VÝSKYT A EFEKTY LÁTEK V PRODUKTECH DENNÍ POTŘEBY

MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

CENTRUM PRO VÝZKUM TOXICKÝCH LÁTEK V PROSTŘEDÍ

VÝSKYT A EFEKTY LÁTEK V PRODUKTECH DENNÍ POTŘEBY

Martina Richterová

Bakalářská práce

Vedoucí: Mgr. Martin Beníšek Brno, Česká republika, rok 2010

Prohlášení: Prohlašuji, ţe jsem tuto bakalářskou práci zpracovala samostatně, pod odborným vedením Mgr. Martina Beníška, na základě odborné literatury a pramenů, uvedených v seznamu pouţité literatury.

V Brně, dne 17. 5. 2010

…………………………………………… podpis

2

Poděkování: Ráda bych poděkovala vedoucímu mé bakalářské práce, Mgr. Martinu Beníškovi, za trpělivé vedení, cenné rady a připomínky, díky nimţ mohla tato práce vzniknout.

3

OBSAH SEZNAM ZKRATEK ………………………………………………………………………... 5 ÚVOD A CÍL PRÁCE ……………………………………………………………………….. 7 1. PPCPs OBECNĚ …………………………………………………………………………. 8 2. PŘEHLED VÝZNAMNÝCH SLOŢEK V PCPs ..……………………………………... 10 2.1. Surfaktanty …………………………………………………………………………. 10 2.2. Antimikrobiální látky ……………………………………………………..………... 12 2.2.1. Parabeny …………………………………………………………………… 12 2.2.2. Antiseptika ……………………………………………………………….….. 13 2.2.2.1. Triclosan …………………………………………………….………. 15 2.3. UV filtry ……………………………………………………………………...…….. 16 3. ZDROJE ZNEČIŠTĚNÍ A OSUD V ŢIVOTNÍM PROSTŘEDÍ ……………………….17 3.1. Surfaktanty ……………………...………………………………………………….. 17 3.2. Antimikrobiální látky ………...…………………………...……………….……….. 18 3.3. UV filtry ……………...……………………………………………………….……. 19 4. DEGRADACE A CHOVÁNÍ V ŢIVOTNÍM PROSTŘEDÍ ……….……….…………. 20 4.1. Surfaktanty …………………………………………………………………………. 20 4.2. Antimikrobiální látky ………………………………………………………………. 22 4.2.1. Triclosan ………………………………………………………………….…. 22 4.3. UV filtry …………………………………………………………………….……… 23 5. EKOTOXIKOLOGICKÉ ÚČINKY ……………………………………………………. 23 5.1. Surfaktanty ………………………………………………………………….……… 23 5.2. Antimikrobiální látky …………………………………………………………...….. 27 5.2.1. Triclosan …………………………………………………………………..… 27 5.3. UV filtry ……………………………………………………………………….…… 28 6. PRAKTICKÁ ČÁST – TEST VLIVU VYBRANÉHO PARABENU A UV FILTRU NA SIGNÁLOVÁNÍ RETINOIDNÍCH RECEPTORŮ IN VITRO….………….…...……… 30 6.1. Úvod ……………………………………………….………………………….……. 30 6.1.1. Princip ……………………………………………………………………….. 31 6.1.2. Cíl …………………………………………………………………………… 31 6.2. Materiál a metody …………………………………………………………….……. 31 6.2.1. Pomůcky ………………………………………………………………..…… 31 6.2.2. Přístroje …………………………………………………………………….... 31 6.2.3. Chemikálie ………………………………………………………….……….. 32 6.2.4. Kultivace buněčné linie P19/A15 …………………………………...………. 32 6.2.5. Nasazení a expozice buněk ……………………………………………..…… 32 6.2.6. Vyhodnocení cytotoxicity ………………………………………………..…. 33 6.2.7. Vyhodnocení luminiscence …………………………………………………. 33 6.3. Výsledky ………………………………………………………………………..…. 33 6.3.1. Cytotoxicita ……………………………………………………………….… 34 6.3.2. Luminiscence ……………………………………………………………….. 35 6.4. Diskuse …………………………………………………………………………...… 38 7. ZÁVĚR …………………………………………………………………………………. 39 ANOTACE…………………………………………………………………………..……… 41 ANNOTATION …………………………………………….……………………………..... 42 POUŢITÁ LITERATURA …………………………………………………………………. 43

4

SEZNAM ZKRATEK AEO … alkohol polyethoxyláty AES … alkyl ethoxysulfáty AO … amin oxidy APEO … alkylfenol ethoxyláty AS … alkyl sulfáty ATRA … all-trans retinová kyselina BP1 … benzophenon-1 BP2 … benzophenon-2 BP3 … benzophenon-3 (2-hydroxy-4-methoxybenzofenon) BP4 … benzophenon-4 BS … benzyl salicylát BSK … biochemická spotřeba kyslíku CESIO … Comite´ Europe´en des Agents de Surface et de leurs Intermediaries Organique CO2 … oxid uhličitý ČOV … čistírna odpadních vod DMEM/F12 … Dulbecco's modified Eagle's medium plus Hams 12 nutrient mixture DMSO … dimethylsulfooxid DNA … deoxyribonukleová kyselina EC10 … efektivní koncentrace způsobující 10% inhibici (Effective Concentration) EC50 … efektivní koncentrace způsobující 50% inhibici (Effective Concentration) EDP … 2-ethylhexyl-4-(dimethylamino) benzoát EMC … 2-ethylhexyl-4-methoxycinnamant Et-PABA … ethyl-4 amino benzoát FDA … Food and Drug Administration FBS … fetální bovinní sérum hAR … androgenní receptor hERα … lidský estrogenní receptor HMS … homosalát IMC … isopentyl-4-methoxycinnamat In vitro … ve zkumavce In vivo …v ţivém organismu

5

Kow … rozdělovací koeficient oktanol/voda Koc … distribuční koeficient organického uhlíku LAS … alkylbenzen sulfonáty LC50 … letální koncentrace způsobující úhyn 50 % testovaných organismů LOAEL … nejniţší účinná koncentrace bez pozorovatelného negativního účinku (LowestObserved-Adverse-Effect-Level) NOEC … koncentrace bez pozorovatelného účinku (No Observed Adverse Effect Concentration) OC … octocrylen OD-PABA … octyl dimethyl para aminobenzoát OMC … octyl methoxycinnamat OS … octyl salicylát PABA … para amino-benzoová kyselina PBS … fosfátem pufrovaný fyziologický roztok PCP … produkty denní potřeby Peg25-PABA … ethoxylovaný ethyl-4-aminobenzoát PPCP…farmaceutika a produkty denní potřeby (Pharmaceuticals and Personal Care Products) PS … fenyl salicylát QAC … kvartérní amonné sloučeniny (Quaternary Amonium Compounds) RARE … responsivní elementy kyseliny retinové RARγ … gama podtyp retinoidních receptorů kyseliny retinové RAR/RXR … retinoic acid receptor (receptor kyseliny retinové) / retinoid X receptor TCC … triclocarban TiO2 … oxid titaničitý TSC … triclosan U.S. EPA … United States Environmental Protection Agency UV … ultrafialové záření ZnO … oxid zinečnatý 3-BC … 3-benziliden camphor 2,8-DCDD … dichlorodibenzo-p-dioxin 4HB ... 4-hydroxy benzofenon 4DHB … 4,4′-dihydroxybenzofenon 2,4-DCP … dichlorfenol 4-MBC … 3-(4-methylbenzyliden) camphor 6

ÚVOD A CÍL PRÁCE Během posledních několika desítek let, kdy se zvyšoval zájem o osud chemických látek v ţivotním prostředí, byl hlavní důraz kladen na látky mající prioritní význam jako znečišťovatelé, tedy na akutní toxické či karcinogenní pesticidy a látky perzistentní či bioakumulativní, produkované průmyslovou výrobou (Daughton and Ternes 1999). V posledních letech začala být věnována pozornost další různorodé skupině látek, která je neméně významná pro ţivotní prostředí. Jedná se o veterinární a humánní léčiva, diagnostické látky, nutraceutika, aktivní sloţky produktů osobní potřeby a mnohé další. Souhrnně je tato skupina označována jako Pharmaceuticals and personal care products (PPCPs), neboli farmaceutické látky a produkty denní potřeby (Caliman and Gavrilescu 2009). Hlavními důvody, proč je látkám PPCPs nyní věnována velká pozornost, je jejich intenzivní pouţití a výroba v obrovských objemech po celém světě. Některé z nich jsou z důvodu kontinuálního vypouštění do ţivotního prostředí často povaţovány za látky perzistentní, ačkoliv jsou rozloţitelné během několika dní (Sedlak et al. 2004). Dále mohou být bioaktivní, mít bioakumulační schopnosti a také mohou narušovat endokrinní činnosti organismů (Caliman and Gavrilescu 2009). Cílem této bakalářské práce je shrnutí poznatků o vybraných sloţkách produktů denní potřeby (PCPs). Jelikoţ jsou PCPs součástí skupiny PPCPs a té je zpravidla věnována pozornost v odborných vědeckých článcích souhrnně s hlavním zaměřením na farmaceutické látky, je v této bakalářské práci pro úplnost uvedena i obecná charakteristika skupiny PPCPs. Konkrétní zaměření je věnováno surfaktantům, antimikrobiálním látkám a chemickým filtrům proti UV záření. V teoretické části jsou tyto sloţky představeny z pohledu výskytu a vyuţití v PCPs. Dále je věnována pozornost vstupům těchto sloţek do ţivotního prostředí a jejich vlastnostem a chování a následným ekotoxikologickým účinkům na organismy. V praktické části je pomocí cytotoxického a luminiscenčního testu zkoumán vliv dvou vybraných látek, jednoho parabenu, benzyl-4-hydroxybenzoátu a jednoho UV filtru, 3-(4-methylbenzyliden) camphoru, na signálování retinoidů. V testu byla pouţita buněčná linie P19/A15, která má vnesený gen pro luciferázu řízený responsivními elementy kyseliny retinové.

7

1. PPCPs OBECNĚ PPCPs je různorodá skupina chemikálií zahrnující humánní a veterinární léčiva (včetně nové skupiny „biologických“ diagnostických látek), kontrastní média pro rentgeny, potravinářská aditiva a další spotřební chemii, jako jsou kosmetické přípravky, vůně, UV filtry a jiné inertní nebo pomocné látky pouţívané ve výrobě farmaceutik a produktů denní potřeby (Ellis 2006). Obecně se jedná o syntetické organické sloučeniny. Neexistuje ţádný oficiální seznam a ani terminologie pro tuto skupinu látek. Termín PPCPs je pouţíván U.S. Environmental Protection Agency (U.S. EPA) (Christian et al. 2003). V rámci skupiny PPCPs jsou rozlišovány dvě kategorie, jak je naznačeno v tabulce č. 1. Jako léčivo je definována léčivá látka, směs léčivých látek nebo léčivý přípravek a je určeno k příznivému ovlivňování zdraví lidí a zvířat. Jedná se o souhrnný pojem pro léčivé látky a léčivé přípravky, který definuje Zákon o léčivech (č. 378/2007 Sb.) (Česko 2007). Skupina produktů denní potřeby (PCP) zahrnuje tzv. produkty pro osobní hygienu, tedy z velké části kosmetické přípravky. Podle Směrnice Evropské unie (Council Directive 76/768/EEC) je kosmetický přípravek definován takto: Jedná se o jakoukoliv látku nebo přípravek určený k uvedení do styku s různými vnějšími částmi lidského těla (pokoţkou, vlasovým systémem, nehty, rty, vnějšími pohlavními orgány) nebo se zuby a sliznicí ústní dutiny, výhradně nebo převáţně za účelem jejich čištění, parfemace, změny jejich vzhledu a/nebo úpravy tělesných pachů a/nebo ochrany či jejich udrţování v dobrém stavu (EU 1976). PPCPs jsou vyuţívány po celém světě jako prostředek ochrany a zlepšování zdraví lidí a zvířat (Kot-Wasik et al. 2007). Zvláštní zájem je projevován o látky, které jsou pouţívány

ve

velkých

objemech,

mohou

přetrvávat

v ţivotním

prostředí,

jsou

bioakumulativní či bioaktivní a také mohou působit na endokrinní systém organismů (Caliman and Gavrilescu 2009). Nicméně přesné mnoţství prodaných nebo spotřebovaných PPCPs je těţké ověřit. Některé léky jsou vyráběny ve stovkách tun, zatímco jiné v mnoţství jeden kilogram. Rovněţ dochází k vývoji nových léků. Produkty pro osobní péči (PCP) jsou vyráběny aţ v extrémně velkém mnoţství, tj. tisíce tun ročně (Lambropoulou et al. 2002). Je tedy na místě rostoucí znepokojení nad fakty, ţe některé PPCPs mají schopnost procházet přes procesy v čistírnách odpadních vod (ČOV) a vstupovat tak do ţivotního prostředí (Nieto et al. 2009, Giokas et al. 2007, Caliman and Gavrilescu 2009).

8

V tabulce č. 1 jsou uvedeny některé hlavní funkční třídy PPCPs z hlediska jejich vyuţití.

Skupiny/třídy sloučenin

Sloučeniny

Léčiva Veterinární a humánní

Trimethoprim, erytromycin, lincomycin, sulfamethaxol,

antibiotika

chloramfenicol, amoxycillin Ibuprofen, diclofenac, fenoprofen, acetaminofen, naproxen,

Analgetika a protizánětlivé léky acetylsalicylová kyselina, fluoxetin, ketoprofen, indometacin, paracetamol Antidepresiva Regulátory tuků

Diazepam, carbamazepin, primidon, salbutamol Clobrifin, bezafibrát, fenofibrová kyselina, etofibrát, gemfibrozil

β-blokátory

Metoprolol, propranolol, timolol, sotalol, atenolol

Kontrastní média pro rentgeny

Iopromid, iopamidol, diatrizoát

Steroidy a hormony

Estradiol, estron, estriol, diethylstilbestrol

Produkty denní potřeby Vůně

Nitro, polycyklické a makrocyklické mošusy; ftaláty

UV-filtry

Benzofenon, methylbenzyliden camphor

Repelenty proti hmyzu

N,N-diethyltoluamid

Surfaktanty

Alkylbenzen sulfonáty, ethoxysulfáty, alkyl sulfáty

Antiseptika

Triclosan, triclocarban, hexachlorofen

Tabulka č.1: Hlavní sloučeniny PPCPs a jejich vyuţití (Ellis 2006)

9

2. PŘEHLED VÝZNAMNÝCH SLOŢEK V PCPs 2.1. Surfaktanty Jedná se o syntetické povrchově aktivní látky, které jsou ze všech chemických látek vyráběné a spotřebovávané v největším objemu na světě. Je to proto, ţe mají různorodé vyuţití pro aplikace. Pouţívají se při výrobě čistících a pracích prostředků, ale také jako přísada v kosmetice, barvách, pesticidech a dalších přípravcích. Hromadí se v mezifázovém rozhraní a sniţují tak povrchové napětí, usnadňují rozpouštění a odstraňování nečistot, mají pěnící a některé také antibakteriální vlastnosti (Lara-Martin et al. 2008). Tyto sloučeniny jsou rozdělovány do čtyř skupin podle jejich náboje. Jedná se o anionické, kationické, amfoterní a neionické surfaktanty (Ivankovic and Hrenovic 2010). Většina surfaktantů ale patří do dvou hlavních skupin, anionických a kationických, které představují více neţ 90 % evropské produkce (Lara-Martin et al. 2008). Anionické surfaktanty jsou historicky nejstarší a nejběţnější typ povrchově aktivních látek. Hydrofóbní část molekuly je obvykle tvořena alkylovými řetězci různých délek, alkylfenyl etherů nebo alkylbenzenů, a hydrofilní částí je karboxyl, sulfát, sulfonát nebo fosfát (Cserhati, Forgacs and Oros 2002). Z této skupiny jsou nejpouţívanější alkylbenzen sulfonáty (LAS), uvedené na obrázku č. 1. Dle údajů z CESIO (Comite´ Europe´en des Agents de Surface et de leurs Intermediaries Organique) je celková roční produkce LASs 434 000 tun jen v Evropě. LASs jsou běţně pouţívané v pracích prostředcích a domácích čistících přípravcích. Další nejvíce pouţívané jsou alkyl ethoxysulfáty (AES) a alkyl sulfáty (AS), které se pro své vynikající pěnící vlastnosti nejčastěji pouţívají jako sloţky šamponů a jiných PCPs. Jejich roční kombinovaná produkce v Evropě je 404 000 tun (Lara-Martin et al. 2008).

Obrázek č. 1: Alkylbenzen sulfonáty (LAS) – obecný vzorec (Ivankovic and Hrenovic 2010)

10

Nejběţnějším typem kationických povrchově aktivních látek jsou kvartérní amonné sloučeniny (QAC), jejichţ obecný vzorec je na obrázku č. 2. Tyto molekuly obsahují alespoň jeden hydrofóbní uhlovodíkový řetězec spojený s pozitivně nabitým atomem dusíku a další alkylové skupiny – methyl nebo benzyl skupiny jako substituenty. Jsou široce pouţívány v čistících prostředcích, změkčovadlech a vlasových kondicionérech. QACs s dlouhým řetězcem jsou také vyuţívány v desinfekčních prostředcích pro jejich antibakteriální účinek proti gramnegativním i grampozitivním bakteriím a také proti některým patogenním druhům hub a prvoků (Ivankovic and Hrenovic 2010).

Obrázek č. 2: Kvartérní amonné sloučeniny (QAC) – obecný vzorec (Smidrkal 1999) Účinky amfoterních povrchově aktivních látek jsou závislé na pH. Jejich molekuly jsou schopné se měnit z kationických na anionické, z nízkého po vysoké pH. Při středním pH se chovají jako oba iontové typy. Nejznámější a nejvíce studované jsou amin oxidy (AO) znázorněné na obrázku č. 3. AOs byly nejprve pouţity jako substituenty pro tradiční mastné alkaloamidy jako látky podporující pěnění v prostředcích na nádobí. Nyní jsou v kosmetickém průmyslu vyuţívány jako sloţky deodorantů (Singh et al. 2006).

Obrázek č. 3: Amin oxidy (AO) – obecný vzorec (Ivankovic and Hrenovic 2010) Povrchová aktivita neionických surfaktantů vychází z rovnováhy mezi hydrofóbními a hydrofilními částmi obsaţenými ve struktuře molekuly. Hydrofóbní částí jsou zpravidla alkylované fenol deriváty, mastné kyseliny, nebo dlouhé řetězce lineárních alkoholů. Hydrofilní část je tvořena ethylenoxidovými řetězci různých délek. Díky jejich nábojové neorientaci jsou neionické surfaktanty kompatibilní s kationickými a anionickými surfaktanty. Jsou široce pouţívány jako emulgátory, smáčedla a pěnící stabilizátory (Cserhati 1995).

11

Nejvýznamnější z neionických surfaktantů jsou alkohol polyethoxyláty (AEO), uvedené na obrázku č. 4, vyráběné v roce 2000 v Evropě v největším objemu 747 000 tun. Jejich vyuţití je v domácích i průmyslových čistících prostředcích. Na druhém místě, podle objemu, jsou alkylfenol ethoxyláty (APEO), ačkoliv byla výroba těchto látek výrazně omezena v důsledku prevence negativních vlivů, jakou je estrogenita a degradace na meziprodukty (Lara-Martin et al. 2008).

Obrázek č. 4: Alkohol polyethoxyláty (AEO) – obecný vzorec (Ivankovic and Hrenovic 2010)

2.2. Antimikrobiální látky 2.2.1. Parabeny Je to skupina chemických konzervačních látek s biocidním účinkem, která se pouţívá jako přídavek do kosmetických přípravků, léčiv, spotřebního zboţí, potravin a průmyslových výrobků jako ochrana před mikrobiálním znehodnocením. V konečném důsledku jsou ale hlavně ochranou spotřebitele (Sasseville 2004). Parabeny byly poprvé pouţity jako antimikrobiální konzervační látky ve farmaceutických výrobcích v polovině roku 1920 (Soni et al. 2005). Jedná se o skupinu homologické řady kyseliny 4-hydroxybenzoové, esterifikované do C-4 polohy (včetně methyl-, ethyl-, propyl-, butyl-, heptyl- a benzyl- parabenu), pouţívané jednotlivě nebo v kombinaci, aby bylo dosaţeno co nejvyššího antimikrobiálního účinku. Většího antimikrobiálního účinku je také dosaţeno prodluţováním délky řetězce esteru. Tím ale také klesá rozpustnost ve vodě. Chemická struktura je znázorněna na Obrázku č. 5 (Soni et al. 2005).

12

Obrázek č. 5: Chemická struktura parabenu, R = methyl (CH3) , ethyl (C2H5), propyl (C3H7), butyl (C4H9) (Soni et al. 2005) Jako konzervační prostředek jsou parabeny téměř ideální. Mají široké spektrum antimikrobiálního účinku, jsou bezpečné pro pouţití (tj. relativně nedráţdivé, s nízkou toxicitou, neznecitlivující), stabilní v celém rozmezí pH a jsou dostatečně rozpustné ve vodě k vytvoření účinné koncentrace. Nicméně, při pH větším neţ 8 můţe dojít k hydrolytické reakci, která můţe znamenat sníţení konzervačního účinku. V čisté formě jsou v podobě bezbarvých krystalů nebo krystalického prášku bez zápachu a chuti, jsou hygroskopické v přírodě a mají vysoký koeficient oktanol/voda (Kow). Obecně platí, ţe parabeny jsou stabilní na vzduchu a jsou odolné hydrolýze v teplé i studené vodě a kyselém roztoku (Soni et al. 2005). Parabeny se pouţívají v koncentracích 0,1-0,3% ve farmaceutických přípravcích a v koncentraci 0,01-0,1% v kosmetice a potravinách (Aronson 2006). V potravinách mají ale také svůj přirozený výskyt. Methyl paraben je známý jako sloţka ostruţiníku morušky, bílého vína, Bourbonu vanilky a dalších (Soni et al. 2005). Propyl paraben byl objeven v nadzemní části Stocksia brahuica z čeledi Sapindaceae (mýdelníkovité) (Ali et al. 1998).

2.2.2. Antiseptika Antiseptika jsou skupinou látek s antimikrobiálním účinkem, které jsou vyuţívány nejen jako konzervační přísady v potravinách, PCPs a léčivech (Kabara 1980), ale chrání také PCPs před růstem mikroorganismů, jakými mohou být bakterie, viry nebo plísně. Jsou také schopné zničit jiţ přítomné mikroorganismy ve sloţkách, které jsou pouţívané k výrobě PCPs (Antimicrobials 2007).

13

Obavy o potencionální mikrobiální kontaminaci a riziko infekce potravinářského a všeobecně spotřebitelského trhu vedly ke zvýšení pouţívání antiseptik. V PCPs lze nalézt široké spektrum antiseptik a ačkoliv jsou pouţívány jiţ stovky let, přesto je o nich známo mnohem méně neţ o antibiotikách. Rozdíl mezi antibiotiky a antiseptiky je obecně ten, ţe antiseptika mají širší spektrum účinnosti neţ antibiotika a zárověň antibiotika mají specifické intracelulární cíle (antiseptika mohou mít více cílů) (McDonnell and Russell 1999). Antiseptika v PCPs, bývají někdy označována také jako antibakteriální přípravky, protoţe poskytují důleţité opatření na ochranu spotřebitelů v domácnostech i v nemocnicích, kdy se snaţí zabránit šíření bakterií. Tyto výrobky, v závislosti na jejich sloţení a pouţití, mohou zneškodnit či zastavit růst bakterií, které mohou být původci zápachu, koţních infekcí, střevních nebo jiných běţných onemocnění. Patří mezi ně například potencionálně smrtelné onemocnění způsobené bakteriemi jako jsou Salmonella a E.coli. Tyto produkty reguluje Food and Drug Administation (FDA) jako léky bez lékařského předpisu, u kterých musí být prokázáno, ţe jejich pouţití je bezpečné a účinné (Antimicrobials 2007). V kosmetice jsou antiseptika nejčastěji pouţívána v oblasti níţe uvedených PCPs: Antiperspiranty

a deodoranty – antibakteriální ochrana omezuje růst baterií

způsobujících zápach. Mýdla – antibakteriální sloţka při umývání rukou nebo těla má schopnost usmrcovat bakterie nebo je ovládat tak, aby nezpůsobily onemocnění, zápach či infekci kůţe. Při oplachování mýdla dojde k uchování velmi malého mnoţství antibakteriální sloţky na pokoţce a tím dochází k ochraně před bakteriemi. Tato mýdla jsou k dispozici v pevné i kapalné formě. Antimikrobiální gel na ruce – prostředek vyuţívaný při nutnosti omytí rukou bez moţnosti pouţití mýdla a vody. Pleťové vody, čistící pleťová mýdla – hydratují suchou pokoţku a poskytují šetrnou ochranu proti bakteriím, také zde malé mnoţství antibakteriální sloţky zůstává na pokoţce delší dobu i po opláchnutí vodou a potlačuje tak výskyt bakterií. Stomatologické výrobky – jsou vytvořeny pro sníţení bakteriální mikroflóry v ústech, která můţe v konečném důsledku vést k onemocnění dásní. Zubní pasty a ústní vody mohou pomáhat předcházet zubnímu plaku a onemocnění dásní (Antimicrobials 2007).

14

Obecně jsou jako antimikrobiální látky pouţívány v největším mnoţství alkoholy. Mají rychlý a širokospektrý účinek antimikrobiální aktivity proti vegetativním bakteriím (včetně mykobakterií), virům a houbám, ale nejsou sporicidní. V nízkých koncentracích jsou vyuţívány jako konzervační přísady a jsou schopné podporovat činnost dalších antiseptik (McDonnell and Russell 1999). Anilidy jsou sloučeniny pouţívané hlavně jako antiseptika, případně jsou pouţívány v nemocnicích. Nejvíce studovaný ze skupiny anilidů je triclocarban (TCC), který je pouţíván jako sloţka mýdel a deodorantů. TCC je účinný hlavně proti grampozitivním bakteriím (Black et al. 1975). Do další skupiny antiseptik, biguanidů, patří chlorhexidin, který je pravděpodobně nejvíce pouţívaný v antimikrobiálních přípravcích, zejména pro mytí rukou a čištění ústní dutiny. Také je známý jako desinfekční a konzervační prostředek (McDonnell and Russell 1999). Z mnoha ještě dalších antiseptických látek je nutné zmínit skupinu bis-fenolů, do kterých patří triclosan a hexachlorofen. Jejich hlavní vyuţití je v antiseptických mýdlech a prostředcích na oplachování rukou (McDonnell and Russell 1999). Triclosanu je věnována samostatná kapitola. 2.2.2.1. Triclosan Triclosan (TSC) je jednou z velkoobjemově vyráběných látek s antimikrobiálním účinkem, která je široce pouţívána nejen jako přídavek v PCPs (Ahn et al. 2008). Triclosan má široké antimykotické a antibakteriální vlastnosti, které jsou vyuţívané v domácích potřebách, zdravotnickém materiálu a kosmetice. Jsou součástí zubních past, ústních vod, tekutých i tuhých mýdel, deodorantů, krémů na ruce, přípravků k léčbě akné, pomůcek pro umývání nádobí (utěrky, houbičky), plastových krájecích prkének, noţů, ponoţek, spodního a loţního prádla atd. (Bhargava and Leonard 1996, Triclosan information 2000-2010). Také je 2% roztok triclosanu pouţíván k oplachům či koupelím pokoţky těla pro léčbu koţních onemocnění, ekzémů a dermatididy (Coia et al. 2006). Jeho chemická struktura je 2,4,4´-trichloro-2´-hydroxydiphenyl ether (Obrázek č. 6). Má formu bílého krystalického prášku bez zápachu a chuti s molekulární hmotností 289,5 g/mol a bodem tání 57°C ± 1°C. Je prakticky nerozpustný ve vodě, mírně rozpustný v alkalickém prostředí a snadno rozpustný ve většině organických polárních rozpouštědel (Bhargava and Leonard 1996).

15

Obrázek č. 6: Triclosan (Bhargava and Leonard 1996)

2.3. UV filtry Uznáním škodlivých účinků ultrafialového záření (UV) na pokoţku, byl spuštěn vývoj nových organických látek (nyní běţně označovaných jako filtry ultrafialového záření – UV filtry), které mohou absorbovat UV záření a zmírnit negativní vlivy expozice slunečnímu záření (Giokas et al. 2007). UV filtry se vyskytují v opalovacích krémech, rtěnkách, lacích a barvách na vlasy, šamponech a dalších kosmetických

přípravcích. Jsou to buď organické molekuly,

tzv. chemické UV filtry, které absorbují světlo v UV oblasti (UVA 400-320 nm, UVB 320-280 nm), nebo fyzikální UV filtry, jako jsou oxid titaničitý (TiO2) a oxid zinečnatý (ZnO), které UV záření odráţejí a rozptylují (Schlumpf et al. 2008). Aby mohly být UV filtry v kosmetických výrobcích pouţívány, je ve Spojených státech nutné schválení agenturou FDA a v Evropě Evropskou komisí. Je nutný průkaz, ţe tyto látky jsou bezpečné a účinné (UV filter Ingredients, 2007).

2-hydroxy-4-methoxybenzofenon (BZ-3)

3-(4-methylbenzylidene) camphor (4-MBC)

2-ethylhexyl-4-methoxycinnamant (EMC)

2-ethylhexyl-4-(dimethylamino)benzoát (EDP)

Obrázek č. 7: Příklady nejpopulárnějších chemických UV filtrů (Giokas et al. 2007) 16

3.ZDROJE ZNEČIŠTĚNÍ A OSUD V ŢIVOTNÍM PROSTŘEDÍ Za moţné zdroje znečištění lze povaţovat uţ procesy při výrobě, zpracování a distribuci, i kdyţ je jejich podíl na celkovém součtu znečištění zanedbatelný (Ellis 2006). Největšími zdroji jsou odpadní vody z čistíren odpadních vod, úniky ze skládek, odtoky povrchových vod a také přímé vstupy PCPs do prostředí (Daughton and Ternes 1999, Caliman and Gavrilescu 2009). Transport odpadních vod přes městské kanalizační systémy a jejich čištění v ČOV je velmi důleţité pro kontaminaci vodního prostředí (Plagellat et al. 2006, Schoknecht et al. 2003). Ke kontaminaci odpadních vod sloţkami z PCPs dochází při běţných činnostech, jakými jsou úklid, praní textilií, osobní hygiena a ochrana různých materiálů (Kupper et al. 2006, Caliman and Gavrilescu 2009).

3.1. Surfaktanty Masivní pouţívání prostředků obsahujících surfaktanty kaţdý den v domácnostech i průmyslu má za následek rozptýlení v různých sloţkách ţivotního prostředí – v půdě, vodě, sedimentech. Zbytky povrchově aktivních látek z pouţívání jsou vypouštěny do kanalizací nebo přímo do povrchových vod. Ve velkém mnoţství se také hromadí v ČOV. Koncentrace povrchových látek nebo jejich degradačních produktů se liší v povrchových vodách, sedimentech i půdách s kaly (Lara-Martin et al. 2008). Jakmile jsou prostředky obsahující sloţky surfaktantů pouţity, odcházejí s odpadní vodou do kanalizace, kde se odhaduje, ţe je 50 % objemu zdegradováno, 25 % nasorbováno na nerozpustné částice a 25 % je rozpuštěno (Lara-Martin et al. 2008). Následně se dostávají surfaktanty v odpadních vodách do ČOV, kde jsou z 95 - 99 % obvykle odstraněny (McAvoy et al. 1998). Většina pouţívaných surfaktantů je aerobně biologicky rozloţeno během sekundárního čištění, ale značná část je také vylučována ve formě kalů (15 – 37 % v případě LASs a více neţ 90 % pro většinu hydrofóbních sloţek) (Ahel et al. 1994). Osud surfaktantů, konkrétně LASs, v ţivotním prostředí je znázorněn na obrázku č. 8.

17

Výroba Použití v domácnosti

kanalizace

odpadní vody

ČOV

Expozice rostlin

voda sediment

kal

Nepřímý vliv člověka Expozice zvířat

Vodní prostředí

Suchozemský efekt Půda hnojená kaly

Vyplavení do podzemních vod

Nadzemní společenstva Půdní společenstva Společenstva podzemních vod

Obrázek č. 8: Osud LASs surfaktantů v ţivotním prostředí (de Wolf and Feijtel 1998)

3.2. Antimikrobiální látky Antiseptika se dostávají do odpadních vod z domácností, nemocnic i průmyslu. Odpadní vody jsou následně vypouštěny přímo do povrchových vod nebo jsou kanalizací přepraveny do ČOV. Během tohoto procesu můţe dojít ke zředění odpadní vody kontaminované antiseptiky vodou bez kontaminace. Také se mohou odpadní vody dostat přímo do vodního prostředí následkem úniku z kanalizace a kanalizačních výpustí (Segura et al. 2009). Antiseptika v odpadních vodách mohou být v ČOV odstraněna v závislosti na jejich schopnosti vázat se na částice (coţ ovlivňuje jejich odstranění pomocí fyzikálně-chemické nebo biologického úpravy) a jejich náchylnosti k biologické přeměně (Ternes and Joss 2007). Antiseptika, mající niţší afinitu k pevným částicím a vyšší odolnost vůči biotransformaci, budou následně vypouštěna do vodních toků (Roberts and Thomas 2006). Látky sorbované na pevné částice, se mohou prostřednictvím kalů dostat do ţivotního prostředí. Odpadní kaly jsou vyuţívány v zemědělství nebo ukládány na skládky (Ternes et al. 2004). Zdroje antiseptik jsou naznačeny na obrázku č. 9 společně se zdroji UV filtrů.

18

UV filtry

Antiseptické látky

opalovací krém

další PCPs (šampón, kosmetika…)

přenos na ručník, oblečení; praní (koupání); příjem a vylučování přes kůţi

koupání (praní)

ČOV

přímý vstup

vyřazení

nepřímý vstup povrchové vody

Obrázek č. 9: Přímé a nepřímé cesty vstupů UV filtrů a antiseptických látek do povrchových vod (Balmer et al. 2004, Cuderman and Heath 2007).

3.3. UV filtry Jak jiţ bylo naznačeno na obrázku č. 1 výše, pro UV filtry existují dva moţné vstupy do ţivotního prostředí. Jedná se o přímý vstup do povrchových vod v důsledku rekreační činnosti, například při koupání, kdy dochází k uvolňování UV filtrů obsaţených v kosmetických přípravcích do vody. Produkty, které jsou označeny jako voděodolné, mají obecně 50 - 80% odolnost proti vodě (WRR – water resistance retention) po čtyřech ponořeních do vody, zatímco ty, které mají podobné vlastnosti jako produkty běţně pouţívané, např. opalovací krémy, spreje apod., jsou rychle smývatelné a mají WRR kolem 10 – 30 % po opláchnutí (Stokes and Diffey 1999). Také je zde moţnost vstupu nepřímého, kdy se do povrchových vod UV filtry dostávají prostřednictvím vod odpadních, především z domácností, nemocnic a ČOV. Nepřímé cesty mohou zahrnovat odstranění zbytků kosmetických přípravků z pokoţky jejím omytím (osprchováním), ale také odstraněním z těla vyloučením po vstupu pokoţkou nebo po poţití, např. následkem pouţívání rtěnky (Balmer et al. 2004, Daughton and Ternes 1999).

19

4. DEGRADACE A CHOVÁNÍ SLOŢEK PCPs V ŢIVOTNÍM PROSTŘEDÍ 4.1. Surfaktanty Surfaktanty v odpadních vodách se obvykle dostávají do ČOV, kde jsou částečně aerobně zdegradovány a částečně jsou naabsorbovány na čistírenské kaly (Scott and Jones 2000). Sorpce v půdě nebo v sedimentu můţe sníţit toxicitu surfaktantů v ţivotním prostředí (Ivankovic and Hrenovic 2010). Při nízkých koncentracích se totiţ mohou surfaktanty nasorbovat na minerální povrch nebo na čistý sediment díky van der Waalsovým silám mezi hydrofóbními a hydrofilními částmi surfaktantu a povrchu. Jak se ale koncentrace surfaktantů zvyšuje, aktivní sorpční místa na povrchu pevných částic se stávají méně dostupná a dochází k tvorbě více a více hemimicel (Adeel and Luthy 1995, Ying 2006). Přítomnost sedimentů příznivě ovlivňuje biodegradaci. Je to pravděpodobně z důvodu společné akumulace surfaktantů a bakterií v sedimentech (Ivankovic and Hrenovic 2010). Při studiu biodegradace ASs ve vodním sedimentu bylo zjištěno, ţe surfaktany se na sediment naváţí a stimulují bakterie, aby se připojily k nim (Cserhati et al. 2002). Biodegradace většinou závisí na chemické struktuře surfaktantu a fyzikálně-chemických podmínkách v ţivotním prostředí (Ivankovic and Hrenovic 2010). Příkladem můţe být salinitou těţko ovlivnitelný rozklad dodecylbenzensulfonátu sodného v mořské vodě, kdy při zvyšování teploty dochází ke zvyšování rychlosti degradace (Quiroga et al. 1989). Jinak je sledování surfaktantů ve fázi, kdy dosáhnou vodního prostředí, velice náročné. Je to z důvodu, ţe se povrchově aktivní látky prodávají často jako komerční směsi, které mohou zahrnovat stovky různých homologů, isomerů a/nebo ethoxymerů. Kaţdý z nich má různé fyzikálně-chemické vlastnosti (např. vypočtené log Kow pro AEOs je 2,67-6,69, v závislosti na tom, zda se jedná o homolog či ethoxymer) (Lara-Martin et al. 2008).

20

Většina surfaktantů je degradována mikroorganismy v ţivotním prostředí. Anionické LASs jsou degradovány aerobními organismy tvořícími biofilm (Ying 2006). Nicméně úplná degradace LASs v ČOV není zcela moţná, protoţe LAS jsou schopné přetrvávat za anaerobních podmínek (Holt et al. 1998, Ying 2006). Je to z toho důvodu, ţe biodegradace při omega-oxidaci alkylového řetězce a rozštěpení benzenového jádra vyţaduje molekulární kyslík (de Wolf and Feijtel 1998). Po biodegradaci omega-oxidací dochází k betaoxidaci (Yadav et al. 2001). Výsledné mono- a dikarboxylové sulfofenylové kyseliny jsou dále desulfonovány a aromatické jádro je rozštípnuto (de Wolf and Feijtel 1998). K rozloţení LASs za aerobních podmínek, je nutná přítomnost určitého společenstva kmenů bakterií (Hrsak and Begonja 1998). Jedná se o striktně aerobní gramnegativní bakterie rodů Alcaligenes, Deleya, Oceanospirillum, Aquaspirillum a Pseudomonas (Sigoillot and Nguyen 1992). Kationické surfaktanty jsou v aerobních podmínkách rozloţitelné různou rychlostí (Ivankovic and Hrenovic 2010). Fyzikálně-chemické vlastnosti QACs mohou mít rozhodující vliv při biologické degradaci v ţivotním prostředí. Například biodegradace za aerobních podmínek obecně klesá s počtem skupin nemethylovaných alkylů (Ying 2006). Také náhrada methyl za benzyl skupinu můţe dále sníţit biologickou rozloţitelnost QACs (Garcia et al. 2001). Méně častěji vyuţívané amfoterní surfaktanty AOs jsou snadno biologicky rozloţitelné v aerobních i anaerobních podmínkách (Singh et al. 2006) a neionické surfaktanty jsou obecně snadno biodegradabilní za aerobních podmínek (Scott and Jones 2000). Surfaktanty své vlastnosti povrchově aktivních a pěnících látek vykazují i v přirozených vodách uţ v nízkých koncentracích 1mg/l. Ačkoliv nejsou toxické pro člověka, jejich přítomnost je povaţována v pitné vodě za neţádoucí z estetického hlediska. Surfaktanty také způsobují sníţení biochemické spotřeby kyslíku (BSK) ve vodě. Přítomnost surfaktantů ve vodních tocích má za následek sníţení provzdušňovací kapacity aţ o 40 %, v klidných vodách dokonce aţ o 70 %. Dalším negativním projevem surfaktantů v povrchových vodách je fakt, ţe koncentrují na hladině mykobakterie a viry, které jsou dále transportovány vodou nebo větrem a mohou představovat zdroje epidemických nemocí (Yapijakis and Wang 2004).

21

4.2. Antimikrobiální látky Antiseptika se mohou částečně biologicky rozkládat nebo mineralizovat v ČOV díky bakteriím, které jsou schopné tyto látky kometabolizovat nebo je vyuţívat jako zdroj uhlíku a energie pro růst (Ternes et al. 2004). Pokud antiseptika dosáhnou vodního prostředí, jsou ovlivněna různými abiotickými a biotickými procesy, které mají vliv na jejich biodostupnost a následně také dopad na vodní biotu. Relativní význam těchto procesů o osudu antiseptik je dán jejich fyzikálně-chemickými vlastnostmi a také podmínkami v prostředí, ve kterém jsou přítomny (Peschka et al. 2007). Biodegradace a další procesy, jako jsou sorpce, fotolýza a hydrolýza, mohou sníţit zatíţení ţivotního prostředí antiseptiky a také částečně vést k degradaci nebo mineralizaci (Halling-Sorensen et al. 1998, Segura et al. 2009). Antiseptika, mající niţší citlivost na tyto nebiologické procesy, mohou být perzistentní a jejich koncentrace v ţivotním prostředí je sniţována hlavně ředěním ve vodním prostředí. Protoţe jsou ale antiseptika do ţivotního prostředí uvolňována kontinuálně, jsou často povaţována v přírodních vodách v místě vypouštění za látky perzistentní, ačkoliv jsou schopné degradace během několika dní (Sedlak et al. 2004).

4.2.1. Triclosan Osud triclosanu v ČOV je takový, ţe ze 79 % podléhá biodegradaci, 15 % je sorbováno na čistírenský kal a do povrchové vody vstupuje ze 6 % (Singer et al. 2002). Bylo zjištěno, ţe v povrchových vodách je za rozklad triclosanu zodpovědná fotolytická reakce. Důkazem je švýcarské jezero Lake Greifensee, ve kterém byla od srpna do října roku 1999 sledována koncentrace triclosanu s tím výsledkem, ţe na konci léta došlo k 80% ztrátě (Tixier et al. 2002). Fotolýza triclosanu ve vodě vede za UV záření o vlnové délce 254 nm k hydrolýze, dechloraci a vzniku produktů 2,8-dichlorodibenzo-p-dioxinu (2,8-DCDD) a 2,4-dichlorfenolu (2,4-DCP) (Ferrer et al. 2004). Na druhou stranu, ze sedimentů je triclosan těţko odstranitelný, jak bylo zjištěno sledováním švýcarského jezera Greifensee, kde byl nalezen 30 let starý triclosan (Singer et al. 2002).

22

4.3. UV filtry V současné době není znám dostatek informací, aby bylo moţné zcela popsat osud UV filtrů v ţivotním prostředí. Z poměrně vysokých hodnot Koc (distribuční koeficient organického uhlíku) lze usuzovat, ţe UV filtry jsou schopné se vázat na pevné částice, zvláště ty s vysokým obsahem organických látek. Z tohoto faktu vyplývá, ţe tyto sloučeniny mohou být z vodního sloupce odstraňovány sorpcí či sedimentací. Nicméně i jiné děje mohou být za odstraňováním UV filtrů z vod. Příkladem je rychlý rozklad v povrchových vodách ethylhexyl methoxycinnamatu (EMC) i přes vysoký rozdělovací koeficient log Kow a koeficient Koc (Giokas et al. 2007). Předpokládá se, ţe těmi dalšími mechanismy odstraňování UV filtrů jsou ty fotochemického původu. Po expozici nasyceného roztoku UV filtry slunečnímu záření dochází k degradaci UV filtrů na oxidační radikály, které mohou mít toxické účinky (Inbaraj et al. 2002).

5. EKOTOXIKOLOGICKÉ ÚČINKY 5.1. Surfaktanty Anionické surfaktanty, které samy o sobě vykazují značnou biologickou aktivitu, jsou schopné vázat se na bioaktivní makromolekuly, jakými jsou škrob (Merta and Stenius 1999), bílkoviny (Nielsen et al. 2000), peptidy a DNA, nebo se vloţí do různých buněčných fragmentů (tj. membránových fosfolipidů), kde způsobí jejich vyřazení z funkce. Vazby na proteiny a peptidy mohou změnit skládání polypeptidového řetězce a povrchový náboj molekuly. Změna struktury náboje můţe vést k modifikované biologické funkci (Cserhati et al. 2002). Primárním cílem kationických surfaktantů je cytoplazmatická membrána bakterií. QACs se váţí na vnitřní membrány a způsobí jejich rozpad prostřednictvím svého dlouhého alkylového řetězce (McDonnell and Russell 1999). Neionické surfaktanty jsou obecně méně efektivní neţ ionické. Vyvíjejí antimikrobiální aktivitu vazbou na různé proteiny a fosfolipidové membrány. Tím je zvyšována propustnost membrán a váčků s následkem úniku sloučenin s nízkou molekulární hmotností. Ztráta iontů a aminokyselin můţe vést k poškození buňky nebo aţ k buněčné smrti (Cserhati 1995).

23

Vysoké koncentrace nahromaděných surfaktantů mohou inhibovat mikroorganismy v ČOV a způsobovat tak ohroţení čištění a odbourávání odpadních vod a odstraňování škodlivin. Různé typy surfaktantů jsou nalézány v různých úrovních v ČOV, povrchových vodách, suchých kalech, kalech pouţívaných jako hnojiva v zemědělství a sedimentech. Nadměrné pouţívání jakéhokoliv druhu surfaktantu a jejich zneškodňování v ţivotním prostředí, zejména ve vodě, by mohlo váţně ovlivnit ekosystém. Z tohoto důvodu jsou anionické, kationické, neionické i amfoterní surfaktanty sledovány a regulovány ve fázi vypouštění do ČOV a příjmu vodními organismy (Ivankovic and Hrenovic 2010). Obecně platí, ţe koncentrace surfaktantů povolená pro příjem vodními organismy je niţší neţ skutečná koncentrace toxicity pro vodní organismy. Ředění v povrchových vodách by mělo minimalizovat toxické účinky na mikroorganismy (Ivankovic and Hrenovic 2010, Ying 2006). Singh et al. (2002) testovali sedm surfaktantů na šesti sladkovodních organismech (4 druhy ryb, korýš, larvy dvoukřídlého hmyzu) a zjistili, ţe kationické surfaktanty jsou toxičtější neţ anionické a anionické jsou toxičtější neţ neionické surfaktanty. Toxický vliv surfaktantů na bakterie není natolik studován, jako například toxicita pro vodní bezobratlé a ryby. Přesto největší pozornost je věnována toxicitě kationických surfaktantů QACs, které jsou široce pouţívány jako desinfekční prostředky ve zdravotnictví, k čištění povrchů, desinfekci rukou personálu a pacientů kolonizovaných Staphylococcus aureus (Smith et al. 2008). S tím souvisí obava, ţe intenzivní pouţívání QACs můţe vést ke vzniku resistence bakterií (Walsh et al. 2003). Proto je rizikové pouţívat desinfekční prostředky v niţších koncentracích neţ je uváděno výrobcem (Smith et al. 2008). Také existuje hypotéza, ţe QACs mohou mít negativní vliv na čištění odpadních vod. Jejich biocidní účinek na bakterie aktivního kalu můţe způsobit narušení křehké biologické rovnováhy (Ivankovic and Hrenovic 2010). Toxicita surfaktantů na organismy ţijící ve vodním prostředí je testována na vodních rostlinách, bezobratlých i obratlovcích. Z rostlin jsou modelovými organismy různé druhy řas (Ivankovic and Hrenovic 2010). Projev toxicity na nich je dán velkou variabilitou podle typu surfaktantu a testovaného druhu. Řasy tvoří první trofické úrovně a jsou základními producenty kyslíku ve vodních ekosystémech (Sibila et al. 2008). Z vodních bezobratlých je nejčastějším modelovým organismem tzv. vodní blecha neboli hrotnatka velká - Daphnia magna. Modelovými organismy obratlovců jsou většinou ryby, případně ţáby (Ivankovic and Hrenovic 2010). Kromě přímých toxických účinků surfaktantů na organismy jsou zde i účinky 24

na endokrinní systém a také akumulace v organismech. Je prokázáno, ţe APEOs má schopnost se ve velkém mnoţství hromadit v různých tkáních pstruha duhového Oncorhyncus mykiss a také v něm rychle metabolizovat. Produkty degradace APEOs jsou oktylfenoly a nonylfenoly. Koncentrace oktylfenol reziduí byly zvýšeny ve ţluči, exkrementech, játrech, střevech a slepém střevě (Ferreira-Leach and Hill 2001). Tyto produkty biodegradace vzbuzují pozornost z důvodu jejich estrogenních účinků a schopnosti hromadit se ve vodních organismech. Oktylfenoly a nonylfenoly mohou indukovat tvorbu vitellogeninu u samců ryb, ačkoliv je tento hormon za normálních podmínek produkován pohlavně dospělými samicemi vlivem estrogenů (Pedersen et al. 1999). Tímto způsobem narušují oktylfenoly a nonylfenoly normální fungování endokrinního systému ryb (Ivankovic and Hrenovic 2010). Surfaktanty se mohou dostat prostřednictvím čistírenských kalů, pouţívaných jako hnojiva, také do půdy. Jsou téţ součástí různých agrochemikálií, proto je nutné sledovat i toxicitu pro terestrické rostliny. Je prokázáno, ţe neionické surfaktanty jsou pro suchozemské rostliny toxické, a to v roztoku mnohem více neţ v půdě. Předpokládá se, ţe je to z důvodu adsorpce na pevné částice. Tím je také sníţena toxicita pro kořeny rostlin (Ivankovic and Hrenovic 2010). Anionické surfaktanty LASs nejsou pro terestrické rostliny příliš toxické (Ying 2006). Údaje o testování toxických účinků jednotlivých druhů surfaktantů na různých typech organismů jsou uvedeny v tabulce č. 2. Organismy jsou rozděleny do skupin bakterií, řas, rostlin, korýšů, ryb a ţab. Testy byly provedeny u surfaktantů LAS (alkylbenzen sulfonáty), QAC (kvartérní amonné sloučeniny), AO (amin oxiny), AEO (alkohol polyethoxyláty), AES (alkyl ethoxysulfáty). Jako výstupní body jsou pouţity EC10 – efektivní koncentrace způsobující 10% inhibici, EC50 – efektivní koncentrace způsobující 50% inhibici, LC50 – letální koncentrace, při které uhyne 50 % testovaných organismů, NOEC (no observed effect concentration) – koncentrace bez pozorovatelného účinku (Ivankovic and Hrenovic 2010). Jednotlivá data z testování byla sestavena do tabulky autory Ivankovic and Hrenovic (2010) z původních zdrojů: (Mariani et al. 2006, Sutterlin et al. 2008, Garcia et al. 2007, Belanger et al. 2006, Liwarska-Bizukojc et al. 2005, Ying 2006, Pavlic et al. 2005, Sibila et al. 2008).

25

Organismus

Bakterie

Surfaktanty LAS

EC50-Luminiscence 30 min

109,7

Pseudomonas putida

LAS

EC50 – inhibice růstu 16 h

33,4

Vibrio fischeri

QAC

EC50-Luminiscence 30 min

0,5

Pseudomonas putida

QAC

EC50 – inhibice růstu 16 h

6,9

AO

EC50-Luminiscence 15 min

2,4

Microcystis aeruginosa

AEO

EC10 Hustota buněk

0,154

Dunaliella sp.

LAS

EC50 - 24 h

3,5

Pseudokirchneriella subcapitata

AES

EC50 – Hustota buněk 72 h

3,5

Raphidocelis subcapitata

AES

IC50 – Hustota buněk 72 h

2,18

Dunaliella sp.

QAC

EC50 - 24 h

0,79

Navicula pelliculosa

AEO

EC10 Hustota buněk

0,140

AEO

EC10 – Počítání lístků

0,101

AES

LC50 –Mortalita Nauplii 72 h

23,92

QAC

EC50 - Znehybnění 24 h

0,38

Daphnia magna

AO

EC50 - Znehybnění 48 h

6,8

Carassius auratus

LAS

EC50 - Znehybnění 48 h

5,1

Salmo gairdneri

AES

EC50 - Znehybnění 48 h

10,84

Salmo gairdneri

QAC

EC50 - Znehybnění 48 h

1,21

Pimephales promelas

AEO

NOEC - Přeţití

4,35

Xenopus laevis

AES

LC50 - 72 h

6750

Rostliny Lemna minor Artemia franciscana Korýši Daphnia magna

Ryby

Ţáby

Koncentrace mg/l

Vibrio fischeri

Phosphobacterium phosphoreum

Řasy

Výstupní bod

Tabulka č. 2: Toxicita různých typů surfaktantů na vybrané organismy (Ivankovic and Hrenovic 2010)

26

5.2. Antimikrobiální látky Parabeny jsou rychle vstřebávány, metabolizovány a vylučovány z těla. Jedinci, kteří nemají poškozenou kůţi, nejsou ţádným způsobem podráţděni, nicméně pouţití na kůţi poškozenou vyvolá alergickou reakci. Testování v in vitro (ve zkumavce) a in vivo (v ţivém organismu) studiích na účinky genotoxicity prokázalo negativní výsledky. Parabeny také nejsou karcinogenní. Některé ale mají účinky na reprodukci. Schopnost parabenů transaktivovat estrogenový receptor roste s velikostí alkylové skupiny, naopak akutní toxicita parabenů se zvyšující se délkou alkylového řetězce klesá (Soni et al. 2005). Většina studií ohledně testování ekotoxikologických účinků parabenů je z 50. – 90. let 20. století a není volně přístupná na vědeckých databázích. Autorkou odborného článku, který veškeré známé ekotoxikologické účinky shrnuje, je Soni et al. (2005). Studie, která by se zabývala ekotoxikologickými účinky antiseptik celkově, dosud nebyla vytvořena nebo nebyla přístupna v době psaní této práce, ačkoliv nyní známé účinky některých konkrétních antiseptik jsou závaţné. Příkladem je triclocarban, který by podle autorů Chen et al. (2008) měl být uznán jako nový druh endokrinního disruptoru. Ve svém výzkumu zjistili, ţe sám má malou nebo ţádnou androgenní aktivitu, ale má zesilující vliv na silné nativní androgeny. Závěry z in vivo testování naznačují, ţe triclocarban má pozitivní vliv na androgenní receptory tkání nebo buněk, které jsou androgenními cíly (semenný váček, břišní prostata, Cowperova ţláza) (Chen et al. 2008).

5.2.1. Triclosan Původním předpokladem bylo, ţe triclosan působí degradačním účinkem na bakteriální membránu (Russell 2004). Nicméně bylo prokázáno, ţe triclosan působí prostřednictvím mechanismu

inhibice

enoyl-acyl

nosiče

bílkoviny

reduktázy

FabI

v organismech

Staphylococcus aureus a Escherichia coli, pro které je tento enzym důleţitý v cyklu biosyntézy mastných kyselin

(Fan et al. 2002).

Triclosan

má

vynikající

účinnost

na Staphylococcus aureus a je vyuţíván i proti methicilin-rezistentním kmenům Staphylococcus aureus v nemocnicích (Bamber and Neal 1999). Naopak některé bakterie mají přirozenou rezistenci proti triclosanu. Jedná se o Pseudomonas aeruginosa, která je odolná proti vysoké úrovni triclosanu. Je to díky přítomnosti odtokové pumpy, která vyčerpává

27

triclosan ven z buňky. Tak můţe Pseudomonas aeruginosa přeţít koncentraci triclosanu přesahující 1000 µg/ml (Chuanchuen et al. 2003). V testování toxicity triclosanu na Daphnia magna bylo zjištěno, ţe při 48 hodinovém působení je EC50 390 µg/l a na ryby při působění 96 hodin je střední letální koncentrace pro Pimephales promelas 260 µg/l a pro Lepomis macrochirus 370 µg/l (Orvos et al. 2002). Veldhoen et al. (2006) studovali, zda environmentálně relevantní koncentrace triclosanu vyvolá změny hormonu štítné ţlázy u severoamerického skokana volského (Rana catesbeiana). Prokázali, ţe vystavení nízké hladiny triclosanu hormonům štítné ţlázy narušuje související genové exprese a můţe měnit postembryonální rozvoj ţab (Veldhoen et al. 2006).

5.3. UV filtry Několik UV filtrů vykazuje estrogenní a některé také anti-androgenní účinky. Jsou přítomny v ČOV, povrchových vodách, biosféře i mateřském mléce, coţ naznačuje potencionální expozici během vývoje. Vývojová toxicita byla studována na potkanech působením UV filtru 3-(4-methylbezyliden) camphor (4-MBC) a 3-benziliden camphor (3-BC), podávaných v chovu generaci rodičů před pářením, během těhotenství a kojení aţ do dospělosti potomků. Potomci vykazovali posílení růstu prostaty po podávání 4-MBC a změnu děloţní genové exprese po obou UV filtrech. 4-MBC a 3-BC způsobily opoţdění puberty a mají vliv na hmotnost reprodukčních orgánů u dospělých potomků. Také byly zaznamenány účinky na štítnou ţlázu. Nejniţší hodnoty koncentrace, kdy byl pozorován negativní efekt na potkanech (LOAEL), jsou pro 4-MBC 7 mg/kg a pro 3-BC 0,24 mg/kg. Hodnoty NOAEC jsou pro 4-MBC 0,7 mg/kg a pro 3-BC 0,07 mg/kg (Schlumpf et al. 2008). V jiné studii Kunz a Fent (2006b) analyzovali 18 UV filtrů a jeden metabolit in vitro na estrogenní, antiestrogenní, androgenní a antiandrogenní účinky v necytotoxických koncentracích na rekombinantní systém kvasinek nesoucích lidský estrogenní receptor (hERα) nebo androgenní receptor (hAR). Jejich výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 3.

28

Sloučenina

Estrogenní aktivita

Antiestrogenní aktivita

Androgenní aktivita

Antiandrogenní aktivita

4-methylbenzyliden camphor (4MBC)

--

xxx

--

xxx

3-benzyliden camphor (3BC)

x

xxx

--

xxx

benzophenon-1 (BP1)

xxx

--

--

xxx

benzophenon-2 (BP2)

xxx

--

xxx

xxx

4-hydroxy benzofenon (4HB)

xxx

--

--

xxx

4,4′-dihydroxybenzofenon (4DHB)

xxx

--

--

xxx

benzophenon-3 (BP3)

x

xxx

--

xxx

benzophenon-4 (BP4)

x

xxx

--

xxx

isopentyl-4-methoxycinnamat (IMC)

--

xxx

xx

xxx

octyl methoxycinnamat (OMC)

--

xxx

xx

xxx

octocrylen (OC)

--

xxx

x

xxx

benzyl salicylát (BS)

x

xxx

--

xxx

fenyl salicylát (PS)

xx

xxx

--

xxx

homosalát (HMS)

--

xxx

xxx

xxx

octyl salicylát (OS)

--

xxx

xx

xxx

--

xxx

--

--

xxx

--

--

xx

--

xxx

--

xxx

--

x

--

--

para amino-benzoová kyselina (PABA) ethyl-4 amino benzoát (Et-PABA) octyl dimethyl para aminobenzoát (OD-PABA) ethoxylovaný ethyl 4-aminobenzoát (Peg25-PABA)

Vysvětlivky: znaky ukazují účinnost sloučenin UV filtrů v jednotlivých testech: xxx maximální dávka – reakce křivky s ≥ 80% účinností, xx submaximální dávka – reakce křivky s ≥ 30% účinností, x submaximální dávka – reakce křivky s < 30% účinností, -- nebyl detekován, tučné nejúčinnější Tabulka č. 3: Výsledky testování estrogenity, antiestrogenity, androgenity a antiandrogenity na různých UV filtrech (Kunz and Fent 2006b). 29

Ačkoliv jsou známé informace o účincích samostatných UV filtrů, jejich činnost a interakce ve směsích jsou méně prostudované. Kunz a Fent (2006a) prováděli in vitro studii s 8 běţně pouţívanými UV filtry, které různě nakombinovali do směsí po 2, 4 a 8 a testovali je na kvasinkách Saccharomyces cerevisiae nesoucích lidský estrogenní receptor α (hERα). Zjistili, ţe mezi směsmi UV filtrů se vyskytují významné interakce, například zvýšení základní aktivity o 10 %, ke kterým došlo i v případě koncentrací, které byly na úrovni NOEC u jednotlivých UV filtrů. Tyto výsledky jsou důleţité pro hodnocení rizik a nebezpečí pouţívání UV filtrů v PCPs (Kunz and Fent 2006a).

6. PRAKTICKÁ ČÁST: TEST VLIVU VYBRANÉHO PARABENU A UV FILTRU NA SIGNÁLOVÁNÍ RETINOIDNÍCH RECEPTORŮ IN VITRO 6.1. Úvod Retinoidní receptory kyseliny retinové jsou, jako steroidní hormony a hormony štítné ţlázy, nukleárními receptory, které reagují na různé ligandy. Těmi jsou all-trans retinová kyselina a 9-cis retinová kyselina, které jsou oxidačními metabolity vitamínu A a jsou nezbytné pro buněčnou proliferaci, vývoj a diferenciaci obratlovců, a proto mají rozhodující roli při normálním růstu a udrţování homeostázy v těle (Bastien 2004). Nedostatek vitamínu A v průběhu těhotenství způsobuje embryonální malformace v různých orgánech (Zile 1998, Zile 2001), zatímco přebytek retinové kyseliny můţe pomocí jejích receptorů vyvolat teratogenní akce ve vyvíjejícím se embryu (Kamata et al. 2008). V této práci byl zjišťován vliv vybraného UV filtru – 3-(4-methylbenziliden camphoru) (4-MBC) a parabenu – benzyl-4-hydroxy benzoátu (benzyl paraben) na signální dráhu retinoidních receptorů, za pouţití buněčné linie P19/A15.

30

6.1.1. Princip Buněčná linie P19 je odvozená linie z myšího teratokarcinomu a částečně si zachovává vlastnosti podobné embryonálním kmenovým buňkám. Především se jedná o schopnost diferenciace (van der Heyden and Defize 2003). Odvozená linie P19/A15 má vnesený gen pro luciferázu, který je řízený RARE (responsivními elementy kyseliny retinové). Po aktivaci retinoidních receptorů ligandem, kterým je kyselina retinová, dojde k expresi genů řízených RARE, včetně vneseného genu pro luciferázu. Exprimovaná luciferáza katalyzuje luminiscenční reakci přeměny luciferinu na oxidovanou formu, při níţ vzniká světlo. Tato vzniklá luminiscence je měřena. Studovaný 4-MBC a benzyl paraben mohou expresi cílových genů ovlivnit, coţ se projeví změnou úrovně luminiscence. Také je sledován cytotoxický vliv studovaných látek.

6.1.2. Cíl Cílem je úspěšná kultivace savčích buněk linie P19/A15, stanovení potencionálního vlivu 4-MBC (UV filtru) a benzyl parabenu (parabenu) na aktivitu signální dráhy receptoru pro kyselinu all-trans retinovou a stanovení cytotoxického vlivu 4-MBC a benzyl parabenu na buněčnou linii P19/A15.

6.2. Materiál a metody 6.2.1. Pomůcky sterilní 96 jamkové desky pro tkáňové kultury, bílé 96 jamkové desky, kultivační lahvičky, skleněné lahvičky, jednorázové sterilní Pasteurovy pipety, jednorázové sterilní plastové pipety, rukavice

6.2.2. Přístroje kahan, odsavačka, mikropipety, multikanálová pipeta 100-200 μl, zpětný mikroskop, třepačka, flow-box, inkubátor sycený oxidem uhličitým (CO2), Cellometr, luminometr Luminoscan Ascent, destičkový spektrofotometr

31

6.2.3. Chemikálie médium DMEM/F12 bez fenolové červeně, médium DMEM s fenolovou červení, fetální bovinní sérum (FBS), L-glutamin, sterilní trypsin, sterilní fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS), kit pro stanovení luminiscence Steady-glo (Promega), neutrální červeň (Sigma-Aldrich), benzyl 4-hydroxybenzoát – benzyl paraben (čistota 99 %, SigmaAldrich), 3-(4-methylbenzylidene) camphor – 4-MBC (čistota ≥ 98 %, Sigma-Aldrich), dimethylsulfooxid (DMSO), all-trans retinová kyselina – ATRA (čistota ≥ 98 %, SigmaAldrich)

6.2.4. Kultivace buněčné linie P19/A15 Buňky jsou kultivovány v médiu DMEM s 10% FBS při teplotě 37 °C v inkubátoru syceném CO2, v plastové 25 cm2 kultivační lahvičce. Změna barvy kultivačního média do oranţova upozorňuje na nutnost buňky zpasáţovat. Protoţe tato linie buněk roste relativně rychle, je nutné pasáţovat přibliţně kaţdý třetí den v poměru 1:10 aţ 1:20 v závislosti na konfluenci.

6.2.5. Nasazení a expozice buněk Pro pouţití buněk v testu je nutné rozsuspendování buněk v bílém kultivačním médiu (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-glutamin) v rámci pasáţování. Buňky jsou spočítány pomocí Cellometru a po vhodném naředění nasazeny do 96 jamkové destičky v 100 μl média na jamku. Počet buněk vhodný pro 24 hodinový experiment je 10 000 na jamku, pro 6 hodinový 12 000 buněk na jamku. Po 24 hodinách inkubace jsou dávkovány expoziční roztoky: 

negativní kontrola – rozpouštědlová = DMSO



pozitivní kontrola – ředící řada ATRA



benzyl paraben v DMSO – samostatně nebo v koexpozici s ATRA



4-MBC v DMSO – samostatně nebo v koexpozici s ATRA

Kaţdá jednotlivá koncentrace vzorku i ATRA je nanášena na desku v triplikátu. Expozice je prováděna ve 100 μl média bez fenolové červeně s výslednou koncentrací DMSO 1 % celkového objemu média v jamce.

32

6.2.6. Vyhodnocení cytotoxicity Po uplynutí doby expozice 6 nebo 24 hodin jsou pod zpětným mikroskopem zkontrolovány viditelné změny počtu a tvaru buněk. Z kaţdé jamky je odpipetováno 200 μl média a následně přidáno 100 μl neutrální červeně. Buňky v expozici jsou inkubovány dalších 90 minut v inkubátoru syceném CO2. Po uplynutí této doby je projev cytotoxicity měřen na destičkovém spektrofotometru. Vyhodnocení je provedeno v programu Microsoft Excel, kde je srovnávána cytotoxicita vzorků exponovaných sledovanými látkami. Ze získaných hodnot jsou vyloučeny odlehlé hodnoty a z kaţdého triplikátu je spočítán aritmetický průměr a směrodatná odchylka. Výsledky jsou převedeny na procenta a srovnávány s DMSO jako 100% kontrolou.

6.2.7. Vyhodnocení luminiscence Po uplynutí doby expozice 6 nebo 24 hodin jsou pod zpětným mikroskopem zkontrolovány viditelné změny počtu a tvaru buněk. Z kaţdé jamky je odpipetováno 150 μl média, přidáno 50 μl originálního kitu. Tím jsou buňky zlyzovány. Destička je umístěna do třepačky, kde během 15 minut dojde k promíchání. Následně je mnoţství 100 μl z kaţdé jamky přepipetováno do bílé desky. Ihned je měřena luminiscence na luminometru. Vyhodnocení je opět provedeno v programu Microsoft Excel, kde je srovnávána intenzita luminiscence kalibračních vzorků a vzorků exponovaných sledovanými látkami. Ze získaných hodnot jsou vyloučeny odlehlé hodnoty a z kaţdého triplikátu je spočítán průměr a směrodatná odchylka. Výsledky jsou převedeny na procenta a srovnávány v případě testu bez koexpozice s ATRA s DMSO jako negativní kontrolou, v případě s koexpozicí s ATRA s 32 nM ATRA.

6.3. Výsledky Po úspěšné kultivaci savčí buněčné linie P19/A15, která má vnesený gen pro luciferázu, byl testován potencionální vliv dvou vybraných látek na signální dráhy receptoru pro kyselinu all-trans-retinovou. Jednou z látek byl benzyl paraben, patřící do skupiny parabenů, druhou testovanou látkou byl UV filtr 4-MBC. Tyto dvě látky byly vybrány pro své účinky při aktivaci RARγ v předchozích testech s kvasinkami (Kamata et al. 2008). Současně byl také

33

proveden kontrolní test cytotoxicity, který měl odhalit případnou toxicitu pro buňky, která by mohla být důvodem pro ovlivnění výsledků účinků látek při měření luminiscence. V testu cytotoxicity byl sledován projev toxicity na buňkách v 6 a 24 hodinovém testování. Pro testy luminiscence bylo provedeno několik opakování 6 a 24 hodinových testů. Výsledné průměrné hodnoty obou testů jsou uvedeny níţe.

6.3.1. Cytotoxicita Cytotoxické působení v 6 hodinovém testu prokázalo nevýznamný toxický vliv látek benzyl parabenu a 4-MBC na buňky u sledovaných koncentrací. Pouze v 24 hodinovém testu zobrazeném v grafu č. 1 je moţné vidět toxicitu nejvyšší testované koncentrace 50 μM látky 4-MBC, blíţící se 40 %. Přesto byla tato koncentrace testována i na luminiscenčním testu pro zjištění moţného vlivu cytotoxicity na luminiscenční odpověď. Toxicita okolo 20 % zjištěná u benzyl parabenu není obecně povaţována za významnou vzhledem k rozptylům u testů cytotoxicity za pouţití neutrální červeně.

100 80 60 40 20

DM S O

benz y l paraben

DM S O

50µM

25µM

10µM

5µM

1µM

0

100µM

50µM

10µM

5µM

1µM

0

0

% ro z p o u št ěd l o vé k o n tro ly D M SO

120

4-M B C

Graf č. 1: Výsledné hodnoty v procentech z měření cytotoxického účinku benzyl parabenu a 4-MBC v 24 hodinovém testu. Výsledky jsou vztaţeny k negativní kontrole DMSO. Chybové úsečky značí směrodatnou odchylku.

34

6.3.2. Luminiscence Pro kalibraci byly pouţity roztoky negativní kontroly – DMSO a pozitivní kontroly – ředící řady s ATRA. Testy 6 i 24 hodinový mají kaţdý vlastní kalibrační křivku. Pro test 6 hodinový je uvedena křivka v grafu č. 2, 24 hodinovému testu je vlastní graf č. 3. V testování vlivu benzyl parabenu a 4-MBC bez koexpozice s ATRA bylo zjištěno, ţe látkami benzyl paraben a 4-MBC nebyla ovlivněna exprese cílových genů a tedy nedošlo k pozorovatelné změně úrovně luminiscence. Při testování vlivu benzyl parabenu a 4-MBC v koexpozici s ATRA bylo zjištěno, ţe tyto látky luminiscenční odpověď 32 nM ATRA ovlivňuji. Pro 6 a 24 hodinový test bylo dosaţeno rozdílných výsledků. Výsledné hodnoty pro 6 hodinový test jsou uvedeny v grafu č. 4. Odpověď benzyl parabenu ve všech sledovaných koncentracích se zvyšuje oproti kontrole 32 nM ATRA. Zvyšování probíhá exponenciálně, aţ na koncentraci 50 μM, kde došlo k mírnému sníţení odpovědi. U testované látky 4-MBC došlo ke zvýšené odpovědi při koncentraci 1 a 5 μM, účinkem 4-MBC při vyšších koncentracích luminiscenční odpověď klesala. Výsledné hodnoty pro 24 hodinový test jsou uvedeny v grafu č. 5. Při testování benzyl parabenu byl zjištěn exponenciální růst odpovědi. Nejniţší koncentrace 1 a 5 μM způsobily sníţení odpovědi oproti 32 nM ATRA. Od koncentrace 10 μM je jiţ pozorovatelné zvýšení odpovědi, kdy nejvyšší koncentrace 100 μM dosahuje více neţ dvojnásobné odpovědi oproti 32 nM ATRA. U látky 4-MBC došlo ke zvýšení odpovědi oproti 32 nM ATRA aţ do koncentrace 50 μM testovaného roztoku. Nejvyšší zesílení odpovědi ATRA je však pozorovatelné při koncentraci 10 μM. U koncentrací 25 μM a 50 μM pak je luminiscenční odpověď stále vyšší neţ odpověď samotné ATRA 32 nM, ale jiţ je patrné sníţení, pravděpodobně vinou cytotoxicity.

35

% ATRA 3 2 nM

200

150

100

50

10

00

0n

M

nM 50

00

nM 00 25

10

00

nM

M 50

0n

M 5n 12

nM

M 4n

M 5n

32

D

0,

M

S

O

0

Graf č. 2: Kalibrační křivka pro 6 hodinový test, DMSO jako negativní kontrola, ředící řada ATRA jako pozitivní kontrola; hodnoty jsou uvedeny v procentech, chybové úsečky značí směrodatnou odchylku.

350

% ATRA 3 2 nM

300 250 200 150 100 50

10

00

0n

M

nM 50

00

nM 00 25

10

00

nM

M 50

0n

M 5n 12

nM 32

M 4n

M 5n 0,

D

M

S

O

0

Graf č. 3: Kalibrační křivka pro 24 hodinový test, DMSO jako negativní kontrola, ředící řada ATRA jako pozitivní kontrola; hodnoty jsou uvedeny v procentech, chybové úsečky značí směrodatnou odchylku.

36

% A T R A 32 n M

200 150 100 50

32 nM

benz y l paraben

32 nM

A TR A

50µM

25µM

10µM

5µM

1µM

0

100µM

50µM

10µM

5µM

1µM

0

0

4-M B C

A TR A

Graf č. 4: Výsledné hodnoty změn luminiscence buněk v koexpozici s ATRA v 6 hodinovém testu působení benzyl parabenu a 4-MBC; hodnoty jsou uvedeny v procentech, kontrolou je 32 nM ATRA. Chybové úsečky značí směrodatnou odchylku.

% A T R A 32 n M

250 200 150 100 50

32 nM

benz y l paraben

32 nM

A TR A

50µM

25µM

10µM

5µM

1µM

0

100µM

50µM

10µM

5µM

1µM

0

0

4-M B C

A TR A

Graf č. 5: Výsledné hodnoty změn luminiscence buněk v koexpozici s ATRA v 24 hodinovém testu působení benzyl parabenu a 4-MBC; hodnoty jsou uvedeny v procentech, kontrolou je 32 nM ATRA. Chybové úsečky značí směrodatnou odchylku.

37

6.4. Diskuse V cytotoxickém testu sledování účinků 3-(4-methylbezyliden) camphoru (4-MBC) a benzyl-4-hydroxy benzoátu (benzyl paraben) bylo prokázáno, ţe při 6 hodinové expozici není ani jedna z uvedených látek pro buňky P19/A15 v testovaných koncentracích toxická. Pouze v 24 hodinovém testu byl pozorován zvýšený cytotoxický účinek látky 4-MBC v koncentraci 50 μM, který dosahoval téměř 40 %. V testování potencionálního vlivu 4-MBC a benzyl parabenu na aktivitu signální dráhy receptoru pro kyselinu all-trans retinovou na buňkách P19/A15 bez koexpozice s ATRA nebyl pozorován ţádný vliv. Naopak při 6 i 24 hodinovém testování 4-MBC a benzyl parabenu v koexpozici s ATRA byla aktivita retinoidních receptorů kyseliny retinové ovlivněna (grafy č. 4 a 5). Výsledky ukazují, ţe tyto dvě látky aktivující RARγ (Kamata et al. 2008) samostatně neaktivují RAR/RXR závislou na signální dráhu buněk P19/A15, mohou ale ovlivňovat odpověď přirozeného ligandu těchto receptorů, all-trans kysleiny retinové. Kromě výše zmíněné aktivace RARγ způsobuje 4-MBC také vývojovou toxicitu prokázanou na potkanech (Schlumpf et al. 2008), která by teoreticky mohla souviset právě s narušením retinoidního signálování. Kromě ovlivnění retinoidních receptorů můţe 4-MBC působit také na další jaderné receptory, mimo jiné působí jako antiestrogen a antiandrogen (Kunz and Fent 2006b) Závěrem lze říci, ţe tímto testováním bylo prokázáno, ţe 3-(4-methylbenziliden) camphor (4-MBC) a benzyl-4-hydroxy benzoát (benzyl paraben) jsou schopné v koexpozici s kyselinou all-trans retinovou ovlivňovat aktivitu signální dráhy retinoidních receptorů u savčí linie buněk P19/A15.

38

7. ZÁVĚR Produkty denní potřeby své označení získaly oprávněně. Jedná se opravdu o produkty, jakými jsou různé kosmetické, čistící a hygienické prostředky, se kterými se setkáváme kaţdý den. Tyto produkty obsahují sloţky látek, které ačkoliv jsou pro nás svými vlastnostmi prospěšné, pro ţivotní prostředí uţ nikoliv. Jsou jimi například surfaktanty, antimikrobiální látky a UV filtry, kterým se věnuje tato práce. Surfaktanty jsou látky hromadící se v mezifázovém rozhraní a sniţující tak povrchové napětí. Tím usnadňují rozpouštění a odstranění nečistot, mají pěnící schopnosti a některé i antibakteriální vlastnosti. Jejich vyuţití je v čistících a pracích prostředcích, vlasových šamponech a kondicionérech, změkčovadlech, prostředcích na nádobí a deodorantech. Antimikrobiální látky jsou vyuţívány jako konzervační látky s biocidním účinkem, ale také jsou součástí čistících a hygienických přípravků, kde jejich význam spočívá hlavně v potlačování výskytu mikroorganismů. Vyskytují se v potravinách i kosmetických prostředcích, jako jsou mýdla, pleťové vody, antiperspiranty a deodoranty a stomatologické výrobky. Jedním z nejvýznamnějších antiseptik je triclosan, látka mající výborné antimykotické a antibakteriální vlastnosti, vyuţívané v široké škále produktů. UV filtry jsou látky chránící pokoţku před škodlivými paprsky slunečního záření, proto je jejich vyuţití také veliké, jak uţ v opalovacích krémech, tak ale také ve rtěnkách či lacích a barvách na vlasy. Z těchto fakt je zřejmé, ţe jsou tyto sloţky PCPs téměř nepostradatelné pro moderní ţivot. Jsou ale také původci znečištění ţivotního prostředí a jejich závaţné ekotoxikologické účinky na organismy nelze opomínat. Do ţivotního prostředí vstupují ať uţ přímo, kdy dochází únikům odpadních vod či přímým kontaktům uvedených látek s prostředím, tak také nepřímo. Tyto látky jsou schopné projít nezměněné přes procesy v čistírnách odpadních vod (ČOV) a také se navázat na čistírenské kaly, jichţ je hojně vyuţíváno jako hnojiv v zemědělství. Protoţe jsou tyto sloţky PCPs do prostředí vypouštěny kontinuálně, často jsou povaţovány za látky perzistentní, ačkoliv jsou rozloţitelné během několika dní.

39

Ať uţ v terestrickém nebo vodním prostředí, jsou organismy často vystaveny setkání s popisovanými sloţkami PCPs nebo jejich degradačními produkty. Účinky těchto látek jsou (jak je podrobněji uvedeno v kapitole ekotoxikologických účinků) přímo toxické či ovlivňující běţnou činnost endokrinního systému s různými následky. Výsledky a informace ze studií, které jsou v této práci citovány, potvrzují, ţe zájem o tyto opomíjené sloţky produktů denní potřeby je oprávněný a ţe další výzkumy z oblasti osudu surfaktantů, antimikrobiálních látek a UV filtrů v ţivotním prostředí a jejich následných ekotoxikologických účinků na organismy jsou nutné.

40

ANOTACE V posledních několika letech začal stoupat zájem environmentalistů o látky, které se vyskytují v nízkých koncentracích v produktech denní potřeby (PCPs), jakými jsou kosmetické, hygienické a čistící přípravky. Hlavním důvodem tohoto zájmu je skutečnost, ţe tyto produkty jsou pouţívány velmi intenzivně a jsou vyráběny v obrovských objemech po celém světě. Cílem předloţené bakalářské práce je shrnutí poznatků o vybraných sloţkách PCPs, se zaměřením na surfaktanty, antimikrobiální látky a UV filtry. Konkrétní pozornost je věnována charakteristice těchto sloţek, jejich výskytu a chování v ţivotním prostředí a následným ekotoxikologickým účinkům na organismy. V praktické části bakalářské práce je pomocí cytotoxického a luminiscenčního testu zkoumán vliv parabenu benzyl-4hydroxybenzoátu a UV filtru 3-(4-methylbenzyliden) camphoru na signálování retinoidů. Výsledkem je potvrzení schopnosti obou látek ovlivňovat aktivitu retinoidních receptorů kyseliny retinové i u savčích buněk odvozené linie P19/A15. Klíčová slova: produkty denní potřeby, surfaktanty, antimikrobiální látky, UV filtry, parabeny, antiseptika, triclosan

41

ANNOTATION In the past few years, the environmentalists‘ interest in substances occuring in low concetrations within the personal care products (PCPs), such as cosmetic, hygienic and cleansing preparations, have risen. The main reason for this interest is the fact that these products are being used very intensively and are produced in huge quantities all over the world. The aim of the presented bachelor thesis is to summarise the knowledge about the selected constituents of PCPs with focus on surfactants, antimicrobial agents and UV filters. Particular attention is devoted to the characterization of these substances, to their occurrence and their behavior in the environment and subsequent ecotoxicological impacts on organisms. The practical part of this bachelor thesis deals with the examination of the influence of paraben benzyl-4-hydroxybenzoate and and UV filter 3-(4-methylbenzylidene) camphor on signaling of retinoids by means of cytotoxic and luminescent test. The result of it is the confirmation of the fact that both of the substances are able to influence the activity of retiond receptors of retinoic acid also at the mammalian cells of the derived line P19/A15. Keywords: personal care products, surfactants, antimicrobial agents, UV filters, parabens, antiseptics, triclosan

42

POUŢITÁ LITERATURA Adeel, Z. & R. G. Luthy (1995) Sorption and transport kinetics of a nonionic surfactant through an aquifer sediment. Environmental Science & Technology, 29, 1032-1042. Ahel, M., W. Giger & M. Koch (1994) Behavior of alkylphenol polyethoxylate surfactants in the aquatic environment .1. Occurrence and transformation in sewage-treatment. Water Research, 28, 1131-1142. Ahn, K. C., B. Zhao, J. Chen, G. Cherednichenko, E. Sanmarti, M. S. Denison, B. Lasley, I. N. Pessah, D. Kultz, D. P. Y. Chang, S. J. Gee & B. D. Hammock (2008) In vitro biologic activities of the antimicrobials triclocarban, its analogs, and triclosan in bioassay screens: Receptor-based bioassay screens. Environmental Health Perspectives, 116, 1203-1210. Ali, Z., V. U. Ahmad, M. Zahid & R. B. Tareen (1998) Benzoic acid derivatives from Stocksia brahuica. Phytochemistry, 48, 1271-1273. Antimicrobials. What are Antimicrobials? What are the types of Antimicrobial OTC drug products? [online]. c2007. Cosmeticsinfo.org. [cit. 2010-02-04]. Dostupný z WWW: http://cosmeticsinfo.org/HBI/13 Aronson, J. K. 2006. Parabens. In Meyler's Side Effects of Drugs: The International Encyclopedia of Adverse Drug Reactions and Interactions, ed. J. K. A. Editor: , 26792679. Amsterdam: Elsevier. Bamber, A. I. & T. J. Neal (1999) An assessment of triclosan susceptibility in methicillinresistant and methicillin-sensitive Staphylococcus aureus. Journal of Hospital Infection, 41, 107-109. Bastien J. & C. Rochette-Egly (2004) Nuclear retinoid receptors and the transcription of retinoid-target genes. Gene, 328, 1-16. Belanger, S. E., P. B. Dorn, R. Toy, G. Boeije, S. J. Marshall, T. Wind, R. Van Compernolle & D. Zeller (2006) Aquatic risk assessment of alcohol ethoxylates in North America and Europe. Ecotoxicology and Environmental Safety, 64, 85-99. Bhargava, H. N. & P. A. Leonard (1996) Triclosan: Applications and safety. American Journal of Infection Control, 24, 209-218. Black, J. G., D. Howes &T. Rutherford (1975) Skin deposition and penetration of trichlorocarbanilide. Toxicology 3:253–264. In: Antiseptics and disinfectants: Activity, action, and resistance (McDonnell, G. & A. D. Russell) (1999) Clinical Microbiology Reviews, 12, 147-+. Caliman, F. A. & M. Gavrilescu (2009) Pharmaceuticals, Personal Care Products and Endocrine Disrupting Agents in the Environment - A Review. Clean-Soil Air Water, 37, 277-303. Chen, J. G., K. C. Ahn, N. A. Gee, M. I. Ahmed, A. J. Duleba, L. Zhao, S. J. Gee, B. D. Hammock & B. L. Lasley (2008) Triclocarban enhances testosterone action: A new type of endocrine disruptor? Endocrinology, 149, 1173-1179. Christian, T., R. J. Schneider, H. A. Farber, D. Skutlarek, M. T. Meyer & H. E. Goldbach (2003) Determination of antibiotic residues in manure, soil, and surface waters. Acta Hydrochimica Et Hydrobiologica, 31, 36-44. Chuanchuen, R., R. R. Karkhoff-Schweizer & H. P. Schweizer (2003) High-level triclosan resistance in Pseudomonas aeruginosa is solely a result of efflux. American Journal of Infection Control, 31, 124-124.

43

Coia, J. E., G. J. Duckworth, D. I. Edwards, M. Farrington, C. Fry, H. Humphreys, C. Mallaghan & D. R. Tucker (2006) Guidelines for the control and prevention of meticillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in healthcare facilities. Journal of Hospital Infection, 63, S1-S44. Cserhati, T. (1995) Alkyl ethoxylated and alkylphenol ethoxylated nonionic surfactants interaction with bioactive compounds and biological effects. Environmental Health Perspectives, 103, 358-364. Cserhati, T., E. Forgacs & G. Oros (2002) Biological activity and environmental impact of anionic surfactants. Environment International, 28, 337-348. Cuderman, P. & E. Heath (2007) Determination of UV filters and antimicrobial agents in environmental water samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 387, 13431350. Česko. Zákon o léčivech a o změnách některých souvisejících zákonů (zákon o léčivech) 378/2007 Sb. Sbírka zákonů [online]. 6. prosince 2007 [cit. 2010-04-11]. Dostupný z WWW: http://aplikace.mvcr.cz/archiv2008/sbirka/2007/sb115-07.pdf Daughton, C. G. & T. A. Ternes (1999) Pharmaceuticals and personal care products in the environment: Agents of subtle change? Environmental Health Perspectives, 107, 907938. de Wolf, W. & T. Feijtel (1998) Terrestrial risk assessment for linear alkyl benzene sulfonate (LAS) in sludge-amended soils. Chemosphere, 36, 1319-1343. Ellis, J. B. (2006) Pharmaceutical and personal care products (PPCPs) in urban receiving waters. Environmental Pollution, 144, 184-189. EU. Council directive on the approximation of the laws of the Member States relating to cosmetic products (76/768/EEC). Council directive 76/768/EEC [online]. 27. July 1976 [cit. 2010-03-23]. Dostupný z WWW:
44

Holt, M. S., K. K. Fox, M. Burford, M. Daniel & H. Buckland (1998) UK monitoring study on the removal of linear alkylbenzene sulphonate in trickling filter type sewage treatment plants. Contribution to GREAT-ER project #2. Science of the Total Environment, 210, 255-269. Hrsak, D. & A. Begonja (1998) Growth characteristics and metabolic activities of the methanotrophic-heterotrophic groundwater community. Journal of Applied Microbiology, 85, 448-456. Inbaraj, J. J., P. Bilski & C. F. Chignell (2002) Photophysical and photochemical studies of 2phenylbenzimidazole and UVB sunscreen 2-phenylbenzimidazole-5-sulfonic acid. Photochemistry and Photobiology, 75, 107-116. Ivankovic, T. & J. Hrenovic (2010) Surfactants in the environment. Arhiv Za Higijenu Rada I Toksikologiju, 61, 95-110. Kabara, J. J. (1980) Gras anti-microbial agents for cosmetic products. Journal of the Society of Cosmetic Chemists, 31, 1-10. Kamata, R., F. Shiraishi, J. I. Nishikawa, J. Yonemoto & H. Shiraishi (2008) Screening and detection of the in vitro agonistic activity of xenobiotics on the retinoic acid receptor. Toxicology in Vitro, 22, 1050-1061. Kot-Wasik, A., J. Debska & J. Namiesnik (2007) Analytical techniques in studies of the environmental fate of pharmaceuticals and personal-care products. Trac-Trends in Analytical Chemistry, 26, 557-568. Kunz, P. Y. & K. Fent (2006a) Estrogenic activity of UV filter mixtures. Toxicology and Applied Pharmacology, 217, 86-99. --- (2006b) Multiple hormonal activities of UV filters and comparison of in vivo and in vitro estrogenic activity of ethyl-4-aminobenzoate in fish. Aquatic Toxicology, 79, 305-324. Kupper, T., C. Plagellat, R. C. Brändli, L. F. de Alencastro, D. Grandjean & J. Tarradellas (2006) Fate and removal of polycyclic musks, UV filters and biocides during wastewater treatment. Water Research, 40, 2603-2612. Lambropoulou, D. A., D. L. Giokas, V. A. Sakkas, T. A. Albanis & M. I. Karayannis (2002) Gas chromatographic determination of 2-hydroxy-4-methoxybenzophenone and octyldimethyl-p-aminobenzoic acid sunscreen agents in swimming pool and bathing waters by solid-phase microextraction. Journal of Chromatography A, 967, 243-253. Lara-Martin, P. A., A. Gomez-Parra & E. Gonzalez-Mazo (2008) Reactivity and fate of synthetic surfactants in aquatic environments. Trac-Trends in Analytical Chemistry, 27, 684-695. Liwarska-Bizukojc, E., K. Miksch, A. Malachowska-Jutsz & J. Kalka (2005) Acute toxicity and genotoxicity of five selected anionic and nonionic surfactants. Chemosphere, 58, 1249-1253. Mariani, L., D. De Pascale, O. Faraponova, A. Tornambe, A. Sarni, S. Giuliani, G. Ruggiero, F. Onorati & E. Magaletti (2006) The use of a test battery in marine ecotoxicology: The acute toxicity of sodium dodecyl sulfate. Environmental Toxicology, 21, 373-379. McAvoy, D. C., S. D. Dyer, N. J. Fendinger, W. S. Eckhoff, D. L. Lawrence & W. M. Begley (1998) Removal of alcohol ethoxylates, alkyl ethoxylate sulfates, and linear alkylbenzene sulfonates in wastewater treatment. Environmental Toxicology and Chemistry, 17, 1705-1711. McDonnell, G. & A. D. Russell (1999) Antiseptics and disinfectants: Activity, action, and resistance. Clinical Microbiology Reviews, 12, 147-+. Merta, J. & P. Stenius (1999) Interactions between cationic starch and mixed anionic surfactants. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 149, 367-377.

45

Nielsen, A. D., K. Borch & P. Westh (2000) Thermochemistry of the specific binding of C12 surfactants to bovine serum albumin. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology, 1479, 321-331. Nieto, A., F. Borrull, R. M. Marcé & E. Pocurull (2009) Determination of personal care products in sewage sludge by pressurized liquid extraction and ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1216, 5619-5625. Orvos, D. R., D. J. Versteeg, J. Inauen, M. Capdevielle, A. Rothenstein & V. Cunningham (2002) Aquatic toxicity of triclosan. Environmental Toxicology and Chemistry, 21, 1338-1349. Pavlic, Z., Z. Vidakovic-Cifrek & D. Puntaric (2005) Toxicity of surfactants to green microalgae Pseudokirchneriella subcapitata and Scenedesmus subspicatus and to marine diatoms Phaeodactylum tricornutum and Skeletonema costatum. Chemosphere, 61, 1061-1068. Pedersen, S. N., L. B. Christiansen, K. L. Pedersen, B. Korsgaard & P. Bjerregaard (1999) In vivo estrogenic activity of branched and linear alkylphenols in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). The Science of The Total Environment, 233, 89-96. Peschka, M., P. H. Roberts & T. P. Knepper (2007) Analysis, fate studies and monitoring of the antifungal agent clotrimazole in the aquatic environment. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 389, 959-968. Plagellat, C., T. Kupper, R. Furrer, L. F. de Alencastro, D. Grandjean & J. Tarradellas (2006) Concentrations and specific loads of UV filters in sewage sludge originating from a monitoring network in Switzerland. Chemosphere, 62, 915-925. Quiroga, J. M., D. Sales & A. Gomezparra (1989) Experimental evaluation of pollution potential of anionic surfactants in the marine-environment. Water Research, 23, 801807. Roberts, P. H. & K. V. Thomas (2006) The occurrence of selected pharmaceuticals in wastewater effluent and surface waters of the lower Tyne catchment. Science of The Total Environment, 356, 143-153. Russell, A. D. (2004) Whither triclosan? Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 53, 693695. Sasseville, D. (2004) Hypersensitivity to preservatives. Dermatologic Therapy, 17, 251-263. Schlumpf, M., S. Durrer, O. Faass, C. Ehnes, M. Fuetsch, C. Gaille, M. Henseler, L. Hofkamp, K. Maerkel, S. Reolon, B. Timms, J. A. F. Tresguerres & W. Lichtensteiger (2008) Developmental toxicity of UV filters and environmental exposure: a review. International Journal of Andrology, 31, 144-150. Schoknecht, U., R. Wegner, W. Horn & O. Jann (2003) Emission of biocides from treated materials - Test procedures for water and air. Environmental Science and Pollution Research, 10, 154-161. Scott, M. J. & M. N. Jones (2000) The biodegradation of surfactants in the environment. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes, 1508, 235-251. Sedlak DL, Huang CH, Pinkston K. (2004) Strategies for selecting pharmaceuticals to assess attenuation during indirect potable water reuse. In: Pharmaceuticals in the Environment: Sources, Fate, Effects and Risks (Kümmerer K, ed). Berlin:Springer, 107–120 Segura, P. A., M. Francois, C. Gagnon & S. Sauve (2009) Review of the Occurrence of Antiinfectives in Contaminated Wastewaters and Natural and Drinking Waters. Environmental Health Perspectives, 117, 675-684.

46

Sibila, M. A., M. C. Garrido, J. A. Perales & J. M. Quiroga (2008) Ecotoxicity and biodegradability of an alkyl ethoxysulphate surfactant in coastal waters. Science of The Total Environment, 394, 265-274. Sigoillot, J. C. & M. H. Nguyen (1992) Complete oxidation of linear alkylbenzene sulfonate by bacterial communities selected from coastal seawater. Applied and Environmental Microbiology, 58, 1308-1312. Singer, H., S. Muller, C. Tixier & L. Pillonel (2002) Triclosan: Occurrence and fate of a widely used biocide in the aquatic environment: Field measurements in wastewater treatment plants, surface waters, and lake sediments. Environmental Science & Technology, 36, 4998-5004. Singh, S. K., M. Bajpai & V.K. Tyagi (2006) Amine Oxides: A Review, Journal Oleo Science., 55, 99-119 Singh, R. P., N. Gupta, S. Singh, A. Singh, R. Suman & K. Annie (2002) Toxicity of ionic and nonionic surfactants to six macrobes found in Agra, India. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 69, 265-270. Smidrkal, J. (1999) Tensides and detergents today. Chemicke Listy, 93, 421-427. Smith, K., C. G. Gemmell & I. S. Hunter (2008) The association between biocide tolerance and the presence or absence of qac genes among hospital-acquired and communityacquired MRSA isolates. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 61, 78-84. Soni, M. G., I. G. Carabin & G. A. Burdock (2005) Safety assessment of esters of phydroxybenzoic acid (parabens). Food and Chemical Toxicology, 43, 985-1015. Stokes, R. P. & B. L. Diffey (1999) The water resistance of sunscreen and day-care products. British Journal of Dermatology, 140, 259-263. Sutterlin, H., R. Alexy & K. Kummerer (2008) The toxicity of the quaternary ammonium compound benzalkonium chloride alone and in mixtures with other anionic compounds to bacteria in test systems with Vibrio fischeri and Pseudomonas putida. Ecotoxicology and Environmental Safety, 71, 498-505. Ternes, T. A., A. Joss & H. Siegrist (2004) Peer Reviewed: Scrutinizing Pharmaceuticals and Personal Care Products in Wastewater Treatment. Environmental Science & Technology, 38, 392A-399A. Tixier, C., H. P. Singer, S. Canonica & S. R. Muller (2002) Phototransformation of triclosan in surface waters: A relevant elimination process for this widely used biocide Laboratory studies, field measurements, and modeling. Environmental Science & Technology, 36, 3482-3489. Triclosan information. Application and Benefits [online]. c2000-2010. Ciba.com. [cit. 201004-06]. Dostupný z WWW: http://www.ciba.com/index/ind-index/ind-per_car/ind-pcah/ind-pc-triclosan/ind-pc-triclosan-triclosan-101/ind-pc-triclosan-basicsapplications.htm UV Filter Ingredients. Safety information [online]. c2007. Cosmeticsinfo.org. [cit. 2010-0410]. Dostupný z WWW: http://cosmeticsinfo.org/ingredient_details.php?ingredient_id=1553 van der Heyden, M. A. G. & L. H. K. Defize (2003) Twenty one years of P19 cells: what an embryonal carcinoma cell line taught us about cardiomyocyte differentiation. Cardiovascular Research, 58, 292-302. Veldhoen, N., R. C. Skirrow, H. Osachoff, H. Wigmore, D. J. Clapson, M. P. Gunderson, G. Van Aggelen & C. C. Helbing (2006) The bactericidal agent triclosan modulates thyroid hormone-associated gene expression and disrupts postembryonic anuran development. Aquatic Toxicology, 80, 217-227.

47

Walsh, S. E., J. Y. Maillard, A. D. Russell, C. E. Catrenich, D. L. Charbonneau & R. G. Bartolo (2003) Development of bacterial resistance to several biocides and effects on antibiotic susceptibility. Journal of Hospital Infection, 55, 98-107. Yadav, J. S., D. L. Lawrence, B. A. Nuck, T. W. Federle & C. Adinarayana-Reddy (2001) Biotransformation of linear alkylbenzene sulfonate (LAS) by Phanerochaete chrysosporium: oxidation of alkyl side-chain. Biodegradation, 12, 443-453. Yapijakis C. & L. K. Wang (2004) Treatment of Soap and Detergent in Industry Wastes, in Handbook of Industrial and Hazardous Wastes Treatment, (Eds: L. K. Wang, Y-S. Hung, H. H. Lo, C. Yapijakis), Marcel Dekker, 323-378 Ying, G. G. (2006) Fate, behavior and effects of surfactants and their degradation products in the environment. Environment International, 32, 417-431. Zile, M. H. (1998) Vitamin A and embryonic development: An overview. Journal of Nutrition, 128, 455S-458S. --- (2001) Function of vitamin A in vertebrate embryonic development. Journal of Nutrition, 131, 705-708.

48