SITOTOKSISITAS TERHADAP SEL HeLa DAN IDENTIFIKASI TAKSOL PADA METABOLIT SEKUNDER KAPANG ENDOFIT Taxus sumatrana
AFFAN IQBAL
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Sitotoksisitas terhadap sel HeLa dan Identifikasi Taksol pada Metabolit Sekunder Kapang Endofit Taxus sumatrana adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Maret 2015
Affan Iqbal NIM G84080022
ABSTRAK AFFAN IQBAL. Sitotoksisitas terhadap sel HeLa dan Identifikasi Taksol pada Metabolit Sekunder Kapang Endofit Taxus sumatrana. Dibimbing oleh HASIM dan I MADE ARTIKA. Taxus sumatrana adalah tanaman langka yang diketahui ekstrak batangnya mengandung Taksol, suatu senyawa antikanker. Faktor kelangkaan populasi tanaman T. sumatrana ini menjadi alasan pemanfaatkan kapang endofitnya untuk memproduksi taksol. Tujuan penelitian ini adalah menguji aktivitas sitotoksik metabolit sekunder hasil fermentasi kapang endofit tanaman T. sumatrana terhadap sel HeLa dan mengidentifikasi keberadaan senyawa Taksol pada metabolit tersebut. Sebanyak 9 isolat kapang endofit berhasil diisolasi dari batang tanaman T. sumatrana. Setelah melalui proses fermentasi pada medium PDB selama 3 pekan, campuran ekstrak diklorometana media cair (PDB) hasil fermentasi kapang endofit tanaman T. sumatrana dan ekstrak etanol 80 % dari biomassanya, diuji aktivitas sitotoksik dan dilakukan identifikasi keberadaan senyawa Taksol pada campuran ekstrak tersebut. Campuran ekstrak dengan label kapang 3, 5, dan 7 memiliki aktivitas sitotoksik dengan nilai LC50 terhadap larva udang Artemia salina Leach berturut-turut 13.03 ppm, 3.08 ppm, dan 74.88 ppm. Ekstrak kapang label 3, 5, dan 7 terbukti menghambat pertumbuhan sel kanker Serviks (HeLa) pada uji MTT dengan nilai inhibisi pada kisaran 50 %. Pada uji LC-MS, Ekstrak kapang tidak mengandung Senyawa Taksol. Kata kunci: kapang endofit, metabolit sekunder, sitotoksik, taksol, T. sumatrana ABSTRACT AFFAN IQBAL. Cytotoxicity againt HeLa cells and Identification of Taxol on Secondary Metabolites of Taxus sumatrana’s Endophytic Fungus Supervised by HASIM and I MADE ARTIKA. Taxus sumatrana is a rare plant that it's stem can produce taxol, an anticancer compound. Scarcity of the plant become the reason for using of it's endophyte fungus to produce Taxol. The purpose of this research is to test the cytotoxicity againts HeLa cells of Secondary Metabolites of Taxus sumatrana’s Endophytic fungus and to identify the presence of Taxol. A total of 9 isolates of endophytic fungi were isolated from the stems of the plant Taxus sumatrana. After going through the process of fermentation in PDB medium for 3 weeks, a mixture of dichloromethane extract liquid medium (PDB) and 80 % ethanol extract of biomass, tested cytotoxic activity and to identify the presence of Taxol compounds in the extract mixture. Extract mixture with fungi label 3, 5, and 7 have cytotoxic activity in BSLT test with LC50 values 13:03 ppm 3:08 ppm and 74.88 ppm. Extract fungi label 3, 5, and 7 shown to inhibit the growth of cervical cancer cells (HeLa) in MTT test with inhibition values in the range of 50 %. At LC-MS test, no Taxol compound detected Keyword : cytotoxic, endophytic fungi, secondary metabolite, taxol, Taxus sumatrana,
SITOTOKSISITAS TERHADAP SEL HeLa DAN IDENTIFIKASI TAKSOL PADA METABOLIT SEKUNDER KAPANG ENDOFIT Taxus sumatrana
AFFAN IQBAL
Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
Judul Skripsi : Sitotoksisitas terhadap sel Hela dan Identifikasi Taksol pada Metabolit Sekunder Kapang Endofit Taxus sumatarana. Nama : Affan Iqbal NIM : G84080022
Disetujui oleh
Dr. drh. Hasim, DEA Pembimbing I
Dr. Ir. I Made Artika M.App. Sc Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr.Ir. I Made Artika, M.App. Sc Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, Sang Maha Pembolak-balik Hati. Dengan Kuasa dan Karunia-Nya telah memberikan pada penulis kemantapan hati dan kekuatan tekad untuk menghadapi segala hambatan dan rintangan sehingga proses penyusunan Skripsi ini dapat terselesaikan. Sholawat serta salam semoga terlimpahkan kepada junjungan nabi besar Muhammad SAW, yang secara tidak langsung membimbing penulis untuk selalu berkarya demi kemaslahatan umat manusia. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. drh Hasim, DEA sebagai dosen pembimbing utama dan Dr. Ir. I Made Artika,M.App.Sc sebagai pembimbing kedua yang banyak memberi bimbingan dan arahan kepada penulis dalam melakukan penulisan dan penelitian. Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada DIKTI melalui program PKMP (Program Kreativitas Mahasiswa Penelitian) telah mendanai penelitian ini dengan judul Produksi Taxol dengan Kemurnian Tinggi melalui Pemanfaatan Kapang Endofit Tanaman Taxus sumatrana untuk Skala Industri atas nama Affan Iqbal, Mujiburrahman, dan Muhammad Syukri. Terima kasih kepada kedua orang tua dan keluarga yang selalu memberikan dukungan, perhatian dan doa yang sangat berarti bagi penulis. Terima kasih kepada rekan-rekan selama penelitian, Azmi, Ridho, Kak Mujib, Bambang, Wira, Bobbi dan seluruh teknisi laboratorium atas masukan, saran, dan kritik yang membantu dalam penelitian ini. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada seluruh sahabat seperjuangan di Biokimia 45, teman-teman sebimbingan Puji dan Daviq, teman-teman satu lab Laita, Ines, Didit, Aros Anisa Utami, Yoan, Dian, Rian, Daniel, Vita, teman-teman Crebs Akos, Tati, Esti, Ihsan, Ucup, keluarga Resimen Mahasiswa IPB, kawan-kawan Pendekar PPSDMS Bogor, sedulur PAD 45, dan seluruh sahabat penulis yang tidak dapat disebutkan satu-persatu atas segala bantuan, motivasi dan semangat yang diberikan. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi para pembaca dan dapat berkontribusi dalam kemajuan ilmu pengetahuan khususnya di bidang biokimia. Bogor, Maret 2015
Affan Iqbal
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vii
DAFTAR GAMBAR
vii
DAFTAR LAMPIRAN
vii
PENDAHULUAN
1
METODE PENELITIAN
2
Bahan
2
Alat
2
Prosedur Penelitian
2
HASIL
5
Isolat Kapang Endofit
5
Ekstrak kapang endofit tanaman T. sumatrana.
6
Toksisitas terhadap Larva Udang A. salina Leach (BSLT)
6
Sitotoksisitas terhadap sel HeLa
8
Identifikasi senyawa dengan LC-MS
8
PEMBAHASAN
10
Isolat kapang endofit dan ekstrak metabolit sekunder
10
Toksisitas terhadap larva udang A. salina Leach (BSLT)
11
Sitotoksisitas terhadap sel HeLa
12
Identifikasi senyawa dengan LC-MS
13
SIMPULAN DAN SARAN
16
Simpulan
16
Saran
16
DAFTAR PUSTAKA
17
LAMPIRAN
19
RIWAYAT HIDUP
30
DAFTAR TABEL 1 Bobot campuran ekstrak diklorometana 1:1 (media PDB) dan ekstrak etanol 80 % (biomassa kapang endofit Taxus sumatrana) hasil fermentasi. 2 Persentase (%) kematian larva udang A. salina setelah ditambahkan ekstrak fermentasi kapang endofit Taxus sumatrana dalam waktu 24 jam 3 Nilai LC50 ekstrak 1,3,5, dan 7 . 4 Sitotoksisitas dengan Metode MTT campuran ekstrak diklorometana media cair hasil fermentasi kapang endofit tanaman Taxus sumatrana dan ekstrak etanol 80 % dari biomassanya terhadap pertumbuhan sel HeLa
6
6 7
8
DAFTAR GAMBAR 1 Kapang endofit hasil isolasi dari batang tanaman Taxus sumatrana pada media PDA 2 Kurva Hasil Uji Toksisitas BSLT Larva udang A. salina terhadap ekstrak kapang endofit 3 Spektrum LC-MS massa senyawa yang terkandung dalam ekstrak kapang Taxus sumatrana label kapang 3 (waktu retensi: 13±0.1 menit) 4 Spektrum LC-MS massa senyawa yang terkandung dalam ekstrak kapang Taxus sumatrana label kapang 5 (waktu retensi: 15±0.1 menit) 5 Spektrum LC-MS massa senyawa yang terkandung dalam ekstrak kapang Taxus sumatrana label kapang 7 (waktu retensi: 11±0.1 menit) 6 Spektrum LC-MS massa senyawa yang terkandung dalam ekstrak kapang Taxus chinensis(waktu retensi : 16.3 ±0.1 menit) (Guo et al. 2006 7 Spektrum massa Taksol (waktu retensi : 16.3 ±0.1 menit) (Guo et al. 2006
5 7 9 9 10
13 14
DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Strategi Penelitian Bagan Alir Isolasi dan Pemurnian Kapang Endofit Bagan Alir Proses Fermentasi dan Ekstraksi metabolit Sekunder Kapang Endofit Bagan Alir Proses Uji BSLT Perhitungan LC50 BSLT Tabel Lengkap Hasil Uji MTT Dokumentasi Foto Fermentasi dan Ekstraksi Dokumentasi Foto sel HeLa Perkiraan molekul yang terkandung pada ekstrak kapang endofit tanaman T. sumatrana
21 22 23 24 25 26 27 28 29
1
PENDAHULUAN Tiap tahun penderita kanker di Indonesia terus bertambah. Berdasarkan data rangkuman hasil seluruh pusat patologi di Indonesia mulai tahun 2005 hingga 2009, pasien positif penderita kanker yang tercatat mengalami penambahan ratarata sekitar 2000 penderita pertahun. Tercatat sebanyak 13374 penderita kanker pada tahun 2005 naik menjadi 22647 penderita pada tahun 2009 (Yayasan Kanker Indonesia, 2009). Sumber lain adalah dari data Departeman Kesehatan RI (2008) yang disajikan dalam Profil Kesehatan Indonesia Tahun 2008, pada tahun 2007 prevalensi penyakit kanker di Indonesia mencapai 0.43 %, tiap tahunnya terjadi 200.000 kasus baru yang dilaporkan. Besarnya jumlah penderita kanker berhubungan erat dengan besarnya kebutuhan akan obat penyembuhnya. Pengobatan utama saat ini untuk penyakit kanker adalah operasi dan terapi kimia (Chemotherapy) (DeVita dan Walker 2008). Terapi kimia bertujuan untuk menuntaskan pembersihan sel-sel kanker setelah operasi. Dalam terapi kimia digunakan senyawa Paclitaxel. Paclitaxel merupakan nama generik dari merek dagang Taxol produksi perusahaan Bristol Myer Squibb (NCI 2015). Obat ini cukup mahal dengan harga sekitar Rp.1 juta tiap 30 mg. Mahalnya Paclitaxel/Taksol karena produk ini merupakan produk impor dan proses produksi yang sulit. Dengan kondisi seperti ini, diperlukan usaha untuk memproduksi obat ini secara mandiri untuk menekan harga sehingga dapat meringankan beban para penderita kanker di Indonesia. Indonesia berpotensi untuk bisa memproduksi Taksol secara mandiri. Terdapat tanaman yang tumbuh di indonesia yaitu Taxus sumatrana yang berpotensi menghasilkan senyawa Taksol. Trisnamurti et al. (2003) dalam Artanti et al. (2003) berhasil mengidentifikasi senyawa Taksol yang diekstrak dari batang tanaman T. Sumatrana dengan menggunakan LC-MS (Kromatografi Cair – Spektrofotometri Massa). Permasalahannya adalah jika senyawa Taksol langsung diekstrak dari pohonnya akan mengganggu populasi karena tanaman ini tergolong tanaman langka di habitatnya (Rachmat 2008). Pemanfaatan kapang endofit dapat menjadi pilihan solusi untuk memproduksi senyawa Taksol dari tanaman T. sumatrana. Kapang endofit hidup di dalam jaringan tumbuhan inang dan dapat menghasilkan metabolit sekunder yang sama atau mirip dengan tanaman inangnya (Strobe et al. 2004). Hal ini dapat menjawab permasalahan langkanya tanaman T. sumatrana di habitatnya. Selain itu pengembangan kapang endofit memiliki prospek yang menjanjikan ke arah industri yang ramah lingkungan, biaya produksi rendah serta terjamin mutu dan kontinuitas produksinya (Margono 2008). Pada penelitian ini dilakukan isolasi metabolit sekunder dari kapang endofit yang ditumbuhkan dari tanaman Taxus sumatrana, uji aktivitas antikanker, serta identifikasi senyawa antikanker dari metobolit sekunder yang didapat. Penelitian ini bertujuan untuk menguji aktivitas sitotoksik metabolit sekunder hasil fermentasi kapang endofit tanaman T. sumatrana terhadap sel HeLa dan mengidentifikasi keberadaan senyawa Taksol pada metabolit tersebut. Manfaat dari penelitian adalah diketahuinya aktivitas sitotoksik dan kandungan senyawa yang terdapat pada metabolit sekunder hasil produksi kapang endofit tanaman Taxus sumatrana.
2
METODE PENELITIAN Bahan Bahan utama pada penelitian adalah tumbuhan T. sumatrana yang berasal dari Kebun Raya Cibodas Bogor. Tanaman ini diambil dari bagian batang untuk diisolasi kapang endofitnya. Bahan-bahan lain yang digunakan adalah PDA, PDB, etanol 70 %, etanol 80 %, etanol 99 %, diklorometana 99 %, larva udang, air laut, sel kanker, pereaksi MTT, DMSO, dalam HCl 0.1 N, dan akuades. Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sentrifus Beckman J 21, kertas alumunium, laminar air flow cabinet, penangas air, lemari es, neraca analitik, mikropipet, tabung Eppendorf, jarum Ose, kaca sebar, autoklaf, kapas, vortex, dan seperangkat alat gelas, seperangkat plate BSLT, aerator, 96-well plate, microplate reader, seperangkat instrumen analisis MTT assay, dan LC-MS Biospectrometry sistem ESI (Electrospray Ionisation). Prosedur Penelitian Penelitian dilakukan dengan metode eksperimen laboratorium dengan menguji aktifitas sitotoksik ekstrak kapang endofit yang disolasi dari batang tanaman T. sumatrana. Setelah diperoleh ekstrak kapang yang berpotesi memiliki aktifitas sititoksik, selanjutnya dilakukan identifikasi senyawa yang terkandung dalam ekstrak dengan instrument LC-MS untuk mendapatkan berat molekul senyawa dalam ekstrak. Berat molekul yang didapat akan dibandingkan dengan berat molekul senyawa antikanker Taksol (Paclitaxel) komersil. Secara sistematis metode penelitian ini terdiri atas isolasi dan pemurnian kapang endofit, peremajaan kapang, penumbuhan kapang pada media cair, ekstraksi crude metabolit dari media cair, penapisan awal dengan uji toksisitas BSLT (Brine Shrimp Letality Test), uji potensi antikanker dengan MTT Assay, dan identifikasi senyawa taksol dengan LC-MS. Alur metodologi dapat dilihat pada Lampiran 1. Penelitian ini pada tahap isolasi kapang endofit sampai uji BSLT dilakukan di Laboratorium Departemen Biokimia IPB pada bulan April-Oktober 2012, sedangkan uji MTT dilakukan di Laboratorium Pusat Studi Satwa Primata IPB pada bulan Maret 2013 dan tahap identifikasi senyawa dengan instrumen LCMS dilakukan di Laboratorium Kimia Puspitek Serpong pada bulan November 2012. Isolasi dan pemurnian kapang endofit (Croizer et al. 2006) Batang tanaman T. sumatrana dengan panjang 2 cm dan lebar 1 cm diambil dari pangkal, tengah dan ujung tanaman, dicuci dengan air mengalir, lalu dicelupkan berturut-turut ke dalam etanol 70 % selama 1 menit, natrium hipoklorit 5,3 % selama 5 menit, dan etanol 75 % selama 0,5 menit. Di dalam laminar, bagian batang dibelah dua secara longitudinal, lalu diletakkan di atas cawan Petri berisi Media PDA yang telah dicampur dengan kloramfenikol 0,05 mg/mL, selanjutnya diinkubasi selama 3 hari pada suhu 25 oC. Setelah 3 hari koloni yang
3
tumbuh dipindahkan ke Media PDA baru untuk diinkubasi kembali pada temperatur yang sama. Pengecekan koloni baru dilakukan setiap 24 jam untuk pemurnian lebih lanjut. Peremajaan Kapang Endofit dari Isolat (Pelczar dan Chan 2008) Inokulasi isolat kapang endofit dilakukan secara aseptis di dalam laminar. Laminar terlebih dahulu disterilkan dengan penyinaran sinar ultraviolet selama 1 jam kemudian seluruh bagian dalam laminar dan bagian luar kaca disemprot dengan etanol teknis. Isolat kapang endofit dari agar miring diinokulasi ke dalam media PDA kemudian diinkubasi selama 3 hari pada suhu kamar. Setelah tumbuh, kapang disimpan kembali dalam agar miring untuk stok penyimpanan selama 3 bulan pada suhu -20 oC. Penumbuhan Kapang Endofit pada Media Cair (modifikasi Guo et al. 2006) Isolat kapang yang telah diremajakan masing-masing diinokulasikan ke dalam labu Erlenmeyer berisi 250 ml media PDB. Tiap labu Erlenmeyer dibiarkan pada suhu kamar selama 21 hari (Fermentasi statis). Tiap 3 atau 4 hari tabung dikocok agar udara diatas media dalam tabung tersebar merata. Ekstraksi Metabolit (modifikasi Guo et al. 2006) Setelah dilakukan tahap penumbuhan kapang (Fermentasi statis), media cair dan miselia dipisahkan dengan sentrifugasi dengan kecepatan 3000 g selama 10 menit. Pelet yang merupakan miselia kemudian diresuspensi dengan dengan 100 ml etanol dan digerus dengan glass bead selama 20 menit. Sentrifugasi dilakukan kembali dengan kecepatan dan waktu yang sama untuk mengambil supernatannya. Media cair kultur awal (setelah dipisahkan dengan miselia) diekstraksi dengan diklorometana pada volume yang sama (250 ml) sebanyak dua kali. Fase organik yang didapat kemudian dicampurkan dengan supernatan miselia. Campuran tersebut kemudian diuapkan pada suhu ruang hingga tertinggal residunya. Bobot ekstrak diperoleh dari selisih antara bobot botol kosong dan bobot botol berisi ekstrak. Ekstrak didalam botol dipindahkan ke vial yang lebih kecil dengan dilarutkan terlebih dahulu dengan 1 ml metanol. Stok ekstrak disediakan dalam bentuk residu kering dan dapat dilarutkan kembali saat akan digunakan dalam ujiuji selanjutnya. Uji Toksisitas Ekstrak terhadap A. salina Leach (modifikasi Mc Laughlin et al. 1998) Penetasan kista A. salina Leach. Kista A. salina Leach diperoleh dari Pusat Studi Biofarmaka IPB. Kista ditimbang sebanyak 20 mg kemudian dimasukkan ke dalam wadah khusus yang berisi air laut yang sudah disaring, setelah diaerasi kista dibiarkan selama 48 jam dibawah pencahayaan lampu pijar 25 watt agar menetas sempurna. Larva yang sudah menetas dan memiliki motilitas yang baik (sehat) diambil untuk digunakan dalam uji toksisitas.
4
Uji toksisitas terhadap A. salina Leach. Sebanyak 10 ekor larva A. salina Leach yang sehat (berdasarkan motilitas dan kemampuan larva mencari cahaya) dimasukkan ke dalam vial uji yang berisi 100 μL air laut. Larutan ekstrak kapang ditambahkan pada masing-masing vial uji dengan konsenterasi larutan uji terdiri atas 10, 100, 500 dan 1000 ppm sedangkan untuk kontrol tidak ditambahkan larutan ekstrak. Masing-masing dibuat dua ulangan. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam dengan menghitung jumlah larva yang mati dari total larva yang dimasukkan dalam vial uji. Penghitungan memakai bantuan kaca pembesar. Pada uji ini keluaran yang didapat adalah nilai LC50 pada ekstrak metabolit yang diuji. Untuk memperoleh LC50 pada BSLT sebelumnya harus didapat nilai % mortalitas (kematian) larva udang terhadap ekstrak. % Mortalitas =
𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑙𝑎𝑟𝑣𝑎 𝑚𝑎𝑡𝑖 𝑥100 % 𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑙𝑎𝑟𝑣𝑎 𝑢𝑗𝑖
Grafik antara log konsentrasi terhadap % mortalitas dibuat sehingga diperoleh persamaan regresi linier y = ax + b. Nilai LC50 diperoleh dengan memasukkan nilai y = 50, maka diperoleh konsentrasi senyawa uji yang menyebabkan kematian 50 % larva. Uji Potensi antikanker dengan MTT Assay ( modifikasi Kumala et al . 2009) Kultur sel kanker leher rahim (HeLa) yang telah konfluen yaitu kondisi sel yang telah merata sebagai sel monolayer sampai menutupi tissue disk, dipanen dan dipindahkan ke dalam sumur uji (5000 sel/sumur). Selama 24 jam, normalisasi sel dilakukan dengan inkubasi sel di dalam inkubator CO2 5% sehingga sel siap untuk diberi perlakukan. Inkubator CO2 5% digunakan untuk menciptakan lingkungan yang optimal bagi pertumbuhan sel. Sel kemudian dicuci dengan PBS (Phosphat Buffer Saline). Pencucian dilakukan dengam cara menambahkan PBS 100 μL pada semua sumur kemudian PBS tersebut dibuang dengan membalikkan plate sumur . Tahap selanjutnya adalah perlakuan sampel secara triplo dengan seri konsentrasi 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm, 12.5 ppm, 6.25 ppm, 3.125 ppm dan 1.562 ppm. Selanjutnya, sel diinkubasi selama 48 jam dalam inkubator CO2 5% kemudian ditambahakan pereaksi MTT (3-(4,5-dimetiltiazol2-il)-2,4-difenil tetrazolium bromida) 0,5 mg/mL PBS sebanyak 10 μL/sumur selama 4 jam pada suhu 37o C sampai terbentuk kristal formazan. Sel yang hidup akan mengkonversi reagen MTT menjadi kristal formazan yang berwarna biru tua. Setelah formazan terbentuk, reaksi dihentikan dengan stopper 100 μL SDS 10% dalam 0,1 N HCl. Formazan yang terbentuk dilarutkan dalam 100 μL etanol 96%. Nilai absorbansi atau Optical Density (OD) tiap sumur diukur dengan microplate reader pada λ 562 nm. Keluaran yang diperoleh adalah nilai inhibisi ekstrak uji terhadap pertumbuhan sel kanker HeLa pada konsentrasi tertentu. % Inhibisi =
(𝑅𝑎𝑡𝑎𝑎𝑛 𝑂𝐷 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 − 𝑅𝑎𝑡𝑎𝑎𝑛 𝑂𝐷 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙) 𝑥100 % (𝑅𝑎𝑡𝑎𝑎𝑛 𝑂𝐷 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙)
5
Identifikasi berat molekul senyawa ekstak dengan LC-MS (Modifikasi Ballero et al. 2003.) Analisis LC-MS dilakukan dengan menggunakan instrumen Biospektrometri Mariner LC: Hitachi L 6200 yang dilengkapi dengan pompa biner. Instrumen tersebut dikombinasikan dengan sistem ESI (Electrospray Ionisation). Spesifikasi kolom HPLC untuk analisis adalah Supelco 5μ C18, 250 × 2 mm i.d. Pelarut atau solvent yang digunakan ada dua yaitu solvent A dan B. Solvent A adalah air dengan 0.3 % asam asetat, dan solvent B adalah metanol dengan 0.3% asam asetat. Solvent diaplikasikan pada kecepatan alir 0.5 mL/min. Volume injeksi sampel sebanyak 20 μL. Elusi dilakukan dengan cara isokratik yaitu elusi yang menggunakan perbandingan komponen pelarut yang tetap dari awal sampai dengan akhir proses.
HASIL Isolat Kapang Endofit Kapang endofit mulai tumbuh setelah masa inkubasi selama tiga hari, di sekitar media tumbuh kapang-kapang dengan variasi warna dan bentuk hifa. Pemurnian dilakukan untuk memperoleh beberapa isolat yang dibedakan berdasarkan warna, bentuk, dan morfologi hifa kapang. Pada tahapan ini diperoleh 9 isolat kapang endofit yang berbeda (Gambar 1). Kesembilan kapang tersebut diberi label dengan penomoran 1 hingga 9 untuk keperluan tahapan selanjutnya. Secara morfologi kapang berbeda dengan bakteri. Pada media agar, bakteri akan tumbuh sebagai materi berlendir sedangkan kapang tidak berlendir, maka dapat dipastikan organisme tak berlendir yang tumbuh pada media PDA tersebut adalah kapang.
Gambar 1 Kapang endofit hasil isolasi dari batang tanaman Taxus sumatrana pada media PDA
6
Ekstrak kapang endofit tanaman T. sumatrana. Berdasarkan prosedur penilitian, ekstrak diperoleh dari hasil fermentasi kapang endofit dalam 250 mL media cair PDB. Ekstrak tersebut merupakan campuran dari dua ekstrak yaitu ekstrak diklorometana 1:1 media fermentasi (media cair PDB) dan ekstrak 80 % etanol biomassa kapang. Berikut ini adalah sajian data hasil ekstrak kapang label 1 hingga 9 yang diperoleh dari penimbangan campuran ekstrak yang telah diuapkan (Tabel 1). Tabel 1 Bobot campuran ekstrak diklorometana 1:1 (media PDB) dan ekstrak etanol 80 % (biomassa kapang endofit T. sumatrana) hasil fermentasi. No Kapang
Bobot (g/250 ml kultur)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0.224
0.463
0.516
0.344
0.36
0.254
0.197
0.427
0.33
Kesembilan kapang menghasilkan bobot ekstrak yang bervariasi. Bobot ekstrak paling kecil adalah ekstrak kapang label 1 yaitu 0.224 gram dan yang paling besar adalah ekstrak kapang label 3 dengan bobot 0.516 gram. Toksisitas terhadap Larva Udang A. salina Leach (BSLT) Berikut ini adalah data presentase kematian larva udang A. salina Leach terhadap masing-masing ekstrak kapang (Tabel 2). Parameter kematian larva udang dilihat dari motilitasnya. Larva udang yang masih aktif bergerak setelah masa inkubasi dihitung hidup dan yang tidak bergerak dihitung mati. Tabel 2 Persentase (%) kematian larva udang A. salina setelah ditambahkan ekstrak fermentasi kapang endofit T. sumatrana dalam waktu 24 jam Konsentrasi (ppm)
No kapang 10
50
100
500
1
0
5
25
95
2
0
0
0
0
3
45
70
80
100
4
0
0
0
0
5
60
80
90
100
6
0
0
0
0
7
0
45
60
90
8
0
0
0
0
9
0
0
0
0
7
% Mortalitas
Perolehan data persentase mortalitas larva udang terhadap masing-masing ekstrak dikelompokkan menjadi dua. Kelompok pertama adalah ekstrak dengan label 1,3,5, dan 7 yang memiliki bioaktivitas karena dapat menyebabkan kematian larva udang pada variasi konsentrasi ekstrak yang diujikan. Kelompok kedua adalah ekstrak dengan label 2, 4, 6, 8, dan 9 yang tidak memiliki bioaktivitas karena tidak dapat menyebabkan kematian larva udang pada semua variasi konsentrasi ekstrak yang diujikan. Kelompok ekstrak yang memiliki bioaktivitas diolah lebih lanjut untuk dicari nilai LC50-nya. Dibuat kurva garis antara Log K (konsentrasi) dan % mortalitas larva udang untuk mencari persamaan garis linier dari keempat ekstrak yang memiliki aktivitas sitotoksik terhadap larva udang A. salina Leach (Gambar 2). 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -10 0
y1 = 47.101x2 - 117.32x + 69.991 y3 = 32.535x + 13.723
kapang 1
y5 = 23.948x + 38.315
kapang 3
y7 = 53.096x - 49.212
kapang 5 kapang 7
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Log K
Gambar 2 Kurva Hasil Uji Toksisitas BSLT Larva udang A. salina terhadap ekstrak kapang endofit Nilai LC50 masing-masing ekstrak diperoleh dengan memasukkan nilai y = 50 dari persamaan garis tersebut. Nilai LC50 berturut-turut dari ekstrak kapang label 1, 3. 5, dan 7 adalah 202 ppm, 13 ppm, 3 ppm, dan 75 ppm (Tabel 3). Tiga ekstrak dengan toksisitas tertinggi yaitu 3, 5, dan 7 dipilih untuk diujikan pada uji-uji selanjutnya. Tabel 3 Nilai LC50 ekstrak 1,3,5, dan 7 no ekstrak kapang 1 3 5 7
LC50 (ppm) 202.7 13.03 3.08 74.88
8
Sitotoksisitas terhadap sel HeLa Tiga ekstrak kapang dengan toksisitas tertinggi yang telah melalui proses penapisan awal BSLT yaitu ekstrak kapang 3, 5, 7 diuji aktivitas sitotoksiknya dengan MTT menggunakan sel Kanker Serviks (HeLa). Hasil uji MTT ini disajikan dalam Tabel 4 dibawah ini. Tabel 4 Sitotoksisitas campuran ekstrak diklorometana media cair hasil fermentasi kapang endofit tanaman T. sumatrana dan ekstrak etanol 80 % dari biomassanya terhadap pertumbuhan sel HeLa No ekstrak kapang
Konsentrasi (ppm)
Rata-rata OD (Optical Density)
% Inhibisi
3
100 50 25 12.5 6.25 3.125 1.562 100 50 25 12.5 6.25 3.125 1.562 100 50 25 12.5 6.25 3.125 1.562
0.305 0.371 0.482 0.563 0.678 0.679 0.727 0.368 0.553 0.587 0.591 0.588 0.64 0.728 0.413 0.588 0.538 0.674 0.664 0.527 0.687
58.2 49 33.8 22.7 6.87 6.68 0.14 49.5 24.1 19.4 18.8 19.3 12.1 0 43.3 19.2 26.1 7.4 8.7 27.7 5.7
5
7
Identifikasi senyawa dengan LC-MS Berikut hasil identifikasi massa senyawa yang terkandung pada campuran ekstrak diklorometana media cair hasil fermentasi kapang endofit tanaman Taxus sumatrana dan ekstrak etanol 80 % dari biomassanya dari ekstrak label 3, 5, dan 7.
9
Mariner Spec /69:70 (T /2.60:2.64) -58:60 (T -2.60:2.64) ASC=>NR(2.00)[BP = 144.1, 236]
144.1148
100
235.9
90
% Intensity
80 70 60
50 40 30 261.1074
20
10 0
70.0536
381.0353
287.0695 235.1097
156.0575 162.1152
381.9480
262.0260 231.2
39.0
461.0418
545.9370
423.4
645.0809 615.6
928.4733 0 1000.0
807.8
Mass (m/z)
Gambar 3 Spektrum LC-MS massa senyawa yang terkandung dalam ekstrak kapang Taxus sumatrana label kapang 3 (waktu retensi: 13±0.1 menit) Mariner Spec /63:64 (T /2.37:2.41) -53:54 (T -2.37:2.41) ASC=>NR(2.00)[BP = 230.8, 17]
230.8483
100
16.8
90
257.9504
% Intensity
80 70 60 50 40
175.0561
30
244.8524 20 221.9170 10 0 39.0
144.0916 163.1316 93.9499
232.9130 231.7902 231.2
299.9210 327.9062
380.7608 397.9928 403.9853
476.7711
423.4
569.3934 615.6
649.5279
750.7224
869.0921
807.8
Mass (m/z)
Gambar 4 Spektrum LC-MS massa senyawa yang terkandung dalam ekstrak kapang Taxus sumatrana label kapang 5 (waktu retensi: 15±0.1 menit) Ekstrak kapang label 3 mengandung satu senyawa dengan kelimpahan terbanyak yaitu senyawa dengan berat molekul 144.11 m/z (Gambar 3). Senyawa-senyawa lain dengan kelimpahan yang lebih kecil juga terdeteksi. Senyawa-senyawa tersebut memiliki berat molekul antara 70 m/z hingga 381 m/z. Satuan m/z adalah satuan yang umum digunakan dalam penentuan massa senyawa berdasarkan analisis LC-MS. Huruf “m” menunjukkan jumlah massa atom yang terkandung dalam senyawa dan huruf “z” adalah muatan ion (McNaught dan Wilkinson 1997). Pada Gambar 4, ekstrak kapang label 5 mengandung 2 senyawa dengan kelimpahan terbanyak yaitu senyawa dengan berat molekul 230.8 m/z dan 257 m/z. Senyawa - senyawa lain dengan kelimpahan yang lebih kecil memiliki berat molekul antara 144 m/z hingga 380 m/z. Selanjutnya pada Gambar 5, ekstrak kapang label 7 teridentifikasi 3 senyawa
0
1000.0
10
yang paling melimpah, yaitu senyawa dengan berat molekul 234.85 m/z 207.19 m/z dan 332.82 m/z. Senyawa-senyawa lain dengan kelimpahan yang lebih kecil teridentifikasi memiliki berat molekul antara 136 m/z hingga 392 m/z. Perlu diketahui bahwa berat molekul yang tersaji pada spektrum adalah berat molekul sebenarnya ditambah ion H+ . maka apabila terbaca 144 m/z artinya bobot molekulnya adalah 143 + ion H+. Mariner Spec /57:58 (T /2.14:2.18) -51:53 (T -2.14:2.18) ASC=>NR(2.00)[BP = 234.9, 12]
234.8545
100
11.8
90 80
% Intensity
207.1998
70 60
332.8254
50 40 30 20 10 0
316.8420
218.9107
136.9760 42.4047
39.0
138.9749
236.9127 208.1824 231.2
278.8593 281.2355
392.7535 380.9492 353.2385 430.7004
506.2779
569.4071
657.2227 742.6446
615.6
807.8
423.4
836.0870
923.6250
Mass (m/z)
Gambar 5 Spektrum LC-MS massa senyawa yang terkandung dalam ekstrak kapang Taxus sumatrana label kapang 7 (waktu retensi: 11±0.1 menit)
PEMBAHASAN Isolat kapang endofit dan ekstrak metabolit sekunder Kapang endofit adalah jenis kapang yang hidup dalam jaringan makhluk hidup lainnya (Margono 2008). Kapang endofit diketahui mampu memproduksi metabolit sekunder dengan diversitas yang tinggi. Dalam dua dasawarsa belakangan ini, berbagai golongan metabolit sekunder seperti alkaloid, terpenoid, kuinon, turunan isokumarin, fenilpropanoid, fenolik, dan senyawa alifatik berhasil diisolasi dari kultur in vitro kapang endofit (Tan dan Zou 2001; Zhang et al. 2006). Produksi metabolit sekunder kapang endofit tergolong unik, sebab kapang ini mampu meniru metabolit yang diproduksi oleh inangnya (Strobe et.al 2004). Target kapang endofit yang diisolasi pada penelitian ini adalah dari tanaman Taxus sumatrana. Ekstrak batang T. sumatrana diketahui memiliki potensi antikanker dan senyawa Taksol berhasil diidentifikasi dari ekstrak tanaman tersebut (Trisnamurti et al. 2003 dalam Artanti et al. 2003). Stierle et al. (1993) dalam penelitiannya berhasil memproduksi taksol secara in vitro dengan kapang endofit Taxomyces andreanae yang berasosiasi dengan tumbuhan Taxus brevifolia. Guo et al. (2006) juga berhasil mengidentifikasi senyawa taksol yang diekstrak dari kapang endofit hasil isolasi dari tanaman T. chinensis. Pada penelitian ini, isolasi kapang endofit dilakukan pada batang tanaman T. sumatrana. Hal ini berdasarkan pada penelitian Artanti et al. (2003) bahwa ekstrak T. sumatrana yang memiliki aktivitas antikanker terbaik adalah pada
0
1000.0
11
batangnya, dibandingkan dengan bagian tanaman lainnya yaitu ranting dan daun. Penggunaan Kloramfenikol pada media penumbuhan kapang bertujuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri, karena targetnya adalah kapang. Dari batang tanaman, setelah melalui tahap pemurnian, diperoleh 9 kapang yang berbeda morfologi dan warnanya (Gambar 1). Dengan adanya perbedaan morfologi, warna, dan bentuk hifa kapang, diasumsikan akan menghasilkan variasi hasil metabolit yang diproduksinya. Tahap selanjutnya adalah produksi metabolit sekunder dengan metode fermentasi statis. Kapang-kapang yang sebelumnya tumbuh pada media PDA diinokulasikan pada media cair PDB. Metabolit sekunder adalah senyawa metabolit yang tidak esensial bagi pertumbuhan namun penting untuk kelangsungan organisme dari ancaman lingkungannya. Metabolit sekunder dapat ditemukan dalam bentuk yang unik atau berbeda-beda antara spesies yang satu dan lainnya. Senyawa ini tidak selalu dihasilkan, tetapi hanya pada saat dibutuhkan saja atau pada fase-fase tertentu. Fungsi metabolit sekunder adalah untuk mempertahankan diri dari kondisi lingkungan yang kurang menguntungkan, misalnya untuk mengatasi hama dan penyakit, menarik polinator, dan sebagai molekul sinyal. Singkatnya, metabolit sekunder digunakan organisme untuk berinteraksi dengan lingkungannya (Verpoorte dan Alfermann 2000). Fermentasi statis yang dilakukan selama 3 pekan didesain agar kapang endofit mencapai tahap pertumbuhan stasioner yang mana pada tahap tersebut kapang dapat memproduksi metabolit sekunder secara optimal. Setelah 3 pekan masa fermentasi, menurut metode Guo et al. (2006) media cair PDB dipisahkan dari biomassanya yaitu miselia kapang yang tumbuh selama massa fermentasi. Media cair diekstrak dengan pelarut diklorometana dan biomassa diekstrak dengan dengan etanol 80 %. Kedua hasil ekstrak lalu dicampur. Pencampuran kedua ekstrak ini bertujuan untuk mengumpulkan baik produk ekstraseluler (media cair) maupun intraseluler (biomassa). Hasil pencampuran ekstrak diuapkan menjadi residu ekstrak yang dapat ditimbang untuk persiapan proses uji selanjutnya (Tabel 1). Toksisitas terhadap larva udang A. salina Leach (BSLT) BSLT (Brine Shrimp Letahality Test) adalah salah satu metode awal yang banyak digunakan untuk mengetahui ada tidaknya aktivitas sitotoksik suatu senyawa dan ini merupakan metode penapisan bioaktivitas senyawa antikanker pada ekstrak tanaman. BSLT menggunakan tingkat mortalitas larva udang Artemia salina L terhadap paparan ekstrak uji. Hasil yang diperoleh dihitung sebagai nilai LC50 (letal concentration) ekstrak uji, yaitu konsentrasi ekstrak uji yang dapat menyebabkan 50% kematian larva udang setelah 24 jam masa inkubasi. Berdasarkan metode Meyer jika senyawa dengan LC50 < 1000 µg/ml dapat dianggap sebagai suatu senyawa aktif (Meyer 1982). Artanti et al.(2003) dalam penelitiannya melaporkan bahwa ekstrak etanol tanaman T. sumatrana pada bagian kulit batang, ranting, dan daunnya memiliki nilai toksisitas yang cukup tinggi yaitu 1 ppm pada kulit batang, 25.2 ppm pada ranting,dan 3.7 ppm pada daunnya. Pada uji tahap ini, dilakukan sedikit modifikasi pada variasi dosis yag diberikan. Dosis terbesar yang digunakan adalah 500 ppm. Dosis 1000 ppm tidak digunakan karena hasil residu ekstrak sangat sedikit (Tabel 1). Berdasarkan Tabel
12
2 yang menyajikan data % persen kematian larva udang terhadap variasi konsentrasi ekstrak yang diberikan, terlihat bahwa ekstrak kapang 1, 3, 5, dan 7 memiliki bioaktivitas dengan mampu membunuh larva udang pada variasi konsentrasi yang diberikan, sedangkan ekstrak kapang 2, 4, 6, 8, dan 9 tidak mampu membunuh larva udang pada semua variasi konsentrasi. Hasil ini dapat ditafsirkan lebih jelas dengan mengkonversikannya pada nilai LC50. Nilai LC50 diperoleh dengan membuat persamaan garis antara Log konsentrasi ekstrak kapang yang memiliki bioaktivitas dengan % kematian larva udang (Gambar 5). Berdasarkan pada persamaan garis keempat ekstrak, dihitung nilai LC50-nya dengan memasukkan nilai y = 50. Hasilnya dapat dilihat pada Tabel 3. Menurut klasifikasi Meyer ekstrak kapang 1 yang memiliki nilai LC50 202.7 ppm termasuk senyawa dengan toksisitas rendah. Ekstrak kapang 3 dan 7 memiliki nilai LC50 sedang (13.3 ppm dan 74.88 ppm) dan ekstrak kapang 5 toksisitasnya tinggi (3.08 ppm). Sitotoksisitas terhadap sel HeLa Uji sitotoksisitas adalah evaluasi terstandarisasi untuk menentukan tingkat bahaya (toksisitas) kandungan bahan yang terkandung dalam suatu material secara biologis. Dalam pengembangan obat-obatan baru, termasuk agen-agen kemoterapi, uji sitotoksik digunakan untuk evaluasi preklinik yang penting agar diketahui potensi bioaktivitasnya. Salah satu uji sitotoksik yang umum digunakan dalam pengembangan agen kemoterapi adalah MTT assay. MTT assay telah memenuhi syarat-syarat dalam uji sitotoksisitas antara lain sistem pengujiannya dapat menghasilkan kurva dosis respon yang reprodusibel dengan viabilitas rendah, kriteria respon menunjukkan hubungan linier dengan jumlah sel serta informasi yang didapat dari kurva dosis respon sejalan dengan efek yang muncul pada in vivo. Prinsip MTT assay adalah terjadinya reduksi garam kuning tetrazolium MTT (3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid) oleh sistem reduktase. Suksinat tetrazolium yang termasuk dalam rantai respirasi dalam mitokondria sel-sel yang hidup mereduksi reagen garam kuning MTT larut air membentuk kristal formazan berwarna biru tua atau ungu yang tidak larut air. Penambahan reagen stopper (bersifat detergenik) akan melarutkan kristal berwarna ini yang kemudian diukur absorbansinya menggunakan microplate reader. Intensitas warna ungu yang terbentuk proporsional dengan jumlah sel hidup, sehingga jika intensitas warna ungu semakin besar, maka berarti jumlah sel hidup semakin banyak (Cancer Chemoprevention Research Center 2000). Uji sitotoksisitas ekstrak kapang dilakukan terhadap pertumbuhan sel HeLa. Sel HeLa adalah sel yang diisolasi dari seorang wanita bernama Henrietta Lacks yang meninggal pada usia 31 tahun karena menderita kanker serviks pada tahun 1950-an. Sel tersebut dikultur dalam laboratorium dan menjadi sel manusia pertama yang imortal (abadi). Sel HeLa telah banyak membantu para peneliti dalam penelitan kanker, kloning, pemetaan gen, AIDS, dan penelitan virus (Jiang et al. 2012). Hasil dari uji MTT dapat dilihat pada Tabel 4. Nilai inhibisi terhadap sel Hela lebih dari 50 % pada kapang label 3. Ekstrak kapang label 5 dan 7 nilai inhibisinya mendekati 50 %. Ini menyatakan bahwa kapang endofit yang diisolasi dari batang tanaman T. sumatrana dapat memproduksi senyawa yang aktif dalam penghambatan pertumbuhan sel HeLa. Penghambatan terbaik pada sel HeLa
13
terjadi dengan penambahan dosis ekstrak label kapang 3. Pada ekstrak kapang 3 dan kapang 5 nilai inhibisi (hambatan) terhadap pertumbuhan sel HeLa terlihat bersifat dose dependent, yang berarti persentase inhibisi atau hambatan pertumbuhan sel semakin besar dengan semakin tinggi dosis ekstrak kapang yang diberikan. Namun pada ekstrak kapang 7 terlihat ada pola yang berbeda, dimana nilai inhibisi terhadap pertumbuhan sel HeLa tidak linier terhadap dosis yang diberikan. Pola hambatan yang tidak linier terhadap dosis ekstrak uji pernah dilaporkan oleh Sumaryono dan Wibowo (2010), yang menguji ekstrak etanol daun Aglaia elliptica dari fraksi n-heksana dan fraksi air. Inhibisi non linier terhadap dosis menurut Sumaryono terjadi karena ada dual effect, yaitu senyawa yang dapat mendorong dan menghambat proliferasi sel, tergantung pada besarnya konsentrasi senyawa tersebut. Jika diperhatikan kembali nilai toksisitas terhadap larva udang A. salina Leach yang tinggi, yang mana larva udang tersebut adalah organisme normal dan sehat, maka ekstrak kapang yang dihasilkan pada penelitian ini cukup toksik. Perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan metode invivo untuk mengetahui potensi lebih lanjut ekstrak kapang dari tanaman T. sumatrana ini dalam menghambat sel kanker pada hewan coba. Identifikasi senyawa dengan LC-MS Taksol adalah senyawa inhibitor mitosis yang memiliki aktivitas yang sangat baik dalam melawan berbagai macam kanker. Senyawa ini pertama kali diisolasi dari kulit batang pohon cemara pasifik (Taxus brefivolia) dan lolos uji keamanan oleh FDA (Food and Drug Administration) pada tahun 1992 ( Wani et al. 1971; Kohler dan Goldspiel 1994). Senyawa taksol umumnya diproduksi oleh tanaman bergenus Taxus. Di Indonesia sendiri terdapat tanaman bergenus Taxus yaitu Taxus sumatrana. Senyawa Taksol berhasil diidentifikasi dari ekstrak batang tanaman T. sumatrana menggunakan LC-MS (Trisnamurti et al. 2003 didalam Artanti et al. 2003). Selain dari tanaman bergenus Taxus, senyawa Taksol dapat diproduksi oleh organisme lain, yaitu kapang endofit. Hal ini pertama kali
Gambar 6. Spektrum LC-MS massa senyawa yang terkandung dalam ekstrak kapang Taxus chinensis (waktu retensi : 16.3 ±0.1 menit) Lingkaran biru adalah Taksol (M+ H+) dan lingkaran merah adalah Taksol (M+ Na+) (Guo et al. 2006).
14
dilaporkan oleh Stierle et al. (1993) yang mampu memproduksi Taksol dari kapang endofit Taxomyces andreanae yang disolasi dari batang tanaman Taxus brevifolia. Guo et al. (2006) juga melaporkan bahwa kapang endofit dari Taxus chinensis teridentifikasi mampu memproduksi Taksol. Setelah melalui proses penapisan dan uji toksisitas terhadap sel kanker HeLa, ekstrak yang diperoleh dari hasil fermentasi perlu dilakukan identifikasi senyawanya apakah terdapat senyawa taksol atau tidak. Metode identifikasi pada penelitian ini merujuk pada hasil penelitian Guo et al. (2006) yang membandingkan hasil uji LC-MS ekstrak kapang dari T. chinensis dengan hasil LC-MS senyawa taksol komersil. Hasil analisis LC-MS ekstrak kapang label 3,5, dan 7 pada Gambar 3, Gambar 4, dan Gambar 5 menunjukkan kandungan senyawa berdasarkan kelimpahan dan bobot molekulnya. Hasil data ini dibandingkan dengan data yang diperoleh Guo et al. (2006). Hasil identifikasi Guo merupakan perbandingan hasil running ekstrak kapang dari T. chinensis dengan senyawa Taksol komersil yang memiliki bobot molekul 853 m/z (Gambar 6 dan Gambar 7).
Gambar 7. Spektrum massa Taksol (waktu retensi : 16.3 ±0.1 menit) Lingkaran biru adalah Taksol (M+ H+) dan lingkaran merah adalah Taksol (M+ Na+) (Guo et al. 2006). Penjelasan dari Gambar 6 dan Gambar 7 adalah bahwa pada hasil analisis spektrum massa senyawa Taksol, teridentifikasi bobot molekul ionnya adalah 854,3 (M+H)+ dan 876,3 (M+Na)+. Tanda M+H dan M+ Na adalah molekul senyawa yang terikat dengan ion H+ dan ion Na+ jadi bobot molekul Taksol adalah M yaitu 853.3 m/z (854.3 – 1 atau 876.3 -23). Bobot molekul ion H+ dan ion Na+ adalah 1 m/z dan 23 m/z. Dengan membandingkan hasil identifikasi bobot molekul senyawa pada ekstrak hasil fermentasi kapang endofit T. sumatrana (Gambar 3, Gambar 4, dan Gambar 5) dengan bobot molekul senyawa taksol (Gambar 7) dan bobot melokul yang diperoleh Guo et al. (2006) (Gambar 6), tidak teridentifikasi senyawa dengan bobot molekul 853 m/z atau yang mendekati. Bobot molekul
15
terbesar berturut-turut yang teridentifikasi pada ekstrak kapang label 3, 5, dan 7 berturut-turut pada kisaran 381 m/z, 380 m/z, dan 392 m/z. Tidak teridentifikasinya senyawa pada bobot molekul 853 m/z menunjukkan tidak ada senyawa taksol pada ekstrak hasil fermentasi kapang endofit T. sumatrana. Bobot molekul senyawa-senyawa yang terdeteksi pada spektrum LC-MS dapat digunakan untuk memperkirakan jenis senyawa yang terkandung di dalam ekstrak kapang, yaitu dengan menggunakan database massa molekul yang telah dipublikasikan secara umum. Pada analisis ini digunakan database dari Massbank (2015), suatu situs online yang menyajikan secara cukup lengkap dan akurat nama-nama senyawa berdasarkan bobot molekulnya. Hasilnya adalah terdapat beberapa senyawa yang memiliki bobot molekul mendekati bobot molekul senyawa yang terdeteksi pada analisis LC-MS ekstrak kapang yang tersaji pada Gambar 3, Gambar 4, dan Gambar 5 (dapat dilihat pada Lampiran 9). Misalnya ekstrak kapang label 3 yang memiliki puncak (peak) spektrum LC-MS pada 144.1148 m/z, dengan memasukkan nilai puncak tersebut pada database, terdeteksi 3 senyawa yang memiliki bobot molekul mendekati nilai puncak yaitu senyawa 1-naphthylamine (BM 143.07350 4) Methyl-5-thiazoleethanol (BM 143.04048) dan Valpromide (BM 143.13101). Ketiga senyawa tersebut setelah ditelusuri profilnya pada situs NCBI (National Center for Biotechnology Information) dengan fitur PubChem diketahui bukan senyawa antikanker. Senyawa-senyawa lain yang memiliki bobot molekul mendekati tiga nilai puncak spektrum ekstrak kapang label 7 juga tidak ada yang teridentifikasi sebagai agen antikanker. Penelusuran pada ekstrak kapang label 5 yang memiliki 2 nilai puncak, teridentifikasi 3 senyawa yang memiliki bobot molekul mendekati salah satu nilai puncak dengan bobot molekul 257.9504 m/z yang mana salah satu senyawa tersebut yaitu 5-Methylcytidine. Senyawa bobot molekul 257.10117 tersebut menurut data PubChem (2015) pernah diujikan untuk menghambat proliferasi sel kanker Leukemia, walaupun hasilnya tidak signifikan. Perkiraan kandungan senyawa berdasarkan bobot molekul ini belum dapat digunakan secara pasti untuk mengidentifikasi jenis senyawanya. Perlu diketahui dahulu golongan metabolit sekunder dengan uji fitokimia dengan dilanjutkan dengan identifikasi strukstur senyawanya dengan analisis NMR atau yang lainnya agar diketahui secara detail jenis senyawa yang ada pada ekstrak kapang endofit. Tidak teridentifikasinya keberadaan senyawa Taksol pada ekstrak hasil fermentasi kapang endofit tanaman T. sumatrana kemungkinan karena kondisi lingkungan pertumbuhan kapang tidak memungkinkan untuk memproduksi Taksol. Substrat-substrat yang tersedia pada media tumbuh kapang mungkin kurang optimal mendukung produksi metabolit sekunder dari kapang endofit tanaman T. sumatrana. Kemungkinan lain adalah kapang endofit tersebut tidak memiliki gen penyandi Taksol yang hanya dimiliki oleh tanaman inangnya saja atau memiliki gen tapi tidak terekspresi.
16
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Metabolit sekunder dalam campuran ekstrak diklorometana media cair (PDB) hasil fermentasi kapang endofit tanaman Taxus sumatrana dan ekstrak metanol 80 % dari biomassanya memiliki potensi aktivitas sitotoksik. Sebanyak 3 dari 9 isolat kapang memiliki kisaran LC50 > 100 ppm terhadap larva udang Artemia salina Leach dan mampu menghambat pertumbuhan sel kanker serviks (HeLa) hingga 50 %. Pada uji identifikasi bobot molekul senyawa dengan LCMS, tidak ditemukan keberadaan senyawa Taksol pada ekstrak hasil fermentasi kapang endofit tanaman T. sumatrana.
Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai identifikasi jenis dan spesies kapang yang diperoleh dari hasil isolasi dari batang tanaman T. sumatrana. Perlu juga dilakukan pengembangan metode fermentasi dengan modifikasi media kapang yang bertujuan untuk mengoptimalkan target produk yang diinginkan. Uji sitotoksisitas ekstrak hasil fermentasi kapang endofit tanaman Taxus sumatrana terhadap sel kanker dengan mengujikannya secara in vivo diharapkan dapat memberi informasi lebih lanjut dari potensi ekstrak kapang endofit untuk dikembangkan menjadi obat antikanker. Terakhir, diperlukan identifikasi lebih lanjut golongan senyawa yang terkandung dalam ekstrak hasil fermentasi kapang endofit tanaman T. sumatrana dengan uji fitokimia kemudian dilanjutkan dengan analisis struktur molekulnya agar diperoleh profil lengkap dari senyawa aktif yang diperoleh.
17
DAFTAR PUSTAKA Artanti N, Djamilah, Lotulung PD, Liswidowati, Minarti, Hanafi M,Kardono LBS, dan Darmawan A. 2003. Evaluasi potensi ekstrak Taxus sumatrana dan benalu sebagai anti kanker. Pemaparan Hasil Litbang. Pusat Penelitian Informatika. LIPI Ballero M, Loi MC, van Rozendaal EL, van Beek TA, van de Haar C, Poli F, dan Appendino G. 2003. Analysis of pharmaceutically relevant 17 taxoids inwild yew trees from Sardinia. Fitoterapia 74:34-39 Cancer Chemoprevention Research Center. 2000. SOP Uji Sitotoksik metode MTT. No Dukumen: CCRC-02-010-00. Fakultas Farmasi UGM. Croizer J, Thomas SE, Aime ME, Evan HC, dan Holmes KA. 2006. Molecular characterization of fungal endophytic morphospecies isolated from stem and pods of Theobroma cacao. Plant pathol. 55:783-791 Croteau R, Kutchan TM, dan Lewis NG. 2000. Natural products (secondary metabolites). Dalam B. Buchanan, W Gruissem, dan R. Joneas edisi Biochemistry and Molecular Biology of Plants. American Society of Plant Biologists, Rockville, MD. 1250–1268. Curtis L, Lieberman A, Tark MS, Rea W, dan Vetter M. 2004. Adverse healt effect of indoor molds. Journal of Nutritional & Environment 14(3):261– 274. Depkes RI 2008. Profil kesehatan Indonesia 2008. [terhubung berkala].http://www.depkes.go.id/downloads/publikasi/Profil_Kesehatan_In donesia_2008.pdf [28 Agustus 2012] DeVita VT dan Walker JE. 2008. A history of cancer chemotherapy. Cancer Res. 68(21) : 8643-8653 [terhubung berkala] http://cancerres. aacrjournals.org/content/68/21/8643 [14 Maret 2015] Goodman J dan Walsh V. 2001. The Story of Taxol: Nature and Politics in the Pursuit of an Anti-Cancer Drug. Cambridge University Press. Guo BH, Wang YC, Zhou XW, Hu K, Tan F, dan Tang KX. 2006. An endophyte Taxol-producing fungus BT2 isolated from Taxus chinensis var. mairei. African Jaournal of Biotechnology 5: 875-877 Jiang H dan Gordon B. 2012. The immortal live of Henrietta Lack and beyond. [terhubung berkala] http://u.osu.edu/gordon.3/files/2012/06/Hui-Jiang-834spr.-2012.pdf [20 juni 2014] Kohler J. dan Goldspiel BR. 1994. Evaluation of new drug Paclitaxel (Taxol). Pharmacotherapy 14: 3-34 Kumala S, Septisetyani EP, dan Meiyanto E. 2009. Fraksi n-butanolik kapang endofit Buah Makasar meningkatkan efek apoptosis doxorubusin pada sel MCF-7. Majalah Farmasi Indonesia. 20:42-47 Margiono S. 2008. Produksi metabolit sekunder (antibiotik) oleh isolat jamur endofit indonesia. Majalah Farmasi Indonesia. 19(2): 86-94. MassBank. 2015. High quality mass spectral database [terhubung berkala] http://www.massbank.jp/index.html [17 Maret 2015] McNaught AD dan Wilkinson A. 1997. IUPAC. Compendium of Chemical Terminology, 2nd ed. (the "Gold Book"). Oxford: Blackwell Scientific Publications. Meyer, H.N. 1982. Brine Shrimp Lethality Test: Med. Plant Research. 45: 31-34
18
Mc Laughlin, dan Rogers L. 1998. The use of biological assays to evaluate botanicals. Drug Information Journal. 32:513-524. [NCBI] National Centre of Biotechnology Information. 2015. PubChem [terhubung berkala] http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ [18 Maret 2015] [NCI] National Cancer Institute. 2015. Taxol [terhubung berkala].http://dtp.nci.nih.gov/timeline/flash/success_stories/S2_taxol.htm [14 Maret 2015] Pelczar MJ dan Chan EC. 2005. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press PubChem. 2015. Deposited Record (SID 103271758) [terhubung berkala] http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?sid=103271758 [18 Maret 2015] Rahmat HH. 2008. Variasi genetik dan teknik perbanyakan vegetatif cemara sumatra (Taxus sumatrana) [Tesis]. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Stierle A, Strobel G, dan Stierle D. 1993. Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of pasific yew. Sci.260:214216 Strobe G, Daisy, Castillo, dan Harper J. 2004. Natural product from endophytic microorganism. J. Nat. Prod. 67 : 257-268 Sumaryono W dan Wibowo AE. 2010. Aktivitas sitotoksik etanol daun Aglaia elliptica Blume terhadap Galur Sel Kanker Serviks (HeLa). J. Ilmu Kefarmasian Indonesia. 8(1):19-23 Tan RX dan Zou WX. 2001. Endophytes: a Rich Source of Functional Metabolites. Nat.Prod.Rep. 18:448-459. Verpoorte R dan Alfermann AW. 2000. Metabolic engineering of plant secondary metabolism. Springer. Page.1-3 Vogaser M dan Seger C. 2008. A decade of HPLC-MS/MS in the routine clinical laboratory-goals for further development. Clinical Biochemistry Rev. 41: 649-662 Wani MC, Taylor HL, Wall ME, Coggon P, dan McPhail A. 1971. Plant antitumor agents. VI. The isolation and structure of Taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia. J. Am.Chem.Soc. 93:2325-2327. [WHO] World Health Organization. 2006. Comprehensive Cervical Cancer Control. A guide to essential practice. Yayasan Kanker Indonesia.2009.Rangkuman Hasil Seluruh Pusat Patologi di Indonesia. Jakarta Zhang HW, Song YS, dan Tan RX.2006 . Biology and Chemistry of Endophytes. Nat.Prod.Rep. 23:753-771 Zhao K. 2004. Study on the preparation and regeneration of protoplast from Taxol-producing fungus Nodulisporium sylvivorme. Nature and Science 2:52-59
19
LAMPIRAN
20
21
Lampiran 1 Strategi Penelitian Isolasi dan Pemurnian Kapang Endofit
Peremajaan Kapang Endofit dari Isolat
Produksi Metabolit Kapang Endofit pada Media Cair
Ekstraksi Metabolit Sekunder
Penapisan Potensi Kapang dengan BSLT
Uji MTT
Identifikasi dengan LC-MS
22
Lampiran 2. Bagan alir Isolasi dan Pemurnian Kapang Endofit
Batang tanaman Taxus sumatrana (2 cm, 1 cm) dicuci dengan air
Batang tanaman disterilkan dengan etanol 70 % (1 menit), natrium hipoklorit 5.3 % (5 menit), etanol 75 % (0.5 menit)
Batang dibelah longitudinal
Batang yang telah dibelah diletakkan diatas media PDA yang mengandung kloramfenikol 0.05 mg/ml
Proses inkubasi selama 3 hari, pada suhu 25 oC.
Koloni kemudian dipindahkan ke PDA dalam cawan Petri dan diinkubasi pada 25 oC.
Masing-masing endofit di tanam pada agar miring (PDA), dan di inkubasi 25 oC.
Setiap 3 bulan sekali, diremajakan kembali, dan sebagian isolat disimpan dalam medium PDA pada suhu -80 oC.
23
Lampiran 3. Bagan alir proses Fermentasi dan Ekstraksi Metabolit Sekunder Kapang Endofit
Isolat kapang yang telah diremajakan
Inokulasikan pada 200 ml media PDB
Fermentasi selama 21 hari dan selanjutnya ekstraksi
Media kultur dan miselia dipisah dengan sentrifugasi, media kultur diekstrak dengan diklorometana 2 kali, miselia diresuspensi dengan 100 ml etanol kemudian disentrifugasi untuk diambil supernatan
Supernatan miselia dicampur dengan ekstrak kultur awal, kemudian diuapkan. Residu diukur bobotnya
Ekstrak dalam botol dipindahkan ke vial yang lebih kecil dengan dilarutkan pelarut
24
Lampiran 4. Bagan alir proses Uji BSLT
Penetasan larva udang Artemia salina selama 1-2 hari dibawah penerangan lampu.
Penyiapan seri konsentrasi sampel (5000 ppm, 1000 ppm, 500 ppm, 100 ppm)
Penyiapan plate BSLT, tiap plate berisi 0.2 ml sampel, 1.8 ml air laut dan 10 ekor larva udang. Tiap sampel dilakukan duplo. Plus 2 sumur kontrol tanpa larutan sampel Inkubasi dalam suhu kamar selam 24 jam
Penghitungan jumlah larva yang mati tiap sumurnya
Penentuan LC 50 dengan regresi linier menggunakan grafik logaritmik Microsoft Excel
25
Lampiran 5. Perhitungan LC50 BSLT
sampel Kapang 1
Kapang 3
Kapang 5
Kapang 7
K sampel (ppm)
Log K
% mati
10 50 100 500 10 50 100 500 10 50 100 500 10 50 100 500
1 1.69 2 2.69 1 1.69 2 2.69 1 1.69 2 2.69 1 1.69 2 2.69
0 5 25 95 45 70 80 100 60 80 90 100 0 45 60 90
LC50
202.7
13.03
3.08
74.88
Persamaan garis Kapang 1, y = 47.101x2 - 117.32x + 69.991 Kapang 3, y = 32.535x + 13.723 Kapang 5, y = 23.948x + 38.315 Kapang 7, y = 53.096x - 49.212 Contoh perhitungan LC50 Kapang 3 y = 50 y = 32.535x + 13.723 50 = 32.535x + 13.723 36.277 = 32.535x x = 1.1150 x = Log K Log K = 1.1150 K = 101.1150 K = 13.03 K = Konsentrasi ekstrak yang dapat membunuh 50% populasi larva udang LC50 = 13.03 ppm
26
Lampiran 6. Tabel lengkap hasil uji MTT Ektrak 3
Ulangan Rata2
%inhibisi
0.376
0.305
58.2
0.356
0.371
49
Ppm
ODI
ODII
ODIII
100
0.292
0.246
50
0.344
0.413
25
0.556
0.469
0.42
0.482
33.8
12.5
0.621
0.549
0.519
0.563
22.7
6.25
0.751
0.672
0.611
0.678
6.87
3.125
0.647
0.733
0.658
0.679
6.68
1.562
0.632
0.785
0.764
0.727
0.14
Ektrak 5 100
0.398
0.349
0.356
0.368
49.5
50
0.581
0.528
0.549
0.553
24.1
25
0.603
0.536
0.622
0.587
19.4
12.5
0.593
0.62
0.56
0.591
18.8
6.25
0.587
0.558
0.618
0.588
19.3
3.125
0.623
0.605
0.691
0.64
12.1
1.562
0.598
0.786
0.8
0.728
0
Ektrak 7 100
0.431
0.417
0.391
0.413
43.3
50
0.598
0.611
0.555
0.588
19.2
25
0.513
0.543
0.559
0.538
26.1
12.5
0.674
0.708
0.64
0.674
7.4
6.25
0.652
0.708
0.633
0.664
8.7
3.125
0.501
0.564
0.515
0.527
27.7
1.562 Cell Control
0.749
0.641
0.67
0.687
5.7
0.729
0.726
0.729
0.728
0
27
Lampiran 7 . Foto fermentasi dan ekstraksi .
Proses Fermentasi kapang endofit hasil isolasi dari batang tanaman T. sumatrana pada media PDB
Foto Media cair (PDB) setelah 3 pekan dan telah dipidahkan dari biomassanya
Foto. Campuran ekstrak diklorometana 1:1 (media PDB) dan ekstrak metanol 80 % (biomassa kapang endofit Taxus sumatrana). Yang telah diuapkan
28
Lampiran 8. Foto sel HeLa hasil MTT
Kontrol Sel HeLa
Sel HeLa yang diberi perlakuan 100 ppm ekstrak kapang label 5
Sel HeLa yang diberi perlakuan 100 ppm ekstrak kapang label 3
Sel HeLa yang diberi perlakuan 100 ppm ekstrak kapang label 7
29
Lampiran 9. Perkiraan molekul yang terkandung pada ekstrak kapang endofit tanaman T. sumatrana No Titik Perkiraan Senyawa Kapang Puncak 3 144.1148 1-naphthylamine
Massa Molekul 143.0735
Rumus Molekul
143.04048
C6H9NOS
143.13101
C8H17NO
230.8483 Asulam Diazoxide
230.0356 229.99168
C8H10N2O4S C8H7ClN2O2S
Naproxen
230.09429
C14H14O3
257.10117
C10H15N3O5
257.10117
C10H15N3O5
257.10519
C15H15NO3
257.10519
C15H15NO3
232.01702 234.13683
C9H10Cl2N2O C13H18N2O2
Lidocaine Methylphenidate
234.17321 233.14158
C14H22N2O C14H19NO2
207.1998 DL-Thioctic acid
206.04352
C8H14O2S2
206.05791
C11H10O4
205.03751 332.05219
C10H7NO4 C10H13N4O7P
332.00078
C11H13BrN2O5
4-Methyl-5thiazoleethanol Valpromide 5
257.9504 2'-OMethylcytidine 5-Methylcytidine 9-methoxy-2,2dimethyl-6-hydro2H-pyrano Tolmetin 7
234.8545 Diuron Lenacil
Dimethylesculetin
Xanthurenic acid 332.8254 2'-Deoxyinosine 5'monophosphate
Brivudine
C10H9N
Keterangan (PubChem) senyawa aromatik, karsinogen, molekul koenzim transport Anticonvulsants, obat epilepsi senyawa herbisida Obat Gastrointestinal, antihipoglikemik senyawa anti-inflamasi dan analgesik agen antivirus Hepatitis C agen inhibitor proliferasi sel leukimia, antiherpes belum diketahui banyak
agen anti-inflamasi, inhibitor Siklo-Oksigenase senyawa herbisida senyawa herbisida, anti bakteri Vibrio chlorea agen anastesi lokal Stimulan syaraf pada pengobatan ADHD (Attention Deficit Hyperactivity Disorder) asam lipoat, suplemen sejens vitamin agen anti - Arrhythmia (gangguan irama jantung), agen Gastrointestinal, Vasodilator Obat Hiperlipidemia nama lain dari Hypoxanthine deoxyriboside, turunan nukleotida Antivirus herpes
30
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bojonegoro pada tanggal 13 November 1989. Penulis adalah anak kedua dari empat bersaudara dari pasangan Drs. Munariadi dan Titik Nurhayati. Riwayat pendidikan penulis adalah Madrasah Aliyah di Pesantren AlMukmin Ngruki di Solo Tahun 2005-2008. Tahun 2008 penulis diterima di IPB melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB) dan terdaftar sebagai Mahasiswa Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selain pendidikan formal, penulis pernah mengenyam beberapa pendidikan non formal yaitu: Pendidikan dan Latihan Dasar Bela Negara Resimen Mahasiswa Mahawarman Jawa Barat (Bandung, Februari 2009), Kursus Pelatih Nasional (Malang, Juli 2009) dan Pelatihan Kepemimpinan Nasional PPSDMS Nurul Fikri (Depok, Juli 2010). Selama masa perkuliahan di IPB penulis menjadi wakil komti Biokimia angkatan 45. Penulis juga aktif mengikuti Organisasi Kemahasiswaan yaitu sebagai Anggota LDK Al Hurriyah tahun 2008, Staff di Lembaga Pengajaran Qur’an (LPQ) LDK Al Hurriyah perode 2009-2010, Ketua Divisi Metabolisme Crebs periode 2011-2012, dan terakhir sebagai Komandan Resimen Mahasiswa IPB periode 2011-2012. Penulis juga aktif dalam berbagai kepanitiaan seperti Ulumul Qur’an LPQ Al Hurriyah tahun 2009, Pelatihan Paskibra IPB tahun 2009-2011. Pendidikan dan Latihan Dasar Resimen Mahasiswa IPB tahun 2009 dan 2010. LKIP (Lomba Karya Tulis Ilmiah Populer) 2010 dan 2011 dan Latihan Pemusatan Resimen Mahasiswa Diploma IPB tahun 2011. Penulis pernah pernah melakukan praktik lapang di Laboratorium Bioteknologi Kimia bahan Alam, Lembaga Ilmu dan Pengetahuan Indonesia (LIPI) Bogor selama periode Juli sampai dengan Agustus 2011 dengan judul Uji Aktivitas Antidiabetes Ekstrak Etil Asetat Kapang Endofit Kayu Manis (Cinnamomum burmanii) dengan Enzim α-glukosidase. Penulis juga aktif dalam penulisan karya ilmiah. Pada tahun 2010 penulis mendapat hibah dana PKM-GT (Program Kreativitas Mahasiswa-Gagsan tertulis) berkat penulisan karya ilmiah berjudul Pemanfaatan Hemiselulosa pada Tandan Kosong Kelapa Sawit sebagai Bahan Baku Xilitol Menggunakan Khamir Candida tropicalis. Pada tahun 2011 penulis mengikuti PKM Penelitian dengan proposal berjudul Produksi Taxol Dengan Kemurnian Tinggi Melalui Pemanfaatan Kapang Endofit Tanaman Taxus sumatrana untuk Skala Industri.
