AKTIVITAS SITOTOKSIK DAN APOPTOSIS SEL KHAMIR EKSTRAK KLOROFORM KAPANG ENDOFIT Evodia suaveolens
AZMI AZHARI
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
ABSTRAK AZMI AZHARI. Aktivitas Sitotoksik dan Apoptosis Sel Khamir Ekstrak Kloroform Kapang Endofit Evodia suaveolens. Dibimbing oleh WARAS NURCHOLIS dan DIMAS ANDRIANTO. Kanker dapat terjadi apabila jumlah sel tidak dapat dipertahankan dalam jumlah tetap. Sel yang mengalami gagal apoptosis akan mengalami pembelahan terus menerus. Apoptosis adalah suatu kematian sel terprogram. Apoptosis pada sel khamir dapat dijadikan sebagai model, karena siklus sel khamir mirip dengan sel manusia. Evodia suaveolens dapat menghasilkan senyawa evodiamin yang dapat memicu apoptosis. Kapang endofit dapat menghasilkan senyawa bioaktif yang mirip inang tanamannya. Sebanyak 8 isolat kapang endofit telah diisolasi dari batang Evodia suaveolens. Kapang endofit lalu difermentasi dan diekstraksi metabolit sekundernya dengan kloroform. Ekstrak diujikan sitotoksitasnya dengan menggunakan metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test). Nilai LC50 dari setiap kapang endofit Evodia suaveolens adalah kapang 1 bernilai 315 ppm, kapang 3 bernilai 270 ppm, kapang 5 bernilai 400 ppm, kapang 7 bernilai 19.7 ppm dan kapang 8 bernilai 403 ppm. Kapang 2, 4, dan 6 tidak toksik pada konsentrasi 500, 100, 50 dan 10 ppm. Konsentrasi LC50 masing-masing isolat dipakai untuk induksi apoptosis pada sel khamir. Secara berturut-turut persen frekuensi sel khamir yang mengalami petit dari kapang 1, kapang 3, kapang 5, kapang 7, dan kapang 8 adalah 69%, 75%, 86%, 90% dan 90.4%. Persen frekuensi ini membuktikan isolat 1, 3, 5, 7 dan 8 kapang endofit Evodia suaveolens dapat menginduksi apoptosis pada sel khamir.
ABSTRACT AZMI AZHARI. Cytotoxic and Apoptosis Activities in Yeast of Chloroform Extract from Endophytic Molds Evodia suaveolens. Supervised by WARAS NURCHOLIS and DIMAS ANDRIANTO. Cancer can occur if the cell cannot be sustained in the amount fixed. Cells that have failed apoptosis, they will division continously. Apoptosis is the process of programmed cell death. Apoptosis in yeast cell can be used as model because yeast cell cycle similar to human cell. Evodia suaveolens produce evodiamine, it trigger apoptosis. Endophytic mold produce bioactive compounds that similar to its host plant. Eight isolates endophytic mold have been isolated from steam of Evodia suaveaolens. Endophytic mold then was fermented and secondary metabolites was extracted with chloroform. Then the extracts was tested using cytotoxic activity with BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) method. Values of LC50 from each endophytic mold of Evodia suaveolens are 315 ppm (mold 1), 270 ppm (mold 3), 400 ppm (mold 5), 19.7 ppm (mold 7), and 403 ppm (mold 8). Mold 2,4, and 6 is not toxic in 500, 100, 50, and 10 concentration. Each concentration of LC50 used for apoptosis induction in yeast cell. Percentation of yeast cell that have petite from mold 1, mold 3, mold 5, mold 7, and mold 8 are 69%, 75%, 86%, 90%, and 90.4% respectively. This percentation showed that isolate 1, 3, 5, 7, 8 from endophytic mold Evodia suaveolens can induction apoptosis in yeast cell.
AKTIVITAS SITOTOKSIK DAN APOPTOSIS SEL KHAMIR EKSTRAK KLOROFORM KAPANG ENDOFIT Evodia suaveolens
AZMI AZHARI G84080050
Skripsi sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
Judul Skripsi : Aktivitas Sitotoksik dan Apoptosis Sel Khamir Ekstrak Kloroform Kapang Endofit Evodia suaveolens Nama : Azmi Azhari NIM : G84080050
Disetujui, Komisi Pembimbing
Waras Nurcholis, M.Si Ketua
Dimas Andrianto, M.Si Anggota
Diketahui,
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc Ketua Departemen Biokimia
Tanggal Lulus :
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat, berkah, dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi ini dengan baik. Shalawat serta salam semoga selalu tercurah kepada Nabi Muhammad SAW, keluarga, sahabat, dan para pengikutnya sampai akhir zaman. Penelitian ini berjudul Aktivitas Sitotoksik dan Apoptosis Sel Khamir Ekstrak Kloroform Kapang Endofit Evodia suaveolens. Kegiatan penelitian yang merupakan salah satu syarat memperoleh gelar sarjana sains pada Departemen Biokimia ini dilakukan dari bulan Februari hingga Juni 2012, bertempat di Laboratorium Biokimia Institut Pertanian Bogor. Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu dalam penyelesaian penelitian ini baik secara langsung maupun tidak langsung. Ucapan terima kasih kepada DIKTI selaku sumber pendanaan dari penelitian ini yang merupakan PKM-P (Program Kreativitas Mahasiswa Penelitian) yang berjudul Pemanfaatan Senyawa Metabolit Sekunder Evodia suaveolens sebagai Antikanker yang disusun oleh Ridho Pratama, Affan Iqbal, dan Ayu Arthuria. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Waras Nucholis, M.Si. sebagai ketua pembimbing dan Dimas Andrianto, M.Si. sebagai anggota pembimbing yang telah memberikan bimbingan, motivasi, saran, dan kritiknya. Terima kasih kepada kedua orang tua tercinta, adik, Laita dan seluruh keluarga atas segala kasih sayang, perhatian, doa, dan dukungan yang tak henti-hentinya diberikan kepada penulis dan sangat berarti bagi penulis. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada rekan-rekan selama penelitian Affan, Ridho, Khoerotunnisa atas saran dan motivasi yang diberikan. Selain itu, penulis ucapkan terima kasih kepada teman-teman seperjuangan Biokimia 45, rekan penelitian satu lab, Ines, Mega, Didit, Dian, Aros, Anisa Utami, Daniel, Elvita, Yoan, Rian, seluruh warga kosan Kingstone Perwira dan juga sahabatsahabat yang tidak dapat disebutkan satu persatu atas segala bantuan, saran, dan motivasi yang diberikan. Penulis berharap semoga hasil penelitian dan karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi semua pihak yang memerlukannya. Bogor, Juni 2012
Azmi Azhari
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di kabupaten Cirebon pada tanggal 6 Maret 1990 dari ayah bernama Drs. Khudlori dan ibu bernama Dra. Rodliyah Zaenudin M.Ag. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara. Pendidikan penulis dimulai dari TK Khatulistiwa dan SDN II Pegagan, kemudian dilanjutkan ke SMP Negeri 1 Kota Cirebon. Tahun 2008 penulis menyelesaikan pendidikan di MAN Darussalam Ciamis dan pada tahun yang sama lolos seleksi masuk dan melanjutkan studi di Institut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Di IPB penulis mengambil mayor Biokimia di Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan penulis menjadi komti (ketua kelas) dari sejak TPB (Tingkat Persiapan Bersama) hingga masuk departemen Biokimia. Penulis juga aktif dalam kegiatan organisasi kemahasiswaan di IPB dan organisasi mahasiswa daerah, diantaranya penulis pernah aktif sebagai Kordinator CIC (Communication and Information Center) Community Research and Education of Biochemistry periode 2009/2010, dan staf humas Ikatan Kekeluargaan Cirebon 2011/2012. Selain itu, penulis yang hobinya menulis ini menjadi ketua dan tergabung komunitas FIKSI (Forum Imajinasi dan Kreativitas Sastra IPB) yang baru dibentuknya untuk menampung bakat menulis sastra. Penulis juga sering menulis di kompasiana.com dan mengikuti berbagai agendanya. Penulis juga pernah aktif dalam beberapa kepanitiaan seperti panitia lomba penulisan cerpen dan film dokumenter TPB IPB 2008, Masa perkenalan Kampus Mahasiswa Biokimia tahun 2009, Pesta Sains Nasional 2008 dan 2009, Biokimia Expo 2010, dan beberapa kepanitiaan lainnya. Penulis melakukan Praktik Lapang di Laboratorium Bioteknologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong Bogor, dengan judul Uji Aktivitas Antidiabetes Ekstrak Kloroform Kapang Endofit Kayu Manis (Cinnamomum burmanii) dengan Enzim αglukosidase. Penulis dalam bidang karya ilmiah pernah mendapat hibah dana bersaing dari Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) dalam Pekan Kreativitas Mahasiswa (PKM) untuk kategori Bidang Penelitian pada tahun 2012 menggantikan Ayu Arthuria dengan judul Pemanfaatan Senyawa Metabolit Sekunder Kapang Endofit Evodia suaveolens sebagai antikanker dan menjadi pembicara makalah lomba karya ilmiah dalam kegiatan seminar kesehatan nasional 2012. Penulis juga pernah memenangkan penghargaan setara emas PKMGT (Program Kreativitas Mahasiswa Gagasan Tertulis) pada PIMNAS (Pekan Ilmiah Nasional) ke 25 pada tahun 2012 dengan judul Asuransi Pertanian Berbasis Indeks Iklim sebagai Solusi Penyelamatan Petani dari Gagal Panen Akibat Iklim Ekstrim di Indonesia.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL .................................................................................................. ix DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. ix DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................... ix PENDAHULUAN .................................................................................................. 1 TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................................... 1 Kanker ................................................................................................................. 1 Apoptosis ............................................................................................................. 2 Sel khamir (Saccharomyces cerevisiae) .............................................................. 2 Evodia suaveolens ............................................................................................... 3 Kapang endofit .................................................................................................... 3 Fermentasi ........................................................................................................... 4 Ekstraksi .............................................................................................................. 4 BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) ................................................................... 4 BAHAN DAN METODE ....................................................................................... 5 Alat dan Bahan .................................................................................................... 5 Metode ................................................................................................................. 5 HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................... 6 Hasil Isolasi Kapang Endofit Evodia suaveolens ................................................ 6 Hasil Fermentasi dan Ekstrak Klorofom Kapang Endofit Evodia suaveolens .... 7 Hasil Uji Sitotoksik dengan BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) ...................... 8 Kurva Pertumbuhan Sel Khamir ......................................................................... 9 Hasil Uji Induksi Apoptosis pada Sel Khamir .................................................. 10 SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................. 11 Simpulan ............................................................................................................ 11 Saran .................................................................................................................. 11 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 11 LAMPIRAN .......................................................................................................... 14
DAFTAR TABEL Halaman 1. Rendemen ekstrak kloroform hasil fermentasi kapang endofit Evodia suaveolens ...................................................................................................... 8 2. Hasil frekuensi sel khamir yang mengalami petite akibat induksi ekstrak kloroform kapang endofit Evodia suaveolens ................................................ 10 DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Sel khamir yang mengalami apoptosis ............................................................ 2 2. Saccharomyces cerevisiae pembesaran 10 x 40.............................................. 3 3. Tanaman Evodia suaveolens ........................................................................... 3 4. Kapang endofit A dan B Evodia suaveolens ................................................... 7 5. Isolat kapang endofit Evodia suaveolens ........................................................ 8 6. Fase kloroform pada proses ekstraksi kapang endofit Evodia suaveolens ..... 8 7. Nilai LC50 dari uji sitotoksik BSLT ekstrak kloroform kapang endofit Evodia suaveolens ........................................................................................... 9 8. Kurva pertumbuhan sel khamir berdasarkan nilai bobot sel ........................... 9 9. Perbandingan ukuran sel normal (A) dan sel petite (B) .................................. 10 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Tabel kapang endofit Evodia suaveolens ........................................................ 15 2. Tabel khamir yang mengalami petite setelah perlakuan ekstrak .................... 17 3. Nilai LC50 ........................................................................................................ 19 4. Strategi penelitian............................................................................................ 21 5. Induksi apoptosis (pembuatan media) ............................................................. 22 6. Perlakuan induksi apoptosis ............................................................................ 23
1
PENDAHULUAN Indonesia merupakan negara yang dikenal dengan keanekaragaman hayatinya yang tinggi. Salah satunya adalah tanaman yang berkhasiat sebagai antikanker seperti Zodia atau Evodia suaveolens. Tanaman ini berasal dari daerah Papua (Kardinan 2007), dan dapat digunakan untuk mengusir nyamuk. Studi terbaru mengatakan Evodia suaveolens dapat menghasilkan senyawa evodiamin (Humbert et al. 2012). Senyawa ini mempunyai aktivitas yang baik sebagai antikanker yang mana dapat menghambat proliferasi, metastasis dan mempercepat apoptosis beragam sel kanker (Jiang 2009). Namun, pengembangan obat yang berbahan dasar Zodia masih menghadapi kendala, senyawa aktif yang diperoleh dari tanaman ini tidaklah banyak sehingga diperlukan tanaman yang banyak untuk mendapatkan senyawa tersebut. Terbatasnya sumber daya alam, dan waktu tumbuh tanaman yang lama membuat efisiensi produksi obat ini menjadi turun. Kanker merupakan penyakit degeneratif yang mematikan. WHO (World Health Organization) (2012) memprediksi kasus kanker dunia yang menyebabkan kematian akan mengalami 13.1 juta jiwa tahun 2030. Sebagian besar penyakit kanker disebabkan oleh lingkungan dan gaya hidup. Faktor lingkungan yang menyebabkan kanker antara lain polusi, asap rokok, radiasi, dan infeksi organisme. Faktor gaya hidup yaitu kebiasaan merokok, konsumsi alkohol, makanan yang mengandung bahan tambahan pangan yang karsinogenik, dan makanan berlemak trans serta obesitas (Jemal 2011). Teknologi untuk terapi kanker seperti pembedahan, radiasi, terapi hormon dan kemoterapi banyak dikembangkan saat ini, tapi pengobatan ini memerlukan biaya yang mahal dan memiliki efek samping yang tidak baik bagi tubuh. Oleh karena itu, perlu dikembangkan suatu pengobatan yang dapat mengobati kanker dengan kemampuan mengobati yang kuat dan tanpa efek samping. Pengembangan teknologi produksi senyawa aktif dari tanaman obat merupakan teknologi yang memiliki prospek yang baik. Salah satu bioteknologi yang dapat digunakan untuk menghasilkan senyawa obat dalam skala besar adalah dengan menggunakan metabolit sekunder yang diekstrak dari kapang endofit. Penggunaan kapang endofit dapat meningkatkan efisiensi produksi senyawa antikanker, masa berkembang biak kapang endofit yang relatif singkat dengan laju
pertumbuhan yang tinggi memungkinkan produksi senyawa antikanker dan penginduksi apoptosis semakin efisien dalam jumlah besar. Senyawa bioaktif antikanker yang akan digunakan untuk produk antikanker harus diujikan terlebih dahulu dengan uji sitotoksik. Uji sitotoksik merupakan salah satu pengembangan metode untuk memprediksi keberadaan senyawa yang bersifat toksik pada sel (Kurnijasanti et al. 2008). Studi eksperimental kanker dapat dilakukan terhadap sel khamir melalui induksi apoptosis sehingga akan memberikan informasi yang berkaitan efek modulator apoptosis tersebut terhadap sel (Sukardiman et al. 2006). Penelitian ini menggunakan ekstrak kloroform kapang endofit isolat dari batang Evodia suaveolens. Tujuan penelitian ini adalah untuk menguji aktivitas sitotoksik dan apoptosis sel khamir dari ekstrak tersebut. Hipotesis dari penelitian ini adalah ekstrak kloroform kapang endofit Evodia suaveolens memiliki aktivitas sitotoksik dan dapat menginduksi apoptosis pada sel khamir. Manfaat penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas dari sitotoksik dan apoptosis pada sel khamir ekstrak kloroform kapang endofit Evodia suaveolens yang nantinya dapat dipakai sebagai antikanker.
TINJAUAN PUSTAKA Kanker Kanker dapat disebabkan oleh beberapa faktor yaitu penggunaan tembakau, infeksi, radiasi, kurangnya aktivitas fisik, makanan yang tidak sehat, obesitas, dan polusi lingkungan (Anand et al. 2008). Kanker merupakan penyakit kedua terbesar di dunia, dan 80 % kematian akibat kanker terjadi pada negara industri. Penyakit kanker terus meningkat dalam skala global. Kanker dapat menyerang manusia pada segala usia yaitu dapat menyerang anak-anak dan dapat beresiko lebih tinggi dengan semakin bertambahnya usia. Pada tahun 2007 kanker menyebabkan 13 % kematian terhadap jumlah penduduk dunia (Mattias 2001). Terdapat 150 tipe kanker yang dapat dikategorikan menjadi kanker paru-paru, prostat, kulit, perut, dan kanker kolon yang disebut karsinoma dan yang dikelompokkan sebagai tumor padat. Sarkoma adalah kanker yang terbentuk pada tulang dan jaringan yang meliputi organ, kanker ini padat yang jarang, namun mematikan jika membentuk tumor yang ganas. Leukimia terbentuk pada darah dan tulang sumsum, kanker ini termasuk
2
tumor tidak padat yang disebabkan oleh produksi sel darah putih yang tidak normal. Lymphoma adalah kanker yang terjadi di pembuluh limfa, kanker ini dibagi menjadi 2 katagori yaitu hodkin’s dan non-hodgkins. Myeloma merupakan tumor-tumor yang terbentuk di dalam antibodi yang membentuk plasma sel pada beberapa jaringan. Apoptosis Apoptosis adalah suatu kematian sel secara alami dan terprogram. Apoptosis dapat terjadi jika sel mengalami suatu kerusakan yang tidak dapat diperbaiki lagi diakibatkan oleh terinfeksi virus, stress akibat kelaparan, kerusakan DNA, dan radikal bebas. Fungsi apoptosis adalah untuk melenyapkan sel-sel yang mengalami kerusakan dan tidak dapat lagi menjalankan fungsinya, serta mencegah penularan virus dan berperan penting dalam mencegah kanker. Sel yang mengalami kegagalan dalam apoptosis, akan mengalami pembelahan terus menerus dan berkembang menjadi tumor. Tumor dapat terjadi jika jumlah sel tidak dapat dipertahankan pada jumlah tetap. Pada apoptosis terjadi serangkaian transduksi sinyal akibat dari serangkaian reaksi biokimiawi yang dapat menyebabkan perubahan ciri morfologis yaitu pengkerutan sel, fragmentasi inti sel, kerusakan membran dan sel tersebut dapat pecah menjadi beberapa vesikel yang disebut badan apoptosis (Algiansyah 2009). Apoptosis berbeda dengan nekrosis. Nekrosis adalah suatu kematian sel yang diakibatkan oleh infeksi. Pada nekrosis terjadi perubahan pada inti sel yang pada akhirnya menyebabkan inti menjadi lisis dan membran plasma menjadi pecah. Pada apoptosis terjadi kematian sel terprogram, membran sel tidak pecah, dan inti mengalami fragmentasi yang kemudian mengirimkan sinyal kepada sel yang berada didekatnya untuk difagosit. Proses apoptosis dikendalikan oleh berbagai sinyal tingkat sel yaitu dari ekstrinsik dan intrinsik. Sinyal ekstrinsik bisa berasal dari hormon, faktor pertumbuhan, nitrit oksida, dan sitokin. Sinyal tersebut harus bisa menembus membran plasma ataupun transduksi sinyal untuk mendapatkan respon. Sinyal intrinsik apoptosis merupakan suatu respon yang diinisiasi oleh sel sebagai respon terhadap stress dan akhirnya dapat mengakibatkan kematian sel. Pengikatan reseptor nuklear oleh glukokortikoid, panas, radiasi, kekurangan nutrisi, infeksi virus, dan hipoksia merupakan keadaan yang dapat menimbulkan pelepasan sinyal intrinsik
a Gambar 1
b Sel khamir yang mengalami apoptosis: a. SEM (Scanning Electron Micrograph) b. TEM (Transmission Electron Micrograph) (Granot 2003)
melalui kerusakan sel (Lumongga 2008). Koloni khamir yang mengalami apoptosis dapat dibedakan dari koloni normalnya. Koloni yang mengalami apoptosis berubah menjadi koloni petit akibat dari disfungsi mitokondria (kehilangan kemampuan respirasi pada mitokondria) sehingga laju pertumbuhan sel khamir menjadi jauh lebih lambat dari sel khamir normal (Gambar 1) (Madigan et al 2000). Sel khamir yang mengalami petite mendapatkan energi dari proses glikolisis dan tidak mampu menggunakan sumber karbon yang tidak dapat difermentasikan, sedangkan sel khamir normal tidak hanya memperoleh energi dari glikolisis, tetapi juga dari proses respirasi. Oleh sebab itu, koloni yang mengalami petit terlihat lebih kecil. Koloni khamir yang mengalami petit jarang terjadi secara alami, karena jumlah glukosa di alam melimpah sehingga bukan pembatas untuk pertumbuhan khamir, apalagi oksigen yang jumlahnya juga melimpah (Algiansyah 2009). Sel khamir (Saccharomyces cerevisiae) Khamir adalah suatu organisme uniselular, eukariot yang bereproduksi secara aseksual melalui pertunasan, bisa juga dengan pembelahan biner dan memproduksi semacam spora haploid untuk bereproduksi secara seksual. Saccharomyces cervisiae adalah organisme yang biasa dipakai oleh masyarakat indonesia untuk dimanfaatkan pembuatan roti dan tape singkong. Selain itu, khamir jenis ini juga dipakai pada berbagai industri yaitu proses produksi minuman beralkohol (Ahmad 2005). Saccharomyces cerevisiae merupakan khamir sejati secara morfologi hanya membentuk blastospora berbentuk bulat lonjong, silindris, oval atau bulat telur yang dipengaruhi oleh strainnya (Gambar 2). Penampilan makroskopik mempunyai koloni
3
berbentuk bulat, warna kuning muda, permukaan berkilau, licin, tekstur lunak dan memiliki sel bulat dengan askospora 1-8 buah (Ahmad 2005). Taksonomi Saccharomyces cerevisiae menurut Sanger (2004) diklasifikasikan sebagai berikut super kingdom Eukaryota, phylum Fungi, subphylum Ascomycota, kelas Saccharomycetes, ordo Saccharomycetales, family Saccharomycetaceae, genus Saccharomyces, spesies Saccharomyces cerevisae.
Gambar 2 Saccharomyces cerevisiae pembesaran 10 x 40 (Ahmad 2005) Evodia suaveolens Tanaman Zodia (Evodia suaveolens Scheff) merupakan tanaman asli Indonesia yang berasal dari Irian (Papua) yang pada umumnya ditanam di pekarangan rumah, tanaman yang mempunyai tinggi antara 50 cm hingga 200 cm (rata-rata 75 cm), dipercaya mampu mengusir nyamuk dan serangga lainnya dari sekitar tanaman. Oleh sebab itu, tanaman ini sering ditanam pada pekarangan rumah untuk menghalau nyamuk. Aroma yang dikeluarkan oleh tanaman Zodia cukup wangi. Tanaman ini dapat mengeluarkan aroma apabila tanaman tergoyang oleh tiupan angin sehingga diantara daunnya saling menggosok, maka keluarlah aroma yang wangi. Saat ini sebagian masyarakat menyimpan tanaman Zodia pada pot di dalam ruangan sehingga selain memberikan aroma yang khas, juga aromanya dapat menghalau nyamuk dari ruangan. Selain itu, manfaat yang lainnya adalah sebagai antikanker (Kardinan 2007). Evodia suaveolens diklasifikasikan ke dalam kingdom Plantae (tumbuh-tumbuhan), subkingdom Tracheobionta (tumbuhan berpembuluh), super divisi Spermatophyta (menghasilkan biji), divisi Magnoliophyta (tumbuhan berbunga), kelas Magnoliopsida (berkeping dua), sub kelas Rosidae, ordo Sapindales, family Rutaceae (suku jerukjerukan), genus Evodia, spesies Evodia suaveolens Scheff.
Gambar 3 Tanaman Evodia suaveolens (Anonim 2012) Kapang endofit Endofit secara bahasa berasal dari kata endon yang berarti di dalam dan phyton yang berarti tanaman (Schulz & Boyle 2005). Secara umum, endofit adalah makhluk hidup yang berada di dalam tanaman dapat bersifat parasitik atau simbiotik. Kapang endofit adalah fungi yang menginfeksi jaringan tanaman yang sehat tanpa menyebabkan sakit (Clay 2004). Cendawan atau fungi adalah suatu organisme heterotrof, dan memerlukan senyawa organik untuk pertumbuhannya. Organisme ini tidak berklorofil dan mempunyai sel yang kaku. Cendawan dapat dibagi menjadi dua bagian yaitu khamir (yeast) yang berbentuk uniselular dan kapang (mold) yang berbentuk benang (filamen). Fase khamir timbul jika organisme itu hidup sebagai parasit (merugikan) dalam jaringan dan ada juga yang bersifat saprofit (menguntungkan) dalam jaringan. Fase kapang ini dapat tumbuh dalam organisme tersebut, jika hidup sebagai saprofit (Gandjar & Sjamsuridzal 2006). Winarno (2006) menemukan bahwa hasil pemurniaan mikroba endofit dari batang kina Cinchona ledgeriana Moens diperoleh dua jenis kapang yang dapat menghasilkan senyawa alkaloid kinin dan sinkonin. Kedua senyawa tersebut biasanya terkandung dalam batang Kina yang memiliki aktivitas antimalaria. Hubungan antara mikroba endofit dan tanaman dalam menghasilkan metabolit sekunder sangat menarik dipelajari. Sejak tahun 1993 penelitian produksi taxol yang merupakan obat kanker oleh kapang endofitik Taxomyces andreanae dan Pestalotiopsis microspora telah dilaporkan. Pada perkembangan senyawa aktif yang dihasilkan oleh kapang endofit ternyata tidak selalu sama dengan senyawa yang dihasilkan oleh tanaman inangnya sehingga kapang endofit menjadi sumber senyawa aktif baru yang sangat menjanjikan. Disamping itu pencarian senyawa baru dari mikroba endofit diharapkan
4
dapat mengurangi kerusakan lingkungan akibat pemanfaatan tanaman secara besarbesaran untuk mendapatkan senyawa aktif (Strobel et al. 2004). Hasil penelitian terhadap kapang endofit menunjukkan bahwa bagian tanaman yang berbeda dari satu tanaman inang memperlihatkan isolat kapang endofit yang berbeda. Perbedaan habitat dan ekosistem tanaman inang ini juga menunjukkan perbedaan kapang endofit. Fermentasi Fermentasi adalah suatu proses perubahan biokimia yang terjadi di dalam substrat organik sebagai akibat kerja zat-zat katalis kimia (enzim) yang diproduksi oleh mikroba tertentu. Fermentasi secara teknik dapat didefinisikan sebagai suatu proses oksidasi anaerobik atau partial anaerobik karbohidrat yang menghasilkan alkohol serta beberapa asam, namun banyak proses fermentasi yang menggunakan substrat protein dan lemak (Muchtadi & Ayustaningwarno 2010). Fermentasi terbagi menjadi dua, yaitu fermentasi spontan dan tidak spontan (membutuhkan starter). Fermentasi spontan adalah fermentasi yang biasa dilakukan menggunakan media penyeleksi, seperti garam, asam organik, asam mineral, dan pati. Media penyeleksi tersebut akan menyeleksi bakteri patogen dan menjadi media yang baik bagi tumbuh kembang bakteri selektif yang membantu jalannya fermentasi. Fermentasi tidak spontan adalah fermentasi yang dilakukan dengan penambahan kultur organisme bersama media penyeleksi sehingga proses fermentasi dapat berlangsung lebih cepat (Rejeki 2011). Mikroba yang melakukan fermentasi membutuhkan energi yang umumnya diperoleh dari glukosa. Dalam keadaan aerob, mikroba mengubah glukosa menjadi air, CO 2 dan energi (ATP). Beberapa mikroba hanya dapat melangsungkan metabolisme dalam keadaan anaerob dan hasilnya adalah substrat yang setengah terurai. Hasil penguraiannya adalah air, CO2, energi dan sejumlah asam organik lainnya, seperti asam laktat, asam asetat, etanol serta bahan-bahan organik yang mudah menguap (Muchtadi & Ayustaningwarno 2010). Kapang endofit menyimpan potensi ekonomi yang tidak terbatas dan belum banyak diaplikasikan dalam industri farmasi dan pertanian sumber bahan obat, enzim dan senyawa biologis pengendali hama di masa
depan. Proses fermentasi memegang peranan penting dalam produksi senyawa tersebut secara masal dalam skala industri. Produksi senyawa bioaktif melalui fermentasi jamur endofit ini berpotensi besar bagi industri karena reprodusibel, penyediaannya bisa tidak terbatas karena tidak dibatasi jumlah tanaman (Sugijanto 2008). Ekstraksi Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan beberapa zat atau senyawa dengan pelarut tertentu. Pemisahan terjadi berdasarkan kemampuan yang berbeda dari komponenkomponen dalam campuran. Pelarut yang digunakan adalah pelarut dengan kemampuan menjerap bahan yang dibutuhkan (Purba 2011). Proses ekstraksi terdiri dari beberapa tahapan yaitu pencampuran bahan dengan pelarut, pemisahan dan isolasi ekstrak. Pada pencampuran bahan ekstrak dengan pelarut dibiarkan saling berkontrak sehingga terjadi perpindahan masa. Setelah terjadi penjerapan, maka pemisahan dilakukan dengan alat pemisah. Pemisahan bertujuan untuk memisahkan larutan ekstrak dan pelarut. Setelah didapatkan fase ekstrak pelarut, maka pelarut lalu diuapkan dan didapatkan ekstrak murni. Ekstraksi dilakukan berulang sehingga zat yang dijerap lebih optimal (Dirjen POM 2000). Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan pelarut kloroform. Kloroform adalah suatu pelarut non polar yang dapat digunakan untuk ekstraksi alkaloid (Winarno 2006). Evodiamin adalah senyawa alkaloid yang dihasilkan oleh Evodia suaveolens. Alkaloid dalam bentuk bebas tidak dapat larut di dalam air, namun dapat larut di dalam kloroform (Jiang 2009). BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) Uji toksisitas adalah suatu uji pendahuluan untuk mengetahui aktivitas farmakologi suatu senyawa. Prinsipnya komponen bioaktif selalu bersifat toksik jika diberikan dengan dosis tinggi dan menjadi obat pada dosis rendah. Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) merupakan salah satu uji untuk mengetahui toksisitas suatu senyawa (Zebua 2011). Artemia salina Leach merupakan organisme sejenis udang-udangan yang berukuran kecil dan dikenal dengan nama brine shrimp. Artemia salina Leach digunakan sebagai hewan uji untuk menentukan ketoksikan suatu senyawa dalam ekstrak tumbuhan yang diwujudkan sebagai racun (Baraja 2008).
5
Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) sering digunakan untuk praskrining terhadap senyawa aktif yang terkandung dalam ekstrak tumbuhan karena murah, cepat, mudah dan dapat dipercaya. Suatu metode yang menggunakan Artemia salina Leach telah diperkenalkan sebagai metode bioassay yang sederhana untuk penelitian produk alam. Sifat toksisitas suatu senyawa dapat dibandingkan dengan uji kultur sel sehingga dapat diasosiasikan dengan aktivitas antikanker (Baraja 2008).
longitudinal, lalu diletakkan di atas cawan petri berisi PDA yang telah dicampur dengan kloramfenikol 0,05 mg/mL (Theantana et al. 2007). Keduanya diinkubasi selama 3 hari pada suhu 25oC. Koloni dipindahkan ke PDA dalam cawan petri dan diinkubasi lagi pada suhu 25oC dan dilakukan pengecekan secara berkala untuk pemurnian lebih lanjut. Masingmasing endofit diisolasi melalui beberapa kali ditanam pada agar miring (PDA) dan diinkubasi dalam inkubator suhu 25oC dan diremajakan.
BAHAN DAN METODE
Peremajaan kapang endofit dari isolat Inokulasi isolat kapang endofit dilakukan secara aseptis di dalam laminar. Laminar terlebih dahulu disterilkan dengan penyinaran sinar ultraviolet selama 1 jam, dan kemudian seluruh bagian dalam laminar dan bagian luar kaca disemprot dengan etanol 70%. Isolat kapang endofit dari agar miring diinokulasi ke dalam media PDA kemudian diinkubasi selama dua hari pada suhu kamar (Pelczar & Chan 1996).
Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Laminar Air Flow (LAF), neraca analitik, autoklaf, oven, tabung reaksi, cawan petri, labu Erlenmeyer, lempeng pemanas, pengaduk magnetik, jarum ose, pembakar spirtus, pinset, lampu UV, inkubator bergoyang (shaker incubator), sumur BSLT, sentrifus, tabung sentrifus, homogenizer, lemari es, tabung Eppendorf, kaca sebar, mikro pipet, tip (biru, kuning, putih), kertas aluminium, colony counter, dan plastik penyegel. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman Evodia suaveolens yang didapatkan dari toko tanaman hias di Baranangsiang Bogor, isolat kapang endofit dari batang tanaman Evodia suaveolens, ekstrak metabolit sekunder dari kapang endofit Evodia suaveolens, khamir Saccharomyces cerevisiase, akuades, etanol, glukosa, kloroform, natrium hipoklorit 5.3%, kloramfenikol, PDA (Potatos Dextrose Agar), PDB (Potatos Dextrose Broth), air laut, Artemia salina, YEPD (Yeast Extract, Dextrose, Pepton) padat, cair dan petit. Metode Penelitian ini terdiri beberapa tahapan yaitu isolasi dan pemurnian kapang endofit, peremajaan kapang endofit, fermentasi, ekstraksi senyawa metabolit sekunder, uji sitotoksik dengan BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) LC50 dan induksi apoptosis pada sel khamir. Isolasi dan pemurnian kapang endofit Batang tanaman Evodia suaveolens dengan panjang 2 cm dan lebar 1 cm dicuci dengan air mengalir, lalu disterilkan dengan etanol 70% selama 1 menit, natrium hipoklorit 5,3% selama 5 menit, dan etanol 75% selama 0,5 menit. Bagian batang dibelah dua secara
Fermentasi kapang endofit Isolat kapang yang telah diremajakan masing-masing diinokulasikan ke dalam tabung Erlenmeyer berisi 50 ml media PDB. Tiap tabung Erlenmeyer dilakukan fermentasi dengan metode statik pada suhu kamar selama 12 hari dan diuji juga dengan fermentasi dinamis dengan agitasi 171 rpm selama 5 hari. Perbedaan ini untuk mengetahui perbandingan fermentasi tersebut untuk menghasilkan ekstrak lebih banyak (Kumala dan Muhamad 2005). Ekstraksi metabolit sekunder Kapang endofit dalam Erlenmeyer diekstrak dengan pelarut kloroform masingmasing sebanyak tiga kali ekstrak dan pada tiap ekstraksi digunakan pelarut sebanyak 50 ml. Fase pelarut ditampung dalam botol yang telah diketahui bobot kosongnya. Hasil ekstraksi diuapkan dalam ruang asam hingga tertinggal residunya. Bobot ekstrak diperoleh dari selisih antara bobot botol berisi ekstrak dan bobot botol kosong. Ekstrak di dalam botol dipindahkan ke vial yang lebih kecil dengan dilarutkan terlebih dahulu dengan pelarutnya (Kumala dan Muhamad 2005). Uji toksistas dengan BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) Telur udang Artemia salina L sebanyak 1 sudip dilarutkan dalam 250 ml air laut dalam sebuah gelas piala,
6
dimasukkan aerator, dan didiamkan selama 1x24 jam agar menjadi larva udang. Selanjutnya, disiapkan larutan sampel dengan konsentrasi masingmasing 500 ppm, 100 ppm, 50 ppm, dan 10 ppm setelah ditambah air laut dan Artemia salina. Perhitungan larva yang masih hidup dan yang mati dilakukan setelah 24 jam untuk menentukan nilai LC50 (Meyer et al. 1982). Induksi apoptosis pada sel khamir Induksi apoptosis pada sel khamir meliputi beberapa tahapan yaitu pembuatan media, peremajaan sel khamir, inkubasi dan pemanenan sel khamir, serta perlakuan induksi apoptosis pada sel khamir (Granot 2003). Pembuatan Media (Campbell 1991). Media yang digunakan untuk induksi apoptosis pada sel khamir meliputi media cair dan padat, serta media padat petit YEPD (Yeast Extract Peptone Dextrose). Media cair YEPD memiliki komposisi 1% yeast extract, 2 % pepton, 2% glukosa, 1.8% baktoagar, dan akuades hingga 100 ml, lalu disterilkan dengan autoklaf pada suhu 120°C selama 15 menit dengan tekanan 10 atm. Semua media yang dibutuhkan dalam penelitian ini memiliki komposisi dan cara pembuatan yang hampir sama. Perbedaannya terletak pada penambahan baktoagar di medium padat YEPD. Sementara pada media petit dilakukan pengurangan jumlah glukosa menjadi 0.1%, penambahan etanol 2%. Peremajaan Sel Khamir (Campbell 1991). Sel-sel khamir diremajakan pada media YEPD padat dengan menggoreskan 2 ose khamir dan diinkubasi pada suhu 27°C selama 2 hari. Hasil peremajaan akan digunakan sebagai biakan perlakuan. Inkubasi dan Pemanenan Sel Khamir (Campbell 1991). Proses inkubasi ini dilakukan untuk mengetahui kurva pertumbuhan dari sel khamir. Kurva ini didapatkan dengan menghitung bobot kering sel khamir. Pada awalnya, sel-sel khamir ditumbuhkan pada media padat YEPD, kemudian sebanyak 1 ose sel khamir dipindahkan ke medium cair YEPD dan dipindahkan sebanyak 200 µl ke masingmasing 5 tabung untuk diukur jumlah khamir selama 5 hari. Sel dipanen dengan proses sentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm selama 10 menit dan peletnya dicuci 2 kali dengan akuades secukupnya. Pelet yang sudah dicuci kemudian diukur bobotnya dan dicatat, selanjutnya dilakukan metode gravimetri
untuk didapatkan bobot kering sel. Bobot akhir sel khamir kemudian didapatkan melalui perhitungan sebagai berikut: Bobot Akhir Sel Khamir = Bobot Basah – Bobot Kering Perlakuan Induksi Apoptosis (Granot 2003). Percobaan ini akan dilakukan pada beberapa perlakuan, yaitu ekstrak metabolit sekunder kapang endofit Evodia suaveolens yang telah diseleksi dari uji toksistas BSLT, glukosa 2% sebagai kontrol positif, dan akuades sebagai kontrol negatif. Konsentrasi yang dipakai untuk induksi adalah nilai konsentrasi LC50 dari masing-masing kapang endofit. Ekstrak metabolit sekunder sebanyak 400 µl lalu dimasukan ke dalam Eppendorf yang berisi 100 µl kultur sel khamir dan ditambahkan 500 µl YEPD. Campuran itu dihomogenisasi terlebih dahulu, kemudian diinkubasi pada 37°C selama 24 jam. Sama halnya pada perlakuan ekstrak kapang endofit Evodia suaveolens, perlakuan kontrol positif ditambahkan glukosa 2% dan kontrol negatif akuades untuk mengganti ekstrak pada perlakuan. Uji Frekuensi Petit (Granot 2003). Pada 24 jam dilakukan pengambilan sebanyak 15 µl sel dari biakan perlakuan yang telah diencerkan sebanyak 10-6 kali. Sel-sel khamir tersebut disebar merata ke cawan petri yang berisi media padat petit dan diinkubasi pada suhu 28°C selama 24 jam, kemudian dilakukan perhitungan koloni petit. Sel-sel khamir yang berubah menjadi koloni petit tampak berukuran lebih kecil dibandingkan sel-sel khamir normal. Sel-sel khamir yang berubah menjadi koloni petit dihitung frekuensi petitnya dengan rumus : x 100 %
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Isolasi Kapang Endofit Evodia suaveolens Tanaman dan mikroorganisme saling berhubungan erat satu dengan yang lain. Mikroorganisme ada yang bersifat menyerang tanaman tersebut dan menyebabkan penyakit, sementara ada pula yang bersifat menguntungkan. Kapang adalah cendawan yang hidup pada tumbuhan, dan bersifat menguntungkan (saprofit) bagi inangnya. Ada dua jenis kapang yang berasal dari tumbuhan yaitu epifit yang berasal dari luar tanaman, dan endofit yang berasal dari dalam (Winarno 2006). Kapang endofit yang digunakan adalah berasal dari dalam batang Evodia suaveolens.
7
A
B
Gambar 4 Kapang Endofit A dan B Evodia suaveolens Tahapan pertama penelitian ini adalah isolasi dengan tujuan mengisolasi kapang yang terdapat di dalam batang dari Evodia suaveolens. Batang yang dicuci, sebelum proses pemotongan dan isolasi dilakukan bertujuan untuk menghilangkan kotoran yang berada diluar batang. Setelah itu dilakukan sterilisasi berurutan dengan menggunakan etanol, sodium hipoklorit (NaOCl), dan etanol. Hal ini dimaksudkan agar mikrob yang berada di luar batang, tidak ikut tumbuh pada media isolasi. Media PDA (Potatos Dextrose Agar) ditambahkan kloramfenikol sebagai antibakteri (Sukandar 2010). Beberapa perlakuan tersebut berguna pada proses isolasi kapang endofit yang berada pada batang Evodia suaveolens. Isolat kapang endofit yang didapatkan dari Evodia suavelones beragam dan dibedakan dari penyebaran hifa, warna kapang, dan bentuk permukaan kapang tersebut. Pada saat kapang tersebut telah tumbuh, hifa diambil dan dipindahkan pada media PDA yang baru. Pada Gambar 4, kapang endofit A dan B dilakukan isolasi. Kedua kapang tersebut bentuk morfologinya berbeda sehingga dipindahkan pada media PDA baru. Setelah kapang tersebut tumbuh selama tiga hari, maka diamati lagi. Jika kapang endofit tumbuh lebih dari satu, maka dimurnikan lebih lanjut. Isolat kapang endofit dari Evodia suavelolens yang telah didapatkan, akan disamakan satu dengan yang lain sehingga isolat kapang endofit diyakini berbeda dari satu sama lain. Beberapa kapang yang terlihat sama, dicoba ditumbuhkan lebih lama untuk melihat warna pada saat umur tua. Jika warnanya sama, maka isolat satunya dieliminasi. Proses isolasi ini menghasilkan kapang endofit Evodia suaveolens yang beragam. Banyaknya isolat yang akan dihasilkan bergantung pada media yang digunakan. Penggunaan media yang berbeda akan
menghasilkan kekayaan spesies yang berbeda (Nurhasanah 2008). Dari media PDA (Potatoes Dextrose Agar) terdapat 8 kapang endofit (Gambar 5). Media ini bersifat tidak selektif dan dapat digunakan untuk menumbuhkan atau mengidentifikasi kapang. Media ini mengandung sumber karbohidrat dalam jumlah cukup yaitu terdiri dari 20% ekstrak kentang dan 2% glukosa sehingga baik untuk pertumbuhan kapang tetapi kurang baik untuk pertumbuhan bakteri (Julianingsih 2012). Keterangan mengenai warna, bentuk permukaan dan pola setiap kapang disajikan pada Lampiran 1.
Kapang 1
Kapang 2
Kapang 3
Kapang 4
Kapang 5
Kapang 6
Kapang 7
Kapang 8
Gambar 5 Isolat Kapang Endofit dari Evodia suaveolens Hasil Fermentasi dan Ekstrak Klorofom Kapang Endofit Evodia suaveolens Fermentasi adalah suatu proses merubah substrat menjadi produk. Tujuannya untuk menumbuhkan dan menghasilkan produk senyawa aktif. Isolat kapang endofit Evodia suaveolens ditumbuhkan pada media PDB (Potato Dextrose Broth) yang telah disterilisasi sebelumnya pada autoklaf. Media PDB biasa dipakai untuk pertumbuhan,
8
Tabel 1 Rendemen ekstrak kloroform hasil fermentasi kapang endofit Evodia suaveolens Nomor Kapang Kapang 1 Kapang 2 Kapang 3 Kapang 4 Kapang 5 Kapang 6 Kapang 7 Kapang 8
Bobot Ekstrak (Gram) Fermentasi Dinamis 0.03 0.03 0.02 0.02 0.03 0.03 0.03 0.02
Bobot Ekstrak (Gram) Fermentasi Statis 0.41 0.21 0.10 0.11 0.06 0.05 0.08 0.10
pemanenan dan produksi kapang (Simanjuntak 2011). Fermentasi dilakukan secara statis dan dinamis. Tujuannya untuk mengetahui perbandingan ekstrak yang didapatkan antara keduanya. Fermentasi statis tanpa agitasi selama 12 hari dan fermentasi dinamis selama 5 hari dengan agitasi 171 rpm. Pada fermentasi substrat yang terdapat pada media PDB (Potato Dextrose Broth) dimanfaatkan kapang endofit tersebut untuk kebutuhan pertumbuhannya. Setiap kapang endofit, menghasilkan produk yang kemungkinan berbeda. Fermentasi ini diharapkan dapat memproduksi evodiamin dari salah satu isolat kapang endofit Evodia suaveolens. Kapang endofit dapat menghasilkan senyawa yang mirip dengan inangnya yaitu Evodia suaveolens sehingga diharapkan senyawa evodiamin yang didapatkan dapat menginduksi apoptosis pada sel khamir (Jiang 2009). Ekstraksi dilakukan setelah fermentasi selesai dilakukan dengan tujuan mengekstrak senyawa yang diinginkan. Ekstraksi ini menggunakan kloroform karena dapat dipakai untuk mengekstrak alkaloid (Winarno 2006). Evodiamine adalah senyawa alkaloid yang dihasilkan dari Evodia suaveolens sehingga diekstraksi dengan kloroform. Pengocokan dilakukan pada ekstraksi dengan tujuan agar ekstrak terjerap secara menyeluruh. Pengocokan ini menghasilkan dua fase yaitu fase air dan fase kloroform. Fase kloroform berada pada bagian bawah (Gambar 6) dan dipisahkan dengan pipet. Ekstraksi dilakukan tiga kali untuk memperbanyak senyawa yang terjerap oleh kloroform. Kloroform diuapkan sampai tertinggal residunya. Bobot residu ini ditimbang dan didapatkan dari bobot botol yang berisi ekstrak dikurangi dengan bobot kosong. Bobot ekstrak disajikan pada Tabel 1. Dari tabel tersebut, didapatkan residu terbesar dari ekstrak adalah kapang 1 untuk fermentasi
A
Gambar 6 Fase kloroform (A) pada proses ekstraksi kapang endofit Evodia suaveolens statis yaitu sebanyak 0.41 gram dan kapang 1, 2, 5, 6, dan 7 untuk fermentasi statis sebanyak 0.03 gram. Fermentasi statis menghasilkan senyawa yang lebih banyak dibandingkan fermentasi dinamis. Fermentasi secara dinamis menghasilkan residu ekstrak yang lebih sedikit, disebabkan oleh metabolit yang dihasilkan kemungkinan dimakan kembali oleh kapang tersebut (Simanjuntak 2002). Ekstrak dilarutkan lagi dalam kloroform, dipindahkan pada botol vial dan diuapkan kembali untuk uji sitotoksik dengan BSLT dan senyawa yang memiliki bioaktif dari seleksi sitotoksik, diinduksi pada sel khamir untuk mengetahui daya apoptosisnya. Hasil Uji Sitotoksik dengan BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) Senyawa bioaktif antikanker yang akan digunakan untuk produk antikanker harus diujikan terlebih dahulu dengan uji sitotoksik. Uji sitotoksik merupakan salah satu pengembangan metode untuk memprediksi keberadaan senyawa yang bersifat toksik pada sel (Kurnijasanti et al. 2008). Salah satu metode uji sitotosisitas adalah Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) yang digunakan untuk praskrining terhadap senyawa yang diduga berkhasiat sebagai anti tumor (Widyastuti 2008). Uji BSLT merupakan uji pendahuluan di National Cancer Institute (NCI) Amerika. Hewan uji yang digunakan dalam BSLT adalah Artemia salina L. Tujuan utama dari tahapan ini adalah untuk mengetahui ekstrak yang dihasilkan oleh kapang endofit dari Evodia suaveolens yang paling berpotensi. Selain itu, tujuannya adalah mengetahui konsentrasi yang dapat membunuh dari setengah populasi Artemia salina. Nilai tersebut menggambarkan bioaktivitas metabolit yang dihasilkan dari kapang endofit Evodia suaveolens. Semakin kecil nilai konsentrasi yang dapat membunuh setengah populasi larva maka akan semakin tinggi bioaktivitasnya, begitu pula sebaliknya.
9
>500
500 400
>500
>500 403
400 315
270
300 200 100
19,6
0 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 Nilai LC50 K=Kapang Endofit Gambar 7 Nilai LC50 dari uji sitotoksik BSLT ekstrak kloroform kapang endofit Evodia s.
Bobot (Gram)
Pada uji ini akan dipilih ekstrak kapang endofit Evodia suaveolens yang memiliki bioaktivitas yang terbaik. Nilai LC50 (Gambar 7 dan lampiran 3) dari kapang endofit Evodia suavelolens telah dibandingkan. Dari Gambar 7, diperjelas bahwa kapang 1 memiliki nilai 315 ppm, kapang 3 memiliki nilai 270 ppm, kapang 5 memiliki nilai 400 ppm, kapang 7 memiliki nilai 19.7 ppm dan kapang 8 memiliki nilai 403 ppm. Nilai tersebut menunjukkan konsentrasi yang dapat membunuh dari setengah populasi Artemia salina. Berbeda pada kapang 2, 4, dan 6, ketiganya tidak memiliki daya toksik pada konsentrasi 500, 100, 50 dan 10 ppm. Ketiganya memiliki nilai toksik diatas 500 ppm Kapang endofit tersebut memiliki nilai Lethal Concentration (LC50) yang bervariasi. Pada kapang 7 didapatkan 19.6 ppm. Konsentrasi ini sudah dapat membunuh setengah populasi Artemia salina. Beda halnya dengan kapang endofit lainnya, yang memiliki dosis konsentrasi kematian diatas
200 ppm. Kapang 7 paling berpotensi digunakan sebagai agen penginduksi apoptosis, karena memiliki bioaktivitas yang tinggi dan kapang 2, 4, dan 6 (warna hijau) memiliki bioaktivitas diatas 500 ppm sehingga ketiganya tidak diuji lebih lanjut karena sudah tidak berpotensial. Semakin kecil konsentrasi, berarti bioaktivitasnyapun tinggi (Zebua 2011). Konsentrasi yang dipakai dari nilai LC50 lima kapang endofit (kapang 1, 3, 5, 7, 8) digunakan sebagai konsentrasi untuk induksi apoptosis pada sel khamir dan tiga kapang endofit yaitu kapang 2, 4, dan 6 tidak diuji karena sudah tidak potensial. Kurva Pertumbuhan Sel Khamir Tahapan ini bertujuan untuk mengetahui pertumbuhan pada sel khamir. Kurva pertumbuhan pada sel khamir didapatkan dari metode gravimetri dengan mengukur bobot sel dengan mengurangkan bobot basah sel dengan bobot kering. Laju pertumbuhan ini akan berguna untuk membuat kurva pertumbuhan dan akan dipakai untuk menentukan awal fase stasioner dari sel khamir. Pada tahapan ini sel khamir telah mencapai pertumbuhan dan aktivitas yang maksimum (Granot & Snyder 1991). Fase ini dipakai pada saat induksi metabolit sekunder pada sel khamir. Sel khamir pada media YEPD (Yeast Extract Peptone Dextrose) dipindahkan pada media cair YEPD merupakan media starter dengan tujuan agar khamir mengalami proses adaptasi (Rizqiyanti 2012). Setelah adaptasi, sel mengalami pembelahan yang sangat rendah, karena baru selesai tahap penyesuaian diri. Fase ini adalah fase pertumbuhan awal. Setelah mengalami proses adaptasi sel khamir akan memasuki fase log (fase eksponensial). Fase ini ditandai dengan pertumbuhan sel yang cepat. Hal ini terlihat pada peningkatan jumlah sel khamir pada 0
0.5 55 0.4 0.3 0.2 = 0.1 5 0
24
48
72
94
108
Jam keGambar 8 Kurva pertumbuhan sel khamir berdasarkan nilai bobot sel
120
10
jam sampai 48 jam. Pada fase ini sel khamir memproduksi zat-zat metabolit yang dibutuhkan untuk memenuhi nutrisinya. Hasil penelitian menunjukkan fase stasioner terjadi setelah inkubasi 48 jam. Pada kurva tersebut (Gambar 8) laju pertumbuhan tidak lagi pesat karena sel khamir memasuki fase kematian. Hal ini sesuai dengan penelitian Granot & Snyder (1991) dan penelitian Rizqiyanti (2012) bahwa sel mengalami fase stasioner pada waktu setelah 48 jam. Oleh sebab itu, fase ini adalah fase yang tepat pada saat inkubasi dengan perlakuan ekstrak. Pada fase ini, khamir juga membutuhkan nutrisi untuk pertumbuhannya. Perlakuan ekstrak juga ditambahkan medium nutrisi baru sehingga sel khamir akan mengalami pertumbuhan yang baik (Granot & Snyder 1991). Hal ini ditunjukan juga pada penelitian Granot et al. (2003), induksi glukosa 2% menyebabkan apoptosis pada sel khamir. Hasil Uji Induksi Apoptosis pada Sel Khamir Sel khamir respirasi aerob dan anaerob. Sel khamir pada kondisi normal memperoleh energi dari glikolisis dan siklus krebs. Sel yang mengalami petite (Gambar 9B) berukuran lebih kecil dibandingkan dengan sel normal (Gambar 9A). Hal ini disebabkan sel telah kehilangan kemampuan untuk berespirasi akibat rusaknya mitokondria akibat mekanisme apoptosis sehingga laju pertumbuhan menjadi lebih lambat (Madigan et al. 2000). Sel khamir memiliki kemampuan
A
B
Gambar 9 Perbandingan ukuran sel normal (A) dan sel petite (B)
untuk tetap hidup meskipun dalam keadaan kekurangan nutrisi serta kerusakan organel mitokondria. Hal ini disebabkan karena sel khamir masih menjalankan proses glikolisis (respirasi anaerob) tanpa mitokondria dengan mengubah glukosa menjadi ATP melalui fermentasi etanol (Muray et al. 2006). Hal ini menjadikan mekanisme apoptosis khamir dapat dideteksi dengan visualisasi pada cawan sebar. Ekstrak metabolit sekunder dari kapang endofit Evodia suaveolens yang diujikan adalah dari kapang 1, kapang 3, kapang 5, kapang 7 dan kapang 8 dengan konsentrasi berturut-turut 315 ppm, 270 ppm, 400 ppm, 19.7 ppm dan 403 ppm. Konsentrasi dari kelima kapang endofit tersebut berasal dari nilai LC50 uji toksisitas BSLT (Brine Shrimp Lethality Test). Konsentrasi ini dipakai untuk induksi apoptosis pada sel khamir dengan tujuan untuk mengetahui frekuensi jumlah sel yang mengalami petite akibat induksi senyawa aktif tersebut. Berdasarkan Tabel 2, frekuensi sel khamir yang mengalami petite tertinggi adalah berasal dari senyawa aktif kapang 7 dan 8 yaitu 90%. Keduanya dapat menginduksi apoptosis 90% dengan konsentrasi 19.7 ppm dan 403 ppm. Frekuensi petite sel khamir terkecil berasal dari induksi senyawa kapang 1 yaitu 69% dengan konsentrasi 315 ppm. Pada penelitian Rizqianti (2012), ekstrak flavonoid murni dari daun salam dapat menginduksi apoptosis pada sel khamir sebesar 99.1%. Jumlah frekuensi petite sel khamir ini lebih besar, karena flavonoid yang diekstrak dari daun salam telah murni, berbeda dengan ekstrak alkaloid (evodiamin) yang belum murni sehingga ada senyawa lain yang dapat berpengaruh terhadap apoptosis sel khamir. Pada saat ekstraksi kloroform senyawa dari Tabel 2 Hasil frekuensi sel khamir yang mengalami petite akibat induksi ekstrak kloroform kapang endofit Evodia suaveolens Nomor Konsentra Sel Sel Persen Kapang si Peti Nor Petite te mal K1 315 ppm 32 14 69% K3 270 ppm 42 14 75% K5 400 ppm 167 67 86% K7 19,7 ppm 36 4 90% K8 403 ppm 19 2 90.4% Kontrol (Glukosa 69 20 77% + 2%) Kontrol (Akuades) 0 32 0% –
11
kapang endofit kemungkinan tidak hanya alkaloid, namun bisa juga senyawa lain terekstrak (Winarno 2006). Selain itu, flavonoid dan alkaloid kemungkinan berbeda khasiatnya dalam menyebabkan apoptosis. Sel-sel khamir yang ditumbuhkan pada media petite padat (semua perlakuan) tidak semuanya menjadi menjadi koloni petite. Hal ini disebabkan oleh sel khamir yang dapat beradaptasi pada kadar glukosa yang terbatas, walaupun pada media petite sumber utama karbon pada media petit adalah etanol (sumber karbon yang tidak dapat difermentasikan). Sel-sel khamir yang berubah menjadi koloni petite hanya mampu menggunakan glukosa yang jumlahnya sangat terbatas (karena mengalami disfungsi mitokondria akibat proses apoptosis). Hal ini mengindikasikan bahwa glukosa sebagai sumber karbon utama pada media yang memiliki nutrien lain yang terbatas dapat menginduksi terjadinya apoptosis seperti yang dilaporkan Granot (2003). Pada kontrol positif dengan pemberian glukosa dapat memicu apoptosis lebih banyak disebabkan oleh khamir kurang mampu beradaptasi dengan sumber karbon yang terlalu banyak (Algiansyah 2009). Pelarut yang digunakan untuk melarutkan ekstrak adalah akuades steril yang pada dasarnya tidak menginduksi apoptosis seperti diperlihatkan pada kontrol negatif. Penggunaan glukosa sebagai kontrol positif disebabkan karena glukosa 2% dapat menginduksi apoptosis yang ditunjukan dengan perubahan sel menjadi petit (Granot et al. 2003). Pada penelitian Granot (2003) bahwa pemberian glukosa dengan konsentrasi tinggi dapat memicu apoptosis dengan perubahan morfologi menjadi sel yang berukuran kecil (petit), fragmentasi DNA, tingginya produksi spesies oksigen reaktif dan membran blebbing (kerusakan membran). Dari penelitian ini, ekstrak kapang endofit yang potensial adalah kapang endofit 7 dengan konsentrasi 19.7 ppm dapat memicu apoptosis dengan frekuensi 90%. Kapang 1, 3, 5, dan 8 juga mampu menginduksi apoptosis pada konsentrasi diatas 200 ppm. Kapang 2, kapang 4, dan kapang 6 tidak diujikan pada induksi apoptosis, sebab sebelumnya telah diujikan pada BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) tidak memiliki daya toksik pada konsentrasi 500 ppm. Oleh sebab itu, kapang 2, 4 dan 6 tidak perlu lagi diujikan. Pertumbuhan koloni yang mengalami petit yang disebabkan oleh induksi ekstrak metabolit sekunder dari kapang endofit Evodia suaveolens yaitu kapang 1, 3, 5, 7 dan
8 merupakan salah satu indikasi adanya mekanisme apoptosis. Hal ini menunjukkan metabolit sekunder tersebut memiliki suatu senyawa yang dapat memicu apoptosis pada sel khamir.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Simpulan dari penelitian ini adalah isolasi terhadap kapang endofit dari Evodia suaveolens menghasilkan 8 isolat. Hasil aktivitas sitotoksik menunjukkan toksik tertinggi terdapat dari kapang 7 yaitu 19.7 ppm. Kapang ini juga mampu menginduksi apoptosis pada sel khamir dicirikan dengan frekuensi petite sebesar 90%. Nilai ini membukitkan ekstrak kloroform kapang endofit dari Evodia suaveolens memiliki daya toksiksitas yang cukup baik dan dapat menginduksi apoptosis pada model sel khamir. Saran Perlu dikaji lebih lanjut jenis kapang endofit yang diisolasi dari Evodia suaveolens, dan senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan dari masing-masing kapang. Penelitian mengenai mekanisme induksi apoptosis perlu diujikan lebih lanjut dengan isolasi DNA dan elektroforesis untuk mengetahui fragmentasi DNA, visualisasi dengan mikroskop pemindai (SEM) untuk melihat kerusakan membran, dan uji aktivitas enzim caspase yang memiliki peran penting dalam peristiwa apoptosis.
DAFTAR PUSTAKA Ahmad RZ. 2008. Pemanfaatan khamir Saccharomyces cerevisiae untuk ternak. Wartazoa 15 (1): 49-55 Algiansyah. 2009. Kemampuan ekstrak dedaunan berpotensi antioksidan untuk memodulasi apoptosis pada sel khamir [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Anand P, Sundaram C, Jhurani S, Kunnumakkara AB, Aggarwal BB. 2008. Curcumin and cancer an old-age disease with an age-old solution. Cancer Letters 267 : 133–164. Anonim. 2011. Zodia tanaman anti nyamuk [terhubung berkala] http://ccd.co.id/wpcontent/uploads/2011/02/zodia.bmp [20 Juni 2012].
12
Baraja M. 2008. Uji toksistas ekstrak daun Ficus elastica Nois ex Blume terhadap Artemia salina Leach dan profil kromatografi lapis tipis [skripsi]. Surakarta: Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Surakarta.
Kurnijasanti R, Hamid IS, Rahmawati K. 2008. Efek sitotoksis in vitro dari ekstrak buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) terhadap kultur sel kanker mieloma. J. Penelit. Med. Eksakta 7 ( 1) : 48-54.
Campbell I, Duffus JH. 1991. Yeast a practical approach. Leeds : IRL Press. Clay K. 2004. Fungi and the food of the gods. Nature 427: 401-402
Lumongga F. 2008. Apoptosis. [terhubung berkala] repository.usu.ac.id/bitstream/1 23456789/2061/1/09E01457.pdf [10 Juni 2012]
Ditjen POM. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta: Departemen Kesehatan RI
Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biology of Microorganisms. Edisi ke-9. New Jersey: Prentice Hall.
Gandjar I, Sjamsuridzal W. 2006. Mikologi Dasar dan Terapan. Ed 1. Jakarta:Yayasan Obor Indonesia
Matthias R. 2001. Cancer. First edition. Sta Clara: MR publishing
Granot D, Levine A, Dor-Hefetz E. 2003. Sugar-induced apoptosis in yeast cells. FEMS Yeast Research 4:7-13. Granot D, Snyder M. 1991. Glucose induces cAMP-independent growth related changes in stationery-phase cells of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl Acad. Sci. 88:5724-5728 Humbert et al. penemu: United States Patent Application Publication. 19 Jan 2012. Extract of Evodia suaveolens scheff repellent compositions and use thereof. US 20120015054A1 Jemal A et al. 2011. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin 61 (2): 69–90. Jiang J, Hu C. 2009. Evodiamine: A Novel Anti-Cancer alkaloid from Evodia rutaecarpa. Molecules 14: 1852-1859 Julianingsih D. 2012. Sterilisasi dan Media Mikroba. [terhubung berkala] http://tekpan.unimus.ac.id/index.php?opt ion=com_content&view=article&id=105 :sterilisasi-dan-media-mikroba-olehdewi -julianingsih&catid=34:tugas mahasiswa &Itemid=55 [4 Juni 2012] Kardinan A. 2007. Tanaman Pengusir dan Pembasmi Nyamuk. Jakarta: Agromedia Pustaka. Kumala S, Muhammad G. 2005. Isolasi dan Penapisan Kapang Endofit Tanaman Secang (Caesalpinia sappan L.) sebagai Penghasil Senyawa Antibakteri. MEDICINUS (Scientific Journal of Pharmaceutical Development and Medical Application) 21 :15 [terhubung berkala] http://lib.atmajaya.ac.id/ default.aspx?tabID=61&id=129265&src =a [28 September 2011].
Mayer A, Gustafson K. 2008. Marine Pharmacology in 2005–2006: Antitumour and Cytotoxic Compounds. European Journal of Cancer 44: 2357– 2387 Melliawati et al. 2006. Pengkajian bakteri endofit penghasil senyawa bioaktif untuk proteksi tanaman. Biodiversitas 7(3): 221-224. Meyer BN et al. 1982. Brine shrimp: a convenient general bioassay for active plants constituent. J Medical Plant Res 45:31-34. Michael L. 2003. Beating cancer with natural medicine. USA: Bloomington. Muchtadi TR, Ayustaningwarno F. 2010. Teknologi Proses Pengolahan Pangan. Bandung: Alfabeta. Murray et al. 2006. Harper’s Illustrated Biochemistry 27th Edition. USA: The McGraw-Hill Companies. Nurhasanah. 2008. Isolasi mikroba endofitik penghasil senyawa antimikroba pada tanaman ciremai (Phyllanthus acidus) dan meniran (Phyllanthus niruri). Warta Akab 19:20-32 Pelczar JR, Chan ES. 1996. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Pr. Purba CYC. 2011. Bioaktivitas ekstrak kayu teras suren (Toona sinensis Roemor) dan profil kromatografi lapis tipis fraksi aktifnya [Skripsi]. Bogor: Fakultas Kehutanan, Institut Pertanian Bogor Rejeki YS. 2011. Pengaruh kondisi kultivasi terhadap produksi antibakteri dari bakteri asam laktat asal bekasam ikan sepat rawa (Trichogaster trichopterus)
13
[Skripsi]. Bogor: Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Rizqianti AA. 2012. Ekstrak flavonoid daun salam (Syzygium polyanthum Wight.) Sebagai agen proapotosis sel khamir [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Sanger 2004, diacu dalam Ahmad Riza Zainuddin. 2008. Pemanfaatan Khamir Saccharomyces cerevisiae untuk Ternak. Wartazoa 15 (1), 49-55 Schulz B, Boyle C. 2005. The endophytic continuum. Mycol 109 (6) : 661-686 Simanjuntak P. 2011. Indonesia Gudang Mikroba Antikanker dan Antidiabetes. [terhubung berkala] http://www.biotek. lipi.go.id/index.php/news/biotek/755ind onesia-gudang-mikroba-antikanker-danantidiabetes-?PHPSESSID=275d90261d f7e82c864cb9992fb7a347 [4 Juni 2012] Simanjuntak P. et al. 2002. Produksi alkaloid kuinina oleh beberapa mikroba endofit dengan penambahan zat induser (studi mikroba endofit tanaman Cinchona sp. (2)). Majalah Farmasi Indonesia 13(1): 1-6 Strobel G, Daisy, Castillo, Harper J. 2004. Natural product from endophytic microorganism. J. Nat. Prod. 67 : 257268 Sugijanto NE, Indrayanto G, Zaini NC. 2008. Paradigma baru produksi antibiotika menggunakan jamur endofit dari tanaman Alyxia Reinwardtii [terhubung berkala] http://repo.unair.ac.id/data/ richfiles/abstrak%20EKSAK%200610% 20_upload_(81).pdf [19 Juli 2012]. Sukandar et al. 2010. Karakterisasi senyawa aktif antibakteri ekstrak air bunga kecombrang (Etlingera elatior) sebagai bahan pangan fungsional. Valensi 2 (1):333-339 Sukardiman et al. 2006. Uji antikanker dan induksi apoptosis fraksi kloroform dari daun pepaya (Carica papaya) terhadap kultur sel kanker. Media Kedokteran Hewan 22 (2): 110-113 Theantana T, Hyde S, Lurnyong. 2007. Asparaginase production by endophytic fungi isolated from some thai medical plants. KMITL Science Technology· Journ 7 (1): 13-18
[WHO] World Health Organization. 2012. Cancer [terhubung berkala]. http://www.who.int/mediacentre/factshe es/fs297/en/ [18 Juni 2012]. Widyastuti S. 2008. Uji toksisitas ekstrak daun iprih (Ficus glabella Blume) terhadap Artemia salina Leach dan profil kromatografi lapis tipis. Jurusan Farmasi Universitas Muhamadiyah Surakarta Winarno EK. 2006. Produksi alkaloid oleh mikroba endofit yang diisolasi dari batang kina Cinchona ledgeriana Moens dan Cinchona Pubescens Vahl (Rubiaceae). Jurnal Kimia Indonesia. (2):8-15 Zebua NI. 2011. Aktivitas hambatan gabungan ekstrak kunyit (Curcuma domestica Va), temulawak (Curcuma xanthorrhiza Roxb), dan Lempuyang (Zingiber zerumbet) terhadap proliferasi sel kanker usus besar HCT (ATCC-CCL 116) [Skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor
14
LAMPIRAN
15
Lampiran 1 Tabel Kapang Endofit Evodia suaveolens No Kapang 1
Tengah Putih
Warna Samping Belakang Putih Putih
Permukaan
Pola
Tidak rata
Tumbuh seperti kapas dan tersebar tidak merata
2
Putih
Putih
Putih
Tidak rata
Kapas tersebar dengan merata
3
Putih
Putih
Putih
Tidak rata
Kapas tumbuh lebat ditengah
4
Putih
Putih
Putih
Rata
Tumbuh seperti kapas dan tersebar.
5
Kehitaman
Putih
Hitam keabuan
Rata
Kapas tumbuh acak
6
Putih
Putih
Putih
Rata
Tumbuh banyak disamping samping cawan seperti kapas putih
Foto
16
7
Hijau
Hijau
Hijau
Rata
Kapas berwarna hijau yang tersebar
8
Hitam
Putih
Hitam
Rata
Seperti kapas yang tersebar merata
17
Lampiran 2 Tabel Khamir yang mengalami petite setelah perlakuan masingmasing ekstrak No. Jenis
Konsentrasi
Perlakuan 1
Kapang 1
315 ppm
2
Kapang 3
270 ppm
3
Kapang 5
400 ppm
4
Kapang 7
19.7 ppm
Foto Khamir
18
5
Kapang 8
403 ppm
6
Kontrol
Glukosa 2%
positif
7
Kontrol negatif
Akuades
19
Lampiran 3 Nilai LC50 Nomor Kapang Kapang 1
Kapang 2
Kapang 3
Kapang 4
Kapang 5
Kapang 6
Kapang 7
Kapang 8
Konsentrasi (ppm) 500 100 50 10 500 100 50 10 500 100 50 10 500 100 50 10 500 400 300 200 100 50 10 500 100 50 10 500 100 50 10 8 6 4 2 500 100 50 10
Contoh perhitungan: Kapang 3= Y= -7.765+0.1659x 50= -7.765+0.1659x X=270 ppm
Persen Udang Mati 80 20 0 0 0 0 0 0 100 10 0 0 20 10 0 0 100 20 20 0 0 0 0 20 0 0 0 100 100 100 80 20 20 10 0 60 20 10 10
Nilai LC50 (ppm) 315
-
270
-
400
-
19.7
403
20
600 500 Konsentrasi (ppm)
y = -7.765+0.1659X 400 300 200 100 0 0
20
40
60
80
Persen Udang Mati
Gambar 10 Grafik LC50 Kapang 3
100
120
21
Lampiran 4 Strategi Penelitian Isolasi dan Pemurnian Kapang Endofit Peremajaan Kapang Endofit dari Isolat Fermentasi Kapang Endofit
Ekstraksi Metabolit Sekunder Uji Sitotoksitas dengan BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) Induksi Apoptosis pada Sel Khamir
22
Lampiran 5 Induksi Apoptosis (Pembuatan Media)
Media cair YEDP dibuat dari 1% yeast ekstrak, 2% pepton, 2% glukosa, dan akuades hingga 100 ml
Pembuatan media terdiri dari media cair YEPD, media padat YEPD dan media padat petit
Media padat YEDP dibuat dari 1% yeast ekstrak, 2% pepton, 2% glukosa, 1.8% baktoagar, dan akuades hingga 100 ml
Media petit YEDP dibuat dari 1% yeast ekstrak, 2% pepton, 0.1 % glukosa, 1.8% baktoagar, etanol 2%, dan akuades hingga 100 ml
Sterilisasi autoklaf suhu 1200C, 15 menit 10 atm.
23
Lampiran 6 Perlakuan Induksi Apoptosis
Perlakuan terdiri dari ekstrak metabolit sekunder kapang endofit, glukosa 2% sebagai kontrol positif dan akuades sebagai kontrol negatif
Ekstrak kapang endofit: Tambahkan 400 µl ekstrak dengan konsentrasi LC50 dari masing-masing kapang endofit ke eppendorf seberisi 100 µl kultur sel khamir, 500 µl YEPD cair perlakuan kontrol positif: ekstrak kapang endofit diganti dengan glukosa 2% perlakuan kontrol negatif : ekstrak kapang endofit diganti akuades 400 µl
Ekstrak dihomogenisasi terlebih dahulu, kemudian diinkubasi pada 37°C selama 24 jam.
24
