Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin
Vliv konzumace probiotických jogurtů a prebiotik na počet bakterií rodu Bifidobacterium ve střevě. Diplomová práce
Vedoucí práce: Ing. Doubravka Rožnovská, Ph.D.
Brno 2011
Vypracovala: Ivana Imrichová
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Vliv konzumace probiotických jogurtů a prebiotik na počet bakterií rodu Bifidobacterium ve střevě vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne ………………………………………. podpis diplomanta …………………........
PODĚKOVÁNÍ Ráda bych poděkovala Ing. Doubravce Rožnovské, Ph.D. za odborné vedení a cenné rady při vyhotovení této práce a mikrobiologických analýzách. Děkuji Ing. Pavle Sládkové, Ph.D. za poskytnuté rady a pomoc při mikrobiologických analýzách. Dále bych chtěla poděkovat MUDr. Boženě Hofrové za pomoc a mnoho dobrých rad při realizaci experimentu. V neposlední řadě bych chtěla poděkovat všem dobrovolníkům, kteří se experimentu účastnili, společnosti HOLLANDIA Karlovy Vary, a.s. a jejímu řediteli Ing. Michalu Škodovi za poskytnutí vzorků a finančního daru a všem, kteří mi s experimentem pomáhali.
ABSTRAKT Vliv konzumace probiotických jogurtů a prebiotik na počet bakterií rodu Bifidobacterium ve střevě
Diplomová práce se věnuje problematice probiotik a prebiotik a jejich vlivem na gastrointestinální trakt. Praktická část se zabývá vlivem konzumace jogurtů s probiotickou kulturou (Bifidobacterium, Lactobacillus acidophilus) a prebiotik (inulinu) na obsah bifidobakterií ve střevě, který se stanovoval mikrobiologickým rozborem stolice dobrovolníků účastnících se studie. Čtyřiadvacet zdravých dobrovolníků ženského pohlaví ve věku 22 až 45 let bylo rozděleno do tří skupin: skupina K (kontrolní - nekonzumující jogurty ani inulin), skupina J (konzumující jogurty s probiotickou kulturou po dobu 21 dnů), skupina I (konzumující jogurty s probiotickou kulturou a po 14 dnech přídavek inulinu). Počet bakterií se stanovoval plotnovou metodou na agaru BSM s BSM suplementem. Výsledky byly zpracovány statistickým testem ANOVA. Při pravidelné konzumaci probiotických jogurtů sice došlo k nepatrnému zvýšení počtu bifidobakterií ve stolici, ale tento nárůst nebyl dostatečně velký na to, aby mohl být pokládán za průkazný. Po ukončení konzumace došlo k poklesu množství bifidobakterií ve stolici. Podobně tomu bylo při konzumaci inulinu, kdy došlo k nepatrnému zvýšení množství bifidobakterií ve stolici. Toto zvýšení ovšem také nebylo dostatečné, aby se mohlo pokládat za průkazné. Po ukončení konzumace jogurtů s přídavkem inulinu došlo opět k poklesu počtu bifidobakterií.
Klíčová slova: probiotika, prebiotika, jogurt, inulin, mikroflóra střev, bifidobakterie, gastrointestinální trakt
ABSTRACT The effect of the probiotic yogurt and prebiotics consumption on the number of bacteria of the genus Bifidobacterium in the intestine
This thesis is focused on probiotics and prebiotics and their effects on the gastrointestinal tract. The aim of the practical part was to investigate the effect of the consumption of probiotic yogurt (Bifidobacterium, Lactobacillus acidophilus) and prebiotic (inulin) on the Bifidobacterium content in the intestine. This was detected by microbiological analysis of the faeces of volunteers. Twenty four healthy female volunteers, aged 22 and 45 were chosen for tests. They were divided into three groups: The first group (Group K) were not given any yogurt or inulin. The second group (Group J) were given probiotic yogurt for 21 days and the third group (Group I) were given probiotic yogurt for 14 days and probiotic yogurt and inulin for 7 days. The number of bifidobacteria was detected by using BSM-Agar with BSM supplement and ANOVA was used for the statistical analysis. In spite of slight increase in the amount of bifidobacteria in the faeces after the regular probiotic yogurt consumption, the results were not statistically significant. After cessation of the yogurt consumption, the amount of bifidobacteria in the faeces decreased. The addition of inulin slightly increased the number of bifidobacteria, however it was not statistically significant. After the end of yogurt and inulin consumption, the amount of bifidobacteria decreased.
Keywords: probiotics, prebiotics, yogurt, inulin, intestine microbiota, bifidobacteria, gastrointestinal tract
SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK BMK
Bakterie mléčného kysání – LAB
BSM
Bifidus Selective Medium
FAO
Food and Agriculture Organization – Organizace OSN pro výživu a zemědělství
FOS
Fruktooligasacharidy
GALT
Gut Associated Lymphoid Tissues – lymfoidní tkáň spojená se střevem
GIT
Gastrointestinal tract, gastrointestinální trakt
GOS
Galaktooligosacharidy
HMOS
Human Milk Oligasaccharides – oligosacharidy mateřského mléka
IBS
Irritable Bowel Syndrom – syndrom dráždivého tračníku
IBD
Irritable Bowel Disease, idiopatický střevní zánět
IMO
Isomaltooligosacharidy
ITF
Inulin Type Fructans – fruktany inulinového typu
KTJ
Kolonie tvořící jednotky
LAB
Lactic Acid Bacteria – bakterie mléčného kvašení – BMK
NOAEL
No Observed Adverse Effect Level – dávka, která po celoživotní konzumaci nevyvolá žádný měřitelný negativní účinek
SCFA
Short Chain Fatty Acids – mastné kyseliny s krátkým řetězcem
WHO
World Health Organization – Světová zdravotnická organizace
XOS
Xylooligosacharidy
OBSAH 1 ÚVOD .......................................................................................................................... 10 2 CÍL PRÁCE ................................................................................................................. 12 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED ............................................................................................. 13 3.1 Střeva a jejich mikroflóra ...................................................................................... 13 3.1.1 Stavba střev .................................................................................................... 13 3.1.2 Přirozená střevní obrana ................................................................................. 15 3.1.3 Mikroflóra střev .............................................................................................. 16 3.1.3.1 Metabolická činnost mikroorganismů .................................................... 17 3.1.3.2 Kolonizace střev ..................................................................................... 19 3.4 Probiotika .............................................................................................................. 22 3.4.1 Obecná charakteristika probiotik .................................................................... 22 3.4.2 Mechanismus působení probiotik ................................................................... 24 3.4.3 Příznivé účinky probiotik ............................................................................... 25 3.4.4 Vedlejší účinky probiotik ............................................................................... 31 3.4.5 Charakteristika vybraných probiotických bakterií.......................................... 32 3.4.5.1 Bifidobakterie ......................................................................................... 32 3.4.5.2 Lactobacillus acidophilus ....................................................................... 34 3.4.6 Použití probiotik ............................................................................................. 34 3.4.6.1 Kysané (fermentované) mléčné výrobky (KMV) ................................... 36 3.4.6.2 Jogurty..................................................................................................... 39 3.5 Prebiotika .............................................................................................................. 40 3.5.1 Obecná charakteristika prebiotik .................................................................... 40 3.5.1.1 Nepříznivé účinky prebiotik ................................................................... 41 3.5.2 Rozdělení prebiotik......................................................................................... 42 3.5.2.1 Oligosacharidy – fruktooligosacharidy – inulin ..................................... 42 3.5.2.2 Xylooligosacharidy ................................................................................. 44
3.5.2.3 Isomaltooligosacharidy ........................................................................... 45 3.5.2.4 Galaktooligosacharidy ............................................................................ 45 3.5.2.5 Oligosacharidy mateřského mléka .......................................................... 45 3.5.2.6 Laktulóza ................................................................................................ 46 3.5.3 Funkce a význam prebiotik ............................................................................. 46 3.6 Synbiotika.............................................................................................................. 48 4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ....................................................................................... 49 4.1 Materiál ................................................................................................................. 49 4.2 Metodika................................................................................................................ 51 4.2.1 Příprava experimentu...................................................................................... 51 4.2.2 Průběh vlastního experimentu ........................................................................ 51 4.2.2.1 Časový harmonogram experimentu ........................................................ 52 4.2.2.2 Stanovení počtu bakterií rodu Bifidobacterium plotnovou metodou...... 53 4.2 Vyhodnocení ......................................................................................................... 56 5 VÝSLEDKY ................................................................................................................ 57 6 DISKUZE..................................................................................................................... 62 6.1 Vliv jogurtů s probiotickou kulturou na nárůst bifidobakterií .............................. 62 6.1.1 Výsledky konkrétních studií ........................................................................... 62 6.1.2 Výsledky experimentu .................................................................................... 63 6.2 Vliv inulinu na nárůst bifidobakterií ..................................................................... 64 6.2.1 Výsledky konkrétních studií ........................................................................... 64 6.2.2 Výsledky experimentu .................................................................................... 65 7 ZÁVĚR ........................................................................................................................ 67 8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ......................................................................... 69 9 SEZNAM OBRÁZKŮ, TABULEK A GRAFŮ .......................................................... 74 10 PŘÍLOHY .................................................................................................................. 75
1 ÚVOD Problematika probiotik a prebiotik je v dnešní době velmi populární, neboť je jí přisuzováno mnoho zdravotně prospěšných účinků, včetně pozitivního vlivu na trávicí trakt a na celkovou dobrou fyzickou a psychickou pohodu člověka. Některé pozitivní účinky probiotik a prebiotik jsou již prokázány i u lidí, jiné však stále prokázány nejsou. Především z etických důvodů mohou být zkoumány pouze in vitro nebo ve studiích se zvířaty. Kromě výše zmíněných účinků je také předmětem výzkumu, zda se po konzumaci dostanou probiotika až do tlustého střeva, a jakou dobu tam přetrvávají. U prebiotik se zkoumá především vliv na selektivní podporu růstu probiotik v tlustém střevě. Střevní mikroflóra je tvořena nepřeberným souborem mikroorganismů různých druhů a kmenů. U dospělého člověka činí 1 až 2 kg hmotnosti, což je v podstatě hmotnost lidského mozku. K optimální funkci střev musí být zachována mikrobiální vyváženost. Se změnou životního stylu, způsobu stravovaní, se zvyšujícím se stresem a užíváním antibiotik se v dnešní moderní době ovšem udržení správné střevní rovnováhy stává stále větším problémem. S vědomím, že střevní mikroflóra může hrát v hostitelově zdraví důležitou roli, je snahou změnit její složení k potenciálně prospěšnému složení. Toho lze docílit dvěma způsoby: 1) konzumací žijících mikroorganismů, které se díky své rezistenci k trávícím procesům (žaludečním kyselinám, trávícím enzymům, žlučovým kyselinám atd.) dostanou až do tlustého střeva, kde (dočasně) rostou a stávající se metabolicky aktivní; 2) konzumací nestravitelných látek, které jsou odolné vůči trávení, a stávají se tak v tlustém střevě potravou pro přebývající bakterie a tím stimulují jejich růst a metabolismus. Příznivé účinky konzumace podmáslí a jogurtů byly známy po staletí, ale teprve ve 20. století byly pozitivní účinky konzumace fermentovaných mléčných produktů spojovány s probiotiky obsaženými v těchto produktech. Pozitivní vliv probiotik objevil na počátku minulého století ruský lékař Ilja Mečnikov (1908), který tvrdil, že stárnutí člověka je způsobeno otravou střevní mikroflóry. Proti tomuto procesu je dle jeho názoru možno bojovat hlavně konzumací jogurtů s obsahem příznivě působících
10
bakterií. Také Louis Pasteur vyslovil větu: „Tyto organismy jsou nekonečně malé, ale jejich význam v přírodě je nekonečně velký.“ Změny způsobené konzumací probiotik ovšem mohou být jen dočasné. Na rozdíl od toho prebiotika působí na zlepšení hostitelova zdraví selektivní stimulací růstu anebo aktivity jednoho nebo více bakteriálních druhů, které jsou již ve střevě přítomny.
11
2 CÍL PRÁCE Cílem teoretické části práce bylo prostudovat dostupnou literaturu týkající se problematiky probiotik a prebiotik, jejich vlivu na gastrointestinální trakt a složení střevní mikroflóry. Cílem experimentální části bylo zjistit, jaký vliv na obsah bakterií rodu Bifidobacterium ve střevě má pravidelná konzumace probiotických jogurtů a inulinu. Dílčími cíly bylo sestavit pokusnou skupinu osob, poskytnout jim nezbytné instrukce, zajistit odběry vzorků a jejich převoz do mikrobiologické laboratoře, kde se provedla mikrobiologická analýza vzorků, jejich odečet a následné statistické zpracování.
12
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED
3.1 Střeva a jejich mikroflóra Střevo je neobyčejně složitý žijící systém, který se podílí na ochraně hostitele silnou obranou před agresory pocházejícími z vnějšího prostředí. Tato obranyschopnost je založena na třech složkách, které jsou mezi sebou v neustálém kontaktu a interakci. Jedná se o mikroflóru, bariéru střevní sliznice a místní imunitní systém (tj. lymfoidní tkáň spojená se střevem; GALT). Mezi další funkce střev patří také procesy vedoucí k trávení potravy a vstřebávání živin (Bourlioux, a kol., 2003). Množství a rozmanitost bakterií v různých částech gastrointestinálního traktu je ovlivněno pH, peristaltikou, dostupností živin, oxidačně-redukčním potenciálem uvnitř tkáně, věkem hostitele, zdravím hostitele, bakteriální adhezí, součinností bakterií, sekrecí hlenu obsahujícího imunoglobuliny, antagonismem bakterií a časem pasáže (Roberfroid, a kol., 2010).
3.1.1 Stavba střev Tenké střevo (intestinum tenue) je nejdelším úsekem trávicí trubice. Měří tři až pět metrů a tvoří jej tři části: dvanáctník – duodenum, lačník – jejunum a kyčelník – ileum. Dvanáctníkem navazuje tenké střevo na vrátník žaludku a kyčelníkem ústí do tlustého střeva. Dvanáctník je dlouhý 25 až 30 cm, má tvar podkovy, do jejíhož ohbí je vsunuta hlava slinivky břišní. Do dvanáctníku ústí žlučovod a vývod slinivky břišní. Na dvanáctník plynule navazuje lačník, který začíná ohnutím ležícím v levé polovině břišní dutiny a jeho kličky tvoří asi 2/3 délky tenkého střeva. Kyčelník zaujímá asi 1/3 celkové délky tenkého střeva a ústí v pravé kyčelní jámě do tlustého střeva. V ústí kyčelníku je jednosměrně průchodná chlopeň
(valva
ileocaecalis
–
ileocekální
chlopeň),
propouštějící obsah tenkého střeva do prvního úseku tlustého střeva (Hulín, a kol., 1984). Stavba stěny tenkého střeva je následující: sliznice dvanáctníku je složena do poloměsíčitých řas, které probíhají kolmo na podélnou osu střeva. Jejich výška se směrem od vrátníku snižuje. V lačníku a kyčelníku vybíhá sliznice v drobné prstovité výběžky – střevní klky (villi intestinales). Klky mnohonásobně zvětšují slizniční povrch střeva a umožňují resorpci živin na obrovské ploše (Hulín, a kol., 1984). 13
V hlubokých prohlubních mezi klky (Lieberkühnovy krypty) jsou uloženy střevní žlázky, produkující šťávu bohatou na enzymy. Buňky střevní sliznice kryjící povrch klků mají schopnost resorbovat rozštěpené živiny do krevního a mízního oběhu. Za tímto účelem jsou klky protkány hustou sítí cév. Krev a míza tudy protékající odvádějí vstřebané látky do jater nebo přímo k různým tkáním těla (Hulín, a kol., 1984). V podslizničním vazivu jsou uloženy uzlíky mízní tkáně, zejména na dvanáctníku se nachází i hlenové žlázy, jejichž sekret chrání slizniční povrch (Hulín, a kol., 1984). Vrstvy stěny tenkého střeva (Komprda, 2003): •
pobřišnice - mezenterium
•
seróza
•
podélná svalovina
•
myenterická nervová pleteň
•
kruhová svalovina
•
submukózní nervová pleteň
•
podslizniční svalovina
•
mukóza (sliznice) s klky
Obr. 1 Gastrointestinální trakt 14
Tlusté střevo (intestinum crassum) je konečným úsekem trávicí trubice a měří 1 m. Začíná oddílem slepého střeva a končí ústím análního kanálu. Tlusté střevo probíhá převážně po obvodu břišní dutiny. Dělí se na několik částí. Je to slepé střevo s červovitým výběžkem, vzestupný, příčný a sestupný tračník a esovitá klička. Poslední částí je konečník, který je vyústěním tlustého střeva ven z těla a plní funkci vypuzování výkalů (Hulín, a kol., 1984). Stěna tlustého střeva má stejné vrstvy jako stěna tenkého střeva. Sliznice je složena do poloměsíčitých řas a neobsahuje střevní klky. Sliznici tvoří pouze jedna buněčná vrstva a ve stavbě žlázek převládají pohárkové buňky produkující hlen (Hulín, a kol., 1984). Mezi důležité biologické funkce tlustého střeva patří absorpce a sekrece určitých elektrolytů a vody, stejně tak jako uchování a exkrece nevyužitých látek (Gibson a Roberfroid, 1995).
3.1.2 Přirozená střevní obrana Střevo je orgán, který přichází do kontaktu s exogenními činiteli (viry, bakteriemi, alergeny). Jeho primárním úkolem je chránit hostitele před těmito činiteli prostřednictvím střevní sliznice, místního imunitního systému a interakcí se střevními bakteriemi (trvale osídlujícími i přechodnými) (Collado, a kol., 2009). Bariérou proti vniknutí nebo příjmu patogenních mikroorganismů, antigenů a škodlivých sloučenin ze střevního lumenu je neporušený střevní epitel s optimální střevní flórou (Holzapfel, a kol., 1998). Další účinnou bariérou proti antigenům je střevní sliznice, která antigeny účinně vstřebává. Pro vyvolání specifické imunitní odezvy je nezbytný specializovaný mechanismus transportu antigenů přítomný ve vstřebávacím epitelu (klcích) a v Peyerových placích. U zdravých jedinců je tato bariéra stabilní, zabezpečuje ochranu hostitele a zajišťuje normální funkci střev a imunologickou rezistenci (Holzapfel, a kol., 1998). GALT (Gut Associated Lymphoid Tissues – lymfoidní tkáň spojená se střevem) je považován za největší imunitní orgán lidského těla. Je zde produkováno 70 až 80 % imunoglobulinů A (IgA). To převyšuje celkovou produkci všech ostatních druhů imunoglobulinů v těle. Za klíčový mechanismus, kterým probiotika ovlivňují GALT, se považuje adheze k epitelu a sliznici (Salvini, a kol., 2004). 15
Samotná střevní mikroflóra je nezbytná pro stimulaci imunitního systému střevní sliznice a pomnožení imunokompetentních buněk (Holzapfel, a kol., 1998). Je také důležitá k udržení správného prostředí střevního lumenu, neporušenosti sliznice střevního epitelu, výrazně se podílí také při metabolismu a absorpci živin (Gil a Rueda, 2002).
3.1.3 Mikroflóra střev Odhaduje se, že GIT (gastrointestinální trakt) dospělého člověka obsahuje asi 1014 životaschopných
bakterií,
což
představuje
desetinásobek
celkového
množství
eukaryotických buněk ve všech tkáních lidského těla (Holzapfel, a kol., 1998). Hmotnost mikrobů je u dospělého člověka ve střevech 1 až 2 kg (Turek, a kol., 2009). V žaludku se nachází jen málo bakterií kvůli velmi vysoké aciditě (pH 1), která zničí téměř všechny procházející bakterie (Holzapfel, a kol., 1998). Některé bakterie žijí na žaludečních stěnách. Počet osídlujících bakterií je asi 102 KTJ/ml obsahu. U zdravých lidí se podařilo izolovat laktobacily, enterokoky a bacily. Nejvíce prostudovanou bakterií žaludku je Helicobacter pylori způsobující žaludeční obtíže (Roberfroid, a kol., 2010). Nicméně vyprazdňování žaludku umožní některým bakteriím přežít a projít přes pylorický svěrač do dvanáctníku (Holzapfel, a kol., 1998). Prostředí dvanáctníku je kyselé (pH 4-5) s počtem bakterií 102 – 104 KTJ/ml obsahu, s převládajícími laktobacily a streptokoky (Roberfroid, a kol., 2010). Bakterie, které se sem dostanou, musí odolávat žlučovým solím a pankreatickým sekretům (Holzapfel, a kol., 1998). Mikroflóra lačníku je podobná a markantně se mění až v kyčelníku, kde dochází k nárůstu pH a obsahu bakterií na 106 – 108 KTJ/ml obsahu (Roberfroid, a kol., 2010). Tenké střevo je místem, kde probíhá mnoho bakteriálních infekcí jako salmonelóza nebo infekce způsobené E. coli. Z tohoto důvodu je tenké střevo cílem probiotik soupeřících s patogeny. Podobně oligosacharidy mateřského mléka mohou blokovat adhezi patogenů na povrchu epitelu (Roberfroid, a kol., 2010). V tlustém střevě se pH blíží neutrálním hodnotám a je tedy příznivé pro většinu bakterií (Roberfroid, a kol., 2010). Předpokládá se, že v tlustém střevě zdravých dospělých jedinců žije 300 až 400 různě kultivovatelných druhů patřících k více než 190 rodům. Mezi známou mikroflórou tlustého střeva dominuje pouze pár velkých skupin v počtech 1010 – 1011/g. Patří mezi ně skupiny striktních anaerobů, jako jsou rody Bacteroides,
Eubacterium,
Bifidobacterium 16
a Peptostreptococcus.
Fakultativní
anaeroby patří do flóry subdominantní, označované také jako „satelitní flóra“, zahrnující Enterobacteriaceae, streptokoky a laktobacily (Holzapfel, a kol., 1998). Reziduální flóra, kam patří minoritní skupiny a patogeny, je vždy přítomna v malém množství. U zdravých jedinců se zdá být množství případných toxických látek nedostatečné, aby hostiteli škodilo. Jejich množství by muselo být větší než 5x107/g (Holzapfel, a kol., 1998).
Potenciálně škodlivé
Bacteroides Eubacteria
Potenciálně příznivé
Bifidobacteria Anaerobní G+koky Clostridium Lactobacillus Methanogens E. coli Reducenti sulfátu Fusobacteria Enterobacteria Veillonella Staphylococci Proteus P. aeruginosa Obr. 2 Přehled prospěšných a škodlivých druhů bakterií (Bourlioux, a kol., 2003)
Pokud ve složení střevního ekosystému převládají bakterie příznivé pro zdraví nad bakteriemi škodlivými, nazýváme tento stav „normobióza“. Opačným stavem je tzv. „dysbióza“, při které ve střevě převládá škodlivá mikroflóra a tím vytváří podmínky pro rozvoj nemocí (Roberfroid, a kol., 2010).
3.1.3.1 Metabolická činnost mikroorganismů Doba průchodu bakterií zažívacím traktem je u zdravých osob 55 až 72 hodin, z toho 4 až 6 hodin připadá na průchod od úst ke slepému střevu a 54 až 56 hodin stráví v tlustém střevě. Doba strávená v tenkém střevě je tedy pro růst a množení bakterií příliš krátká. V tlustém střevě jsou oproti tomu vhodné podmínky (Bourlioux, a kol., 2003). 17
V tlustém střevě se také nachází dostatečné množství živin, které bakterie využívají k získání energie pro růst a množení. Živiny představuje všechna snědená potrava, která nebyla absorbována hostitelem a přešla přes ileocekální chlopeň (vláknina a nestravitelné sacharidy), odumřelé buňky a hlen, a metabolity pocházející z činnosti bakteriálních enzymů (Bourlioux, a kol., 2003). Hlavními substráty pro růst bakterií jsou potravní nestravitelné sacharidy, které uniknou hydrolýze a absorpci v tenkém střevě. Mezi nestravitelné sacharidy patří rezistentní
škrob
a rezistentní
dextriny,
neškrobové
polysacharidy
(pektiny,
arabinogalaktany, arabská guma, guarová guma a hemicelulózy), nestravitelné oligosacharidy (rafinóza, stachyóza, fruktany inulinového typu (ITF – inulin-type fructans), galaktany a manany) stejně jako nestrávené části disacharidů (laktóza) a alkoholických cukrů (laktitol, izomalt). Rezistentní škrob, neškrobové polysacharidy, většina potravní vlákniny a také některé nestravitelné oligosacharidy jsou fermentovány velkou řadou střevních bakterií, ačkoliv stupeň jejich rozkladu může být různý. Nicméně některé nestravitelné oligosacharidy jsou v tlustém střevě rychle a selektivně fermentovány (např. rafinóza, ITF a galaktany) malým množstvím bakterií (např. bifidobakterie, laktobacily) (Roberfroid, a kol., 2010). Celkový příjem nestravitelných sacharidů u západního typu stravování je asi 20 až 30 g/den. Endogenní sacharidy zejména z mucinu a chondroitin sulfátu zahrnují asi 2 až 3 g/den. Hlavní sacharolytické druhy střevní mikroflóry patří k rodům Bacteroides, Bifidobacterium, Ruminococces, Eubacterium, Lactobacillus a Clostridium (Roberfroid, a kol., 2010). Sacharidy jsou v tlustém střevě fermentovány na SCFA (mastné kyseliny s krátkým řetězcem – short chain fatty acids), hlavně acetát, propionát a butyrát a množství dalších metabolitů jako laktátové produkty, pyruvát, etanol, jantaran a také plyny H2, CO2, CH4 a H2S. Celkově SCFA okyselují luminální pH, čímž potlačují růst patogenů, a také ovlivňují střevní motilitu. Jsou rychle absorbovány střevní sliznicí a dodávají hostiteli energii (Roberfroid, a kol., 2010). Látky jako acetát, propionát a butyrát jsou velmi důležité, protože ovlivňují metabolismus tlustého střeva, jaterní regulaci lipidů a cukrů a dodávají energii buňkám (např. butyrát je živinou pro kolonocyty) (Bourlioux, a kol., 2003). Acetát je metabolizován hlavně ve svalech, ledvinách, srdci a mozku. Propionát je zpracováván játry, je možným glukogenním substrátem a může přispívat k inhibici syntézy cholesterolu. Může být také důležitý při regulaci ukládání tukové tkáně. Butyrát je 18
metabolizován střevním epitelem, kde slouží jako hlavní zdroj energie i jako regulátor růstu a diferenciace buněk. Je potvrzeno, že stimulací apoptózy může butyrát snižovat riziko rakoviny tlustého střeva. U rektálně podávaného butyrátu bylo zjištěno, že napomáhá při symptomech idiopatického střevního zánětu (IBD – Irritable Bowel Disease) (Roberfroid, a kol., 2010). Druhou důležitou skupinou látek pro bakteriální růst jsou bílkoviny, peptidy a aminokyseliny. Do tlustého střeva se denně dostane průměrně 25 g bílkovin. Jsou to nestravitelné části potravy, sekrety bakterií, odumřelé buňky epitelu, produkty bakteriálního rozpadu a hlen. Mezi hlavní proteolytické bakterie patří rody Bacteroides a Clostridium (Roberfroid, a kol., 2010). Proteiny jsou ve střevě fermentovány na větvené řetězce mastných kyselin (izobutyrát, izovalerát) a řadu dusíkatých a sirných sloučenin. Na rozdíl od zdraví prospěšných produktů sacharidové fermentace některé konečné produkty metabolismu aminokyselin mohou být pro hostitele toxické (např. amoniak, aminy a fenolické sloučeniny). Důsledkem toho je nadměrná fermentace bílkovin, zejména v koncové části tračníku, spojená s chorobami jako je rakovina tlustého střeva a syndrom dráždivého tračníku (IBS – Irritable Bowel Syndrom), které zpravidla začínají v této části střeva (Roberfroid, a kol., 2010). Fermentací látek poskytují mikroorganismy hostiteli také energii(Collado, a kol., 2009). Několik druhů střevní mikroflóry produkuje vitaminy. Převážně vitamin K a některé vitaminy skupiny B (Collado, a kol., 2009). Množení bakterií může mít ovšem také nepříznivé účinky. Kromě tvorby potenciálně karcinogenních látek a toxických metabolitů je to inaktivace určitých léčiv (Bourlioux, a kol., 2003).
3.1.3.2 Kolonizace střev Kolonizace střev je ovlivněna několika faktory, které budou popsány v následující části.
Porod vaginální a císařský řez Střeva novorozence jsou před porodem prostá bakterií. Během porodu a po porodu se jeho střeva začínají rychle kolonizovat. Kolonizace gastrointestinálního traktu bakteriemi začíná kontaktem novorozence s flórou porodních cest matky. Jedná se především o anaerobní bakterie (Bezirtzoglou, 1997). 19
Mikroflóra novorozenců, kteří na svět přišli císařským řezem, je charakterizována nedostatkem anaerobů. U těchto novorozenců se vyskytují převážně mikroaerofilní mikroorganismy, fakultativně anaerobní a sporulující formy jako např. Clostridium, protože jedinými zdroji mikrobiální kontaminace jejich gastrointestinálního traktu jsou bakterie pocházející z okolního prostředí a od zaměstnanců nemocnice (Bezirtzoglou, 1997).
Kojení a umělá kojenecká výživa Asi týden po porodu bez ohledu na druh porodu je vývoj střevní mikroflóry ovlivněn především výživou (Coppa, a kol., 2004). U dětí kojených mateřským mlékem je viditelný ostrý nárůst bifidobakterií s doprovodným snížením E. Coli a Streptococcus, zatímco počty klostridií jsou nízké nebo nulové. Je to způsobeno tím, že mateřské mléko obsahuje mimo jiné oligosacharidy mateřského mléka (Human milk oligosaccharides - HMOS), které podporují růst bifidobakterií (Holzapfel, a kol., 1998). Oproti tomu komplexní mikrofóra kojenců živených umělou kojeneckou výživou obsahuje vysoké množství fakultativních anaerobů, bakteroidů, klostridií a streptokoků. Aby se podpořil růst bifidobakterií i u nekojených dětí, je snaha vyrábět dětskou umělou výživu s přídavkem oligosacharidů podobných HMOS (Holzapfel, a kol., 1998, Mountzouris, a kol., 2002).
Přechod na pevnou stravu Při postupném přechodu kojených dětí na pevnou stravu přikrmováním vzroste počet klostridií, streptokoků, E. Coli, bakteroidů a Gram-pozitivních koků. Složení střevní flóry se tak začíná více podobat střevní flóře dětí na umělé kojenecké výživě. Po úplném odstavení kojení a zpravidla do konce druhého roku života je střevní mikroflóra podobná mikroflóře dospělých (Holzapfel, a kol., 1998).
Složení stravy Dle studií zvýšený příjem vlákniny vyvolává nárůst celé řady bakteriálních druhů. Více tuku způsobuje nárůst nesporulujících anaerobních bakterií a pokles bakterií mléčného kvašení. Zvýšený příjem bílkovin vyvolává nárůst bakterií mléčného kvašení.
20
Nejefektivněji ji je mikroflóra ovlivňována ovliv stravou při použití substrátů substrát specifických k určitým
rodům ům
nebo
druh druhům.
Např.,
pokud
jsou
do
stravy
p přidány
fruktooligosacharidy (prebiotika), které k jsou specificky využívané bifidobakteriemi, ifidobakteriemi, lze pozorovat vysoký nárůst koncentrace konce bifidobakterií a pokles bakteroid teroidů (Bourlioux, a kol., 2003).
Věk
Geny, receptory ?
Způsob porodu
Skladba stravy
Nestravitelné sacharidy, prebiotika
STŘEVNÍ MIKROFLÓRA
Mateřská řská flóra
Probiotika Antibiotika, léčiva
Novorozenecké prostředí
ňující kolonizaci střev st ev a složení mikroflóry GIT (Bourlioux, a kol., Obr. 3 Faktory ovlivňující 2003)
Vliv léčiv, antibiotik Příjem antibiotik způsobuje ůsobuje poškození flóry (Bourlioux, a kol.,, 2003). 2003)
Vliv věku Během stárnutí roste podíl bakteroidů b a snižuje se počet et bakterií mléčného mléč kvašení. Dle některých autorůů je to způsobeno zp částečnou nebo bo úplnou ztrátou bariéry, která je tvořena žaludeční kyselinou (Bourlioux, a kol., 2003). Složení normální mikroflóry dospělých dosp jedinců se považuje za stabilní, dokud není jedinec vystaven stresovým situacím, situacím nebo pokud mu nejsou podávána antimikrobiální léčiva. iva. Existují záznamy, které dokazují, že starší lidé mají střevo střevo osídleno menším počtem tem bifidobakterií a vyššími vyšší počty plísní a enterobakterií v porovnání rovnání s mladšími 21
dospělými. U starších lidí bylo také doloženo zvýšené množství bakterie Clostridium difficile než u mladších jedinců (Rautio, 2002).
Vliv genů, receptorů Na povrchu všech sliznic v těle leží ochranná vrstva hlenu, která je průběžně tvořena buňkami. Ve střevě existují 2 dva typy hlenu: 1) nerozpustný gel, který je pevně přilnut k buňkám; 2) viskózní vrstva, která je rozpustná ve vodě a pokrývá tento gel. Hlen je tvořen mucinem (přírodní glykoprotein, jehož struktura vytváří gel). Jeho polysacharidové složky tvoří pouze těchto pět sacharidů: galaktóza, fukóza, kyselina sialová, N-acetylglukózamin a N-acetylgalaktózamin. Polysacharidové struktury přichází do přímého kontaktu s bakteriemi a jejich důležitá role v rozpoznávacím procesu mezi buňkami je již dnes známá. Bakterie jsou gelem zachyceny pomocí specifického mechanismu (Bourlioux, a kol., 2003). Střevní lumen je doslova lemován sacharidy. Proto existuje velký počet míst pro potenciální navázání bakterií se speciálními povrchovými strukturami. Soubor těchto míst je ovlivněn geneticky (Bourlioux, a kol., 2003).
3.4 Probiotika 3.4.1
Obecná charakteristika probiotik
Název probiotika pochází z řeckého „pro bios“, což znamená „pro život“ (Soccol, a kol., 2010). Probiotika jsou živým doplňkem stravy, který příznivě ovlivňuje zdraví hostitele zlepšením rovnováhy jeho střevní mikroflóry (Fuller, 1989). Podle definice WHO (World Health Organization – Světová zdravotnická organizace) jsou probiotika živé mikroorganismy, které mají při konzumaci v dostatečném množství prospěšné účinky na zdraví konzumenta (FAO/WHO, 2002). Můžeme je získat nejčastěji ve formě fermentovaných mléčných výrobků nebo jako volně prodejné preparáty obsahující lyofilizované bakterie (Collins a Gibson, 1999). Mezi probiotické druhy se řadí především bakterie rodu Bifidobacterium, Lactobacillus a kvasinky. Jako probiotikum se používá také Saccharomyces boulardii.
22
Tato kvasinka byla izolovaná z ovoce liči v Indonésii. Její výhodou je rezistence ke všemu kromě mykocidních antibiotik (Tomasik a Tomasik, 2003).
Účinná probiotika by měla: -
Působit blahodárně na hostitele.
-
Být nepatogenní a netoxická.
-
Být schopna přežití a metabolizace v trávicím traktu – rezistentní vůči nízkému pH, organickým kyselinám a trávícím enzymům.
-
Být přilnavá k epitelovým buňkám.
-
Být schopna se rychle množit a trvale nebo dočasně kolonizovat trávicí trakt.
-
Obsahovat velké množství životaschopných buněk.
-
Zachovat si životaschopnost během skladování a používání.
-
Mít dobré senzorické vlastnosti.
-
Být izolována ze stejného druhu jako jejich plánovaný hostitel (Collins a Gibson, 1999, de Vrese a Schrezenmeir, 2008, Fuller, 1989, Tomasik a Tomasik, 2003).
Tab. 1 Mikroorganismy, které jsou označeny jako probiotika (O´Grady a Gibson, 2005) Rod
Druh
Lactobacilli
Lactobacillus acidophilus Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus reuteri Lactobacillus casei Lactobacillus gasseri Lactobacillus plantarum Lactobacillus johnsonii Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium longum Bifidobacterium breve Bifidobacterium adolescentis Bifidobacterium infantis Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Saccharomyces boulardii Lactococcus lactis subsp. lactis
Bifidobacteria
Enterococci Kvasinky Lactococci
Probiotický mikroorganismus nemůže ovlivnit své prostředí, pokud jeho populace nedosáhne určitého množství, které leží pravděpodobně v rozmezí 106 až 108 KTJ/g intestinálního obsahu. Aby mohlo být dosaženo této hranice, mikroorganismy musí být v intestinálním traktu schopny růstu a kolonizace. Ze skutečností uvedených 23
v předešlém textu je tedy vhodným místem pro kolonizaci probiotik terminální část kyčelníku a tlusté střevo (Walstra, a kol., 2006). U experimentů, ve kterých byly konzumovány rozdílné probiotické kmeny, se ukázalo, že po ukončení příjmu probiotik během pár týdnů probiotické kmeny obvykle z GIT vymizí. K dosažení příznivého účinku probiotik je tedy doporučena pravidelná konzumace probiotických produktů (denní dávka obvykle mezi 109 až 1011 KTJ) (Fondén, a kol., 2003). Množství bifidobakterií ve střevě se snižuje s věkem. K udržení jejich vysokých hodnot mohou být použity dvě strategie: 1) kontinuální konzumace preparátů nebo potravin obsahujících bifidobakterie; 2) do potravin mohou být přidány bifidogenní substráty nebo prebiotika, které podpoří růst bifidobakterií ve střevě (Alander, a kol., 2001).
Tab. 2 Funkční charakteristiky probiotických bakterií (Hutkins, 2006): Vlastnost Přežívání Kolonizace Bio-funkce Bezpečnost Tolerance vůči kyselinám + Tolerance vůči žluči + Tolerance vůči stresu + Kompatibilita se startovacími kulturami + Faktory adherence + Vazebné faktory + Prebiotický metabolismus + Vysoká rychlost růstu + Faktory kompetice + Produkce kyselin s krátkým řetězcem + Imunomodulace + Snižování hladiny cholesterolu + Protinádorové účinky + Podpora činnosti střevních bakterií + Hydrolýza laktózy + Antimikrobiální účinky + Stimulace produkce hlenu + Avirulence + Nezánětlivost + Bez vedlejších účinků + Bez genového transferu +
3.4.2
Mechanismus působení probiotik
Účinky probiotik mohou být rozděleny do tří skupin: 1) Probiotika mohou modulovat obranu hostitele (vrozenou i získanou imunitu). Tento mechanismus působení je s největší pravděpodobností důležitý pro prevenci a léčbu 24
infekčních onemocnění, ale také pro léčení (chronických) zánětů zažívacího ústrojí nebo jeho částí. Navíc toto probiotické působení by mohlo být důležité pro vyhubení buněk nádorového původu (Oelschlaeger, 2010). Probiotika chrání střevo kompeticí s patogeny o navázání na sliznici střeva, posílením těsného spojení erytrocytů a zlepšením slizniční imunitní odezvy vůči patogenům. Další složky ovlivňující imunitní systém jsou látky bakteriální stěny a bakteriální DNA (Gil a Rueda, 2002). 2) Probiotika mohou přímo působit na jiné mikroorganismy, komenzální anebo patogenní. To může být v mnoha případech významné pro prevenci a léčbu infekcí a obnovení střevní mikrobiální rovnováhy (Oelschlaeger, 2010). Konečným produktem metabolismu laktobacilů a bifidobakterií jsou mastné kyseliny s krátkým řetězcem (SCFA), které působí antagonisticky vůči jiným organismům. Jejich nahromaděním se sníží pH prostředí a vytvořením nepřijatelného prostředí inhibují růst škodlivých a patogenních mikroorganismů. Laktobacily, laktokoky a některé druhy bifidobakterií produkují bakteriociny, což jsou proteiny nebo komplexy proteinů s inhibujícím účinkem (Fooks a Gibson, 2002). 3) Probiotické účinky mohou být založeny na činnostech ovlivňujících látky jako toxiny a produkty hostitele, např. soli žlučových kyselin a složek potravy. Tyto činnosti mohou mít za následek inaktivaci toxinů, detoxikaci hostitele a složek potravy ve střevě (Oelschlaeger, 2010). Všechny tyto tři mechanismy se s velkou pravděpodobností podílejí na obraně proti infekci, prevenci rakoviny a stabilizaci nebo znovuobnovení fyziologické rovnováhy mezi střevní mikroflórou a jejím hostitelem. Pravděpodobně ale neexistuje probiotický organismus, který by působil všemi třemi mechanismy dohromady, přinejmenším ne v takové míře, která by mohla být léčivem pro prevenci nebo léčbu všech zmíněných druhů nemocí. Druh účinků, které určitá probiotika vykonávají, závisí na jejich metabolických vlastnostech, molekulách přítomných na jejich povrchu nebo na vylučovaných komponentách (Oelschlaeger, 2010).
3.4.3
Příznivé účinky probiotik
Probiotikům je přisuzováno mnoho příznivých zdravotních účinků. V prevenci a léčbě různých onemocnění jsou oblasti, kde jsou jejich účinky považovány za prokázané, zatímco v jiných oblastech prokázané nejsou a považují se za možné (Nevoral, 2010).
25
Potlačení endogenních patogenů
Kolonizace
Potlačení exogenních patogenů
Kontrola IBD
Kontrola IBS
Zmírnění symptomů potravinové alergie u kojenců
Rovnovážná střevní mikroflóra
Vyvážená imunitní odpověď
PROBIOTIKA
Poskytování SCFA a vitamínů střevnímu epitelu
Imunomodulace Metabolická aktivita Posílení vrozené imunity
Snížení rizikových faktorů rakoviny tlustého střeva Hydrolýza laktózy
Nižší počet toxigenních/mutagenních reakcí ve střevě
Dekonjugace a sekrece žlučových solí
Zlepšení laktózové tolerance
Snížení sérového cholesterolu
Obr. 4 Příznivé účinky probiotik na zdraví (Parvez, a kol., 2006)
Tab. 3 Evidence příznivých účinků probiotik na zdraví střev (Hutkins, 2006) Prokázané účinky Idiopatický střevní zánět Chronická pouchitida1 Ulcerózní kolitida1 Střevní infekce Akutní průjem2 Klostridiová kolitida3 Průjem způsobený antibiotiky3 1 Prevence recidivy 2 Léčba 3 Prevence 4 Pooperační prevence
Částečně prokázané účinky Pouchitida4 Cestovní průjem2,3 Epizodické průjmy3
26
Potenciální účinky Crohnova choroba2,4 Ulcerózní kolitida2 Pouchitida2
Tab. 4 Účinky probiotik na zdraví (Fondén, a kol., 2003) Prokázané účinky Zmírnění symptomů laktózové intolerance Léčba průjmu rotavirového původu Léčba kojeneckých enteritid Léčba průjmu způsobeného antibiotiky Zmírnění symptomů atopické dermatitidy u dětí Snižování biomarkerů (škodlivé fekální enzymy) Modulace střevní mikroflóry Modulace imunity Pozitivní efekt na rakovinu žlučníku a děložního hrdla
Potenciální účinky Zmírnění symptomů IBD Zmírnění symptomů IBS Zlepšení zácpy Antimutagenní/antikarcinogenní činnost Léčba kandidových a bakteriálních vaginóz Snižování cholesterolu a krevního tlaku Eradikace multirezistentních mikrobů Kontrola infekce Prevence přenosu AIDS a sexuálně přenosných nemocí
Průjmová onemocnění Dle výsledků randomizovaných studií s léčbou akutních průjmových onemocnění probiotiky došli vědci k těmto závěrům: •
Probiotika mírně zkracují dobu trvání průjmového onemocnění o 17 až 30 hodin.
•
Účinek je závislý dle použitého probiotika.
•
Je zřetelná závislost na dávce. Při dávkách vyšších než 1010 KTJ byly pozorovány vyšší účinky.
•
Probiotika jsou účinná proti vodnatým průjmům a virovým gastroenteritidám, nikoliv proti invazivním bakteriálním průjmům. Při včasném podání se objeví i lepší účinek.
Probiotika byla použita také v prevenci akutní gastroenteritidy u dětí. Při více než 17 měsíčním sledování mělo průjmové onemocnění pouze 7 % dětí, které byly živeny mlékem s probiotikem (Bifidobacterium bifidum a Streptococcus thermophilus), ve srovnání s 31 % dětí ve skupině bez probiotika. Lactobacillus rhamnosus GG působil také preventivně proti průjmovým onemocněním u hospitalizovaných dětí. Acidofilní mléko redukuje žaludeční pH a snižuje mikrobiální kolonizaci žaludku a následně i tracheální kolonizaci a výskyt pneumonií u pacientů na jednotce intenzivní péče v dvojité slepé randomizované studii (Nevoral, 2010). Příčinou průjmu cestovatelů jsou různí činitelé, ale většinou enterotoxická bakterie E. coli. Incidence u dospělých cestovatelů do cizích zemí je odhadována na 5 až 50 %. Závěrem meta-analýzy kvalitních studií bylo zjištěno, že Saccharomyces boulardii a směs Lactobacillus acidophilus a Bifidobacterium bifidum měly průkazně pozitivní 27
efekt. Použití probiotik je tedy považováno za bezpečnou a účinnou metodu v prevenci průjmových onemocnění turistů (Nevoral, 2010). Probiotika se ukázala jako účinná v léčbě průjmových onemocnění po terapii antibiotiky (Nevoral, 2010). Porušení nebo zničení střevní mikroflóry způsobené antibiotiky stejně tak jako následný nadměrný růst obyčejně neškodných bakterií (např. Clostridium difficile) vede často k průjmům a symptomům spojených s produkcí toxinů. Tento druh průjmu je častým klinickým problémem a vyskytuje se u 25 až 30 % pacientů (de Vrese a Marteau, 2007). Dle meta-analýzy podávání probiotik snižuje výskyt průjmů po antibioticích, přibližně na jednu třetinu (Nevoral, 2010). Probiotika působí také příznivě u průjmových onemocnění malých dětí způsobených rotaviry (Parvez, a kol., 2006).
Primární prevence alergií Při porovnání kojenců a dětí, u kterých se později projevila atopická dermatitida, mají již tři týdny po narození odlišné složení střevní mikroflóry něž děti zdravé. Několik studií prokázalo schopnost probiotik preventivně bránit rozvoji atopického ekzému. U alergické rýmy, astmatu a potravinové alergie však tento příznivý účinek pozorován nebyl. Na druhé straně existují také studie, které preventivní vliv probiotik neprokazují (Collado, a kol., 2009). Probiotika byla zkoušena také v léčbě atopického ekzému. Dle nedávno zveřejněné meta-analýzy jsou však probiotika v léčbě tohoto ekzému neúčinná (Nevoral, 2010).
Intolerance laktózy Asi 10 až 15 % dospělé populace má po požití již malého množství laktózy zažívací potíže, což je dáno výrazně sníženou aktivitou střevní laktázy. Laktóza je metabolizovaná bakteriemi a výsledkem je flatulence (nadýmání), průjem, nausea (pocit nevolnosti), bolesti břicha. Tito lidé lépe tolerují kysané mléčné výrobky. Jejich efekt je přisuzován delším průchodem GIT a účinkem živých bakterií, které obsahují enzym laktázu. Probiotikum díky laktáze pomáhá v tlustém střevě štěpit laktózu, a tak zlepšuje laktózovou toleranci (Nevoral, 2010).
28
Idiopatická střevní onemocnění (IBD) Idiopatická střevní onemocnění (Irritable Bowel Disease – IBD) jsou chronické a vracející se záněty postihující převážně tlusté nebo tenké střevo. Mezi tato onemocnění patří ulcerózní kolitida, pouchitida a Crohnova choroba (Collado, a kol., 2009). Ulcerózní kolitida – Dle meta-analytických studií jsou probiotika efektivní v udržování remise ulcerózní kolitidy a jejich účinek v prevenci relapsů (recidiv) onemocnění je srovnatelný s mesalazinem (kyselina 5-aminosalicylová, používá se k léčbě IBD). Crohnova choroba – Na základě analýz dosud provedených studií není v současné době přesvědčivý důkaz o tom, že probiotika jsou účinná v udržování remise Crohnovy choroby (Nevoral, 2010).
Dráždivý tračník (IBS) Symptomy dráždivého tračníku (Irritable Bowel Syndrom – IBS) trpí 3 až 25 % populace (Nevoral, 2010). Je charakterizován bolestmi břicha, plynatostí a změnami poruch hybnosti tlustého střeva (Collado, a kol., 2009). Výsledky studií s podáváním probiotik u dospělých byly různé. Jedna studie u dětí neprokázala příznivý efekt podávání Lactobacillus rhamnosus GG. V nedávné době však provedená meta-analýza 20 studií s celkem 1404 pacienty prokázala zlepšení symptomů při podávání probiotik ve srovnání s placebem (Nevoral, 2010).
Nekrotizující enterokolitida Tímto závažným onemocněním trpí nedonošené děti. V současné době se soudí, že ke vzniku nekrotizující enterokolitidy jsou potřeba tři faktory: nedonošenost, enterální výživa a bakteriální kolonizace. Dle meta-analytických studií podávání probiotik významným způsobem snížilo riziko těžké nekrotizující enterokolitidy nedonošených dětí (Nevoral, 2010).
29
Prevence nádorových onemocnění tlustého střeva Kolorektální karcinom je druhá nejčastější příčina úmrtí na nádorová onemocnění. Vzniká z abnormální proliferace epitelových buněk tračníku nebo rekta. Příjem probiotik, prebiotik nebo synbiotik je novou terapeutickou možností prevence výskytu tohoto druhu rakoviny, protože mění střevní mikroflóru. Tato strategie potlačuje rozvoj a progresi nádorů snížením střevních zánětů, zlepšením imunitních funkcí a antitumorgení aktivitou, navázáním na potenciální potravinové karcinogeny včetně toxinů masných výrobků a redukcí bakteriálních enzymů jako beta-glukuronidázy, která hydrolyzuje prekarcinogenní látky. Ochranný účinek probiotik a synbiotik na ujmutí, růst a metastázování transplantovaných a chemicky vyvolaných nádorů prokázalo několik studií na zvířatech (Collado, a kol., 2009).
Snižování krevního tlaku Předběžné výsledky klinických studií a studií na zvířatech indikují, že probiotika mohou snižovat krevní tlak. Pravidelná konzumace probiotik může poskytovat mírný preventivní účinek proti srdečním onemocněním (Parvez, a kol., 2006).
Zlepšení imunitních funkcí a prevence infekcí Dalším předloženým účinkem LAB a bifidobakterií u lidí je stimulace imunitního systému převážně nespecifickou aktivací fagocytů a zvýšenou aktivací obranných imunitních buněk. Nicméně u zdravých osob tyto účinky většinou nejsou pozorovány, proto se zdá, že probiotika nemodifikují imunitní odezvu. Klinická evidence pro tento imunitní účinek je limitovaná (Walstra, a kol., 2006).
Peptické vředy Infekce způsobená bakteriemi Helicobacter pylori je hlavním důvodem vzniku peptických vředů a rizikovým faktorem zhoubných nádorů žaludku. Léčba antibiotiky je velice efektivní, ale drahá, způsobuje vedlejší účinky a rezistenci k antibiotikům. Probiotika představují levnou alternativu. Dle studií probiotika in vitro inhibují H. pylori. Podle studií na zvířatech jsou účinná v redukci žaludečních zánětů vyvolaných 30
H. pylori. Sedm z devíti studií na lidech prokazují po podání probiotik dochází k zlepšení H. pylori gastritid a snížení koncentrace H. pylori. Přídavek probiotik k antibiotické léčbě zlepšil eradikaci onemocnění a také zmírnil vedlejší účinky léčby (Lesbros-Pantoflickova, a kol., 2007). Eradikaci infekcí H. pylori probiotickou léčbou zatím žádná studie neprokázala. Dlouhodobé užívaní výrobků obsahujících probiotika však může mít příznivé účinky na infekci H. pylori u lidí, především snížení rizika vzniku onemocnění spojených s vysokými počty žaludečních zánětů (Collado, a kol., 2009).
Prevence onemocnění a udržování zdraví Probiotika a jogurty jsou užívány pro udržení zdraví v mnoha společnostech na světě. L. reuteri ATCC 55730 snižoval absence v zaměstnání, nemocnost v pečovatelských zařízeních, omezoval koliky kojenců a epizody teplot a průjmů v dětských kolektivních zařízeních. Lactobacillus casei DN 114-001 a Lactobacillus rhamnosus GG také zlepšovaly odolnost k onemocněním v dětských zařízeních. Kombinace Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum a Lactobacillus gasseri zkracovala u dospělých dobu trvání onemocnění z nachlazení, ale nikoliv výskyt tohoto onemocnění. Předpokládaný mechanismus účinku je v posílení imunitní funkce a v přímé inhibici patogenu. Probiotika tedy mohou mít význam, pokud se zařadí do stravy zdravých lidí za účelem udržení zdraví. Takového tvrzení je však spíše dietním než klinickým doporučením a v současnosti není možno vytvořit specifické klinické doporučení. (Nevoral, 2010).
3.4.4
Vedlejší účinky probiotik
Probiotika jako živé mikroorganismy mohou být u citlivých jedinců teoreticky zodpovědné za 4 typy vedlejších účinků: infekce, zdraví škodlivé metabolické aktivity, přehnaná stimulace imunitního systému a transfer genů. Případů infekce bylo pozorováno však velmi málo. Ty se vyskytovaly především u velmi nemocných pacientů, kteří dostávali probiotické tablety pro zlepšení svého vážného stavu (Marteau a Seksik, 2004).
31
3.4.5
Charakteristika vybraných probiotických bakterií
Jelikož je probiotických kmenů velké množství, pro bližší charakteristiku byla vybrána probiotika vyskytující se v probiotickém jogurtu v experimentální části této práce, tedy rod Bifidobacterium obecně a z rodu Lactobacillus pouze druh Lactobacillus acidophilus.
3.4.5.1 Bifidobakterie Rod Bifidobacterium jsou tyčinky rozmanitého tvaru, obvykle mírně zakřivené a kyjovité, často zhuštěné či s náznaky větvení. Vyskytují se jednotlivě, v párech ve „V“ seskupeních, někdy v řetízcích, palisádách nebo růžicích (Sedláček, 2007). Jsou Gram-pozitivní, nepohyblivé, nesporulující, neacidorezistentní a anaerobní organismy (Sedláček, 2007). Některé druhy mohou tolerovat kyslík, některé jsou obligátně anaerobní (Shah a Lankaputhra, 2002), zatímco některé mohou tolerovat kyslík pouze v přítomnosti oxidu uhličitého (10 % CO2)(Sedláček, 2007). Jsou kataláza negativní, vzácně mohou být pozitivní při růstu na vzduchu doplněném o 10 % CO2 (Sedláček, 2007). Kataláza může rozložit peroxid vodíku produkovaný jinými BMK jako Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus. Peroxid vodíku je zodpovědný za inaktivaci enzymu fruktózo-6-fosfát-fosfoketolázy, který je hlavním enzymem bifidobakterií pro metabolismus cukrů (Shah a Lankaputhra, 2002). Bifidobakterie produkují převážně kyselinu octovou a mléčnou, obvykle v poměru 3:2. Produkují také kyselinu mravenčí, ethanol a kyselinu jantarovou. Někdy bývá udáváno, že neprodukují CO2, propionovou a máselnou kyselinu (Sedláček, 2007). Studie Shah a Lankaputhra (2002) však produkci kyseliny máselné a hippurové prokázaly. Bifidobakterie mohou růst při teplotách v rozmezí 25-45 °C, maximum je 43-45 °C, minimum 25-28 °C. Optimální teplota pro růst bifidobakterií lidského původu je 3638 °C, zatímco pro bifidobakterie zvířecího původu je optimum 41-43 °C. Při teplotách pod 20 °C a nad 46 °C se růst neprojevuje. Optimální pH pro růst je 6,5-7,0. Nerostou při pH pod 4,5-5,0 a nad 8,0-8,5. Při hodnotách pH pod 4,1 většina druhů hyne do jednoho týdne i při teplotách 4 °C. Při pH pod 2,5 hyne většina druhů do tří hodin. Uhličitany a bikarbonáty mohou být použity bifidobakteriemi jako zdroj uhlíku.
32
Bifidobakterie nemohou jako zdroj uhlíku využívat mastné kyseliny nebo organické kyseliny (Shah a Lankaputhra, 2002). Nacházejí se v ústech a střevním traktu teplokrevných obratlovců včetně člověka, u hmyzu a v odpadních vodách. U kojenců představují až 90 % střevní flóry (Sedláček, 2007). Dnes je zahrnuto do rodu Bifidobacterium 30 druhů, 10 z nich je lidského původu (zubní kazy, fekálie a vagina), 17 pochází ze zvířecího intestinálního traktu nebo bachoru, 2 z odpadních vod a jeden z fermentovaného mléka (Soccol, a kol., 2010). Poté co se přišlo na to, že růst bifidobakterií je stimulován mateřským mlékem, bylo provedeno mnoho studií. Zjistilo se, že nezbytnou látkou pro růst bifidobakterií je Nacetyl-D-glukosamin obsažený v mateřském mléce (Shah a Lankaputhra, 2002). Další bifidogenní látky jako laktulóza a prebiotika (oligosacharidy rafinóza, stachyóza a inulin) jsou popsány dále v textu). Maximální růst a produkce kyseliny mléčné byla zaznamenána u několika druhů v kravském mléce s 20% pepsinem natráveného mléka, a u mléka s 2 % laktulózy. Byl také zaznamenán růst u syrovátky natrávené pepsinem, syrovátky se syrovátkovými proteiny natrávenými pepsinem, syrovátkových proteinů natrávených pepsinem a smetany natrávené pepsinem (Shah a Lankaputhra, 2002). Růst bifidobakterií také nastává ve smetaně s obsahem 1 % dextrózy a 0,1% kvasnicového extraktu. Produkce kyselin může být zvýšena přidáním 0,05 % cysteinu anebo 0,2% kvasničného extraktu nebo 0,2 % tryptonu. Cystein se ukázal být nezbytným pro růst bifidobakterií. Navíc cystein a další látky obsahující –SH skupiny přispívají ke snižování redoxního potenciálu a tím zlepšují životaschopnost bifidobakterií (nemusí to platit pro všechny bifidobakterie). Pomalý růst těchto bakterií v mléce je dán chybějící proteolytickou aktivitou. Přidáním zdroje dusíku ve formě peptidů nebo aminokyselin zlepší jejich životaschopnost. Zvýšená produkce kyselin je také v plnotučném mléce, kde jsou peptidy a aminokyseliny získané proteolytickými mikroorganismy Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus nebo Lb. casei (Shah a Lankaputhra, 2002). Muciny (glykoproteiny hlenu) jsou také růstovými faktory pro Bifidobacterium spp. Jsou vylučovány mucinozními buňkami slinných žláz a GIT. Muciny jsou oligosacharidy galaktózy, fukózy, N-acetyl-galaktosaminu, N-acetyl-glukosaminu a kyseliny sialové spojené v peptidy jako prolin, serin a threonin. Glykoproteiny
33
izolované z mleziva se jeví jako efektivní při podpoře růstu bifidobakterií (Shah a Lankaputhra, 2002).
3.4.5.2 Lactobacillus acidophilus Druh Lactobacillus acidophilus patří do 1. skupiny rodu Lactobacillus, která je obligátně homofermentativní, což znamená, že fermentuje hexózy výhradně na kyselinu mléčnou; pentózy ani glukonát nefermentují (Sedláček, 2007). Jsou to tyčinkovité nepohyblivé bakterie se zaoblenými konci, velikosti 0,6-0,9 x 1,5-6 µm. vyskytující se jednotlivě, v párech nebo krátkých řetízcích (Hammes a Hertel, 2009). Jsou Grampozitivní, fakultativně anaerobní, kataláza negativní a nesporulující (Curry a Crow, 2002). Jejich nezbytné výživové požadavky jsou kalcium pantotenát, kyselina listová, niacin a riboflavin. Pyridoxal, thiamin, thymidin a vitanin B12 nejsou nutné (Hammes a Hertel, 2009). Izolovány ze střevního traktu člověka a zvířat, úst a vaginy člověka, kvasu chlebového těsta a vína (Hammes a Hertel, 2009). Optimální růstová teplota je 30 až 40 °C a optimální pH obvykle v rozmezí 5,5 až 6,2 (Sedláček, 2007). Jsou schopni růstu při 45 °C (Gopal, 2002). Lactobacillus acidophilus se nedá spolehlivě rozlišit od Lactobacillus gasseri, Lactobacillus
crispatus
a
Lactobacillus
amylovorus
žádným
jednoduchým
fenotypickým testem. Pro toto odlišení je potřeba provést elektroforetickou analýzu rozpustných proteinů buňky nebo laktátových dehydrogenáz, detailní studie buněčné stěny nebo přednostně genotypické identifikační metody (Hammes a Hertel, 2009).
3.4.6
Použití probiotik
Probiotika se používají v mnoha výrobcích, z nichž nejdůležitějšími jsou kysané mléčné výrobky. Přidávají se také do fermentovanách masných výrobků nebo cereálních výrobků.
34
Tab. 5 Známé a komerčně přístupné kmeny označované jako probiotika (Görner a Valík, 2004) Probiotické kmeny bakterií
Výrobce
Lactobacillus acidophilus La 1 Lactobacillus acidophilus L-1 Lactobacillus acidophilus CH5 Lactobacillus acidophilus NCFB 1748 Lactobacillus casei G6 Lactobacillus casei Shirota Lactobacillus reuteri Lactobacillus rhamnosus GG Enterococcus faecium M 74 Lactobacillus lactis L1A Bifidobacterium sp. BB12 Bifidobacterium longum BB536
Nestlé Mona Chr. Hansen Arla Valio Yakult BioGaia Valio Mediapharm Morrmejerier Chr. Hansen Morinaga – Wiesby
Aby bylo možno tvrdit, že potravina má probiotický efekt, musí splňovat směrnice vytvořené WHO (FAO/WHO, 2002). Postup výběru probiotických bakterií pro použití do potravin je následující: Nejdříve musí být kmen identifikován a charakterizován na úroveň rodu druhu a kmene pomocí fenotypových a molekulárně genetických metod. Identifikace kmenu je velmi důležitá kvůli specifickým zdravotním účinkům, epidemiologickým studiím i kvůli kontrolám. Identifikovaný kmen je následně bezpečně uložen do mezinárodní sbírky mikroorganismů. Dále dochází k testování funkčních charakteristik pomocí in vitro testů a také pomocí testů na zvířatech. Testuje se rezistence vůči kyselinám a žluči, adherence na střevní buňky a produkce specifických metabolitů. Dále se prokazuje bezpečnost kultury, což je velmi důležitá vlastnost. Bezpečnost se prokazuje pomocí in vitro testů, pokusy na zvířatech a aplikací lidským dobrovolníkům. Faktory patogenity, především produkce enterotoxinů a enteroinvazivita, musí být vyloučeny. V rámci lidských studií jsou vyžadovány dvojitě zaslepené randomizované placebem kontrolované studie, které by měly být nejméně dvakrát zopakovány. V další fázi nastává výroba probiotické potraviny. Musí se zohlednit technologické vlastnosti (přežívání po kryokonzervaci a lyofilizaci), určit skladovací podmínky, doba spotřeby nebo trvanlivosti a koncentrace živých buněk v potravině nebo potravním doplňku. Důležité také je, aby probiotické kmeny přežívaly až do konce spotřební doby (FAO/WHO, 2002). Pokud se jedná o fermentované mléčné probiotické výrobky, jako
35
účinné množství se považuje obsah nejméně 106 životaschopných buněk na gram výrobku (Rada, 2010).
3.4.6.1 Kysané (fermentované) mléčné výrobky (KMV) Kysaným mléčným výrobkem je mléčný výrobek získaný kysáním mléka, smetany, podmáslí nebo jejich směsi za použití mikroorganismů mléčného kysání, tepelně neošetřený po kysacím procesu (Vyhláška č. 77/2003 Sb). Základem jsou biochemické pochody, při nichž se laktóza přemění anaerobní fermentací na kyselinu mléčnou pomocí beta-galaktosidázy, která je produktem bakterií mléčného kvašení (BMK, Lactic Acic Bacteria - LAB) (Lukášová a kolektiv, 2001). Dnešní fermentované mléko má pravděpodobný původ ve způsobu skladování syrového mléka v dobách před vynalezením chladící techniky. Skladování mléka při určitých podmínkách podporovalo růst a činnost BMK, které přeměnily původní mléko v novou formu s odlišnými organoleptickými vlastnostmi (Gilliland, 1998). V odlišných klimatických pásmech pak vznikaly různé druhy kysaných mléčných výrobků. V mírném pásmu vznikalo obyčejné zakysané mléko, protože bylo fermentováno mezofilními BMK. V subtropickém pásmu vznikl klasický jogurt působením termofilních BMK. Ve východní Evropě, centrální Asii, v Zakavkazsku a jinde vznikly výrobky jako kefír a kumys fermentací BMK a kvasinek (Görner a Valík, 2004). Kromě toho že mléko získalo příjemnou chuť a vůni, fermentovaný výrobek nepodléhal zkáze a byl lépe uchovatelný (Gilliland, 1998). Kysané mléčné výrobky jsou tradičními mlékárenskými výrobky. V tržním sortimentu se nachází velká řada těchto produktů, která se stále rozšiřuje. Mnoho těchto výrobků se uplatňuje v různých dietách a při léčebné výživě (Lukášová a kolektiv, 2001).
36
Tab. 6 Členění KMV na skupiny a podskupiny dle vyhlášky č. 77/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro mléko a mléčné výrobky, mražené krémy a jedlé tuky a oleje Druh Kysaný mléčný výrobek
Skupina Jogurt
Podskupina nízkotučný nebo odtučněný, se sníženým obsahem tuku, smetanový
Jogurtové mléko Acidofilní mléko Kefír Kefírové mléko Kysané mléko nebo smetanový zákys Kysaná nebo zakysaná smetana Kysané podmáslí Kysaný mléčný výrobek s bifidokulturou
KMV jsou velmi ceněny pro svůj nutriční, biologický a léčebný význam. Jsou vhodné prakticky pro všechny populační skupiny. Obsahují všechny složky z mléka (některé
druhy
KMV
v technologicky
upraveném
množství),
mají
vhodné
organoleptické vlastnosti, jsou sytivé a relativně snadno stravitelné (z žaludku odcházejí rychleji než sladké mléko)(Lukášová a kolektiv, 2001). Nutriční a energetická hodnota KMV/100g závisí na obsahu tuku, bílkovin a cukrů jednotlivých tržních druhů a pohybuje se v rozmezí asi od 130 do 800 kJ. Jogurty jsou vhodným nosičem zejména pro minerální a vitaminové doplňky (Lukášová a kolektiv, 2001). Produkcí kyseliny mléčné, resp. dalších kyselin dochází ke snižování pH střevního traktu. Důsledkem je zvýšená retence vápníku, fosforu, železa a stabilizace produkce vitamínů skupiny B (Simeonovová, a kol., 2003). Velký význam mají metabolické produkty BMK a přítomná probiotika ovlivňující skladbu intestinální flóry. Antibakteriální účinek mikroflóry kultur užívaných při výrobě KMV vůči řadě patogenů byl prokázán v sekundárně kontaminovaných KMV in vitro i v pokusně vyráběných KMV (Lukášová a kolektiv, 2001). Mikroflóra KMV působí příznivě na detoxikaci např. nitrátů, nitritů i některých dalších látek v trávicím traktu, snižuje hladiny sérového cholesterolu a toxických aminů a stimuluje kvalitu imunitního systému aj.(Lukášová a kolektiv, 2001).
37
Hlavní změny složek mléka při výrobě KMV Laktóza – V průběhu výroby KMV je 20 až 30 % laktózy přeměňováno pomocí enzymů startovacích kultur na kyselinu mléčnou. Kyselina mléčná přispívá k lepšímu využití vápníku, fosforu a železa, sráží bílkoviny v jemných vločkách, podporuje sekreci žaludečních šťáv a aktivitu pepsinu. Její koncentrace je v rozmezí 0,5 až 1 %. Možnost konzumace KMV u osob s laktózovou intolerancí je pravděpodobně způsobena uvolňováním beta-galaktosidázy, rozpadem buněk kysacích kultur ve střevě (Lukášová a kolektiv, 2001). Konzumenti s laktózovou intolerancí mohou díky sníženému obsahu laktózy strávit kysané mléčné výrobky mnohem lépe než obyčejné mléko (Walstra, a kol., 2006). Vedle uvedeného homofermentačního procesu může probíhat i proces heterofermentační, při kterém jsou v menší míře produkovány další produkty. Tak vznikají těkavé mastné kyseliny (např. mravenčí, octová, propionová aj.), karbonylové sloučeniny (acetaldehyd, diacetyl aj.), etanol a CO2. Některé z těchto látek vznikají i z jiných substrátů (např. z aminokyselin a citrátů) (Lukášová a kolektiv, 2001). Mléčný tuk – Porovnáním čerstvého a fermentovaného mléka lze zjistit u KMV relativní změny v množství volných mastných kyselin (Lukášová a kolektiv, 2001). Lipolýzou
uvolněné
mastné
kyseliny
příznivě
ovlivňují
stravitelnost
tuků
(Simeonovová, a kol., 2003). Bílkoviny – Během fermentací proteolyticky aktivnější laktobacily uvolňují z kaseinu peptidy a aminokyseliny, které jsou využívány jako zdroj dusíku. Kvalita těchto změn je závislá na druhu kultur, podmínkách vedení fermentací, zejména na době působení teplot a dosažených hodnot pH (Lukášová a kolektiv, 2001). Koagulované a proteolyzované mléčné bílkoviny jsou lépe stravitelné (Simeonovová, a kol., 2003). Vitaminy – Vitaminy jsou v průběhu fermentace spotřebovávány bakteriemi mléčného kysání a následně jsou těmito mikroorganismy produkovány. Rozdíly v obsahu vitamínů jsou rozdílné dle použitých kultur. Minerální látky – Fermentace nemá vliv na obsah minerálních látek (Lukášová a kolektiv, 2001).
38
Tab. 7 Druhy živých mikroorganismů v kysaných mléčných výrobcích dle vyhlášky č. 77/2003 Sb. Název kysaného Použitá kultura Mléčná mikroflóra výrobku výrobku v 1 g Acidofilní mléko Lactobacillus acidophilus a další mezofilní, 106 Lactobacillus příp. termofilní kultury bakterií mléčného acidophilus kvašení Jogurty*) Protosymbiotická směs Streptococcus salivarius 107 subsp. thermophilus a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Kysané mléko vč. Monokultury nebo směsné kultury bakterií 106 smetanového mléčného kvašení zákysu, podmáslí a kysané smetany Kefír Zákys připravený z kefírových zrn, jehož BMK 106 a kvasinky mikroflóra se skládá z kvasinek zkvašujících 104 laktózu Sacharomyces unisporus, Sacharomyces cerevisiae, Sacharomyces exignus a dále Leuconostoc, Lactococcus a Aerobacter, rostoucí ve vzájemném společenství Kefírové mléko Zákys skládající se z kvasinkových kultur rodu BMK 106 a kvasinky Kluyveromyces, Torullopsis nebo Candida 102 valida a mezofilních a termofilních kultur bakterií mléčného kvašení v symbióze Kysaný mléčný Bifidobacterium sp. v kombinaci s mezofilními 106 bifidobakterie výrobek s bifido- a termofilními bakteriemi mléčného kvašení kulturou *) U jogurtových výrobků mohou být kromě základní jogurtové kultury přidávány kmeny produkující kyselinu mléčnou a pomáhající dotvářet specifickou chuťovou nebo texturovou charakteristiku výrobku. Musí však být zachován optimální poměr obou základních kmenů jogurtové kultury.
3.4.6.2 Jogurty Jogurt je kysaný mléčný výrobek získaný kysáním mléka, smetany, podmáslí nebo jejich směsi pomocí mikroorganismů uvedených v tabulce č.7 (Vyhláška č. 77/2003 Sb.). Jogurty jsou vyráběny z pasterovaného mléka s rozdílným obsahem mléčného tuku, který se může pohybovat v rozmezí 0 % až 3,2 %. Pokud obsahuje výrobek mléčný tuk, bývá většinou před zaočkováním kultury homogenizován, což zaručuje, že smetana během fermentačního procesu nevyvstává k povrchu. Pro zlepšení textury a konzistence výrobku bývá v mnoha případech před pasterací přidáváno ještě nízkotučné sušené mléko. Někdy se přidávají také stabilizátory pro zadržování vody a tím může být dosaženo pevnější konzistence a textury (Gilliland, 1998). Pasterace probíhá při teplotách 85 až 95 °C po dobu pěti minut. Poté se rychle ochladí na 30 až 40 °C a přidají se jogurtové kultury. U klasického typu zrání dochází k fermentaci 39
přímo ve spotřebitelksém obalu při teplotě 40 až 45 °C pod dobu 2 až 4 hodin. Po této době jsou výrobny přemístěny do chladírny a tím dojde k zastavení procesu fermentace (Šustová, 2010). Typickými startovacími kulturami jogurtu je směs Streptococcus thermophilus (S. salivarius subsp. thermophilus) a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus v různém poměru, nejčastěji 1:1. Pokud je v kultuře více laktobacilů, výsledná chuť je kyselejší (Gilliland, 1998). Nové druhy výrobků mohou také obsahovat kultury druhu Lactobacillus acidophilus nebo Bifidobacterium. Tím se stanou zdrojem pro spotřebitele prospěšných probiotických bakterií. Tradiční startovací jogurtové kultury (např. S. thermophilus a Lb. delbrueckii) nerostou v intestinálním traktu. Mohou poskytovat některé prospěšné účinky, zejména zlepšením využití laktózy u osob s poruchami trávení laktózy (Gilliland, 1998). Mohou být také podpůrnými bakteriemi pro růst probiotických kultur, které v mléce špatně rostou (Walstra, a kol., 2006).
3.5 Prebiotika 3.5.1
Obecná charakteristika prebiotik
Prebiotika jsou definována jako nestravitelné složky potravy, které příznivě ovlivňují hostitele selektivní stimulací růstu a/nebo aktivity jedné bakterie nebo omezeného počtu střevních bakterií, a tím zlepšují zdraví hostitele (Gibson a Roberfroid, 1995).
Aby mohly být složky potravy klasifikovány jako prebiotika musí splňovat tato kritéria: 1) Nesmí být hydrolyzovatelné ani absorbovatelné v horní části zažívacího ústrojí. 2) Musí být selektivním substrátem pro jeden nebo omezený počet druhů střevu prospěšných komenzálních bakterií, které jsou stimulovány k růstu anebo k metabolické aktivitě. 3) Musí být schopné upravit střevní flóru ve prospěch zdravějšího složení. 4) Musí vyvolat luminální nebo systematické efekty, které jsou příznivé pro zdraví hostitele (Gibson a Roberfroid, 1995).
Jelikož jakákoliv složka potravy, která se neporušeně dostane do tlustého střeva, by mohla být považována za prebiotikum, je to právě selektivita fermentace střevu 40
prospěšných bakterií, jako např. laktobacilů a bifidobakterií, která je rozhodujícím kritériem pro klasifikaci prebiotik (Collins a Gibson, 1999). Mezi složky, které nesplňují selektivitu fermentace, mohou být zařazeny např. neškrobové polysacharidy: pektiny, guarovou gumu, β-glukany, oligosacharidy, alkoholické cukry a endogenní látky jako mucin a chondroitin sulfát (Tomasik a Tomasik, 2003). Tyto složky potravy mohou být označeny jako „colonic foods“, tzn. potrava pro střeva. Ve střevě slouží jako substrát pro střevní endogenní bakterie. Tím hostiteli nepřímo poskytují další energii, metabolické živiny a esenciální mikronutrienty (Gibson a Roberfroid, 1995).
Tab. 8 Klasifikace vybraných druhů sacharidů jako „colonic foods“ a prebiotika (Gibson a Roberfroid, 1995) Sacharid Rezistetní škrob Neškrobové polysacharidy Celulóza Hemicelulózy Pektiny Gumy Nestravitelné oligosacharidy Fruktooligosacharidy Galaktooligosacharidy Oligosacharidy sójových bobů Glukooligosacharidy
Colonic food
Prebiotikum
Ano
Ne
Ano Ano Ano Ano
Ne Ne Ne Ne
Ano Ano Ano ?
Ano ? ? Ne
Na rozdíl od Gibsona a Roberfroida (1995), jak je vidět z předchozí tabulky, Tomasik (2003) do skupiny prebiotik zahrnuje i rezistentní škrob, některé oligosacharidy, laktitol, mannitol, sorbitol a xylitol, Aachary a Prapulla (2011) do této skupiny zahrnují také xylooligosacharidy, Chen a kol. (2001) isomaltooligosacharidy a dle Bouhnika (2004) sem patří i laktulóza.
3.5.1.1 Nepříznivé účinky prebiotik Prebiotika vyvolávají ve střevním lumenu osmotický efekt a v tlustém střevě jsou fermentována. Mohou vyvolat plynatost a nadmutí břicha. Bolest břicha a průjem se objevuje až při velkých denních dávkách. Nedávno bylo s vysokými denními dávkami spojeno zvýšení jícnového refluxu. Tolerance k prebiotikům závisí na dávce a individuálních faktorech (přítomnsot IBS nebo jícnového refluxu) a citlivosti
41
jednotlivců. Tolerance může také vzniknout adaptací na pravidelnou konzumaci (Marteau a Seksik, 2004).
3.5.2
Rozdělení prebiotik
3.5.2.1 Oligosacharidy – fruktooligosacharidy – inulin Inulin je lineární sacharid složený z fruktózových jednotek, které jsou spojené β-(2→1) glykosidickou vazbou s koncovou glukózou, která je k řetězci připojena α-(1→2) vazbou. Řetězec může obsahovat 2 až 60 (v průměru 10) fruktózových zbytků. Charakteristickým rysem struktury inulinu jsou jeho β-(2→1) vazby. Tato vazba není rozložitelná enzymy trávicího traktu savců, proto chrání inulin před rozložením a je také zodpovědná za sníženou kalorickou hodnotu a za účinky potravní vlákniny (Niness, 1999). Oligofruktóza (OF) je definována jako fruktooligosacharid (FOS) obsahující 2 až 10 monosacharidových zbytků spojených glykosidickou vazbou. Oligofruktóza získaná z čekanky obsahuje dva typy řetězce, a to fruktózový řetězec a fruktózový řetězec s koncovou glukózovou jednotkou. Uměle vytvořená oligofruktóza obsahuje pouze fruktózový řetězec s koncovou glukózovou jednotkou. Oba dva typy oligofruktózy mají β-(2→1) vazby mezi fruktózovými molekulami a oba dva jsou tedy stejně výživově přínosné (Niness, 1999). FOS jsou ve vodě dobře rozpustné sladké látky, které vykazují 40 až 60 % sladivosti sacharózy, nehydrolyzují se sacharidázami, a proto se klasifikují jako rozpustná vláknina. Energetická výtěžnost fruktózy vázané v OF je pouze asi 25 až 35 % energetické výtěžnosti volné fruktózy (asi 4,2-6,3 kJ/g) (Velíšek a Hajšová, 2009). Inulin se přirozeně nachází v mnoha potravinách rostlinného původu, např. v banánech, ječmeni, čekance, česneku, Jeruzalémském artyčoku, pórku, cibuli a ovsu. Extrahován bývá z kořene čekanky, Jeruzalémského artyčoku, artyčoku, jiřinek a pampelišek. Odhaduje se, že denní příjem inulinu u dospělých je mezi 3 až 11 g/den v Evropě a mezi 1 až 4 g/den v Severní Americe (Lomax a Calder, 2009).
42
Tab. 9 Výskyt inulinu a oligofruktózy v některých surovinách v čerstvém stavu (Suková, 2010) Zdroj
Jedlá část
Čekanka Česnek Pór Cibule Chřest Pšenice
Kořen Cibulová hlíza Cibulová hlíza Cibulová hlíza Listy Zrno
Inulin (g/100 g)
Oligofruktóza (g/100 g)
35,7 – 47,6 9,0 – 16,0 3,0 – 10,0 1,1 – 7,5 2,0 – 3,0 1,0 – 4,0
19,6 – 26,2 3,6 – 6,4 2,4 – 8,0 1,1 – 7,5 2,0 – 3,0 1,0 – 4,0
Inulin a oligofruktóza bývají obsaženy ve velkém množství různých druhů potravin. Nejvíce jsou přidávány do mléčných produktů, jako je fermentované mléko, mléko, mléčné nápoje, sýry a dezerty. Dále se přidávají také do pečiva, roztíratelných výrobků, čokolády, náhražek masa, cereálií, müsli tyčinek a zmrzliny. Většina potravin obsahuje 2 – 4 g inulinu nebo oligofruktózy na jednu porci (Collado, a kol., 2009, Coussement, 1999).
Β2-1 fruktany, mezi které patří inulin a FOS splňují všechna kritéria pro prebiotika: 1) Jsou rezistentní k hydrolýze a absorpci v horním zažívacím traktu (vazba β-(2→1) není hydrolyzovatelná savčími zažívacími enzymy); 2) Jsou fermentovatelné střevní mikroflórou; 3) Selektivně stimulují růst anebo aktivitu střevu prospěšných bakterií jako bakterií rodu Lactobacillus a Bifidobacterium (Lomax a Calder, 2009).
Doporučené dávky založené na testech i na zkušenostech z potravinářského průmyslu se pohybují okolo 5 až 8 gramů na porci oligofruktózy a 10 gramů na porci inulinu. Tyto dávky nejsou brány jako hodnoty NOAEL, které jsou mnohem vyšší (Coussement, 1999). Dle studií by měla konzumace 15 gramů inulinu nebo oligofruktózy denně zvýšit počet bifidobakterií ve stolici. Při těchto dávkách došlo ke zvýšení bifidobakterií u inulinu z 9,2 na 10,1 log10/gram stolice a u oligofruktózy z 8,8 na 9,5 log10/gram stolice (Gibson, a kol., 1995). Bylo potvrzeno, že užívání 3x5 g fruktooligosacharidů denně vede k průkaznému nárůstu obsahu bifidobakterií ze 6 na 22 % (Gibson a Roberfroid, 1995). Závěrem jiné studie, kdy 17 zdravých dobrovolníků konzumovalo 20 g oligofruktózy obohacené inulinem denně bylo, že po konzumaci prebiotik významně vzrostl počet bakterií Bifidobacterium longum a Bifidobacterium adolescentis (Joossens, a kol., 2011). 43
Vysoké dávky inulinu však mohou způsobit zvýšené nadýmání a tím způsobit uživateli zažívací diskomfort. Akceptovatelnost nestravitelných složek střevy závisí zejména na dvou vlastnostech. První je osmotický efekt vedoucí ke zvýšenému obsahu vody v tlustém střevě. Touto teorií se může vysvětlit, proč má sorbitol větší laxativní účinky než oligofruktóza. Druhý je fermentační efekt, který je způsoben fermentačními produkty, zejména SCFA a plyny. Pomaleji fermentující se složky jsou lépe tolerovatelné než jejich rychle fermentující analoga (Coussement, 1999). Tolerance lidí k inulinu a oligofruktóze se u každého jedince liší. U někoho se neprojeví žádné vedlejší účinky ani při dávkách nad 10 g, zatímco jiní lidé pociťují zažívací diskomfort již při velmi malých množstvích. Dle citlivosti mohou být lidé rozděleni do tří skupin: •
osoby nevnímavé (více než 30 g/den bez jakýchkoliv nežádoucích účinků);
•
osoby vnímavé (do 10 g/den bez nežádoucích účinků, nad 20 g/den nežádoucí účinky);
•
osoby velmi vnímavé (nežádoucí účinky při dávkách pod 10 g/den) (Coussement, 1999).
Další rizika konzumace inulinu jsou u lidí s intolerancí fruktózy (průjmy, plynatost, křeče a bolesti v podbřišku), která se vyskytuje u 30 až 40 % obyvatel. Projevuje se ovšem až při příjmu 0,5 g na porci a závisí také na mikroflóře střeva. Při určitých léčebných podmínkách může docházet také k nárůstu některých škodlivých druhů střevních bakterií, jejichž vliv na projevy autoimunitních onemocnění není dosud prozkoumán (Suková, 2010).
3.5.2.2 Xylooligosacharidy Xylooligosacharidy (XOS) jsou oligomery složené z jednotek xylózy, které se nachází v bambusových výhoncích, ovoci, zelenině, mléku a medu. Obecně jsou xylózové zbytky spojeny vazbou β-(1→4), počet xylózových jednotek může být v rozmezí od dvou do deseti a jsou známy jako xylobióza, xylotrióza a další (Aachary a Prapulla, 2011).
44
3.5.2.3 Isomaltooligosacharidy Isomaltooligosacharidy (IMO) jsou sloučeniny glukózových oligomerů spojených vazbou α-(1→6), například isomaltóza, panóza, isomaltotrióza. V Japonsku jsou používané jako sladidla. Podávání 10 g aktivních komponent IMO zdravým mužům průkazně zvýšila četnost defekace a pocit nekompletní defekace (Chen, a kol., 2001).
3.5.2.4 Galaktooligosacharidy Galaktooligosacharidy (GOS) jsou složeny z laktózových a galaktózových jednotek. Přirozeně se vyskytují v mateřském mléce lidí a v malém množství i v mléce kravském. Komerčně jsou vyráběny enzymatickou reakcí z laktózy, kdy jsou galaktózové zbytky navázány k laktóze. V tenkém střevě může dojít k méně významné degradaci, ale většina GOS se dostane v neporušeném stavu do tlustého střeva a je fermentována bifidobakteriemi, bakteroidy, enterobakteriemi a laktobacily (Alander, a kol., 2001). V luštěninách, především v sóji a také v jiných potravinách rostlinného původu, se vyskytují α-galaktooligosacharidy (rafinóza, stachyóza, verbaskóza, ajugóza a další). Tyto oligosacharidy lze považovat za deriváty sacharózy nebo melibiózy. Doprovází je řada cyklitolů a galacyklitolů (Velíšek a Hajšová, 2009). α-galaktooligosacharidy jsou v tenkém střevě neštěpitelné sacharázami, ale stimulují růst bifidobakterií a jsou využitelné i dalšími bakteriemi tlustého střeva, které produkují α-D-galaktosidázu a metabolizují ji za tvorby plynů (oxid uhličitý, metan, vodík aj.). Jsou považovány za hlavní příčinu nadýmání (flatulence) při konzumaci luštěnin (Velíšek a Hajšová, 2009).
3.5.2.5 Oligosacharidy mateřského mléka Oligosacharidy
lidského
mateřského
mléka
(HMOS
–
Human
Milk
Oligosaccharides) jsou pro lidi bezpochyby prvním a nejdůležitějším prebiotikem. Jsou tvořeny 3 až 9 monosacharidovými jednotkami. Z kvantitativního hlediska jsou po laktóze a lipidech třetí nejpočetněji zastoupenou složkou lidského mléka. Jejich největší koncentrace je v mlezivu (více než 20 g/l). Poté se jejich koncentrace snižuje a asi po dvou týdnech se ve zralém mléce ustálí na 12 až 14 g/l. Oproti tomu obsah oligosacharidů v kravském mléce, z něhož se většinou připravuje dětská umělá výživa, je nižší než 1 g/l (Coppa, a kol., 2004).
45
HMOS jsou tvořeny v prsní žláze specifickými enzymy (glykosyltransferázami), přidáváním monosacharidových jednotek (galaktózy, fukózy, N-acetyl-glukózaminu, kyseliny sialové) k základní molekule laktózy. Tím jsou tvořeny lineární i větvené struktury. Monosacharidy, ze kterých jsou složené, jsou spojeny specifickými vazbami odolnými vůči enzymům, které jsou přítomné v novorozenecké a kojenecké střevní stěně (laktáza, sacharáza-izomaltáza, maltáza-glukoamyláza, amyláza). Díky tomu většina oligosacharidů, která je přijata v mateřském mléce, prochází neporušeně skrz tenké střevo do tlustého střeva, kde dochází k selektivní stimulaci probiotik (Coppa, a kol., 2004). Rozdíly ve složení střevní mikroflóry dětí kojených mateřským mlékem a dětí živených náhražkami mateřského mléka jsou úzce spjaty s odlišným obsahem mléčných oligosacharidů (Coppa, a kol., 2004). Oligosacharidy mateřského mléka mají velmi komplikovanou strukturu, a proto je jejich umělá příprava v současné době prakticky nemožná. Jako prebiotika se proto do potravin a krmiv používají FOS nebo GOS. Tyto látky se přidávají i do umělých kojeneckých výživ, přestože nemohou plně nahradit HMOS, podporují alespoň bifidobakterie ve střevě (Rada, 2010).
3.5.2.6 Laktulóza Laktulóza se získává z laktózy izomerací v alkalickém prostředí. Jako minoritní produkt současně vzniká epilaktóza. Laktulóza je nestravitelným disacharidem, je poněkud sladší (asi 60 % sladivosti sacharózy) a má jako laktóza slabé laxativní účinky. Stimuluje růst bifidogenní mikroflóry (Velíšek a Hajšová, 2009).
3.5.3
Funkce a význam prebiotik
Prebiotika mohou ovlivnit obranyschopnost hostitele. V prvé řadě zvýšením počtu bifidobakterií. Tím se zlepší kompetice s patogeny o místa navázání na střevní epitel a také kompetice o živiny a inhibují se přežívající patogenní druhy. Některé příznivé druhy bakterií mohou přejít přes střevní bariéru a dostat se tak do Peyerových plaků a aktivovat imunitní buňky. Dle jiných autorů se přes střevní bariéru dostávají jen mikrobiální látky jako složky buněčné stěny a cytoplazmatické protilátky.
46
Bifidobakterie a laktobaicily jsou schopny produkovat antibakteriální látky, které inhibují růst a přežívání patogenů (Lomax a Calder, 2009). Za druhé fermentace prebiotik bifidobakteriemi vytváří SCFA, což má následující efekty: •
Okyselení střevního prostředí, což je vůči některým patogenním druhům bakterií (bakteroidy, klostridia a koliformní bakterie) nepříznivé.
•
Okyselení střevního prostoru má příznivý vliv na produkci mucinu (hlenu). To zlepšuje mukózovou morfologii, snižování kolonizace a přemísťování patogenních bakterií.
•
Přichycení k SCFA receptorům na imunitních buňkách v GALTu.
•
Butyrát snižuje požadavky epitelových buněk na glutamin, čili je šetrnější ke GALTu.
•
Butyrát může také pozměnit genovou expresi epitelových buněk, a to může pozměnit signalizaci epitelových buněk mukózovému imunitnímu systému (Lomax a Calder, 2009).
Oligosacharidy se liší rozdílnou fermentační aktivitou. Všechna prebiotika zvyšují počty bifidobakterií a většina z nich snižuje množství klostridií. Xylooligosacharidy a laktulóza podporují nejvíce zvýšení počtu bifidobakterií, zatímco fruktooligosacharidy podporují nejvíce počty laktobacilů. Galaktooligosacharidy způsobují největší snížení množství klostridií. Produkce SCFA je nejvyšší u laktulózy a galaktooligosacharidů. Produkce plynů je nejnižší u isomaltooligosacharidů a nejvyšší u inulinu. Isomaltooligosacharidy a GOS nejefektivněji podporují nárůst bifidobakterií a laktátu, zatímco produkují nejméně plynů (Rycroft, a kol., 2001).
Hlavní fyziologické a patofyziologické účinky prebiotik jsou spojeny se selektivní stimulací růstu anebo aktivity určitých druhů střevní mikroflóry. Mezi prokázané účinky patří: •
Zlepšení anebo stabilizace složení střevní mikroflóry
•
Zlepšení střevních funkcí (objem, pravidelnost a konzistence stolice)
•
Zvýšení absorpce minerálů a zlepšení zdraví kostí (obsah Ca v kostech, obsah minerálních látek v kostech, hustota kostní tkáně)
47
•
Úprava produkce gastrointestinálních peptidů, energetického metabolismu a sytosti
•
Spuštění (po narození) a modulace imunitních funkcí
•
Zlepšení funkce střevní bariéry, redukce metabolických endotoxinů
•
Snížení rizika střevních infekcí
Předpokládané účinky prebiotik: •
Snížení rizika obezity, diabetu 2. typu, metabolického syndromu, atd.
•
Snížení rizika anebo zvládání průběhu střevních zánětů
•
Snížení rizika rakoviny tlustého střeva (Roberfroid, a kol., 2010)
3.6 Synbiotika Termín synbiotikum je používán pro označení produktu, který obsahuje současně probiotika i prebiotika. Protože toho označení naráží na synergismus, mělo by být používáno především pro produkty, ve kterých prebiotické látky selektivně podporují probiotické komponenty (Schrezenmeir a de Vrese, 2001). Nejjednodušším příkladem synbiotik určených pro lidskou výživu je jogurt s obsahem probiotických bakterií společně s prebiotickou oligofruktózou (Rada, 2010). Dle některých studií na zvířatech Bifidobacterium longum a Bifidobacterium animalis rostou rychleji na médiu s inulinem nebo s fruktooligosacharidy než na médiu bez nich (Bielecka, a kol., 2002). Mezi hlavní výhody synbiotik patří zvýšená odolnost probiotické složky v GIT. V synbiotických výrobcích se kromě inulinu a FOS vyskytuje často také škrob. Jelikož některé druhy bifidobakterií jsou schopny se navázat na škrobová zrna, při použití škrobu pak vykazují větší rychlost růstu a odolnost při pasáži žaludkem a tenkým střevem (Anonym1,2011).
48
4
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
4.1 Materiál Chemikálie: •
Fyziologický roztok: 1/4 RINGER's na 500 ml destilované vody.
Kultivační médium: •
BSM-Agar (Bifidus Selective Medium Agar) (Fluka, Švýcarsko) o Dodavatel: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Industriestrasse 25, Postfach, CH 9471 Buchs, Švýcarsko
•
BSM suplement (Fluka, Švýcarsko) o Dodavatel: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Industriestrasse 25, Postfach, CH 9471 Buchs, Švýcarsko
Přístroje a pomůcky: •
Laboratorní váhy, 220A (Schoeller instruments, Praha, ČR)
•
Vodní lázeň, Julabo TW 20 (Schoeller instruments, Praha, ČR)
•
Horkovzdušný sterilátor, D-91126, (Mennert, Německo)
•
Autokláv, Sanyo MLS-3750/3780 (Schoeller instruments, Praha, ČR)
•
Myčka, G 7883, Miele professional, (Labor, Brno)
•
Lednice, Liebherr, 7082218-01 (Německo)
•
Anaerostat, THERMO SCIENTIFIC (Trigon-plus, s.r.o., ČR)
•
Homogenizátor, Bagmixer 400 (Fabrilabo, Francie)
•
Vortex, MS2 Minishaker, (IKA Šerme, Německo)
•
Přístroj pro usnadnění odečtu mikroorganismů, LKB 2002 (POL-EKOAPARATURA, EU)
•
Běžné laboratorní sklo a pomůcky
Vzorek: Vzorek lidských exkrementů dodaný ve sterilním plastovém kontejneru s lopatkou pro odběr stolice, řádně označený. Jogurt: Jogurt bílý selský s probiotickou kulturou BIFI: •
Hmostnot 200 g 49
•
Složení: o mléko, mléčná bílkovina, živá jogurtová kultura, probiotická kultura Bifidobacterium, Lactobacillus acidophilus, obsah tuku nejméně 3,5 %. o Obsahuje nejméně 100 milionů živých mikroorganismů v 1 g. o 200 g představuje 125 kcal.
•
Výrobce: HOLLANDIA Karlovy Vary, a.s., Krásné Údolí č.p. 151, 364 01 Toužim, CZ
•
Výrobce udává, že pravidelná konzumace jogurtů s přídavkem probiotických kultur příznivě ovlivňuje složení střevní mikroflóry.
Inulin: Inulin rozpustná vláknina: •
Hmotnost 5 g
•
Složení: o 90 % inulin, 10 % oligosacharidy
•
Výživové hodnoty v 5 g: o Energetická hodnota
25 kJ
o Bílkoviny
0
o Oligosacharidy
0,5 g
o Tuky
0
o Rozpustná vláknina – inulin 4,5 g •
Doporučená denní dávka: 5 g
•
Použití: do kávy, čaje, džusu, nealkoholických nápojů, jogurtů, pudinků a polévek
•
Výrobce: F&N dodavatelé, s.r.o., Labská 128, Kostelec nad Labem – Jiřice, 277 13, ČR
•
Výrobce graficky znázorňuje změnu střevní mikroflóry před užitím a po užití: o Před užitím: 30 % bifidobakterie, 70 % patogenní bakterie o Po užití: 70 % bifidobakterie, 30 % patogenní bakterie
50
4.2 Metodika 4.2.1 Příprava experimentu Pro experiment byla vybrána skupina 24 zdravých dobrovolníků dle následujících kritérií: •
dospělá osoba ženského pohlaví,
•
věk 22 až 45 let,
•
bez zažívacích obtíží, nemocí střev, průjmů atd.,
•
měsíc před experimentem ani v průběhu experimentu bez užívání antibiotik,
•
nevykonávat fyzicky náročné povolání,
•
nestravovat se speciální výživou, která není pro naši populaci běžná,
•
netrpět laktózovou intolerancí,
•
neužívat v nadměrném množství alkohol,
•
neužívat projímadla.
Dobrovolníci byli seznámeni s průběhem experimentu a s požadavky, které byly kladeny na způsob jejich stravování (stravování běžně zavedeným způsobem) a fyzické aktivity (fyzická aktivita na stejné úrovni jak odpovídá dosavadním zvyklostem) v průběhu experimentu, a o odběru a uchování vzorků. Dále byli požádáni, aby po trvání experimentu nekonzumovali kromě předložených probiotických a prebiotických produktů žádné další produkty, na kterých se vyskytovalo označení, že obsahují probiotické kmeny anebo prebiotika. Souhlas s těmito požadavky byl stvrzen podpisem dokumentu – Pokyny pro epidemiologickou studii. Kromě výše uvedeného dokumentu bylo dodáno potvrzení ošetřujícího lékaře o tom, že účastníci studie nejsou dle bakteriologického vyšetření bacilonosiči.
4.2.2 Průběh vlastního experimentu Dobrovolníci byli náhodně rozděleni do tří skupin po 8 lidech: •
skupina J: skupina konzumující jogurty
•
skupina I: skupina konzumující jogurty a jogurty s přídavkem inulinu
•
skupina K: kontrolní skupina nekonzumující jogurty 51
Účastníci obdrželi plastové sterilní kontejnery s lopatkou v dostatečném množství a dle zařazení do skupiny jogurty a inulinový prášek. Odebrané vzorky byly uchovávány při teplotě 2 až 5 °C (lednice), a poté odvezeny v chladícím termoboxu při teplotě do 4 °C do laboratoře, kde byly do 24 hodin zpracovány.
4.2.2.1 Časový harmonogram experimentu Pokus byl rozdělen do tří období: adaptační období, kdy se osoby stravovaly běžným zavedeným způsobem, období konzumace jogurtů a inulinu a období doznívání účinku.
Skupina J: Etapa A trvající 10 dní – adaptace → vynechání konzumace kysaných mléčných výrobků, včetně jogurtů. Po této době proběhl sběr a rozbor vzorků. Etapa B trvající 21 dní – pravidelná konzumace předloženého jogurtu v množství 200 g na den, vynechání ostatních kysaných mléčných výrobků. Sběr a rozbor vzorků proběhl po 7, 14 a 21 dnech konzumace jogurtů. Etapa C trvající 10 dní – doznívání účinku → vynechání ve stravě kysaných mléčných výrobků včetně jogurtů. Sběr a rozbor vzorků proběhl po 3, 7 a 10 dnech ukončení konzumace jogurtů.
Skupina I: Etapa A trvající 10 dní – adaptace → vynechání konzumace kysaných mléčných výrobků včetně jogurtů. Po této době proběhl sběr a rozbor vzorků. Etapa B1 trvající 14 dní - pravidelná konzumace předloženého jogurtu v množství 200 g na den, vynechání ostatních kysaných mléčných výrobků. Sběr a rozbor vzorků byl uskutečněn po 7 a 14 dnech konzumace jogurtů. Etapa B2 trvající 7 dní – pravidelná konzumace předloženého jogurtu v množství 200 g na den s přídavkem předloženého probiotika v množství 5 g na den. Po této etapě byl odebrán vzorek k rozboru. Etapa C trvající 10 dní – doznívání účinku → vynechání ve stravě kysaných mléčných výrobků včetně jogurtů. Sběr a rozbor vzorků proběhl po 3, 7 a 10 dnech ukončení konzumace jogurtů.
52
Skupina K: Skupina K měla po celou dobu experimentu, tedy po 41 dní vynechat ve stravě kysané mléčné výrobky včetně jogurtů. Z finančních důvodů a za předpokladu, že posledních 10 dní nedojde k výrazným změnám v nárůstu počtu bifidobakterií ve stolici u této skupiny, byl ukončen odběr vzorků po dokončení etapy B.
kontrola: strava bez kysaných mléčných výrobků
adaptace
Skupina K doznívání
konzumace 200 g jogurtu/den
účinku adaptace
konzumace 200 g
doznívání
+ inulin
jogurtu/den
0. den
Skupina J Skupina I
účinku
10. den
14. den
21. den
41. den
Obr. 5 Grafické znázornění časového harmonogramu experimentu
Odběry vzorků stolice byly provedeny v těchto termínech: 1. odběr: 10. den (konec adaptace) 2. odběr: 17. den (7. den konzumace jogurtů u skupin J a I) 3. odběr: 24. den (14. den konzumace jogurtů u skupin J a I) 4. odběr: 31. den (21. den konzumace jogurtů u skupin J a jogurtu + inulinu u skupiny I) 5. odběr: 34. den (3. den bez konzumace jogurtů – doznívání účinku u skupin J a I) 6. odběr: 38. den (7. den bez konzumace jogurtů – doznívání účinku u skupin J a I) 7. odběr: 41. den (10. den bez konzumace jogurtů – doznívání účinku u skupin J a I)
4.2.2.2 Stanovení počtu bakterií rodu Bifidobacterium plotnovou metodou Podstatou zkoušky je inhibující účinek antibiotik na růst doprovodné mikroflóry v kysaných mléčných výrobcích. Použitím selektivního BSM média (Bifidus Selective Medium) a anaerobní kultivace při 37 °C po dobu 125 h jsou izolovány fialové vypouklé kolonie bifidobakterií.
53
Po skončení inkubace se pro výpočet použijí 2 misky ve dvou po sobě jdoucích ředěních (Burdychová a Sládková, 2007). BSM agar obsahuje peptonový a masový extrakt, který je zdrojem uhlíku, dusíku, vitaminů a minerálních látek. Kvasniční extrakt nahrazuje vitaminy skupiny B, které stimulují růst bakterií. Zdrojem sacharidů je dextróza. Chlorid sodný udržuje osmotický tlak. Půda obsahuje v nízké koncentraci látku pro detoxikaci vedlejších metabolických produktů, dále obsahuje redukční a pufrovací činidla. Selektivní soli inhibují růst plísní, enterokoků a jiných Gram-negativních bakterií. Další složka inhibuje glykolýzu inaktivováním glyceraldehyd-3 fosfát dehydrogenázy, která se nachází a je důležitá pro rozmanité bakterie a plísně (také Streptococci sp.). Troje antibiotika jsou selektivními činidly a inhibují doprovodnou bakteriální flóru, jako Bacili, Enterobacteriaceae a Pseudomonas. Bifidobakterie mohou redukovat azosloučeniny přítomné v médiu, které poskytují koloniím růžově fialové zbarvení (Sigma-Aldrich, 2011).
Příprava půdy Laboratorní váhou bylo naváženo do skleněné reagenční láhve 55,5 g dehydratované půdy (BSM-Agar, Fluka, Švýcarsko). Ta byla zalita 1000 ml destilované vody a ponechala se nabobtnat. Poté byla provedena sterilace média v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 21 minut. Po ukončení sterilace byla reagenční láhev se sterilní půdou vložena do vytemperované vodní lázně s teplotou 42 °C. Po vytemperování byl do láhve přidán suplement (BSM Supplement, Fluka, Švýcarsko) v množství 116 mg/1000 ml půdy a následně dobře rozmíchán.
Rozbor vzorků Z kontejneru byl odvážen na laboratorních vahách 1 g vzorku, který byl umístěn do mikrotenového sáčku. Ke vzorku bylo přidáno 99 ml fyziologického roztoku a poté proběhla homogenizace na homogenizátoru po dobu 90 sekund. Následně bylo provedeno dekadické ředění (1 ml vzorku + 9 ml fyziologického roztoku) do předem připravených sterilních zkumavek s fyziologickým roztokem. Pro dobré rozmíchání vzorku ve zkumavkách byl použit vortex. Do Petriho misek byl z příslušného ředění odpipetován vždy 1 ml vzorku. Poté bylo inokulum zalito vytemperovanou kultivační
54
půdou BSM se suplementem. Vzorky byly po zatuhnutí inkubovány v anaerostatu při teplotě 37 °C po dobu 5 dnů. Poté byl proveden odečet kolonií pomocí přístroje.
1 g vzorku + 99 ml sterilovaného fyziologického roztoku
homogenizace (90 vteřin)
desetinné ředění
zalití inokula (1 ml) živnou půdou BSM se suplementem
ztuhnutí půdy
kultivace v anaerostatu 37°C,125 hodin
odečítání kolonií
vyhodnocení výsledků
Obr. 6 Schéma mikrobiologické analýzy
Obr. 7 Kolonie bifidobakterií po mikrobiologické kultivaci 55
4.2 Vyhodnocení Použitím následující rovnice bylo vypočítáno množství bifidobakterií N v jednotkách KTJ (kolonie tvořících jednotek) na 1 g zkoušeného vzorku.
Rovnice pro výpočet N KTJ mikroorganismů:
∑ 0,1
ΣC součet kolonií spočítaných na vybraných plotnách n1 počet ploten použitých pro výpočet z prvního ředění n2 počet ploten použitých pro výpočet z druhého ředění d
první pro výpočet použité ředění
Výsledné počty bifidobakterií byly pro další zpracování převedeny do logaritmických hodnot. Pro každou skupinu byly spočteny nárůsty bifidobakterií mezi jednotlivými stanoveními. Pokud by se potvrdil předpoklad pozitivního vlivu konzumace jogurtů na počet bifidobakterií, mělo by být možno pozorovat vyšší nárůsty ve skupině J než v kontrolní skupině. Obdobně by mělo být možno pozorovat vyšší nárůsty ve skupině I než v obou zbývajících skupinách. Odlišnost nárůstů mezi skupinami byla testována pomocí statistického testu ANOVA. Nulová hypotéza tohoto testu předpokládá, že všechny nárůsty pocházejí z rozdělení se stejnou střední hodnotou. Výstupem testu je tzv. p-hodnota udávající pravděpodobnost s jakou uděláme chybu, pokud na základě dat nulovou hypotézu zamítneme. Běžně používanou hranicí pro zamítnutí nulové hypotézy je 0,05, někdy též 0,1.
56
5 VÝSLEDKY V rámci experimentu byly podrobeny analýze vzorky stolice dobrovolníků, kteří byli rozděleni do tří skupin: skupina J (konzumující jogurty), skupina I (konzumující jogurty s následným přídavkem inulinu) a skupina K (kontrolní). Po mikrobiologické kultivaci vzorků na BSM agaru se suplementem byly u jednotlivých skupin sledovány nárůsty počtu bifidobakterií. Přesné výsledky jsou uvedeny v tabulce č.12 v přílohách.
Porovnání nárůstů počtu bifidobakterií mezi jednotlivými odběry a skupinami Výsledky byly zpracovány pomocí statistického testu ANOVA, který testuje shodnost středních hodnot jednotlivých výběrů (nárůstů v rámci dané skupiny). Všechny výsledky vyšly na hladině významnosti 0,05 statisticky neprůkazně, na hladině významnosti 0,1 vyšel statisticky průkazný pouze jeden z dílčích výsledků. Výsledky po vyhodnocení ukazují, že rozdíly nárůstů bifidobakterií mezi danými skupinami nejsou statisticky odlišné. Přesto můžeme pozorovat, že při pravidelné konzumaci jogurtu a jogurtu s inulinem u skupiny J a I dochází k většímu nárůstu bifidobakterií než u skupiny kontrolní. A že po ukončení konzumace jogurtů a jogurtů doplněných inulinem dochází k poklesu. Překvapivé je, že u jogurtové skupiny došlo k většímu nárůstu v posledním týdnu konzumace jogurtů než u skupiny inulinové, kdy bylo k pravidelné dávce jogurtu přidáno 5 g inulinu.
Rozdíl počtu KTJ u jednotlivých subjektů mezi dvěma po sobě následujícími měřeními a následné porovnaní výsledků mezi třemi pozorovanými skupinami Mezi prvním odběrem (po ukončení etapy A) a druhým odběrem (po 7 dnech konzumace jogurtů) nebyl statisticky průkazný nárůst bifidobakterií v žádné studijní skupině (p-hodnota= 0,3123). U skupiny J a skupiny I byl však zaznamenán větší nárůst bifidobakterií než u skupiny K. Mezi druhým stanovením (po 7 dnech konzumace jogurtu) a třetím stanovením (po 14 dnech konzumace) také nebyl prokázán statisticky průkazný rozdíl nárůstu bifidobakterií mezi třemi sledovanými skupinami (p-hodnota= 0,7492). Překvapivě ani u jedné skupiny nedošlo k nárůstu počtu bifidobakterií, ale k mírnému poklesu u všech
57
tří skupin. Vysoká p-hodnota naznačuje, že nárůsty byly téměř identické v porovnání se standardními odchylkami jednotlivých výběrů. Skupina K má vyšší rozptyl. Stejný výsledek byl nalezen i při srovnání nárůstů mezi stanovením třetím (po 14 dnech konzumace jogurtu) a čtvrtým (po ukončení etapy B, tedy po 21 dnech konzumace jogurtu a u skupiny I po 7 dnech konzumace jogurtu s přídavkem inulinu). V této fázi však již došlo k nárůstu bifidobakterií. Skupina K má opět vyšší rozptyl než ostatní dvě skupiny a také nejvyšší přírůstky, které jsou ovšem dané výhradně jedním pozorováním (+2,77). Po odstranění tohoto pozorování je průměrný nárůst v skupině K roven 0,16, což odpovídá podobnému nárůstu jako u skupiny J (0,1660) a skupiny I (0,1726). Při porovnání čtvrtého a pátého stanovení (kdy došlo k ukončení konzumace jogurtů i inulinu u jogurtové a inulinové skupiny) můžeme na hladině významnosti 0,1 při počtu 16 lidí považovat za statisticky významně odlišné nárůsty ve skupině J a skupině I (p-hodnota = 0,0521). U skupiny J došlo k dalšímu nepatrnému nárůstu bifidobakterií, kdežto u skupiny I došlo k poklesu. U porovnání rozdílů počtu bifidobakterií mezi pátým a šestým stanovením dochází u obou skupin – J i I – k prakticky stejnému poklesu (-0,370877 u jogurtové, a - 0,373068 u inulinové). Není statisticky průkazný rozdíl (p-hodnota = 0,9934). U posledního porovnání, tedy mezi šestým a sedmým stanovením dochází k poklesu bifidobakterií u obou skupin (jogurtová i inulinová). U skupiny J dochází k poklesu o 0,507065, u skupiny I k poklesu o 0,203651. Rozdíl poklesu mezi těmito dvěma skupinami opět není statisticky průkazný (p-hodnota = 0,4740).
58
Tab. 10 Rozdíly nárůstů počtu bifidobakterií mezi jednotlivými po sobě následujícími odběry Skupiny Rozdíly nárůstů bifidobakterií mezi odběry číslo:
phodnota
K n
J
Střední
Směrodatná
hodnota
odchylka
n
I
Střední
Směrodatná
hodnota
odchylka
n
Střední
Směrodatná
hodnota
odchylka
1, 2
0,3123
7
-0,0915434
1,2995
3
1,02577
0,43031
7
0,358203
0,84545
2, 3
0,7492
6
-0,332986
1,0978
5
-0,380081
0,53685
8
-0,0774822
0,61524
3, 4
0,7223
7
0,534647
1,3175
8
0,165974
0,69170
7
0,172629
0,87078
4, 5
0,0521
X
8
0,336072
0,72600
8
-0,523151
0,88500
5, 6
0,9934
X
8
-0,370877
0,48042
5
-0,373068
0,39694
6, 7
0,4740
X
8
-0,507065
0,70869
5
-0,203651
0,73358
Tab. 11 Nárůsty od prvního do posledního stanovení v porovnání od prvního měření (první měření je hodnota 0) Skupina/Stanovení
1
2
3
4
Kontrolní
0
-0,09154 -0,42453 0,110118
Jogurt
0
1,02577
Inulin
0
0,358203 0,280721 0,45335
5
6
7
0,645689 0,811663 1,147735 0,776858 0,269793 -0,0698
59
-0,44287 -0,64652
Počet bakterií rodu Bifidobacterium (log/KTJg-1)
Rozdíly počtu bifidobakterií mezi jednotlivými odběry 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 -0,2 1
2
3
4
5
6
-0,4 -0,6 -0,8
Jednotlivé odběry Jogurt
Inulin
Kontrola
Graf 1 Nárůsty a poklesy obsahu bifidobakterií od počáteční nulové hodnoty prvního měření dle výsledků z ANOVY
Z grafu 1 lze pozorovat, že u skupiny J došlo k většímu nárůstu bifidobakterií než u skupiny I. Po 21 dnech konzumace jogurtu (stanovení č. 4) počet bifidobakterií stále stoupá (stanovení č. 5), ale již od 3 dnů po ukončení konzumace jogurtů počet bifidobakterií u této skupiny značně klesá k původní nulové hodnotě. U skupiny I lze také vidět nárůst počtu bifidobakterií, i když je mírnější než u skupiny J. Tady dochází k poklesu ihned po ukončení konzumace jogurtů i inulinu (stanovení č. 4). Počet bifidobakterií klesá pod počáteční úroveň. Skupina K kolísá od záporných ke kladným hodnotám. Bohužel z finančních důvodů nebylo možné analyzovat poslední 3 odběry této skupiny.
60
7
Počet bakterií rodu Bifidobacterium (log/KTJg-1)
Absolutní množství bifidobakterií (průměry v rámci skupin) 7,5 7 6,5 6 5,5 5 1
2
3
4
5
6
Jednotlivé odběry Jogurt
Inulin
Kontrola
Graf 2 Průměr absolutních hodnot ve skupinách při jednotlivých měřeních
Graf č. 2 znázorňuje absolutní hodnoty počtu bifidobakterií u dobrovolníků, kteří odevzdali všechny vzorky. Tím se tedy může nepatrně lišit od grafu č.1. Z absolutních hodnot můžeme vidět, že skupina I měla už na začátku větší množství bifidobakterií, což je normální, protože každý člověk má přirozeně jinou hladinu, dle jeho stravovacích zvyklostí, genetických předpokladů atd. U skupiny J nelze vidět nárůst během konzumace jogurtů, ale až po ukončení konzumace. U skupiny I lze pozorovat mírný průběžný nárůst během konzumace. U obou skupin však lze pozorovat postupné snižování hladiny bifidobakterií po ukončení konzumu. Skupina K měla nejnižší počty bifidobakterií.
61
7
6 DISKUZE Je obtížné porovnat výsledky tohoto pokusu s výsledky jiných studií, protože každá studie zabývající se problematikou probiotik a prebiotik a jejich vlivu na složení střevní mikroflóry se liší v mnoha ohledech - metodikou, dávkami probiotik a prebiotik, studovanými kmeny probiotik, různými druhy prebiotik, délkou trvání studie, počtem subjektů a systémy měření. Bifidobakterie jsou známy a studovány pro své četné příznivé účinky. Aby však bylo těchto účinků dosaženo, musí bifidobakterie projít přes trávicí trakt. Zda bifidobakterie přežily a v jakém množství je zjišťováno různými metodami, např. mikrobiologickými analýzami stolice. Dle dostupných informací a na základě dosud provedených experimentů byly očekávány následující výsledky: Po pravidelné konzumaci probiotických jogurtů dojde k postupnému přechodnému zvýšení počtu bifidobakterií a následně po ukončení konzumace dojde k opětovnému poklesu na výchozí hodnoty (Mättö, a kol., 2006). Inulin, který je klasifikován jako prebiotikum, by měl ještě více podpořit nárůst bifidobakterií ve střevě a tedy i ve stolici.
6.1 Vliv jogurtů s probiotickou kulturou na nárůst bifidobakterií K dosažení příznivého účinku probiotik je doporučena pravidelná konzumace probiotických produktů (denní dávka obvykle mezi 109-1011 KTJ) (Fondén, a kol., 2003).
6.1.1 Výsledky konkrétních studií Studie, ve které bylo zjišťováno, zda jsou probiotické bakterie (Lactobacillus F19, Lactobacillus acidophilus NCFB 1748 a Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb-12) konzumované ve formě jogurtů, schopny přežít v trávicím traktu a přetrvat ve střevě, prokázala, že dva ze tří studovaných kmenů (Lactobacillus F19 a B. animalis subsp. lactis Bb-12) velmi dobře přežívají průchod trávicím traktem. Tyto 2 kmeny byly detekovány v dostatečném množství ve stolici. Konzumace probiotického jogurtu tedy dočasně zvýšila počty bifidobakterií (u 79% lidí) i laktobacilů (u 100 % lidí). Krátce po
62
ukončení konzumace těchto jogurtů došlo k tzv. wash-outu těchto dvou kmenů (Mättö, a kol., 2006). Ve studii, v níž muži ve věku 25 let konzumovali 300 g jogurtu (Lactobacillus acidophilus a Bifidobacteirum lactis) denně po dobu 5 týdnů, došlo u zkoumané skupiny k nárůstu počtu L. acidophilus (z 0,02 na 0,19 %) a B. lactis (z 0,4 na 1,4 %). Závěrem Kleinovy studie je, že po konzumaci jogurtů s těmito bakteriemi jsou L. acidophilus a B. lactis přítomny ve stolici v průkazně vyšším množství (Klein, a kol., 2008). Oproti tomu ve studii Prilassniga z roku 2007, kdy se zjišťovalo, zda se po orálním požití probiotik objeví tyto bakterie ve stolici, nebyly kromě jedné výjimky laktobacily ani bifidobakterie ve stolici detekovány (Prilassnig, a kol., 2007).
6.1.2 Výsledky experimentu
Skupina J Graf 1: Výsledky skupiny J naznačují, že při pravidelné konzumaci jogurtů s probiotickou kulturou dochází k mírnému nárůstu počtu bifidobakterií ve stolici. U porovnání nárůstu mezi prvním a druhým odběrem jsme však mohli u této skupiny porovnávat pouze 3 účastníky z 8, protože nebyly odevzdány všechny vzorky. U dalších stanovení, kdy lze také vidět nárůst, byl již odevzdán dostatečný počet vzorků. Zajímavým jevem je, že k nejvyššímu obsahu těchto bakterií dochází až 3 dny po ukončení konzumace jogurtů. To by mohlo naznačovat, že je potřeba více času než 21 dní k tomu, aby došlo k maximálnímu nárůstu bifidobakterií. Dále je zajímavé, že nedochází ihned po ukončení konzumace k takzvanému „wash-outu“, ale že ještě nějakou dobu po ukončení konzumace ve střevech bifidobakterie přetrvávají. Nárůsty a poklesy ovšem nebyly natolik velké, aby byly statisticky průkazné. Z grafu 2, kde byly hodnoceny absolutní počty bifidobakterií u osob, které odevzdali vzorky při každém odběru, však nelze potvrdit nárůst obsahu bifidobakterií po konzumaci probiotického jogurtu u této skupiny. K nárůstu došlo až do tří dnů po ukončení konzumace. Po ukončení konzumace jogurtů můžeme z grafu 1 i z grafu 2 vidět postupné snižování obsahu bifidobakterií, což koreluje s dostupnou literaturou.
63
Denní dávka probiotických mikroorganismů byla 2x1010 KTJ, což odpovídá doporučením pro dosažení příznivého účinku. Tato dávka však nemusela být dostačující pro to, aby se promítla v mikrobiologickém rozboru stolice.
Skupina I, odběry před začátkem konzumace inulinu Graf 1: Výsledky skupiny I jsou více vypovídající, neboť bylo odevzdáno více vzorků, a lze vidět mírný nárůst oproti původní hodnotě. Graf 2: U skupiny I došlo mezi 1. až 3. odběrem (konzumace pouze jogurtů) k většímu nárůstu než u skupiny jogurtové.
6.2 Vliv inulinu na nárůst bifidobakterií Protože inulin je klasifikován jako prebiotikum, bylo očekáváno, že u skupiny I dojde k mnohem většímu nárůstu bifidobakterií ve stolici než ve skupině J.
6.2.1 Výsledky konkrétních studií Dle studie Gibsona z roku 1995 by měla konzumace 15 gramů inulinu nebo oligofruktózy denně vést k množstevní převaze bifidobakterií ve stolici. V jeho studii došlo ke zvýšení bifidobakterií po konzumaci 15 g inulinu denně z 9,2 na 10,1 log10/ gram stolice a po konzumaci 15 g oligofruktózy denně z 8,8 na 9,5 log10/ gram stolice (Gibson, a kol., 1995). V další studii byla také potvrzena selektivní fermentace fruktooligosacharidů bifidobakteriemi u zdravých dobrovolníků. Bylo potvrzeno, že užívání 3x5 g fruktooligosacharidů denně vede k průkaznému nárůstu obsahu bifidobakterií z 6 na 22 %, zatímco bakteroidy klesly z 25 na 4 %, klostridie z 1 na 0,2 % a fusobakterie ze 4 na 0,4 % (Gibson a Roberfroid, 1995). Závěrem jiné studie, ve které 17 zdravých dobrovolníků konzumovalo 20 g oligofruktózy obohacené inulinem denně bylo, že po konzumaci prebiotik významně vzrostl počet bakterií Bifidobacterium longum a Bifidobacterium adolescentis (Joossens, a kol., 2011).
64
6.2.2 Výsledky experimentu Teorii, že inulin podporuje nárůst bifidobakterií, ovšem z našeho experimentu nelze průkazně potvrdit. Dle výsledků došlo k jen nepatrnému zvýšení obsahu bifidobakterií oproti skupině J, která inulin nekonzumovala. U skupiny I dochází okamžitě po ukončení konzumace ihned po 3 dnech ke snížení počtu bifidobakterií, a to dokonce na hodnotu nižší než byla hodnota výchozí a dále klesá až do konce experimentu. Dávka inulinu byla oproti výše citovaným studiím třetinová, a to jen 5 g inulinu denně. To v rámci množství celodenní stravy nemuselo mít na bifidobakterie požadovaný efekt. Z těchto výsledků lze usuzovat, že doporučená dávka 5 g/den není dostačující a měla by se zvýšit dle studií Gibsona (Gibson, a kol., 1995, Gibson a Roberfroid, 1995, Joossens, a kol., 2011) a Joossense (Joossens, a kol., 2011) alespoň trojnásobně. Ovšem v porovnání se skupinou J jsou u skupiny I nárůsty bifidobakterií celkově nižší i před konzumací inulinu, což může být způsobeno mnoha dalšími vlivy včetně již zmíněného složení potravy.
Na výsledky tohoto experimentu mohlo mít vliv mnoho vnějších i vnitřních faktorů. Na naší straně to mohla být nízká denní dávka jogurtu a inulinu, která byla dobrovolníkům předepsána, dále laboratorní chyby. Dalšími možnými vlivy na průběh a výsledky mohla být nedisciplinovanost dobrovolníků, jako např. nedodržení každodenní konzumace předepsaného množství, neodevzdání příslušného vzorku dle časového harmonogramu, změna ve stravování, změna ve fyzické aktivitě, užití projímadla, užití většího množství alkoholu, nedodržení chladící teploty při uchování vzorků, nedodržení předepsaných zásad. Z vnějších příčin se na neprůkaznosti mohly podílet různé stresové situace u dobrovolníků nebo strava potlačující růst bifidobakterií. Neopomenutelným možným vlivem může být také fakt, že bifidobakterie jsou velmi náchylné a jejich kultivace není snadná. Dále také finanční rozpočet experimentu, který neumožňoval kultivaci na více plotnách, a také dokončení odběrů vzorků u kontrolní skupiny. V případě opakování experimentu bych navrhovala následující zlepšení. Všichni účastníci by měli dodržovat předepsanou kontrolovanou stravu o stejném kvalitativním složení, která by neovlivňovala růst bifidobakterií ani pozitivně, ani negativně. Dále by byla vhodnější užší věková skupina, složena nejlépe ze studentek nebo studentů, kteří 65
by měli podobnou nebo stejnou pracovní a fyzickou aktivitu a kteří by bydleli v místě zpracování vzorků. Tím by se usnadnil sběr vzorků a urychlila se analýza. Důležitou součástí je také dostatečný finanční rozpočet, který by umožňoval stanovení na více plotnách, paralelní stanovení, delší dobu průběhu experimentu, více dobrovolníků, větší množství denních dávek.
66
7 ZÁVĚR V rámci pokusu bylo zkoumáno, zda bez kontrolované a předepsané diety a v běžně konzumovaném množství (200 g/den) má pravidelná konzumace jogurtu s obsahem probiotické kultury (Bifidobacterium, Lactobacillus acidophilus) vliv na počet bifidobakterií v tlustém střevě. To by se mělo promítnout na nárůstu jejich množství ve stolici. Dále bylo zkoumáno, zda výrobcem doporučované množství inulinového prášku (5 g/den) má prokazatelný vliv na počet těchto bakterií ve stolici. Počet bifidobakterií byl zjišťován plotnovou metodou za použití selektivního agaru pro bifidobakterie (BSM agar + BSM suplement). Na základě existujících studií se očekávalo, že během konzumace probiotických jogurtů, obsahujících rod Bifidobacterium, dojde ke zvýšení obsahu těchto bakterií ve vzorcích stolice a po ukončení konzumace dojde k opětovnému poklesu. V experimentální části této práce sice došlo k nepatrnému zvýšení počtu bifidobakterií ve stolici při pravidelné konzumaci probiotických jogurtů, ale tento nárůst nebyl dostatečně velký na to, aby mohl být pokládán za průkazný. Tento výsledek se tedy neshoduje s většinou diskutovaných studií. Po ukončení konzumace jogurtů došlo k předpokládanému poklesu množství bifidobakterií ve stolici. Z této práce tedy nevyplývá, že by měla konzumace jogurtů prokazatelně pozitivní vliv na nárůst množství bifidobakterií ve střevech. Po přídavku inulinového prášku v množství pěti gramů denně se dle studií očekávalo, že inulin selektivně podpoří růst bifidobakterií v tlustém střevě, a to se promítne zvýšeným počtem těchto bakterií ve vzorcích stolice. V tomto experimentu došlo k nepatrnému zvýšení jejich množství ve stolici v porovnání s kontrolní a jogurtovou skupinou. Toto zvýšení ovšem také nebylo dostatečné, aby se mohlo pokládat za průkazné. Po ukončení konzumace jogurtu s přídavkem inulinu došlo, obdobně jako u jogurtové skupiny, k poklesu počtu bifidobakterií. Z toho můžeme usuzovat, že výrobcem doporučované množství pravděpodobně nestačí pro průkazné navýšení probiotických bakterií. Toto množství by se mělo dle dostupných studií nejméně trojnásobně zvýšit, a to na hodnotu 15 až 20 g inulinu denně. Výsledky našeho pokusu mohly být ovlivněny mnoha různými faktory od laboratorních chyb po složení stravy dobrovolníků a také neodevzdáním dostatečného počtu vzorků na počátku pokusu, kdy lze vidět nejednoznačné výsledky u jogurtové a inulinové skupiny. 67
Přestože tato práce neprokázala příznivý vliv konzumace jogurtů a inulinu na počet bakterií rodu Bifidobacterium ve střevě, převážná většina studií tento jev prokázala.
68
8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY AACHARY, A. A.; PRAPULLA, S. G.; 2011: Xylooligosaccharides (XOS) as an Emerging Prebiotic: Microbial Synthesis, Utilization, Structural Characterization, Bioactive Properties, and Applications. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, roč. 10. č. 1, s. 2-16. ISS 1541-4337. ALANDER, M.; MATTO, J.; KNEIFEL, W.; JOHANSSON, M.; KOGLER, B.; CRITTENDEN, R.; MATTILA-SANDHOLM, T.; SAARELA, M.; 2001: Effect of galacto-oligosaccharide supplementation on human faecal microflora and on survival and persistence of Bifidobacterium lactis Bb-12 in the gastrointestinal tract. International Dairy Journal, roč. 11. č. 10, s. 817-825. ISS 0958-6946. ANONYM1; 2011: Synbiotika. Brno: Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta, Ústav experimentální biologie, Oddělení mikrobiologie; [cit. 2011-03-02]; dostupné na: http://www.sci.muni.cz/mikrob/mikrofloraGIT/funkcnipotrav/odk3.htm. BEZIRTZOGLOU, E.; 1997: The intestinal microflora during the first weeks of life. Anaerobe, roč. 3. č. 2-3, s. 173-177. ISS 1075-9964. BIELECKA, M.; BIEDRZYCKA, E.; MAJKOWSKA, A.; 2001: Selection of probiotics and prebiotics for synbiotics and confirmation of their in vivo effectiveness. Food Research International, roč. 35. č. 2-3, s. 125-131. ISS 0963-9969. BOURLIOUX, P.; KOLETZKO, B.; GUARNER, F.; BRAESCO, V.; 2003: The intestine and its microflora are partners for the protection of the host: report on the Danone Symposium "The Intelligent Intestine," held in Paris, June 14, 2002. American Journal of Clinical Nutrition, roč. 78. č. 4, s. 675-683. ISS 0002-9165. BURDYCHOVÁ, R.; SLÁDKOVÁ, P.; 2007: Mikrobiologická analýza potravin. Brno: Ediční středisko MZLU v Brně, 218 s. COLLADO, M. C.; ISOLAURI, E.; SALMINEN, S.; SANZ, Y.; 2009: The Impact of Probiotic on Gut Health. Current Drug Metabolism, roč. 10. č. 1, s. 68-78. ISS 1389-2002. COLLINS, M. D.; GIBSON, G. R.; 1999: Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut. American Journal of Clinical Nutrition, roč. 69. č. 5, s. 1052S-1057S. ISS 0002-9165. COPPA, G. V.; BRUNI, S.; MORELLI, L.; SOLDI, S.; GABRIELLI, O.; 2004: The first prebiotics in humans - Human milk oligosaccharides. Journal of Clinical Gastroenterology, roč. 38. č. 6, s. S80-S83. ISS 0192-0790. COUSSEMENT, P. A. A.; 1999: Inulin and oligofructose: Safe intakes and legal status. Journal of Nutrition, roč. 129. č. 7, s. 1412S-1417S. ISS 0022-3166. CURRY, B.; CROW, V.; 2002: Lactobacillus spp., General characteristics. In: ROGINSKI; FUQUAY; FOX, eds. Encyclopedia of Dairy Sciences, (vol 3). 69
DE VRESE, M.; MARTEAU, P. R.; 2007: Probiotics and prebiotics: Effects on diarrhea. Journal of Nutrition, roč. 137. č. 3, s. 803S-811S. ISS 0022-3166. DE VRESE, M.; SCHREZENMEIR, J.; 2008: Probiotics, Prebiotics, and Synbiotics. Food Biotechnology. Berlin: Springer-Verlag Berlin, (vol 111). FAO/WHO; 2002: Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. FONDÉN, R.; SAARELA, M.; MÄTTÖ, J.; 2003: Lactic acid bacteria (LAB) in functional dairy products, s. 244-262. In: MATTILA-SANDHOLM, T.; SAARELA M., eds. Functional dairy products. CRC Pres. FOOKS, L. J.; GIBSON, G. R.; 2002: Probiotics as modulators of the gut flora. British Journal of Nutrition, roč. 88., s. S39-S49. ISS 0007-1145. FRIČ, P.; 2010: Střevní mikroflóra, probiotika, prebiotika a synbiotika. Potraviny součást zdravého životního stylu. Olomouc: Solen. FULLER, R.; 1989: Probiotics in man and animals. Journal of Applied Bacteriology, roč. 66. č. 5, s. 365-378. ISS 0021-8847. GIBSON, G. R.; BEATTY, E. R.; WANG, X.; CUMMINGS, J. H.; 1995: Selective stimulation of bifidobacteria in the human colon by oligofructose and inulin. Gastroenterology, roč. 108. č. 4, s. 975-982. ISS 0016-5085. GIBSON, G. R.; ROBERFROID, M. B.; 1995: Dietary modulation of the human colonic microbiota - Introducing the concept of prebiotics. Journal of Nutrition, roč. 125. č. 6, s. 1401-1412. ISS 0022-3166. GIL, A.; RUEDA, R.; 2002: Interaction of early diet and the development of the immune system. Nutrition Research Reviews, roč. 15. č. 2, s. 263-292. ISS 0954-4224. GILLILAND, S. E.; 1998: Fermented Milks and Probiotics, s. 195-202. In: MARTH; STEEL, eds. Applied Dairy Microbiology. New York: Marcel Dekker, 516 s. GOPAL.; 2002: Lactobacillus spp., Lactobacillus acidophilus. In: ROGINSKI; FUQUAY; FOX, eds. Encyclopedia of Dairy Sciences, (vol 3). GÖRNER, F.; VALÍK, Ľ.; 2004: Aplikovaná mikrobiológia požívatín. Bratislava: Malé centrum, 528 s. HAMMES, W. P.; HERTEL, C.; 2009: Genus I. Lactobacillus Beijerinck, s. 491-492. In: Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology. Springer, (vol 3). HOLZAPFEL, W. H.; HABERER, P.; SNEL, J.; SCHILLINGER, U.; HUIS IN'T VELD, J. H. J.; 1998: Overview of gut flora and probiotics. International Journal of Food Microbiology, roč. 41. č. 2, s. 85-101. ISS 0168-1605.
70
HULÍN, I.; ZLATOŠ, J.; HÁJEK, J.; 1984: Somatologie. AVICENTRUM. HUTKINS, R. W.; 2006: Cultured Dairy Products, s. 107-144. In: Microbiology and Technology of Fermented Foods: Blackwell Publishing, s. 473. CHEN, H. L.; LU, Y. H.; LIN, J. J.; KO, L. Y.; 2001: Effects of isomalto-oligo saccharides on bowel functions and indicators of nutritional status in constipated elderly men. Journal of the American College of Nutrition, roč. 20. č. 1, s. 4449. ISS 0731-5724. JOOSSENS, M.; HUYS, G.; VAN STEEN, K.; CNOCKAERT, M.; VERMEIRE, S.; RUTGEERTS, P.; VERBEKE, K.; VANDAMME, P.; DE PRETER, V.; 2011: High-throughput method for comparative analysis of denaturing gradient gel electrophoresis profiles from human fecal samples reveals significant increases in two bifidobacterial species after inulin-type prebiotic intake. Fems Microbiology Ecology, roč. 75. č. 2, s. 343-349. ISS 0168-6496. KLEIN, A.; FRIEDRICH, U.; VOGELSANG, H.; JAHREIS, G.; 2008: Lactobacillus acidophilus 74-2 and Bifidobacterium animalis subsp lactis DGCC 420 modulate unspecific cellular immune response in healthy adults. European Journal of Clinical Nutrition, roč. 62. č. 5, s. 584-593. ISS 0954-3007. KOMPRDA, T.; 2003: Základy výživy člověka. Brno: MZLU v Brně, 164 s. LESBROS-PANTOFLICKOVA, D.; CORTHESY-THEULAZ, I.; BLUM, A. L.; 2007: Helicobacter pylori and probiotics. Journal of Nutrition, roč. 137. č. 3, s. 812S818S. ISS 0022-3166. LOMAX, A. R.; CALDER, P. C.; 2009: Prebiotics, immune function, infection and inflammation: a review of the evidence. British Journal of Nutrition, roč. 101. č. 5, s. 633-658. ISS 0007-1145. LUKÁŠOVÁ, J.; KOLEKTIV, A.; 2001: Hygiena a technologie mléčných výrobků. Brno: Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 180 s. MARTEAU, P.; SEKSIK, P.; 2004: Tolerance of probiotics and prebiotics. Journal of Clinical Gastroenterology, roč. 38. č. 6, s. S67-S69. ISS 0192-0790. MÄTTÖ, J.; FONDÉN, R.; TOLVANEN, T.; VON WRIGHT, A.; VILPPONENSALMELA, T.; SATOKARI, R.; SAARELA, M.; 2006: Intestinal survival and persistence of probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium strains administered in triple-strain yoghurt. International Dairy Journal, roč. 16. č. 10, s. 11741180. ISS 0958-6946. MOUNTZOURIS, K. C.; MCCARTNEY, A. L.; GIBSON, G. R.; 2002: Intestinal microflora of human infants and current trends for its nutritional modulation. British Journal of Nutrition, roč. 87. č. 5, s. 405-420. ISS 0007-1145. NEVORAL, J.; 2010: Probiotika a jejich klinické užití. Potravinářská revue, roč. č. 2, s. 18-19. 71
NINESS, K. R.; 1999: Inulin and oligofructose: What are they? Journal of Nutrition, roč. 129. č. 7, s. 1402S-1406S. ISS 0022-3166. O´GRADY, B.; GIBSON, G. R.; 2005: Microbiota of the Human Gut, s. 1-12. In: TAMINE, A. Y., ed. Probiotic Dairy Products: Blackwell, 216 s. OELSCHLAEGER, T. A.; 2010: Mechanisms of probiotic actions - A review. International Journal of Medical Microbiology, roč. 300. č. 1, s. 57-62. ISS 1438-4221. PARVEZ, S.; MALIK, K. A.; KANG, S. A.; KIM, H. Y.; 2006: Probiotics and their fermented food products are beneficial for health. Journal of Applied Microbiology, roč. 100. č. 6, s. 1171-1185. ISS 1364-5072. PRILASSNIG, M.; WENISCH, C.; DAXBOECK, F.; FEIERL, G.; 2007: Are probiotics detectable in human feces after oral uptake by healthy volunteers? Wiener Klinische Wochenschrift, roč. 119. č. 15-16, s. 456-462. ISS 0043-5325. RADA, V.; 2010: Využití probiotik, prebiotik a synbiotik. Interní medicína pro praxi, roč. č. 2, s. 92-97. RAUTIO, M.; 2002: Indigenous Intestinal Microbiota and Disease. Disertační práce. Department of Microbiology, National Public Health Institute and Division of General Microbiology, Department of Biosciences. Helsinki: University of Helsinki. Dostupné na: http://ethesis.helsinki.fi/julkaisut/mat/bioti/vk/rautio ROBERFROID, M.; GIBSON, G. R.; HOYLES, L.; MCCARTNEY, A. L.; RASTALL, R.; ROWLAND, I.; WOLVERS, D.; WATZL, B.; SZAJEWSKA, H.; STAHL, B.; GUARNER, F.; RESPONDEK, F.; WHELAN, K.; COXAM, V.; DAVICCO, M. J.; LEOTOING, L.; WITTRANT, Y.; DELZENNE, N. M.; CANI, P. D.; NEYRINCK, A. M.; MEHEUST, A.; 2010: Prebiotic effects: metabolic and health benefits. British Journal of Nutrition, roč. 104. č., s. S1S63. ISS 0007-1145. RYCROFT, C. E.; JONES, M. R.; GIBSON, G. R.; RASTALL, R. A.; 2001: A comparative in vitro evaluation of the fermentation properties of prebiotic oligosaccharides. Journal of Applied Microbiology, roč. 91. č. 5, s. 878-887. ISS 1364-5072. SALVINI, F.; GRANIERI, L.; GEMMELLARO, L.; GIOVANNINI, M.; 2004: Probiotics, prebiotics and child health: Where are we going? Journal of International Medical Research, roč. 32. č. 2, s. 97-108. ISS 0300-0605. SEDLÁČEK, I.; 2007: Taxonomie prokaryot: Masarykova univerzita. SHAH, N. P.; LANKAPUTHRA, W. E. V.; 2002: Bifidobacterium spp., s.141-151. In: ROGINSKI, H.; FUQUAY J. W.; FOX P. F., eds. Encyclopedia of Diary Sciences: Academic Press, (vol 1).
72
SCHREZENMEIR, J.; DE VRESE, M.; 2001: Probiotics, prebiotics, and synbiotics approaching a definition. American Journal of Clinical Nutrition, roč. 73. č. 2, s. 361S-364S. ISS 0002-9165. SIGMA-ALDRICH; 2011: BSM-Agar, [cit. 2011-2-25]. Dostupné na: http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Fluka/Datasheet/88517dat.Par.0 001.File.tmp/88517dat.pdf SIMEONOVOVÁ, J.; INGR, I.; GAJDŮŠEK, S.; 2003: Zpracování a zbožíznalství živočišných produktů. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 124 s. SOCCOL, C. R.; VANDENBERGHE, L. P. D.; SPIER, M. R.; MEDEIROS, A. B. P.; YAMAGUISHI, C. T.; LINDNER, J. D.; PANDEY, A.; THOMAZ-SOCCOL, V.; 2010: The Potential of Probiotics: A Review. Food Technology and Biotechnology, roč. 48. č. 4, s. 413-434. ISS 1330-9862. SUKOVÁ, I.; 2010: Přednosti a potenciální rizika z konzumace inulinu. Agronavigátor. [cit. 2011-2-24], dostupné na: http://www.agronavigator.cz/default.asp?ch=13&typ=1&val=105600&ids=147 ŠUSTOVÁ, K.; 2010: Mlékárenské technologie, přednášky. Brno: Mendelova univerzita v Brně. TOMASIK, P. J.; TOMASIK, P.; 2003: Probiotics and prebiotics. Cereal Chemistry, roč. 80. č. 2, s. 113-117. ISS 0009-0352. TUREK, B.; ŠÍMA, P.; ŠEVČÍK, J.; 2009: Od Mečnikova k Hrubému a probiotikům aneb střevní mikroflóra včera a dnes. Výživa a potraviny, roč. č. 6, s. 149-150. VELÍŠEK, J.; HAJŠOVÁ, J.; 2009: Chemie potravin 1. Tábor: OSSIS, 580 s. VYHLÁŠKA MINISTERSTVA ZEMĚDĚLSTVÍ č.77/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro mléko a mléčné výrobky, mražené krémy a jedlé tuky a oleje. WALSTRA, P.; WOUTERS, J. T. M.; GEURTS, T. J.; 2006: Fermented Milks, s. 570571. In: Dairy Science and Technology. Boca Raton: CRC Press, 782 s.
73
9 SEZNAM OBRÁZKŮ, TABULEK A GRAFŮ Obr. 1 Gastrointestinální trakt Obr. 2 Přehled prospěšných a škodlivých druhů bakterií (Bourlioux, a kol., 2003) Obr. 3 Faktory ovlivňující kolonizaci střev a složení mikroflóry GIT (Bourlioux, a kol., 2003) Obr. 4 Příznivé účinky probiotik na zdraví (Parvez, a kol., 2006) Obr. 5 Grafické znázornění časového harmonogramu experimentu Obr. 6 Schéma mikrobiologické analýzy Obr. 7 Kolonie bifidobakterií po mikrobiologické kultivaci Tab. 1 Mikroorganismy, které jsou označeny jako probiotika (O´Grady a Gibson, 2005) Tab. 2 Funkční charakteristiky probiotických bakterií (Hutkins, 2006) Tab. 3 Evidence příznivých účinků probiotik na zdraví střev (Hutkins, 2006) Tab. 4 Účinky probiotik na zdraví (Fondén, a kol., 2003) Tab. 5 Známé a komerčně přístupné kmeny označované jako probiotika (Görner a Valík, 2004) Tab. 6 Členění KMV na skupiny a podskupiny dle vyhlášky č. 77/2003 Sb., kterou se stanoví požadavky pro mléko a mléčné výrobky, mražené krémy a jedlé tuky a oleje Tab. 7 Druhy živých mikroorganismů v kysaných mléčných výrobcích dle vyhl. 77/2003 Sb. Tab. 8 Klasifikace vybraných druhů sacharidů jako „colonic foods“ a prebiotika (Gibson a Roberfroid, 1995) Tab. 9 Výskyt inulinu a oligofruktózy v některých surovinách v čerstvém stavu (Suková, 2010) Tab. 10 Rozdíly nárůstů počtu bifidobakterií mezi jednotlivými po sobě následujícími odběry Tab. 11 Nárůsty od prvního po poslední stanovení v porovnání od prvního měření (první měření je hodnota 0) Tab. 12 Počty KTJ bifidobakterií (zlogaritmované hodnoty) u jednotlivých osob při jednotlivých stanoveních Graf 1 Nárůsty a poklesy obsahu bifidobakterií od počáteční nulové hodnoty prvního měření dle výsledků z ANOVY Graf 2 Průměr absolutních hodnot ve skupinách při jednotlivých měřeních
74
10 PŘÍLOHY Tab. 12 Počty KTJ bifidobakterií (zlogaritmované hodnoty) u jednotlivých osob při jednotlivých stanoveních odběr 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4
po 10 dnech bez probiotik
po 7 dnech konzumace jogurtů
po 14 dnech konzumace jogurtů
po 21 dnech konzumace jogurtů + u inulinové skupiny po 21 dnech konzumace jogurtů a 7 dnech konzumace inulinu
75
K 5,259637 6,30103 4,958607 6,560667 5,405765 7,268237 5,560667 5,560667 5,560667 6,592076 5,60206 7,31079 6,21388 4,435729 4,958607 7,018549 6,876638 4,560667 6,21388 2,958607 4,954243 4,833669 5,706795 6,104735 5,134699 5,658445 5,736759 5,700546 5,733854
Skupiny J I 5,803705 7,072551 7,104735 6,771521 6,072551 7,312716 7,052029 7,922395 5,861697 5,958607 6,104735 4,958607 6,405765 6,389971 5,657577 6,958607 6,962929 8,052029 7,778151 4,958607 7,786622 7,421005 6,729459 5,971445 5,435729 5,320335 6,405765 4,877685 7,405765 5,178715 7,189056 5,778809 8,165433 5,189056 7,072551 4,803705 6,477121 7,650572 7,176091 5,861697 5,581857 6,065817 6,888026 5,894618 6,784682 4,867092 7,794298 5,405765 9,446876 5,706795 7,630705 5,502675 6,560667 6,657577 5,91285 5,888026 6,945379
odběr 5 5 5 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 6 6 6 7 7 7 7 7 7 7 7
po 3 dnech bez jogurtů
po 7 dnech bez jogurtů
po 10 dnech bez jogurtů
76
K
Skupiny J 5,674611 6,381853 5,633468 6,098486 6,401087 6,119975 7,630705 4,736759 5,591065 6,551893 5,588017 5,104735 5,69897 5,674611 6,638943 4,861697 5,780775 4,736759 4,60206 5,165433 5,160004 4,771521 6,325963 5,110896
I 6,51491 6,592076 6,996034 7,041393 7,856234 6,791116 6,019305 5,967207 6,598094 5,581857 6,736759 7,495166 6,473155
6,286987 5,801217 7,270361 7,235069 7,4225 5,085712 5,861697 5,393176
