VALIDASI SEKUNDER METODE ANALISA KAPANG DAN KHAMIR PADA SAOS SKRIPSI RIZQI FEBRINA F

VALIDASI SEKUNDER METODE ANALISA KAPANG DAN KHAMIR PADA SAOS

SKRIPSI

RIZQI FEBRINA F24070053

DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI

Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa skripsi dengan judul Validasi Sekunder Metode Analisa Kapang dan Khamir pada Saos adalah hasil karya saya sendiri dengan arahan dosen pembimbing akademis dan belum diajukan dalam bentuk apapun di perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Bogor, Juni 2013 Yang membuat pernyataan, Rizqi Febrina NIM F240070053

ABSTRACT Rizqi Febrina. Method Secondary Validation of Mould and Yeast Analysis Sauce Food are frequentlycontaminated by mold and yeast. The method used for analysis of mold on food in Indonesia set by BSN (Badan Standarisasi Nasional) was using potato dextrose agar (PDA) media. Problems are sometimes occured when using this media due to the spreading of mold colony that suppress other colonies to grow, resulting difficulties to asses morphology as well as enumeration of the mold. Statistifically, the outcome would be less acurate. Another method that could be used for the analysis of mold and yeast are the methods of ISO (International Standart Operation). Rose bengal dichloran chloramphenicol media (DRBC) was found to be a better media for quantative analysis of mold and yeast since it contains dichloran and rose bengal that could prevent the growth of spreading colonies. Laboratory experiments was needed to verify that using of different media can domonstrate the same performance for method enumeration. Secondary validation conducted for verification, if the laboratory using standard methods or adopting validated method. This Research was performed using the method of SNI 01-2897-1992 and ISO (International Standart Operation). Both of that methods were compared to obtained a valid methods. Parameters determined on method validation were accuracy precision, linearity, limit of detection, and limit of quantification. The results showed that all parameters were in accordance with the acceptance criteria of Internationa Standart Operation Method Validation. Accuracy was determined SNI method and ISO method with recovery percentage in range of 84%-109% for SNI and ISO method. The linearity in the concentration of 10; 100; 1000; and 10.000 cfu/gram resulted in correlation coefficent of 0,9979–0,9981. limit of detection in this method was 2cfu/gram and limit of quantification was 4 cfu/gram. For sauce product, the number of colonies grown in both media of DRBC and PDA were not significantly diffrent. Keywords : DRBC, method validation, mould, sauce, yeast

VALIDASI SEKUNDER METODE ANALISA KAPANG DAN KHAMIR PADA SAOS

SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan

Oleh RIZQI FEBRINA F24070053

DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013

Judul Skripsi : Validasi Sekunder Metode Analisa Kapang dan Khamir pada Saos Nama : Rizqi Febrina NIM : F24070053

Menyetujui: Dosen Pembimbing

Dr. Harsi D Kusumaningrum NIP 197601312005012001

Mengetahui, Ketua Departemen

Dr. Ir. Feri Kusnandar, M.Sc NIP. 19680526.199303.1.004

Tanggal Ujian :

PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga skripsi ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Mei 2012 ini adalah validasi metode analisa dengan judul “Validasi Sekunder Metode Analisa Kapang dan Khamir pada Saos”. Ucapan terimakasih, penulis sampaikan kepada LDITP (Laboratorium Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan) yang telah menyediakan pendanaan penelitian, Ibu Dr. Harsi D Kusumaningrum sebagi pembimbing, Ibu Dr. Didah Nurfaridah, S.TP, M.Si dan Ibu Siti Nurjanah, S.TP, M.Si sebagai penguji. Ungkapan terimakasih juga disampaikan kepada papa, mama, serta seluruh keluarga, atas doa dan kasih sayangnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor,

Juni 2013

DAFTAR ISI DAFTAR ISI ................................................................................. DAFTAR TABEL........................................................................... DAFTAR GAMBAR ..................................................................... DAFTAR LAMPIRAN.................................................................. PENDAHULUAN......................................................................... LATAR BELAKANG ............................................................. TUJUAN ................................................................................... METODOLOGI PENELITIAN .................................................... WAKTU DAN TEMPAT .......................................................... BAHAN DAN ALAT ............................................................... METODE PENELITIAN ......................................................... HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................... KEMURNIAN KULTUR ....................................................... ANALISA JUMLAH KULTUR ............................................. PARAMETER UJI TERVALIDASI ...................................... VERIFIKASI METODE PADA PRODUK SAOS ............... KESIMPULAN .............................................................................. DAFTAR PUSTAKA ..................................................................... LAMPIRAN ....................................................................................

HALAMAN iii iv v vi 1 1 2 2 2 3 4 9 9 9 10 17 19 20 22

DAFTAR TABEL Jumlah awal kultur uji kapang ...................................................... Jumlah awal kultur uji khamir ...................................................... Jumlah awal kultur uji kapang dan khamir ................................... Rata-rata jumlah perolehan kembali kapang dan khamir dengan perhitungan mengacu pada SNI ................................................... Rata-rata jumlah perolehan kembali kapang dan khamir dengan perhitunga mengacu pada ISO ..................................................... Jumlah kultur yang tumbuh pada saos berbagai merk ..................

Halaman 10 10 11 13 13 17

DAFTAR GAMBAR Diagram persiapan media PDA......................................................... Diagram persiapan media DRBC....................................................... Diagram persiapan sampel................................................................. Perhitungan jumlah koloni kapang dan khamir .................................. Diagram penentuan akurasi, presisisi dan linearitas ........................... Diaram penentuan LOD dan LOQ...................................................... Diagram verifikasi jumlah kapang dan khamir dengan berbagai merk

Halaman 4 4 5 6 7 8 8

Kultur murni kapang Rhizopus Olighosporus...................................... 9 Kultur murni Saccharomyces cerevisiae.............................................. 9 Jumlah koloni kapang dan khamir dengan perhitungan mengacu pada SNI..12 Jumlah koloni kapang dan khamir dengan perhitungan mengacu pada ISO............................................................................... 12 Presisi metode dengan perhitungan mengacu pada SNI ...................... 14 Presisi metode dengan perhitungan mengacu pada ISO....................... 14 Linearitas dengan perhitungan mengacu pada SNI.............................. 16 Linearitas dengan perhitungan mengacu pada ISO .............................. 16 Berbagai jenis kapang dan khamir yang tumbuh pada berbagai merk saos .. 17

DAFTAR LAMPIRAN Halaman Biodata..................................................................................................................22 Rancangan validasi metode...................................................................................23

1

PENDAHULUAN Latar Belakang Pangan merupakan sumber gizi bagi manusia. Pertumbuhan dan perkembangan mikroorganisme dalam makanan sangat erat hubungannya dengan kehidupan manusia. Pertumbuhan mikroorganisme dalam pangan dapat menyebabkan perubahan yang menguntungkan. Selain itu pertumbuham mikroorganisme dalam pangan juga dapat mengakibatkan perubahan fisik yang tidak diinginkan, sehingga bahan pangan tersebut tidak layak dikomsumsi. Pangan menjadi layak atau tidak dikonsumsi tidak terlepas dari ada tidaknya mikoorganisme perusak dan patogen pangan. Mikroorganisme tersebut dapat terkandung di dalam makanan disebabkan karena kontaminasi pada bahan pangan selama proses pengolahan dan penyimpanan. Kontaminasi yang sering terjadi pada negara Indonesia yang beriklim tropis adalah kontaminasi disebabkan oleh kapang dan khamir. Saos merupakan produk berbentuk pasta dengan aroma khas. Saos biasa ditambahkan sebagai bahan penyedap dan penambah rasa pada makanan. Saos adalah produk yang dihasilkan dari campuran bubur atau pasta atau padatan tomat maupun cabai yang diperoleh dari tomat yang masak, yang diolah dengan bumbu-bumbu, dengan atau tanpa penambahan bahan pangan lain. Saos seringkali memiliki masalah pertumbuhan kapang pada saat penyimpanannya. Metode yang digunakan untuk analisis kapang dan khamir yang ditetapkan BSN (Badan Srandardisasi Nasional) melalui SNI 01-2897-1992, yaitu tentang tata cara uji kapang dan khamir menggunakan media potato dextrose agar (PDA). Namun terdapat kelemahan pada media potato dextrose agar (PDA), yaitu sulitnya menghitung jumlah kapang dan khamir disebabkan oleh pertumbuhan kapang yang melebar (spreading) dari satu atau dua jenis kapang tertentu pada cawan petri yang mengakibatkan tertutupnya koloni kapang dan khamir lain, atau bahkan terhambatnya pertumbuhan kapang dan khamir lain sehingga tingkat kepercayaan terhadap hasil menjadi kurang (Indriati dan Herawati 2009). Metode lain yang dapat digunakan untuk analisis kapang dan khamir adalah metode ISO (International Standart Operation). Metode ISO (International Standart Operation) memiliki sensitifitas yang cukup baik karena menggunakan media dichloran rose bengal chloramphenicol (DRBC) yang merupakan media yang dapat menekan penyebaran koloni kapang dan khamir (Henson 1981). Penggunaan media DRBC diketahui dapat menghambat penyebaran koloni pada kapang dan khamir. Rose bengal adalah salah satu zat pewarna yang dapat mengatasi masalah yang disebabkan oleh kapang dan khamir yang pertumbuhannya melebar. Dichloran (2,6-dichloro-4-nitroaniline), digunakan sendiri-sendiri atau dikombinasikan dengan rose bengal diketahui sangat efektif menekan pertumbuhan kapang dan khamir sehingga diameter koloninya tidak melebar. Dichloran, juga dikenal sebagai dichloronitroaniline (DCNA) adalah fungisida yang terdaftar untuk mengontrol kapang dan khamir yang bersifat patogenik (Henson 1981). Penggunaan media DRBC menekan pertumbuhan kapang dan khamir yang melebar tanpa mempengaruhi germinasi sporanya.

2

Namun, penggunaan media DRBC membutuhkan biaya yang lebih mahal dibandingkan menggunakan media PDA. Validasi metode analisa adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (SNI 19-170252000 Klausul 5.4.5.1). Validasi primer dilakukan jika laboratorium menggunakan metode analisis baru hasil pengembangan, atau metode yang dimodifikasi terhadap suatu metode standar. Validasi sekunder dilakukan untuk verifikasi, jika laboratorium menggunakan atau mengadopsi metode standar yang telah divalidasi (Sukarno 2005). Pendeteksian kapang dan khamir pada skripsi ini dilakukan dengan menggunakan metode yang mengacu pada SNI 01-2897-1992 dan metode ISO (Iternational Standart Operation) yaitu ISO 21527-1:2008(E). Kedua metode tersebut dibandingkan hasilnya sehingga didapatkan metode yang valid. Metode valid diperlukan untuk dapat ditetapkan dengan jelas bidang penerapannya dan kehandalan mutlak yang diberikannya. Validasi metode pengujian adalah proses menetapkan dan mengevaluasi sifat atau gambaran dari manfaat, ini merupakan suatu bagian dari program jaminan mutu (Siregar 2007).

Tujuan Penelitian Tujuan Umum Tujuan umum dari penelitian ini adalah menentukan metode yang tepat untuk analisis kapang dan khamir. Tujuan Khusus Tujuan khusus penelitian ini adalah : 1. Melakukan validasi sekunder atau verifikasi metode SNI 01-2897-1992 dan metode ISO 21527-1:2008(E). 2. Membandingkan hasil analisis kapang dan khamir yang diperoleh dari dua metode berbeda yaitu metode SNI 01-2897-1992 dan ISO 21527-1:2008(E) . Manfaat Penelitian Manfaat dari penelitian ini adalah : 1. Mendapatkan informasi mengenai metode analisa yang tepat untuk digunakan pada analisis kapang dan khamir. 2. Mendapatkan informasi mengenai tingkat validitas metode yang digunakan.

METODOLOGI PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian ini merupakan bagian dari kegiatan LDITP (Laboratorium Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan). Salah satu syarat laboratorium terakreditasi adalah implementasi metode uji yang sudah divalidasi dengan ketentuan pada ISO/IEC 17025:2005 butir 5.4. Penelitian dilaksanakan di

3

Laboratorium Mikrobiologi Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan IPB.

Bahan dan Alat Bahan yang digunakan memiliki grade analitik. Media yang digunakan pada penelitian ini adalah potato dextrose agar (PDA OXOID), dichloran rose bengal chloramphenicol (DRBC OXOID), pottato dextrose broth (PDB OXOID), aquadest, chloramphenicol, dan pengencer (0,1% pepton water OXOID). Sampel yang digunakan adalah saos dengan berbagai merk. Kultur yang digunakan Rhizopus oligosporus dan Saccharomyces cerevisisae (ATTC 9763). Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah cawan petri, micro pipet, erlenmeyer, gelas piala, alumunium foil, tissue, kapas, bunsen, vortex, hockey stick, sudip, timbangan, kantong plastik steril, wadah pipet, inkubator 25°C, stomacher, bunsen, outoclaf, laminar flow, oven/alat sterilisasi kering, tabung reaksi dan tabung reaksi bertutup, oven suhu 30°C.

Metode Penelitian Persiapan Pengencer Pada metode ISO dan SNI menggunakan 0,1% pepton water sebagai pengencer. Pepton water ditimbang sebanyak 1 gr kemudian dicampurkan dengan 1 liter aquadest dalam labu takar. Labu takar digoyang hingga seluruh pepton water larut dan tercampur dengan aquadest secara merata. Pengencer ditempatkan di dalam tabung reaksi dalam jumlah 9 ml untuk membuat pengenceran 1:10 (1ml atau 1gr contoh dalam 9 ml) dan ditempatkan di dalam erlenmeyer masingmasing berisi 90ml untuk membuat pengenceran 1:10 (10 ml atau 1gr contoh dalam 90 ml). Pengencer disterilisasi 121° selama 15 menit. Persiapan Media Media pottato dextrose broth (PDB) ditimbang sebanyak 6 gram dicampur dengan 250 ml aquadest. Media dipanaskan di atas hotplate dan diaduk hingga larut kemudian dimasukkan ke dalam tabung tertutup masing-masing 7-10 ml. Tabung yang telah berisi media disterilisasi ke dalam otoklaf selama 15 menit pada suhu 121°C kemudian didinginkan pada suhu 50° C. Media potato dextrose agar (PDA) ditimbang sebanyak 39 gram dicampur dengan 1 liter aquadest. Bahan dipanaskan di atas hotplate dan diaduk hingga larut kemudian disterilisasi pada autoclave 121° C selama 15 menit. Sebelum digunakan terlebih dahulu didinginkan pada suhu 50°C. Antibiotik kloramfenikol dilarutkan sebanyak 1 gram dalam 100 ml aquadest steril, kemudian ditambahkan ke dalam media sebanyak 4 ml. Agar dituangkan ke dalam masing-masing cawan petri steril sebanyak 15-20 ml. Cawan yang berisi media dibiarkan memadat dan disimpan di dalam oven steril pada suhu 30°C selama 24 jam dengan posisi terbalik hingga permukaan media kering dan siap untuk dilakukan spread. Persiapan media PDAdapat dilihat pada Gambar 1.

4

PDA + aquadest dipanaskan hingga larut

kloramfenikol + aquadest steril

diterilisasi 121°C, 15menit dinginkan hingga suhu 50°C, ditambahkan 4ml kloramfenikol dituangkan ke dalam cawan petri 15-20ml disimpan pada oven steril suhu 30°C selama 24 jam dengan posisi terbalik hingga permukaan agar mengering Gambar 1. Diagram persiapan media PDA Media dichlorant rose bengal agar (DRBC) yang telah ditimbang sebanyak 31,5 dan dicampur dengan 1 liter aquadest. Media dipanaskan di atas hotplate dan diaduk hingga larut. Media disterilisasi ke dalam otoklaf selama 15 menit pada suhu 121°C dan didinginkan pada suhu 50° C dan ditambahkan dengan 0,1 gr antibiotik kloramfenikol. Kemudian dituangkan ke dalam masing-masing cawan petri steril sebanyak 15-20 ml. Cawan yang berisi media dibiarkan memadat dan disimpan di dalam oven steril pada suhu 30°C selama 24 jam dengan posisi terbalik hingga permukaan media kering dan siap untuk dilakukan spread. Persiapan media dapat dilihat pada Gambar 2. DRBC + aquadest

kloramfenikol

dipanaskan hingga larut diterilisasi 121°C, 15menit dinginkan hingga suhu 50°C, ditambahkan kloramfenikol dituangkan ke dalam cawan petri 15-20ml disimpan pada oven steril suhu 30°C selama 24 jam dengan posisi terbalik hingga permukaan agar mengering Gambar 2. Diagram persiapan media DRBC

5

Persiapan Sampel a. Sampel negatif Sampel ditimbang secara aseptik sebanyak 10 gr, kemudian dimasukkan ke dalam plastik steril berisi 90 ml pengencer. Kemudian sampel dihomogenkan hingga tercampur merata dengan pengencer dan dibiarkan kurang lebih 15 menit sebelum digunakan. b. Sampel positif Sampel ditimbang aseptik sebanyak 10 gr, kemudian dimasukkan ke dalam kantong plastik steril berisi 90 ml pengencer. Selanjutnya kapang Rhizopus oligosporus dan khamir Saccharomyces cerevisiae diinokulasi ke dalam sampel masing-masing sebanyak 0,5 ml ke dalam suspensi sampel dan dihomogenkan. Sampel dibiarkan kurang lebih 15 menit sebelum digunakan. c. Kontrol positif Kapang Rhizopus oligosporus dan khamir Saccharomyces cerevisiae diencerkan ke dalam 0,1% pepton dan dihomogenkan. Persiapan sampel untuk validasi kapang khamir dapat dilihat pada Gambar 3. saos + pepton water

saos + pepton water + kultur

kultur + pepton water

dihomogenkan

dihomogenkan

dihomogenkan

Sampel negatif

Sampel positif

Kontrol positif

Gambar 3. Diagram persiapan sampel Uji Kemurnian Kultur Sebelum melakukan penelitian terlebih dahulu harus dilakukan persiapan kultur uji. Kultur murni larutan stok acuan merupakan faktor penting yang harus diperhatikan dalam melakukan validasi metode analisa. Untuk memastikan kemurnian kultur stok acuan diperlukan konfirmasi melalui serangkaian tahap analisis. Dalam penelitian ini kultur murni yang digunakan adalah kapang Rhizopus oligosporus dan khamir Saccharomyces cerevisiae . Kultur yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Pangan IPB diperiksa kemurniaannya di bawah mikroskop. Biakan yang telah diperiksa kemurniannya dapat digunakan sebagai kultur stok dan kultur kerja. Kultur ditumbuhkan ke dalam media agar miring pottato dextrose agar (PDA) dan diinkubasi 25°C selama 5 hari untuk dijadikan kltur stok. Sedangkan untuk kultur kerja diambil satu ose kultur murni dan ditumbuhkan di dalam pottato dextrose broth (PDB) dan diinkubasi pada suhu 25°C selama 5 hari. Analisa Jumlah Kultur Kultur kerja yang siap digunakan diencerkan menggunakan pengencer 0,1% pepton water hingga pengenceran 10-7 agar diketahui jumlah kapang dan khamir yang tumbuh dalam kultur kerja. Kemudian kultur dimasukkan ke dalam cawan petri yang telah berisi media padat sebanyak 0,1 ml dan disebar menggunakan

6

hockey stick. Jumlah koloni yang tumbuh pada masing-masing cawan akan diakumulasikan dan dihitung sebagai jumlah colony forming unit per milliliter (cfu/ml). Pengenceran yang menunjukkan pertumbuhan sekitar 0, 10, 100, 1000 dan 10.000 CFU/ml akan digunakan sebagai standar penetapan inokulum. Perhitungan koloni secara ringkas dapat dilihat pada Gambar 4. Analisa jumlah koloni kapang dan khamir dilakukan untuk mengetahui jumlah kultur. Kultur kerja yang akan digunakan terlebih dahulu diketahui jumlahnya penambahan kultur pada sampel dapat diatur sesuai dengan jumlah yang diinginkan. Cawan yang masuk ke dalam perhitungan adalah cawan petri dengan jumlah koloni 10-150 koloni (SNI) dan <150 koloni (ISO). Rumus perhitungan koloni adalah sebagai berikut : N = ∑ C/ [(1 x n1) + (0,1 x n2) x d] Dimana : n1 = jumlah cawan pada pegenceran pertama n2 = jumlah cawan pada pegenceran kedua d = pengenceran pada cawan pertama ∑ C = jumlah koloni pada cawan N = jumlah koloni per ml atau gram Kultur kerja 1ml 9ml pengencer 0,1ml

0,1 ml

Inkubasi 25°C 5 hari

0,1 ml

0,1ml 0,1ml

PDA DRBC 10 10-2 -1

10-3 10-4 10-5

10-6

Gambar 4. Perhitungan jumlah koloni kapang dan khamir Menentukan akurasi relatif, presisi, dan linearitas Penentuan linearitas, akurasi relatif dan presisi dilakukan kalibrasi 5 tingkatan dengan pengulangan sebanyak 5 kali. Tingkatan yang dipilih pada penelitian ini adalah 0, 10, 100, 1000 dan 10.000. Tingkatan 0 pada penelitian ini diperoleh dari sampel negatif. Saos sebanyak 10 gr dilarutkan ke dalam 90 ml pengencer kemudian dipipet sebanyak 0,1 ml dan dimasukkan ke dalam 3 cawan petri yang berisi media padat PDA atau DRBC sebanyak 0.3 ml, 0.3 ml dan 0.4 ml. Tigkatan 10, 100, 1000 dan 10.000 diperoleh dari sampel positif yaitu sampel saos sebanyak 10 gr ditambahkan masing-masing 1 ml kultur kapang dan khamir (0,5 ml kapang dan 0,5 ml khamir) yang telah diatur jumlah kulturnya sebanyak yang diinginkan, kemudian didilarukan dengan pengencer sebanyak 90 ml. Sampel dipipet sebanyak 0,1 ml ke dalam cawan yang telah berisi media padat

7

dan disebar menggunakan hockey stick sehingga pertumbuhannya menyebar dan tidak saling menumpuk antara koloni satu dengan koloni lainnya kemudian diinkubasi 25°C selama 5 hari. Untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada Gambar 5. Sampel negatif 10 gr saos

Sampel positif 10 gr saos + 1ml kultur (104)

10 gr saos + 1ml kultur (103)



9 ml pengencer 0,1 ml

0,1 ml

0,3 ml 0,3 ml 0,4 ml 0,3 ml 0,4 ml Tingkata 0

0,1 ml

PDA

0,1 ml

PDA

PDA

PDA DRBC

10

DRBC

100

DRBC

1000

10.000

Gambar 5. Diagram penentuan akurasi relatif, presisi dan linearitas Parameter akurasi ditentukan dengan menghitung nilai recovery menggunakan rumus: %Recovery (R) = [(A-B)/C] x 100 Keterangan : A = sampel dengan inokulum (sampel positif) B = sampel tanpa inokulum (sampel negatif) C = inokulum tanpa sampel (kontrol positif) Keseragaman nilai yang diperoleh dari pengukuran berulang dinyatakan sebagai presisi dengan rumus: N = √∑ii=n((loga1-logb1/x1)2 2p

Keterangan : a1 = cawan1 b1 = cawan2 (log a1- log b1)/x1 = perbedaan relatif hasil logaritma duplo i = 1,2,3,...,n p = jumlah penentuan duplo (jumlah sampel uji) Linearitas dihitung berdasarkan persamaan matematik data dari uji 5 ulangan. Parameter hubungan linear menggunakan koefisien kolerasi R pada analisis regresi linear Y=aX+b.

8

Menentukan LOD dan LOQ Tahapan penentuan LOD dan LOQ dihitung melalui garis linearitas. Selain itu dapat juga dilakukan dengan kalibrasi 3 tingkatan yang terkecil dengan pengulangan sebanyak 6 kali. Inokulasi kultur sebesar 3, 10, 30 cfu/ml ditambahkan ke dalam sampel dan diaduk hingga homogen. Sampel kemudian diinkubasi masing-masing 25°C selama 5 hari pada media PDA dan DRBC.

10 gr saos + 3 ml kultur (102)


0,1 ml


0,1 ml

0,1 ml

PDA DRBC

PDA DRBC

PDA DRBC

Gambar 6. Diagram penentuan LOD dan LOQ Nilai LOD dan LOQ dihitung menggunakan rumus : LOD = 3,3 Sa b LOQ = 10 Sa b Keterangan : Sa = simpangan baku intersep b = rata-rata kemiringan garis Verifikasi Jumlah Kapang dan Khamir pada Saos Verifikasi dilakukan untuk mengetahui jumlah kapang dan khamir yang terdapat pada saos. Sampel saos dengan berbagai merk diperiksa jumlah kapang dan khamir. Saos sebanyak 10 gr dilarutkan ke dalam 90ml pengencer kemudian dipipet dan dimasukkan ke dalam 3 cawan petri yang berisi media padat PDA atau DRBC sebanyak 0.3 ml, 0.3 ml dan 0.4 ml. Untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada Gambar 7. 10gr saos

0,3 ml 0,3 ml 0,4 ml

90 ml pengencer PDA

DRBC

Gambar 7. Diagram verifikasi jumlah kapang dan khamir dengan berbagai merk

9

HASIL DAN PEMBAHASAN Kemurian Kultur Kemurnian kultur uji merupakan faktor penting yang harus diperhatikan dalam validasi metode analisis karena dapat mempengaruhi hasil uji (Sac 2002). Konfirmasi kemurnian kultur dilakukan dengan melihat pertumbuhan kultur murni di bawah mikroskop. Pertumbuhan kultur dapat dilihat pada Gambar 11 dan 12.

Gambar 11. Kultur murni kapang Rhizopus Oligosporus perbesaran 100 kali Kultur uji yang digunakan pada penelitan ini adalah kapang dan khamir. Kapang yang digunakan merupakan kapang Rhizopus olighosporus yang banyak ditemui pada buah-buahan dan sayur-sayuran yang membusuk. Koloni kapang Rhizopus olighosporus di bawah mikroskop berwarna keabu-abuan, sprorangiofor berwarna kecoklatan, muncul berlawanan arah dengan rhizoid. Kultur uji khamir yang digunakan pada penelitian ini adalah Saccharomyces cerevisiae yang koloninya berwarna putih dan licin. Bentuknya bulat, lonjong ataupun panjang dengan bau yang khas. Saccharomycess cerevisiae tidak memiliki hifa dan tubuh buah seperti kapang. Saccharomycess cerevisiae tahan terhadap suhu tinggi, mempunyai sifat stabil dan mudah adaptasi.

Gambar 12. Kultur murni Saccharomyces cerevisiae perbesaran 100 kali

Analisa Jumlah Kultur Berdasar pembuatan spike diketahui jumlah kapang yang tumbuh pada media PDA sebanyak 6,92 cfu/ml untuk perhitungan secara SNI dan 6,93cfu/ml

10

untuk perhitungan ISO setelah diinkubasi selama 5 hari pada suhu 25°C. Jumlah koloni kapang yang tumbuh pada media DRBC sebanyak 6,91 cfu/ml untuk perhitungan SNI dan 6,92 cfu/ml untuk perhitungan ISO. Nilai RSD media PDA sebsar 0,92% pada perhitungan SNI dan 0,83% pada perhitungan ISO. Nilai RSD pada media DRBC sebsar 0,81% pada perhitungan SNI dan 0,81% pada perhitungan ISO. Data kultur uji kapang dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2. Jumlah awal kultur uji kapang pada media PDA dan DRBC dihitung menggunakan perhitungan menurut SNI 9(10-150 koloni) dan ISO (<150 koloni) dilakukan 5 kali ulangan

Rata-rata SD RSD (%)

Perhitungan SNI PDA DRBC 6,92 6,93 0,06 0,06 0,92 0,83

Perhitungan ISO PDA DRBC 6,91 6,92 0,05 0,06 0,81 0,81

Jumlah khamir yang tumbuh pada media PDA sebanyak 7,03 cfu/ml menggunakan perhitungan SNI dan 7,03 cfu/ml untuk perhitungan ISO setelah diinkubasi selama 5 hari pada suho 25°C. Jumlah koloni kapang yang tumbuh pada media DRBC sebanyak 7,04 cfu/ml untuk perhitungan SNI dan 7,02 cfu/ml untuk perhitungan ISO. Nilai RSD media PDA sebsar 0,56% pada perhitungan SNI dan ISO. Nilai RSD pada media DRBC sebsar 0,59% pada perhitungan SNI dan 0,60% pada perhitungan ISO. Jumlah pertumbuhan khamir dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3. Jumlah awal kultur uji khamir pada media PDA dan DRBC dihitung menggunakan perhitungan menurut SNI (10-150 koloni) dan ISO (<150 koloni) dilakukan 5 kali ulangan




Jumlah koloni kapang dan khamir sukar dijaga secara konstan. Untuk itu harus dilakukan ulangan sebanyak 5 kali untuk mengetahui jumlah kultur kerja. Dari 5 kali pengulangan didapatkan jumlah kultur kerja kapang khamir yang diinkubasi menggunakan media PDA sebesar 7,03 cfu/ml menggunakan perhitungan SNI dan 7,01 cfu/ml menggunakan perhitungan ISO. Jumlah kultur kerja kapang dan khamir uang tumbuh pada media DRBC sebsar 6,99 cfu/ml menggunakan perhitungan SNI dan 6,99 cfu/ml menggunakan perhitungan ISO. Nilai RSD pada media PDA 0,71% pada perhitungan SNI dan 0,57% menggunakan perhitungan ISO. Pada penggunaan media DRBC nilai RSD sebesar 0,63% padaperhitungan SNI dan 0,62% pada perhitungan ISO. Jumlah

11

RSD hitung yang lebih kecil dari 10% masih dapat diterima (Sac 2002). Jumlah koloni kapang khamir dapat dilihat pada Tabel 4. Tabel 4. Jumlah awal kultur uji kapang dan khamir pada media PDA dan DRBC dihitung menggunakan perhitungan menurut SNI 9(10-150 koloni) dan ISO (<150 koloni) dilakukan 5 kali ulangan




Berdasarkan hasil penelitian pertumbuhan koloni pada media DRBC lebih mudah dihitung dibandingkan media PDA. Hal tersebut dikarenakan kapang dan khamir yang tumbuh pada media DRBC ditekan penyebarannya sehingga kononi yang satu tidak menghambat pertumbuhan koloni lainnya. Pewarnaan pada media DRBC juga mempermudah perhitungan karena koloni akan tampak lebih jelas dan tidak menumpuk.

Parameter Uji Tervalidasi Pada penelitian ini dilakukan validasi dua metode pengujian kapang dan khamir, yaitu metode SNI 01-2897-1992 dan metode ISO 21527-1:2008(E). Kedua metode ini merupakan metode pengujian kapang dan khamir yang sudah baku sehingga hanya perlu dilakukan validasi yang sifatnya kuantitatif. Metode SNI 01-2897-1992 menyebutkan bahwa pengujian kapang dan khamir menggunakan media PDA yang diinkubasi pada suhu 25°C selama 5 hari dan pengujian kapang dan khamir metode ISO 21527-1:2008(E) menggunakan media DRBC yang diinkubasi 25°C selama 5 hari. Kedua metode dikonfirmasi dengan parameter linearitas, akurasi relatif, presisi, LOD dan LOQ. Akurasi Kecermatan atau akurasi merupakan ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Akurasi biasa dinyatakan sebagai persen recovery. (Harmita 2004). Tahapan ini dilakukan dengan menambahkan 5 tingkatan kultur pada saos tomat dan dilakukan ulangan sebanyak 5 kali untuk mendapatkan nilai perolehan kembali kultur yang ditumbuhkan. Akurasi diukur dengan persen perolehan kembali melalui uji komparatif. Presentasi perolehan kembali adalah banyaknya inokulum yang dapat diisolasi kembali dari sejumlah sampel.

12

Gambar 13. Jumlah koloni kapang dan khamir yang diperoleh dari tiap tingkatan inokulum dengan perhitungan mengacu pada SNI (10-150 koloni) dengan 5 tingkat inokulum dilakukan 5 kali ulangan

Hasil perolehan kembali inokulum dapat dilihat pada Gambar 13 dan 14. Berdasarkan penelitian empat tingkatan inokulum dapat dilihat bahwa jumlah perolehan kembali media DRBC lebih tinggi dibandingkan dengan jumlah perolehan kembali media PDA yang dihitung menggunakan cara perhitungan SNI maupun ISO.

Gambar 14. Jumlah koloni kapang dan khamir yang diperoleh dari tiap tingkatan inokulum dengan perhitungan mengacu pada ISO (<150 koloni) dengan 5 tingkat inokulum dilakukan 5 kali ulangan Perolehan kembali pada media DRBC yang lebih tinggi dibandingkan dengan media PDA menunjukkan bahwa media kapang dan khamir lebih optimal tumbuh pada media DRBC. Hal tersebut didukung dengan penelitian Indriati dan Heruwati (2009) yang menyatakan media DRBC lebih baik digunakan untuk menghitung jumlah koloni kapang dan khamir yang tumbuh karena dapet menekan pertumbuhan koloni yang sifatnya menyebar. Kapang dan khamir yang tumbuh pada media DRBC terpisah antar koloninya sehingga lebih mudah dalam perhitungan.

13

Tabel 5. Rata-rata jumlah perolehan kembali kapang dan khamir dengan perhitungan mengacu pada SNI (10-150 koloni) dengan 5 tingkat inokulum dilakukan 5 kali ulangan

No 1 2 3 4 5

PDA DRBC Inokulum Perolehan Inokulum Perolehan (log cfu/ Kembali (log cfu/ Kembali gram) (%) gram) (%) 0 0 0 0 0,9 84 0,9 89 2,0 100 2,0 105 3,0 100 3,0 102 3,9 97 4,1 102

Perolehan kembali pada ulangan pertama mendapatkan hasil dibawa 100% pada media PDA dan DRBC. Pada ulangan selanjutnya perolehan kembali yang didapatkan di atas 100. Rata-rata jumlah perolehan kembali koloni tiap tingkatan dapat dilihat pada Tabel 5 dan 6. Hasil perolehan kembali berkisar antara 84109% masih dapat dikatan baik. Hal tersebut mengacu kepada AOAC (2002) dimana nilai perolehan kembali yang masih dapat diterima pada kisaran 80-120%. Dengan demikian kedua metode ini dapat diadopsi untuk keperluan analisis. Tabel 6. Rata-rata jumlah perolehan kembali kapang dan khamir dengan perhitungan mengacu pada ISO (<150 koloni) dengan 5 tingkat inokulum dilakukan 5 kali ulangan

No 1 2 3 4 5

PDA Inokulum Perolehan (log Kembali cfu/gram) (%) 0 0 0,9 87 2,1 102 3,3 101 4,1 98

DRBC Inokulum Perolehan (log Kembali cfu/gram) (%) 0 0 0,9 89 2,1 102 3,0 105 4,1 102

Jumlah perolehan kembali yang kurang dari 100% bisa terjadi karena adanya ketidaktelitian pada saat analisis atau adanya inokulum yang mati pada saat dicampurkan ke dalam sampel. Hal tersebut mungkin saja terjadi karena pada saos terdapat bahan pengawet yang berfungsi untuk membunuh mikroorganisme. Namun demikian, secara keseluruhan jumlah perolehan kembali masih dapat diterima sesuai dengan standar AOAC.

14

Presisi Presisi menggambarkan keseragaman nilai yang diperoleh dari pengukuran berulang pada suatu prosedur analisis (Leyva et al. 2008). Evaluasi presisi adalah langkah utama dari validasi (Walton 2001). Untuk bisa dipercaya maka harus didapatkan presisi yang baik. Pada verifikasi metode yang digunakan adalah ripitabilitas. Ripitabilitas ditunjukkan dari nilai RSD analisis.

Gambar 15. Presisi metode dinyatakan sebagai nilai relative standart deviation (RSD) pada tiap tingkat inokulum dengan perhitungan mengacu pada SNI (10-150 koloni) dilakukan 5 kali ulangan Gambar 15 dan 16 menunjukkan nilai RSD pada tiap tingkat inokulum dengan perhitungan mengacu pada metode SNI dan ISO.. Dari empat tingkatan inokulum terlihat nilai RSD pada media PDA lebih besar dibandingkan nilai RSD pada media DRBC. Nilai RSD PDA pada tingkatan 10. 100, 1000, 10.000 adalah 7,8%, 1,4%, 1,2%, dan 1,4%. Nilai RSD media DRBC pada tingkatan 100, 1000, 10.000 adalah 5,3%, 1%, 0,8% dan 0,8%. Nilai RSD dari penelitian masih berkisar antara 0%-7,8%.

Gambar 16. Presisi metode dinyatakan sebagai nilai relative standart deviation (RSD) pada tiap tingkat inokulum dengan perhitungan mengacu pada ISO (<150 koloni) dengan 5 tingkat inokulum dilakukan 5 kali ulangan Nilai RSD pada tingkatan 10 adalah 7,8% untuk media PDA dan 5,3% untuk media DRBC. Nilai tersebut masih cukup tinggi jika dibandingkan dengan ketiga tingkatan lainnya. Namun, nilai RSD masih dapat diterima karena kurang dari 10% (Sac 2002). Perhitungan menggunakan metode SNI dan ISO menunjukkan

15

bahwa nilai RSD media DRBC lebih baik dibandingkan dengan nilai RSD media PDA. Hal tersebut menunjukkan bahwa DRBC memiliki presisi yang lebih baik jika dibandingkan dengan PDA. Semakin kecil nilai RSD yang dihasilkan maka keterulangan penelitian tersebut semakin baik.

Linearitas Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik, proposional terhadap konsentrasi analit dalam sampel (Harmita 2004). Penetapan linearitas minimal dilakukan dengan lima level konsentrasi inokulim. Tabel 7 Koefisien determinasi dan persamaan regresi linear perhitungan mengacu pada SNI (10-150 koloni) dengan 5 tingkat inokulum dilakukan 5 kali ulangan Ulangan 1 2 3 4 5 Ratarata

Media PDA Persamaan linear y = 1,0035x - 1,0158 y = 1,0383x - 1,0484 y = 1,0383x - 1,0645 y = 1,0363x - 1,0661 y = 1,0253x - 1,0249

Media DRBC R Persamaan linear R 0,9929 y = 1,0010x - 0,9969 0,9995 y = 1,0226x - 1,0073 0,9996 y = 1,0127x - 0,9995 0,9981 y = 1,0267x - 1,0165 0,9997 y = 1,0332x - 1,0339

0,9942 0,999 0,9988 0,9993 0,9993

y = 1,0283x - 1,0440

0,9998

0,9995

y = 1,0192x - 1,0120

Tabel 8 Koefisien determinasi dan persamaan regresi linear perhitungan mengacu pada ISO (<150 koloni) dengan 5 tingkat inokulum dilakukan 5 kali ulangan Ulangan 1 2 3 4 5 Ratarata

Media PDA Persamaan linear y = 1,0136x - 1,0661 y = 1,0537x - 1,1258 y = 1,0642x - 1,1952 y = 1,0463x - 1,1163 y = 1,0281x - 1,0338 y = 1,0031x - 1,0325

R 0,9926 0,9972 0,9949 0,9974 0,9995

Media DRBC Persamaan linear y = 1,0081x - 1,0326 y = 1,0380x - 1,0848 y = 1,0287x - 1,0792 y = 1,0338x - 1,0522 y = 1,0429x - 1,0883

R 0,9938 0,9964 0,9964 0,9985 0,9987

0,9979

y = 1,0100x - 1,0299

0,9981

16

Gambar 17. Linearitas dengan perhitungan mengacu pada SNI (10-150 koloni) dengan 5 tingkat inokulum dilakukan 5 kali ulangan Pengujian linearitas pada metode SNI dan ISO menghasilkan kurva linearitas yang proposional. Berdasarkan Gambar 17 dan 18 dapat dilihat linearitas kedua metode. Nilai linearitas pada Gambar 17 dinyatakan dalam y = ax + b dimana y adalah jumlah sel (log cfu/ml) dan x jumlah inokulum. Pada media PDA yang perhitungannya mengacu pada SNI diperoleh persamaaan y = 1,0283x - 1,0440 dan R2 = 0.9998. Linearitas DRBC pada perhitungan SNI y = y = 1,0192x - 1,0120 dan R2= 0.9995. Pada perhitungan menggunakan SNI nilai koefisien korelasi media PDA lebih tinggi dibandingkan dengan media DRBC.

Gambar 18. Linearitas dengan perhitungan mengacu pada ISO (<150 koloni) dengan 5 tingkat inokulum dilakukan 5 kali ulangan Linearitas media PDA pada perhitungan ISO adalah y = 1.0031x-1.0325 dan R² = 0.9979. Linearitas media DRBC menggunakan perhitungan ISO y = 1,0100x-1,0299 dan R2= 0,9981. Nilai koefisien korelasi pada perhitungan SNI lebih kecil dibandingkan perhitungan ISO dikarenakan pada media ISO jumlah kapang yang dapat dihitung lebih besar (<150 koloni). Kedua metode masih dapat dikatakan linear jika nilai R² (koefisien kolerasi) mendekati 1. Linearitas perhitungan SNI dan ISO pada kedua metode dapat diterima karena memenuhi persyaratan. Nilai koefisien kolerasi yang memenuhi persyaratan adalah sebesar ≥0,9970 (ICH 1995), ≥0,97 (SNI) atau 0,9980 (AOAC).

17

LOD dan LOQ Limit deteksi adalah jumlah konsentrasi terendah dari mikroorganisme yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon yang signifikan. Batas deteksi merupakan parameter pada analisis dan merupakan kuantitas terkecil yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama (Harmita 2004). Limit deteksi dapat juga ditentukan dengan persamaan linear. Persamaan liear yang diperoleh pada uji linearitas selanjutnya digunakan untuk menghitung limit deteksi. Pada penentuan LOD dilakukan 6 kali ulangan dengan menambahkan tiga tingkatan terendah inokulum yaitu 3, 10, dan 30. Hasil penelitian menunjukkan pada konsentrasi terendah masih terdeteksi kapang khamir yang tumbuh yaitu 3cfu/gram. Limit deteksi dapat juga ditentukan dengan menggunakan persamaan linear. Limit deteksi yang diperoleh dari perhitungan kurva linear adalah 2 cfu/gram untuk media PDA dan media DRBC. Nilai LOD yang didapatkan pada penelitian ini masih lebih baik dibandingkan dengan penelitian yang dilakukan oleh Alles et all. (2009) yang pada penelitiannya mendapatkan nilai LOD kapang dan khamir sebesar 10cfu/gram. Selain limit deteksi, limit kuantifikasi (LOQ) juga merupakan parameter dalam validasi sekunder. Limit kuantifikasi adalah konsentrasi terendah dari mikroorganisme yang dapat ditentukan dengan tingkat presisi dan akurasi yang dapat diterima di bawah kondisi pengujian yang disepakati. Berdasarkan hasil penelitian nilai LOQ media PDA dan media DRBC adalah 4cfu/gram. Hal tersebut mengartikan bahwa jumlah kapang dan khamir yang terhitung di bawah nilai LOQ yang didapatkan memiliki akurasi dan presisi yang kurang baik.

Verifikasi Metode pada Produk Saos Verifikasi sampel negatif dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya kapang dan khamir pada saos. Verifikasi metode pengujian kapang dan khamir dilakukan dengan menggunakan 10 jenis saos dengan merk berbeda. Kapang dan khamir yang tumbuh pada saos dapat dilihat pada Gambar 19.

Gambar 19. Berbagai jenis kapang dan khamir yang tumbuh pada berbagai merk saos pada media DRBC

18

Hasil pengujian berbagai jenis saos yang ada di pasaran terdapat berbagai jenis kapang dan khamir yang tumbuh. Jumlah kapang khamir pada saos A, B, C, E, dan J masih memenuhi persyaratan karena jumlah koloni yang tumbuh pada saos tersebut masih memenuhi syarat mutu yaitu < 50 koloni/gr. Saos D, F, G, dan H tidak memenuhi syarat mutu karena jumlah koloni yang tumbuh >50 koloni/gr. Salah satu parameter yang dalam verifikasi adalah RSD. Pada Tabel 9 dapat dilihat verifikasi dengan berbagai macam merk saos. Nilai RSD yang didapatkan dari hasil penelitian masih memenuhi persyaratan yaitu berkisar antara 0% 5.83%. Syarat RSD < 10% masih dapat terpenuhi oleh kedua metode yang diuji. Tabel 9. Jumlah kultur yang tumbuh pada saos berbagai merk Sampel

Ulangan

A

1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1

B C D E F G H I J

2

Media PDA Media DRBC Log cfu/ml RSD(%) Log cfu/ml RSD(%) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,30 1,60 0,00 0,00 1,30 1,60 1,00 1,30 0,00 0,00 1,00 1,30 1,84 1,95 5,83 1,88 1,7 1,90 1,00 1,60 0,00 0,00 1,00 1,60 4,24 4,26 2,53 4,69 4,09 3,98 4,27 4,13 2,98 0,17 4,09 4,12 3,72 3,72 1,17 0,15 3,78 3,73 3,87 3,77 0,22 4,52 3,86 3,54 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

Uji T membandingkan ulangan yang dilakukan oleh dua metode dengan membuat asumsi atau hipotesis nol, bahwa tidak ada perbedaan signifikan dari kedua metode. Uji T dilakukan dari logaritma jumlah koloni dari kedua metode apakah terdapat perbedaan nyata dengan α=5%. Analisi Uji T pada penelitian ini menggunakan rumus pada Microsoft Excell. Hasil Uji T dapat dilihat pada Lampiran. Dari hasil analisis terlihat bahwa kedua metode yang digunakan untuk menganalisis 10 jenis sampel tidak berbeda nyata. Hasil uji dapat dilihat pada tabel 7. Nilai t hitung -1,39743, t tabel 2,262157 dan persen kolerasi 0,991931. Nilai P > 0.005 maka HO diterima (tidak terdapat perbedaan nyata antara dua metode pada taraf signifikansi 5%). Hal tersebut didukung oleh penelitian Rabie

19

et al. (1997) yang menyertakan hasil analisis kapang dan khamir pada tanaman jali (barley) menggunakan media PDA dan DRBC tidak berbeda nyata. Namun penelitian tersebut tidak dengan menghitung jumlah kapang dan khamir yang tumbuh melainkan dengan dengan melihat ada atau tidaknya kapang dan khamir yang tumbuh pada kedua media. Berdasarkan hasil verifikasi metode secara keseluruhan metode ISO memiliki hasil yang lebih baik dibandingkan dengan metode SNI. Hal tersebut didukung oleh hasil penelitian yang menunjukkan sebagian besar hasil perthitungan metode ISO memberikan jumlah koloni yang lebih tinggi dibandingkan dengan metode SNI. Hal tersebut dikarenakan dalam perhitungannya metode ISO lebih mudah dihitung karena koloni yang tumbuh pada media DRBC terlihat terpisah, tidak menyebar dikarenakan rose bengal yang terdapat di dalam media tersebut mampu menkan penyebaran koloni. Adanya warna yang berbeda antara koloni satu dan lainnya akan memudahkan perhitungan. Oleh karena itu, untuk perhitungan jumlah koloni disarankan untuk menggunakan metode ISO agar dihasilkan jumlah analisis yang lebih baik. Hal tersebut didukung dengan penelitian yang dilakukan oleh Alborch et al. (2012) yang menyatakan bahwa jumlah koloni kapang dan khamir yang ditumbuhkan menggunakan media DRBC lebih tinggi jumlahnya dibandingkan dengan jumlah kapang dan khamir yang ditumbuhkan pada media lainnya. Penggunaan metode SNI memiliki keunggulan dari segi ekonomis dan lebih tahan terhadap cahaya. Namun, analisis menggunakan metode SNI memiliki kelemahan dalam hal perhitungan. Kapang dan khamir yang tumbuh pada media PDA penyebarannya tidak dapat ditekan sehingga koloni yang tumbuh akan saling bertumpuk dan sulit untuk dihitung. Selain itu PDA juga merupakan media yang tidak spesifik sehingga berbagai jenis mikroorganisme dapat tumbuh. Hal tersebut didukung dengan hasil penelitian Somashekar (2004) yang melakukan isolasi kapang dan khamir dari sampel tepung maizena dan kopi menggunakan media PDA. Mikroorgaisme yang tumbuh pada media PDA berbagai macam jenisnya namun sulit untuk diidentifikasi karena PDA bukan merupakan media selektif.

KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Metode SNI dan ISO dapat digunakan sebagai acuan untuk melakukan uji kapang dan khamir pada laboratorium. Parameter uji verifikasi yaitu akurasi, presisi, linearitas, LOD dan LOQ masih memenuhi pesyaratan. Nilai RSD dari kedua metode berada antara 0%-7,8%. Nilai tersebut masih memenuhi persyaratan yaitu di bawah 10%. Koefisien relasi yang didapat dari hasil penelitian juga masih > 0.97. Perhitungan koloni sebaiknya mengacu pada ISO yaitu jumlah koloni yang dihitung <150. Penghitungan tersebut menghasilkan linearitas yang lebih baik jika dibandingkan dengan perhitungan yang mengacu pada SNI. Pada verifikasi 10 sampel saos tomat dengan merk yang berbeda analisis T-test yang dilakukan menunjukkan bahwa kedua metode tidak berbeda nyata sehingga kedua metode dapat digunakan sebagai acuan dalam analisis.

20

Saran Pada penelitian ini digunakan kapang Rhizopus oligosporus dan khamir Saccharomyces cerevisiae untuk penelitian selanjutnya adalah perlu dilakukan uji dengan berbagai jenis kultur kapang dan khamir yang lain untuk dapat mengetahui tingkat selektifitas media terhadap masing-masing jenis kapang dan khamir.

DAFTAR PUSTAKA Alborch L, Bragulat MR, Castella G, Abarca ML, Cabanes FJ. 2012. Food Microbiology 32 (2012) 97e103 Alles S, Shrest N, Ellsworth A, Rider A, Foti D, Mozola M, Neogen C, Lesher PL, Lansing MI. 2009. Validation of the Soleris yeast and mold test for semiquantitative determination of yeast and mold in selected foods. Journal of AOAC International 92(5):1396-415. [AOAC] Association of Analitycal Chemist. 1999. AOAC International Qualitative and Quantitative Microbiology Guidelines for Methods Validation. Journal of AOAC International vol. 62. No. 2 USA. [BAM] Bacteriological Analitical Manual. 2001. Method for Detection of Enumeration of Yeast. AOAC Interbational 18th Edition. USA. [BSN] Badan Standarisasi Nasional. 1992. SNI 01-2897-1992. Penentuan Mutu Mikrobiologi. Badan Standarisasi Nasional Indonesia. [BSN] Badan Standarisasi Nasional. 2004. SNI 01-3546-2004. Saos Tomat. Badan Standarisasi Nasional Indonesia. Harmita. 2004. Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode Dan Cara Perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. I, No.3, Desember 2004, 117 – 135. [ICH] International Conference on Harmonization. 1995. Validation of Analytical Procedurs: Definitions and Terminology. http://www.ich.org. [22 Juni 2013]. Indriati N and Heruwati ES. 2009. Molds Associated with Indonesian Traditional Fisheries Product. Indonesian Marine and Fisheries Product Processing and Biotechnology. Jakarta. [ISO] 1614:2003. 2003. Microbiology of Food and Animal Feeding StuffsProtocol for the Validation of Alternative Methods. European Commitee for Standarization. Leyva A, Quintana A, Sanchez M, Rodriquez EN, Cremata J, Sanchez JC. 2008. Method Development and Validation. Biologicals 36:134-141. Rabie CJ, Lubben A., Marais GJ. Jansen H, International Journal of Food Microbiology 35 (1997) Il7- 127. Ray Bibek. 2004. Third Edition Fundamental Food Microbiology. CRC Press. Washington DC. Sac Singlas. 2002. Validasi Metode dari Metode-Metode Mikrobiologi. Guidance Note : C&B and ENV 002.

21

Siregar CJP. 2007. Praktik Sistem Manajemen Laboratorium Pengujian yang Baik (Good Training Laboratory Managemen System Practice). Jakarta . Penertbit Buku Kedokteran EGP. Cetakan Pertama. Somashekar D, Rati ER, Anand S, Chandrashekar A. 2004. Food Microbiology 21 (2004) 809–813. Sukarno S. 2005. Validasi dan Verifikasi Metode Analisa. Disampaikan pada Pertemuan Manajer Mutu dan Manajer Teknisi Laboratorium Badan POM RI di Medan. Jakarta. Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional. Badan POM RI.

22

LAMPIRAN Lampiran 1. Biodata penulis Rizqi Febrina, lahir di Pematangsiantar pada tanggal 16 Februari dari pasangan Bahri Tawar, SPd dan Sugiati, SE sebagai anak pertama dari dua bersaudara. Penulis menamatkan pendidikan jenjang TK di TK Al-Washliyah Pematangsiantar (1995), SD di SD Swasta Taman Siswa Pematangsintar (2001), jenjang SMP di SLTPN 4 Pematangsintar (2004), jenjang SMA di SMAN2 Pematangsintar (2007), dan jenjang S1 di Institut Pertanian Bogor dengan Mayor Ilmu dan Teknologi Pangan (ITP) (Approved by IFT) melalui jalur USMI dan mengambil beberapa mata kuliah supporting course (SC). Selama mengikuti perkuliahan di IPB penulis aktif menjadi anggota Himpunan Mahasiswa Ilmu dan Teknologi Pangan (HIMITEPA), Ikatan Mahasiswa Muslim Asal Medan (IMMAM), dan Himpunan Mahasiswa Islam (HMI). Penulis menikuti beberapa kegiatan sebagai panitia dalam Lomba Cepat Tepat Ilmu Pangan (LCTIP), mengikuti seminar Pelatihan Sistem Managemen Halal (PLASMA), seminar Hazar Analysis Critical Control Point (HAACP). Penulis mengikuti beberapa kegiatanberupa pelatihan, kunjungan, seminar dan kepanitiaan seperti mengunjungi industri pengolahan pangan di wilayah Jawa Barat dan Jawa Tengah. Penulis telah mendapatkan sertifikat Good Laboratory Practice dalam pelatihan GLP 2011. Tulisan yang pernah penulis hasilkan bersama rekan-rekan sedisiplin ilmu antara lain Smiley Biscuit as Weaning Food to Under Five Children’s Fe Deficiency in Developing Country (2011), Industrialisasi dan Konsumsi Minuman Pala di Aceh Sebagai Minuman Pencegah Insomnia Pasca Gempa Tsunami (2011), dan Strategi Pengembanagan dan Pemasaran Produk “ALUTSA” Abon Berbasis Belut Dengan Variasi Rasa (2011). Penulis menyelesaikan tugas akhirnya dengan melakukan penelitian dengan mengangkat judul “ Validasi Sekunder Metode Analisis Kapang dan Khamir pada Saos” di bawah bimbigan Dr. Harsi D Kusumaningrum.

23

Lampiran 2 Rancangan validasi metode analisa 1. Validasi Metode Analisa 1.1 Membuat 5 tingkatan untuk menentukan presisi, akurasi dan linearitas 1.1.1 Persiapan sampel 10 gram 1.1.2 Inokulasi kultur 0, 10, 100, 1000, 10.000 cfu/ml 1.1.3 Pemupukan pada 3 tingkat tertinggi duplo 1.1.4 Inkubasi 25°C selama 5 hari 1.2 Membuat lima tingkatan untuk menentukan LOD dan LOQ 6.2.2 Persiapan sampel 10 gram 6.2.3 Inokulasi kultur 3, 10, 30 cfu/ml 6.2.4 Pemupukan duplo 6.2.5 Inkubasi 25°C selama 5 hari8 2. Perhitungan 2.1 Hitung koloni cawan petri. 2.1.1 Pilih cawan dengan jumlah koloni <150 koloni 7.1.2 Cara perhitungan : N = ∑ C/ [(1 x n1) + (0,1 x n2) x d] Dimana : n1 = jumlah cawan pada pegenceran pertama n2 = jumlah cawan pada pegenceran kedua d = pengenceran pada cawan pertama ∑ C = jumlah koloni pada cawan N = jumlah koloni per ml atau gram 2.2 Akurasi %Recovery (R) = [(A-B)/C] x 100 Keterangan : A = sampel dengan inokulum (sampel positif) B = sampel tanpa inokulum (sampel negatif) C = inokulum tanpa sampel (kontrol positif) 2.3 Presisi N = √∑ii=n((loga1-logb1/x1)2 2p

Keterangan : a1 = cawan1 b1 = cawan2 (log a1- log b1)/x1 = perbedaan relatif hasil logaritma duplo i = 1,2,3,...,n p = jumlah penentuan duplo (jumlah sampel uji) 2.4 Linearitas Y=ax+b 2.5 LOD dan LOQ LOD = 3,3 Sa b LOQ = 10 Sa b Keterangan :

24

Sa = simpangan baku intersep b = rata-rata kemiringan garis

VALIDASI SEKUNDER METODE ANALISA KAPANG DAN KHAMIR PADA SAOS SKRIPSI RIZQI FEBRINA F

Recommend Documents