Využití variability DNA ve studiu příbuzenských vztahů linií a rodin plemene koně genové rezervy 1. ÚVOD

Využití variability DNA ve studiu příbuzenských vztahů linií a rodin plemene koně genové rezervy

1. ÚVOD Předmětem ochrany se stávají stále častěji nejen divoce ţijící druhy ţivočichů, ale také tradiční a původní plemena hospodářských zvířat. Důvody k jejich ochraně jsou velmi rozmanité od kulturně historických, zájmových, ekologických atd. aţ po čistě utilitární – tato plemena mohou slouţit jako rezervoár těch genů a alel, které byly u vysoce produktivních kulturních plemen eliminovány. Má-li být tento poţadavek uspokojen, stejně tak jako má-li být zajištěno přeţití a udrţena ţivotaschopnost těchto často málopočetných plemen (z nichţ mnohá jsou na hranici vyhynutí), je nutno udrţet jejich genetickou variabilitu na co moţná nejvyšší úrovni. K tomuto účelu jsou rozpracovány různé chovatelské postupy, které se ovšem neobejdou bez důkladné genetické analýzy. Míra polymorfismu těchto plemen, zejména pak jsou-li vystavena inbreedingu, je důleţitou charakteristikou takové analýzy (Frankham, 1995). Polymorfní genetické markery se mohou pouţívat nejen k mapování rozsahu a rozloţení polymorfismu ve sledovaných populacích, ale mohou téţ poslouţit jako základ pro vytvoření strategií na zachování jejich variability. Nástrojem k takovým genetickým analýzám, který zejména poslední dvě dekády zaznamenává bouřlivý rozvoj, je zkoumání polymorfismu DNA, především pak mikrosatelitní a mitochondriální.

6

Využití variability DNA ve studiu příbuzenských vztahů lini a rodin plemene koně genové rezervy

2. LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1. Polymorfismus DNA – nástroj genetické analýzy Nástup masivního vyuţívání variability DNA pro potřeby identifikace individuí, určování parentity i studia příbuzenských vztahů mezi jednotlivci či skupinami různé taxonomické úrovně spadá do 2. poloviny 80. let minulého století. Zásadní vliv na to měl mohutný rozvoj tzv. DNA technologií, které nesmírně urychlily a zjednodušily analýzu DNA, zejména pak metoda PCR vynalezená r. 1985 Kary Banksem Mullisem (Nobel Foundation official web site; Kary Mullis' personal website), a dále metody automatizovaného sekvenování. Uţitím těchto technik se analýza DNA stala rutinní záleţitostí. Identifikační metody pomocí analýzy polymorfismů DNA rozpracoval A. Jeffreys, (Jeffreys et al., 1985 a,b,c) ve formě DNA fingerprintingu a jako první pouţil těchto metod v praxi k určení parentity a totoţnosti (Aronson 2005). Brzy nato se techniky DNA fingerprintingu (téţ DNA typing, DNA profiling, genetic profiling, otiskování nukleové kyseliny, dle Rosypal et al. 2001) začaly prosazovat i v chovu domácích a hospodářských zvířat (Buitkamp et al. 1991).

7


2.2. Organizace a struktura genomu DNA eukaryontních buněk se nachází jednak v jádře, jednak mimo jádro v tzv. semiautonomních organelách (obr. 1 a 2, tab. 1). U ţivočichů jsou tyto semiautonomní organely zastoupeny mitochondriemi. Ke genetickému testování ţivočichů se pouţívá obou těchto typů DNA.

Obr. 1: Rozložení jaderné a mimojaderné (zde mitochondriální) DNA v buňce

Mitochondriální a nukleární DNA je zde zobrazena pomocí fluorescenční mikroskopie. Tato mikrofotografie ukazuje rostoucí buňku bičíkovce Euglena gracilis. Buňka je obarvena směsí ethidium bromidu a DiOC6, která způsobuje červenou fluorescenci jaderné DNA a zelenou mtDNA. Místa bohatá na mtDNA emitují ţluté světlo. (Darnell et al. 1990, str. 686, in: Říha (2000) Mitochondrie)

8


Tab. 1: Souhrn znaků semiautonomních organel  Mají vlastní DNA prokaryontního typu.

 Jsou schopny proteosyntézy pomocí vlastních ribosomů prokaryontního typu.

 Jsou kryty dvěma membránami.

 Probíhá v nich energetický metabolismus.

 Vznikly endosymbiózou raných eukaryot s prokaryontními organismy.

 Velikostí se podobají bakteriím.

 Dlouhodobým souţitím s hostitelskou buňkou ztratily schopnost samostatného přežití, protoţe se redukoval jejich genom a proteosyntetický aparát

 Jsou schopny samostatné reprodukce, mnoţí se v buňkách dělením do značné míry nezávisle na hostitelské buňce – jinak vznikat nemohou. Jejich počet je však regulován genetickou informací jádra. Ta také řídí takřka rovnoměrné rozdělení semiautonomních organel do dceřiných buněk.  Mají matrilineární dědičnost

Savčí genom je z převáţné části tvořen jaderným genomem. U člověka, kterého jakoţto typického savce lze pokládat za vhodný modelový organismus a jehoţ genom byl kompletně zmapován díky projektu lidského genomu HPG (Human Genome Project Information), činí podíl jaderného genomu 99,9995 % a na mitochondrie zbývá 0,0005 %, viz obr. 2 (Strachan and Read 1999, Human Genome Project Information XII-2007).

9


Obr. 2: Organizace DNA sekvencí lidského genomu (Strachan and Read 1999, s. 139; Hruban et al. 1999, s. 70)

SINE = short interspersed elements = krátké vtroušené elementy LINE = long interspersed elements = dlouhé vtroušené elementy

* Podle současných zjištění je lidský jaderný genom tvořen 3 164,7 Mpb a počet jaderných genů se odhaduje na 30 000 (Human Genome Project Information (XII-2007)

10


2.2.1. Jaderná DNA Jaderná DNA je rozdělena do druhově specifických útvarů zvaných chromozómy. Kůň domácí (Equus caballus) má 64 chromozómů, z toho 31 párů autozómů a 2 gonozómy. DNA se v jaderných chromozómech nachází v komplexu se specifickými proteiny, zejména histony, s nimiţ vytváří tzv. nukleohistonové vlákno, neboli nukleohistonový komplex (Brown 1999, Kočárek 2004). Podle dosavadních zjištění HPG méně neţ 2 % lidského jaderného genomu kóduje proteiny. Repetitivní sekvence tvoří přinejmenším 50 % lidského genomu. Přitom však 99,9 % nukleotidových bází je u všech lidí stejných (Human Genome Project Information XII-2007). Ke genetickým analýzám se dá pouţít jakékoli části genomu, jako výhodnější se ovšem jeví vyuţití nekódujících, resp. extragenových sekvencí (viz obr. 2), které obecně vykazují větší variabilitu neţ kódující (Brown 1999). Pro své první genetické analýzy Jeffreys pouţil tzv. minisatelity (Jeffreys et al. 1985 a, b, c). Minisatelity spolu s mikrosatelity patří do skupiny tandemových repetitivních sekvencí extragenové DNA, které jsou tvořeny opakujícími se nukleotidovými motivy různého typu řazenými za sebou. Jejich variabilita spočívá v různém počtu opakování těchto motivů v daném lokusu u různých jedinců téhoţ druhu – různé alely jsou tedy tvořeny různými počty opakování týchţ nukleotidových motivů. Dědičnost mini- i mikrosatelitů je mendelistická. Minisatelity dosahují délky aţ 20 kb, přičemţ opakující se jednotka můţe mít aţ 25 bází. Mikrosatelity se skládají z desetkrát aţ dvacetkrát opakovaných mono-, di-, tri- nebo tetranukleotidových motivů (obr. 3). Koncem 80. let se DNA fingerprinting pomocí minisatelitů rozšířil po celém světě a stal se mezinárodním standardem pro genetické testování. Jeffreys si však uvědomoval limity této techniky - pokládal ji za pomalou, nepříliš citlivou a zastaralou. Proto svou pozornost zaměřil na mikrosatelity, které díky své délce kolem sta párů bází oproti několika tisícům párů bází minisatelitů poskytovaly dostatečně vari-

11


abilní lokusy, avšak snadněji amplifikovatelné a zároveň odolnější vůči degradaci (Zagorski 2006). I v této věci má Jeffreys světový primát, kdyţ jako první pouţil mikrosatelity k identifikaci ostatků nacistického lékaře Josefa Mengeleho (Jeffreys et al. 1992).

Obr. 3: Schematické znázornění mikrosatelitu 1. chromozóm (1. alela) 5´

3´ CATCATCATCATCATCAT GTAGTAGTAGTAGTAGTA

3´

5´

2. chromozóm (2. alela) 5´

3´ CATCATCAT GTAGTAGTA

3´

(CAT)n

5´

=

mikrosatelitní repetitivní motiv primery

Po několika letech tato technika nahradila DNA fingerprinting pomocí minisatelitů a stala se novým standardem pro forenzní vědu (Zagorski 2006). Ačkoliv jsou mikrosatelity relativně krátké, vyskytují se v genomu hojně a jsou v něm více méně rovnoměrně rozprostřeny. Například u člověka mikrosatelity s motivem CA jako 5´- CACACACACACACACA-3´ 3´- GTGTGTGTGTGTGTGT-5´ tvoří aţ 0,5 % genomu, celkem 15 Mb.

12


Mikrosatelity sloţené z jedné báze typu 5´- AAAAAAAAAAAAA-3´ 3´- TTTTTTTTTTTTT-5´ tvoří další 0,3 % (Brown 1999).

Obecně v genomu savců bývá motiv (CA)n, resp. (AC)n zastoupen nejvíce. K dalším často se vyskytujícím motivům patří např. (GATA)n, (GACA)n, (CAC)n. U koní je jedním z nejrozšířenějších vysoce polymorfní motiv (TG)n, jehoţ podíl na celkové délce nukleární DNA je přibliţně 1 ku 100 000 bp. (Hamanová, 2005). U koní se mikrosatelity označují velkými písmeny, přičemţ jednotlivá písmena označují určitou alelu (Burócziová et al., 2005). Funkce mikrosatelitů v genomu nebyla dosud uspokojivě objasněna, avšak z dosavadních studií vyplývá, ţe jejich distribuce patrně není náhodná. Vyskytují se např. u promotorů kódujících sekvencí, přičemţ tyto promotory slouţí také jako zesilovače (Zima et al., 2004). Předpokládá se, ţe některé z mikrosatelitů jsou schopny vázat specifické regulační proteiny. Podílejí se pravděpodobně na organizaci chromatinu, regulaci exprese genů, rekombinaci, replikaci a reparaci DNA a zřejmě téţ hrají nějakou roli v buněčném cyklu (Kraic, 2005). Délka mikrosatelitních repeticí můţe podle některých studií dokonce ovlivňovat fyziologii a ontogenezi – uvádí se např. souvislost mezi extrémním zmnoţením repeticí a některými váţnými vývojovými poruchami, jako mentální retardace. (Zima et al., 2004). Mikrosatelity se široce vyuţívají téţ jako vysoce informativní genetické markery při analýzách populací, které umoţňují detekci případů porušení genetické rovnováhy v důsledku selekce, migrace, náhodného genetického driftu, stejně jako stanovení stupně inbreedingu (Dovc et al. 2006). Některé práce ukazují, ţe mikrosatelity mohou být pouţity ke zjištění příslušnosti jedince k jednotlivé populaci či subpopulaci (Rannala and Mountain, 1997; Cornuet et al., 1999). Ověřením této teorie pomocí porovnání analýzy mikrosatelitních markerů a analýzy na základě rodokmenových informací u simulované populace se zabývali Baumung and Sőlkner (2003).

13


2.2.1.1. Využití mikrosatelitní DNA v genetických studiích u koní U koní se polymorfismu mikrosatelitní DNA vyuţívá mj. k určování původu a příbuzenských vztahů jedinců i populací a k odhadům genetické diverzity. Např. Hořín et al. (1998) pouţil analýzy 12 mikrosatelitů (spolu s některými dalšími polymorfickými systémy) ke studiu polymorfismu, heterozygotnosti a genetických distancí u starokladrubských koní. Jednalo se o tyto lokusy: AHT4, AHT5, ASB2, HMS2, HMS3, HMS6, HMS7, HTGG, HTG4, HTG7, HTGl0 a VHL20. Zjistil, ţe vraníci a bělouši vykazují blízkou genetickou příbuznost, avšak průměrná genetická distance mezi nimi ţe je na úrovni dvou různých plemen. Heterozygotnost u lipicánů na základě analýzy 17 mikrosatelitních lokusů na 14 chromozómech (AHT4, AHT5, AHT21, HMS1, HMS2, HMS6, HMS7, HMS8, HTG4, HTG6, HTG7, HTG10, LEX053, UCDEQ405, UCDEQ437, UCDEQ505 a VHL20) sledovali Curik et al. (2003). Rozsáhlou studii genetické diverzity lipicánů provedli téţ Achmann et al. (2004). V rámci této studie byl vyhodnocen 561 lipický kůň ze 7 evropských zemí a 47 kladrubských koní. Na základě analýzy 22 mikrosatelitních lokusů na 16 chromosomech (AHT4, AHT5, AHT21, ASB2, HMS1, HMS2, HMS3, HMS6, HMS7, HMS8, HTG4, TG6, HTG7, HTG10, LEX053, LEX054, MPZ002, NVHEQ18, UCDEQ405, UCDEQ437, UCDEQ505 a VHL20) bylo stanoveno, ţe genetická diverzita u lipicánů je obdobná jako u jiných plemen a ţe mezi lipicány z různých hřebčínů existuje sice mírná, avšak zřetelná genetická odlišnost. Byly objeveny tři genetické skupiny: skupina tvořená subpopulacemi Rakouska, Slovinska a Itálie a reprezentující chov lipicánů v nejklasičtější podobě; skupina sloţená z chorvatské, slovenské a maďarské subpopulace a nakonec rumunská subpopulace, která tvoří zvláštní genetickou jednotku. Největší genetická odlišnost byla zaznamenána mezi rumunskou a italskou subpopulací. Genetická rozdílnost lipicánů a kladrubských koní je jasně patrná. Dále bylo zjištěno, ţe výsledky genetického rozboru odpovídají historickým faktům. Správnost chovatelské dokumentace byla potvrzena u 80,9%, resp. 91,1% lipických koní (v závislosti na tom, zda z dokumentace byla vyloučena zvířata získaná odjinud).

14


Azor et al. (2007) se zaměřili na španělské klusáky (Trotador Español), plemeno vzniklé kříţením klisen původních baleárských plemen s orlovskými, francouzskými a americkými klusáky. Bylo pouţito 16 mikrosatelitních markerů ke genetické analýze 40 vzájemně nepříbuzných španělských klusáků, 25 původních baleárských koní (Menorquina – 11koní, Mallorquina – 14 koní) a 32 andaluských koní. Bylo zjištěno, ţe průměrná heterozygotnost i průměrný počet alel na lokus je u španělských klusáků srovnatelný s hodnotami jiných plemen. Dále bylo potvrzeno, ţe příbuznost mezi španělskými klusáky a baleárskými plemeny je v současné době nízká, coţ znamená, ţe genofond současných španělských klusáků není zaloţen na původních populacích baleárských koní.

Všechny zde citované práce konstatují, ţe dosaţených výsledků a závěrů lze velmi dobře vyuţít k vývoji chovatelských strategií zaměřených zejména na zachování genetické diverzity.

15


2.2.2. Mitochondriální DNA 2.2.2.1. Obecná charakteristika Obr. 4: Zobrazení mtDNA v elektronovém mikroskopu

Cvrčková 1994, str. 428, in: Říha (2000) Mitochondrie

Mitochondriální DNA se od jaderné DNA liší v mnoha ohledech. Především se dědí téměř výhradně maternálně (Hutchison et al. 1974), ojedinělé případy průniku mitochondrií ze spermie do vajíčka jsou pozorovány velmi vzácně (Kondo et al. 1990, Gyllensten et al. 1991, Avise 1991, Kaneda et al., 1995). Není vázána v komplexu s proteiny. Nemá schopnost rekombinací, takţe její genetická rozmanitost je vytvářena mutacemi (Brown 1985; Hagelberk et al., 1999; Hruban et al. 1999; Pesole et al. 1999). V mitochondrii se vyskytuje v několika identických exemplářích, někdy však dochází k tzv. heteroplazmii, kdy některá molekula mtDNA zmutuje a v jednom organismu, případně i v jedné buňce či mitochondrii se pak mohou vyskytovat rozdílné molekuly mtDNA (Hruban et al. 1999). Další významnou specifikou mtDNA je genetický kód, který se liší nejen od jaderného, ale i mezi mitochondriemi jednotlivých druhů organismů, viz tab. 2 (Říha 2000).

16


Tab. 2: Odlišnosti mitochondriálního genetického kódu Kodón UGA AGA AGG AUA AUU CGG CUU CUC CUA CUG

Jaderné geny prokaryí eukaryí, chloroplasty Stop

i

Mitochondrie Savci Drosophila Neurospora Kvasinky Rostliny Trp Trp Trp Trp Stop

Arg

Stop

Ser

Arg

Arg

Arg

Ileu Ileu Arg

Met Met Arg

Met Met Arg

Ileu Met Arg

Met Met Arg

Ileu Ileu Arg+Trp

Leu

Leu

Leu

Leu

Thr

Leu

(Darnell et al.1990, str.690, in: Říha (2000) Mitochondrie)

Mitochondriální genom má řadu pozoruhodných a odporujících si vlastností. Především je velmi rozmanitý. Jeho velikost se pohybuje od 6 kpb (prvoci Plasmodium sp., původci malárie) aţ po více neţ 2000 kpb u některých vyšších rostlin (Cucurbitae). U většiny eukariot však kolísá mezi 15 – 60 kpb (Burger et al., 2003, Brown 1999, Říha 2000). Obsah mitochondriálního genomu se pohybuje od 100 genů u „jakobid“ (Jakoba sp. – bičíkovci, kteří by dle Edgcomb et al. (2001) a Burger et al. (2003) mohli představovat raná mitochondriální protista) aţ po pouhých pět u plasmodií (Burger et al. 2003). Dále je nutno zmínit velmi rozmanitou organizaci a podíl kódujících a nekódujících oblastí DNA. Např. u vláknité houby Podospora anserina se na celkové délce mtDNA kódující sekvence podílejí 25 procenty, zatímco mitochondriální genom savců je velmi úsporný a kondenzovaný (některé geny se např. u koní dokonce překrývají, viz Xu and Árnason 1994) a podíl nekódujících sekvencí je menší neţ 10 % (Brown 1985, Říha 2000, Xu and Árnason 1994). Donedávna se mělo za to, ţe DNA se u většiny organismů v mitochondriích vyskytuje ve formě jednoho kruhového „chromozómu“, byť ve více identických kopiích (Boore 1999, Říha 2000) - s výjimkou heteroplasmie, coţ je jev, kdy v jednom organismu nebo dokonce i v jednotlivých buňkách se vyskytují mutované varianty DNA (Hruban et al. 1999, Říha 2000). V současné době však přibývají přesvědčivé důkazy, ţe značná část mtDNA, pokud ne většina, se primárně vyskytuje ve formě lineárních

17


molekul. Z mnohobuněčných ţivočichů mají jednu lineární molekulu mtDNA například některá Cnidaria (ţahavci), u řady organismů se však mtDNA skládá z několika oddělených lineárních molekul. Jako naprosto extrémní případ se v tomto směru jeví prvok Amoeboidium parasiticum, jehoţ mtDNA se skládá z několika set různých typů lineárních molekul (Lang et al. 2002). Co se týče ţivočichů vybavených cirkulární mtDNA, i zde byly objeveny případy s několika různými molekulami – např. u háďátka Globodera sp. a morulovce rodu Dicyema (Burger et al. 2003). Mitochondriální genom parazitických bičíkovců rodu Trypanosoma sestává dokonce z několika tuctů velkých „maxikruţnic“ kódujících geny, a několika tisíců „minikruţnic“, které specifikují řídící RNA (guide RNA, gRNA), podílející se na editování mitochondriální mRNA. Navzdory vysoké genetické plasticitě si však jsou všechny typy mitochondrií funkčně velmi podobné. Lze prohlásit, ţe často bizarní rozdíly ve struktuře a evoluční dynamice jejich genomů se na funkci mitochondrií neprojevují (Říha 2000).

18


2.2.2.2. Savčí mtDNA Savčí mitochondriální DNA má naproti tomu poměrně jednotnou stavbu. Co se týče zastoupení bází, v kompletní molekule je pár G-C zastoupen 41 % a pár A-T 59%. Dva řetězce kruhového mitochondriálního chromosomu mají nerovnoměrný podíl G- a C- bází, coţ způsobuje rozdílné hmotnosti řetězců. Řetězec s převahou guaninu se nazývá těţký řetězec a označuje se H-strand (heavy strand), řetězec s převahou cytosinu je lehčí, nazývá se tedy lehký řetězec, neboli L-strand (light strand). V lehkém řetězci (L-strand) jsou jednotlivé báze zastoupeny v tomto poměru: A 32,2 %; C 28,5 %; G 13,4 %; T 25,9 % (MITOMAP 2007). Rozměr molekuly mtDNA se pohybuje kolem16,5 kpb (Říha 2000), genom je úsporný a podíl nekódujících sekvencí je malý. Mitochondriální chromozóm je kruhový. Obsahuje vţdy těchto 37 genů: 2 pro rRNA, 13 pro proteiny a 22 pro tRNA (Boore 1999, Brown 1985, Říha 2000, Xu and Árnason 1994, MITOMAP 2007; viz obr. 5 a tab. 3) Obr. 5: Stavba lidské mtDNA. Transkripce vnějšího vlákna, H-strand (těžký řetězec), probíhá pouze ve směru hodinových ručiček; transkripce vnitřního, L-strand (lehký řetězec), proti směru.

Pytlík 1996, str. 553–6, in: Říha (2000) Mitochondrie

19


Nejproměnlivějším úsekem mtDNA je její hlavní nekódující oblast, tzv. oblast D-smyčky (D-loop region) nebo téţ kontrolní oblast. Tento úsek obsahuje hlavní regulační prvky pro replikaci a expresi mitochondriálního genomu. Jeho název je odvozen od třívláknové struktury v podobě vytěsněné (displacement) smyčky, která se tvoří při replikaci nově vznikajícím těţkým řetězcem vytěsňujícím rodičovský Hstrand. Struktura oblasti D-smyčky vykazuje výrazné mezidruhové rozdíly. Její délka kolísá mezi 800 aţ1400 pb, můţe se však ještě značně zvětšit díky repetitivním sekvencím, které se vyskytují u některých druhů (Sbisà et al. 1997). Frekvence nukleotidových substitucí se u mitochondriální DNA uvádí obvykle jako 5 aţ 10 krát vyšší neţ u jaderné DNA (Brown et al. 1979), to je však značně zjednodušující pohled. Frekvence nukleotidových substitucí je v různých úsecích mitochondriální DNA různá – například v nekódující kontrolní oblasti (D-loop) je u člověka podle odhadu 2,8 aţ 5krát vyšší neţ ve zbytku mitochondriálního genomu (Aquadro and Greenberg, 1982, Cann et al. 1984). Některé úseky vykazují frekvence nukleotidových substitucí srovnatelné s jadernými, jiné však mutují 20 krát (např. lokus malé rRNA), některé dokonce aţ 100 krát rychleji (tRNA) neţ jejich jaderné protějšky (Pesole et al. 1999). Ke genetickým studiím byla mitochondriální DNA poprvé vyuţita v polovině 80. let Mary Claire Kingovou v cause Abuelas de Plaza de Mayo. Jednalo se o prokázání biologické příbuznosti mezi osiřelými dětmi a jejich prarodiči. Pouţití jaderné DNA bylo v tomto případě problematické vzhledem k tomu, ţe na dítě přenáší od kaţdého rodiče jen 50 % jaderné DNA. Bylo by tedy nutné analyzovat DNA všech čtyř prarodičů, aby bylo moţno s jistotou určit původ dítěte. Pokud by jeden nebo dva z prarodičů nebyli k dispozici, identifikace dítěte by nemohla být jednoznačná. Proto Kingová dala přednost mitochondriální DNA. Pouţila úsek o 600 pb, jehoţ variabilita je tak vysoká, ţe určení příbuzenských vztahů dětí bylo nezpochybnitelné (Genetic Testing Methodologies, 2010). Analýza mitochondriální DNA se osvědčila i jako nástroj zkoumání vnitro- i mezidruhové variability, struktury plemen a populací a fylogeneze (Mirol et al., 2002). Variabilita D-loop oblasti se široce vyuţívá i při výzkumu původu a příbuzenských vztahů u koní (Ishida et al., 1994 a, b; Marklund et al., 1995; Dovc et al., 1996; Bowling et al., 2000; Kavar et al., 1999). 20


2.2.2.3. Charakteristika koňské mtDNA Mitochondriální DNA koně domácího (Equus caballus) je tvořena zhruba 16660 pb včetně přibliţně 1200 pb dlouhé kontrolní oblasti, která obsahuje mj. různý počet opakujících se 8nt identických motivů. Díky tomu je délka kontrolních oblastí a potaţmo s tím i celých molekul mitochondriální DNA u různých zvířat různá (tab. 3). Xu a Árnason (1994) stanovili délku kontrolní oblasti u svého vzorku na 1192 pb, přičemţ v ní objevili souvislou řadu opakujícího se osminukleotidového motivu 5´-CTGCACCT-3´ (Xu and Árnason 1994). Ishidova skupina provedla rozbor Dsmyčky mtDNA tří nepříbuzných anglických plnokrevníků a zjistila délku 1114 pb, 1115 pb a1146 pb. Repetitivní sekvence byly tvořeny různými počty tandemových repetic osminukleotidového motivu TGTGCACC, v případě prvních dvou vzorků jich bylo 18, v případě třetího vzorku 22 (Ishida et al. 1994a). V obou případech se potvrzuje Ishidovo zjištění, ţe jde o strukturu bohatou na G/C páry (Ishida et al. 1994a). Zastoupení jednotlivých bází v lehkém řetězci D-smyčky u koní udává Ishida et al. (1994a) takto: A 314 – 321 (28,0 – 28,5 %); C 339 – 351 (30,4 – 30,6 %); G 163 – 171 (14,6 – 14,9 %); T 294 – 303 (26,4 – 26,6 %).

21


Tab. 3: Lokalizace jednotlivých struktur v molekule mtDNA koně (Equus caballus). (Xu and Árnason, 1994)

Charakreristiky oblastía

polohab do

od tRNA - Phe 12S rRNA tRNA - Val 16SrNA tRNA - Leu(UUR) NADH 1 tRNA - Ile tRNA - Gln tRNA - Met NADH 2 tRNA - Trp tRNA - Ala tRNA - Asn Or.L-strand replication tRNA - Cys tRNA - Tyr Co I tRNA-Ser(UCN) tRNA - Asp Co II tRNA - Lys ATPasa 8 ATPasa 6 Co III tRNA - Gly NADH 3 tRNA-Arg NADH 4L NADH 4 tRNA - His tRNA - Ser(AGY) tRNA - Leu(CUN) NADH 5 NADH 6 tRNA - Glu Cyt b tRNA - Thr tRNA - Pro Control region (1192 pb) a

1 1 2 2 3 3 3 3 4 5 5 5 5 5 5 6 6 7 7 7 7 8 9 9 9 9 10 11 11 11 11 14 14 14 15 15 1

1 71 046 113 694 771 727 865 868 937 976 119 193 194 293 360 362 972 981 048 735 804 965 645 429 498 845 915 205 583 652 713 783 114 183 188 328 468 549

1 1 2 2 3 3 3 3 4 5 5 5 5 5 5 6 6 7 7 7 8 8 9 9 9 9 10 11 11 11 11 13 13 14 15 15 15 16

70 045 112 693 768 727 795 793 936 977 045 121 121 225 226 294 906 904 047 731 802 007 645 427 497 842 913 211 581 651 711 782 603 587 155 327 401 403 660

(L)

(L) (L) (L) (L) (L)

(L) (L)

(L)

Struktury zahrnují tRNA, rRNA, geny kódující proteiny, lokus ori lehkého řetězce a kontrolní oblast.

Antikodony dvou tRNA – Leu a dvou tRNA – Ser jsou v závorkách. b

Pozice zahrnují i 5´ a 3´nt kaţdé struktury. Pozice 1 je přiřazena 5´ konci tRNA – Phe. (L) značí lehký řetězec

(L-strand). CO III, NADH3 a NADH4 nejsou zakončeny stop kodony. Molekula obsahuje 29 repetitivních motivů v kontrolní oblasti. Acession-No koňské mtDNA je EMBL X7954 (Xu and Árnason, 1994).

22


2.2.2.4. Využití mtDNA v genetických studiích u koní Rozsáhlá studie koňské mtDNA byla iniciována sekvenční analýzou D-smyčky (Ishida et al. 1994a) a stanovením úplné sekvence mtDNA (tab. 3, Xu and Árnason 1994). V současné době existují tisíce titulů zabývajících se touto problematikou, a proto v této práci budou citovány jenom některé studie nejbliţší jejímu zaměření. Marklund et al. (1995) odhalili pomocí analýzy mtDNA u souboru 78 koní nepříbuzných po mateřské linii 15 různých vzorků SSCP a u 4 rodin, sledovaných po 5 generací od společné klisny zakladatelky, byla zjištěna přesná a stálá maternální dědičnost. Stálá dědičnost mitochondriálních haplotypů byla zjištěna i uvnitř rodin 49 lipických klisen, přičemţ zde nebyly pozorovány ţádné sekvence, jeţ by bylo moţno pokládat za mutace. Šestnáct rodin, reprezentovaných těmito klisnami, bylo na základě sekvenační analýzy seskupeno do 13 odlišných mitochondriálních haplotypů. Analýza SSCP u nich odhalila 3 různé skupiny vzorků SSCP (Kavar et al. 1999). Na tuto práci navázala sekvenační analýza kontrolní oblasti mtDNA 212 lipicánů ze 7 hřebčínů. Bylo odhaleno 37 různých haplotypů. Ze srovnání sekvencí lipicánů se 136 sekvencemi domestikovaných a divokých koní uloţenými v GenBank vyplynulo, ţe lipické sekvence jsou přítomné ve většině haplotypových podskupin i jiných domácích koní. Zároveň bylo zjištěno, ţe většina ze 47 polymorfismů se vyskytuje na 5´ konci kontrolní oblasti mtDNA, zatímco na 3´ konci jich bylo nalezeno jen 14. (Kavar et al. 2002). Bowling et al. (2000) pomocí srovnávací sekvenační analýzy hypervariabilní oblasti mtDNA zkoumali matrilineární diverzitu 62 arabských koní chovaných v USA, kteří podle rodokmenů pocházeli z 34 originálních pouštních arabských klisen dovezených do USA v polovině 19. století. Bylo objeveno 27 haplotypů s celkovým počtem 31 substitucí v úseku o 397 pb, coţ podle odhadu činí 89 % veškerých haplotypů arabských koní registrovaných v USA. Byla téţ potvrzena spolehlivost záznamů o mateřských liniích v plemenných knihách. Studie dále demonstrovala vhodnost sekvenační analýzy mtDNA pro řešení otázek sporné maternity a zpochybnila tradiční předpoklad, ţe arabští koně z téhoţ kmene nutně musí pocházet ze společné zakladatelky. 23


Analýzy 381 pb dlouhého úseku D-loop oblasti u 100 anglických plnokrevníků z 19 nejrozšířenějších rodin bylo pouţito k rekonstrukci populace klisen zakladatelek plemene (v období kolem let 1650-1750). V rámci těchto 19 rodin bylo nalezeno 17 haplotypů. Pouţita byla metoda SSCP i přímá sekvenace. Bylo zjištěno, ţe téměř polovina samičích linií podle rodokmenů odvozovaných od některé z asi 30 historicky uznávaných zakladatelek obsahuje sekvence, které vylučují společný původ. Autoři to přičítají záměnám jednotlivých klisen v zakladatelském období (Hill et al. 2002). Luís et al. (2002) se zaměřili na srovnání kontrolních oblastí mtDNA u dvou přeţívajících rodin původního španělského plemene Soraia. Nalezli dva haplotypy lišící se mezi sebou ve třech lokusech. Autoři konstatují, ţe takto extrémně nízký počet přeţívajících mateřských linií vyţaduje vytvoření plánu pro udrţovací šlechtění tohoto ohroţeného plemene. Stejný tým provedl v roce 2006 výzkum variability kontrolní oblasti mtDNA iberských plemen a plemen Nového světa sekvenační analýzou, aby zjistil jejich příbuznost a aby ověřil historický původ koní Nového světa. Bylo testováno celkem 153 vzorků reprezentujících 30 iberských a amerických plemen. Bylo nalezeno 44 haplotypů sdruţených do sedmi skupin. Sníţená úroveň variability zaznamenaná u plemen Menorquina, Soraia a Sulphur Mustang je způsobena tzv. průchodem genetickým „hrdlem láhve“ (bottleneck – výrazné omezení genetické variability v důsledku velmi tvrdé selekce nebo jiného faktoru, který způsobí drastický pokles četnosti populace a díky tomu i její genetické diverzity), nebo malým počtem zakladatelů. Iberská plemena však podle všech indicií vykazují vyšší diverzitu neţ jihoamerická a severoamerická plemena. Ačkoliv se ukázalo, ţe iberská i novosvětská plemena jsou polyfyletického původu, práce poskytuje soubor genetických dat ukazující na zvýšený výskyt iberských haplotypů u plemen Nového světa, coţ koresponduje s historickými fakty (Luís et al. 2006). Cothran et al. (2005) sledovali genetickou variabilitu 421 bp dlouhého úseku kontrolní oblasti mtDNA u silně ohroţeného původního litevského plemene Zemaitukai (Ţemaiču, pozn. aut.). V práci se zaměřili na posouzení validity rodokmenů, zjištění diverzity mtDNA a zjištění příbuzenských vztahů k jiným plemenům. Ze závěrů vyplývá, ţe všech pět zbývajících rodin plemene má vzájemně odlišné haplotypy. Nebyla prokázána příbuznost plemene s jinými plemeny koní. Genetická variabilita

24


mtDNA uvnitř plemene je vzhledem k jeho malému počtu překvapivě vysoká. Výsledků studie bude vyuţito při ochraně plemene.

2.2.2.5. Souběžné využití analýzy mikrosatelitní a mitochondriální DNA v genetických studiích u koní

V některých studiích se objevují souběţně analýzy jak mikrosatelitní, tak mitochondriální DNA. Zatímco variability mikrosatelitů se vyuţívá ke stanovení genetické diverzity (zjištěná heterozygotnost, genová diverzita, průměrný počet alel na lokus, genetická rozdílnost), polymorfismus mtDNA umoţňuje ověřovat příslušnost zvířat k daným rodinám, stanovovat genetické distance a odhadovat variabilitu mtDNA zakladatelek rodin (Dovc et al. 2006). Kakoi et al. (2007) soudí, ţe porovnáním velkého počtu mitochondriálních haplotypů koní z celosvětových podkladů lze vytvořit haplotypové skupiny, coţ se můţe stát významným nástrojem pro správné přiřazování mateřských linií (rodin) k fylogenetickým skupinám koní, a tím pádem i pro objasnění geografického původu a charakterizaci rodin původních japonských koní. Co se mikrosatelitů týče, vysoká polymorfie příznačná pro tyto markery je činí velmi vhodnými pro výzkum genetické variability, struktury a příbuzenských vztahů u plemen koní v celosvětovém měřítku (Kakoi et al. 2007).

25


3. HYPOTÉZA Variabilita mikrosatelitní DNA je vhodné kritérium pro zařa-

1.

zování kladrubských koní do subplemenných skupin (linií, rodin)

Variabilita mitochondriální DNA je vhodným kritériem pro

2.

zařazování kladrubských koní do rodin

4. CÍLE PRÁCE •

Ověření pracovní hypotézy, resp. nalezení vhodného kritéria pro zařazování zvířat do linií či rodin

•

Ověření správnosti zařazení koní do rodin provedené dle existující dokumentace

•

Určení míry příbuznosti mezi jednotlivými rodinami i zvířaty

Získané údaje budou vyuţity ke zmapování matrilineární a patrilineární genetické rozmanitosti u kladrubských koní a k ověření správnosti jejich zařazení do rodin. Těchto informací pak bude moţno vyuţít pro sestavování vhodných, geneticky co nejméně příbuzných rodičovských párů. Dalším přínosem této práce pak bude moţnost pouţití jejich výsledků k ověřování totoţnosti a původu jednotlivých koní i k výzkumu původu a k rekonstrukci výstavby plemene jako takového zejména v těch obdobích, z nichţ chybějí chovatelské záznamy.

26


5. MATERIÁL A METODIKA 5.1. Zvířata Modelovou populací je stádo starokladrubských koní, běloušů i vraníků (obr. 6) v majetku Národního hřebčína Kladruby nad Labem a v malé míře i z dalších chovů.

Obr. 6: Kladrubský vraník a bělouš v klusu

Copyright © 2003 NH Kladruby nad Labem. Všechna práva vyhrazena.

27


5.1.1. Původ a historie chovu starokladrubského koně Starokladrubský kůň je nejstarším kontinuálně chovaným a zároveň jediným autochtonním plemenem koní na území České republiky. Je světovým unikátem jak pro svůj původ, tak i jako ukázka úspěšné chovatelské práce, díky níţ se podařilo jednak udrţet bílé stádo přes jeho malou četnost bez známek inbrední deprese, a jednak zregenerovat vrané stádo z pouhých několika jedinců, kteří unikli likvidaci.Rozsáhlý komplex Národního hřebčína Kladruby nad Labem byl i se starokladrubským koněm - běloušem v lednu 1995 prohlášen státní kulturní památkou. (Nár. hřebčín IV-2010, Jakubec et al. 2004). Krevní základna plemene se začala tvořit jiţ před čtyřmi staletími, kdy byl císařem Rudolfem II. Habsburským roku1579 zaloţen dvorní hřebčín v Kladrubech nad Labem a kdy se do něj začali dováţet koně starošpanělští a později staroitalští (Nár. hřebčín IV-2010). O samostatném stabilizovaném plemeni lze hovořit od přelomu 18. a 19. století (Jakubec et al., 2004). Od samého počátku to bylo plemeno málopočetné a zuţování jeho krevní základny se bránilo dalším přílivem italsko-španělské krve. Ten však ustal počátkem 19. století v důsledku zániku většiny starošpanělských a staroitalských chovů v Evropě a od té doby bylo kladrubské stádo chováno více méně čistokrevně. Poněvadţ pak jiţ nikde jinde koně italsko-španělského původu nebylo moţno získat, stal se název "kůň starokladrubský" novým názvem jejich plemene, pod kterým se uvádělo v příručkách hipologických i zootechnických (Nár. hřebčín IV-2010). Během 2. poloviny 19. století a v průběhu 20. stol. bylo v rámci snah o zlepšení exteriéru a uţitkových vlastností plemene a o rozšíření jeho krevní základny pouţito několika hřebců i klisen jiných plemen, ne všechny tyto akce se však setkaly s úspěchem, viz tab. 4 (Bílek 1957, Nár. hřebčín XII-2007).

28


Tab. 4: Přehled koní jiného než kladrubského plemene použitých v chovu v průběhu 19. a 20. stol. * Kůň

pohl.

Plemeno

Nar.

Původ

Období

Potomci

Linie/rodina

využití

zařazení

založ. koněm

do chovu Angl.plnoa polo-

2.pol. 19. stol.

A1/1 a A1/2

0

–

po I. sv. v.

dcery

–

4 vnučky

–

- poč. 20.stol.

krevníci arabský

Shagya X

♂

Nonius

♂

anglonorman 1950 Jugoslávie

1963-1964

Favory

♂

lipicán

1938 Bábolna

1951-1959

Rudolfo

♂

lusitano

1968 Portugalsko

1977-1985

Siglavi Pakra

♂

lipicán

1946 Jugoslávie

1957-1967

Bárta

♀

orlov.klusák

1953

Legion

♂

orlov.klusák

1950

Romke

♂

fríský kůň

1966 Holandsko

XXXV

Radovec

polokrevník

Chrenovský hřebčín

1958-?

5 synů 9 dcer 1 syn 11 dcer

FAVORY (běl) L RUDOLFO (běl)L

2 synové SIGL.PAKRA (vr.) 2 dcery 1 syn 1 dcera

lllllllllll

L

BÁRTA

R

Algasovský hřebčín

1954-1963

2 dcery

1974-1985

vé

–

2 synoROMKE (vr)

22 dcer Mikrob

♂

orlov.klusák

Chrenovský 1972

hřebčín

1978-1981

1 dcera

–

* nejsou uvedeny klisny 1. generace pouţité při regeneraci kladrubského vraníka (pozn. aut.) L - linie, R - rodina

Poslední dvě století se starokladrubský kůň chová ve dvou barevných variantách – vraník a bělouš (obr. 6), ačkoliv do třicátých let 19. století zde bylo také stádo starokladrubských hnědáků. To však bylo znehodnoceno pokříţením holandskými hřebci a proto bylo odstraněno. Vrané stádo bylo v meziválečném období téměř zlikvidováno a jen díky úsilí profesora VŠZ v Praze Františka Bílka, DrSc. se na poslední chvíli podařilo zachránit několik posledních zvířat a v r. 1941 přistoupit pod jeho vedením k regeneraci starokladrubského vraníka (Nár. hřebčín XII-2007, Volenec 1995). V roce 1992 konstatuje pokračovatel prof. Bílka Doc. Ing. Jaromír Dušek,

29

L


DrSc., ţe regenerační proces je zdárně završen a starokladrubský vraník je zachráněn (Dušek 1992). Původ starokladrubského koně po otcovské linii je moţno vysledovat zpět k zakladatelům kmenů (nověji linií) kteří jim dali jména (Generale, Generalissimus, Sacramoso, Solo, Favory, Siglavi Pakra, Romke, Rudolfo). Přehled zakladatelů kmenů celého plemene je uveden v tab. 5 (Nár. hřebčín IV-2010).

Tab. 5: Kmeny starokladrubských hřebců (dle nového ŘPK 2005) Linie

Zakladatel

č.

název linie

Barva Barva

Nar.

zakl.

linie

zakl.

Plemeno

Původ

L1

Generale Gss XXIII

Běl

Běl

1787

Starokladr. Kopčany

L11

Generale-

Běl

Běl

1938

Starokladr. Kladruby n/L

Běl

1797

Starokladr.

Generalissimus Syn hřebce Generale

L13

Generalissimus

Běl

L3

Sacramoso

Vr

L12

Napoleone

Vr

Vr

1845

L31

Solo

Vr

Vr

L2

Favory

Plav.

Běl

1927 1779

Starokladr. Syn Sacramosa XXIX Starokladr. Kladruby n/L→ Lipica

1938

Lipicán

Běl

Běl

1965

Starokladr. Kladruby n/L

Vr Vr Běl

Vr Vr Běl

1946 1966 1968

Lipicán Fríský kůň Lusitano

Vr/běl 1800

kmen zanikl r. 1929

Starokladr. Kroměříţ ItalskoŘím španělské

kmen zanikl r. 1922

Bábolna → Kl. n/L

Gss XXIX L21

FavoryGeneralissimus

L4 L5 L6

Siglavi Pakra Romke Rudolfo

Dakovo (Chorvatsko) Holandsko Portugalsko

Kmen Napoleone zanikl v r. 1922. Původní kmen Generalissimus (zkr. Gss) zaloţený hřebcem Generalissimus I narozeným r. 1797, zanikl v r. 1929 úhynem hřebce Generalissimus XXII. Znovu byl obnoven alespoň podle jména v r. 1941 jako kmen 30


Generale-Generalissimus hřebcem Generalissimus XXIII (nar. r. 1938 po otci Generale XXIII z matky 407 Gss XXII). V r. 1970 vznikl podobně kmen FavoryGeneralissimus, jehoţ zakladatelem se stal hřebec Generalissimus XXIX nar. r. 1965 po otci Favory IV z matky 817 Gss XXIII (Nár. hřebčín IV-2010). Kmen Favory byl zaloţen plavým hřebcem Favory narozeným r. 1779 v Kladrubech nad Labem a převedeným

do

hřebčína

Lipica,

kde

zaloţil

stejnojmenný

kmen

lipicánů.

V kladrubském chovu se neuplatnil. V r. 1951 byl však za účelem rozšíření krevní základny do kladrubského chovu zařazen jeho potomek lipický hřebec 92 Favory narozený r. 1938 v hřebčíně Bábolna, který tak zaloţil kmen Favory starokladrubských běloušů (Bílek 1957, Nár. hřebčín IV-2010). Po mateřské linii je původ starokladrubského koně moţno vysledovat zpět k 8 zakladatelkám čistokrevných klasických rodin a 7 zakladatelkám čistokrevných neklasických rodin, jejichţ přehled (dle nového Řádu plemenné knihy starokladrubského koně schváleného 2005) je uveden v tabulkách 6a a 6b (Nár. hřebčín IV-2010). Tab. 6a: Čistokrevné klasické rodiny (vyznačeny tučně):

rodina č.

rodina – název

rodina č.

(rok naroz. zakladatelky)

rodina – název (rok naroz. zakladatelky)

R18

-Maestosa (1740)

R13a

Deflorata-Plutona (1767

R20

Almerina (1769)

R26Z

Madar VI-Káča (1782)

R21

Almerina-Albona

R10

Ragusa (1888)

R23

Almeria-Aluta

R101

Ragusa-Raguza

R8

Almerina-Campanella

R17

Rava-Maga (1755)

R22

Almerina-Egloga

R25Z

Rava-Ravana

R12

Almerina-Formosa

R9

Sardinia-Magura (1770)

R11

Almerina-Maja

R13

Sardinia-Neapolitana

R19

Cariera (1894)

R16

Sardinia-Septimia

31


Tab. 6b: Čistokrevné neklasické rodiny:

rodina č.

rodina – název

rodina – název

rodina č.



R7

Narcis (1939)

R27Z

Favora (1963)

R15

Xandra (1938)

R28Z

Dana (1969)

R14

Bárta (1953)

R29Z

Gita (1974)

R24Z

Ritorna(1974)

V současné době Plemenná kniha starokladrubského koně dle aktualizace provedené k 18. 1. 2010 eviduje 536 chovných starokladrubských koní (tab. 7). Koní nezařazených do chovu vč. koní bez původu je přibliţně 3200 (Nár. hřebčín IV2010). Tab. 7: Počty chovných starokladrubských koní k 18. 1. 2010 BĚLOUŠI Nár. hřebčín Soukr. chovy Celkem

hř. 18 10 28

kl. 74 160 234

VRANÍCI hř. 18 11 29

kl. 76 169 245

Celkem 186 350 536

Po celou dobu existence plemene se vzhledem k jeho omezené četnosti uplatňuje příbuzenská plemenitba, coţ na jedné straně vedlo k zachování jeho původního charakteru, na straně druhé to však sebou nese zvýšené riziko inbrední deprese se všemi jejími negativními dopady zejména na konstituci, ţivotaschopnost a reprodukční schopnosti. Aby se zjistilo, nakolik je plemeno ohroţeno inbrední depresí, byly mezi lety 1993 - 2004 provedeny genetické analýzy plemene (Jakubec et al., 2004). Volenec et al. (1995) provedl studii stupně inbreedingu. Průměrný koeficient inbreedingu starokladrubských hřebců byl 7,2 %, přičemţ u běloušů činil 6,1 % a u vraníků 8,2 %. Průměrný koeficient inbreedingu dcer těchto plemeníků činil 7,75 % za celé plemeno, u dcer běloušů 7,29 % a u dcer vraníků 8,4 %. Průměrný koeficient inbreedingu pro klisny z hlediska jejich příslušnosti k mateřským liniím byl 7,53 % pro bělky a 7,91 % pro vranky (7,75 % pro celé plemeno). Vyšší hodnoty u černé

32


variety korespondují s intenzivnějším inbreedingem pouţívaným při regeneračním procesu starokladrubského vraníka. V další práci (Jakubec et al. 1996) byly odhadnuty koeficienty inbreedingu pro všechny jedince a koeficienty příbuznosti pro všechny páry jedinců. Inbreeding a příbuznost byly sledovány zpětně aţ po 8. generaci předků. Všichni jedinci byli testováni pomocí 6 systémů krevních skupin a 10 systémů biochemického polymorfismu. Byly odhadnuty průměrné koeficienty inbreedingu otcovských skupin potomků, otcovských linií, obou barevných variant a celého plemene. Současně byly pro stejné genetické skupiny odhadnuty průměrná heterozygotnost a genetická distance. Pro celé plemeno byly odhadnuty tyto parametry: průměrný koeficient inbreedingu 6,72 %, průměrná heterozygotnost 36,65 %, průměrný koeficient příbuznosti 4,92 % a průměrná genetická distance 8,41. Z těchto hodnot vyplývá, ţe míra inbreedingu v plemeni není příliš vysoká. Hořín et al. (1998) provedli analýzu polymorfismu MHC (major histocompatibility complex – oblast kódující několik skupin genů, které hrají zásadní roli při antigenové odpovědi a stejně tak i v některých neimunitních funkcích), polymorfismu krevních skupin, biochemického polymorfismu a polymorfismu mikrosatelitní DNA. Vyplynulo z ní, ţe genetický polymorfismus kladrubských koní nevykazuje redukci a je srovnatelný s genetickým polymorfismem jiných plemen koní. Práce Jakubce et al. (2004) se zaměřila na porovnání koeficientu inbreedingu v letech 1993 a 2003, a to u hřebců a klisen v rámci celého plemene, bílé a černé varianty a hřebčích linií uvnitř variant. Z práce vyplývá, ţe v sledovaném období poklesl průměrný koeficient inbreedingu všech hřebců plemene ze 7,16 % na 5,47 %, z toho běloušů z 6,06 % na 5,10 % a vraníků z 8,21 % na 5,94 %. U klisen poklesl ze 7,90 % na 5,05 % v rámci celého plemene, z toho u bělek ze 7,29 % na 4,17 % a u vranek z 8,40 % na 5,86 %. Dále byla posuzována plodnost klisen Národního hřebčína Kladruby nad Labem i soukromých chovů v letech 1995 aţ 2003. Plodnost kolísala kolem 65 % a nejevila známky poklesu.

33


5.1.2. Rodiny starokladrubského Nejstarší rodinou je rodina lipického původu AFRICA – MAESTOSA „E“, zaloţená r. 1740. Dle Bílka (1957) a Lercheho (1956) ovšem zakladatelka rodiny Africa pocházela Kladrub. Do kladrubského stáda se krev této rodiny dostala prostřednictvím vrané klisny 8 Maestosa, nar. 28. 4. 1936 v Topolčiankách po Maestoso I. Její matkou byla 266 Neapolitano Gratia-4, po Neapolitano Gratia z 80 Napoleone, po Napoleone Amelia III. 8 Maestosa měla 25 % starokladrubské krve a 75 % lipické krve a byla vyuţita jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. Druhou v pořadí co do stáří je rodina ALMERINA, téţ starokladrubského původu, jejíţ zakladatelkou je klisna Almerina narozená r. 1769 (Bílek 1957). Tato rodina se dělí na 6 podrodin (tab. 6a, příloha č. I). Almerina–Albona - v elektronické Plemenné knize starokladrubského koně (Nár. hřebčín IV-2010) je nejstarší představitelkou a zároveň společným předkem z mateřské strany všech příslušníků této rodiny klisna 334 Shagya (29 Idea) nar. 1925. Její bábou byla 89 Gss Albona (nar. r. 1903), která je potomkem generace F11 klisny Almerina. Bábou 89 Gss Albony byla Albona nar. r. 1874 (F9. generace od klisny Almerina) po Gss (nar. 1867), z Alba VIII (F8, nar. 1861) po G. Arioste (1850). Alba VIII je přímým potomkem klisny Albania I (nar. 1803) po Generale I (nar. 1796) z kopčanské klisny Ameny (nar. 1790). Albania I je starší ze dvou pravnuček Almeriny (Bílek 1957). Almerina-Aluta“P“ – v elektronické Plemenné knize starokladrubského koně (Nár. hřebčín IV-2010) je nejstarší představitelkou a zároveň společným předkem z mateřské strany všech příslušníků této rodiny klisna 276 Shagya I (nar. 1922), F12 gen. po klisně Almerina. Její bába Aluta nar. 1887 po G 1887 (F10), dcera klisny Algebra (F9) nar. 1875 po Gss 1867, z Alba VIII, tj. pochází v přímé linii téţ z klisny Albania I narozené r. 1803 (Bílek 1957). Almerina-Campanella – zakladatelkou je klisna 43 Campanella, černá hnědka nar. 6. 5. 1942 v Kladrubech n/L po hřebci Sacramoso XXX (nar. 1927). Její matkou byla

34


klisna 438 Shagya I z 265 Generale XXX (nar. 1921) po Shagya I – Radovecký. Patřila tedy ve skutečnosti do rodiny Almerina–Aluta „P“, takţe rodina AlmerinaCampanella je v podstatě formální. 43 Campanella měla 62,5 % stkl., 25 % arabské a 12,5 % lipické krve. Byla vyuţita jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. (Nár. hřebčín IV-2010, Bílek 1957). Almerina-Egloga – zakladatelkou je 116 Generale XXIX (Egloga) generace F13 nar. 18. 3. 1916 v Kladrubech n/L po Generale Isalka z Eglantine (1896) po Gss Rava (1889). Prabábou Eglantine je klisna Alba XI (1870) po Gss Forbice (1897) z Alba VIII, tj. i tato rodina se odvozuje od Albanie I. Almerina-Formosa – zakladatelkou je klisna 35 Formosa (475 Furioso VII), nar. 13. 5. 1934 ve Slatiňanech po Furioso VII; z 265 Generale XXX, která patřila do rodiny Almerina – Aluta „P“. 35 Formosa byla vyuţita jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. Měla 43.75% stkl. krve a 56.25% krve angl. polokrevníka. Almerina – Maja – zakladatelkou je vraná klisna 1 Maja, (F13) nar. 29. 1. 1922 (dle elektronické Plemenné knihy NHK v Kladrubech n/L, dle dokumentu Regenerační proces v chovu starokladrubského vraníka v Nových Dvorech u Opavy, viz Nár. hřebčín IV-2010) po Maestoso Radovecký (nar. 1911); z 301 Napoleone (nar. 6. 4. 1914). Byla vyuţita jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. Měla 50% stkl. krve a 50% lipic. krve. Maja je přímým potomkem klisny Abocca (nar. 1800) po Principe z kopčanské klisny Ameny (nar. 1790). Abocca je starší ze dvou pravnuček Almeriny. BÁRTA – zakladatelkou je vraná klisna orlovského klusáka 154 Bárta, nar. 17. 2. 1953 v Chrenovském hřebčíně (SSSR), po hřebci Bars. Její matkou byla klisna Utrata, po 5878 Suchovoj z Ulybka, po 2300 Balans. Byla vyuţita jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. CARIERA - zaloţená r. 1894. V elektronické Plemenné knize starokladrubského koně (Nár. hřebčín IV-2010) je nejstarší představitelkou a zároveň společným předkem z mateřské strany všech příslušníků této rodiny klisna 119 Generalissimus XIX (Carpeta), narozená 2. 12. 1916.

35


DANA "G" (1969) – zakladatelkou je Č 3934 Dana nar. 5. 2. 1969 po Favory IV – K ze zemské klisny po Sacramoso XXXIII. Šedá bělka. DEFLORATA-PLUTONA – zakladatelkou je 60 Plutona, lipická klisna nar. 27. 4. 1943 v Topoľčiankách, po Pluto I. Její matkou byla klisna 451 Maestoso I, po Maestoso I z 234 Neapolitano Gratia, po Neapolitano Gratia. Hnědě tečkovaná bělka. Byla vyuţita jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. FAVORA – zakladatelkou je klisna Č 3912 Favora nar. r. 1963 po Favory VI–K ze zemské klisny po Generale XXXVI. Šedá bělka. MADAR VI-KÁČA "F" (1782) – zakladatelkou je lipická klisna Č 1056 Káča nar. 21. 2. 1983 v maďarském hřebčíně Bábolna, po hřebci Incitato X. Její matkou byla 117 Conversano XX po Favory XX Bábolenský z 566 Pluto XXIII. Šedá bělka. NARCIS „I“ – zakladatelkou je 15 Narcis, nar. 17. 3. 1939 v Chrástu u Chrudimi, po 530 Sacr. XXIX-3 Avara. Její matkou byla zemská klisna Líza po Sacramoso Aja XXVII ze zem. klisny č. 23, po 145 Lord Willibald. Vranka s odznaky, s podílem 75% stkl. krve a 25% krve č. teplokrevníka. Byla vyuţita jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. RAGUSA – zaloţená r. 1888. V elektronické Plemenné knize starokladrubského koně (Nár. hřebčín IV-2010) je nejstarší představitelkou a zároveň společným předkem z mateřské strany všech příslušníků této rodiny klisna 85 Napoleone (Ragusa), po Napoleone Generale III. RAGUSA-RAGUZA – zakladatelkou je 32 Raguza (z rodiny Ragusa), nar. 22. 3. 1938 v Kladrubech n/L.,po Generale XXXIII z 416 Shagya I, po Shagya I z 85 Napoleone (Ragusa), po Napoleone Generale III. Smíš. bělka s podílem 75 % starokladrubské a 25 % arabské krve. Do chovu byla zařazena v Kladrubech n/L. pod č. 531 Generale XXXIII, v r. 1945 byla předána do hřebčína Slatiňany, kde nadále působila v chovu jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. RAVA-MAGA (1755) - zakladatelkou je lipická klisna 7 Maga, nar. 28. 1. 1939 v Topoľčiankách, po Maestoso I. Její matkou byla klisna 101 Pluto XVII, po 4 Pluto XVII

36


z 30 Rigoletta, po Conversano Austria. Šedě tečkovaná bělka. Byla vyuţita jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. RAVA-RAVANA (1755) - nejstarší představitelkou a zároveň společným předkem z mateřské strany všech příslušníků této rodiny uvedeným elektronické Plemenné knize starokladrubského koně (Nár. hřebčín IV-2010) je lipická klisna 615 Rava, bělka, nar. 31. 3. 1944 v Topolčiankách po Maestoso I. Pravnučkou této klisny byla bělka 275 Ravana nar. 8.2.1974 v Topolčiankách po Neapolitano VII PerlettaPiberský. 275 Ravana měla dceru. Č 1128 Ravana, červeně tečkovanou bělku po Maestoso IX-7, narozenou 29.7.1980 v Topolčiankách, která se stala zakladatelkou této rodiny. RITORNA (1974) – zakladatelkou je klisna 292 Ritorna, vranka, nar. 17. 11. 1974 v hřebčíně Slatiňany, po Solo Narcis IV z české teplokrevné klisny 254 Rita, nar. 21. 1. 1961, která je nejstarším v elektronické Plemenné knize starokladrubského koně (Nár. hřebčín IV-2010) zaznamenaným předkem této rodiny. Byla pouţita v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. SARDINIA-MAGURA – zakladatelkou je 3 Magura, nar. 9. 12. 1937 v Topolčiankách, po Maestoso I. Její matkou byla klisna 274 Sacramoso XXIX-1, po Sacramoso XXIX z 31 Virtuosa, po Pluto Slatina III, vranka s podílem 25 % starokladrubské a 75 % lipické krve. Byla vyuţita jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. SARDINIA-NEAPOLITANA – zakladatelkou je lipická klisna 9 Neapolitana, nar. 3. 2. 1934 v Topolčiankách, po Neapolitano Gratia I. Její matkou byla klisna 16 Malaga, po Pluto Slatina III z Malaga, po Maestoso Slavina II. Tmavá hnědka. Do chovu byla zařazena v r. 1942, kdy byla zakoupena spolu se svou dcerou 44 Capriolina, nar. 1942 (po Sigl. Capriola I). Byla vyuţita jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. Její dcera 44 Capriolina byla později téţ zařazena do chovu. SARDINIA-SEPTIMIA – zakladatelkou je 121 Septimia, nar. 28. 4. 1950 v Zahrádkách u České Lípy, po 411 Generale XXXIII-1. Její matkou byla klisna Spaniola po Pluto Presciana ze Sardina, po Maestoso Gratia. Byla to šedá bělka s podílem 31.25 % sta-

37


rokladrubské, 50 % lipické a 18.75 % arabské krve. Byla vyuţita jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. XANDRA – zakladatelkou je černě tečkovaná bělka 67 Xandra, nar. 1938, slezská zemská klisna s oţehem, bez původu (v teplokrevném typu). Byla vyuţita jako matka parentální generace v regeneračním procesu starokladrubského vraníka. (in: Plemenná kniha NHK v Kladrubech n/L a dokument Regenerační proces v chovu starokladrubského vraníka; Nár. hřebčín IV-2010)

38


5.2. Metodika 5.2.1. Mikrosatelity Cílem analýzy mikrosatelitů bylo zjistit, zda jsou vhodným kritériem pro zařazování kladrubských koní do linií a rodin a případně stanovit mezi nimi příbuznost. Genotypováno bylo 16 mikrosatelitních lokusů (tab. 8) rozptýlených na 10 chromozómech. Laboratorní analýza mikrosatelitů byla provedena ve Výzkumném ústavu ţivočišné výroby v Praze – Uhříněvsi. Vycházela z metod pouţívaných ve Výzkumném ústavu, modifikovaných pro koňskou DNA (Jandurová et al. 2004, Jandurová et al. 2005). Krevní vzorky byly náhodně odebrány 324 starokladrubským koním v rozmezí 10 let (1990 aţ 2000), vţdy cca u 10 % jedinců z kaţdé linie. DNA byla izolována z celé krve pomocí kitu NucleoSpin Blood Kit (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA). K amplifikaci byla pouţita mnohonásobná PCR (multiplex PCR). Reakční směs o objemu 7,5 μl obsahovala 80 – 100 ng templátové DNA, 1,25 μl reakčního pufru (10x Stockmarks Buffer), 2 μl směsi dNTP (1.25 mmol/l), 2 μl směsi primerů Primer mix (20 nmol/l) a 1,25 U Taq Gold polymerázy. Všechny tyto komponenty pocházejí z kitu StockMarks for Horses Equine Genotyping Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Reakce byla provedena v termocykléru TGradient 96 thermal cycler (Whatman Biometra, Goettingen, Germany). Počáteční denaturace při 95 °C trvala 10 min., pak následovalo 31 cyklů: 30 s 95 °C, 30 s 60 °C a 60 s. 72 °C. Při posledním cyklu byla reakční směs vystavena teplotě 72 °C po dobu 60 min. Produkty PCR byly rozpuštěny v 7,5 μl vody. Analýza PCR produktů a výpočet délky alel byl proveden pomocí sekvenátoru ABI PRISM 310 (Applied Biosystems) a analytického software GeneScan.

39


Tab. 8: Specifické lokusy koní

očekávaná veli-

Lokus

Barvivo

Barva

AHT4

6-FAM

Blue

140-166

AHT5

VIC

Green

126-147

ASB17

PET®

Red

104-116

ASB2

VIC

Green

237-268

ASB23

VIC

Green

176-212

CA425

PET

Red

224-247

HMS1

PET

Red

166-178

HMS2

NED

Yellow

215-236

HMS3

NED

Yellow

146-170

HMS6

VIC

Green

154-170

HMS7

6-FAM

Blue

167-187

HTG4

6-FAM

Blue

116-137

HTG6

VIC®

Green

74-103

HTG7

NED

Yellow

114-128

LEX3

PET

Red

137-160

VHL20

6-FAMTM

Blue

83-102

kost (pb)

40


5.2.2. mtDNA Cílem analýzy mtDNA bylo zjistit, zda je vhodným kritériem pro zařazování kladrubských koní do rodin, ověřit zařazení do rodin podle rodokmenů a případně zjistit příbuzenské vztahy mezi rodinami Laboratorní analýza mtDNA se téţ prováděla ve Výzkumném ústavu ţivočišné výroby. Zkoumaný soubor tvořilo170 zvířat z 23 rodin, z nichţ 166 je genovými rezervami. Pracovní postup při analýze mtDNA je následující: 1. izolace mtDNA 2. amplifikace příslušného úseku mtDNA 3. zjištění polymorfismů příslušného úseku mtDNA 4. statisticko-matematické zpracování získaných údajů, interpretace výsledků

5.2.2.1. Izolace mtDNA Izolaci mtDNA lze provádět z celé (tj. nefrakcionované) čerstvé či mraţené krve, tkání, slin, případně z vlasových folikulů. Tkáně se jako zdroj DNA pouţívaly zejména ve starších pracích (játra a srdce – Hutchison et al. 1974, ledviny - Árnason et al. 1991, Xu et al. 1996, játra -Ishida et al. 1994a, ledviny - Xu and Árnason 1994). Skupina soustředěná kolem prof. Dovče pouţívá standardní postup dle Whitea and Densmorea (White and Densmore 1992, Kavar et al. 1999, Kavar et al. 2002, Ivankovic et al. 2002,). V této práci byla zdrojem mtDNA celá zmrazená krev genových rezerv uchovávaná v genetické bance, vedené ve Výzkumném ústavu ţivočišné výroby (166 vzorků), a sliny získané výtěrem dutiny tlamní vatovými tampony (4 vz., koně v majetku hřebčín Favory s. r. o., Benice). Izolace a purifikace se prováděla jednak na přístroji Applied Biosystem AbiPrism 6100 Nucleic Acid PrepStation(vakuum) dle protokolu (160 vz.), jednak pomocí techniky magnetických partikulí (Magnetic Par-

41


ticle Technology) dle protokolu (10 vz., z toho 4 vz. slin a 6 vz. krve). za pouţití kitu MagMAX™-96 DNA Multi-Sample Kit (Applied Biosystems).

Izolace DNA pomocí Applied Biosystem AbiPrism 6100 Nucleic Acid PrepStation(vakuum)

Izolace DNA se skládá ze dvou kroků – z lyzace a z vlastní izolace. Lyzační reakce se provádí v mikrozkumavkách o objemu 1,5 ml, do nichţ se nejprve napipetuje 25 μl proteinázy K (Proteinase K Solution, 20 mg/ml), dále 85 μl pufru BloodPrep DNAPK Digestion Buffer a 75 μl rozmraţené krve. Směs se promíchá a inkubuje 20 minut při teplotě 58 ºC; během lyzace se vzorky silně vortexují. Poté se směs nechá zchladnout na laboratorní teplotu. Pak se k ní přidá 650 μl roztoku BloodPrep DNA Purification Solution, zahřátým na 37 ºC, a směs se opatrně promíchá pipetou (5x nasát celý objem do pipety a vypustit). Vlastní izolace: Vzorky lyzované krve se napipetují do kolonek přístroje 6100 Nucleic Acid PrepStation (650 μl). Po odsátí roztoku následují tyto kroky: 1. 650 μl Purification Solution ke kaţdému vzorku – odsátí pomocí vakua. 2. 600 μl Wash Solution – odsátí. 3. 300 μl Wash Solution – odsátí. 4. Předvymývací vakuum, ţádný roztok. 5. Na dno jamek přidat eluční destičku. 6. 100 μl Elution Solution 1 – inkubace 3 min., odsátí. DNA se zachytí na eluční destičce. 7. 100 μl Elution Solution 2 (úprava pH vyizolované DNA pufrem). Pufr se pomocí vakua odsaje do destičky s DNA. 5.2.2. Amplifikace mtDNA

42


Izolace DNA pomocí techniky magnetických partikulí (Magnetic Particle Technology)

A) Z krve: Lyzace: 1. Předehřát vyhřívací blok na 60 – 65 ºC 2. Připravit PK buffer/enzyme Mix 3. Do kaţdé mikrozkumavky napipetovat 50 μl PK buffer/enzyme Mix a 50 μl celé krve, promíchat nasátím do pipety 5 – 7 x nebo opatrným vortexováním. 4. Utěsnit, inkubovat 20 min při 60 – 65 ºC 5. Přidat 200 μl Multi-Sample DNA Lysis Buffer ke kaţdému vzorku, utěsnit, protřepávat 3 min při rychlosti 7 Extrakce: 1. Ke kaţdému vzorku přidat 20 μl směsi DNA vázajících magnetických partikulí, utěsnit, protřepávat 3 min při rychlosti 6 2. Ke kaţdému vzorku přidat 240 μl 100 % isopropanolu, utěsnit, protřepávat 3 min při rychlosti 3 aţ 4 3. Umístit na magnetický stojan na 5 min 4. Odstranit supernatant ze vzorků, dokud jsou na magnetickém stojanu 5. Promýt kaţdý vzorek 150 μl promývacího roztoku 1 (Wash Solution 1): a) Do kaţdého vz. přidat 150 μl promývacího roztoku 1, utěsnit, protřepávat 1 min při rychlosti 7 b) Umístit na magnetický stojan na 1 min c) Odstranit supernatant ještě na stojanu 6. Opakovat krok 5 dvakrát za pouţití 150 μl promývacího roztoku 2 (Wash Solution 2) 7. Protřepávat odkryté vzorky 2 min při rychlosti 9 Eluce: 1. Ke kaţdému vz. přidat 50 μl DNA vymývacího pufru 1 (DNA Elution Buffer 1) 2. Inkubovat při 70 ºC po dobu 5 min 3. Ke kaţdému vz. přidat 50 μl DNA vymývacího pufru 2 (DNA Elution Buffer 2), promíchat 10 krát nasátím do pipety, utěsnit a protřepávat 5 min rychlostí 7 4. Umístit na 5 min na magnetický stojan

43


5. Přenést eluáty ze vzorků na magnetickém stojanu na eluční destičku, utěsnit. Purifikované vzorky, které nebyly ihned pouţity k dalšímu zpracování, byly ponechány na eluční destičce. Do 24 hod byly uchovávány při 2 – 4 ºC, v případně uskladnění po delší dobu pak při teplotě alespoň. -20 ºC. B) Ze slin: Postup se v detailech lišil. Vlastní extrakci předcházelo rozrušení vzorků: 1. Napipetovat do kaţdé zkumavky 400 μl lyzačního pufru (Multi-Sample DNA Lysis Buffer) 2. Tampóny bez špejlí dát do zkumavek s lyzačním pufrem 3. Protřepávat odkryté zkumavky 3 min při rychlosti 7 4. Odstranit tampóny tak, aby ve zkumavkách zůstalo co moţná nejvíce pufru (cca 200 μl) 5. Přidat 160 μl 100 % isopropanolu ke kaţdému vzorku, utěsnit, protřepávat 3 min při rychlosti 7 Extrakce: 1. Ke kaţdému vzorku přidat 20 μl směsi DNA vázajících magnetických partikulí, utěsnit, protřepávat 3 min při rychlosti 7 2. Umístit na 5 min na magnetický stojan 3. Vymýt magnetické partikule: a) Odstranit ze vzorků supernatant, dokud jsou na magnetickém stojanu b) Do kaţdého vz. přidat 150 μl promývacího roztoku 1 (Wash Solution 1), utěsnit, protřepávat 1 min při rychlosti 7 c) Umístit na magnetický stojan na 1 min 4. Zopakovat krok 3 za pouţití 150 μl promývacího roztoku 2 (Wash Solution 2) 5. Vzorky odkrýt a odstranit z nich supernatant, dokud jsou na magnetickém stojanu. Odkryté protřepávat 2 min při rychlosti 9 6. Zatímco vzorky schnou, připravit RNase A mix 7. Přidat 100 μl RNase A mix do kaţdého vzorku, utěsnit, protřepávat 2 min při rychlosti 7

44


8. Přidat 100 μl pufru Multi-Sample DNA Lysis Buffer a 120 μl 100 % isopropanolu ke kaţdému vzorku, utěsnit, protřepávat 3 min při rychlosti 7 9. Umístit na 1 min na magnetický stojan 10. Třikrát zopakovat krok 3; pouţít 150 μl promývacího roztoku 2 (Wash Solution 2) 11. Vzorky odkrýt a odstranit supernatant, dokud jsou na magnetickém stojanu 12. Vzorky sušit – odkryté protřepávat 2 min rychlostí 9 Eluce: 1. Ke kaţdému vz. přidat 50 μl DNA vymývacího pufru 1 (DNA Elution Buffer 1) 2. Inkubovat při 70 ºC po dobu 5 min 3. Ke kaţdému vz. přidat 50 μl DNA vymývacího pufru 2 (DNA Elution Buffer 2), utěsnit a protřepávat 2 min rychlostí 7 4. Umístit na 3 min na magnetický stojan 5. Přenést eluáty ze vzorků, zatímco jsou na magnetickém stojanu, na eluční destičku, utěsnit. Pro uchování vzorků platí totéţ, co pro vzorky získané z celé krve.

5.2.2.2. Amplifikace mtDNA K amplifikaci se pouţívá buď celá oblast D smyčky, nebo její upstream oblast, případně upstream i downstream oblast pomocí specifických primerů. Pouţívají se primery navrţené na základě genů tRNAThr a tRNAPhe v evolučně konzervativní oblasti mtDNA, které jsou společné pro mnohé ţivočišné druhy (Anderson et al. 1981, Anderson et al. 1982, Bibb et al. 1981; in: Ishida et al. 1994a). V této práci byla amplifikována upstream část kontrolní oblasti D smyčky o 384 pb (nt 15450 – nt 15834) pomocí primerů pouţitých např. v práci T. Kavar et al. (2002): HDF: 5´-AGTCTCACCATCAACACCCAAAGC-3´ HF: 5´-CCTGAAGTAGGAACCAGATG- 3´

45


Reakční směs o objemu 20 μl obsahovala 3 μl templátové DNA o koncentraci 10 pmol/μl, 0,5 μl kaţdého primeru, 6 μl vody a 10 μl dvakrát koncentrovaného roztoku PPP Master Mix, který představuje vyváţenou směs jednotlivých komponentů (polymeráza, nukleotidy, pufr, MgCl2 aj.). Amplifikace se prováděla v termocykléru Biometra T Gradient v těchto krocích: I)

1. cyklus: 95 °C – 5 min. – denaturace

-----------------------------------------------------------

II)

95 °C – 10 s – denaturace 62 °C – 20 s – anelace 72 °C – 30 s – elongace? -------------------------------40x

-----------------------------------------------------------

III)

72 °C – 5 min. – elongace .4 °C – chlazení

Přítomnost DNA v jednotlivých vzorcích se zjišťovala pomocí gelové elektroforézy na 3% agarosovém gelu. Vzorky obsahující amplifikovaný úsek DNA v dostatečném mnoţství pak byly purifikovány pomocí sady Min-Elute dle protokolu (na 5 μl PCR produktu 1,67 μl SAP (c = 1 U/μl) a 0,33 μl exonukleázy EXO I (c = 20 U/μl), obojí od firmy FERMENTAS. Následovala inkubace 60 min. při 37 °C a denaturace enzymů při 75 °C 15 min.

46


5.2.2.3. Zjištění polymorfismu mtDNA Byla pouţita metoda přímé sekvenace, tak jako v jiných podobných pracích (Cothran et al. 2005, Kakoi et al. 2007, Kavar et al. 2002, Luís et al. 2002, Luís et al. 2006, Royo et al. 2005 a další), v sekvenátoru Applied Biosystems (Hitachi) 3100-A. Pouţíval se BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Sekvenční PCR předcházela purifikace. Pouţilo se 5 µl PCR směsi (4µl na 15 µl), 1,67 µl alkalické fosfatázy SAP (Shrimp Alcalic Phosphatase), 0,33 µl endonukleázy EXO I. Směs se odstředila při 2000 ot/min. za laboratorní teploty, inkubovala se 1 hod. při 37 °C, poté se promíchala a denaturovala pomocí exonukleázy po dobu 15 min. při 75 °C. Pro sekvenační PCR se pouţil 1 µl premixu, 0,5 µl sekvenačního pufru, který je součástí kitu BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, 0,08 µl primeru (pro kaţdý primer byla provedena sekvenační PCR zvlášť) a 1 µl přečišťeného produktu předchozí PCR. Reakční směs se doplnila destilovanou vodou do 5 µl. Sekvenační PCR: I)

denaturace → 95 °C – 1 min.

---------------------------------------------------------------------

II)

denaturace

→ 95 °C – 10 s

anelace a elongace → 55 °C – 10 s → 60 °C – 4 min.

→

--------------------------------------------40x ---------------------------------------------------------------------

II)

chlazení → 4 °C

Produkt sekvenační PCR byl přečištěn pomocí BigDye Exterminator purifikačního kitu (Applied Biosystem). Pouţilo se 25 µl PCR produktu, 20 µl roztoku SAM a 5 µl exterminatoru (suspense). Reakční směs byla protřepávána po dobu 30 min. a odstředěna při 1000 otáčkách za minutu. K vlastní sekvenaci bylo pouţito 10 µl supernatantu.

47


5.2.3. Zpracování dat 5.2.3.1. Analýza mikrosatelitů

Curik et al. (2003) hodnotil heterozygotnost u lipicánů na základě analýzy 17 mikrosatelitních lokusů na 14 chromozómech pomocí programového balíčku SAS statistical package (SAS Institute 1999–2001). Achmann et al. (2004) provedl studii 22 mikrosatelitních lokusů na 16 chromosomech u 561 lipicána a 47 kladrubských koní. Hodnotil tyto charakteristiky: frekvence alel, počet alel, pozorovaná heterozygotnost a genetická diverzita (vs. očekávaná heterozygotnost podle Hardyho-Weinbergova zákona) počítaná pro jednotlivé lokusy a/nebo subpopulace – programový balíček SAS statistical package (SAS Institute 1999–2001).

Testy odchylky od Hardyho-Weinbergova zákona (HWZ) byly provedeny pomocí softwarového balíčku GENEPOP v. 3.3 (březen 2001); dostupný na ftp://ftp.cefe.cnrs-mop.fr/genepop/

Genetická struktura lipického koně byla analyzována pomocí Wrightova koeficientu F (Wright 1951)

Koeficienty fixace (FST, FIS a FIT) byly spočítány podle Weir and Cockerham (1984) s pouţitím softwarového balíčku GENETIX 4.04 (leden 2003, Belkhir et al. 2002; dostupný na http://www.univmontp2.fr/genetix/genetix/intro.htm).

Počet efektivních migrantů za generaci (Nm, kde N je celkový efektivní počet koní a m je míra migrace) je zaloţen na odhadech FST (Weir and Cockerham 1984) a byl spočítán podle vzorce Nm = (1 - FST)/4 FST, odvozeného Wrightem (1969).

48


Vztah mezi odhady Nm jednotlivých hřebčínů získanými z genetické analýzy 561 koně a poměrem migrujících koní mezi dvojicemi hřebčínů (součet emigrujících a imigrujících koní dělený celkovým počtem koní v dané dvojici hřebčínů) byl analyzován pomocí regresní lineární analýzy.

Molekulárně genetická příbuznost mezi subpopulacemi byla odvozena pomocí distance DAS sdílených alel (Chakraborty and Jin 1993). Distanční matice byly spočítány pomocí softwarového balíčku POPULATION v.1.2.28 (Olivier Langella; dostupný na http://www.pge.cnrs-gif.fr/bioinfo/populations/).

Fylogenetické stromy (dendrogramy) byly sestrojeny za pomoci algoritmu UPGMA (Sneath and Sokal 1973). Dendrogramy byly vyhotoveny pomocí softwarového balíčku TREEVIEW v. 1.6.6. (2001), Page 1996; dostupný na http://www.taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/rod.html

DAS distance mezi subpopulacemi a rovněţ sdílení alel mezi jedinci byly uţity při analýze hlavních komponent (principal component analyses - PCA). K analýze a grafickému zobrazení bylo vyuţito softwaru SAS (SAS Institute 1999–2001).

Zařazení jednotlivých koní do nejpravděpodobnějších subpopulací bylo provedeno pomocí softwarového balíčku GENECLASS v. 1.0.02 (Cornuet et al. 1999); dostupný na http://www.montpellier.inra.fr/URLB/geneclass/geneclass.html).

V této práci byla hodnocena: Frekvence alel, pozorovaná heterozygotnost, genetická diverzita (očekávaná heterozygotnost za předpokladu Hardyho - Weinbergovy rovnováhy - HWE)

49


Test HWE a genetické vzdálenosti. Tyto charakteristiky byly odhadnuty napříč rozdílnými lokusy a liniemi s vyuţitím softwarového balíku TFPGA 1.3 (Miller, 1997), který vytváří standardizovanou matici genetických distancí s korekcí na malé vzorky (Nei, 1978).

Shluková analýza. Byla provedena diskriminační metodou UPGMA, a vyjádřena jako dendrogram s vyuţitím analýzy bootstrap. Robustnost dendrogramu byla testována 1000 bootsrapovými vzorky. Algoritmus UPGMA byl pouţit, protoţe je vhodnější v porovnání s algoritmem Neighbour-Join v přítomnosti migrace jedinců mezi liniemi či rodinami (Achmann et al., 2004). Genetické diference uvnitř a mezi sledovanými liniemi. Byly zjištěny pomocí koeficientů fixace (FIS, FIT a FST) odhadnutých programem FSTAT (Gaudet, 2001) podle Weir and Cockerham (1984):

FIS

2 a

HS HI HS

HT

FST

2 a

2 b

2 a

HT H I HT

2 w

2 a 2 b

HS HT

FIT

2 b

2 w

2 b 2 b

2 w

kde: HI – heterozygotnost jedince v populaci, HS – očekávaná heterozygotnost jedince uvnitř subpopulace, HT – očekávaná heterozygotnost jedince v celé populaci, σ2a – proměnlivost mezi subpopulacemi, σ2b – proměnlivost mezi jedinci uvnitř subpopulace, σ2w – proměnlivost mezi všemi jedinci.

Počty migrantů za populaci (Nm). Byly odhadnuty ze vztahu (Wright, 1969)

Nm

1 FST 4 FST .

50


Vhodnost vyuţití mikrosatelitů k zařazení jedince do příslušné linie. Byla posuzována pomocí přiřazovacího testu, provedeného simulační metodou podle Rannala and Mountain (1997). Tato metoda hodnotí Bayesovským přístupem pravděpodobnost správného zařazení (P-hodnota) kaţdého jedince do linie. Pro přiřazovací test byl pouţit program GENECLASS 2 (Piry, 2004). Správnost zařazení jedince do linie byla ověřena analýzou hlavních komponent (principal component analysis - PCA), k čemuţ byl pouţit softwarový balík GENETIX (Belkhir et al., 2002) Linie starokladrubského koně a jejich zakladatelé jsou uvedeni v tab. 5. Pro srovnání byly stanoveny genetické příbuznosti mezi liniemi pomocí informací z rodokmene. Soubor rodokmenů 324 jedinců zahrnutých do analýzy zahrnoval 5 generací předků. Rodokmenové informace byly vyuţity k odhadu koeficientu inbreedingu (FX) a koeficientu příbuznosti (RXY). Úplnost rodokmenu, který má vysoký význam pro odhad komponent FX a RXY, byla hodnocena dle Cassell et al. (2003):

cp

a

k g i i 1

2

kde: cp – je koeficient úplnosti rodokmenu, ak – je počet známých předků v g generacích.

Z rodokmene byla matice příbuznosti mezi jednotlivými jedinci sestavena od nejstarších jedinců po nejmladší. Koeficient inbreedingu jedince (FX) byl odhadnut jako původový koeficient (coancestry coefficient) dle Falconer and Mackay (1996).

F X = f ZY = 0,25 (f AC + f AD + f BC + f BD) kde: f je původový koeficient mezi dvěma jedinci, např. X a Y přičemţ A a B představují rodiče jedince X; zatímco C a D představují rodiče jedince Y.

51


Podobně jako u koeficientu inbreedingu byl odhadnut i koeficient příbuznosti mezi dvěma jedinci (RXY) opět dle Falconer and Mackay (1996): RXY = 2f XY Pro odhad koeficientů inbreedingu a koeficientu příbuznosti byla vyuţita procedura INBREED programového balíku SAS (SAS, 2005). Míra genetické podobnosti na základě informací z rodokmene byla posouzena metodou shlukové analýzy za vyuţití procedury VARCLUS programového balíku SAS (SAS, 2005). Vstupní data tvořila průměrná hodnota koeficientu příbuznosti mezi liniemi.

5.2.3.2. Analýza mtDNA

Kavar et al. (1999) pouţili pro analýzu sekvencí mtDNA programových balíčků ClustalW a PHYLIP (Felsenstein J. 1993). Stejného programového vybavení bylo pouţito v práci Kavar et al. (2002). Sekvence 385 pb dlouhého fragmentu upstream části a 310 pb dlouhého fragmentu downstream části kontrolní oblasti mtDNA lipicánů byly porovnány se sekvencemi různých plemen domácího koně, sekvencemi koně Przewalského a pozdně pleistocénních koní z Aljašky za pouţití programu ClustalW. Dendrogram byl sestrojen pomocí programu PHYLIP. Graficky byl dendrogram znázorněn pomocí programu TreeView (Kavar et al. 2002). Ve studii zaměřené na variabilitu mtDNA ve vztahu k původům arabských koní chovaných v USA byl k sestrojení dendrogramu taktéţ pouţit PHYLIP (Bowling et al. 2000). ClustalX Multiple Sequence Alingment Program (verze 1.81, Thompson et al. 1997) byl pouţit pro srovnání sekvencí u anglických plnokrevníků (Hill et al. 2002). Fylogenetický strom byl vizualizován pomocí TreeView. Pravděpodobnost identity (PI), tj. pravděpodobnost, ţe dva jedinci v populaci sdílejí identický haplotyp, byla vypočítána jako součet druhých mocnin frekvencí kaţdého haplotypu v dané populaci (PI = ∑ ak2, kde a je frekvence k-tého haplotypu, Bowling et al. 2000).

52


Ostatní statistiky diverzity byly spočítány pomocí programu Arlequin, verze 2.0 (Schneider et al. 2000, in: Hill et al. 2002). Royo et al. (2005) pouţili pro sekvenční analýzu program PILEUP (Feng and Doolittle 1987) z programového balíčku Winsconsin Package 10.2 (Genetics Computer Group, Madison, WI). Fylogenetická analýza byla provedena pomocí Arlequin 2.0 software package (Schneider et al. 2000) a NETWORK 3.1.1.1 (Royo et al. 2005). Luís et al. (2006) provedli rozbor nukleotidové a haplotypové diverzity díky programu DNASP 4.00.5 software a ARLEQUIN 2000 software a NETWORK 4.1.0.8 software. Cothran et al. (2005) pouţili software MEGA verze 2.1. V práci zaměřené na původní japonská plemena bylo pouţito programu Genetyx Mac v. 11.0 (Software Development, Tokyo, Japan, in Kakoi et al. 2007). V této práci byl ke grafickému zobrazení výstupu ze sekvenátoru a jeho převedení do textového souboru ve formátu FASTA byl pouţit program SeqSkape. Mnohočetné přiřazení (multiply alignment) bylo provedeno manuální metodou pomocí volně distribuovaného programového balíčku BioEdit (Hall, 1999) s navazující fylogenetickou analýzu programem ClustalW, včleněným do programu BioEdit. Pro srovnání byla provedena fylogenetická analýza včetně mnohočetného přiřazení pomocí freewarových balíčků, resp. webové sluţby Phylogeny.fr dostupné na adrese http://phylogeny.lirmm.fr/phylo_cgi/index.cgi (Dereeper A. et al. 2008), která nabízí různé postupy, skládající se z řetězce vloţených programů pro jednotlivé kroky plně automatické fylogenetické analýzy. Byly vybrány programové řetězce „One Click“ Mode, kde jsou vloţené programy pro jednotlivé kroky analýzy předvoleny, a „A la Carte“ Mode, kde si uţivatel tyto programy pro kaţdý krok volí sám z uvedené nabídky. V této práci byla pouţita tato kombinace: 1. krok – mnohočetné přiřazení - program T-Coffee 2. krok – zpřesnění („pročištění“) alignmentu – program Gblocks 0.91b 3. krok – odhad fylogeneze – program MrBayes 3.1.2. 4. krok – grafické zobrazení dendrogramu – TreeDyn nebo DrawGram

53


6. Výsledky 6.1. Analýza mikrosatelitní DNA Celkový počet alel nalezených na 16 mikrosatelitních lokusech u starokladrubského koně byl 132. Průměrný počet alel na mikrosatelitní lokus byl 8,25 s rozsahem 4 aţ 14. Pro pozorovanou heterozygotnost napříč všemi mikrosatelitními lokusy byla v průměru odhadnuta hodnota 0,637 a hodnota genetické diverzity 0,678. Pozorovaná heterozygotnost jednotlivých mikrosatelitů se pohybovala v rozmezí od 0,374 u mikrosatelitu HTG6 do 0,827 u mikrosatelitu AHT4. Podobně jako u heterozygotnosti byla nejniţší hodnota genetické diverzity zjištěna u mikrosatelitu HTG6 (0,406). Nejvyšší hodnota genetické diverzity však byla zjištěna u mikrosatelitu VHL20 (0,835). Celkové informace o odlišnostech a souhrnných statistikách jsou v tab. 9. Statisticky průkazná odchylka od HWE byla zjištěna u lokusů ASB23 (P < 0,01), HMS3 (P < 0,01), HMS7 (P < 0,01), HTG7 (P < 0,01) a VHL20 (P< 0,01). Podobné hodnoty pozorované heterozygotnosti a genetické diverzity byly také zjištěny u španělských keltských koní (Cañon et al., 2000), u lipicánů (Achmann et al., 2004), u německých taţných koní (Aberle et al., 2004) a u biłgorajského koně (Ząbek et al., 2005). Naopak Iwańczyk et al. (2006) uvádí hodnoty heterozygotnosti a genetické diverzity pro polské chladnokrevné koně výrazně niţší. Popisné statistiky mikrosatelitů napříč liniemi, tj. počet jedinců, průměrný počet alel, pozorovaná heterozygnost a genetická diverzita jsou uvedeny v tab. 10. Pozorovaná heterozygotnost a genetická diverzita vykazovaly pro všechny linie podobné hodnoty. Nejniţší hodnota heterozygotnosti byla zjištěna u linie Generale (0,569) a nejvyšší hodnota u linie Favory (0,680). Také u genetické diverzity vykazovala nejvyšší hodnotu linie Favory (0,677). Naopak nejniţší hodnotu genetické diverzity vykazovala linie Rudolfo (0,547). Nízká hodnota genetické diverzity u linie Rudolfo však můţe být způsobena zahrnutím nízkého počtu jedinců této linie do analýzy. Hodnoty pozorované heterozygotnosti a genetické diverzity jsou ovlivněny počtem alel. 54


Tab. 9: Charakteristiky a souhrnné statistiky pro mikrosatelitní lokusy analyzované u populace starokladrubského koně

Lokus

Počet alel

Pozorovaná Rozmezí

heterozygotnost

Genet.

Lokace na

Genet. od-

diverzita

chromozomu

lišnost (GST)

AHT4

10

143 – 160

0,827

0,821

24

0,076

AHT5

6

130 – 140

0,716

0,752

8

0,081

ASB2

14

236 – 255

0,821

0,846

15

0,060

ASB17

11

95 – 121

0,784

0,778

2

0,085

ASB23

12

178 – 207

0,534

0,703

3

0,073

CA425

6

234 – 244

0,651

0,622

28

0,029

HMS1

5

174 – 184

0,519

0,543

15

0,063

HMS2

12

217 – 238

0,725

0,734

15

0,044

HMS3

10

148 – 168

0,509

0,607

9

0,070

HMS6

10

155 – 172

0,685

0,713

4

0,075

HMS7

8

117 – 125

0,549

0,625

1

0,076

HTG4

6

127 – 137

0,682

0,700

9

0,106

HTG6

6

79 – 95

0,374

0,406

15

0,114

HTG7

4

117 – 125

0,556

0,600

4

0,162

LEX3

5

144 – 156

0,497

0,561

X

0,044

VHL20

7

85 – 105

0,765

0,835

30

0,115

Průměr

8.25

-

0,637

0,678

-

0,081

Z tab. 10 je zřejmé, ţe s výjimkou linií Generale a Sacramoso dosahovala pozorovaná heterozygotnost vyšší hodnoty neţ genetická diverzita. To naznačuje pokles variability u zmíněných linií. Při poklesu efektivní velikosti populace (Ne) a poklesu variability dochází ke ztrátě vzácných alel z genového poolu a dochází ke sníţení genetické diverzity pod hodnotu pozorované heterozygotnosti, neboť vzácné alely přispívají k hodnotě heterozygotnosti pouze nepatrně (Cunningham et al. 2001). Vyšší hodnoty pozorované heterozygotnosti neţ genetické diverzity pozoroval u ohroţené

55


populace asturonských poníků Cañon et al. (2000) a u malé populace biłgorajských koní také Ząbek et al. (2005). Genetická variabilita u starokladrubského koně se udrţuje pomocí připařovacích plánů, kdy se rodičovské páry sestavují z co moţná nejméně příbuzných jedinců. Díky tomu došlo k sníţení koeficientu inbreedingu v celkové populaci o 2,87% z hodnoty 7,75% u koní narozených v roce 1993 na hodnotu 4,88% u koní narozených v roce 2003 (Jakubec et al. 2009). Hodnoty genetické odlišnosti (GST) vykazovaly celkovou odlišnost 8,1%. Tato hodnota je ve shodě s hodnotami publikovanými Cañon et al. (2000) pro španělské keltské koně. Naopak je v rozporu s hodnotami, které uvádí Bjørnstad et al. (2000) pro norské koně (12%) nebo například pro plemena španělských oslů (3.6%) publikované Aranguren-Méndez et al. (2001). Tab. 10: Charakteristiky a souhrnné statistiky pro mikrosatelitní lokusy analyzované u linií starokladrubského koně

Linie

N

Průměr počtu alel

Pozorovaná heterozygotnost

Genetická diverzita

Generale

40

4,38

0,569

0,575

Generale-Generalissimus

60

5,50

0,623

0,600

Favory

80

6,06

0,680

0,677

Favory-Generalissimus

68

5,69

0,656

0,622

Sacramoso

198

6,75

0,637

0,660

Solo

120

5,44

0,624

0,618

Siglavi Pakra

28

4,25

0,647

0,604

Romke

32

4,63

0,630

0,605

Rudolfo

22

3,94

0,659

0,547

Hodnoty F statistiky jsou uvedené v tab. 11. Hodnoty FST jsou si velmi podobné v rozsahu od 0,024 do 0,123. Z celkové hodnoty FST multilokusů je zřejmé, ţe na celkové genetické proměnlivosti se rozdíly mezi liniemi podílejí jen 7%. Zbylých

56


93% je způsobeno rozdílností mezi jedinci. V průměru má kaţdá linie sníţený podíl heterozygotnosti pod 1%. Celková populace má sníţený podíl heterozygotnosti o 7,3%. Podobné hodnoty také zjistil při porovnání španělských keltských koní Cañon et al. (2000). Vysoké hodnoty FIS pro lokusy ASB23 a HMS3 odpovídají převaze jedinců homozygotních v těchto lokusech. Celková hodnota FIT udává průměrnou míru koeficientu inbreedingu v populaci. Tato hodnota (7,3%) se shoduje s hodnotou, kterou odhadl pro ţijící populaci v roce 1993 Jakubec et al. (2004). Statistické odchylky hodnoty FIS od 0 byly zjištěny u lokusu ASB23 u linií Generale, Generale-Generalissimus, Favory, Favory-Generalissimus, Sacramoso a Solo; u lokusu HMS3 u linií Favory, Generale a Generale-Generalissimus; u lokusu HMS7 u linií Sacramoso a Siglavi Pakra; u lokusu LEX3 u linií Favory-Generalissimus a Romke a u lokusu VHL20 u linie Sacramoso. U těchto mikrosatelitních lokusů a linií dochází k sníţení heterozygotnosti a to můţe mít za následek inbrední depresi. Zvýšení hodnoty FIS však můţe být zapříčiněno Wahlundovým efektem, způsobujícím pokles heterozygotnosti v populaci v důsledku jejího rozdělení na subpopulace, a nikoliv pouze nárůstem koeficientu inbreedingu. Naopak u linií Generale a Solo bylo zjištěno u mikrosatelitního lokusu HMS3, respektive ASB23 zvýšení heterozygotnosti. Statistické odchylky hodnoty FIS od 0 u lokusů ASB23, HMS3, HMS7, LEX3 a VHL20 odpovídají odchylkám těchto lokusů od HWE. Signifikantní odchylka FIS od 0 pro průměrné hodnoty byla zjištěna pouze u linie Favory-Generalissimus. U ostatních linií nebylo zjištěno odchýlení od 0, coţ ukazuje na stabilizaci genetické variability. Statistické sníţení hodnoty FIS u linie Sacramoso vykazuje ţádoucí nárůst genetické variability.

57


Tab. 11: Odhady FIT, FIS celá populace (FIS total), uvnitř liniové FIS a FST

G-Gss = Generale-Generalissimus, F-Gss = Favory-Generalissimus, Sigl.Pakra = Siglavi Pakra * P < 0,05, ** P < 0,01

58


Standardní genetické vzdálenosti (D) mezi liniemi podle Nei (1978) a genetické odlišnosti (diference) stanovené pomocí párového koeficientu FST jsou uvedené v tab. 12. Nejniţší hodnota standardní genetické vzdálenosti podle Nei (1978) byla zjištěna mezi liniemi Sacramoso a Solo (0,049) a nejvyšší mezi liniemi Romke a Rudolfo (0,429). Lze to vysvětlit faktem, ţe Sacramoso a Solo fakticky tvoří jednu linii (zakladatel linie Solo byl z linie Sacramoso), zatímco zakladatelé linií Romke a Rudolfo byli různých plemen, byť společného starošpanělského původu, přičemţ Romke se pouţíval výhradně ve vraném, zatímco Rudolfo pouze v bílém stádě. Podobné hodnoty genetické diverzity publikoval Ząbek et al. (2005) při porovnání malé populace biłgorajských koní s běţnými plemeny koní. Párové (pairwise) koeficienty FST vykazovaly u většiny párů linií střední hodnoty. Pouze mezi liniemi Generale vs. Solo, Generale vs. Siglavi Pakra, Generale vs. Romke, Generale-Generalissimus vs. Siglavi Pakra, Generale-Generalissimus vs. Romke a Siglavi Pakra vs. Rudolfo byla zjištěny vysoké hodnoty FST., coţ ukazuje na vyšší genetickou distanci mezi zmíněnými liniemi. Na druhé straně mezi liniemi Sacramoso vs. Solo či Sacramoso vs. Romke byly odhadnuty hodnoty FST nízké. Z hodnot párového koeficientu FST je zřejmé, ţe od 2 do 17,4% je moţné mikrosatelitní variabilitu u starokladrubského koně vysvětlit rozdělením populace na černé a bílé stádo, které se po dlouhou dobu chovaly odděleně, tj. nedocházelo mezi nimi k výměně ani plemeníků, ani plemenic. Hodnoty FST odpovídají hodnotám genetické vzdálenosti (D). Odhad toku genů (gene flow) je znázorněn jako průměrný počet migrantů za populaci (Nm), viz tab. 12. Největší poměr migrantů byl zjištěn mezi liniemi Sacramoso vs. Solo (12,1) a naopak nejniţší mezi liniemi Siglavi Pakra vs. Rudolfo (1,1). Tuto skutečnost je opět moţno vysvětlit rozdělením plemene na dvě více-méně nezávislé populace. Sacramoso a Solo jsou vrané linie, mezi kterými docházelo k intenzivní výměně chovného materiálu obojího pohlaví, zatímco linie Siglavi Pakra je vraná a linie Rudolfo bílá, tj. byly chovány jedna od druhé odděleně. Počty migrantů za populaci (Nm) jsou ve shodě s hodnotami genetické vzdálenosti (D) a párového koeficientu FST. Vyšší počet migrantů je důsledkem snahy o připařování co nejméně příbuzných jedinců i mezi jednotlivými liniemi, čímţ se zamezuje blízké příbuzenské plemenitbě.

59


Tab. 12: Genetické vzdálenosti D podle Nei (1978) - nad diagonálou FST (pod diagonálou) spolu s počtem efektivních migrantů za populaci (v závorce)

G-Gss = Generale-Generalissimus, F-Gss = Favory-Generalissimus Sigl. Pakra = Siglavi Pakra

60


Z UPGMA dendrogramu (obr. 7) je zřejmé, ţe linie byly rozděleny do dvou základních shluků. Tyto shluky představují rozdělení linií podle barevné varianty. Linie Solo, Romke, Siglavi Pakra a původně i Sacramoso jsou vrané; linie Generale, Generale-Generalissimus, Favory, Favory–Generalissimus a Rudolfo představují zástupce běloušů. Jedinci linie Sacramoso se v poslední době vyskytuji v obou barevných variantách. Z prvního shluku jsou si nejvíce podobné linie Sacramoso a Solo. Tyto dvě linie jsou fakticky totoţné, neboť zakladatelem linie Solo byl hřebec Sacramoso XXXI, který byl v rámci regenerace starokladrubských vraníků přejmenován na Solo I a podílel se tak rozhodujícím způsobem na regeneračním procesu kladrubského vraníka. K těmto dvěma liniím je také v úzkém vztahu linie Romke. Tyto tři linie vykazovaly nejvyšší podobnost mikrosatelitních lokusů z celé populace. Tomu odpovídá i průměrný počet migrujících jedinců (Nm) mezi těmito třemi liniemi (tab. 12). Linie Siglavi Pakra vykazovala od vyjmenovaných linií výraznou genetickou vzdálenost. Toto zjištění však neodpovídá obecně známým faktům ani plemenářským záznamům. Zakladatel linie Siglavi Pakra byl lipický hřebec, tj. plemene nejblíţe příbuzného kladrubskému a mezi oběma plemeny docházelo v minulosti k poměrně časté výměně chovného materiálu (Bílek, 1957). Naproti tomu Romke byl fríský hřebec, coţ je plemeno přes společný starošpanělský původ dosti vzdálené a v chovu starokladrubského koně se aţ na zmíněného hřebce Romke neuplatnilo. Linie Generale– Generalissimus a Favory–Generalissimus vykazovaly nejvyšší genetickou podobnost. Ovšem jak vyplývá z plemenářské dokumentace, linie Generale–Generalissimus je de facto linií Generale, zatímco linie Favory-Generalissimus je ve skutečnosti linií Favory. Není tedy logické, aby linie Generale–Generalissimus (tj. Generale) byla vzdálenější linii Generale, neţ linii Favory–Generalissimus (tj. Favory). Stejně tak neodpovídá známým historickým faktům, aby linii Favory-Generalissimus byla bliţší linie Generale–Generalissimus neţ vlastní Favory. Linie Generale, která sice patří mezi linie nejstarší a současně se podílela, podobně jako linie Favory, na obnovení linie Generalissimus, vykazovala k těmto třem liniím uvnitř druhého shluku největší vzdálenost. Jak uţ bylo zmíněno výše, tato vyšší vzdálenost byla ovlivněna počty migrantů za populaci mezi zmíněnými liniemi. Podle svého původu by totiţ největší vzdálenost vůči ostatním měla vykazovat linie zaloţená poměrně nedávno lusitánským hřebcem Rudolfo, zatímco původní starokladrubská linie Generale a lipická linie Favory by si měly být bliţší. Z hlediska známých původů linií by tedy měly být na jedné 61


větvi linie Generale a Generale–Generalissimus, na sousední větvi Favory a Favory– Generalissimus a na nejvzdálenější větvi Rudolfo. Z obr. 7 dále vyplývá, ţe druhý shluk je charakterizován niţší robustností, neţ první, neboť vykazuje relativně niţší hodnoty bootstrappingu pro jednotlivé větve. Obr. 7: UPGMA dendrogram zkonstruovaný z genetických vzdáleností podle Nei (1978). Červená čísla u jednotlivých větví udávají hodnotu bootstrapingu.

88 97 78

66

100 57 40 77

Obr. 8 a téţ. příloha č. IV, znázorňují výsledky PCA analýzy linií na základě 16 mikrosatelitů. S výjimkou několika málo jedinců rozděluje osa 1 na jedince černé a bílé varianty. U osy 2, která by měla ukázat rozdělení na jednotlivé linie, uţ však k ţádné významné diferenciaci nedošlo. Z grafického znázornění je patrné, ţe jednotlivé linie se mezi sebou navzájem překrývají. U pravého shluku, který zahrnuje jedince linií vrané varianty: Sacramoso, Solo a Romke, je překryv větší. U levého shluku sice nedochází k tak výraznému nahloučení jedinců, ale linie jsou přesto promíchány mezi sebou v celém rozsahu. To je způsobeno nízkou četností populací a snahou o připařování co nejméně příbuzných jedinců metodou střídavého, resp. rotačního připařování.

62


Z výsledků přiřazovacího testu jedinců od příslušných linií bylo zjištěno, ţe na hladině významnosti P < 0,05 a P < 0,01 (10 000 simulovaných jedinců) bylo správně zahrnuto pouze 53,70 % jedinců. Z výsledků hodnot bootstrappingu metody PCA zaloţené na 16 mikrosatelitech a z výsledků přiřazovacího testu vyplývá, ţe rozdílnost mezi jednotlivými liniemi není zřejmá. Z tohoto důvodu vyuţití pouze mikrosatelitních markerů pro přesné zařazení jedinců do linie u plemene starokladrubský kůň není vhodné. Obr. 8: Bodový graf relativních pozic 324 jedinců definovaný metodou hlavních komponent založený na korelační matici alel na 16 mikrosatelitních markerech.

Pro srovnání byla stanovena genetická příbuznost mezi liniemi pomocí informací z rodokmene. U všech testovaných jedinců byl aţ do páté generace zjištěn úplný rodokmen (cp = 1). Popisné statistiky pro hodnoty koeficientu inbreedingu jedinců v jednotlivých liniích jsou uvedeny v tab. 13. Z tab. 13 vyplývá, ţe pro jednotlivé linie se průměrný koeficient inbreedingu pohyboval v rozmezí od 0,048 (Favory) po 0,096 (Generale). Nejvyšší míra variability v hodnotách koeficientu inbreedingu byla odhadnuta u linie Siglavi Pakra (SD = 0,050) a naopak nejniţší u linie Generale– Generalissimus (SD = 0,019). Celková průměrná hodnota koeficientu inbreedingu přes všechny linie dosahovala hodnoty Fx = 0,076 (SD = 0,038). Tato odhadnutá

63


průměrná hodnota koeficientu inbreedingu odpovídá odhadnuté hodnotě FIT v molekulární části analýzy (tab. 11, FIT = 0,073) a také hodnotě, kterou publikovali Jakubec et al. (2009) v analýze zahrnující všechny jedince populace starokladrubského koně narozené v roce 1993 (Fx = 0,0775).

Tab. 13: Popisné statistiky koeficientu inbreedingu (Fx) v liniích Linie

Průměr Fx

SD

Min

Max

Generale

0,096

0,022

0,062

0,139

Generale-Generalissimus

0,078

0,019

0,042

0,128

Favory

0,048

0,029

0,003

0,155

Favory-Generalissimus

0,049

0,030

0,005

0,096

Sacramoso

0,091

0,040

0,006

0,222

Solo

0,080

0,035

0,003

0,207

Siglavi Pakra

0,082

0,050

0,011

0,177

Romke

0,084

0,043

0,004

0,151

Rudolfo

0,051

0,025

0,011

0,085

Vše

0,076

0,038

0,003

0,222

Fx = koeficient inbreedingu, SD = míra variability v hodnotách koeficientu inbreedingu

Odhadnuté průměrné hodnoty koeficientu příbuznosti uvnitř a mezi jednotlivými liniemi jsou uvedeny v tab. 14. Průměrné hodnoty koeficientu příbuznosti uvnitř linií se pohybovaly v rozmezí od 0,179 (Favory a Sacramoso) aţ 0,304 (Generale– Generalissimus). Průměrné hodnoty koeficientu příbuznosti mezi jednotlivými liniemi se pohybovaly od 0,040 (Generale–Generalissimus × Sacramoso) do 0,214 (Generale × Generale–Generalissimus). Vyšší průměrné hodnoty koeficientu příbuznosti svědčí o vyšší příbuznosti (provázanosti) jedinců linií. Celkově nízké hodnoty byly zjištěny mezi liniemi barevných variant (vraníci × bělouši). Naopak uvnitř barevné varianty byla zjištěna vyšší průměrná hodnota koeficientu příbuznosti neţ mezi lini64


emi. To lze opět vysvětlit sestavováním rodičovských pádů z jedinců stejné barevné varianty. K připařování jedinců různých barevných variant dosud docházelo pouze v malé míře.

Tab. 14: Průměrné hodnoty koeficientu příbuznosti uvnitř (na diagonále) a mezi liniemi (nad diagonálou) Linie Generale G_Gss Favory. F_Gss Sacramoso

G

G-Gss

Favory

F-Gss

Sacr.

Solo

SP

Romke

Ru

0,301

0,214

0,152

0,173

0,085

0,039

0,056

0,042

0,198

0,304

0,153

0,176

0,087

0,040

0,045

0,043

0,176

0,179

0,126

0,107

0,080

0,073

0,082

0,132

0,231

0,111

0,086

0,090

0,099

0,146

0,179

0,176

0,159

0,162

0,091

0,257

0,195

0,212

0,052

0,279

0,185

0,064

0,215

0,065

Solo Sigl. Pakra Romke Rudolfo

0,256

G = Generale, G-Gss = Generale-Generalissimus, F-Gss = Favory-Generalissimus, Sacr. = Sacramoso, SP = Siglavi Pakra, Ru = Rudolfo

Z průměrných hodnot koeficientů příbuznosti mezi liniemi v tab. 14 byl sestaven graf shlukové analýzy (obr. 9). Tuto metodu pro zjištění podobnosti mezi jedinci plemene starokladrubského koně jiţ dříve pouţil Přibyl et al. (1997). Na základě informací z rodokmene byly linie, podobně jako na základě mikrosatelitních markerů, rozděleny do dvou základních shluků dle barevné varianty. Uvnitř těchto shluků dochází ve srovnání se shluky dle mikrosatelitních markerů k mírným změnám. U černé varianty vykazovaly nejvyšší příbuznost linie Solo a Romke. K těmto dvěma liniím je také v úzkém příbuzenském vztahu linie Sacramoso. Ani tyto výsledky však nejsou ve shodě s vývojovou příbuzností linií, neboť linie Solo vznikla formálním odštěpením od linie Sacramoso, a tedy jsou fakticky totoţné. Proto by z tohoto hlediska nejvyšší příbuznost měly vykazovat tyto dvě linie, další v pořadí by měla být linie Siglavi Pakra a nejvzdálenější by měla být linie Romke.

65


U linií bílé barvy byly při stanovení genetické příbuznosti touto metodou v nejbliţším příbuzenském vztahu linie Generale a Rudolfo, dále Favory a Favory– Generalissimus. Uţší příbuzenský vztah mezi liniemi Favory a Favory– Generalissimus lze vysvětlit jiţ zmíněnou regenerací linie Generalissimus linií Favory, avšak blízký příbuzenský vztah mezi Generale a Rudolfo nemá opodstatnění. Obr. 9: Shluková analýza zkonstruovaná z průměrných koeficientů příbuznosti mezi liniemi F F-Gss G-Gss G Ru Solo Ro Sacr SP

G = Generale, G-Gss = Generale-Generalissimus, F = Favory, F-Gss = Favory-Generalissimus, Sacr = Sacramoso, Solo = Solo, SP = Siglavi Pakra, Ro = Romke, Ru = Rudolfo

Při porovnání odhadnutých hodnot na základě mikrosatelitních markerů a rodokmenových informací jsou patrné jisté rozdíly pouze v utváření shluků uvnitř barevných variant (obr. 8). Je zřejmé, ţe zařazení jedince do linie u plemene starokladrubský kůň pouze na základě analýzy 16 mikrosatelitních lokusů rozptýlených na 10 chromozómech není spolehlivé. Avšak ani genetická příbuznost mezi liniemi stanovená pomocí informací z rodokmene neodpovídá známým faktům jejich vzniku a vývoji.

66


6.2. Analýza mtDNA Byla provedena analýza 293 nukleotidového úseku D smyčky mtDNA u 170 kladrubských koní z 23 rodin (tab. 15).

Tab. 15: Seznam sledovaných rodin a používané zkratky

RODINA

Africa - Maestosa "E" (1740) Almerina - Albona (1769) Almerina - Aluta "P" (1769) Almerina - Campanella (1769) Almerina - Egloga (1769) Almerina - Formosa (1769) Almerina - Maja (1769) Bárta (1953) Cariera (1894) Dana "G" (1969) Deflorata - Plutona (1767) Favora (1963) Madar VI - Káča "F" (1782) Narcis "I" (1939) Ragusa (1888) Ragusa-Raguza (1888) Rava - Maga(1755) Rava - Ravana (1755) Ritorna (1974) Sardinia - Magura (1970) Sardinia - Neapolitana "C" (1770) Sardinia - Septimia (1770) Xandra (1938)

ZKRATKA

Barva

počet zv.

Pozn.

AFM ALA ALU ALC ALE ALF ALM B C DA DEP F M N RS RSR RVM RVR RIT SAM SAN SAS X

vr-běl běl běl vr-běl běl* vr vr-běl vr-běl běl* běl vr běl běl vr-běl běl vr-běl vr-běl běl vr vr vr-běl vr-běl vr-běl

7 15 4 8 12 6 7 9 12 4 2 9 3 7 13 5 4 5 5 10 7 7 9

reg

reg reg reg reg

reg

reg reg reg

reg reg reg reg

*) - ve zkoumaném vzorku zvířat z této rodiny se vyskytla 1 hnědka reg = rodiny zaloţené v rámci regeneračního procesu kladrubského vraníka

67


Do souboru byly zahrnuty téţ příslušné části DNA dvou jedinců osla domácího (Equus asinus accession DQ368596, verze DQ368596.1, GI:86559260, Equus asinus accession NC001788, verze NC_001788.1, GI:5835345) a andaluského koně (Pura Raza

- PRE; accession EU256622, verze EU256622.1, GI:165911376) z

nukleotidové databáze GenBank. Jako referenční (outgroop) sekvence byla pouţita sekvence GI:86559260 (GenBank). V tomto souboru bylo identifikováno 16 (resp. 17 při zahrnutí sekvence PRE do souboru) různých haplotypů. Oproti referenční sekvenci bylo nalezeno 48 (resp. 49 včetně PRE) polymorfních lokusů (příloha č. II). Průměrný počet polymorfismů na jeden haplotyp je 33,29; včetně PRE pak 33,39. Nejniţší počet rozdílů oproti referenční sekvenci byl 31, nejvíce 38 (bez PRE i vč. PRE). Počet polymorfních lokusů pouze v souboru kladrubských koní (tj. bez outgroop sekvence i bez sekvence PRE) činil 20, při zahrnutí sekvence PRE do souboru pak 21 (tab. 16). Jednotlivé kladrubské sekvence se od sebe navzájem lišily v rozmezí od 1 po 12 rozdílných lokusů.

V rámci fylogenetické analýzy byly potvrzeny tyto rodiny (seznam rodin a zkratek viz tab. 15): Bárta (B), Dana „G“ (DA), Madar VI–Káča „F“ (M), Rava– Maga (RVM), Rava-Ravana (RVR), Ritorna (RIT), Sardinia–Magura (SAM), Sardinia–Neapolitana „C“ (SAN), Sardinia–Septimia (SAS.ost.), které tvoří samostatné clustery. Z rodiny SAS se vyčleňují 2 zvířata:  962 Santana (číslo genobanky A2575, rodina SAS), jejíţ haplotyp se od haplotypu ostatních příslušníků rodiny liší na lokusu 144 (substituce A/G- Santana/SAS), 121 (G/A) a 288 (T/C)  405 Sorga (A2601SAS) se substitucemi T/G (Sorga/SAS) na 114. lokusu a T/C na 288. lokusu.

68


Tab. 16: Polymorfní lokusy kladrubských rodin

Afr-Rag = Africa–Maestosa „E“, Ragusa, Ragusa-Raguza SDFN = 390 Caprida (A2605SAN), Deflorata-Plutona, Favora, Narcis „I“ SAS A2575 = 962 Santana (č. genobanky A2575, rodina Sardinia- Septimia) SAS A2601 = 405 Sorga (č. genobanky A2601, rodina Sardinia- Septimia)

69


Dále byly identifikovány tři clustery tvořené třemi skupinami rodin, které sdílejí identické haplotypy:  Deflorata-Plutona, Favora, Narcis „I“ (SDFN) s identickými haplotypy, kterým odpovídá i haplotyp klisny 390 Caprida (č. vz. A2605SAN) z rodiny Sardinia–Neapolitana. Celý tento cluster včetně klisny 390 Caprida se od rodiny Sardinia–Neapolitana „C“ liší pouze na jednom lokusu, kde na pozici 119 je u SAN thymin, zatímco u výše jmenovaného clusteru včetně 309 Capridy cytosin.  Cariera a Xandra (C-X), jejichţ haplotypu je velmi blízká sekvence PRE, která se od této skupiny odlišuje pouze jedním nukleotidem na pozici 218, kde u clusteru C-X je adenin a u PRE guanin.  Afrika–Maestosa „E“, Ragusa a Ragusa-Raguza (Afr-Rag),

Naproti tomu rodina Almerina se rozpadá na dva clustery, a to na cluster tvořený podrodinou Almerina–Albona (ALA), který má na 220 lokusu thymin, a na cluster tvořený ostatními podrodinami (Alm.ost.), který má na tomto lokusu cytosin.

Výše uvedené clustery jsou sdruţeny do několika haploskupin na nadřazených větvích. Vzájemná poloha i skladba těchto větví se u jednotlivých programů mírně liší. Podle programu ClustalW je to 5 větví (obr. 10, 13): 1.

Afr-Rag

2.

RVR

3.

SAN,SDFN, ALA ─ Alm.ost

4.

SAM, C-X, PRE

5.

DA, RVM, B, RIT, M, SAS.ost, 962 Santana (A2575SAS) ─ 405 Sorga (A2601SAS)

70


Podle programu „One Click“ Mode (obr. 11, 14): 1.

B

2.

SAS.ost

3.

962 Santana (A2575SAS). ─ 405 Sorga (A2601SAS)

4.

M

5.

RIT

6.

SAM, PRE ─ C-X

7.

RVM ─ DA, RVR, Afr-Rag, ALA ─ Alm.ost ─ SAM ─ SDFN

Podle programu „A la Carte“ Mode (obr. 12, 15): 1.

RVR ─ DA

2.

SAS.ost ─ 405 Sorga (A2601SAS), B

3.

M

4.

SAM, PRE ─ C-X

5.

RIT

6.

962 Santana (A2575SAS).

7.

Afr-Rag

8.

RVM, ALM.ost ─ ALA, SDFN ─ SAN

Clustery spojené v rámci nadřazené větve tučnými pomlčkami jsou umístěny na společné větvi niţšího řádu.

71


Obr. 10: Fenogram v programu ClustalW E as 2

E as 1

RVR.

Afr-Rag

SAN.

SDFN

Alm.ost

ALA.

SAM.

C-X

PRE

DA.

RVM.

B.

RIT.

M.

SAS.ost

A2575SAS.

A2601SAS.

E as 1 = outgroop - Equus asinus (osel domácí) accession DQ368596, verze DQ368596.1, GI:86559260; E as 2 = Equus asinus NC001788, v. NC_001788, GI:5835345; Afr-Rag = Afrika– Maestosa „E“,Ragusa a Ragusa-Raguza; ALA = Almerina-Aluta, Alm.ost. = ostatní podrodiny Almeriny, B = Bárta; C-X = Cariera a Xandra; DA = Dana „G“; M = Madar VI–Káča „F“; PRE = andaluský kůň (

; accession EU256622, v. EU256622.1, GI:165911376); RIT = Ritorna;

RVM = Rava–Maga; RVR = Rava-Ravana; SAM = Sardinia–Magura; SAN = Sardinia–Neapolitana „C“; SAS.ost = Sardinia–Septimia; SDFN = A2605SAN (390 Caprida, č. genobanky A2605, rodina Sardinia-Neapolitana), Deflorata-Plutona, Favora a Narcis „I“; A2575SAS = 962 Santana (SardiniaSeptimia); A2601SAS = 405 Sorga (Sardinia-Septimia)

72


Obr. 11: Fenogram v modu „One Click“

E_as = outgroop - Equus asinus (osel domácí) accession DQ368596, verze DQ368596.1, GI:86559260; E_as_2 = Equus asinus NC001788, v. NC_001788, GI:5835345; Afr-Rag = Afrika– Maestosa „E“,Ragusa a Ragusa-Raguza; ALA = Almerina-Aluta, Alm.ost. = ostatní podrodiny Almeriny, B = Bárta; C-X = Cariera a Xandra; DA = Dana „G“; M = Madar VI–Káča „F“; PRE = andaluský kůň RIT = Ritorna; RVM = Rava–Maga; RVR = Rava-Ravana; SAM = Sardinia–Magura; SAN = Sardinia–Neapolitana „C“; SAS.ost = Sardinia–Septimia; SDFN = A2605SAN (390 Caprida, SardiniaNeapolitana), Deflorata-Plutona, Favora a Narcis „I“; A2575SAS = 962 Santana (Sardinia- Septimia); A2601SAS = 405 Sorga (Sardinia- Septimia) Červená čísla udávají hodnotu bootstrapu.

73


Obr. 12: Fenogram v modu „A la Carte“

E_as = outgroop - Equus asinus (osel domácí) accession DQ368596, verze DQ368596.1, GI:86559260; E_as_2 = Equus asinus NC001788, v. NC_001788, GI:5835345; Afr-Rag = Afrika– Maestosa „E“,Ragusa a Ragusa-Raguza; ALA = Almerina-Aluta, Alm.ost. = ostatní podrodiny Almeriny, B = Bárta; C-X = Cariera a Xandra; DA = Dana „G“; M = Madar VI–Káča „F“; PRE = andaluský kůň; RIT = Ritorna; RVM = Rava–Maga; RVR = Rava-Ravana; SAM = Sardinia–Magura; SAN = Sardinia–Neapolitana „C“; SAS.ost = Sardinia–Septimia; SDFN = A2605SAN (390 Caprida, SardiniaNeapolitana), Deflorata-Plutona, Favora a Narcis „I“; A2575SAS = 962 Santana (Sardinia- Septimia); A2601SAS = 405 Sorga (Sardinia- Septimia) Červená čísla udávají hodnotu bootstrapu.

74


Obr. 13: Fylogram v programu ClustalW E as 2

E as 1

RVR.

Afr-Rag

SAN.

SDFN

Alm.ost

ALA.

SAM.

C-X

PRE

DA.

RVM.

B.

RIT.

M.

SAS.ost

A2575SAS.

A2601SAS. 0.1

E as 1 = outgroop - Equus asinus (osel domácí) accession DQ368596, verze DQ368596.1, GI:86559260; E as 2 = Equus asinus NC001788, v. NC_001788, GI:5835345; Afr-Rag = Afrika– Maestosa „E“,Ragusa a Ragusa-Raguza; ALA = Almerina-Aluta, Alm.ost. = ostatní podrodiny Almeriny, B = Bárta; C-X = Cariera a Xandra; DA = Dana „G“; M = Madar VI–Káča „F“; PRE = andaluský kůň; RIT = Ritorna; RVM = Rava–Maga; RVR = Rava-Ravana; SAM = Sardinia–Magura; SAN = Sardinia–Neapolitana „C“; SAS.ost = Sardinia–Septimia; SDFN = A2605SAN (390 Caprida, SardiniaNeapolitana), Deflorata-Plutona, Favora a Narcis „I“; A2575SAS = 962 Santana (Sardinia- Septimia); A2601SAS = 405 Sorga (Sardinia- Septimia)

75


Obr. 14: Fylogram v modu „One Click“

E_as = outgroop - Equus asinus (osel domácí) accession DQ368596, verze DQ368596.1, GI:86559260; E_as_2 = Equus asinus NC001788, v. NC_001788, GI:5835345; Afr-Rag = Afrika– Maestosa „E“,Ragusa a Ragusa-Raguza; ALA = Almerina-Aluta, Alm.ost. = ostatní podrodiny Almeriny, B = Bárta; C-X = Cariera a Xandra; DA = Dana „G“; M = Madar VI–Káča „F“; PRE = andaluský kůň; RIT = Ritorna; RVM = Rava–Maga; RVR = Rava-Ravana; SAM = Sardinia–Magura; SAN = Sardinia–Neapolitana „C“; SAS.ost = Sardinia–Septimia; SDFN = A2605SAN (390 Caprida, SardiniaNeapolitana), Deflorata-Plutona, Favora a Narcis „I“; A2575SAS = 962 Santana (Sardinia- Septimia); A2601SAS = 405 Sorga (Sardinia- Septimia) Červená čísla udávají hodnotu bootstrapu.

76


Obr. 15: Fylogram v modu „A la Carte“

E_as = outgroop - Equus asinus (osel domácí) accession DQ368596, verze DQ368596.1, GI:86559260; E_as_2 = Equus asinus NC001788, verze NC_001788, GI:5835345; Afr-Rag = Afrika– Maestosa „E“,Ragusa a Ragusa-Raguza; ALA = Almerina-Aluta, Alm.ost. = ostatní podrodiny Almeriny, B = Bárta; C-X = Cariera a Xandra; DA = Dana „G“; M = Madar VI–Káča „F“; PRE = andaluský kůň; RIT = Ritorna; RVM = Rava–Maga; RVR = Rava-Ravana; SAM = Sardinia–Magura; SAN = Sardinia–Neapolitana „C“; SAS.ost = Sardinia–Septimia; SDFN = A2605SAN (390 Caprida, SardiniaNeapolitana), Deflorata-Plutona, Favora a Narcis „I“; A2575SAS = 962 Santana (Sardinia-Septimia); A2601SAS = 405 Sorga (Sardinia-Septimia) Červená čísla udávají hodnotu bootstrapu.

77


7. Diskuse Vhodnost vyuţití mikrosatelitů pro zařazování kladrubského koně do linií se nepotvrdila. Příčinou je příbuzenská plemenitba pouţívaná po dlouhou dobu při malé četnosti populace. Za takových okolností dochází k výměně jaderného genetického materiálu v takové míře, ţe se nemůţe vytvořit sada chromosomů, a tedy i mikrosatelitů charakteristická pro danou linii. Proto jsou patrné jisté rozdíly pouze v utváření shluků uvnitř barevných variant (obr. 8), neboť ty se chovají více méně odděleně. Vzhledem k povaze jaderné dědičnosti lze očekávat, ţe stejná situace nastane i při snaze zařadit tímto způsobem kladrubské koně do rodin. Z tohoto důvodu jsem od ověřování tohoto bodu upustila. Fylogenetická analýza mtDNA potvrdila, ţe rozčlenění populace starokladrubského koně do rodin má u zkoumaného souboru své genetické opodstatnění. Rodiny vedené v plemenářských záznamech nejsou v rozporu s rozdělením mitochondriálních haplotypů, naopak v některých případech poskytují dokonce podrobnější členění. Ve zkoumaném vzorku bylo zjištěno 16 haplotypů, z nichţ: ● 9 haplotypů odpovídá rodinám uváděným v rodokmenech: (Bárta /B/, Dana „G“/DA/, Madar VI–Káča „F“ /M/, Rava–Maga /RVM/, Rava-Ravana /RVR/, Ritorna /RIT/, Sardinia–Magura /SAM/, Sardinia–Neapolitana „C“ /SAN/, Sardinia–Septimia /SAS.ost./). ● 3 haplotypy jsou společné vţdy několika rodinám sdruţeným do skupiny: 1. Afr-Rag: -Maestosa „E“, Ragusa, Ragusa-Raguza 2. C-X:

Cariera – Xandra

3. SDFN:

Deflorata-Plutona, Favora, Narcis „I“

Příčinou toho můţe být společný původ rodin v dané skupině, tj. ze stejné zakladatelky. Další moţností je, ţe haplotypy rodin dané skupiny jsou polymorfní v downstream oblasti D smyčky mtDNA.

78


● Rodina Almerina, dle rodokmenových záznamů rozčleněná na 6 podrodin, se rozpadá pouze na dvě genetické podrodiny tvořené dvěma různými haplotypy: 1. Almerina-Albona /ALA/ 2. „ostatní“ /Alm.ost/: Alm.-Aluta „P“, Alm.-Campanella, Alm.-Egloga, Alm.-Formosa, Alm.-Maja. Toto členění bylo zaznamenáno u všech zkoumaných zvířat z rodiny Almerina (celkem 52 zvířat; z toho 15 z podrodiny Almerina-Albona a 37 zvířat z ostatních podrodin) bez výjimky. Je proto málo pravděpodobné, ţe jde o chybu ve zpracování vzorků. Vzhledem k tomu, ţe se tyto haplotypy liší pouze na jednom lokusu, příčinou je nejspíše mutace na větvi vedoucí k podrodině Almerina-Albona. V úvahu přicházejí klisny Albona (generace F9 od Almeriny), Duse (F10), 89 Generalissimus Albona (F8), 103 Generale nebo 334 Shagya, neboť byly ve své generaci jedinými představitelkami této rodiny a tudíţ pouze jejich haplotyp se přenesl na pokračovatelky (viz příloha č. I). ● 3 klisny - 962 Santana, 405 Sorga podle rodokmenu z rodiny SardiniaSeptimia a 390 Caprida z rodiny Sardinia-Neapolitana „C“, tj. 1,76 % z celkového počtu sledovaných zvířat, mají haplotypy odlišné od haplotypů svých rodin. 962 Santana a 405 Sorga se od rodiny Sardinia-Septimia liší třemi, resp. jednou substitucí, zatímco haplotyp 390 Capridy odpovídá skupině SDFN a nikoliv rodině SardiniaNeapolitana „C“. Z tohoto důvodu je na místě zopakovat analýzu mtDNA těchto zvířat a případně jejich potomků či nejbliţších příbuzných po mateřské linii. Ovšem i v případě, ţe je tato nesrovnalost způsobena nesprávnými plemenářskými záznamy, dokládají tyto výsledky mimořádnou preciznost v evidenci rodokmenů, neboť obvykle se v podobných studiích odhalí kolem 10 % rodokmenů neodpovídajících genetickým datům (Bowling et al. 2000, Dovc et al. 1996 et 2006, Hill et al. 2002, Ivankovic et al. 2002, Kavar et al. 1999 et 2002). U nadřazených haploskupin, které objasňují širší příbuzenské vztahy mezi jednotlivými haplotypy, je situace méně jednoznačná. Avšak i kdyţ se dendrogramy zkonstruované jednotlivými programy do jisté míry liší, můţeme u nich nalézt shodu nebo alespoň velkou podobnost některých haploskupin. Analýza pomocí všech tří programových balíčků potvrdila tyto:

79


RVM; Alm.ost., ALA; SDFN, SAN; Afr-Rag (bootstrapová podpora větve 0,83 u „One Click“ modu. U „A la Carte“, bootstrap této větve není uveden, ale větev niţšího řádu sdruţující haplotypy ALA, Alm.ost., SDFN a SAN má bootstrapovou podporu 0,81. C-X,PRE; SAM (bootstrap „One Click“0,98, „A la Carte“ 0,99) Haplotypy SDFN - SAN a ALA - Alm.ost. jsou vţdy na jedné větvi, ať uţ jako samostatný cluster („A la Carte“ Mode), nebo alespoň jako součást nadřazeného clusteru jako v případě programu ClustalW a „One Click“ Mode. Jako stabilní se jeví téţ uskupení 962 Santana, 405 Sorga a SAS.ost., i kdyţ jejich začlenění do clusterů vyššího řádu je mírně odlišné. Bootstrapová podpora 0,8 větve příslušející clusteru SDFN – SAN – ALA – Alm.ost. a 0,98 („One Click“), resp. 0,99 („A la Carte“) větve C-X – PRE – SAM, stejně jako jejich poměrně stabilní uskupení, ukazuje na značnou robustnost těchto clusterů. Bootstrapové hodnoty ostatních větví jsou příliš nízké, takţe příbuzenské vztahy mezi clustery na nich leţícími nelze spolehlivě posoudit.

80


8. Závěr Hypotéza o vyuţití mikrosatelitů pro ověření správnosti zařazení kladrubských koní do linií a rodin nebyla potvrzena. Vzhledem k mendelistické dědičnosti mikrosatelitů, malé četnosti plemene a vysokému stupni meziliniové plemenitby, při němţ se stírá genetický vliv otce zakladatele, mikrosatelitní DNA není vhodným kritériem pro zařazování jedinců do linií. Stejný problém nastane, pouţije – li se analýza mikrosatelitní DNA pro zařazování koní do rodin, neboť jaderné geny se přenášejí na potomky po mateřské i po otcovské linii podle stejných principů. Ani vyuţití současné mikrosatelitní analýzy pro odhad koeficientu inbreedingu není optimální. Sestavování rodičovských párů pouze na základě informací o zařazení jedince do linie podle chovatelských záznamů se ukazuje při snaze o sníţení koeficientu inbreedingu jako dostačující. K podobným závěrům dospěli také Baumung and Sölkner (2003), podle nichţ i neúplný rodokmen je pro odhad koeficient inbreedingu a dalších populačních parametrů vhodnější neţ mikrosatelitní markery. K dosaţení shodných vypovídacích hodnot ze srovnání významnosti mezi rodokmenovými informacemi a mikrosatelitními markery by podle těchto autorů muselo být sledováno více neţ 100 (lépe 200) markerů. Analýzou mtDNA se zjistilo, ţe 9 rodin má svůj vlastní unikátní haplotyp. Rodina Almerina, která se dělí na 6 podrodin, má haplotypy dva – jeden zastupuje podrodinu Almerina Aluta, druhý ostatní podrodiny Almeriny. Příčinou toho je spíše mutace, ke které pravděpodobně došlo u některé ze zakladatelek podrodiny, neţ chyba v plemenářských záznamech. Tomu nasvědčuje i fakt, ţe obě skupiny se liší pouze v jednom nukleotidu. 8 rodin je sloučeno do tří haplotypů, coţ znamená, ţe buď kaţdá tato haplotypová skupina pochází z jedné matky zakladatelky a tudíţ se jedná o jednu haplotypovou rodinu a rodokmenové členění je pouze formální, nebo ţe rozdíly se nacházejí v jiné části mtDNA, např. v downstream oblasti D-smyčky. Její dodatečná analýza umoţní získat přesnější údaje o příbuzenských vztazích mezi těmito rodinami Haplotypy 3 zvířat neodpovídají haplotypům jejich rodin, coţ je 1,76 % z celkového mnoţství zkoumaných zvířat. I v případě, ţe se jedná o chybně sestavené

81


rodokmeny, vypovídá to o velmi pečlivém vedení plemenářských záznamů, neboť obvykle se rodokmeny s výsledky analýzy mtDNA rozcházejí přibliţně v 10 % případů. Na základě těchto výsledků lze pokládat hypotézu č. 2, tj. ţe variabilita mitochondriální DNA je vhodným kritériem pro zařazování kladrubských koní do rodin, za potvrzenou.

82


9. PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY ABERLE K. S., HAMANN H., DRÖGEMÜLLER, DISTL O. (2004) Genetic diversity in German draught horse breeds compared with a group of primitive, riding and wild horses by means of microsatellite DNA markers. Animal Genetics, 35, 270–277. ACHMANN R., CURIK I., DOVC P., KAVAR T., BODO I., HABE F., MARTI E., SÖLKNER J. AND BREM G. (2004) Microsatellite diversity, population subdivision and gene flow in the Lipizzan horse. Animal Genetics, 35, 285–92 ANDERSON S., BANKIER A. T., BARRELL B. G., DE BRUIJN M.H.L., COULSON A. R., DROUIN J., EPERON I. C., NIERLICH D.P., ROE B.A., SANGER F., SCHREIER P.H., SMITH A.J.H., STADEN R.

AND

YOUNG I.G. (1981) Sequence and organi-

zation of the human mitochondrial genome. Nature 290, 457-65; in: Ishida et al., 1994a. ANDERSON S.,

DE

BRUIJN M.H.L., COULSON A.R., EPERON I.C., SANGER F.

AND

YOUNG I.G. (1982) Complete sequence of bovine mitochondrial DNA, conserved features of the mammalian mitochondrii geonome. Journal of Molecular Biology 156, 683-717; in: Ishida et al., 1994a AQUADRO C.F. AND GREENBERG B.D. (1982) Human mitochondrial DNA variation and evolution: analysis of nucleotide sequences from seven individuals. Genetics 103: 287-312 ARANGUREN-MÉNDEZ J., JORDANA J., GOMEZ M. (2001): Genetic diversity in Spanish donkey breeds using microsatellite DNA markers. Genetics Selection Evolution 33, 433-442. ÁRNASON U, GILBERT A.

AND

WIDEGREN B. (1991) The complete nucleotide

sequence of the mitochondrial DNA of the fin hale, Balaneoptera Physalus. Journal of Molecular Evolution 33, 556-68

83


ARONSON J.D. (2005) DNA fingerprinting on trial: the dramatic early history of a new forensic technique Endeavour 29(3),126-31 AVISE J.C. (1991) Matriarchal liberation. Nature 352, 192 AZOR P.J., VALERA M., GÓMEZ M.D., GOYACHE F. AND MOLINA A. (2007) Genetic characterization of the Spanish Trotter horse breed using microsatellite markers. Genetics and Molecular Biology, 30, 1, 37-42 BAUMUNG R., SÖLKNER J. (2003) Pedigree and marker information requirements to monitor genetic variability. Genetics Selection Evolution 35, 369 – 383. BELKHIR K., BORSA P., CHIKHI L., RAUFASTE N, BONHOMME F. (2001) GENETIX 4.02, logiciel sous Windows TM pour la génétique des populations. Laboratoire Génome, Populations, Interactions, CNRS UMR 5000, Université de Montpellier II, Montpellier (France). BELKHIR K., BORSA P., CHIKHI L., RAUFASTE N.

AND

BONHOMME F. (2002)

GENETIX, Version 4.04 logiciel sous Windows TM pour la Genetique des populations. Laboratoire Génome, Populations, Interactions CNRS UMR 5000, Université de Montpellier II, Montpellier, France. In: (Achmann et al. 2004). BIBB M.J., VAN ETTEN R.A., WRIGHT C.T., WALBERG M.W. AND CLAYTON D.A. (1981) Sequence and gene organization of mouse mitochondrial DNA. Cell 26, 167-80; in: Ishida et al., 1994a BÍLEK F.: Kůň lipicánský – lipicán. Kůň starokladrubský. IN: Speciální zootechnika II. Chov koní. 74-104. Státní zemědělské nakladatelství Praha, 1957 BJØRNSTAD G., GUNBY E., RØED K. H. (2000): Genetic structure of Norwegian horse breeds. Journal of Animal Breeding and Genetics 117, 307 – 317 BOORE J.L. (1999) Animal mitochondrial genomes. Nucleic Acids Research 27, 1967-80

84


BOWLING A.T., DE VALLE A. AND BOWLING M. (2000) A pedigree-based study of mitochondrial D-loop DNA sequence variation among Arabian horses. Animal Genetics 31, 1-7 BROWN T.A. (1999) Genomes. John Wiley and sons, Inc., USA and Can., by arrangement with Bios Scientific Publisher Ltd, Oxford, U. K BROWN W.M. (1985) The mitochondrial genome of animals. In: Molecular Evolutionary Genetics. Edited by MacIntyre R.J., Plenum, New York, pp.95-130. BROWN W.M., GEORGE M. JR. AND WILSON A.C. (1979) Rapid evolution of animal mitochondrial DNA. PNAS – Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 76, 1967-71 BURÓCZIOVÁ M., ČERMÁKOVÁ J., DVOŘÁK J. (2005) Vyuţitie DNA-mikrosatelitov pre overovanie pôvodu koní. In: MendelNet Agro 05. Proceeding of Ph.D. students conference. BUITKAMP J., AMMER H. AND GELDERMANN H. (1991) DNA fingerprinting in domestic animals Electrophoresis 12 (2-3), 169-74 BURGER G., GRAY M.W. AND LANG B.F. (2003) Mitochondrial genomes: Anything goes. TRENDS in Genetics 19, No.12, 709-716 CANN R.L., BROWN W.M. AND WILSON A.C. (1984)Polymorfic sites and the mechanism of evolution in human mitochondrial DNA. Genetics 106, 479-99 CANN R.L., STONEKING M. AND WILSON A.C. (1987) Mitochondrial DNA and human evolution. Nature 325, 31-6 CAÑON J., CHECA M.L., CARLEOS C., VEGA-PLA J.L., VALLEJO M., DUNNER S. (2000) The genetic structure of Spanish Celtic horse breeds inferred from microsatellite data. Animal Genetics, 31: 39-48. CASSELL B.G., ADAMEC V., REARSON R.E. (2003) Effect of incomplete pedigrees on estimates of inbreeding and inbreeding depression for days to first service and

85


summit milk yield in Holsteins and Jersey. Journal of Dairy Science 86: 2967 – 2976 CHAKRABORTY R. AND JIN L. (1993) Determination of relatedness between individuals by DNA fingerprinting. Human Biology 65, 875–95; in: Achmann et al., 2004 CORNUET J.-M., PIRY S., LUIKART G., ESTROUP A. AND SOLIGNAC M. (1999) New methods employing multilocus genotypes to select or exclude populations as origins of individuals. Genetics 153, 1989–2000. in: Achmann et al. 2004. COTHRAN E.G., RYTIS JURAS

AND

VALE MACIJAUSKIENE (2005) Mitochondrial

DNA D-loop sequence variation among 5 maternal lines of the Zemaitukai horse breed. Genetics and Molecular Biology,28, 4, 677-681 CUNNINGHAM E.P., DOOLEY J.J., SPLAN R.K. BRADLEY D.G. (2001) Microsatellite diversity, pedigree relatedness and the contributions of founder lineages to thoroughbred horses Animal Genetics 32, 360 – 364. CURIK I., ZECHNER P., SÖLKNER J., ACHMANN R., BODO I., DOVC P., KAVAR T., MARTI E.

AND

BREM G. (2003) Inbreeding, Microsatellite Heterozygosity, and

morphological Traits in Lipizzan Horses. Journal of Heredity 94(2),125–32 DARNELL, J., LODISH, H. AND BALTIMORE, D.: Molecular Cell Biology. 2. vydání. Scientific American Books New York 1990, str.686. Převzato z http://mujweb.atlas.cz/Veda/mitochondrie

DEREEPER A., GUIGNON V., BLANC G., AUDIC S., BUFFET S., CHEVENET F., DUFAYARD J.F., GUINDON S., LEFORT V., LESCOT M., CLAVERIE J.M.

AND

GASCUEL O. (2008) Phylogeny.fr: robust phylogenetic analysis for the nonspecialist. Nucleic Acids Research 36, 465-9 (Web Server issue):W465-9. Epub 2008 Apr 19. (PubMed) DOVC P., KAVAR T. AND HABE F. (1996) Mitochondrial D-loop variation in Lipizzan horses. Animal Genetics 27 (Suppl. 2), 33 - 44

86


DOVC P., KAVAR T., SÖLMNER H. AND ACHMANN R. (2006) Developemnent of the Lipizzan Horse Breed. Reproduction in Domestic Animals 41, 280-85 DUŠEK J.: Uchování a vyuţití genových rezerv v chovu koní. IN: Uchovanie a vyuţitie génovych rezierv v chove hospodárskych zvierat. Sborník AZV ČSFR 159, (1992), 70-89 EDGCOMB V.P., ROGER A.J., SIMPSON A.G.B., KYSELA D.T.

AND

SOGIN M.L.

(2001) Evolutionary Relationships Among "Jakobid" Flagellates as Indicated by Alpha- and Beta-Tubulin Phylogenies. MBE 18, No. 4, 514-52 FALCONER, D.S. AND MACKAY, T.F.C. (1996) Introduction to Quantitative Genetics, Fourth Edition, London: Longman. FELSENSTEIN J. (1993) PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.5c., University of Washington, Department of Genetics, Seattle FENG D.F.

AND

DOOLITTLE R.F. (1987) Progressive sequence alignment as a pre-

requisite to correct phylogenetic trees. Journal of Molecular Evolution 25,351– 60, in: Royo et al. (2005) FRANKHAM,R (1995) Conservation genetics. Annual Review of Genetics 29, 305327 GAUDET J. (2001) FSTAT (version 2.9.3), a program to estimate and test gene diversities and fixation indices. http://www.unil.ch/izea/softwares/fstat.html. GYLLENSTEN U.B., WHARTON D., JOSEFSSON A. AND WILSON A.C. (1991) Paternal inheritance of mitochondrial DNA in mice. Nature 352, 255-7 HAGELBERK E., GOLDMAN N., LIÓ P., WHELAN S., SCHIEFENHÖVEL W. CLEGG J.B. AND BOWDEN D.K. (1999) Evidence for mitochondrial DNA recombination in a human population of island Melanesia. Proceedings of the Royal Society B 266, 485-92

87


HALL T.A. (1999) BioEdit: a user-friendly Biological semence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series 41, 95-98 HAMANOVÁ K. (2005) Polymorfismus DNA se zaměřením na mikrosatelity u koní (zkrácený obsah dizertační práce – podklad pro seminář určený pro chovatelskou veřejnost) [online]. [cit. ]. Dostupný z <www.hucul.net/knihy/hucul_rk.htm> HILL E.W., BRADLEY D.G., AL-BARODY M., ERTUGRUL O., SPLAN R.K., ZAKHAROV I.

AND

CUNNINGHAM E.P. (2002) History and integrity of tho-

roughbred dam lines revealed in equine mtDNA variation. Animal Genetics 33, 287-94. HOŘÍN P., COTHRAN E.G., TRTKOVÁ K., MARTI E., GLASNÁK P., HENNEY P. AND VYSKOČIL M. (1998) Polymorphizm of Old Kladruber horses, surviving but endangered baroque breed. European Journal of Immunogenetics 25 No.5, 357-63 HRUBAN VOJTĚCH a kolektiv autorů (1999) Principy a aplikace molekulární genetiky ve šlechtění. ČZU Praha, scripta. HUTCHISON C.A., NEWBOLD J.E., POTTER S.S. AND HALL EDGELL M. (1974) Maternal inheritance of mammalian mitochondrial DNA. Nature 251: 536-8. ISHIDA N., HASEGAWA T., TAKEDA K., SAKAGAMI M., ONISHI A., INUMARU S., KAMTSU M. AND MUKOYAMA H. ( 1994a) Polymorfic sequence in the D-loop region of equine mitochondrial DNA. Animal Genetics. 25, 215-22. ISHIDA N., HIRANO T. AND MUKOYAMA H. (1994b)Detection of aberrant alleles in the D-Loop region of equine mitochondrial DNA by single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis. Animal Genetics 25, 287. IWAŃCZYK E., JURAS R., CHOLEWIŃSKI G., COTHRAN E. G. (2006) Genetic structure and polygenetic relationships of the Polish Heavy Horse. Journal of Applied Genetics 47, 353 -359.

88


IVANKOVIC A., KAVAR T., CAPUT P., MIOC B., PAVIC V.

AND

DOVC P. (2002)

Genetic diversity of three donory populations in the Croatian coastal region Animal Genetics 33, 169–77 JAKUBEC V., GLASNÁK V., JELÍNEK J., PŘIBYL J., VOLENEC J. AND ZÁLIŠ N. (1996) Genetic analysis of sire lines and sire progeny groups in the Old Kladrub horse. Scentia Agriculturae Bohemica 27 (4), 283-92 JAKUBEC V., VOLENEC J., MAJZLÍK I. AND SCHLOTE W (2004) Analysis of inbreeding in the genetic resource of the „Old Kladrub horse“ in the period from 1993 to 2003. Conservation genetics of endangered horse breeds. EAAP publication No. 116, 85-90 JAKUBEC V., VOSTRÝ L., SCHLOTE W., MAJZLÍK I., MACH K. (2009): Selection in the genetic resource: genetic variation of the linear described type traits in the Old Kladrub horse. Archiv Tierzucht, 52, 343-355. JANDUROVÁ O.M., KOTT T, KOTTOVÁ B.

AND

CZERNEKOVÁ V. (2004) Seven

microsatellite markers useful for determining genetic variability in White and Brown Short-Haired goat breeds. Small Ruminant Research 52,(3), 271- 4 JANDUROVÁ O.M., KOTT T, KOTTOVÁ B., CZERNEKOVÁ V.

AND

MILERSKI M.

(2005) Genetic relationships among Šumava, Valachian and Improved Valachian sheep Small Ruminant Research 57 (2-3), 157-65 JEFFREYS A.J., ALLEN M.J., HAGELBERG E. AND SONNBERG A. (1992) Identification or the skeletal remains of Mengele, Josef by DNA analysis. Forensic Science International 56 (1), 65-76 JEFFREYS A.J., BROOKFIELD J.F. AND SEMEONOFF R. (1985a) Positive identification of an immigration test-case using human DNA fingerprints. Nature 317, 81819. JEFFREYS A.J., WILSON V.

AND

THEIN S.L. (1985b) Hypervariable „minisatellite“

regions in human DNA. Nature 314, 63-73

89


JEFFREYS A.J., WILSON V.

AND

THEIN S.L. (1985c) Individual-specific „finger-

prints“ of human DNA. Nature 316, 76-9 KAKOI H., TOZAKI T. AND GAWAHARA H. (2007) Molecular Analysis Using Mitochondrial DNA and Microsatellites to Infer the Formation Process of Japanese Native Horse Populations. Biochemical Genetics 45, Nos. 3/4, 375-95 KANEDA H, HAYASHI J, TAKAHAMA S, TAYA CH., LINDAHLS K.F. AND YONEKAWA H. (1995) Elimination of paternal mitochondrial DNA in intraspecific crosses during early mouse embryogenesis. PNAS - Proceedings of the National Academy of. Sciences. USA 92, 4542-4546 KAVAR T., HABE F., BREM G. AND DOVC P. (1999) Mitochondrial D-loop sequence variation among the 16 maternal lines of the Lipizzan horse breed. Animal Genetics 30, 423-30 KAVAR T., BREM G., HABE F., SÖLKNER J. AND DOVC P. (2002) History of Lipizzan horse maternal lines as revealed by mtDNA analysis. Genetics Selection Evolution 34, 635-48 KOČÁREK E. (2004) Genetika. Scientia s.r.o. pedagogické nakladatelství, Praha KOCHER D., THOMAS W.K., MEYER A., EDWARDS S.V., PAABO S., VILLABLANCA F.X.

AND

WILSON A.C. (1989) Dynamics of mitochondrial DNA evolution in

animals: amplification and sequencing with conserved primers. PNAS – Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 86, 6196–200. KONDO R., SATTA Y., MATSUURA E.T, ISHIWA H., TAKAHATA N. AND CHIGUSA S.I. (1990) Incomplete maternal transmission of mitochondrial DNA in Drosophilla. Genetics 126 (3), 657-63. KRAIC J. (2005) Moţná úloha nekódujúcích sekvencíí v regulácii expresie génov. In: Progres v biológii: Zborník referátov z medzinárodnej vedeckej konferencie 4. Biologické dni. Nitra. FPV UKF v Nitre. 2005. p. 508. ISBN 80-8050-864-X LANG B.F., O'KELLY C., NERAD T., GRAY M.W. AND BURGER G. (2002) The closest unicellular relatives of animals. Current Biology 12, 1773-8. 90


LERCHE F. (1956) Státní hřebčín Kladruby nad Labem. Státní zemědělské nakladatelství v Praze. LUÍS C., BASTOS-SILVEIRA C., COTHRAN E.G. AND OOM. M.M (2002) Variation in the mitochondrial control region sequence between the two maternal lines of the Sorraia horse breed. Genetics and Molecular Biology25, 3, 309-11 LUÍS C., BASTOS-SILVEIRA C., COTHRAN E.G. AND OOM. M.M.(2006) Iberian Origins of New World Horse Breeds. Journal of Heredity 97(2),107–13 MARKLUND S., CHAUDAHRY R., MARKLUND L., SANDBERG B. AND ANDERSON L. (1995) Extensive mtDNA diversity in horses revealed by PCS-SSCP analysis. Animal Genetics 26, 193-6 MIROL P.M., GARCÍA P.P.

AND

DULOUT F.N. (2002) Mitochondrial variability in

the D-loop of four equine breeds shown by PCR-SSCP analysis. Genetics and Molecular Biology 25 no. 1 MONTGOMERY G.W.

AND

SISE J.A. (1990) Extraction of DNA from sheep white

blood cells. New Zealand Journal of Agricultural Research 33, 437–41. MILLER M.P. (1997) Tools for population genetic analyses (TFPGA): A Windows program for the analysis of allozyme and molecular population genetic data; 1997; http://herb.bio.nau.edul~miller/tfpga.htm. NEI M. (1978) Estimation of average heterozygosis and genetic distance from a small number of individuals. Genetics, 89, 583 – 590. PESOLE G., GISSI C., DE CHIRICO A. AND SACCONE C. (1999) Nucleotide substitution rate of mammalian mitochondrial genomes. Journal of Molecular Evolution 48, 427-34 PIRY S, ALAPETITE A, CORNUET, J.-M., PAETKAU D, BAUDOUIN, L., ESTOUP, A. (2004) GeneClass2: a Software for Genetic Assignment and First-Generation Migrant Detection. Journal of Heredity 9, 536-539.

91


PŘIBYL J., JAKUBEC V., JELÍNEK J., VOLENEC J. KRYS J. (1997) Clustering of Kladrub horses on the basis of kinship. Czech Journal of Animal Science, 42, 199205. ROSYPAL S

AND KOL.

(2001)Terminologie Molekulární biologie. Vydavatel prof.

RNDr. Stanislav Rosypal, DrSc., Vodova 18, 612 00 Brno RANNALA B., MOUNTAIN J. L. (1997) Detecting immigration by using multilocus genotypes. PNAS - Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 94, 9197-9201. ROYO L. J., ÁLVAREZ I., BEJA-PEREIRA A., MOLINA A., FERNÁNDEZ I., JORDANA J., GÓMEZ E., GUTIÉRREZ J. P. AND GOYACHE F. (2005) The Origins of Iberian Horses Assessed via Mitochondrial DNA. Journal of Heredity 96(6), 663–9 SBISÀ E., TANZARIELLO F., REYES A., PESOLE G. AND SACCONE C. (1997) Mammalian mitochondrial D-loop region structural analysis: identification of new conserved sequences and their functional and evolutionary implications. Gene 205, 12540 SCHNEIDER S., ROESSLI D. AND EXCOFFIER L. (2000) Arlequin: a Software for Population Genetics Data Analysis (Version 2.0). Genetics and Biometry Laboratory, University of Geneva, Switzerland. In: Hill et al., 2002 SNEATH P.H.A. AND SOKAL R.R. (1973) Numerical Taxonomy. W.H. Freeman, San Francisco, CA, USA. in: Achmann et al. (2004) STRACHAN T.

AND

READ A.P. (1999) Human Molecular Genetics. Sond Edition.

Bios Scientific Publishers Ltd, Oxford, UK THOMPSON J.D., GIBBON TJ., PLEWNIAK F., JEANMOUGIN F.

AND

HIGGINS D.G.

(1997) The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research 24, 4876-82 VOLENEC J., JAKUBEC V., JELÍNEK J., PŘIBYL J AND ZÁLIŠ N. (1995) Analysis of Inbreeding of old-Kladrub Horses. Scientia Agriculturae Bohemica 26 (4), 27996 92


WALSH P.S., METZGER D.A. AND HIGUCHI R. (1991) Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques 10 (4), 506–13 WEIR B.S. AND COCKERHAM C.C. (1984) Estimating F-statistics for the analysis of population structure. Evolution 38, 1358–70. in: Achmann et al. (2004) WHITE P. S. AND DENSMORE L.D.: Mitochondrial DNA isolation IN: Molecular Genetic Analysis of Populations. A Practical Approach. (ed. by A.R. Hoelzel), 423. Oxford University Press, Oxford, 1992 WRIGHT S. (1951) The genetical structure of populations. Annual Eugenetics 15, 323–54. in: Achmann et al. (2004) WRIGHT S. (1969) Theory of Gene Frequencies: Evolution and the Genetics of Populations, Vol. 2. The University of Chicago Press, Chicago, USA. in: Achmann et al. (2004) XU X. AND ÁRNASON Ú. (1994) The complete mitochondrial DNA sequence of the horse, Equus caballus: extensive heteroplasmy of the control region. Gene 148, 357-62 XU X, GULLBERG A., ÁRNASON Ú. (1996) The Complete Mitochondrial DNA (mtDNA) of the Donkey and mtDNA Comparisons Among Four Closely Related Mammalian Species-Pairs. Journal of Molecular Evolution 43, 438–446 ZĄBEK T. NOGAJ A., RADKO A., NOGAJ J., SŁOTA E (2005) Genetic variation of Polish endangered Biłgoraj horses and two common horse breeds in microsatellite loci. Journal of Applied Genetics., 46, 299-305. ZIMA J., MACHOLÁN M., MUNCLINGER P., PIÁLEK P (2004). Genetické metody v zoologii. Univerzita Karlova, Praha, ISBN 80-246-0795-6

93


ELEKTRONICKÉ ZDROJE GENBANK (staţeno X- 2009) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ GENETIC TESTING METHODOLOGIES USED IN DETERMINING RELATEDNESS OF SURVIVORS (staţeno V-2010), University Laboratory High School, the University of Illinois http://www.uni.illinois.edu/~dstone/dis_genetic_test_methods.html GENEPOP V. 3.3 (březen 2001) ftp://ftp.cefe.cnrs-mop.fr/genepop/ HUMAN GENOME PROJECT INFORMATION (staţeno XII-2007) http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml KARY MULLIS' personal website (staţeno XII-2007) http://www.karymullis.com/ LASKER FOUNDATION (staţeno XII-2007) http://www.laskerfoundation.org/rprimers/gnn/timeline/1869a.html MITOMAP: A Human Mitochondrial Genome Database. (staţeno XII-2007) http://www.mitomap.org NETWORK (staţeno XII-2007) http://www.fluxus-engineering.com NÁRODNÍ HŘEBČÍN KLADRUBY NAD LABEM, S. P. – oficiální webové stránky (staţeno XII – 2007 a IV - 2010) http://www.nhkladruby.cz NOBEL FOUNDATION official web site (staţeno XII-2007) http://nobelprize.org POPULATION v.1.2.28 (Olivier Langella; dostupný na http://www.pge.cnrsgif.fr/bioinfo/populations/). ŘÍHA P. (2000) Mitochondrie (staţeno XII-2007) http://mujweb.atlas.cz/Veda/mitochondrie/index.htm SAS STATISTICAL PACKAGE (1999–2001) SAS Institute inc.

94


http://www.sas.com TREEVIEW v. 1.6.6. (2001), Page 1996 http://www.taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/rod.html UNIVERSITY OF COLORADO official web site (staţeno XI-2007) http://www.colorado.edu//physics/Web/Gamow/ ZAGORSKI N. (2006) Profile of Alec J. Jeffreys. PNAS – Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 103, no. 24, 8918-20 http://www.pnas.org/cgi/content/full/103/24/8918#B11

SEZNAM ZKRATEK mtDNA – mitochondriální DNA vz. – vzorek HWE - Hardyho - Weinbergova rovnováha (Hardy–Weinberg Equilibrium) SD - směrodatná odchylka (standard deviation)

95

Využití variability DNA ve studiu příbuzenských vztahů linií a rodin plemene koně genové rezervy 1. ÚVOD

Recommend Documents