Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin
Vliv konzumace fermentovaných mléčných výrobků na modulaci střevní mikroflóry Diplomová práce
Vedoucí práce: Ing. Doubravka Rožnovská, Ph.D.
Brno 2012
Vypracovala: Bc. Miroslava Daňková
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Vliv konzumace fermentovaných mléčných výrobků na modulaci střevní mikroflóry vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne………………………………………. podpis diplomanta……………………….
PODĚKOVÁNÍ Děkuji Ing. Doubravce Rožnovské, Ph.D. za odborné a vlídné vedení, rady a čas, který mi při zpracování diplomové práce věnovala. Děkuji Ing. Pavle Sládkové, Ph.D. a Ing. Miroslavě Kolářové za odborné rady a vedení praktické části diplomové práce. Zvláště pak děkuji Ing. Kolářové za poskytnutí dílčích výsledků její disertační práce. Děkuji za finanční podporu IGA MENDELU IP 19/2011. Děkuji i společnosti Hollandia Karlovy Vary a.s za poskytnutí vzorků a všem dobrovolníkům, kteří se zúčastnili pokusu. Současně děkuji své rodině a příteli za podporu a trpělivost během studia.
ABSTRAKT Vliv konzumace fermentovaných mléčných výrobků na modulaci střevní mikroflóry Diplomová práce se zabývá problematikou složení lidské střevní mikroflóry a jejím ovlivněním za pomocí kysaných mléčných výrobků. Bližší pozornost je v praktické části věnována počtu bakterií rodu Enterococcus, Bifidobacterium a Lactobacillus acidophilus ve střevech, který je ovlivněn konzumací probiotických a synbiotických jogurtů. Pro experiment byly vytvořeny tři skupiny dobrovolníků. V každé skupině bylo zapojeno 22 studentů. Experiment trval 38 dní. Byl rozčleněn do tří fází: adaptační, konzumace, doznívání. Skupina kontrolní po dobu pokusu nekonzumovala žádné kysané mléčné výrobky, skupina probiotická konzumovala jogurt s probiotickou kulturou a skupina
synbiotická konzumovala jogurt s probiotickou kulturou
a s přídavkem inulinu. V průběhu pokusu byly odebírány vzorky stolice, které byly podrobeny mikrobiologickému vyšetření na selektivních živných půdách. Po zahájení konzumace jogurtů se zvýšil počet bakterií ve vzorcích stolice u všech tří bakteriálních rodů. Mezi 14. a 21. dnem konzumace se počet bifidobakterií i laktobacilů postupně snižoval, pokles pokračoval i v době doznívání. U enterokoků se počet začal snižovat až v době doznívání (po 21. dnu). U synbiotické skupiny se počet bifidobakterií začal snižovat také až ve fázi doznívání, což naznačuje pozitivní vliv inulinu v jogurtu. Klíčová slova: střevní mikroflóra, kysané mléčné výrobky, probiotika, prebiotika, synbiotika
ABSTRACT The effect of consumption of fermented dairy products according to the modulation of intestinal microflora
This thesis deals with the composition of human intestinal microflora and how it is affected by fermented dairy products. The practical part is dedicated to variaty of bacteria of the genus Enterococcus, Bifidobacterium and Lactobacillus acidophilus in the bowel which is affected by consumption of probiotic and symbiotic yoghurt. There were created three groups of volunteers for the experiment. In each group were involved 22 students. The experiment lasted 38 days. It was divided into three phases: adaptation, consumption and subside. Control group did not consume fermented dairy products during the experiment, the second group consumed probiotic yoghurt with probiotic cultures and synbiotic group consumed yoghurt with probiotic cultures and appended inulin. During the experiment stool samples were colected. Those were used to microbiological testing on the selective nutrient soils. After the initiation phase of the consumption of yoghurt has increased the number of bacteria in fecal samples from all three bacterial genera. Between the 14th and the 21st day of consumption the number of bifidobacteria and lactobacillus gradually decreased, the decrease continued even during the subside phase. As for enterococcus, the number began to decrease in the subside phase (after 21. days). In synbiotic group, the number of bifidobacteria also decreased in the subsidie phase, and that indicates a positive effect of inulin.
Key words: intestinal microflora, fermented dairy products, probiotics, prebiotics, synbiotics
OBSAH 1
ÚVOD ..................................................................................................................... 10
2
CÍL PRÁCE ............................................................................................................ 11
3
LITERÁRNÍ PŘEHLED ........................................................................................ 12 3.1
Fermentované (kysané) mléčné výrobky ......................................................... 12
3.1.1
Biologická hodnota a dietetický význam .................................................. 12
3.1.2
Dělení kysaných mléčných výrobků ......................................................... 13
3.1.3
Dělení podle použitých mikroorganismů .................................................. 13
3.1.4
Základní tržní skupiny .............................................................................. 14
3.1.5
Hlavní stupně výroby fermentovaných mléčných výrobků ...................... 16
3.2
Bakterie mléčného kysání ................................................................................ 19
3.2.1
Vlastnosti a využití bakterií mléčného kysání .......................................... 20
3.2.2
Dělení bakterií mléčného kysání............................................................... 20
3.2.3
Vybrané rody bakterií mléčného kysání ................................................... 21
3.3
Čisté mlékárenské kultury ................................................................................ 24
3.3.1 3.4
Trávení ............................................................................................................. 25
3.5
Střevní mikroflóra člověka ............................................................................... 26
3.5.1 3.6
4
Jogurtová kultura ...................................................................................... 24
Osídlení střevního traktu ........................................................................... 28
Probiotika, prebiotika, synbiotika .................................................................... 30
3.6.1
Probiotika .................................................................................................. 31
3.6.2
Prebiotika .................................................................................................. 40
3.6.3
Synbiotika ................................................................................................. 44
MATERIÁL A METODIKA.................................................................................. 45 4.1
Materiál ............................................................................................................ 45
4.1.1
Jogurty Hollandia ...................................................................................... 45
4.1.2
Kultivační média ....................................................................................... 45
4.1.3
Roztoky ..................................................................................................... 45
4.1.4
Přístroje a pomůcky .................................................................................. 46
4.1.5
Vzorek ....................................................................................................... 46
4.2
4.2.1
Příprava experimentu ................................................................................ 47
4.2.2
Průběh experimentu .................................................................................. 47
4.2.3
Harmonogram experimentu ...................................................................... 48
4.2.4
Odběr vzorků ............................................................................................ 49
4.2.5
Mikrobiologická analýza vzorků stolice a měření pH jogurtů ................. 49
4.2.6
Stanovení rodu Bifidobacterium ............................................................... 49
4.2.7
Stanovení bakterií rodu Enterococcus ...................................................... 50
4.2.8
Stanovení bakterií rodu Lactobacillus acidophilus .................................. 51
4.2.9
Vyhodnocení ............................................................................................. 53
4.2.10
Rodová a druhová identifikace ................................................................. 53
4.3 5
6
Metodika .......................................................................................................... 47
Statické vyhodnocení ....................................................................................... 56
VÝSLEDKY ........................................................................................................... 56 5.1
Stanovení mikroorganismů ve vzorcích stolice ............................................... 56
5.2
Stanovení pH jogurtů ....................................................................................... 60
DISKUZE ............................................................................................................... 61 6.1
Vliv konzumace jogurtů na celkový počet bakterií Enterococcus ................... 63
6.1.1
Výsledky našeho experimentu .................................................................. 63
6.1.2
Výsledky jiných studií v porovnání s naším pokusem ............................. 63
6.2
Vliv konzumace jogurtů na celkový počet bakterií Bifidobacterium a
Lactobacillus acidophilus ........................................................................................... 64 6.2.1
Výsledky našeho experimentu u bakterií Bifidobacterium ....................... 64
6.2.2
Výsledky našeho experimentu u bakterií Lactobacillus acidophilus ....... 64
6.2.3
Výsledky jiných studií v porovnání s naším pokusem ............................. 64
7
ZÁVĚR ................................................................................................................... 66
8
POUŽITÁ LITERATURA ..................................................................................... 67
9
SEZNAM TABULEK A OBRÁZKŮ .................................................................... 73
1
ÚVOD
Dnešní uspěchaný životní styl spolu s dalšími faktory, jako je charakter stravy, užívání léků může mít negativní vliv na složení a správnou funkci střevní mikroflóry. Některé potraviny neplní jen funkci dodavatele základních živin, ale mají i pozitivní účinky na zdraví. Takovým potravinám se říká funkční. Patří mezi ně zakysané mléčné výrobky s přídavkem živých bakterií mléčného kvašení. Jedná se především o bakterie z rodů Lactobacillus, Bifidobacterium a Streptococcus. Kysané mléčné výrobky mají velmi dlouhou výrobní tradici. Jedná se o různé jogurty, acidofilní, kefírová nebo jogurtová mléka, kysanou smetanu, podmáslí, mléčný zákys apod. Kysané mléčné výrobky mají relativně nízkou energetickou hodnotu, jsou bohatým zdrojem plnohodnotných bílkovin, vápníku, fosforu a různých vitaminů. Velmi významné jsou především kysané mléčné výrobky s přídavkem probiotických bakterií (zástupci z rodu Lactobacillus a Bifidobacterium). Probiotické bakterie působí blahodárně na zdraví tím, že zlepšují mikrobiální rovnováhu v zažívacím traktu. Kultury bakterií musí být schopné přežít průchod trávicím traktem a dále musí být schopné se ve střevě množit. Je prokázané, že zmírňují obtíže způsobené změnou složení střevní mikroflóry např. při léčbě antibiotiky, infekcích trávicího traktu, při stresu a stárnutí. Výsledkem pravidelné konzumace kysaných mléčných výrobků pak bývá náprava symptomů, jako je průjem a zácpa. Za tzv. terapeutické minimum je spotřebitelům doporučována denní konzumace alespoň 100 g mléčného výrobku s minimálním obsahem 106 probiotických bakterií v 1 g nebo 1 ml potraviny. Pro jednotlivé skupiny kysaných mléčných výrobků je množství bakterií použité mikrobiální kultury stanoveno vyhláškou ministerstva zemědělství č. 77/2003 Sb. V průběhu užívání probiotik formou kysaných mléčných výrobků nebo prostřednictvím farmaceutických preparátů jsou tyto kmeny prokazovány ve stolici, ale již několik dní po přerušení jejich přísunu zmizí. V současné době se hledají cesty, jak udržet příznivě působící bakterie v trávicím traktu s trvalejším efektem.
10
2
CÍL PRÁCE
Cílem teoretické části bylo prostudovat dostupnou literaturu o fermentovaných mléčných výrobcích s použitím jogurtové kultury, o ovlivňování střevní mikroflóry, o problematice probiotik a prebiotik a možnostech obohacování potravin těmito prospěšnými bakteriemi. Také prostudovat metodiku stanovení bakterií rodu Lactobacillus, Bifidobacterium a Enterococcus ve vzorku stolice. Cílem experimentální části bylo sestavit pokusnou skupinu osob pro ověření vlivu konzumace fermentovaných mléčných výrobků na modulaci střevní mikroflóry. Součástí bylo zabezpečení odběru vzorků a předání do mikrobiologické laboratoře, kde probíhaly mikrobiologické analýzy vzorků stolice dle zvolené metodiky. Získané výsledky poté statisticky zpracovat a uspořádat do přehledných tabulek a grafů.
11
3
LITERÁRNÍ PŘEHLED
3.1 Fermentované (kysané) mléčné výrobky Fermentované mléčné výrobky mají svůj původ v mnohých lidových mléčných nápojích, rozšířených po celém světě (GAJDŮŠEK, 2000). Současný způsob výroby je odvozen od historických druhů kysaných mléčných výrobků. K výrobě se používá zákysů z izolovaných čistých mlékařských kultur. Základní kultury bakterií obsahují buďto mezofilní nebo termofilní bakterie mléčného kysání (homofermentativní nebo heterofermentativní), nebo kvasinky. Díky kvasinkám probíhá kromě mléčného kysání i alkoholové kvašení (SIMEONOVOVÁ, 2003). Podle vyhlášky se kysaným mléčným výrobkem rozumí mléčný výrobek získaný kysáním mléka, smetany, podmáslí nebo jejich směsi za použití mikroorganismů, tepelně neošetřený po kysacím procesu. Jogurtem se rozumí kysaný mléčný výrobek získaný kysáním mléka, smetany, podmáslí nebo jejich směsi pomocí mikroorganismů. Druhy mikroorganismů jsou uvedeny v příloze č. 2, tabulce 4 dané vyhlášky (VYHLÁŠKA 77/2003). Tržní sortiment je velmi pestrý a neustále se rozšiřuje. Pro rozmanitost složení se mnoho mléčných výrobků uplatňuje v dietách a při léčebné výživě. Příznivé chuťové vlastnosti a vhodná konzistence umožňují nejrůznější kombinace kysaných mlék s řadou
zchutňujících,
želírovacích,
ovocných,
minerálních,
vitaminových,
vlákninových a jiných doplňků. Různé kombinace jsou základem sortimentní pestrosti (LUKÁŠOVÁ, 2001).
3.1.1 Biologická hodnota a dietetický význam Fermentované mléčné výrobky jsou prakticky vhodné pro všechny populační skupiny. Jsou organolepticky vyhovující a relativně snadno stravitelné (LUKÁŠOVÁ, 2001). Nedílnou součástí mléčných výrobků jsou bakterie mléčného kvašení, které prokysávají mléko. V procesu kysání dochází k přeměně laktózy převážně na kyselinu mléčnou. Zakysané mléčné výrobky jsou přirozeně biologicky konzervovanými výrobky, vlivem nízkého pH vytvářeného mléčnými mikroorganismy. Tyto organismy také zvyšují stravitelnost mléka. Kysané mléčné výrobky jsou často tolerované osobami trpícími intolerancí laktózy (BABIČKA, 2009).
12
Díky nízkému pH ve střevě dochází ke zvýšenému zadržování vápníku, fosforu a železa. Bakterie mléčného kysání jsou schopné produkovat vitamin B12, B1, B2, B6, kyselinu listovou a pantotenovou, niacin a další (GAJDŮŠEK, 2000). V posledních desetiletích se dostává do popředí výroba probiotických kysaných mléčných výrobků obsahujících kromě běžných mléčných kultur i kultury s dietetickoléčebnými účinky. Jejich pravidelná konzumace působí pozitivně na trávicí pochody i na celkový zdravotní stav konzumenta. Probiotické účinky byly prokázány zejména u mikroorganismů: Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus acidophilus a Streptococcus thermophilus. Tyto bakterie bývají obvykle používány v kombinaci s běžnými jogurtovými kulturami (SIMEONOVOVÁ, 2003).
3.1.2 Dělení kysaných mléčných výrobků Kysané mléčné výrobky se dělí na druhy, skupiny a podskupiny (LUKÁŠOVÁ, 2001). Tab. 1 - Dělení kysaných mléčných výrobků (LUKÁŠOVÁ, 2001) Druh
Fermentovaný mléčný výrobek
Skupina
Podskupina
Jogurt
Nízkotučný nebo odtučněný, se sníženým obsahem tuku, smetanový
Jogurtové mléko Acidofilní mléko Kefír Kefírové mléko Kysané mléko nebo smetanový zákys Kysaná nebo zakysaná smetana Kysané podmáslí Kysaný mléčný výrobek s bifidokulturou
3.1.3 Dělení podle použitých mikroorganismů Podle typu použitých bakterií mléčného kysání lze výrobky rozdělit do základních skupin: jogurtové výrobky, acidofilní výrobky, bifidogenní výrobky, smetanové výrobky a kefírové výrobky (BABIČKA, 2009).
13
Tab. 2 - Druhy mikroorganismů v kysaných mléčných výrobcích (Vyhláška 77/2003) Druh výrobku Acidofilní mléko
Použité mikroorganismy
Mléčná mikroflóra výrobku v 1g
Lactobacillus acidophilus a další mezofilní, příp.
106 Lactobacillus
termofilní kultury BMK
acidophilus
Protosymbiotická směs Streptococcus salivarius Jogurty
ssp. thermophilus a Lactobacillus delbrueckii ssp.
107
bulgaricus Kysané mléko vč. smetanového
Monokultury nebo směsné kultury bakterií
zákysu, podmáslí
mléčného kysání
106
a kysané smetany Zákys připravený z kefírových zrn, jehož mikroflóra se skládá z kvasinek zkvašujících Kefír
laktózu Sacharomyces unisporus, Sacharomyces cerevisiae, Sacharomyces exignus a dále Leuconostoc, Lactococcus a Aerobacter, rostoucí ve
Bakterie mléčného kysání 106 a kvasinky 104
vzájemném společenství Zákys skládající se z kvasinkových kultur rodu Kefírové mléko
Kluyveromyces, Torulopsis nebo Candida valida a mezofilních a termofilních kultur bakterií mléčného kysání v symbióze
Kysaný mléčný výrobek s bifidokulturou
Bifidobacterium ssp. v kombinaci s mezofilními a termofilními bakteriemi mléčného kysání
Bakterie mléčného kysání 106 a kvasinky 102
Bifidobakterie 106
3.1.4 Základní tržní skupiny Podle tržní skupiny dělíme kysané mléčné výrobky na jogurty a kysaná mléka. Mezi jogurty patří jogurty pevné, z tradiční výroby, se zráním ve spotřebitelském obalu a jogurty šlehané z kontinuální výroby se zráním v tancích. Do skupiny kysaných mlék patří kysané mléko, kysaná smetana, kysané podmáslí, smetanový zákys, acidofilní mléko, kefír a kumys (LUKÁŠOVÁ, 2001).
14
3.1.4.1 Jogurty Jogurty patří k nejrozšířenějším mléčným výrobkům v produkci kysaných mléčných produktů. Tato skupina je charakterizována obsahem termofilních bakterií mléčného kysání a bakterií aromatizujících. Pro rozšíření sortimentu se používá přídavek dalších mikrobiálních
kultur
a
dochází
tak
k ovlivnění
senzorických
vlastností
(LUKÁŠOVÁ, 2001). Jogurty u nás jsou vyráběny převážně pomocí základní jogurtové kultury (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus). Liší se od sebe zpravidla tučností, délkou zrání a ochucením (BABIČKA, 2009). Z původních klasických jogurtů se vyvinula široká paleta výrobků o různé konzistenci – tekuté ve formě nápojů, krémovité nebo s pevným koagulátem. Rozlišují se bílé a ochucené jogurty. Jogurty s příchutí mohou obsahovat různé nemléčné složky jako ochucující složky, barviva a stabilizátory. Vyrábějí se i jogurty fortifikované různými vitaminy, minerálními látkami, aminokyselinami apod. (SIMEONOVOVÁ, 2003). Zvláštní skupinou jogurtů jsou výrobky obohacené probiotickou kulturou. Nejčastěji se jedná o bakterie rodu Bifidobacterium a Lactobacillus acidophilus. Mezi další používané bakterie patří druh Streptococcus thermophilus, Lactobacillus casei a jeho další druhy pokud vykazují probiotické účinky (ŠUSTOVÁ, 2008). Přiměřený počet probiotik tzv. terapeutické minimum, musí být konzumováno pravidelně, aby se mohl projevit efekt změny mikroflóry na zdravotní stav konzumenta. Spotřeba by měla být více než 100 g výrobku za den, obsahující min. 106 životaschopných jedinců v 1 gramu potraviny. Přežití těchto bakterií až do konce doby použitelnosti je důležitý faktor (LOURENS-HATTINGH a VILJOEN, 2001). Jogurt patří mezi nejrozšířenější funkční potraviny na světě. Funkční potraviny jsou takové potraviny, které mají kromě výživové hodnoty příznivý účinek na zdraví konzumenta.
Obsahují
složky,
které
mají
v lidském
organismu
specifickou
fyziologickou a pro zdraví prospěšnou funkci. Nejsou zaměřeny na léčbu konkrétní nemoci, ale působí na organismus preventivně, proto vytvářejí předpoklady pro fyzickou i duševní pohodu a udržení zdraví. Podle výživových doporučení by se jogurty měly konzumovat jako součást denní stravy. Obecně lze říci, že jogurt působí blahodárně na střevní mikroflóru člověka a je spolu
s acidofilním
mlékem
nejvýznamnější
(ŠUSTOVÁ, 2008).
15
probiotickou
potravinou
3.1.4.2 Další kysané mléčné výrobky Acidofilní mléko Pro výrobu acidofilního mléka se používá acidofilní kultura Lactobacillus acidophilus. U nás se při výrobě používá kombinace acidofilní kultury se smetanovou kulturou, aby konečný produkt nebyl příliš kyselý (ŠUSTOVÁ, 2008). Kefírové mléko, Kefír Kefír se vyrábí působením kefírové kultury. Zákys je připravený z kefírových zrn, jehož mikroflóra se skládá z kvasinek a kultur bakterií mléčného kvašení (BABIČKA, 2009). Ve výrobcích se smíšenou kulturou mléčných bakterií a kvasinek dochází k rozkladu laktózy mléčným kvašením, za vzniku kyseliny mléčné a současně i alkoholovým kvašením, kdy vzniká ethanol a oxid uhličitý, který dodává těmto výrobkům specifickou štiplavou chuť (SIMEONOVOVÁ, 2003). Kysané mléko, Smetanový zákys, Kysané podmáslí Základem pro výrobu je smetanová kultura. (BABIČKA, 2009). Tato kultura zahrnuje bakterie rodu Lactococcus a Leuconostoc, které se podle požadovaného typu fermentace používají v různých kombinacích (SIMEONOVOVÁ, 2003).
3.1.5 Hlavní stupně výroby fermentovaných mléčných výrobků Podstatou výroby kysaných mléčných výrobků je činnost mikroorganismů, tzv. čistých mlékařských kultur. Díky přítomnosti mikroorganismů dochází k rozkladu laktózy, mléčné bílkoviny, výjimečně i tuku. Vznikají nové látky charakteristické pro daný výrobek (ŠUSTOVÁ, 2008). Zásadně mají kysané mléčné výrobky obsahovat pouze mléčné bakterie řádově v koncentracích 106 až 108 v 1 ml. Pro splnění tohoto požadavku je třeba dbát vysokých nároků na suroviny, pasteraci mléka, sanitaci výrobního zařízení, použití aktivních kysacích kultur a dodržení výrobních postupů za vysokých hygienických podmínek (LUKÁŠOVÁ, 2001).
16
3.1.5.1 Požadavky na mléko Na jakost mléka pro výrobu kysaných mléčných výrobků jsou kladeny vysoké nároky. Mléko musí svými vlastnostmi a složením vytvářet vhodné podmínky pro rozvoj a aktivitu přidaných čistých mlékařských kultur. Mléko proto nesmí obsahovat žádné inhibiční látky, musí být hygienicky získáno od zdravých a dobře krmených dojnic a musí mít normální složení a vlastnosti. Mléko by mělo obsahovat co nejnižší počty mikroorganismů, jelikož působením kontaminující mikroflóry jsou rozkládány některé složky potřebné pro čisté mlékařské kultury. Kromě toho vzniklé produkty metabolismu kontaminujících bakterií mohou ovlivňovat růst a aktivitu přidaných mlékařských kultur (SIMEONOVOVÁ, 2003).
3.1.5.2 Výroba Při vlastní výrobě se u mléka upraví tučnost podle toho, jaký má být výsledný produkt (ŠUSTOVÁ, 2008). Mléko se po úpravě tučnosti homogenizuje, aby se rovnoměrně rozptýlily částice tuku. Dále se tato surovina pasteruje. Cílem tepelného ošetření je zničit nežádoucí mikroflóru a upravit mléko tak, aby byly vytvořeny vhodné podmínky pro růst přidaných čistých kultur a výsledný výrobek měl odpovídající vlastnosti. Zahřívá se na 85°C až 95°C po dobu 5 minut. Po pasteraci se provádí rychlé ochlazení na teplotu fermentace (SIMEONOVOVÁ, 2003). Je možné použít UHT záhřev, kdy je konzistence jogurtů pevnější a nedochází k uvolňování syrovátky po fermentaci (ŠUSTOVÁ, 2008).
3.1.5.3 Fermentace a plnění Po pasteraci a ochlazení na fermentační teplotu se mléko zaočkuje mlékárenskými kulturami (ŠUSTOVÁ, 2008). Proces zrání se na výrobcích projevuje změnami chuti, vůně, vzhledu i konzistence. V závislosti na vyráběném druhu výrobku jsou kladeny odlišné
nároky
na
rychlost
a
stupeň
degradace
základních
substrátů
(GAJDŮŠEK, 2000). Zaočkované mléko je buďto plněno přímo do spotřebitelských obalů, kde probíhá fermentace nebo se mléko napustí do tzv. fermentačních tanků, kde se upraví teploty na předepsané hodnoty. Po prokysání a případném promíchání s přidávanými komponenty
je
výrobek
chlazen
a
(SIMEONOVOVÁ, 2003). 17
plněn
do
spotřebitelského
balení
3.1.5.4 Ochucování jogurtů Ochucující složky se přidávají do mléka nebo až do prokysaného produktu. Mezi tyto látky patří např. sacharóza, dextróza, laktóza, aromatické látky a barviva, ovocné přísady, ovocné dřeně, zelenina, džemy, sirupy, ovesné vločky, rozinky, datle, čokoláda apod. Pro zlepšení konzistence se někdy přidávají látky vážící vodu nebo vytvářející síťovitou strukturu, např. škroby, želatina a další (SIMEONOVOVÁ, 2003).
3.1.5.1 Přidávání probiotických MO Probiotické bakterie se v mléku rozmnožují velmi pomalu. V konečném produktu se na konci doby skladování mají vyskytovat v koncentraci vyšší než 106 KTJ/ml výrobku. Většinou se do výrobku, který byl okyselený pravými bakteriemi mléčného kvašení, přidávají před jeho zráním nebo během něj, v takovém množství, aby i bez pomnožení byla na konci skladování požadovaná koncentrace (GÖRNER a VALÍK, 2004).
Obr. 1 - Technologické zpracování mléka na kysané mléčné výrobky (LUKÁŠOVÁ, 2001)
18
3.1.5.2 Změny složek mléka při fermentaci výrobků Laktóza podléhá během fermentace výrobku enzymové hydrolýze. Mění se na glukózu a galaktózu. Tyto monosacharidy jsou dále fermentovány na optické isomery kyseliny mléčné. Kromě tohoto homofermentativního procesu může probíhat heterofermentativní proces, kdy vznikají těkavé mastné kyseliny, např. mravenčí, octová, propionová, dále vznikají karbonylové sloučeniny (acetaldehyd a diacetyl) a v neposlední řadě vzniká ethanol a oxid uhličitý (LUKÁŠOVÁ, 2001). Bílkoviny ve fermentovaných mléčných výrobcích podléhají proteolýze, díky proteolytickým enzymům bakterií mléčného kysání. Koagulované a proteolyzované mléčné bílkoviny jsou lépe stravitelné. Tyto enzymy v průběhu fermentace mléka štěpí pouze kolem 2 % kaseinu (GAJDŮŠEK, 2000). Z kaseinu během fermentace proteolyticky aktivní laktobacily uvolňují peptidy a aminokyseliny, které jsou využívány jako zdroj dusíku. Kvalita procesu je závislá na druhu kultur, podmínkách vedení
fermentací,
na
době působení
teplot
a dosažených hodnotách
pH
(LUKÁŠOVÁ, 2001). Mléčný tuk ve formě mastných kyselin se při porovnání čerstvého mléka a kysaných produktů výrazně neliší (LUKÁŠOVÁ, 2001). Lipolýzou uvolněné mastné kyseliny příznivě ovlivňují stravitelnost tuků (GAJDŮŠEK, 2000). Vitaminy: Bakterie mléčného kvašení často vyžadují pro svůj růst a pro produkci dalších vitaminů některé vitaminy skupiny B. Vlastnosti použitých kultur určují, do jaké míry se bude lišit koncentrace v kysaném výrobku od koncentrace v mléku. Obsah v kysaném výrobku je také určen skladovacími podmínkami a úpravou mléka před fermentací. Tepelné ošetřené mléka snižuje obsah vitaminů B1, B2, C a kyseliny listové (WALSTRA, 1999). Obsah minerálních látek se během fermentace nemění (LUKÁŠOVÁ, 2001).
3.2 Bakterie mléčného kysání Bakterie mléčného kysání jsou velmi heterogenní skupinou mikroorganismů, přesto jsou klasifikovány společně podle tvorby stejného produktu metabolismu kyseliny mléčné (GAJDŮŠEK, 2000). Mezi bakterie mléčného kysání patří skupina kokovitých i tyčinkovitých bakterií, které zahrnují některé druhy rodů: Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus a Bifidobacterium. S výjimkou bakterií rodu 19
Bifidobacterium jsou všechny rody fylogeneticky příbuzné. Význam bifidobakterií v potravinářství
spočívá
v tom,
že
se
sekundárně
přidávají
do
speciálních
fermentovaných výrobků určených pro preventivní léčebná opatření (GÖRNER a VALÍK, 2004). 3.2.1 Vlastnosti a využití bakterií mléčného kysání Bakterie mléčného kysání jsou grampozitivní, anaerobní, mikroaerofilní až fakultativně anaerobní. Morfologicky jsou to koky, ovoidy nebo tyčinky. Výjimkou jsou bifidobakterie, které mají tvar písmene Y. K dalším vlastnostem patří tolerance ke kyselosti mléka kolem pH 4 po několik týdnů (GAJDŮŠEK, 2000). Technologicky a senzoricky významné funkce jsou především v produkci kyseliny mléčné, vzniku senzoricky významných složek (diacetyl, acetaldehyd, volné těkavé mastné kyseliny apod.), rozkladu bílkovin, popř. tuků a potlačování patogenních a technologicky nežádaných mikroorganismů (GAJDŮŠEK, 2000). Protože kyselina mléčná potlačuje rozmnožování hnilobných bakterií, je tato skupina bakterií často využívána pro výrobu potravin a krmiv. Samovolné mléčné kvašení se uplatňuje v mlékárenství při výrobě kysaných mléčných výrobků (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). Tyto bakterie se vyskytují nejen v mléku a mléčných výrobcích. Nachází se i ve střevech lidí a zvířat a na jejich sliznicích, na rostlinách a v půdě (GÖRNER a VALÍK, 2004).
3.2.2 Dělení bakterií mléčného kysání Rozdělení je možné do dvou všeobecných kategorií a to podle metabolismu a podle optimální teploty růstu (GAJDŮŠEK, 2000). Podle produktů katabolického metabolismu rozdělujeme bakterie mléčného kysání do dvou skupin. První jsou homofermentativní mléčné bakterie, které při kysání sacharidů produkují téměř jen kyselinu mléčnou (např. Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus
plantarum,
rod
Streptococcus,
Enterococcus,
Pediococcus
a Lactococcus). Druhou skupinou jsou bakterie heterofermentativní, které produkují kromě kyseliny mléčné také značné množství ethanolu a oxidu uhličitého (např. Lactobacillus fermentum, rod Leuconostoc) (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). Podle optimální teploty růstu dělíme bakterie na mezofilní a termofilní (GAJDŮŠEK, 2000). Mezofilní mikroorganismy mají minimální teplotu vyšší než 5 °C a optimální teplotu nižší než 45 °C, nejčastěji je to okolo 37 °C. Tato skupina 20
představuje většinu všech mikroorganismů. Termofilní mikroorganismy mají optimální teplotu růstu kolem 45 °C nebo vyšší. Většinou je optimum růstu mezi 50 °C a 60 °C. Některé organismy mohou růst výjimečně i při 80 °C a některé extrémní termofily až při teplotách nad 100 °C. Mezi zástupce této skupiny patří bakterie rodu Lactobacillus (Lactobacillus
delbrueckii
ssp.
delbrueckii,
L.
delbrueckii
ssp.
bulgaricus)
(ŠILHÁNKOVÁ, 2008).
3.2.3 Vybrané rody bakterií mléčného kysání 3.2.3.1 Lactobacillus Bakterie rodu Lactobacillus jsou nesporulující, mikroaerofilní, grampozitivní tyčinky, tvořící často řetízky. Podle produktů katabolického metabolismu dělíme rod do dvou skupin a to homofermentativních (L. delbrueckii, L. acidophilus, L. plantarum) a do skupiny heterofermentativních mléčných bakterií (L. fermentum, L. brevis, L. buchneri). Optimální pH pro růst je 5,4 až 6,4. Laktobacily patří mezi bakteriemi mléčného kvašení k náročným na potřebu vitaminů pro svůj růst. Některé potřebují až 6 různých vitaminů (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). V přírodě je tento rod velmi rozšířen. Některé druhy se vyskytují v mléce, kde vyvolávají mléčné kysání, dále se vyskytuje v ústech člověka, v gastrointestinálním traktu savců, na rostlinách a v půdě (VOTAVA et al., 2003). Díky tvorbě kyseliny mléčné, která snižuje pH a tím zastavuje množení hnilobných bakterií, jsou bakterie tohoto rodu využívány ke konzervaci potravin (zeleniny). V mlékárenství se používá např. druh L. delbrueckii ssp. bulgariccus k výrobě jogurtu nebo L. acidophilus k přípravě acidofilního mléka. V sýrařství se využívá L. casei, L. delbrueckii ssp. lactis, L. helveticus. Homofermentativní L. plantarum, který se často vyskytuje na rostlinách, bývá využíván při konzervaci zelí, okurek a pícnin. Je také součástí kefírových zrn spolu s heterofermentativními druhy L. brevis a L. fermentum se nachází v pekařském kvásku (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). L. acidophilus se vyskytuje v trávicím traktu lidí a zvířat a příznivě ovlivňuje střevní mikroflóru. Některé kmeny se používají jako probiotika (SLÁDKOVÁ a BURDYCHOVÁ, 2007). Některé heterofermentativní laktobacily jsou nežádoucí původci kontaminací ve vinařství a pivovarství, kde způsobují chuťové vady produktů (ŠILHÁNKOVÁ, 2008).
21
3.2.3.1 Enterococcus Bakterie rodu Enterococcus jsou mikroaerofilní, grampozitivní koky tvořící řetízky. Řadí se do skupiny homofermentativních bakterií. Dříve byly vyjmuty z rodu Streptococcus (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). Zástupci tohoto rodu se vyskytují běžně v trávicím traktu lidí a zvířat. Rozšířené jsou ve stájích a povrchových vodách. Jsou poměrně rezistentní, mohou přežít záhřev na 60 °C po dobu 30 minut. Při posuzování výskytu enterokoků je nutno přihlížet na materiál, ve kterém jsou stanovovány. Výskyt enterokoků se používá jako indikátor fekálního znečištění pitné vody. Jejich přítomnost ve vodě však poukazuje na nedávné znečištění, protože ve vodě rychle umírají. Výskyt enterokoků v potravinách nelze dávat do přímě souvislosti s fekálním znečištěním, protože se nacházejí i nezávisle v životním prostředí. U některých potravin může poukazovat na nedostatečnou desinfekci pracovních ploch. Navíc některé enterokoky mají technologický význam. Enterococcus faecium je dokonce používán jako probiotikum (SLÁDKOVÁ a BURDYCHOVÁ, 2007). Z potravinářského hlediska je významná odolnost vůči zvýšeným koncentracím soli v potravinách a nízkým hodnotám aktivity vody. I když se technologicky nepoužívají, jsou stálou součástí mikroflóry sýrů, fermentovaných klobás, šunky a jiných i rostlinných potravin. E. faecium se vyskytuje v mléku a mléčných výrobcích (GÖRNER a VALÍK, 2004).
3.2.3.1 Bifidobacterium Rod Bifidobacterium zahrnuje grampozitivní, anaerobní, nesporulující tyčinky, které někdy bývají na jednom z konců rozštěpené (VOTAVA et al., 2003). Charakteristické je heterofermentativní zkvašování sacharidů, kdy je hlavním produktem fermentace kyselina mléčná a octová. Teplotní optimum se pohybuje mezi 37 °C až 43 °C. Optimální pH živných médií je 6,5 až 7,0. Pomalý růst se může objevit ještě při hodnotách pH 4,5 až 5,0 (MAXA a RADA, 1996). Bifidobakterie patří k běžné flóře dutiny ústní a zažívacího traktu. Jako prokazatelně patogenní pro člověka byl zatím usvědčen pouze druh Bifidobacterium dentium, který se podílí na vzniku zubního kazu (VOTAVA et al., 2003). Ve velkém množství se bifidobakterie nachází ve stolici kojenců krmených mateřským mlékem (SLÁDKOVÁ a BURDYCHOVÁ, 2007). Jejich růst podporují tzv. bifidogenní faktory: laktulóza, oligosacharidy a další (GÖRNER a VALÍK, 2004). 22
Zdraví dospělí lidé mají v zažívacím traktu asi 25 % bakterií rodu Bifidobacterium z celkového počtu bakterií. U starých lidí se tento počet snižuje na 10 % a u nemocných mohou dokonce úplně vymizet. U kojenců tvoří až 90 % celkového počtu střevních bakterií, převážně jsou to Bifidobacterium infantis, B. breve, B.
longum.
U
dospělých
lidí
převládají
B.
adolescentis
a
B.
longum
(MAXA a RADA, 1996).
3.2.3.2 Lactococcus Jedná se o grampozitivní, mikroaerofilní až anaerobní koky, tvořící řetízky. Optimální růstová teplota je okolo 30 °C. Řadí se do skupiny homofermentativních bakterií. Lactococcus thermophilus má optimální teplotu 40 až 45 °C a je součástí zákysů pro výrobu jogurtů. Některé kmeny Lactococcus lactis produkují antibiotikum nisin, které inhibuje rozvoj řady grampozitivních bakterií. Toto antibiotikum se používá jako pomocná látka při konzervaci potravin (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). Do rodu Lactococcus patří druhy: Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris, Lactococcus lactis ssp. hordniae, Lactococcus raffinolactis a Lactocossus plantarum (GÖRNER a VALÍK, 2004).
3.2.3.3 Streptococcus Bakterie rodu Streptococcus jsou grampozitivní, většinou fakultativně anaerobní, nepohyblivé, nesporulující koky. Uspořádání je většinou do řetízků. Podle metabolismu je řadíme do skupiny homofermentativních. Jejich optimální teplota je okolo 37 °C. Některé bakterie tohoto rodu jsou termofilní, a proto mají významné využití v potravinářském průmyslu a to např. Streptococcus salivarius ssp. thermophilus. Celá řada druhů je patogenní, způsobují hnisavá onemocnění. Z toho rodu byly vyčleněny nehemolyzující druhy a byly zařazeny do nově vytvořeného rodu Lactococcus (ŠILHÁNKOVÁ, 2008).
3.2.3.1 Pediococcus Bakterie rodu Pediococcus jsou grampozitivní, anaerobní koky. Tvoří kyselinu mléčnou jako téměř jediný produkt metabolismu sacharidů, proto jej řadíme mezi homofermentativní bakterie mléčného kvašení. Tvoří značné množství biacetylu. 23
Vyskytují se v kysaném zelí a jiných kvasících materiálech a využívá se k výrobě masných výrobků (ŠILHÁNKOVÁ, 2008).
3.2.3.2 Leuconostoc Bakterie tohoto rodu patří do čeledi Streptococcaceae. Jsou to grampozitivní, nepohyblivé a nesporotvorné koky. Podle nároku na kyslík se řadí mezi fakultativně anaerobní (GÖRNER a VALÍK, 2004). Zkvašují sacharidy na kyselinu mléčnou, ethanol a oxid uhličitý, proto patří mezi heterofermentativní bakterie (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). Růst je pomalý, např, Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris vyžaduje při teplotách 22 až 30 °C až 48 hod. Důležitou vlastností Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides a ssp. dextranicum je tvorba dextranového slizu, který se produkuje ze sacharózy, čímž vzniká typická táhlovitá konzistence koagulátu (GÖRNER a VALÍK, 2004).
3.3 Čisté mlékárenské kultury V současné době se mikrobiální (mlékárenské) kultury vyrábí ve specializovaných závodech. Výroba zaručuje standardní kvalitu. Pod pojmem mikrobiální kultura se rozumí definované a rozmnožování schopné mikroorganismy. Do surovin se přidávají za účelem vyrobit určitou potravinu nebo zlepšit její senzorické vlastnosti, trvanlivost a konzumovatelnost (GÖRNER a VALÍK, 2004). V mléčném průmyslu se k výrobě používají mezofilní a termofilní kultury bakterií mléčného kysání a kvasinky. Podle obsažených mikrobiálních druhů se čisté mlékařské kultury člení na kultury bakteriální, kvasinkové, plísňové, popř. smíšené (GAJDŮŠEK, 2000).
3.3.1 Jogurtová kultura Jogurty, jogurtová mléka a od nich odvozené výrobky se připravují pomocí kmenových druhů Streptococcus salivarius ssp. thermophilus a Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Tyto mikroby žijí v symbióze a spolu se vyznačují rychlou tvorbou kyseliny mléčné. S. thermophilus produkuje kyselinu mravenčí a tím stimuluje růst a metabolismus laktobacilů. Naopak L. bulgaricus stimuluje růst streptokoků tím, že hydrolyzuje bílkoviny a podporuje ho uvolňováním aminokyselin. Optimální teplotou pro působení je 40 až 43 °C (GÖRNER a VALÍK, 2004). 24
3.4 Trávení Organismus člověka získává potřebné základní živiny, minerální látky a vitaminy potravou. Příjem látek, jejich mechanické a chemické zpracování, vstřebávání látek a vylučování látek tělu nepotřebných zajišťuje trávicí systém. Trávicí systém tvoří několik oddílů: dutina ústní, hltan, jícen, žaludek, tenké a tlusté střevo. Na chemickém zpracování potravy se podílejí velké žlázy, jejíž vývody do trubice ústí a drobné žlázky umístěné ve sliznici trávicí trubice (ROKYTA et al., 2003). Mezi mechanické trávení zařazujeme žvýkáni, polykaní a pohyby žaludku a střev (BURDYCHOVÁ, 2009). V dutině ústní je potrava rozžvýkána a promíchána se slinami. Sousto se přes hltan a jícen dostane do žaludku. V žaludku se potrava mění na tráveninu, která je zde zadržována po dobu 2 až 6 hodin, to záleží na převažující složce potravy. Z žaludku přechází trávenina do první části tenkého střeva (KOMPRDA, 2009). Tenké střevo je nejdelší oddíl trávicí trubice. V živém těle je dlouhé 3 až 5 metrů. Dělí se na tři úseky: dvanáctník (duodenum), lačník (jejunum), kyčelník (ileum) (ROKYTA et al., 2003). Do dvanáctníku ústí vývod ze slinivky břišní a žlučovody. Pomocí enzymů slinivky břišní a enzymů střevní šťávy se zde rozkládají živiny na jednodušší složky, které se již mohou vstřebat do krevního oběhu. Tenké střevo je důležitým orgánem pro vstřebávání živin z potravy, proto je k tomu velmi dobře uzpůsobené (KOMPRDA, 2009). Sliznice vyvstává v příčné řasy a dále vybíhá v klky, tímto způsobem je několikanásobně zvětšena celková vnitřní plocha střeva (ROKYTA et al., 2003). Zhruba za 4 až 8 hodin po příjmu potravy se zbytky dostávají do tlustého střeva, odkud se zcela odstraňují až za 72 hodin (KOMPRDA, 2009). Tlusté střevo je konečný 1,5 m dlouhý úsek trávicí trubice. Rozděluje se na několik částí: slepé střevo s červovitým výběžkem, tračník (vzestupný, příčný a sestupný) a konečník. Fyziologicky přítomné jsou střevní bakterie (ROKYTA et al., 2003). Působením bakterií dochází v tlustém střevě k anaerobní fermentaci, kdy jsou polysacharidy metabolizovány na kyselinu mléčnou, alkohol, těkavé mastné kyseliny, oxid uhličitý a metan. Denně je fermentováno asi 20 g sacharidů. Zvláštní skupinou jsou bakterie hnilobné, které rozkládají aminokyseliny na amoniak, sirovodík, fenol, indol a skatol. Z hlediska zdravotního je žádoucí co možná největší potlačení hnilobných procesů osídlením střeva laktátovými bakteriemi (KOMPRDA, 2007).
25
3.5 Střevní mikroflóra člověka Dobrý zdravotní stav člověka se odráží ve zdraví jeho gastrointestinálního traktu, který je nejvýznamnějším imunitním orgánem v těle. Obsahuje tisíce druhů bakterií, z nichž zde některé žijí trvale, jiné přicházejí s potravou. Při porušení rovnováhy střevní mikroflóry se projeví zdravotní problémy (SLÁDKOVÁ a HLAVÁČOVÁ, 2011). Skutečný počet bakterií ve střevě je asi 10krát vyšší než počet všech buněk v lidském těle. Při narození je střevní trakt téměř sterilní. Po vývoji a ustálení složení mikroflóry v dospělosti, je složení mikrobiálního osídlení téměř konstantní a každý jedinec má složení tak specifické, že by se tento ukazatel mohl používat jako alternativa k otiskům prstů. Při porušení složení má mikroflóra pozoruhodnou schopnost vrátit se časem do stejného stavu jako před tím (QUIGLEY, 2010). Střevní mikroflóra plní velké množství důležitých funkcí pro svého hostitele. Střevní bakterie zvyšují energetický příjem rozkladem nestravitelných polysacharidů přijatých stravou na vstřebatelné monosacharidy. Také zkvašují složené sacharidy, kdy vznikají těkavé mastné kyseliny, které jsou následně zpracovány hostitelem. Tyto mastné kyseliny (acetát, butyrát, propionát) podněcují růst a vyzrávání střevních buněk a přes jejich protizánětlivé vlastnosti modulují imunitní odpověď. Kolonizace komenzálními bakteriemi brání invazi patogenů, tím že s nimi soutěží o stejné živiny. Také zabírají výklenky ve střevní sliznici. Mikrobiální osídlení střevního traktu má rovněž vliv na vývoj a morfologii střeva, přispívá k vývoji cév a k opevnění epiteliální bariéry střev. Střevní mikroflóra hraje klíčovou roli při formování lokální a systémové modulace imunitního systému hostitele (RAUCH a LYNCH, 2011). Obecně lze střevní bakterie rozdělit na druhy, které jsou potenciálně škodlivé, patogenní nebo užitečné pro svého hostitele. U zdravých jedinců se mezi těmito druhy bakterií nachází přírodní rovnováha. Prospěšné bakterie, mezi které patří vybrané druhy rodů Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus a některé druhy rodu Enterococcus a Bacteroides, hrají důležitou roli v otázkách výživy a prevenci chorob. Jejich pozitivní účinky plynou z výroby základních živin, jako jsou vitaminy a organické kyseliny. Působí jako prevence infekcí žaludku a stimulují imunitní reakce. Kromě ochranné funkce je významné detoxikační působení a vázání karcinogenů. Mezi nežádoucí nebo potenciálně patogenní střevní bakterie řadíme druhy rodů Clostridium, Staphylococcus, Proteus, někdy Enterococcus, Escherichia a Bacteroides.
26
Produkují látky, které mohou být potenciálně patogenní pro člověka (GOPAL et al., 2003). Bakterie rodu Bifidobacterium a Lactobacillus jsou členy běžné střevní mikroflóry člověka. Jsou považovány za prospěšné pro hostitele tím, že inhibují růst a adhezi patogenních druhů bakterií na povrch střevních buněk v gastrointestinálním traktu a zvyšují imunitu hostitele. Proto je mnohdy snaha o zvýšení počtu bifidobakterií a laktobacilů podáním některých jejich kmenů nebo oligosacharidů a polysacharidů, které stimulují jejich růst (SATOKARI et al. 2003). Další prospěšnou funkcí je metabolická aktivita, jejímž příkladem je výroba mastných kyselin a vitaminů, které podporují lepší trávení a vstřebávání živin a odstranění toxických a nežádoucích metabolitů (GOPAL et al., 2003). V tlustém
střevě se běžná mikroflóra podílí
na
zachování
hlavních
metabolických a protiinfekčních mechanismů střevního traktu. Normální stav střevní mikroflóry člověka se nazývá normobióza (DORÉ a COTHIER, 2010). Porušení rovnováhy mikroorganizmů v trávicím traktu v důsledku selhání kontrolních mechanizmů je nazývána dysmikrobie. Při ní je zachována kvalitativní struktura, ale kvantitativně se vzájemný poměr mikroorganizmů změní. Tím dochází ke zvýšení počtu mikroorganizmů, které jsou v trávicím traktu běžně v menšině. Tyto mikroorganizmy vyvolávají superinfekci, na kterou může nasednout další infekční agens, jako jsou např. bakterie, viry a plísně (VOTAVA et al., 2003). V tlustém střevě je důležitý symbiotický vztah mezi střevní mikroflórou a hostitelem, který je vzájemně výhodný pro obě strany. Střevní mikroorganismy přispívají prevencí kolonizace patogeny, pomáhají trávit zbytky potravy, produkují živiny a rozvíjejí a udržují slizniční imunitu (OJETTI et al., 2009). Na
druhou
stranu,
u
některých
druhů
bakterií
v
tlustém
střevě
(např. Bacteroides) bylo prokázáno, že produkují metabolity, které jsou karcinogenní a mohou tak zvyšovat riziko výskytu rakoviny tlustého střeva. Změny v kolonizaci střevní mikroflóry zažívacího traktu, způsobené špatnou výživou nebo užíváním antibiotik, mohou vést k onemocnění gastrointestinálního traktu. (TODAR, 2009).
27
Obr. 2 - Schematické znázornění dospělé střevní mikroflóry (ROBERFROID, 2010) Popis
obrázku:
Bakterie
jsou
seřazeny
podle
četnosti
osídlení
lidského
gastrointestinálního traktu. Nejpočetnější skupiny jsou umístěny dole, méně početné nahoře. Rody umístěné v tabulce na levé straně jsou potenciálně škodlivé, rody na pravé straně potenciálně prospěšné pro zdraví hostitele. Ty rody, které se nachází ve středu tabulky, jsou buďto potenciálně škodlivé nebo potenciálně prospěšné, ale obsahují i některé rody, které ještě nebyly klasifikovány nebo byly nedávno identifikovány a jejich prospěšnost nebyla ještě vědecky prověřena.
3.5.1 Osídlení střevního traktu Lidský trávicí trakt obsahuje 1,5 kg živých bakterií v rámci více než 500 identifikovaných druhů. Bakteriální biomasa tvoří přes 60 % hmoty stolice (KOMPRDA, 2010). Složení běžné mikroflóry mohou ovlivňovat různé faktory jako je genetika, pohlaví, stres, výživa a dietní zvyklosti jednotlivce (TODAR, 2009). Mezi další faktory ovlivňující počty a rozmanitost bakterií vyskytujících se v různých oblastech gastrointestinálního traktu patří pH střevního prostředí, peristaltika střev, dostupnost 28
živin, oxidačně-redukční potenciál ve tkáni, věk hostitele, hostitelovo zdraví, bakteriální adheze (přilnavost ke střevní stěně), bakteriální spolupráce, sekret mucinu obsahující imunoglobuliny, bakteriální antagonisté a čas průchodu tráveniny (ROBERFROID et al., 2010). Od kyčelníku tenkého střeva po tlusté střevo se bakteriální koncentrace postupně zvyšuje až na 1012 KTJ/g obsahu. Mezi nejvýznamnější patří rody: Bacteroides, Eubacterium, Bifidobacterium, Peptostreptococcus, Fusobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Streptococcus, Lactobacillus a Escherichia. (SAUNIER a DORÉ, 2002). Člověk je poprvé kolonizován bakteriální mikroflórou v okamžiku narození při průchodu porodními cestami. Plod je v děloze sterilní. Manipulace a krmení dítěte po porodu, vede k vytvoření stabilní flóry na kůži, v ústní dutině a střevním traktu do cca 48 hodin (TODAR, 2009). Bakteriální složení dětského zažívacího traktu závisí na režimu kojení. U kojených dětí obvykle dominují rody Bifidobacterium, které tvoří až 90 % celkového počtu střevních bakterií (SAUNIER a DORÉ, 2002). Rody Enterobacteriaceae a Enterococcus jsou většinou přítomny v malé míře a rody Bacteroides, Staphylococcus, Lactobacillus a Clostridium zde prakticky chybí (TODAR, 2009). Po dosažení 2 roku věku se složení mikroflóry stabilizuje a zůstává tak až do dosažení 16 let. Při dospívání se vyčerpávají živiny ve střevních výklencích a rozvíjí se tak více specifické druhy. Po dosažení dospělosti zůstává složení mikroflóry víceméně konstantní (SAUNIER a DORÉ, 2002). V horní části zažívacího traktu dospělého člověka, jícnu jsou obsaženy pouze bakterie polykané se slinami a potravinami (TODAR, 2009). V žaludku je kultivovaných velmi málo bakterií, díky vysoké kyselosti žaludeční šťávy. Nicméně, se zde může vyskytovat patogenní bakterie Helicobacter pylori, která bývá příčinou žaludečních vředů (TODAR, 2009). Přestože je u zdravých dospělých osob množství bakterií v žaludku nízké (přibližně 102 KTJ/ml obsahu), jsou stěny žaludku osídleny i jinými bakteriemi. U zdravého dospělého žaludku se mezi izolovanými organismy mohou vyskytovat bakterie rodu Lactobacillus, Enterococcus a Bacillus (ROBERFROID et al., 2010). V tenkém střevě převládají rody Lactobacillus, Escherichia, Streptococcus, Bifidobacterium, Fusobacterium (ŠVESTKA, 2008). V první části tenkého střeva je poměrně řídké osídlení grampozitivními bakteriemi, skládající se hlavně z rodů Lactobacillus a Enterococcus faecalis. Tato oblast obsahuje zhruba 105 - 107 KTJ/g. Od první části tenkého střeva ke konečné, se mikroflóra výrazně mění, obsah bakterií se 29
zvyšuje až na 108 KTJ/g (TODAR, 2009). Průchod potravy tenkým střevem je poměrně rychlý (2 až 4 hod). Celkový podíl na fermentaci je zde nízký, ve srovnání s tlustým střevem. Tenké střevo je také prostředí pro vznik mnoha bakteriálních infekcí. Mezi ně patří například infekce bakteriemi rodu Salmonella a některými bakteriemi Escherichia coli. Z tohoto důvodu je tenké střevo také cílem pro probiotika, kde soutěží o vazebná místa s patogeny (ROBERFROID et al., 2010). Mikrobiální osídlení tlustého střeva je kvalitativně podobné mikroflóře nalezené ve výkalech. Populace bakterií v tlustém střevě dosahuje hodnot 1012 KTJ/g obsahu (TODAR, 2009). Kombinace prodloužení průchodu potravy tlustým střevem, neutrálnějšího pH a zvýšené dostupnosti živin (tj. nestrávených zbytků z potravy, které přichází z horní části GIT, odumřelých bakteriálních buněk, mikrobiálních buněčných úlomků a vedlejších produktů mikrobiálního metabolismu) zaručuje, že je tlusté střevo velmi příznivým prostředím k mikrobiální kolonizaci. Prostředí je anaerobní, proto zde převládají zejména anaerobní mikroorganismy (ROBERFROID et al., 2010). Koliformní bakterie se dostávají do popředí s bakteriemi rodu Enterococcus, Lactobacillus
a
Clostridium.
druhy
Převažující
jsou
anaerobní
Bacteroides
a anaerobních bakterie mléčného kvašení rodu Bifidobacterium (Bifidobacterium bifidum) (TODAR, 2009).
3.6 Probiotika, prebiotika, synbiotika Vzájemné působení mezi střevní mikroflórou a lidským tělem, má hluboký dopad na fyziologické funkce člověka. V neposlední řadě ovlivňuje funkci imunitního systému (RAUCH a LYNCH, 2011). Pro zlepšení lidského zdraví mohou být použity probiotické bakterie. Pokud jsou tyto bakterie obsaženy v potravinách, mohou poskytovat
zvláštní
zdravotní
výhody
pro
jejich
konzumenta
(GUARNER
a MALAGELADA, 2003). Prebiotika jsou nestravitelné části přijímané potravy, které slouží jako vhodný substrát pro růst nebo eventuálně pro metabolickou aktivitu pozitivně působících bakterií zažívacího traktu. Jejich příznivý vliv na zdraví hostitele je již několik let uznáván (NAGY et al., 2011). Označením synbiotika se rozumí výrobek s přídavkem probiotika a současně i prebiotika. Základní myšlenkou takto vyrobeného produktu je ta, že bakterie prospěšná lidskému zdraví má k dispozici vhodný substrát, který může v tlustém střevu 30
fermentovat, a tím se zvyšuje šance na prosazení v konkurenci s přirozenou mikroflórou (KALAČ, 2003). Probiotika, prebiotika a synbiotika zaměřené na zlepšení střevní mikroflóry mají velmi vysoké uplatnění v segmentu funkčních potravin na trhu (SAARELA et al., 2002).
3.6.1 Probiotika Probiotika jsou definována jako živé mikroorganismy, aplikovány v přiměřeném množství, které příznivě ovlivňují zdravotní stav hostitele tím, že upravují složení jeho střevní mikroflóry (NAGY et al., 2011). V tlustém střevě se zpomaluje průchod tráveniny a přítomné bakterie tak mají možnost štěpit složky potravy, které beze změny prošly předchozími oddíly trávicího traktu. Tyto složky slouží jako substrát a tedy i jako zdroj energie a živin pro přítomné bakterie. Mikroorganismy v tlustém střevě o tento substrát soutěží. Cílem přidaného probiotika je zvýšení množství a tím i konkurenceschopnosti zdraví prospěšných bakterií (KALAČ, 2003). Nejběžněji používané probiotické bakterie jsou z rodů Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Enterococcus a nepatogenní kvasinky Saccharomyces boulardii (NEVORAL, 2005). Většina druhů probiotických bakterií se přirozeně vyskytuje v zažívacím traktu člověka, jako součást běžné mikroflóry. Výhodnou vlastností některých kmenů je schopnost fermentace oligosacharidů, které nejsou stravitelné lidmi (O´FLAHERTY a KLAENHAMMER, 2010). Probiotické mikroorganizmy nachází uplatnění ve výživě lidí i zvířat. Tyto kultury se běžně používají při výrobě kysaných mléčných výrobků (hlavně rody Bifidobacterium, Lactobacillus), sýrů (Bifidobacterium, Lactobacillus, propionové bakterie), fermentovaných masných výrobků (různé bakterie mléčného kysání), ale i do náplní sušenek a oplatků (Enterococcus faecium). Další možností je podávání probiotik lidem ve formě kapslí, lyofilizovaných nebo sušených prášků (RADA, 2010).
31
3.6.1.1 Kriteria pro zařazení mezi probiotické mikroorganismy Při výběru vhodných probiotických bakterií pro výrobu potravin, se musí přihlížet ke stanoveným kritériím. Jednotlivé bakteriální kmeny mohou být zařazeny mezi probiotika, pokud se prokáže, že mají prokazatelně pozitivní vliv na zdraví hostitele a nejsou toxické ani patogenní (NAGY et al., 2011). Kritéria pro výběr probiotických bakterií (NEVORAL, 2005), (KALAČ, 2003): Bezpečnostní hlediska: 1. Přesné taxonomické zařazení 2. Humánní původ mikroorganismů 3. Rezistence vůči žaludeční kyselině a žlučovým kyselinám 4. Schopnost přežívat, růst a zůstat metabolicky aktivní v trávicím ústrojí 5. Nesmí být toxické a patogenní 6. Genetická stabilita 7. Potenciální rezistence vůči antimikrobiálním látkám původní mikroflóry Technologické vlastnosti: 1. Růstová
schopnost
během
kultivace,
životaschopnost
při
aplikaci
do potravin, transportu a skladování 2. Dobré organoleptické vlastnosti Funkční vlastnosti: 1. Adheze ke střevnímu epitelu a schopnost kolonizace střeva 2. Schopnost imunomodulace 3. Antagonistické působení na patogenní bakterie 4. Tvorba antimikrobiálních látek 5. Klinicky dokumentovatelná a měřitelná užitečnost pro zdraví hostitele
32
3.6.1.2 Nejrozšířenější probiotické kmeny bakterií Mezi probiotické bakterie jsou v současnosti zařazovány nejčastěji kmeny bakterií: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus VTT E-97800, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus lactis, Bifidobactrium ssp. BB12, Bifidobacterium longum BB536, Bifidobacterium breve, Enterococcus faecium M 74. Tyto bakterie mají hlavní stanoviště ve střevě ne v mléku, proto se v mléku rozmnožují velmi pomalu (GÖRNER a VALÍK, 2004). Probiotické mikroorganismy nelze většinou použít samostatně k fermentaci mléka vzhledem ke značně vysoké tvorbě kyselin. Tyto organismy jsou většinou kultivovány v mléce samostatně a přidávány až do finálního výrobku (GAJDŮŠEK, 2000). Koncentrace probiotik v potravině se považuje za účinnou při hodnotě 106 životaschopných jedinců na 1 g potraviny (KALAČ, 2003). Tento počet představuje však jen určitý odhad. S určitostí nelze prokázat, kolik
životaschopných
mikroorganizmů se opravdu dostane do cílového orgánu (ŠVESTKA, 2008). Tab. 3 - Nejčastěji používané probiotické miroorganismy (NEVORAL, 2005) Lactobacillus
Grampozitivní koky
Bifidobacterium
Kvasinky
L. acidophilus
Lactococcus lactis ssp.
B. bifidum
Saccharomyces
cremoris
boulardii
L. casei ssp. rhamnosus
Streptococcus salivarius
B. adolescentis
(GG)
ssp. thermophilus
L. casei Shirota
S. intermedius
B. animalis
L. delbrueckii ssp.
S. diacetylactis
B. infantis
L. reuteri
Enterococcus faecium
B. longum
L. brevis
E. coli (sérotyp
B. thermophilum
bulggaricus
083:K24:H1) L. cellobiosus L. curvatus L. fermentum L. plantarum 299v
33
3.6.1.3 Mechanismy působení probiotik ve střevě Probiotika pozitivně ovlivňují zdraví hostitele modulací a obnovou normálního stavu mikrobiální aktivity ve střevním traktu. Spoluvytvářejí zdravé mikrobiální společenství, působí tak proti zánětlivému procesu ve střevě (KOMPRDA, 2010). Účinky probiotik mohou být klasifikovány do tří skupin: 1.
Pro terapeutické a preventivní využití je důležitá schopnost modulace specifické i nespecifické imunity a zlepšení imunologické bariéry střeva (KOMPRDA, 2010). Tento způsob účinku je pravděpodobně důležitý pro prevenci a terapii infekčních chorob, a také pro léčbu zánětlivých onemocnění zažívacího traktu nebo jeho částí (OELSCHLAEGER, 2010). Perorálně podávaná probiotika mohou posílit specifické IgA reakce na rotavirové infekce dětí nebo na infekce Salmonella typhi u dospělých. Probiotika podávaná ve fermentovaných mléčných
výrobcích,
kolonizující
střeva,
zvyšují
fagocytární
aktivitu
cirkulujících leukocytů po dobu několika týdnů, po dobu trvání kolonizace. Tím dochází k vyvolání imunitní odpovědi na lokální a systémové úrovni. (GUARNER a MALAGELADA, 2003).
2.
Probiotika produkují látky, kterými mohou inhibovat jiné bakterie. Mezi tyto látky patří organické kyseliny, peroxid vodíku a bakteriociny. Snižují nejen počet živých buněk, ale ovlivňují i metabolismus bakterií a produkci toxinů (NEVORAL, 2005).
3.
Probiotické bakterie mají schopnost adheze ke střevnímu epitelu. Tím blokují vazebná místa pro patogenní bakterie. Probiotika využívají živiny ve střevě, které by jinak byly spotřebovány patogenními mikroorganismy. Některé probiotické kmeny jsou schopné degradovat receptory pro toxiny na střevní sliznici (NEVORAL, 2005). Bakterie rodu Lactobacillus jako probiotika kolonizující sliznici střeva, snižují množství bakterií rodu Clostridium na střevní sliznici a snižují též množnosti adheze enteropatogenních a enterotoxigenních kmenů,
např.
Escherichia
coli,
Salmonella
pseudotuberculosis (VOTAVA et al., 2003).
34
typhimurium
a
Yersinia
Tab. 4 - Možnosti působení probiotik ve střevě (NEVORAL, 2005) Mechanismy možného působení Stabilizace střevní flóry soutěžením s patogeny o vazebná místa a živiny Produkce mastných kyselin s krátkým řetězcem Snížení pH obsahu ve střevě Zvýšená rozpustnost minerálních látek Stabilizace střevní slizniční bariéry Produkce antimikrobiálních látek Působení na toxiny a na jejich receptory Stimulace imunitní odpovědi na patogeny
3.6.1.4 Prokázané účinky probiotik Účinky probiotik jsou zkoumány velkým množstvím studií. Ovšem ne všechny studie jsou kvalitní. Pro dobré posouzení si studium léčebného použití probiotik vyžaduje striktně randomizované, dvojitě slepé, placebem kontrolované studie. Současné znalosti účinnosti probiotik ukazují, že perorální příjem může být prokazatelně užitečný při léčbě některých onemocnění (NEVORAL, 2009). Průjmová onemocnění Mechanismy působení probiotik jsou závislé na typu průjmového onemocnění. Průjmy mohou být způsobeny virovou infekcí, užíváním antibiotik nebo průjmy cestovatelské, kde nebyl účinek probiotik ještě prokázán. Probiotika tak mohou působit preventivně nebo léčebně. Mezi základní mechanismy patří stimulace imunitního systému, soutěžení o vazebná místa na střevní sliznici a tvorba inhibičních látek (NEVORAL, 2009). S ohledem na infekční průjmy se zdá, že dvě hlavní oblasti účinnosti probiotik souvisí s průjmy způsobenými rotavirovými infekcemi a infekcemi způsobenými Clostridium difficile. Několik studií dokazuje, že probiotika zkracují dobu trvání rotavirových průjmů (QUIGLEY, 2010). V pokusech, které zkoumaly účinnost probiotik na průjmy způsobené Clostridium difficile se ukázala účinnost u probiotik Lactobacillus rhamnosus GG a Sacharomyces boulardii (SAARELA et al., 2002). Proteolytické trávení molekul toxinu A a B proteázou by mohlo částečně vysvětlovat ochranné účinky Saccharomyces 35
boulardii proti průjmům způsobeným Clostridium difficile. Další studie ukazují, že Lactobacillus plantarum zabraňuje opakovanému výskytu průjmu způsobeným Clostridium difficile (QUIGLEY, 2010). Průjmová onemocnění po léčbě antibiotiky Podávání probiotik v prevenci proti průjmům způsobeným užíváním antibiotik, je založeno na předpokladu, že došlo k porušení stability střevní mikroflóry (SZAJEWSKA, 2007). Probiotika se u tohoto typu průjmů ukázala jako účinná. Studie ukazují, že podávání probiotik snižuje výskyt průjmového onemocnění po antibiotické léčbě asi na jednu třetinu. Za účinné se považují Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus reuteri a Saccharomyces boulardii (NEVORAL, 2010). Další studie ukázaly účinnost i jiných probiotik při prevenci těchto průjmů a to Saccharomyces boulardii, L. acidophilus, L. bulgaricus, Enterococcus faecium SF68, B. longum a Lactobacillus GG (QUIGLEY, 2010). Intolerance laktózy Bakterie použité jako startovací kultury v jogurtu zlepšují trávení laktózy a tak eliminují symptomy intolerance u lidí, kteří nemohou efektivně vstřebávat laktózu. Tento příznivý efekt je způsoben přítomností mikrobiální laktázy, v kysaném mléčném výrobku. Lidé, kteří trpí intolerancí laktózy, mají tendenci vyloučit mléčné výrobky ze své stravy a tím ohrožují svůj příjem vápníku (GUARNER a MALAGELADA, 2003). Probiotika pomocí laktázy pomáhají štěpit laktózu v tlustém střevě, a tím zlepšují toleranci
laktózy.
Laktázu
v jogurtech
produkují
Streptococcus
thermophilus
a Lactobacillus bulgaricus (NEVORAL, 2010). Atopický ekzém Schopnost
probiotik preventivně bránit
v rozvoji
atopického ekzému
byla
demonstrována v několika studiích. Podávání Lactobacillus rhamnosus GG těhotným ženám, 4 týdny před porodem a potom 6 měsíců dítěti po porodu, významným způsobem snižovalo výskyt atopického ekzému ve 2, 4 a 7 letech života dítěte (NEVORAL, 2010). V podobné studii se prokázala účinnost tří probiotik a to Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis a Lactococcus lactis. Ty byly podávány těhotným 36
ženám a následně také kojencům (12 měsíců) s vysokým rizikem atopického ekzému, potravních alergií nebo astmatu. Podávání vedlo k redukci vylučování imunoglobulinů E, které jsou vylučovány u alergických dětí. U dětí se výrazně snížil výskyt atopického ekzému (KREJSEK et al., 2007). Zánětlivá střevní onemocnění Zánětlivé onemocnění střev je termín zahrnující idiopatická střevní onemocnění, ulcerózní
kolitidu
a
Crohnovu
chorobu.
Tato
onemocnění
jsou
spojena
s nekontrolovaným zánětem v rámci gastrointestinálního traktu. Bylo prokázáno, že tato onemocnění zvyšují riziko rozvoje kolorektálního karcinomu v pozdějším věku. Cílem působení probiotik je snížení zánětu střevní sliznice. Proběhlo již několik studií na zvířecích modelech, kde byly prokázány potenciální léčebné přínosy (GEIER et al., 2007). Ulcerózní kolitida Výsledky řady kontrolovaných studií ukazují účinnost probiotik při udržení remise ulcerózní kolitidy a při léčbě mírné až střední recidivy. Jedná se o probiotické bakterie rodu Bifidobacterium, nepatogenní Escherichia coli a Saccharomyces boulardii. V další studii bylo použito osm různých kmenů (B. breve, B. longum, B. infantis, L. acidophilus, L. plantarum, L. paracasei, L. bulgaricus, S. thermophilus). Tato probiotika se také ukázala jako účinná v prevenci a udržení remise u pacientů s ulcerózní kolitidou. V jedné studii byla udržena remise u 85 % pacientů ve srovnání s 6 % pacientů užívajících placebo (QUIGLEY, 2010).
3.6.1.5 Předpokládané účinky probiotik Cestovatelské průjmy Probíhaly pokusy s probiotikem Lactobacillus rhamnosus GG, Saccharomyces boulardii a Streptococcus thermophilus, které se jevily jako účinné v prevenci cestovních průjmů. Ovšem nebylo tomu tak ve všech zkoumaných případech. Rozdílné patogenní druhy bakterií, v různých zeměpisných oblastech, komplikují studie i interpretaci zjištěných dat. Proto jsou pro ověření teorie ještě nutné další studie (SAARELA et al., 2002). 37
Crohnova choroba Na základě dosud prováděných studií, není v současné době přesvědčivý důkaz o tom, že by probiotika byla účinná při léčbě Crohnovy nemoci (QUIGLEY, 2010). Výsledky studií jsou rozdílné. V některých studiích bylo prokázáno podstatné snížení opětovného objevení příznaků nemoci, oproti skupině užívající placebo. V jedné studii se výskyt příznaků snížil 6krát u pacientů užívajících probiotikum Saccharomyces boulardii v kombinaci s lékem masalazinem (lék používaný pro léčbu této choroby), oproti pacientům užívajících tento lék samostatně. Ovšem jiné studie ukazují, že podávání probiotik nezabránilo opětovného propuknutí vyléčené Crohnovy choroby. Možností by mohla být kombinace více probiotických kmenů, která by snad mohla být účinnější. Dosud ale chybí velké, dobře provedené studie, které lépe ukázaly možný význam probiotik při léčbě Crohnovy nemoci (NEVORAL, 2009). Prevence rakoviny střev Ve studiích na zvířatech bylo prokázáno, že užívání probiotik a prebiotik brání rakovině tlustého střeva. Bohužel jejich role při snižování rizika rakoviny tlustého střeva u lidí nebyla prokázána. Studie na zvířatech ukázaly, že probiotika jsou schopna inhibovat růst nádorových buněk. Bylo také prokázáno, že snižují aktivitu některých enzymů, o kterých je známo, že produkují genotoxické sloučeniny, které se u lidí chovají jako iniciátor vzniku nádoru (GUARNER a MALAGELADA, 2003). Přehled desítek epidemiologických studií neprokázal významný vliv probiotik na vznik rakoviny. Na prokázání těchto účinků u člověka je nutné, aby proběhly další nové studie s definovaným typem probiotika (NEVORAL, 2009). Snížení hladiny plazmatického cholesterolu Snížení hladiny cholesterolu v plazmě je u člověka důležité, pro významné snížení rizika infarktu a jiných srdečně-cévních onemocnění. Hlavní metabolismus cholesterolu probíhá v játrech. Podle některých tvrzení by prý některé kmeny L. acidophilus a některé druhy rodu Bifidobacterium měly být schopny snížit hladinu cholesterolu ve střevě. U pokusů na potkanech byla zaznamenána snížená hladina cholesterolu v séru po krmení bifidobakteriemi, které patrně působí na mechanismus enzymu regulujícího syntézu cholesterolu (LOURENS-HATTINGH a VILJOEN, 2001). 38
Bakterie by mohly účinně snižovat hladinu sérového cholesterolu tím, že zvyšují vylučování žlučových kyselin, což má za následek zvýšení syntézy žlučových kyselin ze sérového cholesterolu. To by mělo vést ke snížení celkové hladiny cholesterolu v těle. Další možností snížení hladiny cholesterolu je ta, že se sníží jeho rozpustnost, čímž nedochází k jeho absorpci ze střeva (NGUYEN et al., 2007). Vliv probiotik hladinu cholesterolu je diskutabilní (LOURENS-HATTINGH a VILJOEN, 2001).
Vliv na bakterie druhu Helicobacter pylori Bakterie Helicobacter pylori je důležitým podnětem pro rozvoj chronické gastritidy a vředové choroby žaludku. Tato infekce je dávána do souvislosti i se vznikem karcinomu žaludku. Bylo zhodnoceno několik randomizovaných studií, kde byla mimo základní léčbu použita probiotika. Závěry ukázaly, že probiotika zvyšovala úspěšnost vymícení onemocnění ze 74,8 % na 83,6 % a snižovala výskyt nežádoucích vedlejších účinků (NEVORAL, 2009). Klinické studie na zvířatech prokázaly, že produkty vylučované bakterií L. acidophilus mohou potlačit růst H. pylori jak in vivo, tak in vitro. Lactobacillus johnsonii a LG21 byly účinné v potlačení růstu H. pylori a snížení zánětu žaludeční sliznice. Je třeba provést ještě další studie, které by posoudili efekt probiotik při dlouhodobém užívání, a také jejich účinek v prevenci onemocnění způsobených H. pylori a s tím spojených nemocí (FELLEY a MICHETTI, 2003).
39
3.6.2 Prebiotika Prebiotika jsou definována jako nestravitelné látky obsažené v potravinách, které selektivně stimulují růst nebo aktivitu jedné bakterie nebo omezeného počtu střevních bakterií, a tím pozitivně ovlivňují složení střevní mikroflóry v tlustém střevě, čímž mají celkově pozitivní vliv na zdraví a celkovou pohodu hostitele (NEVORAL, 2009). Ve srovnání s probiotiky, které zavádějí exogenní bakterie do lidského tlustého střeva, prebiotika stimulují preferenční růst omezeného počtu zdraví prospěšných druhů již pobývajících v tlustém střevě. Zejména, ale ne výlučně, bakterie rodu Lactobacillus a Bifidobacterim (QUIGLEY, 2010). Prebiotika jsou selektivně využívána komenzální střevní mikroflórou, ale nepodporují růst potenciálních patogenům, jako jsou rody Clostridium, Bacteroides a Escherichia Coli (MANNING a GIBSON, 2004).
3.6.2.1 Požadované vlastnosti prebiotik Pro zařazení látky mezi prebiotika, musí být splněny určité požadavky. Jsou to (KVASNIČKOVÁ, 2000): 1. Procházejí horní částí trávicí soustavy v nezměněném stavu, kde nesmí být hydrolyzovaná ani absorbovaná 2. Mají sloužit jako selektivní substrát bakteriím tlustého střeva, což povede ke zvýšení metabolické aktivity těchto bakterií nebo k podpoře jejich růstu 3. Pozitivně ovlivňují složení mikroflóry tlustého střeva 4. Mají celkově pozitivní vliv na zdraví jedince a jeho pohodu
3.6.2.2 Vliv prebiotik na střevní mikroflóru a jejich mechanismus působení Základními substráty pro růst bakterií v tlustém střevě jsou nestravitelné sacharidy ze stravy. Jde především o rezistentní škrob, další složky vlákniny (např. celulózu, pektiny a gumy), oligosacharidy, alkoholické cukry, popř. další. Hlavními konečnými produkty bakteriální fermentace v tlustém střevě jsou mastné kyseliny s krátkým řetězcem, především kyselina octová, propionová a máselná (KVASNIČKOVÁ, 2000). Prebiotika mohou ovlivňovat obranyschopnost v důsledku střevní fermentace a podporovat růst prospěšných bakterií střevní mikroflóry. K ovlivnění může docházet tím, že se zvyšuje počet bifidobakterií, které se váží na vazebná místa střevního epitelu, kde by se jinak mohli vázat a přežívat patogenní bakterie. Pozitivní bakterie střevní mikroflóry mohou aktivovat imunitní systém i přes střevní bariéru. Dalším názorem je 40
ten, že se přes střevní bariéru nedostávají prospěšné bakterie, ale mikrobiální látky jako součást buněčné stěny a cytoplazmatických antigenů. Bakterie rodu Bifidobacterium a Lactobacillus jsou schopné produkovat antibakteriální látky, které mohou inhibovat růst patogenů (LOMAX a CALDER, 2009).
3.6.2.3 Přirozený výskyt a vyráběná prebiotika Oligosacharidy používané jako prebiotika jsou buďto přirozené nebo syntetické. Oligosacharidy tvoří třetí kvantitativně největší složku mateřského mléka, jejich koncentrace se pohybuje mezi 6 a 12 g/l. Většinou jsou odvozeny od laktózy. Tyto oligosacharidy mohou chránit kojence krmené mateřským mlékem před infekcemi jak bakteriálními tak i virovými, před toxiny a plísněmi. Existují pozorování, že oligosacharidy v mateřském mléce mají bifidogenní účinek tzn., že podporují růst bifidobakterií a omezují růst nevhodných bakterií (NEVORAL, 2009). Mnoho druhů ovoce a zeleniny obsahují prebiotické oligosacharidy. Příkladem je cibule, česnek, banán, chřest, pórek, topinambur, čekanka. Avšak je pravděpodobné, že množství v těchto potravinách je příliš nízké, aby mohli mít významný vliv (MANNING a GIBSON, 2004). Nejvýznamnější oligosacharid vyskytující se přirozeně je inulin. Nachází se např. v cibuli, česneku, pórku, artyčoku nebo čekance a v menší míře i v obilovinách (VOTAVA et al., 2003). Prebiotické oligosacharidy mohou být vyrobeny extrakcí z rostlinných materiálů, pomocí mikrobiologické a enzymatické syntézy nebo enzymatickou hydrolýzou polysacharidů (SZAJEWSKA, 2007). Syntetické oligosacharidy vychází z běžných sacharidů – sacharosy, laktosy, inulinu nebo škrobu. Technologickými úpravami vznikají spojením jejich stavebních jednotek látky, které se nevyskytují v přírodě. Takto se vyrábí oligosacharidy odvozené od laktózy, laktulóza (galaktosa vázaná na fruktosu) nebo alkoholické cukry (maltitol, laktitol) (KALAČ, 2003). V současnosti je nejznámějším komerčně přístupným prebiotikem inulin, který se v tenkém střevě neabsorbuje ani nehydrolyzuje a tím není rizikový z hlediska zvyšování glykemie. Z potravinářsko-technologického hlediska tyto oligosacharidy zlepšují texturu a chuť produktu (GÖRNER a VALÍK, 2004).
41
3.6.2.4 Oligosacharidy s kladnými účinky na střevní mikroflóru V souvislosti se zlepšením střevní mikroflóry byl studován bifidogenní účinek směsi několika
oligosacharidů.
Největší
pozornost
je
věnována
derivátům
inulinu
(fruktooligosacharidům), galaktooligosacharidům, laktulóze a sójovým oligosacharidům (NEVORAL, 2009). Naopak sacharóza, maltóza a glukóza, které se tráví a absorbují v tenkém střevě, nemají žádný vliv na střevní mikrofóru, neboť se do tlustého střeva nedostávají (KVASNIČKOVÁ, 2000). V tlustém střevu jsou nestravitelné oligosacharidy substrátem pozitivních bakterií. Dochází k produkci velkého množství těkavých mastných kyselin (KALAČ, 2003). Výsledkem je, že v tlustém střevě dochází ke snížení pH (vzniká kyselé pH). Současně se zvýší celkový počet střevních mikroorganismů a zvýší se objem výkalů. Prospěšné bakterie (Bifidobacterium a Lactobacillus) jsou odolné ke kyselému prostředí, zatímco škodlivé bakterie (Clostridium) jsou citlivé ke kyselým podmínkám. Množení prospěšných bakterií je stimulována a škodlivých bakterií potlačována. Ke zlepšení
střevní
mikroflóry
byly
vyvinuty
preparáty
na
bázi
(KVASNIČKOVÁ, 2000). Tab. 5 - Prebiotické oligomery (MANNIN a GIBSON, 2004) Oligosacharidy s prebiotickým potenciálem: Frukto-oligosacharidy Galakto-oligosacharidy Sójové oligosacharidy Laktulóza Laktosacharóza Gluko-oligosacharidy Isomalto-oligosacharidy Xylo-oligosacharidy Palatinosa
42
laktulózy
3.6.2.5 Denní příjem prebiotik Doporučená denní dávka prebiotik je 4-20 g/ den. Uvádí se, že minimální dávka pro pozorovatelné zvýšení bifidobakterií je 4 g/den inulinu nebo fruktooligosacharidů. Dávky vyšší než 20g /den by mohly vyvolat nežádoucí účinky jako je zvýšená plynatost nebo nadýmání (TUOHY et al., 2003). 3.6.2.6 Zdravotní přínosy prebiotik Prebiotika jsou spojována s různými zdravotními přínosy. Příkladem je zvýšení biologické dostupnosti minerálů (hlavně vápníku), modulace imunitního systému, prevence nebo zlepšení průběhu gastrointestinálních infekcí (průjmů), modifikace zánětlivých střevních onemocnění, regulace metabolických stavů spojených s obezitou nebo snížení rizika rakoviny. Je třeba však poznamenat, že důkazy pro výše uvedené zdravotní přínosy nejsou zcela jednoznačně dokázané (MANNING a GIBSON, 2004). Mezi prokázané se pokládají tyto zdravotní přínosy prebiotik: 1. Příznivě ovlivňují složení mikroflóry tlustého střeva, což je výsledkem selektivní podpory růstu žádoucích bakterií rodu Bifidobacterium, čímž se zároveň znevýhodňuje růst potenciálně patogenních bakterií, především bakterií rodu Clostridium. 2.
Zvětšují objem stolice, klesá výskyt zácpy.
3. Snížení energetického příjmu je dáno tím, že jsou fermentovány až v tlustém střevu na těkavé mastné kyseliny, které mají nízkou energetickou hodnotu. Na další vědecké prokázání ještě čekají další účinky, jako je prevence a zeslabení střevních infekcí a průjmů, posílení imunitního systému, prevence rakoviny tlustého střeva a konečníku, snížení hladiny plazmatického cholesterolu a zvýšení využitelnosti vápníku a tím snížení rizika osteoporózy (KALAČ, 2003).
3.6.2.7 Negativní účinky prebiotik U potravin s prebiotiky je třeba přihlížet ke specifitě populačních skupin. Mohly by se vyskytnout problémy s nadměrnou konzumací prebiotik, což by mohlo vyvolat střevní potíže. Mezi negativní účinky přemrštěné dávky prebiotik patří břišní nevolnost, pocit plnosti, slyšitelné zvuky střev, plynatost a průjem (KVASNIČKOVÁ, 2000).
43
3.6.3 Synbiotika Spojením probiotik a prebiotik v jednom produktu vznikají synbiotika. Dochází tak ke zvýhodnění růstu prospěšných bakterií. Ty mají dispozici substrát, který může fermentovat v tlustém střevu. Zdravotní přínos spočívá v kombinaci obou účinných složek, ten je tak větší než zdravotní přínos každé složky aplikované zvlášť. Kriteria pro synbiotika platí taková jako pro každou ze složek samostatně (KALAČ, 2003). Hlavní překážkou pro dosažení a udržení požadované úrovně probiotik ve výrobku, je závislost probiotických mikroorganismů na podmínkách přežití v důsledku zvýšené kyselosti, koncentraci kyslíku a živin. Jedním používaných postupů, jak tyto problémy překonat, je využití prebiotik. Prebiotika působí jako ochranný prostředek vybraných probiotických bakterií a usnadňují jim tak přežití a činnost při skladování výrobku (DONKOR et al., 2007). Příkladem synbiotické potraviny pro lidskou výživu je mléčný kysaný výrobek jogurt obsahující jako probiotikum bifidobakterie a prebiotickou oligofruktózu (RADA, 2010).
44
4
MATERIÁL A METODIKA
4.1 Materiál 4.1.1 Jogurty Hollandia K pokusu
byly
použity
komerčně
vyrobené
fermentované
mléčné
výrobky
od společnosti Hollandia Karlovy Vary a.s. Tato společnost dodala 2 typy jogurtů. První byl Selský jogurt bílý s probiotickými kulturami Bifidobacterium a Lactobacillus acidophilus. Druhý typ byl Selský jogurt bílý s probiotickými kulturami Bifidobacterium a Lactobacillus acidophilus a s přídavkem inulinu. Oba výrobky měly objem 200 ml. Průměrná výživová hodnota výrobku je na 100 g 262 KJ, 3,4 g bílkovin, 3,5 g sacharidů, 3,9 g tuků. Obsah vápníku je 125 mg. Pro výrobu jogurtů bylo použito mléko, mléčná bílkovina, živá jogurtová kultura, probiotické kultury Bifidobacterium, Lactobacillus acidophilus. Obsah tuku je nejméně 3,5 %. Výrobek obsahuje nejméně 100 milionů živých mikroorganizmů v 1 g výrobku. Tyto výrobky musí být skladovány při teplotě 4–8 °C.
4.1.2 Kultivační média Pro stanovení rodu Bifidobacterium byl použit BSM agar (Fluka, Švýcarsko) s přídavkem BSM suplementu (Fluka, Švýcarsko). Rod Lactobacillus acidophilus se kultivoval na MRS agaru (Biokar Diagnostics, Francie) s přídavkem suplementu Clindamycin hydrochloride (Sigma-Aldrich, USA). Pro kultivaci rodu Enterococcus bylo použito médium Bile Esculin azide agar (Himedia, Indie).
4.1.3 Roztoky Fyziologický roztok (Merck, Německo) Pomnožovací médium Nutrient Broth Peptone (Himedia, Italie)
45
4.1.4 Přístroje a pomůcky -
Laboratorní váhy, 220A (Schoeller instruments, Praha, ČR)
-
Vodní lázeň, Julabo TW 20 (Schoeller instruments, Praha, ČR)
-
Autokláv, Sanyo MLS-3750/3780 (Schoeller instruments, Praha, ČR)
-
Vortex, MS2 Minishaker, (IKA Šerme, Německo)
-
Myčka, G7883, Miele professional, (Labor, Brno)
-
Lednice, Liebherr, 7082218-01, (Germany)
-
Termostat, Sanyo, (Schoeller instruments, Praha, ČR)
-
Horkovzdušný sterilátor, D-91126, (Mennert, Německo)
-
Anaerostat, THERMO SCIENTIFIC (Trigon-plus, s.r.o., ČR)
-
pH metr WTW Microprocesor pHmeter pH 95 (Německo)
-
Přístroj pro usnadnění odečtu mikroorganismů, LKB 2002 (POL-EKOAPARATURA, EU)
-
Běžné laboratorní sklo, laboratorní materiál a pomůcky
4.1.5 Vzorek Vzorek stolice dodaný na sterilních odběrových tampónech s aktivním uhlím (Vitrum, Česká republika), rádně označený kódem probanda a číslem stěru. Hmotnost vzorku byla 0,5 g.
46
4.2 Metodika 4.2.1 Příprava experimentu Pro provedení experimentu byly sestaveny tři pokusné skupiny dobrovolníků. Ti byli seznámeni s průběhem pokusu a poučeni o podmínkách, které během něj museli dodržovat. Podmínky pro provedení experimentu: -
Dobrovolník během pokusu nesměl užívat žádná antibiotika a antivirotika. Pokud by došlo k onemocnění, musel by tuto skutečnost oznámit a byl by vyloučen z pokusu.
-
Osoby v pokusu by neměli trpět závažnými onemocněními trávicího traktu ani potravinovými alergiemi, nesměli užívat projímadla.
-
V průběhu pokusu se dobrovolníci mohli stravovat běžným zavedeným způsobem bez dietních výkyvů, s vyloučením fermentovaným mléčných výrobků (jogurtů, acidofilního mléka, kefírů, kyšky, kysaného podmáslí) a kysaného zelí.
-
Fyzická aktivita měla zůstat na stejné úrovni, jako před pokusem.
-
Dobrovolníci nesměli konzumovat alkohol ve větším množství.
4.2.2 Průběh experimentu K provedení experimentu byly sestaveny tři skupiny dobrovolníků. Každá skupina byla složena z 22 probandů v průměrném věku 22 ± 3 roky. Z hlediska pohlaví převládaly ženy. První skupina A (kontrolní) – bez konzumace fermentovaných mléčných výrobků Druhá skupina B (probiotika) – konzumace fermentovaných mléčných výrobků s probiotiky Třetí skupina C (synbiotika) – konzumace fermentovaných mléčných výrobků s prebiotikem inulinem Osoby zapojené do experimentu obdrželi sterilní stěrové tyčinky s aktivním uhlím na vzorky stolice a jogurty ke konzumaci, podle zařazení do skupin. Po odběru vzorku se zkumavky uchovávali při pokojové teplotě v mikrotenovém sáčku, které probandi poté odnášeli do sběrného boxu ve škole. 47
4.2.3
Harmonogram experimentu
Experiment se rozčlenil do tří fází. Fáze adaptační zahajovala pokus, po které následovala fáze konzumace jogurtů (u skupin B a C) a poslední částí byla fáze doznívání.
Skupina A: Kontrolní skupina měla v průběhu celého pokusu po 38 dní dodržovat běžný stravovací režim podle svých zvyklostí, bez větších dietních výkyvů, bez konzumace většího množství alkoholu, s absolutním vynecháním fermentovaných mléčných výrobků (jogurtů, acidofilních a kefírových mlék, kyšky, kysaného podmáslí) a kysaného zelí.
Skupina B: Fáze adaptace: Doba trvání 10 dní. Běžný stravovací režim podle svých zvyklostí, bez větších dietních výkyvů, bez konzumace většího množství alkoholu, s absolutním vynecháním fermentovaných mléčných výrobků (jogurtů, acidofilních a kefírových mlék, kyšky, kysaného podmáslí) a kysaného zelí. Fáze konzumace: Doba trvání 21 dní. Pokyny na stravování stejné jako v první fází, přidává se konzumace bílého selského jogurtu s probiotiky o hmotnosti 200 g na den. Fáze doznívání: Doba trvání 7 dní. Pokyny na stravování stejné jako v první i druhé fázi, bez konzumace probiotického jogurtu.
Skupina C: Fáze adaptace: Doba trvání 10 dní. Běžný stravovací režim podle svých zvyklostí, bez větších dietních výkyvů, bez konzumace většího množství alkoholu, s absolutním vynecháním fermentovaných mléčných výrobků (jogurtů, acidofilních a kefírových mlék, kyšky, kysaného podmáslí) a kysaného zelí. Fáze konzumace: Doba trvání 21 dní. Pokyny na stravování stejné jako v první fázi, přidává se konzumace bílého selského jogurtu s inulinem o hmotnosti 200 g na den. Fáze doznívání: Doba trvání 7 dní. Pokyny na stravování stejné jako v první i druhé fázi, bez konzumace synbiotického jogurtu.
48
4.2.4 Odběr vzorků V průběhu pokusu bylo každému dobrovolníkovi odebráno 6 vzorků stolice v těchto termínech: 1. vzorek: 10. den (konec adaptační fáze) 2. vzorek: 16. den (u skupiny B a C 7. den konzumace jogurtů) 3. vzorek: 23. den (u skupiny B a C 14. den konzumace jogurtů) 4. vzorek: 30. den (u skupiny B a C 21. den konzumace jogurtů) 5. vzorek: 35. den (fáze doznívání, u skupiny B a C bez konzumace jogurtů) 6. vzorek: 38. den (fáze doznívání, u skupiny B a C bez konzumace jogurtů)
4.2.5 Mikrobiologická analýza vzorků stolice a měření pH jogurtů Při analýze vzorků bylo použito pomnožovací médium. Kultivace probíhala plotnovou metodou pomocí roztěru, při níž byly stanovovány tyto skupiny mikroorganismů: rod Enterococcus, Bifidobacterium a Lactobacillus acidophilus. Mikrobiologické ukazatele byly měřeny ve dvou opakováních a každého odebraného vzorku. Průměry z těchto dvou měření byly použity ke statistickému vyhodnocení. Koncentrace H + iontů byla měřena pomocí pH metru. Měření probíhalo přímým ponořením elektrody do vzorku při laboratorní teplotě.
4.2.6 Stanovení rodu Bifidobacterium Stanovení bakterií rodu Bifidobacterium probíhalo na BSM agaru (Fluka, Švýcarsko) s přídavkem BSM suplementu (Fluka, Švýcarsko). Izolace a stanovení počtu bakterií rodu Bifidobacterium bylo provedeno podle normy ČSN EN 467046. 4.2.6.1 Složení a příprava živné půdy Nebylo výrobcem specifikováno. Do skleněné reagenční láhve na laboratorní váze se navážilo 55,5 g dehydratované půdy, která byla zalita jedním litrem destilované vody, půda byla ponechána 10 min v klidu, aby došlo k nabobtnání agaru. Dále byla láhev vložena do autoklávu a sterilována při teplotě 121 °C po dobu 20 minut. Po ukončení sterilace byla vložena reagenční láhev již se sterilní půdou do lázně vytemperované na teplotu 45 °C. Před
49
použitím byl přidán BSM suplement (Fluka, Švýcarsko) připravený dle návodu výrobce.
4.2.6.2 Rozbor vzorků 1. Stěrové tampony se vzorkem se vložili na 6 až 12 hod do pomnožovacího média Nutrient Broth Peptone (Himedia, Italie). 2. Následně se provedlo dekadické ředění, kdy se k 1 ml vzorku přidalo 9 ml sterilního fyziologického roztoku do předem připravených sterilních zkumavek. Pro dobré promíchání byl použit vortex. 3. Na Petriho misky bylo přeneseno sterilní pipetou z příslušného ředění 1 ml vzorku na střed misky. 4. Inokulum na Petriho misce bylo zalito vytemperovanou půdou BSM s BSM suplementem. Obsah v misce byl promíchán a ponechán ztuhnout. 5. Naočkované misky byly vloženy dnem vzhůru ke kultivaci do anaerostatu.
4.2.6.3 Kultivace Kultivace probíhala plotnovou metodou pomocí zalití. Probíhala při teplotě 42 °C po dobu 125 hod anaerobně. Po ukončení kultivace byly na jednotlivých Petriho miskách odečteny narostlé kolonie a výsledek vyjádřen v KTJ/g.
4.2.7 Stanovení bakterií rodu Enterococcus Kultivace rodu Enterococcus probíhala na médiu Bile Esculin Azide Agar (Himedia, Indie). Izolace a stanovení počtu bakterií rodu Enterococcus bylo provedeno dle normy ČSN EN 467049. 4.2.7.1 Složení a příprava živné půdy Kasein, enzymatický hydrolyzát
17,0 g/l
Proteozo - pepton
3,0 g/l
Hovězí extrakt
5,0 g/l
Oxgall
10,0 g/l
Chlorid sodný
5,0 g/l
Citrát železito – amonný
0,5 g/l 50
Azid sodný
0,15 g/l
Agar
15,0 g/l
Do skleněné reagenční láhve bylo naváženo 56,65 g dehydratované půdy, která byla zalita jedním litrem destilované vody, půda byla ponechána 10 min v klidu, aby došlo k nabobtnání agaru. Dále byla láhev vložena do autoklávu a sterilována při teplotě 121 °C po dobu 20 minut. Po ukončení sterilace byla vložena reagenční láhev již se sterilní půdou do vytemperované na teplotu 45 °C. 4.2.7.2 Rozbor vzorků 1. Stěrové tampony se vzorkem se vložili na 6 až 12 hod do pomnožovacího média Nutrient Broth Peptone (Himedia, Itálie). 2. Následně se provedlo dekadické ředění, kdy se k 1 ml vzorku přidalo 9 ml sterilního fyziologického roztoku do předem připravených sterilních zkumavek. Pro dobré promíchání byl použit vortex. 3. Na Petriho misky s připravenou živnou půdou bylo přeneseno sterilní pipetou z příslušného ředění 1 ml vzorku na střed misky. 4. Inokulum bylo rozetřeno sterilní kličkou po povrchu živné půdy a nechalo se vsáknout do půdy. Obsah v misce byl ponechán ztuhnout. 5. Naočkované misky byly vloženy dnem vzhůru ke kultivaci do termostatu.
4.2.7.3 Kultivace Kultivace probíhala při teplotě 37 °C po dobu 48 hod aerobně. Po ukončení kultivace byly na jednotlivých Petriho miskách odečteny narostlé kolonie a výsledek se vyjádřil v KTJ/g.
4.2.8 Stanovení bakterií rodu Lactobacillus acidophilus Kultivace rodu Lactobacillus acidophilus probíhala na MRS agaru (Biokar Diagnostics, Francie) s přídavkem suplementu Clindamycin hydrochloride (Sigma-Aldrich, USA). Izolace a stanovení počtu bakterií Lactobacillus acidophilus bylo provedeno dle normy ČSN ISO 560642.
51
4.2.8.1 Složení a příprava živné půdy Polypepton
10,0 g/l
Masový extrakt
10,0 g/l
Kvasnicový extrakt
5,0 g/l
Glukosa
20,0 g/l
Tween 80
1,08 g/l
Fosfát draselný
2,0 g/l
Octan sodný
5,0 g/l
Citrát amonný
2,0 g/l
Síran hořečnatý
0,2 g/l
Síran manganatý
0,05 g/l
Bakteriologický agar
15,0 g/l
Do skleněné reagenční láhve bylo naváženo 70,3 g dehydratované půdy, která byla zalita jedním litrem destilované vody, půda byla ponechána 10min v klidu, aby došlo k nabobtnání agaru. Dále byla láhev vložena do autoklávu a sterilována při teplotě 121 °C po dobu 20 minut. Po ukončení sterilace byla vložena reagenční láhev již se sterilní půdou do (vodní lázeň Julabo TW 20 Schoeller instruments, Praha, ČR) vytemperované na teplotu C. Před použitím byl přidán Clindamycin v konečné koncentraci 0,5 mg/l.
4.2.8.2 Rozbor vzorků 1. Stěrové tampony se vzorkem se vložili na 6 až 12 hod do pomnožovacího média Nutrient Broth Peptone (Himedia, Italie). 2. Následně se provedlo dekadické ředění, kdy se k 1ml vzorku přidalo 9ml sterilního fyziologického roztoku do předem připravených sterilních zkumavek. Pro dobré promíchání byl použit vortex. 3. Na Petriho misky bylo přeneseno sterilní pipetou z příslušného ředění 1 ml vzorku na střed misky. 4. Inokulum na Petriho misce bylo zalito vytemperovanou půdou MSR s Clindamycinem. Obsah v misce byl promíchán a ponechán ztuhnout. 5. Naočkované misky byly vloženy dnem vzhůru ke kultivaci do anaerostatu.
52
4.2.8.1 Kultivace Kultivace probíhala při teplotě 37 °C po dobu 72 hod anaerobně. Po ukončení kultivace byly na jednotlivých Petriho miskách odečteny narostlé kolonie a výsledek se vyjádřil v KTJ/g.
4.2.9 Vyhodnocení Po ukončení kultivace se pro výpočet použily misky obsahující více než 300 KTJ ve dvou po sobě následujících ředění.
4.2.10 Rodová a druhová identifikace 4.2.10.1 Rod Enterococcus U kolonií byla provedena rodová a druhová identifikace pomocí biochemických testů a metody PCR.
EN-COCCUStest U identifikací rodu Enterococcus byl nejprve proveden test na detekci aktivity pyrrolidonylarylamidazy (PYRA-test), pro potvrzení příslušnosti k danému rodu. Izoláty příslušné k rodu Enterococcus, byly dále identifikovány na soupravě ENCOCCUStest. Souprava EN-COCCUStest je určena pro rutinní druhovou identifikaci klinicky významných zástupců rodu Enterococcus. Souprava obsahuje tři mikrotitrační destičky (každá pro identifikaci dvanácti kmenů) se sušidlem. Dále tři PE sáčky pro inkubaci, 36 formulářů pro záznam výsledků a rámeček destičky s víčkem pro inkubaci. Příprava vzorku: izolované kolonie byly přeočkovány na živnou půdu PCA (Noack, Rakousko) a kultivovány při 37 °C 24 hodin. U 24 hodinové kultury byla provedena detekce aktivity pyrrolidonylarylamidazy (PYRAtest: Pliva-Lachema Diagnostika, ČR) pro potvrzení příslušnosti k rodu Enterococcus. Druhová identifikace byla následně provedena na EN-COCCUStestu. Příprava destičky: Byl nachystán prázdný rámeček s víčkem, po té byl otevřen aluminiový sáček a vyjmuta destička. Pomocí skalpelu byl oddělen příslušný počet řad, odpovídající počtu 53
testovaných kmenů. U vybraných řad panelu byla sejmuta ochranná folie a řady umístěny do připraveného rámečku. Bakteriální suspenze získaná z našich izolátů byla před použitím důkladně promíchána a inokulováno 0,1 ml suspenze do všech jamek příslušného řádku destičky. Do jamek sloupce H po inokulaci byly přidány dvě kapky parafinového oleje pro vytvoření anaerobního prostředí. Rámeček s naočkovanými řadami byl uzavřen do inkubačního sáčku a EN-COCCUStest byl vložen do termostatu, nastaveného na teplotu 37 °C po dobu 24 hodin. Izolace DNA, rodová a druhová identifikace bakterií rodu Enterococcus pomocí PCR DNA byla izolována z bakteriálních buněk rodu Enterococcus, její purifikace a způsob stanovení koncentrace a čistoty provedeny podle autorů SAMBROOK et al (2001) a AUSUBELA et al. (1994). Pro identifikaci rodu Enterococcus byla použita PCR popsaná DEASYM et al. (2000). Pro amplifikaci rodově specifické DNA sekvence (733 bp) byla použita dvojice specifických oligonukleotidových primerů E1/E2. PCR byla provedena v celkovém objemu 25 μl a obsahovala 10 ng purifikované DNA, 10 pmol primeru E1 a E2, 1U HotStar Taq DNA polymerázy a odpovídající množství HotStar Master Mixu (Qiagen, Hilden, Německo). Templátové DNA byly denaturovány inkubací při 95 °C 15 min. DNA byla amplifokována ve 25 cyklech (denaturace při 95 °C/45 s, hybridizace primerů při 60 °C/45 s a syntéza komplementárního DNA řetězce při 72 °C/1 min). V posledním amplifikačním cyklu byla teplota 72 °C prodloužena na 10 min pro kompletní dosyntetizování konečného PCR produktu. Pro druhovou identifikaci byly použity PCR metody popsané autory DUTKA– MALEN et al., (1995). Druhově specifické primery detekují gen ddlE.
faecium,
amplifikovaný PCR produkt, který je specifický pro E. faecium má velikost 550 bp. PCR byla provedena v celkovém objemu 25 μl a obsahovala 10 ng purifikované DNA, 10 pmol každého druhově specifického primeru, 2U HotStar Taq DNA polymerázy a odpovídající množství Qiagen Hotstar Master Mix (Qiagen, Hilden, Německo). Templátové DNA byly denaturovány inkubací při 95 °C/15 min. DNA byla amplifikována ve 30 cyklech (denaturace při 95 °C/1 min, hybridizace primerů při 54 °C/1 min a syntéza komplementárního DNA řetězce při 72 °C/1 min). V posledním amplifikačním cyklu byla teplota 72 °C prodloužena na 10 min. Jako pozitivní kontrola byla použita purifikovaná DNA izolována z bakteriálního kmene E. faecalis CNRZ 238 popsaná COTONEM et. al. (2004). 54
Jako negativní kontrola PCR byly použity komponenty PCR bez DNA. Všechny PCR reakce byly provedeny v termocyklátoru PTC-150HB (MJ Research, Waltham, USA). Po PCR byly amplifikované fragmenty DNA detekovány pomocí agarosové gelové elektroforézy na přístroji Easy, model B1 (Owl Scientific, USA, 1 % agar, 5V cm-1, 60 min) v 1x TBE pufru a vizualizovaný na UV transluminátoru (EB-20E Ultralum, USA) po nabarvení ethidium bromidem (0,5 μg/ml). Dokumentace byla provedena pomocí fotodokumentačního systému Gel imagerTM Ultra-Lum, Inc., USA. Rodově specifická PCR rodu Lactobacillus Bakterie rodu Lactobacillus byly identifikovány pomocí primerů (ŠPANOVÁ et al.,2009): LbLMA 1-rev 5´ CTC AAA ACT AAA CAA AGT TTC 3´ R16-1 5´ CTT GTA CAC ACC GCC CGT CA 3´ Při PCR s těmito primery se amplifikuje produkt o velikosti asi 250 párů bází (bp). Při amplifikaci byla použita směs o následujícím složení: PCR voda 19 μl, 10x reakční pufr kompletní (10x) 2,5 μl; DTP směs (10 mM) 0,5 μl; primer LbLMA 1-rev (10 pmol/μl) 0,5 μl a primer R16-1 (10 pmol/μl) 0,5 μl; Tag DNA polymerasa 1.1 (1 U/μl) 1 μl a DNA matrice (10 ng/μl) 1 μl. Celkový objem PCR směsi byl 25 μl. Všechny složky PCR směsi byly důkladně promíchány, krátce centrifugovány a mikrozkumavky byly vloženy do termocykleru. Podmínky amplifikace byly následující: denaturace DNA 94°C/60 s, hybridizace primerů 55°C/60 s a syntéza komplementárního řetězce 72°C/120 s. Před prvním cyklem byla směs zahřívána při 94 °C/5 min; v posledním cyklu byla syntéza řetězce při 72 °C prodloužena na 7 min. Amplifikace proběhla v 30 cyklech. Poté byla reakční směs s PCR produkty analyzována pomocí 1,5 % agarosové gelové elektroforézy. Na gel se nanášelo 25 μl PCR produktu a 5 μl nanášecího pufru (připraven smícháním 2,5 g Ficollu, 0,04 g bromfenolové modři, 10 ml 0.5 M EDTA pH 8.0 a 90 ml destilované vody). Při detekci PCR produktu byl použit velikostní standard DNA (100-1500 bp žebříček) v množství 5 μl. DNA standard sloužil k určení velikosti aplifikovaného PCR produktu. Identita probiotických bakterií rodu Bifidobacterium a druhová identita Lactobacillus acidophilus a byla stanovena ve spolupráci s Českou sbírkou mikroorganismů v Brně.
55
4.3 Statické vyhodnocení Chemické a mikrobiologické ukazatele byly měřeny ve dvou opakováních u každého vzorku stolice. Průměry z těchto dvou měření byly použity ve statistickém vyhodnocení. Program Statistica 8 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA) byl použit pro výpočet základních statistických charakteristik, regresí (včetně testování lineární a kvadratické funkce) a rozdílů mezi skupinami vzorků v počtu mikrobiálních kolonií (jednostupňové třídění analýzy rozptylu, včetně post hoc Duncanova testu).
5
VÝSLEDKY
5.1 Stanovení mikroorganismů ve vzorcích stolice U všech tří skupin (kontrolní, probiotické, synbiotické) byl sledován vliv konzumace fermentovaných mléčných výrobků na obsah vybraných rodů bakterií střevní mikroflóry člověka. V průběhu pokusu byly odebírány jednotlivcům ve skupinách vzorky stolice, které byly následně podrobeny mikrobiologickému vyšetření. Po mikrobiologické kultivaci se sledovaly počty mikroorganismů ze získaných vzorků stolice v závislosti na konzumaci probiotických nebo synbiotických jogurtů. Obsah bakterií rodu Bifidobacterium, rodu Enterococcus a Lactobacillus acidophilus ve vzorcích stolice byl srovnáván mezi jednotlivými skupinami dobrovolníků (probiotika, synbiotika, kontrola). Výsledky získané ze vzorků stolice byly vyjádřeny jako počty mikroorganismů v KTJ/g vzorku a převedeny na logaritmické hodnoty. Logaritmické hodnoty byly následně zpracovány ve statistickém programu. Grafické znázornění výsledků je uvedeno na obr. č. 3,4 a 5. Slovní vyhodnocení výsledků je uvedeno u každého obrázku.
56
Porovnání závislosti počtu bakterií ve stolici na době odběru mezi jednotlivými skupinami:
Enterococcus S: 5,7+0,16.x-0,0034.x 2 R2 = 0,39; P<0,0001
8
log KTJ/g
P: 6,3+0,12.x-0,0035.x R2 = 0,13; P<0,0001
2
7
Probiotika K: 6,5+0,03.x-0,0007.x 2 R2 = -0,01; P<0,0001
6
Synbiotika Kontrola
5 0
7
14
21
28
Doba odběru
Obr. 3 - Celkový počet Enterokoků ve vzorcích stolice U kontrolní skupiny se počet enterokoků po dobu pokusu mírně navýšil. Podle grafu je patrný vliv konzumace probiotických a synbiotických jogurtů na zvyšování počtu bakterií rodu Enterococcus. Počet enterokoků u skupiny konzumující probiotické jogurty se po dobu konzumace jogurtů (do 21. dne) zvyšoval. Nejvyšší hodnoty bylo dosaženo 14. a 21. den konzumace. Po ukončení fáze konzumace se počet začal snižovat. U synbiotické skupiny se počet enterokoků také zvyšoval. K nárůstu docházelo až do 26. dne, tzn. i po ukončení konzumace jogurtů. Hodnota se udržela i 26. den už ve fázi doznívání. Po 26. dni se počet začal snižovat, ale ve srovnání s probiotickou skupinou pokles počtu nebyl tak prudký.
57
BIFI Probiotika
9 8
log KTJ/g
S: 4,8+0,28.x-0,0070.x 2 R2 = 0,29; P<0,0001
P: 6,4+0,19.x-0,0067.x 2 R2 = 0,06; P<0,0001
Synbiotika Kontrola
7 6 K: 5,6-0,05.x-0,0010.x 2 R2 = 0,01; P<0,0001
5 4 0
7
14
21
28
Doba odběru
Obr. 4 - Celkový počet Bifidobakterií ve vzorcích stolice Počet bakterií rodu Bifidobacterium se u kontrolní skupiny během pokusu nijak výrazně neměnil. Počet bifidobakterií se u probiotické skupiny zvyšoval do 14. dne konzumace jogurtů, kdy počet dosáhl nejvyšší hodnoty a následně se začal snižovat. Ve fázi doznívání se počet stále snižoval. U synbiotické skupiny se počet bifidobakterií zvyšoval až do 21. dne. To znamená, že se počet bifidobakterií zvyšoval po celou dobu konzumace jogurtů, oproti probiotické skupině, kdy hodnoty klesaly už sedm dní před ukončení fáze konzumace. U synbiotické skupiny se počet bakterií začal snižovat ve fázi doznívání, ale pokles nebyl tak výrazný jako u probiotické skupiny. Životaschopnost bifidobakterií v době doznívání je u synbiotické skupiny vyšší než u probiotické.
58
LA 7 S: 4,7+0,22.x-0,0073.x 2 R2 = 0,08; P<0,0001
log KTJ/g
6 Probiotika Synbiotika
5
K: 5,2+0,01.x-0,0004.x 2 R2 = -0,01; P<0,0001
Kontrola
4
P: 3,0+0,31.x-0,0096.x 2 R2 = 0,07; P<0,0001
3 0
7
14 Doba odběru
21
28
Obr. 5 - Celkový počet Laktobacilů ve vzorcích stolice U kontrolní skupiny se počet bakterií rodu Lactobacillus acidophilus během pokusu výrazně nelišil. U probiotické skupiny se počet laktobacilů zvyšoval do 14. dne konzumace jogurtů. Poslední týden konzumace se jejich počet snižoval. Po ukončení fáze konzumace se počet laktobacilů stále snižoval. U synbiotické skupiny se počet laktobacilů zvyšoval také do 14. dne konzumace jogurtů. Od 14. dne se počet bakterií začal snižovat. Pokles pokračoval i ve fázi doznívání. Celkový počet laktobacilů byl u synbiotické skupiny vyšší než u probiotické. Větší množství se zachovalo i ve fázi doznívání, kdy byla životaschopnosti mikroorganismů u obou skupin podobná.
59
5.2 Stanovení pH jogurtů Hodnoty pH byly měřeny v průběhu skladování po dobu 28 dní, ve dnech 0, 7, 14, 21, 26 a 28. V průběhu pokusu byly jogurty skladovány při teplotě 4 °C. Naměřené hodnoty pH jsou vypsány v tab. č. 6. Grafické vyjádření je znázorněno na obr. č. 6. Tab. 6 - Hodnoty pH jogurtů během doby skladování PROBIOTIKA Den
SYNBIOTIKA
Hodnota pH
Den
Hodnota pH
0
4,38
0
4,39
7
4,37
7
4,39
14
4,24
14
4,37
21
4,18
21
4,33
26
4,12
26
4,26
28
4,05
28
4,23
pH 4,45
pH probiotikum 4,4
pH synbiotikum
4,35
pH
4,3 4,25 4,2 4,15 4,1 4,05 4 0
7
14
21
28
Doba skladování
Graf Obr. 16 - Hodnoty pH jogurtů během doby skladování Na začátku skladování jogurtů byly naměřeny nejvyšší hodnoty pH. U probiotických jogurtů byla výchozí hodnota 4,38, u synbiotických jogurtů 4,39. Tyto hodnoty se během skladování postupně snižovaly. Kyselost probiotických jogurtů se zvyšovala více. Konečná hodnota byla 4,05, která ukazuje na vyšší kyselost probiotických jogurtů než synbiotických, kde byla konečná hodnota pH 4,23.
60
6
DISKUZE
Cílem experimentální části bylo sestavit pokusné skupiny osob pro ověření vlivu konzumace fermentovaných mléčných výrobků na modulaci střevní mikroflóry. Byly sestaveny tři pokusné skupiny: kontrolní (bez konzumace mléčných výrobků), skupina probiotická (konzumace probiotického jogurtu), skupina synbiotická (konzumace probiotického jogurtu s inulinem). Při výrobě probiotických jogurtů byly použity bakteriální
kultury Lactobacillus
acidophilus
a Bifidobacterium.
Při
výrobě
synbiotického jogurtu byl navíc přidán inulin. Každá skupina byla složena z 22 dobrovolníků. První fází experimentu byla fáze adaptační, kdy se nekonzumovaly žádné mléčné výrobky, po ní následovala fáze konzumace jogurtů (s výjimkou kontrolní skupiny) a poslední fází byla fáze doznívání. V průběhu se jednotlivcům odebíralo 6 vzorků stolice. Součástí pokusu bylo zabezpečení odběru vzorků a předání do mikrobiologické laboratoře, kde probíhaly mikrobiologické analýzy vzorků stolice dle zvolené metodiky. Složení střevní mikroflóry je proměnlivé. Přirozeně se vyskytující druhy bakterií můžeme rozdělit na zdraví prospěšné nebo potenciálně patogenní. Mezi bakterie s pozitivními účinky, které zároveň patří mezi probiotika, nejčastěji patří bakterie rodu Lactobacillus a Bifidobacterium. Těmto rodům bývají často připisovány příznivé vlastnosti, jako je stimulace imunitní odpovědi nebo vyloučení konkurenčních patogenů (ISOLAURI, 2004). Probiotika jsou definována jako živé mikroorganismy, které při podání v dostatečném množství poskytují zdravotní výhody pro svého hostitele (JENSEN et al., 2012). Již dávno byl prokázán zdravotní přínos tradičních jogurtů a ještě větší přínos jogurtů s obsahem probiotických bakterií. Během fermentace jogurtů dochází k hydrolýze mléčných proteinů, klesá pH, zvyšuje se viskozita a množství bakteriálních metabolitů, které ovlivňují chuť a možná i zdraví podporující vlastnosti jogurtu (FARNWORTH et al., 2007). Udržování vysoké úrovně životaschopných probiotických buněk v jogurtu během doby použitelnosti, není jednoduchý úkol. Mnoho faktorů ovlivňuje životaschopnost probiotik v jogurtech: kmen probiotika, akumulace kyselin, interakce se startovacími kulturami, úroveň rozpuštěného kyslíku a peroxidu vodíku a podmínky skladování. Za dostatečný počet probiotik ve výrobku se považuje hodnota 106 KTJ/ml před vypršením spotřební lhůty (NG et al., 2011).
61
Přežití probiotických mikroorganismů je závislé na pH okolního prostředí. Podle výzkumu LOURENS-HATTINGHA a VILJOENA (2001) se prokázal pokles počtu L. acidophilus při pH 2,0. Při pH 4,0 počet životaschopných buněk výrazně neklesal. Podle ŠILHÁNKOVÉ (2008) je optimální pH pro růst Lactobacillus spp. mezi hodnotami 5,4 a 6,4. Minimum pro růst je 3,8 až 4,4. Hodnoty pro jednotlivé kmeny se vzájemně liší v uvedeném rozmezí. Podle MAXE a RADY (1996) je optimální pH živného média pro bifidobakterie 6,5 až 7,0. Pomalý růst lze pozorovat ještě při pH 4,5 až 5,0. V našem experimentu se během skladování jogurtů, průběžně měřilo jejich pH. Na začátku skladování byly naměřeny nejvyšší hodnoty pH. U probiotických jogurtů byla výchozí hodnota 4,38, u synbiotických jogurtů 4,39. Tyto hodnoty se během skladování postupně snižovaly. Kyselost probiotických jogurtů se zvyšovala více. Konečná hodnota pH 4,05 ukazuje na vyšší kyselost probiotických jogurtů než synbiotických, kde byla konečná hodnota pH 4,23. Ve výzkumu DONKORA et al. (2006) byla hodnocena životaschopnost Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium lactis a Lactobacillus paracasei v jogurtech při hodnotách pH 4,45; 4,50; 4,55 a 4,60. V jogurtech byly přítomné i bakterie L. delbrueckii spp. bulgaricus a Streptococcus thermophilus. Hodnocení probíhalo v rozmezí 28 dnů při skladovací teplotě 4 °C. Na konci pokusu bylo zjištěno, že se během poklesu pH v průběhu skladování zvýšil obsah přítomných organických kyselin. Toto zvýšení kyselin patrně vedlo ke snížení počtu Bifidobacterium lactis. Lactobacilus acidophilus přežil lépe v kyselém prostředí oproti bifidobakteriím i oproti L. paracasei. SHAH a LANKAPUTHRA (1995) pozorovali vliv pH na životnost Lactobacillus acidophilus a Bifidobacterium bifidum v komerčních jogurtech. Ve všech výrobcích zaznamenali průběžný pokles počtu živých bakterií během skladování po dobu pěti týdnů. Počáteční hodnoty pH byly v rozmezí 4,07 a 4,36. Hodnoty pH na konci pokusu byly od 3,8 do 4,26. Během našeho experimentu mohla zvyšující se kyselost jogurtů způsobit snížení počtu životaschopných bakterií L. acidophilus a Bifidobacterium v jogurtech. To by vysvětlovalo pokles počtu bakterií ve vzorcích mezi 14. a 21. dnem konzumace jogurtů. Prebiotika jsou definována jako nestravitelné, zkvasitelné potraviny, které mají příznivý vliv na hostitele selektivní stimulací růstu a činnosti jednoho druhu, nebo omezeného počtu druhů bakterií v tlustém střevě. Prebiotika ovlivňují růst zdraví
62
prospěšných druhů bakterií tlustého střeva a zejména bakterie rodu Lactobacillus a Bifidobacterium spp (QUIGLEY, 2011). Podle studie DONKORA et al. (2007) jogurty s přídavkem prebiotika inulinu vykazovaly lepší zachování životaschopnosti L. acidophilus L10 a L. casei L26 během skladování v chladu. V odlišné studii než byla ta naše, AKINA et al. (2007) sledovali vliv inulinu na probiotické bakterie ve zmrzlinách. Přežití probiotických bakterií bylo větší u vzorků s přídavkem inulinu než u kontrolní skupiny. Nejspíš k tomu efektu došlo díky prebiotickému působení inulinu. Výsledky pokusu naznačily, že přídavek inulinu podněcuje zlepšení životaschopnosti L. acidophilus a B. lactis. Výsledky našeho pokusu, týkající se obsahu bakterií Bifidobacterium u synbiotické skupiny, naznačily podpůrný vliv prebiotika inulinu. Naše výsledky se shodují s výsledky jiných podobných studií.
6.1 Vliv konzumace jogurtů na celkový počet bakterií Enterococcus
6.1.1 Výsledky našeho experimentu V našem experimentu byl patrný vliv konzumace jogurtů na zvýšení počtu enterokoků ve vzorcích. U obou skupin konzumující jogurty došlo ke zvýšení počtu bakterií. U synbiotické skupiny se počet enterokoků zvyšoval déle než u probiotické. U kontrolní skupiny se počet enterokoků nepatrně zvýšil, nicméně hodnoty zůstaly bez výrazných změn po celou dobu pokusu.
6.1.2 Výsledky jiných studií v porovnání s naším pokusem Podle výzkumu MORENA et al. (2006) tvoří enterokoky velkou část přirozeně se vyskytujících bakterií v trávicím traktu savců. Po uvolnění do životního prostředí pomocí výkalů jsou schopni kolonizovat různé prostředí. Často se vyskytují v mléku. Díky jejich mimořádně schopnosti odolávat nepříznivým podmínkám jsou schopny růst i v nepřátelském prostředí. Odolnost Enterokoků vůči pasteračním teplotám, jejich adaptabilita na různé prostředí a růstové podmínky (nízké a vysoké teploty, extrémní pH a slanost) znamenají, že mohou být přítomny v potravinářských výrobcích z mléka nebo masa a v tepelně ošetřených potravinářských výrobcích. 63
Mnoho kmenů Enterokoků (zejm. E. faecalis, E. faecium) je schopno produkovat různé bakteriociny působící na patogeny jako je např. Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Clostridium ssp (GIRAFFA, 2003). Bylo obtížné porovnat výsledky našeho experimentu s výsledky jiných studií. Vliv jogurtů je většinou zaměřen na jiný rod bakterií než na rod Enterococcus. Podle výsledků našeho pokusu by mohlo být zvýšení počtů enterokoků u synbiotické a probiotické skupiny vysvětleno přísunem těchto bakterií z jogurtů do trávicího traktu. Toto tvrzení by bylo podloženo fakty o životaschopnosti a výskytu enterokoků v mléčných výrobcích, jak bylo zmíněno v dostupné literatuře.
6.2 Vliv konzumace jogurtů na celkový počet bakterií Bifidobacterium a Lactobacillus acidophilus
6.2.1 Výsledky našeho experimentu u bakterií Bifidobacterium U obou skupin konzumujících jogurty se počet bakterií rodu Bifidobacterium zvýšil. U kontrolní skupiny se množství bakterií výrazně nelišilo po celou dobu pokusu. U synbiotické skupiny se počet bifidobakterií zvyšoval do 21. dne pokusu, což vykazuje lepší životaschopnost bakterií oproti výsledkům u probiotické skupiny. Tam počet bakterií začal klesat o týden dříve. Ve fázi doznívání se počet bifidobakterií snižoval u obou skupin, ale u synbiotické skupiny pokles nebyl tak prudký jako u probiotik.
6.2.2 Výsledky našeho experimentu u bakterií Lactobacillus acidophilus Počet bakterií rodu Lactobacillus acidophilus se zvyšoval u probiotické i u synbiotické skupiny. V posledním týdnu konzumace jogurtů (po 14. dnu konzumace) se v obou případech počet laktobacilů začal snižovat. Ve fázi doznívání pokles nadále pokračoval. Životaschopnost bakterií ve fázi doznívání byla u obou skupin podobná.
6.2.3 Výsledky jiných studií v porovnání s naším pokusem V pokusu PALARIA et al. (2011) byl zkoumán vliv synbiotických jogurtů na mikroflóru v lidském střevě, konkrétně na střevní bakterie Bifidobacterium, Clostridium a Enterobacteriaceae. V jogurtech byla použita kultura Bifidobacterium 64
lactis a prebiotikum inulin. Třem pokusným skupinám byly odebírány vzorky stolice v 14 časových bodech. U obou skupin konzumujících jogurty, byl pozorován nárůst počtu bakterií Bifidobacterium v období konzumace jogurtů. Toto zvýšení bifidobakterií se podepsalo na výrazném snížení počtu klostridií, ale počet enterobakterií se nezměnil. Cílem dalšího experimentu podle MÄTTO et al. (2006), bylo zjistit přežití L. acidophilus a B. lactis, konzumovaných v jogurtech, po projití střevním traktem. Zjistili, že se konzumací jogurtů přechodně (po dobu konzumace) zvýšil počet bifidobakterií i laktobacilů ve střevech. Ve studii SAVARDA et al. (2011) byl zkoumán vliv jogurtů s Bifidobacterium lactis a Lactobacillus acidophilus na počet fekálních bakterií u dospělých lidí. Výsledky ukázaly, významné zvýšení počtu bifidobakterií i laktobacilů ve srovnání se skupinou, které bylo podáváno placebo. Podle COLLADO et al. (2006) došlo k výraznému zvýšení počtu bifidobakterií ve stolici při konzumaci kysaného mléka. Po ukončení konzumace byl patrný pokles počtu bakterií. Výsledky této studie se potvrdilo přežití Bifidobacterium lactis po průchodu trávicím traktem. Obecně kolonizace probiotickými bakteriemi trvá po tu dobu, pokud trvá suplementace. V jedné studii bylo prokázáno, že po ukončení suplementace vymizel Lactobacillus GG ze stolice u 67 % dobrovolníků během 7 dní (NEVORAL, 2009). Výsledky těchto studií se shodují s výsledky našeho experimentu. V našem experimentu se také zvýšil počet bakterií rodu Bifidobacterium i bakterií rodu Lactobacillus acidophilus ve vzorku vlivem konzumace jogurtů. Ve fázi konzumace se také počet těchto bakterií zvyšoval a ve fázi doznívání se začal postupně snižovat. Náš experiment naznačuje pozitivní vliv konzumace probiotického i synbiotického jogurtu. I v našem pokusu se navíc prokázal pozitivní vliv přídavku prebiotika do probiotického jogurtu, které mělo podpůrný vliv na růst prospěšných střevních bakterií a na životaschopnost bifidobakterií ve fázi doznívání po ukončení konzumace jogurtů, což se také shoduje s výsledky výše uvedených studií.
65
7
ZÁVĚR
Střevní mikroflóra je důležitou složkou trávicího traktu. V posledních letech se do popředí zájmu dostává nejen potlačení patogenních mikroorganismů, ale i možnost zlepšení zdravotního stavu člověka modulací jeho střevní mikroflóry. V posledních letech je populární výzkum probiotik a prebiotik a současně jejich využití v lidské výživě. Mezi nejznámější patří jogurty s probiotickými kulturami a to nejčastěji
rody
Bifidobacterium
a
Lactobacillus
acidophilus.
Pro dosažení
požadovaných terapeutických účinků je doporučována pravidelná konzumace alespoň 100g mléčného výrobku s minimálním obsahem 106 probiotických bakterií v 1 g výrobku. V souvislosti s probiotiky se často diskutuje problém prebiotik. Prebiotikum je nestravitelná složka potravy, která podporuje růst střevních bakterií, zejm. bifidobakterií. V neposlední řadě je důležitý vývoj synbiotických potravin, které obsahují jak probiotika, tak prebiotika, přičemž je očekáváno společné působení těchto dvou složek. V našem výzkumu bylo zjištěno zvýšení počtu bakterií ve stolici vlivem konzumace jogurtů. U probiotické i synbiotické skupiny se navýšil počet bakterií Bifidobacterium, L. acidophilus i Enterococcus. U kontrolních skupin se počet všech bakterií ve vzorcích výrazně neměnil. Výsledky naznačily pozitivní vliv inulinu na životaschopnost bakterií Bifidobacterium. Počet těchto bakterií, na rozdíl od probiotické skupiny, byl u synbiotik ve fázi konzumace jogurtů zvyšován o týden déle. Počet laktobacilů se u obou skupin konzumujících jogurty začal snižovat po 14. dni konzumace. Ve fázi doznívání se u synbiotické skupiny ukázala lepší životaschopnost přítomných bifidobakterií i enterokoků. Životaschopnost laktobacilů u probiotické a synbiotické skupiny byla podobná. Po ukončení konzumace jogurtů, ve fázi doznívání, začal počet všech bakteriálních rodů klesat. Podle
výsledků
lze
doporučit
pravidelnou
konzumaci
probiotických
i synbiotických jogurtů. U synbiotického jogurtu se navíc prokázal podpůrný vliv inulinu na prodloužení životaschopnosti bakterií. Probiotické výrobky jsou na našem trhu velmi dobře zastoupeny, proto by s jejich konzumací neměl být problém. Synbiotické výrobky mají na trhu mnohem menší zastoupení. Bohužel není synbiotickým výrobkům věnována taková pozornost, jakou by si zasloužily. Nicméně se v poslední době na český trh začínají dostávat jogurty s vlákninou, ve kterých bývá obsaženo i prebiotikum oligofruktóza. 66
8
POUŽITÁ LITERATURA
AKIN, M. B., AKIN, M. S., & KIRMACI, Z. (2007). Effects of inulin and sugar levels on the viability of yogurt and probiotic bacteria and the physical and sensory characteristics in probiotic ice-cream. Food Chemistry (104), 93-99. BABIČKA, L. (2009). Průvodce světem potravin. Získáno 22. leden 2012, z Informační centrum bezpečnosti potravin: http://www.bezpecnostpotravin.cz. BURDYCHOVÁ, R. (2009). Preventivní výživa (1. vyd.). Brno: Mendelu, 113 s., ISBN 78-80-7375-280-4. COLLADO, M. C., MORENO, Y., COBO, J. M., MATEOS, J. A., & HERNÁNDEZ, M. (2006). Molecular detection of Bifidobacterium animalis DN-173010 in human feces during fermented milk administration. Food Research International (39), 530535. DONKOR, O. N., HENRIKSSON, A., VASILJEVIC, T., & SHAH, N. P. (2006). Effect of acidification on the activity of probiotics in yoghurt during cold storage. International Dairy Journal (16), 1181-1189. DONKOR, O. N., NILMINI, S. L., STOLIC, P., VASILJEVIC, T., & SHAH, N. P. (2007). Survival and activity of selected probiotic organisms in set-type yoghurt during cold storage. International Dairy Journal (17), 657-665. DORÉ,
J.,
&
COTHIER,
G.
(2010).
The
human
intestinal
microbiota.
Gastroenterologie Clinique et Biologigue (34), 7-15. FARNWORTH, E. R., MAINVILLE, I., DESJARDINS, M. P., GARDNER, N., FLISS, I., & CHAMPAGNE, C. (2007). Growth of probiotic bacteria and bifidobacteria in a soy yogurt formulation. International Journal of Food Microbiology (116), 174-181. FELLEY, C., & MICHETTI, P. (2003). Probiotics and Helicobacter pylori. Best Practice & Research Clinical Gastroenterology (17), 785-791. GAJDŮŠEK, S. (2000). Mlékařství II. (2 vyd.), Brno: Mendelu, 135 s. ISBN 80-7157342-6.
67
GEIER, M. S., BUTLER, R. N., & HOWARTH, G. S. (2007). Inflammatory bowel disease: Current insights into pathogenesis and new therapeutic options; probiotics, prebiotics and synbiotics. International Journal of Food Microbiology (115), 1-11. GIRAFFA, G. (2003). Functionality of enterococci in dairy products. International Journal of Food Microbiology (88), 215-222. GOPAL, P. K., PRASAD, J., & GILL, H. S. (2003). Effect of the consumption of Biffidobacterium lactis HN019 and galacto-oligosacharides on the microflora of the gastrointestinal tract in human subject. Nutricion Research (23), 1313-1328. GÖRNER, F., & VALÍK, L. (2004). Aplikovaná mikrobiológia požívatín. (1 vyd.), Bratislava: Malé Centrum, 528 s. ISBN 80-967064-9-7. GUARNER, F., & MALAGELADA, J. R. (2003). Gut flora in health and diease. The Lancet (8), 512-519. ISOLAURI, E. (2004). Probiotics. Best Practice & Research Clinical Gastroenterology (18), 299-313. JENSEN, H., GRIMMER, S., NATERSTAD, K., & AXELSSON, L. (2012). The presence of live microorganisms, in particular lactic acid bacteria. International Journal of Food Microbiology (153), 216-222. KALAČ, P. (2003). Funkční potraviny: kroky ke zdraví. České Budějovice: DONA, 130 s. ISBN 80-7322-029-6. KOMPRDA, T. (2007). Základy výživy člověka. (1. vyd) Brno: Mendelu, 162 s. ISBN 80-7157-655-7. KOMPRDA, T. (2009). Výživou ke zdraví, (1 vyd.) Velké Bílovice: TeMi CZ s.r.o., 112 s., ISBN 978-80-87156-41-4. KOMPRDA, T. (2010). Soubor přednášek. Funkční potraviny , Brno, Mendelu. KREJSEK, J., KUDLOVÁ, M., KOLÁČKOVÁ, M., & NOVOSAD, J. (2007). Nutrice, probiotika a imunitní systém II. část: Nutrice, přirozená slizniční mikroflóra a individuální reaktivita. Pediatrie pro praxi , 156-162. 68
KVASNIČKOVÁ, A. (2000). Sacharidy pro funkční potraviny: probiotika, prebiotika, symbiotika. (1 vyd.) Praha: Ústav zemědělských a potravinářských nformací, 81 s. ISBN 80-7271-001-x. LOMAX, A. R., & CALDER, P. C. (2009). Prebiotics, immune function, infection and inflammation: a review of the evidence. British Journal of Nutrition (101), 633-658. LOURENS-HATTINGH, A., & VILJOEN, B. C. (2001). Yogurt as probiotic carrier food. International Dairy Journal (11), 1-17. LUKÁŠOVÁ, J. (2001). Hygiena a tachnologie mléčných výrobků. (1. vyd.), Brno: Veterinární a farmaceutická univerzita, 180 s. ISBN 80-7305-415-9. MANNING, T. S., & GIBSON, G. R. (2004). Prebiotics. Best Practice & Research Clinical Gastroenterology (2), 287 - 298. MÄTTÖ, J., FONDÉN, R., TOLVANEN, T., WRIGHT, A. v., VILPPONENSALMELA, T., SATOKARI, R., a další. (Octorber 2006). Intestinal survival and persistence of probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium strains administered in triple-strain yoghurt. International Dairy Journal (16), 1174-1180. MAXA, V., & RADA, V. (1996). Význam bifidobakterií a bakterií mléčného kvašení pro výživu a zdraví. (1. vyd.) Praha: Ústav zemědělských a potravinářských informací, 42 s. ISBN 80-85120-57-7. MORENO, M. R., SARATINOPOULOS, P., TSAKALIDOU, E., & VUYST, L. (2006). The role and application of enterococci in food and heath. International Journal of Food Microbiology (106), 1-24. NAGY, I., VINKLEROVÁ, V., & LUKEŠOVÁ, O. (2011). Probiotika, prebiotika, synbiotika a jejich vztah k imunitě. Výživa a potraviny (4), 86-87. NEVORAL, J. (2005). Prebiotika, probiotika a synbiotika. Pediatrie pro praxi (2), 5965. NEVORAL, J. (29. 1 2009). Zdravotnické noviny. Získáno 20. 3. 2012, z Postgraduální medicína:
http://www.zdn.cz/clanek/postgradualni-medicina/probiotika-a-jejich-
prakticke-uziti-412180. 69
NEVORAL, J. (2010). Probiotika a jejich klinické využití. Potravinářská revue (2), 1819. NG, E. W., YEUNG, M., & TONG, P. S. (2011). Effect of yogurt starter cultures on the survival of Lactobacillus acidophilus. International Journal of Food Microbiology (145), 169-175. NGUYEN, T. D., KANG, J. H., & LEE, M. S. (2007). Characterization of Lactobacillus plantarum PH04, a potential probiotic bacterium with cholesterol-lowering effects. International Journal of Food Microbiology , 113 (3), 358-361. O´FLAHERTY, S., & KLAENHAMMER, T. R. (2010). The role and potential of probiotic bacteria in the gut, and the communication between gut microflora and gut/host. International dairy Journal (20), 262-268. OELSCHLAEGER, T. A. (2010). Mechanisms of probioticactions - A rewiew. International Journal of Medical Microbiology (1), 57-62. OJETTI, V., GIGANTE, G., AINORA, M. E., FIORE, F., BARBARO, F., & GASBARRINI, A. (2009). Microflora imbalance and gastrointestinal diseases. Digestive and Liver Disease Supplements, (2), 35-39. PALARIA, A., JOHNSON-KANDA, I., & O´SULLIVAN, D. J. (2011). Effect of a Synbiotic Yogurt on Levels of Fecal Bifidobacteria, Clostridia, and Enterobacteria. Applied and Enviromental Microbiology (78), 933-940. QUIGLEY, E. (2010). Prebiotics and probiotics; modifying and mining the microbiota. Pharmacological Research (61), 213-218. QUIGLEY, E. M. (2011). The Use of Probiotics, Prebiotics and Synbiotics in the Management of Irritable Bowel Syndrome. European Gastroenterology & Hepatology Review (4), 233-236. RADA, V. (2010). Využití probiotik, prebiotik a synbiotik. Interní medicína (12), 9297. RAUCH, M., & LYNCH, S. V. (2011). The potential for probiotic manipulation of the gastrointestinal microbiome. Current Opinion in Biotechnology (23), 1-10. 70
ROBERFROID, M., & kolektiv. (2010). Prebiotic effects: metabolic and health benefits. British journal of Nutrition (104), 1-63. ROKYTA, R., MAREŠOVÁ, D., & TURKOVÁ, Z. (2003). Somatologie. (2. vyd.) Praha: Eurolex Bohemia, 264s, ISBN 80-86432-49-1. SAARELA, M., MOGENSEN, G., FONDEN´N, R., MäTTÖ, J., & MATTILASANDHOLM, T. (2000). Probiotc bacteria: safety functional and technological properties. Journal of biotechnology (84), 197-215. SAARELA, A., LÄHTEENMÄKI, L., CRITTENDEN, R., SALMINEN, S., & MATTILA-SANDHOM, T. (2002). Gut bacteria and health foods—the European perspective. International Journal of Food Microbiology (78), 99-117. SATOKARI, R. M., VAUGHAN, E. E., SMIDT, H., SAARELA, M., MATTO, J., & VOS, W. M. (2003). Molecular Approaches for the Detection and Identification of Bifidobacteria and Lactobacili in the Human Gastrointestinal Tract. Systematic and Applied Microbiology (26), 572-584. SAUNIER, K., & DORÉ, J. (2002). Gastrointestinal tract and the elderly: functional foods, gut microflora and healthy ageing. Digestive and Liver Disease (34), 19-24. SAVARD, P., LAMARCHE, B., PARADIS, M. E., THIBOUTOT, H., LAURIN, E., & ROY, D. (2011). Impact of Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 and, Lactobacillus acidophilus. International Journal of Food Microbiology (149), 50-57. SERVIN, A. L., & COCONNIER, M. H. (2003). Adhesion of probiotic strains to the intestinal mucosa and interaction with pathogens. Best Practice & Research Clinical Gastroenterology (17), 741-754. SIMEONOVOVÁ, J. (2003). Zpracování a zbožíznalství živočisných produktů. (1. vyd.) Brno: Mendelova univerzita, 122 s. ISBN 80-7157-708-1. SLÁDKOVÁ, P., & BURDYCHOVÁ, R. (2007). Mikrobiologická analýza potravin. (1. vyd.) Brno: Mendelu, 208 s. ISBN 978-80-7375-116-6. SLÁDKOVÁ, P., & HLAVÁČOVÁ, J. (2011). Speciální mikrobiologie. (1. vyd.) Brno: Mendelu, 88 s. ISBN 978-80-7375-558-4. 71
SZAJEWSKA, H. (2007). Probiotics and prebiotics in pediatrics: where are we now? The Turkish Journal of Pediatrics (49), 231 - 244. ŠILHÁNKOVÁ, L. (2008). Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. (3. vyd.) Praha: Academia, 364s, ISBN 978-80-200-1703-1 ŠUSTOVÁ, K. (2008). Mlékárenské technologie.přednášky, Brno: Mendelu. ŠVESTKA, T. (2008). Mikroflóra trávicího traktu a probiotika. Pediatria pre praxi , 1, 34-35. TODAR, K. (2009). The Normal Bacterial Flora of Humans. Získáno 21.1.2011, Online
Textbook
of
Bacteriology
Table
of
Contents,
dostupné
na:
http://textbookofbacteriology.net/normalflora.html TUOHY, k. M., PROBERT, H. M., SMEJKAL, C. H., & GIBSON, G. R. (2003). Using probiotics and prebiotics to improve gut health. Therapeutic focus , 692-700. VOTAVA, M., & kolektiv. (2003). Lékařská mikrobiologie speciální. Brno: Neptun. VYHLÁŠKA77/2003. (2003). Sb. kterou se stanoví požadavky pro mléko a mléčné výrobky, mražené krémy a jedlé tuky a oleje. WALSTRA, P. (1999). Dairy Technology: Principes of Milk Properties and Processes. New York: Marcel Dekker, 17727 s. ISBN 0-8247-0228-x.
72
9
SEZNAM TABULEK A OBRÁZKŮ
Obr. 1 - Technologické zpracování mléka na kysané ml. výrobky (LUKÁŠOVÁ, 2001) 18 Obr. 2 - Schematické znázornění dospělé střevní mikroflóry (ROBERFROID, 2010) ... 28 Obr. 3 - Celkový počet Enterokoků ve vzorcích stolice .................................................. 57 Obr. 4 - Celkový počet Bifidobakterií ve vzorcích stolice .............................................. 58 Obr. 5 - Celkový počet Laktobacilů ve vzorcích stolice ................................................. 59 Obr. 6 - Hodnoty pH jogurtů během doby skladování .................................................... 60 Tab. 1 - Dělení kysaných mléčných výrobků (LUKÁŠOVÁ, 2001) ................................. 13 Tab. 2 - Druhy mikroorganismů v kysaných mléčných výrobcích (Vyhláška 77/2003) 14 Tab. 3 - Nejčastěji používané probiotické miroorganismy (NEVORAL, 2005) .............. 33 Tab. 4 - Možnosti působení probiotik ve střevě (NEVORAL, 2005) ............................... 35 Tab. 5 - Prebiotické oligomery (MANNIN a GIBSON, 2004) ........................................ 42 Tab. 6 - Hodnoty pH jogurtů během doby skladování .................................................... 60
73
