Jednobuněčné organismy Protozoa a řasy
Vladimír Kočí Ústav chemie ochrany prostředí, VŠCHT Praha
Protozoa •
Protozoa hrají v ekosystémech významnou úlohu jako primární konzumenti.
•
Vedle baktérií jsou nejvýznamnějšími organismy podílejícími se na samočistící schopnosti vody.
•
Pro ekotoxikologickou práci jsou vhodné především pro krátký životní cyklus, snadnou kultivaci a dostatečnou vnímavost k jedům.
•
Jednobuněčné organismy – jednodušší metabolismus – přímý vstup látky do organismu
•
Dobře slouží k monitoringu toxicity průmyslových odpadních vod.
•
Protozoální organismy jsou významným trofickým mezistupněm mezi mikrobiálními organismy a makrobiálními organismy vodního potravního řetězce. 2
Test na obrvenkách • Test spočívá ve spektrofotometrickém měření buď množství jedinců či jejich potravy (2 odlišné designy testu). • Inhibice růstu kultury obrvenek je pozorována 1. Jako úbytek zákalu způsobeného přítomností menšího množství jedinců ve srovnání s kontrolou 2. Jako vyšší zákal v testované koncentraci ve srovnání s kontrolou po 24 hodinové expozici způsobený přítomností většího množství nezkonzumované potravy. Obrvenky v kontrolách aktivně snižují množství potravy a tudíž dochází k poklesu zákalu.
3
Testovací organismus • Obrvenka Tetrahymena thermophila • Event. Tetrahymena pyriformis říše Protozoa – prvoci kmen Ciliophora – nálevníci třída Oligohymenophorea – chudoblanní řád Hymenostomatida čeleď Tetrahymenidae
• Obrvený protozoální organismus • Obrvenky vykazují výrazný jaderný dimorfismus – Jedno velké jádro – somatické macronucleus – Jedno malé jádro sloužící k rozmnožování • Modelový organismus pro mnoho genetických experimentů, pro biochemické analýzy i pro studium enzymatických dějů. 4
Tetratox - Test na obrvenkách • Růstový test – měření nárůstu koncentrace jedinců v testované kultuře • Odezva – měření zákalu = nárůst koncentrace organismů • Nárůst koncentrace organismů se určuje buď spektrofotometricky (absorbance při 540 nm) nebo počítačem částic (electronic particle counting). – Pro jednoduchost a přístrojovou nenáročnost je rozšířenější spektrofotometrie • Podmínky testu: – Počáteční koncentrace buněk 1000 - 5000 ks/ml. – Teplota 27 ± 1°C – pH musí být pufrováno na 7,4 (citlivý organismus na výkyvy pH) – Expozice 40-72 hodin 5
ProToxKit - Test na obrvenkách • Inhibice příjmu potravy – měření úbytku množství potravy – obrvenky přijímají potravu konstantní rychlostí
• Expozice – 24 hodin, teplota 30ºC • Populace obrvenek inhibovaná přítomností toxické látky přijímá menší rychlostí potravu a tudíž dochází ke zpomalení rychlosti úbytku potravy v testované kultuře. • Úbytek potravy se stanovuje spektrofotometricky
6
ProToxKit • Komerční test ProToxKit – Sada potřebných pomůcek – Kyvet – Organismálních kultur – Vše potřebné pro test je přítomno v kitu. – Lze ihned začít s testem – odpadá kultivace organismů či čekání na jejich vylíhnutí či reaktivaci.
7
Spirotox • Test Spirotox může být vhodný pro testování toxických účinků látek rozpustných ve vodě, povrchových i pitných vod. • Může být použit pro testování odpadních vod před a po procesu čištění.
• Pro testování pórové vody sedimentů • Testování těkavých látek – Po umístění organismů do mikrodestiček lze kultury uzavřít a zamezit výměně plynů.
8
Testovací organismus • Spirostomum ambiguum je velký nálevník dosahující rozměrů až 2-3 mm říše Protozoa – prvoci kmen Ciliophora – nálevníci třída Polyhymenophorea – mnohoblanní řád Heterotrichida – různobrví čeleď Spirostomidae
• Schopný přežít až 6 týdnů bez potravy při teplotě 5- 28°C • S. ambiguum je pH tolerantní organismus pro oblast 5 – 8. Může být použit v tomto rozmezí pro testování vztahů toxicity a pH.
9
Kultivace organismů v laboratoři • Spirostomum ambiguum je velmi citlivý na přítomnost kovů v kultivačním médiu – nutná je deionizovaná voda (Cu) • Kultivace se provádí v cca 5 litrových akváriích při teplotě 15 - 25°C v temnu či při matném světle. • Potrava: ovesné vločky + sušené olšové listí (50:1) – Olšové listí se používá jako prevence před rozvojem hub – Mohou být použity i jiné listy obsahující tanin – Eventuelně samotný tanin
10
Průběh testu • Test se provádí ve 24-jamkových mikrodestičkách (6 x 4 jamek). • V testu se sledují 2 odezvy (mikroskopicky) – Subletální – deformace, zkracování, immobilizace – Letální • Do každé jamky se umístí 10 organismů • Expozice 24 hodin (prodloužením na 48 hodin lze zvýšit citlivost) – U některých vzorků postačuje 21 hodinová expozice – zejména na organické látky reaguje rychle a korelace mezi 2 a 24 hodinovou odezvou je dobrá
11
Pozorované odezvy • Subletální: ohýbání, zkracování, immobilizace
• Letální: autolýza – Po autolýze dochází k rychlému rozkladu a vymizení organismů – nutná přesná znalost počtu jedinců na začátku testu
– Uhynulý S. ambiguum:
12
Test toxicity na řasách • Test slouží k zjištění nepříznivých účinků testovaných látek na jednodušší autotrofní organizmy, na řasy - primární producenty. • Test je díky rychlému množení řasové suspenze možné uspořádat jako akutní i jako chronický. • Je schopen zaznamenat nejen inhibiční působení látek, ale i jejich stimulační účinky. • Test spočívá v měření nárůstu řasové biomasy či růstové rychlosti v jednotlivých testovaných koncentracích ve srovnání s kontrolou.
13
Mezinárodní standardy • Test No. 201: Alga, Growth Inhibition Test OECD Guidelines for the Testing of Chemicals
• ČSN EN ISO 8692:2004 Jakost vod. Zkouška inhibice růstu sladkovodních zelených řas. ČNI Praha, 2005, s.18.
14
Expozice řas
15
Řasové kultury po expozici
16
Jako zkušební organismus lze použít tyto planktonní sladkovodní řasy: a) Raphidocelis subcapitata (Selenastrum capricornutum; Pseudokirchneria) a) Chlorella kessleri b) Desmodesmus subspicatus (Scenedesmus) c) Scenedesmus quadricauda d) Chlamydomonas reinhardtii 17
Chlorokokální řasy
18
Rozmnožování řas • Rozmnožování se děje autospórami, jež se uvolňují otvorem nebo zeslizovatěním mateřské buněčné stěny.
• Autospora: nepohlavní výtrus jednobuněčných řas ve tvaru dospělé buňky, vytvořený uvnitř plasmatické membrány mateřské buňky
19
Podmínky testu toxicity na řasách • Sledovaná odezva: Inhibice růstu řasové suspenze ve srovnání s kontrolou • Podmínky testu: – Kultivační box sycen vzduchem o 2% objemových CO2 – Osvětlení: 6000 lux, homogenní – Teplota: Dle druhu řasy, 27-35°C
• Opakování: 2-3 paralelky • Objem v jedné kultuře: 100 ml (20-50 ml; 0,25 ml) • Koncentrace řasové suspenze: Na začátku testu 80-100 tisíc buněk/ml • Doba expozice: minimálně 72 hodin, optimum - déle do překonání exponenciální fáze růstu • Při expozici delší než cca 96 hodin lze test při tomto způsobu vyhodnocování považovat za chronický 20
Zjišťování efektu
• Počet jedinců na ml – Mikroskopem – počítací komůrky – počítač částic – Spektrofotometricky pomocí konverzních křivek ze zákalu při 750 nm • Koncentrace chlorofilu – spektrofotometricky 682 nm, fluorescenčně • Celková sušina (biomasa) – spektrofotometricky pomocí konverzních křivek ze zákalu při 750 nm
21
Určování biomasy řas • Biomasa: asi ekologicky nejrelevantnější parametr • Vzhledem k malým množstvím (navážkám řasové sušiny) v testu obtížně stanovitelné • Používají se zástupná měření – převoditelná na biomasu • Nejčastěji se používá určení koncentrace buněk na ml (mikroskopicky, spektrofotometricky (zákal, chlorofyl), počítač částic) a následné převedení pomocí konverzních křivek na biomasu • Biomasa řas se určuje v několika časových intervalech : 24, 48, 72, 94 a více hodin – dle délky a účelu testu
22
Příklad konverzní křivky
23
Růstové křivky 1200
koncentrace buněk, ks/ml
1000
800
3000 1000 300 100
600
10 Kontrola
400
200
0
0
100
200
300 hod
400
500
600
24
Výpočet dose-response křivky A) Růstové rychlosti B) Konečná koncentrace buněk C) Plochy pod křivkou
koncentrace řas, ks/ml
900000
600000
300000
0 0 Kontrola Toxikant
20
40
60
80
100
doba 25
A) Růstové rychlosti • Průměrná růstová rychlost charakterizuje růst řasové kultury po celou dobu expozice
• Kromě průměrné růstové rychlosti lze určovat i rychlosti v určitých fázích testu – např. za účelem sledování prodloužení lagové fáze – Odchylky od tvaru růstové křivky v kontrole bývají citlivějším parametrem toxických účinků
ln N 2 ln N1 t 2 t1
• • • • •
µ= růstová rychlost, den-1 N1 = koncentrace řas na počátku zvoleného časového intervalu N2 = koncentrace řas na konci zvoleného časového intervalu t2 = čas na konci testu t1 = čas na začátku testu 26
B) Konečná koncentrace buněk • Pro výpočet IC50 lze použít hodnotu koncentrace buněk na konci testu, neboli výtěžek.
• Od konečné hodnoty koncentrace buněk se odečítá inokulum na začátku testu (byť se jedná o velmi malou hodnotu vzhledem ke koncové koncentraci). • IC50 se většinou určuje pro expozici 24, 48,72 a 96 hodin.
27
C) Plochy pod křivkou • Plocha pod růstovou křivkou odpovídá celkovému nárůstu biomasy
Ai
c1 c0 t1 c1 c2 2c0 t2 t1 cn1 cn 2c0 tn tn1 2
2
• Ai
plocha pod růstovou křivkou pro danou koncentraci
• c0
jmenovitá počáteční koncentrace cenobií [ks/ml]
• c1
změřená koncentrace cenobií v čase t1 [ks/ml]
• cn
změřená koncentrace cenobií v čase tn [ks/ml]
• t1
doba prvního měření od počátku testu [dny]
• t2
doba n-tého měření od počátku testu [dny]
2
28
Výpočet IC50 • Hodnoty inhibice (stimulace) pro jednotlivé testované koncentrace se počítají dle vzorce:
CX I 100 C • I inhibice, % • C průměrná hodnota koncentrace buněk (růstové rychlosti) v kontrole • X průměrná hodnota koncentrace buněk (růstové rychlosti) v jednotlivých koncentracích toxikantu. • Stimulace je záporná hodnota inhibice.
29
Křivka dávka-odpověď řasového testu
100
Inhibice růstové rychlosti, % .. .
50 0 -50 -100 -150 -200 -250 1
10
100 c, mg.l-1
1000
10000
Z
P
30
Faktory ovlivňující růst řas a výsledky testu • Zabarvené či zakalené vzorky toxikantů snižují přístup světla k řasovým buňkám a tudíž snižují účinnost fotosyntézy – to může ovlivnit růst populace buněk mnohem výrazněji než samotné toxické účinky látek. • Těkavé látky mohou opustit testované nádoby a tudíž dochází k podhodnocení jejich účinků (kultury nelze hermeticky uzavřít, neboť řasy potřebují výměnu plynů pro fotosyntézu. • Některé materiály (mikrodestičkový test) mohou chelatačně vázat nutrienty nutné pro růst řas – dochází opět k inhibici v důsledku nepříznivých podmínek a teprve v druhé řadě v důsledku toxického působení toxikantu.
31
Mikrodestičkový řasový test • Používají se 96 jamkové mikrodestičky, kde je každá jamka samostatnou populací řas. • Jamky mají objem 200-250 µL. Dávkuje se pouze 10 µL živného roztoku a 10 µL řasového inokula.
32
Mikrodestička
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Destilovaná voda
A B
Kontrola
C D
Koncentrační řada toxikantu bez řas
E F G
Koncentrační řada toxikantu s řasami
H
33
AGP – Algal growth potential Stanovení trofického potenciálu • Slouží ke stanovení trofického potenciálu, úživnosti. • Odpadní vody – nebezpečí rozvoje eutrofizace • Měření stimulace růstu řasové suspenze ve srovnání s kontrolou při expozici známou koncentrací vzorku
• Může nastat limitace živinami –důraz je kladen na CO2.
34
