AZ ETS-1 TRANSZKRIPCIÓS FAKTOR FEJ-NYAKI CARCINOMÁKBAN, MELANOMÁBAN ÉS PERITUMORALIS FIBROBLASTOKBAN, VALAMINT A HISZTAMIN HATÁSA AZ ETS-1 EXPRESSZIÓJÁRA
Dr. Horváth Barnabás Témavezető: Dr. Ésik Olga Budapest 2005
Szigorlati bizottság: Dr. Kádár Anna egyetemi tanár Dr. Répássy Gábor egyetemi tanár Dr. Pápai Zsuzsa főorvos Opponensek: Dr. Élő János c. egyetemi tanár Dr. Darvas Zsuzsa egyetemi docens
Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Klinikai Orvostudományok Doktori Iskolája Sugárterápia Program .
TARTALOMJEGYZÉK 1. 2. 3.
4.
ÖSSZEFOGLALÁS SUMMARY BEVEZETÉS A KUTATÁS KIINDULÓPONTJA ÉS A VIZSGÁLT MOLEKULÁK ÁLTALÁNOS JELLEMZŐI 3.1. Ets-1 transzkripciós faktor 3.2. MMP-3 proteolitikus enzim 3.3. E-cadherin adhéziós molekula 3.4. Ki-67 proliferációs marker 3.5. Hisztamin CÉLKITŰZÉSEK 4.1. Ets-1, E-cadherin és Ki-67 vizsgálata betegekből származó tumor mintákban 4.1.1. Ets-1 és MMP-3 RT-PCR vizsgálata műtéti anyagon
4 6 8 14 14 18 19 19 19 23 23 23
4.1.2. Műtéti anyagon végzett ets-1, E-cadherin és Ki-67 immunhisztokémiai vizsgálat
4.2.
In vitro vizsgálat humán melanoma sejtvonalon és humán fibroblast tenyészetben 4.2.1.
Humán melanoma sejtvonalakon végzett RT-PCR vizsgálat és
25
flow-citometria 4.2.2.
Humán fibroblast tenyészetben végzett RT-PCR, flow-citometria és immuncitokémiai vizsgálat
5.
MÓDSZER 5.1. Immunhisztokémia 5.1.1. Betegek és tumor minták, Ets-1, E-cadherin, Ki-67 5.1.2. Immunhisztokémiai festés 5.1.3. Immunreakció értékelése
5.2. 5.3. 5.4.
Melanoma sejtvonalak Sejttenyészet RT.PCR 5.4.1. Betegek és tumor minták 5.4.2. RT-PCR
5.5. 5.6.
23 25 25
Fluoreszcens immuncitokémia Az ets-1 és MMP-3 mennyiségi változásának detekciója flowcitometriával
2
25 26 26 26 26 27 27 28 29 29 30 30 30
6.
EREDMÉNYEK 6.1. Betegekből származó tumor mintákon végzett kísérletek
32 32 6.1.1. Ets-1 immunpozitivitás megjelenése a fej-nyaki daganatokban 33
6.1.2. E-cadherin immunpozitivitás megjelenése fej-nyaki
35
daganatokban 6.1.3.
Az ets-1 és E-cadherin expresszió összevetve a klinikopatológiai
36
adatokkal 6.1.4.
Az ets-1 és E-cadherin expresszió összehasonljtása az N(0) és N(+) csoportban valamint a primer tumorokban és a
36
metasztázisokban 6.1.5.
A Ki-67 index az N(0), N(+), ets-1 negatív és pozitív és az E-cadherin megtartott és csökkent csoportban
6.2.
6.1.6.
Kaplan-Meier túlélési becslés
6.1.7.
Szemikvantitatív RT-PCR, Ets-1, MMP-3
Melanoma sejtvonalakon és fibroblast sejt tenyészetben végzett kísérletek
41
6.2.1. Melanoma sejtvonalakon végzett RT-PCR és flow-citometria eredményei
41
42 6.2.3. Szemikvantitatív RT-PCR 43 6.2.4. Flow-citometria 44 MEGBESZÉLÉS 46 7.1. Fej-nyaki planocellularis carcinomákon végzett kísérletek 46 7.2. Humán melanoma sejtvonalakon és fibroblast tenyészetben végzett vizsgálatok 52 KÖVETKEZTETÉSEK, LEGFONTOSABB ÚJ EREDMÉNYEK 55 KÖSZÖNETNYILVÁNíTÁS 58 RÖVIDTÉSEK JEGYZÉKE 59 IRODALOMJEGYZÉK 60 AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT PUBLIKÁCIÓK 73 6.2.2.
7.
8. 9. 10. 11. 12-
37 38 39
Iimmunfluoreszcens festődés
3
1. ÖSSZEFOGLALÁS A fej-nyaki planocellularis carcinomák, a fejlett diagnosztikus és terápiás lehetőségek mellett is nagy kihívást jelentenek a modern gyógyászatban. Különösen nagy gondot okoz az esetek jelentős részében kialakuló metasztázisok kezelése. A metasztázis képzésben résztvevő olyan molekulákat választottunk a kutatás tárgyául, mint az extracelluláris mátrix (ECM) bontásában részvevő MMP-3, és ennek regulációjában vezető szerepet játszó ets-1 transzkripciós faktor, valamint az epithelialis sejtek egymás közötti kapcsolatát biztosító E-cadherin és a tumor proliferációt mutató Ki-67. Munkánk második részében olyan kérdéssel foglalkoztunk, mint a hisztamin közvetlen metasztázist fokozó hatása. Első lépésben az ets-1 és MMP-3 jelenlétét igazoltuk a tumor mintákban reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) technikával, majd vizsgáltuk az ets-1, E-cadherin és Ki.-67 molekula megoszlását immunhisztokémiai technikával. Második lépésben, in vitro modellben, humán melanoma sejtvonalakon és primer humán fibroblast tenyészetben potenciális kapcsolatot kerestünk az alkalmazott hisztamin és az ets-1 expresszió között. A melanomában bekövetkező, feltételezett H2 receptor mediált ets-1 változást flow citometriával igazoltuk, majd bázikus fibroblast növekedési faktor (bFGF) és hisztamin jelenlétében ill. ezek hiányában vizsgáltuk fibroblast tenyészetben az ets-1 és MMP-3 mRNS szintjét RT-PCR-el valamint az ets-1 és MMP-3 protein mennyiségét flowcitometriával és fluoreszcens immuncitokémiával. A betegekből származó tumorminták feldolgozása alapján megállapítottuk, hogy mind az ets-1, mind a MMP-3 jelen van a fej-nyaki carcinomákban. Az ets-1 expresszió és a klinikopatológiai faktorok, valamint a metastasis és a Ki-67 között nem találtunk összefüggést. Az E-cadherin expresszió csökkenése szignifikáns kapcsolatot mutatott a metasztázissal és a túléléssel, valamint a Ki-67 proliferációs index-el. Az in vitro vizsgálatok egyértelmű összefüggést bizonyítottak a hisztamin valamint az ets-1 expressziója között mind melanomában mind a fibroblastokban, valamint igazolták, hogy a bFGF képes a peritumoralis fibroblastokban a hisztamin termelődésének fokozására. Az eredmények arra utalnak, hogy a Ki-67 proliferációs index és az E-cadherin expresszió mérése hasznos technika lehet a magas kockázatú betegcsoport kiválasztásában, akiknél erélyesebb onkológiai kezelés szükséges. Bár az in vitro
4
kísérletek klinikai interpretációja nagy körültekintést igényel, az eredmények mégis azt sugallják, hogy a különböző forrásokból származó hisztamin szintje − mennyisége − a daganaton belül növelheti a tumorsejtek invazívitását.
5
THE ETS-1 TRANSCRIPTION FACTOR IN HEAD AND NECK CARCINOMA, MELANOMA AND PERITUMORAL FIBROBLASTS, AND THE EFFECT OF HISTAMIN ON THE EXPRESSION OF ETS-1 1. SUMMARY Even with the development of diagnostic tools and therapy, the head and neck squamous cell carcinoma is a great challenge to modern medicine. A particularly difficult problem is the curing of the regional metastasis that is present in the overwhelming majority of cases. We examined molecules involved in the metastatic process, including MMP-3 that takes part in the remodeling of extracellular matrix, ets-1 transcription factor that regulates expression of MMP-3, E-cadherin that is responsible for homotypic cell-cell adhesion, and cell proliferating marker Ki-67. In the second part of our work, we studied the direct influence of histamine on the metastatic process. By using RT-PCR on tumor samples from patients who underwent radical surgery, at the first stage we confirmed the presence of ets-1 transcription factor and MMP-3. Using immunohistochemistry, we detected ets-1, E-cadherin and Ki-67 expression in paraffin-embedded specimens of HNSCC. At the second stage we looked for a potential relationship between exogenously added histamine and expression of ets1 transcription factor in melanoma cell lines and cultured human mucosal fibroblasts. To simulate stromal reaction in vitro, cultured human mucosal fibroblast was used. The level of ets-1 and MMP-3 mRNA was compared using RT-PCR, as was their protein using flow-cytometry, in the presence or absence of bFGF (10 ng/ml) and histamine (1µM). The change of ets-1 level mediated by the H2R in melanoma cells was confirmed by flow-cytometry. By using RT-PCR on tumor samples from patients who underwent radical surgery, we confirmed the presence of ets-1 transcription factor and MMP-3. Correlation between ets-1 expression and clinicopathologic background, metastasis and Ki-67 labeling index was not significant. Reduced expression of Ecadherin showed significant correlation with metastasis, survival, and Ki-67 labeling index. Our results revealed a clear positive correlation between the effect of histamine and induced ets-1 mRNA and protein expression in melanoma sell lines and fibroblasts. Our investigations clearly demonstrated that bFGF can stimulate histamine expression
6
in fibroblasts. This study demonstrated that the Ki-67 labeling index and expression of E-cadherin may be a useful measurement in identifying high-risk patients who need more aggressive therapy. It is very difficult to translate results of in vitro studies, but these results suggest that a high level of histamine arising from several sources, in tumor tissue may accelerate invasiveness of carcinoma.
7
2. BEVEZETÉS Az évente kórismézett összes rosszindulatú daganat 2-5%-a a fej-nyaki területről indul ki (14). Az incidencia világviszonylatban kb. 500000 új megbetegedést jelent évente (92). A fej-nyaki malignomák több mint 95%-a planocellularis carcinoma, vagy ahogy az angol nyelvű irodalomban gyakrabban használják „squamous cell carcinoma”, ill. ennek variánsai (34). A fej-nyaki rákban szenvedő betegek esetében a gyógykezelés sikertelensége és a vele kapcsolatos halálozás meghatározó oka a regionális nyaki nyirokcsomó metasztázis, amely közel 50%-al csökkenti a betegek 5 éves túlélési esélyét (88, 108). Következésképpen a fej-nyaki carcinomák esetén a túléléssel legszorosabb kapcsolatban lévő független prognosztikai tényező a regionális nyaki metasztázisok jelenléte vagy hiánya (63). A fej-nyaki rákok ill. a regionális és távoli metasztázisok diagnosztikájában és kezelésében az utóbbi évtizedekben több területen is jelentős előrehaladás történt. A kifinomult képalkotó eljárások képesek már pár milliméter átmérőjű metasztázisok kimutatására, és a primer tumorok kiterjedésének, a környező anatómiai struktúrák érintettségének pontosabb megítélésére is. Sebészi téren, elsősorban a rekonstrukciós technikák fejlődésével, lehetőség nyílt egyre előrehaladottabb tumorok ablasticus eltávolítása. Az intenzív kutatások és a klinikai megfigyelések nyomán az elmúlt évtizedekben a nyaki metasztázisok műtéti kezelésében is paradigma váltás történt. A korábbi, még Halsted által a XIX. század végén az emlő tumorok sebészi kezelése során kialakított (36), és 1906-ban Crile majd 1951-ben Martin és munkatársai által a fej-nyaki daganatsebészetbe átültetett modell és eljárás, a radicalis nyaki block dissectio (27, 73) mellett és helyett számtalan indikáció, de elsősorban a klinikailag negatív nyak, az un. N0 nyak esetében, a Boca és munkatársai (11) valamint Byers és munkatársai (22) által ajánlott módosított radicalis nyaki block dissectio, ill. a csak bizonyos nyaki nyirokcsomó csoportok eltávolítását célzó selectiv nyaki block dissectio terjedt el. A nem sebészi kezelési módszerekben is jelentős fejlődés ment végbe a múlt század második felében. Ezekkel összefüggésben az általános klinikai gyakorlat jelenleg 3 alapvető megközelítést ismer: definitív kezelés (egyedüli sugárkezelés, integrált
8
kemoterápia és radioterápia); más difinitív terápiához csatlakozó adjuváns kezelés (preoperatív vagy postoperatív irradiáció, indukciós vagy adjuváns kemoterápia); és a palliatív kezelés. Természetesen a három alapvető stratégia között átfedések lehetségesek (56). A klinikai radioterápiában csak a kilovoltos röntgensugárzás volt elérhető addig, amíg a cobalt források, a betatron és a lineáris gyorsítók kifejlesztésével meg nem jelentek a megavoltos sugárforrások az 1940-es évekre. Az új, nagyenergiájú sugárforrások, a korszerű besugárzás tervezés, kedvezően befolyásolták a tumoros betegek irradiációs kezelésének eredményeit. A mélyebb penetráció, a jelentősen csökkent mellékhatások lehetővé tették a fej-nyaki régió mélyebb területein elhelyezkedő daganatok sikeres sugárkezelését. A korszerű irradiációs technikák javították a lokális kontrollt, és csökkentették a komplikációkat. Jelenleg a fej-nyaki planocellularis daganatok jelentős részében az elsődleges ellátáshoz hozzátartozik a sugárterápia. A modern kemoterápia, a malignus daganatok gyógyszeres kezelése több mint 50 éve, a mustárnitrogének alkalmazásával kezdődött, de a legutóbbi időkig a fej-nyaki planocellularis
carcinomák
eredményes
kezelésére
érdemi
hatása
nem
volt.
Tradicionálisan a kemoterápiát az irradiáció és vagy a sebészi kezelés sikertelensége esetén használták, palliatív szándékkal (7). Az múlt század 90-es évek elejétől kezdődően, nagy beteganyagot kezelő, kiemelt onkológiai centrumok eredményeinek metaanalízise alapján, az irradiációval együtt alkalmazott, főleg platina bázisú concomittáló kemoradioterápia az előrehaladt fej-nyaki rákban szenvedő betegek túlélését értékes százalékokkal javított (20). Mindezen fejlődés ellenére a túlélési statisztikák adatai továbbra sem tükröznek lényeges változást. Az utóbbi évek (2000-2005) adatai alapján a gégerákos férfiak 5 éves túlélése az USA-ban 65,1%, Angliában 67,1%, Európában 62,3%, míg az oropharyngealis rákok esetében az USA-ban 58,7%, Angliában 42,1%, Európában 33,1% (85, 86). Áttanulmányozva nagy amerikai statisztikákat, ahol talán a fent említett fejlődés a legteljesebben érvényesült, az ötvenes évekkel összehasonlítva az 5 éves túlélésben a gége rákok esetében 15%-os, míg a szájüregi és garat rákok esetén 14%-os javulás mutatkozik (85).
9
Az
elmúlt
évtizedek
molekuláris
biológiai
vizsgálatai
egyértelműen
bizonyították, hogy a metasztázis képződés, egy többlépcsős, kaszkádszerű folyamat, amelyben nem csak kizárólag a daganatsejt, ill. a daganatsejthez kapcsolódó faktorok vesznek részt, hanem döntő szerepük van a rosszindulatú elváltozást körülvevő szöveti struktúrák, a gazdaszervezet reakcióinak is (35). A heterogén primer tumorban jelenlévő, metasztázis képzésre alkalmas tumorsejt szubpopuláció, egy szekvenciálisan egymásra épülő többszörös tumor-gazdaszervezet kölcsönhatásban válik le a primer daganatról, vándorol át az extracelluláris mátrixon, jut át a bazális membránon és kerül a vér vagy a nyirokkeringésbe, majd jut el, erős szelekciós nyomás alatt a célszövetbe és képezhet metasztázist (70). Klinikailag jól ismert jelenség, hogy a fej-nyaki rákok, az esetek túlnyomó többségében, elsősorban limfogén úton képeznek áttétet, és csak az előrehaladottabb folyamatoknál jelentkezik a hematogén szóródás, amit részben magyaráznak az utóbbi évek vizsgálatai, amelyek szerint több daganatféleség, köztük a fej-nyaki planocellularis carcinomák is képesek limfangiogenezisre, ezzel megteremtve a lehetőséget a limfatikus disszeminációra (120). Tímár és mtsai összefoglaló cikkükben részletesen elemzik a hematogén és limfogén metasztázis képződés közötti eltéréseket. Napjainkban a nyaki áttét diagnosztikája a tapintáson ill. a radiológiai képalkotó eljárásokon alapul (123). A fejlett diagnosztikai lehetőségek, mint a CT, MRI, vagy az ultrahang vezérelt vékonytű aspirációs citológiai vizsgálat ellenére, amelynek szenzitivitása 48-76%-os, a nyaki metasztázisok gyakran csak akkor kerülnek klinikai észlelésre, ha már relatíve nagyok (113, 117). Másrészről sok beteg esik át szükségtelen electiv nyaki block dissectión, az azzal együtt járó indokolatlan műtéti terheléssel és esetleges maradandó funkciókárosodással, az okkult metasztázisoktól való félelem miatt (22, 108). A primer fej-nyaki daganat áttétképző képességének megítélésére az elmúlt évtizedekben, mind klinikai, mind hisztológiai, mind molekuláris szinten több próbálkozás is történt. Ismereteink szerint azonban idáig nem sikerült olyan tényezőt találni, amely rutinszerűen bekerült volna a mindennapi klinikai gyakorlatba, és valós segítséget adna a terápiás döntésekben. A kézikönyvek a prognosztikai faktorokat többféle felosztásban tárgyalják. Itt mi csak a metasztázis képzéssel összefüggő, primer
10
tumorhoz kapcsolódó, leggyakrabban vizsgált tényezőket említjük, mivel saját vizsgálatainkat is ebben az irányban végeztük. A fentieket célzó vizsgálatok egy része, alapvetően morfológiai jegyek jelenlétével vagy hiányával összefüggésben határozza meg a primer daganat metasztatikus kézségét, bár ezeknek a vizsgálatoknak jelentős részében is már a módszerek molekuláris szintűek. Martinez-Gimeno a nyirokcsomó metasztázis kialakulásának előrejelzésére, egy a microvascularis invázió jelenlétét vagy hiányát, a szövettani gradinget, a tumor vastagságát, a gyulladásos infiltráció mértékét, a tumor interfázist, és a perineuralis invázió mértékét magában foglaló, ezeket számszerűsítő, majd különböző valószínűségi csoportokba foglaló rendszert dolgozott ki (74). A tumor és a stroma határán, az invázió megjelenési formáinak is jelentőséget tulajdonítanak a metasztatikus kézség szempontjából. A tentacularis típusú, ujjszerű nyúlványok formájában infiltráló daganat (diffuse spread), nagyobb valószínűséggel képez metasztázist, mint a lekerekedett határokat mutató, expanzívan infiltráló típus (pushing type) (78, 131, 28). A tumor szövet mélységi penetrációját vizsgálták Mohit-Tabatabai, Spiro és Rasgon, akik szájfenéki, szájüregi ill. pharyngealis planocellularis carcinomák esetében találtak összefüggést a nyaki metasztázisok megjelenésének valószínűsége és a primer tumor vastagsága között (81, 112, 93, 49). Bár számos beszámolóban szerepel a tumor grading és a metasztázis valószínűsége közötti kapcsolat, az irodalomi vélemények ebben a kérdésben is erősen megosztott (80, 78, 49). Az angiogenezis a metasztázis képződés egyik alapfeltétele. A tumor angiogenetikus potenciálja jól kvantifikálható az erek jelölésére alkalmas endothelialis antigénekkel, a rutinszerűen használt paraffinba ágyazott metszetekben is. Míg Gasparini majd Williams közvetlen kapcsolatot igazoltak a „microvessel density” (MVD) és a metasztázis valamint a prognózis között fej-nyaki rákokban, addig Gluckman 53 korai szájüregi carcinomában nem tudta kimutatni ugyan ezt az összefüggést (44, 128, 49). A vascularis invázió, mint a nyaki metasztázisokra hajlamosító tényező, szintén vitatott jelentőségű az irodalomban. Számos tanulmány hangsúlyozza a primer
11
tumorban észlelt perineuralis invázió és a nyaki nyirokcsomó metasztázis kapcsolatát (39, 127), azonban mind ez utóbbiról, mind a daganat körüli stromát infiltráló gyulladásos sejtek prognosztikai értékéről ellentmondóak a beszámolók (39, 78). A DNS tartalom fej-nyaki planocellularis carcinomákban betöltött prognosztikai szerepével összefüggésben is történtek vizsgálatok. Wolf és mtsai. 94 gégerákban szenvedő beteg anyagát feldolgozva azt tapasztalták, hogy az aneuploid tumorokban szignifikánsan magasabb a nyaki metasztázis incidenciája, mint a diploid tumorokban (129). Más szerzőknek azonban nem sikerült igazolni ugyanezt az összefüggést (68). Az utóbbi években a molekuláris prognosztikai faktorokat is kiterjedten vizsgálják, fókuszálva a protooncogénekre és suppressor génekre, valamint a tumor és környezete kölcsönhatásában szerepet játszó növekedési faktorokra. A p53 tumor suppressor gén negatívan szabályozza a sejtciklust és a genom épségéért felelős. A p53 funkció csökkenését kapcsolatba hozzák a fej-nyaki tumor agresszivitásának
növekedésével,
a
kemoterápiával
és
irradiációval
szembeni
rezisztencia fokozódásával, a tumor neovascularisatioval, és a rossz prognózissal (56), azonban a p53 onkoprotein abnormalitásainak gyakorisága ellenére, önmagában a prognosztikai jelentősége a klinikumban kevés (33). A tumor progresszió, az invázió, és a metasztázis klinikailag legalább olyan jelentős, mint a tumor indukció. Jól ismert, hogy az invázió és metasztázis képződés szoros kapcsolatban áll az angiogenezis hatékonyságával. Az egyik legismertebb angiogenesist reguláló növekedési faktor a vascular endothelial growth factor (VEGF) emelekedett expresszióját mutatták ki, metasztatikus fej-nyaki laphámrákokban (3). Hasonló eredményeket közöltek Smith és mtsai, akik 65, II-IV stádiumú oropharyngealis planocellularis carcinomában szenvedő beteg anyagát vizsgálva szoros párhuzamot találtak a VEGF expresszió és a túlélés, valamint a távoli metasztázisok között (110). Az előzőekkel szemben más szerzők, 156 fej-nyaki rákban szenvedő beteganyagban nem tudtak összefüggést kimutatni az VEGF expresszió és a klinikai lefolyás között (102). Összességében azonban a legtöbb vizsgálat szerint az emelkedett VEGF szint jelzője a súlyosabb klinikai lefolyásnak és roszabb túlélésnek. A sejtciklus G1 fázisában, reguláló szerepet játszó ciklin D1 prognosztikai szerepéről is ellentmondásos vizsgálatokat publikáltak. Míg egyes szerzők szignifikáns kapcsolatot találtak a ciklin D1 dereguláció és a túlélés között (2), addig más
12
vizsgálatok ennek ellentmondanak. Muller és mtsai, egy az előzőeknél lényegesen nagyobb anyagon, 280 fej-nyaki planocellularis carcinomában szenvedő betegnél, nem tudtak korrelációt bizonyítani a cyclin D1 csökkenés és a túlélés között (82). Az epidermal growth factor receptor (EGFR), és a ligandja a transforming growth factor-α (TGF-α) gyakran mutat fokozott expressziót fej-nyaki laphám rákokban (51). Több klinikai vizsgálat igazolta a fokozott EGFR expresszió és a klinikai lefolyás közötti szignifikáns kapcsolatot (130, 4). A fej-nyaki planocellularis carcinomák invazivitásával szorosabb kapcsolatba hozott markereket is vizsgáltak. A metasztázis képződés folyamatában jelentős szerepük van az adheziós mulekuláknak. Részben ezeknek a molekuláknak a funkciócsökkenése teszi lehetővé a tumorsejt leszakadását a primer tumorról, és részben ezeknek a molekuláknak a jelenléte szükséges a daganatsejt aktív mozgásához és az ECM-on történő áthaladásához. A későbbiekben részletes tárgyalásra kerülő E-cadherinen kívül, fejnyaki rákokban az integrinekkel kapcsolatban vannak bizonyító vizsgálatok, miszerint gyakran megfigyelhető a β1-integrin csökkent és az α6β4-integrin fokozott expressziója (120). Az epidermális sejtekre jellemző a konstitutív CD44 expresszió. Általános jelenség a fej-nyaki rákokban a CD44 megjelenésének csökkenése. A fentiek mellett az irodalomban még számtalan tényezőt vizsgáltak, amely prognosztikai értékkel bírhat a fej-nyaki rákok esetében, de jelenleg nem rendelkezünk megbízható diagnosztikus eszközzel arra, hogy a fej-nyaki daganatok metasztatizáló potenciálját előre jelezzük, pedig egy ilyen módszer rendkívüli jelentőséggel bírna a klinikumban.
A
szabályozásának
metasztázis megismerése,
képzésért egyrészről
felelős új
molekuláris
mechanizmusok
támadáspontokat
nyithat
az
eredményesebb gyógyszeres tumorkezelés előtt, másrészről esetleges kulcs molekulák megtalálásával és jelenlétük kvantifikálásával lehetőség nyílhat prognosztikailag értékes adatok megszerzésére, és segítségünkre lehet az agresszívebb kezelést igénylő magasabb kockázatú betegcsoport meghatározásában.
13
3. A KUTATÁS KIINDULÓPONTJA ÉS A VIZSGÁLT MOLEKULÁK ÁLTALÁNOS JELLEMZŐI A kutatásnak irányt szabó kérdésfelvetések alapvetően klinikusi megközelítésűek. A metasztázis képzésben bizonyítottan részvevő olyan molekulákat választottunk a kutatás tárgyául, amelyek az irodalmi adatok és a molekulák eddig megismert szerepe alapján ígéretesek
lehetnek
a
fej-nyaki
planocellularis
carcinomák
metasztázis
mechanizmusának kutatásában, és a későbbiekben prognosztikai jelentőséggel bírhatnak. További szempont volt, hogy a molekulák között már ismert kapcsolat legyen. Munkánk második részében a hisztamin direkt inváziót és metasztázist fokozó hatásásával foglalkoztunk, az előzőekben vizsgált molekulákon keresztül, és amely téma a nemzetközi irodalomban is nagyon szegényesen reprezentált. 3.1. Ets-1 transzkripciós faktor Az ets-1 gén, amelyet korábban az E26 avian leukémia retrovírus egyik oncogénjeként (v-ets) ismertünk (69), az utóbbi évek vizsgálatai szerint szerepet játszik olyan mindennapos fiziológiai folyamatokban, mint a sejtproliferáció vagy a differenciáció (84). Emberben az ets-1 expressziót elsőként T és B lymphocytákban mutatták ki, de emellett más szövetekben is expresszálódik. Folkman (1971) nevéhez fűződik a megállapítás, miszerint az angiogenezis nélkülözhetetlen a tumor növekedéséhez és a metasztázis képzéshez (24). Ismereteink szerint az ets-1 transzkripciós faktor jelentős szerepet játszik az angiogenezisben. Az érképzésben résztvevő két alapvető sejttípusban, az endothelben és a vascularis simaizom sejtekben, angiogen faktorok, mint VEGF, bFGF, angiotensin II, endothelin1, tumor necrosis factor α és hidrogén peroxid hatására, expresszálódik az ets-1 (30), amely ezeknek a sejteknek a proliferációjához, migrációjához és inváziójához vezet. Az ets-1 gátlása, ets-1 elleni anti-sense oligonukleotid szekvenciával megakadályozza az endothel sejtek migrációját, és angioge faktorokra való válaszkézségét (133). Wernert és mtsai. igazolták, hogy az ets-1 gén a fentiek mellett részt vesz a tumort környező stromának
a
tumor
invázióra
adott
válaszreakciójában,
a
tumor
indukálta
angiogenezisben is (126). Vizsgálatok bizonyították, hogy az ets-1 részt vesz a VEGF és receptorának regulációjában. Ets-1 elleni direkt antisense DNS hatására gátlódik az
14
endothel sejtekben a VEGF expresszió (121). A tumor és környezetében meglévő hypoxia rendkívül erős stimulátora az ér újdonképződésnek. A csökkent oxigén ellátottság aktiválja a hipoxia indukálta transzkripciós faktorokat (HIF), amelyek több további angiogen faktor expresszióját fokozzák, mint a VEGF, nitric oxid szintetáz (NOS), platelet-derived growth factor (PDGF) (107). Oikawa igazolta, hogy az ets-1 promoteréhez a HIF-1 direkt módon kötődik és aktiválja az ets-1 transzkripcióját (89). Az ets-1 szerepet játszik az invázióban és metasztázis képzésben. Az ets-1 gén által kódolt transzkripciós faktor fehérje képes kötődni az uPA gén enhanceréhez, valamint az MMP-3 és MMP-1 gén promoteréhez, és feltételezhetően ezeknek a géneknek az expressziójának aktiválásán keresztül vesz részt a tumoros invázió szabályozásában (91). Az ets-1-nek szerepe van a lymphoid sejtek fejlődésében, a T és B sejtek differenciációjában, valamint számos T sejt specifikus gén expresszióját szabályozza, és részt vesz a B sejtekben az immunglobulin nehéz lánc enhancer gén regulációjában (30). Az apoptosisban betöltött szerepével kapcsolatban úgy tűnik, hogy a szinergistaként a wildtipe p53-al aktiválja a p53-responsive pro-apoptoticus géneket, mint a bax, bid, és bcl2 (105).
ECM bontásában résztvevő proteinázok morfogenezis
bid, bax, bcl2
invázió, metasztázis
embrionális fejlődés
apoptosis
Ets-1 haemopoeticus sejt differenciáció proteinázok, VEGF 1. Ábra
Az ets-1 transzkripciós faktor funkciói
15
angiogenezis
Számos emberi daganatban bizonyították az ets-1 transzkripciós faktor jelenlétét (I. táblázat) ; gyomor (84), tüdő (12), prostata (26), pancreas (59), oesophagus (101), máj (90), bőr angiosarcoma (83), szájüregi carcinoma (91), extrahepaticus epeút carcinoma (60) és meningeoma (66), emlő carcinoma (111). Emlő carcinomában végzett vizsgálatokban az ets-1-t független prognosztikai tényezőnek találták (111), míg tüdő és szájüregi rákok esetén az ets-1 expresszió és a metasztázis között volt szignifikáns kapcsolat (12, 91). Epitheliális tumorokban az ets-1 kettős szerepet tölt be. Egyrészről hozzájárul a tumor növekedéséhez és az oxegenizáció javításához, indukálva a tumor vascularisatiót, másrészről elősegíti a tumor inváziót aktiválva az ECM bontásában résztvevő proteázokat a tumorban és a peritumorális fibroblastokban.
16
17
3.2. MMP-3 proteolitikus enzim Az ECM az első barrier, amellyel az invázióban lévő daganatjest találkozik. A tumor sejtnek az ECM komponenseit bontó proteolitikus enzimekre van szüksége ahhoz, hogy lehetővé váljon a további migrációja.Az invázió és a metasztázis képződés folyamatában a tumorsejteknek adhéziós receptorok közvetítette kölcsönhatásba kell lépniük az ECM-fehérjékkel. Ezért a kölcsönhatásért az integrinek felelősek, amelynek ligandjai
az
ECM
összetevői.
Ennek
a
tumorsejt-ECM
kapcsolatnak
a
következményeként a mátrix lebomlik az adott helyen, lehetővé téve a daganatsejt aktív továbbhaladását. Az ECM bontásában, több más proteolitikus enzim család mellett, jelentős szerepe van a mátrix metalloproteinázoknak (MMP). Jellemzőjük, a katalitikus doménen elhelyezkedő Zn2+ kötő alegység, amely nélkülözhetetlen a katalitikus funkcióhoz (19). Aktiválódásukhoz más proteinázok aktivitása és valószínűleg a környezet alacsonyabb pH-ja szükséges (118). Az MMP családba tartozik a MMP-3 vagy stromelysin-1, amelynek szubsztrátjai proteoglycanok, fibronectin, gelatinok, továbbá a basál membrán fő alkotó eleme a IV collagen és a V collagen (9, 87). A tumorsejt és a környező stroma sejtjeinek interakciója fontos szerepet játszik a tumorok növekedésében és a metasztázisok kialakulásában (136). A fibroblast, mint a stroma meghatározó sejtje, felelős a kötőszövetből, a tumor invázió kapcsán, felszabaduló proteázokért (119, 100, 50). Wernert és mtsai. igazolták, hogy a MMP-3 mRNS legfőbb forrása a peritumorális fibroblastok (126). A MMP-3 hasítja az E-cadherin extracelluláris doménjét, ezzel indukálva egy progresszív fenotípus változást, amely a sejt-sejt kontaktus elvesztésétől, a citokeratin csökkent expresszióján, a vimentin megjelenése és a keratinocyta növekedési faktor expressziójának aktiválásán keresztül, a MMP-ok fokozott termelődéséhez vezet (71). Immundeficiens egerek emlősejt tenyészetében észlelték, hogy a MMP-3 képes a nem invazív sejteket, inflitratív növekedésű daganat kialakítására késztetni, ezzel igazolva a MMP-3 proinvazív aktivitását (72). A MMP-3 ténylegesen az un. „hit-and-run” mechanizmussal hat, vagyis a MMP-3 folyamatos expressziója nem szükséges a tumor fenotípus vagy az általa kiváltott genetikai változások fenntartásához (8).
18
3.3. E-cadherin adhéziós molekula A gerincesek többségében a sejtek közötti kapcsolat megteremtésében alapvető fontosságú molekulák egyik, Ca2+ függő csoportjának legjelentősebb képviselői a cadherinek.
Ezeknek
a
transzmembrán
glikoproteineknek
szerepe
van
a
morfogenezisben és a differenciált fenotípus megtartásában (40). Az E-cadherin többféle epithelialis sejt jellegzetes sejtadhéziós molekulája, amely felépítésében a plazmamembránt egyszer átérő glikoprotein. Öt extracelluláris doménnel, és egy a catenineken keresztül az actin citoskeletonhoz kapcsolódó citoplazmaticus doménnel rendelkezik. Az extracellularis részleten helyezkednek el a feltételezett Ca2+ kötőhelyek. Ca2+ hiányában a cadherin molekula szerkezete megváltozik, és proteolitikus enzimek hatására lebomlik. Szerepe elsősorban az azonos sejtek, sejt-sejt, homofil kötődésben van (115). Csökkent vagy hiányzó E-cadherin expressziót írtak le fej-nyaki planocellularis carcinomában (106, 15, 16, 77, 116, 6, 65), prostata (99), oesophagus (104), gyomor (109), colon (124) és tüdő carcinomában (18, 10) 3.4.
Ki-67 sejtproliferációs marker
A proliferativ daganatsejt frakció mértékének prognosztikai jelentősége a fej-nyaki planocellularis carcinomákban még nem tisztázott ill. vitatott. A Ki-67 proliferációs marker meghatározását 1983-ban írták le, és alkalmazása általánossá vált, mivel relatíve gyors és költségkímélő, mégis megbízható módszer a daganat proliferáló frakciójának meghatározásában (46, 45). A Ki-67 nuclearis antigen jelen van a sejtciklus S, G2 és M fázisában, de hiányzik a G0 fázisban. A Ki-67 nuclearis antigén expressziója fokozódik a sejtciklus előrehaladtával, számottevően az S fázis második felében és maximumát a G2M fázisban éri el (103). 3.5. Hisztamin A hisztidin dekarboxileződésével létrejövő kis molekula tömegű biogén amin, a hisztamin, a biológiában széles körben előforduló kémiai mediátor, amely egyrészt neurotranszmitter, a gastrointestinális és simaizom funkció mediátora, másrészt fő szerepet játszik az allergiás reakcióban, a gyulladásban és a sejt proliferációjában is. Az a hipotézis, miszerint a hisztamin részt vesz a carcinogenezisben és a tumor sejt
19
proliferációban már a hatvanas években megszületett (64), bár mind a mai napig számtalan nyitott kérdés maradt hátra. A hisztidin decarboxileződését katalizáló hisztidin dekarboxiláz (HDC), mint a hisztamin bioszintézisért felelős enzim, specifikus markere a hisztamin szintézisnek. Irodalmi adatok igazolják, hogy emlő és colon carcinomában, melanomában, lymphomában és leukémiában, mind a HDC-t kódoló mRNS, mind a HDC protein szintje és következményesen a hisztamin szintézis, szignifikánsan magasabb, mint a környező ép szövetekben (31). A daganaton belüli hisztamin koncentráció mérésére is történtek vizsgálatok, bár meggyőző eredmények elsősorban emlő, bőr és colon carcinomák esetében állnak rendelkezésünkre. Chanda és Ganguly, Reynolds és mtsai. valamint Garcia-Caballero, kis eltérésektől eltekintve, egyaránt magasabbnak találták a hisztamin koncentrációt az emlő tumorban, mint a környező ép szövetekben (25, 95, 42, 43). Reynolds és mtsai. igazolták, hogy elégséges magas koncentrációban van jelen a hisztamin az emlő carcinomában ahhoz, hogy gátolja a lymphocyta aktivációt (95). Értékes információkat adna a hisztamin in situ kimutatása tumoros szövetmintában, a tumor és a tumorhoz asszociált sejtekben történő megoszlás megítélésére, de a gyorsan bomló kis molekula tömegű hisztamin és a strukturális szövet eltérő fixációs technikái miatt ez rendkívül körülményes, és tudomásunk szerint eddig ilyen jellegű sikeres vizsgálat nem történt. A hisztamin szerepe a tumor genezisben és a metasztázis képződésben még nem tisztázott. Falus és mtsai. igazolták, hogy a hisztamin hatása a melanoma sejtek proliferációjára az aktuális hisztamin receptor típus megoszlás függvénye, ugyanakkor a hisztamin indirekt úton irányítja a helyi T sejt polarizációt a Th2 predominancia irányában (32). Experimentális carcinomákban a hisztaminnak, mint egy autocrin növekedési faktornak a legfontosabb hatása, hogy a H2 receptorokon keresztül stimulálja a
proliferációt
(31).
Hasonlóan
a
hisztamin
kettős
hatására
az
immunrendszerre, ahol a H2 receptoron keresztül immunszupresszor és a H1 receptorokon keresztül immunstimuláló, a daganatok proliferációjára is ambivalens hatása van. Amíg a hisztamin a H2 receptoron keresztül serkenti a sejt proliferációt, addig a H1 receptorokon keresztül a tumor növekedését gátolja (32, 17). Az invázió és metastasis képzés folyamata nagymértékben függ a daganat angiogen potenciáljától. Vizsgálatok igazolták a hisztamint mint angiogen faktort, de az
20
angiogenezis folyamatában betöltött specifikus működése még ismeretlen. Zaubermann több mint harminc éve publikálta megfigyelését, miszerint a hisztamin nyúl corneában angiogenezist indukál (134). Újabb vizsgálatok alapján a hisztamin érújdonképződést kiváltó hatását valószínűleg a nitrogén oxid generálásával kapcsolatban fejt ki (38). A hisztamin egyik fő forrását jelentő hízósejtekkel kapcsolatos első megfigyelés Ehrlich (1879) nevéhez fűződik, miszerint a hízósejtek nagy számban vannak jelen a tumorhoz közeli területeken. Pár évvel később Westphal (1890) a doktori téziseiben rögzítette a hízósejt akcelerációt a tumor közvetlen környezetében (29). Az utóbbi időben több munkacsoport is igazolta azt az eredeti megfigyelést, hogy a hisztamin egyik fő forrásának számító hízósejtek felszaporodnak számos solid tumor környezetében, sőt colorectalis daganatok esetében prognosztikai jelentőséggel is bírnak (37, 62). A hisztamin kapcsolata az invázióval és a metasztázis képzéssel nem tisztázott. Mint angiogen faktor, indirekt úton erősíti az invázió mechanizmusát, azonban, a metasztázis kaszkád által modellezett folyamatokra gyakorolt, direkt metasztázist befolyásoló hatását eddig nem vizsgálták. A hisztamin jelentőségét a daganatokkal kapcsolatban mutatja, hogy bizonyos malignomák esetén már hisztaminnal kapcsolatos terápiás próbálkozások is történtek. Összevethető vizsgálatok eddig gyomor, colorectalis és emlő carcinoma cimetidin adjuváns kezelésével kapcsolatban állnak rendelkezésünkre. Az első beszámoló a H2 receptor antagonista cimetidin terápiás hatásáról gyomor carcinomában szenvedő betegekben Tonnesen-től származik 1988-ból (122). A cimetidint naponta 2 alkalommal adták 400 mg dózisban, a sebészi tumor-eltávolítást követően 2 évig, randomizált placebo kontrollált vizsgálatban. A túlélés az első évben 17%-al, a harmadik évben 6%al, az ötödik évben 2%-al volt jobb, mint a placebóval kezelt csoportban. Ugyanakkor Hallissey egy 442 gyomor carcinomás beteganyagot magában foglaló vizsgálatban 400 ill. 800 mg cimetidin, napi kétszeri adásával, sem talált a túlélésben értékelhető eltérést, 44 hónap, az átlagos követési idő alatt (55). A Tonnesen vizsgálatához hasonló eredményket ért el a túlélésben Adams, cimetidin perioperativ adjuváns alkalmazásával, colorectalis rákban szenvedő betegek esetében (1). Ezt az eredményt később igazolta több kutatócsoport is,
beszámolva a műtét alatt ill. közvetlen a műtétet követően
21
adjuvánsan alkalmazott
szelektív H2
receptor antagonista cimetidin túlélést
szignifikánsan növelő hatásáról három éves követési időn belül (114, 76).
22
4. CÉLKITŰZÉSEK 4.1. Ets-1, E-cadherin és Ki-67 vizsgálata betegekből származó tumor mintákban: A vizsgálat alapvetően kép lépcsőből tevődött össze. Első lépcsőben retrospectiv vizsgálatban jól dokumentált és kórlefolyásában szorosan követett fej-nyaki planocellularis carcinomában szenvedő betegek, kuratív szándékú műtétje során eltávolított specimenek feldolgozásával, vizsgáltuk az adott molekulák jelenlétét, megoszlását, részben RT-PCR részben immunhisztokémiai technikával. 4.1.1.Ets-1 és MMP-3 RT-PCR vizsgálata műtéti anyagon Műtét során eltávolított tumormintákból, RT-PCR vizsgálattal igazoltuk az ets-1 mRNS jelenlétét, majd összevetettük 4 metasztatizáló (M1-4) és 4 nem metasztatizáló (N1-4) esetben RT-PCR vizsgálattal detektált ets-1 és MMP-3 mRNS értékeit. Megfogalmazott kérdések: − Kimutatható-e az ets-1 transzkripciós faktor mRNS-e a tumormintákban, az ép nyálkahártyába? − Van-e eltérés a nem metasztatizáló N(0) és metasztatizáló N(+) tumorminták ets-1 és MMP-3 mRNS tartalmában? 4.1.2. Műtéti anyagon végzett ets-1, E-cadehrin és Ki-67 immunhisztokémiai vizsgálat Az E-cadherin által közvetített intratumorális sejt-sejt közötti adhesiót, a Ki-67 által detektált tumor proliferativ aktivitását, valamint az ets-1 transzkripciós faktor által közvetített mátrix remodelláló képességet vizsgáltuk immunhisztokémiai módszerrel, mint a fej-nyaki planocellularis carcinomák agresszivításának lehetséges markereit. Megfogalmazott kérdések: − Van-e összefüggés a primer tumorokban észlelt ets-1 és E-cadherin expresszió és a betegek klinikopatológiai adatai között? − Van-e statisztikailag értékelhető eltérés az ets-1, E-cadherin és Ki-67 expresszióban az N(0) és N(+) csoport között? − Van-e statisztikailag értékelhető eltérés az ets-1 és E-cadherin expresszióban a primer tumorok és metasztázisok között?
23
− Van-e statisztikailag értékelhető eltérés az ets-1 pozitív és negatív, valamint az E-cadherin megtartott és csökkent csoport kumulatív túlélése között?
24
4.2. In vitro vizsgálat humán melanoma sejtvonalon és humán fibroblast tenyészetben 4.2.1.Humán melanoma sejtvonalakon végzett RT-PCR vizsgálat és flow-citometria A műtéti anyagon végzett vizsgálatok tapasztalatainak valamint irodalmi adatok felhasználásával első lépésben metasztatikus fenotípussal rendelkező humán melanoma sejtvonalakon vizsgáltuk az ets-1 gén expresszióját, ill. hisztaminnal való kapcsolatát RT-PCR-el és flow citometriával. Ezt követően, a H2 receptornak a folyamatban történő részvételét igazoltuk flow citometriával. Megfogalmazott kérdések: − A hisztamin befolyásolja-e a melanoma ets-1 expressziót? − A hisztamin hatása a melanoma sejtek ets-1 expressziójára H2 receptor mediált-e? 4.2.2. Human fibroblast sejttenyészetben végeztt RT-PCR, flow-citometria és immuncitokémiai vizsgálat Második lépésben in vitro fibroblast sejttenyészetben modelleztük az ets-1 transzkripciós faktor, az ECM bontásáért felelős MMP-3 és hisztamin közötti kapcsolatot. Annak vizsgálatára, hogy a hisztamin befolyásolja-e a peritumorális fibroblastok MMP-3 termelését, in vitro modellben, primer humán fibroblast tenyészetben, a melanomához hasonlóan, potenciális kapcsolatot kerestünk az alkalmazott hisztamin és az ets-1 ill. a MMP-3 expresszió között. Rekombináns bázikus fibroblast növekedési faktor (bFGF) és hisztamin jelenlétében ill. ezek hiányában vizsgáltuk fibroblast tenyészetben az ets-1 és MMP-3 mRNS szintjét reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) technikával valamint az ets-1 és MMP-3 protein mennyiségét flow-cytometriával. A hisztamin feltételezett hatásának in situ, sejten belüli vizualizálására fluorescens immuncitokémiai vizsgálatot végeztünk a fibroblast tenyészetben. A modell belső kontrolljaként Wernert és mtsai. által bFGF-ral végzett kísérlet szolgált. − A hisztamin befolyásolja-e a fibroblastok ets-1 és MMP-3 expresszióját? − A bFGF hatással van-e a fibroblast hisztamin termelésére?
25
5. MÓDSZER 5.1. Immunhisztokémia 5.1.1.Betegek és tumor minták Ets-1, E-cadherin, Ki-67: Ets-1 esetében 40 beteg (32 férfi, 8 nő), E-cadherin esetében 98 beteg (87 férfi, 11 nő), műtét során eltávolított anyagát vizsgáltuk, akik planocellularis carcinoma miatt curativ szándékú sebészi beavatkozáson estek át az Országos Gyógyintézeti Központ, Fül-Orr-Gégészeti Osztályán, 1993 és 2001 között. A daganatok lokalizáció (mesopharyngealis, laryngealis, hypopharyngealis) és kiterjedés szerinti (T1-T4) beosztását, valamint a nyaki metasztázisok meghatározását N0-tól N3-ig a UICC TNM Classification of Malignant Tumors (1987) szerint végeztük. A szövettani grading megadása a következők alapján történt: grade 1: jól differenciált, grade 2: közepesen differenciált, grade 3: rosszul differenciált. A hisztológiai diagnózist az OGYK Patológiai Osztályán végezték. Az intraoperativ eltávolított specimenekből a tumoros infiltráció macroscopos vizsgálattal meghatározott punctum maximumából végeztük az immunhisztokémiai vizsgálatot. Figyelembe véve a klinikai tapasztalatot, miszerint a nyaki metastasisok bizonyos esetekben hónapokkal a primer tumor radicalis műtéti eltávolítását követően jelentkeznek, a feldolgozás során az ets-1 és E-cadherin esetében a primer tumor mintákat két csoportra osztottuk: N(0) csoport (n=48), ahol klinikailag vagy a block dissecatum feldolgozása után nem volt szinkron nyaki metasztázis és 2 éves követési idő alatt sem jelentkezett, N(+) csoport (n=50), ahol a diagnózis felállításakor ill. a nyaki dissecatum feldolgozásánál, vagy a következő 2 év alatt jelentkezett nyaki metasztásis. Ezeket az adatokat nem a többi klinikopatológiai paraméterrel együtt kezeltük. Megítélésünk szerint ezzel a felosztással a vizsgálat szempontjából jobban tükrözzük a primer daganatok valós metasztatikus potenciálját, mint a hagyományos klinikai vagy patológiai N beosztással. 5.1.2. Immunhisztokémiai festés: A 3 µm vastagságú, paraffinba ágyazott metszeteket silános lemezen (poly Llisyn Silan), 60 C°-os termosztátban 24 óráig polimerizáltuk. Depparaffináltuk xilolban, leszálló alkoholsorban és mostuk TBS-ben(pH 6,7). Az endogén peroxidáz blokkolást
26
3%-os vizes hidrogén peroxiddal végeztük. Antigén feltárást Antigen unmasking solutio-val (Novocastra, H 3300), mikrohullámú kuktában, 700 W-on 20 percig. Az aspecifikus fehérje blokkolást normál lószérummal 10 percig, végeztük. A metszeteket inkubáltuk a primer, egérben termelt monoklonális, E-cadherin (H-108), Ki-67 (BioGenex), és nyúlban termelt poliklonális Ets-1 antitesttel (c-20, Santa Cruz Biotech. Inc.), 1:200 hígításban, 60 percig. Cadensa pufferes kétszeri mosást következett. A metszeteket
biotinnal
konjugált
univerzális,
lóban
termelt
(anti
egér/nyúl/patkány/kecske) immunglobulin G-vel (Vectastain Kit, Universal Quick Kit, PK 7800) mint szekunder antitesttel, kötöttük. Majd ismételt Cadensa pufferes mosást alkalmaztunk. Utána streptavidinnel konjugált tormaperoxidázzal (Vectastain Kit, Universal Quick Kit, PK 7800) 5 percig inkubáltuk. Cromogénnek Vector NovaRED Substrat Kit, SK 4800 alkalmaztunk 5 percig, az előhívás mindig mikroszkópos ellenőrzés mellett történt. Háttérfestésre hemalaunt (Gill 2) alkalmaztunk 1 percig, majd csapvízben kékitettük 5 percig. A dehidrálást felszálló alkoholsorban 3x5 percig, terpineolban, és xilolban 3x 5 percig végeztük, végül, pertx-el fedtük. A metszeteket fénymikroszkóppal vizsgáltuk (Nikon Alfa-phot 2). 5.1.3. Az immunreakció értékelése: Az értékelést a pozitívan festődő tumorsejtek százalékában adtuk meg, 2000 tumorsejt leszámolása alapján: E-cadherin megtartott ≥50%, és E-cadherin csökkent <50%, a Sato és mtsai. által alkalmazott skála szerint (104), míg a Ki-67 esetében a pozitív nukleáris festődés százalékos megoszlása alapján Ki-67 indexet vettünk fel. Bár mind a tumor sejtekben, mind a környező stromában észleltünk festődést, az ets-1 expressziót csak a tumor sejtekben számszerűsítettük a festődő sejtek arányában, Pande és mtsai. által javasolt skála szerint: - negatív, + 0-tól 10%, ++ 10-től 50%, +++ >50% (91). 5.2.Melanoma sejtvonalak A HT-168 és a HT-168/M1 sejtvonalak az A2058 sejtvonalból származik a magas metasztatikus kapacitás alapján szelektálva immunszuprimált CBA/Ca egéren. Az A2058 sejtvonal agyi metasztázisból származik. A WM983B sejtvonal bőr
27
metasztázisból, míg a WM35 sejtvonalat korai primer tumorból izolálták. A humán melanoma sejtvonalakat Dr. Tímár József bocsátotta rendelkezésünkre (Országos Onkológiai Intézet, Budapest). A sejteket RPMI-1640 médiumon tenyésztettük 10%-os borjú savóval. 5.3. Sejttenyészet Hypopharynx carcinoma miatt végzett műtét során közvetlen a peritumorális területről vett humán nyálkahártya primer fibroblast tenyészetet indítottunk, RPMI médiumon (Sigma, Saint Louis, Missuri, USA) 10% borjú szérummal és antibiotikummal. Amikor a tenyészet elérte a subconfluens szintet, 3 frakciót képeztünk, majd a sejteket mostuk és inkubáltuk RPMI médiumon külön-külön 10 ng/ml recombináns humán bFGF (Sigma, Saint Louis, Missuri, USA) és 1µM hisztamin jelenlétében. A sejtenyészet harmadik kezeletlen frakciója szolgált kontrollként. Mindhárom frakcióból a sejtek egyik csoportját hat órával később RNS kivonásra, míg a másik csoportját 20 órával később flow-cytometriai vizsgálatra készítettük elő. Négy órával a flow-cytometriai vizsgálatra való előkészítést megelőzően 10µg/ml Brefeldin A-t (Sigma, Saint Louis, Missuri, USA) adtunk a sejtekhez, a protein szekréció megakadályozására. Az in vitro kísérlet elrendezését mutatja a 2. ábra.
Brefeldin A 6 óra
20 óra
16 óra
HA HA bFGF
bFGF
kontroll RT-PCR
Fibroblast tenyészet 2. Ábra
FACS Fluoreszcens im m uncitokém ia
A fibroblast tenyészeten végzett kísérlet elrendezése
28
5.4. RT-PCR 5.4.1. Betegek és tumor minták Ets-1, MMP-3: Az ets-1 és MMP-3 mRNS igazolására véletlenszerűen 3 tumormintát, 1 ép algarati nyálkahártya részletet, és mivel az aktivált lymphocyták magas szinten expresszálják az ets-1 mRNS-t, pozitív kontrollként tonsilla szövetet választottunk. Metasztatizáló (M) esetnek vettük, ha a műtét időpontjában már volt igazolt nyaki metastasis, amely szintén eltávolításra került. Nem metasztatizáló (N) esetnek tekintettük, ha a diagnózist és a műtétet követő 2 éves követési időszakban nem jelentkezett áttét.
5.4.2. RT-PCR A műtéti anyagon végzett RT-PCR esetében, intraoperativ vett és folyékony nitrogénben tárolt, majd homogenizált tumor szövetekből, a primer fibroblast tenyészet esetében a tenyészetből TRI-reagent (Sigma, Saint Louis, Missuri, USA) segítségével izoláltuk az RNS tartalmat a megadott protokoll szerint. Az RT PCR-t Pharmacia Ataq gene Controller-ben végeztük. Az RT reakcióhoz 20 µl össztérfogatban a következőket mértük össze: Mg2+ (25 mM) 4µl, 10 x puffer 2 µl, dNTP (4x 10mM) 2 µl, RN-ase inhibitor 1µl (20 U/µl) (Promega Corp. Madison WI, USA), oligo-dT primer 1µl (Promega Corp. Madison WI, USA), Mu-LV reverz transzkriptáz 0,5 µl (25 U/µl), DEPC-es víz és 1µg az összes izolált RNS-ből. Az RNS mintákból 1 µg-ot írtunk át reverz transzkripcióval cDNS-sé 42 0C-on 30 perc, 99 0C-on 5 perc, majd a kész mintákat -80 °C-on fagyasztottuk. A PCR reakcióhoz szükséges oldat összetevői a következők voltak: 10 x puffer (5 µl), 1mM MgCl2, dNTP, Taq DNS polymerase (5 µl) (Promega Corp. Madison WI, USA), 25-50 pmol sense és antisense primer és a cDNS, összességében 50 µl. Az alábbi oligonukleotid primer szekvenciákat alkalmaztuk az RT-PCR során: (a) humán Ets-1 (33)
5’-GGGTGACGACTTCTTTG-3’
(sense
primer)
és
5’-
GTTAATGGAGTCAACCCAGC-3’ (antisense primer), 247 bp.; (b) MMP-3 5’GCTGCAAGGGGTGAGGACAC-3’
(sense
primer)
és
5’-
GATGCCAGGAAAGGTTCTGAAGTG-3’ (antisense primer), 222 bp. (c) GAPDH 5’-
29
ACGCATTTGGTCGTATTGGG-3’
(sense
primer)
és
5’-
TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3’ (antisense primer), 231 bp.. A PCR amplificatio 28 ciklusban történt, thermal cyclerben, minden ciklusban: denaturatio 94 C°-on 1 percig, annealing 57 C°-on 30 másodpercig, primer extensio 72 C°-on 1 percig. Minden amplificált mintából 15 µl-t, 2% agaróz gélen megfuttattunk. A DNS-t ethidium bromid festéssel vizualizáltuk. A denzitometriás értékelést Scion Image software-el végeztük (Scion Corp., 82 Worman’s Mill Court, Siut H, Frederick, Maryland 21701, USA) 5.5. Fluoreszcens immuncitokémia Az intraoperativ körülmények között indított primer emberi fibroblast tenyészetet 1µM hisztamin jelenlétében inkubáltunk 20 órán keresztül, majd fixáltuk 4%-os paraformaldehiddel. Az indirekt fluoreszcens festést humán ets-1 (c-20, Santa Cruz Biotech. Inc) elleni nyúl antitesttel és humán MMP-3 (Santa Cruz Biotech. Inc) elleni kecske antitesttel végeztük, 1:300 higításban. Az előbbi antitestekkel 30 percig inkubáltuk a sejteket, majd mostuk PBS-ben. Ezt követően fluoreszcein isothiocyanattal konjugált (FITC) (Sigma, Saint Louis, Missouri, USA) anti-nyúl ill. anti-kecske IgG-el inkubáltuk további 30 percig, 1:5000 hígításban, majd confocalis mikroszkóppal vizsgáltuk. 5.6. Az ets-1 és MMP-3 mennyiségi változás detekciója flow-cytometriával Polyclonális nyúl anti-humán ets-1 antitest (c-20, Santa Cruz Biotech. Inc.) és polyclonális kecske anti-humán MMP-3 antitestet (Santa Cruz Biotech. Inc.) használtunk indirekt jelzéssel az intracellularis ets-1 és MMP-3 detekcióra. A fixálást 4%-os parafolmaldehidben, 40C-on 10 percig végeztük, majd intenzív mosást követően, 0,1%-os saponinos permeabilizálás után a sejteket anti-humán ets-1 ill. MMP-3 antitesttel
jelöltük
1:100
higításban.
A
sejteket
30
percig
inkubáltuk
szobahőmérsékleten, majd ismételt mosás után, FICT-conjugált nyúl ill. kecske IgG-vel (Sigma, Saint Louis, Missuri, USA) 1:1000 hígításban. Ezt követően a sejteket további 30 percig inkubáltuk 20oC-on. Végül a sejteket mostuk, majd fixáltuk. Legalább 10 000 sejtet analizáltunk, FACS Calibur (Beckton Dickinson) flow citométerrel. A mérések
30
értékelését CellQuest software-el végeztük. Az adatokat Student’t teszttel értékeltük. Statisztikailag szignifikánsnak tekintettük ∗p<0,05. 4 független vizsgálatot végeztünk.
31
6. EREDMÉNYEK 6.1. Betegekből származó tumor mintákban végzett kísérletek 6.1.1.Ets-1 immunpozitivitás megjelenése a fej- nyaki daganatokban Míg a normál pharyngealis nyálkahártya nem mutatott pozitív immunreakciót ets-1-re (3A Ábra), addig a stromát infiltráló tumorsejtek bizonyos frakcióiban kifejezett pozitív reakció volt megfigyelhető (3B Ábra). A pozitivitást mutató tumoroknak közvetlen stromát infiltráló területén észleltük a legerőteljesebb festődést összevetve a centrális ill. perifériás régiókkal. Ets-1 pozitív tumorsejtek esetében, bár az immunreakció lokalizációja többnyire a sejtmagon belül volt észlelhető, néhány esetben a citoplazma is festődött (3C Ábra). Míg a tumoroknak csak 50%-a bizonyult ets-1-re pozitívnak, addig az ets-1 expresszió a fibroblastokban minden esetben megfigyelhető volt (II. Táblázat). Erős pozitív immunreakciót mutattak közvetlenül a tumor infiltratív zónájához közeli fibroblastok, ugyanakkor nem észleltünk pozitivitást az invazív területtől távolabb eső sejtekben (3D Ábra). Az II. táblázat mutatja az ets-1 transzkripciós faktor immunhisztokémiai megoszlását a primer tumorok és a regionális nyirokcsomó metastasisaik között az N(+) esetekben, valamint a pozitív reakció előfordulását az N(0) csoportban.. 20 esetben (50%) volt az ets-1 protein megfigyelhető a tumorsejtekben. Erős festődés (+++) csak 1 tumormintában volt megfigyelhető, míg közepes (++) 7 és enyhe (+) 13 (36%) esetben. Enyhe (+) festődés a regionális nyirokcsomó metastasisokban a 30 esetből 11-ben (36%) volt megfigyelhető, erős (+++) ill. közepes fokú (++) reakciót egyáltalán nem észleltünk. Pusztán 1 esetben volt pozitív a regionális nyirokcsomó metasztázis úgy, hogy a primer tumor nem mutatott pozitív immunreakciót.
32
II. Táblázat Az Ets-1 expresszió immunhisztokémiai megoszlása fej-nyaki planocellularis carcinomákban (n=40)
N 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20.
Primer RLNM Primer RLNM Primer RLNM Primer RLNM Primer RLNM Primer RLNM Primer RLNM Primer RLNM Primer RLNM Primer RLNM Primer RLNM Primer RLNM Primer RLNM Primer RLNM Primer RLNM Primer RLNM Primer RLNM Primer RLNM Primer RLNM Primer RLNM
Ets-1 expresszió Tumor Peritumoralis N sejt fibroblast pozitív Primer + 21. pozitív RLNM + pozitív Primer + 22. pozitív RLNM – pozitív Primer + 23. pozitív RLNM + pozitív Primer – 24. pozitív RLNM – pozitív Primer + 25. pozitív RLNM + pozitív Primer + 26. pozitív RLNM – pozitív Primer – 27. pozitív RLNM – pozitív Primer – 28. pozitív RLNM – pozitív Primer ++ 29. pozitív RLNM – pozitív Primer + 30. pozitív RLNM – pozitív Primer – 31. pozitív – pozitív Primer ++ 32. pozitív – pozitív Primer + 33. pozitív + pozitív Primer +++ 34. pozitív + Primer pozitív – 35. pozitív + Primer – pozitív 36. – pozitív – pozitív Primer 37. – pozitív Primer – pozitív 38. – pozitív + pozitív Primer 39. – pozitív – pozitív Primer 40. – pozitív
Tumor Peritumoralis sejt fibroblast ++ pozitív + pozitív – pozitív – pozitív + pozitív + pozitív – pozitív – pozitív – pozitív – pozitív + pozitív + pozitív ++ pozitív + pozitív – pozitív – pozitív ++ pozitív + pozitív + pozitív – pozitív + pozitív –
pozitív
–
pozitív
–
pozitív
++
pozitív
+
pozitív
–
pozitív
–
pozitív
–
pozitív
–
pozitív
Rövidítések: RLNM= regionális nyaki nyirokcsomó metastasis A festődés mértékének meghatározása a Módszer fejezetben
33
B
A
C
D
3. Ábra (A) A normál pharyngealis mucosa nem mutat immunhisztokémiai reakciót ets-1re (nagyítás, x300). (B) Pozitív ets-1 immunhisztokémiai reakciót mutató fej nyaki planocellularis carcinomából származó reprezentatív metszet. Az ets-1 fehérje elsősorban a tumorsejtek magjában és a tumorsejtekhez közeli fibroblastokban található (nyíl) (nagyítás x400). (C) A tumor (T) túlnyomórészt cytoplasmaticus festődést mutat (D) Az invazív tumort (T) környező stroma fibroblastjain belüli ets-1 reakció. Pozitív jel volt megfigyelhető a tumor övező fibroblastokban (F), és endothelben (V) (nagyítás, x200) III. Táblázat Fej-nyaki planocellularis carcinomában szenvedő betegek klinikopatológiai adatai összefüggésben az ets-1 és E-cadherin expresszióval Ets-1 expresszió Klinikopatológiai faktorok
E-cadherin expresszió
Esetszám Negatív n (%)
Pozitív p n (%)
Esetszám Megtartott n (%)
Redukált n (%)
p
Nem
Férfi Nő
32 8
14 (70) 6 (30)
18(90) 2 (10)
ns
87 11
45 (93) 3 (7)
42 (84) 8 (16)
ns
Hisztológiai grade
G1 G2 G2
0 21 19
0 11 (55) 9 (45)
0 10(50) 10(50)
ns
6 60 32
5 (10) 31 (64) 12 (26)
1 (2) 29 (58) 20 (40)
ns
Tumor stádium
T1/T2 T3/T4
17 23
8 (40) 12 (60)
9 (45) 11(55)
ns
54 44
30 (62) 18 (38)
24 (48) 26 (52)
ns
Lokalizáció
Larynx Hypopharynx Mesopharynx
17 13 10
11 (55) 5 (25) 4 (20)
6 8 6
ns
60 15 23
33(70) 5(10) 10(20)
27 (54) 10 (20) 13 (26)
ns
Fisher’s exact teszt, ns- nem szignifikáns, *p<0,05
34
6.1.2. E-cadherin immunpozitivitás megjelenése fej nyaki daganatokban A fej-nyaki plamocellularis carcinomákon és az ép mucosan végzett E-cadherin immunhisztokémiai vizsgálat reprezentatív példáit mutatja a 4/A,B,C ábra. Az ép nyálkahártyán, a vártnak és az irodalmi adatoknak megfelelően, a szöveti felszín felé csökkenő
intenzítású,
a
sejtmembránt
kirajzoló,
mozaikszerű
festődés
volt
megfigyelhető. Hasonló mozaikszerű, citomembranózus festődés volt jellemző a pozitív reakciót adó tumorsejcsoportokra is
A
B
C
D
4. Ábra Reprezentatív E-cadherin és Ki-67 pozitív immunreakció a primer fej-nyaki planocellularis carcinomákban (A) Az ép nyálkahártyában tapasztalt E-cadherin immunreakció (x300.) (B) A tumorban észlelt pozitív E-cadherin reakció ≥ 50% (x300). (C) A tumorban észlelt pozitív E-cadherin immunreakció < 50% (x300). (D) A tumorban észlelt Ki-67 immunreakció (x300)
35
6.1.3. Az ets-1 és E-cadherin expresszió összevetve a klinikopatológiai adatokkal A III. táblázatban foglaltuk össze a tumorminták leginvazívabb területén észlelt ets-1 és E-cadherin expressziót, összevetve a betegek klinikopatológiai adataival. Az ets-1 transzkripciós faktor esetében a vizsgált 40 (32 férfi, 8 nő), különböző betegtől származó mintában, nem találtunk szignifikáns eltérést sem a kor, sem a szövettani grading, sem a lokalizáció, sem a TNM tekintetében. E-cadherin esetében a vizsgálatba 98 beteget anyagát vettünk be (87 férfi, 11 nő). Az életkor 37 és 79 (átlag±SD: 56,4±8) volt. A klinikopatológiai faktorok és az E-cadehrin expresszió megtartottsága között, hasonlóan, mint az ets-1 esetében, nem találtunk szignifikáns összefüggést (III. Táblázat) 6.1.4. Az ets-1 és E-cadherin expresszió összehasonlítása az N(0) és N(+) csoportban, valamint a primer tumorokban és a metasztázisokban. Az ets-1 transzkripciós faktor esetében az immunpozitivitásban az N(0) és N(+) csoport között nem mutatkozott szignifikáns eltérés. Hasonlóan nem találtunk statisztikailag értékelhető különbséget a primer tumorok és a metasztázisok közötti ets-1 expresszióban, bár a primer tumorok között tendenciájában több az ets-1 pozitív eset (5. ábra).
p=0,273
Ets-1 %
75
A
70%
65%
(n=7)
(n=13)
75
50
25
30%
p=0,333
100
Ets-1 %
100
(n=7)
N (0)
N (+)
63%
(n=20)
(n=19)
50
50% 25
35%
(n=3)
50%
(n=20)
37% (n=11)
0
B
0
Primer tumor
Metastasis
5. Ábra (A) az ets-1 negatív (üres oszlop) és ets-1 pozitív (fekete oszlop) százalékos megoszlása az összes N(0) és N(+) eset között. (B) Az ets-1 negatív (üres oszlop) és pozitív (fekete oszlop) megoszlása primer tumorokban és metasztázisokban. (Fisher’s exact teszt,*p<0,05)
Az N(0) csoportban 34%-ban (n=19), míg az N(+) csoportban 62%-ban (n=31) találtuk az E-cadherin expressziót redukáltnak. Az eltérés statisztikailag szignifikáns,
36
bár határértéken mozog. A két csoport közötti statisztikailag értékelhető eltérés mutatja a kapcsolatot a primer tumorban történő E-cadherin expresszió redukciója és a regionális metasztázis megléte között. Az E-cadherin expressziónak a tumoros progresszió
során
bekövetkező
változásának
megítélésére
összevetettük
az
immunhisztokémiai festődést a primer tumorok és a metasztázisok között. A két csoport E-cadherin expressziója között jelentős szignifikáns eltérést találtunk (6. ábra).
p=0,042
75
39%
62%
(n=19)
(n=31)
50
25
A
0
p=0,0003
100
E-cadherin %
E-cadherin %
100
61%
38%
(n=29)
(n=19)
N (0)
N (+)
75
51%
82%
(n=50)
(n=41)
50
49% 25
(n=48) 18% (n=9)
B
0
Primer tumor
Metastasis
6. Ábra (A) az E-cadherin megtartott (fekete oszlop) és E-cadherin csökkent (üres oszlop) százalékos megoszlása az összes N(0) és N(+) eset között. (B) Az E-cadherin megtartott (fekete oszlop) és csökkent (üres oszlop) megoszlása primer tumorokban és metasztázisokban. (Fisher’s exact teszt, *p < 0 05)
6.1.5. A Ki-67 index az N(0), N(+), ets-1 negatív és pozitív és az E-cadherin megtartott és csökkent csoportban. A összes vizsgált beteg anyagában a Ki-67 index 18% és 80% között változott. Az E-cadherin csökkent csoportban a Ki-67 index átlaga (48% ± 14%SD), ami szignifikánsan magasabb, mint az E-cadherin megtartott csoportban (38% ± 11.9% SD) (7/A ábra). Az ets-1 pozitív csoportban talált Ki-67 index átlaga (43% ± 17,6% SD), míg az ets-1 negatív csoportban (40% ± 15,8% SD), amely értékek között nincs statisztikailag értékelhető eltérés (7/B ábra). A Ki-67 index a nyaki nyirokcsomóval rendelkező betegek N(+) (47.9% ± 15.6% SD) és a nyaki nyirokcsomóval nem rendelkező betegek N(0) (38.4% ± 10.9% SD) között szignifikáns eltérést mutatott (*p<0.05, Mann-Whitney U teszt) (7/C ábra).
37
p=0,006
90
80
70
80
70
60
70
K i-6 7 in d e
K i-6 7 in d e
60 50 40 30 20
50 40 30
0
E-cadherin csökkent
E-cadherin megtartott
B
p <0,007
60 50 40 30
20
20
p= 0,794
10
10
A
Ki-67 inde
80
90
10 0
0
Ets-1 pozitív
C
Ets-1 negatív
N(+)
N(-)
7. Ábra A Ki-67 proliferációs index a (A) E-cadherin csökkent és megtartott, (B) Ets-1 pozitív és negatív, (C) N(+) és N(0) csoportban. Mann-Whitney U teszt p< 0,05.
6.1.6. Kaplan-Meier túlélési becslés A 8. ábra mutatja a 98 fej-nyaki planocellularis carcinomában szenvedő beteg túlélési adatait. A leghosszabb követési idő 90 hónap a legrövidebb 60 hónap volt. Az ets-1 pozitív és ets-1 negatív betegcsoport túlélésében nem mutatkozott szignifikáns eltérés, sőt az értékek közel azonosak voltak. Az előzőekkel ellentétben a túlélés az E-cadherin megtartott betegcsoportban szignifikánsan jobb, mint az Ecadherin csökkent csoportban.
1
0,8 0,7
Ets-1negatív(n=20)
0,6
0,52%
0,5
Ets-1pozitív(n=20)
0,4
0,49%
0,3 0,2 0,1 0
A
p<0,05
0,9
Kumulatív valószínűség
Kumulatív valószínűség
1
p>0,05
0,9
E-cadherinmegtartott
0,8
(n=48)
0,7
0,67%
0,6
E-cadherincsökkent0,53% (n=50)
0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
0
20
40
60
80
100
B
Aműtét ótaeltelt idő(hónap)
0
12
24
36
48
60
72
84
Aműtét ótaeltelt idő(hónap)
8. Ábra (A) Ets-1 pozitív és negatív beteg túlélési görbéje (B) Ecadherin megtartott és csökkent betegek túlélési görbéje. (Kaplan-Meier, szignifikancia vizsgálat a két görbe között logrank teszttel)
38
6.1.7. Szemikvantitatív RT-PCR Ets-1 MMP-3 A 9/A ábra mutatja az ets-1 mRNS RT-PCR vizsgálat eredményét normál garat nyálkahártyán (M), fej-nyaki daganat szövetben (T1, T2, T3) és a pozitív kontrollnak tekintett tonsilla (C) szövetben. Az egészséges mucosát kivéve minden tumorminta és a pozitív kontrollnak választott tonsilla szövet is expresszált ets-1 mRNS-t. A metasztázist adó 4 (M1-4) és a nem metasztatizáló 4 (N1-4) tumormintából végzett RT-PCR eredményét szemlélteti a 8/B ábra. A denzitometriával számszerűsített eredmények alapján nem volt kimutatható összefüggés az ets-1 mRNS szint és a metasztatizáló hajlam között. Az MMP-3 tekintetében azonban a metasztázist adó és nem metasztatizáló tumorok mRNS mennyiségében jól detektálható eltérés mutatkozott (9/B ábra).
39
A
B 1
1
2
2
3
3
4
4
1
Ets-1 RT-PCR termék 1
1
2
2
3
3
4
4
MMP-3 RT-PCR termék 1
1
2
2
3
3
4
4
9. Ábra (A) Az ets-1 expressio kimutatása RT-PCR-el normál pharyngealis mucosán, fej-nyaki planocell. carcinoma mintákon, és tonsilla szöveten, mint pozitív kontrollon. A normál mucosa nem mutat ets-1 mRNS expressiót, minden tumor szövetben kimutatható az ets-1 mRNS. (C tonsilla szövet, M normál mucosa, T1-3 tumor szövet). (B) Metastatizáló (M) és nem metazstatizáló (N) fej-nyaki tumorminták ets-1 és MMP-3 mRNS vizsgálata. A PCR termék számszerűsítése denzitometriás módszerrel, megjelenítése tetszőlegesen felvett skálán történt. (az alkalmazott sofrware: Scion Image, Scion Corporation, 82 Worman's Mill Court, Suite H, Frederick, Maryland 21701, USA)
40
6.2. Melanoma sejtvonalakon és fibroblast sejt tenyészeten végzett kísérletek 6.2.1. Melanoma sejt vonalakon végzett RT-PCR és flow-citomeria eredményei Vizsgáltuk az ets-1 gén expresszióját a négy melanoma sejtvonalon PCR-el (10/A ábra), valamint a hisztamin hatására bekövetkező ets-1 fehérje mennyiségi változását flow-citometriával (10/B ábra). Minden vizsgált melanoma sejtvonalban jelen volt az ets-1 mRNS, továbbá mind a négy sejtvonalban emelkedett az ets-1 expresszió mértéke az alkalmazott 1µM hisztamin hatására. Szignifikáns mértékű változást a WM35, HT-168 és HT-168/M1 sejtvonalakon detektáltunk. A legintenzívebb protein szint növekedést, a WM 35 sejtvonalon mértünk.
274 bp Ets-1 453 bp GAPDH
A mean Fluoreszcens fluorescence intensity intenzitás
1 600
2
3
4
**
500
** *
400
c o n tro l HA
300 200 100
B
0 W M 35
WM 9 8 3 /B
H T -1 6 8
H T1 6 8 /M 1
10. Ábra (A) Ets-1 mRNS expresszió analízise RT-PCR vizsgálattal a 4 humám melanoma sejtvonalon. 1: WM35, 2: WM983/B, 3: HT-186, 4: HT-186/M1. (B) Ets-1 flow citometriás analízise 1µM hisztamin, 24 órás inkubációját követően humán melanoma sejtvonalakon. Fekete oszlop− hisztamin kezelt, csíkos oszlop− kontroll sejtek. Az adatok a geometriai átlag ± s.e.m kezeletlen sejtek (100%) százalékában vannak felvéve. (**p<0.01, *p<0,05, Student's t test).
41
fluoreszcens intenzítás
600
** **
500 400
** *
*
*
300 200
C HA Dimaprit dBcAMP
100 0 WM35
WM983/B
11. Ábra Hisztamin (HA) 1µM, H2 receptor agonista dimaprit 1µM, dBcAMP 0,1µM, hatása az ets-1 expresszióra WM35 és WM983/B melanoma sejtekre. Az adatok a geometriai átlag ± s.e.m kezeletlen sejtek (100%) százalékában vannak felvéve. (∗p<0.05,**p<0,01, Student's t test). (C− kontroll, kezeletlen sejtek)
A H2 receptor triggereli a Gαs proteint, amely stimulálja az adenilát ciklázt és a cAMP szintézist. Amennyiben a megfigyelt hisztamin hatás a H2 receptoron keresztül érvényesül ez a hatás indukálható adenilát cikláz induktorral, mint a dB-cAMP. Dibutiryl-cAMP kezelést pozitív kontrollként használtuk a kísérleti elrendezésben, mely jelentősen növelte az ets-1 expressziót. Annak megítélésére, hogy a H2 receptor részt vesz-e az ets-1 modulációban, 100nM dBcAMP-t alkalmaztunk. A melanoma sejtek, amelyket 1 µM hisztaminnal, vagy 1 µM H2 agonisával (dimaprit) vagy 100 nM dBcAMP-vel kezeltünk jól megfigyelhető ets-1 expresszió szint növekedést mutattak, 24 óra után (11. ábra) 6.2.2. Immunnofluoreszcens festődés A primer fibroblast sejttenyészeten végzett immunfluorescens vizsgálat célja a hisztamin, általunk feltételezett, biológiai hatásának in situ vizualizálása volt. A kísérlet jól mutatja, hogy míg in vitro 1 µM hisztamin stimulálta mind az ets-1 mind az MMP-3 produkciót a tenyésztett fibroblastokon belül (12/B,D ábra), addig a kezeletlen kontroll sejtekben ez az indukció elmaradt (12/A, C ábra). A kezeletlen sejtekben nem volt detektálható sem ets-1 sem MMP-3 pozitív jel, vélhetően a fehérjék igen alacsony mennyisége miatt.
42
A
B
C
D
12. Ábra Ets-1 és MMP-3 protein immuncitokémiai festése fibroblast tenyészetben. (A) Kezeletlen (kontroll) sejtek ets-1 immuncitokémiai festése nem mutat pozitív reakciót. (B) 1µM hisztamin adása után 20 órával a fibroblastokban jól detektálható az ets-1 protein. (C) A kontroll sejtek nem mutatnak pozitív reakciót MMP-3-ra. (D) 1µM hisztamin 20 órás inkubációja után a fibroblastokban megjelenik a MMP-3 protein (x600).
6.2.3. Szemikvantitatív RT-PCR A 13. ábra mutatja a hisztamin és a bFGF hatását a fibroblast tenyészet ets-1 és MMP-3, semikvantitatív RT PCR-al detektált, mRNS expressziójára. A hisztamin és a bFGF szignifikánsan növelte mind az ets-1-t mind a MMP-3-t kódoló mRNS szintjét 6 órás hisztamin ill. bFGF inkubációt követően, összehasonlítva a kezeletlen kontroll sejtekkel. A vizsgálatot 4 alkalommal végeztük el, mind a 4 alkalommal új fibroblast tenyészettel és azonos eredménnyel.
43
B HA
bFGF
C
MMP-3 PCR termék
Ets-1 PCR termék
A
HA
bFGF
C
13. Ábra Ets-1 és MMP-3 mRNS detektálása fibroblast tenyészetben, RT-PCR vizsgálattal hisztamin (HA) és bFGF (bFGF) adását követően 6 órával. (A) hisztamin (1µM) és bFGF (10 ng/ml) adását követően detektált ets-1 mRNS változás fibroblastokban. (B) hisztamin (1µM) és bFGF (10 ng/ml) adását követően detektált MMP-3 mRNS változás fibroblastokban. A PCR termék mennyiségét denzitometrival számszerűsítettük, Scion Image software felhasználásával (Scion Corporation, 82 Worman's Mill Court, Suite H, Frederick, Maryland 21701,USA).
6.2.4. Flow-citometria Az ets-1 transzkripciós faktor és a MMP-3 expresszió, flow-citometriával detektált, növekedését mutatja a 14/A és B ábra. Összehasonlítva az ets-1 és MMP-3 fehérje mennyiségét a bFGF és hisztamin kezelt fibroblast tenyészetekben, 20 órás inkubációt követően, szignifikáns emelkedés volt megfigyelhető a kezeletlen sejtekkel szemben. Ez az eredmény megegyezik az RT PCR eredményével. Egyezően a RT PCR vizsgálattal, itt is 4 független kísérletet végeztünk, azonos eredménnyel. Némileg meglepő eredményt hozott a bFGF-al kezelt fibroblast tenyészet hisztamin szintet vizsgáló flow-citometriás vizsgálata (14/C ábra). Jelentősen emelkedett hisztamin mennyiség volt mérhető a bFGF kezelt fibroblastokban flowcitometriával, 20 órás bFGF (10 ng/ml) történő inkubációt követően.
44
( a k e z e le t le n s e jt e k % - b a n )
B
G e o m e tr ia i á t la g
( a k e z e le t le n s e jt e k % - b a n )
C
bFGF
C
bFGF
HA
HA
( a k e z e le t le n s e jt e k % - b a n )
C
G e o m e tr ia i á t la g
G e o m e tr ia i á t la g
A
C
bFGF
14. Ábra Fibroblast tenyészet ets-1, MMP-3 és hisztamin expressziójának reprezentatív flow citometriás vizsgálata. (A) Felső panel: fibroblast tenyészet est-1 expressziójának reprezentatív flow citometriás eredménye bFGF (10ng/ml) és hisztamin (HA) (1µM) adását követően 20 órával. Alsó panel: bFGF (szürke oszlop), hisztamin (fekete oszlop) és kezeletlen kontroll (fehér oszlop) relatív hatása az ets-1 protein expresszióra. (B) Felső panel: fibroblast tenyészet MMP-3 expressziójának reprezentatív flow citometriás eredménye bFGF (10ng/ml) és hisztamin (HA) (1µM) adását követően 20 órával. Alsó panel: bFGF (szürke oszlop), hisztamin (fekete oszlop) és kezeletlen kontroll (fehér oszlop) relatív hatása az MMP-3 protein expresszióra. (C) Felső panel: fibroblast tenyészet hisztamin expressziójának reprezentatív flow citometriás eredménye bFGF (10ng/ml) adását követően 20 órával. Alsó panel: bFGF (fekete oszlop), kontroll sejtek (fehér oszlop) relatív hatása a hisztamin expresszióra. Az adatok a geometriai átlag ± s.e.m kezeletlen sejtek (100%) százalékában vannak felvéve. (∗p<0.05, Student's t test). Az eredmények 4 független vizsgálat alapján készültek. ( második antitest, kontroll, bFGF kezelt, hisztamin kezelt (HA)).
45
7. MEGBESZÉLÉS 7.1. Fej-nyaki planocellularis carcinomákon végzett vizsgálatok A jelenleg használt szövettani vizsgálatok korlátai a tumor viselkedésének meghatározására ismertek. Különösen nincsenek eszközeink arra, hogy előrejelezzük, melyik kis primer fej-nyaki tumor fog nyaki metasztázist adni, az azzal együttjáró közel 50%-os 5 éves túlélési esély csökkenéssel. Figyelembe véve az onkológia egyik régi szabályát, miszerint a tumoron végzett első beavatkozás döntő a végeredmény tekintetében, a daganat metasztatizáló képességének előrejelzése rendkívüli fontosságú lenne a fej-nyak sebész számára olyan döntések meghozatalában például, hogy negatív nyaki status mellett végezzen-e elektív nyaki block dissectiót vagy sem. A malignus fenotípus legjellemzőbb tulajdonságai, mint a tumorsejt invázió és a metasztázis képzés, sok más molekuláris tényező mellett, az ECM bontására képes proteázok jelenlétét is szükségessé teszik (94). A mátrix metalloproteinázok
a
malignusan transzformált sejtekben fokozott expressziót mutatnak, úgyszintén a metasztatikus potenciállal rendelkező tumorokban (75). A MMP-1, MMP-3, MMP-9 és az uPA gének mindegyike tartalmaz egy ets kötő nukleotid szakaszt a cis reguláló egységen, amelyen keresztül az Ets transzkripciós családba tartózó transzkripciós faktorok képesek indukálni ezeknek a proteázoknak az expresszióját (48). Wasylyk és mtsai. igazolták, hogy az ets-1 molekula a szignál transzdukció olyan eleme, amely a nucleuson kívül is képes megkötni onkoproteineket, mint a Ha-Ras, az Scr vagy a Mos, és megindítani a fiziológiás és patofiziológiás folyamatokban szerepet játszó gének expresszióját (125). A fenti tények ismeretében az ets-1 transzkripciós faktor, az ECM bontásáért felelős proteázok működésének szabályozásán keresztül, feltételezhetően részt vesz a metasztázis képzésben is. A reguláció pontos mechanizmusa egészében még nem tisztázott, és különösen kevés adat áll rendelkezésre az ets-1-nek a fej-nyaki carcinomák metasztázis képződésében betöltött szerepéről. Az RT PCR vizsgálat, a sebészi kezelésben részesült betegekből vett tumormintákon meggyőzően igazolta az ets-1 mRNS jelenlétét, ugyanakkor az ép mucosa negativitása mutatta, hogy az ets-1 gén a normál epithelialis sejtekben nincs aktivált állapotban. A metasztázist adó 4 tumorból és a nem metasztatizáló, szintén 4 esetből származó minták reprezentatív RT-PCR vizsgálata viszont nem mutatott
46
összefüggést a metasztatizáló képesség és az ets-1 mRNS szint között. Az MMP-3 esetében minden tumor mintában kimutatható volt a MMP-3 mRNS, továbbá a metasztatizáló és nem metasztatizáló tumorminták között meggyőző eltérés mutatkozott a reprezentatív vizsgálat során. A vizsgálatot kis esetszámon végeztük és hangsúlyozottan reprezentatív szándékkal, annak megítélésére, hogy az általunk vizsgált molekulák valóban jelen vannak-e fej-nyaki planocellularis carcinomákban. Irodalmi adatok szerint, különböző tumorok immunhisztokémiai vizsgálattal 3583%-ban mutatnak ets-1 expressziót (91, 54). A mi anyagunkban a tumorok 50%-ában (n=20) találtunk specifikus immunfestődést ets-1 proteinre a tumorsejteken belül, míg a peritumorális régió fibroblastjai minden esetben pozitívak voltak. A pozitívan festődő epithelialis tumor sejtekben túlnyomórészt nuclearis festődés volt megfigyelhető, bár bizonyos esetekben a citoplasmában is észleltünk pozitív immunreakciót. Ez utóbbit, a transzkripciós faktor esetén ritkább festődési jelenséget más szerzők is leírták, és vélhetően kapcsolatban van a Wasylyk és mtsai. által észlelt nucleuson kívüli kötődési képességgel (125). Saeki és mtsai. oesophagus carcinomában (101), Pande és mtsai. szájüregi rákok esetében (91) szignifikáns összefüggést talált az ets-1 expresszió és az invazivitás között. A mi vizsgálatunkban, a tumor sejteken belül megfigyelt és számszerűsített immunreakció nem mutatott statisztikai összefüggést a klinikopatológiai adatokkal (III. Táblázat). Bár a minta kicsi, mégis ez az eredmény arra enged következtetni, hogy az ets-1 transzkripciós faktor fej-nyaki carcinomák tumor sejtjeiben kimutatható expressziója önmagában jelentőség nélküli, mint ahogyan ezt a reprezentatív céllal végzett RT PCR vizsgálat eredménye is megerősítette. Annak a megítélésére, hogy az ets-1 expresszió mértéke változik-e a metasztázis képződés folyamatában, immunohisztokémiai módszerrel összevetettük a primer tumor és a regionális nyirokcsomó metasztázisokban az ets-1 expresszióját. Az eredmények azt mutatták, hogy az ets-1 expresszió szintje alacsonyabb a metasztázisokban, mint a metasztázist adó primer tumorban, de az eltérés statisztikailag nem szignifikáns. Hasonlóan az előzőekkel nem találtunk értékelhető összefüggést a metasztatizáló N(+) és a nem metasztatizáló N(0) csoport, tumorsejteken belül detektált ets-1 expressziója között.
47
Az ets-1 expresszió negativitása − csökkent volta vagy hiánya − nem jelentett kimutathatóan több esélyt a túlélésre. A fentiekkel szemben lényeges eredménynek tűnik, hogy míg a pozitív mintákban is a tumor sejteknek csak bizonyos frakciói mutattak pozitív festődést, addig a vizsgált anyagok mindegyikében a tumor sejtekhez közeli fibroblastokban intenzív ets-1 immunreakció volt megfigyelhető. Ez a tény azt valószínűsíti, hogy az ets-1 elsősorban a peritumorális stroma mesenchymalis sejtjeiben van jelen és vesz részt a tumor és mikrokörnyezete interakciójában, szabályozva többek között a fibroblastok által termelt proteolitikus enzimek expresszióját. Gilles és mtsai. igazolták, hogy az epithelialis sejtekben mutatott ets-1 expresszió szorosan kapcsolódik, az un. epithelialis mesenchymalis átmenethez, és a tumoros progresszió folyamatában azok az epithelialis sejtek mutatnak ets-1 expressziót, amelyek némileg hasonlóan a kötőszöveti sejtekhez, képesek aktív mozgásra, migrációra és metasztatizálnak (48). Ez a jelenség talán magyarázza azt a tényt, hogy a primer tumor epithelialis tumorsejtjeinek csak bizonyos frakciója mutat specifikus festődést ets-1-re. Figyelembe véve Gilles és mtsai. in vitro vizsgálatának eredményét, teoretikusan az ets-1 transzkripciós faktor expressziója markere lehetne a planocellularis carcinomán belüli, és már metasztázis képzésre alkalmas szubklónnak, azonban ezt a feltételezett összefüggést nekünk nem sikerült közvetlen prognosztikai értékű eredményként értékelni beteganyagunkban. Összességében a vizsgálati sorozat eredményeiből levonható következtetés az, hogy a fej-nyaki planocellularis carcinomákban az ets-1 transzkripciós faktor jelenlétének nincs közvetlen, a túlélésben vagy a klinikopatológiai faktorokban kifejezhető statisztikai jelentősége, azonban az ets-1 gén expressziója bizonyos tumorsejt frakciókban, összefüggésben más tumor biológiai jelenségekkel, indikátora lehet a metasztatikus kaszkádban résztvevő tumorsejt klónnak. Konzekvens jelenléte a peritumorális fibroblastokban arra utal, hogy patofiziológiai jelentősége inkább a tumor és környezete kölcsönhatásában van. Számos carcinoma mutat csökkent intercellularis adhéziót és a differenciált epithelium karakterisztika elvesztését, ami arra utal, hogy a cadherineknek fontos szerepe van malignus progresszióban. Bizonyítékok vannak, hogy a cadherineknek szerepe van a daganatos invázió és metasztázis képződés gátlásában (10). A hám
48
eredetű tumorok jelentős részében az E-cadherin működésének károsodása összefüggést mutat az invazivitással (79). Az E-cadherin adhéziós molekula ismert fiziológiás szerepe és a tumorokban mutatott csökkent működése révén elméletileg alkalmas lehetne a primer tumor metasztatizáló hajlamának előrejelzésére, de eddig ezt igazán széles klinikai gyakorlatban nem igazolták. Vizsgálatunk alapvető kérdése az volt, hogy van e különbség az E-cadherin expresszióban a nyirokcsomó metasztázissal rendelkező és nem rendelkező primer daganatok között, valamint a metasztázis képződés során változik-e az E-cadherin expresszió mértéke. Eredményeink szerint az E-cadherin expresszió csökkenése korrelál a nyirokcsomó metasztázissal, és igazoltnak véljük, hogy az E-caedhrin expresszió változik a primer tumorban és a metasztázisban. Az eredményeink szignifikáns összefüggést mutatnak a csökkent E-cadherin expresszió és a regionális nyaki nyirokcsomó metasztázisok megjelenése között. Ugyanakkor az irodalom egyáltalán nem egységes ebben a kérdésben. Takes és mtsai. által, 121 fej-nyaki planocellularis carcinomában szenvedő betegben végzett vizsgálatban csak marginális korrelációt talált az E-cadherin expresszió csökkenése és a nyirokcsomó metasztázisok között (p= 0,06) (116). Japán kutatók 18 szájüregi planocellularis carcinomás beteg paraffinba ágyazott anyagát immunhisztokémiai módszerrel feldolgozva szignifikáns összefüggést találtak az E-cadherin funkció csökkenés valamint a szövettani grade, és TN stádiumok között (132). Hasonló eredményre jutottak Inada és mtsai. 40 nyelőcső planocellularis carcinomás betegen anyagát vizsgálva, ahol szignifikáns összefüggést találtak az 5 éves túlélés, az invázió mélysége, és a metasztázis valamint az E-cadherin funkció elvesztése között (58). Zheng és mtsai. az előzőeket megerősítve, 74 nasopharyngealis carcinomás beteg esetében találtak összefüggést az 5 éves túlélés, a nyirokcsomó metasztázis és az Ecadehrin expresszió mértéke között (135). Schipper és mtsai. ugyancsak statisztikai összefüggést találtak az E-cadherin expresszió és a metasztázisok között (106), azonban mások
vizsgálataiban
az
E-cadehrin
expresszió
elvesztése
nem
bizonyult
szignifikánsnak a nyaki nyirokcsomó metasztázisok kialakulását illetően (16, 77, 6). Az eredményekben mutatkozó eltérés megítélésünk szerint részben a pozitív és negatív eseteket elkülönítő „cutoff pointban”, és részben a különböző antitesteket alkalmazó technikák miatt lehetséges. Mattijssen és mtsai. 50 betegen végzett vizsgálatban és Andrews és mtsai. 36 betegen végzett vizsgálatban egy nagyon részletes
49
értékelési rendszert alkalmazott. A mi vizsgálatunkban az E-cadherin expresszáló tumorsejtek megítélése a Sato és mtsai. által javasolt skála szerint történt (104). Ezt az értékelési skálát alkalmasnak valamint idő és költségkímélőnek, mégis relevánsnak véljük az E-cadherin expresszió számszerűsítésére. Vizsgálatunkban az E-cadherin expresszió, a 0,05-os határértéket jóval meghaladó módon, szignifikánsan alacsonyabb volt a metasztázisokban mint a metasztázist adó primer tumorokban. Ez az eredmény igazolja a feltételezést, hogy az Ecadherin expresszió változik a tumor progresszió folyamán, és alátámasztja azt a hipotézist miszerint a metasztázis folyamatában a tumorsejt elveszt bizonyos epithelialis tulajdonságokat. Fej-nyaki daganatok esetében a tumor proliferációs kapacitását jelző Ki-67 markerre
vonatkozó
klinikai
vizsgálatok
eredményei
eléggé
ellentmondóak.
Lényegében hasonló beteganyagon Korupkat és mtsai. szignifikáns kapcsolatot találtak a Ki-67 expresszió és a nyirokcsomó metasztázis ill. a klinikai kimenetel között (67). Hasonlóan az előzőekhez gégerákos betegek anyagában Grzanka és mtsai. szignifikáns korrelációt mutattak ki a sejtproliferációs index és olyan klinikopatológiai faktorok között, mint a nyaki status, szövettani grade (52). Roland és mtsai. szintén fej-nyaki planocellularis carcinomákban az előzőeknek megfelelő összefüggést a Ki-67 expresszió és a nyaki metasztázis ill. a túlélés között nem tudtak igazolni (97). Mi a vizsgálatunkban a tumor sejt proliferációt az ets-1 negatív ill. pozitív, az E-cadherin megtartott ill. csökkent, valamint a metasztázist nem adó N(0) és metasztatizáló N(+) csoport között vizsgáltuk. Míg az ets-1 transzkripciós faktor expressziója nem mutatott összefüggést a proliferációs index-szel, addig mind az E-cadherin csökkent, mind az N(+) csoportban szignifikánsan magasabb proliferációs hányadot regisztráltunk, mint a megfelelő csoportokban. Az eredmény megerősíti a feltételezést, hogy a tumor proliferációs kapacitása összefügg a biológiai agresszivitással, a kedvezőtlen klinikai kimenetellel és a metasztázis kialakulásának magasabb valószínűségével. A mi vizsgálatunkban a Kaplan-Meier túlélési görbe szignifikáns összefüggést mutatott az E-cadherin expresszió és a túlélés között. Bosch és mtsai. nagy anyagon, 200 fej-nyaki laphámrákos beteg anyagát feldolgozva, a mi eredményeinknél szorosabb korrelációt talált a túlélés, a nyaki metasztázis között, sőt megállapították, hogy az Ecadherin expresszió csökkenése erősebb független prognosztikai faktor, mint a TNM, a
50
hisztológiai grading, vagy a tumor lokalizációja (15). Ugyanakkor korábbi irodalmi adatok nem támasztják alá, hogy az E-cadherin expresszió csökkenése szignifikánsan befolyásolná a betegek túlélési esélyét (106, 16, 77). A túlélési vizsgálat bizonytalansága részben adódhat abból, hogy nem különböztettük meg a 3 anatómiai fej-nyaki régiót ill. a betegek relatív alacsony számából és az alkalmazott értékelési scorból. Bár Rodrigo és mtsai. arról számoltak be egy 72 beteget magában foglaló anyagon, hogy a pharyngealis, laryngealis régió E-cadherin expressziója között nem volt szignifikáns eltérés, de a mi megítélésünk szerint az anatómiai szubrégiók eltérő biológiai tulajdonságai befolyásolhatják az eredményeket (96). Ez utóbbit támasztja alá 96 metasztázis asszociált gén expressziójának összehasonlító vizsgálata gége és hypopharynx tumoros betegek esetében (120). Így nagyon körültekintőnek kell lennünk az eredményekből levont következtetéssel. A vizsgálatok azt igazolják, hogy a Ki-67 proliferációs index és az E-cadherin expresszió
mérése
hasznos
technika
lehet
a
magas
rizikójú
betegcsoport
kiválasztásában, akiknél agresszívabb onkológiai kezelés szükséges. Mindezekből arra következtettünk, hogy az E-cadherin és a Ki-67 értékes résztvevője lehet, egy a fejnyaki daganatok prognózisát vizsgáló panelnek. Bár ahhoz, hogy a két molekula, mint a fej-nyaki planocellularis carcinomák metasztázis képzésének markere lehessen, és a Tumor Marker Utility Grading System által klinikai alkalmazásra alkalmassá váljon, további vizsgálatok és a metodikák standardizálása feltétlenül szükséges.
51
7.2. Humán melanoma sejtvonalakon és fibroblast tenyészeten végzett vizsgálatok A melanoma invazív potenciálja és az ets-1 kapcsolata már ismert az irodalomban. A melanoma sejtek migrációs képessége 60%-al csökkenthető az ets-1 gátlásával (98). A metasztatikus melanoma sejtvonalakon végzett saját vizsgálataink egyértelmű összefüggést mutattak a hisztamin kezelés és az ets-1 expresszió növekedése között, valamint igazolták, hogy ezt a hatást a hisztamin a H2 receptoron keresztül fejti ki. Ismerve az ets-1 malignus sejtekben igazolt szerepét, eredményeink felvetik azt az érdekes lehetőségét, miszerint a hisztamin ismert sejt proliferációt növelő és migrációt fokozó hatását ets-1 mediált úton fejtené ki. A 7 transzmembrán doménnel rendelkező H2 receptor szignált heterotrimer GTP-kötő fehérjék továbbítják a sejt számára, az adenil-cikláz, cAMP, protein-kináz A rendszeren keresztül. A protein-kináz A a c-jun és c-fos-on keresztül aktiválja az AP-1 transzkripciós faktort, amelyről tudjuk, hogy az ets1 indukciójában szerepet játszik (30). Feltételezésünk szerint a hisztamin ezen a szignál transzdukciós úton keresztül fokozza az ets-1 expresszióját (15. ábra). H2 receptor plazmamembrán
G
AC cAMP PKA sejtmag c-fos c-jun
AP-1 Ets-1
15. Ábra
Az hisztamin hatása az ets-1 indukcióra a H2 receptoron keresztül
. A műtéti anyagunkon végzett ets-1 immunhisztokémia eredménye összhangban az
irodalmi
adatokkal,
miszerint
az
52
ets-1
a
peritumoralis
fibroblastokban
expresszálódik, figyelmünket a daganat és környezete kölcsönhatására irányította. Szintén irodalmi adatok igazolják, hogy az ets-1 transzkripciós faktor a tumort környező stromában fokozott festődést mutat immunhisztokémiai módszerrel. In vitro vizsgálatokban kimutatták, hogy az ets-1 expresszió fokozódik malignus keratinocyták és fibroblastok co-culturájában (13), valamint fibroblastokban, amelyeket tumorsejtek kondicionált mediumával kezeltek (47), ill. fibroblastokban amelyeket különböző citokinekkel vagy növekedési faktorokkal indukáltak (23). Hasonló eredményeket hoztak endothel sejttenyészetben végzett kísérletek, ahol savas fibroblast growth factor (aFGF), valamint bFGF és vascular endothelial growth factor (VEGF), ets-1 indukciójára való hatását vizsgálták (61). A tumor és környezete hisztamin mediált kölcsönhatását sok megközelítésből vizsgálták, de a hisztamin és a metasztázist elősegítő közvetlen tényezők, mint az ECM bontásában kulcsszerepet játszó MMP-ok kapcsolatáról szegényesek az információk. Korábbi vizsgálatunkban igazoltuk, hogy a hisztamin képes indukálni az ets-1 protooncogent a H2 receptoron keresztül melanoma sejtvonalon (57). Elfogadva az irodalmi adatokat, miszerint az ets-1 transzkripciós faktornak központi szerepe van az ECM bontásában részvevő proteolitikus enzimek expressziójában a peritumoralis fibroblastokban,
valamint
felhasználva
saját
a
melanoma
sejtvonalon
ets-1
indukálhatóságával nyert eredményeinket, adódik a feltételezés, hogy a hisztamin a peritumoralis fibroblastokban is képes indukálni az ets-1-et és következményesen a MMP-3-t, ezzel potenciálisan fokozni a tumor agresszivitását. Annak megítélésére, hogy a tumorsejtek által termelt növekedési faktor és feltételezésünk szerint a hisztamin valóban fokozza-e az ets-1 transzkripciós faktor expresszióját a peritumorális fibroblastokban és ezzel párhuzamosan emelkedik-e az ets-1 által regulált MMP-3 expresszió mértéke is, in vitro kísérletet végeztünk. Monoclonalis bFGF és hisztamin jelenlétében ill. ezek hiányában vizsgáltuk primer fibroblast tenyészetben az ets-1 és MMP-3 mRNS szintjét RT PCR-al valamint az ets-1 és MMP-3 protein mennyiségét flow-cytometriával. Azt tapasztaltuk, hogy mind az ets1 mind az MMP-3 mRNS szint jelentősen növekedett, mind az bFGF mind a hisztamin kezelt mintákban. Ugyanezt az eredményt hozta a két molekula fehérje szintű vizsgálata flow-citometriával. A protein szintű vizsgálatot megerősíti az immunfluorescens festés eredménye, amely in situ a vizsgált sejtekben jól vizualizálhatóan igazolta a fehérje
53
szintek növekedését. Wernert és mtsai. vizsgálataiból ismert, hogy a bFGF fokozza az ets-1 expressziót peritumorális fibroblastokban (126), ezért választottuk a bFGF-t „kontrollként” a kísérletbe. Az 16. ábrában megpróbáltuk összefoglalni, saját eredményeink ill. a rendelkezésünkre álló irodalmi adatok alapján, a tumor és közvetlen környezete hisztamin mediált kölcsönhatását, összefüggésben a peritumoralis fibroblastok MMP termelésével. Bár ilyen jellegű vizsgálat fej-nyaki rákok esetén nem történt, de ismert, hogy a hisztamin egyik fő forrásának képező hízósejtek számos solid tumor környezetében felszaporodnak, sőt colorectalis daganatok esetében prognosztikai jelentőséggel is bírnak (37, 62). Az invázióban és angiogenezisban kulcsszerepet játszó bFGF az erek bazális membránjában és az ECM-ban raktározódik, és a területen lévő hízósejtek is szintetizálják. Vizsgálatok igazolják az emelkedett hisztamin szintet és termelést különböző humán tumorokban és kísérletesen indukált neoplasiákban (53, 5, 41, 43). Az in vitro végzett kísérletünk eredménye alátámasztja a feltételezést, miszerint a peritumorális fibroblastokban megjelenő ets-1 expresszió a tumor által termelt növekedési faktorok eredménye. Megítélésünk szerint a hisztamin lehet az egyik, ets-1 indukciót kiváltó faktor, amely származhat a magukból a tumorsejtből (41, 32) vagy a daganatot infiltráló hízósejtekből (29) ill. a tumort körülvevő stroma peritumorális fibroblastjaiból. Ez utóbbit igazolja vizsgáltunk azon eredménye, miszerint a daganatsejt által termelt bFGF a peritumoralis fibroblastokban a hisztamin termelést növeli és ez autocrin módon tovább erősítheti a hisztamin fibroblastokra gyakorolt hatását. Burtin és mtsai. azt találták, hogy a hisztamin koncentráció a növekedő solid tumorok perifériás területein magasabb, mint a centrális régióban (21). Ez a korábban nehezen magyarázható megfigyelés jól harmonizál azzal a feltételezésünkkel, miszerint a tumorhoz kapcsolt hisztamin mediált történések alapvetően a tumor és környezete kölcsönhatásában értelmezhetők, és helyileg is a tumor-környezete régióban zajlanak.
54
HíZÓSEJT
HA bFGF
FIBROBLAST
HA
Ets-1
TUMOR
HA
bFGF MMP-3
Invázió metastasis
E-cadherin
MMP-3 hasítja az E-cadherin extracellularis doménjét,
ECM alkotórászek proteolízise
Agresszívabb fenotipus
16. Ábra
A tumor és környezetének hisztaminnal összefüggő kapcsolata (HA− hisztamin)
A peritumoralis fibroblastok által termelt, többek között hisztamin indukált és ets-1 transzkripciós faktor által regulált MMP-3, részt vesz az ECM alkotóelemeinek proteolízisében, valamint az epithelialis tumorsejtek felszínén az E-cadherin adhéziós molekula extracellularis doménjének hasításával, a molekulát inaktiválja és elősegíti a tumor
egy
malignusabb
fenotípus
irányában
történő
átalakulását.
Mindezen
folyamatokra a hisztaminnak akceleráló hatása van. Az irodalomból ismert tény, hogy az ets-1 részt vesz az endothel sejtek proliferációjában, az azokat egy angiogen fenotípus irányába változtatja. Eddig a hisztamin régóta ismert angiogen hatását pusztán a nitrogén oxid generálásával hozták összefüggésbe. Az általunk kísérletesen igazolt hisztamin-ets-1 kapcsolat, további magyarázatot adhat a hisztamin érképzésben betöltött szerepére. A számos kísérleti eredmény ellenére a hisztamin pontos szerepe a tumorgenezisben egészében még nem tisztázott. Különösen kevés adat áll rendelkezésünkre azonban a hisztaminnak a daganatok metasztázis képződésében betöltött szerepével kapcsolatban.
55
Az általunk végzett in vitro vizsgálatok egyértelmű összefüggést bizonyítottak a hisztamin valamint az ets-1 és MMP-3 expresszió indukciója között, mind mRNS mind protein szinten, valamint igazolták, hogy a bFGF, egyéb ismert hatásai mellett, képes a peritumoralis fibroblastokban hisztamin képződést előidézni. Bár az in vitro kísérletek klinikai értékelése nagy körültekintést igényel, az eredmények azt látszanak igazolni, hogy a különböző forrásokból származó hisztamin szintje a tumoron belül, elősegítheti az ets-1 és következményesen az MMP-3 termelődését a peritumorális fibroblastokban, ill. növelheti a daganat invazívitását.
56
8. KÖVETKEZTETÉSEK, LEGFONTOSABB ÚJ EREDMÉNYEK A fej-nyaki planocellularis carcinomában szenvedő betegek műtéti anyagának ets-1,
E-cadherin,
és
Ki-67,
RT-PCR
és
immunhisztokémiai
vizsgálatának
végeredménye alapján a következő következtetéseket vontuk le. 1. Az ets-1 transzkripciós faktor bár jelen van a tumorok bizonyos hányadában, de elsősorban a peritumoralis stroma sejtjeinek fontos molekulája. Direkt prognosztikai értéke fej-nyaki planocellularis carcinomában nincs. 2. Az E-cadherin adheziós molekula és a Ki-67 proliferációs marker alkalmas molekula a fej-nyaki rákok metastatizáló potenciáljának előrejelzésére. Az in vitro, melanoma sejtvonalon és peritumoralis fibroblast tenyészetben végzett vizsgálatok eredménye alapján megállapítható, hogy: 1. A hisztamin fokozza az ets-1 transzkripciós faktor expresszióját a humán melanoma sejtvonalakban. 2. A hisztamin az ets-1-re gyakorolt indukciós hatását a melanomákban H2 receptoron keresztül fejti ki. Ezen utóbbi megállapításaink, felvetik a lehetőségét, hogy a hisztamin melanoma proliferációt fokozó hatását, ets-1 mediálta úton is kifejti. 3. A hisztamin, indukálva az ets-1 transzkripciós faktor és következményesen a MMP-3 expresszióját a preritumoralis fibroblastokban, növeli az ECM degradatioban résztvevő proteolitikus enzim jelenlétet ezzel fokozva a tumor invazivitását. 4. A tumorban jelenlévő bFGF a peritumoralis fibroblastokban növeli a hisztamin termelést, ezzel elvileg önmagában megteremtve a lehetőségét a hisztamin mediált tumor-környezet kölcsönhatásoknak.
57
9. KÖSZÖNETNYILVÁNíTÁS
Értekezésem végén szeretném kifejezni köszönetemet és hálámat mindazoknak, akik az eddig elvezető többéves munkában önzetlen és pótolhatatlan segítséget nyújtottak: -témavezetőmnek, Dr. Ésik Olgának; -Dr. Schaff Zsuzsa Profeszor Asszonynak, akiknek a segítsége, útmutatásai nélkül nem készülhetett volna el ez az értekezés; -volt és jelenlegi főnökeimnek, Z. Szabó László Professzor Úrnak és Csokonai Vitéz Lajos Tanár Úrnak, akik kutatási tevékenységemet támogatták; -Dr. Falus András Professzor Úrnak, aki munkámat lehetővé tette laboratóriumában; -Dr. Hegyesi Hargitának, aki a laboratóriumi munkába bevezetett, és mindvégig aktív együttműködésével segített, valamint az értekezés elkészítésénél időt nem kímélve segítségemre volt; -minden kollégámnak, akik az Országos Gyógyintézeti Központ Fül-orr-gégészeti Osztályán Ph.D. napomon helyettem is dolgoztak a betegellátásban; - Dr. Nagy Pálnak a szövettani metszetek kiértékelésénél nyújtott segítségért; - Truszka Ferencnének, aki a szövettani vizsgálatok elvégzésében rendkívüli segítséget nyújtott; - a Schering-Plough Central East AG cégnek, amely a Ph.D. tandíjamat vállalta a képzés teljes ideje alatt, és személy szerint Dr. Lipcsei Andrásnak; - betegeimnek, akiknek a hozzájárulása a kutatáshoz szavakkal nem kifejezhető. Végül, de nem utolsó sorban köszönettel tartozom családomnak kutatómunkám és az értekezés megírása alatti támogatásukért, és különösen feleségemnek és kisfiamnak a megszámlálhatatlan tőlük távol töltött óra miatti megértésükért.
58
10. RÖVIDíTÉSEK JEGYZÉKE ECM
extracellularis mátrix
MMP-3
mátrix metalloproteináz 3
bFGF
bázikus fibroblast növekedési faktor
VEGF
vascularis endothel növekedési faktor
TGFα
transforming growth factor α
EGFR
epidermalis növekedési faktor receptor
HIF
hipoxia indukálta transzkripciós faktor
NOS
nitrogén oxid szintetáz
uPA
urikinase type plasminogen activator
HDC
hisztidin dekarboxiláz
RLNM
regionális nyaki nyirokcsomó metasztázis
PKA
protein-kináz A
HA
hisztamin
MVD
microvessel density
FACS
fluorescent activated cell sorter
RT-PCR
transcription polymerase chain reaction
59
11. IRODALOMJEGYZÉK 1. Adams WJ, Morris DL. Short-course cimetidine and survival with colorectal cancer. Lancet 1994;344:1768−1769. 2. Akervall JA, Michalides RJ, Mineta H. Amplification of cyclin D1 in squamous cell carcinoma of the head and neck and the prognostic value of chromosomal adnormalities and cyclin D1 overexpression. Cancer 1997;79:380−389. 3. Alcalde RE, Terakado N, Otsuki K. Angiogenesis and expression of plateletderived endothelial cell growth factor in oral squamous cell carcinoma. Oncology 1997;54:324−328. 4. Almadori G, Cadoni G, Galli J. Epidermal growth factor receptor expression in primary laryngeal cancer: an independent prognostic factor of neck nodes relaps. Int J Cancer 1999;84:188−191. 5. Anderson A, Henningson S, Lundell L, Rosengren E. Diamines and polyamines in DMBA induced breast carcinoma containing mast cells resistant to compound 48/80. Agents Action 1976;6/5:577−583. 6. Andrews NA, Jones AS, Helliwell TR, Kinsella AR. Expression of the Ecadherin-catenin cell adhesion complex in primary sqamous cell carcinoma of the head and neck and their nodal metastases. Br J Cancer 1997;75:1474−1480. 7. Ballenger JJ. Diseases of the nose, throat, ear, head, and neck. 14th ed. Lea and Febiger, Philadelphia, London, p 753. 1991. 8. Bergers G, Coussens LM. Extrinsic regulators of epithelial tumor progression: metalloproteinases.
Curr
Opnion
in
Genetics
and
Development
2000;10:120−127. 9. Bejarano PA, Noelken ME, Suzuki K, Hudson BG, Nagase H. Degradation of basement membranes by human matrix metalloproteinase 3 (stromelysin). Biochem J 1988;256:413−419. 10. Birchmeier W, Behrens J. Cadherins expression in carcinomas: Role in the formation of cell junctions and the prevention of invasiveness. Biochem Biophys Acta 1994;1198:11−26. 11. Bocca E, Pignatarao O, Oldini C. Functional neck dissection: an evaluation of 853 cases. Laryngoscope 1984;94:942−945.
60
12. Bolon I, Gouyer V, Devouassoux M, Vanderbunder B, Wernert N, Moro D, Brambilla C, Brambilla E. Expression of c-ets-1, collagenase 1, and urokinasetype plasminogen activator genes in lung carcinomas. Am J Pathol 1995;147:1298−1310. 13. Borchers AH, Powell MB, Fusenig NE, Bowden T. Paracrine factor and cell-cell contact-mediated induction of proteinase and c-ets gene expression in malignant keratinocyte/dermal fibroblast cocultures. Exp Cell Res 1994;213:143−147. 14. Boring CC, Squires TS, Tong T. Cancer statistics. CA Cancer J Clinic 1992;2: 19−18. 15. Bosch FX, Andl C, Abel U, Kartenbeck J. E-cadherin is a selective and strongly dominant prognostic factor in squamous cell carcinoma: A comparison of Ecadherin with desmosomal components. Int J Cancer 2005;114:779−790. 16. Bowie JH, Caslin AW, Roland NJ, Field JK, Jones AS, Kinsella AR. Expression of the cell-cell adhesion cadherin in sqamous cell carcinoma of the head and neck. Clin Otolaryngol 1993;18:196−201. 17. Brandes LJ, Warrington RC, Arron RJ, Bogdanivic RP, Fang W, Queen GM, Stein DA, Tong J, Zaborniak CLF, LaBella FS. Enhanced cancer growth in mice administered daily human-equivalent doses of some H1-antihistamines: Predictive in vitro correlates. J Natl Cancer Inst 1994;86:770−775. 18. Bremnes RM, Veve R, Hirsch FR, Franklin WA. The E-cadherin cell-cell adhesion complex and lung cancer invasion, metastasis, and progmosis. Lung Cancer 2002;36:115−124. 19. Bronchud MH, Foote M, Peters WP, Robinson MO. Principles of Molecular Oncology. New Jersey: Humana Press; 2000. 309 p. 20. Browman GP, Hodson DI, Mackenzie RJ, Bestic N, Zuraw L, Cancer Care Ontario Practice Guideline Initiative Head and Neck Cancer Disease Site Group. Choosing a concomitant chemotherapy and radiotherapy regimen for squamous cell head and neck cancer: a systematic review of the published literature with subgroup analysis. Head and Neck 2001;23:579−589. 21. Burtin C, Scheinmann P, Salomon JC, Lespinats G, Frayssinet C, Lebel B. Increased tissue histamine in tumour-bearing mice and rats. Br J Cancer 1981;43:684−688.
61
22. Byers RM. Modified neck dissection: a study of 967 cases from 1970 to 1980. Am J Surg 1985;150:414−421. 23. Calmels TPG, Matot V, Wernert N, Vandenbunder B, Stehelin D. Invasive tumors induce c-ets-1 transcription factor expression in adjacent stroma. Biol Cell 1995;84:53−61. 24. Carmeliet P, Jain R. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature 2000;407:249−257. 25. Chanda R, Ganguly AK. Diamineoxidase activity and tissue histamine content of human skin, breast and rectal carcinoma. Cancer Lett 1987;34:207−212. 26. Chen Z, Fisher RJ, Li B, Tanaka T, Kung H, Lautenberger JA, Rhim JS. Elevated expression of ETS-1 gene in a metastatic, tumorigenic human prostate epithelial cell line transformed by the v-Ki-ras oncogene. Int J Oncol 1997;11: 1179−1184. 27. Crile GW, Excision of cancer of the head and neck. JAMA 196;47:1780−1786. 28. Crissman JD, Liu WY, Gluckman JL. Cummings G. Prognostic value of histopathological parameters is squamous cell carcinoma of the oropharynx. Cancer 1984;54:2995−3001. 29. Dimitriadou V, Koutsilieris M. Mast cell-tumor cell interaction. Anticancer Research 1997;17,1541−1550. 30. Dittmer J. The biology of the ets 1 proto-oncogene Molecular Cancer 2003;2:29−50. 31. Falus A, Grosman N, Darvas Zs. Histamine: Biology and Medical Aspects, SpringMed Publishing Ltd.,S Karger AG, Budapest, Basel, p 206, 2004. 32. Falus A, Hegyesi H, Lázár-Molnár E, Pós Z, László V, Darvas Zs. Paracrine and autocrine interaction in melanoma: histamine is a relevant player in local regulation. Trends in Immunology 2001;22, 648−652. 33. Frank JL, Bur ME, Grab JL, Kay S, Ware JL, Sismanis A, Neifeld JP. P53 tumor suppressor oncogene expression in squamous cell carcinoma of the hypopharynx. Cancer 1994;73:181−186. 34. Ferlito A. Histologic classification of larynx and hypopharynx cancers and their implication. Acta Otolaryngol. 1976;Suppl.343:1−21.
62
35. Fidler IJ, Critical factor in the biology of human cancer metastasis: twentyeighth
G.H.A.
Clowes
Memorial
Award
Lecture.
Cancer
Research
1990;50;6130−6138. 36. Fisher B, Redmond C, Fisher E. The contribution of recent NSABP clinical trials of primary breast cancer therapy to an understanding of tumor biology−an overview of findings. Cancer 1980;46:1009−1025. 37. Fisher ER, Paik SM, Rockette H, Jones J, caplan R, Fisher B. Prognostic significance of eosinophils and mast cells is rectal cancer. Hum Pathol 1989;20:159−163. 38. Fraser RA, Simpson JG. Role of mast cells in experimental tumour angiogenesis. In: Development of the vascular system (Ciba Fuondation Symposium 100), London: Pitman; 1983. p 120-131 39. Frierson HF, Cooper HP. Prognostic factors in squamous cell carcinoma of the lower lip. Hum Pathol 1986;17:346−354. 40. Frixen UH, Behrens J, Sachs M, et al. E-cadherin-mediated cell-cell adhesion prevents invasiveness of human carcinoma cells. J Cell Biol 1991;113:173−185. 41. Garcia-Caballero M, Neugebauer E, Rodriguez F, Nunez de Castro I, Heredia A, Oosting E, Vera-Thorbeck C. Changes is histamine synthesis, tissue content and catabolism in human breast cancer. Agents Action 1989;27:227−231. 42. Garcia-Caballero M, Brandes LJ, Hosoda S. Histamine in normal and cancer cell proliferation. Oxfor: Pegamon Press;1993. 43. Garcia-Caballero M, Neugebauer E, Rodroguez F, Nunez De Castro I, VaraThorbeck C. Histamine synthesis and content in benigne and malignant tumours. Its effect on other host tissue. Surg Oncology 1994;3:167−173. 44. Gasparini G, Weidner W, Maluta S. Intra-tumoral microvessel density and p53 protein: correlation with metastases in head end neck squamous cell carcinoma. Int J Cancer 1993;55:739−744. 45. Gerdes J, Schwab U, Lemke H, Stein H. Production of a mouse monoclonal antibody reactive a human nuclear antigen associated with cell proliferation. Int J Cancer 1983;31:13−20.
63
46. Gerdes J, Lemke H, Baisch H, Wacker HH, Stein H. Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67. J Immunol 1984;133:1710−1715. 47. Gilles F, Raes MB, Stehelin D, Vandenbunder B, Fafeur V. The c-ets-1 protooncogene is a new early-response gene differentially regulated by cytokines and growth factors in human fibroblasts. Exp Cell Res 1996;222:370−378. 48. Gilles Ch, Polette M, Birembaut Ph, Brünner N, Thompson EW. Expression of c-ets-1 mRNA is associated with an invasive, EMT-derived phenotype in breast carcinoma cell lines. Clin Exp Metastasis 1997;15:519−526. 49. Gluckman JL, Pavelic ZP, Welkoborsky HJ, Mann W, Stambrook P, Gleich L, Wilson K, Righi P, Portugal LG, McDonald J, Biddinger P, Steward D, Gartside P. Prognostic indicators for squamous cell carcinoma of the oral cavity: A clinicopathologic correlation. Laryngoscope 1997;107:1239−1244. 50. Gogly B, Hornebeck W, Groult N, Godeau G, Pellat B. Influence of heparin(s) on the interleukin-1-β-induced expression of collagenase, stromelysin-1, and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in human gingival fibroblasts. Biochemical Pharmacology 1998;56:1447−1454. 51. Grandis JR, Tweardy DJ. Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Res 1993;53:3579−3584. 52. Grzanka A, Sujkowska R, Janiak A, Adamska M. Immonogold labeling of PCNA and Ki-67 antigen at the ultrastructural level in laryngeal squamous cell carcinoma and its correlation with lymph node metastasis and histological grade. Acta Histochem 2000;102:139−149. 53. Gricco GP, Davio CA, Martin G, Engel N, Fiksimons CP, Brgoc RM, Rivera ES. Histamine as an autocrine growth factor in experimental mammary carcinomas. Agents Actions 1991;43:17−20. 54. Gutman A, Wasylyk B. The collagenase gene promoter contains a TPA and oncogene-responsive unit encompassing the PEA3 and AP-1 binding sites. EMBO J 1990;9:2241−2246.
64
55. Hallissey MT, Dunn JA, Baker PG, Billingham LJ. A prospective rendomised trial of cimetidine therapy in gastric cancer: An interim report (abstract). Gut 1996;39:(Suppl 1) W47 56. Harrison LB, Session RB, Hong WK. Head and neck cancer: multidisciplinary approach. Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia, 24. p.555. USA, 1998. 57. Hegyesi H, Horváth B, Pállinger É, Pós Z, Molnár V, Falus A. Histamine elevates the expression of Ets-1, a protooncogen in human melanoma cell lines through H2 receptor. FEBS letters 2005;579:2475−2479. 58. Inada S, Koto T, Futami K, Arima S, Iwashite A. Evaluation of malignancy and the prognosis of esophageal cancer based on an immunohistochemical study (p53,
E-cadherin,
epidermal
growth
factor
receptor)
Surg
Today
1999;29:493−503. 59. Ito T, Nakayama T, Ito M, Naito S, Kanematsu T, Sekine I. Expression of the ets-1 proto-oncogene in human pancreatic carcinoma. Mod Pathol 1998;11: 219−215. 60. Ito Y, Miyoshi E, Takeda T, Sakon M, Tsujimoto M, Yokosaki Y, Monden M. Ets-1 expression in extrahepatic bile duct carcinoma and cholangiocellular carcinoma. Oncology 2000;58:248−252. 61. Iwasaka C, Tanaka K, Abe M, Sato Y. Ets-1 regulates angiogenesis by inducing the
expression
of
urokinase-type
plasminogen
activator
and
matrix
metalloproteinases and migration of vascular endothelisl cells. J Cell Physiol 1996;169:522−531. 62. Jeziorska M, Haboubi NY, Schofield PF, Woolley DE. mast cell distribution and tumor cell rpoliferation in colonic carcinoma. Gut 1999;34 (Suppl):S5(Abstract) 63. Johnson JT, Wagner RL, Myers EN. A long-term assassment of adjuvant chemotherapy on outcome of patients with extracapsular spread of cervical metastasis from squamous carcinoma of the head and neck. Cancer 1996;77: 181−185. 64. Kahlson G, Rosengren E. New approaches to the physiology of histamine. Annu Rev Physiol 1965;48:155−196.
65
65. Kawano T, Nakamura Y, Yanoma S, Kubota A, Furukawa M, Miyagi Y, Tsukuda M. Expression of E-cadehrin, and CD44s and CD44v6 its association with progmosis in head and neck cancer. Auris Nasus Larynx 2004;31:35−41. 66. Kitange G, Tsonuda K, Anda T, et al. Immunohistochemical expression of ets-1 transcription factor and urokinase-type plasminigen activator is correlated with the malignant and invasive potential in meningiomas. Cancer 2000;89: 2292−2300. 67. Korupkat Ch, Rudolph P, Frahm S, Parwaresch R, Werner JA. Proliferation marker Ki-S11 prognostic indicator for squamous cell carcinoma of the hypopharynx. Virchows Arch 1999;435:590−595. 68. Lampe HB, Flint A, Wolf GT, McClatchey KD. Flow cytometry: DNA analysis of squamous cell carcinoma of the upper aerodigestive tract. J Otolaryngol 1987;16:371−375. 69. Leprince D, Gegonne A, Coll J, de Taisne C, Sahnneberger A, Lagron C. A putativa second cell derived oncogene of avian leukemia retrovirus E26. Nature 1983;306:395−397. 70. Liotta LA, Steeg PS, Stetler-Stevenson WG, Cancer metastasis and angiogenesis: an imbalance of positive and negative regulation Cell 1991;64: 327−336. 71. Lochter A, Srebrow A, Sympson CJ, Terracio N, Werb Z, Bissel MJ. Misregularion of stromelysin-1 expression in mous mammary tumor cells accopanies acquisition of stromelisyn-1 dependent invasive properties. J Biol Chem 1997;272:5007−5015. 72. Lochter A, Galosy S, Muschler J, Freedmen N, Werb Z, Bissell MJ. Matrix metalloproteinase stromelysin-1 triggers a cascade of molecular alterations that leads to stable epithelial-to-mesenchymal conversion and a premalignant phenotype in mammary epithelial cells. J Cell Biol 1997;139:1861−1872. 73. Martin H, DelValle B, Ehrlich H, Cahan WG. Neck dissection. Cancer 1951;4: 441−499. 74. Martinez-Gimeno C, Rodriguez RM, Navarro C, Varela CL. Squamous cell carcinoma of the oral cavity: a clinicopathologyic scoring system for the
66
evaluating risk of cervacal lymph node metastasis. Laryngoscope 1995;105:728−733. 75. Matrisian LM, Bowden GT, Krieg P, et al. The mRNA coding for the secreted protease is expressed more abundantly in malignant than in benign tumors. Proc Natl Acad Sci 1989;83:9413−9417. 76. Matsumoto S. Cimetidine and survival with colorectal cancer Lancet 1995;346:115. 77. Mattijssen V, Peters HM, Schalkwijk L, et al. E-cadherin expression in head and neck sqamous-cell carcinoma associated with clinical outcome. Int J Cancer 1993;55:580−585. 78. McGavran MH, Bauer WC, Ogura JH. The incidence of cervical lymph node metastasis from epidermoid carcinoma of the larynx and their relationship to certain characteristics of the primary tumot: a study based on the clinical and pathological findings for 96 patients treated by primary en block laryngectomy and radical neck dissection. Cancer 1961;14:55−65. 79. Meiners S, Brinkmann V, Naundorf H, Birchmeier W. Role of morphogenetic factors in metastasis of mammary carcinoma cells. Oncogene 1998;16:9−20. 80. Mendelson BC, Woods JE, Beahrs OH. Neck dissection int he treatment of carcinoma of the anterior two thirds of the tongue. Surg Gynecol Obstet 1976;143:75−80. 81. Mohit-Tabatabai MA, Sobel HJ, Rush BF, Mashberg A. Relation of thickness of floor of mouth stage I and II cancers to regional metastasis. Am J Surg 1986;152:351−353. 82. Muller D, Millon R, Velten M. Amplification of 11q13 gene DNA merkers in head and neck squamous cell carcinomas: correlation with clinical outcome. Eur J Cancer 1997;33:2203−2210. 83. Naito S, Shimizu K, Nakashima M, Nakayama T, Ito T, Ito M, Yamashita S, Sekine I. Overexpression of ets-1 transcription factor in angiosarcoma of the skin. Pathol Res Pract 2000;196:103−109. 84. Nakayama T, Ito M, Ohtsuru A, et al. Expression of the Ets-1 proto-oncogene in human gastric carcinoma. Am J Pathol 1996;149:1931−1939. 85. National Cancer Institute, Cancer Statistics Rewiev 1975-2001.
67
86. National Statistics, Registration of Cancer Diagnosed England, 1. táblázat, National Statistics website, www.statistics.gov.uk 87. Nicholson R, Murphy G, Breathnach R. Human and rat malignant-tumor associated mRNAs encode stromelysin-like metalloproteinases. Biochemistry 1989;28:5195−5203. 88. O’Brien CJ, Smith JW, Soong SJ, Urist MM, Maddox WA. Neck dissection with and without radiotherapy ─ prognostic factors, patterns of recurrence and survival. Am J Surg 1986;152:465−463. 89. Oikawa M, Abe M, Kurosawa H, Hida W, Shirato K, Sato Y. Hypoxia induces transcription factor ets-1 via the ectivity of hypoxia-inducible factor-1. Biochem Biophys Res Commun 2001;289:39−43. 90. Ozaki I, Mizuta T, Zhao G, et al. Involvement of Ets-1 gene in overexpression of
matrilysin
in
human
hepatocellular
carcinoma.
Cancer
Research
2000;60:6519−6525. 91. Pande P, Mathur M, Shukla NK, Ralhan R. Ets-l: a plausible marker of invasive potential and lymph node metastasis in human oral squamous cell carcinomas. J Pathol 1989;189:40−45. 92. Parkin DM, Laara E, Muir CS. Estimates of the worldwide frequency of sixteen major cancer in 1980. Int J Cancer 1988;41:187−197. 93. Rasgon BM, Cruz RM, Hilsinger RL, Sawicki JE. Relation of lymph node metastasis to histopathologic appearance in oral cavity and oropharyngeal carcinoma: a case series and literature review. Laryngoscope 1989;99:1103−1110. 94. Répássy G, Tamás L, Forster-Horváth Cs, Juhász A, Tímár J. Mátrixbontó MMP-2 kollagenáz expressziója gége- és hypopharynx tumorokban. Fül-, orr-, gégegyógy 2001;47:9−12. 95. Reynolds JL, Akhter JA, Magarey CJ, Schwartz P, Adams WJ, Morris DL. Histamine in human breast cancer. British Journal of Surgery 1998;85: 535−541. 96. Rodrigo JP, Dominguez F, Alvarez C, Herrero A, Suarez C. Expression of Ecadehrin, CD44s, and CD44v6 in laryngeal and pharyngeal carcinomas. Am J Otolaryngology 2003;24:384−389.
68
97. Roland NJ, Caslin AW, Bowie G, Jones AS. Has the cellular proliferation marker Ki-67 any clinical relevance in squamous cell carcinoma of the head and neck? Clin Otolaryngol 1994;19:13−18. 98. Rothhammer T, Hahne JC, Florin A, Poser I, Soncin F, Wernert N, Bosserhoff AK. The ets-1 transcription factor is involved int he development and invasion of malignant melanoma. Cell Mol Life Sci 2004;61:118−128. 99. Rubin Ma, Mucci NR, Figurski J, Fecko A, Pienta KJ, Day ML. E-cadehrin expression in prostate cancer: A broad survey using high-density tissue microarray technology. Hum Pathol 2001;32:690−697. 100.
Ryoo YW, Kwon HJ, Lee KS. Interferon-γ regulates stromelysin-1 gene
expression in human skin fibroblasts. J Dermatological Science 1996;12: 189−194. 101.
Saeki H, Kuwano H, Kawaguchi H, Ohno S, Sugimachi K. Expression of
Ets-1 transcription factor is correlated with penetrating tumor progression in patients
with
squamous
cell
carcinoma
of
the
esophagus.
Cancer
2000;89:1670−1676. 102.
Salven P, Heikkila P, Anttonen A. Vascular endothelial growth factor in
squamous cell head and neck carcinoma: expression et prognostic significance. Mod Pathol 1997;10:1128−1133. 103.
Sasaki K, Murakami T, Kawasaki M, Takahashi M. The cell cycle
associated change of the Ki-67 reactive nuclear antigen expression. J Cell Physiol 1987;133:579−584. 104.
Sato F, Shimada Y, Watanabe G, Uchida S, Makino T, Imamura M.
Expression of vascular endothelial growth factor, matrix metalloproteinase-9 and E-cadherin in the process of lymph node metastasis in oesophageal cancer. Br J Cancer 1999;80:1366−1372. 105.
Sato Y, Teruyama K, Nakano T, Oda N, Abe M, Tanaka K, Iwasaka-
Yagi C. Role of transcription factors in angiogenesis: Ets-1 promotes angiogenesis
as
well
as
endothelial
2001;947:117−123.
69
apoptosis.
Ann
NY
Acad
Sci
106.
Schipper JH, Unger A, Jahnke K. E-cadherin as a functional marker of
the differentiation and invasion of squamous cell carcinoma of the head and neck. Clin Otolaryngol 1993;19:381−384. 107.
Semenza GI. Hypoxia-inducible factor I: master regulator of O2
homeostasis. Curr Opin Genet Dev 1998;8:588−594. 108.
Shah JP. Patterns of cervical Lymph node metastasis from squamous
carcinoma of the upper aerodigestive tract. Am J Surg 1990;160:405−409. 109.
Shino Y, Watanabe A, Yamada Y, Tanase M, Yamada T. Matsuda M.
Clinocopathologic evaluation of immunohistochemical E-cadherin expression in human gastric carcinoma. Cancer 1995;76:2193−2201. 110.
Smith BD, Smith GL, Carter D. Prognostic significance of vascular
endothelial growth factor protein levels in oral and oropharyngealis squamous cell carcinoma. J Clin Oncol 2000;18:2046−2052. 111.
Span PN, Manders P, Heuvel JJ, Thomas CM, Bosh RR, Beex LV,
Sweep CG. Expression of the transcription factor ets-1 is an independent prognostic marker for relapse-free survival in breast cancer. Oncogene 2002;21:8506−8509. 112.
Spiro RH, Huvos AG, Wong GY, Spiro JD. Predictive value of tumor
thickness in squamous cell carcinoma confined to the tongue and floor of the mouth. Am J Surg 1986;152:345−350. 113.
Stern WBR. Computed tomography of the clinically negative neck. Head
Neck Surg 1990;12:109−113. 114.
Svendsen LB, Ross C, Knigge U, Frederiksen HJ, Graversen P,
Kjaergard J. Cimetidine as an adjuvant treatment in colorectal cancer. A doubleblind, randomized pilot study. Dis Colon Rectum 1995;38:514−518. 115.
Takeichi M. Cadherins in cancer: Implications for invasion and
metastasis. Curr Opin Cell Biol 1993;5:806−811. 116.
Takes RP, Baatenburg de Jong RJ, Alles MJRC, Meeuwis CA, Marres
HAM, et al., Markers for nodal metastasis in head and neck squamous cell cancer. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2002;128:512−518. 117.
Takes RP, Righi P, Meeuwis CA, Manni JJ, Knegt P, Marres HAM. The
value of ultrasound with ultrasound fine-needle aspiration biopsy compared to
70
computed tomography in the detection of regional metastases in clinically negative neck. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1998;40:1027−1032. 118.
Tannock IF. Hill RP. The Basic Science of Oncology, third ed. McGraw-
Hill, Singapore, p 233. 1998. 119.
Tisty TD, Hein PW. Know the neighbor: stromal cells can contribute
oncogenic
signals.
Current
Opinion
in
Genetics
and
Development
2001;11:54−59. 120.
Tímár J, Csuka O, Remenár É, Répássy G, Kásler M. Progression of head
and neck squamous cell cancer. Cancer and Met Rev 2005;24:107-127. 121.
Tomita N, Morishita R, Taniyama Y, Koike H, Aoki M, Shimizu H,
Matsumoto K, Nakamura T, Kenada Y, Ogihara T. Angiogenetic property of hepatocyta growth factor is dependent on upregulation of essential transcription factor for angiogenesis, ets-1. Circulation 2003;107:1411−1417. 122.
Tonnesen H, Knigge U, Bulow S, Damm P, Fischerman K, Hesselfeldt P.
Effect of cimetidine on survival after gastric cancer. Lancet 1988;11:990−992. 123.
Van den Brekel MWM. Magnetic resonance imaging vs palpation of
cervical lymph node metastases. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1991;117:666−673. 124.
Van der Wurff AA, Ten Kate J, Van der Linden EP, Dinjens WN, Arends
JW, Bosman FT. L-CAM expression in normal, premalignant, and malignant colon mucosa. J Pathol 1992;168:287−291. 125.
Wasylyk C, Gutman A, Nicholson R, Wasylyk B. The Ets-1 oncoprotein
activates the stromelysin promoter through the same elements as several nonnuclear oncoprotein. EMBO J 1991;10:1127−1134. 126.
Wernert N, Gilles F, Fafeur V. Stromal expression of c-ets-1
transcription
factor
correlates
with
tumor
invasion.
Cancer
Res
1994;54:5683−5688. 127.
Willen R, Nathanson A, Moberger C, Anneroth G. Squamous cell
carcinoma of the gingiva: histological classification and grading of malignancy. Acta Otolaryngol 1975;79:146−154.
71
128.
Williams JK, Carlson GW, Cohen C, Derose PB, Hunter S, Jurkiewicz
MJ. Tumor angiogenesis as a prognostic factor in oral cavity tumors. Am J Surg 1994;168:373−380. 129.
Wolf GT. Fisher SG, Truelson JM, beals TF, DNA content and regional
metastasis in patients with advanced laryngeal squamous carcinoma. Laryngoscope 1994;14:479−483. 130.
Xia W, Lau YK, Zhang HZ. Combination of EGFR, HER-2/neu, and
HER-3 is a stronger predictor for the outcome of oral squamous cell carcinoma than any individual family members. Clin Cancer Res 1999;5:4164−4174. 131.
Yamamoto E, Mikayawa A, Kohama G. Mode of invasion and lymph
node metastasis in squamous cell carcinoma of the oral cavity. Head Neck Surg 1984;6:938−947. 132.
Yamada K, Jordan R, Mori M, Speight PM. The relationship between E-
cadherin ecpression, clinical stage and tumour differentiation in oral squamous cell carcinoma. Oral Diseases 1997;3:82−85. 133.
Yasuda M, Ohzeki Y, Shimizu S, Naito S, Ohtsuru A, Yamamoto T,
Kuroiwa Y. Stimulation of in vitro angiogenesis by hydrogen peroxide and the relation with ETS-1 in endothelial cells. Life Sci 1999;64:249−258. 134.
Zauberman H, Michaelson IC, Bergmann F, Maurice DM. Stimulation of
neovascularisation of the cornea by biogenic amines. Exp Eye Res 1969;8: 77−83. 135.
Zheng Z, Pan J, Chu B, Wong YC, Cheung AL, Tsao SW.
Downregulation and abnormal expression of E-cadherin and beta-catenin in nasopharyngeal carcinoma: close assotioation with advanced disease stage and lymph node metastasis. Human Pathol 1999;30:458−466. 136.
Zipori D. Stromal cells in tumor growth and regression. Cancer J 1994;3:
164−169.
72
12- AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT PUBLIKÁCIÓK Közlemények: 1. Barnabás Horváth, Hargita Hegyesi, Pál Nagy, András Falus, Zsuzsa Schaff. Expression of ets-1 transcription factor in human head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) and the effect of histamine on metastatic potential of invasive tumor through the regulation of expression of ets-1 and matrix metalloproteinase MMP3. Head Neck 27:585-596, 2005. 2. Hargita Hegyesi, Barnabás Horváth, Éva Pállinger, Zoltán Pós, Viktor Molnár and András Falus. Histamine elevates the expression of Ets-1, a protooncogen in human melanoma cell lines through H2 receptor. FEBS letters 579:2475-2479, 2005. 3. Horváth Barnabás, Csákó László, Nagy Pál, Csokonai Vitéz Lajos, Schaff Zsuzsa. Az ets-1 transzkripciós faktor expressziójának vizsgálata immunhisztokémiai és RTPCR módszerrel fej-nyaki planocellularis carcinomákban. Fül-, Orr-, Gégegyógyászat 51:126-132, 2005.
73
