Vybrané kapitoly z praktické NMR spektroskopie
SPECTROSPIN 500 DRX 500 Avance
Způsob snímání dat, CW versus FT CW
Beff 2
efektivní magnetické pole zůstává konstantní
frekvence RF záření postupně se mění
[Hz]
FT offset
RF puls (frekvence, doba trvání, výkon) FT
Schéma moderního NMR spektrometru s chlazenou měřící sondou, tzv. kryosondou
Temperature 17K Temperature 4K
25 Bar
Computer
Důležité součásti NMR spektrometru
Magnet Měřící sonda Field frequency lock Systém shimovacích cívek Pulsní gradienty magnetického pole Kvadraturní detekce
Průřez supravodivým magnetem Pohled shora
Kapalný dusík (-196oC)
Měřící sonda
Měřený vzorek
Solenoid Evakuovaný plášť
He
y
x z
Nárůst velikosti magnetického pole NMR spektrometrů
Pracovní frekvence [MHz]
1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 1950
1960
1970
1980
1990
Rok uvedení na trh
2000
2010
2020
Zhasnutí magnetu „quench“
Historické NMR spektrometry První komerčně dostupný CW-NMR spektrometr s rezonanční frekvencí 30 MHz (1952), Varian Inc.
CW-NMR spektrometr s rezonanční frekvencí 40 MHz (1961), ÚPT Brno
1H
NMR spektrum ribonukleasy A při 40 MHz
1H
NMR spektrum lysozymu při 900 MHz
900 MHz magnet firmy Oxford Instruments
900 MHz 1H NMR spektrum lysozymu
900 MHz magnet firmy Bruker
900 MHz NMR spektrometr v NMR laboratoři University v Utrechtu
První 1 GHz NMR spektrometr Centre de RMN à Très Hauts Champs Lyon, France
RIKEN Research Institute Yokohama, Japan
600 MHz NMR spektrometr na VŠCHT Praha
Měřící sonda
Schéma moderního NMR spektrometru s chlazenou měřící sondou, tzv. kryosondou
Temperature 17K Temperature 4K
25 Bar
Computer
Kryosonda Chlazená plynným He na teplotu 17 K, předzesilovače na cca 40 K
Kyvety pro kapalinovou NMR spektroskopii.
Srovnání citlivosti 500 MHz sondy TBI a 600 MHz kryosondy CTCI při měření 1H
620:1
6600:1
7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 500 TBI
600 TCI (cryo)
1) 500 versus 600 MHz
2) využití kryotechnologie 3) 12 let vývoje technologie NMR spektroskopie
Sensitivity between CryoProbe (CP) TCI and Room Temperature (RT) TXI probe
Sensitivity enhancement: 1.8-fold
Field frequency lock
Stabilizace magnetického pole v čase C6H12 (bez locku)
• Vlivem driftu Bo dochází k postupné změně polohy měřeného signálu.
• Řešením je systém nazývaný „field lock“.
• Jedná se o jakýsi separátní NMR spektrometr, který pracuje nejčastěji se signálem deuteria a podle velikosti změny Bo a tedy polohy signálu 2H koriguje hlavní pole Bo.
Systém shimovacích cívek
Homogenizace magnetického pole v prostoru • Nehomogenita Bo vzniká vlivem nedokonalé konstrukce magnetu, okolních feromagnetických předmětů, nehomogenity vzorku… • Odstraňuje se malými změnami Bo pomocí tzv. korekčních cívek. Tento proces se nazývá shimování.
• Korekční cívky jsou umístěny okolo hlavní cívky v různých směrech a lze jimi definovaně modifikovat hlavní pole.
Ukázky: a) špatně naladěný („nashimovaný“) magnet
b) dobře naladěný („nashimovaný“) magnet
Homogenizace magnetického pole v prostoru • Cívky označené pouze z (jakýmkoliv řádem) jsou axiální (lze je ladit za rotace vzorku).
z
z2
• Cívky označené jakýmkoliv řádem x nebo y jsou radiální (nelze ladit za rotace vzorku).
y2x2
xz3
Homogenizace magnetického pole v prostoru • Kritéria správného nashimování magnetu jsou: - velikost signálu deuteria z rozpouštědla - šířka čáry vybraného signálu 1H (rozpouštědlo) - velikost FIDu • Moderní NMR spektrometry mají polo- nebo automatické shimování (nejčastěji na principu využití pulsních gradientů magnetického pole).
• Nejčastější problémy při shimování:
Homogenizace magnetického pole v prostoru
• Pro ladění z-tových cívek platí, že liché řády působí na čáru symetricky z obou stran, zatímco sudé řády pouze z jedné strany. • Shimování vyžaduje trpělivost!!!!
Pulsní gradienty magnetického pole
Proč se v NMR spektroskopii využívají PFG? • Výběr koherencí (eliminace dlouhých fázových cyklů) • Velmi efektivní potlačení nežádoucích signálů ve spektru (H2O) bez efektu přenosu magnetizace chemickou výměnou
Jak se v NMR spektroskopii využívají PFG? A. Výběr žádané koherence v systému • Při výběru určité koherence se nejprve jedním gradientním pulsem rozfázují všechny koherence, které jsou v daném okamžiku ve spinovém systému přítomné, a následujícím Gpulsem se zfázuje pouze koherence žádaná!!!
pi i (G.r )i i 0 i
- řád koherence - gyromagnetický poměr jádra (G.r)i - vektor G-pulsu ti - délka G-pulsu Pi gi
Požadovaná koherence se zrefokusuje pouze je-li součet efektů všech gradientních pulsů na ni působící roven nule. B. Odstranění žádané koherence ze systému • Pro odstranění vybrané koherence stačí použít pouze jeden G-puls, aplikovaný ve vhodném okamžiku přítomnosti nežádoucí koherence v systému.
Pulsní gradienty magnetického pole Bo
Gz
-Gz
• Po aplikaci pulsního gradientu magnetického pole se efektivní magnetické pole Beff, které působí na určitý spin a tím pádem i jeho resonanční frekvence a fáze f stanou funkcí polohy.
Beff = f (r) F = f (r) • Následuje-li po prvním gradientním pulsu druhý puls o stejném směru a velikosti, dojde k refokusaci jednotlivých vektorů magnetických momentů.
Příklady použití gradientních pulsů Stavební bloky A. 180 deg refokusační puls
p1 = - p2 1 = 2 (G.r)1= (G.r)2 1 = 2
180 deg
G2
G1
B. 180 deg defokusační puls 180 deg
G1
p1 = 1 = (G.r)1= 1 =
G2
- p2 2 - (G.r)2 2
Příklady použití gradientních pulsů Potlačení signálu (vody) Signál H2O je 104-105 násobně intenzivnější než odezva měřené molekuly specifikace.
WATERGATE: Založena na selektivní manipulaci signálů vody a rozpuštěné látky spolu s gradientním echem.
90 deg 1H
180 deg
G G
G 2
Příklady použití gradientních pulsů Potlačení signálu (vody) 180 deg puls
Příklady použití gradientních pulsů Selektivní excitace jednoho signálu 90
180 sel. další manipulace se spiny
G1
G2
1. spinové echo
2. spinové echo
Excitace DPFGSE sekvencí
B1/2 ~ 40 Hz
Gausovským pulsem B1/2 ~ 10 Hz
Pravoúhlým pulsem
B1/2 ~ 10 Hz
Kvadraturní detekce
Detekce NMR signálu Průběh signálu v přijímací cívce (-x):
x
y
x
x
y
y
I = C * cos (wot) I
t
y
x
x
x
y
y
Detekce NMR signálu • Signál z přijímací cívky je tzv. analogový, to znamená v určitých mezích nabývá libovolných hodnot. Pokud jej převádíme do počítače, je nutné jej převést na signál v digitální podobě. • Podívejme se proto na vztah šířky spektra a rychlosti, kterou musíme data snímat, t. j. tzv. vzorkovací rychlosti (sampling rate). nosná frekvence 0
• Nyquistova teorie říká, že je nutné vzorkovat minimálně dvojnásobkem rychlosti, která odpovídá signálu s nejvyšší frekvencí. Jinými slovy šířka spektra SW v Hz je rovna polovině rychlosti vzorkování SR.
SR = 2 * SW
Detekce NMR signálu
• Vzorkujeme-li rychlostí 1/(2*SW) dostaneme následující výsledek:
nosná frekvence 0
SW
• Budeme-li vzorkovat poloviční rychlostí, šířka spektra bude polovina původního a dojde k tzv. překlopení signálu (aliasing, folding). Dojde též k distorzi fáze signálu.
u
nosná frekvence 0 f = b+(u- a) a
b SW/2
Kvadraturní detekce •Jak ale můžeme rozlišit signály s vyšší frekvencí než 0 od signálů s frekvencí nižší? +
nosná frekvence 0
SW
• Jednou z možností je umístění nosné frekvence na jeden konec spektra tak, aby byly všechny signály měly frekvence buď větší nebo menší než 0. V tomto případě není nutné určovat znaménko. 2 (+)
1 ()
nosná frekvence 0
2 x SW
• Při takovémto uspořádání vyvstanou dva následující problémy: 1. Musíme použít mnohem větší výkon při generování RF pulsu, protože musíme excitovat dvojnásobně velkou oblast (2 x SW). S tím je spojen problém potřeby většího množství bodů paměti pro zachování stejného digitálního rozlišení.
Kvadraturní detekce 2. Dochází k překládání šumu z prázdné části excitované oblasti. Důsledkem toho je nutnost použití většího počtu průchodů, abychom dosáhli stejné kvality spektra, tj. stejného poměru signál/šum. +
nosná frekvence 0
SW
= w/ 2
x
y
0 = 0 v RSS
- = -w/ 2
• Alternativou je umístit nosnou frekvenci přesně doprostřed spektra a použít tzv. kvadraturní detekci pro rozlišení kladného a záporného znaménka.
Kvadraturní detekce • Základem jsou dva příjímače, jejichž fáze je posunutá o 90o. Ve skutečnosti je použita pouze jedna přijímací cívka a její signál je rozdělen na dvě části. PH = 0 F
S
F
PH = 90
S wo
PH = 0 F
S
F
S
PH = 90
• Zatímco odezva přijímače s fází 0 je pro oba signály shodná (cos), přijímač s fází 90o detekuje signál s opačnou polaritou (sin a –sin).
Kvadraturní detekce Průběh signálu ve dvou přijímačích navzájem posunutých o 90o
x
y
x
x
y
y
I = C * cos (wt) I = C * sin (wt) I
t
y
x
x
x
y
y
Kvadraturní detekce • Po Fourierově transformaci dostaneme:
F
PH = 0
S
FT
F
PH = 90
S
FT
• Sečteme-li signály z obou přijímačů, můžeme jednoduše rozlišit signály s opačnou fází. F
S
