Vliv nanočástic na živé organismy

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

Vliv nanočástic na živé organismy Bakalářská práce

Libor Vysloužil

Vedoucí bak. práce: doc. Mgr. Vít Kudrle, Ph.D.

Brno 2011

Bibliografický záznam Autor:

Libor Vysloužil Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita

Název práce:

Vliv nanočástic na živé organismy

Studijní program:

Fyzika

Studijní obor:

Biofyzika

Vedoucí práce:

doc. Mgr. Vít Kudrle, Ph.D.

Rok obhajoby:

2011

Klíčová slova:

magnetické nanočástice, plazmová příprava, PECVD, toxicita, buněčná kultura BY-2

Bibliographic entry Author:

Libor Vysloužil Faculty of Science, Masaryk University

Title of thesis:

Influence of nanoparticles on living organisms

Degree programme:

Physics

Field of study:

Biophysics

Supervisor:

doc. Mgr. Vít Kudrle, Ph.D.

Year of defence:

2011

Keywords:

magnetic nanoparticles, plasma synthesis, PECVD, toxicity, cell culture BY-2

Poděkování Na tomto místě bych chtěl poděkovat svému vedoucímu doc. Mgr. Vítu Kudrlemu, Ph.D. za odborné vedení a cenné rady, ale také Mgr. Ondřeji Jaškovi, Ph.D. a Bc. Peterovi Zelinovi za pomoc při přípravě nanočástic. Tato práce by nevznikla ani bez pomoci doc. Ing. Reného Kizka, PhD. který mi umožnil provádět biologické testy v laboratořích Mendelovy univerzity Velký dík patří i Mgr. Olze Kryštofové za odbornou pomoc v laboratoři, při analýze, ale také za cenné rady při psaní této závěrečné práce.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem svou bakalářskou práci napsal samostatně a výhradně s použitím citovaných pramenů. Brno 20. května 2011 Libor Vysloužil

Abstrakt Oblast nanotechnologií je v současné době jedním z nejrychleji se rozvíjejících oborů moderní vědy. Významnou roli zde hrají magnetické nanočástice (MNPs) tvořené oxidy železa. Díky svým unikátním vlastnostem nabízejí MNPs široké potenciální využití v biomedicínským aplikacích.Předložená bakalářská práce se zabývá vlivem MNPs na suspenzní tabákovou kulturu BY-2. Nanočástice byly připraveny metodou plazmochemické depozice z plynné fáze (PECVD). Tyto částice byly syntetizovány za sníženého tlaku, v argon-kyslíkové atmosféře a výboj byl udržován pomocí mikrovlnného generátoru o frekvenci 2,45 GHz. Jako prekurzor byl použit pentakarbonyl železa Fe(CO)5. Pro biologické testy jsme se rozhodli použít vzorek složený z nanočástic maghemitu (γ-Fe2O3). Zkoumali jsme i vliv funkcionalizace pomocí plazmatu za přítomnosti amonných a vodních par. Takto připravené nanočástice byly v různých koncentracích přidány do kultivačního média obsahujícího buněčnou kulturu BY-2. Po 7 dnech byla kultura odebrána a analyzována. Byl stanoven přírůstek biomasy, obsah celkových bílkovin, obsah thiolových sloučenin, aktivita glutathion S - trasferáz (GST) a antioxidační aktivita. Na základě získaných výsledků můžeme říci, že námi připravené nanočástice vykazovaly pro buněčnou kulturu BY-2 jen mírnou toxicitu.

Abstract Nowadays, nanotechnology is one of the fastest and highly developed fields of modern science. Magnetic nanoparticles (MNPs) composed of iron oxides have a very important position in this area. Due to their unique properties the MNPs offer a wide potential use in biomedical applications. Presented thesis deals with the influence of the MNPs on the suspension culture of tobacco cells BY-2. Nanoparticles were prepared by plasma - enhanced chemical vapor deposition (PECVD) method. They were synthesized under low pressure, in argon - oxygen atmosphere and discharge was sustained by a microwave generator at a frequency of 2.45 GHz. Iron pentacarbonyl Fe(CO)5 was used as a precursor. For biological tests we decided to use a sample composed of maghemite nanoparticles (γ-Fe2O3). Besides using them raw, we tested their functionalization by plasma in the presence of ammonia and water vapor. Nanoparticles prepared in this way were added in different concentrations to cultivation medium containing cell culture BY-2. Culture was removed and analyzed after 7 days. We determined biomass increase, the content of total protein, content of thiol compounds, the activity of glutathione S-transferase (GST) and antioxidant activity. Based on the test results we conclude that our nanoparticles showed only mild toxicity on the cell culture BY-2.

Obsah 1. 2. 3. 4.

5.

6.

7. 8.

Seznam použitých zkratek...........................................................................................................1 Úvod...............................................................................................................................................2 Cíle bakalářské práce...................................................................................................................3 Teoretická část...............................................................................................................................4 4.1. Nanotechnologie.....................................................................................................................4 4.1.1. Nanočástice.....................................................................................................................5 4.2. Magnetické nanočástice (MNPs) železa a jeho oxidů............................................................5 4.2.1. Aplikace MNPs...............................................................................................................7 4.2.2. Příprava MNPs železa a jeho oxidů................................................................................8 4.2.2.i. Chemická koprecipitace solí železa ........................................................................9 4.2.2.ii. Syntéza MNPs v reverzních micelách ....................................................................9 4.2.2.iii. Tepelný rozklad .....................................................................................................9 4.2.2.iv. Laserová pyrolýza................................................................................................10 4.3. Plazmochemická depozice z plynné fáze - PECVD.............................................................11 4.3.1. Plazma...........................................................................................................................11 4.3.2. Princip metody PECVD................................................................................................13 4.4. Rostlinný materiál.................................................................................................................16 4.4.1. Buňka............................................................................................................................16 4.4.2. Buněčná kultura............................................................................................................17 4.5. Vliv nanočástic na živé organismy.......................................................................................19 4.6. Toxikologické markery........................................................................................................20 4.6.1. Přírůstek biomasy a životnost.......................................................................................20 4.6.2. Obsah celkových bílkovin.............................................................................................20 4.6.3. Obsah thiolových sloučenin..........................................................................................21 4.6.4. Aktivita glutathion S - transferáz .................................................................................21 4.6.5. Antioxidační aktivita.....................................................................................................22 4.6.5.i. Metoda využívající DPPH......................................................................................22 4.6.5.ii. Metoda využívající ABTS ....................................................................................22 4.6.5.iii. Metoda využívající DMPD .................................................................................22 4.6.5.iv. Metoda využívající Blue CrO5 ............................................................................22 Experimentální uspořádání a metody......................................................................................24 5.1. Syntéza MNPs.......................................................................................................................24 5.2. Funkcionalizace nanočástic..................................................................................................25 5.3. Biologický materiál...............................................................................................................26 5.4. Odběr vzorků........................................................................................................................26 5.5. Příprava vzorku pro analýzy.................................................................................................26 5.6. Přístrojové vybavení pro spektrofotometrické analýzy........................................................27 Výsledky a diskuze......................................................................................................................28 6.1. Příprava a analýza nanočástic...............................................................................................28 6.2. Vliv magnetických nanočástic oxidů železa (MNPs) na tabákovou kulturu BY-2...............31 6.2.1. Vliv čistých (nefukcionalizovaných) MNPs na tabákovou kulturu BY-2 ....................32 6.2.2. Vliv MNPs funkcionalizovaných amoniakem na tabákovou kulturu BY-2..................35 6.2.3. Vliv MNPs fukcionalizovaných vodní parou na tabákovou kulturu BY-2...................38 Závěr ...........................................................................................................................................41 Seznam použité literatury..........................................................................................................43

1. Seznam použitých zkratek ABTS: 2,2-azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonát) BY-2: suspenzní kultura tabáku Nicotiana tabacum odrůda Bright Yellow – 2 DMPD: N,N-dimethyl-1,4-diaminobenzen DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl Fe3O4 : oxid železnato-železitý, magnetit GAE: gallic acid equivalent, ekvivalent kyseliny gallové (3,4,5-hydroxybenzoové) používaný pro kalibraci při měření antioxidační aktivity GST: glutathion S - transferázy, skupina enzymů katalyzujících reakce glutathionu MNPs (Magnetic NanoParicles): magnetické nanočástice (v našem případě tvořené oxidy železa) PECVD (Plasma-Enhanced Chemical Vapor Deposition): Plazmochemická depozice z plynné fáze RF plazma: radio-frekvenční plazma, tj. plazma buzené elektromagnetickým zářením o frekvenci 10 kHz až 30 MHz sccm:standard cubic centimeter per minute (standardní kubický centimetr za minutu), jednotka průtoku γ-Fe2O3: gama oxid železitý, maghemit

1

2. Úvod Ještě v polovině minulého století nebylo zřejmé, že bychom někdy byli schopni manipulovat s hmotou na atomární či molekulární úrovni. Koncem padesátých let 20. století se však již našli jednotlivci, kteří předpověděli možnost konstrukce zařízení o molekulárních rozměrech, tak, jak to od pradávna dělá příroda. V 80. letech bylo postupně rozvinuto zkoumání možnosti syntézy a vlastností částic, krystalů, povrchů atd. o rozměrech řádově v nanometrech. Velkým mezníkem byly vynálezy rastrovacího tunelového mikroskopu a mikroskopie atomárních sil, díky kterým bylo vědcům umožněno nejen pozorovat, ale dokonce i manipulovat s jednotlivými atomy a molekulami. Tyto průlomové objevy našly zanedlouho uplatnění v průmyslu a brzy bylo možné obrábět povrchy s nanometrickou přesností a vyrábět elektronické čipy o rozměrech blížících se 100 nm. Možnosti využití rozličných struktur s velikostí v řádech nanometrů byly zanedlouho rozpoznány i biology, a tím započal výzkum jejich aplikací v medicíně, farmacii a biotechnologiích. Zrodil se nový interdisciplinární obor - nanotechnologie [1]. V posledních letech dochází v oblasti nanotechnologií k obrovskému pokroku. Kvantové tečky a uhlíkové nanonotrubky se používají pro výrobu miniaturních a přitom extrémně výkonných čipů, stříbrné nanočástice nalezly uplatnění v textilním průmyslu a jako kontrastní materiál při vyšetření pomocí magnetické rezonance jsou využívány magnetické nanonočástice oxidů železa. Odvrácenou stranou mohutného rozvoje nanotechnologií je do jisté míry fakt, že v současnosti existuje jen málo odborných výrazů, které by se tak často používaly (a zneužívaly) v oblasti reklamy a marketingu, jako jsou pojmy nanotechnologie nebo nanomateriály. Velmi často se tak stává, že výrobci těmito pojmy označují své produkty a ona kouzelná předpona „nano“ jim přisuzuje vlastnosti, kterými tyto výrobky ve skutečnosti vůbec nedisponují. Ruku v ruce s novými rozmanitými aplikacemi nanostruktur se objevují otázky o jejich možném negativním vlivu na živé organismy. Proto je v současné době pozornost mnoha vědeckých týmů zaměřena na výzkum v oblasti potenciální toxicity nanomateriálů. Vzhledem k ekonomické náročnosti a etickým otázkám je však takřka nemožné zkoumat účinky nanostruktur na lidech. Proto jsou ve většině dosud publikovaných prací využívány buněčné kultury. Toxikologické testy prováděné na buněčných kulturách jsou kromě své jednoduchosti a ekonomické nenáročnosti výhodné i v tom, že se jedná o jednotný, dobře definovaný biologický materiál a může nám poskytnout prvotní představu o tom jaký vliv mohou mít toxické látky na živý organismus.

2

3. Cíle bakalářské práce Předložená práce si klade za hlavní cíl zodpovědět otázku, zda jsou magnetické nanočástice připravované metodou PECVD vhodné pro budoucí široké využití v biomedicínských aplikacích. Za tímto účelem byl studován vliv takto připravených nanočástic na suspenzní tabákovou kulturu BY-2. Byly sledovány tyto konkrétní cíle: •

příprava magnetických nanočástic oxidů železa (MNPs) pomocí metody PECVD

•

stanovení vlivu MNPs na růstové charakteristiky buněčné kultury BY-2

•

studium dalších vybraných biomarkerů toxicity u buněčné kultury tabáku BY-2 vystavené působení MNPs o různých koncentracích

•

povrchová úprava (funkcionalizace) MNPs pomocí amoniaku a vodních par a opětovné provedení výše zmíněných toxikologických testů

3

4. Teoretická část 4.1. Nanotechnologie Oblast nanotechnologií je v současné době jedním z nejrychleji se rozvíjejících oborů moderní vědy. Za duchovního otce nanotechnologií (i když tento pojem ještě nepoužil) je považován Richard P. Feynman. Ve své světoznámé přednášce s názvem There's Plenty of Room at the Bottom [3], poprvé uvedené roku 1959 na půdě Kalifornského technologického institutu (Calltech), vyzval tehdejší vědeckou komunitu k pokroku v oblasti manipulace s objekty na atomární úrovni. Samotný pojem nanotechnologie1 ve smyslu manipulace s materiálem po jednotlivých atomech nebo molekulách, zavedl až o 15 let později N. Taniguchi [4]. Nanotechnologie je ve své podstatě nauka zabývající se strukturami, jejichž alespoň jeden rozměr je v řádu nanometrů. Nanomateriály můžeme podle počtu nanometrických rozměrů dělit na: •

0-dimenzionální (všechny tři dimenze jsou v nanometrickém rozsahu): nanočástice

•

1-dimenzionální (dvě dimenze jsou v nanometrickém rozsahu): nanodráty, nanotrubky, nanovlákna

•

2-dimenzionální (jedna dimenze je v nanometrickém rozsahu): nanovrstvy Dá se říci, že nanomateriály tvoří přechodový stupeň mezi makroskopickými strukturami

jako jsou např. buňky (velikost cca 1 μm) a atomy nebo molekulami s rozměry okolo 0,1 nm (1Å). Výjimečnost nanomateriálů spočívá ve velkém poměru atomů na povrchu ku atomům uvnitř materiálu (jinými slovy poměr povrch/objem). Díky tomu nanomateriály disponují velkým aktivním povrchem a s tím související reaktivitou. Další zajímavou vlastností těchto struktur je, že pro ně již neplatí zákony klasické fyziky, protože při rozměrech pod 100 nm se začínají ve větší míře projevovat kvantové efekty.

4.1.1. Nanočástice Jedná se o materiál, který má všechny tři rozměry v nanometrickém rozsahu. Běžně připravované nanočástice částicemi dosahují rozměrů 1-100 nm. V současné době existuje velké 1. Nano (symbol n) je předpona soustavy SI a znamená násobek 10-9 základní jednotky. Tato předpona pochází z řeckého slova nanos, což znamená trpaslík [2].

4

množství různých typů nanočástic ať už z hlediska struktury nebo chemického složení. Na základě struktury jsou významné tyto typy nanočástic: •

nanoklastr: soubor atomů či molekul vázaný slabými interakcemi

•

nanokrystal: krystalická nanočástice (atomy vázány kovalentími vazbami)

•

kvantová tečka: polovodičová nanočástice (využívaná v elektronice)

Z hlediska složení a využití nanočástic jsou typickými zástupci: •

fullereny: transport látek

•

uhlíkové nanotrubky: pevné a pružné kompozitní materiály

•

stříbrné nanočástice: antibakteriální účinky, SERS (povrchem zesílená ramanova spektroskopie)

•

oxid titaničitý: bílé potravinářské barvivo E171

•

koloidní zlato: léčba rakoviny

•

magnetické nanočástice (MNPs)

Ilustrace 1: Nanočástice uhlíkového fullerenu C60 [5] a jednovrstevná uhlíková nanotrubka [6]

4.2. Magnetické nanočástice (MNPs) železa a jeho oxidů Z hlediska potenciálního využití v rozličných praktických aplikacích jsou významným typem nanomateriálů magnetické nanočástice. Jedná se o krystalické nanočástice, které se od ostatních

liší

zejména

svou

vlastností

označovanou

jako

superparamagnetismus.

Superparamagnetické látky se vyznačují tím, že v nepřítomnosti magnetického pole je střední

5

hodnota jejich magnetizace nulová, avšak po vložení do tohoto pole se tyto látky chovají jako paramagnetické. Navíc jejich sukceptibilita (koeficient úměrnosti mezi magnetizací a intenzitou magnetického pole) je větší než v případě látek paramagnetických. Díky svým magnetickým vlastnostem MNPs interagují s magnetickým polem. Toho se využívá například při některých chemických metodách přípravy, kdy se vzniklé nanočástice oddělují z reakční směsi pomocí magnetu, nebo v biomedicínských aplikacích, kdy lze pomocí vnějšího magnetického pole manipulovat s MNPs umístěnými v pacientově organismu. Z hlediska chemického složení jsou nejčastěji připravované MNPs tvořeny železem popřípadě oxidy železa. Železo se v pevném skupenství vyskytuje ve 3 krystalových modifikacích α, γ a δ [7]. Jejich rozložení můžeme vidět na fázovém diagramu (ilustrace 2).

Ilustrace 2: Fázový diagram železa [8] Díky svým redukčním schopnostem může železo tvořit velmi stabilní oxidy. Nejběžněji se vyskytujícími jsou [9] : •

oxid železnatý (FeO), známý jako wustit

•

oxid železnato-železitý (Fe3O4), triviálním názvem magnetit

•

oxid železitý ( Fe2O3) vyskytující se v několika různých krystalových modifikacích: γ-Fe2O3 - maghemit α-Fe2O3 - hematit

Běžně připravované MNPs skládají z α - železa, magnetitu, maghemitu, hematitu a wustitu.

6

4.2.1. Aplikace MNPs Porovnáme-li velikost nanočástic (1 - 100 nm) vzhledem k velikosti běžných buněk (10 100 µm), můžeme říci, že nanočástice jsou přibližně 1000 krát menší než buňky. Z tohoto důvodu mohou nanočástice interagovat s organismy na buněčné úrovni. Pokud ještě vezmeme v úvahu, že MNPs jsme schopni usměrňovat magnetickým polem podobně, jako když přesunujeme po stole nějaký železný předmět magnetkou umístěnou pod stolem, jsou potenciální aplikace těchto nanočástic nasnadě. Jedním z problémů pro potenciální biomedicínské aplikace MNPs jsou jejich hydrofobní vlastnosti, díky nimž nejsou tyto nanočástice dostatečně stabilní ve vodných roztocích. Pokud si uvědomíme, že živé organismy jsou tvořeny z více než poloviny vodou, je jednou z nutných podmínek pro využití MNPs v biomedicině zvýšení jejich hydrofilních vlastností (smáčivosti) [10]. Jednou z možností zvýšení smáčivosti MNPs je úprava jejich povrchu navázáním surfaktantu. Mezi nejčastěji používané surfaktanty patří polymerní látky (např. SiO2). Na takto upravený povrch nanočástice je poté možno navázat specifický ligand, vázající se k dané biomolekule, popř. léčivu.

Ilustrace 3: Schématické znázornění funkcionalizované nanočástice dle [10] Ve fázi klinického testování je již použití magnetických nanočástic na bázi oxidů železa jako kontrastního materiálu ke zvýšení citlivosti MRI (magnetické rezonance). Zobrazování pomocí magnetické rezonance je velmi výhodné pro zobrazování měkkých tkání. Hojně se využívá např. při diagnostikách nádorů vnitřních orgánů nebo kardiovaskulárních onemocněních[11]. Stále častěji jsou MNPs využívány v magnetických separačních procesech, kde se využívají specifické ligandy vázající se na konkrétní sloučeniny, nebo buňky, které jsou následně z roztoku odděleny pomocí magnetického pole. Další možností využití je také cílenému zavádění léků. Zde se využívá právě unikátních magnetických vlastností, díky kterým by bylo možné pomocí vnějšího magnetického pole přesně nasměrovat MNPs do konkrétního místa v pacientově organismu. 7

Jako výhodné se jeví využití MNPs při léčbě rakoviny tzv. hypertermií2. Terapie hypertermií je založena vystavení tkáně vysokým teplotám. Výzkum ukázal, že vysoké teploty mohou poškodit a zabít rakovinné buňky, přičemž ostatní tkáň je poškozena minimálně [12]. Jednou z možností, jak dosáhnout lokální hypetermie je nahromadění MNPs v místě zasaženém rakovinou a následné umístění pacienta do proměnného magnetického pole s vysokou frekvencí [13]. Díky tomu dojde v rozkmitání přítomných nanočástic, čímž se v místě nádoru výrazně zvýší teplota. Tato metoda je již ve fázi klinického testování na lidech, ale je téměř vždy kombinována s jinou, konvenční formou léčby, jako je ozařování nebo chemoterapie. Díky využití hypertermie je však nádorová tkáň daleko citlivější, a proto nejsou nutné tak vysoké dávky ozáření popř. cytostatik aplikovaných při chemoterapii. Magnetické nanočástice tvořené železem s oxidační číslem 0 (Fe 0) se díky svým mimořádným redukčním schopnostem a velkému povrchu s úspěchem používají k čištění odpadních vod. Jsou schopny redukovat celou řadou toxických chlorovaných uhlovodíků za vzniku neškodných chloridů železa [14] a dokáží také redukovat rozpustné sloučeniny těžkých kovů, jako je uran, olovo, arzén nebo chrom, které se poté stávají nerozpustnými a lze je z daného prostředí odstranit [15].

4.2.2. Příprava MNPs železa a jeho oxidů Důležitou podmínkou pro široké praktické využití MNPs je existence jednoduchého a ekonomicky nenáročného výrobního procesu. Z pohledu průmyslové výroby MNPs by měl tento proces splňovat několik požadavků. Kromě již zmíněné ekonomičnosti by měl produkovat minimum odpadních látek a probíhat pokud možno v kontinuálním režimu. V současné době existuje celá řada metod přípravy železných nanočástic. Mezi nejpoužívanější procesy pro přípravu magnetických nanočástic patří chemická koprecipitace solí železa [16], syntéza MNPs v reverzních micelách [17], tepelný rozklad organických prekurzorů obsahujících železo [18], laserová pyrolýza plynné směsi [19] a v neposlední řadě námi využívaná metoda plazmochemické depozice nanočástic z plynné fáze (PECVD) [20].

4.2.2.i.

Chemická koprecipitace solí železa

Metoda je založena společném vylučování málo rozpustných látek z roztoku spolusrážením s mnohonásobně vyšším množstvím jiné, velmi dobře rozpustné, látky (tzv. nosičem). Roztok železnatých a železitých solí v molárním poměru 1:2 je srážen alkalickým roztokem za vzniku 2. Zahřátí organismu nebo jeho části na teplotu 38.4–39.9 °C.

8

magnetických oxidů železa, zejména Fe3O4 (magnetit) a γ-Fe2O3 (maghemit) [16]. Koprecipitační reakci popisuje následující rovnice: Fe + 2 + 2Fe + 3 + 8OH − → Fe3O 4 + 4H 2 O Pro řízení velikosti i tvaru vznikajících částic může být nastavena celá řada parametrů procesu, mezi které patří pH, iontová síla nebo koncentrační poměr Fe2+/Fe3+[21]. Nevýhodou metody je však to, že nejsme schopni připravit MNPs s přesně definovanými rozměry. Přidáním určitých látek např. polyvinlyalkoholu můžeme sice zúžit velikostní rozsah vznikajících látek, ale pro přípravu nanočástic o konkrétních rozměrech je vhodnější použít jinou metodu.

4.2.2.ii.

Syntéza MNPs v reverzních micelách

V případě této metody se používají micelární struktury tvořené surfaktantem (zejména cyklodextriny nebo fosfolipidové membrány) v prostředí nepolárního rozpouštědla [17]. Micely se chovají jako nanoreaktory s velikostí 1-10 nm, uvnitř kterých se nachází roztok soli železa (používá se např. FeCl2), který reaguje za vzniku MNPs (např. tvořených γ-Fe2O3)[22].Velikost částic může být řízena koncentrací surfaktantu a teplotou. V poslední době jsou metody s využitím micel používány k získání nanočástic oxidů železa s malými rozdíly ve velikosti a fyzikálních vlastnostech.

Ilustrace 4: Průběh syntézy MNPs uvnitř micelárního nanoreaktoru [23]

4.2.2.iii. Tepelný rozklad Další možností může být příprava MNPs tepelným rozkladem [18] různých prekurzorů obsahujících železo, např. rozklad železitého komplexu kyseliny olejové. Různou volbou organických rozpouštědel můžeme měnit bod varu systému a tím i složení získaných MNPs. Na základě RTG difrakční analýzy bylo zjištěno, že rozpouštědla s nižším bodem varu poskytují menší MNPs složené hlavně z maghemitu a naopak použitím rozpouštědla s výšším bodem varu získáme větší MNPs tvořené převážně wustitem (oxid železnatý – FeO). Tepelným rozkladem můžeme získat částice o průměrné velikosti 4-21 nm.

9

4.2.2.iv. Laserová pyrolýza Výše uvedené metody vycházejí z osvědčených postupů a chemických technologií. Vzhledem k tomu, že požadované množství nanoprášku je poměrně malé, používají se i jiné, specializované metody. Jednou ze specializovaných metod přípravy MNPs je laserová pyrolýza plynné směsi. Spočívá v laserem aktivované tepelné syntéze nanočástic z organických prekurzorů obsahujících železo [19].

Ilustrace 5: Aparatura pro syntézu MNPs pomocí laserové pyrolýzy [24] Nejvíce používaným prekurzorem je pentakarbonyl železa – Fe(CO) 5. Využívá se účinků laserového paprsku, pomocí kterého je daný prekurzor rozložen a uvolněné atomy železa se shlukují v nanočástice zachytávané na filtru. Jako pracovní plyny tvořící atmosféru reakční zóny jsou používány např. argon, ethen a vzduch. Vzduch je používán jako oxidační činidlo. Při vlastní syntéze vznikají nanočástice tvořené α – železem. Tyto částice jsou však kvůli svému velkému povrchu na vzduchu nestálé a ihned by oxidovaly. Navíc celá reakce probíhá za současného uvolnění velkého množství tepla, a proto se v těchto syntézách používá vzduch nebo kyslík jako oxidační činidlo, které oxiduje α – železo na oxidy přímo v reakční trubici.

4.3. Plazmochemická depozice z plynné fáze PECVD Technika plazmochemické depozice patří mezi zajímavé specializované metody přípravy MNPs. I přesto, že oproti zavedeným metodám nabízí určité výhody, mezi které patří například čistota připravených nanočástic, nebyla doposud pro průmyslovou výrobu MNPs využita. Její 10

princip a uspořádání je podobné jako u laserové pyrolýzy. Avšak jako aktivátor rozkladné reakce prekurzoru je místo laserového svazku použit plazmový výboj. Pro pochopení principu této metody je vhodné říci si něco o plazmových výbojích.

4.3.1. Plazma Plazma bývá někdy označováno jako čtvrté skupenství hmoty. Je to proto, že tvoří jistý logicky navazující článek posloupnosti pevná látka – kapalina – plyn. Pevná látka se vyznačuje pevným, vetšinou i pravidelným uspořádáním částic. Částice v pevných látkách jsou vázány stabilními chemickými vazbami. Budeme-li tedy dodávat pevné látce energii, zvýší se kinetická energie částic a látka přejde do skupenství kapalného, ve kterém jsou částice k sobě vázány pouze slabými interakcemi (např. vodíkové nebo Van der Wallsovské vazby). Budeme-li poté dále zvyšovat kinetickou energii částic zrušíme i slabé vazby a částice se budou v prostoru pohybovat nezávisle na sobě. Tím získáme látku v plynném skupenství [25]. Přechod látky k plazmatu je velice specifický. Při dodání určité hraniční energie, ozn. jako ionizační, uvolní atomy elektrony ze svých elektronových obalů, a tím vznikají volné nosiče elektrického náboje – kladné ionty a záporné elektrony. Plazma můžeme tedy definovat jako kvazineutrální soubor částic s volnými nosiči nábojů, který vykazuje kolektivní chování [26]. Právě díky obsahu volných nosičů náboje je plazma elektricky vodivé a dokáže interagovat i s a magnetickým polem. Tyto výjimečné vlastnosti ji předurčují pro široké spektrum aplikací. I přesto, že v přírodě se s plazmatem setkáme poměrně zřídka (blesky, polární záře), tvoří až 99 % pozorované hmoty vesmíru. Je to způsobeno zejména tím, že většina hvězd je tvořena právě plazmatem [27].

11

Ilustrace 6: Sloupec plazmatu během procesu syntézy nanočástic. Kromě fialové zóny, kde převládá argon, pozorujeme i zónu vlastní syntézy, kde jsou již výrazné emise fragmentů pentakarbonylu. Jednou z nejdůležitějších charakteristik plazmatu je stupeň ionizace, který udává poměr ionizovaných molekul ku všem molekulám tvořícím plazmový výboj. Můžeme říci, že stupeň ionizace v podstatě určuje i koncentraci volných elektronů ve výboji a u běžných plazmových výbojů se pohybuje v rozmezí od 10-8 do 1. Podle stupně ionizace můžeme plazmové výboje rozdělit na slabě (do ½) a silně (nad ½) ionizované plazma . •

Slabě ionizované plazma – koncentrace neutrálních molekul převládá nad koncentrací nabitých částic.

•

Silně ionizované plazma - koncentrace nabitých částic převládá nad koncentrací neutrálních molekul.

Dalším významným kritériem pro dělení plazmových výbojů je teplota výboje. Podle teploty můžeme tedy plazma rozdělit na: •

vysokoteplotní (T > 106 K) plazma

•

nízkoteplotní (T < 106 K) plazma, které dále můžeme dělit na horké (T > 103 K) a studené (T < 103 K) plazma.

K tomu, abychom mohli v praxi udržet stabilní plazmový výboj, musíme mít k dispozici budící zdroj. Tento zdroj musí dodávat energii kontinuálně nebo pulsně. V případě pulzního zdroje však musí být perioda energetických pulzů kratší něž je čas potřebný k rekombinaci iontů a elektronů v plazmě. Jedním z jednoduchých a účinných budících zdrojů může být elektromagnetické pole. Podle parametrů můžeme budící elektromagnetické pole rozdělit na: 12

stejnosměrné, pulzní a střídavé. Střídavá pole můžeme dále dělit podle frekvence na nízkofrekvenční, rádiová a mikrovlnná. Nejčastěji využívanými druhy plazmatu, z hlediska frekvence elektromagnetického budícího zdroje jsou radiofrekvenční a mikrovlnné plazma.[28] Aparatury využívající radiofrekvenčně buzeného (RF) plazmatu jsou hojně používané v laboratorních i průmyslových aplikacích, zejména pro svou jednoduchou konstrukci a snadný fyzikální popis kinetiky procesů. Běžně používané RF výboje pracují při tlacích 1-1000 Pa a využívají RF generátor. Nejvíce používané jsou frekvence 13,56 MHz a 27,12 MHz, které patří mezi tzv. dohodnuté frekvence. K nejčastějším aplikacím RF plazma patří povrchové úpravy předmětů, mezi které patří leptání povrchů, odstraňování nečistot (rekonstrukce zoxidovaných povrchů v archeologii), příprava tenkých povrchových vrstev nebo redukce pomocí vodíkového plazmatu [29]. Mikrovlnné plazma je buzeno s frekvencemi vyššími, než v případě RF výboje. V praxi se nejčastěji využívá dohodnutá frekvence 2,45 GHz. Tento druh plazmatu má ve srovnání se stejnosměrným, popřípadě vysokofrekvenčním výbojem daleko vyšší teplotu elektronů. Díky tomu je mikrovlnné plazma velmi reaktivní. Na rozdíl od RF plazmatu bývají mikrovlnné výboje provozovány v širším rozmezí tlaků (od 0.1 Pa až do 10 4 Pa) . Mikrovlnné plazma je hojně využívané pro iniciaci chemických reakcí, které by jinak musely probíhat za mnohem vyšších teplot. Z dalších aplikací můžeme zmínit povrchové leptání syntetických polymerních materiálů, nanášení tenkých vrstev, ale i úpravu povrchových vlastností kovů a jejich slitin [29]. Díky tomu, že elektrony jsou řádově 10 000 krát lehčí než okolní atomy, mají plazmové výboje výjimečné vlastnosti, a proto jsou hojně využívány v chemických procesech. Na základě poměru hmotností jsou výměny energie elastickými srážkami mezi elektrony a okolními atomy a molekulami zanedbatelné. Díky tomu jsme schopni udržet elektrony s velmi vysokou teplotou a tomu odpovídající energií (řádově až desítky eV), zatímco výboj jako celek má teplotu mnohonásobně nižší. Toho se využívá právě pro iniciaci chemických reakcí, při kterých bychom normálně museli dosáhnout daleko vyšších teplot, čímž by mohlo dojít například ke znehodnocení vzorku, popřípadě poškození reakční aparatury [30].

4.3.2. Princip metody PECVD PECVD (plasma ennhanced chemical vapour deposition) je jednou z nejpoužívanějších metod plazmové syntézy MNPs zejména díky své relativní nenáročnosti a širokému rozsahu provozních podmínek [20]. Základním principem této metody je vnášení par prekurzoru do plazmového výboje a disociace jeho vazeb volnými elektrony. Z provozních důvodů není možné 13

pro syntézu MNPs použít přímo páry kovového železa. Jako výhodné se ukázalo použití organických sloučenin železa, které mají mnohonásobně nižší bod varu než kovové železo. Nejčastěji využívanými prekurzory pro přípravu nanočástic železa a jeho oxidů jsou kovové komplexní

sloučeniny

pentakarbonyl

železa - Fe(CO)5

a

v

některých

případech

i

ferrocen - Fe(C5H5)2. Pentakarbonyl železa se za normálních podmínek vyskytuje jako slámově zbarvená kapalina štiplavého zápachu. Vzhledem k symetrické struktuře a neutralitě náboje je Fe(CO) 5 těkavý, nerozpustný ve vodě, ale naopak rozpustný ve většině organických rozpouštědlech. Mírnou nevýhodou při práci s touto sloučeninou je to, že se musí uchovávat v temnu, protože ve styku s viditelným světlem se samovolně rozkládá. Připravuje se reakcí jemného železného prášku s oxidem uhelnatým (CO) [31].

Ilustrace 7: Pentakarbonyl železa

V plazmatu dochází k disociaci vazeb Fe-C elektronovým nárazem a odštěpují se jednotlivé atomy železa, které se shlukují a vytvářejí nanočástice. Zbývající část prekurzoru – CO (oxid uhelnatý) odchází odtahem ven z aparatury. Touto metodou lze syntetizovat částice složené z α-Fe nebo magnetitu (Fe3O4) a maghemitu (γ-Fe2O3) o různé velikosti volbou operačních podmínek jako jsou tlak, výkon jdoucí do výboje a průtok reakčních plynů. V porovnání PECVD s „mokrými“ chemickými metodami, jako je např. koprecipitace, není pro plazmovou syntézu nanočástic potřeba žádných dalších chemických sloučenin a MNPs vznikají v suché podobě ve formě nanoprášku. Pro potenciální biomedicínské aplikace je zajisté přínosem, že vzniklé MNPs nejsou znečištěny žádnými jinými chemickými látkami. Další výhodou této metody je i to, že je možno zkonstruovat aparaturu pracující v kontinuálním režimu, což se jeví jako velmi zajímavé pro průmyslové aplikace. Podobně jako PECVD by mohla fungovat i příprava MNPs pomocí tepelného rozkladu. Avšak díky některým výhodným vlastnostem plazmatu syntéza 14

probíhá za daleko nižších teplot. Co se týče provozních nákladů na výrobu nanočástic, jedinými spotřebovávanými látkami jsou pentakarbonyl železa, argon, kyslík a elektrická energie. Mezi hlavní negativa této metody patří poměrně složité uspořádání syntetické aparatury a nároky na elektrické napájení. V některých případech bývá využita i nízkotlaká syntéza, která skýtá oproti vysokotlaké určité výhody, ale na druhou stranu musí být kladen zvýšený důraz na vzduchotěsnost veškerých součástek a spojů.

15

4.4. Rostlinný materiál 4.4.1. Buňka Buňka (lat. cellula) je základní stavební a funkční jednotka těl organismů. Buňky jsou vysoce organizované živé struktury, obsahující v cytoplazmě množství specializovaných organel [32]. Od okolního prostředí je buňka oddělena tzv. cytoplazmatickou membránou. Jedná se fosfolipidovou dvojvrstvu obsahující tzv. transmembránové proteiny. Schopnost fosfolipidů vytvářet membrány je dána jejich chemickou strukturou (obsahují hydrofobní i hydrofilní část). Buněčné membrány fyzicky oddělují vnitřek buňky od okolního prostředí a zprostředkovávají také komunikaci mezi buňkami. Další důležitou funkcí buněčných membrán je transport látek mezi buňkou a okolním prostředím. typ transportu

mechanismus

druh přenášených látek plyny (O2, N2, CO2), malé lipofilní (hydrofobní) snaha vyrovnat rozdílné koncentrace látky (uhlovodíky, mastné kys., voda alkoholy, prostá difuze přímo přes membránu vně a uvnitř buňky, močovina) prostá difuze prstřednictvím vodou snaha vyrovnat rozdílné koncentrace hydrofilní látky ( např. ionty), lépe vstupují vyplněného iontového kanálu vně a uvnitř buňky, anionty než kationty přenos po koncentračním spádu pomocí lipofilního přenašeče, který se aminokyseliny, mono a disacharidy, fosfátové naváže na přenášenou látku usnadněná difuze ionty za spotřeby ATP, proti koncentračnímu membránové pumpy spádu Na+, K+, H+, Ca+ přenos pomocí váčků,nesoucích přenášenou látku, které splynou s velké organické molekuly (hormony), celé buňky cytóza cytoplazmatickou membránou (bakterie) Tabulka 1: Hlavní typy transmembránového přenosu látek, vytvořeno dle: [33] Rozlišujeme dva základní typy buněk: prokaryotické (velikost 1 - 10 µm, jednoduchá vnitřní struktura) a eukaryotické (velikost 10 – 100 µm, složité vnitřní organely a membránové struktury) Podle rozdílů v morfologii můžeme eukaryotické buňky rozdělit buňky rostlinné, živočišné a buňky hub. Rostlinné buňky obsahují na rozdíl od živočišných buněčnou stěnu, obsahují fotosynteticky aktivní organely a během diferenciace mohou výrazně zvětšovat svou velikost. Buněčná stěna je pevný celulózní obal přiléhající z vnější strany k cytoplazmatické membráně. Díky ní se rostlinná buňka lépe vyrovnává s nepříznivými vnějšími podmínkami, jako je např. mechanický tlak nebo osmotické jevy. Buněčná stěna rostlin je tvořena zejména celulózou a pektinem.

16

Ilustrace 8: Buněčný obal rostlinných buněk, upraveno dle:[34]

4.4.2. Buněčná kultura Buněčná kultura je soubor jednoho druhu buněk, které jsou kultivovány in vitro za specifických podmínek. Průkopníkem v oblasti buněčných kultur byl francouzský lékař Alexis Carrel (1873-1944), který v roce 1912 vložil do živného roztoku kus kuřecího srdce, jehož buňky vydržely v kultivační nádobě po plných 27 let [35]. Tímto způsobem mohou být kultivovány jak prokaryotické (např. bakterie), tak rostlinné či živočišné buňky. Tyto buňky jsou pěstovány v kultivačních médiích, jejichž složení je specifické pro každý typ buněk [36]. Buněčné kultury slouží k testování látek, léčiv a jejich toxicity či mutagenity. Živočišné buněčné kultury hrají významnou roli ve výzkumu rakoviny a vývoji protinádorových léčiv. Kultury rostlinných buněk mají uplatnění například v zemědělství ke šlechtění nových odrůd a vyvíjení geneticky modifikovaných plodin. Při studium toxicity zvolené látky se postupuje od nejjednodušších organismů, kterými jsou bakterie nebo kvasinky přes rostlinny až k vyšším živočichům. Dá se tedy říci, že sledování vlivu dané látky na rostlinné buňky tvoří jeden ze základních toxikologických testů. Použití rostlinných buněk k toxikologickým testům je výhodné jak z hlediska etického tak i toho důvodu., že kultivace rostlinných buněk je poměrně jednoduchou záležitostí. Vzhledem k potenciálnímu využití MNPs v medicínských aplikacích by vyvrcholením studia vlivu těchto nanočástic na živé organismy mělo být klinické testování na lidech. Mezi jednu z nejčastěji používaných modelových kultur vyšších rostlin patří buněčná kultura tabáku BY-2. Z taxonomického hlediska se jedná o buňky tabáku viržinského (lat. Nicotiana tabacum) odrůdy Bright Yellow – 2. Tak jako většina rostlinných buněčných kultur je i 17

kultura BY-2 tvořena nezeleným nediferenciovaným pletivem, které za normálních okolností pokrývá místo, ve kterém došlo k poranění rostliny. Takový typ pletiva bývá v odborné terminologii označován jako kalus [37]. Buňky kalusu dokáží za dobu jednoho týdne, při volbě optimálních růstových podmínek, svůj počet znásobit až 100 krát. Odrůda BY-2 se v laboratoři uchovává jako tzv. suspenzní kultura, která se vyznačuje tím, že jednotlivé buňky v mediu rostou samostatně, nebo maximálně v krátkých řetězcích. Protože se jedná o buňky nediferenciované jsou vhodným experimentálním materiálem dávajícím přibližnou představu o tom, jak může celý organismus reagovat na vnější podnět. Díky svým, mezi rostlinnými buňkami, výjimečným vlastnostem, se dají prováděné toxikologické testy statisticky změřit a na základě toho rozhodnout, zda jsou pozorované změny způsobeny právě použitým faktorem, nebo se vyskytují náhodně.

Ilustrace 9: Snímek BY-2 buněk s MNPs z optického mikroskopu

18

4.5. Vliv nanočástic na živé organismy Organismy jsou v průběhu svého života vystaveny řadě nepříznivých faktorů vnějšího prostředí. Tyto faktory mohou narušovat základní životní pochody a také vést k narušení buněčné membrány a s tím spojené ztrátě integrity buňky – nekróze nebo k aktivaci tzv. programované buněčné smrti – apoptóze [32]. Jedním z nepříznivých faktorů ovlivňujících buňky mohou být toxické látky, jenž definujeme jako látky, které jsou i v relativně malém množství schopny vyvolat vážné poškození organismu, popřípadě i smrt. Vliv nanočástic na živé organismy se liší podle jejich chemické složení. Pro své antibakteriální účinky se v textilním průmyslu hojně využívají stříbrné nanočástice. Bílé potravinářské barvivo E171, které je tvořeno nanočásticemi oxidu titaničitého, bylo již v mnoha studiích označeno za toxické, či dokonce mutagenní [38]. Uhlíkové nanotrubky bývají díky svému jehlovitému tvaru přirovnávány k asbestu . V práci [39] byly uhlíkové nanotrubky zaváděny do břišní dutiny myši domáci. Bylo prokázáno, že tyto nanočástice mohou způsobovat mesotheliomu (rakovina plicního epitelu) podobně jako azbestová vlákna. V další práci bylo zjištěno,že uhlíkové nanotrubky dokáží pronikat nervovou soustavou některých mořských živočichů a mohou jim způsobit vážné zdravotní komplikace.[40]. Z hlediska mechanismů, kterými nanočástice působí na živé organismy je kromě potenciální karcinogenity a mutagenity významná i podpora tvorby volných kyslíkových radikálů [41]. Touto vlastností nanočástice disponují zejména díky svému velkému povrchu a s tím souvisejkící reaktivitou. Volné radikály jsou sloučeniny kyslíku vznikající jako vedlejší produkt buněčného metabolismu. Jedná se o molekuly, které mají jeden nebo více volných elektronů, jsou velmi reaktivní a velmi snadno tvoří vazby s biomolekulami a tím mění jejich biologickou aktivitu. Dalším typem nanočástic dostávajících se do popředí zájmu vědeckých pracovišť jsou MNPs, zejména pro jejich možné využití v biomedicínských aplikacích. Cílem vědeckých prací je zjištění, do jaké míry je tento druh nanočástic toxický pro živé organismy. Z jejich poznatků (viz. tabulka 2) vyplývá, že nejčastěji používaným modelovým organismem jsou lidské a živočišné buněčné kultury. Dále bylo zjištěno, že v případě čistých (nefunkcionalizovaných) MNPs byla výraznější toxicita prokázána pouze při koncentracích převyšujících 250 μg/ml. Některé studie zkoumaly vliv funkcionalizace na toxicitu MNPs. Na povrch nanočástic byly navázány většinou membránové proteiny nebo polysacharidy. Tato povrchová úprava nanočástic zvyšuje jejich toxicitu. Jedním z možných vysvětlení je, že vlivem funkcionalizace se zvyšují hydrofilní vlastnosti MNPs, které tak mohou lépe pronikat do buněk, kde mohou narušit fyziologické prostředí a 19

způsobovat patologické reakce. toxicita nepokrytých MNPs toxicita pokrytých MNPs 25-50% životaschopnost při 250 µg/ml Gupta, 2004 lidské fibroblasty 99% přežití při 1 µg/ml LC50 (50% živých) Hussain, 2005 krysí játra není nebyla prokázána při 250 µg/ml není při 1 mg/ml; lehká toxicita při 10 mg/ml Muller, 2007 lidský makrofág dextran nebyla zkoumána Cheng, 2004 COS-7 cells není nebyla prokázána MPEG–Asp3-NH2: bez MPEG-Asp3známek toxicity; MPEG– NH2, PAA a PAA snížená životaschopnost nad 200 MPEGµg/ml Wan, 2007 OCTY buňky myší PAA,PAA nebyla zkoumána lidský karcinom 91% životaschopnost při Yu, 2006 prsu PMAO-PEG nebyla zkoumána 200 µg/ml Tabulka 2: Souhrn významných vědeckých prací v oblasti toxicity MNPs tvořených oxidy železa autor,rok

buněčná kultura

funkcionalizace MA-PEG (membránové proteiny)

4.6. Toxikologické markery Pro posouzení toxicity nanočástic bývá sledováno velké množství parametrů, ať už běžných (přírůstek biomasy, životnost buněk, obsah celkových bílkovin) či specifických (obsah thiolových sloučenin, aktivita GST, antioxidační aktivita)

4.6.1. Přírůstek biomasy a životnost Základním sledovaným markerem toxicity je stanovení hmotnosti buněk po uplynutí určité doby, během které je rostlina vystavena působení dané látky. Rostlinné buňky na toxické látky reagují různými způsoby. V každém případě však na detoxikaci musí buňky vynaložit velké množství energie. Kvůli tomu se zpomalují anabolické děje a tím pádem se snižuje i přírůstek biomasy.

4.6.2. Obsah celkových bílkovin Jestliže jsou buňky vystaveny působení nějaké toxické látky, dochází u nich vlivem obranných mechanismů k výrazným biochemickým změnám. Zejména se mění enzymová aktivita a začínají se syntetizovat proteiny, které se za normálních okolností vyskytují v buňkách pouze v nízkých koncentracích. Vzhledem k tomu, že jejich syntéza je indukována přítomností nějakého 20

stresového faktoru označujeme takové proteiny jako stresové. Jedním ze základních toxikologických testů je stanovení koncentrace všech proteinů obsažených v buněčném peletu. Získané hodnoty jsou však mírně zkresleny skutečností, že při vystavení buněk stresovým faktorům je naopak tvorba některých ostatních proteinů mírně omezena [42].

4.6.3. Obsah thiolových sloučenin Mezi důležité zástupce stresových proteinů patří thiolové sloučeniny. Jedná se o organické slučeniny síry, odvozené od alkoholů záměnou jednoho nebo více kyslíků v -OH skupině za síru. Významnými zástupci biologicky aktivních thiolových sloučenin jsou cystein, glutathion, fytochelatin a metalothionein. Díky -SH skupině mohou thiolové sloučeniny tvořit disulfidické můstky, které stabilizují terciální strukturu bílkovin. Jednou z dalších biologických funkcí je i podíl na detoxikačních mechanismech organismu. Celkový obsah thiolových sloučenin v buněčném peletu je tudíž závislý na přítomnosti toxických látek a stává se tak důležitým biomarkerem toxicity [43].

4.6.4. Aktivita glutathion S - transferáz Glutathion je jedním z nejvýznamnějších biologicky aktivních zástupců thiolových sloučenin. V buňkách se podílí na řadě životně nezbytných činností, mezi které patří např. biosyntéza a oprava DNA, řízení správné funkce koenzymů nebo odstraňování volných radikálů [44]. Co se týče chemické struktury, jedná se o malý tripeptid, složený z glutaminu, cysteinu a glycinu.

Ilustrace 10: Struktura glutathionu Glutathion se také výrazným způsobem zapojuje do detoxikačních mechanismů organismu. Díky svým výhodným chemickým vlastnostem dokáže glutathion reagovat s některými toxickými látkami, např. těžkými kovy, přes svou thiolovou (-SH) skupinu. Takto navázaný toxin je poté organismem daleko lépe odbourán. Rovnice popisující reakci glutathionu a toxické látky je: RX + GSH → GSR + HX , kde RX je toxická látka a GSH glutathion. Biokatalyzátorem této reakce je skupina enzymů označovaných jako glutathion S - transferázy (GST). Jednoduchou metodou stanovení množství detoxikačních

21

reakcí glutathionu v buňkách je sledování aktivity GST [45].

4.6.5. Antioxidační aktivita Jedním z nejnebezpečnějších účinků toxických látek na organismus je tvorba volných radikálů. Jsou to atomy nebo molekuly mající ve svém elektronovém obalu jeden, vzácně i více volných elektronů [46]. Díky tomu mohou reagovat s většinou biomolekul, a tím způsobit narušení jejich struktury a biologických funkcí [47]. Jedním z ukazatelů množství vytvořených volných radikálů v buňkách je antioxidační aktivita. Je definována jako schopnost sloučeniny inhibovat oxidační degradaci různých sloučenin působením volných radikálů. Metody jejího stanovení se nejčastěji zakládají na přímé reakci studované látky s radikály nebo na reakci s přechodnými kovy. Mezi nejvýznamnější patří metody využívající DPPH, ABTS, DMPD a blue CrO5 [48].

4.6.5.i.

Metoda využívající DPPH

DPPH test je založen na schopnosti stabilního volného radikálu 2,2-difenyl-1 pikrylhydrazylu (DPPH) reagovat s donory vodíku. DPPH • vykazuje silnou absorpci v UV-VIS spektru. Při tomto testu se po redukci antioxidantem (AH) nebo radikálem (R •) původně fialový roztok odbarví dle následující reakcí [49]: DPPH• + AH → DPPH•-H + A•, DPPH• + R• → DPPH•-R

4.6.5.ii.

Metoda využívající ABTS

Metoda využívající ABTS je založena na neutralizaci radikálkationtu vzniklého jedno elektronovou oxidací syntetického chromoforu ABTS• (2,2‘-azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6sulfonátu) na radikál ABTS• – e- → ABTS•+. Tato reakce se sleduje fotometricky na základě změny absorpčního spektra, kdy se původně modrozelený roztok odbarví na žlutý [50].

4.6.5.iii. Metoda využívající DMPD Při stanovení antioxidační aktivity pomocí této metody se N,N-dimethyl-1,4-diaminobenzen (DPMD) v experimentálním roztoku převede pomocí působení železité soli, na relativně stabilní a barevnou radikálovou formu. Po přidání vzorku se v přítomnosti redukčních faktorů radikál zháší a tím odbarvuje, což jsme schopni fotometricky vyhodnotit [51].

22

4.6.5.iv. Metoda využívající Blue CrO5 Tato metoda využívá skutečnosti, že v kyselém prostředí se za působení H2O2 radikálu mění oranžový roztok dichromanu amonného na chrom peroxid (CrO5). CrO5 je silné oxidační činidlo a díky svému tmavě modrému zbarvení lze snadno měřit fotometricky [52].

23

5. Experimentální uspořádání a metody 5.1. Syntéza MNPs Syntéza MNPs probíhala v nízkotlakém mikrovlnně buzeném plazmovém výboji pomocí metody PECVD. Aparatura pro syntézu MNPs se skládá z části generující mikrovlny nutné pro udržení výboje a části vakuové, která pracuje za sníženého tlaku a slouží ke směšování par prekurzoru a reakčních plynů a k záchytu vytvořených MNPs na filtru. Mikrovlnná část aparatury dodává výboji energii a tím slouží k jeho stabilizaci. Skládá se z mikrovlnného generátoru (magnetronu) s proměnným výkonem 150 – 1500 W, který generuje mikrovlnné vlny o frekvenci 2,45 GHz. Magnetron je obsluhován pomocí dotykového displeje, na kterém můžeme nastavovat hodnotu maximálního výkonu. Je zde také zobrazován odražený výkon, který lze ovlivnit třemi písty, které se potřeby mohou zasouvat nebo vysouvat. Naším cílem je vždy dosáhnout co nejmenšího odraženého výkonu. Typická hodnota odraženého výkonu se pohybuje okolo 30 W, tedy cca 5% postupujícího výkonu. Pro chlazení mikrovlnného generátoru je použit vodní okruh. Nejdůležitější částí vakuové části aparatury je křemenná trubice, ve které probíhá samotný plazmový výboj. Je uložena kolmo na směr postupujících mikrovln, má délku 1 m, vnější průměr 45,8 mm a vnitřní průměr 40,8 mm. Zahřátá křemenná trubice je pomocí kompresoru chlazená proudem stlačeného vzduchu.. Do této trubice jsou shora přiváděny reakční plyny pomocí PE hadiček o vnějším průměru 6 mm. V naší práci jsme používali argon a kyslík. Průtok těchto plynů byl regulován pomocí průtokoměrů Bronkhorst s propojením na PC. Maximální průtok pro argon byl 5000 sccm a pro kyslík 2500 sccm (vysvětlení zkratky sccm viz 3). Fe(CO)5 je do trubice přiváděn zdola přes křemennou trubičku s vnitřním průměrem 5,2 mm. Tekutý pentakarbonyl je skladován v 250 ml baňce, která je obalena hliníkovou fólií. Ta zajišťuje, že tento prekurzor není samovolně rozkládán světlem. Průtok pentakarbonylu je regulován otočným skleněným kohoutem. Páry Fe(CO)5 jsou do plazmového výboje nasávány rozdílem tlaků mezi trubicí a zásobní baňkou.

3. standard cubic centimeter per minute – standartní kubický centimetr za minutu, jednotka průtoku 1 sccm = 1.68 × 10−3 Pa m3 s−1, pri tlaku 101 325 Pa a teplote 293 K

24

Ilustrace 11: Schéma aparatury pro syntézu MNPs Před začátkem každého experimentu musí dojít k vyčerpání aparatury olejovou vývěvou až na tlak okolo 10 Pa. Poté je do trubice vpuštěn argon, čímž stoupne tlak v aparatuře asi na 1300 Pa. Následuje zapálení výboje, přičemž někdy je nutné použít vnější ionizátor - Teslův transformátor. Po zapálení je nastaven konkrétní výkon a průtok plynů charakteristický pro typ částic, které chceme připravit. Bylo zjištěno, že výboj zapálený v čistém argonu je vysoký přibližně 1 m (přes celou křemenno trubici). Přidáváním dalších molekulárních plynů (v našem případě kyslíku) se výboj zháší a jeho výška se zmenšuje Otočením regulačního kohoutu dojde k nasátí par prekurzoru do plazmového výboje, kde dochází k rozkladu Fe(CO)5. Vzniklé nanočástice jsou unášeny proudem plynu a zachytávány na filtru. Zbytek reakční směsi je veden přes vývěvu odtahem ven z aparatury. MNPs jsou po pasivaci, která probíhá po zhasnutí výboje v argonové atmosféře po dobu asi 2 h, přeneseny z filtru pomocí štětce do připravených mikrozkumavek.

5.2. Funkcionalizace nanočástic Povrchové modifikace nanočástic probíhaly v menší plazmové aparatuře. V tomto zařízení je 30 cm dlouhá trubice uložena vodorovně, elektrody tvoří čela trubice. Výboj je generován radiofrekvenčními vlnami. Jelikož je hustota výkonu menší než v případě mikrovlnné syntetické aparatury, pracuje se zde za daleko nižších teplot. Výkon generátoru je do 100 W. Výboj je

25

zapalován za tlaku 110 Pa. Úprava může probíhat dvěma způsoby. Za prvé pomocí amonných par, kdy je výboj zapálen pouze v atmosféře tvořené amoniakem (průtok: 10 sccm). Za druhé pomocí vodních par, ve kterých však výboj nelze zapálit. Výboj je proto zapálen v argonu (průtok: 20 sccm) a k aparatuře je připojena baňka s vodou. V důsledku toho, že tenze par vody při pokojové teplotě je vyšší než provozní tlak v naší aparatuře, stačí pootevřít jehlový ventil a vodní páry samovolně proudí do prostoru trubice. Nanočástice jsou nasypány přímo na povrchu křemenné trubice, kde na ně působí plazmový výboj společně s reakčními plyny a dochází k jejich funkcionalizaci.

5.3. Biologický materiál V našem experimentu jsme používali suspenzní tabákovou kulturu BY-2. Buňky byly pěstovány v Murashige-Skoog mediu modifikovaném pro kulturu BY. Poměr media ku buňkám jsme stanovili na 10:1. Do takto připravených roztoků byly přidány nanočástice v množství odpovídající daným koncentracím. Rozhodli jsme se pro logaritmickou škálu koncentrací od 0 μg/ml, kterou jsme určili jako kontrolní vzorek až po 1000 μg/ml u nemodifikovaných popř. 100 μg/ml u modifikovaných (z důvodu menšího množství nanoprášku). Pro každou koncentraci nanočástic byly připraveny 2 vzorky. Hodnoty sledovaných markerů byly poté vypočteny jako aritmetický průměr těchto 2 vzorků. Takto připravené baňky i s naváženými nanočásticemi byly kultivovány po dobu 1 týdne v třepačce při teplotě 25 °C.

5.4. Odběr vzorků Po 1 týdnu kultivace byly vzorky z erlenmayerových baněk přeneseny do 50 ml zkumavek. Následně byly podrobeny centrifugaci při 7000 g po dobu 15 min. Tím jsme oddělili buňky s nanočásticemi od zbylého média. Přebytečné médium jsme opatrně odpipetovali a zbylé buňky s MNPs jsme zvážili. Po odečtení navážky nanoprášku jsme zjistili hmotnost buněčného peletu

5.5. Příprava vzorku pro analýzy Z každého vzorku bylo odebráno přibližně 100 mg a přeneseno do mikrozkumavky o objemu 2 ml. Ke každému vzorku byl přilit tekutý dusík a poté následovala dezintegrace buněk pomocí tyčového homogenizéru ULTRA-TURRAX T8 (IKA, Germany) a resusupendace v 1 ml fosfátového pufru. Takto připravené vzorky jsme umístili na 30 min do třepačky při teplotě 4 °C. Poté byly vzorky zcentrifugovány pomocí Universal 32 R centrifugy (Hettich-Zentrifugen GmbH,

26

Tuttlingen, Germany) při 16 000 g po dobu 30 min. Následně byl odebraný supernatant podroben biochemickým testům.

5.6. Přístrojové vybavení pro spektrofotometrické analýzy Biochemické testy jsme vyhodnocovali spektrofotometricky pomocí automatického chemického analyzátoru BS-200 (Mindray, Čína). Reagencie a vzorky jsme umístili v podavači vzorků vychlazeném na 4 °C. Z něj byly roztoky pipetovány přímo do plastových kyvet. Inkubace probíhala při 37 °C. Kyvety byly po přidání jakékoliv reagencie či vzorku promíchány. Celý přístroj byl ovládán softwarem BS-200 (Mindray, Čína).

Ilustrace 12: Automatický chemický analyzátor BS-200.

27

6. Výsledky a diskuze 6.1. Příprava a analýza nanočástic Syntéza MNPs probíhala pomocí nízkotlakého mikrovlnně buzeného plazmového výboje. Základní pracovní parametry syntézy, které jsme schopni měnit, jsou tlak (1300-3000 Pa), výkon jdoucí do výboje (200-700 W) a průtok reakčního plynu (do 500 sccm). Zjistili jsme, že z hlediska množství vyrobeného nanoprášku je nejvýhodnější použít výkon okolo 700 W.

Ilustrace 13: Syntéza MNPs metodou PECVD. V horní části obrázku pozorujeme fialový sloupec plazmatu v argon-kyslíkové atmosféře. Dole vidíme trubici, kterou je do výboje přiváděn pentakarbonyl a plamen ve kterém probíhá vlastní syntéza MNPs. Vznikající nanočástice začínají pokrývat povrch křemenné trubice. Každý vzorek nanoprášku připravený v naší aparatuře byl podroben rentgenové strukturní analýze na Ústavu fyziky materiálů AV ČR. Výstupem z této analýzy je difraktogram, což je graf, na jehož horizontální ose je vynesen dvojnásobek difrakčního úhlu 2Θ a na vertikální ose intenzita registrovaného rentgenového záření. Na základě velikosti a umístění píků jsme schopni určit o jakou krystalickou fázi se jedná a podle šířky píku zjistíme přibližnou velikost částic. Pro ilustraci uvádím difraktogram vzorku LP 28 (ilustrace 14) a tabulku (tabulka 2) s výsledky této analýzy pro několik vzorků o charakteristickém složení.

28

Ilustrace 14: Difraktogram vzorku LP 28 Fe 3O4 γ-Fe 2O3 označení vzorku α-Fe LP16 81% / 14nm 19% / 4nm LP26 52% / 6nm 48% / 16nm LP28 100% / 14nm LP30 40% / 33nm 60% / 13nm Tabulka 3: Hmotnostní podíl a velikost nanočástic pro jednotlivé krystalické struktury na základě rtg difrakce Jak je uvedeno v tabulce 3, jsme v naší aparatuře schopni připravit i nanočástice tvořené α - železem. Takový nanoprášek vzniká, pokud je výboj zapálen pouze v čistém argonu. Např. vzorek LP16 byl připraven při pracovním tlaku 3000 Pa a výkonu 700 W. Jako pracovní plyn byl použit pouze argon při průtoku 200 sccm Vzniklé MNPs, skládající se z α – železa, jsou díky svému velkému povrchu na vzduchu velmi nestabilní a prakticky ihned se oxidují na Fe 3O4. Tato reakce je silně exotermická a proto je nepraktické připravovat nanočástice oxidů železa oxidací α-železných nanočástic vně aparatury. Z tohoto důvodu se přidává v průběhu syntézy do výboje kyslík, jenž způsobí, že k oxidaci železa dochází přímo uvnitř reakční trubice. Takto připravené nanočástice se jeví jako vhodné pro biomedicínské aplikace. Jednou z variant, kterou jsme schopni připravit byl vzorek označený jako LP28. Tento vzorek byl připraven při pracovním tlaku 3000 Pa a výkonu 700 W. Průtok reakčních plynů byl 200 sccm argonu a 400 sccm kyslíku. Syntéza probíhala po dobu 10 min, přižemž bylo připraveno asi 5 g nanočástic. Na základě rentgenové krystalografie bylo zjištěno, že daný vzorek je složen pouze z γ-Fe2O3. Takto připravený vzorek nanoprášku byl použit

29

na biologické testy. V další části práce jsme se pokusili o fukcionalizaci vzorku LP28 v RF plazmatu za pomocí amonných a vodních par. V případě povrchové úpravy pomocí vody jsme výboj zapálili v argonové atmosféře při průtoku argonu 20 sccm. Reakce probíhala při tlaku 110 Pa a výkon RF generátoru byl nastaven na 10 W. Dosažení vyššího výkonu, který by byl pro funkcionalizaci vhodnější, bylo znemožněno tím, že při vyšších výkonech se výboj stával nestabilním. V případě funcionalizace pomocí amoniaku však lze výboj zapálit bez použití dalších plynů. Bylo možné použít výkon až 50 W při průtoku amoniaku 10 sccm a pracovním tlaku 80 Pa. Jelikož na této aparatuře nebyl dosud proveden systematický výzkum vlivu času na povrchovou úpravou nanoprášku, rozhodli jsme se pro jistotu ponechat nanočástice v plazmovém výboji po dobu 1 h. Takto funcionalizované nanočástice jsme podrobili obdobným biologickým testům jako vzorek LP28

30

6.2. Vliv magnetických nanočástic oxidů železa (MNPs) na tabákovou kulturu BY-2 Při sledování účinků MNPs na kulturu BY-2 jsme sledovali tyto toxikologické markery: přírůstek biomasy, obsah celkových bílkovin, obsah thiolových sloučenin, aktivita glutathion S transferáz a antioxidační aktivita. Antioxidační aktivita byla stanovována pomocí 4 různých metod (DPPH, ABTS, DMPD a blue CrO5). Abychom mohli posuzovat jednotlivé metody, byly nakalibrovány na kyselinu gallovou (jednotka GAE - ekvivalent kyseliny gallové). Tyto metody se od sebe liší nejen použitým reakčním činidlem, ale také citlivostí pro různé druhy antioxidantů. Protože antioxidační aktivity měřené jednotlivými metodami vykazovaly obdobné rozhodli jsme se z důvodu jednodušší interpretace výsledků tyto hodnoty sjednotit. Pro každý vzorek jsme sečetli hodnoty získané pomocí jednotlivých metod a tím jsme získali celkovou antioxidační aktivitu daného vzorku. Výsledky všech biologických testů jsou uvedeny v grafech, kde na ose x je nanesena koncentrace MNPs ve vzorku a na ose y hodnota stanovovaného biomarkeru. Ve všech testech je jako kontrolní použit vzorek o koncentraci MNPs 0 μg/ml buněčné suspenze, tzn. vzorek bez přítomnosti nanočástic.

6.2.1. Vliv čistých (nefukcionalizovaných) MNPs na tabákovou kulturu BY-2

Graf 1: Vliv nefunkcionalizovaných MNPs na růst buněčné kultury Základním sledovaným markerem bylo stanovení vlivu MNPs na množství biomasy. V případě čistých MNPs nemají výraznější vliv na růst buněk. Minimum hmotnosti je dosaženo při 31

koncentraci 1000 μg/ml, kdy sledujeme mírný pokles hmotnosti peletu o 9 % v porovnání s kontrolním vzorkem.

Graf 2: Vliv nefunkcionalizovaných MNPs na koncentraci celkových bílkovin v 1g buněk Při studiu závislosti obsahu bílkovin na koncentraci nanočástic jsme pozorovali, že s rostoucí koncentrací MNPs roste i koncentrace bílkovin. I přes rostoucí trend bylo zjištěno, že v porovnání s kontrolou koncentrace 10 μg/ml obsahuje o 22 % méně bílkovin, při koncentraci 100 μg/ml je hodnota srovnatelná s kontrolou a při koncentraci MNPs 1000 μg/ml zjišťujeme již 31 % nárůst ve srovnání s kontrolou. Ze získaných výsledků můžeme usuzovat, že při koncentraci 10 μg/ml MNPs dochází k omezení tvorby některých proteinů. Naopak při obsahu 1000 μg nanočástic v 1 ml buněčné suspenze se stresové proteiny začínají ve větší míře syntetizovat jako reakce na zasažení buněk cizorodou látkou. Díky tomu dochází k prudkému nárůstu koncentrace celkových bílkovin v buněčném peletu.

Graf 3: Vliv nefunkcionalizovaných MNPs na koncentraci thiolových (-SH) skupin Z výsledků stanovení koncentrace -SH skupin můžeme vysledovat, že dochází k výraznému nárůstu při koncentraci nanočástic 10 μg/ml, a to o 32 % oproti kontrole. Ostatní vzorky vykazují srovnatelný obsah -SH skupin v porovnání s kontrolním vzorkem. Na základě námi získaných 32

hodnot můžeme konstatovat, že při koncentraci 10 μg na 1 ml buněčné suspenze dochází pravděpodobně k výraznější syntéze thiolových sloučenin, které se podílejí na detoxikačních procesech organismu.

Graf 4: Vliv nefunkcionalizovaných MNPs na aktivitu glutathion S – transferáz (GST) V případě měření aktivity glutathion S - transferáz pozorujeme, že oproti kontrolnímu vzorku je zde znatelný nárůst hodnot v přítomnosti čistých MNPs. Pro koncentraci 10 μg/ml, kdy je aktivita GST největší, je nárůst 105 % v porovnání s kontrolou. Avšak se stoupající koncentrací částic aktivita GST mírně klesá. Sledování aktivity GST nám dává možnost zjistit množství detoxikačních reakcí v organismu za účasti glutathionu. Můžeme tedy konstatovat, že přítomnost MNPs stimuluje u buněčné kultury aktivaci obranných mechanismů, kterých se účastní thiolové sloučeniny (např. GST)

Graf 5: Vliv nefunkcionalizovaných MNPs na celkovou antioxidační aktivitu Při stanovení antioxidační aktivity, která nám určuje množství volných radikálů vznikajících v organismu jako reakce na stres způsobený cizorodou látkou, můžeme sledovat nárůst aktivity o 33 % oproti kontrolnímu vzorku při koncentraci 10 μg/ml. Antioxidační aktivita poté s rostoucí 33

koncentrací MNPs klesá. Při koncentraci 100 μg/ml dosahuje hodnoty srovnatelné s kontrolním vzorkem, u nejvyšší koncentrace - 1000 μg nanočástic na 1 ml buněčné suspenze již můžeme sledovat pokles aktivity, a to o 24 % v porovnání s kontrolou. Ze získaných výsledků můžeme předpokládat, že nejvíce volných radikálů se ve vzorku tvoří při koncentraci 10 μg/ml a se stoupající koncentraci nanočástic se tvorba volných radikálů snižuje.

34

6.2.2. Vliv MNPs funkcionalizovaných amoniakem na tabákovou kulturu BY-2

Graf 6: Vliv amoniakem funkcionalizovaných MNPs na růst buněčné kultury V grafu růstových charakteristik buněčné kultury BY-2 v závislosti na obsahu amoniakem funkcionalizovaných MNPs můžeme pozorovat lehké stimulační účinky na růst kultury při koncentraci nanočástic 1 μg/ml. Oproti kontrole zjišťujeme nárůst hmotnosti biomasy o 4 %. V případě vzorků s obsahem 10 a 100 μg amoniakem funkcionalizovaných MNPs v 1 ml sledujeme v porovnání s kontrolním vzorkem bez přítomnosti MNPs, pokles o 10 - 13 %. Na základě zjištěných výsledků můžeme konstatovat, že zde nastává mírná inhibice růstu buněčné kultury při vyšších koncentracích MNPs.

Graf 7: Vliv amoniakem funkcionalizovaných MNPs na koncentraci celkových bílkovin Dalším významným parametrem při studiu účinků různých látek na živé organismy je obsah všech bílkovin přítomných v buněčném peletu. V případě amoniakem funkcionalizovaných MNPs zjišťujeme, že při koncentraci nanočástic 1 μg/ml dochází ke snížení tvorby bílkovin o 7 % v porovnání s kontrolou, ale se stoupající koncentrací MNPs obsah bílkovin roste. Pro vzorky o 35

koncentracích 10 a 100 μg nanočástic v 1 ml buněčné suspenze pozorujeme nárůst koncentrace bílkovin ve srovnání s kontrolním vzorkem o 14 respektive 79 %.

Graf 8: Vliv amoniakem funkcionalizovaných MNPs na koncentraci thiolových (-SH) skupin Jedny z významných detoxikačních látek jsou thiolové sloučeniny, které díky své -SH skupině mohou reagovat s potenciálními toxiny a zmírnit tak jejich účinek na živý organismus. V našem experimentu jsme sledovali obsah thiolových skupin v závislosti na koncentraci amoniakem funkcionalizovaných MNPs. Na základě zjištěných hodnot můžeme říci, že při koncentracích nanočástic 1 μg/ml a 10 μg/ml došlo ve vzorcích ke zvýšení koncentrace -SH skupin o 5 - 9 % v porovnání s kontrolou. Výrazné minimum a tudíž i omezení tvorby thiolových sloučenin nastává při obsahu 100 μg nanočástic v 1ml. V tomto vzorku je hodnota koncentrace thiolových skupin v porovnání s kontrolním vzorkem nižší o 44 %.

Graf 9: Vliv amoniakem funkcionalizovaných MNPs na aktivitu glutathion S - transferáz (GST) Měřením aktivity glutathion S - transferáz v závislosti na koncentraci MNPs můžeme zprostředkovaně zjistit, v jakém množství probíhají v daném vzorku detoxikační reakce pomocí glutathionu, jelikož GST je skupina enzymů katalyzující právě vazbu glutathionu na potenciální toxin. Na základě zjištěných výsledků můžeme konstatovat, že dochází k výraznému poklesu 36

aktivity GST v porovnání s kontrolním vzorkem pro všechny studované koncentrace amoniakem funkcionalizovaných nanočástic. Nejnižší aktivita GST byla pozorována při koncentraci MNPs 100 μg/ml a její hodnota je menší o 54 % než v případě kontrolního vzorku.

Graf 10: Vliv amoniakem funkcionalizovaných MNPs na celkovou antioxidační aktivitu Při sledování celkové antioxidační aktivity v závislosti na koncentraci amoniakem funkcionalizovaných nanočástic zjišťujeme, že s rostoucí koncentrací MNPs ke snižování antioxidační aktivity. V porovnání s kontrolou dochází při koncentraci 1 μg/ml ke zvýšení aktivity o 13 %. U zbylých koncentrací docházelo v porovnání s kontrolou k poklesu antioxidační aktivity. Minima bylo dosaženo u vzorku s koncentrací MNPs 100 μg/ml. Při této koncentraci amoniakem funkcionalizovaných magnetických nanočástic je antioxidační aktivita, v porovnání s kontrolním vzorkem, nižší o 46 %.

37

6.2.3. Vliv MNPs fukcionalizovaných vodní parou na tabákovou kulturu BY-2

Graf 11: Vliv vodou funkcionalizovaných MNPs na růst buněčné kultury Základním sledovaným parametrem toxicity dané látky je její vliv na přírůstek biomasy. Na základě námi zjištěných výsledků můžeme konstatovat že MNPs funcionalizované vodními parami jen mírně snižují růst buněčné kultury BY-2. Minimum hmotnosti buněk zjišťujeme při koncentraci 100 μg/ml a oproti kontrolnímu vzorku je zde pokles o 9 %.

Graf 12: Vliv vodou funkcionalizovaných MNPs na koncentraci celkových bílkovin Z grafu závislosti celkového obsahu bílkovin na koncentraci vodou funkcionalizovaných MNPs můžeme pozorovat zvýšenou tvorbu bílkovin oproti kontrolnímu vzorku u všech koncentrací MNPs. Nejvyšší tvorba bílkovin (42 % nárůst v porovnání s kontrolou) byla zjištěna u vzorku obsahujícího 10 μg nanočástic v 1 ml buněčné suspenze. Zvýšení koncentrace bílkovin může být způsobeno syntézou stresových proteinů, které napomáhají buňkám vyrovnat se s nefyziologickými podmínkami.

38

Graf 13: Vliv vodou funkcionalizovaných MNPs na koncentraci thiolových (-SH) skupin Na základě sledování koncentrace thiolových skupin v závislosti na obsahu nanočástic můžeme konstatovat, že dochází ke snížení tvorby thiolových sloučenin oproti kontrolnímu vzorku u koncentrací 1 μg/ml a 10 μg/ml a to o 9 - 18 %. Avšak maximální koncentrace -SH skupin byla zjištěna ve vzorku s obsahem 100 μg vodou funkcionalizovaných MNPs na 1 ml buněčné suspenze a její hodnota je o 17 % vyšší než v případě kontrolního vzorku bez přítomnosti MNPs. Biologicky aktivní thiolové sloučeniny patří chemickým složením mezi proteiny a díky své -SH skupině jsou schopny navázat potenciální toxin, a tím zvýšit odolnost buněk např. proti účinkům těžkých kovů.

Graf 14: Vliv vodou funkcionalizovaných MNPs na aktivitu glutathion S – transferáz (GST) Důležitým toxikologicky významným markerem je studium aktivity GST, díky kterému zjišťujeme, jakou intenzitou probíhají v daném vzorku detoxikační reakce pomocí glutathionu. Z výsledků můžeme vysledovat, že dochází k nárůstu aktivity GST oproti kontrolnímu vzorku při všech koncentracích MNPs. Maximum aktivity je dosaženo při nejvyšší koncentraci - 100 μg/ml a hodnota aktivity GST je v tomto případě o 26 % větší než u kontrolního vzorku.

39

Graf 15: Vliv vodou funkcionalizovaných MNPs na celkovou antioxidační aktivitu Při stanovení antioxidační aktivity můžeme sledovat pokles hodnot aktivity oproti kontrolnímu vzorku při všech koncentracích nanočástic. Minimum nastává při koncentraci 10 μg/ml a pokles aktivity oproti kontrolnímu vzorku je 29 %. Na základě toho můžeme konstatovat, že tento druh MNPs nepodporuje tvorbu volných radikálů v buňkách. Ba naopak při koncentraci 10 μg vodou funkcionalizovaných MNPs v 1 ml buněčné suspenze dochází k výraznému omezení tvorby těchto pro organismus velmi nebezpečných molekul.

40

7. Závěr Předložená bakalářská práce se zabývá vlivem magnetických nanočástic oxidů železa na suspenzní tabákovou kulturu BY-2. Vzorky magnetických nanočástic na bázi železa byly připraveny pomocí metody plazmochemické depozice z plynné fáze (PECVD) . Jako prekurzor byl v naší práci použit pentakarbonyl železa Fe(CO)5. Vhodnou volbou syntézních podmínek jsme schopni připravit nanočástice tvořené jak železem tak i jeho železa. Pro zjištění konkrétního složení a velikosti částic bylo použito rentgenové strukturní analýzy. Námi prezentované výsledky biologických testů se týkají nanoprášku složeného z čistého maghemitu o průměrné velikosti částic 14 nm, který byl následně fukcionalizován pomocí vodních a amonných par. Dalším cílem této práce bylo zjištění vlivu námi připravených funcionalizovaných i nefunkcializovaných nanočástic na kulturu tabáku BY - 2. V této části experimentu byla tabáková kultura BY – 2 vystavena koncentracím nanočástic v rozmezí 0-1000 μg/ml buněčné suspenze. Pro toxikologické testy bylo použito multiinstrumentální vybavení a stanovován přírůstek biomasy, koncentrace celkových bílkovin, koncentrace thiolových sloučenin, aktivita glutathion S - transferáz (GST) a antioxidační aktivita. Pokud bychom měli shrnout výsledky našeho experimentu, můžeme konstatovat, že žádný druh MNPs (funkcionalizované i nefunkcionalizované) nemá výraznější vliv na růst buněk. Co se týče obsahu celkových bílkovin, můžeme říci, že byl zjištěn zvýšený obsah bílkovin oproti kontrolnímu vzorku od koncentrace 10 μg nanočástic na 1ml buněčné suspenze pro všechny druhy MNPs. Z toho můžeme usuzovat, že zde docházelo ke zvýšené tvorbě stresových proteinů, jež jsou jedním z indikátorů přítomnosti cizorodé látky v buňkách. U nemodifikovaných MNPs dochází ke zvýšení obsahu thiolových sloučenin a aktivity GST při všech koncentracích MNPs, což ukazuje na skutečnost, že v buňkách docházelo ke spouštění obranným mechanismů proti potenciálně toxickým látkám. Posledním sledovaným toxikologickým markerem bylo studium antioxidační aktivity. Zde můžeme konstatovat, že se zvyšující se koncentrací MNPs klesá antioxidační aktivita pro čisté nánočástice a nanočástice funkcionalizované amonnými parami. Z toho usuzujeme, že námi připravené nanočástice nepodporují tvorbu volných radikálů, které jsou pro organismus nebezpečné a bývají produkovány některými toxickými látkami. Na základě získaných výsledků můžeme říci, že námi připravené nanočástice vykazovaly jen mírnou toxicitu, která však neovlivňovala celkový růst buněčné kultury. Abychom však mohli s 41

jistotou tvrdit, že nanočástice připravované metodou PECVD jsou potenciálně vhodné i pro biomedicínské aplikace, museli bychom provést větší množství toxikologických testů i s použitím rozmanitějšího biologického materiálu (např. živočišné buňky, celistvé rostliny nebo drobní živočichové).

42

8. Seznam použité literatury [1]

Antón P.S., Silberglitt R., Schneider J. (2001): „The Global Technology Revolution“, National

Defense

Research

Institute,

Arlington

VA,

ISBN

0-8330-2949-5,

www.rand.org/publications [2]

http://en.wikipedia.org/wiki/Nano-

[3]

R. P. Feynman (1960) „There’s Plenty of Room at the Bottom, “ Engineering and Science magazine,

[4]

vol. XXIII, no. 5

N. Taniguchi (1974), "On the Basic Concept of 'Nano-Technology", Proc. Intl. Conf. Prod. Eng. Tokyo, Japan Society of Precision Engineering, Part II

[5]

Fullerenes. In Wikipedia : the free encyclopedia [online]. St. Petersburg (Florida) : Wikipedia Foundation, 2001, last modified on 2011 [cit. 2011-05-16]. Dostupné z WWW: .

[6]

Zschemie.euweb.cz [online]. 2006 [cit. 2011-05-16]. Formy uhlíku. Dostupné z WWW: .

[7]

Boehler, Reinhard (2000), "High-pressure experiments and the phase diagram of lower mantle and core materials", Review of Geophysics (American Geophysical Union) , 38: 221– 245.

[8]

Wikipedia, the free encyclopedia [online]. 2011 [cit. 2011-04-07]. Iron. Dostupné z WWW: .

[9]

J.E Greedon, (1994), „Magnetic oxides in Encyclopedia of Inorganic chemistry“ Ed. R. Bruce King, John Wiley & Sons

[10]

Q A Pankhurst et al (2003), Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine, J. Phys. D: Appl. Phys. 36 R167

[11]

Na, H. B., Song, I. C. and Hyeon, T. (2009), Inorganic Nanoparticles for MRI Contrast Agents, Advanced Materials, 21: 2133–2148.

[12]

van der Zee J. (2002), Heating the patient: A promising approach?, Annals of Oncology, 13:1173–1184.

[13]

Rudolf Hergt et al (2006), Magnetic particle hyperthermia: nanoparticle magnetism and materials development for cancer therapy, J. Phys.: Condens. Matter 18 S2919 43

[14]

M. Pupeza, M. Cernik, M. Greco (2007), Dechlorination of chlorinated hydrocarbons by zero-valent iron nano-particles, NATO Science Series, Volume 75, Part 3, 111-118

[15]

Sherman M. Ponder,, John G. Darab, and, Thomas E. Mallouk (2000), Remediation of Cr(VI) and Pb(II) Aqueous Solutions Using Supported, Nanoscale Zero-valent Iron, Environmental Science & Technology, 34 (12), 2564-2569

[16]

Lee, S.-J., Jeong, J.-R., Shin, S.-C., Kim, J.-C., Kim, J.-D. (2004), Synthesis and characterization of superparamagnetic maghemite nanoparticlesprepared by coprecipitation technique, Journal of Magnetism and Magnetic Materials 282: 147-150.

[17]

Pillai, V., Kumar, P., Hou, M.J., Ayyub, P., Shah, D.O. (1995) Preparationof nanoparticles of silver halides, superconductors and magnetic materials usingwater-in-oil microemulsions as nano-reactors, Advances in Colloid and Interface Science, 55: 241-269.

[18]

Hui-ping SHAO, Hyo-Sook LEE, Yong-Jae SUH, Jong-Hee KIM, Ying LI,Chong-Oh KIM (2006): Preparation of Monodispersed Iron Nanoparticles by ThermalDecomposition. J of Iron and Steel Research, Volume13, Supplement 1, 205–208

[19]

VEINTEMILLAS-VERDAGUER, S.; MORALES, M. P. ; SERNA, C. J. (1998), Continuous production of γ-Fe2O3 ultrafine powders by laser pyrolysis, Materials letters, 35, 3-4, s. 227-231. ISSN 0167-577X.

[20]

D. Vollath (2008), Plasma synthesis of nanopowders, Journal of Nanoparticle Research, Vol. 10: 39–57,

[21]

Itoh, H., Sugimoto, T. (2003), Systematic control of size, shape, structure,and magnetic properties of uniform magnetite and maghemite particles, Journal of Colloid and Interface Science, 265: 283-295.

[22]

Lee, Y., Lee, J., Bae, C., Park, J.-G., Noh, H.-J., Park, J.-H. and Hyeon, T. (2005), LargeScale Synthesis of Uniform and Crystalline Magnetite Nanoparticles Using Reverse Micelles as Nanoreactors under Reflux Conditions, Advanced Functional Materials, 15: 503–509.

[23]

ŘEZANKA, Pavel . KSICHT Korespondenční Seminář Inspirovaný Chemickou Tematikou [online].

2009

[cit.

2011-03-10].

Nanočástice

I.

Dostupné

z

WWW:

. [24]

R. Alexandrescu, I. Morjan, F. Dumitrache, et al. (2008), “Photochemistry Aspects of the Laser Pyrolysis Addressing the Preparation of Oxide Semiconductor Photocatalysts”,

44

International Journal of Photoenergy, vol. 11 [25]

Blundell, Stephen J.; Katherine M. Blundell (2008). Concepts in Thermal Physics. Oxford University Press. ISBN 978-0198567707

[26]

Wikipedia, the free encyclopedia [online]. 2011-3-29 [cit. 2011-03-30]. Plasma (physics). Dostupné z WWW: .

[27]

F. F. Chen (1984), Uvod do fyziky plazmatu. Academia, Praha, (z angl. originálu: Introduction to Plasma Physics, Plenum Press, 1977)

[28]

FRIDMAN, Alexander.

(2008),

Plasma

chemistry.

Cambridge:

CAMBRIDGE

UNIVERSITY PRESS. 1022 s. [29]

KOUSAL, J - KLÍMA, M - LAZAR, P - SLAVÍČEK, P - ŠŤASTNÁ, B - BRABLEC, A SULOVSKÝ, P. (1999) "Plazmová tužka" - nová metoda úprav povrchů materiálů. Materiálové vědy na prahu 3. milénia, VUT Brno, pp. 346-347

[30]

Rossnagel, S.M.; Cuomo, J.J.; Westwood, W.D. (1990), Handbook of Plasma Processing Technology - Fundamentals, Etching, Deposition, and Surface Interactions, William Andrew Publishing/Noyes.

[31]

Samson, S. ; Stephenson, G. R (2004). "Pentacarbonyliron" in Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis (Ed: L. Paquette) , J. Wiley & Sons, New York.

[32]

ALBERTS, B., JOHNSON, A., LEWIS, J., RAFF, M., ROBERTS, K., WALTER, P., (2002), Molecular biology of cell. Garland Science, New York.

[33]

PTÁČEK, V; ŽALUDOVÁ, R . Chemické složení živé hmoty a cytologie. Brno : Tribun EU, 2008. 159 s. ISBN 978-80-7399-528-7.

[34]

Molecular expressions [online]. 2005 [cit. 2011-03-23]. Plant Cell Wall. Dostupné z WWW: .

[35]

Carrel, Alexis (1912), "On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism". Journal of Experimental Medicine 15 (5); 516–528.

[36]

KOČÁREK, E – PÁNEK, M – NOVOTNÁ, D. Klinická cytogenetika I : úvod do klinické cytogenetiky : vyšetřovací metody v klinické cytogenetice. 1. vydání.

Praha : Karolinum,

2006. 120 s. Učební texty Univerzity Karlovy v Praze; ISBN 80-246-1069-8. [37]

Nagata T, Nemoto Y, Hasezawa S (1992), Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell in the cell biology of higher plants, International Review of Cytology 132, 1-30

45

[38]

University of California - Los Angeles (2009). Nanoparticles used in common household items cause genetic damage in mice. ScienceDaily. Retrieved April 7, 2011, from http://www.sciencedaily.com /releases/2009/11/091116165739.htm

[39]

Poland C, et al. (2008). "Carbon Nanotubes Introduced into the Abdominal Cavity of Mice Show Asbestos-Like Pathogenicity in aPilot-Study" (http:/ / www. nature. com/ nnano/ journal/ vaop/ ncurrent/ abs/ nnano. 2008. 111. html). Nature Nanotechnology 3 (7): 423–8.

[40]

A. BAUN, N. B. HARTMANN, K. GRIEGER, K. (2008), Ecotoxicity of engineered nanoparticles to aquatic invertebrates. Ecotoxicology. 2008, 17, 5, s. 387. ISSN 0963-9292.

[41]

Nel, A et al. (2006). "Toxic Potential of Materials at the Nanolevel". Science 311 (5761): 622–7.

[42]

Procházka S., Macháčková I., Krekule J., Šebánek J. a kol., 1998: Fyziologie rostlin. Academia, Praha, 484 s.

[43]

Patai, Saul, “The chemistry of the thiol group”, London, 1974.

[44]

Pompella, A; Visvikis, A; Paolicchi, A; De Tata, V; Casini, AF (2003). "The changing faces of glutathione, a cellular protagonist". Biochemical Pharmacology 66 (8): 1499–503

[45]

Sheehan D, Meade G, Foley VM, Dowd CA (November 2001). "Structure, function and evolution of glutathione transferases: implications for classification of non-mammalian members of an ancient enzyme superfamily". Biochem. J. 360 (Pt 1): 1–16.

[46]

Nonhebel, D. C. and Walton, J. C. Free-radical chemistry; structure and mechanism; University Press, Cambridge [Eng.] 1974

[47]

Del Mastero, R.F. (1980), An approach to free radicals in medicine an biology. Acta. Physiol. Scand. 492: 153-168

[48]

Sochor J., Ryvolova M., Krystofova O., Salas P., Hubalek J., Adam V., Trnkova L., Havel L., Beklova M., Zehnalek J., Provaznik I., Kizek R. (2010), Fully Automated Spectrometric Protocols for Determination of Antioxidant Activity: Advantages and Disadvantages. Molecules. 15(12):8618-8640

[49]

Parejo, L.; Codina, C.; Petrakis, C.; Kefalas, P., (2000), Evaluation of scavenging activity assessed by Co(II)/EDTA-induced luminol chemiluminescence and DPPH center dot (2,2diphenyl-1-picrylhydrazyl) free radical assay. J. Pharmacol. Toxicol. Methods , 44, (3), 507512.

[50]

Re, R.; Pellegrini, N.; Proteggente, A.; Pannala, A.; Yang, M.; Rice-Evans, C. (1999), 46

Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic. Biol. Med., 26, (9-10), 1231-1237. [51]

Gulcin, I.; Bursal, E.; Sehitoglu, M. H.; Bilsel, M.; Goren, A. C. (2010), Polyphenol contents and antioxidant activity of lyophilized aqueous extract of propolis from Erzurum, Turkey. Food Chem. Toxicol., 48, (8-9), 2227-2238.

[52]

Charalampidis, P. S.; Veltsistas, P.; Karkabounas, S.; Evangelou, A., (2009), Blue CrO5 assay: A novel spectrophotometric method for the evaluation of the antioxidant and oxidant capacity of various biological substances. Eur. J. Med. Chem., 44, (10), 4162-4168.

47