ZIMOGRAM AKTIVITAS KOLAGENASE DARI Bacillus licheniformis F-11.1 DAN F-11.4
ISNAWATI PUSPITA
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2013
ABSTRAK ISNAWATI PUSPITA. Zimogram Aktivitas Kolagenase Bacillus licheniformis F-11.1 dan F-11.4. Dibimbing oleh SRI BUDIARTI dan MAGGY T. SUHARTONO. Bacillus licheniformis F-11.1 dan F-11.4 merupakan strain dari bakteri B. licheniformis F-11 yang diisolasi dari limbah udang di Palembang, Indonesia. Kedua bakteri tersebut telah mengalami perlakuan mutasi pada operon Asam Poliglutamat (PGA) dan kitinase-AB sehingga tidak memiliki aktivitas kitinase, tetapi memiliki aktivitas protease yang tinggi. Enzim kolagenase berperan penting dalam pelunakan daging dan mempercepat penyembuhan luka. Pemekatan enzim dapat dilakukan salah satunya dengan cara mengendapkan protein dengan amonium sulfat yang dapat menstabilkan enzim sehingga mengurangi denaturasi protein. Zimogram merupakan teknik elektroforesis untuk mengetahui adanya aktivitas suatu enzim secara kualitatif pada gel elektroforesis. Tujuan penelitian ini adalah menganalisis aktivitas kolagenase dari Bacillus licheniformis F-11.1 & F-11.4 secara kualitatif menggunakan teknik zimogram. Analisis dilakukan terhadap kedua isolat yang ditumbuhkan pada tiga media tumbuh, yaitu LB+5% kolagen (LBC), ½LB+5% kolagen (LBHC), dan 5% kolagen (CLG). Pertumbuhan sel kedua isolat lebih baik pada media LBC. Zimogram menunjukkan Bacillus licheniformis F-11.1 dan F-11.4 menghasilkan kolagenase pada ketiga media tumbuh yang ditambahkan kolagen sebagai substrat pertumbuhan. Hal tersebut ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening pada gel akibat degradasi kolagen oleh kolagenase. Isolat B. licheniformis F-11.1 menghasilkan fraksi terbanyak dari enzim ekstrak kasar yang berasal dari media tumbuh LBC sebanyak 32 fraksi. Sementara itu, isolat B. licheniformis F-11.4 menghasilkan fraksi terbanyak dari enzim ekstrak kasar yang berasal dari media tumbuh LBHC sebanyak 37 fraksi.
ABSTRACT ISNAWATI PUSPITA. Zimogram Collagenase Activity From Bacillus licheniformis F-11.1 and F-11.4. Supervised by SRI BUDIARTI and MAGGY T. SUHARTONO. Bacillus licheniformis F-11.1 and F-11.4 are strains from B. lichniformis F-11 were isolated from shrimp shell waste in Palembang, Indonesia. They has poliglutamat acid mutation in the operon (PGA) and chitinase AB, so it doesn’t have chitinase activity, but high protease activity. Collagenase plays an important role in the softening of meat and the wound healing process. Precipitation enzyme can use ammonium sulfate to stabilize the enzyme, therebly reducing protein denaturation. Zimogram is an electrophoresis technique to determine the activity of an enzyme in situ and qualitative results of the gel electrophoresis. This research was conduct to analyze the activity Bacillus licheniformis F-11.1 and F-11.4 collagenase qualitatively using techniques zimogram. Analysis is performed on both isolates that grown in three growth media, ie LB + 5% collagen (LBC), ½ LB + 5% collagen (LBHC), and 5% collagen (CLG). Bacillus licheniformis F-11.1 and F-11.4 produce collagenase in the three growth media were added collagen as the substrate growth. Cell growth both isolates best on LBC media. Zimogram showed B. licheniformis F-11.1 and F-11.4 produce collagenase. It shown by the formation of clear zone on the gel due to degradation of collagen by collagenase. Isolates B. licheniformis F-11.1 produce the highest fraction of enzyme crude extract derived from LBC media is 32 fraction. Meanwhile isolates B. lichniformis F-11.4 produce the highest fraction of crude extract derived from LBHC media is 37 fraction.
ZIMOGRAM AKTIVITAS KOLAGENASE DARI Bacillus licheniformis F-11.1 DAN F-11.4
ISNAWATI PUSPITA
Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2013
Judul
: Zimogram Aktivitas Kolagenase dari Bacillus licheniformis F-11.1 dan F-11.4.
Nama
: Isnawati Puspita
NIM
: G34080065
Menyetujui :
Dr. dr. Sri Budiarti Pembimbing 1
Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono Pembimbing 2
Mengetahui Ketua Departemen Biologi
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si NIP 19641002 1989302 2 001
Tanggal lulus : PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas rahmat-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Penelitian ini dilakukan mulai Desember 2011 sampai Juli 2012, di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia PPSHB, Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Terpadu, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Judul yang diambil dalam penelitian ini adalah Zimogram Aktivitas Kolagenase Dari Bacillus licheniformis F11.1 dan F-11.4. Karya ilmiah ini merupakan salah satu syarat untuk mendapatkan glar sarjana sains di Intitut Pertanian Bogor. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. dr. Sri Budiarti dan Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono atas bimbingan dan arahan yang diberikan selama mengerjakan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Ibu Ika (Laboran Lab Mikrobiologi dan Biokimia, PPSHB, IPB), Bapak Ace Baehaki, Ibu Diana, dan teknisi laboratorium terpadu serta laboratorium mikrobiologi, Departemen Biologi, Ipb, atas bantuan yang diberikan selama penulis melakukan penelitian di laboratorium tersebut. Tak lupa penulis ucapkan terima kasih kepada kedua orang tua atas doa, dukungan, kekuatan, kesabaran, dan semangat yang diberikan selama ini. Terima kasih penulis ucapkan pula kepada teman-teman biologi 45, biologi 46, Biologi 44, dan penghuni kost Madep yang senantiasa memberi semangat kepada saya. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Putri Ramadani, Desi Setianingsih, Ratu Aqila, A. Traya S., Dewi Senja R. S.Si, Suwaibatul A, Wathri Fitrada, dan Cindy T. S.Si yang telah membantu, menemani, dan memberikan motivasi kepada penulis selama ini. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Januari 2013
Isnawati Puspita
RIWAYAT HIDUP Isnawati Puspita dilahirkan di Tasikmalaya pada tanggal 06 Juni 1990 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara dari pasangan Nano Sumarno dan Euis Apipah. Penulis memulai pendidikannya dari SD N 04 Cipayung, SMP N 9 Jakarta, dan SMA N 64 Jakarta. Kemudian, penulis melanjutkan pendidikannya di Departemen Biologi, Institut Pertanian Bogor pada tahun 2008. Pada tahun 2010, penulis melakukan studi lapang di Taman Wisata Alam dan Cagar Alam Pangandaran dengan judul makalah Keanekaragaman Morfologi Batang Pohon di Pangandaran Dan Potensinya. Selanjutnya, penulis juga melakukan praktek lapang pada tahun 2011 di Rumah Sakit Pusat Angkatan Udara (RSPAU) dr. Esnawan Atariksa dengan judul makalah Pemeriksaan Klinis di Laboratorium RSPAU dr. Esnawan Antariksa, Halim Perdanakusuma, Jakarta. Selama menjadi mahasiswa Institut Pertanian Bogor, penulis aktif dalam berbagai kegiatan kemahasiswaan. Penulis pernah menjadi bendahara divisi Pengembangan Dan Sumberdaya Masyarakat (PSDM) dalam organisasi Himpunan Mahasiswa Biologi (Himabio) pada tahun 2009-2010. Kemudian, ia juga pernah menjadi ketua divisi Informasi Dan Komunikasi (Infokom) Himabio pada tahun 2010-2011. Pada tahun 2011, ia juga aktif menjadi penanggung jawab dan tim penulis majalah Chepalos. Penulis juga aktif dalam kegiatan drama musikal Bacillus Biologi sebagai director, script writer, dan official team selama 3 tahun. Selan itu, ia juga aktif diberbagai kepanitiaan kegiatan kampus, seperti Biologi Interaktif, Lomba Cepat Tepat Biologi (LCTB), Bina Desa, Masa Pengenalan Departemen Biologi, dan Grandbiodiversity.
vii
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR ......................................................................................................... viii DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................................... viii PENDAHULUAN.............................................................................................................. 1 Latar Belakang ........................................................................................................ 1 Tujuan ..................................................................................................................... 1 BAHAN DAN METODE .................................................................................................. Waktu dan Tempat .................................................................................................. Bahan dan Alat ........................................................................................................ Metode ..................................................................................................................... Pembuatan Kolagen ................................................................................................. Peremajaan Isolat .................................................................................................... Pembuatan Inokulum ............................................................................................... Produksi Enzim Kolagenase .................................................................................... Pemekatan Enzim Ekstrak Kasar ............................................................................. Zimogram Aktivitas Kolagenase .............................................................................
1 1 1 1 1 2 2 2 2 2
HASIL ................................................................................................................................ 3 Pertumbuhan Sel dan Kadar Protein Enzim ............................................................ 3 Zimogram Aktivitas Kolagenase ............................................................................. 4 PEMBAHASAN ................................................................................................................ 6 SIMPULAN ....................................................................................................................... 7 SARAN .............................................................................................................................. 7 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................................ 7 LAMPIRAN ....................................................................................................................... 9
viii
DAFTAR GAMBAR Halaman 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Kurva Pertumbuhan Sel dan Kadar Protein Enzim Isolat F-11.1 pada media LBC .......... Kurva Pertumbuhan Sel dan Kadar Protein Enzim Isolat F-11.1 pada media LBHC ....... Kurva Pertumbuhan Sel dan Kadar Protein Enzim Isolat F-11.1 pada media CLG .......... Kurva Pertumbuhan Sel dan Kadar Protein Enzim Isolat F-11.4 pada media LBC ......... Kurva Pertumbuhan Sel dan Kadar Protein Enzim Isolat F-11.4 pada media LBHC ....... Kurva Pertumbuhan Sel dan Kadar Protein Enzim Isolat F-11.4 pada media CLG .......... Hasil zimogram, jumlah fraksi dan jumlah protein dari enzim ekstrak kasar isolat B. licheniformis F-11.1 yang tumbuh pada media LBC, LBHC, dan CLG ............. 8. Hasil zimogram, jumlah fraksi, dan jumlah protein enzim ekstrak kasar dari isolat B. licheniformis F-11.4 yang tumbuh pada media LBC, LBHC, dan CLG .... 9. Hasil zimogram, jumlah fraksi, dan jumlah protein enzim semi murni dari isolat B. licheniformis F-11.1 yang tumbuh pada media LBC, LBHC, dan CLG. ..... 10. Hasil zimogram, jumlah fraksi, dan jumlah protein enzim semi murni dari isolat B. licheniformis F-11.4 yang tumbuh pada media LBC, LBHC, dan CLG ......
3 3 3 4 4 4 5 5 5 6
DAFTAR LAMPIRAN 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.
Halaman Diagram Metode Pembuatan Kolagen .............................................................................. 10 Komposisi Media Luria Bertani Agar (LBA) dan Media LB (Inokulum) ....................... 10 Media Produksi LBC, LBHC, dan CLG ........................................................................... 10 Komposisi Larutan Bradford............................................................................................. 10 Komposisi Larutan BSA, Konsentrasi, dan Kurva Standar BSA ..................................... 11 Persentase Penggunaan Amonium Sulfat Pada Proses Pemekatan ................................... 12 Komposisi dan cara membuat Larutan 50 mM Bufer Fosfat pH 7 .................................. 13 Metode Zimogram ............................................................................................................ 13 Komposisi Gel Penahan dan Gel Pemisah ....................................................................... 14 Komposisi Larutan Akrilamid, Bufer Gel Pemisah, dan Bufer Gel Penahan .................. 14 Komposisi Larutan Bufer Sampel .................................................................................... 14 Komposisi Bufer Elektroforesis pH 8.3 ........................................................................... 14 Komposisi dan cara membuat Larutan 50 mM Bufer Fosfat pH 9 ................................... 15 Komposisi Larutan Pewarna Gel (Staning) dan Peluntur (Destaining)............................. 15
1
PENDAHULUAN Latar Belakang Enzim merupakan golongan protein yang banyak terdapat di dalam sel hidup dan berperan penting sebagai biokatalisator pada proses biokimiawi dalam sel (Trismilah & Sumaryanto 2005). Penggunaan enzim saat ini sudah mengalami peningkatan. Enzim memiliki sifat yang sensitif, selektif, dan spesifik terhadap suatu substrat sehingga enzim banyak digunakan oleh industri. Salah satu enzim yang banyak digunakan adalah enzim protease. Rao et al. (1998) melaporkan 65% dari enzim yang dijual di dunia adalah enzim protease. Protease merupakan enzim yang memiliki daya katalitik spesifik dan efisien terhadap ikatan peptida pada protein. Salah satu enzim yang tergolong protease adalah kolagenase. Kolagenase memiliki sifat proteolitik sehingga dapat memecah ikatan peptida dari kolagen (Kim et al. 2002). Menurut Chung et al (2004), kolagenase mampu memecah ikatan peptida pada kolagen, sehingga penggunaan kolagenase dalam proses hidrolisis kolagen dinilai lebih efektif dan efisien. Kolagenase memiliki berbagai manfaat diantaranya berperan dalam proses pelunakan daging (Hultman & Rustad 2003, diacu dalam Yuniarti 2010) dan penyembuhan luka (Riley & Herman 2005). Kolagenase dapat dihasilkan dari jaringan mamalia (Park et al. 2002), usus ikan bandeng (Yuniarti 2010), dan bakteri yang berasal dari organ dalam ikan filefish (Kim et al. 2002). Pada jaringan mamalia, kolagenase dapat ditemukan di jaringan epitel, leukosit, dan sel tulang (Golub et al. 1976). Bakteri yang dapat menghasilkan kolagenase, antara lain, Clostridium histolyticum (Bond & Wart 1984), Serratia marcesens, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus (Harrington 1996), dan B. licheniformis F-11.4 (Baehaki et al. 2012). Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah B. licheniformis F-11.1 dan F-11.4. Bacillus licheniformis F-11.1 dan F-11.4 merupakan strain dari B. licheniformis F-11 yang diisolasi dari limbah udang di Palembang (Weldeck et al. 2006). Kedua isolat tersebut telah mengalami perlakuan mutasi pada operon asam poliglutamat (PGA) dan kitinase-AB. Perlakuan mutasi tersebut menyebabkan kedua bakteri tidak memiliki aktivitas kitinase, tetapi memiliki aktivitas protease yang tinggi (Hoffmann et al. 2010). Oktivianti (2012) melaporkan bahwa kedua isolat dapat menghasilkan kolagenase pada tiga media tumbuh, yaitu media LBC
(100%LB+5% kolagen), LBHC (50% LB+ 5% kolagen), dan CLG (5% kolagen). Produksi kolagenase kedua isolat optimum pada media LBC dengan aktivitas spesifik kolagenase sebesar 2.057 U/mg untuk F-11.1 dan 4.695 U/mg untuk F-11.4. Aktivitas kolagenase dalam penelitian tersebut belum dianalisis secara kualitatif sehingga perlu dilakukan analisis secara kualitatif terhadap aktivitas katalitik enzim tersebut. Analisis enzim secara kualitatif dapat dilakukan dengan teknik zimogram. Zimogram merupakan teknik elektroforesis untuk mengetahui adanya aktivitas suatu enzim terhadap substrat yang ditambahkan kedalam gel akrilamid. Teknik ini memiliki keuntungan antara lain sederhana, sensitif, dan spesifik (Mubarik 2005). Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis enzim kolagenase dari Bacillus licheniformis F-11.1 & F-11.4 secara kualitatif menggunakan teknik zimogram.
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember 2011 hingga Juli 2012 di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia PPSHB-IPB, Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, dan Laboratorium Terpadu Departemen Biologi, FMIPA IPB, Bogor. Bahan Bahan yang diteliti adalah isolat bakteri B. licheniformis F-11.1 dan F-11.4 koleksi laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia, Pusat Studi Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), Institut Pertanian Bogor. Metode Pembuatan Kolagen. Substrat yang digunakan dalam penelitian ini adalah kolagen. Kolagen tersebut berasal dari kulit ikan Bandeng (Lestari 2005, diacu dalam Yuniarti 2010) (Lampiran 1). Kulit ikan dibersihkan dari sisik, daging, lemak, dan kotoran yang menempel. Selanjutnya, kulit dipotong-potong dengan ukuran 3x3 cm. Kemudian, potongan kulit dicuci dengan air hingga bersih. Selanjutnya, kulit direndam dalam asam asetat 1.5% dengan perbandingan (berat kulit (gr) / volume asam asetat (ml)) 1:2
2
selama 24 jam. Setelah perendaman, kulit ikan lalu dibersihkan dengan air mengalir sampai tidak tercium bau asam. Setelah itu, kulit tersebut direndam dalam akuades dengan perbandingan (berat kulit (gr) / volume asam asetat (ml)) 2:1 dan diinkubasi pada suhu 50oC selama 3-4 jam. Kemudian, rendaman kulit tersebut disaring menggunakan kertas saring. Penyaringan ini dilakukan untuk memisahkan cairan kolagen dan sisa-sisa kulit yang tidak terpakai Peremajaan Isolat. Isolat B. licheniformis F-11.1 & F-11.4 diremajakan pada media tumbuh optimum Luria Bertani (LB) Agar, kemudian diinkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam diinkubator (Lampiran 2). Isolat yang telah diremajakan disimpan pada suhu 4o C dan digunakan sebagai isolat kerja. Pembuatan Inokulum. Media yang digunakan sebagai inokulum adalah media tumbuh optimum B. licheniformis, yaitu media LB cair (Ratu 2007) (Lampiran 2). Sebanyak 2 lup dari kedua isolat masing-masing ditumbuhkan pada media LB sebagai inokulum. Inokulum diinkubasi di shaker waterbath (Certomat WR) dengan kecepatan 110 rpm selama 24 jam pada suhu tumbuh optimum 50oC untuk B. licheniformis F-11.1 dan 40oC untuk B. licheniformis F-11.4. Inokulum dengan nilai optical density (OD) 0.7-0.8 digunakan sebagai isolat kerja pada media produksi. Produksi Enzim Kolagenase. Produksi enzim kolagenase dilakukan dengan mengekstraksi enzim dari tiga media tumbuh, yaitu LBC, LBHC, dan CLG. Sebanyak 10% inokulum yang memiliki nilai OD 0.8 dimasukkan ke masing-masing erlenmeyer beisi media produksi kolagenase (Lampiran 3). Selanjutnya ketiga erlenmeyer tersebut diinkubasi di shaker waterbath (Certomat WR) dengan kecepatan 110 rpm dan diinkubasi pada suhu tumbuh optimum masing-masing isolat. sebanyak 20 ml kultur dari erlenmeyer diambil setiap 10 jam selama 40 jam. Sebanyak 2 ml kultur yang telah diambil kemudian diamati laju pertumbuhannya dengan mengukur turbiditas selnya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm. Selanjutnya, sisa kultur yang telah diambil kemudian. Diekstraksi untuk mendapatkan enzim ekstrak kasar. Ekstraksi dilakukan dengan cara sentrifugasi kultur menggunakan alat Tomy
MRX-152 dengan kecepatan 4000 rpm selama 20 menit pada suhu 4oC. Supernatan yang dihasilkan merupakan enzim ekstra kasar (EEK). Enzim ekstrak kasar kemudian dianalisis aktivitasnya menggunakan teknik zimogram. Selain itu diukur pula kadar proteinnya menggunakan metode Bradford (Bradford 1976, diacu dalam Ratu 2007) (Lampiran 4). Sebanyak 50 µl enzim sebagai sampel direaksikan dengan 2.5 ml larutan Bradford dan dikocok kuat. Bovin Serum Albumin (BSA) digunakan sebagai larutan standar (Lampiran 5). Sebanyak 50 µl akuades sebagai blanko direaksikan dengan 2.5 ml larutan Bradford dan dikocok kuat. Masingmasing campuran tersebut diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Selanjutnya dilakukan pembacaan nilai absorbansinya di spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm. . Pemekatan Enzim Ekstrak Kasar. Pemekatan enzim ekstrak kasar dilakukan untuk mendapatkan enzim semi murni (ESM). Pemekatan ini dilakukan dengan cara mencampurkan enzim ekstrak kasar dengan 50% amonium sulfat (Bollag & Edelstein 1991) (Lampiran 6). Kemudian, campuran tersebut didiamkan selama semalam. Setelah itu, campuran tersebut disentrifugasi menggunakan Micro 200R Hettich Zentrifugen pada kecepatan 10000 rpm, suhu 4oC, selama 20 menit. Pelet yang dihasilkan merupakan enzim semi murni (ESM). Selanjutnya, pelet tersebut dilarutkan kedalam 50mM bufer fosfat pH 7 dengan perbandingan (b/v) 1: 2 (Lampiran 7). Zimogram Aktivitas Kolagenase. Aktivitas kolagenase dideteksi dengan menggunakan zimogram (Baehaki et al. 2012) (Lampiran 8). Gel akrilamid 12% sebagai gel pemisah ditambahkan dengan 1% kolagen (Lampiran 9). Sementara itu, gel akrilamid 4% sebagai gel penahan tidak ditambahkan substrat kolagen (Lampiran 9). Komposisi larutan akrilamid, bufer gel pemisah, dan bufer gel penahan dapat dilihat pada lampiran 10. Sampel yang digunakan adalah EEK dan ESM kedua isolat. Sebanyak 40 µl sampel dicampurkan dengan 10 µl bufer sampel (Lampiran 11). Kemudian, 18 µl campuran tersebut digunakan sebagai sampel untuk elektroforesis. Selanjutnya, gel yang sudah berisi sampel dimasukkan kedalam alat dan direndam dalam bufer elektroforesis (Lampiran 12). Kemudian, gel dielektroforesis
3
menggunakan BIO-RAD dengan kekuatan 70 volt dan 50 ampere. Elektroforesis dilakukan sampai sampel berada 2 cm dari tepi bawah gel. Selanjutnya, gel direndam dalam 2.5% Triton X-100 dan diputar di atas shaker waterbath (Certomat WR) pada kecepatan 110 rpm selama 1 jam. Larutan tersebut dibuang kemudian diganti dengan 50mM bufer fosfat pH 9 dan gel tersebut diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam (Lampiran 13). Setelah diinkubasi, gel tersebut diwarnai dengan pewarna Coomassie Brilliant Blue dan diputar di atas shaker waterbath (Certomat WR) pada kecepatan 110 rpm (Lampiran 14). Pewarnaan tersebut dapat menghasilkan zona bening akibat dari aktivitas kolagenase terhadap kolagen.
HASIL Pertumbuhan Sel dan Kadar Protein Enzim. Pengamatan laju pertumbuhan sel bakteri dapat dilakukan dengan pengukuran turbiditas sel. Pengukuran turbiditas sel dilakukan dengan mengukur tingkat kekeruhan media selama waktu inkubasi. Tingkat kekeruhan media didapat dari nilai OD yang diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm. Isolat B. licheniformis F11.1 tumbuh lebih baik pada media tumbuh LBC. Pada media tersebut, isolat F-11.1 tumbuh optimum pada jam ke-30 dengan nilai absorbansi sebesar 1.38. Kadar protein EEK dan ESM isolat tersebut optimum pada jam
0.5
2
0.4
1.5
ke-20 dan 40 dengan nilai masing-masing sebesar 0.1 mg/ml (Gambar 1). Sementara itu, pada media tumbuh LBHC, isolat tersebut tumbuh optimum pada jam ke-10 dengan nilai absorbansi sebesar 1.43. isolat F-11.1 yang tumbuh pada media tersebut memiliki kadar protein EEK dan ESM optimum pada jam ke10 dan 40 dengan nilai masing-masing sebesar 0.2 mg/ml dan 0.1 mg/ml (Gambar 2). Pada media CLG, isolat F-11.1 tumbuh optimum pada jam ke-10 dengan nilai absorbansi sebesar 0.61. Kadar protein EEK dan ESM yang dimiliki isolat tersebut optimum pada jam ke-40 dengan nilai masing-masing sebesar 0.1 mg/ml (Gambar 3). Isolat B. licheniformis F-11.4 tumbuh lebih baik pada media LBC. Pada media LBC, isolat tersebut tumbuh optimum pada jam ke20 dengan nilai absorbansi sebesar 1.64. Enzim ekstrak kasar dan ESM isolat tersebut memiliki kadar protein yang optimum pada jam ke-30 dan 40 dengan nilai masig-masing sebesar 0.15 mg/ml dan 0.10 mg/ml (Gambar 4). Isolat F-11.4 yang ditumbuhkan pada media LBHC tumbuh optimum pada jam ke10 dengan nilai absorbansi sebesar 1.32 dan memiliki kadar protein EEK optimum pada jam ke-20 sebesar 0.3 mg/ml. Kadar protein ESM isolat tersebut optimum pada jam ke-40 dengan nilai sebesar 0.1 mg/ml (Gambar 5). Sementara itu, pada media CLG isolat F-11.4 tumbuh optimum pada jam ke-40 dengan nilai absorbansi sebesar 0.266. Kadar protein EEK dan ESM isolat tersebut optimum pada jam ke-30 dan 40 dengan nilai masing-masing sebesar 0.1 mg/ml (Gambar 6).
0.5
2
0.4
1.5 1
1 0.2
0.2 0.5
0.1 0
0
10 20 30 40 Waktu inkubasi (jam)
0.4
1.5
0.3
0.3
0.3
2
0.5
0.5
0.1 0
0 10 20 30 40 Waktu inkubasi (jam)
1 0.2 0.5
0.1 0
0 10 20 30 40 Waktu inkubasi (jam)
Kadar Prot ein EEK (mg/ ml)
Kadar Prot ein EEK (mg/ ml)
Kadar Prot ein EEK (mg/ml)
Kadar Prot ein ESM (mg/ml)
Kadar Prot ein ESM (mg/ml)
OD 620 nm
OD 620 nm
Kadar Prot ein ESM (mg/ ml) OD 620 nm
EEK : Enzim ekstrak kasar ESM : Enzim semi murni
Gambar 1 Kurva pertumbuhan sel dan kadar protein enzim isolat F-11.1 media LBC.
EEK : Enzim ekstrak kasar ESM : Enzim semi murni
Gambar 2 Kurva pertumbuhan sel dan kadar protein enzim isolat F-11.1 media LBHC.
EEK : Enzim ekstrak kasar ESM : Enzim semi murni
Gambar 3 Kurva pertumbuhan sel dan kadar protein enzim isolat F-11.1 media CLG.
4
0.4
1.5
0.5
2
0.4
1.5
0.3
0.3
1 0.2
0.5
0.1
0
0
10 20 30 40 Waktu inkubasi (jam) Kadar Protein EEK (mg/ ml) Kadar Protein ESM (mg/ml) OD 620 nm EEK : Enzim ekstrak kasar ESM : Enzim semi murni
Gambar 4 Kurva pertumbuhan sel dan kadar protein enzim isolat F-11.4 media LBC
1 0.2 0.5
0.1
0.5
OD 620 nm
2
0.5
2
0.4
1.5
0.3 1 0.2 0.5
0.1
0
0 10 20 30 40 Waktu inkubasi (jam)
0
0 10 20 30 40 Waktu inkubasi (jam)
Kadar Prot ein EEK (mg/ ml)
Kadar Protein EEK (mg/ ml)
Kadar Prot ein ESM (mg/ml) OD 620 nm
Kadar Protein ESM (mg/ml)
EEK : Enzim ekstrak kasar ESM : Enzim semi murni
Gambar 5 Kurva pertumbuhan sel dan kadar protein enzim isolat F-11.4 media LBHC
Zimogram Aktivitas Kolagenase. Secara keseluruhan, zimogram kedua isolat dapat menghasilkan aktivitas kolagenolitik. Hal tersebut ditunjukan dengan terbentuknya pita bening pada gel akibat terdegradasinya kolagen pada gel oleh kolagenase. Hasil zimogram EEK kedua isolat yang ditumbuhkan pada media LBC menghasilkan pita bening yang lebih tebal dibandingkan isolat yang tumbuh di media LBHC dan CLG. Sementara itu, pada media LBHC pita bening yang dihasilkan tidak membentuk zona bening yang teratur (Gambar 7 dan 8). Zimogram enzim semi murni menghasilkan pita yang lebih tipis dibandingkan dengan pita hasil zimogram ekstrak kasar enzim. Enzim semi murni dari isolat F-11.1 yang ditumbuhkan pada media LBC menghasilkan pita bening pada jam 10, 20, 30, dan 40 (Gambar 9). Pada media LBHC dan CLG tidak terbentuk pita bening. Eenzim semi murni dari F-11.4 pada media LBC menghasilkan pita bening pada jam ke-30, sedangkan ESM isolat F-11.4 yang tumbuh pada media LBHC menghasilkan pita bening pada jam ke-10, 20, dan 30 (Gambar 10). Jumlah protein tiap sampel per 10 jam didapat dari nisbah kadar protein sampel dengan volume sampel yang dimasukan
OD 620 nm EEK : Enzim ekstrak kasar ESM : Enzim semi murni
Gambar 6 Kurva pertumbuhan sel dan kadar protein enzim isolat F-11.4 media CLG.
kedalam gel. Jumlah protein yang terdapat di dalam gel berbeda-beda tiap sampel. Enzim ekstrak kasar isolat B. licheniformis F-11.1 dan F-11.4 memiliki jumlah protein optimum tertinggi yang berasal dari isolat yang tumbuh pada media LBHC. Isolat B. licheniformis F11.1 memiliki jumlah protein optimum pada jam ke-10 sebesar 3.36 µg, sedangkan isolat B. licheniformis F-11.4 optimum pada jam ke20 sebesar 5.57µg. Enzim semi murni isolat B. licheniformis F-11.1 memiliki jumlah protein optimum tertinggi berasal dari ESM isolat yang ditumbuhkan di media CLG pada jam ke-40 sebesar 1.89 µg. Sementara itu, isolat B. licheniformis F-11.4 memiliki jumlah protein optimum tertinggi berasal dari ESM isolat yang ditumbuhkan di media LBC pada jam ke-30, sebesar 2.42 µg. Zimogram yang dihasilkan tiap sampel dapat membentuk beberapa fraksi atau pita bening. Fraksi-fraksi tersebut terbentuk berdasarkan ukuran dan berat molekul yang dimiliki oleh sampel. Jumlah fraksi terbanyak yang dihasilkan EEK dan ESM isolat B. licheniformis F-11.1 didapat dari media LBC, sebanyak 32 dan 9 fraksi. Ekstrak kasar enzim dan ESM isolat B. licheniformis F-11.4 memiliki jumlah fraksi terbanyak dari media LBHC sebanyak 37 dan 6 fraksi.
5
Jam ke- 10
20
30
40
Media : LBC Σ Fraksi : 6, 9, 9, 8 Σ Protein (µg) : 1.8, 2.3, 1.5, 1.7
Jam ke- 10
20
30
40
Jam ke- 10
Media : LBHC Σ Fraksi : Σ Protein (µg) : 3.4, 3, 2.4, 1.5
20
30
40
Media : CLG Σ Fraksi : 8, 8, 5, 6 Σ Protein (µg) : 1.8, 1.8, 1.9, 2
Gambar 7 Hasil zimogram, jumlah fraksi dan jumlah protein dari EEK isolat B. licheniformis F-11.1 yang tumbuh pada media LBC, LBHC, dan CLG Jam ke-
10
20
30
40
Media : LBC Σ Fraksi : 8, 5, 8, 6 Σ Protein (µg) : 1.5, 1.5, 2.7, 2.3
Jam ke- 10
20
30
40
Jam ke-
Media : LBHC Σ Fraksi : 7, 9, 11, 10 Σ Protein (µg) : 1.2, 5.6, 2.3, 3
10
20
30
Media : CLG Σ Fraksi : 6, 7, 6, 5 Σ Protein (µg) : 1.2, 1.9, 2., 2
Gambar 8 Hasil zimogram, jumlah fraksi, dan jumlah protein EEK dari isolat B. licheniformis F-11.4 yang tumbuh pada media LBC, LBHC, dan CLG
Jam ke-
10
20
30
40
Media : LBC Σ Fraksi : 1, 5, 1, 2 Σ Protein (µg) : 0.39, 1.07, 1.33, 1.63
Jam ke-
10
20
30
40
Media : LBHC Σ Fraksi : Σ Protein (µg) : 0.5, 1.2, 1.6, 1.9
Jam ke-
10
20
30
40
Media : CLG Σ Fraksi : Σ Protein (µg) : 0.2, 0.5, 1.4, 1.9
Gambar 9 Hasil zimogram, jumlah fraksi, dan jumlah protein ESM dari isolat B. licheniformis F-11.1 yang tumbuh pada media LBC.
40
6
Jam ke-
30
Jam ke- 10
Media : LBC Σ Fraksi : 2 Σ Protein (µg) : 2.4
20
30
Media : LBHC Σ Fraksi : 2, 2, 2 Σ Protein (µg) : 0.3, 1.8, 1.5, 2.3
Jam ke- 10
20
30
40
Media : CLG Σ Fraksi : Σ Protein (µg) : 1.1, 1.7, 1.9, 2
Gambar 10 Hasil zimogram, jumlah fraksi, dan jumlah protein ESM dari isolat B. licheniformis F-11.4 yang tumbuh pada media LBC dan LBHC.
PEMBAHASAN Bacillus licheniformis F-11.1 dan F-11.4 yang ditumbuhkan pada tiga media berbeda menunjukkan hasil pertumbuhan sel yang berbeda. Kedua isolat tumbuh lebih baik pada media yang mengandung komposisi 100% LB dan 5% kolagen, yaitu media LBC. Hal tersebut ditunjukkan dengan nilai OD yang lebih tinggi dibandingkan dengan nilai OD dari media LBHC dan CLG. Selain itu, isolat yang ditumbuhkan pada media LBC mengalami fase kematian setelah jam ke-30. Sementara itu, isolat yang ditumbuhkan pada media LBHC dan CLG sudah mengalami fase kematian pada jam ke-10. Hal tersebut disebabkan oleh ketersediaan nutrisi yang lengkap pada media tumbuh isolat. Sel bakteri yang tumbuh subur pada suatu media menunjukkan bahwa media tersebut cocok untuk pertumbuhannya. Media yang cocok bagi pertumbuhan bakteri dapat membantu bakteri dalam menghasilkan enzim ekstraseluler selama masa pertumbuhannya. Selain itu, faktor agitasi, suhu dan pH juga mempengaruhi pertumbuhan bakteri. Pergeseran suhu dan nilai pH akan menyebabkan terhambatnya pertumbuhan bakteri (Suhartono 1992). Media LBC memiliki komposisi LB 100% dan 5% kolagen, media LBHC memiliki komposisi LB 50% dan 5% kolagen, sedangkan media CLG hanya mengandung 5% kolagen. Media LB mengandung NaCl, Tryptone, dan ekstrak khamir. Ekstrak khamir memiliki asam amino & peptida, vitamin yang larut dalam air, dan karbohidrat. Kolagen merupakan sumber nitrogen yang berperan sebagai induser. Sumber karbon yang paling
tinggi didapat pada media LBC. Ketersediaan karbon tersebut menyebabkan isolat dapat hidup lebih lama. Sementara itu, pada media CLG hanya tersedia sumber nitrogen dari protein kolagen. Hal tersebut menyebabkan isolat pada media tersebut tidak dapat tumbuh dengan baik. Kadar protein yang dihasilkan kedua isolat dari tiga media tumbuh memiliki konsentrasi yang berbeda-beda. Pada media LBC, kadar protein enzim ektrak kasar kedua isolat terus mengalami peningkatan sampai menjelang fase kematian. Sementara itu, kadar protein dari isolat yang ditumbuhkan pada media LBHC cenderung menurun setelah fase eksponensial. Pada media CLG, kedua isolat menghasilkan kadar protein dari enzim ekstrak kasar yang paling sedikit dibandingkan dengan media LBC dan LBHC. Kadar protein dari ekstrak kasar enzimnya cenderung stabil. Peningkatan kadar protein enzim dapat disebabkan oleh aktivitas bakteri selama masa pertumbuhan. Sintesis enzim ekstraseluler bakteri terjadi pada akhir fase eksponensial. Namun, enzim yang dihasilkan lebih sedikit selama fase tersebut dan terakumulasi dalam jumlah besar saat fase stasioner (Suhartono 1992). Pemurnian parsial enzim dapat dilakukan dengan mengendapkan protein menggunakan pelarut organik dan garam. Salah satu jenis garam yang dapat digunakan adalah amonium sulfat (Bollag & Edelstein 1991). Penggunaan amonium sulfat dalam proses pemekatan enzim memiliki beberapa keuntungan, diantaranya mudah didapat, harga yang relatif murah, dan dapat menstabilkan enzim. Pada proses pemekatan dengan amonium sulfat
7
terjadi proses salting out. Penambahan garam menyebabkan air yang mengelilingi protein terlepas dan terikat oleh garam, sedangkan molekul-molekul protein akan saling berikatan membentuk gumpalan. Protein dan supernatan dipisahkan dengan sentrifugasi. Endapan yang dihasilkan merupakan protein yang bebas dari zat nonprotein (Suhartono 1989). Kadar protein dari enzim semi murni memiliki konsentrasi yang lebih rendah dari enzim ekstrak kasar. Hal tersebut disebabkan oleh terpisahnya protein dengan zat nonprotein (Suhartono 1989). Namun, konsentrasi enzim semi murni terus meningkat selama masa pertumbuhan dan optimum pada akhir fase stasioner sampai fase kematian. Zimogram merupakan suatu teknik elektroforesis menggunakan gel akrilamid, sodium dodecyl sulphate (SDS), dan substrat. Sodium dodecyl sulphate (SDS) berfungsi untuk mendenaturasi protein sehingga protein dapat terpisah dan bergerak pada gel akrilamid sesuai dengan berat dan ukuran molekulnya. Protein yang sudah bergerak akibat proses elektroforesis, kemudian direnaturasi kembali oleh Triton X-100. Renaturasi protein dilakukan agar protein dapat menghidrolisis substrat pada gel dengan menginkubasi gel ke dalam bufer pada pH yang sesuai dengan aktivitas enzim. Daya katalitik protein divisualisasikan dengan merendam gel ke dalam pewarna Coomasie briliant blue hingga terbentuk fraksi atau pita bening (Baehaki et al. 2012). Hasil zimogram kedua isolat dari ketiga media tumbuh menunjukkan adanya aktivitas kolagenase. Hal tersebut ditunjukkan dengan terbentuknya pita bening pada gel akrilamid yang sudah ditambahkan kolagen. Zimogram enzim ekstrak kasar kedua isolat dari media LBC menujukkan hasil paling baik. Hal tersebut disebabkan oleh fraksi yang terbentuk terlihat lebih pekat. Sementara itu, zimogram enzim ekstrak kasar dari media CLG menunjukkan hasil yang kurang baik. Fraksi yang terbentuk pada gel tersebut terlihat sangat tipis. Zimogram enzim semi murni kedua isolat paling baik dihasilkan dari media LBC. Sementara itu, zimogram enzim semi murni kedua isolat dari media CLG tidak memunculkan fraksi. Kepekatan fraksi yang dihasilkan diduga akibat dari aktivitas enzim yang dihasilkan kedua isolat. Aktivitas kolagenase pada media CLG merupakan aktivitas terendah dibandingkan aktivitas kolagenase pada media LBC dan LBHC (Oktivianti 2012). Ketidakmunculan pita pada
gel dapat disebabkan oleh rendahnya aktivitas enzim atau hilangnya aktivitas enzim selama proses pemekatan. Hilangnya aktivitas enzim dapat disebabkan oleh perubahan suhu dan pergeseran nilai pH. Selain untuk menganalisis aktivitas enzim, zimogram juga digunakan untuk menghitung berat molekul suatu enzim. Perhitungan berat molekul dilakukan dengan menghitung jarak migrasi (rf) molekul sampel dan protein standar pada gel. Nagano dan To (1999) melaporkan bahwa zimogram dari Bacillus subtilis FS-2 menunjukan adanya aktivitas enzim kolagenase dengan berat molekul sebesar 125 kDa. Selain itu, aktivitas kolagenase juga ditunjukkan oleh hasil zimogram dari Sterptomyces sp strain 3B yang memiliki berat molekul sebesar 116 kDa & 97 kDa (Petrova et al. 2006).
SIMPULAN Aktivitas kolagenase dari Bacillus licheniformis F-11.1 & F-11.4 dapat dianalisis menggunakan teknik zimogram. Hal tersebut ditunjukkan dengan terbentuknya pita bening (fraksi) pada gel elektroforesis. Fraksi zimogram paling pekat dihasilkan dari enzim ekstrak kasar isolat yang ditumbuhkan pada media 100% LB + 5% kolagen (LBC). Isolat B. licheniformis F-11.1 menghasilkan fraksi terbanyak dari enzim ekstrak kasar yang berasal dari media tumbuh LBC sebanyak 32 fraksi. Sementara itu, isolat B. licheniformis F-11.4 menghasilkan fraksi terbanyak dari enzim ekstrak kasar yang berasal dari media tumbuh yang berisi 50% LB + 5% kolagen (LBHC), yaitu sebanyak 37 fraksi. SARAN Perlu dilakukan penentuan kondisi optimum pertumbuhan dan kadar protein kolagenase pada ketiga media, berbagai pH dan suhu. Selain itu, perlu dilakukan pemurnian enzim dan dihitung berat molekul protein enzim kolagenase dari kedua bakteri tersebut pada tiga media tumbuh. DAFTAR PUSTAKA Baehaki et al. 2012. Purification and characterization of collagenase from B. licheniformis F11.4. Afr J Micribiol Res 6: 2373-2379. Bollag DM, Edelstein SJ. 1991. Protein Methods. New York: Wiley-Liss Bond MD, Wart HE. 1984. Purification and separation of individual collagenase of Clostridium histolyticum using red dye
8
ligand chromatography. Biochem 23: 3077-3085. Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram uantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochen 72: 248-254. Chung L, Dinakarpandian D, Yoshida N, Laurel-Frields GB, Visse R, Nagase H. 2004. Collagenase unwinds triple helical collagen proir to peptida bond hydrolisis. EMBO Journal 23 : 3020-3030. Harrington DJ. 1996. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infect Immun 64: 1885-1891. Hoffmann K, Daum G, Koster M, Kulicke WM, Rammes HM, Bisping B, Meinhardt F. 2010. Genetic Improvment of Bacillus licheniformis Strains for Efficient Deproteinization of Shrimp Shells and Production of High-Molecular-Mass Chitin and Chitosan. Applied And Enviromental Microbiology 76 : 82118221. Hultmann L, Rustad T. 2004. Iced storage of Atlantic salmon (Salmo salar)-effect on endogenous enzymes and their impact on muscle protein and texture. J Food Chem. 87: 31-41. Golub LM, Siegel K, Ramamurthy NS, Mandel ID. 1976. Some characteistics of collagenase activity in gingival crevicular fluid and its relationship to gingival disease in human. J Dental Research 55: 1049-1057. Kim SK, Park PJ, Kim JB, Shahidi F. 2002. Purification and characterization of collagenase from the tissue of filefish, Novoden modestrus. J Biochem Mol Biol 35: 165-171. Lestari SD. 2005. Analisis sifat fisika, kimiawi dan rheologi gelatin kulit hiu gepeng (Alloipis sp.) dengan penambahan MgSO4, sukrosa dan gliserol. [skripsi]. Bogor: Program Studi Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Mubarik NR. 2005. Analisis Zimogram αAmilase Mikrob Toleran Basa. J Mikrobiologi Indonesia 10: 48-50. Nagano H, To KA. 1999. Purification of collagenase and specificity of its related enzyme from Bacillus subtilis FS-2. Biosci Biotechnol Biochem 63: 181-183.
Octivianti CT. 2012. Produksi dan Uji Aktivitas Kolagenase dari Bacillus licheniformis F-11.1 dan F-11.4 [skripsi]. Bogor : Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Petrova D, Derekova A, Vlahov S. 2006. Purification and properties of individual collagenases from Streptomyces sp Strain 3B. Folia Microbiol. 51:93-98. Rao MB, Tanksale AM, Ghatge MS, Deshpande VV. 1998. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiol Mol Biol Rev 62: 597-635. Ratu AP. 2007. Media Optimum Untuk Produksi Protease Dari Bacillus licheniformis F 11 [skripsi]. Bogor : Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Riley KN, Herman IM. 2005. Collagenase promotes the cellular responses to injury and wound healing in vivo. J Burns Wound 4: 112-124. Suhartono MT. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Bogor: Dirjen DIKTI, Pusat Antar Universitas (PAU) Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor. Suhartono MT. 1992. Protease. Bogor: Depdikbud, DIKTI, Pusat Antar Universitas Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor. Trismilah, Sumaryanto. 2005. Pengaruh kadar nitrogen dalam media pada pembuatan protease menggunakan Bacillus megaterium DSM 319. J Ilmu Ilmu Farm Indones 3: 9-12. Waldeck J, Daum G, Bisping B, Meinhardt F. 2006. Isolation and molecular characterization of chitinase-deficient Bacillus licheniformis strains capable of deproteinization of Shrimp Shell waste to obtain highly viscous chitin. Applied And Enviromental Microbiology 72 : 7879-7883. Yuniarti T. 2010. Purifikasi Dan Karakterisasi Kolagenase Dari Organ Dalam Ikan Bandeng (Chalos chalos Forskall) Selama Periode Kemunduran Mutu Ikan [tesis]. Bogor : Megister Sains Program Studi Teknologi Hasil Perairan, Institut Pertanian Bogor.
9
LAMPIRAN
10
Lampiran 1 Diagram Metode Pembuatan Kolagen Kulit Ikan Bandeng
Dicuci dengan air
Direndam dalam akuades (berat kulit (gr) / volume asam astat (ml)) 2:1, 3-4 jam, 50oC
Dibersihkan dari daging, lemak, dan kotoran.
Dicuci dengan air
Direndam dalam 1.5% Asam Asetat (berat kulit (gr) / volume asam astat (ml)) 1:2, 24 jam, suhu ruang
Dipotong-potong
Kolagen yang larut dalam akuades akan tidak tersaring. Kolagen tersebut digunakan untuk substrat
Kulit disaring menggunakan kertas saring
Lampiran 2 Komposisi Media Luria Bertani (LB) Agar dan media LB Cair (inokulum) No
Bahan
LB Agar (100 ml)
LB Cair (50 ml)
1
NaCl
1 gr
0.5 gr
2
Tryptone
1 gr
0.5 gr
3
Ekstak Khamir
0.5 gr
0.25 gr
4
Agar
0.15 gr
-
5
Akuades
100 ml
50 ml
Lampiran 3 Kompsisi Media Produksi LBC, LBHC, dan CLG LBHC (50 ml)
CLG (50
No
Bahan
LBC (50 ml)
1
NaCl
0.475 gr
0.237 gr
-
2
Tryptone
0.475 gr
0.237 gr
-
3
Ekstak Khamir
0.237 gr
0.118 gr
-
4
Akuades
47.5 ml
47.5 ml
47.5 ml
5
Kolagen
2.5 ml
2.5 ml
2.5 ml
ml)
Lampiran 4 Komposisi Larutan Bradford 100 ml No Bahan 1 Brilian blue G 2 Etanol 95% 3 H2PO4 4 Akuades
Jumlah 0.01 gr 5 ml 5 ml 90 ml
Komposisi Blanko, Standar, dan Sampel pada metode Bradford Bahan Blanko (ml) Standar (ml) Akuades 0.05 0
Sampel (ml) 0
11
Enzim BSA (1 mg/ml) Bradford
0 0 2.5
0 0.05 2.5
0.05 0 2.5
Lampiran 5 Komposisi Larutan BSA, Konsentrasi, dan Kurva Standar BSA a. Komposisi Bovin Serum Albumin (BSA) 10 ml No Bahan Jumlah 1 Bovin Serum Albumin 10 mg 2 Akuades 10 ml b.
Konsentrasi dan Kurva Larutan Standar Bovin Serum Albumin (BSA) Konsentrasi BSA Volume BSA (µl) Volume Bradford (µl) (mg/ml) 0 0 50 0.05 2.5 47.5 0.1 5 45 y = 0.96x + 0.2927
0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0
Blanko
2
R = 0.9724
Standar BSA
Linear (Standar BSA) 0
0.05
0.1
0.15
Kurva Standar Bovin Serum Albumin (BSA)
12
Lampiran 6 Persentase Penggunaan Amonium Sulfat Pada Proses Pemekatan Protein
13
Lampiran 7 Komposisi dan cara membuat Larutan 50 mM Bufer Fosfat pH 7 250 ml Sebanyak 1.724 gr NaH2PO4 dilarutkan kedalam 250 ml akuades. Larutan tersebut akan menjadi larutan A. Selanjutnya, sebanyak 2.22 gr Na2HPO4 dilarutkan kedalam 250 ml akuades. Larutan tersebut akan menjadi larutan B.Kemudian, nilai pH pada larutan B diukur menggunakan pH meter. Setelah itu teteskan larutan A ke larutan B sampai pH larutan B menjadi 7. Lampiran 8 Metode Zimogram
Persiapan Alat dan Bahan 1. Alat yang digunakan adalah BIO-RAD.Bahan yang digunakan adalah akrilamid, bis-akrilamid, TEMED, dan APS. 2. Pemasangan alat elektroforesis SDS-PAGE (BIORAD). 3. Pengecekan kebocoran pada plat elektroforesis dengan memasukkan akuades kedalam plat tersebut. Pembuatan Gel Pemisah 1. Pembuatan larutan gel pemisah 2. Injeksi larutan gel pemisah ke plat elektroforesis 3. Pengerasan gel 15-20 menit Pembuatan Gel Penahan 1. Pembuatan larutan gel pemisah 2. Injeksi larutan gel pemisah ke plat elektroforesis 3. Pemasangan sisir 4. Pengerasan gel 15-30 menit
Persiapan Sampel 1. Pencampuran 10µl bufer sampel dengan 40 µl enzim (sampel) 2. Injeksi sampel ke dalam masing-masing sisir.
Running
Running gel dengan BIO RAD pada kekuatan 70 volt/50 Ampere.
Perendaman gel dalam 2.5% Triton X100 selama 1 jam di shaker waterbath
14
Inkubasi gel menggunakan 50mM bufer fosfat pH 9 di inkubator 37oC selama 24 jam
Pewarnaan gel dengan Coomassie Briliant Blue di shaker waterbath (Certomat WR) 110 rpm
Lampiran 9 Komposisi Gel Penahan dan Gel Pemisah Nama Bahan Gel Pemisah 12% Akrilamid (larutan A) 4.2 ml Bufer Gel Pemisah 2.5 ml (larutan B) Bufer Gel Penahan (larutan C) Kolagen 1 ml Akuades 2.1 ml 1% APS 0.1 ml TEMED 0.01 ml
Gel Penahan 4% 0.65 ml 1.25 ml 3 ml 0.05 ml 0.005 ml
Lampiran 10 Komposisi Larutan Akrilamid, bufer gel pemisah, dan bufer gel penahan Nama Bahan 30% (b/v) Akrilamid 0.8% (b/v) BisAkrilamid 1.5 M Tris-HCl pH 8.8 1.5 M Tris-HCl pH 6.8 10% SDS Akuades Steril
Akrilamid 100 ml (Larutan A)
Bufer Gel Pemisah 100 ml (Larutan B)
Bufer Gel Penahan 100 ml (Larutan C)
30 gr
-
-
0.8 gr
-
-
-
75 ml
-
-
-
50 ml
100 ml
4 ml 21 ml
4 ml 46 ml
Lampiran 11 Komposisi Larutan Bufer Sampel No Bahan 1 60 mM Tris-HCl pH6.8 2 50% Gliserol 3 10% SDS 4 1% Bromophenol Blue 5 Akuades steril
Jumlah 0.6 ml 5 ml 2 ml 1 ml 0.9 ml
Lampiran 12 Komposisi Bufer Elektroforesis pH 8.3 No Bahan 1 Tris 2 Glysin 3 SDS
Jumlah 1.51 gr 7.20 gr 0.2 gr
9.5 ml
500 ml
15
Lampiran 13 Komposisi dan cara membuat Larutan 50 mM Bufer Fosfat pH 9 250 ml Sebanyak 1.724 gr NaH2PO4 dilarutkan kedalam 250 ml akuades. Larutan tersebut akan menjadi larutan A. Selanjutnya, sebanyak 2.22 gr Na2HPO4 dilarutkan kedalam 250 ml akuades. Larutan tersebut akan menjadi larutan B. Kemudian, nilai pH pada larutan B diukur menggunakan pH meter. Setelah itu larutan A diteteskan ke larutan B sampai pH larutan B menjadi 9.
Lampiran 14 Komposisi Larutan Pewarna Gel (Staining) dan Peluntur (Destaining) Pewarna Gel Peluntur No Bahan 200 ml 200 ml 1 Coomassie Briliant Blue 0.2 gr 2 Metanol 90 ml 20 ml 3 Akuades Steril 90 ml 160 ml 4 Asam Asetat Glasial 20 ml 20 ml
