................................... 212 Dubná SoĖa ................................................. 107 Dušková Marta.................................... 123, 127 DvoĜák J. . ................................................... 193 DvoĜáková Blanka......................................... 71 Falta Daniel ................................................ 187 Filip Vladimír.......................................... 85, 89 Flajšmanová KateĜina ................................. 100 Foltys Vladimír ..................................... 39, 119 Greif Gabriel .................................. 75, 81, 171 Greifová Mária ............................... 75, 81, 171 Grosová Stanislava........................................ 21 Havlíková Šárka............................................ 49 Hellerová Klára .......................................... 207 Hlavsová Barbora ................................. 53, 177 Hofericová Margita ....................................... 43 Hoferková Petra .......................................... 115 HoláĖ Felix.................................................... 64 Homutová Iva.............................................. 107 Horna Aleš ................................................. 221 Hoza Ignác ................................................. 217 HrabČ Jan ........................................ 58, 64, 262 Hudecová Anna..................................... 94, 131 ChebeĖová Viera ........................................ 152 Chládek Gustav .................................... 33, 187 Chumchalová Jana ............................. 148, 160 Janda Václav .............................................. 227 Janovþíková Lenka...................................... 131 Janštová Bohumíra ............................. 123, 212 Jenknerová Jana ......................................... 227 JĤzl Miroslav ............................................. 248 Karlová Tereza........................................ 85, 89 275

Šmidrkal Jan ........................................... 85, 89 ŠĢástková-Belušíková Zora ........................ 127 ŠtČtina JiĜí ............................................ 13, 268 Šustová KvČtoslava .................... 203, 248, 251 Švandrlík ZdenČk ......................................... 49 Šviráková Eva ...................................... 53, 177 Tománková Eva .......................... 100, 103, 107 Tomáška Martin............................................ 43 Tremlová Bohuslava .................................. 256 TĤma ŠtČpán .............................................. 200 Tykvartová Dagmar ...................................... 58 Valík ďubomír....................................... 94, 131 Vilímková Miroslava ................................. 137 Vorlová Lenka ........................................... 212 Vozková Lenka .......................................... 212 Zárubová Markéta......................................... 85 Zeman Ladislav .......................................... 221 Zítka OndĜej ............................................... 221

PĜibyla Lubomír ............................................ 33 PĜidalová Hana ........................................... 212 Pudil František ........................................... 227 Pufrová Eva................................................... 49 Rada VojtČch .............................. 107, 100, 103 Roþková Šárka .................................... 100, 103 Rohacká Hana ............................................ 137 RosĤlek Martin ........................................... 200 Roubal Petr.................................................. 137 ěíha J. . ....................................................... 193 Sabolová Gabriela ...................................... 233 Schmidt Štefan ..................................... 81, 171 Skýpala Martin ........................................... 187 Sojková K. .................................................. 193 Staruch Ladislav ......................................... 171 Šantinová Eva .................................... 148, 183 Šedivá Alena ...................................... 236, 242 Šmehilová Martina...................... 100, 103, 107

276

ANAMET, s. r.o. Kováků 26 150 00 Praha 5 tel. 257328175, 606737749 fax 257323278 sales @anamet.cz www.anamet.cz

Analytické přístroje ALLIANCE INSTRUMENTS pro potravináře ( především pro mlékárenský průmysl )

OPTIGRAPH - sledování časového vývoje koagulace mléka prostřednictvím měření transmitance NIR signálu současně v deseti vzorcích mléka. Důležité informace pro optimalizaci výrobního procesu sýrů (doba koagulace, vývoj tuhosti ).

CINAC - současné sledování až 32 hodnot ( teplota, pH, vodivost, redox) charakterizujících průběh acidifikace při procesech v mlékárenském průmyslu.

INFRASCAN - NIR spektrofotometr pro široké použití v potravinářském průmyslu např. měření vlhkosti, obsahu tuků, proteinů atd.

LUMiSizer, LUMiFuge, LUMiReader velikost částic a stabilita disperzí, určování skladovatelnosti emulzí ( shelf life ), sledování koalescence a flokulace, rozpad emulzí.

NICOLET CZ s. r. o. Specialisté v oboru molekulové spektroskopie FT-NIR analyzátory potravináĜských výrobkĤ Stanovení bČžných parametrĤ potravináĜských výrobkĤ za nČkolik minut, bez destrukce vzorku a potĜeby chemikálií. Zakázkový vývoj metod, vþetnČ automatizace stanovení, bezplatné pĜedvedení pĜístrojĤ s možností mČĜení vlastních vzorkĤ.

Servisní práce zdarma.

Aplikaþní, servisní a obchodní stĜedisko:

Nicolet CZ s.r.o. Nad Trnkovem 11 106 00 Praha 10

T/F: 272 760 432, 272 768 569 Mobil: 602325829, 603554788, 603725812

ThermoScientific FTIR, FTNIR, Raman, Microscopy

Kvalita spektrometrĤ Nicolet ovČĜena více než 250 uživateli v ýR a SR.

CELOSTÁTNÍ PěEHLÍDKY SÝRģ 2008 Výsledky pĜehlídek a sborník pĜednášek konference „Mléko a sýry“

Vydavatel:

Vysoká škola chemicko technologická v Praze Technická 5, 166 28 Praha 6

Editor:

ŠtČtina J., ýurda L.

Tisk:

KANAG – TISK, s.r.o. Technická 5, 166 28 Praha 6

Rok vydání:

2008

Poþet stran:

286

ISBN

978-80-7080-695-1

Publikace neprošla jazykovou ani odbornou úpravou. Za obsah pĜíspČvkĤ odpovídají autoĜi.

Editor: Št tina J., urda L. Vydavatel: Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Technická 5; Praha 6 Rok vydání: 2008 ISBN

Recommend Documents