Biotechnologicky významné organismy
Tvorba astaxantinu u Haematococcus
Haematococcus
Třída: Chlorophyceae
řád: Chlamydomonadales syntetizuje chlorofyl a, b a primární karotenoidy typické pro Chlorophyceae a cévnaté rostliny (-karoten, lutein, violaxantin, neoxantin a zeaxantin). Za určitých růstových podmínek začnou vegetativní buňky syntetizovat astaxantin (sekundární karotenoid) morfologické a fyziologické změny (bičíky, omezení toku elektronů)
Wayama et al. 2013
Astaxantin se u Haematococcus vyskytuje ve formě mono- a di-esterů mastných kyselin a tvoří až 95 % sekundárních karotenoidů
Produkce astaxatinu u jiných druhů řas
H. lacustris=pluvialis
Haematococcus Životní cyklus Haematococcus pluvialis vhodné médium
Elliot, 1934
Po přemístění do vhodného prostředí se z tlustostěnných akinet bičíkaté zoospory, které rostou a dělí se (disperzní fáze). Bičíkovci zastaví dělení po proběhnutí 5 životních cyklů, pak se změní na nepohyblivé kulovité buňky (palmeloidní stádium). Nepohyblivé buňky pokračují v růstu a dělí se tvorbou aplanospor dalších cca 200 hodin. Produkční fáze - dochází k rychlému nárůstu biomasy a zvyšuje se obsah astaxantinu. Buňky stárnoucích kultur vytváří silnou stěnu a mění se v červené odpočívající akinety.
Biosyntéza astaxantinu kyselina mevalonová
prekurzor sec.karotenů
Collins et al. 2011
A–D. Flagellated motile cell.
E–H. Palmella stage cell under noninductive conditions I–L. Palmelloid cell under inductive conditions for 24 hours M–P. Large red cyst (aplanospore). In all images the scale bar represents 10 mm.
Lokalizace astaxantinu v buňkách Pigment přítomen v lipidových globulích v cytoplasmě (mimo chloroplast). Astaxantin se hromadí v cytoplasmě palmelových buněk a akinet. Primárně se ukládá v okolí jádra (červený střed a zelená periferie). Při vyšší světelné intenzitě se červený pruh kolem jádra rozšíří, případně zaplní celou cytoplasmu. Je-li zdroj světla eliminován, karotenoid migruje zpět do centra buňky. Cytoplasma starých buněk je zcela zaplněna astaxantinem.
Parametry ovlivňující akumulaci astaxantinu intenzita světla živiny (N, P, poměr C/N) přidání kovových iontů (Fe2+) zvýšená salinita teplota pH
Ionty Fe reagují s peroxidem vodíku (Fentonova reakce) a dávají vznik volným radikálům .OH
Fe2+ + H2O2
Fe3+ + .OH + OH-
Ochranná funkce sekundárních karotenoidů
chlorofylové triplety
singletní kyslík
primární - součástí fotosyntetického aparátu
Indukce mutagenů a fůze protoplastů Herbicidy norflurazon a fluridon (bleaching herbicides) specificky inhibují fytoen desaturázu.
Norflurazon
Fluridone
Fůzí protoplastů byly získány polyploidní hybridy Haematococcus. U polyploidů Fs6.1 a Fs6.5 bylo zjištěno trojnásobné množství astaxantinu (120 pg/buňku) oproti výchozímu kmenu.
Pěstování Haematococcus pluvialis ve 30 litrovém bioreaktoru. Projekt EU: hledání nových zdrojů přírodního astaxantinu pro akvakultury. Využití pro pigmentaci masa lososů a korýšů.
Algatech - Israel Velkoplošné kultivace – uzavřené fotobioreaktory v Negevské poušti
„červená“ fáze akumulace astaxantinu
Čína BGG, Yunnan Province
Hawaii-based Maui Tropical Algae Farm (MTAF)
Čína - Jingzhou Natural Astaxanthin Inc.
Usušená řasová biomasa Haematococcus pluvialis
Velkoplošná kultivace v otevřené nádrži (Indie)
Cyanotech - Hawai
Dunaliella Dunaliella (Chlorophyceae) má vejčité buňky (na bázi širší, v apikální části užší) 2-8 m x 5-15 m s dvěma stejně dlouhými bičíky. Velikost a tvar buněk jsou ovlivněny podmínkami vnějšího prostředí. Nepohlavně se dělí podélným dělením. Pohlavní proces: isogamie. Známy homothalické i heterothalické kmeny. Po splynutí vzniká tlustostěnná zygota. Po meiozi se otvorem v zygotě uvolní bičíkovci.
Ultrastruktura Nemá kontraktilní vakuoly!!!
Halotolerance Dunaliella preferuje vodní prostředí se salinitou větší než 2M (10 %). Typicky lze jednodruhové kultury Dunaliella nalézt v hypersalinních jezerech jako je Mrtvé Moře (Israel), Great Salt Lake (Utah, USA), Pink Lake (Austrálie). Dosud nebyl zjištěn žádný eukaryontní organismus s vyšší halotolerancí.
Pink Lake (západní Austrálie) hypersalinní jezero s Halobacterium
Lake Retba, Senegal
An extremely salty lake in Western Australia showing a bloom of Dunaliella. The red colour is due to beta-carotene, which is produced commercially using Dunaliella and sold in tablet form as a vitamin supplement.
The orange color of Laguna Colorada is due to a type of microalgae (Dunaliella salina)
Glycerolový cyklus Calvinův cyklus
glykolýza
Produkce β-karotenu Pouze u Dunaliella bardawil a Dunaliella salina byla zjištěna schopnost produkovat velké množství -karotenu, pokud jsou pěstovány za vhodných podmínek (vysoká salinita, vysoká světelná intenzita, nedostatek N).
Lokalizace β-karotenu v buňkách
β-karoten se nachází v lipidových globulích v prostoru mezi thylakoidy na okraji chloroplastu. U ostatních rostlin a řas s nízkým obsahem β -karotenu je tento lokalizován uvnitř thylakoidů.
Extenzivní kultivace The large open ponds used for the culture of Dunaliella salina at Hutt Lagoon, Western Australia, by Congnis Nutrition and Health. The largest ponds are about 250 ha in area.
Sea salt salinas with halobacteria and Dunaliella, San Francisco Bay, California, 1999
saliny Krym
saliny Sečovlje Slovinsko
Intenzivní kultivace N.B.T. Ltd has been cultivating the unique line of Dunaliella bardawil which can produce the huge amounts of multi carotenoid. The cycle of pure cultivating Dunaliella is about 10 days.
Israel - Eilat Cultivated Dunaliella separated by centrifugation to get the paste, and the paste spray dried to make the powder and then, delivered to all over the world.
Produkty
β-karoten je využíván na obarvování potravin, jako provitamin A v krmivu i potravě, jako kosmetické aditivum a v multivitaminových preparátech.
The Rise and Fall of -Carotene Prof. Omenn 1998 Could Synthetic -Carotene Be the Real Problem?
Carotenoid Isomers, HPLC Analysis Dunaliella -carotene, 9-cis & all-trans
Synthetic all-trans-Carotene Low fat solubility crystals
Synthetic β-Carotene Orange Drinks
Hoffman-La Roche synthesis is C19 + C2 + C19
PHYTOENE-RICH DUNALIELLA The Weizmann Institute Israel
The Response of b-carotene and Phytoene to Norflurazon
Mutagen - Norflurazon –specificky inhibuje phytoen desaturazu
Phytoene Dunaliella Micro-Ponds (50L) The Weitzman Institute
NBT Ltd., Eilat, Israel, Scale-up ponds (60 m3 )
Production Pond (600 m3 )
Dunaliella capsules
Arthrospira
Spirálově stočená vlákna bez slizové pochvy. Vlákna většinou nepohyblivá, příležitostně rotační pohyb. Každá buňka má dobře patrné příčné přepážky a zřetelné póry v BS. Buňky více méně isodiametrické nebo kratší než širší, často s aerotopy.
Arthrospira Apikální a koncové buňky jsou okrouhlé nebo cylindrické někdy s kalyptrou nebo ztloustlou BS. Thylakoidy jsou radiálně uspořádané. Některé kmeny halotolerantní. Rozmnožování fragmentací na hormogonie nebo tvorbou nekrotických buňek.
Buněčné přepážky a thylakoidní membrány
Povrch, četné granule
Arthrospira
Spirulina
A. platensis
A. maxima
A. maxima a A. fusiformis jsou známy jako Spirulina platensis a komerčně se pěstují. Arthrospira je jednak alkalifilní (pH kolem 10) a jednak termofilní – optimum 35-37ºC.
jezero Texcoco, Mexiko, Sosa Texcoco – produkce Na CO3
Earthrise Company, Kalifornie USA
https://www.youtube.com/watch?v=qfCBDyPiTS4 https://www.youtube.com/watch?v=U6cslNtc6P4 https://www.youtube.com/watch?v=ezNaZnCuPdA
Cyanotech Corporation on the Big Island of Hawaii, USA
Chemické látky z Arthrospira Vysoké hladiny PUFAs (- linolenic acid) a pigmentů (fykocyanin, myxoxantofyl, zeaxantin).
Lipidy 6-13 %, polovina MK Monogalaktosyldiacylglycerol (MGDG)
Fosphatidylglycerol (PG)
Sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG)
-linolenová kyselina 18:3n-6 (GLA)
nenasycená mastná kyselina (PUFA) •účinně snižuje hladinu cholesterolu •využití při léčení atopických ekzémů •zmírnění příznaků premenstruačního syndromu •předpokládá se také pozitivní vliv na srdeční choroby, Parkinsonovu nemoc a roztroušenou sklerózu 1968 se zjistilo, že Arthrospira je jedinečná v obsahu GLA (nejbohatší řasový zdroj).
Obsah mastných kyselin u kmenů rostoucích při různých teplotách
Obsah GLA u mutantů Arthrospira pěstovaných za stálého světla a L/D
Obsah GLA a MK u mutantů pěstovaných venku a uvnitř
Environmentální podmínky mají zásadní vliv na složení a obsah MK. Optimalizací podmínek lze dosáhnout max. obsahu a produkce GLA.
Podmínky prostředí
Obsah GLA
poznámka
teplota
optimum 30 – 35 C
podm. pro optimální růst (log fáze)
max. lipidů
L/D cyklus
koncentrace dusíku pěstování venku
produkce
polárních
celkově tuky, složení MK se nezměnilo
Zvýšení obsahu GLA použitím inhibitorů Herbicidy piridazinonové skupiny (např. Norflurazon, SAN 9785) inhibují desaturaci MK. SAN 9785 inhibuje 6 desaturázu (přeměnu 18:2 na GLA)
norflurazon
Selekce rezistentních kmenů – některé kmeny skutečně s vyšší produkcí GLA (v přítomnosti i nepřítomnosti inhibitoru)
Pigmenty Karotenoidy Pigmentové složení typické pro sinice. Chlorofyl a, karotenoidy (myxoxantofyl, -karoten, zeaxantin, oscillaxantin).
Fykobiliproteiny
c-fykocyanin u Arthrospira platensis
- největší ekonomický potenciál, už z Arthrospira komerčně vyráběny (Japonsko). Arthrospira má 2 fykobiliproteiny: c-fykocyanin a allofykocyanin (fykocyanin může tvořit až 20 % všech proteinů, pravděpodobně slouží jako zásobní látka).
Přírodní barvivo Lina Blue
Zjištěné léčebné účinky Arthrospira
• redukuje poškození jater vlivem užívání drog a dlouhodobým působením těžkých kovů. • zmírňuje projevy artritidy – protizánětlivý a antioxidativní účinek c-fykocyaninu
Využití Arthrospira v programu proti podvýživě
Program World Health Organisation United Nations (1993) 3 experimentální projekty: Karla, Indie – integrovaný systém San Clemente, Peru – projekt ukončen pro politické nepokoje Farende, západní Afrika pěstování Arthrospira Eleusine coracana (Poaceae)
200 tablet/18 USD
180 tablet/33USD
Aquamole—Fresh Spirulina dip for chips, crackers and breads. By Denise Fox, France. http://www.algaeindustrymagazine.com/the-future-of-algae-pt-2/
Spirulina Paste candy
http://goodnessgreen.com/goodness-green-spinach-kiwispirulina-smoothie/
http://pureglutton.com/lunar-luxuries-intercontinental-kuala-lumpur
Chlorella Jednobuněčná zelená kokální řasa, kulovitý až elipsoidní tvar, parietální chloroplast s pyrenoidem. Vysoká růstová rychlost – oblíbený modelový organismus. Na chlorele Melvin Calvin studoval temnostní fázi fotosyntézy. Chlorella má ze všech dosud studovaných organismů nejvyšší obsah chlorofylu. Které druhy se používají pro velkoplošné kultivace?
Kultivace Chlorella
Kruhovité kultivační nádrže (Taiwan) Kultivační jednotky v Třeboni
USA, Japonsko, Taiwan, Holandsko, Německo, Israel, Česká republika, Bulharsko.
Zjištěné léčebné účinky Chlorella • chlorofyl protizánětlivé účinky, podporuje hojení ran • proti zácpě (vláknina, chlorofyl) • eliminace těžkých kovů a jiných jedů • léčba chudokrevnosti (chlorofyl, Fe, kyselina listová, vitamin B12) • protinádorová aktivita Ch. vulgaris. Růst fibrosarkomu u myší byl inhibován injekcí chlorelového extraktu • zlepšuje trávení, podporuje metabolismus • obsahuje anti-oxidant karoten • podporuje imunitní systém • pomáhá proti hypertenzi
Taiwan 500 tab/25 USD
Chlorelový med Malaisie
300 tablet /15 USD USA
Dávkování 6 tablet denně, zvýšit až na 20 Vláknina, Chlorella, probiotické bakterie Česko 225 tablet/240 Kč DDD 15 tab.
Rusko
Nostoc flagelliforme
Pouštní krusty severní a SZ Číny
N. pruniforme
Nostoc commune
Výživa Konzumace mikrořas má v určitých místech dávnou tradici, ale na světový trh se rozšířily teprve v posledních 30 letech. Mezinárodní organizace Protein-Calorie Advisory Group of United Nations (PAG) a International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) vytvořily soubor doporučení, které by měl produkt na trhu splňovat. 1. Obecná charakteristika a. Popis kmene a jeho biologických vlastností, vyloučení škodlivosti organismu a deklarace čistoty kultivovaného kmene b. Charakteristika substrátu, živin a dalších látek použitých v kultivačním procesu. c. Podmínky sklizně a dalšího zpracování d. Stabilita produktu a zajištění hygienických podmínek
Výživa 2. Chrakteristika produktu a. Morfologický popis b. Fyzikální vlastnosti c. Detailní chemické složení
3. Zjištění výživné hodnoty na pokusných zvířatech (hlodavci) a. Biologická hodnota (Biological value – BA) b. Protein efficiency ratio (PER), koeficient stravitelnosti (digestibility coefficient – DC) c. Energie získaná strávením produktu (metabolizable energy) d. Vlastnosti produktu jako potravinového doplňku
4. Testy na cílové skupině zvířat (těch, které se budou řasami krmit) a. Přijatelnost jako potrava b. Určení maximálního množství, které lze přidávat jako doplněk k potravě c. Testování případných vedlejších účinků
Výživa 5. Hodnocení míry bezpečnosti produktu a. Analýza kontaminace různými polutanty b. Studie týkající se bakteriálních a plísňových kontaminací c. Krátkodobé studie na hlodavcích, prasatech, ptácích aj. krmených produktem d. Dlouhodobé studie testující karcinogenitu a mutagenitu na dvou různých druzích zvířat e. Studium vlivu na reprodukci f. Multigenerační studie
6. Klinické studie na lidech
Powell et al. 1965
Vliv sušení biomasy na výživnou hodnotu proteinu
Obecně: Řasy a sinice, které jsou považovány za hodnotný zdroj proteinu (Scenedesmus, Chlorella, Arthrospira) mají vysokou výživnou hodnotu a pokud jsou vhodně zpracovány, jsou plně stravitelné. Kvalita proteinů je vysoká v porovnání s ostatními rostlinnými proteiny a dosahuje 80 % kaseinu.
Protein efficiency ratio
A - kontrola kasein (10 % protein) C - S. o., sušený na slunci (10 % protein) B - Scenedesmus obliquus, bubnově D - S. o., sušený na slunci, povařený (10 %) sušený (10 % protein) E - S. o., bubnově sušený (20 % protein)
PER aneb jak vykrmit krysy
Toxikologické studie zahrnují krátkodobé a dlouhodobé studie, kdy jsou řasovou biomasou krmeni hlodavci a jiná zvířata. Zkoumána je přítomnost toxických látek.
biogenní toxiny - syntetizované buňkou nebo tvořeny ukládáním metabolitů Nukleové kyseliny Za určitých podm. mohou být biogenními toxiny nukleové kyseliny. Obsah NK u řas a sinic 4-6 % sušiny. Doporučená dávka max. 2g NK z nekonvenčních zdrojů (řas), celková denní dávka NK by neměla překročit 4g. Pokusy prokázaly mizivý vliv konzumace řas na hladinu kys. močové v plasmě. (kontrolní skupina, pokusná skupina po každém jídle přidáno 7g bubnově sušeného Scenedesmus)
Feoforbid v 1977 byly pozorovány vyrážky a svědění kůže po konzumaci Chlorella. Feoforbid vzniká při degradaci chlorofylu. Minimální efektivní dávka, která vyvolá dermatitidu je 25 mg/den. Experimenty na hlodavcích LD50 – 455mg /kg těles. hmotnosti/den.
chlorofyl
feofytin
chlorofyláza
feoforbid
Chlorofyláza je do určité míry schopná přežít zvýšenou teplotu – zůstává aktivní v řasových buňkách sušených za nízké teploty. Její aktivita se zvyšuje za vlhka (nevhodné skladování).
abiogenní toxiny - environmentální kontaminanty, především antropogenního původu; dostávají se do buňky zvenčí, jsou buňkou akumulovány Těžké kovy Většina mikroorganismů má schopnost akumulovat těžké kovy Kontaminanty se do média dostávají ze vzduchu (pokud jsou kultivace na znečištěných územích), příp. používáním kontaminované vody. Vysrážení kadmiových a olověných iontů při zásaditých podmínkách, ty pak mohou být “sklizeny” spolu s řasovou biomasou. Organické látky Polychlorované bifenyly, polycyklické aromatické uhlovodíky, zbytky pesticidů. Existuje jen velmi málo publikací. Pokud nejsou kultury ošetřovány pesticidy, možnost kontaminace je minimální.
Powell et al. 1965
Chlorella v ČR Velkoplošné kultivace MBÚ AVČR Třeboň Opatovický Mlýn
Česká značka Queen Euniké přírodní doplňky – přidána chlorela z MBÚ Třeboň
Rapeto a.s. je česká firma – doplňky stravy
