Vysokoúčinná kapalinová chromatografie HPLC – High Performance Liquid Chromatography Vysokoúčinná ...X... Vysoceúčinná kapalinová chromatografie RRLC – Rapid Resolution Liquid Chromatography Rychle rozlišovací kapalinová chromatografie UPLC – Ultra Performance Liquid Chromatography Extrémně účinná kapalinová chromatografie UHPLC – Ultra High Pressure Liquid Chromatography Extrémně vysokotlaká kapalinová chromatografie
Jan Poustka - ISM 2007
VŠCHT PRAHA
Princip kapalinové chromatografie Princip: dělení (separace, rozlišování) sloučenin na základě různé zádrže (retence) v chromatografickém systému: sorbent (stacionární fáze) a eluent (mobilní fáze)
Členění metod: - uspořádání: kolonová, na tenké vrstvě ...
- separační parametry: účinnost, rychlost ... - stacionární fáze: eluční, ionexová, chirální ...
Separační parametry Rozlišení:
N R 4
' 1 k2 ' k2 1
k’– kapacitní (retenční) faktor:
nebo
2t R1 t R 2 R w1 w2
ns Vs t R t 0 k KD nm Vm t0 '
– separační faktor: k’2/k’1 N – počet teoretických pater – účinnost
5,55 t N w 122
2 R
(efficiency – výkonnost)
R = 1,5 baseline separace
HETP = L/N - výškový ekvivalent teoretického patra Y - HETP X - Průměrná lineární rychlost
Interpretace separačních parametrů k‘ ~ složení stacionární a mobilní fáze, teplota, průtok, délka kolony
- charakterizuje retenci za daných podmínek - faktor retence (doby analýzy)
~ složení stacionární a mobilní fáze, teplota, průtok
- charakterizuje separaci složek (porovnáváme k‘) - faktor selektivity separace (rozdělení analytů)
N ~ kvalita stacionární fáze - zrnění a třídění, složení mobilní fáze, průtok, délka kolony, teplota
- charakterizuje kvalitu eluční zóny - šířka, symetrie... - faktor kvality eluční zóny (tvaru píku)
R ~ sjednocující veličina
- kombinuje všechny parametry separace
Stacionární fáze - volba typu (separační selektivity) a provedení chromatografie Rozdělovací:
- normální fáze (klasická x HILIC) - reverzní fáze (klasická x semipolární) - iontově párová (na reverzní fázi)
Iontově výměnná (IE) - katex, anex
Chirální
- cyklodextrinové fáze
Afinitní
HPLC: 3-10 µm - různé - p do 400 bar RRLC: 1,8 µm - porézní směsné - p do 600 bar UPLC: 1,7 µm - porézní unif. - p do 1000 bar UHPLC: 1,0 µm - neporézní - p do 5000 bar
Hlavní typy interakcí při separaci * van der Waalsovy síly disperzní – London indukovaný dipól - indukovaný dipól
C N O H
* van der Waalsovy síly orientační – Keesom dipól - dipól * van der Waalsovy síly indukční – Debye dipól – indukovaný dipól
H ** elektrostatické síly – Coulomb
N H
H
H O
O H
N H H
H
O O
*** vodíková vazba
C C
S
O **** π - π interakce
Chromatografie na normální fázi: Stacionární fáze - polární: silikagel, modifikovaný silikagel Mobilní fáze - nepolární (retence podle složení m.f.)
HILIC Hydrophilic Interaction LIquid Chromatography
Chromatografie na reverzní fázi: Stacionární fáze - nepolární: modifikovaný silikagel (C18) Mobilní fáze - polární (retence podle složení m.f.) ODS - oktadecylovaný silikagel (C18) C4,C8,C30
Endcapping (Embedding): Klasický - 100% nepolární Polární - část polární skupiny Porézní x neporézní Monomerní x polymerní (zesítěný)
Porovnání HILIC, NP a RP chromatografie
Chirální chromatografie: Stereoisomery (enantiomery, diastereoisomery... ) - jsou separovány interakcí s chirální fází
Iontově párová chromatografie: Polární analyt + polární činidlo (iontově párové činidlo) nepolární komplex s retencí na nepolární s.f. - realizace na reverzní fázi
Iontově výměnná chromatografie: Stacionární fáze - zakotveny nebo ; opačné ionty jsou mobilní (retence podle složení m.f.)
Afinitní chromatografie: Stacionární fáze - imobilizace ligandu (biologicky aktivní sloučeniny) ; vzorek se váže do komplexu, z kterého je uvolněn změnou složení m.f.)
Mobilní fáze - polarita, iontová síla, technika eluce Volba: - rozpustnost vzorku - kompatibilita se stacionární fází a celým systémem - isokratická ...X... gradientová eluce
Mobilní fáze - volba podle eluční síly Polarita (Snyderův polaritní index) ........ P’ Eluotropní hodnota - eluční síla (typ stacionární fáze, primárně pro NP) - ε0 Rozpustnostní parametr ...
Rozpouštědlo
P’
ε0 (silikagel) ε0 (C18)
Hexan
0,1
0
-
7,3
Aceton
5,1
0,53
8,8
9,6
Acetonitril
5,8
0,52
3,1
12,7
Methanol
5,1
0,7
1,0
14,5
10,2
-
-
23,5
Voda
Typické kolony a sorbenty - technické parametry Rozměry kolony
Zrnění
10-25 cm x 3-4,6 mm 0,5-7,5 cm x 3-4,6 mm 5-25 cm x + 2 mm
3-10 μm 3-10 μm 3-10 μm
0,1-2 ml/min 0,1-2 ml/min 0,05-1 ml/min
konvenční (klasická) rychlá narrow x micro-bore 2
15-100 cm x + 1 mm 10-200 cm x 0,2-0,5 mm 100-200 cm x 0,04-0,08
3-10 μm 1-5 μm --------
30-60 μl/min 1-10 μl/min < 1 μl/min
narrow x micro-bore 1 kapilární (s náplní) kapilární (open tubular)
0,5-2,5 ml/min 0,1-1,0 ml/min < 0,1-0,5 ml/min < 1 μl/min
RRLC UPLC UHPLC nano-LC (Lab on Chip)
0,5-2 cm x 2 mm 5-15 cm x 2 mm 5-15 cm x < 1-2 mm Drážky na čipu
Lab on Chip
1,8 μm 1,7 μm 1,0 μm 2,5-10 μm
Průtok
Chromatografie
Třídění sorbentu - vliv na back pressure Vstupní frita
SORBENT
- větší propustnost porozita může být větší než zrnění sorbentu
Výstupní frita
- menší propustnost porozita musí být menší než zrnění sorbentu odpovídající back pressure
Aplikace sorbentů o nízkém zrnění
Aplikace rychlé separace (RRLC)
Aplikace UPLC - multireziduální analýza pesticidů 100
HPLC %
20.06
0 2.00 100
Time 4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
14.00
16.00
18.00
20.00
22.00
Průtok 0,3 ml/min (oba systémy)
UPLC %
6.53
0 2.00
Time 4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
14.00
16.00
18.00
20.00
22.00
UPLC 10 min HPLC 50 min