UNIVERZITA JANA EVANGELISTY PURKYNĚ V ÚSTÍ NAD LABEM
FAKULTA PŘÍRODOVĚDECKÁ
ÚVOD DO STUDIA BIOLOGIE STUDIJNÍ OPORA PRO POSLUCHAČE KOMBINOVANÉHO BAKALÁŘSKÉHO STUDIA BIOLOGIE
JAN IPSER
ÚSTÍ NAD LABEM
1
2005
ÚVODNÍ POZNÁMKA
Vážené studentky a studenti,
dostává se vám do rukou studijní opora k předmětu Úvod do studia biologie. Je určena vám, frekventantům kombinované formy bakalářského stupně studia biologie realizovaného na Přírodovědecké fakultě Univerzity J. E. Purkyně v Ústí nad Labem. Záměrem autora bylo vytvořit relativně ucelený text obsahující základní informace k tématickým celkům, které jednak tvoří stěžejní část předmětu Úvod do studia biologie (biologické systémy a jejich klasifikace, biologie buňky, biologie populací a společenstev, dědičnost a proměnlivost, biologická evoluce) zařazeného ve studijním programu do prvního ročníku, jednak jsou v průběhu dalšího studia rozvíjeny v rámci výuky dílčích biologických disciplin. Obsahuje podstatné informace k tématickým celkům, které jsou blíže probírány na konzultacích, seminářích a cvičeních. Snahou autora zároveň bylo omezit na nezbytné minimum ty partie, které jsou probírány podrobně v jiných předmětech vašeho studijního programu, aby bylo zamezeno nadměrné duplicitě. Úspěšným zvládnutím uvedeného předmětu byste měli být v obecné rovině vybaveni celkovým přehledem o základních biologických jevech a procesech, znalostmi základních biologických termínů, metod a přístupů požívaných k poznávání živých systémů. Od předmětu Úvod do studia biologie očekáváme, že vám napomůže orientovat se v moderní biologii a jejích trendech. Předmět je pojímán jako určitá propedeutika ke studiu dílčích biologických disciplin, zařazených ve studijním plánu a rozvíjejících již nabyté vědomosti, schopnosti a dovednosti. Značně rozsáhlá partie textu opory je věnována biologii buňky a to především proto, že by měla sloužit jako teoretická část pro praktickou výuku řady laboratorních biologických metod. Tato studijní opora tudíž není koncipována jako učebnice pokrývající proporcionálně všechny stěžejní oblasti biologie, ale jako studijní materiál, který je kompatibilní s příbuznými předměty zařazenými do výše uvedeného studijního programu a tvoří s nimi jednotný celek. Dovoluji si upozornit, že elektronická verze studijní opory Úvod do studia biologie je určena výhradně pro vaše osobní studijní účely a nesmí být dále rozšiřována (kopírována). Přeji vám hodně úspěchů ve studiu zvoleného oboru. V případě potřeby se neostýchejte využít všech dalších obvyklých a dostupných forem komunikace s vyučujícími (elektronické, telefonické, osobní) nad rámec uskutečněných konzultací.
Autor
2
I. OBECNÉ VLASTNOSTI BIOLOGICKÝCH SYSTÉMŮ Život můžeme definovat na nejobecnější úrovni jako zvláštní formu pohybu hmoty. Základním předmětem biologie je poznání života jako zvláštní formy existence hmoty, poznání struktury a funkcí tohoto zvláštního způsobu bytí. Z hlediska dosaženého stupně poznání biologických věd můžeme na onu zvláštní formu existence hmoty nahlížet jako na dialekticky podmíněnou, časoprostorově ohraničenou, s okolím interagující, hierarchicky uspořádanou a evolvující strukturně-funkční jednotu bílkovin a nukleových kyselin vyznačující se vlastními atributy (tj. atributy živých soustav), principy, zákonitostmi a zákony, které se vyvíjejí na základě existujících fyzikálních a chemických procesů, avšak dosahují kvalitativně vyššího, svébytného stupně vývoje hmoty. Proces poznání se vyvíjí od poznávání makrosvěta dvěma směry: k poznávání megasvěta a k poznávání mikrosvěta. Přiblížení se k poznání podstaty života souvisí především s rozvojem poznání života na stále nižších úrovních mikrosvěta – celulární, subcelulární, molekulární, submolekulární. Je zřejmé, že při takto orientovaném studiu života nemůže biologie využívat pouze specifických biologických metod, technik a tradičních přístupů, které byly adekvátní pro studium biologických makroobjektů a makroprocesů. K postižení obecných vlastností života musí biologie nutně respektovat a aplikovat zejména poznatky a metody chemických a fyzikálních věd, obecnou teorii systémů, teorii informace, teorii řízení, teorii nerovnovážné termodynamiky a další. Biologie na úrovni mikrosvěta se neobejde bez tvorby modelů (kybernetických, matematických) a odpovídajícího matematického aparátu při řešení některých problémů, nebo vyhodnocování experimentálně získaných dat. Pro rozvoj biologického poznání mají nesporný význam též logika, filozofie a etika, kteréžto vědy na druhé straně mohou být v mnohém metodami aplikovanými v moderní biologii i výsledky biologických věd inspirovány. Základní strukturní a funkční jednotkou živé hmoty je buňka. Hovoříme o tzv. buněčném principu organizace živých systémů. Každá buňka představuje systém: hmotný, konečný, otevřený, hierarchicky uspořádaný, adaptivní, autoregulující se a autoreprodukující se. Těmto charakteristikám buňky jako systému odpovídají základní atributy života: autoreprodukce, autoregulace, metabolizmus, dědičnost, vývoj (ontogenetický a fylogenetický), růst, pohyb a dráždivost.
I.1. BIOLOGICKÝ SYSTÉM JAKO OTEVŘENÝ SYSTÉM V obecné teorii systémů se rozlišují tři základní typy systémů: systém izolovaný, který s okolím nevyměňuje hmotu, energii, ani informaci, systém uzavřený, který s okolím vyměňuje energii a systém otevřený, který s okolím vyměňuje hmotu, energii i informaci. (Pozn.: Někdy se tyto jednotlivé typy systémů charakterizují pouze na základě výměny hmoty a energie s okolím, neboť informace je vždy vázána na hmotu). Systémy izolované a uzavřené se nacházejí ve stavu termodynamické rovnováhy, nebo k tomuto stavu spějí, pokud jsou z něho vychýleny v důsledku náhodných fluktuací. Stav termodynamické rovnováhy (rovnovážný stav) je nejpravděpodobnějším stavem systému, tedy stavem, ve kterém systém dosahuje maximální entropie a je proto systémem neuspořádaným. Živé systémy jsou však systémy uspořádané (organizované); to znamená, že se nacházejí ve stavu vzdáleném od termodynamické rovnováhy (rovnovážného stavu) a tudíž jsou to systémy existující s nižší než maximální pravděpodobností 3
a s nižším obsahem entropie, než mají systémy v rovnovážném stavu. Proto za míru uspořádanosti živého systému je možné považovat negentropii udávající vzdálenost daného uspořádaného systému od systému neuspořádaného (tj. systému s maximální entropií). Evoluční vznik, existence a vývoj živých systémů není v rozporu s termodynamickými zákony a principy. Fluktuace, které systém vychýlí dostatečně daleko od rovnovážného nebo jemu blízkého stavu, mohou vést k ustavení nové uspořádanosti, ke vzniku disipativních struktur. Záznam informace do vnitřní paměti systému může rezultovat v ustavení stability uspořádanějšího stacionárního stavu. Tím je naznačena uskutečnitelnost vývojových změn v náležitě organizovaných (uspořádaných) systémech; biologické systémy mezi ně patří. Biologická evoluce je spjata se vznikem uspořádaných systémů a s převažující tendencí jejich vývoje k systémům s vyšší uspořádaností. Na každý biologický objekt lze nahlížet jako na otevřený systém s disipativní strukturou; existence takových systémů je možná za předpokladu akumulace negentropie, zprostředkované interakcemi systému s okolím. Znemožnění interakce otevřeného systému s okolím vede nutně k nárůstu entropie systému, snižování jeho uspořádanosti (organizovanosti) a dříve či později k dosažení rovnovážného stavu. Z biologického hlediska lze smrt označit za stav, ve kterém se dosahuje termodynamické rovnováhy; umírání jako proces končící smrtí je z tohoto hlediska procesem entropizačním. Život a smrt jsou dvě stránky téhož: první je spojeno se vznikem a vývojem uspořádaného systému, druhé s jeho destrukcí. Existence každého živého systému je časově omezená a každý živý systém, jakmile jednou vznikl, spěje neodvratně ke svému zániku. To platí jak pro kteroukoli jednotlivou buňku, tak pro všechny vyšší úrovně organizace živé hmoty. Přestože mezi zástupci různých taxonů evolučně méně či více příbuzných existují četné rozdíly, které reflektují rovněž rozdílný stupeň uspořádanosti toho kterého systému, jsou však nepatrné oproti rozdílům ve stupni uspořádanosti jakéhokoli živého (biologického) systému a jakéhokoli systému neživého (nebiologického). A právě tento rozdíl můžeme považovat za podstatu života jako nové kvality v evoluci vesmíru; života jako kvalitativně vyšší formy pohybu hmoty, než je forma fyzikální a chemická a zároveň nižší, než je forma společenská. Životní projevy a procesy nelze pochopit a vysvětlit jejich redukcí na procesy chemické a fyzikální, ani vnášením antropomorfizujících či sociologizujících přístupů. Obojí odporuje respektování života jako svébytné formy pohybu hmoty s vlastními principy, zákonitostmi a zákony; nutně vede k falešnému, nepřesnému, objektivně nepravdivému poznání. Každý systém je rozložitelný (alespoň v abstrakci) na subsystémy. V biologii buňky za základní systém považujeme buňku a jednotlivé buněčné organely (kompartmenty) za jeho subsystémy. Okolím systému (buňky) je vnější prostředí buňky; to nabývá různých podob v závislosti na tom, o jakou buňku se jedná. U samostatně žijícího prvoka to může být například voda v nádrži, u bakterie prostředí uvnitř hostitelského organizmu, u buňky tkáně mnohobuněčného organizmu bezprostřední okolí dané buňky (extracelulární tekutina), ale také – v širším slova smyslu – okolí tkáně či orgánu, se kterým daná buňka komunikuje například prostřednictvím mezibuněčných spojů. Jednotlivé subsystémy systému (buňky) vytvářejí strukturně a funkčně propojený celek při zachování menšího či většího stupně relativní autonomie. V buňkách se takto uplatňuje princip kompartmentace, který umožňuje diferenciaci (specializaci), kooperaci i integraci buněčných procesů. V souladu s tímto principem jsou jednotlivé subsystémy v rámci systému zpravidla jednak strukturně a funkčně specializovány, jednak vzájemně kooperují a proto jednotlivé funkce subsystémů mohou být v rámci vyššího celku integrovány (princip integrace). Realizace specifických funkcí buněčných subsystémů je možná při intracelulární prostorové separaci funkčních struktur (princip asymetrie). Tato separace není absolutní; struktury jednotlivých kompartmentů jsou propojeny mezi sebou navzájem, nebo se svým okolím a proto mohou dílčí buněčné procesy na sebe navazovat (spřažené reakce, kaskády), mohou se vzájemně podmiňovat nebo ovlivňovat (autoregulace), kooperovat a doplňovat se (princip komplemetarity). 4
Za subsystémy buňky lze označit například buněčné jádro, endoplazmatické retikulum, Golgiho aparát či mitochondrie. Každý z těchto subsystémů představuje specifickou strukturu, která plní specifické funkce; zároveň jsou tyto struktury a/nebo jejich funkční produkty propojeny a vzájemně se podmiňují nebo ovlivňují. Takové propojení struktur a funkcí je možné pouze při vymezeném rozsahu principu specializace v buňce. To se projevuje existencí některých stejných nebo téměř stejných základních struktur vznikajících v důsledku uplatnění jednotného stavebního principu (např. membránový princip). Integrace kooperujících, specializovaných, časoprostorově strukturně a funkčně oddělených subsystémů vede k hierarchickému uspořádání biologických systémů (princip hierarchie). Biologické systémy, existující na vyšší než buněčné úrovni, jsou organizovány analogickým způsobem.
I.2. BIOLOGICKÝ SYSTÉM JAKO HMOTNÝ SYSTÉM Jakákoli buňka představuje hmotný objekt a jakýkoli proces realizovaný uvnitř buňky, mezi interagujícími (komunikujícími) buňkami nebo mezi buňkami a jejich okolím je vždy vázán na hmotný substrát; pro možnost realizace jakéhokoli buněčného procesu mimo odpovídající hmotný substrát neexistuje žádné vědecké opodstatnění. Dílčí procesy v buňce podléhají fyzikálním a chemickým zákonům, lze je na jejich základě vysvětlit a při vědomí abstrakce a simplifikace (a pouze za těchto podmínek) je na procesy chemické a fyzikální redukovat. Jakýkoli buněčný proces je spojen s tokem látek, energie a informace, přičemž tyto jednotlivé komponenty (látky, energie, informace) jsou v reálných buněčných systémech navzájem neoddělitelné; izolovat je od sebe lze rovněž pouze v abstrakci, jestliže např. přistupujeme k buňce jako systému látkovému, energetickému nebo informačnímu. Tok látek představuje jakékoli změny v látkovém složení buňky, výměně látek buňky s okolím, v přeměně látek (metabolizmu) a v časoprostorové organizaci (uspořádání) látek. Jinými slovy, tok látek obecně představuje příjem látek z prostředí, jejich přeměnu živým systémem a výdej již neutilizovatelných (odpadních) látek do prostředí (okolí živého systému). Pro chemické složení buněk je charakteristické majoritní zastoupení organických sloučenin (tedy různých uhlíkatých sloučenin), mezi nimiž mají v živých buňkách (ostatně pro život jako vlastnost vyvíjející se hmoty vůbec) specifické postavení především biopolymery fungující jako informační makromolekuly (nukleové kyseliny, proteiny a polysacharidy). Nukleové kyseliny jsou nezbytné pro procesy autoreprodukční. Proteiny jsou jednak strukturními komponentami buňky, jednak plní řadu většinou velmi specifických funkcí; např. bez enzymů by se nemohla uskutečnit většina biochemických procesů (syntetických nebo regulačních), konec konců život jako takový je za pozemských podmínek bez katalytické aktivity enzymů nepředstavitelný. Oligosacharidy a polysacharidy jsou zapojeny do velmi četných dějů intermediárního metabolizmu a jsou též významnými stavebními složkami buněk. Mimo jiné se významně podílejí na ochraně buněk (buněčné stěny) a na rozpoznávacích a transportních buněčných procesech (receptory, antigeny aj.). Jednotlivé buněčné komponenty vytvářejí velmi složité, hierarchicky uspořádané, dynamické struktury, participující na udržení stacionárního stavu (tj. stavu vzdáleného od stavu termodynamické rovnováhy).
5
I.3. BIOLOGIOCKÝ SYSTÉM JAKO ENERGETICKÝ SYSTÉM Životní procesy v buňce jako reálném hmotném systému se nemohou uskutečňovat beze změn energie, tj. bez příjmu a výdeje energie (energetická bilance), jejího přenosu a transformace. Připomeňme si, že energie je vlastně nejobecnější mírou pohybu hmoty, je od hmoty neoddělitelná (E = m c2), je její vlastností a proto nemůže být produkována. Primárním vnějším zdrojem energie pro živé systémy je Slunce. Existence takového zdroje energie je nezbytnou podmínkou pro vznik, udržení a progresívní evoluční vývoj uspořádaných stavů biologických systémů prostřednictvím realizace negentropických dějů. Buňky jsou schopné energii s okolím permanentně vyměňovat, uvnitř ji transformovat ve volnou energii a fixovat volnou energii při chemických reakcích. Bez takové výměny energie by buněčné děje záhy ustaly a systém by spěl do stavu termodynamické rovnováhy, protože část energie, přeměněná při intracelulárních transformacích energie na teplo, by nebyla doplněna z vnějšího energetického zdroje a v důsledku toho by se v buňce snižovalo množství energie schopné konat práci. Energie, uvolněná při (bio)chemických reakcích, může být deponována v makroergních vazbách některých sloučenin (např. nukleotidtrifosfátů - NTP) a v případě potřeby z nich zase, jako z pohotově dostupných donorů, uvolněna a dále transformována. Živým systémem neutilizovatelná energie může být uvolňována ve formě tepla a chemických látek s nižším obsahem energie do okolí systému.
I.4. BIOLOGICKÝ SYSTÉM JAKO INFORMAČNÍ SYSTÉM Přenos informace je vždy vázán na přenos hmoty nebo energie. Biologické systémy s okolím permanentně vyměňují informace. Buňky jako otevřené systémy využívají takovéto informace v rozsahu, který nenarušuje jejich vnitřní paměť, při regulaci životních procesů způsoby, které umožňují udržet stacionární stav. Přitom se nutně uplatňují četné zpětnovazebné vztahy (zpětné vazby pozitivní a negativní) a další regulační mechanizmy. Mezi celulárními subsystémy i mezi buňkou a jejím okolím se tedy uskutečňuje tok informací, tzn. procesy zahrnující přenos informací, jejich expresi a transformaci, případně jejich vznik a disipaci. Informační tok ve všech živých soustavách neodporuje žádnému z obecných zákonů kybernetiky a teorie informace. Každá buňka disponuje vnitřní pamětí a četnými rekogničními strukturami a mechanizmy. Ústřední roli mezi nimi sehrává genetická paměť a mechanizmy její reprodukce, přenosu a také dědičné proměnlivosti (mutability). Primárním, nepostradatelným zdrojem informací pro zachování organizace živého systému a jeho bezchybnou autoreprodukci jsou nukleové kyseliny (základní informační biomakromolekuly), v jejichž primární struktuře je obsažena genetická informace. Jak je známo z teorie informace, při přenosu informace dochází k šumu. Za specifickou formu šumu v biologických systémech je možné považovat mutaci, tj. relativně stálou, s určitou pravděpodobností vznikající, reprodukovatelnou dědičnou změnu genetické informace (primární struktury nukleových kyselin – DNA, příp. RNA). Na mutaci lze však zároveň nahlížet jako na primární událost a potenciální materiální substrát pro evoluční proces. S jistým zjednodušením můžeme konstatovat, že evoluční proces se v zásadě realizuje na základě pozitivně selektovaného šumu (mutace) v genetické informaci. Mezi další informační biomakromolekuly se řadí především proteiny a polysacharidy
6
I.5. PRINCIP HIERARCHIE V ŽIVÝCH SYSTÉMECH Všechny živé systémy jsou hierarchicky uspořádané. Hovoříme o tzv. hierarchickém principu organizace živých systémů, který lze schématicky znázornit následující posloupností jednotlivých organizačních úrovní živých systémů: atomy → molekuly a ionty → nízkomolekulární látky → makromolekulární látky → supramolekulární struktury (komplexy) → buněčné organely → jednotlivé buňky → kolonie buněk → tkáně → orgány → soustavy orgánů → organizmy → populace → společenstva → ekologické systémy → složky biosféry → biosféra. Každá z uvedených úrovní je charakteristická množinou (spektrem) pro ni specifických znaků (ve smyslu kvalitativním i kvantitativním) a současně relativní autonomií, v jistém rozsahu limitovanou vlastnostmi (potencialitami) entit nižších úrovní.
I.6. AUTOREPRODUKCE Základním předpokladem autoreprodukce je striktní přenos kvantitativně i kvalitativně nezměněné genetické informace z generace na generaci (vertikální přenos) a její adekvátní vyjádření (exprese). Přesný přenos genetické informace je zajištěn mechanizmy buněčného dělení (mitóza, meióza) a souvisí se zmnožením (replikací) DNA před vlastním dělením buněk. Exprese genetické informace se realizuje především prostřednictvím transkripce (přepisu) genetické informace do podoby informační ribonukleové kyseliny (mRNA) a tzv. funkčních ribonukleových kyselin – ribozomových (rRNA) a transferových (tRNA), a translace (překladu) genetické informace (strukturních genů) do podoby primární struktury polypeptidového řetězce za účasti ribozomů, souboru tRNA s navázanými aktivovanými molekulami standardních aminokyselin, mRNA a souboru translačních faktorů včetně příslušných enzymů. Procesy replikace, transkripce a translace jsou složitě regulované (regulace genové exprese). Regulovány jsou rovněž fáze buněčného cyklu, především v tzv. kontrolních bodech prostřednictvím systému cyklinů a cyklin-dependentních kináz (Cdk) a růstových faktorů. V průběhu biologické evoluce se vyvinulo několik typů a způsobů rozmnožování. Všechny lze v zásadě subsumovat do dvou základních skupin a mechanizmů. Jednu skupinu tvoří rozmnožování nepohlavní a rozmnožování pohlavní. Při studiu většiny biologických procesů na organizmální a vyšší úrovni je třeba přihlížet ke způsobu rozmnožování příslušného druhu. Stručný přehled a charakteristika některých nejčastěji se vyskytujících způsobů rozmnožování je uveden níže.
I.6.1. NEPOHLAVNÍ ROZMNOŽOVÁNÍ (AMIXE) Nepohlavní rozmnožování je evolučně původnější, typické pro organizmy nacházející se na nižším stupni fylogenetického vývoje. Mezi jeho charakteristické znaky patří absence gamet a produkce geneticky identických individuí (klonu) prostřednictvím mitotického (nebo jemu analogického – amitotického, binárního) dělení, které zajišťuje rovnoměrné rozdělení (v případě amitózy přibližně rovnoměrné) a distribuci zreplikovaných genoforů z mateřské buňky do nově vznikajících („dceřinných“) buněk. Nepohlavní rozmnožování tedy konzervuje existující genotypy (resp. genomy) a tudíž nepřispívá k rozšíření genetické variability (neuvažujeme-li vliv mutačního procesu).
7
BINÁRNÍ DĚLENÍ Jedná se o prosté rozdělení buňky na dvě části (buňky dceřinné), obsahující stejnou genetickou výbavu. Vyskytuje se u bakterií, některých jednobuněčných řas a prvoků. FIZIPARIE Jedná se o způsob rozmnožování na základě dělení (fragmentace) těla mnohobuněčných organizmů, uplatňující se např. u nižších bezobratlých živočichů (láčkovci, ploštěnci, kroužkovci) a souvisí s jejich vysokou regenerační schopností. GEMIPARIE Gemiparií rozumíme vytváření pupenů na výchozích (rodičovkých) organizmech a jejich následné oddělení za vzniku nových, samostatně existujících jedinců (potomků). Vyskytuje se například u láčkovců, mechovek nebo pláštěnců. VEGETATIVNÍ ROZMNOŽOVÁNÍ Tento způsob nepohlavního rozmnožování je typický pro stélkaté rostliny i pro mnohé druhy cévnatých rostlin. U některých taxonů rostlin existují dokonce specifické orgány vegetativního rozmnožování (cibule, hlízy, oddenky, šlahouny apod.). Mezi významné pěstitelské a šlechtitelské metody patří očkování a roubování jako formy vegetativního rozmnožování, uplatňované zejména v ovocnářství.
I.6. 2. POHLAVNÍ ROZMNOŽOVÁNÍ (AMFIMIXE) Pohlavní rozmnožování je evolučně odvozenější. Je spojeno s tvorbou gamet prostřednictvím meiózy, která mechanizmem segregace a rekombinace genů zajišťuje vyšší variabilitu genetické informace, přenášené při pohlavním aktu od rodičů na potomky. Při gametogenezi je tedy segregována do jednotlivých gamet sestava chromozomů (resp. genů), odlišná od té, která byla původně obsažena v zárodečných buňkách. Vznikají tak geneticky (genotypově) vysoce heterogenní populace. Pohlavní rozmnožování tudíž vede k rozšíření genetické variability (na rozdíl od rozmnožování nepohlavního). Primární podmínkou zplození nového diploidního (2n) jedince je splynutí dvou haploidních (1n) rodičovských gamet (resp. buněčných jader) za vzniku oplozené samičí gamety (zygoty) s jedním diploidním (2n) buněčným jádrem obsahujícím rovným dílem (tj. vždy jednou polovinou) zastoupený genetický materiál pocházející z obou zúčastněných rodičovských gamet (spermie a vajíčka, pylového zrna a vaječné buňky). Další proliferací a diferenciací zygoty se vyvíjí nový jedinec. Kromě diploidních organizmů existují též organizmy polyploidní, tj. takové, které ve svém genomu obsahují celé násobky (vyšší než dvě) haploidních (základních) sad chromozómů. Je zřejmé, že u polyploidního organizmu, např. tetraploidního, povede meióza k redukci chromozomů na polovinu a proto gamety tetraploida budou diploidní (2n) a po splynutí dvou diploidních gamet (pocházejících od tetraploidních jedinců) se u potomka obnoví tetraploidní (4n) stav. Obecně tedy platí, že při pohlavním způsobu rozmnožování se v průběhu gametogeneze redukuje počet chromozomů (obsah jaderné genetické informace) na polovinu a po oplození se obnovuje (v zygotě) původní počet chromozomů (obsah genetické informace) charakteristický pro somatické buňky příslušného druhu. Princip segregace spolu s principem kombinace (uplatňujícími se při gametogenezi) ve svých důsledcích zaručují konstantní počet chromozomů (karyotypovou stabilitu) jednotlivých druhů organizmů. 8
Je třeba upozornit na některé zvláštnosti pohlavního rozmnožování. Například zygota u některých druhů rostlin (řas) a hub bezprostředně po svém vzniku prochází meiotickým dělením za produkce haploidních pohlavních spor, z nichž se vyvinou haploidní jedinci. APOMIXE Jako apomiktické se označuje takové rozmnožování, při kterém se nový jedinec vyvíjí buď z pohlavní buňky (gamety), anebo z jiné buňky pohlavního aparátu, avšak bez vzniku zygoty (azygoticky). Apomixi tedy lze označit za zvláštní případ amfimixe. PARTENOGENEZE Partenogenezí se rozumí vývoj nového jedince z neoplozeného vajíčka nebo vaječné buňky. Například u včel se z neoplozených vajíček partenogeneticky vyvíjejí samci a proto jsou haploidní, kdežto z oplozených vajíček se vyvíjejí samice, které jsou proto diploidní. Partenogeneze se významně uplatňuje též v reprodučním procesu mšic a některých dalších skupin bezobratlých živočichů. GYNOGENEZE Při gynogenezi se nový jedinec vyvíjí ze samičí gamety, avšak po stimulaci (indukci dělení) samčí gametou. Gynogenezi lze navodit u některých druhů rostlin a bezobratlých živočichů stimulací samičí gamety samčí gametou, která byla před tím enukleována, anebo v níž bylo buněčné jádro inaktivováno (například vlivem radioaktivního ozáření). ANDROGENEZE Při androgenezi se nový jedinec vyvíjí z neoplozené samčí gamety. Androgeneze, indukovaná při kultivaci pylových zrn nebo prašníků za specifických podmínek in vitro, je jednou z efektivních a účelně používaných šlechtitelských metod k produkci haploidních rostlin, neboť v relativně krátkém časovém intervalu lze diploidizací apomikticky vzniklých haploidů získat dokonale homozygotní (dihaploidní) čisté linie. APOGAMETIE Tento způsob rozmnožování se může vyskytnout u cévnatých rostlin. Nový haploidní jedinec (resp. semeno) vzniká z některé synergidy nebo antipody, nikoli z (neoplozené) vaječné buňky. ADVENTIVNÍ EMBRYONIE Vyskytuje se u cévnatých rostlin. V tomto případě se vyvíjí nový jedinec z některé buňky nucellu.
I.7. AUTOREGULACE Procesy, uskutečňující se uvnitř živých systémů, jsou regulovány v interakcích s vnějším prostředím (okolím) vzájemně propojenou soustavou zpětných vazeb (pozitivních a negativních) a dalších autoregulačních mechanizmů. V tomto smyslu hovoříme též o biokybernetickém principu organizace živých systémů. Funkce genů, resp. jimi determinované děje v organizmech (buňkách) jsou nejednou modifikovány působením environmentálních faktorů. Příkladem může být vztah mezi endogenně podmíněnou složkou biorytmů a modifikujícím vlivem určitých složek prostředí. Pravděpodobně u všech eukaryotních organizmů se vyskytují vrozené, geneticky determinované regulované cirkadiánní rytmy, které zahrnují cyklicky se uskutečňující biologické aktivity s délkou periody 9
blízkou 24 hodinám. I když konkrétní formy této rytmicity biologických aktivit jsou výsledkem interakce genotypu a proměnlivých faktorů vnějšího prostředí, rytmicita přetrvává i při konstantních vnějších podmínkách. U živočichů se na regulačních procesech podílejí celé funkčně k tomu specializované systémy – imunitní, endokrinní a nervový. Významným druhem biocyklů u rostlin je tzv. fotoperiodizmus. Termínem fotoperiodizmus se označuje schopnost většiny druhů rostlin kvést pouze při určitém průběhu dynamicky se měnícího poměru délky dne a noci během jednotlivých ročních období. Z tohoto hlediska se rozlišují rostliny krátkého dne (např. rýže, tabák, chryzantéma) a rostliny dlouhého dne (např. špenát, huseníček, ředkev, řepa). Kromě těchto dvou skupin rostlin existují druhy, jejichž schopnost vykvést není závislá na poměru délky dne a noci a ve vztahu k fotoperiodě se tudíž chovají neutrálně (např. rajče). Fotoperiodizmus je jedním z ekologických faktorů, participující na geografickém rozšíření rostlin krátkého a dlouhého dne. Fotoperiodizmus je vysvětlován především na základě dvou modelů: 1. Model fotoperiodizmu u rostlin krátkého dne Podle tohoto modelu rostlina vykvete pouze tehdy, pokud je udržována po určitou minimální dobu ve tmě (tzv. kritická perioda). Přerušení kritické periody světlem o určité vlnové délce (v červené oblasti spektra, např. 660 nm) znemožní vykvetení, naopak osvícení světlem o určité jiné vlnové délce (např. 730 nm) může vést ke zkrácení kritické periody. V těchto procesech sehrávají významnou roli fytochromy (PhyA, PhyB, PhyC, PhyD, PhyE). Fytochromy jsou proteinové homodimery, jejichž řetězce jsou konjugovány s molekulami typu rodopsinu schopnými absorbovat světelnou energii. Jednotlivé typy fytochromů se liší rozsahem absorpčního spektra, resp. absorpčním maximem. Fytochromy se vyskytují ve dvou navzájem přecházejících formách: forma PR (red) absorbuje světlo v červené oblasti spektra, forma PFR (far red) v oblasti delších vlnových délek (> 700 nm). Absorpce červeného světla formou fytochromu PR vede k jeho konverzi na formu PFR a naopak, absorpce světla o vlnové délce větší než 700 nm formou fytochromu PFR vede k jeho konverzi na formu PR. Ve tmě (v noci), tedy v průběhu kritické periody, dochází ke spontánní konverzi formy PFR na formu PR, která je nutná ke spuštění signálu kvetení (florigenu), a k dalším doprovodným reakcím. Ozáření rostliny červeným světlem vede k okamžité konverzi fytochromů formy PR na formu PFR a tím k narušení opačně probíhající konverze v kritické periodě (PFR → PR), což může mít za následek až inhibici kvetení. Naproti tomu iluminace rostliny na počátku kritické periody světlem o vlnové délce větší než 700 nm může vést k poměrnému zkrácení kritické periody, protože je posílena tvorba fytochromu formy PR. 2. Model fotoperiodizmu u rostlin dlouhého dne (model Arabidopsis) U Arabidopsis jako modelového zástupce rostlin dlouhého dne je znám transkripční faktor typu zinkového prstu označovaný jako CONSTANS (CO). Tento faktor se podílí na spuštění celé řady genů, včetně genu FT (flowering locus T), jehož exprese je nezbytná pro navození procesů přeměny apikálních pupenů v pupeny květní. Produkce mRNA pro CO-faktor vykazuje cirkadiánní rytmicitu: v ranních a pozdně odpoledních hodinách je vysoká, v průběhu dne je nízká. Faktor CONSTANS je v buňce přes den (zejména kolem poledne) a v noci velmi účinně degradován v proteazomech. Degradace CO-faktoru je spouštěna ranním (dopopledním) světlem, ve kterém je vyšší podíl červené části spektra (kolem 660 nm) a zprostředkována fytochromem B. V pozdně odpoledních hodinách dochází k absorpci světla modré části spektra tzv. kryptochromy a světla o vlnových délkách větších než 700 nm fytochromem A, což vede k inhibici degradace CO-faktoru. Tím se CO-faktor akumuluje a může se projevit jeho regulační funkce, jejímž prostřednictvím se spouští transkripce genů, nutných pro indukci kvetení (gen FT). Existuje představa, že mechanizmus, popsaný pro Arabidopsis, by se mohl uplatňovat i u rostlin krátkého dne. Výsledky studia fotoperiodizmu u některých rostlin krátkého dne (např. rýže) naznačují, že CO-faktor (nebo faktor jemu podobný) působí jako supresor genu FT a tím jako inhibitor kvetení za dlouhého dne.
10
I.8. METABOLIZMUS Termínem metabolizmus se označuje organizovaná, integrovaná, autoregulující se soustava chemických přeměn látek a energií uvnitř živého systému, uskutečňovaná převážně prostřednictvím enzymově katalyzovaných reakcí. Metabolické děje tvoří uspořádaný systém, jehož jednotlivé subsystémy (metabolické dráhy, cykly) jsou vzájemně propojeny a v rámci systému koordinovány. Metabolické procesy probíhají permanentně v každém živém systému, podílejí se na udržení jeho homeostázy a jsou nezbytnou podmínkou jeho existence. Veškeré živé systémy jsou primárně závislé na vnějších zdrojích látek a energie. Buňky mnohobuněčných organizmů využívají rovněž látek, které do nich pronikají z vnitřního prostředí ve formě dále již nehydrolyzovatelných živin (aminokyseliny, monosacharidy, mastné kyseliny, vitaminy). Prostřednictvím metabolických procesů jsou přeměňovány látky, které do buňky (organizmu) proniky z vnějšího prostředí i ty, které již byly v buňce (organizmu) vytvořeny. Přitom vynikají nejen látky (produkty) pro buňku (organizmus) nezbytné , ale též látky nepotřebné, látky dále v buňce (organizmu) již neutilizovatelné (zplodiny látkové přeměny), nebo látky škodlivé, které jsou vylučovány z buňky (organizmu) do vnějšího prostředí. V živých systémech je udržován stacionární stav neustálou výměnou hmoty, energie a informací s okolím a tím je možné dosáhnout homeostáze, tedy zdánlivě s časem se neměnícího konstantního složení a konstantních vlastností (fyzikálních, chemických) uvnitř systému. Obecně platí, že každou formu energie lze převést na jinou pouze za ztráty určitého množství využitelné energie ve formě tepla. Živé systémy nejsou schopny uvolněnou tepelnou energii převést zpětně na jakoukoli jinou jimi využitelnou formu energie; dochází tedy k tzv. degradaci energie. Transformace energie jsou nedílnou součástí všech metabolických procesů. Ty se realizují především (bio)chemickými reakcemi. Množství využitelné energie, která se při uvažované chemické reakci může uvolnit, představuje tzv. změna Gibbsovy (volné) energie (∆G). Pro biologické systémy se udává jako standardní změna Gibbsovy energie ∆G˚′ za podmínek: t = 22˚C (=295K), p = 101,3 kPa, koncentrace reaktantů c = 1 mol dm-3, pH = 7. Děje v biologických systémech probíhají v zásadě za konstantního tlaku (p = konst.) a proto konkrétní ∆G závisí na teplotě a na koncentracích reagujících složek (mimo jiné faktory). V metabolizmu dominují reakce oxidačně-redukční, při nichž se redukovaná látka (donor elektronů) oxiduje a současně jiná oxidovaná látka (akceptor elektronů) redukuje. Jednotlivé oxidoredukční soustavy lze charakterizovat prostřednictvím standardního redukčně-oxidačního potenciálu (Eº), který vyjadřuje redukční (resp. oxidační) sílu systému vztaženou ke standardu (vodíkové elektrodě). Předpokládejme, že se látka A může uvolněním elektronu oxidovát za vzniku kationtu (A ↔ A+ + e-) a látka B přijetím elektronu redukovat za vzniku aniontu (B + e- ↔ B¯ ). Jestliže bude redoxní potenciál soustavy B/B¯ vyšší než soustavy A/A+, potom látka B může fungovat jako oxidační činidlo (akceptor elektronů) látky A (donor elektronů) a oxidovat ji. V soustavě látek, uspořádaných vzestupně podle hodnot redoxních potenciálů, mohou spontánně probíhat reakce ve směru od látky (složky) s nižším redoxním potenciálem k látce (složce) s vyšším redoxním potenciálem; přitom dochází k uvolnění odpovídajícího množství energie (při rozdílu redoxně-oxidačního potenciálu 1V je to přibližně 95,6 kJ·mol-1). Reakce opačným směrem se mohou realizovat pouze za suplementace potřebného množství energie. V biologických systémech jsou takové reakce umožněny katalytickou aktivitou enzymů, jejíž podstata spočívá ve snížení aktivační energie, a spřažením jednotlivých biochemických reakcí v intermediárním metabolizmu. K posouzení uskutečnitelnosti určité reakce a charakteru jejího průběhu (exergonická, endergonická apod.) je tedy vhodné použít tabelovaných hodnot standardních redoxních potenciálů. Doplňme, že oxidace v živých systémech probíhají stupňovitě, zpravidla jako 11
dehydrogenace (tj. přenosem dvou elektronů z uvolněného jednoho páru atomů vodíku na vhodný akceptor, resp. přenašeč jakým je NAD+ nebo NADP+); přímá, jednostupňová oxidace by ve většině případů vedla k uvolnění velkého množství tepelné energie, které by přesahovalo kompenzační kapacitu biologického systému, systém by se přehřál a v důsledku toho poškodil nebo zcela dezorganizoval (zánik systému, smrt). Veškeré biochemické reakce v buňce (organizmu) se řídí stejnými fyzikálními a chemickými zákony jako chemické reakce v neživých systémech, avšak vyznačují se některými zvláštnostmi, charakteristickými pro živé systémy. Především jsou tyto reakce, jak už bylo zmíněno výše, v naprosté většině katalyzovány enzymy, zajišťovanými (podobně jako potřebná energie) samotnou buňkou. Určité reakce probíhají pouze v některých buněčných kompartmentech, takže jsou prostorově separovány od jiných reakcí probíhajících v jiných buněčných kompartmentech. Biochemické reakce se realizují též v určitém časovém sledu a návaznosti, jsou navzájem spřažené. Produkty jedné reakce se stávají substráty pro další reakce, produkty těchto reakcí se stávají zase substráty pro jiné navazující reakce atd., takže se v buňce vytváří plynulý tok látek (metabolitů) a energie. Většina biochemických reakcí se uskutečňuje za relativně konstantních nízkých teplot a tlaků; výjimky z toho představují organizmy, které osidlují některé extrémní biotopy (horké vody, dna oceánů apod.). Ve všech živých buňkách jsou obměňovány veškeré chemické komponenty, kromě DNA obsahující genetickou informaci. Takováto obměna se označuje jako metabolický obrat (turnover). Přitom je nutné, aby byl zachován stacionární stav, jinými slovy, aby si rychlosti syntetických a rozkladných procesů byly rovny (resp. nepřesahovaly rozsah přijatelných odchylek). Metabolizmus je především funkčně spjat s růstem buňky (organizmu). Avšak i v těch buňkách, které se nedělí a nerostou, se uskutečňují určité, pro přežití buňky nezbytné tzv. udržovací procesy (housekeeping processes), kterými jsou obnovovány organické komponenty buňky a udržovány adekvátní gradienty iontů na membránách (neboť intracelulární iontové složení je odlišné od extracelulárního). Důsledkem těchto procesů je skutečnost, že se buňka nachází ve stacionárním stavu, ve kterém se její složení zásadně nemění; přitom utilizuje energii, aniž by konala práci. Vzhledem k nesmírné rozmanitosti živých systémů fosilních i recentních jsou adekvátně tomu rozmanité i metabolické procesy. Zároveň však existuje určitá početně nevelká skupina evolučně konzervovaných metabolických procesů, které se vyskytují (téměř) univerzálně ve všech živých systémech. Souhrn reakcí endergonických (tj. reakcí, k jejichž uskutečnění je třeba dodat energii), většinou spojených s redukcí substrátů (prekurzorů) a rezultujících v syntézu složitějších, energeticky bohatších látek (tj. látek s vyšším obsahem volné energie), představuje ten oddíl metabolizmu, který se označuje jako anabolizmus. Naopak souhrn reakcí exergonických (tj. reakcí probíhajících za podmínek existujících v daném živém systému spontánně, bez dodání energie), většinou spojených s oxidací substrátu (výchozí látky) a rezultujících v látky jednodušší, energeticky chudší (tj. s nižším obsahem volné energie), představuje ten oddíl metabolizmu, který se označuje jako katabolizmus (reakce degradační, rozkladné). Metabolické děje se tedy rozdělují do dvou základních skupin: (1) děje anabolické (anabolizmus), jejichž prostřednictvím jsou v buňce (organizmu) syntetizovány nové, chemicky složitější látky a (2) děje katabolické (katabolizmus), jejichž prostřednictvím jsou z vnějšího prostředí přijímány látky a energie a přeměňovány uvnitř buňky (organizmu) podle momentálních potřeb na látky chemicky jednodušší. Některé metabolické procesy zasahují jak do dějů anabolických, tak katabolických a označují se jako amfibolické. Kromě toho se vyskytují též tzv. děje anaplerotické, jejichž prostřednictvím jsou pouze doplňovány intermediární produkty metabolických drah.
12
Biosyntetické procesy se v živých systémech obecně uskutečňují čtyřmi základními typy reakcí. Mezi ně patří: (1) reakce kondenzační – tyto reakce se uplatňují při biosyntéze mnoha sloučenin, především polysacharidů, tuků a peptidů (proteinů). Za dodání energie se při tom mezi kondenzujícími složkami vytvářejí chemické vazby glykozidové, esterové nebo peptidové; na syntézu každé takové vazby je zapotřebí více než jedné makroergní vazby ATP, naopak při její hydrolýze se menší množství energie uvolní (∆G ~ -12 kJ·mol-1). Výchozím substrátem při biosyntéze polysacharidů je fosforylovaný monosacharid. Velmi často jím je glukóza-1-fosfát, jehož přítomnost v buňce může být výsledkem různých metabolických cest (např. fosforylace glukózy při hydrolytické degradaci polysacharidů, meziprodukt glukoneogeneze, meziprodukt fotosyntézy). Reakcí glukóza-1-fosfátu s UTP se uvolní fosfát a vznikne UDP~glukóza, která může plnit roli prekurzoru pro syntézu glykogenu. Při syntéze tuků (triacylglycerolů) karboxylová kyselina nejprve za utilizace energie poskytované ATP a uvolnění fosfátu vytváří meziprodukt acyl-AMP. Na tento meziprodukt se napojuje enzym, který katalyzuje další reakci, při které dochází k substituci AMP za koenzym A a jejímiž produkty jsou acyl-koenzym A a AMP. Biosyntéza (poly)peptidů, resp. proteinů, je popsána podrobněji na jiném místě (podkapitola Translace). (2) reakce redukční - v živých systémech se syntetické redukční reakce uskutečňují převážně mechanizmem hydrogenace, při čemž se významně uplatňuje jako přenašeč vodíku především NADP, méně často NAD. Pozn.: Přestože standardní redukčně-oxidační potenciál NAD i NADP je stejný ( E0 = - 0,32 V), jejich skutečný redoxně-oxidační potenciál v buňce je rozdílný (pro NAD činí kolem –0,2 V, pro NADP kolem 0,4 V, což odráží jejich kvantitativně rozdílné zastoupení v buňkách v redukované nebo oxidované formě: NAD > NADH+H+, kdežto NADP < NADPH+H+). S tím souvisí i jejich odlišná afinita vůči dehydrogenázám, ve kterých fungují jako koenzymy; soustava NADP/NADPH+H+ se uplatňuje převážně v anabolických procesech, soustava NAD/NADH+H+ převážně v katabolických procesech. (3) reakce hydroxylační – těmito reakcemi je za účasti zpravidla NADPH+H+ včleněn molekulární kyslík do molekuly určité organické sloučeniny ve formě hydroxylové skupiny. Vyskytují se často například jako reakce zapojené do posttranslačních úprav polypeptidových řetězců (např. hydroxylace prolinu na hydroxyprolin) nebo úprav xenobiotik (hydroxylované molekuly některých xenobiotik jsou z organizmu snadněji vylučovány, anebo jsou v něm snadněji degradovatelné). (4) asimilace molekulárního dusíku – asimilace molekulárního (vzdušného dusíku) je unikátním reakčním mechanizmem. Vyskytuje se pouze u některých druhů prokaryot (Azotobacter, Rhizobium) a za využití katalytické aktivity nitroreduktázy jim umožňuje přeměnu tohoto plynu na amoniak (resp. amoniové ionty) podle obecného schématu: N2 + 8H+ + 16ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi Pozn.: V tomto reakčním mechanizmu významnou roli plní atomy Fe (Fe/S přenašeč) a atom Mo, které molekula nitroreduktázy obsahuje. Molekula N2 se váže na atom Mo (beze změny jeho oxidačního čísla) a je redukována elektrony, jejichž donorem jsou atomy Fe; ATP snižuje redukčně-oxidační potenciál oxidoredukčního centra (z hodnoty přibližně – 0,28V na hodnotu přibližně – 0,43V). Podle příjmu látek (výživy) a energie z vnějšího prostředí a jejich využití můžeme biologické systémy utřídit podle několika hledisek do různých skupin: (1) podle zdroje přijímané energie jsou to fototrofové, kteří využívají sluneční energii a konvertují ji na jinou formu energie, a chemotrofové, kteří uvolňují energii oxidací 13
chemických látek. Chemotrofy lze ještě dále rozdělit do dvou podskupin: chemolitotrofové, kteří oxidují anorganické sloučeniny a chemoorganotrofové, kteří oxidují organické sloučeniny (2) podle zdroje materiálu, který využívají pro vlastní výstavbu jsou to autotrofové, kteří jsou schopni syntetizovat veškeré potřebné organické sloučeniny pouze ze sloučenin anorganických, a heterotrofové, kteří mohou syntetizovat potřebné organické sloučeniny pouze z jiných organických sloučenin jako prekurzorů; tyto prekurzory jsou pro heterotrofy současně zdroji energie. Zvláštní postavení mezi autotrofy a heterotrofy zaujímají auxotrofové, tedy organizmy, které jsou schopny si vytvořit autotrofními mechanizmy téměř všechny potřebné organické látky až na několik málo, nebo dokonce pouze jedinou, které (kterou) musejí získat již v hotovém stavu (stejně jako heterotrofové). (3) podle donorů elektronů jsou to litotrofové, u kterých jsou donorem elektronů jednoduché anorganické látky (např. voda, sulfan, amoniak) a organotrofové, u kterých jsou donorem elektronů organické látky (např. glukóza, mastné kyseliny) (4) podle konečných akceptorů elektronů jsou to anaerobové, pro které jsou konečným akceptorem elektronů různé, většinou anorganické látky působící jako oxidační činidla s nízkou účinností, a aerobové, pro které je konečným akceptorem elektronů molekulární kyslík. Mezi mikroorganizmy existují skupiny, které v souhrnu vytvářejí téměř spojitý přechod od anaerobiózy k aerobióze. Obligátní anaerobové jsou organizmy s fermentativním nebo anaerobním metabolizmem, které mohou existovat pouze v prostředí bez přístupu molekulárního kyslíku (je pro ně toxický). Aerotolerantní anaerobové se od obligátních anaerobů odlišují toliko v tom, že mohou existovat i v přítomnosti molekulárního kyslíku, ale nevyužívají ho jako akceptoru elektronů. Mikroaerofilové již mohou nejen existovat v prostředí s molekulárním kyslíkem, ale tento kyslík mohou i využívat jako akceptor elektronů za podmínky, že jeho koncentrace v atmosféře je vyšší než koncentrace v substrátu (prostředí, ve kterém rostou). Fakultativní anaerobové jsou organizmy s fermentativním, aerobním i anaerobním metabolizmem (respirací), které mohou existovat v přítomnosti molekulárního kyslíku i v jeho nepřítomnosti. Využívají molekulární kyslík jako základní akceptor elektronů, avšak při jeho nedostatku nebo nepřítomnosti mohou metabolizovat anaerobně. Obligátní aerobové mohou existovat pouze za přítomnosti molekulárního kyslíku, který je konečným akceptorem elektronů jejich aerobního metabolizmu (aerobní respirace). U chemoorganotrofů se rozlišují tři základní typy dýchání (respirace): (1) anaerobní, při kterém je donorem elektronů nějaká organická sloučenina a akceptorem elektronů kyslíkatá sloučenina (např. NO3, NO2, SO42), avšak nikoli molekulární kyslík (2) fermentace, při kterém je donorem elektronů organická látka a akceptorem elektronů některý z meziproduktů její dehydrogenace (oxidaxe) (3) aerobní, při kterém je donorem elektronů organická látka a akceptorem elektronů (a to externím) molekulární kyslík. Oxidovaná látka (donor elektronů) může být podrobena oxidaci úplné (tj. až na anorganické sloučeniny s nejnižším obsahem volné energie, tzv. energetické žebráky – oxid uhličitý + voda), anebo neúplné (tj. na sloučeninu s vyšším obsahem volné energie, např. acetát). Anaerobní metabolizmus je charakteristický tím, že potřebná energie se uvolňuje při přechodu atomů vodíku mezi soustavami o různých redoxně-oxidačních potenciálech. Hlavním intracelulárním substrátem, který je možné v tomto smyslu vzužít, jsou monosacharidy. Vzhledem k tomu, že rozdíly redoxně-oxidačních potenciálů soustav sloučenin vznikajících metabolizováním monosacharidů jsou malé, je malý i výtěžek anaerobního metabolizmu (např. metabolizováním molekuly glukózy na laktát se uvolní energie o hodnotě přibližně 200 kJ·mol-1 14
a jsou syntetizovány 2 molekuly ATP). Některá eukaryota a bakterie (např. Clostridium botulinum, Trichomonas vaginalis) jsou schopny využívat i jiné typy redoxních soustav, např. soustavu acetát/pyruvát (E˚ ~ - 0,65V, energie uvolněná při využití dvou atomů vodíku postačuje k syntéze 1 molekuly ATP). Fermentativní metabolizmus využívá dehydrogenace aldehydové skupiny (3C - sloučeniny) na karboxylovou skupinu (rovněž 3C - sloučeniny) a přenosu dvou atomů vodíku na NAD+ (E˚ ~ - 0,5V). Tato reakce probíhá nejen při fermentaci, ale též při glykolýze. Její spřažení s redukcí pyruvátu je vlastním základem anerobní glykolýzy; při ní se přenášené atomy vodíku nakonec využití k redukci pyruvátu na laktát (E˚ ~ - 0,2V). Rozdíl redoxně-oxidačních potenciálů obou uvedených soustav je přibližně 0,5V; tomu odpovídá uvolnění energie o velikosti přibližně 50 kJּmol-1, což je dostačující k syntéze jedné molekuly ATP mechanizmem tzv. substrátové fosforylace: aldehydová skupina ke oxidována molekulou fosfátu za vzniku karboxylfosfátu a přenosu dvou atomů vodíku na NAD+; fosfátová skupina je následně za katalytické aktivity kinázy přenesena na molekulu ADP Aerobní metabolizmus využívá jako finální akceptor elektronů molekulární kyslík. Standardní redukčně-oxidační potenciál soustavy H2O/O2 je přibližně + 0,82V (resp. přibližně + 0,75V uvnitř buněk z důvodu nižšího nižšího parciálního tlaku kyslíku). Za těchto podmínek je možné většinu živin intracelulárně úplně oxidovat až na CO2 a H2O. Základní procesy anaerobního metabolizmu eukaryot (nevratná oxidační dekarboxylace pyruvátu na acetylkoenzym A, beta-oxidace mastných kyselin, cyklus trikarboxylových kyselin) se uskutečňují v mitochondrích (blíže viz kapitola Mitochondrie), jejíž matrix obsahuje příslušnou enzymovou výbavu. Většina energie, kterou mitochondrie buňkám poskytují se však uvolňuje při oxidaci NADH + H+ složkami dýchacího řetězce, který jako celek zprostředkuje přenos elektronů z redukovaného NAD v mitochondriální matrix na molekulární kyslík. Hlavní složky dýchacího řetězce mitochondrií tvoří čtyři komplexy molekul: komplex I (FeS-proteiny), komplex II (sukcinátdehydrogenáza), komplex III (FeS – proteiny a cytochromy) a komplex IV (sukcinátdehydrogenáza). Komplexy I, III a IV přenášejí elektrony přes relativně velký rozdíl redoxně-oxidační potenciál a současně utilizují uvolněnou energii pro transport protonů z mitochondriální matrix přes vnitřní membránu do mezimembránového prostoru. Komplex II zprostředkuje oxidaci sukcinátu a přenos uvolněných elektronů na ubichinon (derivát izoprenu), který funguje jako přenašeč elektronů mezi komplexem I a komplexem III, avšak energie se přitom uvolní jen velmi málo (protože rozdíl hodnot redoxpotenciálů obou zúčastněných soustav je nepatrný). Přenos elektronů mezi komplexem III a komplexem IV zajišťuje cytochrom c (malý protein navázaný na vnější povrch vnitřní metochondriální membrány). Při přenosu dvou elektronů celým dýchacím řetězcem až na molekulární kyslík (čemuž odpovídá rodíl redoxpotenciálů přibližně 1V) se jednosměrně přetransporutje asi 10 protonů z matrix na vnější stranu vnitřní mitochondriální membrány, čímž se na této membráně ustaví protonový gradient. Přenos dvou elektronů přes tento gradient se realizuje za spotřeby kyslíku a je spřažen se syntézou ATP mechanizmem tzv. oxidativní fosforylace. Je tedy patrné, že tento způsob syntézy ATP je závislý vzniku protonového gradientu při dýchání (obecně na dýchání) a zároveň dýchání závisí na momentálním množství ADP, které může být fosforylováno na ATP. V důsledku toho vyšší spotřeba ATP vede konec konců ke zrychlení respirace (je vyšší nabídka ADP) a podobně vyšší nabídka ATP vede k rozvoji procesů, vyžadujících dodání energie. Metabolické procesy, týkající se degradace a biosyntézy sacharidů, lipidů, proteinů, nukleových kyselin a jejich stavebních jednotek, se souhrnně označují jako primární (základní) metabolizmus. V obecné rovině a s jistou nepřesností lze konstatovat, že základní metabolizmus je v zásadě shodný (nebo téměř shodný) v buňkách všech organizmů. Kromě toho existují ještě víceméně druhově specifické metabolické procesy, které navíc mohou probíhat jen 15
v některých tkáních (orgánech) mnohobuněčných organizmů, nebo jen v určité fázi jejich ontogenetického vývoje; takovéto procesy se souhrnně označují jako sekundární metabolizmus a jeho produkty jako sekundární metabolity. Sekundární metabolity mohou být někdy pro svého producenta nepostradatelné (např. hormony ve smyslu chemických signálů), často však zásadní význam pro průběh a udržení jeho životních funkcí nemají, ale představují pro něho určitou selektivní výhodu (např. rostlinné alkaloidy, antibiotika, biotoxiny.
I.9. RŮST Růst zahrnuje procesy syntézy jednotlivých stavebních (strukturních) komponent živého systému, odráží procesy transkripce a translace genetické informace (především v interfázi buněčného cyklu nebo v G0 fázi) a navazuje na ně. U mnohobuněčných organizmů (resp. jednobuněčných, žijících v koloniích) je růst vyjádřen nejen těmito procesy, ale též proliferační aktivitou (dělením) buněk. V ontogenezi mnohobuněčných organizmů není rychlost růstu konstantní, ale proměnlivá. Vyjádření dynamiky růstu v časoprostorové posloupnosti je zde možno chápat jako jeden z projevů asymetrie morfogenetických (embryogenetických, histogenetických, organogenetických) a tudíž i diferenciačních procesů. Růst souvisí též s procesy regeneračními a některými adaptačními. Řada organizmů je schopna regenerovat kompletně nebo parciálně poškozené části (pletiva, tkáně, orgány); dokonce z některých buněk může regenerovat celý organizmus (omnipotentní buňky, totipotentní buňky) nebo jeho poměrně rozsáhlé části (pluripotentní buňky). Regenerace (obnova) určitých tkání může být celoživotním charakteristickým znakem některých mnohobuněčných organizmů (např. fakticky růst studenokrevných živočichů, diferenciace krvinek z kmenových buněk). Naproti tomu některé jiné buňky dospívají tzv. terminální diferenciací do stadia, ve kterém již neproliferují a nejsou schopny dediferenciace a následné rediferenciace. Mezi adaptační procesy, související s růstem, lze zařadit hyperplázii (= zvýšená mitotická aktivita buněk bez zvětšení jejich rozměrů jako adaptační reakce na fyziologickou zátěž) a hypertrofii (= zvýšená mitotická aktivita buněk současně doprovázená zvětšením jejich rozměrů). U involujících mnohobuněčných organizmů (nebo kolonií jednobuněčných organizmů) dochází ke zpomalení až zástavě růstu, resp. úbytek buněk převažuje nad produkcí nových buněk (rychlost růstu nabývá záporných hodnot). Základní zákonitosti a charakteristiky růstu ozřejmíme na příkladu růstu individuální buňky a populace (kolonie) buněk. Růst individuální buňky lze sledovat přímo (mikroskopicky) nebo nepřímo (mikrofotograficky, mikrokinematograficky apod.). Z naměřených veličin (délka, šířka, průměr, objem buňky) v různých časových intervalech lze vyvodit závěr, že růst buňky je za optimálních podmínek přibližně exponenciální (hodnoty sledovaných veličin s časem rostou exponenciálně), i když v mezích jednoho buněčného cyklu se exponenciála nemusí výrazně lišit od přímky. Růst bakteriální buňky je v průběhu jedné generační doby téměř plynulý, u eukaryotické buňky mohou být v průběhu buněčného cyklu patrné fluktuace (např. větší rychlost růstu ve fázi G1 a G2 oproti fázím mitózy). Růst buněčné populace se obvykle hodnotí pomocí parametrů růstu odvozených od proliferační aktivity buněk sledované populace. Za podmínek statické kultivace je možné růst rozdělit do čtyř fází: (1) fáze klidová (lag fáze) je obdobím přípravy buněk na růst, proliferační aktivita limituje k nule (teoreticky je nulová), (2) fáze exponenciální je charakteristická intenzívní proliferací s exponenciálním nárůstem populace, (3) fáze stacionární, v níž dochází postupně ke zpomalování růstu (proliferační aktivity) a současně k nárůstu úhynu buněk až do ustavení rovnováhy mezi přírůstkem nových 16
buněk a úhynem starých, (4) fáze odumírání (resp. zániku populace) je charakteristická narušením ustavené rovnováhy mezi přírůstkem a úhynem ve fázi stacionární ve prospěch úbytku. V momentě zániku populace všechny buňky uhynuly. Grafickým vyjádřením dějů prvních tří fází je sigmoidální křivka. Jestliže budeme uvažovat průměrnou rychlost dělení buněk v populaci (R), generační dobu (G), počet generací (n), počet buněk v nulté generaci (N0), počet buněk v t-té generaci (Nt), časový interval (∆t = tt – t0) mezi nultou generací (t0) a t-tou generací (tt), dobu potřebnou ke zdvojnásobení počtu buněk (T, doubling time), rychlost množení (c) udávající počet generací za časovou jednotku, pak pro jednotlivé parametry růstu buněčné populace lze odvodit následující vztahy: Nt = N0 ּ 2 n (za předpokladu, že dělením každé mateřské buňky vzniknou dvě nové buňky) R = n / ∆t G=1/R n = (log Nt - log N0) / log 2 T = ∆t / n c = 1 / T = n / ∆t Nt = N0 ּ 2cּ ∆t (základní rovnice růstu buněčné populace) Derivací základní rovnice (exponenciály) růstu buněčné populace podle času dostaneme rovnici pro rychlost růstu. Pro výpočet hodnoty směrnice úsečky znázorňující exponenciální fázi růstu při semilogaritmickém uspořádání grafu, ve kterém je logaritmus (log nebo ln) počtu buněk vyjádřen jako funkce času, platí vztahy: k = (log Nt – log N0) / ∆t = log 2ּ R ≅ 0,301ּ R µ = (ln Nt – ln N0) / ∆t = ln 2ּ R ≅ 0,693ּ R Popsané fáze růstu buněčné populace mají obecnější platnost; lze je aplikovat například i na vývoj některých populací v ekosystémech.
I.10. POHYB Všechny živé systémy vykazují určité formy pohybu (od fyzikálního pohybu atomů, iontů a molekul až k různým formám vlastního aktivního pohybu, realizovaného prostřednictvím specializovaných pohybových struktur a orgánů – cytoskelet, pseudopodie, kinocilie, končetiny apod.). Živé systémy se mohou pohybovat pasivně a/nebo aktivně. Pasivní pohyb je generován silovým působením vnějšího zdroje pohybu na biologický objekt a realizuje se bez energetického 17
výdaje biologického objektu. Jako příklady pasivního pohybu můžeme uvést anemochorii (pohyb způsobený větrem) nebo hydrochorii (pohyb způsobený vodou). Aktivní pohyb spočívá v přeměně chemické energie v energii mechanickou (kinetickou) biologickým systémem za utilizace jeho vlastních zdrojů energie (obvykle ATP nebo jiné sloučeniny s makroergními vazbami). Zpravidla se uskutečňuje jako reakce na fyzikální nebo chemický podnět (tzv. indukované pohyby), v některých případech samovolně (tzv. autonomní či endogenní pohyby), bez zjevného vnějšího stimulu. Mezi autonomními pohyby lze jmenovat například turgorové a nutační pohyby rostlin. Z velké škály různých forem indukovaného aktivního pohybu uvedeme alespoň některé. Taxe představují lokomoční pohyby směrem ke zdroji stimulu (pozitivní taxe) nebo směrem od zdroje stimulu (negativní taxe), často pod specifickým úhlem mezi organizmem a zdrojem stimulu, např. fototaxe, chemotaxe, hydrotaxe, termotaxe, proudění cytoplazmy, pohyb bičíků. Tropizmy jsou ohybové pohyby rostlin pozitivně nebo negativně orientované vůči směru působení stimulu (pozitivní a negativní tropizmy), např. fototropizmus, geotropizmus, chemotropizmus. Nastie jsou pohyby rostlin neorientované vůči směru působení stimulu, např. fotonastie, nyktinastie, termonastie, seizmonastie. Pozn.: Taxe jsou známy i u jednobuněčných organizmů. Například Escherichia coli se pohybuje pozitivně chemotakticky v médiu k místu vyšší koncentrace glukózy, galaktózy nebo některých aminokyselin (serin, aspartát). Pozitivní chemotaxi na tzv. chemokiny (skupina cytokinů) vykazují některé buňky imunitního systému. U řas rodu Chlamydomonas je typ fototaxe ovlivněn intenzitou světla o určité vlnové délce: při nižší intenzitě světla se řasa pohybuje pozitivně fototakticky (k jeho zdroji), po dosažení určité hodnoty a dalším zvyšování intenzity světla nad tuto hodnotu se pohybuje negativně fototakticky (od jeho zdroje). U některých druhů bakterií je známa též magnetotaxe; například sladkovodní bakterie Magnetospirillum magnetotacticum obsahuje uvnitř buňky drobné částice magnetitu, které na Severní Polokouli způsobují její pohyb po magnetických siločarách směrem k severnímu pólu a vzhledem ke sklonu těchto siločar (inklinaci) též směrem ke dnu, kde žijí. Magnetotaktické bakterie, osidlující biotopy na Jižní Polokouli, se obdobně pohybují směrem k jižnímu pólu. V buňkách realizují transformaci chemické energie na energii kinetickou převážně tzv. molekulové motory. Jsou to složené oligomerní proteiny typu ATPáz, asociované s mikrotubuly (dyneiny, kineziny) a mikrofilamenty (myoziny). Zpravidla jeden polypeptidový řetězec molekulového motoru vytváří tzv. motorovou doménu, která vykazuje ATPázovou aktivitu a je místem kontaktu s příslušnou strukturou cytoskeletu, po níž se motor pohybuje anebo kterou pohybuje. Další polypeptidový řetězec (či řetězce) molekulového motoru vytváří tzv. koncovou doménu, která nese vazebná místa pro různé molekuly nebo supramolekulární buněčné struktury; některé z těchto polypeptidových řetězců obsahují též vazebná místa pro ligandy, které mohou funkci motoru regulovat. Molekulární motory samy zajišťují uvolnění energie, potřebné k mechanickému pohybu, vlastní katalytickou aktivitou, kterou vykazují při hydrolytickém štěpení ATP. Z tohoto důvodu bývají někdy též označovány jako mechanokatalytické enzymy (tento název se však dnes používá již zřídka). K hydrolytickému štěpení ATP dochází po kontaktu molekulového motoru s mikrotubulem nebo mikrofilamentem, po němž se pohybuje anebo jímž pohybuje. Vlastní mechanizmus pohybu nefixovaného (volného) molekulárního motoru po určité cytoskeletární struktuře se uskutečňuje na principu konformačních změn motorové domény, indukovaných energií uvolněnou při hydrolýze ATP. Tyto konformační změny rezultují v parciální posun motorové domény po cytoskeletární struktuře, po jehož dokončení motorová doména obnovuje svou původní konformaci. Cyklickým opakováním posunu motorové domény se motor postupně pohybuje v určitém směru. Jestliže je molekulový motor koncovou doménou fixován k nějakému celulárnímu podkladu, potom se popsanými cykly posouvá cytoskeletární struktura (mikrotubulus, mikrofilamentum apod.); takovýto způsob pohybu cytoskeletárních struktur se označuje jako klouzání (sliding). 18
Oba uvedené pohyby, zprostředkované molekulárními motory (tj. pohyb motorů po cytoskeletárních strukturách a pohyb cytoskeletárních struktur vůči fixovanému motoru), jsou podkladem pro uskutečnění všech forem aktivních pohybů na buněčné úrovni. Přitom pro jednotlivé molekulové motory je charakteristický směr pohybu (např. dynein směřuje od plus-konce k minus konci mikrotubulu). Molekulové motory nevykazují specifitu pro určitý druh transportovaného materiálu. Přiřazení buněčného objektu (struktury), který má být transportován, určitému typu molekulového motoru je řízeno rozpoznávacími proteiny (tzv. adaptory), které disponují vazebnými místy jak pro transportovaný objekt (strukturu), tak pro příslušný typ molekulového motoru. Aktivní pohyb se realizuje na různých úrovních organizace živé hmoty (molekulární, buněčné, organizmální). Koordinací spektra (souboru) pohybů na nižší organizační úrovni se realizují pohyby na úrovni vyšší.
I.10.1. AMÉBOIDNÍ POHYB Améboidní pohyb je formou lokomoce buňky po povrchu pevného substrátu. V buňce pohybující se tímto způsobem jsou účinkem solifikačních proteinů, asociovaných s mikrofilamenty, nejprve navozeny změny v konzistenci buněčného kortexu, který přejde ze stavu gelu do stavu solu. Tím jsou dány podmínky pro vytvoření výběžku (pseudopodium, filopodium) ve směru pohybu buňky. Výběžek se prodlužuje a současně adheruje k podkladu. Někdy k podkladu adherují pouze specifické úseky výběžků za účasti extracelulární matrix, která je prostřednictvím jednoho typu transmembránových proteinů, tzv. integrinů a některých dalších proteinů (jako vinkulin, talin apod.) propojena s intracelulárními mikrofilamenty; v těchto případech hovoříme o fokálním kontaktu. Jednotlivé fokální kontakty mohou být u některých buněk vzájemně propojeny proteinovými strukturami aktinového typu, nazývanými stresová vlákna. Pro posun buňky ve směru buněčného výběžku je nutná následná kontrakce buňky na opačném pólu, než se nachází výběžek. Směr pohybu lze považovat za odpověď buňky na vnější chemický nebo fyzikální podnět (chemotaxe, fototaxe, reotaxe apod.).
I.10.2. POHYB KINOCILIÍ (BIČÍKŮ A ŘASINEK) Významnou mikrotubulární strukturou jsou bičíky a řasinky buněk eukaryotických organizmů. Jsou to buněčné útvary, zajišťující aktivní pohyb buňky. Jejich vlastní pohybový aparát sestává ze systému vzájemně propojených devíti dvojic mikrotubulů uspořádaných po obvodu a jedné dvojice mikrotubulů lokalizované uprostřed. Vždy s jedním mikrotubulem z každé obvodové dvojice je asociován v pravidelných odstupech pár ramének dyneinu, která se mohou za utilizace energie uvolněné štěpením ATP posouvat po volném mikrotubulu sousední dvojice směrem od vrcholu kinocilie k její bázi, tím měnit tvar kinocilie a v důsledku toho indukovat pohyb kinocilie, resp. celé buňky. Molekulárním mechanizmem tohoto pohybu je klouzání (sliding) mikrotubulů uspořádaných do svazků. Je třeba dodat, že kompletní pohybový aparát kinocilií nesestává pouze z uvedených komponent a naznačeného mechanizmu pohybu, ale je mnohem komplikovanější. Bičík bakterií se liší od bičíku buněk eukaryotických organizmů vnitřní (molekulární) stavbou i tím, že jeho povrch není pokryt cytoplazmatickou membránou (ani jiným obdobným útvarem). Základní stavební hmotou je flagelin, protein globulárního typu, jehož molekuly vytvářejí šroubovicovou strukturu (11 molekul flagelinu na jeden závit). Bičík je ukotven v cytoplazmatické membráně prostřednictvím poměrně strukturně složitého bílkovinného 19
aparátu. V cytoplazmatické membráně je kruhovitě uspořádaná soustava proteinových molekul, jejichž funkci lze považovat za funkci statoru. Do této soustavy jsou zakomponovány diskovité struktury báze bičíku, jejíž funkci lze považovat za funkci rotoru. Zdrojem energie pro pohyb bičíku je protonový gradient: tok protonů dovnitř buňky indukuje rotační pohyb bičíku. Transformace energie chemické v mechanickou se u bakteriálního bičíku děje pouze v této bazální části. Směr otáčení bičíku a tím směr pohybu bakteriální buňky je však řízen jinými buněčnými mechanizmy. Biofyzikální a biochemické aspekty mechanizmu pohybu bičíku jsou značně složité.
KINOCILIE
20
STRUKTURA KINOCILIÍ
Dvojice mikrotubulů jsou spojeny krátkými raménky dyneinu.
21
I.10.3. POHYB PŘÍČNĚ PRUHOVANÉHO SVALSTVA Kontraktilní jednotkou příčně pruhovaných svalů je sarkomera, jejíž hlavní složky tvoří aktinová a myozinová filamenta; kromě nich jsou v sarkomeře obsaženy ještě další proteiny, především tropomyozin a troponin. Typickými představiteli molekulových motorů mikrofilamentů jsou myoziny. Na každé molekule myozinu se rozlišuje hlavička, krček a ocásek. Hlavička je částí molekuly myozinu, která nese vazebné místo pro ATP a pro aktinové jednotky (monomery) mikrofilament. Hlavička vykazuje ATPázovou aktivitu, přičemž je schopna využít energie uvolněné hydrolýzou ATP k vlastnímu posunu po aktinovém mikrofilamentu. Hlavička je prostřednictvím krčku spojena s ocáskem různé délky. Délka ocásku je klasifikačním znakem, podle něhož se myoziny dělí do dvou skupin: myozin I (jednohlavičkový) má krátký ocásek a vyskytuje se v monomerní formě, myozin II (dvojhlavičkový) má dlouhý ocásek a vyskytuje se ve vláknité dimerní formě, která vzniká helikálním vinutím ocásků dvou monomerů. Molekuly myozinu II se mohou spojovat prostřednictvím takto konformovaných úseků za vzniku myozinových filament. V myofibrile jsou aktinová a myozinová vlákna uspořádána. Aktinová mikrofilamenta, asociovaná s molekulami tropomyozinu a komplexy troponinu (troponin A, B, C), jsou fixována v tzv. Z - disku myofibrily bílkovinou aktininem. Troponinový komplex je odpovědný za stabilizaci tropomyozinu v poloze, ve které překrývá molekuly aktinu v oblastech, v nichž se nacházejí vazebná místa pro myozin; proto se v klidovém stavu nemůže uskutečnit reakce mezi aktinem a myozinem. Filamenta myozinu II jsou orientována hlavičkami do mezer mezi aktinovými mikrofilamenty a stabilizována proteinem titinem. Mechanizmem svalové kontrakce je klouzání myozinových filament po aktinových mikrofilamentech. V relaxovaném stavu je na hlavičkách myozinových filament navázán ATP a je znemožněna reakce myozinu s aktinem. Po nervovém stimulu svalového vlákna (depolarizace membrány svalové buňky účinkem acetylcholinu) se z endoplazmatického retikula uvolní vápenaté ionty a naváží se na troponin C troponinového komplexu. Vazba vápenatých iontů na troponin C rezultuje v jeho uvolnění z troponinového komplexu a v důsledku toho k posunu molekul tropomyozinu; tím se demaskují vazebná místa aktinových molekul. Tyto změny vedou k aktivaci ATPázové aktivity myozinu, kterou je katalyzováno štěpení ATP na hlavičce myozinu. Štěpením ATP je umožněno navázání hlavičky myozinu na aktinové mikrofilamentum a jeho posun (po uvolnění ADP a fosfátu z hlavičky myozinu) hlavičkou myozinu směrem k ocásku myozinu. Po zpětném transportu vápenatých iontů do sarkoplazmatického retikula a po navázání ATP na vazebné místo pro ATP na hlavičce myozinu se obnoví původní (klidový) stav. Svalová kontrakce je tedy výsledkem vtahování aktinových vláken mezi vlákna myozinová a uskutečňuje se synchronní aktivací hlaviček myozinu v rozsahu celé sarkomery.
I.11. VÝVOJ Vývoj lze chápat jako realizaci naprogramovaných procesů spějících k určitému finálnímu („cílovému“) stavu jak ve smyslu ontogenetickém (vývoj jedince – embryogeneze, histogeneze, organogeneze), tak fylogenetickém (druhovém). Ve vývoji je možné rozlišit fázi (složku) progresivní (směřující od jednoduššího ke složitějšímu, resp. od nediferencovaného stavu k diferencovanému – omnipotence, totipotence, pluripotence) i regresivní (směřující od složitějšího k jednoduššímu, resp. od diferencovaného k méně diferencovanému či nediferencovanému stavu – dediferenciace, apoptóza, atavizmus). 22
I.11.1. DIFERENCIACE BUNĚK Schopnost diferenciace se vyskytuje u mnohobuněčných i jednobuněčných organizmů. Diferenciací buněk mnohobuněčného organizmu se rozumí systém procesů, jimiž v průběhu individuálního (ontogenetického) vývoje dochází k morfologickému a funkčnímu rozrůzňování dosud nerozrůzněných omnipotentních (případmě multipotentních) buněk v buňky specializované. Buňky omnipotentní jsou takové, které se mohou vyvinout v diferencovanou buňku jakéhokoli typu. Jako příklad omnipotentní buňky můžeme uvést zygotu. Multipotentní buňky mohou diferencovat v několik odlišných buněčných typů, nikoli v jakýkoli typ diferencovaných buněk. Jako příklad lze uvést prekurzorové buňky krvinek v kostní dřeni. Diferenciace buněk probíhá na různých úrovních. Za nejnižší je považována úroveň molekulární. Diferenciační procesy na molekulární úrovni se mohou manifestovat v mnoha různých formách. V některých případech jako unikátní produkty vysoce specializovaných buněk (rodopsin v buňkách sítnice, hemoglobin v erytrocytech), jindy jako soubory (spektra) určitých látek charakteristických pro jeden nebo několik typů diferencovaných buněk (soubory enzymů, izoenzymy, specifické metabolické dráhy), jako produkty strukturních genů specificky exprimovaných v daném typu diferencovaných buněk a podobně. Diferenciace na buněčné úrovni se může projevit morfologicky odlišným tvarem a velikostí buněk nebo kvalitativním a kvantitativním zastoupením některých buněčných struktur (např. přítomností či nepřítomností kinocilií a jejich různým počtem, tvarem, polohou a počtem buněčných jader). Klasickým příkladem diferenciace jednobuněčných organizmů je sporulace u sporulujících bakterií. Určitou úroveň funkční a morfologické diferenciace lze dokumentovat u jednobuněčných organizmů tvořících kolonie (např. Volvox). Diferenciace u mnohobuněčných organizmů je značně rozmanitější, komplexnější a rozsáhlejší. Diferenciace na jakékoli úrovni organizace živých systémů je primárně projevem genotypu, realizací jeho potenciálních možností. Všechny buňky, představující klon jednobuněčných organizmů, obsahují stejnou genetickou informaci (pomineme-li změny mutační). Analogicky všechny buňky mnohobuněčného organizmu obsahují totožnou genetickou informaci jako zygota, od níž jsou odvozeny. Skutečnost, že všechny buňky mnohobuněčného organizmu můžeme považovat za geneticky identické a přesto zároveň diferencované do různých typů specializovaných buněk, se vysvětluje existencí systému diferencované exprese genů. V průběhu diferenciace jsou na základě interakce genotypu jednotlivých buněk a faktorů prostředí (vnitřního – intracelulárního a vnějšího – extracelulárního až extraorganizmálního) v přesném sledu zapínány určité soubory genů a vypínány soubory jiných genů. Za obecně platný princip diferenciace lze označit princip genové kontroly. Míra diferenciace jednotlivých typů buněk je různá. S tím souvisí i problematika reverzibility a ireverzibility diferenciace. Výrazné rozdíly lze zjistit jak mezi různými typy diferencovaných buněk jedinců téhož druhu, tak mezi různými taxony. Diferencované somatické buňky explantátů rostlinných pletiv v podmínkách in vitro mohou dediferencovat v nediferencované buňky kalusu, které se za vhodných kultivačních podmínek stávají totipotentními, tzn. mohou (teoreticky i jedna samostatná buňka) regenerovat v intaktní, plně diferencovanou rostlinu. U živočichů kompletní dediferenciace buněk a jejich následná totipotence není známa. Vyskytuje se zde pouze částečná dediferenciace s možností dílčí regenerace tkání. Některé typy diferencovaných, vysoce specializovaných buněk však nejsou schopné ani částečné dediferenciace a regenerace; příkladem mohou být zralé erytrocyty savců, které dosahují tzv. terminální diferenciace, tj. stavu, ve kterém buňky nejsou schopny se dělit a spějí pouze k svému zániku.
23
Pro ilustraci uvádíme příklad diferenciace květních orgánů u rostlin. Kvetoucí rostliny procházejí dvěma základními vývojovými fázemi: vegetativní, ve které se vyvíjejí a rostou vegetativní orgány, a reprodukční, ve které se vyvíjejí reprodukční orgány. Kvetení je výsledkem vývojové přeměny apikálního meristému v květní meristém, jehož diferenciací se vytvářejí jednotlivé části květu. Tyto vývojové změny apikálního meristému spolupodmiňuje fotoperioda. Primárním místem fotoperiodických reakcí jsou listy, z nichž je vysílán chemický signál (tzv. florigen) do apikálního meristému, který zahajuje přeměnu tohoto meristému v meristém květní. Květní meristém diferencuje ve čtyři koncentricky uspořádané skupiny buněk, ze kterých vznikají kališní lístky (kalich), korunní lístky (koruna), tyčinky a pestíky. Tyto diferenciační procesy jsou vysvětlovány na základě tzv. ABC modelu. Podle tohoto modelu existují tři skupiny (A, B, C) interagujících genů, které kódují transkripční faktory potřebné pro expresi (transkripci) genů, zodpovědných za vývin uvedených částí květu. Buňky, ve kterých se exprimují pouze geny skupiny A, diferencují v kališní lístky, buňky, v nichž se experimují geny skupiny A a B, diferencují v korunní lístky, buňky, v nichž se experimují geny skupiny B a C, diferencují v tyčinky a konečně buňky, v nichž se experimují pouze geny skupiny C, diferencují v pestíky. Takovéto skupiny genů byly prokázány u Arabidopsis thaliana: Apetala 1 (AP1) a Apetala 2 (AP2) ze skupiny A, Apetala 3 (AP3) a Pistillata (PI) ze skupiny B a Agamous (AG) ze skupiny C. Protein Leafy participuje na procesech přeměny apikálního meristému v květní meristém a plní významnou roli jako spouštěč genů skupiny A, B i C; např. působí-li protein Leafy sám, spouští gen AP1, působí-li v interakci s genovým produktem genu UFO (unusual floral organs), dojde k expresi genu AP3, působí-li protein Leafy s jiným specifickým proteinem, exprimuje se gen AG. Exprese genu Agamous však zároveň navozuje zablokování exprese genu AP1. Obdobně exprese genu AP2 vede k inhibici exprese genu AG. Genové produkty genů AP3 a PI jsou heterodimerní proteiny; pokud se váží v příslušných oblastech květního meristému k produktu genu AP1, dochází k vývinu korunních lístků (koruny), pokud se váží k produktu genu AG, dochází k vývinu tyčinek. Do těchto procesů zasahuje ještě další transkripční faktor, který je produktem genu Sepallata (SEP3); s komplexy produktů genů AP3-PI-AP1 a AP3-PI-AG vytváří komplex SEP3-AP3-PI-AP1 nebo SEP3-AP3-PI-AG, který se napojuje na specifické sekvence DNA a spouští transkripci dalších genů nezbytných pro diferenciaci příslušných květních útvarů. U Arabidopsis thaliana jsou známy čtyři geny Sepallata (SEP1, SEP2, SEP3, SEP4); pokud se exprimuje jenom gen SEP4, vznikají květy pouze s korunními lístky, pokud jsou inaktivovány (reprimovány) všechny čtyři geny SEP, žádné květy se nevytvoří. Vývoj květů se tedy realizuje prostřednictvím kaskády aktivit řady genů, v níž produkty určitých genů fungují jako transkripční faktory, které spouštějí (popř. vypínají) transkripci dalších genů, podmiňujících na příslušných lokalizacích diferenciaci buněk apikálního a květního meristému v definitivní květní útvary (kalich, koruna, tyčinky, pestíky).
I.11.2. STÁRNUTÍ BUNĚK Stárnutí je obecným znakem všech živých systémů. Jedná se o velmi komplexní jev, při jehož poznání bylo zatím dosaženo pouze dílčích výsledků. Při studiu problematiky stárnutí se uplatňují různé přístupy a jsou akcentovány různé aspekty. Proto ani neexistuje vyčerpávající a všeobecně přijímaná definice stárnutí. Stárnutí lze vymezit jako progresivní ztrátu fyziologických funkcí, doprovázenou morfologickými a anatomickými změnami, která zvyšuje pravděpodobnost smrti. Procesy stárnutí jsou primárně determinovány geneticky, avšak rychlost, s jakou jsou v jednotlivých buňkách, tkáních, orgánech a organizmech realizovány, je výsledkem interakce genotypu a prostředí. Negativní vlivy zevního prostředí, které urychlují stárnutí buněk, mají obvykle kumulativní, resp. synergidní účinek. Ve shodě s tím se příznaky stárnutí projevují zpravidla dříve a intenzivněji v buňkách mitoticky inaktivních nebo s nízkou mitotickou aktivitou (např. v neuronech mozku, v buňkách srdečního a příčně pruhovaného svalu), než v buňkách s vysokou mitotickou aktivitou (např. v buňkách rostlinných meristémů, střevního epitelu apod.). S mitotickou aktivitou pravděpodobně souvisí i délka života, charakteristická pro členy různých taxonomických skupin živočichů a rostlin. Některé skupiny bezobratlých živočichů žijících v koloniích (např. houby, koráli) nevykazují jako celek téměř žádné znaky stárnutí a vyznačují se dlouhověkostí; za jednu z možných příčin je považováno permanentní nahrazování starých buněk novými. Podobný mechanizmus se patrně uplatňuje i u některých solitérně žijích bezobratlých (např. mořské sasanky). Mezi obratlovci se obecně delšího věku 24
dožívají poikilotermní živočichové (ryby, plazi, obojživelníci) než homoiotermní (ptáci, savci). Tyto rozdíly bývají dávány do souvislosti v zásadě s trvalým růstem poikilotermních živočichů po celou dobu jejich života (a tedy vyšší, déletrvající mitotickou aktivitou jejich buněk) na jedné straně a omezeným obdobím růstu (do dosažení dospělosti) poikilotermních živočichů (a tedy nižší, kratší dobu trvající mitotickou aktivitou jejich buněk). U některých modelových organizmů (např. Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster) bylo již zjištěno několik genů, které ovlivňují procesy stárnutí jak ve smyslu jejich progrese, tak ve smyslu jejich retardace. Jsou též známy mutace některých genů, které mají za následek urychlení stárnutí; na podkladě mutací se rozvíjejí určité geneticky podmíněné choroby projevující se předčasným stárnutím (např. Wernerův syndrom, ataxia teleangiectasia). Za jeden z významných faktorů, ovlivňujících procesy stárnutí na celulární úrovni, je považována nedokonalá (neúplná) replikace telomér chromozómů. S každým buněčným cyklem se v důsledku toho teloméry zkracují a po dosažení určité limitní hodnoty (přibližně po 50 – 70 buněčných cyklech) ustává buněčné dělení (mitotická aktivita) a buňka dříve či později hyne.
I.11.3. APOPTÓZA Žádná buňka není nesmrtelná. Smrt některých buněk může být následkem poškození, způsobených vlivem vnějších faktorů fyzikálních, chemických, nebo biologických. V určitých případech má však buněčná smrt endogenní původ, to znamená, že je zákonitým výsledkem realizace naprogramovaných intracelulárních procesů. V takových případech hovoříme o apoptóze neboli programované buněčné smrti. Apoptóza se uplatňuje jako jeden z mechanizmů diferenciace buněk a likvidace buněk zestárlých, buněk s ireparabilním poškozením (jak bylo uvedeno výše) nebo jinak ohrožujících integritu organizmu (např. buňky infikované viry, imunokompetentní buňky, jejichž aktivita již není žádoucí). V současné době jsou známy tři hlavní cesty, kterými se apoptóza realizuje: (1) apoptóza iniciovaná intracelulárními signály (neboli mitochondriální) Na povrchu vnější membrány mitochondrií je v normálních ( „zdravých“ ) buňkách exprimován protein Bcl-2. Tento protein je navázán na protein Apaf-1 (= apoptotic protease activatin factor–1), který působí jako aktivátor apoptózní proteázy. Dojde-li k určitému vnitřnímu poškození buňky, protein Bcl-2 se uvolňuje z vazby na protein Apaf-1 a do mitochondrií penetruje protein Bax, který způsobuje uvolnění cytochromu c. Uvolněný cytochrom c se spolu s proteinem Apaf-1 navazuje na molekuly kaspázy 9 a vzniká komplex označovaný jako apoptozom (= cytochrom c + Apaf-1 + kaspáza 9 + ATP). Kaspáza 9 je jedním z členů kaspáz (cysteinaspartáza), rodiny proteáz, která štěpí polypeptidové řetězce v místech výskytu zbytků aspartátu a současně aktivuje další kaspázy. Jedna kaspáza aktivuje jinou a tak se spouští kaskáda vzájemných aktivací kaspáz a tím i jejich proteolytické aktivity, která vede k degradaci cytoplazmatických proteinů a chromozomální DNA. Buňka se rozpadá na fragmenty, které jsou fagocytovány. (2) apoptóza iniciovaná extracelulárními signály Na realizaci apoptózy touto cestou se podílejí dva povrchové receptory: TNF (receptor pro tumory nekrotizující faktor alfa (TNF-α) a Fas (neboli CD95) typu integrálních proteinů. Jestliže se na tyto receptory naváží odpovídající ligandy, tj. TNF-α, resp. ligand FasL, vznikne signál, který se přenáší do cytoplazmy a navozuje aktivaci kaspázy 8. Aktivací této kaspázy se spouští kaskáda aktivací dalších kaspáz (podobně jako v případě mitochondriální cesty apoptózy), jejichž aktivitou je buňka destruována a nakonec fagocytována.
25
Touto cestou indukují apoptózu například cytotoxické T-buňky (Tc-buňky). Po připojení se na cílovou buňku začnou produkovat ligand FasL, který se naváže na Fas receptor cílové buňky a popsaným způsobem v ní iniciuje apoptózu. (3) apoptóza iniciovaná faktorem AIF (= apoptosis- iducing factor) AIF je protein, který se nachází v intermembránovém prostoru mitochondrií. Na základě určitých buněčných signálů se tento faktor z mitochondrií uvolňuje, dostává se do buněčného jádra, kde se váže na DNA. Jakmile vznikne tato vazba, spouští se procesy destruující DNA, jejichž konečným důsledkem je smrt buňky a její fagocytóza. Při této formě apoptózy se - na rozdíl od předešlých dvou – neuplatňují kaspázy. Procesy, které se při apoptóze uskutečňují, se cytomorfologicky manifestují změnami velikosti buněk (zmenšení objemu v důsledku izoosmotických ztrát tekutin, svraskávání cytoplazmatické membrány spojené s tvorbou výběžků, kondenzace a fragmentace chromatinu). Žádná z buněčných změn, vznikajících při apoptóze, není doprovázena zánětlivou reakcí (na rozdíl od nekrózy), neboť při apoptóze se neuvolňuje buněčný obsah do extracelulárního prostoru. Jak bylo uvedeno, apoptózní buňky nebo jejich části jsou fagocytovány. Jsou známy určité mechanizmy, kterými fagocyt rozpozná takovou buňku. Například u některých apoptózních buněk dochází k uvolnění kyseliny sialové z cukerné složky glykoproteinových membránových receptorů a tím k odhalení vlastní cukerné složky (galaktóza, aminosacharidy), na kterou se může navázat fagocyt prostřednictvím svého povrchového lektinu. Podobně se v procesu rozpoznání apoptózní buňky fagocytem uplatňuje demaskovaný membránový fosfatidylserin, na který se může navázat fagocyt svým komplementárním povrchovým receptorem. Popsané mechanizmy apoptózy se vyskytují v živočišných (lidských) buňkách. K apoptóze ovšem dochází i u ostatních skupin organizmů (rostlin, hub). Rovněž tam se uplatňují specifické typy proteáz, avšak ve vlastním průběhu apoptózních dějů existují určité odlišnosti; například aktivace proteáz účastnících se apoptózy v rostlinných buňkách vede k destrukci centrální vakuoly s následnou dezintegrací ostatních buněčných komponent. Apoptóza je regulována řadou faktorů a to jak pozitivně (ve prospěch apoptózy), tak negativně (v neprospěch apoptózy). Faktory, které regulují apoptózu negativně, působí zejména prostřednictvím inhibice některých dějů nezbytných pro realizaci apoptózy (např. inhibice kaspáz nebo inhice aktivace kaspáz). Apoptóza jako programovaná smrt je geneticky determinována. Dosud bylo zjištěno několik genů, které jsou za apoptózu zodpovědné. Apoptóza může být též navozena odlišným účinkem mutačně změněných produktů těch strukturních genů, které za apoptózu nejsou zodpovědné (resp. to o nich není známo). Poruchy apoptózy mohou být příčinou vzniku vývojových vad (anomálií) nebo se mohou podílet na rozvoji některých autoimunitních chorob, malignit či AIDS.
I.11.4. NEKRÓZA Nekrózu můžeme vymezit jako formu buněčné smrti, která není výsledkem realizace endogenního programu, ale je konečným stadiem reakce buňky (organizmu) na škodlivé účinky faktorů prostředí. V průběhu dějů, spějících k nekróze, lze vyčlenit několik základních stupňů: (1) působení faktoru prostředí (xenobiotikum, patogenní agens), které vede k primárnímu poškození buňky (2) řetězec (kaskáda) intracelulárních reakcí na vzniklé poškození (regulace proteosyntézy, poruchy intracelulárního transportu, replikace virové DNA, aktivace lyzozomálních enzymů)
26
(3) autolýza poškozené buňky, zprostředkovaná vlastními enzymy buňky, doprovázená uvolněním buněčného obsahu do extracelulárního prostoru. V mnohobuněčných organizmech je nekróza buňky (tkání) výsledkem spolupůsobení i buněk (orgánů, systémů) přímo nezasažených faktorem, jehož účinek může být fatální. Mohou se přitom uplatnit např. detoxikační procesy v játrech, metabolická konverze xenobiotik, tvorba protilátek proti cizímu antigenu, aktivita makrofágů, reaktanty zánětlivého procesu a řada dalších.
I.11.5. FYLOGENEZE A KLASIFIKACE ORGANIZMŮ V průběhu evoluce se vyvinuly dva základní typy organizmů: (1) jednobuněčné, které představují živé systémy vykonávající veškeré základní biologické funkce a tudíž schopné samostatné existence (2) mnohobuněčné, které představují živé systémy charakteristické diferencovanými, specializovanými a kooperujícími buňkami (pletiva, tkáně, orgány, soustavy orgánů), integrovanými v jeden vyšší celek (mnohobuněčný organizmus). Jednotlivé buňky jsou schopny v některých případech samostatné existence, avšak zpravidla jen za určitých specifických podmínek. Na základě poznávání vývojových vztahů mezi srovnávanými skupinami organizmů za použití různorodých taxonomických a klasifikačních principů a metod (druhová příbuznost, homologie, homoplazie, parsimonie, pleziomorfie, apomorfie, kladistika, fenetika, eklektika a další) se konstruuje tzv. fylogenetický strom. S ohledem na dosaženou úroveň poznání fylogeneze v současné době je možné živé systémy rozčlenit do níže uvedených skupin: I. ŽIVÉ SYSTÉMY NEBUNĚČNÉ - VIRUSOIDY - VIROIDY - VIRY Všechny nebuněčné živé systémy obsahují vlastní genetickou informaci, avšak nedisponují transkripčním, ani translačním aparátem a proto nejsou schopny autonomní reprodukce. Jejich rozmnožování je vázáno na exploataci transkripčního a translačního aparátu vlastního hostitele, včetně zajištění příslušných látkových i energetických zdrojů hostitelem. Lze je proto označit za typické obligátní intracelulární parazity. Na evoluci živých nebuněčných systémů není jednotný názor. Existují v zásadě dva protichůdné směry: podle jednoho z nich tyto systémy odrážejí nejranější fáze vzniku života a představují jeho nejprimitivnější formy, z nichž evolvovaly primitivní buněčné systémy; podle druhého jsou považovány za produkty fylogenetické regrese buněčných systémů, sekundárně rezultující ve ztrátu schopnosti autonomní autoreprodukce a s ní spojený obligátní parazitizmus. VIRUSOIDY jsou krátké úseky ssDNA, dsDNA, ssRNA nebo dsRNA (řádově stovky nukleotidů) umístěné v kapsidech některých (většinou rostlinných) virů kromě vlastní virové DNA nebo RNA. Virusoidy se mohou replikovat za využití příslušných enzymů, které jsou kódovány genomem viru a hostitelské buňky viru. Virus, který obsahuje virusoid, se proto označuje též jako pomocný virus (helper virus). VIROIDY jsou krátké (řádově stovky nukleotidů), neobalené ssRNA vyskytující se v hostitelských buňkách jako infekční částice. Předpokládá se, že vznikají cirkularizací některých intronů posttranskripčně vyštěpených z pre-mRNA hostitelské buňky. S tím pozitivně koreluje dominující horizontální způsob jejich přenosu. Viroidy se replikují za využití příslušných enzymů, syntetizovaných hostitelskou buňkou. Při replikaci plní ssRNA viroidu 27
funkci matriční +RNA podle níž se syntetizuje –RNA, která je následně využita jako matrice pro syntézu nových RNA viroidů. Některé viroidy jsou známy jako fytopatogeny s klinickými příznaky podobnými virózám (např. viroid PSTV způsobuje vřetenovitost hlíz brambor). VIRY jsou intracelulární parazité bakterií, rostlin i živočichů včetně člověka; podle hostitele se klasifikují na bakteriální viry (neboli bakteriofágy), rostlinné a živočišné viry. Na virové částici je možné rozlišit tzv. hlavičku, krček a úchytný aparát (bičík). Některé viry (tzv. obalené viry) mají povrch virionu pokryt ještě biomembránou odvozenou od membránových struktur hostitelské buňky, avšak v průběhu maturace strukturně pozměněnou produkty exprimovaného virového genomu (zejm. se jedná o glykoproteiny se specificky virovou antigenitou, inkorporované do membrány). Zevní část hlavičky tvoří kapsid, složený z proteinových jednotek (kapsomer) a vyznačující se pro určité skupiny virů specifickou symetrií (nejčastěji helikální, ikozaedrová a binární). Mimo hostitelskou buňku viry nevykazují atributy živých systémů a mohou krystalizovat (krystalografické metody identifikace a diagnostiky některých virů). Uvnitř hlavičky se nachází virová DNA nebo RNA; podle toho se viry klasifikují na DNA-viry neboli dnaviry a RNA-viry neboli rnaviry. Existují viry s jednořetězcovou nukleovou kyselinou (ssDNA, ssRNA) i s dvouřetězcovou nukleovou kyselinou (dsDNA, dsRNA). Genom některých rnavirů (Retroviridae) s pozitivní (+) ssRNA a některých dnavirů s dsDNA (Hepadnaviridae) obsahuje gen pro reverzní transkriptázu, kterou syntetizuje hostitelská buňka, v níž se virový genom exprimuje. Reverzní transkriptáza katalyzuje reverzní (zpětnou) transkripci pozitivního řetězce RNA do komplementární polydeoxyribonukleotidové sekvence (DNA), tedy transkripci ve směru RNA → DNA. Krček tvoří část spojující hlavičku s úchytným aparátem (bičíkem); úchytný aparát není obligátní součástí všech virových částic. II. ŽIVÉ SYSTÉMY BUNĚČNÉ - doména BAKTERIE (BACTERIA) - doména ARCHEA (ARCHAEA) - doména EUKARYA (EUCARYA) • říše PRVOCI (PROTOZOA) • říše CHROMISTA (CHROMISTA) • říše ROSTLINY (PLANTAE) • říše HOUBY (FUNGI) • říše ŽIVOČICHOVÉ (ANIMALIA) Z hlediska cytologického se u domén bakterie a archea vyskytuje typ buněk, který je odlišný v řadě znaků od typu buněk domény eukarya. Buňky prvních dvou domén se označují jako prokaryotické a organizmy, zařazované do těchto domén, jako prokaryota. Prokaryotní buňky charakterizují především tyto znaky: nukleoid (analog typického morfologického jádra obaleného jaderným obalem, které se vyskytuje v eukaryotních buňkách), kružnicová DNA (tzv. prokaryotický chromozom neasociovaný s histony a jinými bílkovinami v nukleohistonový komplex, tj. chromatin), buněčná stěna převážně s peptidoglykanovou nebo pseudopeptidoglykanovou kostrou, ribozomy se sedimentační konstantou 70S (malá podjednotka 30S, velká podjednotka 50S) nebo jí blízkou, transkripce i translace probíhá v cytoplazmě, plazmidy (fakultativní genofory, jejichž přítomnost není nepostradatelná), absence buněčných organel (mitochondrie, chloroplasty apod.). Buňky třetí domény se označují jako eukaryotické a organizmy do ní zařazované jako eukaryota. Eukaryotické buňky charakterizují zejména následující znaky: morfologicky vyvinuté buněčné jádro oddělené jaderným obalem od okolní cytoplazmy, jaderný genom rozčleněný do chromozomů (tvořených komplexem lineární dsDNA, histonů a některých proteinů nehistonového typu, tj. chromatinem), rozčlenění na kompartmenty (mitochondrie, Golgiho komplex, endoplazmatické retikulum, lyzozomy, peroxizomy, chloroplasty a jiné plastidy v rostlinných buňkách), oddělení místa transkripce genetické informace jaderné DNA 28
(jádro) od místa její translace (cytoplazma), ribozomy se sedimentační konstantou 80S (malá podjednotka 40S, velká podjednotka 60S), mitochondrie a chloroplasty jako mimojaderné genofory pravděpodobně endosymbiotického původu s vlastním genetickým aparátem prokaryotického typu (kružnicová dsDNA, sedimentační konstanta ribozomů 70S nebo blízká 70S, iniciační aminokyselina N-formyl-metionin apod.), na buněčném cyklu nezávislá (autonomní) replikace mitochondrií a chloroplastů, na povrchu buněk hub a rostlin je buněčná stěna na bázi polysacharidů (u hub chitin, u rostlin celulóza). Z uvedeného je patrné, že cytologické vymezení prokaryotických a eukaryotických typů buněk nevyjadřuje hierarchické uspořádání dotyčných taxonů. Klasifikace organizmů do tří domén bylo provedeno na základě výsledků komparativních molekulárně genetických analýz prokaryotické 16S rRNA a eukaryotické 18S rRNA. Tyto druhy rRNA jsou komponentami menších podjednotek ribozomů recentních druhů a lze je považovat za fylogeneticky velmi starobylé biomakromolekuly odrážející ve své primární struktuře evoluci translace jako nezbytného stupně exprese genetické informace spojeného s proteosyntézou a autoreprodukcí. Vzhledem ke komplexnosti translačního aparátu patří jeho základní komponenty (rRNA) mezi evolučně vysoce konzervované molekuly. Proto podíl nehomologických sekvencí rRNA srovnávaných dvou (a více) skupin organizmů lze považovat za míru jejich příbuznosti a za veličinu vyjadřující evoluční vzdálenost mezi nimi (= procento nehomologických sekvencí mezi dvěma zkoumanými skupinami organizmů). Ve fylogenetickém stromu, konstruovaném za využití takto získaných informací, je délka větví úměrná zjištěné evoluční vzdálenosti. V současných evolučních teoriích se obvykle připouští existence tzv. univerzálního předka všech tří domén a ještě staršího předka všech živých systémů, tzv. progenota (přibližně před 4 miliardami let). BACTERIA jsou jednobuněčné organizmy s prokaryotním typem buňky, jejichž povrch je kryt (s výjimkou mykoplazmat) buněčnou stěnou s peptidoglykanovou kostrou. Peptidoglykan tvoří lineárně uspořádaná vlákna glykanu (= řetězec složený z molekul N - acetylglukózaminu a kyseliny N-acetylmuramové střídavě spojených β -1,4- glykozidickou vazbou), příčně propojená tetrapeptidem (L-Ala – D-Glu – D-AP– L-Ala; D-AP = kyselina diaminopimelová), estericky napojeným k C3 molekuly kyseliny N-acetylmuramové. Struktura bakteriální stěny je významným taxonomickým znakem u bakterií, podle něhož se rozdělují na tzv. G+ (Gram pozitivní) a G (Gram-negativní) bakterie. U G+ baktérií je peptidoglykanová kostra vícevrstevná, přičemž na její zevní stranu jsou navázány molekuly teikoových kyselin (ribitolteikoová, glycerolteikoová). Buněčná stěna G bakterií je tenčí, neobsahuje teikoové kyseliny, avšak přiléhá k ní jěště vnější membrána s bohatě zastoupenými lipoproteiny a především lipopolysacharidy, které se podílejí na antigenních vlastnostech bakteriálních povrchů. U některých skupin bakterií (např. mykobakterie, enterobakterie) se stavba jejich buněčné stěny od uvedené obecné stavby bakteriální buněčné stěny částečně odchyluje. Bakterie skupiny Tenericutes (mykoplazmata) bakteriální stěnu vůbec netvoří a většina z nich obsahuje v cytoplazmatické membráně cholesterol. Některé druhy bakterií mohou vytvářet ještě další povrchové útvary. Je to kapsula (pouzdro) – heterogenní hydratovaná vrstva polysacharidů, lipidů a proteinů na povrchu buněčné stěny, typická pro bakterie rostoucí v podobě hladkých kolonií (tzv. S-formy, smooth na rozdíl od tzv. R-forem, rough, drsných kolonií), pochva – extracelulární útvar vylučovaný bakteriální buňkou, často obsahující kationty některých prvků a obalující sérii rozdělených bakteriálních buněk v jeden větší morfologický útvar; prostéka – výběžek bakteriální buňky tvořený částí buněčné stěny, cytoplazmatické membrány a cytoplazmy; u bakterií množících se pučením mohou být konce prosték pupenotvorné; stéblo – cytoplazmy prostý výběžek bakteriální buňky sloužící k úchytu buňky k pevnému substrátu a často obsahující kationty některých kovů. Morfologicky tvoří buňky bakterií několik základních typů: koky (monokoky, diplokoky, tetrakoky, sarciny, streptokoky, stafylokoky), tyčky a zakřivené bakterie (vibria, spirily, 29
spirochety). Některé mohou vytvářet endospory (plektridium, klostridium, bacily). U sporulujících bakterií lze v životním cyklu rozlišit dvě stádia: vegetativní (bakterie se množí dělením) a stadium sporulace (klidové stadium, kdy se buňka nedělí, ale vytváří endosporu; za vhodných podmínek endospora vyklíčí /germinace/, obnoví se buněčné dělení a buňka přechází do vegetativního stadia). Některé skupiny bakterií tvoří mycelium (= úplně větvené bakteriální buňky): substrátové (např. mykobakterie) a vzdušné (např. streptomycety). Bakterie mohou být nepohyblivé (tj. bez aktivního pohybu, vykonávaného prostřednictvím vlastních pohybových struktur) nebo pobyblivé pomocí jednoho či více bičíků nebo pomocí fimbrií. Genom tvoří tzv. bakteriální chromozom (nukleoid) a lze je proto označit za organizmy haploidní. Kromě tohoto genoforu mohou být v bakteriální buňce přítomny ještě plazmidy (jeden nebo více) jako semiautonomní organely. Plazmidy se mohou integrovat do bakteriálního chromozomu a v některých případech se přenášet při konjugaci do recipientní bakteriální buňky (tzv. F-dukce, neboli sex-dukce). Na konjugaci lze nahlížet jako na primitivního (archaického) předchůdce později evolvujícího sexuálního rozmnožování. Bakterie se rozmnožují binárním dělením nebo pučením. Při binárním dělení se buňka nejprve prodlužuje ve směru podélné osy a replikuje se DNA. Postupně se za účasti cytoplazmatické membrány a buněčné stěny začne formovat septum, kterým je nakonec původní bakteriální buňka rozdělena na dvě rovnocenné části – dvě nové buňky. Charakteristickým znakem binárního dělení je, že při něm výchozí (dělící se) buňka ztrácí svou individualitu (podobně jako je tomu při dělení mitotickém). Pučení může být zahájeno teprve v buňce, která dorostla do finální velikosti, je schopna replikace chromozomu a rozdělení nukleoidu. V té době se začne na povrchu bakteriální buňky tvořit pupen de novo; do pupenu se přesouvá jeden nukleoid, pupen se postupně odděluje od mateřské buňky až se nakonec oddělí jako samostatné individuum, tj. nová bakteriální buňka, která se postupně růstem zvětšuje. Charakteristickým znakem pučení tedy je, že mateřská buňka při něm neztrácí svou individualitu. Z hlediska metabolického tvoří bakterie velmi heterogenní doménu, ve které jsou zastoupeny jak skupiny autotrofní (= litotrofní; obligátně nebo fakultativně autotrofní a mixotrofní), tak heterotrofní (= organotrofní), ve vztahu k utilizovatelné energii fototrofní (podle vztahu k utilizovatelnému zdroji uhlíku fotoautotrofní neboli fotolitotrofní a fotoheterotrofní neboli fotoorganotrofní) a chemotrofní (podle vztahu k utilizovatelnému zdroji uhlíku chemoautotrofní neboli chemolitotrofní a chemoheterotrofní neboli chemoorganotrofní). Fotoautotrofní bakterie jsou schopny fixovat oxid uhličitý v Calvinově cyklu za využití vnějšího zdroje energie (Slunce) a jednoduchých anorganických látek (sirovodík, vodík, síra, voda) jako donorů elektronů a uskutečňovat anoxygenní nebo oxygenní (prochlorofyta, cyanobakterie) fotosyntézu, spojenou s produkcí ATP (cyklickou fosforylací u anoxygenní fotosyntézy, necyklickou u oxygenní fotosyntézy). Fotoheterotrofní bakterie mohou využívat jednoduché organické látky (acetát, fumarát, oxalát, malát apod.) jako zdroje uhlíku i donorů elektronů a uskutečňovat anoxygenní fotosyntézu. Chemoautotrofní bakterie využívají jako zdroje uhlíku oxid uhličitý (fixovaný prostřednictvím Calvinova cyklu). Energii získávají oxidací anorganických látek, které slouží jako donor elektronů a deponují v syntetizovaných molekulách ATP. Podle donora elektronů se dělí na bakterie vodíkové (oxidují vodík na vodu), nitrifikační (oxidují amoniak na dusitany – nitrozobakterie, nebo dusitany na dusičnany – nitrobakterie), sirné (oxidují elementární síru, sirovodík a některé další sirné látky až na sírany), železité (oxidují sloučeniny s kationty Fe2+ na sloučeniny s kationty Fe3+). Chemoheterotrofní využívají jako zdroje uhlíku organické látky (sacharidy, lipidy, proteiny apod.); ty jsou též zdrojem energie, elektronů a protonů. Konečným akceptorem elektronů je organická nebo anorganická sloučenina. Podle typu akceptoru elektronů uskutečňují respiraci anaerobní (akceptorem elektronů je organická látka, nikoli molekulární kyslík), aerobní (akceptorem elektronů je molekulární kyslík) nebo fermentaci (akceptorem elektronů je určitý intermediární produkt oxidace donora elektronů). 30
ARCHAEA jsou mikroorganizmy, které se v mnoha znacích velmi podobají bakteriím, avšak zároveň v řadě jiných znaků se od nich odlišují. Morfologicky tvoří koky, tyčky a zakřivené buňky (spirily). Povrch buňky je tvořen buněčnou stěnou se pseudopeptidoglykanovou kostrou. Vlákna pseudoglykanu (= střídající se molekuly N-acetylglukózaminu a kyseliny N-acetyltalosaminuronové spojené β-1,3-glykozidovou vazbou) jsou paralelně propojena tetrapeptidem (Glu – Lys – Ala – Gly) kovalentně spojeným s lyzinovými zbytky tripeptidů (Glu – Ala – Lys) estericky navázaných na C3 protilehlých molekul kyseliny N-acetyltalosaminuronové. U některých archeí je stavba buněčná stěny jednodušší (proteinová vrstva přiléhající k cytoplazmatické membráně), případně se buněčná stěna vůbec nevyskytuje (např. Thermoplasma). Cytoplazmatická membrána je tvořena lipidovou vrstvou, v níž je však (na rozdíl od typické cytoplazmatické membrány eukaryot) mezi komponentou alkoholovou (glycerol) a organické karboxylové kyseliny vytvořena vazba éterová (nikoli esterová). Základní komponentu této lipidové vrstvy tvoří izoprenoidy s dlouhými lineárními řetězci, které prostupují napříč celou cytoplazmatickou membránou a na obou koncích (tj. na vnitřní i vnější straně membrány) obsahují hydrofilní hydroxylové skupiny. Fyzikálněchemické vlastnosti (acidorezistence, termorezistence) uspořádání dvou glyceroldiéterových vrstev cytoplazmatické membrány v jednu vrstvu glyceroltetraéterovou pozitivně korelují s extrémními ekotypy, které archea jako typické organizmy hypertermofilní (Thermoplasma, Sulfolobus), hyperhalofilní (Halobacterium, Halococcus) a metanogenní (Methanobacterium) osidlují. Cytoplazmatická membrána archeí obsahuje pouze protonové V ATPázy (nikoli F0F1 ATPázy), které plní funkci syntáz ATP. Geny archeí mohou obsahovat introny. Jsou též známy výrazné rozdíly ve struktuře rRNA ve srovnání s bakteriemi. PROTOZOA jsou většinou jednobuněčné organizmy žijící individuálně nebo ve vícebuněčných uskupeních. Buněčný povrch tvoří cytoplazmatická membrána, případně ještě buněčná stěna s převažující polysacharidovou nebo proteinovou základní složkou. Někteří prvoci vytvářejí též schránky (např. krytenky, dírkonoši). K aktivnímu pohybu používají pseudopodie, bičíky, cilie, cirry nebo undulující membrány. Specifickými intracelulárními strukturami jsou potravní vakuoly, které se uplatňují při příjmu a zpracování potravy a pulzující vakuoly, které plní osmoregulační funkci a jimiž vylučují do prostředí odpadní látky. Rozmnožují se převážně nepohlavně dělením, pučením nebo rozpadem schizogonií, méně často pohlavně konjugací (při níž dochází k výměně části mikronukleu) nebo gamogonií (splýváním gamet, samičích a samčích gamontů). Pro některé skupiny prvoků (např. výtrusovce) je charakteristické střídání pohlavního a nepohlavního způsobu rozmnožování v rámci životního cyklu (tzv. metageneze). Někteří prvoci za nepříznivých životních podmínek vytvářejí cysty (např. nálevníci) nebo spory (např. výtrusovci). Prvoci jsou v zásadě organizmy chemoheterotrofní (s osmotickým, fagocytárním nebo parazitickým způsobem výživy), pouze ti, kteří obsahují v buňkách sekundárně endosymbiotické chloroplasty (např. krásnoočka) mohou být mixotrofní (tzn. že fotoautotrofní procesy u nich doplňují procesy chemoheterotrofní). CHROMISTA představují vysoce hetrogenní říši, která zahrnuje některé organizmy jednobuněčné (např. skrytěnky, bičíkovci) i mnohobuněčné (hnědé řasy – stélky), v důsledku přítomnosti sekundárně endosymbioticky získaných chloroplastů fotoautotrofní (uskutečňují oxygenní fotosyntézu) s možností též chemoheterotrofní výživy (mixotrofie), resp. jenom chemoheterotrofní (druhy bez chloroplastů, např. oomycety, opalinky). Z hlediska evolučního jsou za původnější považovány druhy fotoautotrofní (tj. obsahující chloroplasty), za odvozené jsou považovány druhy bez chloroplastů. Kromě vlastního genomu se může vyskytovat v chloroplastech ještě fragment genomu endosymbionta, tzv. nukleomorf. Lyzin syntetizují tzv. DAP dráhou (tj. dráhou přes kyselinu diaminopimelovou, stejně jako rostliny). Buněčná stěna je zpravidla polysacharidového typu (avšak např. u rozsivek je křemičitá, tzv. frustula, sestávající ze dvou částí – horní a dolní vulvy). K aktivnímu pohybu slouží bičíky. Rozmnožování je nepohlavní i pohlavní, přičemž pohlavní proces může být izogamický 31
(morfologicky nerozlišené samčí a samičí gamety), anizogamický (morfologicky rozlišené samčí a samičí gamety) i oogamický (nepohyblivá vaječná buňka, pohyblivý spermatozoid). U některých skupin se vyskytuje metageneze (např. hnědé řasy). PLANTAE jsou jednobuněčné i mnohobuněčné fotoautotrofní organizmy s primárními chloroplasty (opatřenými dvěma membránami) jako místy oxygenní fotosyntézy. Typickým zásobním polysacharidem je škrob; transportními glycidy jsou monosacharidy a disacharidy (především glukóza, fruktóza, sacharóza). Lyzin syntetizují tzv. DAP dráhou (tedy přes kyselinu diaminopimelovou, stejně jako Chromista). Rostlinné buňky evolučně pozbyly schopnosti fagotrofie. Povrch buněk tvoří polysacharidová buněčná stěna (především na bázi celulózy), pouze v oddělení Glaucophyta se vyskytuje bakteriální typ buněčné stěny. Některé skupiny rostlin tvoří různě organizované stélky (thallus) jako formu vegetativního těla nediferencovaného na jednotlivá pletiva; stélky však mohou být členěny na rizoidy, kauloidy a fyloidy odpovídající funkčně kořenům, stonkům a listům těch skupin rostlin, které vytvářejí pletivově a orgánově diferencované rostlinné tělo (cormus). Rozmnožování je pohlavní i nepohlavní, pro životní cyklus je charakteristická metageneze. Poměr gametofytu ku sporofytu má sestupnou tendenci ve směru od evolučně (fylogeneticky) starších k evolučně (fylogeneticky) mladším taxonům. U pohlavně se rozmnožujících rostlin dochází ke střídání haploidní a diploidní fáze. Říše Plantae zahrnuje velice různorodé skupiny organizmů. V současné době je přijímáno její dělení na dvě podříše : Biliphyta (s odděleními Glaucophyta a Rhodophyta ruduchy) a Viridiplantae (v níž se rozlišují dvě vývojové linie Chlorophytae – zelené řasy a Streptophytae s vývojovými větvemi Charophytae – parožnatky, Bryophytae – mechorosty a Cormophytae – vyšší rostliny). FUNGI jsou organizmy jednobuněčné (např. kvasinky) i mnohobuněčné, stélkaté, chemoheterotrofní (neschopné jakéhokoli typu fotosyntézy). Stélka může vytvářet hyfy, které často bývají rozlišené na část vegetativní (vykazuje trofické funkce) a reprodukční (vykazuje reprodukční funkce). Houby evolučně pozbyly schopnosti fagotrofie. Organické látky (živiny) rozkládají mimo vlastní organizmus (stélku) prostřednictvím jimi vylučovaných enzymů (hydrolázy) a přijímají teprve produkty tohoto enzymaticky katalyzovaného rozkladu živného substrátu. Povrch buněk je kryt buněčnou stěnou polysacharidového typu, tvořenou převážně chitinem, případně β-1,3- nebo β-1,6-polyglukany. Základní zásobní látky tvoří polysacharid glykogen a tuky. Hlavními transportními sacharidy jsou trehalóza a cukerné alkoholy manitol a sorbitol. Syntetizují lyzin tzv. AAA-dráhou (tj. metabolickou dráhou přes kyselinu α-aminoadipovou), což svědčí pro fylogeneticky velmi starobylou divergenci říše hub od ostatních organizmů (neboť mezi dráhou AAA a DAP se nevyskytují žádné společné enzymy, ani intermediáty). V této říši se vyskytují různé typy rozmnožování nepohlavního (rozdělení buněk – některé druhy kvasinek, pučení – kvasinky, fragmentace hyf, konidie, sporangiospory – např. Zygomycota, zoospory – pouze Chytridiomycota), zejména u parazitických druhů hub, i pohlavního, přičemž reprodukční orgány nemusejí být morfologicky diferencované (např. bazidiomycety - párovací typy hyf). Životní cyklus může zahrnovat fázi haploidní, dikaryotickou (tvořenou buňkami obsahujícími dvě nezfúzovaná haploidní jádra), u některých druhů též diploidní. ANIMALIA jsou mnohobuněčné, chemoheterotrofní organizmy. Jejich buňky jsou bez buněčné stěny a nejsou schopny syntetizovat lyzin žádnou biosyntetickou dráhou. Rozmnožují se jak nepohlavně (různé typy pučení, fragmentace jedince s následnou regenerací chybějících částí těla), tak pohlavně, přičemž živočichové mohou být jednopohlavní (gonochoristé) nebo oboupohlavní (hermafrodité).
32
I. OBECNÁ BIOLOGIE BUŇKY II.1. CHEMICKÉ SLOŽENÍ BUŇKY – PRVKY A ANORGANICKÉ LÁTKY II.1.1. PRVKY A ANORGANICKÉ LÁTKY KROMĚ VODY Ve všech buňkách se vyskytuje C, H, O, N, P, Ca, S, Na, K, Mg, Cl. Těchto jedenáct prvků se s ohledem na jejich kvantitativní zastoupení označuje jako makroelementy. Tvoří kolem 99% všech prvků v buňce, přičemž největší podíl – kolem 95%, připadá na C, H, O a N. Tyto prvky jsou zastoupeny ve všech hlavních skupinách organických látek, které se v buňkách vyskytují (sacharidy, lipidy, proteiny, nukleové kyseliny aj.) a v nichž převažují nad sloučeninami anorganickými (s výjimkou vody). V organizmech se vyskytují sodné ionty především jako tzv. extracelulární ionty, tzn. že jejich koncentrace je značně vyšší v extracelulárním prostředí, než v intracelulárním prostředí. Naopak draselné ionty se nacházejí ve vyšších koncentracích v intracelulárním prostředí než v extracelulárním a proto jsou označovány jako intracelulární ionty. Rozdílné rozložení iontů po obou stranách biomembrány je příčinou ustavení membránového potenciálu (vnitřní povrch membrány je negativní vůči vnějšímu povrchu). Ionty chloridové, monohydrogenuhličitanové, mono- a dihydrogenfosforečnanové uvnitř buňky se ve značné míře podílejí na udržení acidobazické rovnováhy. Koncentrace vápenatých iontů je v buňkách relativně nízká. Část je vázána na cytoplazmatické proteiny, část je deponována v oddělených kompartmentech (zejména v endoplazmatickém retikulu). Podíl všech ostatních prvků, které jsou v buňce obsaženy, činí méně než 1%. Souborně jsou označovány jako mikroelementy. I když jsou mikroelementy v buňkách zastoupeny pouze ve velmi nízkých koncentracích, plní mnohé funkce, ve kterých jsou nezastupitelné (např. atomy Fe jako součást hemoglobinu, Cu jako složka některých krevních barviv a enzymů, Mo jako složka nitrogenázy, Mn, Co a některé další ve funkci koenzymů atd.).
II.1.2. VODA Voda je pro existenci jakékoli buňky nepostradatelná. Je kontinuálně rozložena ve všech buněčných kompartmentech. Představuje základní rozpouštědlo polárních sloučenin a prostředí pro realizaci všech biochemických procesů v buňce. S tím souvisí i její funkce jako základního prostředí, ve kterém se uskutečňuje transport látek jak uvnitř jednotlivých buněk, tak mezi buňkami mnohobuněčného organizmu. Voda je též hlavní složkou buňky i z hlediska kvantitativního. Za fyziologických podmínek jsou molekuly vody jen málo disociovány na ionty H+ (resp. H3O+) a OH. Autoionizace vody je velmi významná pro realizaci životních dějů (např. hydrolytických, transportních, udržování acidobazické rovnováhy). Molekuly vody jsou polarizovány, vytvářejí elektrický dipól. Proto mohou být ionty různých sloučenin v buňce hydratovány a může se kolem nich vytvářet hydratační obal. Voda je velmi dobrý vodič tepla, což se uplatňuje pozitivně při exotermních reakcích (zamezuje lokálnímu přehřátí). Vysoké 33
povrchové napětí umožňuje její elevaci v kapilárních prostorech. Voda je též dobrým elektrickým izolantem. V každé molekule vody se může jeden atom kyslíku vázat se dvěma atomy vodíku jiné molekuly a každý atom vodíku se může vázat k sousednímu atomu kyslíku. Uspořádání vazeb v molekulách vody je tetraedrické (v kapalné i pevné fázi). Tendence molekul vody vytvářet mezi sebou navzájem vodíkové vazby rezultuje v některé důležité fyzikálně-chemické vlastnosti. Jednou z nich je značně vysoký bod varu (v porovnání s jinými nízkomolekulárními sloučeninami se stejnou nebo podobnou relativní molekulovou hmotností), přičemž se vytváří dostatečně široký diapazon teplot, v němž se fyzikální a chemické vlastnosti významně nemění. Z ekologického hlediska je významná anomálie vody, která umožňuje i vyšším živočichům přežít ve vodním prostředí při teplotách vzduchu bod bodem mrazu. Tvorba vodíkových vazeb v molekulách vody (resp. mezi nimi) nepřímo ovlivňuje pevnost vazeb hydrofobních. Preferenční tvorba vodíkových vazeb před vazbami van der Waalsovými ve sloučeninách, u kterých je to možné, vede k faktické nemísitelnosti polárních a nepolárních sloučenin. Tato vlastnost sehrála zřejmě významnou roli v nejranějších fázích biologické evoluce, ve které se molekuly hydrofobních sloučenin mohly uplatnit jako komponenty útvarů (micel, koacervátů) uzavírajících určitou část objektivní reality a separujících ji od okolního prostředí. Relativní uzavřenost (oddělenost) od okolí je podmínkou vývoje jakéhokoli otevřeného systému, tedy i biologického. Tvorba vodíkových vazeb v molekulách vody (resp. mezi nimi) tak nepřímo ovlivňuje pevnost vazeb hydrofobních.
IONIZACE MOLEKUL VODY
34
VODÍKOVÁ VAZBA MEZI MOLEKULOU VODY A AMONIAKU
II.2. ORGANICKÉ LÁTKY II.2.1. MASTNÉ KYSELINY Mastné kyseliny jsou alifatické karboxylové kyseliny s větším počtem atomů uhlíku v molekule. Jsou nedílnou součástí lipidů, v nichž se estericky váží s molekulou příslušného alkoholu (např. glycerolu). Mastné kyseliny tvoří hydrofobní úseky složitých molekul a buněčných struktur, jichž jsou součástí. Masné kyseliny, v jejichž molekulách jsou atomy uhlíku spojeny pouze jednoduchými vazbami, se označují jako nasycené mastné kyseliny; nasycené mastné kyseliny mají pevnou konzistenci. Mastné kyseliny, v jejichž molekulách jsou atomy uhlíku spojeny kromě jednoduchých vazeb též dvojnými vazbami, se označují jako nenasycené mastné kyseliny; jsou to tekuté, olejové látky. Pokud je v alifatickém řetězci molekuly mastné kyseliny přítomna pouze jedna dvojná vazba, hovoříme o mononenasycené mastné kyselině, je-li přítomno více dvojných vazeb, hovoříme o polynenasycené mastné kyselině. Dvojná vazba může zaujímat konfiguraci cis nebo trans. Atom uhlíku, ze kterého vychází dvojná vazba a který je nejvzdálenější od karboxylového konce řetězce molekuly nenasycené mastné kyseliny, se označuje jako omega – atom uhlíku. Nenasycené mastné kyseliny se vyskytují častěji v buňkách rostlinných než živočišných. V biologických systémech bylo detegováno dosud přes padesát různých mastných kyselin, vesměs se sudým počtem atomů uhlíku. Mezi nejčastěji se vyskytující nasycené mastné kyseliny patří kyselina palmitová (C15H31COOH) a kyselina stearová (C17H35COOH). Z nenasycených mastných kyselin jsou časté kyselina olejová (C17H33COOH, jedna dvojná vazba), kyselina linolová (C17H31COOH, dvě dvojné vazby cis), kyselina linolenová (C17H29COOH, tři dvojné vazby cis) a kyselina arachidonová (C19H31COOH, čtyči dvojné vazby cis), jejíž oxidací vznikají biologicky aktivní látky prostaglandiny (neboli ikozanoidy). 35
NASYCENÉ MASTNÉ KYSELINY
Cis-9-octadecenoic acid (Oleic acid)
Trans-9-octadecenoic acid (Elaidic acid)
NENASYCENÉ MASTNÉ KYSELINY
Molekuly mastných kyselin jsou syntetizovány z dvouuhlíkatých fragmentů v cytoplazmě. Výchozí látkou je acetylkoenzym-A. Princip biosyntézy alifatického řetězce molekuly mastné kyseliny spočívá v redukci acetylu na zbytky – CH2 – CH2 - , při níž funkci donorů atomů vodíku plní NADPH + H+. Další dvouuhlíkaté fragmenty pro výstavbu molekuly mastné kyseliny poskytuje energeticky bohatší malonylkoenzym-A (což je produkt karboxylace acetylkoenzymu-A). Sled reakcí, v nichž je již syntetizovaný úsek alifatického řetězce prodlužován postupně o tyto dvouuhlíkaté fragmenty, je katalyzován multienzymovým komplexem syntetázy mastných kyselin. Při značné simplifikaci reakčního mechanizmu biosyntézy mastných kyselin lze říci, že jednotlivé reakční kroky zahrnují enzymově katalyzovanou kondenzaci určitého acylu s malonylem při současné dekarboxylaci, následovanou dehydrogenací (NADPH + H+ → NADP+), dehydratací ( – H2O) a další dehydrogenací (NADPH + H+ → NADP+), přičemž jednotlivé reaktanty jsou navázány na multienzymový komplex syntetázy. Biosyntéza mastných kyselin je proces vyžadující dodání energie. Na prodloužení řetězce o jeden dvouuhlíkatý fragment se spotřebuje 1 molekula ATP pro malonylovou jednotku a 2 molekuly NADPH + H+ (= energie 6 molekul ATP) k redukci acetylu na zbytek –CH2 – CH2 - , dohromady energie odpovídající energii uvolněné štěpením 7 molekul ATP. Celková energetická bilance syntézy jedné molekuly mastné kyseliny o počtu atomů uhlíku n je tedy rovna 7·(n/2 – 1) molekul ATP. Podobným mechanizmem je alifatický řetězec mastné kyseliny v buňkách odbouráván po dvouuhlíkatých fragmentech tzv. β – oxidací mastných kyselin. Meziprodukty biosyntézy a biodegradace mastných kyselin jsou prakticky shodné, avšak jednotlivé reakční stupně jsou v obou procesech katalyzovány jinými enzymy.
36
II.2.2. LIPIDY Lipidy jsou deriváty vyšších monokarboxylových (tzv. mastných) kyselin, v biologických systémech většinou nasycených se sudým počtem atomů uhlíku (kyselina palmitová, kyselina stearová). Z dalších mastných kyselin jsou to zejména kyselina olejová, kyselina arachidonová, kyselina linolová a kyselina linolenová, které představují skupinu nenasycených mastných kyselin. Pokud molekula tuku obsahuje pouze nasycené mastné kyseliny, je takový tuk označován jako nasycený, pokud obsahuje nenasycené mastné kyseliny, označuje se jako nenasycený (mononenasycený, obsahuje-li mononenasycené mastné kyseliny, resp. polynenasycený, obsahuje-li polynenasycené mastné kyseliny). Konzistence tuků závisí do značné míry na typu přítomné mastné kyseliny a na délce jejího řetězce. Alifatické řetězce nasycených mastných kyselin se mohou k sobě velmi těsně přikládat a tvořit poměrně pevné útvary s vyšším bodem tání. Dvojné vazby v konfiguraci cis v molekulách nenasycených mastných kyselin tak těsné přiblížení alifatických řetězců neumožňují a proto vznikají méně pevné útvary s nižším bodem tání. Dvojné vazby v konfiguraci trans v molekulách nenasycených mastných kyselin umožňují přiblížení alifatických řetězců na menší vzdálenost než je tomu v případě nenasycených mastných kyselin s dvojnými vazbami v konfiguiraci cis, avšak na větší, než je to možné u řetězců nasycených mastných kyselin; proto za jinak stejných podmínek leží hodnota bodu tání tuků obsahujících trans nenasycené mastné kyseliny mezi hodnotou nasyceného tuku a nenasyceného tuku s cis nenasycenými mastnými kyselinami. Nenasycené tuky, běžně se vyskytující v živých systémech, jsou tedy za pokojové teploty převážně tekuté (tzv. oleje). Nedílnou složkou lipidů je alkohol (např. glycerol, sfingozin = 2-amino-4-transoktodecen1,3-diol). V molekulách lipidů převažují nepolární skupiny, které jsou příčinou jejich hydrofobního charakteru. Nicméně existují i tzv. polární lipidy. Jedna část jejich molekuly, tvořená řetězcem mastné kyseliny, je hydrofobní, druhá část, ve které se vyskytují ionizované skupiny (např. fosfátové skupiny a aminoskupiny v molekulách fosfolipidů), je hydrofilní. V důsledku takovéto struktury molekuly vykazují polární lipidy amfifilii. Polární lipidy jsou hlavní složkou biomembrán, jejichž základní fyzikálně-chemické vlastnosti jsou podmíněny právě amfifilií. Z hlediska chemického se lipidy dělí do dvou hlavních skupin: na lipidy jednoduché a lipidy složené. Mezi nejčastěji se vyskytující jednoduché buněčné lipidy patří acylglyceroly neboli tuky. Jsou to estery vyšších monokarboxylových kyselin s glycerolem (=1,2,3-propantriol). Náleží k nejrozšířenějším buněčným lipidům a představují jeden z hlavních zdrojů energie, využitelné v různých biochemických procesech. TRIACYLGLYCEROLY se v buňkách syntetizují z glycerol-3-fosfátu a příslušných aktivovaných mastných kyselin (tedy acylkoenzymů-A). Prvním reakčním krokem je přenos dvou acylů mastných kyselin z acylkoenzymů-A na glycerol-3-fosfát; tím vznikne 1,2-diacylglycerol-3-fosfát (osfatidát); při další reakci se odštěpí fosfát za vzniku diacylglycerolu, který následně reaguje s další molekulou acylkoenzymu-A; při této reakci se z acylkoenzymu-A přenese na molekulu diacylglycerolu další acyl mastné kyseliny za vzniku konečného produktu - molekuly triacylglycerolu.
37
SCHÉMA SYNTÉZY ACYLGLYCEROLU
VOSKY jsou další skupinou jednoduchých lipidů v živých systémech, v jejichž molekule je místo glycerolu vázán některý vyšší jednosytný alkohol (např. cetylalkohol, stearylalkohol, myristylalkohol atp.). Jedná se o silně hydrofobní sloučeniny, které proto v organizmech plní převážně ochrannou funkci (např. vrstvy vosků na povrchu listů omezují průnik vody).
38
Molekuly složených lipidů obsahují kromě vyšších karboxylových kyselin a alkoholu ještě další složku: kyselinu trihydrogenfosforečnou, a potom se takové lipidy označují jako fosfolipidy, nebo sacharid, a potom se označují jako glykolipidy. Vzhledem k tomu, že molekuly fosfolipidů i glykolipidů obsahují skupiny, které mohou disociovat na ionty, představují tyto složené lipidy tzv. polární lipidy. Molekuly složených lipidů tedy sestávají z úseku, který je nepolární (hydrofobní) a úseku, který je polární (hydrofilní). Amfifilie složených lipidů se významně odráží ve funkcích biologických struktur (např. buněčných membrán), do nichž jsou tyto lipidy zavzaty. Při biosyntéze některých polárních lipidů se rovněž uplatňuje jako meziprodukt fosfatidát. Fosfatidát reaguje s cytidintrifosfátem (CTP) za vzniku CDP - diacylglycerolu a uvolnění fosfátu; CDP - diacylglycerol pak může reagovat s další komponentou (serinem, glycerolfosfátem, inozitolem) za vzniku příslušných konečných produktů (fosfatidylserinu, fosfatidylglycerolu, fosfatidylinozitolu). Fosfatidylserin může být prekurzorem dalších polárních lipidů: fosfatidylcholinu (vzniká metylací fosfatidylserinu) nebo fosfatidyletanolaminu (vzniká dekarboxylací fosfatidylserinu).
SCHÉMA MOLEKULY SLOŽENÉHO LIPIDU
39
FOSFOLIPIDY jsou složené lipidy, v jejichž molekule je některá mastná kyselina nahrazena fosfátovou skupinou vytvářející fosfoesterovou vazbu mezi molekulou přítomného alkoholu a molekulou některé dusíkaté látky. Mezi nejčastěji zastoupené alkoholy patří glycerol, cholin nebo sfingozin. Cholin a sfingozin jsou dusíkaté alkoholy, jejichž funkci mohou v některých fosfolipidech plnit jiné látky s podobnou strukturou (např. serin). Fosfolipidy tvoří základní složku biologických membrán. Fosfolipidy lze dále rozdělit na: (a) Glycerolfosfatidy Patří mezi ně lecitin (= fosfatidylcholin), kefalin (= fosfatidyletanolamin), serinkefalin (= fosfatidylserin), fosfatidylinozitol, kardiolipin (= fosfatidylglycerol) (b) Sfingofosfatidy Patří mezi ně sfingomyelin (= sfingofosfatidylcholin) GLYKOLIPIDY jsou složené lipidy, jejichž molekuly sestávají z mastné kyseliny, alkoholu sfingozinu a některého sacharidu. Glykolipidy se podle typu sacharidu, který obsahují, dělí na: (a) Cerebrozidy V jejich molekule je vázán jednoduchý monosacharid (např. galaktóza). (b) Gangliozidy Sacharidovou složku v jejich molekule tvoří některý ze složitějších sacharidů (např. kyselina sialová neboli kyselina N-acetylneuraminová).
II.2.3. IZOPRENOIDY Základní jednotkou izoprenoidů je izopren (= 2-metyl-1,3-butadien). Jeho polymerizazací a některými chemickými modifikacemi (např. cyklizace izoprenového řetězce, hydroxylace, přesun metylových skupin nebo jejich uvolnění z řetězce) vznikají různé skupiny izoprenoidů (hopanoidy, steroidy, terpeny). Deriváty izoprenoidů s lineárními řetězci na obou koncích spojenými éterovou vazbou s molekulami glycerolu představují evolučně starobylé membránové lipidy archebakterií. STEROIDY Steroidy jsou izoprenoidy odvozované od alicyklického kondenzovaného uhlovodíku steranu se 17 atomy uhlíku v molekule. Molekuly steroidů vyskytující se v biologických systémech však sestávají z 18 až 27 atomů uhlíku. Tyto další atomy uhlíku se připojují k molekule steranu ve formě metylů (substituce v poloze C10, C13) nebo vedlejšího řetězce (k atomu C17). Kromě toho mohou molekuly steroidů nést ještě další substituenty, především hydroxyskupiny, oxoskupiny, karboxyskupiny a některé další. Rozdíly ve struktuře jednotlivých steroidů, dané různým počtem uhlíkových atomů, přítomností různých substituentů a jejich rozložením na molekule, jsou příčinou odlišných fyzikálně-chemických i biologických vlastností jednotlivých steroidů. Steroidy, jejichž molekuly nesou vedlejší uhlíkatý řetězec a jsou hydroxylovány v poloze C3, se označují jako steroly. Patří k nejrozšířenějším steroidům v přírodě. Mezi biologicky významné a hojně se vyskytující zástupce je možné uvést cholesterol (složka biomembrán) a ergosterol (prekurzor vitaminu D2). Mezi další steroidy, plnící v organizmu důležité funkce, patří steroidní hormony (androgeny, estrogeny, progesteron, kortikoidy) a žlučové kyseliny.
40
HOPANOIDY Hopanoidy jsou dalším typem polycyklických izoprenoidů. Vyskytují se u bakterií. Jejich základním představitelem je hopanoid tetrahymanol, který je odvozován (stejně jako steroid cholesterol) od společného prekurzoru squalenu.
TERPENY Terpeny jsou syntetizovány rostlinnými buňkami. Některé z nich se uplatňují jako doplňkové fotosyntetické pigmenty (karoteny, xantofyly). β-karoten je prekurzorem retinolu (vitamin A), diterpen fytol je součástí vitamínu E a K, řada dalších terpenů je obsažena v některých produktech sekundárního metabolizmu rostlin (např. silice, pryskyřice).
II.2.4. SACHARIDY Sacharidy jsou polyalkoholy obsahující v molekule oxoskupinu. V živých systémech se vyskytují mono- , oligo- i polysacharidy. Z chemického hlediska jsou monosacharidy buď polyhydroxyaldehydy (tzv. aldózy), nebo polyhydroxyketony (tzv. ketózy). Molekuly monosacharidů obsahují jeden nebo více asymetrických atomů uhlíku (centra chirality) a proto mohou tvořit stereoizoméry (obecně 2n, kde n = počet asymetrických atomů uhlíku v molekule). Podle polohy atomů vodíku a hydroxylové skupiny na asymetrickém atomu uhlíku sousedícím se skupinou – CH2OH se monosacharidy dělí na monosacharidy řady D a monosacharidy řady L. Naprostá většina monosacharidů, které se nacházejí v živých systémech, patří k řadě D. Molekuly mononosacharidů s delším řetězcem (pentózy, hexózy) mohou vytvářet kromě lineárních (necyklických) též cyklické struktury (furanózy s pětičetným kruhem, pyranózy se šestičlenným kruhem); vznik cyklických struktur vyplývá z rotace vazeb C – C, kterou je umožněna adice hydroxylové skupiny na oxoskupinu téže molekuly, přičemž atom kyslíku se stane součástí cyklické struktury (polymetylenoxidový kruh). Nově vytvořené centrum chirality v cyklické struktuře molekuly monosacharidu je příčinou vzniku anomerů α a β, které představují konfigurační izoméry. Hydroxylová skupina na anomerním atomu uhlíku umožňuje reakcí s jinou molekulou vznik glykozidové vazby (O-glykozidová vazba v molekulách oligosacharidů a polysacharidů, tj. hologlykozidů, O-glykozidová, S-glykozidová nebo Nglykozidová vazba v molekulách heteroglykozidů). MONOSACHARIDY Mezi nejrozšířenější monosacharidy v živých systémech paří D-glukóza (aldohexóza) a D-fruktóza (ketohexóza); oba se mohou v buňkách vyskytovat i ve volném stavu. Aldopentózy D-ribóza a deoxy-D-ribóza (většinou 2-deoxy-D-ribóza, méně často 3-deoxy-D-ribóza) jsou v buňkách obsaženy především ve formě heteroglykozidů (např. jako součásti ribonukleotidů a deoxyribonukleotidů nukleových kyselin). Mezi významné monosacharidy intermediárního metabolizmu, vyskytující se v buňkách převážně ve formě fosfátů, patří D-glyceraldehyd (aldotrióza) a dihydroxyaceton (ketotrióza), D-erytróza (aldotetróza), D-ribulóza, D-xylulóza (ketopentózy ) a sedoheptulóza (ketoheptóza).
41
V buňkách plní řadu důležitých funkcí nebo jsou složkami některých struktur též deriváty monosacharidů. Aminocukry D-glukózamin a D-galaktózamin jsou například stavebními komponentami chitinu a proteoglykanové kostry buněčné stěny baktérií. Manózamin je složkou molekul sialových kyselin, obsažených v glykoproteinech, proteoglykanech a glykoplipidech. Tyto makromolekuly se uplatňují např. při agregačních reakcích, při rekogničních procesech, jako strukturní součásti buněčných receptorů apod.
PŘÍKLADY MONOSACHARIDŮ
42
VZORCE MOLEKULY GLUKÓZY
OLIGOSACHARIDY Oligosacharidy jsou v buňkách zastoupeny nejčastěji disacharidy sacharózou (významný transportní sacharid rostlin), laktózou (důležité zejména pro intermediární metabolizmus bakteriálních buněk), cellobiózou a α-maltózou (glykozidová vazba C1→C4), resp. β-izomaltózou (glykozidová vazba C1 → C6), které jsou základními stavebními složkami mnoha polysacharidů.
PŘÍKLADY DISACHARIDŮ
43
POLYSACHARIDY Polysacharidy jsou obecně v buňkách zastoupeny ve formě homopolysacharidů i heteropolysacharidů. Nejrozšířenější jsou glukany, tedy polymery tvořené glukózovými jednotkami navzájem spojenými glykozidickou vazbou. Jejich řetězce mohou být lineární, nebo různě větvené. Molekuly polysacharidů vytvářejí – podobně jako i ostatní biomakromolekuly – uspořádané struktury. Vytvoření určité struktury (konformace) a/nebo její změny se odrážejí ve funkčních vlastnostech polysacharidů.
OBECNÉ SCHÉMA POLYMERACE A DEPOLYMERACE
44
Hlavním zásobním polysacharidem rostlin je škrob. Škrob je polysacharid, jehož základní stavební jednotkou je disacharid maltóza. Ta vytváří jednak amylózu s helikálně uspořádaným lineárním řetězcem, jednak amylopektin s větveným řetězcem (v důsledku glykozidových vazeb C1 → C6). Amylóza a amylopektin tvoří vyšší podjednotky škrobu; vzhledem k tomu, že jejich podíl není konstantní, existují různé varianty škrobu s odlišnými fyzikálně-chemickými vlastnostmi. V živočišných buňkách je typickým rezervním polysacharidem s větveným řetězcem a rovněž s výrazným strukturním polymorfizmem glykogen. Zásobním polysacharidem v hlízách a oddéncích některých druhů rostlin je též inulin, jehož stavební podjednotky tvoří molekuly fruktózy. Řada mikroorganizmů (bakterie, řasy) produkuje dextrany, jejichž stavební jednotkou je glukóza, nebo agar, jehož základní stavební jednotkou (jako agarózy) je galaktóza. Celulóza se uplatňuje jako stavební polysacharid buněčných stěn rostlinných i některých bakteriálních buněk. Je též složkou určitých rostlinných mechanických (podpůrných) pletiv. Celulóza vytváří lineární paralelně uspořádané řetězce, na jejichž soudržnosti se podílejí vodíkové vazby. Na tyto řetězce se mohou ještě navázat molekuly jiných polysacharidů. Hemicelulózy na rozdíl od celulózy jsou heterogenní skupinou polysacharidů s odlišným chemickým složením a kratšími řetězci. Celulózová, resp. hemicelulózová vlákna jsou v buněčné stěně napojena na matrici, na jejímž složení nejvíce participují pektiny, pektinové kyseliny, extenzin (glykoprotein) a případně lignin. Pektiny jsou kyselé polysacharidy, které se vyskytují též v buněčné šťávě vakuol a ve větších množstvích se akumulují v dužnatých plodech; snadno poutají vodu, botnají a tak ovlivňují hospodaření rostlin s vodou. Lignin je složitý, u rostlin velmi rozšířený vysokomolekulární heterogenní polymer, který způsobuje dřevnatění (lignifikaci) buněčné stěny a tím zvyšuje její pevnost; hojně je proto zastoupen v buněčných stěnách pletiv s převážně mechanickými funkcemi. Hlavním stavebním materiálem buněčných stěn hub a některých útvarů živočichů (např. exoskelet bezobratlých) je chitin. Jeho lineární řetězec sestává z podjednotek 2-aminoacetyl-β-D-glukózy V buňkách se vyskytují také heteropolysacharidy. V živočišných buňkách představují významnou skupinu glykózaminoglykany, jejichž lineárně uspořádané makromolekuly jsou tvořeny podjednotkami disacharidu, sestávajícími zpravidla z hexózaminu (sulfonylovaného nebo acetylovaného na C3) a kyseliny glukuronové, a vzájemně spojenými vazbami C1 → C4 nebo C1 → C3. Mnoho významných funkcí plní složené (konjugované) sacharidy. Jejich molekula sestává ze složky cukerné a necukerné. Jestliže je necukernou složkou molekula lipidu, hovoříme o glykolipidech. Jestliže je necukernou složkou molekula proteinu nebo peptidu, pak hovoříme o glykoproteinech (převažuje složka bílkovinná nad nebílkovinnou) nebo proteoglykanech (převažuje složka cukerná nad bílkovinnou). Obecně lze říci, že v živých systémech se monosacharidy uplatňují zejména jako pohotové zdroje energie (glukóza) a komponenty makromolekul (nukleotidy, glykoproteiny, heteroglykozidy), oligo- a polysacharidy jako složky některých celulárních i extracelulárních struktur a jako rezervní látky, které mohou být metabolizovány a ze kterých může být uvolněna chemicky vázaná energie, potřebná pro endergonické buněčné procesy. Sacharidy jsou jedním z hlavních donorů uhlíku pro biosyntetické procesy.
45
POLYSACHARIDY A JEJICH LOKALIZACE V BUŇCE
46
Centrální látkou, od níž vychází a do níž ústí metabolizmus sacharidů, je glukóza-6-fosfát. Tato sloučenina se může účastnit řady procesů a to jak za aerobních, tak za anaerobních podmínek. Základním, evolučně starobylým procesem katabolizmu sacharidů je glykolýza. Při ní je glukóza-6-fosfát nejprve za účasti příslušné izomerázy izomerován na fruktóza-6-fosfát a ten dále fosforylován na fruktóza-1,6,-bisfosfát. V následujícím kroku se fruktóza-1,6-bisfosfát štěpí na dvě trojuhlíkaté sloučeniny: glyceraldehyd-3-fosfát a dihydroxyacentonfosfát. V dalším průběhu glykolýzy glyceraldehyd-3-fosfát plní funkci donora vodíku: dehydrogenuje se (aldehydová skupina se oxiduje na karboxylovou) na 1,3-bisfosfoglycerát a uvolněné atomy vodíku se přenášejí na NAD+ (vzniká NADH+H+); 1,3-bisfosfoglycerát se následně přeměňuje na 3-fosfoglycerát, přičemž se uvolněná energie využije k syntéze ATP (tzv. substrátová fosforylace). 3-fosfoglycerát se dále odbourává přes 2-fosfoglycerát, 2-fosfoenolpyruvát a enolpyruvát až na pyruvát, přičemž přechod 2-fosfoenolpyruvátu na enolpyruvát je spřažen se syntézou další molekuly ATP mechanizmem substrátové fosforylace. Při glykolýze jedné molekuly glukózy tedy vzniknou 2 molekuly pyruvátu, spotřebují se dvě molekuly ATP na fosforylaci (glukóza → glukóza-6-fosfát a fruktóza-6-fosfát → fruktóza-1,6-bisfosfát), substrátovou fosforylací vzniknou 4 molekuly ATP (po dvou od každé triózy při přeměnách 1,3-bisfosfoglycerát → 3-fosfoglycerát a 2-fosfoenolpyruvát → pyruvát) a ve dvou krocích se 47
přenesou celkem 4 atomy vodíku na NAD+ za vzniku NADH+H+; to znamená, že pokud jde o sloučeniny s makroergní vazbou, celkově vzniknou 2 molekuly ATP a 2 molekuly NADH+H+. Všechny reakce glykolýzy se odehrávají v cytosolu a žádný ze zúčastněných enzymů není vázán na jakoukoli buněčnou strukturu. Tato skutečnost koresponduje s tím, že glykolýza je jedním ze starobylých základních biochemických procesů, které evolvovaly již v buňkách bez zjevné kompartmentace (jako jsou např. bakterie).
SCHÉMA GLYKOLÝZY
48
49
Pyruvát představuje určitý kruciální bod buněčného metabolizmu. Jeho další přeměny závisejí na typu organizmu (např. aerob, aneaerob) a do jisté míry též na konkrétních podmínkách, ve kterých se organizmus nachází. U aerobních organizmů může být pyruvát za účasti enzymů přeměněn mechanizmem oxidační dekarboxylace na acetyl-koenzym A, který může být následně zapojen do cyklu trikarboxylových kyselin a úplně oxidován až na CO2 a H2O; NADH+H+ se u těchto organizmů reoxiduje prostřednictvím dýchacího řetězce (blíže viz kapitola Mitochondrie). Úplnou oxidaci glukózy lze sumárně vyjádřit rovnicí: C6H12O6 → 6CO2 + 6H2O + 36ATP, ∆G˚ = - 2 872 kJ·mol-1. Z celkového množství energie, uvolněné při úplné oxidaci jednoho molu glukózy, tj. 2 872 kJ, je přibližně 40% deponováno v ATP (33 kJ·mol-1 ATP x 36 molů ATP = 1 188 kJ; 118 800 : 2 872 ~ 40%). Uvedený způsob úplné oxidace glukózy je uskutečnitelný u všech organizmů, které jsou vybaveny dýchacím řetězcem a ve kterých může probíhat cyklus trikarboxylových kyselin. Glukóza však může být úplně oxidována (tzn. přeměněna až na CO2 a H2O) nejen výše popsaným způsobem, tj. prostřednictvím cyklu trikarboxylových kyselin a dýchacího řetězce. Děje se tak bez účasti cyklu trikarboxylových kyselin a dýchacího řetězce prostřednictvím pentózového cyklu. Tento cyklus lze označit za doplňkový způsob odbourávání glukózy, protože se vyskytuje pouze v některých buňkách. V oxidační fázi pentózového cyklu (sestávající ze dvou dehydrogenací a jedné dekarboxylace) je hexóza (glukóza-6-fosfát) přeměněna na pentózu (ribóza-5-fosfát), přičemž uvolněné atomy vodíku se přenášejí na NADP+, který redukují na NAHPH+H+. K úplné oxidaci jedné molekuly hexózy se tedy musí uskutečnit šest otáček tohoto cyklu; při nich se vytvoří celkem 12 molekul NADPH+H+. NADPH+H+ je sloučenina s makroergní vazbou (podobně jako ATP), která při biosyntetických procesech založených na redukčních reakcích funguje jako reduktans (donor vodíku) s vysokým obsahem 50
využitelné energie, neboli jako tzv. redukční síla (na rozdíl od ATP, které funguje jako pohotový zdroj energie). Energie těchto 12 molekul NADPH+H+ je ekvivalentní 36 molekulám ATP a tudíž z hlediska energetického zisku není rozdíl mezi úplnou oxidací glukózy pentózovým cyklem nebo aerobní glykolýzou (prostřednictvím cyklu trikarboxylových kyselin a dýchacího řetězce), rozdíl je ve využití této energie. Pozn.: Pentózy, vznikající oxidací hexózy v pentózovém cyklu, se mohou stát součástí nukleotidů, nebo mohou být převedeny zpět na hexózy (avšak odlišným reakčním mechanizmem, než byly produkovány) Organizmy, které nedisponují dýchacím řetězcem (většinou anaerobové), anebo jím disponují (aerobové), ale dočasně trpí nedostatkem kyslíku (jako např. v namáhaném svalu), mohou reoxidovat NADH+H+ na NAD+ procesem zvaným fermentace neboli kvašení (blíže viz kapitola Metabolizmus). Obecně lze fermentaci charakterizovat jako proces, při kterém se substráty oxidují pouze částečně a oxidací uvolněná energie se využije k syntéze ATP mechanizmem substrátové fosforylace; současně se redukované koenzymy reoxidují přenesením vodíku na zbytek substrátu vzniklý jeho částečnou oxidací (např. pyruvát, acetaldehyd), a redukovaný produkt (např. laktát, etanol). Je-li akceptorem atomů vodíku např. pyruvát, redukuje se za katalytického účinku laktátdehydrogenázy na laktát. Tento děj však není spojen s žádným energetickým ziskem. Fermentační odbourávání 1 molekuly glukózy tedy vede v naprosté většině případů pouze k produkci 2 molekul ATP, tzn. je z hlediska celkové energetické bilance 18-krát méně efektivní než úplná oxidace glukózy. Do reoxidace NADH+H+ mohou obdobným způsobem zapojeny i jiné organické látky než pyruvát; podle toho lze hovořit o dalších typech fermentace (např. máselná, etanolová). SCHÉMA MLÉČNÉHO KVAŠENÍ
51
SCHÉMA ALKOHOLOVÉHO KVAŠENÍ
Biosyntéza sacharidů se v živých systémech realizuje více způsoby. Autotrofní organizmy syntetizují sacharidy prostřednictvím Calvinova cyklu v průběhu fotosyntézy z anorganických substrátů, jimiž jsou oxid uhličitý a vodu (blíže kapitola Chloroplasty, fotosyntéza a fotorespirace). Heterotrofní organizmy využívají jako substráty pro biosyntézu sacharidů některé z organických látek,které produkují při katabolických procesech; jedná se převážně o sloučeniny tříuhlíkaté a čtyřuhlíkaté (např. pyruvát, laktát, meziprodukty cyklu trikarboxylových kyselin), výjimečně dvouuhlíkaté (např. acetylkoenzym A může být v rostlinných a některých mikroorganizmálních buňkách přeměněn glyoxylátovým cyklem na sukcinát, který dále vstupuje jako čtyřuhlíkatá sloučenina do obvyklých procesů biosyntetézy sacharidů). Biosyntéza glukózy se označuje jako glukoneogeneze (též glukogeneze). S jistým omezením lze říci, že se jedná o obrácený chod glykolýzy, katalyzovaný týmiž enzymy kromě úseků, ve kterých je rovnováho posunuta silně na stranu glykolýzy (pyruvát → 2-fosfoenolpyruvát, fruktóza-1,6-bisfosfát → fruktóza-6-fosfát, glukóza-6-fosfát → glukóza). Na syntézu jedné molekuly glukózy je třeba dvou molekul pyruvátu. Každá z nich se za využití energie, uvolněné hydrolýzou 1 molekuly ATP a 1 molekuly GTP mění oklikou (např. přes oxalacetát) na 2-fosfoenolpyruvát; 2-fosfoenolpyruvát přechází na 3-fosfoglycerát, který se za využití energie uvolněné hydrolýzou další molekuly ATP přeměňuje na 1,3-bisfosfoglycerát. 1,3-bisfofoglycerát se redukuje za využití jedné molekuly NADH+H+ (která se oxiduje 52
na NAD+) na glyceraldehyd-3-fosfát; ze dvou těchto tříuhlíkatých sloučenin vzniká fruktóza-1,6,-bisfosfát, který dále postupně přechází přes fruktóza-6-fosfát na glukóza-6-fosfát, případně až na glukózu. Celková energie, potřebná k biosyntéze jedné molekuly glukózy, tak odpovídá energii uvolněné z 12 molekul ATP (4ATP + 2GTP ~ 2ATP + 2 NADH+H+ ~ 6ATP). Produkty glukogeneze mohou být použity k biosyntéze oligosacharidů a polysacharidů. Takové procesy se souhrnně označují termínem glykoneogeneze (též glykogeneze).
II.2.5. AMINOKYSELINY Aminokyseliny jsou základní stavební jednotkou bílkovin a peptidů. Aminokyseliny jsou organické mono- a dikarboxylové kyseliny, které v molekule obsahují alespoň jednu aminoskupinu. Základních aminokyselin, které se vyskytují v bílkovinách a peptidech, syntetizovaných buňkami organizmů, je 20 (resp. 21, zahrnujeme-li mezi ně i selenocystein). Všechny tyto aminokyseliny patří k tzv. α – aminokyselinám, protože v jejich molekulách je atom vodíku, vázaný na asymetrický atom uhlíku α (chirální centrum), substituován aminoskupinou (-NH2). Pouze jediná ze základních aminokyselin – glycin – neobsahuje ve své molekule asymetrický uhlík. Některé aminokyseliny (tzv. diaminokarboxylové aminokyseliny) mají substituovaný ještě další atom vodíku vázaný k jinému atomu uhlíku, než α - uhlíku. V molekule aminokyseliny je na α-uhlík navázána karboxylová skupina, aminoskupina, atom vodíku a postranní řetězec; jednotlivé aminokyseliny se navzájem tedy liší postranním řetězcem. Naprostá většina aminokyselin v bílkovinách náleží k L – řadě, přestože L- i D- formy tvoří zrcadlově symetrické konfigurace molekul, které jsou termodynamicky i kineticky totožné. Aminokyseliny s D-konfigurací se v biologických systémech nacházejí ojediněle a látky, které takové aminokyseliny obsahují, plní zpravidla některé specifické funkce. Například D-aminokyseliny se vyskytují v antibiotikách produkovaných bakteriemi; tato antibiotika jsou toxická pro jiné druhy bakterií (resp. i další skupiny mikroorganizmů), protože D- aminokyseliny působí jako antimetabolity inhibující normální průběh metabolických dějů. D-aminokyseliny jsou však pravidelnou součásí tetrapeptidu peptidoglykanové kostry buněčné stěny bakterií. Aminokyseliny mohou být klasifikovány z různých hledisek. Z chemického hlediska lze rozdělit základní aminokyseliny do následujících skupin: a) kyseliny monoaminokarboxylové: glycin (Gly), alanin (Ala), valin (Val), leucin (Leu), izoleucin (Ile) b) hydroxyaminokyseliny: serin (Ser), treonin (Thr) c) aminokyseliny sirné: metionin (Met), cystein resp. cystin (Cys), selenocystein (SeC) Pozn.: Molekula cystinu vzniká spojením dvou molekul cysteinu prostřednictvím S-S vazby (oxidací sulfhydrylových skupin molekul cysteinu). d) kyseliny monoaminodikarboxylové: kyselina asparagová (Asp), kyselina glutamová (Glu) e) kyseliny diaminokarboxylové: asparagin (Asn), glutamin (Gln), lyzin (Lys), arginin (Arg) f) aminokyseliny cyklické: fenylalanin (Phe), tyrozin (Tyr), tryptofan (Trp), histidin (His), prolin (Pro), resp. hydroxyprolin (OH-Pro)
53
Řada aminokyselin je elektrochemicky aktivní, protože v postranním řetězci (R) molekuly obsahují některé ionogenní skupiny (kyselé: -COOH, -SH; zásadité: -NH2, =NH). Tyto skupiny mohou při vhodném pH tvořit anionty nebo kationty. Podle zastoupení jednotlivých aminokyselin v polypeptidovém řetězci se tak může peptid (resp. bílkovina) chovat jako aniont nebo kationt, jinými slovy jako kyselá nebo bazická bílkovina. Existuje určitá hodnota pH, při níž je daná aminokyselina elektroneutrální, tzn. chová se jako obojetný (dipolární) iont. Hodnota tohoto pH je pro každou aminokyselinu specifická a označuje se jako izoelektrický bod (IEB). Rovněž pro každý peptid nebo bílkovinu lze stanovit IEB, jehož hodnota závisí na jejich aminokyselinovém složení (a v biologických systémech též na fyzikálně-chemických vlastnostech bezprostředního okolí, které daný peptid nebo bílkovinu obklopuje). Aminokyseliny se tedy mohou chovat (a také chovají) jako slabé elektrolyty, přičemž platí: a) pro anionty COOH <────> COO¯ + H+ [COO¯ ] [H+] K1 = – ––––––––––––– [COOH] pK1 = - log K1 pH < pK1,
/disociační konstanta/
pK1 ≈ 3,5 – 5,5
b) pro kationty:
NH3+ <————–> NH2 + H+
Obdobně jako pro anionty: pK2 = - log K2 pH > pK2,
pK2 ≈ 7,0 – 9,0
c) pro objetné (dipolární) ionty: pK1 < pH < pK2
Aminokyseliny se významně uplatňují v metabolizmu všech organizmů. Zapojují se především do následujících hlavních typů reakcí: (1) dekarboxylace aminokyselin na příslušné aminy, resp. diaminokyselin na diaminy (např. lyzin → kadaverin, ornitin → putrescin); tyto reakce jsou enzymaticky katalyzovány specifickými karboxylázami (dekarboxylázami). Produkty těchto dekarboxylací mohou být enzymaticky dále přeměňovány (např. monoaminooxidázy katalyzují oxidaci adrenalinu a noradrenalinu).
54
(2) aerobní deaminace je enzymaticky katalyzovanou přeměnou aminokyselin na α-oxokyseliny; enzymy, které tyto reakce katalyzují, jsou oxidoreduktázy (dehydrogenázy) s FAD nebo NAD, pří. NADP jako koenzymem. Aerobní deaminace patří mezi reakce exergonické, jimiž buňky uvolňují energii, kterou dále podle potřeby utilizují. (3) transaminace jsou reakce katalyzované transaminázami (skupina transferáz), při kterých je aminoskupina přenesena z určité aminokyseliny na příslušnou oxokyselinu. V mechanizmu těchto reakcí se uplatňuje pyridoxalfosfát (koenzym transamináz): nejprve se na něj přenese aminoskupina z aminokyseliny za vzniku pyridoxaminfosfátu, ze kterého se pak předá oxokyselině. Například L-aspartát:2-oxoglutarátaminotransferáza (AST) katalyzuje reakci: glutamát + oxalacetát ↔ α-oxoglutarát + aspartát; podobně L-alanin:2-oxoglutarátaminotransferáza katalyzuje reakci: glutamát + pyruvát ↔ α-oxoglutarát + alanin. Vztahy mezi konkrétním druhem aminokyseliny, transaminázou a určitou oxokyselionou jsou specifické a u jednotlivých biologických druhů geneticky determinované. Aminokyseliny, které se nemohou u daného druhu tvořit transaminací, jsou pro tento druh nepostradatelné (esenciální), všechny ostatní aminokyseliny, které se tímto mechanizmem mohou tvořit, jsou postradatelné (neesenciální). Mezi esenciální aminokyseliny člověka patří: treonin, metionin, valin, leucin, izoleucin, lyzin, fenylalanin a tryptofan; tyto aminokyseliny musejí být do organizmu dodávány již hotové z jiných zdrojů (potravou, v níž jsou obsaženy). (3) kondenzace (polylymerace) aminokyselin se uplatňuje při syntézy peptidových řetězců. Při těchto reakcích se z karboxylové skupiny jedné aminokyseliny a aminoskupiny další aminokyseliny vytvoří peptidová vazba (-CONH), jíž jsou jednotlivé aminokyseliny v peptidovém řetězci spojeny (blíže viz podkapitola Translace).
II.2.6. PEPTIDY Peptidy, oligopeptidy (v molekule obsahují do dvaceti aminokyselinových zbytků) i polypeptidy (v molekule obsahují přibližně od dvaceti do jednoho sta aminokyselinových zbytků), sestávají z polypeptidových řetězců, složených z určitého počtu a sledu aminokyselin. Na každém (poly)peptidovém řetězci se rozlišuje N-konec, tvořený volnou nebo acetylovanou aminoskupinou koncové aminokyseliny, a C-konec, tvořený volnou nebo amidovanou karboxylovou skupinou koncové aminokyseliny. Biosyntéza polypetidového řetězce začíná od N-konce a směřuje k C-konci. Primární strukturu polypeptidového řetězce představuje lineární sekvence aminokyselin, jejichž pořadí se uvádí od N-konce k C-konci. Na peptidový řetězec lze tedy nahlížet jako na lineární polymer. V takovém polymeru řetězec hlavních valencí peptidu vytváří statistické klubko, ve kterém jsou jednotlivé skupiny řetězců aminokyselin uspořádány kolem těžiště přibližně podle Gaussova rozložení. Primární struktura je plně charakterizována kovalentními vazbami polypeptidového řetězce.
55
SPOJENÍ AMINOKYSELIN V PEPTIDOVÉM ŘETĚZCI PEPTIDOVOU VAZBOU
Primární strukturu polypeptidového řetězce představuje lineární sekvence aminokyselin, jejichž pořadí se uvádí od N-konce k C-konci. Na peptidový řetězec lze tedy nahlížet jako na lineární polymer. V takovém polymeru řetězec hlavních valencí peptidu vytváří statistické klubko, ve kterém jsou jednotlivé skupiny řetězců aminokyselin uspořádány kolem těžiště přibližně podle Gaussova rozložení. Primární struktura je plně charakterizována kovalentními vazbami polypeptidového řetězce.
56
SCHÉMA PRIMÁRNÍ STRUKTURY MOLEKULY POLYPEPTIDU
Peptidy však vytvářejí nejen primární strukturu, ale též sekundární strukturu typu α - šroubovice nebo tzv. β -struktury (čili struktury skládaného listu). Pro sekundární strukturu je charakteristická přítomnost vodíkových vazeb vznikajících mezi peptidovými vazbami dvou sousedních závitů α-šroubovice nebo dvou sousedních oblastí β-struktury. Strukturu α-šroubovice (helixu) odvodili Pauling a Corey. Z výsledků rentgenostrukturních analýz vyvodili, že peptidová vazba může existovat ve dvou elektronových strukturách: neutrální a polární. K tomuto závěru dospěli na základě nálezu kratší vazby C-N (0,132 nm oproti obvyklým 0,147 nm) a prodloužené vazby C=O (1,124 nm oproti obvyklým 0,121 nm). To znamená, že vazba C-N nabývá částečně charakter dvojné vazby a vazba C=O nabývá částečně charakter jednoduché vazby; tato zjištění nasvědčují účasti π-elektronů na tvorbě peptidové vazby. Vlastní model šroubovice zahrnuje tři Paulingovy principy: (1) celá čtveřice atomů, které tvoří peptidovou vazbu (tj. C, O, N, H), musí ležet v jedné rovině, (2) zbytek každé aminokyseliny musí být v molekule polypeptidu situován vzhledem k sousedním skupinám a 57
ke šroubovici stejně jako ostatní zbytky aminokyselin (tzv. princip ekvivalence zbytků aminokyselin), (3) pro každou peptidovou vazbu se tvoří dvě vodíkové vazby (můstky), čímž je udržována maximální kompaktnost šroubovice; přitom se vzhledem k polaritě vodíkového můstku předpokládá tendence ke kolineárnímu uspořádání vazeb N-H a C=O. Na základě výpočtu volné energie vodíkové vazby při vzájemném postavení skupin -CO- a –NHpod určitým úhlem Θ dospěl k závěru, že tento úhel zřejmě nebude přesahovat hodnotu 26˚. Za použití těchto (a dalších) údajů je možné Paulingův-Coreyův model α – šroubovice charakterizovat těmito základními znaky: (1) na jeden závit připadá 3,6 aminokyselinových zbytků (2) výška závitu je 0,54 nm (3) průměr válcového povrchu, ve kterém jsou uloženy všechny atomy uhlíku, je 1,01 nm (4) vodíkové vazby mezi sebou tvoří vždy peptidové vazby v intervalu daném číslem 4 (5) postranní řetězce aminokyselin jsou umístěny vně šroubovice Šroubovice v Paulingově-Coreyově modelu může být pravotočivá nebo levotočivá (směr rotace se stanovuje od N-konce k C – konci polypeptidového řetězce). Uvážíme-li však skutečnost, že v biologických systémech jsou molekuly bílkovin (až na výjimky) sestaveny z L- aminokyselin, potom směr rotace šroubovice polypeptidového řetězce už nemůže být libovolný – šroubovice polypeptidových řetězců jsou v molekulách bílkovin pravotočivé. Postranní řetězce aminokyselin v takové šroubovici směřují opačným směrem, než je směr polypeptidového řetězce a mohou na sebe vzájemně působit (van der Waalsovy síly). V levotočivé šroubovici polypeptidového řetězce, obsahujícího L-aminokyseliny, by postranní řetězce těchto aminokyselin byly orientovány ve stejném směru jako je směr polypeptidového řetězce a struktura takové šroubovice by byla termodynamicky výhodnější, než struktura pravotočivé šroubovice o stejné aminokyselinové sekvenci. Současně by však byla méně stabilní a méně chráněna proti působení polárních rozpouštědel, což je z hlediska biologických funkcí bílkovin nežádoucí. V průběhu biologické evoluce tak byla preferována sekundární struktura proteinů typu pravotočivé α – šroubovice. Z chemického hlediska představuje tvorba šroubovice případ intramolekulární krystalizace. Destrukce šroubovice je kooperativní proces, podobný fázovému přechodu. V živých systémech mohou probíhat v polypeptidech procesy přechodu statistické klubko ↔ α – šroubovice reverzibilně. V bílkovinných molekulách, jejichž struktura je složitější, může být přechod šroubovice → statistické klubko ireverzibilní. Při studiu struktury peptidů zjistili Pauling a Corey kromě šroubovicového uspořádání polypeptidových řetězců ještě uspořádání jiné, které bylo označeno jako struktura skládaného listu neboli β-struktura. Na rozdíl od α-šroubovice jsou polypeptidové řetězce protaženy a jejich jednotlivé úseky (o délce několika aminokyselinových zbytků) se k sobě přikládají buď paralelně(vedle sebe), takže takto uspořádané úseky jsou orientované od N-konce k C-konci stejným směrem, anebo antiparalelně, takže takto uspořádané úseky jsou od N-konce k C-konci navzájem opačně orientované. Paralelně ležící úseky polypeptidového řetězce (nebo více polypeptidových řetězců) jsou navzájem poutány vodíkovými vazbami mezi skupinami peptidových vazeb –CO- a –NH- (každá peptidová vazba může vytvořit jeden pár vodíkových vazeb). Představíme-li si β-strukturu jako skládaný list, pak postranní řetězce aminokyselin směřují kolmo k rovině listu. Sekundární strukturu v podobě α-šroubovice nebo β-struktury nemusí vytvářet celá molekula peptidu. Například v molekule chymotrypsinu se uspořádaná část molekuly v podobě β-struktury střídá s neuspořádanou částí. Při vytváření rovnovážné konformace polypeptidu se významně uplatňují vodíkové vazby, vzájemné interakce skupin postranních řetězců aminokyselin a vztah těchto skupin aminokyselin ke složkám obklopujícího je prostředí; sekundární struktura polypeptidů není tedy trvale rigidní, neměnná, ale v závislosti na řadě faktorů se může dynamicky měnit. 58
SCHÉMA α – ŠROUBOVICE A β – STRUKTURY (SKLÁDANÉHO LISTU)
59
II.2.7. BÍLKOVINY (PROTEINY) Kondenzací molekul aminokyselin se tvoří peptidové (oligopeptidové, polypeptidové) řetězce. Bílkoviny jsou lineární polymery (kopolymery) složené z aminokyselin vzájemně spojených peptidovou vazbou (resp. z polypeptidových řetězců, které vznikly jako produkt polykondenzace při proteosyntéze). Molekula bílkoviny může sestávat z jednoho nebo více polypeptidových řetězců (např. inzulín ze dvou, v molekule hemoglobinu jsou čtyři globinové řetězce). Bílkoviny patří mezi významné informační biomakromolekuly. Každý jednotlivý organizmus, každá buňka si syntetizuje vlastní soubor bílkovin na základě genetické informace, obsažené v genomu a proto je každý takový soubor unikátní. Bílkoviny mohou tvořit celkem čtyři strukturní úrovně: primární, sekundární, terciární a kvartérní. Primární strukturou se rozumí pořadí aminokyselin v molekule bílkoviny (resp. v jejích polynukleotidových řetězcích), determinované genetickou informací (tj. pořadím nukleotidů v molekule DNA, resp. RNA u RNA - virů). Primární struktura vytváří základní rámec pro utváření možných vyšších struktur. Sekundární strukturou molekul bílkovin se rozumí jejich uspořádání typu α-šroubovice nebo β-struktury, jak o tom bylo psáno výše. Terciární strukturou se rozumí prostorové (tj. třírozměrné) uspořádání polypeptidových řetězců v důsledku tvorby disulfidických vazeb (můstků) mezi sirnými aminokyselinami (zbytky cysteinu), obsaženými v polypeptidových řetězcích, a především schopnosti chemicky různorodých skupin postranních řetězců aminokyselinových zbytků vytvářet nekovalentní vazby (vodíkové vazby, van der Waalsovy síly). Na specifické terciární struktuře závisí funkce bílkovinné molekuly. Změna (narušení) původní terciární struktury může rezultovat ve změnu nebo ztrátu funkce proteinu (tzn. že protein se stává dysfunkčním, afunkčním, nebo může plnit alternativní funkci). Na molekulách bílkovin můžeme vymezit tzv. domény. Doména je úsek bílkovinné molekuly s charakteristickou primární, sekundární a terciární strukturou determinující specifickou funkci tohoto úseku v rámci molekuly jako celku. Je-li rozsah konformační změny molekuly proteinu dostatečně malý, může jím být postižena pouze určitá doména a jí zabezpečovaná funkce, ostatní funkce (resp. ostatní domény) proteinu mohou zůstat nedotčeny. Podle typu terciární struktury se bílkoviny rozdělují do dvou velkých skupin: (a) globulární - mají kulovitý tvar, v jejich molekulách se uspořádané úseky (α-šroubovice, β-struktura) střídají s neuspořádanými úseky; představují většinu proteinů (b) fibrilární – mají vláknitý tvar, v jejich molekulách převažují uspořádané úseky (α-šroubovice, β-struktura) nad neuspořádanými.
60
SCHÉMA MECHANIZMU VZNIKU TERCIÁRNÍ STRUKTURY PROTEINŮ
Kvartérní strukturu nabývá molekula složené bílkoviny jejím sestavením ze dvou a více polypeptidových řetězců. Každý polypeptidový řetězec, který je součástí molekuly složené bílkoviny, se označuje jako podjednotka (syn. monomer nebo protomer). Je-li molekula bílkoviny složena ze stejných podjednotek, označuje se jako homopolymer (resp. homooligomer), je-li složena z více peptidových podjednotek lišících se aminokyselinovým složením, označuje se jako heteropolymer (resp. heterooligomer). Oligomerní bílkovina se v biologických systémech chová jako jedna molekula. S tím souvisí skutečnost, že složená bílkovina je schopna plnit příslušnou biologickou funkci teprve po vytvoření kvartérní struktury. Proto také její přechod na nižší strukturní úroveň (zpravidla) znamená ztrátu funkce. Například molekula alkalické fosfatázy disociací na podjednotky pozbývá své enzymatické aktivity. Naopak bílkoviny, které jsou funkční v monomerním stavu, mohou se stát nefunkčními ve stavu oligomerním; například fosfoglyceraldehyddehydrogenáza pozbývá enzymatické aktivity asociací dvou molekul v jednu a obnovuje ji při disociaci tohoto dimeru na monomery. 61
PŘÍKLAD MOLEKUL PROTEINŮ S KVARTÉRNÍ STRUKTUROU
Struktura bílkovin se může měnit vlivem různých fyzikálně-chemických faktorů a podmínek prostředí. Jednou z častých příčin změny konformace makromolekuly je denaturace. Denaturace narušuje nativní vyšší strukturu bílkovinné molekuly a vede k částečné nebo úplné ztrátě původní konformace. Může být vyvolána změnou teploty (tzv. tepelná denaturace), prudkou změnou pH nebo vlivem některých chemických sloučenin (tzv. chemická denaturace) narušujících vodíkové vazby mezi peptidovými vazbami (např. močovina, kyselina trifluoroctová, soli guanidinu). Je-li denaturace šetrná (nevede k fragmentaci či degradaci polypeptidového řetězce), může se po opětovném navození adekvátních podmínek znovu obnovit i původní konformace molekuly bílkoviny; takový proces se označuje jako renaturace. Denaturace a renaturace bílkovin mají značný význam pro realizaci mnoha životních dějů.
SCHÉMA DENATURACE A RENATURACE PROTEINŮ
62
PŘEHLEDNÉ SCHÉMA STRUKTURNÍCH ÚROVNÍ MOLEKUL PROTENŮ
Bílkoviny v buňce obsahují určité množství vody, jejíž molekuly jsou vázány s různými skupinami bílkovinných molekul a vytvářejí solvátový obal. Solvatace v zásadě určuje rozpustnost jednotlivých bílkovin ve vodě. Hydratační voda vyplňuje povrchové nerovnosti molekuly bílkoviny, je s molekulou bílkoviny pevně vázána a proto se pohybuje současně s ní. Elektrolyty do hydratační vody nepronikají a nerozpouštějí se v ní. Kromě hydratační vody se k bílkovinám pojí ještě tzv. krystalická voda, která znemožňuje molekulám bílkovin pravidelného tvaru vytvořit krystalovou mřížku, protože mezi nimi zůstávají nepatrné prostory vyplněné vodou, do které mohou volně pronikat ionty solí. Podobně jako molekuly aminokyselin i molekuly bílkovin se mohou chovat jako polyionty. Jejich sumární náboj je závislý na struktuře bílkovinné molekuly, tedy na zastoupení jednotlivých aminokyselin. Proto každá bílkovina má svou charakteristickou disociační konstantu. V izoelektrickém bodu (tedy při určité hodnotě pH) se ovšem chová elektroneutrálně. Buněčné bílkoviny bývají klasifikovány na skupinu bílkovin strukturních (stavebních) a skupinu bílkovin funkčních. Mezi stavební bílkoviny jsou řazeny ty, které jsou součástí různých celulárních útvarů (např. biomembrán nebo ribozomů). Mezi funkční bílkoviny jsou řazeny ty, které v buňce plní nějaké funkce (enzymatické, mechanickochemické, transportní, depotní, regulační, rozpoznávací apod.). Toto dělení bílkovin má spíše didaktický význam, protože i strukturní bílkoviny nejsou zcela bezfunkční a naopak funkční bílkoviny jsou součástí nějakých struktur (byť dočasně). 63
Jednu z důležitých skupin bílkovin v buňce představují histony. Jsou to bazické proteiny obsahující ve své molekule větší počet zbytků aminokyselin lyzinu a argininu, jejichž volné aminoskupiny postranního řetězce ionizují za vzniku -NH3+. V důsledku toho se mohou mezi skupinami –NH3+ určité oblasti polypeptidových řetězců molekul histonů a negativně nabitými fosfátovými skupinami nukleových kyselin vytvořit vazby a vzniknout nukleohistonové komplexy. Specifita těchto vazeb vyplývá z aminokyselinové sekvence molekul histonů, nikoli z nukleotidové sekvence DNA. Histony jsou jednou ze základních složek nukleozomů jako strukturně-funkčních jednotek chromozomů. Na stavbě nukleohistonového komplexu participují histony pěti tříd: H2A, H2B, H3 a H4, jejichž oktamer tvoří tzv. jádro nukleozomu, a histon H1, který se podílí na spojení sousedních nukleozomů. Vzhledem k zastoupení histonů jako základních složek chromatinu nepřekvapuje, že patří mezi evolučně nejvíce konzervované biomakromolekuly (např. primární struktura histonu H4 tura domácího se liší od primární struktury histonu H4 hrachu pouze aminokyselinovými zbytky v poloze 102). Jednotlivé aminokyseliny molekul histonů však mohou být chemicky modifikovány (acetylovány, metylovány, fosforylovány apod.). Některé z těchto modifikací jsou reverzibilní a uplatňují se specificky v průběhu buněčného cyklu. Například k acetylaci histonů dochází v oblastech chromatinu, které budou transkribovány; acetylové skupiny neutralizují pozitivní náboj příslušných aminokyselin polypeptidových řetězců molekul histonů, tím se oslabí vazba mezi histony a DNA a taková rozvolněná oblast nukleohistonového komplexu se stává přístupnou pro DNA-polymerázu, která může zahájit transkripci. Složitější je situace v případě metylace určitých oblastí molekul histonů, přestože vede, stejně jako acetylace, k neutralizaci pozitivních nábojů aminokyselinových zbytků; v některých případech má za následek aktivaci genů, v jiných jejich inaktivaci (např. imprimované geny v somatických buňkách). Fosforylace histonů se podílí jako jeden z více faktorů na dynamice kondenzace a dekondenzace chromozomů v průběhu buněčného dělení. V mnohobuněčných organizmech se vyskytuje více molekulárních variant jednotlivých tříd histonů. Jedna z těchto variant se chová jakoby varianta základní, která je inkorporována do nukleozomů při syntéze DNA v průběhu S-fáze interfáze. Později může být nahrazena jinou variantou v závislosti na konkrétním buněčném typu a stadiu diferenciace. Některé varianty histonů též asociují s některými transkripčními faktory a podílejí se tak na zapínání a vypínání genových oblastí v průběhu ontogenetického vývoje. Je zřejmé, že histony jsou velmi dynamickou složkou, která zasahuje do řady základních životních procesů buněk.
SLOŽENÉ PROTEINY (PROTEIDY) Jako složené proteiny nebo též proteidy bývají označovány ty proteiny, v jejichž molekule je obsažena ještě nebílkovinná složka. Podle této nebílkovinné složky je klasifikujeme do několika skupin: Glykoproteiny obsahují sacharidovou složku, která tvoří menší podíl, než složka bílkovinná.Glykoproteiny se vyskytují hojně v cytoplazmatické membráně, tvoří některé enzymy apod. Proteoglykany – obsahují sacharidovou složku (velmi část N-acetylglukózamin), která tvoří menší podíl, než složka bílkovinná. Proteoglykany jsou často buňkami sekretovány a uplatňují se jako složky extracelulární matrix. Lipoproteiny – obsahují lipidovou složku, vyskytují se jako součást buněčných membrán Nukleoproteiny – jsou to bílkoviny, které vytvářejí složité komplexy s nukleovými kyselinami, kde se uplatňují při regulacích genové exprese apod. Fosfoproteiny – v jejich molekulách jsou přítomny fosfátové skupiny, jejichž prostřednictvím zasahují do buněčných regulačních procesů (např. aktivace některých molekul nacházejících se v neaktivním stavu) 64
Chromoproteiny – v jejich molekule je zabudován atom kovového prvku. Chromoproteiny se často uplatňují jako složky enzymů (cytochrómy); nebílkovinná komponenta s atomem kovu (Fe, Cu, Co, atd.) někdy plní funkci koenzymu.
Proteiny se odbourávají hydrolyticky, tzv. proteolýzou, katalyzovanou proteolytickými enzymy zvanými proteázy. Jedna skupina proteáz, exopeptidázy, katalyzuje hydrolýzu peptidových vazeb koncových aminokyselin: karboxypeptidázy na C-konci, aminopeptidázy na N-konci. Jiná skupina proteáz, endopeptidázy, katalyzuje hydrolýzu peptidových vazeb uvnitř polypeptidového řetězce za vzniku menších peptidů (oligopeptidů až dipeptidů). Proteázy zpravidla vznikají jako inaktivní proenzymy, které jsou aktivovány (limitovanou proteolýzou uskutečněnou jinou proteázou, autodigescí) až na místě určení. Proteázy štěpí všechny bílkoviny (některé i v extracelulárním prostředí, do kterého jsou vylučovány); jejich specifita se týká pouze určitých struktur polypeptidového řetězce. Konečnými produkty odbourávání proteinů jsou jednotlivé aminokyseliny. Při katabolizmu proteinů (resp. peptidů a aminokyselin) se uvolňuje amoniak. Amoniak je pro biologické systémy toxický a proto musí být z nich rychle vyloučen (vodní živočichové), nebo detoxikován (převážně suchozemští živočichové). Hlavním způsobem detoxikace amoniaku u živočichů urikotelních je jeho převedení na kyselinu močovou zapojením do metabolizmu glycinu, u živočichů ureotelních jeho zapojením do ornitinového cyklu. U rostlin může být odpadní forma dusíku zabudována do některých aminokarboxylových kyselin (glutamin, asparagin) nebo alkaloidů; ty mohou být v rostlině deponovány a podle potřeby uvolněny, což souvisí se skutečností, že dusík je ekologickým limitujícím faktorem pro růst rostlin. Kyselina močová se vytváří poměrně složitým sledem reakcí z glycinu, glutaminu, formiátu a CO2 přes meziprodukty 4-amino-5-imidazolkarboxamid a xantin). Ornitinový cyklus v zásadě zprostředkuje kondenzaci CO2 a NH3, jejímž produktem je močovina (= diamid kyseliny uhličité, NH2-CO-NH2). Nejprve za dodání energie z ATP a katalytické aktivity karbamylfosfátsyntetázy reaguje oxid uhličitý s amoniakem a vzniká karbamoylfosfát (NH2COO~P), jehož karbamylová skupina je následně účinkem příslušné transferázy přenesena na δ-aminoskupinu ornitinu, čímž vznikne citrulin. V další enzymaticky katalyzované a energií dotované (ATP) reakci citrulin reaguje s aspartátem na argininosukcinát, ze kterého po enzymattickém odštěpení fumarátu vzniká arginin. Štěpení argininu arginázou vede k produkci močoviny, která se jako konečný produkt metabolizmu dusíkatých látek vylučuje z organizmu, a ornitinu, který je k dispozici pro další otočku cyklu. Ornitinový cyklus je úzce propojen s cyklem trikarboxylových kyselin (blíže kapitola Mitochondrie): jednak mu poskytuje fumarát a přijímá od něho oxalacetát (pro syntézu aspartátu transaminací), jednak je cyklus trikarboxylových kyselin (propojený s dýchacím řetězcem) zdrojem energie pro chod ornitinového cyklu. Biosyntéza peptidů a proteinů je blíže rozvedena v podkapitole Translace a na dalších místech, proto se jí na tomto místě nebudeme zabývat.
65
II.2.8. DUSÍKATÉ BÁZE, NUKLEOZIDY A NUKLEOTIDY Mezi významné dusíkaté báze všech buněk patří báze pyrimidinové (uracyl, tymin, cytozin) a purinové (adenin, guanin) zejména jako složky nukleozidů (= báze + monosacharid) a nukleotidů (= báze + monosacharid + zbytek kyseliny fosforečné). O jejich významu jako komponent nukleových kyselin je pojednáno podrobněji na jiných místech, především v kapitole Informační biomakromolekuly). Nukleotidtrifosfáty (ATP, GTP, CTP, UTP, TTP) plní řadu významných funkcí v buněčném metabolizmu. Především je třeba jmenovat adenozintrifosfát (ATP), který je možné považovat za univerzální přenašeč energie. K tomu přispívá především skutečnost, že molekula ATP obsahuje dvě makroergní vazby, je polární, takže nemůže samovolně procházet cytoplazmatickou membránou a zůstává uvnitř buňky, avšak současně je relativně malá, takže uvnitř buňky může snadno difundovat.
SCHÉMA STRUKTURY MOLEKULY ATP
66
Každá z obou makroergních (fosfátových) vazeb, které molekula ATP obsahuje, může být hydrolyzována za vzniku buď adenozindifosfátu (ADP) a fosfátu, nebo adenozinmonofosfátu (AMP) a pyrofosfátu podle schématu: ATP + H2O ←→ ADP + Pi, resp. ATP + H2O ←→ AMP + P~Pi. Touto hydrolýzou se uvolňuje značně velké množství energie (více, než hydrolýzou jiných chemických vazeb – peptidových, glykozidových, esterových - v molekulách organických látek, přítomných v buňkách); při každé z obou uvedených reakcí je za standardních podmínek ∆G° = - 33 kJ.mol-1. Vzhledem k tomu, že hodnota změny Gibbsovy energie závisí (mimo jiné) na koncentracích reaktantů a v buňkách jsou ATP, ADP a AMP přítomny v nestejných koncentracích (cATP > cADP > cAMP), je hodnota ∆G za těchto podmínek ještě vyšší. Obecně platí vztah: ∆G = ∆G˚ + R·T· ln [ATP] / { [ADP] · [Pi]}
(R = plynová konstanta, T = absolutní teplota)
Při hydrolýze ATP na ADP obvykle vzniká určitý fosforylovaný meziprodukt. Takováto fosforylace může být v zásadě trvalá (zprostředkovaná katalytickou aktivitou kináz), nebo dočasná (např. fosforylace molekuly přenašeče při transmembránovém přenosu iontů). Při hydrolýze ATP na AMP vzniká naopak meziprodukt s navázaným AMP (např. aminoacyladenylát při aktivaci aminokyselin v průběhu translace, nebo acyladenylát při tvorbě acylkoenzymu A v průběhu aktivace mastných kyselin při syntéze triacylglycerolů). V buněčném metabolizmu je spotřebovaný (hydrolyzovaný) ATP obnovován fosforylací ADP (nikoli AMP), což lze schematicky vyjádřit rovnicí: ATP + AMP ←→ 2ADP. Protože změna Gibbsovy energie je při této reakci téměř nulová, znamená to, že se jedná o vratnou reakci. Část ADP může být využita k resyntéze ATP, část může hydrolyzovat na AMP. Směr průběhu uvedené reakce závisí na poměru ATP a AMP v buňce: protože koncentrace AMP je zpravidla mnohonásobně nižší, než koncentrace ATP, funguje AMP jednak jako indikátor změn v celkové bilanci metabolizmu ATP, jednak jako alosterický aktivátor některých enzymů, které se významně uplatňují při metabolizmu sacharidů (např. při glykolýze). Produkce a spotřeba ATP jsou tedy řízeny prostřednictvím zpětné vazby.
SCHÉMA VYUŽITÍ ATP V METABOLIZMU
67
V menší míře se jako přenašeči energie uplatňují ostatní nukleotidtrifosfáty. Často jsou však nezastupitelné v některých specifických buněčných procesech (např. při translaci genetické informace). Pyrimidinové a purinové báze, nukleozidy a nukleotidy nukleových kyselin jsou schopny syntetizovat téměř všechny organizmy (vyjma některých skupin bakterií), přičemž mechanizmy, kterými tyto syntézy realizují, jsou si navzájem značně podobné. Na základě toho lze usuzovat, že se jedná o mechanizmy evolučně velmi staré a konzervované. Prekurzory pyrimidinového kruhu jsou karbamoylfosfát (na jehož vzniku se podílejí hydrogenuhličitanové ionty a aminoskupina pocházející z glutamátu) a aspartát, které za katalytického účinku příslušné transferázy vedou k syntéze N-karbamoylaspartátu (neboli ureidosukcinátu), který dále dehydratuje účinkem lyázy na dihydroorotát a ten dehydrogenuje (za přítomnosti NAD+ nebo FAD a FMN) na orotát. Orotát (neboli uracyl-6-karboxylát) je základem všech pyrimidinů. Orotát je fosforylován za účasti PRPP (= 5´-fosforybózylpyrofosfát) a příslušné transferázy na orotidin-5´-fosfát (OMP), jehož dekarboxylací vznikne uridin-5´-fosfát (UMP); UMP se dále může fosforylovat za využití ATP na UDP a UTP. Aminací UTP se produkuje CTP. Z uvedeného vyplývá, že při syntéze molekul pyrimidinových nukleozidů a nukleotidů se syntetizuje pyrimidinové jádro samostatně a teprve poté se pomocí PRPP napojí na molekulu ribózy. UTP se může při transkripci zabudovat do molekul RNA (mRNA, rRNA, tRNA). Pyrimidinové deoxyribonukleotidy, které se zabudovávají při replikaci (resp. při reverzní transkripci) do DNA (tj. dCTP, dTTP) vznikají enzymaticky katalyzovanou redukcí ribózy ribonukleotidů na deoxyribózu: z UDP tak vzniká dUDP; dUDP může být defosforylován na dUMP, který se metylací mění na dTMP. Degradace pyrimidinových bází neprobíhá u všech organizmů stejně, avšak existují některé hlavní dráhy. Cytozin se deaminuje na uracyl. U živočichů je uracyl hydrogenován na dihydrouracyl, u kterého v dalších krocích dochází k otevírání kruhu mezi N1 a C6 za vzniku karbamoyl-β-alaninu, který se dále hydrolyzuje na β-alanin a karbamát, z něhož nakonec vyniká CO2 a NH3. U některých mikroorganizmů je uracyl oxidován na barbiturát, který je dále štěpen na močovinu a malonát. Hlavní cesta degradace tyminu spočívá v jeho hydrogenaci na dihydrotymin a po rozevření kruhu další přeměnu na karbamoyl-β-aminobutyrát, který poskytuje β-aminobutyrát a karbamát, z něhož rovněž vzniká CO2 a NH3. Syntéza purinového skeletu je podstatně složitější. Uplatňuje se při ní jakýsi stavebnicový princip. Podle něho se postupně skládá sedm stavebních prvků, pocházejících většinou od různých aminokyselin (glycin, k. asparagová, k. glutamová) a to od samého počátku na bázi ribóza-5´-fosfátu. Za prekurzor purinových ribonukleotidů lze označit inozinmonofosfát (IMP). Aminací IMP vyniká GMP, který může za utilizace ATP dále přejít na GDP a GTP; enzymatickou redukcí ribózy v GDP je produkován dGDP. Jiná cesta aminace IMP vede přes meziprodukt N-sukcinyl-AMP k AMP, jehož fosforylací za utilizace ATP vzniká ADP, případně dále ATP; enzymatickou redukcí ribózy v ADP se tvoří dADP. Degradace purinových bází nukleových kyselin vykazuje určité obecné znaky. Prvním krokem odbourávání adeninu i guaninu je deaminace. V případě adeninu vzniká nejprve hypoxantin (= 6-hydroxypurin), který je za katalytické aktivity xantinoxidázy oxidován na xantin (=2,6-dihydroxypurin), kdežto v případě guaninu vzniká přímo xantin. Xantin je dále oxidován na kyselinu močovou (=2,6,8-trioxopurin), která je finálním produktem katabolizmu purinů. Kyselina močová je u urikotelních živočichů (plazi, ptáci) rovněž finálním produktem katabolizmu proteinů, je jimi ve značném množství produkována a vylučována (např. v guanu). Naproti tomu u ureotelních živočichů (např. savců) se jako finální produkt katabolizmu purinů tvoří a je vylučována za fyziologických podmínek pouze v malém množství. Ureotelní (přesněji neurikotelní) živočichové totiž disponují enzymatickou výbavou umožňující jim odbourávat kyselinu močovou do různého stupně: za katalytické aktivity urikázy se otevírá pyrimidinový kruh a vzniká alantoin (Diptera, savci kromě primátů), který se dále otevřením imidazolového 68
kruhu účinkem alantoinázy přeměňuje na kyselinu alantovou (některé ryb); kyselina alantová může být enzymaticky štěpena na glyoxylát a močovinu (ostatní ryby, obojživelníci, primáti aj.) a konečně močovina může být za katalýzy ureázy štěpena až na amoniak a oxid uhličitý (např. korýši). Značný podíl nukleotidů, nukleozidů a dusíkatých bází (pyrimidinových, purinových) v buňkách představují produkty katabolizmu nukleových kyselin a nukleoproteinových komplexů. Dekompozici nukleových kyselin na nukleotidy katalyzují nukleázy (tj. hydrolázy ze skupiny fosfodiesteráz, které štěpí fosfodiesterové vazby). Nukleotidy jsou dále hydrolyzovány fosfomonoesterázami (fosfatázami) na nukleozidy za uvolnění kyseliny fosforečné. Fosforolytickým štěpením N-glykozidové vazby účinkem nukleozidáz (ze skupiny glykozidáz) se z nukleozidu uvolňuje příslušná báze, která může být dále některým z výše uvedených způsobů degradována, a fosforečný ester pentózy, který se může začlenit do metabolizmu sacharidů.
69
III. INFORMAČNÍ BIOMAKROMOLEKULY Mezi biomakromolekuly jsou obvykle řazeny molekuly o relativní molekulové hmotnosti v rozsahu řádů 103 – 108. K základním makromolekulám (tzv. biomakromolekulám) v biologických systémech patří polysacharidy, proteiny a nukleové kyseliny. Každá z těchto tří skupin organických látek představuje určitý typ polymerů. Polymer je makromolekula složená z mnoha kovalentně spojených nízkomolekulárních podjednotek (monomerů). Jsou-li tyto jednotky shodné chemickým složením, jedná se o homopolymery, liší-li se navzájem chemickým složením, jedná se o heteropolymery. Polymery, které se vyskytují v biologických systémech a tvoří jejich látkovou podstatu, jsou označován jako biopolymery; mezi nimi se významně uplatňují především nukleové kyseliny a proteiny. Nukleové kyseliny lze v tomto smyslu označit za specifický druh heteropolymerů, tvořených polynukleotidovými řetězci (tj. polymery nukleotidů navzájem spojených fosfodiesterovými vazbami); v případě DNA jsou to polydeoxyribonukleotidové řetězce (polydeoxyribonukleotidy) s deoxyribonukleotidy (dAMP, dGMP, dTMP, dCMP) jako monomery, v případě RNA jsou to polyribonukleotidové řetězce (polyribonukleotidy) s ribonukleotidy (AMP, GMP, UMP, CMP) jako monomery. Proteiny (bílkoviny) představují specifický druh heteropolymerů sestávajících z jednoho nebo více polypeptidových řetězců, což jsou polymery tvořené aminokyselinami jako monomery, navzájem spojenými peptidovými vazbami. Pojem informační molekuly označuje ty (bio)makromolekuly, které zprostředkují uchování a přenos genetické informace v souladu s centrálním dogmatem molekulární biologie (tj. obecně ve směru DNA → DNA a DNA ↔ RNA → proteiny). Tomuto vymezení vyhovují polymery, jakými jsou nukleové kyseliny a proteiny; právě z polymerního charakteru těchto látek je možno vyvozovat jejich schopnost působit jako informační makromolekuly. Nukleové kyseliny a proteiny tak představují základní složky všech živých systémů s evolučně etablovanými, těsnými, vzájemně propojenými strukturně-funkčními vztahy determinujícími a zprostředkujícími na základě vnitřní jednoty autoreprodukci, autoregulaci a metabolismus (homeostázu) jako základní atributy živé hmoty i umožňujícími na základě vnitřní rozpornosti vývoj jak ve smyslu ontogenetickém, tak fylogenetickém.
III.1. KLASIFIKACE A FUNKCE BÍLKOVIN III.1.1. ENZYMY A KOENZYMY Nejpočetnější skupinu bílkovin tvoří enzymy, buněčné biokatalyzátory, které na principu snížení hodnoty aktivační energie katalyzují většinu biochemických reakcí, určují jejich směr a specifitu. Bez jejich katalytické aktivity by se většina buněčných procesů nemohla uskutečnit a konec konců nemohl by existovat ani žádný živý systém. V buňce (organizmu) probíhá současně velké množství biochemických (metabolických) reakcí. Enzymy participují na jejich specifickém, vzájemně propojeném (spřaženém) a koordinovaném průběhu. Enzymy vykazují specifitu k typu katalyzované reakce (tzv. reakční specifita) i k substrátu, jehož utilizaci v příslušné reakci katalyzují (tzv. substrátová specifita). Substrátová specifita dosahuje u jednotlivých enzymů různého stupně: od specifity relativně skupinové, kdy týž enzym může využívat jako substrát látky chemicky náležející k různým typům sloučenin, přes specifitu 70
skupinovou, kdy daný enzym katalyzuje určitou reakci pouze v rámci substrátů stejné chemické skupiny (např. pouze u alkoholů, nebo pouze u esterů) až po specifitu výhradně pro jediný substrát. Enzymy mohou vykazovat rovněž stereospecifitu, jestliže reaktanty jsou stereoizoméry. Některé enzymy jsou funkční jen v přítomnosti neproteinové komponenty označované jako kofaktor (prostetická skupina nebo koenzym). Kofaktor, který s enzymem vytváří pevnou (permanentní) vazbu, se označuje jako prostetická skupina, kofaktor, který je s enzymem spojen pouze dočasně, se označuje jako koenzym a proteinová komponenta enzymu jako apoenzym. Jestliže je apoenzym spojen s koenzymem, označuje se tento komplex jako holoenzym. Kofaktory se účastní vlastní, enzymem katalyzované reakce. Mezi časté kofaktory patří NAD, NADP, hem, flavin, ionty některých kovů (Cu a Mn – peptidázy, Mo-xantinoxidáza, Co - fenoloxidáza) nebo skupiny (např. sulfhydrylové). Enzymy se klasifikují podle reakční specifity do šesti hlavních tříd: 1. Oxidoreduktázy – za využití kofaktoru katalyzují mezimolekulové oxidačně-redukční přeměny mechanizmem přenosu atomů vodíku z molekul donorových na akceptorové (dehydrogenázy, transhydrogenázy), nebo zabudováním molekuly kyslíku do molekuly substrátu (oxygenázy), nebo přenosem elektronů (transelektronázy). 2. Transferázy – jsou to složené bílkoviny, které katalyzují přenos aktivovaných skupin z molekul donorových na akceptorové, přičemž přenášené skupiny jsou součástí kofaktorů těchto enzymů. Mezi tranferázy patří například transaminázy (katalyzují přenos aminoskupiny z aminokyseliny na oxokyselinu), metyltransferázy (katalyzují přenos metylskupiny) atp. 3. Hydrolázy – katalyzují hydrolytické štěpení kondenzačně vzniklých vazeb. Patří sem např. proteázy (štěpí peptidové vazby), esterázy (štěpí esterové vazby), glykozidázy (štěpí glykozidové vazby), nukleázy (štěpí fosfodiesterové vazby v nukleotidových řetězcích), lipázy (štěpí esterové vazby lipidů) atp. 4. Lyázy – jsou to složené proteiny, které katalyzují nehydrolytické štěpení některých vazeb (např. C-C, C-N, C-O) anebo jejich vznik, pokud nevyžaduje dodání energie. V triviálních názvech lyáz se vyskytuje označení „syntáza“. Patří sem např. dekarboxylázy (katalyzují odštěpení CO2 z molekuly substrátu). 5. Izomerázy – katalyzují intramolekulové přesuny atomů a jejich skupin (izomeraci). Molekuly těchto enzymů jsou většinou jednodušší bílkoviny. Patří sem například epimerázy, racemázy, cis – trans izomerázy. 6. Ligázy - jsou to enzymy, které za účasti kofaktorů katalyzují zpravidla tvorbu energeticky náročných vazeb za současného štěpení zdroje energie (např. ATP). V triviálních názvech ligáz se vyskytuje označení „syntetáza“. Do této skupiny patří například DNA-ligáza a RNA-ligáza (katalyzují syntézu fosfodiesterových vazeb mezi nukleotidy v polynukleotidových řetězcích), pyruvátkarboxyláza (katalyzuje zabudování CO2 do molekluly pyruvátu za vzniku oxalacetátu) atp. Konkrétní mechanizmy enzymové katalýzy jednotlivých enzymů jsou velmi různorodé, avšak všechny enzymy při tom vykazují určité obecně platné znaky. K nim patří především reakce mezi aktivním centrem enzymu a substrátem za vzniku komplexu enzym – substrát. V aktivním centru enzymu jsou obsaženy a specificky prostorově uspořádány zbytky určitých aminokyselin tak, že podmiňují substrátovou specifitu enzymu, tj. umožňují specifickou vazbu aktivního centra na příslušný substrát a zároveň umožňují uskutečnit určitou změnu v části molekuly substrátu tak, aby mohla proběhnout katalyzovaná reakce. Dalším obecným znakem všech enzymově katalyzovaných reakcí je vznik určitého produktu nebo více produktů. Děje, které probíhají při enzymově katalyzovaných reakcích, lze vyjádřit obecně přijímaným schématem: E + S ↔ komplex E-S ↔ P + E (E = enzym, S = substrát, P = produkt) 71
SCHÉMA TVORBY KOMPLEXU ENZYM – SUBSTRÁT
Každé enzymatické reakce se fakticky zúčastňují dva substráty, přičemž jeden slouží jako donor a jeden jako akceptor určité funkční skupiny, jejíž přenos enzym katalyzuje. Enzym jako katalyzátor přitom napomáhá zeslabit chemické vazby v molekulách substrátů a tím umožnit vznik nových kovalentních vazeb při tvorbě produktu. U některých enzymů nemusí být přítomnost druhého substrátu hned zřejmá; např. druhým substrátem proteáz je voda a jimi katalyzovanou reakci lze zapsat ve tvaru : R1-CO-NH-R2 + H2O ↔ R1-COOH + H2N-R2 . Enzymatické reakce se nezúčastňuje celá molekula enzymu, ale pouze jeho určitá část, tzv. aktivní centrum. Proto modifikace aminokyselinových zbytků nebo i záměny některých aminokyselin v polypeptidovém řetězci v místech mimo aktivní centrum víceméně neovlivňují aktivitu enzymu. Ve shodě s tím je výskyt mnohem četnějších a rozsáhlejších rozdílů v primární struktuře oblastí polypeptidových řetězců vzdálenějších od aktivního centra než v aktivním centru, zjištěný při molekulárně-genetické intertaxonové komparaci bílkovin se stejnou funkcí. Genové mutace, které vedou k dílčí změně primární struktury v místech mimo aktivní centrum, zpravidla nemají za následek ztrátu enzymové aktivity, ale spíše jen její modifikaci (alteraci). Mutační změny postihující aminokyselinové složení aktivního centra jsou často spojeny se ztrátou funkce enzymu a jejich nositelé selekčně znevýhodněni. Primární struktura aktivního centra enzymů je evolučně silně konzervovaná. Některé enzymy obsahují více aktivních center stejné struktury a funkční aktivity (např. hemoglobin obsahuje 4 taková aktivní centra) nebo odlišných struktur a enzymových aktivit; jedná se o proteiny s kvartérní strukturou, kde každá z podjednotek může obsahovat strukturně stejná nebo odlišná aktivní centra a podle toho katalyzovat stejnou reakci nebo různé reakce. Některé enzymy plní stejnou funkci (tj. katalyzují určitou reakci), ale navzájem se liší určitými fyzikálně-chemickými vlastnostmi (např. rozdílnou elektroforetickou mobilitou, izoelektrickým bodem, účinností katalytické aktivity apod.); takovéto strukturní varianty enzymů se stejnou substrátovou a reakční specifitou se označují jako izoenzymy. Jednotlivé komponenty (aminokyseliny) reakčního centra mohou být na polypeptidovém řetězci od sebe dost vzdáleny a dostávají se do vzájemného postavení umožňujícího uskutečnění enzymatické reakce až na úrovni sekundární a terciární struktury. Realizace jakékoli enzymatické reakce tedy vyžaduje specifickou konformaci molekuly enzymu (resp. jeho aktivního centra). Proto denaturované bílkoviny nemohou plnit enzymatické funkce.
72
Studiem kinetiky enzymové katalýzy se podrobně zabývali Michaelis a Mentenová. Vycházeli z předpokladu, že při reakci enzymu se substrátem se s určitou rychlostí (charakterizovanou rychlostní konstantou k1) vytváří komplex enzym – substrát, který je s určitou jinou rychlostí (charakterizovanou rychlostní konstantou k2) přeměňován na produkt za uvolnění enzymu, jenž může být znovu zapojen do další katalytické reakce. Rychlosti opačně probíhajících reakcí jsou charakterizovány rychlostními konstantami k-2 a k-1 (viz schéma):
k1 k2 E + S <────> E-S <────> P + E k -1 k -2 Na začátku enzymatické reakce je molární koncentrace enzymu ve srovnání s molární koncentrací substrátu mnohem nižší, tudíž i koncentrace komplexu E-S a produktu je mnohem nižší než koncentrace substrátu. Tyto podmínky znamenají stav vzdálený od rovnovážného stavu. Změny koncentrace substrátu a produktu v závislosti na čase (v průběhu enzymatické reakce) lze vyjádřit ve formě rovnice Michaelise – Mentenové:
- ∆ S/∆t = ∆P/∆t = VS S/(S + KS) VS = k2 E0
KS = (k –1+ k –2)/k1 ≅ k –1/k1
kde VS = maximální rychlost, E0 = výchozí koncentrace enzymu, KS = Michaelisova konstanta Rovnice Michaelise – Mentenové tedy vyjadřuje závislost reakční rychlosti na koncentraci substrátu. Z ní vyplývá, že při zvyšující se koncentraci substrátu reakční rychlost neroste neomezeně, ale blíží se hodnotě VS. Je to pochopitelné, protože teoreticky můžeme připustit, že maximální koncentrace komplexu E-S může být rovna výchozí koncentraci enzymu a tudíž i reakční rychlost musí mít svou maximální hodnotu danou výrazem VS = k2·E0. Jestliže zvolíme koncentraci substrátu tak, že platí rovnost S = KS, potom bude rychlost enzymatické reakce (V): V = VS/2 = -∆S/∆t. Dalšími úpravami lze odvodit Michaelisovu konstantu. Přitom vyjádříme hodnotu 1/V jako funkci 1/S, takže: 1/(-∆S/∆t) = 1/VS [(1 + KS/S)] = 1/VS + (KS/VS) (1/S) Geometrickou interpretací tohoto vztahu (tedy 1/V jako funkce 1/S) je přímka, jejíž směrnice má hodnotu KS/VS a průsečík této přímky s osou y leží v bodě odpovídajícím výrazu 1/VS. Podle současných názorů proces enzymaticky katalyzované reakce sestává z několika etap. Nejprve se reakcí enzymu se substrátem vytváří neaktivní komplex enzym – substrát. Tento komplex se aktivuje přechodem přes aktivační bariéru, na jejímž vrcholu se tvoří aktivní komplex enzym – substrát. Závěrečnou etapou je vznik produktu a uvolnění enzymu. Celý proces je provázen odpovídajícími změnami Gibbsovy (volné) energie. Při reakci enzymu se substrátem se molekuly substrátu jednak váží k aktivnímu centru enzymu, jednak se fixují v určité vzájemné prostorové konfiguraci. To znamená, že vytvořením neaktivního komplexu enzym – substrát zaujímají zúčastněné molekuly vzájemně vhodné prostorové uspořádání ještě před aktivací komplexu. Důsledkem toho je poměrně malý úbytek entropie při přechodu neaktivního komplexu enzym – substrát k aktivnímu komplexu enzym – substrát (na rozdíl od neenzymatických katalytických reakcí, při nichž aktivační 73
entropie nabývá relativně velkých záporných hodnot). Tato okolnost spolu s nízkou aktivační energií jsou hlavními příčinami mnohonásobně vyšších rychlostí enzymaticky katalyzovaných reakcí v porovnání s reakcemi katalyzovanými jinými katalyzátory, než enzymy. ENZYMOVÁ KATALÝZA A AKTIVAČNÍ ENERGIE
74
Při aktivačním procesu, tedy při tvorbě aktivního komplexu enzym – substrát, se musejí aktivovat molekuly substrátu (resp. obou substrátů, které jsou pro uskutečnění enzymatické reakce nutné). V tomto procesu dochází k rozštěpení stávajících stacionárních orbitů molekul substrátů. Toto rozštěpení se realizuje jako homolytické (bez přesunu elektronů mezi partnery) za tvorby volného radikálu, nebo jako heterolytické (s přesunem elektronů na stranu elektrofilního partnera) za vniku iontů. Funkční skupiny nacházející se v aktivním centru enzymu tento aktivační proces facilitují. Tutéž roli plní i prostetické skupiny (kofaktory), přítomné v aktivním centru. Účinnost enzymů závisí na řadě faktorů fyzikálních i chemických. Mezi nejvýznamnější z nich patří: 1. koncentrace substrátu: rychlost katalyzované reakce se zvyšuje se zvyšující se koncentrací substrátu až do nasycení aktivních míst daného enzymu. 2. koncentrace enzymu: rychlost katalyzované reakce je lineární funkcí koncentrace enzymu. 3. pH prostředí: jednotlivé typy enzymů se liší primární strukturou (tedy aminokyselinovým složením) aktivního centra a v souvislosti s tím i stupněm ionizace aktivního centra. Proto jednotlivým skupinám enzymů přísluší určité optimální pH prostředí, při kterém je jejich katalytická aktivita maximální, kdežto při všech ostatních hodnotách pH je nižší. 4. teplota: podobně jako existuje pro jednotlivé skupiny enzymů optimální pH, existuje též optimální teplota, při které enzymaticky katalyzovaná reakce probíhá nejrychleji a při odchylkách od této teploty se zpomaluje. 5. inhibitory enzymově katalyzovaných reakcí: tyto reakce mohou být inhibovány některými látkami označovanými jako inhibitory. Inhibitorem může být sloučenina, jejíž molekula je podobná molekule substrátu (nejčastěji strukturní analog substrátu nebo produktu – antimetabolit, případně samotný produkt reakce). Ta se naváže na aktivní centrum enzymu jako substrát, se kterým o aktivní místo na enzymu „soutěží“, ale enzymaticky katalyzovaná reakce za vzniku (normálního) produktu neproběhne; v tomto případě hovoříme o tzv. kompetitivní inhibici. Jako inhibitory se mohou uplatnit i některé látky, jejichž molekuly nejsou podobné molekulám substrátu. Mohou se připojovat k aktivnímu centru enzymu bez kompetice se substrátem a zpravidla trvale (ireverzibilně) ho inhibovat; hovoříme o tzv. nekompetitivní inhibici. Některé látky se mohou napojit na jinou část molekuly enzymu, než na aktivní centrum a indukovat konformační změnu, která znemožní nebo sníží vazbu substrátu na aktivní centrum enzymu a v důsledku toho i realizaci příslušné enzymatické reakce; pak hovoříme o alosterické inhibici. Přítomnost inhibitorů (I) a typ inhibice je možné prokázat na základě analýzy kinetiky enzymatických reakcí. V případě kompetitivní inhibice vzniká vedle normálního produktu enzymatické reakce s určitou rychlostí (charakterizovanou rychlostní konstantou) ještě neaktivní komplex enzym – inhibitor (komplex E – I). Za předpokladu, že se komplexy enzym – substrát a enzym – inhibitor tvoří ve stavu dynamické rovnováhy, získáme úpravou rovnice Michaelise – Mentenové kinetickou rovnici: - ∆S/∆t = ∆P/∆t = VS S/[KS (1 + KI I) + S], KI = kI / k –I, kde kI a k –I jsou rychlostní konstanty tvorby, resp. rozpadu komplexu enzym – inhibitor a konstanta KI udává množství vznikajícího komplexu enzym – inhibitor v rovnovážném stavu. Z uvedené kinetické rovnice je zřejmé, že účinek kompetitivní inhibice spočívá v růstu Michaelisovy konstanty [KS (1 + KI I)]. Vliv kompetitivního inhibitoru je tudíž možné eliminovat (omezit) adekvátním zvýšením koncentrace substrátu. Při grafické interpretaci případu enzymatické reakce s kompetitivní inhibicí bude průsečík přímky funkční závislosti 1/V na 1/S totožný s průsečíkem přímky stejné funkční závislosti enzymatické reakce bez inhibitoru, avšak obě přímky se budou lišit hodnotou směrnice. V případě nekompetitivní inhibice nemůže být inhibiční účinek inhibitoru eliminován zvýšením koncentrace substrátu, protože inhibitor se substrátem nekompetuje o aktivní místo na molekule enzymu, ale obvykle způsobuje irreverzibilní změnu aktivního centra. 75
Při kinetickém popisu enzymatické reakce s nekompetitivní inhibicí se do kinetické rovnice dosadí místo výchozí koncentrace enzymu (E0) koncentrace aktivního enzymu (EA), protože množství enzymu rovnající se rozdílu E0 – EA je z reakce vyloučeno inhibitorem. V důsledku toho se změní konstanta VS: místo VS = k2 E0 bude mít tvar VS = k2 EA. Při nekompetitivní inhibici se tak zvýší jak hodnota směrnice přímky E0/EA – násobně, tak i poloha průsečíku přímky s osou y ve srovnání s průběhem přímky při enzymatické reakci bez nekompetitivní inhibice. 6. aktivátory enzymově katalyzovaných reakcí: tyto reakce mohou být aktivovány určitými látkami. Jako aktivátory působí například některé ionty (Ca2+, Mg2+, Zn2+) a některé bílkovinné regulační faktory, jejichž navázání na enzym rezultuje v konformační změnu, která umožní realizovat příslušnou enzymatickou reakci. K aktivaci některých enzymů vedou též posttranslační úpravy, při nichž teprve z neaktivního primárního produktu translace (proenzymu) vznikne aktivní enzym. Alosterická inhibice (nebo alosterická aktivace) se významně uplatňuje při regulaci aktivity enzymů. Jedním z důležitých aspektů enzymatických reakcí je autoregulace rychlosti metabolických procesů. Veškeré biochemické reakce v buňce nebo organizmu musejí být regulovány; jinými slovy – jejich rychlost musí adaptivně reflektovat změny vnějších podmínek. Autoregulace zahrnuje dvě základní fáze: zpětnovazebnou a oscilační. Zpětná vazba (pozitivní, negativní) je nutnou podmínkou autoregulace; při regulaci enzymové aktivity často působí konečný produkt určité metabolické dráhy jako inhibitor (příp. aktivátor) prvního stupně řetězce reakcí. Schopnost systému oscilovat je obecnou podmínkou jakéhokoli adaptačního mechanizmu, tudíž i nutnou podmínkou autoregulace enzymové aktivity a konsekventně metabolických či jiných životních dějů. Proces autoregulace je dostatečně citlivý a stabilní, jestliže regulující systém není lineární. Alosterické bílkoviny tento požadavek splňují. Jsou to proteiny vytvářející vesměs kvartérní strukturu, na níž spočívá princip nelineární kinetiky enzymatických reakcí. Alosterické enzymy mají ve své molekule nejen aktivní centrum, na které se specificky váže substrát, ale ještě tzv. alosterické místo, na které se reverzibilně váže alosterický efektor (tj. aktivátor nebo inhibitor). Protože složený protein (enzym) sestává z několika (minimálně dvou) podjednotek, obsahuje více aktivních center schopných vázat substrát a více alosterických míst pro inhibitor nebo aktivátor. Mezi jednotlivými aktivními centry a alosterickými místy existuje určitý vztah, který umožňuje interakci mezi navázanými molekulami substrátu, inhibitoru nebo aktivátoru a tím nelineární chování systému (nelineární kinetiku). Účinnost enzymu udává tzv. katalytická aktivita, jejíž jednotkou v soustavě SI je katal [kat]. Jeden katal je množství enzymu, který přemění za standardních podmínek (teplota 30º C, optimální pH) 1 mol substrátu za 1 sekundu. /Pozn.: Dřívější jednotkou katalytické aktivity enzymů byla tzv. mezinárodní jednotka aktivity označovaná 1U (unit) a definovaná jako množství enzymu katalyzujícího za standardních podmínek a při nasycení substrátem přeměnu 1 µmolu substrátu za 1 minutu. Mezi mezinárodní jednotkou aktivity a katalem je tedy jednoduchý převodní vztah: 1 µkat = 60U).
KOENZYMY (1) Koenzymy oxidoreduktáz NIKOTINAMIDADENINDINUKLEOTID (NAD+/NADH + H+) NIKOTINAMIDADENINDINUKLEOTIDFOSFÁT(NADP+/NADPH + H+) Většina oxidačních a redukčních reakcí v buňkách se děje prostřednictvím uvolnění nebo přijetí atomu vodíku. Obě jmenované sloučeniny patří mezi nejvýznamnější koenzymy 76
intracelulárních oxidoreduktáz, v nichž zprostředkují přenos atomů vodíku. Atom dusíku nikotinamidového kruhu nese pozitivní náboj. Na pyridinové jádro se váže jeden elektron nebo jeden atom vodíku, v roztoku zůstává proton. Každá molekula NAD+ a NADP+ může přijmout celkem dva elektrony a redukovat se na NADH + H+, resp. NADPH + H+. NAD+ je koenzymem fermentace i dýchacího řetězce, kde je jeho oxidace elementárním kyslíkem spřažena s tvorbou ATP při aerobní fosforylaci. NADPH není v buňkách aerobů oxidován kyslíkem. Zprostředkuje redukci při biosyntéze mnoha látek (lipidy, proteiny, nukleové kyseliny).
FLAVINADENINMONONUKLEOTID (FMN) FLAVINADENINDINUKLEOTID (FAD) FMN i FAD jsou deriváty riboflavinu. Přenášejí dvakrát jeden elektron z oxidovaného substrátu (FAD + 2H → FADH2) UBICHINONY (KOENZYM Q) Ubichinony jsou deriváty benzochinonu. Participují na přenosu elektronů (např. na cytochrómy v dýchacím řetězci), přičemž se mění na ubihydrochinony. Pro jejich lipofilní charakter se dobře uplatňují při přenosu elektronů v membránách mitochondrií a chloroplastů (plastochinon). LIPOÁTOVÝ KOENZYM Zprostředkuje vazbu a přenos acylů, elektronů a vodíku z donoru na FAD (akceptor). Acyl je při tomto procesu převeden na koenzym A (CoA).
(2) Koenzymy transferáz ADENOZINTRIFOSFÁT (ATP) Uplatňuje se při přenosu fosfátových skupin především na skupiny alkoholické, acyly a amidy za účasti kináz. Podobně se uplatňují i další nukleotidtrifosfáty. cAMP Působí především jako efektor pro alosterickou regulaci enzymů. Je to jeden z nejvýznamnějších tzv. druhých poslů, uplatňujících se při přenosu buněčných signálů. KOENZYM A (CoA-SH) Za účasti ATP přenáší acyly, které se připojují k SH-skupině molekuly koenzymu. URIDINFOSFOGLUKÓZA (UDPG) Uplatňuje se při biosyntéze sacharidů. TETRAHYDROFOLÁT (= kyselina 6,7,8,9 – tetrahydrolistová) Tento koenzym váže jednouhlíkaté radikály za vzniku N10 – formyltetrahydrofolátu. Uplatňuje se významně především při biosyntéze purinů, pyrimidinů a při transmetylacích aminokyselin.
77
(3) Koenzymy lyáz a ligáz BIOTIN Biotin váže oxid uhličitý při různých karboxylačních procesech (např. při biosyntéze mastných kyselin). CYANOKOBALAMIN V molekule obsahuje atom kobaltu s navázaným kyanidovým iontem. Tento kyanidový iont se může substituovat (např. hydroxylem nebo dusitanovým iontem). Cyanokobalamin se proto uplatňuje v procesech, kde se takové substituce realizují. Koenzymů existuje velký počet. Zde byly uvedeny jen jedny z nejvíce rozšířených v biologických systémech a zapojujících se do většiny základních biochemických procesů v buňkách.
III.1.2. ROZPOZNÁVACÍ FUNKCE BÍLKOVIN Termínem rozpoznávání (rekognice) se rozumí proces specifického spojení dvou biomakromolekul nebo biomakromolekuly s molekulou o nízké molekulové hmotnosti prostřednictvím nekovalentních interakcí (slabých vazeb). Rozpoznávání je předpokladem pro realizaci dalších funkcí proteinů. Uplatňuje se například při vazbě enzymu na substrát (substrátová specifita), při vazbě antigenu s protilátkou nebo receptoru s ligandem, při intracelulárním transportu molekul na místo určení, při navázání proteinů na nukleové kyseliny atd. Bez rekogniční funkce biomakromolekul (proteinů) by se nemohl vyvinout a existovat žádný uspořádaný autoreprodukující se a autoregulující se systém.
III.1.3. MECHANOCHEMICKÉ FUNKCE BÍLKOVIN Polymerní (oligomerní) a supramolekulární struktury jsou složeny z podjednotek. Při tvorbě těchto struktur jsou podjednotky sestavovány různými způsoby. Vznik dimérů je založen na komplementaritě monomerních struktur. Na obdobném principu je založena i tvorba filament. Většina podjednotek filament vytváří terciární strukturu globulárního tvaru, na jejímž povrchu se nachází vazebné místo komplementární k jinému místu vlastního povrchu. Spojováním komplementárních míst určité množiny podjednotek za sebou se vytvářejí filamenta lineární, resp. helikální (např. helikální aktinová filamenta). Podjednotky některých supramolekulárních struktur se uspořádávají plošně (např. proteiny biomembrán) nebo tubulárně (např. kapsidy viru tabákové mozaiky). Některé bílkovinné supramolekulární struktury jsou schopny samosestavení z podjednotek i v podmínkách in vitro. To znamená, že informace každé podjednotky je dostatečná k tomu, aby mohl vzniknout funkční finální produkt. Samosestavování je známé např. u ribozomů a kapsidů některých virů. Ve všech těchto procesech se významně uplatňují nekovalentní interakce. V jiných případech na procesu tvorby oligomerních a supramolekulárních struktur participují tzv. chaperony. Chaperony jsou specifickou skupinou proteinů, které se v buňkách podílejí na různých úpravách polypeptidových řetězců (např. sbalování polypeptidového řetězce, sestavování molekul některých proteinů, zamezení agregace dalších proteinů jejich vyvázáním apod.). Chaperony tvoří několik rodin; jsou rozšířeny mezi organizmy všech říší, kde plní – jak je patrné – důležité funkce. 78
V buňkách se nacházejí určité kontraktilní systémy. Jejich základní jednotkou je vláknitá proteinová struktura označovaná jako molekulární motor. Základní funkcí všech molekulárních motorů je přeměna chemické energie na mechanickou práci. Mezi významné a široce zastoupené bílkoviny s mechanickochemickými funkcemi náleží myozin, aktin, troponin a tropomyozin. Myozin je protein, jehož molekula je rozlišena na část fibrilární, tvořenou dvěma helikálními polypeptidovými řetězci o stejném aminokyselinovém složení, a na část globulární, tvořenou čtyřmi oligopeptidovými řetězci s vazebným místem pro molekulu aktinu. Myozin je strukturní bílkovinou v buňkách, váže molekuly aktinu a katalyzuje hydrolytické štěpení ATP. Tropomyozin má obdobnou strukturu jako fibrilární úsek molekuly myozinu. Molekula aktinu, tvořená jedním polypeptidovým řetězcem, je globulární bílkovina. Může však polymerovat za vzniku dvouvláknové šroubovice. Troponin je protein s regulační funkcí ve svalových vláknech; troponinový komplex sestává ze tří polypeptidových rětězců. Všechny tyto bílkoviny jsou obsaženy ve svalových vláknech, v nichž vytvářejí filamenta sarkomér: silná filamenta myozinová a slabá filamenta aktinová s napojenými molekulami tropomyozinu a tzv. troponinového komplexu. Při svalovém stahu dochází ke vzniku aktinomyozinového komplexu prostřednictvím globulárních částí molekul myozinu (tzv. myozinových hlavic). Vznikem tohoto komplexu jsou navozeny podmínky pro hydrolýzu ATP; energie, která se při tom uvolní, se využije ke změně konformace myozinových hlavic, v jejímž důsledku dochází k rozpojení myozinových a aktinových vláken a tím k rozpadu aktinomyozinového komplexu. Hlavice molekuly myozinu se napojí na vazebné místo další molekuly a celý proces se opakuje; tím dochází k posunu molekuly myozinu podél aktinového vlákna a k zasouvání aktinového vlákna mezi filamenta myozinu. Při kontrakci svalových vláken se regulačně uplatňují vápenaté ionty, jejichž působení je zprostředkováno troponinem a tropomyozinem.
III.1.4. OBRANNÉ FUNKCE BÍLKOVIN Obranné funkce organizmů spočívají v přítomnosti specifických struktur, které jsou schopné rozpoznat, eliminovat a zapamatovat si cizí biologické struktury. Takovéto obranné struktury existují u všech skupin organizmů, včetně jednobuněčných, avšak v různých podobách a různě organizované. Obranné mechanizmy zahrnují fagocytózu, buňkami zprostředkovanou a humorální (neboli tzv. protilátkovou) imunitu. Ve všech obranných mechanizmech jsou určitým způsobem zastoupeny proteiny a sehrávají v nich zásadní roli; zejména je to zjevné u protilátkové imunity, při které se jako odpověď na cizí agens syntetizuje a uvolňuje určitá protilátka. Obranné reakce v imunitním systému obratlovců se zahajují rozpoznáním cizího antigenu membránovým receptorem lymfocytu. V případě, že se na receptor naváže cizí antigen, začíná se lymfocyt dělit a vytvoří klon buněk. Při humorální imunitě část B-lymfocytů klonu (tzv. buňky efektorové) začne produkovat protilátky se stejnou rozpoznávací specifitou jakou měl membránový receptor. Jiná část buněk klonu (tzv. buňky paměťové), které disponují imunologickou pamětí, přežívají v organizmu dlouhou dobu a jsou schopny při opakovaném proniknutí týchž antigenů do organizmu rychle produkovat nové efektorové buňky i buňky paměťové. Uvolněnými protilátkami jsou cizí antigeny neutralizovány (eliminovány). Chemicky jsou protilátky složené proteiny typu glykoproteinů příslušných ke skupině imunoglobulinů (Ig). Molekuly protilátek sestávají ze dvou těžkých (H) a dvou lehkých (L) řetězců navzájem spojených čtyřmi disulfidovými vazbami. Každá z těchto molekul obsahuje dvě rozpoznávací a vazebná místa pro antigen. Rozpoznání je vysoce specifický proces, při kterém dochází k interakci mezi vazebným místem pro antigen na molekule protilátky a epitopem (antigenní determinantnou) antigenu.
79
III.2. NUKLEOVÉ KYSELINY Nukleové kyseliny jsou makromolekuly tvořené polynukleotidovými řetězci. Podle druhu polynukleotidového řetězce se rozlišují dva základní typy nukleových kyselin: 1. ribonukleové kyseliny (RNA) – jsou to nukleové kyseliny (heteropolymery) složené z jednoho polyribonukleotidového řetězce, nebo ze dvou komplementárních polyribonukleotidových řetězců (obsahujících jako monomery AMP, GMP, UMP, CMP) spojených vodíkovými vazbami. 2. deoxyribonukleové kyseliny (DNA) – jsou to nukleové kyseliny (heteropolymery) složené z jednoho deoxyribonukleotidového řetězce, nebo ze dvou komplementárních polydeoxyribonukleotidových řetězců (obsahujících jako monomery dAMP, dGMP, dTMP, dCMP) spojených vodíkovými vazbami. Stavební složky nukleových kyselin tvoří: 1. sacharid 2. kyselina fosforečná (zbytek) 3. dusíkaté báze pyrimidinové (C – cytozin, T – tymin, U – uracyl), dusíkaté báze purinové (A – adenin, G – guanin) Zastoupení těchto jednotlivých stavebních složek v DNA a RNA je uvedeno v následující tabulce: složka DNA RNA sacharid β-D-2´-deoxyribóza β-D-ribóza (cyklická furanóza) fosfát
dusíkaté báze a) pyrimidinové
b) purinové
estericky vázaný zbytek H3 PO4
estericky vázaný zbytek H3 PO4
tymin (T) cytozin (C)
uracyl (U) cytozin (C)
adenin (A) guanin (G)
adenin (A) guanin (G)
Vytvořením N-glykozidové vazby mezi atomem C1´ ribózy a atomem dusíku N1 pyrimidinové báze nebo atomem dusíku N9 purinové báze vznikne příslušný ribonukleozid (uridin – U, cytidin – C, adenozin – A, guanozin – G). Vytvořením N-glykozidové vazby mezi atomem C1´ deoxyribózy a atomem dusíku N1 pyrimidinové báze nebo atomem dusíku N9 purinové báze vznikne příslušný deoxyribonukleozid (deoxytymidin – dT, deoxycytidin – dC, deoxyadenozin – dA, deoxyguanozin – dG). Vytvořením esterické vazby mezi zbytkem kyseliny fosforečné a OH-skupinou vázanou na atom uhlíku C5´ ribózy ribonukleozidu vznikne příslušný ribonukleotid-5´-monofosfát, resp. zkráceně ribonukleotid (uridinmonofosfát – UMP, cytidinmonofosfát – CMP, adenozinmonofosfát – AMP, guanozinmonofosfát – GMP). Vytvořením esterické vazby mezi zbytkem kyseliny fosforečné a OH-skupinou vázanou na atom uhlíku C5´ deoxyribózy deoxyribonukleozidu vznikne příslušný deoxyribonukleotid -5´- monofosfát, resp. zkráceně deoxyribonukleotid (deoxytymidinmonofosfát – dTMP,
80
deoxycytidinmonofosfát – dCMP, deoxyadenozinmonofosfát – dAMP, deoxyguanozinmonofosfát – dGMP). V RNA se vytváří fosfodiesterová vazba mezi C3´ jednoho ribonukleotidu a C5´následujícího ribonukleotidu. Postupným lineárním napojováním dalších ribonukleotidů prostřednictvím fosfodiesterové vazby se kondenzačními reakcemi syntetizuje polyribonukleotidový řetězec. Obdobně se vytváří fosfodiesterová vazba v DNA mezi C3´ jednoho deoxyribonukleotidu a C5´následujícího deoxyribonukleotidu a postupným lineárním napojováním dalších deoxyribonukleotidů prostřednictvím této vazby se syntetizuje polydeoxyribonukleotidový řetězec. Syntéza polyribonukleotidového řetězce (RNA) i polydeoxyribonukleotidového řetězce (DNA) se v biologických systémech uskutečňuje ve směru 5´→ 3´(je orientovaná); to znamená, že vždy následující ribonukleotidfosfát, resp. deoxyribonukleotidfosfát se připojí svým fosforylovaným 5´- koncem k 3´- konci předcházejícího (v řetězci již zabudovaného) ribonukleotidu, resp. deoxyribonukleotidu, za vzniku fosfodiesterové vazby.
SCHÉMA STRUKTURY POLYNUKLEOTIDOVÉHO ŘETĚZCE
81
III.2.1. KYSELINA DEOXYRIBONUKLEOVÁ - DNA DNA je obsažena v buňkách všech organizmů a ve virových částicích (kromě RNA-virů). Vyskytuje se v nich v různých formách a tak může být podle vybraných kritérií klasifikována do několika základních skupin: 1. podle počtu deoxyribonukleotidových řetězců DNA jednořetězcová = ssDNA (single-stranded DNA): sestává z jednoho polydeoxyribonukleotidového řetězce DNA dvouřetězcová = dsDNA (double-stranded DNA): sestává ze dvou komplementárních, antiparalelně orientovaných polydeoxyribonukleotidových řetězců V izolované douřetězcové DNA bylo opakovaně zjištěno, že: (a) molární množství purinových bází je rovno molárnímu množství pyrimidinových bazí (A+G = T+C), (a) molární množství adeninu je rovno molárnímu množství tyminu (A=T) a molární množství guaninu je rovno molárnímu množství cytozinu (G = C). Tyto vztahy jsou známy jako tzv. Chargaffovo pravidlo.
SCHÉMA STRUKTURY POLYDEOXYRIBONUKLEOTIDOVÉHO ŘETĚZCE
82
Později, v souvislosti s objasněním dvoušroubovicové struktury DNA, bylo prokázáno, že v dvouřetězcové molekule DNA se vytvářejí páry bází (v postavení cis) spojené vodíkovými vazbami, přičemž: (a) vždy jedna z bází daného páru je purinová a jedna pyrimidinová, (b) se páruje adenin (v aminoformě) s tyminem (v oxoformě) dvěma vodíkovými vazbami (A = T) a guanin (v oxoformě) s cytozinem (v aminoformě) třemi vodíkovými vazbami (G ≡ C). Popsaný princip párování bází v dvouřetězcové molekule DNA, jehož důsledkem je vznik komplementárních polydeoxyribonukleotidových řetězců (resp. téměř komplementárních, neboť případný vznik chyby při párování bází nelze nikdy vyloučit), popisuje tzv. Watsonovo – Crickovo pravidlo. Toto pravidlo lze též aplikovat při replikaci nukleových kyselin, při syntéze mRNA (primárního transkriptu) podle templátu při transkripci, při hybridizaci nukleových kyselin a při interakci kodonu s antikodonem v průběhu translace. Z Watsonova – Crickova pravidla existují některé výjimky. Mezi ně patří paralelní řetězce dsDNA s bázemi v postavení trans a stejně orientovanými fosfodiesterovými vazbami, úseky dsDNA, ve kterých jsou vodíkovými vazbami spárovány stejné báze (A-A, T-T, C-C, G-G) a více než dvouřetězcové (třířetězcové, čtyřřetězcové) DNA, resp. triády a tetrády bází. Výskyt takovýchto útvarů je omezen na specifické úseky nukleových kyselin, resp. na specifické molekulárně biologické procesy, a jejich vznik je podmíněn fyzikálně-chemickými vlastnostmi jednotlivých komponent DNA. S ohledem na způsob syntézy polydeoxyribonukleotidových řetězců lze na každém z nich rozeznat 5´- konec a 3´- konec. V dvouřetězcové DNA (dsDNA) jsou fosfodiesterové vazby obou řetězců navzájem opačně orientované a proto proti 5´- konci jednoho řetězce se nachází 3´- konec druhého řetězce a naopak (proti 3´- konci jednoho řetězce se nachází 5´- konec druhého řetězce). Oba řetězce jsou tedy vůči sobě orientovány antiparalelně. 2. podle tvaru DNA kružnicová – jednořetězcová: nemá volné konce - dvouřetězcová a) kovalentně uzavřená kružnice (CCC, covalently closed circle): nemá volné konce, ani zlom v řetězcích b) otevřená kružnice (OC, open circle): má volné konce a alespoň jeden zlom v jednom řetězci DNA lineární – jednořetězcová: má volné konce 5´a 3´ - dvouřetězcová: má volné konce 5´a 3´
3. podle lokalizace v buňce DNA – jaderná (nDNA): součást chromozomů eukaryot; jejím analogem u prokaryot je nukleoid neboli prokaryotický chromozom. - mimojaderná – mitochondriální (mtDNA): v mitochondriích - chloroplastová (ctDNA): v chloroplastech - plazmidová: v plazmidech
83
DNA se může vyskytovat na více strukturních úrovních: 1. PRIMÁRNÍ STRUKTURA DNA Primární strukturou DNA se rozumí sekvence deoxyribonukleotidů v řetězci DNA. Jednotlivé deoxyribonukleotidy (dAMP, dGMP, dTMP, dCMP) nejsou rozloženy v polydeoxyribonukleotidových řetězcích DNA rovnoměrně, náhodně, a proto můžeme v rámci genomu (resp. i jediné molekuly DNA či jednotlivých chromozomů) rozlišit určité typy dílčích sekvencí. Sekvence, které se v haploidním genomu vyskytují pouze jednou, označujeme jako sekvence unikátní; většinou jsou lokalizovány ve strukturních genech. Sekvence, které se v haploidním genomu vyskytují ve více kopiích, označujeme jako sekvence repetitivní (opakující se). Repetitivní sekvence mohou sestávat z různého, avšak pro danou repetici konstantního počtu deoxyribonukleotidů, který vyjadřuje délku repetice; zastoupení jednotlivých nukleotidů, jejich pořadí a počet v dané repetitivní sekvenci se označuje jako jednotka repetice a počet jednotek repetice v haploidním genomu jako četnost repetice. Repetitivní sekvence (repetice) lze klasifikovat v rámci genomu do několika dílčích typů (repetice krátké tandemové, dlouhé terminální, přímé, rozptýlené, obrácené typu vlásenky nebo palindromu). V primární struktuře DNA všech organizmů (kromě RNA-virů) je zakódována genetická informace, kterou se rozumí informace o primární struktuře proteinů (polypeptidů), ribonukleových kyselin typu rRNA a tRNA a o vazbě specifických proteinů k určitým sekvencím DNA. Primární struktura DNA je tedy určující pokud jde o obsah genetické informace, její reprodukci (replikaci), přepis (transkripci) a následně též překlad (translaci). Konvenčně se sekvence deoxyribonukleotidů (bází) v řetězci DNA uvádí od 5´- konce. 2. SEKUNDÁRNÍ STRUKTURA Dvouřetězcová DNA může vytvářet vyšší, sekundární strukturu. Nejčastěji se vyskytující formou sekundární struktury je dvoušroubovice (helix), jejíž základní model lze popsat následujícími znaky: sestává ze dvou komplementárních antiparalelně orientovaných polydeoxyribonukleotidových řetězců ovíjejících společnou osu a uspořádaných tak, že páry bází (spojené vodíkovými vazbami podle Watsonova - Crickova pravidla) směřují dovnitř šroubovice a oporná pentózafosfátová (přesněji deoxyribózafosfátová) kostra na povrch šroubovice. V důsledku otáčení řetězců kolem osy dvoušroubovice dochází v rámci jednotlivých komplementárních párů bází ke změně jejich vzájemné polohy v prostoru. Vzájemným obtáčením komplementárních řetězců se vytváří dvoušroubovicové vinutí, které může být pravotočivé nebo levotočivé. Protože jednotlivé páry bází jsou posunuty o určitou vzdálenost od osy dvoušroubovice, spojnice C1´- atomů deoxyribózových zbytků, příslušejících jednotlivým komplementárním párům bazí, obvykle nejsou kolmé na osu dvoušroubovice a neprocházejí jí, vytváří povrch dvoušroubovice reliéf, na kterém se rozlišují dva žlábky: menší a větší; ve žlábcích se některé skupiny atomů komponent polydeoxyribonukleotidových řetězců mohou účastnit interakcí s dalšími látkami, zejména proteiny. Na úrovni sekundární struktury může DNA vytvářet v závislosti na konkrétní deoxyribonukleotidové sekvenci a na stavu prostředí konformace energeticky adekvátní daným podmínkám. Konformace B se v živých buňkách vyskytuje nejčastěji (je přítomna ve všech buněčných organizmech a DNA virech) a představuje konformaci dvoušroubovice, popsané Watsonem a Crickem. Dalším základním druhem konformace je konformace A, která je dobře známá z podmínek in vitro; v buňkách se vyskytuje za nižší vlhkosti (ve sporách mikroorganizmů). Konformace B a konformace A mohou v sebe navzájem přecházet. Vinutí u konformace A i B je pravotočivé. Třetím základním druhem konformace DNA je konformace Z, která se uplatňuje při procesu rekombinace, regulace genové exprese a některých víceméně specifických molekulárně-biologických procesech (např. aktivace některých genů); na rozdíl od předchozích dvou konformací je vinutí konformace Z levotočivé. 84
Jednotlivé druhy konformací DNA se liší v řadě znaků, z nichž hlavní jsou uvedeny v následující tabulce: znak dvoušroubovice DNA při konformaci B A Z vinutí pravotočivé pravotočivé levotočivé počet bp na 1 závit 10,5 11 12 zvýšení na 1 závit [nm] 3,4 2,5 4,6 zvýšení na 1 bp [nm] 0,34 0,23 0,38 větší žlábek široký, hluboký úzký, mělký mělký menší žlábek úzký, hluboký široký, mělký úzký, hluboký osa šroubovice vede přes páry bazí větší žlábek menší žlábek konformace deoxyribózy C2´- endo C3´- endo konformace glykozidové anti anti C – anti, G - syn vazby ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
MODEL DVOUŠROUBOVICE MOLEKULY DNA
85
Sekundární struktura DNA (dvoušroubovice) může přecházet ve strukturu primární a naopak v závislosti – mimo jiné – na fyzikálně-chemických podmínkách prostředí. Účinek vyšších teplot nebo některých chemických látek na dvoušroubovici DNA se může projevit přerušením vodíkových vazeb spojujících oba komplementární řetězce a přechodem dvoušroubovicové struktury v samostatné polydeoxyribonukleotidové řetězce. Takový proces se označuje jako denaturace (tepelná, resp. chemická). Průběh denaturace odráží nukleotidové složení konkrétní molekuly DNA, resp. relativní podíl deoxyribonukleotidových párů G-C v ní. Při tepelné denaturaci obecně platí, že se zvyšujícím se podílem párů G – C se zvyšuje teplota denaturace. Příčinou je spojení bází v každém páru G – C třemi vodíkovými vazbami, kdežto bází v každém páru A – T pouze dvěma vodíkovými vazbami a tudíž tomu odpovídající větší spotřeba energie na rozrušení tří vodíkových vazeb než dvou. Grafickým vyjádřením závislosti míry denaturace na teplotě je sigmoidální křivka. Praktický význam má teplota tání Tm (melting temperature) definovaná jako teplota, při které zdenaturuje 50% dvoušroubovicových molekul DNA; poskytuje orientační informaci o složení konkrétní dsDNA. Pominou-li podmínky pro denaturaci dvoušroubovicové DNA, mohou se oddělené polynukleotidové řetězce znovu komplementárně spojit a obnovit výchozí dvoušroubovicovou strukturu; takový proces se označujeme jako renaturace. Je však třeba upozornit, že stav po renaturaci nemusí být úplně identický s původním stavem molekuly DNA před denaturací. Reverzibilita přechodů z jedné strukturální úrovně DNA na jinou, popsatelná v termínech denaturačně-renaturační kinetiky, se uplatňuje v základních molekulárně-genetických procesech, jakými jsou replikace DNA, transkripce a translace genetické informace a je rovněž využívána v řadě metod (technik) aplikovaných při genových manipulacích. 3. TERCIÁRNÍ STRUKTURA Fyzikálně-chemické vlastnosti sekundární struktury lineární i kružnicové DNA typu dvoušroubovice umožňují ještě její další vinutí (nadšroubovicové) do vyššího stupně spiralizace za vzniku nadšroubovice (superhelix). Přechod šroubovice DNA (sekundární struktura) – nadšroubovice (terciálrní struktura) je reverzibilní. Nadšroubovicové vinutí může být dvojího typu: (1) záporné, které se realizuje mechanismem odvíjení řetězců DNA (2) kladné, které se realizuje mechanismem svinování řetězců DNA. Z výše uvedeného je zřejmé, že neexistuje pouze jediný, přesně definovaný typ nadšroubovice, ale může se jich vytvářet celá škála. K přesnější charakteristice konkrétní nadšroubovice (molekuly DNA) je možno využít topologické parametry: (1) celkové číslo vinutí (L) – udává počet závitů v nadšroubovici, resp. celkový počet překřížení jednoho řetězce DNA druhým v nadšroubovici (2) dvoušroubovicové číslo (T) – udává počet závitů v dvoušroubovici, resp. celkový počet překřížení jednoho řetězce druhým v dvoušroubovici (3) nadšroubovicové číslo (W) – udává celkový počet nadšroubovicových závitů v nadšroubovici, resp. celkový počet překřížení dvoušroubovice v nadšroubovici Mezi těmito topologickými parametry platí vztah: L = T + W
86
SCHÉMA STRUKTURY MOLEKULY DNA
4. CHROMATIN Chromatin je komplex dsDNA a proteinů tvořící významnou složku buněčného jádra (chromozomů) eukaryot. Stav chromatinu se dynamicky mění v průběhu celého buněčného cyklu. Tyto změny se cytologicky projevují rozdílným stupněm spiralizace chromatinových vláken (resp. chromozomů), který úzce souvisí především s realizací základních genetických procesů v buněčném jádru (replikace, transkripce), s karyokinezí, cytokinezí a s procesy diferenciace buněk. Elementární stavební jednotkou chromatinu je nukleozom; sestává z oktameru histonů (H2A, H2B, H3, H4), úseku DNA obtáčející histonový oktamer (necelé dva závity, délka přibližně 200 bp) a histonu H1, který není součástí histonového oktameru, ale z vnější strany se napojuje na koncové oblasti úseku DNA obtáčející histonový oktamer. Oktamer histonů je v úseku nukleozomu uspořádán jako soubor tetrameru (H3)2-(H4)2 a dvou dimerů (H2A-H2B)2. Z nukleozomu lze enzymaticky uvolnit histon H1; vzniklý útvar se označuje jako jádro nukleozomu (= histonový oktamer + úsek DNA, která ho obtáčí). Zpravidla se vymezují tři organizační úrovně chromatinu odpovídající třem stupňům jeho spiralizace: (1) nukleozomové řetězce (10 nm vlákno) Nukleozomový řetězec je tvořen souborem jader nukleozomů spojených molekulou lineární dsDNA. Průměr tohoto řetězce je přibližně 10 nm a proto se též označuje jako 10 nm chromatinové vlákno; je typické pro interfázní buněčné jádro, představuje nejvyšší stupeň despiralizace chromozomů a strukturu, která umožňuje replikaci DNA i transkripci genetické informace. 87
(2) solenoid (30 nm vlákno) Na vzniku solenoidu participuje histon H1. Každá zúčastněná molekula histonu H1 se napojí na oktamer histonů jednoho nukleozomu v místě výstupu úseku DNA, která ho obtáčí, a současně na specifická místa úseku DNA, která leží mezi oběma sousedními nukleozomy (resp. jádry nukleozomů) nukleozomového řetězce. V důsledku takového připojení histonu H1 dochází k přiblížení a spiralizaci nukleozomů v nukleozomovém řetězci za vzniku solenoidu, ve kterém na jeden závit připadá šest nukleozomů. Průměr solenoidu je přibližně 30 nm a proto se též označuje jako 30 nm vlákno; toto vlákno se váže na tzv. proteinové lešení oblastí DNA označovanou jako SAR (scaffold attachment region), kdežto ostatní úseky DNA jsou uspořádány ve formě smyček jako tzv. chromatinové domény. Proteinové lešení je tvořeno řadou proteinů převážně nehistonového typu, které plní významné biologické funkce (např. polymerázy, topoizomerázy, proteiny HMG, některé transkripční faktory). 30 nm vlákno je útvarem, který umožňuje transkripci genetické informace v chromatinových doménách; vyskytuje se v interfázním jádru a v časných stadiích profáze. Histon H1 kromě zřejmě nezastupitelné funkce při formování solenoidu (spiralizaci nukleozomového řetězce), plní též funkci ochrany DNA před účinkem nukleáz. (3) mitotický chromozom (600 – 700 nm vlákno) Postupnou kondenzací 30 nm vláken v průběhu mitózy se vytvářejí 600 – 700 nm vlákna chromatinová (chromatidy), charakteristická zejména pro metafázní chromozomy, v nichž stupeň spiralizace dosahuje maxima. Toto uspořádání chromatinu již neumožňuje replikaci DNA, ani transkripci genetické informace. Chromatin chromozomů eukaryotických organizmů lze rozdělit do dvou kategorií: (1) euchromatin – je to chromatin dekondenzovaný, transkripčně aktivní (2) heterochromatin - je to chromatin kondenzovaný, transkripčně inaktivní. Heterochromatin, který je v některých částech chromozomů (telomery, centromery) obsažen trvale (tj. po celý buněčný cyklus, ve všech buňkách a ve všech ontogenetických stadiích) se označuje jako konstitutivní. Konstitutivní heterochromatin je tvořen vysoce repetitivní, nekódující DNA a bývá též místem častého výskytu transpozónů. Heterochromatin, který se v závislosti na fázi buněčného cyklu, stadiu ontogenetického vývoje, typu diferenciace a diferencovaných buněk může stát euchromatinem (a naopak), se označuje jako fakultativní. Molekulární mechanizmy přechodu chromatinu ze stavu heterochromatinového do stavu euchromatinového a ze stavu euchromatinového do stavu heterochromatinového mají zásadní význam pro realizaci diferenciačních procesů v ontogenezi každého jedince. Právě jejich působením lze vysvětlit zapínání a vypínání zcela určitých genových oblastí v přesně vymezených údobích ontogenetického vývoje, resp. funkční zapojení pouze specifické množiny genů z komplexního (zpravidla diploidního) buněčného genomu v diferencované tkáni nebo orgánu mnohobuněčného organismu.
III.2.2. KYSELINY RIBONUKLEOVÉ - RNA RNA může sestávat z jednoho nebo dvou polyribonukleotidových řetězců. Základními stavebními jednotkami RNA jsou ribonukleotidy (AMP, GMP, UMP, CMP) spojené fosfodiesterovou vazbou mezi atomy C3´a C5´dvou sousedních zbytků ribózy. Dusíkaté báze vytvářejí v dvouřetězcových molekulách RNA (resp. v dvouřetězcových úsecích molekul RNA) podle Watsonova - Crickova pravidla platného pro RNA komplementární páry spojené vodíkovými vazbami (A = U, G ≡ C). Na základě principu komplementarity bází mohou vznikat hybridní molekuly mezi různými molekulami RNA ( hybrid RNA – RNA), nebo mezi molekulou DNA a molekulou RNA ( hybrid DNA – RNA). 88
SCHÉMA POLYRIBONUKLEOTIDOVÉHO STRUKTURY ŘETĚZCE (RNA)
V buňkách prokaryot i eukaryot se vyskytují tři základní druhy RNA: mediátorová (informační) ribonukleová kyselina (mRNA), ribozomová nukleová kyselina (rRNA) a transferová ribonukleová kyselina (tRNA). RNA se může vyskytovat na třech strukturních úrovních: primární, sekundární, terciární. Primární strukturou RNA se rozumí sekvence ribonukleotidů v polyribonukleotidovém řetězci RNA. Sekundární struktura vzniká vytvořením dvouřetězcové molekuly RNA, resp. dvouřetězcových úseků v molekule RNA. Dalšími interakcemi mezi určitými oblastmi molekuly může vzniknout i struktura terciární, která je mnohdy nezbytná pro plnění biologické funkce příslušné makromolekuly. Jednotlivé základní druhy RNA vytvářejí různé typy sekundární a terciární struktury, v nichž se odráží zejména odlišný způsob syntézy a funkcí mRNA, rRNA a tRNA v buňce. Všechny základní typy RNA se podílejí na realizaci (expresi) genetické informace, každý z nich specifickým způsobem. Kromě toho u RNA - virů je RNA nositelkou genetické informace, zakódované v její primární struktuře. 1. MEDIÁTOROVÁ RIBONUKLEOVÁ KYSELINA – mRNA Mediátorová ribonukleová kyselina (mRNA = messenger RNA) se syntetizuje v průběhu transkripce genetické informace podle matričního řetězce DNA, příp. RNA (u některých RNA-virů). U prokaryotických organismů je produkterm transkripce (tzv. primární transkript) přímo mRNA, která je bezprostředně transportována (ještě před dokončením transkripce) 89
na ribozomy (resp. polyribozom), kde se účastní translace genetické informace z formy sekvence ribonukleotidů do formy sekvence aminokyselin (tj. do primární struktury) polypeptidového řetězce jednoznačně určené právě sekvencí ribonukleotidů mRNA. U eukaryot bývá primárním transkriptem zpravidla premediátorová RNA (pre-mRNA, hnRNA), která je posttranskripčně upravována. Chemické úpravy na jejích koncích (čepička na 5´- konci, polyadenylace na 3´-konci) souvisejí se stabilizací molekuly RNA, jejím transportem do cytoplazmy a částečnou ochranou před účinkem ribonukleáz. Sestřihem jsou z molekuly pre-mRNA odstraněny tzv. introny, tj. úseky, které se nepřekládají do primární struktury polypeptidového řetězce. mRNA je tedy tím druhem RNA, který vzniká transkripcí strukturních genů (tj. genů kódujících primární strukturu určitého polypeptidového řetězce) a v průběhu translace plní funkci matrice při biosyntéze polypeptidového řetězce na ribozomu.
2. TRANSFEROVÁ RIBONUKLEOVÁ KYSELINA – tRNA V buňce teoreticky musí být přítomen minimálně jeden typ tRNA pro každou ze souboru 20 (resp. 21 včetně selenocysteinu) standardních aminokyselin. Ve skutečnosti je jednotlivých typů tRNA v buňce ještě více, přičemž každá z nich vzniká přepisem genů pro tRNA. Přes tuto různorodost existují obecné zákonitosti ve struktuře jednotlivých typů tRNA. Všechny molekuly tRNA sestávají z poměrně krátkých ribonukleotidových řetězců (kolem 75 – 95 ribonukleotidů). Kromě standardních bazí (A, G, U, C) obsahují ještě několik nestandardních bází (např. pseudouridin, dihydrouridin, hypoxantin a další). Velká část polyribonukleotidového řetězce tRNA obsahuje komplementární báze a proto tRNA vytvářejí sekundární strukturu, která má charakteristickou podobu „jetelového listu“. Tento útvar sestává ze čtyř hlavních ramen (akceptorové, pseudouridinové, antikodonové, dihydrouridinové) a jedné variabilní smyčky (dlouhé nebo krátké). Akceptorové rameno zahrnuje 5´- i 3´-konec, přičemž přes OH-skupinu C2´ nebo C3´zbytku ribózy AMP koncové sekvence CCA na 3´-konci se váže příslušná aminokyselina. Jako předpis, podle kterého je každá z 20 (resp. 21) standardních aminokyselin přesně přiřazena pouze určitému typu tRNA o specifické struktuře, funguje genetický kód. Pseudouridinové rameno (TψC) vytváří smyčku obsahující pseudouridin. Dihydrouridinové rameno (DHU) vytváří smyčku obsahující dihydrouridin. Antikodonové rameno vytváří smyčku, ve které je lokalizován antikodon, což je triplet komplementární k příslušnému tripletu (kodonu) mRNA. Variabilní smyčka se nachází mezi pseudouridinovým a antikodonovým ramenem. Četnými interakcemi a především vlivem vodíkových vazeb mezi bázemi ribonukleotidů smyčky dihydrouridinového ramena a variabilní smyčky se formuje terciární struktura tRNA. Uplatňuje se, mimo jiné, při realizaci proteosyntézy na ribozomech.
3. RIBOZOMOVÁ RIBONUKLEOVÁ KYSELINA – rRNA Rovněž ribozomová ribonukleová kyselina existuje ve více typech, které vznikají transkripcí genů pro rRNA. Zpravidla se charakterizují hodnotou sedimentační konstanty. Jednotlivé typy rRNA se podílejí na stavbě ribozomů a spoluúčastní se procesů, které se na nich realizují (proteosyntéza). Většina eukaryotní rRNA se syntetizuje v průběhu interfáze v jadérku při přepisu DNA, která ji kóduje (tzv. rDNA), jako pre-rRNA, z níž se posttranskripčně vystřihnou finální molekuly rRNA. Molekuly rRNA ihned asociují se specifickými proteiny, které byly syntetizovány v cytoplazmě a dopraveny do buněčného jádra. Vznikající ribonukleoproteinové komplexy (subjednotky ribozómů) jsou poté exportovány z hjádra do cytoplazmy, kde se jako ribozómy účastní translace genetické informace. Některé tzv. malé rRNA se nesyntetizují v jadérku.
90
IV. BUNĚČNÉ MEMBRÁNY A MEMBRÁNOVÉ STRUKTURY Membránový princip je jedním ze základních stavebních a funkčních principů buněk. Biomembrány vytvářejí strukturní základ řady buněčných organel a participují na mnoha buněčných procesech a funkcích. Buněčné membrány ve vztahu k vnějšímu prostředí buněk vytvářejí rozhraní (většinou jsou selektivně permeabilní), které umožňuje separovat intracelulární prostor s vlastnostmi odlišnými od okolí buňky. Tím u jednobuněčných organizmů významným způsobem participují na existenci buňky jako otevřeného (biologického) systému, schopného samostatné existence. V mnohobuněčných organizmech vnější (cytoplazmatické) membrány oddělují jednotlivé buňky navzájem (kromě buněčných stěn). Intracelulární biomembrány umožňují vnitřní kompartmentaci buněk a s ní související oddělení určitých souborů buněčných pochodů od sebe navzájem, resp. více či méně specificky prostorovou lokalizaci určitých buněčných komponent a pochodů. Zároveň však biomembrány jednotlivé buněčné kompartmenty přímo propojují (např. jaderná membrána – membrány endoplazmatického retikula) nebo se na jejich propojení nějakým způsobem podílejí (např. vezikulární transport, endocytóza, exocytóza). Tím, že biomembrány fungují jako selektivní bariéry, participují na zprostředkování regulace buněčných funkcí. Evolučně konzervované schéma biomembrán představuje fosfolipidová dvojvrstva, ve které jsou jednotlivé vrstvy orientovány kolmo (s nepatrnými odchylkami) k ploše membrány. Takové uspořádání molekul fosfolipidů je za obvyklých podmínek vnějšího prostředí velmi stabilní, tzn. že se jedná o uspořádání s nízkou volnou energií. Proto bimolekulární fosfolipidové nebo lipidové filmy mohou vznikat autoorganizací. Molekuly fosfolipidů směřují polárními (hydrofilními) oblastmi na vnější stranu biomembrány, kdežto nepolárními (hydrofobními) oblastmi dovnitř (ke středu) biomembrány. Biomembrány s takto uspořádanými fosfolipidy jsou amfifilní. Na polárních koncích se vyskytují především aminoskupiny, hydroxylové a karboxylové skupiny. Nepolární část lipidů biomembrán tvoří řetězce mastných kyselin. Rozložení jednotlivých lipidů v obou vrstvách není shodné a vede k asymterii biomembrány; například v živočišných buňkách převažují na straně vnější (obrácené do okolí buňky nebo do okolí buněčné membránové struktury) lecitiny a sfingomyeliny (obecně cholinové fosfolipidy), glykolipidy jsou výhradně na této straně, kdežto na opačné straně převažují kefaliny a fosfatidylserin (obecně aminofosfolipidy). Biomembrány různých buněčných typů se liší jak zastoupením jednotlivých lipidů, tak poměrem lipidů a proteinů, které jsou jejich další základní komponentou. Například bakteriální cytoplazmatické membrány neobsahují cholesterol; cytoplazmatické membrány rostlinných buněk místo cholesterolu obsahují některé jiné steroly; poměr lipidů ku proteinům je v membránách erytrocytů téměř 1 : 1, kdežto v myelinové pochvě přibližně 4 : 1.
91
SCHÉMA FOSFOLIPIDOVÉ DVOJVRSTVY A MICELY
Na hydrofilní konce fosfolipidové dvojvrstvy biomembrán se napojují polárními skupinami postranních řetězců aminokyselin molekuly proteinů. S hydrofobní částí fosfolipidové dvojvrstvy biomembrán se váží slabými vazbami nepolární oblasti proteinů; tyto interakce mezi řetězci mastných kyselin molekul fosfolipidů a příslušnými úseky membránových proteinů podmiňují určité pnutí fosfolipidové dvojvrstvy. Molekuly proteinů v závislosti na jejich terciární struktuře interagují s molekulami fosfolipidů do různé hloubky dvojvrstvy. Podle toho rozlišujeme: (a) tzv. integrální proteiny, jejichž polypeptidové řetězce v konformaci α - helixu či β – struktury prostupují fosfolipidovou dvojvrstvou jednou (např. glykoforin, integriny) nebo vícekrát (např. membránové receptory se sedmi transmembránovými helixy, poriny), takže například jeden konec peptidu vyčnívá nad povrch buňky a druhý zasahuje do cytoplazmy; takovéto integrální proteiny se označují jako transmembránové. (b) povrchové (periferní) proteiny, jejichž molekuly se prostřednictvím nekovalentních vazeb(vodíkové vazby, elektrostatické síly) váží k polárním oblastem molekul membránových fosfolipidů nebo k integrálním proteinům a z převážné části vyčnívají nad povrch fosfolipidové dvojvrstvy.
92
SCHÉMA USPOŘÁDÁNÍ HLAVNÍCH KOMPONENT BUNĚČNÉ MEMBRÁNY
Fosfolipidová dvojvrstva je dostatečně elastickým útvarem v důsledku působení slabých mezimolekulárních sil při hydrofilních a hydrofobních interakcích a v důsledku přítomnosti dvojných vazeb v poloze cis v řetězcích nenasycených mastných kyselin, které umožňují jejich ohyb. Pohyb řetězců mastných kyselin je závislý jak na jejich struktuře, tak na některých dalších faktorech, zejména na teplotě. Stanovuje se tzv. bod přechodu, definovaný jako teplota, při které je pohyblivost řetězců minimální a vnitřní oblasti bimolekulárního filmu nabývají rigidní (resp. krystalické) formy; jinými slovy, je to teplota, při které přechází bimolekulární film (fosfolipidová biomembrána) z tekuté fáze do fáze pevné (bod tání). Hodnota tohoto bodu odráží především uspořádání a možné interakce řetězců mastných kyselin molekul fosfolipidů. Dlouhé řetězce nasycených mastných kyselin se mohou těsně k sobě přikládat a vytvářet pevné struktury; proto se vyznačují vyššími hodnotami bodu tání a s tím související nižší fluiditou fosfolipidové dvojvrstvy. Řetězce nenasycených mastných kyselin s konfigurací cis dvojných vazeb se nemohou přikládat k sobě tak těsně jako řetězce nasycených mastných kyselin; v důsledku toho je hodnota bodu tání fosfolipidů, jejichž molekuly obsahují nenasycené mastné kyseliny, nižší (oproti fosfolipidům s nasycenými mastnými kyselinami) a fluidita fosfolipidové dvojvrstvy vyšší. Molekuly fosfolipidů při zachování základní orientace molekul tak mohou v biomembráně vykazovat laterální migraci a jejím prostřednictvím měnit svou polohu. Molekuly některých membránových komponent (např. cholesterolu) však pohyblivost lipidových molekul částečně retardují. Kromě laterální migrace mohou fosfolipidy měnit svou polohu ještě rotačním pohybem kolem osy kolmé k ploše membrány, nebo kolem osy paralelní s plochou membrány (tzv. překlápění či flip-flop pohyb). Polohu v membráně mohou měnit i molekuly proteinů. Přesuny molekul komponent biomembrán probíhají v obou případech formou difuze spontánně, nebo mohou být indukovány některými ději probíhajícími na membráně (např. přesuny při aglutinační reakci antigen – protilátka). Biomembrány tak za fyziologického stavu nejsou rigidní útvary s pevně fixovanou polohou jednotlivých komponent, ale struktury tekuté (fluidní). 93
Na základě fyzikální struktury a fyzikálně-chemických vlastností biomembrán byl vypracován model fluidní mozaiky, který zřejmě nejlépe vyhovuje současným poznatkům o jejich struktuře. Fluidita je významnou fyzikálně-chemickou vlastností, umožňující realizaci řady biologických funkcí (transmembránový transport látek, transdukce informačních signálů, redistribuce molekul membrány apod.). Rovněž umožňuje buňkám a membránovým buněčným organelám realizovat v určitém rozmezí některé morfologické adaptace a reparovat vzniklá poškození omezeného rozsahu.
IV.1. CYTOPLAZMATICKÁ MEMBRÁNA Hlavní funkcí cytoplazmatické membrány je vymezení vnitrobuněčného prostoru vůči okolí (ostatní objektivní realitě). Vydělení určité entity v prostředí je nutnou podmínkou její samostatné existence a jejího specifického vymezení se vůči ostatním entitám. V kontextu evoluce biologických systémů znamenal vznik membrány s vlastnostmi odpovídajícími cytoplazmatickým membránám recentních organizmů zásadní událost. Teprve systém relativně uzavřený (separovaný) od okolního prostředí mohl evolvovat, jinými slovy mohl směřovat k vyšší uspořádanosti, autoorganizaci, autoregulaci a autoreprodukci. Zdůrazněme ještě jednou slovo relativně, protože vnitřní obsah (systém), ohraničený membránou, se může organizovat jedině tehdy, jestliže má možnost permanentně přijímat a transformovat energii a látky ze zdroje lokalizovaného mimo vlastní systém, tj. nacházejícího se v okolí systému, a tím čelit entropizaci. Neméně důležitou podmínkou autoorganizace je možnost uvolnění přebytečné energie a látek mimo vlastní systém. Konečně samoorganizovat se a evolvovat jako biologický systém může pouze takový útvar, který je schopen rozlišit vlastní od cizího. Pokud by chemickou evolucí vznikly jakkoli vhodné sloučeniny a struktury potenciálně schopné autoreprodukce a autoregulace (jako jsou nukleové kyseliny a proteiny), avšak nebyly odděleny od okolí membránou s rekogniční funkcí, nemohla by se jejich autoreprodukční a autoregulační potence evolučně realizovat. Kooperace a integrace biochemických reakcí je velmi často možná pouze tehdy, jsou-li alespoň některé (ne-li všechny) zúčastněné komponenty fixovány trvale nebo dočasně k vhodnému podkladu. Struktura cytoplazmatické membrány (resp. biomembrán obecně) jí umožňuje plnit funkci nosiče některých molekul a molekulárních komplexů. Jak je všeobecně známo, mnoho významných životních dějů probíhá právě na buněčných membránách. Cytoplazmatická membrána tedy především ohraničuje buňku vůči jejímu okolí, realizuje regulovaný tok látek, energie a informace mezi buňkou a okolím v závislosti na potřebách buňky a na stavu (změnách) vnějšího prostředí, participuje na některých mechanizmech adaptace (cytomorfologické, fyziologické) a plní rekogniční funkci (zejména ve vztahu k jiným buňkám). Tím vším vymezuje chování buňky jako otevřeného systému. Cytoplazmatická membrána je strukturně asymetrická. Kromě základních skupin fosfolipidů, sterolů a proteinů obsahuje glykolipidy a glykoproteiny. Některé z nich se uplatňují jako informační molekuly (receptory) v rekogničním procesu. Řetězce oligosacharidové složky jsou situovány vždy na vnější stranu cytoplazmatické membrány, kde vytvářejí tzv. glykokalyx, který interaguje s molekulami složek extracelulární matrix. U buněk, které jsou na povrchu opatřeny ještě buněčnou stěnou (buňky bakterií, hub, rostlin), vzniká mezi cytoplazmatickou membránou a buněčnou stěnou periplazmatický prostor, se kterým cytoplazmatická membrána bezprostředně komunikuje.
94
SCHÉMA FLUIDNÍHO MODELU CYTOPLAZMATICKÉ MEMBRÁNY
IV.2. ENDOPLAZMATICKÉ RETIKULUM Endoplazmatické retikulum tvoří ve všech eukaryotických buňkách (kromě spermií) rozsáhlou síť vzájemně propojených membránových struktur oddělujících od okolního prostředí cytoplazmy vnitřní (luminální) obsah a komunikujících jak s jaderným obalem, tak s cytoplazmatickou membránou. Endoplazmatické retikulum je místem syntézy jednotlivých komponent buněčných membránových struktur (lipidů, proteinů) a budoucích extracelulárních proteinů. Na vnější stranu membrán endoplazmatického retikula se při translaci genetické informace mohou napojovat ribozomy za vzniku tzv. drsného endoplazmatického retikula. Ribozomy se napojují na proteinové složky membrány endoplazmatického retikula prostřednictvím specifického oligopeptidového řetězce o délce asi dvaceti převážně hydrofobních aminokyselin nacházejících se na N-konci syntetizovaného proteinu (polypeptidového řetězce). Na tuto tzv. signální sekvenci se napojí ribonukleoproteinový komplex, označovaný jako SRP (signal recognizing particle, partikule rozpoznávající signál), který se posléze připojí ke specifickému 95
receptoru na ribozomu. Ribozom zaujímá prostřednictvím této vazby ve vztahu k endoplazmatickému retikulu takovou polohu, ve které je umožněn prostup syntetizujícího se polypeptidového řetězce z ribozomu do endoplazmatického retikula přes translokační kanál, vzniklý v membráně endoplazmatického retikula kolem signální sekvence. Některé ze syntetizovaných proteinů pronikají do membrán endoplazmatického retikula a stávají se jejich součástí jako integrální proteiny, přičemž N-konec je umístěn na luminální straně membrány; ostatní vstupují do cisteren endoplazmatického retikula jako sekreční proteiny. Oligopeptidový úsek, kterým se ribozom přičlenil k membránám endoplazmatického retikula, se ještě v průběhu syntézy polypeptidového řetězce za katalytického účinku specifického membránového enzymu odštěpí a po dokončení syntézy celého polypeptidového řetězce se uvolní i ribozom, který je využitelný v dalším proteosyntetickém procesu. Proteiny, které proniknou dovnitř endoplazmatického retikula, jsou v něm částečně posttranslačně upravovány (nespecificky glykozylovány membránovou glykozyltransferázou, některé aminokyseliny jsou hydroxylovány, mezi některými úseky polypeptidových řetězců se vytvářejí disulfidické můstky). Z endoplazmatického retikula jsou proteiny v oddělených váčcích přepraveny do Golgiho aparátu, kde jsou podrobeny dalším úpravám a posléze jsou odtud opět ve váčcích dopraveny k cytoplazmatické membráně a exocytózou uvolněny do extracelulárního prostoru. Významnou skupinu proteinů, syntetizovaných a částečně upravovaných v drsném endoplazmatickém retikulu, tvoří lyzozomální enzymy, které jsou odtud postupně přepravovány (a dále upravovány v Golgiho aparátu) ve formě váčků do lyzozomů. V prokaryotických buňkách se ribozomy analogicky připojují k cytoplazmatické membráně. Proteiny, určené k sekreci, v průběhu jejich syntézy prostupují cytoplazmatickou membránou do periplazmatického prostoru, kde plní příslušné funkce, nebo se stávají složkami buněčné stěny. Část endoplazmatického retikula, na jehož vnější povrch se nepřipojují ribozomy, se označuje jako hladké endoplazmatické retikulum. Je místem syntézy většiny membránových lipidů (kromě mastných kyselin a některých mitochondriálních fosfolipidů), steroidních látek a glykogenu. Hladké endoplazmatické retikulum je místem akumulace vápenatých iontů (zejm. sarkoplazmatické retikulum buněk příčně pruhovaného svalstva). Jsou v něm rovněž hydroxylována některá xenobiotika. Endoplazmatické retikulum jako celek se tedy podílí na syntéze jak proteinových, tak lipidových komponent buněčných membrán, které se prostřednictvím intracelulární přepravy sekrečních váčků a včleněním jejich membrán do membrán cílových stávají strukturní součástí těchto cílových membrán. Endoplazmatické retikulum je též organelou, která se významně podílí na udržování a regulaci koncentračního gradientu vápenatých iontů mezi cytoplazmou (s nízkou koncentrací Ca2+) a lumen endoplazmatického retikula (s vysokou koncentrací Ca2+). Iontovými kanály v membráně endoplazmatického retikula mohou procházet ionty Ca2+ z lumen endoplazmatického retikula do cytoplazmy, kdežto v opačném směru jsou proti koncentračnímu spádu transportovány prostřednictvím Ca2+ ATPázy.
96
ENDOPLAZMATICKÉ RETIKULUM
97
IV.3. GOLGIHO APARÁT (KOMPLEX) Golgiho aparát (neboli Golgiho komplex) představuje polarizovaný systém plochých membránových struktur (cisteren) nacházejících se v blízkosti endoplazmatického retikula. Část, lokalizovaná v bezprostřední blízkosti drsného endoplazmatického retikula, se oznažuje jako strana cis, část, lokalizovaná nejblíže k cytoplazmatické membráně (nejdále od endoplazmatického retikula), se označuje jako strana trans. Jednotlivé cisterny bývají navzájem izolované a komunikace mezi nimi se realizuje prostřednictvím transportních váčků, které se oddělují od jedné cisterny a splývají s jinou cisternou. Tento transport je v zásadě orientovaný ve směru od strany cis ke straně trans Golgiho aparátu. V jednotlivých cisternách probíhají různé úpravy proteinů (specifická glykozylace, specifická proteolýza, sulfatace a jiné) podle toho, jakými soubory enzymů ta která cisterna disponuje. Proto obsah váčku, který se oddělil od cisterny na straně cis (nejblíže endoplazmatickému retikulu), v níž předtím prošel první úpravou, může prodělat další úpravu v sousední v cisterně (směrem ke straně trans), do které byl přepraven. Takto uspořádaná sekvence chemických (resp. biochemických) úprav v cisternách Golgiho aparátu a přeprava upravených produktů ve formě váčků pokračuje, až je dosaženo poslední cisterny na straně trans, v níž vznikají konečné produkty, které se též třídí podle místa jejich určení. Je zřejmé, že v důsledku uskutečněných chemických úprav (modifikací) tyto finální produkty nabývají některých nových fyzikálně-chemických vlastností souvisejících s biologickými funkcemi, které plní v místě určení. Část konečných produktů je směrována do lyzozomů (přes endozomy), část do sekrečních váčků; sekreční váčky jsou posléze dopraveny k cytoplazmatické membráně a exocytovány. Strukturní uspořádání Golgiho aparátu a mohutnost jeho rozvoje je závislá především na typu buňky a její metabolické aktivitě. Gogiho aparát je tedy útvar dynamicky se měnící s fyziologickými podmínkami a diferenciačními procesy v buňce. Golgiho aparát bývá v rostlinných buňkách označován jako diktyozom.
GOLGIHO APARÁT
98
IV.4. PEROXIZOMY Peroxizomy jsou membránové struktury eukaryotických buněk specifické vysokým obsahem oxidáz, které mohou katalyzovat uvolnění vodíku ze substrátu za vzniku peroxidu vodíku. Peroxid vodíku je následně štěpen katalytickou aktivitou katalázy, přičemž uvolněný kyslík je utilizován v oxidačních procesech mnoha různých látek uvnitř buňky (např. etanol je touto cestou metabolizován na acetaldehyd, mastné kyseliny na acetylkoenzym A, meziprodukty katabolizmu nukleových kyselin na alantoin, luciferin je oxidován luciferázou za současné emise fotonů, některé depotní lipidy rostlinných buněk jsou konvertovány na sacharidy apod.). Enzymy určené pro peroxizomy jsou syntetizovány na ribozomech. Molekuly těchto enzymů obsahují na C-konci specifickou sekvenci aminokyselinových zbytků, která se uplatňuje při jejich translokaci do vnitřního prostoru peroxizomů. Obecně lze říci, že se peroxizomy účastní mnoha katabolických a detoxikačních procesů. Dědičné poruchy jejich funkce tedy mohou vést k závažným negativním následkům pro buňku, resp. pro celý organizmus. Membrány peroxizomů nejsou odvozeny od membrán endoplazmatického retikula nebo jiných buněčných membránových struktur, nýbrž vykazují autonomii v tom smyslu, že při jejich tvorbě (resp. dynamické obměně) se využívají cytoplazmatické lipidy a proteiny. Z hlediska evolučního je možné nahlížet na peroxizomy jako na organely uplatňující se v aerobním metabolizmu v období, kdy ještě neevolvovaly mitochondrie, avšak již došlo ke zvýšení podílu kyslíku v atmosféře. (Pozn.: To platí zejména o tzv. hydrogenozomech nacházejících se v buňkách některých organizmů, jejichž buňky neobsahují mitochondrie.) Analogickým útvarem peroxizomů jsou v rostlinných buňkách glyoxizomy.
IV.5. LYZOZOMY Lyzozomy jsou další membránovou strukturou eukaryotických buněk. V buňkách rostlin a hub jejich funkci zastávají vakuoly. Jak bylo naznačeno již výše, lyzozomy se formují jako váčky oddělující se od cisteren na straně trans Golgiho aparátu. Po svém vzniku jsou na povrchu dočasně pokryty ještě klatrinovým obalem. Uvnitř lyzozomů jsou obsaženy četné trávicí enzymy, původně syntetizované v drsném endoplazmatickém retikulu a dále upravované v Golgiho aparátu. Většinu z nich tvoří různé typy hydroláz (proteázy, fosfatázy, lipázy, nukleázy apod.) uplatňující se při dekompozici pro buňku již nepotřebných nebo škodlivých makromolekul bez zřetele na jejich původ (intracelulárně syntetizovaných nebo pocházejících z vnějšího prostředí). Reakční optimum těchto hydroláz leží v kyselé oblasti; nižší hodnota pH uvnitř lyzozomů (kolem 5) oproti ostatním oblastem cytoplazmy je udržována působením membránové ATPázy, která transportuje protony dovnitř lyzozomů. Produkty hydrolýzy mohou být po uvolnění do cytoplazmy reutilizovány, nebo exocytovány a podílet se na extracelulárním trávení. Pokud se lyzozomální enzymy uvolní z lyzozomů do intracelulárního prostředí, nastane autolýza buňky. V případě, že se nejedná o proces patologický, ale řízený, označuje se jako apoptóza (programovaná smrt); uplatňuje se významně v embryogenezi a morfogenezi. Existují geneticky (mutačně) podmíněné poruchy funkce lyzozomů, které se mohou projevovat jako tzv. lyzozomální dědičné choroby; manifestují se převážně jako následek nedokonalého lyzozomálního katabolizmu určité skupiny makromolekul (mukopolysacharidóza,
99
glykogenóza). Genetické i negenetické faktory mohou participovat na patologickém procesu extracelulární digesce katalyzované lyzozomálními enzymy u některých revmatických chorob. Vakuoly buněk rostlin a hub kromě trávicích funkcí lyzozomů zastávají ještě funkci depotní, neboť shromažďují a skladují odpadní a zásobní látky, a funkci regulační, týkající se regulace buněčného turgoru. V genezi lyzozomů lze vyčlenit následující dvě stadia: (1) primární lyzozomy – jsou to lyzozomy nově oddělené od Golgiho aparátu, které ještě nevykazují trávicí aktivitu. (2) sekundární lyzozomy - jsou to lyzozomy, které vznikají fúzí s jinými buněčnými útvary, jejichž obsah je lyzozomálními enzymy rozkládán. Podle toho, s čím primární lyzozom fúzoval, mívají sekundární lyzozomy vlastní názvy: fagozom je sekundární lyzozom, vzniklý fúzí primárního lyzozomu s fagocytovanými (membránou opatřenými) částicemi, sekundární endozom je sekundární lyzozom, vzniklý fúzí primárního lyzozomu s endocytárním váčkem. (Pozn.: Některými autory termín „sekundární endozom“ již není používán. V odborné literatuře se lze setkat s dalšími odlišnými klasifikacemi lyzozomů, než je uvedeno v tomto textu.)
LYZOZOMY
O ostatních membránách a membránových strukturách (transportní váčky, jaderná membrána, membrány mitochondrií a chloroplastů) je pojednáno v dalších kapitolách (buněčné jádro, mitochondrie, chloroplasty, buněčný transport).
100
V. CYTOSKELET Termínem „cytoskelet“ se označuje systém vláknitých proteinových struktur (mikrotubulů, mikrofilament a intermediárních filament) v eukaryotické buňce, které plní mechanické funkce. Cytoskeletární struktury v buňkách prokaryot dosud nebyly přesvědčivě prokázány.
V.1. MIKROTUBULY Mikrotubuly jsou tvořeny molekulami evolučně velmi konzervativní globulární bílkoviny tubulinu. Jednotlivé molekuly tubulinu mají charakter heterodimeru sestávajícího ze dvou podjednotek – z podjednotky α a z podjednotky β, na níž se nachází vazebné místo pro GTP (resp. GDP). V buňkách mnohobuněčných organizmů se vyskytuje více molekulárních variant tubulinů, tzv. izotubuliny, které jsou produktem rozdílných posttranslačních úprav. Spektra izotubulinů se zpravidla liší mezi různě diferencovanými buňkami. V cytosolu buněk se nachází určitý podíl molekul tubulinu ve volném (disociovaném) stavu; představuje rezervoár tubulinových molekul pro syntézu mikrotubulů. Molekuly tubulinu se mohou vázat nekovalentními interakcemi tak, že podjednotka β jednoho heterodimeru se připojuje k podjednotce α následujícího heterodimeru za vzniku protofilamenta. Délka jednotlivých protofilament je dána počtem takto lineárně interagujících tubulinových heterodimerů. Paralelním řazením obvykle třinácti vzájemně posunutých protofilament a jejich příčnými spoji vznikají mikrotubulární struktury. Mikrotubuly jsou dynamicky se měnící supramolekulární struktury. V důsledku mechanizmu formování protofilament jsou mikrotubuly orientované a rozlišují se na nich dva konce: kladný konec neboli plus – konec, který tvoří podjednotka β, a záporný konec neboli minus – konec, který tvoří podjednotka α. Mikrotubulus se na plus - konci prodlužuje asociací molekul tubulinu s navázaným GTP a odbourává se na minus - konci disociací molekul tubulinu s navázaným GDP; to znamená, že energie uvolněná štěpením GTP se využívá k depolymeraci mikrotubulu. Asociace heterodimerů tubulinu se realizuje v tzv. nukleačních centrech (MTOC = microtubuli organizing centre). Mezi nukleační centra patří centrozom, ve kterém dochází k nukleaci např. mikrotubulinu mitotického aparátu buňky nebo soustavy dalších mikrotubulinů cytoplazmatických, a bazální tělíska, ve kterých dochází k nukleaci mikrotubulů řasinek a bičíků. V MTOC živočišných buněk bývá dvojice centriol tvořených uspořádanými devíti trojicemi mikrotubulů; centrioly se mohou v buňce dělit nebo vznikat de novo. V MTOC rostlinných buněk se centrioly nevyskytují. Při nukleaci je minus-konec mikrotubulu přivrácen k nukleačnímu centru, plus – konec je od něho odvrácen. Nukleační centra jsou nejen místem prodlužování mikrotubulů, ale též je jimi řízen počet protofilament v konkrétním mikrotubulu a uspořádání složitých mikrotubulárních struktur. Na mikrotubuly se v buňce mohou vázat tzv. proteiny asociované s mikrotubuly (MAP = microtubuli associated proteins), které participují na stabilitě mikrotubulů, mimo jiné i tvorbou příčných spojení mezi jednotlivými mikrotubuly nebo jejich skupinami. Stabilita (resp. dynamika) mikrotubulů se liší jednak mezi různými typy buněk, jednak mezi různými intracelulárními mikrotubulárními strukturami uvnitř jednotlivých typů buněk. Rozsáhlé přestavby mikrotubulárních útvarů se uskutečňují pravidelně v průběhu buněčného dělení. Mikrotubuly se v buňce významně uplatňují jako opěrné struktury pro pohyb molekulárních motorů. Mezi ně patří dynein, který se za využití energie uvolněné štěpením ATP může pohybovat po mikrotubulu ve směru od jeho plus - konce k minus - konci, a kinezin, který se 101
za využití energie ze stejného zdroje může pohybovat po mikrotubulu směrem opačným. Mikrotubuly plní funkce při intracelulární přepravě různých buněčných objektů. Pouhé prodlužování („růst“) mikrotubulů v dělicím vřeténku má zásadní význam pro uskutečnění translokace na něj navázaných subcelulárních struktur.
V.2. MIKROFILAMENTA Základní komponentou mikrofilament je aktin. Molekula aktinu má globulární tvar a je tvořena jedním polypeptidovým řetězcem s vazebným místem pro ATP; tento nepolymerovaný aktin se označuje jako G-aktin. Jednotlivé monomery aktinu mohou při vhodné iontové síle okolního prostředí spontánně agregovat prostřednictvím nekovalentních vazeb za vzniku tzv. F-aktinu. Aktiny tvoří velkou rodinu proteinů a proto aktiny nacházející se v různých typech buněk (např. rostlinné, živočišné, různě diferencované) netvoří molekulárně homogenní, ale heterogenní skupinu. Jednotlivé typy aktinů, které se liší primární strukturou, se označují jako izoaktiny. Přes tyto skutečnosti patří aktin mezi evolučně velmi konzervativní proteiny. Aktinová mikrofilamenta jsou tvořena vzájemně ovinutými molekulami F-aktinu, k nimž jsou napojeny molekuly tropomyozinu (na jednu molekulu tropomyozinu připadá přibližně sedm monomerních molekul aktinu). Aktinová vlákna jsou dynamické buněčné struktury. Podobně jako mikrotubuly jsou orientovaná, tzn. že na nich rozlišujeme plus - konec a minus – konec, a jsou syntetizována na plus - konci a degradována (štěpena) na minus - konci. Při této dekompozici (depolymerizaci) F-aktinu na G-aktin se utilizuje energie uvolněná hydrolýzou ATP (podobně jako se při dekompozici mikrotubulů utilizuje energie uvolněná hydrolýzou GTP). Mikrofilamenta formují v buňkách rozsáhlé, členité, hustě propojené sítě. Asociací mikrofilament s některými dalšími intracelulárními proteiny dochází k vytvoření podélných svazků vláken, které mohou nabývat i značné délky. Vyšší počet těchto vláken těsně pod cytoplazmatickou membránou (tzv. buněčný kortex) má za následek její gelovitou strukturu. Jiná skupina intracelulárních proteinů participuje na propojení aktinových mikrofilament s integrálními proteiny cytoplazmatické membrány. Změny ve struktuře těchto útvarů, vytvářených na bázi aktinových mikrofilament nebo jejich modifikací, se významně uplatňují při metabolických procesech buňky, při přenosu buněčných signálů, buněčném transportu a dalších dějích. Aktinová mikrofilamenta jsou též součásí některých speciálních buněčných útvarů, mezi nimiž lze uvést například stereocilie, mikroklky či jiné buněčné výběžky. Významně se též uplatňují při transformaci chemické energie v kinetickou.
V.3. INTERMEDIÁRNÍ FILAMENTA Intermediární filamenta jsou útvary složené z různých typů fibrilárních proteinů. Proto jsou intermediární filamenta značně heterogenní komponentou cytoskeletu. Přestože existují různé formy intermediárních filament, vyskytuje se v určitém typu diferencovaných buněk zpravidla pouze jedna. Mezi nejrozšířenější rodinu intermediárních filament náleží laminy, které jsou nezbytné pro vznik jaderného obalu. Dalšími významnými rodinami proteinů intermediárních filament jsou cytokeratiny, podílející se například na soudržnosti buněk epitelů a neurofilamenta, vyztužující výběžky neuronů. 102
Základním stavebním prvkem intermediárních filament je tetramer (většinou homotetramer). Interakcemi mezi jednotlivými tetramery se konstituuje protofilamentum ve tvaru dvou dvouřetězcových navzájem ovinutých šroubovic (tzv. coiled coil). Paralelní agregací většího počtu protofilament do plochy vznikají finální intermediární filamenta. S intermediárními filamenty asociují některé další proteiny, kterými jsou intermediární filamenta vzájemně spojena do svazků, anebo které zprostředkují napojení intermediárních filament na jiné cytoskeletární struktury. Podstatným znakem, který intermediární filamenta odlišuje od mikrotubulů a mikrofilament je to, že neparticipují na pohybových funkcích buňky. Intermediární filamenta se podílejí zejména na mechanickém zpevnění některých buněčných útvarů (buněčné výběžky, dezmozomy).
MIKROTUBULY A MIKROFILAMENTA Microfilaments
103
VI. BUNĚČNÝ TRANSPORT V buňkách se uskutečňuje transport látek více mechanizmy. Obecně je za transportní děj považován proces, při kterém se mění hodnota sledované veličiny (energie, látkové množství, hybnost) v určitém místě systému s časem, tedy změna hodnoty takové veličiny je funkcí času. K popisu transportních dějů se používají dva základní parametry: tok (J) a hnací síla (F). Tok je definován jako množství veličiny X (energie, látkové množství), které projde jednotkovou plochou (kolmou na zvolenou osu) za jednotku času; lze ho stanovit podle vzorce: J = (1/S) (∆X/∆t), kde J = tok, S = plocha, X = měřená veličina, t = čas. Hnací síla je příčinou toku ve směru zvolené osy a obecně je gradientem určité veličiny Y. V rovnovážných systémech je tok přímo úměrný hnací síle, jestliže k němu dochází v jednom směru nebo za izotropních podmínek: J = c F, kde c = konstanta úměrnosti (závisí na teplotě, tlaku a složení směsi). V systémech vzdálených od rovnovážného stavu není mezi tokem a hnací silou lineární závislost (odchyluje se od linearity). S ohledem na energetickou stránku se rozlišuje transport pasivní, k jehož realizaci není třeba dodávat energii a aktivní, který se může realizovat pouze za dodání (spotřeby) energie.
SCHÉMA PASIVNÍHO A AKTIVNÍHO TRANSPORTU PŘES MEMBRÁNU
104
VI.1. VOLNÁ DIFUZE Difuzí se rozumí tok, při kterém dochází v koncentračně nehomogenním systému k vyrovnávání koncentrací, tj. až do ustavení termodynamické rovnováhy. Příčinou toku látky jsou rozdíly v její koncentraci. Průběh difuze ve směsi závisí na řadě faktorů, z nichž mezi hlavní patří rozdíl koncentrací látky v systému, hodnota difuzního koeficientu difundující složky ve směsi, fáze difundující složky, viskozita prostředí (rozpouštědla) a efektivní poloměr difundující molekuly. K jeho přibližnému popisu v biologických systémech lze aplikovat 1. a 2. Fickův zákon. Difuze přes cytoplazmatickou membránu závisí na fyzikálních vlastnostech membrány (které nejsou konstantní, ale dynamicky se mění) a difundujících molekul. S ohledem na chemické složení, strukturu a selektivní permeabilitu cytoplazmatické membrány mohou přes ni difundovat obecně malé molekuly hydrofilní (voda, etanol, močovina), látky lipofilní (steroidy, mastné kyseliny, uhlovodíky) a některé plyny (kyslík, dusík). Buňka difuzní procesy nereguluje a proto i v ní probíhají až do ustavení termodynamické rovnováhy, resp. do stavu velmi blízkého termodynamické rovnováze.
VI.2. IONTOVÉ KANÁLY A USNADNĚNÁ DIFUZE Iontové kanály jsou tvořeny membránovými oligomerními proteiny. Jejich polypeptidové řetězce několikanásobně prostupují celou membránou a v závislosti na jejich aminokyselinovém složení i na interakcích s dalšími komponentami biomembrány v ní napříč vytvářejí struktury, kterými mohou procházet některé ionty (např. Na+, K+, Ca2+, Cl-). Tok iontů iontovými kanály se děje ve směru koncentračního spádu, tedy bez dodání energie. Vzhledem k tomu, že se uskutečňuje předem vytvořenými kanály, bývá tato forma buněčného transportu označována jako usnadněná (facilitovaná) difuze. Současně je třeba si uvědomit, že na podkladu strukturní heterogenity proteinů vytvářejících iontové kanály se projevuje jejich heterogenita konformační, která se odráží ve specifitě jednotlivých iontových kanálů pouze pro určitý druh iontů. Usnadněná difuze (transport iontovými kanály) je tedy proces iontově specifický. Kromě toho stav iontových kanálů se dynamicky mění podle fyzikálně-chemických změn na membráně a v jejím okolí. Proteiny iontových kanálů též mohou reagovat selektivně na některé signály (např. vazba ligandu, změna membránového potenciálu) zavřením nebo otevřením kanálu. Iontové kanály zprostředkují tok iontů mezi buňkou a jejím okolím. Mezi cytoplazmatickými membránami některých typů živočišných buněk existují intercelulární spoje označované jako gap junctions. Jsou tvořeny specifickými proteiny, konexiny, které umožňují intercelulární komunikaci realizovanou obousměrným tokem některých látek (iontů, cAMP, určitých meziproduktů intermediárního metabolizmu, apod.). Podobně jako jiné transmembránové iontové kanály i gap junctions se mohou zavírat a otevírat v závislosti na lokálních fyzikálněchemických poměrech a tak tok látek mezi buňkami ovlivňovat. Mezibuněčná komunikace je – obecně – významným mechanizmem kooperačních, regulačních a integračních procesů zasahující do supracelulárních úrovní organizace živých systémů. Gap junctions se na ní podílejí. Iontové kanály se rozdělují do dvou velkých skupin: A. CHEMICKY ŘÍZENÉ Chemicky řízené kanály jsou membránové receptory, tvořené molekulami složených bílkovin (pentamerů). Každá tato bílkovinná makromolekula sestává z pěti subjednotek podobného aminokyselinového složení, které jsou navzájem uspořádány do kruhovité struktury. Vlastní iontový kanál se otevře uprostřed tohoto útvaru až v důsledku konformační změny vzniklé 105
po navázání příslušného ligandu (neuromediátoru). Podle toho, jaký je výsledný náboj postranních řetězců aminokyselinových zbytků přítomných uvnitř samotného kanálu, jsou iontové kanály propustné pro kationty nebo pro anionty: záporný náboj umožňuje průchod kationtů, kladný náboj umožňuje průchod aniontů. Chemicky řízené kanály se nacházejí v postsynaptické membráně vstupního úseku neuronu. V nervové soustavě jsou známy dva typy kationtových kanálů: (1) acetylcholinové – vyskytují se na nervosvalové ploténce, na četných synapsích v mozku a ve vegetativních gangliích, tedy tam, kde je neuromediátorem acetylcholin (2) glutamátové – vyskytují se na budivých synapsích v CNS obratlovců, tedy tam, kde je neuromediátorem glutamát. Po otevření acetylcholinových i glutamátových kanálů dochází nejen k průniku sodných iontů dovnitř buňky, ale též draselných iontů z buňky do extracelulárního prostředí, avšak tok Na+ převažuje nad tokem K+ (neboť hodnota gradientu pro Na+ je vyšší než hodnota gradientu pro K+) a proto uvedený pohyb sodných a draselných iontů přes cytoplazmatickou membránu může vést k její depolarizaci a vzniku depolarizačního synaptického potenciálu, který může za vhodných podmínek rezultovat ve vzruch. Pozn.: V současné době je známo několik typů glutamátových kanálů. Jedním z nich je tzv. NMDA kanál, jehož ligandem je N-metyl-D-aspartát. NMDA kanál se po navázání tohoto ligandu otevírá, avšak až když už je membrána depolarizována, a propouští dovnitř buňky i vápenaté ionty. Existují údaje, které svědčí pro účast těchto kanálů na vzniku některých trvalých změn v nervové soustavě a v procesech souvisejících s vytvářením paměťových stop. Neuromediátory GABA a glycin jsou ligandy aniontových kanálů, které zvyšují propustnost cytoplazmatické membrány pro chloridové ionty. Jestliže na membráně existuje nenulový elektrochemický potenciál chloridových iontů, může být výsledkem otevření kanálů pro chloridové ionty vznik tlumivého synaptického potenciálu. Nicméně i v případě, že elektrochemický potenciál chloridových iontů na membráně je prakticky nulový, může mít aktivace těchto kanálů tlumivý účinek: jsou-li totiž současně otevřeny i kationtové kanály, je depolarizace membrány způsobená tokem Na+ do buňky kompenzována stejnosměrným tokem Cl¯ a proto nemusí vzniknout depolarizační synaptický potenciál, rezultující ve vzruch. Obecně lze tedy konstatovat, že otevření chloridových kanálů může stabilizovat klidový potenciál. Pozn.: Neuromediátory adrenalin, noradrenalin a serotonin ovlivňují stav iontových kanálů zprostředkovaně prostřednictvím aktivovaných G-proteinů, které se mohou na iontové kanály vázat přímo, anebo mohou navodit jejich fosforylaci (např. proteinkinázou aktivovanou cAMP).
B. NAPĚŤOVĚ ŘÍZENÉ Tyto kanály jsou typické pro vodivý úsek (axon, neurit) neuronu. Chemicky se jedná o rodinu složitých transmembránových proteinů, jejichž strukturu obecně tvoří tetramer transmembránových helixů, které obklopují vlastní kanál, do něhož zasahují polární úseky molekuly proteinu ve tvaru kliček. Napěťově řízené kanály reagují na změny membránových potenciálů a otevírají se při depolarizaci cytoplazmatické membrány. Místem, které reaguje na změny membránového potenciálu, je patrně úsek několika aminokyselinových zbytků s kladným nábojem na postranních řetězcích, přítomný v každém monomeru. Poloha tohoto úseku je vlivem působící elektrické síly při klidovém potenciálu taková, že iontový kanál je uzavřený a tedy neprostupný pro příslušné ionty. Změnou (zmenšením) elektrické síly v důsledku depolarizace membrány se změní konformace makromolekulárního komplexu 106
tvořícího napěťově řízený kanál, tím i poloha uvažovaného aminokyselinového úseku a kanál se otevře pro příslušné ionty. Napěťově řízené kanály se vyznačují vysokou specifitou pro ionty, které jimi mohou procházet. Sodíkové kanály (Na+ - kanály) jsou specifické pro sodné ionty, podobně draselné kanály (K+-kanály) jsou specifické pro draselné ionty. Každý sodíkový kanál disponuje vlastním inaktivačním mechanizmem: depolarizací cytoplazmatické membrány se otevírá pouze po velmi krátký časový interval (přibližně 1 msec), po jehož uplynutí přechází do tzv. inaktivního stavu, navozeného uzavřením ústí kanálu jednou z proteinových domén makromolekulárního komplexu; po repolarizaci membrány tato doména ústí kanálu uvolní, kanál se vrátí do klidové polohy (při klidovém potenciálu) a může se znovu otevřít až při další depolarizaci. Na Na+-kanály lze nahlížet jako na zesilovače, neboť pouze nepatrná změna (přibližně o 5 mV) hodnoty klidového potenciálu (- 70 mV) ve smyslu depolarizace umožní intenzivní tok sodíkových iontů přes cytoplazmatickou membránu, který způsobí velkou depolarizaci při vzniku akčního potenciálu (několikanásobně větší, než jaká postačuje pro otevření Na+- kanálu, až na hodnotu přibližně +20 mV). Můžeme tedy konstatovat, že v depolarizační fázi akčního potenciálu se uplatňuje mechanizmus pozitivní zpětné vazby /malá depolarizace → otevření kanálu → tok Na+ → zvětšení depolarizace → (otevření dalších a vzdálenějších kanálů → další zvětšení depolarizace)n → otevření maximálního počtu kanálů → maximální depolarizace/. Na základě tohoto mechanizmu fungování Na+-kanálů lze vysvětlit jednak konstantní hodnotu akčního potenciálu (odpověď typu „vše nebo nic“), jednak velmi vysokou rychlost šíření akčního potenciálu po neuronu (řádově až desítky metrů za sekundu). Ve srovnání s kanály pro draselné ionty reagují Na+-kanály na změny membránového potenciálu rychleji. Draselné kanály jsou specifické pro draselné ionty. Stejně jako Na+-kanály se otevírají při depolarizaci cytoplazmatické membrány, avšak není u nich znám inaktivační mechanizmus; jakmile se membrána repolarizuje, K+-kanály se opět uzavřou. K+-kanály nefungují jako zesilovače; při jejich činnosti se uplatňuje mechanizmus negativní zpětné vazby. Celkově lze konstatovat, že gradient iontů ustavující se na membránách, je obecným znakem živých systémů a představuje vzájemně převoditelnou formu volné energie. Tento jev je v buňkách široce využíván (např. při syntéze ATP v průběhu fotosyntézy a respirace, při šíření vzruchů v nervové soustavě, při aktivním transmembránovém transportu apod.).
VI.3. PŘENAŠEČOVÝ TRANSPORT Pod pojmem přenašečový transport se rozumí transport zprostředkovaný proteinovými přenašeči. Z energetického hlediska se jedná o transport, který může být pasivní nebo aktivní. Každý přenos lze rozložit do sledu několika dějů. Při tomto typu transportu se uplatňuje rekogniční schopnost proteinového přenašeče. Proto nejdříve musí dojít k rozpoznání přenášené látky (ligandu). Výsledkem rekogničního děje je více či méně specifická vazba přenášené látky na přenašečový protein. Teprve poté nastane vlastní translokace, tj. přemístění látky z jedné strany biomembrány na opačnou. Po této translokaci se přenášená látka uvolňuje z přenašeče, který se může opět zapojit do dalšího transportního cyklu. Podle počtu přenášených látek a směru přenosu můžeme rozlišovat přenašečový transport typu uniportu, kdy je v určitém směru přenášena pouze jedna látka (ligand), typu synportu, kdy je přenos jedné látky (ligandu) v určitém směru spojen s přenosem jiné látky (ligandu) ve stejném směru, nebo typu antiportu, kdy je přenos jedné látky (ligandu) v určitém směru 107
spojen s přenosem jiné látky (ligandu) v opačném směru. Přenašeči, podílející se na těchto typech transportu, využívají energii dříve ustanoveného elektrochemického gradientu; např. při synportu Na+ - glukóza pronikají do buňky sodné ionty po koncentračním i elektrickém spádu a společně s nimi molekuly glukózy proti koncentračnímu spádu. Obdobně je tomu v případě antiportu Na+ - Ca2+ (např. v buňkách srdečního svalu), kdy sodné ionty po spádu vstupují do buňky a vápenaté ionty jsou proti spádu uvolňovány z buňky. Pasivní forma transportu, zprostředkovaná přenašeči, byla prokázána pro molekuly některých aminokyselin, sacharidů a iontů. Stejně jako ostatní formy pasivního transportu se uskutečňuje bez dodání energie a její průběh je, mimo jiné faktory, ovlivněn (vymezen) kapacitou přenašečů. Formy aktivního transportu jsou závislé na dodání energie. Hlavním donorem energie v buňkách je ATP, méně často (spíše ve více či méně specifických procesech) se uplatňují další NTP. Pro aktivní transport lze též využít energie, uvolňované při exergonických reakcích, světelné energie, nebo elektrochemického gradientu iontů na membránách. Významnými přenašečovými proteiny aktivního přenašečového transportu jsou membránové transportní ATPázy (iontové pumpy), participující většinou na přenosu iontů. Jednou z velmi rozšířených je Na+/K+ ATPáza, přenášející draselné ionty z vnějšího prostředí do buňky a sodné ionty naopak z buňky do vnějšího prostředí proti koncentračnímu spádu a podílející se tak na udržování membránového potenciálu a stálých osmotických poměrů v buňce. Při tomto přenosu se nejprve prostřednictvím ATP fosforyluje molekula přenašeče a dojde k přenosu sodných iontů z buňky; v další fázi, v níž se fosfátová skupina opět uvolní a obnoví se původní konformace přenašeče, dochází k přenosu draselných iontů do buňky. Ca2+ ATPáza plní důležitou úlohu při přenosu vápenatých iontů z cytosolu do cisteren endoplazmatického retikula proti koncentračnímu gradientu výměnou za ionty vodíku (Ca2+ ↔ 2H+); při této výměně iontů ATPáza nekoná elektrickou práci. Tento přenos Ca2+ iontů se uplatňuje zejména ve svalových buňkách, v nichž odčerpáním vápenatých iontů z cytosolu je umožněna relaxace kontrahovaného svalu. K+/H+ ATPáza transportuje draselné ionty do buňky výměnou za vodíkové ionty. Tato ATPáza je účinná např. v buňkách žaludku obratlovců, kde se podílí na produkci HCl. V cytoplazmatických membránách rostlinných buněk H+ ATPáza převádí vodíkové ionty z intracelulárního prostředí na vnější stranu membrán bez výměny za jiný kationt; tato ATPáza tedy koná elektrickou práci a přispívá ke vzniku membránových potenciálů. Z hlediska strukturního i funkčního jsou ATPázy tříděny do několika rodin. Výše uvedené ATPázy patří k rodině tzv. P ATPáz. Jinou rodinou jsou protonové ATPázy typu F0F1. Membránová komponenta F0 je protein složený z více podjednotek a funguje jako iontový kanál. S komponentou F0 je spojena komponenta F1, která je rovněž vícepodjednotkovým proteinem s vlastní enzymatickou aktivitou. Tyto ATPázy se výrazně podílejí na syntéze ATP v buňce (zejména na vnitřní membráně mitochondrií, na membránách tylakoidů v chloroplastech a v buňkách aerobních bakterií) a fungují tedy jako syntázy. V ATPázy zprostředkují transport protonů v membránách lyzozomů, sekrečních váčků a vakuol eukaryotických buněk. Byly zjištěny i v buňkách archebakterií, kde se podílejí též na syntéze ATP. V souvislosti s probíraným typem buněčného transportu je vodné na tomto místě pojednat o významné vlastnosti biolgieckých membrán, kterou je membránový potenciál. Vznik membránového potenciálu vždy nějak souvisí s činností iontových pump: buď přímo, nebo zprostředkovaně. Vznik a udržení membránového potenciálu tedy může být přímo výsledkem činnosti elektrogenní iontové pumpy. Udržení takto vzniklého membránového potenciálu závisí na funkceschopnosti (funkčním stavu) iontové pumpy a na suplementaci energetickými zdroji dostačujícími pro její normální činnost. Ustavení membránového potenciálu v důsledku přímého působení iontové pumpy je považováno za evolučně původní a vyskytuje se zejména v cytoplazmatických membránách bakterií, hub, rostlin a semiautonomních organel. Zprostředkovaně s činností iontových pump souvisí tzv. difuzní potenciál. Tento způsob vzniku membránového potenciálu je považován za evolučně odvozený a je charakteristický 108
pro cytoplazmatické membrány živočišných buněk. Uvnitř buňky je koncentrace K+ několikanásobně vyšší, než v extracelulárním prostředí (odtud označení draslíku jako intracelulárního prvku) a naopak koncetrace Na+ je několikanásobně vyšší v extracelulárním prostředí, než uvnitř buňky (odtud označení sodíku jako extracelulárního prvku). Uvedené nerovnoměrné rozložení draselných a sodných iontů na obou stranách cytoplazmatické membrány vede k ustavení membránového potenciálu (například přibližně –70 mV u neuronu), udržovaného sodíko-draslíkovou pumpou (Na+/K+-ATPázou). Cytoplazmatická membrána živočišných buněk je pro K+ propustnější než pro Na+. Draselné ionty proto mají tendenci difundovat po koncentračním spádu z buňky do extracelulárního prostředí a tím porušit elektrickou rovnováhu. To je avšak možné pouze v omezeném rozsahu. Za předpokladu, že na idealizované cytoplazmatické membráně nemůže být úbytek kationtů uvnitř buňky, způsobený přesunem draselných iontů do extracelulárního prostředí, kompenzován odpovídajícím přesunem aniontů ve stejném směru, ani přísunem sodných kationtů v opačném směru, tedy z extracelulárního prostředí dovnitř buňky, vzniká tak rozdíl elektrického potenciálu. Je proto zřejmé, že kromě chemické síly, působící na pohyb draselných iontů směrem z buňky, projeví se i elektrická síla, působící na pohyb draselných iontů směrem opačným, tj. z extracelulárního prostředí do buňky, a tendující k eliminaci vzniklého rozdílu elektrického potenciálu. Jakmile elektrický potenciál dosáhne hodnoty, při níž se vyrovnává chemická síla působící na pohyb draselných iontů směrem z buňky s elektrickou silou působící na pohyb draselných iontů směrem do buňky, ustaví se stacionární stav. Membránový (difuzní) potenciál je za daných podmínek udržován intracelulárně se nacházejícími draselnými ionty (při zvyšující se koncentraci K+ v extracelulárním prostředí membránový potenciál úměrně klesá) a proto není přímo závislý na činnosti elektrogenní iontové pumpy. Reálná cytoplazmatická membrána je však částečně permeabilní pro Na+, což vede k přesunu určitého množství těchto iontů z extracelulárního prostředí dovnitř buňky a tím ke snížení difuzního potenciálu, který by se ustavil za předpokladu, že takový tok Na+ nenastává. Iontová sodíkodraslíková pumpa tok sodných iontů kompenzuje a tak udržuje konstantní hodnotu membránového potenciálu systému nacházejícího se ve stacionárním stavu (která je tudíž odlišná od teoreticky očekávané hodnoty pro rovnovážný difuzní potenciál draselných iontů). Tato pumpa (Na+/K+-ATPáza) přenáší přes cytoplazmatickou membránu sodné a draselné ionty v poměru 3 : 2. To znamená, že při utilizaci jedné molekuly ATP přenese 3 Na+ z buňky do extracelulárního prostředí a 2 K+ z extracelulárního prostředí dovnitř buňky; tím se spolupodílí na udržování záporně nabité vnitřní strany cytoplazmatické membrány. I když se na vzniku membránového potenciálu podílejí především draselné ionty, je jím ovlivněno chování dalších iontů. Jak již bylo uvedeno výše, vyskytují se sodné ionty ve výrazně vyšší koncentraci v extracelulárním prostředí, než uvnitř buňky. Totéž platí o vápenatých iontech. Elektrická i chemická síla působí na pohyb Na+ a Ca2+ ve stejném směru, tedy z extracelulárního prostředí do prostředí intracelulárního, což rezultuje ve vznik určitého nenulového elektrochemického potenciálu. Cytoplazmatická membrána je dobře propustná pro chloridové anionty. Chemická síla, která působí na pohyb Cl¯ z extracelulárního prostředí dovnitř buňky (tj. difuze po koncentračním spádu) je přibližně rovna elektrické síle, která působí na pohyb Cl¯ z buňky do extracelulárního prostředí a proto hodnota elektrochemického potenciálu je v tomto případě prakticky rovna nule. S tím souvisí skutečnost, že s případnou změnou permeability cytoplazmatické membrány pro chloridové anionty nenastává výrazná změna v jejich přesunu přes membránu. Pouze na cytoplazmatických membránách buněk, které disponují chloridovou pumpou, se v důsledku její činnosti ustavuje stacionární stav a rozložení iontů Cl¯ na obou stranách membrány se proto odchyluje od teoreticky očekávaného rozložení těchto iontů za rovnovážného stavu.
109
Poznámka: Zamysleme se nad vztahy: iontová pumpa – iontové gradienty – membránový potenciál. Předpokládejme, že dojde k zablokování Na/K pumpy (například v důsledku inhibice tvorby ATP). Potom (1) sodné ionty začnou pomalu pronikat dovnitř buňky a protože nemohou být odtransportovány zpět Na/K pumpou, bude cytoplazmatická membrána postupně depolarizována (2) následkem této depolarizace se bude zmenšovat síla, která udržuje rozložení chloridových iontů na obou stranách cytoplazmatické membrány tak, že jejich koncentrace je na vnější straně vyšší, než na vnitřní straně, a proto začnou pronikat dovnitř buňky (snadněji než sodné ionty, protože je membrána pro chloridové ionty propustnější) (3) z dějů, uvedených v bodě (1) a (2) vyplývá, že do buňky vlastně začne pronikat NaCl a proto se bude zvyšovat osmolarita buněčného obsahu, což povede následně k pronikání molekul vody dovnitř buňky a k jejímu botnání.
VI.4. TRANSLOKACE SKUPIN Translokací skupin se rozumí transport, při kterém je přenášená látka chemicky modifikována membránovými proteiny, které zároveň plní funkci vektorů. Membránové proteiny se na jedné straně membrány spojují s transportovanou látkou a katalyzují její chemickou modifikaci. Energie, která se při této modifikaci uvolní, se spotřebovává na uskutečnění vlastní translokace modifikované látky na opačnou stranu biomembrány, kde se přenášená látka uvolní z vazby na membránový protein. Membránový protein současně s tím obnovuje svůj původní stav (který měl před translokací) a může se zapojit do dalšího transportního cyklu. Jako příklad této formy transportu je možné uvést translokaci disacharidů z vnějšího prostředí přes cytoplazmatickou membránu dovnitř buněk sliznice tenkého střeva: molekula disacharidu je hydrolyzována a vzniklé monosacharidy jsou na účet energie, uvolněné hydrolýzou molekuly disacharidu, translokovány na vnitřní stranu cytoplazmatické membrány.
VI.5. PŘEPRAVA MEMBRÁN Vzhledem ke stejné nebo velmi podobné základní struktuře biomembrán mohou se části různých membránových kompartmentů navzájem spojovat, vyměňovat nebo doplňovat. Tyto procesy se neuskutečňují pouhou translokací části membrány jednoho kompartmentu k membráně jiného kompartmentu a proto používáme označení přeprava membrán (membrane traffic). Přeprava biomembrán se realizuje prostřednictvím váčků oddělujících se z membránových buněčných struktur (endoplazmatické retikulum, Golgiho aparát, cytoplazmatická membrána), které uzavírají obsah váčků, a pohybujících se k cílovému místu, ve kterém se nachází jiná membránová struktura, s níž membrána váčku splyne a jeho obsah se uvolní. Přesuny váčků v buňce se realizují po vláknitých cytoskeletálních strukturách za účasti molekulárních motorů. Počáteční etapu přepravy biomembrán představuje endocytóza, závěrečnou etapu exocytóza. Přeprava biomembrán souvisí se sekreční činností buněk a s recyklací biomembrán.
110
ENDOCYTÓZA je etapa přepravy biomembrán, při které jsou do buňky přijímány látky z vnějšího prostředí a uvnitř buňky transportovány uzavřené ve váčcích k cílovému místu, anebo jsou v těchto váčcích degradovány. Pro endocytózu rozpuštěných látek se používá označení pinocytóza. Při ní část cytoplazmatické membrány invaginuje, až se posléze od ní oddělí malý váček obsahující látky z vnějšího prostředí; váček se v cytoplazmě spojí s časným endozomem. Většina endozomů při průchodu cytoplazmou se spojí s primárními lyzozomy za vzniku sekundárních lyzozomů, nebo s nějakými jinými membránovými strukturami. V sekundárním lyzozomu dochází k enzymatickému rozkladu a trávení obsahu endozomu. Někdy mohou endozomy sloužit pouze jako vektory látek z vnějšího prostředí na jedné straně buňky přes buňku do prostředí na opačné straně buňky (např. přenos některých rozpuštěných látek z krevního oběhu přes buňky endotelu cév do intercelulárního prostoru); tato forma pinocytózy se označuje jako transcytóza a je patrné, že se v ní prolíná endocytóza s exocytózou. Pro endocytózu pevných, relativně velkých částic (např. bakterií a některých dalších mikroorganizmů), se používá označení fagocytóza. Představuje proces, při kterém jsou částice z vnějšího prostředí pohlceny a posléze ve váčcích, nazývaných fagolyzozomy, degradovány. Fagocytóza může být nespecifická, nebo specifická; např. specifická fagocytóza bakterií je podmíněna vazbou specifické protilátky na povrch bakteriálních buněk. V buňkách eukaryot může endocytóza probíhat buď jako konstitutivní endocytóza, tj. permanentně, bez závislosti na nějakých vnějších stimulech, anebo jako adsorptivní endocytóza, tj. v závislosti na stimulaci specifickým signálem (vazbou ligandu na příslušný povrchový membránový receptor). Po stimulaci membránových receptorů specifickým signálem se za dodání energie z ATP oddělují od cytoplazmatické membrány váčky a pokrývají se proteinem, zvaným klatrin. Takto obalené váčky, tzv. coated vesicles, jsou transportovány cytoplazmou, přičemž se klatrinový obal od měchýřku postupně oddělí. Fúze váčku s cílovou membránou se uskutečňuje za účasti dalších specifických proteinů a dodání energie z ATP. Adsorptivní endocytóza umožňuje selektivní výběr přijímaných látek z okolí buňky a jejich nakoncentrování vychytáváním (tj. specifickou vazbou určité látky na odpovídající receptor) i z prostředí, ve kterém se vyskytují v nízké koncentraci. Při endocytóze se část cytoplazmatické membrány spotřebuje na tvorbu váčků, při exocytóze se naopak cytoplazmatická membrána zvětší o membránu váčků. Za fyziologických podmínek jsou endocytóza a exocytóza v rovnováze; obě participují na recyklaci cytoplazmatické membrány, čímž udržují její velikostní odchylky (fluktuace) v přijatelných mezích. EXOCYTÓZA je etapou přepravy membrán, při níž jsou z buňky vylučovány látky, které byly předtím v buňce nasyntetizovány a přemisťovány v uzavřených váčcích. Exocytózou jsou vylučovány do okolí buňky mnohé biologicky účinné látky (protilátky, některé hormony, neurotransmitery, metabolity, komponenty extracelulární matrix apod.). Sekret, uzavřený do části membrány té organely, ve které byl syntetizován nebo upravován, se postupně přepravuje v buňce až k cílovému místu na cytoplazmatické membráně, na němž je z buňky vyloučen do extracelulárního prostoru, nebo (v případě tzv. pučení) se do extracelulárního prostoru dostává celý transportní váček (např. při uvolňování virionů z hostitelské buňky). Soubor uspořádaných procesů, které participují na buněčné sekreci, se označuje jako sekreční dráha. V ní můžeme vymezit následující etapy: syntéza proteinů na ribozomech drsného endoplazmatického retikula a jejich vstup do endoplazmatického retikula → prvotní (částečná) úprava proteinů v cisternách endoplazmatického retikula → oddělení váčků od membrán endoplazmatického retikula → přeprava proteinů ve váčcích pokrytých fragmenty membrány endoplazmatického retikula do cisteren na cis-straně Golgiho komplexu → úprava materiálu obsaženého ve váčcích za jejich současného přesunu k trans – straně Golgiho aparátu → oddělení váčků od membrán Golgiho aparátu na trans - straně → přeprava váčků k cytoplazmatické membráně → fúze membrány váčků 111
s cytoplazmatickou membránou a uvolnění jejich obsahu do extracelulárního prostředí. Oddělování váčků od endoplazmatického retikula je nespecifický proces realizující se bez zapojení membránových receptorů. Kolem váčků se vytváří proteinový obal za účasti tzv. ARF-proteinu ze skupiny G-proteinů. Na molekulu ARF-proteinu je navázán GTP a řetězec mastné kyseliny. Tímto řetězcem mastné kyseliny se ARF-protein ukotví v membráně endoplazmatického retikula a za dodání energie z ATP se postupně kolem něho vytvoří obal odděleného váčku, tzv. koatomer, sestávající ze sedmi uspořádaných obalových proteinů COP (= coat protein); koatomerový obal obklopuje váček až do setkání s cílovou membránou. Za účasti ještě několika dalších tzv. rab proteinů, náležejících rovněž do skupiny G-proteinů, je takto obalený váček přepravován cytoplazmou k cílové membráně. Rab proteiny se mohou jednak ukotvovat v různých membránách řetězcem mastné kyseliny, kterou obsahují, jednak v interakci s tzv. přepravními (eskortními) proteiny se mohou pohybovat prostředím cytoplazmy. V momentě, kdy je cílové membrány dosaženo, se GTP vázaný na ARF-protein hydrolyzuje, ARF-protein se odpojí od membrány váčku a obal složený z koatomerů se rozpadne. Následuje fúze váčků s cílovou membránou, pro kterou je využita energie uvolněná hydrolýzou GTP. Sekreční dráha, v níž nedochází k žádné úpravě látek obsažených ve váčcích, oddělených od Golgiho aparátu, se označuje jako neregulovaná (konstitutivní); vyskytuje se například při sekreci protilátek plazmatickými buňkami, nebo při vylučování sérového albuminu z jaterních buněk do krevního oběhu. Sekreční dráha, v níž je naopak obsah váčků oddělených od Golgiho aparátu dále upravován, se označuje jako regulovaná; při ní vznikají vlastní sekreční váčky, v nichž mohou být molekuly transportovaných látek dále upravovány za katalytického působení enzymů, obsažených ve váčcích. Takto jsou upravovány například prekurzory proteohormonů na aktivní hormony, jejichž uvolnění ze sekrečních váčků je indukováno adekvátním signálem. Transport váčků jako specifická forma komunikace mezi membránovými kompartmenty buňky je systém spřažených negentropických dějů a proto musí být energeticky dotován.
Pozn.: Nové výsledky velmi intenzívního výzkumu buněčného transportu vedou k neustálému zpřesňování poznatků v této oblasti a s tím spojenými častými revizemi, včetně terminologie. Dovoluji si požádat čtenáře, aby k výše uvedenému textu přistupoval s vědomím této skutečnosti a považoval ho pouze za základní, značně zjednodušené vodítko k problematice buněčného transportu a souvisejících dějů. Obdobná situace panuje i pokud se týká buněčných receptorů, o nichž je pojednáno v následující kapitole.
112
SCHÉMA PŘEPRAVY PROSTŘEDNICTVÍM TRANPORTNÍCH VÁČKŮ
.
113
VII. BUNĚČNÉ RECEPTORY Buněčné receptory slouží k příjmu informací z okolí v podobě různých signálů (chemických, mechanických, světelných apod.). Tyto signály přímo (bezprostředně) nebo zprostředkovaně ovlivňují chování buňky. Buněčné receptory se nacházejí jak na povrchu buňky, tak uvnitř buňky, přičemž jedny i druhé se vyznačují vlastními specifiky a přijímají vymezený okruh signálů.
VII.1. MEMBRÁNOVÉ RECEPTORY Membránovými receptory jsou výhradně specifické proteiny. Většina signálů, které přijímají, jsou signály chemické, méně často jiné (světelné, mechanické). Podle typu přijímaných signálů se rozeznávají chemoreceptory, mechanoreceptory a fotoreceptory jako základní typy receptorů. Interakce mezi signálem a receptorem jsou specifické. Každá buňka disponuje určitým spektrem receptorů; tím je dán rozsah možných interakcí signál – receptor a jemu odpovídajících buněčných reakcí na tyto signály. Spektrum receptorů v mnohobuněčném organizmu těsně koreluje s typem diferencovaných, specializovaných buněk, resp. s dosaženým stupněm jejich diferenciace a specializace. To znamená, že určitý typ receptorů se vyskytuje převážně nebo výhradně na určitém typu diferencovaných (specializovaných) buněk. S tím souvisí i skutečnost, že různě diferencované buňky nesoucí shodný typ receptorů mohou po přijetí stejného signálu reagovat odlišně. Procesy, počínající interakcí signál - receptor a končící definitivní odpovědí na signál, vytvářejí tzv. signální dráhu. CHEMORECEPTORY jsou membránové receptory, které přijímají chemické signály. Patří mezi ně: (a) receptory iontových kanálů - řídí transport iontů membránovými kanály. Signálem pro ně mohou být některé mediátory (např. acetylcholin – receptor pro tento neurotransmiter je současně iontovým kanálem). (b) receptory asociované s G-proteiny – jsou to membránové proteiny spojené s trimerním proteinem vázajícím GTP (GTP - binding protein = G - protein). α - podjednotka tohoto proteinu váže GTP (aktivní stav) nebo GDP (inaktivní stav) a vykazuje GTPázovou aktivitu, podjednotky β a γ váží G-protein kovalentně na fosfolipidy biomembrány. Při reakci signálu s receptorem se změní konformace receptoru, která umožní zaměnit GDP z inaktivní α-podjednotky GTP a tím převést α – podjednotku do aktivního stavu. GTP je následně hydrolyzován G-proteinem na GDP, α – podjednotka G-proteinu se uvolňuje od receptoru (se kterým byla v kontaktu a který se po této hydrolýze vypíná) a aktivuje enzym, který katalyzuje tvorbu dalšího členu signální dráhy (většinou druhého posla, např. cAMP, IP3) lokalizovaného na membráně. Druhý posel (cAMP) se uvolňuje do cytoplazmy, kde aktivuje další článek signální dráhy (obvykle proteinkinázu A). Aktivovaná proteinkináza A fosforylací aktivuje další článek signální dráhy (další enzymy, např. kinázy nebo protein, který se může napojit na specifické sekvence DNA a aktivovat transkripci příslušné transkripční jednotky). Je-li druhým poslem cAMP, může se na jeho syntéze podílet uvolněná α – podjednotka některých trimerních G-proteinů tím, že aktivuje na cytoplazmatickou membránu navázanou adenylátcyklázu, která pak katalyzuje syntézu cAMP z AMP. U některých jiných G-proteinů však uvolněná α – podjednotka syntézu cAMP inhibuje. G-proteinem může být rovněž aktivována na cytoplazmatické membráně lokalizovaná fosfolipáza C, která katalyzuje štěpení membránového fosfatidylinozitolbisfosfátu za vzniku inozitoltrifosfátu (IP3) a diacylglycerolu. 114
IP3 je dalším druhým poslem. Na membránách endoplazmatického retikula otevírá iontové kanály pro vápenaté ionty. Diacylglycerol za přítomnosti vápenatých iontů aktivuje proteinkinázu C, která se dále může podílet na regulaci transkripce některých genů. Funkci druhých poslů mohou plnit též vápenaté ionty. Například v lumen sarkoplazmatického retikula svalových buněk jsou vápenaté ionty ve vysoké koncentraci. Určitou signální drahou jsou stimulovány iontové kanály membrán sarkoplazmatického retikula pro vápenaté ionty tak, že se otevřou, vápenaté ionty se z lumen retikula uvolní do cytoplazmy, tam se naváží na troponin C a tím se umožní styk myozinu s aktinem; výsledkem těchto procesů je svalová kontrakce. Účinkem retikulární membránové Ca2+ ATPázy jsou vápenaté ionty přetransportovány proti koncentračnímu spádu zpět do lumen sarkoplazmatického retikula, dochází k uvolnění vápenatých iontů z troponinu C a v důsledku toho k přerušení styku mezi myozinem a aktinem; tím jsou navozeny podmínky pro relaxaci svalu.
Přenos signálů prostřednictvím membránových receptorů spojených s G-proteiny je velmi rozšířen mezi organizmy různých taxonomických skupin. Tento systém je založen na amplifikačním principu, tzn. že signál je na jednotlivých úrovních signální dráhy postupně zesilován: malá konformační změna receptoru při jeho interakci se specifickým signálem nakonec může rezultovat ve změnu chování celého systému (buňky, orgánu, případně celého organizmu – např. účinky feromonů u hmyzu). (c) receptory s enzymovou aktivitou - jsou to proteiny lokalizované na vnitřní straně cytoplazmatické membrány, které samy vykazují vlastní enzymovou aktivitu (většinou proteinkinázovou, příp. fosfatázovou), anebo aktivují jiné enzymy (např. proteinkinázy). Podle místa fosforylace nebo defosforylace proteinu se receptory s vlastní enzymovou aktivitou blíže označují (např. tyrozinfosfatáza, treoninkináza apod.). Tyto receptory jsou specifické pro řadu velmi významných buněčných signálů jako jsou růstové faktory (epidermální - EGF, destičkový – PDGF, fibroblastový – FGF), některé hormony (inzulin, růstový hormon, somatomedin neboli IGF), mediátory diferenciace buněk v embryogenezi nebo cytokiny. Signální dráhy, které od receptorů s enzymovou aktivitou začínají, jsou mnohastupňové; cílovým místem jsou jaderné transkripční faktory, nebo regulační faktory buněčného cyklu. Fosforylované oblasti receptorů (např. na tyrozinu) jsou rozpoznávány specifickými intracelulárními proteiny s tzv. SH2 doménami. Vazbou SH2 domény na fosforylovanou oblast receptoru dochází k autofosforylaci proteinu, což je signálem pro další signální proteiny typu proteinkináz. Na konci tohoto několikastupňového procesu jsou aktivovány proteiny vázající se na specifické úseky DNA a regulující transkripci genů v přilehlé oblasti. Zpravidla nejprve dochází k aktivaci strukturních genů pro tzv. časné proteiny, které ovlivní expresi dalších strukturních genů, jejichž produkty jsou tzv. pozdní proteiny; teprve tyto proteiny plní specifické funkce v buňce (např. při jejím dělení nebo diferenciaci). Na vypnutí signalizačního systému, ve kterém jsou zapojeny receptory s enzymovou aktivitou, participují proteinfosfatázy, které katalyzují defosforylaci fosforylovaných proteinů. Může se též uplatnit intracelulární destrukce receptoru s navázaným ligandem, jestliže byl tento útvar předtím vpraven do buňky endocytózou. Všechny signální dráhy v buňce tvoří vzájemně propojený informační (a možno říci též biokybernetický) systém. Porucha některých jeho subsystémů (někdy i jediného prvku) může mít pro buňku nebo i celý organizmus dalekosáhlé důsledky. Například, mutace, která vede k trvalé mitotické aktivitě buňky, může být prvotní příčinou jejího maligního zvratu. V této souvislosti lze zmínit onkogeny jako mutačně změněné protoonkogeny. Produkty protoonkogenů patří mezi velmi významné regulační proteiny fungující v řadě signálních drah, avšak produkty mutačně změněné mohou vést k vytvoření maligního nádoru. Například normální produkt protoonkogenu ras, protein Ras ze skupiny membránových G-proteinů, je zapojen do několika signálních drah. Mutace protoonkogenu ras projevující se fenotypově neschopností hydrolyzovat GTP, má za následek udržování Ras proteinu v trvale aktivním stavu a může se projevit abnormální mitotickou aktivitou. Mutace tohoto typu jsou relativně často zjišťovány v lidských nádorech. Na druhé straně existují antionkogeny, jejichž produkty působí proti účinku onkogenů (resp. jejich produktů). Například účinek antionkogenního regulačního proteinu p53 (tj. proteinu o molekulové hmotnosti 53 kDa) se fenotypově projevuje zablokováním přechodu buňky z G1 - fáze do S – fáze interfáze, jestliže je DNA poškozena (zpravidla ve větším rozsahu). Po dobu, po kterou je buněčný cyklus takto dočasně zastaven, mohou probíhat reparace poškozené DNA vedoucí k eliminaci (nebo alespoň redukci) rizika vzniku a projevu mutací. Mutace genu 115
pro protein p53, které vedou v tomto smyslu k proteinu nefunkčnímu nebo hypofunkčnímu, se mohou projevit fenotypově zvýšenou mutabilitou v důsledku nereparovaných (nebo jen z části reparovaných) poškození DNA před vstupem buňky do S-fáze. Není bez zajímavosti, že je v maligních nádorech zjišťován častý výskyt mutací v genu p53, resp. nefunkční protein p53. Tyto nálezy dobře korespondují s teoriemi o mutačním původu malignit (resp. o mutacích jako primárních událostech karcinogeneze).
FOTORECEPTORY jsou membránové receptory specificky reagující na světelný signál (na tok fotonů). Spektrum fotoreceptorů je ve srovnání se spektrem chemoreceptorů velmi omezené. I když se buňky s fotoreceptory vyskytují u prokaryotických i eukaryotických organizmů, existuje mezi známými fotoreceptory vysoký stupeň strukturní homologie. Bakteriorodopsin fototaktických bakterií (např. Halobacterium halobium) se po absorpci světelného kvanta retinalem, se kterým je spojen, konformačně změní; tato změna umožní transmembránový transport protonů na bázi protonové pumpy, čímž se vytvoří membránový potenciál využitelný pro pohyb bičíků. Jemu strukturně blízký rodopsin v buňkách sítnice oka živočichů včetně člověka je rovněž spojen s retinalem fungujícím jako akceptor fotonů. Konformační změny rodopsinu, indukované po absorpci světelného kvanta retinalem, vedou k uvolnění α – podjednotky (zvané transducin), která aktivuje dále fosfodiesterázu hydrolyzující cGTP. cGTP v buňce udržuje sodíkové kanály v otevřeném stavu; jestliže se v důsledku hydrolýzy snižuje jeho koncentrace, má to za následek uzavření sodíkových kanálů a tím změnu membránového potenciálu. V konečné fázi této signální dráhy tedy na změně koncentrace cGTP závisí transformace světelné energie ve formu, která může být dále zpracována neurofyziologickými mechanizmy. Podobně jako rodopsin se chová transmembránový, s retinalem konjugovaný protein channelopsin-1, který funguje jako iontový kanál: po aktivaci světlem (absorpční maximum je při 500 nm) propouští H+. je znám u některých řas (např. rodu Chlamydomonas).
VII.2. INTRACELULÁRNÍ RECEPTORY Intracelulární receptory jsou bílkovinné látky, rozmístěné uvnitř buňky. Jsou známy receptory pro některé hormony (např. tyroxin, steroidní hormony), které pro vysoký stupeň lipofilie mohou pronikat cytoplazmatickou membránou přímo (nikoli zprostředkovaně přes membránové receptory). Molekuly těchto receptorů nesou minimálně dvě rozpoznávací místa: jedno pro specifickou oblast DNA a další pro hormon. V nepřítomnosti hormonu je vazebné místo receptoru pro specifickou oblast DNA maskováno proteinem, se kterým je receptor spojen, a proto vazba receptoru na DNA není možná. Navázání příslušného hormonu na vazebné místo receptoru pro hormon navodí konformační změnu receptoru, která má za následek uvolnění proteinu z receptoru a tím demaskování vazebného místa pro specifickou oblast DNA. Receptor s navázaným hormonem se pak přemisťuje z cytoplazmy do buněčného jádra, kde se může připojit ke specifické oblasti DNA a regulovat její transkripci. Obvykle jsou interakcí komplexu receptor-hormon se specifickou oblastí DNA transkripčně aktivovány strukturní geny pro časné proteiny s funkcí regulačních proteinů. Časné proteiny interakcí s dalšími specifickými oblastmi DNA vedou k transkripci přilehlých strukturních genů, jejichž produktem jsou pozdní proteiny. Teprve až pozdní proteiny se zpravidla uplatňují při některých funkčních změnách a diferenciačních procesech. Popsaným mechanizmem tedy dochází k navození exprese zcela určitých strukturních genů, resp. k tkáňově specifické expresi zcela určitých genů. Například pohlavní hormony takto řídí expresi genů, jejichž produkty se uplatňují při vývoji sekundárních pohlavních znaků a dozrávání pohlavních orgánů.
116
VII.3. RECEPTORY PRO ANTIGENY Jako antigeny se označují ty molekuly, které mohou být rozpoznány povrchovými receptory (B- a T-lymfocytů). Tyto povrchové receptory se vyznačují vysokým stupněm specifity. Rozpoznáván však není antigen jako celek, ale pouze jeho část (resp. určité místo na antigenu), která se označuje jako epitop neboli antigenní determinanta. Receptory B-lymfocytů (BCR = B-cell receptor) jsou protilátky (imunoglobuliny) umožňující navázání epitopu na molekule solubilního antigenu. Receptory T- lymfocytů (tzv. TCR = T-cell receptor) umožňují napojení na epitop antigenu, vázaného receptorem buňky prezentující antigen (APC = antigen-presenting cell); buňkou prezentující (nabízející) antigen může být B-lymfocyt, makrofág nebo dendritová buňka. V přítomnosti dalších příslušných signálů mohou být oba typy lymfocytů aktivovány a adekvátním způsobem reagovat. Aktivace T-lymfocytů vede k tzv. aktivovaným T-lymfocytům neboli T-buňkám, aktivace B-lymfocytů k tzv. B-buňkám neboli plazmatickým buňkám. V případě B-buněk je adekvátní reakcí na antigen syntéza a sekrece protilátky (imunoglobulinu) stejného složení, jaké má povrchový receptor, na který se navázal antigen. Antigen, který se váže na TCR, je produktem úpravy antigenu původně navázaného na receptor B-lymfocytu (případně jiného typu buňky, která je schopná realizovat jeho úpravu, např. makrofág). Úprava antigenu B-lymfocytem je několikastupňový proces, který lze stručně shrnout do následujících bodů: (1) navázání antigenu na povrchový receptor (IgM) B-lymfocytu, (2) endocytóza antigenu a jeho intracelulární rozštěpení v endozomu na peptidy, (3) spojení proteinů MHC, které byly dopraveny do endozomu, s peptidy rozštěpeného antigenu, (4) doprava komplexu MHC – peptid antigenu k cytoplazmatické membráně, (5) prezentace peptidu antigenu na povrchu B-lymfocytu. Podobně se realizuje úprava antigenů v makrofázích a buňkách infikovaných viry nebo bakteriemi. Buňky, které na svém povrchu prezentují upravený antigen (tj. peptid antigenu), se označují jako antigen prezentující (syn. antigen poskytující či antigen nabízející) buňky. Upravený antigen na povrchu B-lymfocytu je specificky rozpoznáván receptorem T-lymfocytu. Po navázání povrchového receptoru T-lymfocytu na peptid antigenu na povrchu antigen prezentujícího B-lymfocytu se navodí série dějů, označovaných jako aktivace B-lymfocytu a vyúsťujících v diferenciaci B-lymfocytu v plazmatickou buňku produkující protilátky. Z uvedeného je patrné, že receptory T-lymfocytů jsou schopny rozpoznávat pouze upravený antigen v komplexu s molekulou MHC, nikoli volný antigen (na rozdíl od B-lymfocytů). Ve vztahu k MHC lze rozlišit dva základní typy efektorových T-lymfocytů: (1) cytotoxické lymfocyty (Tc – lymfocyty = CD8 – lymfocyty), které rozpoznávají upravený antigen v komplexu s MHC I. třídy; předpokladem pro rozpoznání upraveného antigenu je předchozí navázání povrchového proteinu CD8 Tc-lymfocytů na molekuly MHC I, čímž je umožněna adheze Tc-lymfocytu na povrch buňky prezentující antigen, (2) pomocné lymfocyty (Th-lymfocyty = CD4-lymfocyty), které rozpoznávají upravený antigen v komplexu s MHC II. třídy; pro rozpoznání upraveného antigenu je důležité předchozí navázání povrchového CD4-proteinu Th-lymfocytů na molekuly MHC II, čímž jsou vytvořeny předpoklady pro navázání Th-lymfocytu na povrch buňky prezentující antigen. Th-lymfocyty se dále klasifikují podle jejich schopnosti aktivovat určité imunokompetentní buňky: Th1-lymfocyty aktivují makrofágy, Th2-lymfocyty aktivují B-lymfocyty. Th2-lymfocyty produkují řadu významných látek; interleukiny IL-4, IL-5, IL-6 (syntetizované po navázání Th2-lymfocytů na upravený antigen prezentovaný na povrchu B-lymfocytu) plní roli signálů k navození proliferace a diferenciace B-lymfocytů, růstový faktor TGF-β a interferon gama (IFN-γ) se uplatňují při řízení přesmyků imunoglobulinových tříd v plazmatických buňkách.
117
Hlavní histokompatibilní komplex (MHC = major histocompatibility complex) je membránový bílkovinný komplex fungující jako receptor specializovaný na navázání cizích oligopeptidů, které zpravidla vznikají v infikovaných tkáňových buňkách jako degradační produkty infekčního agens (např. viru) a jejich prezentaci na buněčném povrchu. Molekuly jednotlivých druhů MHC (u člověka je jich známo pět) jsou syntetizovány v endoplazmatickém retikulu, intracelulárně váží přítomný cizí oligopeptid a sekreční dráhou jsou i s navázaným oligopeptidem dopraveny do buněčné membrány, na jejímž povrchu oligopeptid (antigen) prezentují. Tkáňová buňka, prezentující cizí oligopeptid, je rozpoznána Tc lymfocytem, který se na ni naváže; touto vazbou jsou vytvořeny podmínky pro spuštění dějů, jejichž konečným výsledkem je smrt infikované buňky. Popsaný mechanizmus vztahů mezi buňkou prezentující cizí peptid a Tc lymfocyty se uplatňuje při resorpci transplantátu, který není geneticky identický s genotypem příjemce; v tomto případě je jako cizí peptid rozpoznán prezentovaný vlastní peptid buňky transplantované tkáně. Pouze vlastní buněčné oligopeptidy určitého jedince, navázané na MHC a prezentované na povrchu tkáňových buněk, jsou Tc lymfocyty tolerovány. Protilátky se z chemického hlediska řadí mezi glykoproteiny. Molekula každé protilátky sestává z podjednotek, tvořených dvěma identickými lehkými polypeptidovými řetězci (L-řetězce) a dvěma identickými těžkými polypeptidovými řetězci (H-řetězce). Složení na N-konci obou řetězců v rozsahu asi 100 aminokyselinových zbytků je vysoce variabilní a proto se tyto úseky označují jako variabilní oblasti (V – oblasti). Místa s obzvláště vysokou variabilitou uvnitř těchto variabilních oblastí se označují jako hypervariabilní oblasti; jsou tři na každém lehkém i těžkém řetězci. Zároveň však většinou platí, že určitá konkrétní sekvence aminokyselinových zbytků variabilní oblasti B-lymfocytů téhož klonu je stejná a odlišná od sekvence B-lymfocytů jiných klonů. Lze konstatovat, že variabilita aminokyselinového složení variabilních oblastí polypeptidových řetězců je zdrojem jednak vysoké rozmanitosti protilátek (a to nejen pokud se jedná o primární, ale též sekundární a zejména terciární strukturu), jednak jejich vysoké specifity. Konkrétní aminokyselinové složení hypervariabilních oblastí a jemu odpovídající terciární struktura rezultují ve vytvoření specifického vazebného místa pro určitý epitop. Specifita protilátky (imunoglobulinu) je tedy determinována primární strukturou variabilních oblastí. Na rozdíl od N-konců polypetidových řetězců protilátek je aminokyselinové složení jejich C-konců konstantní (resp. dochází zde pouze k nepatrným odchylkách v aminokyselinovém složení) a proto se tyto úseky polypeptidových řetězců označují jako konstantní oblasti (C-oblasti). Uvedené charakteristické znaky V- a C- oblastí souvisejí s odlišnými funkcemi, které plní: V- oblasti plní rekogniční funkci, tzn. jsou zodpovědné za rozpoznání epitopu, kdežto C-oblasti jsou zodpovědné za spuštění procesů, vedoucích k účinné odpovědi na epitop (antigen). Imunoglobuliny se blíže klasifikují podle typu lehkých a těžkých řetězců. Podle zastoupení jednotlivých typů (resp. subtypů) těžkých řetězců v molekule se imunoglobuliny klasifikují do pěti základních tříd: IgG (L2H2), IgA (L2H2 nebo /L2H2/2), IgM (/L2H2/5), IgD (L2H2) a IgE (L2H2). Imunoglobuliny jednotlivých tříd se vzájemně liší nejen složením a strukturou molekuly, ale též biologickými funkcemi a lokalizací v organizmu. V případě imunoglobulinů člověka se rozlišují: (1) dva typy lehkých řetězců : řetězce kappa (κ) a řetězce lambda (λ), přičemž imunoglobuliny téhož typu lehkých řetězců mají identické aminokyselinové složení C-oblasti a rozdílné aminokyselinové složení V-oblasti, (2) pět typů těžkých řetězců : gamma (γ), alfa (α), mí (µ), delta (δ), epsilon (ε), přičemž imunoglobuliny téhož typu těžkých řetězců mají identické aminokyselinové složení C-oblasti a rozdílné aminokyselinové složení V-oblasti. Řetězce α se podrozdělují na dva podtypy: α1, α2, řetězce γ na čtyři podtypy: γ1, γ2, γ3, γ4.
118
Povrchové receptory pro antigeny na T-lymfocytech (TCR) jsou převážně heterodimery, složené ze dvou transmembránových polypeptidů, označovaných jako α – polypeptid a β - polypeptid. Aminokyselinové složení N-konce každého polypeptidu je variabilní a proto se tento úsek nazývá – stejně jako v případě protilátek – variabilní oblast. Variabilní oblasti obou polypeptidových řetězců kooperují za vzniku vazebného místa pro určitý epitop. U menší části T-lymfocytů jsou receptory pro antigeny též heterodimery, avšak sestávající z jiných dvou typů transmembránových polypeptidů, označovaných jako γ - polypeptid a δ - polypeptid. Každý řetězec BCR nebo TCR je kódován genem, který se však formuje jako strukturněfunkční jednotka sestavením jednotlivých separovaných genových segmentů (subgenů) teprve při diferenciaci lymfocytu. Takto sestavený gen je transkribován a transkripcí vzniklá mRNA je translatována. Počet genových segmentů, z nichž jsou jednotlivé geny pro TCR a BCR sestavovány, je značně velký; odhaduje se, že na základě různých kombinací těchto segmentů lze dosáhnout řádově 1010 navzájem odlišných vazebných míst pro antigeny. Geny, které vznikají kombinací subgenů (genových segmentů) na základě vývojového programu dané buňky, se označují jako komplexní geny a mechanizmus, kterým se takové kombinace subgenů realizují (tj. spojování subgenů), se označuje jako přeskupování subgenů. Přeskupování subgenů probíhá při diferenciaci raných proB-lymfocytů na nezralé proBlymfocyty. Přitom je každá doména lehkého i těžkého řetězce imunoglobulinů kódována specifickým subgenem. Kromě toho jsou součástí genu pro určitý imunoglobulin ještě další subgeny: J-subgeny, které kódují koncové aminokyseliny variabilních oblastí obou typů řetězců, D-subgeny, které kódují aminokyseliny třetí hypervariabilní oblasti těžkých řetězců a L-subgeny, které kódují signální peptid obou typů řetězců. Přeskupování subgenů má však svá určitá omezení, která umožňují zachovávat při sestavování komplexního genu určitou obecnou strukturu: pro lehký řetězec je struktura komplexního genu L ─ VJ ─ C, pro těžký řetězec je struktura komplexního genu L ─ VDL ─ C. Nesmírná rozmanitost protilátek, která vyplývá pouze z mechanizmu sestavování komplexního genu na bázi přeskupování genů, se dále ještě zvětšuje v důsledku rekombinačního procesu a tzv. přesmyku imunoglobulinových tříd (izotypů), který se může uskutečnit jak na úrovni příslušných úseků DNA, tak na úrovni transkripce. Jako přesmyk imunoglobulinových tříd se označuje proces, při kterém dochází v linii B-lymfocytů v průběhu jejich diferenciace k přechodu určitého imunoglobulinu z jedné třídy do jiné za produkce molekul imunoglobulinů se shodnou variabilní oblastí lehkého i těžkého řetězce a odlišnou konstantní oblastí. Komplexní gen pro imunoglubuliny exprimuje pouze jednu alelu daného chromozomového páru, tzn. jednu alelu pro lehký a jednu alelu pro těžký řetězec; tento jev se označuje jako alelická exkluze. Současně s tím platí, že v každém B-lymfocytu se může syntetizovat buď jenom lehký řetězec κ nebo lehký řetězec λ, nikoli oba; hovoříme o tzv. izotypové exkluzi. Při diferenciaci kmenové buňky vznikne lymfocyt s konkrétní kombinací subgenů komplexních genů pro těžký a lehký řetězec imunoglobulinu. Proliferací takového lymfocytu vznikne klon, jehož buňky produkují týž imunoglobulin, který na povrchu membrány působí jako receptor pro určitý antigen. Vzhledem k tomu, že se jednotlivé klony B-lymfocytů liší navzájem konkrétní sestavou subgenů komplexních genů pro řetězce imunoglobulinů a tím i strukturou molekul imunoglobulinů samotných, je zřejmé, že v organizmu existuje ohromné množství rozmanitých molekulárních variant imunoglobulinů v podobě receptorů. V případě výskytu určitého antigenu dojde k jeho navázání na již vytvořený povrchový receptor B-lymfocytu, následně k selektivní proliferaci (aktivaci) tohoto lymfocytu a jeho potomstva a k vyselektování klonu B-buněk (plazmatických buněk) produkujících protilátku, identickou 119
s povrchovým receptorem původního B-lymfocytu, na který se antigen navázal. Teorie, podle níž je vyselektován preformovaný specifický klon B-buněk v závislosti na přítomném antigenu, se označuje jako teorie klonální selekce. Procesy probíhající v imunitním systému jsou velice těsně vzájemně propojené a založené na striktní kooperaci jednotlivých druhů imunokompetentních buněk. Autonomie imunitního systému je omezená, neboť interaguje s dalšími systémy v organizmu, zejména se systémem endokrinním a nervovým. Narušení těchto vzájemných vztahů může vést k závažným důsledkům pro celý organizmus (např. autoagresívní choroby, rozvoj AIDS, mnohočetný myelom aj.).
120
VIII. INTERCELULÁRNÍ SPOJE Buňky tkání a některých kolonií buněk jsou vzájemně spojeny intercelulárními spoji. Existuje více typů intercelulárních spojů, přičemž výskyt toho kterého typu je často charakteristický pro buňky určitého druhu tkáně. Jednotlivé typy intercelulárních spojů se odlišují se jak strukturou, tak s ní souvisejícími funkcemi.
VIII.1. TĚSNÍCÍ SPOJE Těsnící (neboli těsné) spoje představují jednu z forem membránových intergrálních proteinů. Vyskytují se zejména ve tkáních, jejichž buňky k sobě velmi těsně přiléhají, např. v epiteliích v oblasti oddělující apikální a bazolaterální část buněčného povrchu. V místech těchto spojů je kontakt mezi sousedními buňkami tak těsný, že i výměna látek difuzí mezi nimi není možná (cytoplazmatické membrány sousedních buněk mohou na styčných plochách splývat). Přes tyto skutečnosti se proteiny těsných spojů jen dílčím způsobem podílejí na soudržnosti buněk, protože jejich napojení na cytoskelet je omezené.
VIII.2. VODIVÉ SPOJE Na vodivých spojích se podílejí transmembránové proteiny zvané konexiny. Tyto proteiny v cytoplazmatické membráně vytvářejí šestičlenný dutý válec, označovaný jako konexon. Konexony dvou sousedních buněk se vzájemně spojují za vzniku nespecificky propustného intercelulárního kanálku, kterým mohou mezi buňkami procházet přiměřeně velké molekuly a ionty. Propustnost kanálků je regulována koncentrací vápenatých iontů v cytosolu: při jejím zvýšení se kanálky zavírají a tím se omezuje nebo blokuje jejich podíl na mezibuněčné komunikaci. Za fyziologických podmínek se přechod iontů a molekul se signalizační funkcí vodivými spoji může uplatňovat při intercelulárním šíření chemických signálů a změn membránového potenciálu. Buňky vzájemně propojené vodivými spoji proto mohou reagovat na adekvátní podnět jako určitý celek (např. srdeční sval). Nicméně, i když se tento typ mezibuněčných spojů zjišťuje v různých typech buněk, jako spoj mezi buňkami nervové tkáně a příčně pruhovaného svalstva se nevyskytuje.
VIII.3. ADHEZIVNÍ SPOJE Specifickou komponentou adhezivních spojů jsou transmembránové proteiny zvané kadheriny. Kadheriny vytvářejí rodiny proteinů, pro které je charakteristické, že se části molekul kadherinů téže rodiny, které vyčnívají nad povrch buňky, mohou za přítomnosti vápenatých iontů navzájem spojovat. V souvislosti s tím existují tkáňově specifické typy kadherinů (např. v buňkách nervové tkáně kadherin N, v buňkách epitelové tkáně kadherin E). Konce molekul kadherinů, které prostupují cytoplazmatickou membránou do intracelulárního 121
prostoru, se váží prostřednictvím dalších proteinů k souboru mikrofilament lokalizovaných těsně pod membránou. Propojení molekul kadherinů s cytoskeletárními strukturami se významně podílí jednak na vzniku různých tvarových změn, jednak na značné mechanické pevnosti a soudržnosti buněk s adhezivními intercelulárními spoji.
VIII.4. DEZMOZOMY Na stavbě dezmozomů participují rovněž kadheriny. Jedná se o molekuly kadherinů, které jsou prostřednicvím dalších proteinů navázány na intermediární filamenta cytoskeletu. V místech dezmozomů se vytvářejí v cytoplazmatické membráně terčovité útvary, které se vzájemně spojují interakcí těch částí molekul kadherinů, které vyčnívají nad buněčný povrch.
VIII.5. PLAZMODEZMY Plazmodezmy jsou typem intercelulárních spojů vyskytujícím se u rostlinných buněk. Plazmodezmy vytvářejí mezi dvěma sousedními buňkami kanálky, tzv. dezmotubuly, kterými mohou pronikat menší molekuly a ionty z jedné buňky do druhé. Soubor rostlinných buněk propojených plazmodezmy se označuje jako symplast. Symplast je někdy považován za určitou nadmolekulární fyziologickou jednotku, ve které se může realizovat tok informace a tok látek (metabolitů) difuzí. V důsledku metabolické kooperace a dalších forem intercelulární komunikace mezi členy symplastu může symplast reagovat na určité podněty (vlivy) jako jeden celek.
122
INTERCELULÁRNÍ SPOJE
123
IX. MITOCHONDRIE Mitochondie jsou semiautonomní buněčné organely se dvěma samostatnými membránami, s vlastní DNA (mtDNA, mitochondriální genofor prokaryotického typu) a vlastním proteosyntetickým aparátem (s ribozomy prokaryotického typu). Obě mitochondriální membrány, vnější a vnitřní, rozdělují vnitřní prostor mitochondrie na dva kompartmenty: vnější neboli intermembránový prostor mezi oběma membránami a vnitřní neboli lumen (matrix) zahrnující prostor vymezený vnitřní membránou. Vnější mitochondriální membrána je prostoupena větším počtem porinů, které umožňují propustnost i větších molekul (kolem 10 kDa) a proto je složení intermembránového prostoru blízké složení cytoplazmy.Vnitřní membrána je více či méně zřasena, takže vytváří útvary označované jako kristy, které až několikanásobně zvětšují její povrch. V nich jsou lokalizovány četné transportní proteiny uplatňující se při selektivním transmembránovém transportu, enzymy respiračního řetězce, komplex ATP-syntáz a přenašečové soustavy participující na dějích oxidační fosforylace.
MITOCHONDRIE
124
Mitochondrie jsou místem aerobní respirace. Tento typ respirace (vedle respirace anaerobní) je u chemotrofních organizmů základním prostředkem uvolnění energie z přijatých živin. V průběhu aerobní respirace jsou za přítomnosti oxidoreduktáz přenášeny elektrony z donorů, jimiž jsou atomy vodíku katabolizovaných substrátů (sacharidy, mastné kyseliny), na konečné akceptory (většinou anorganická oxidační činidla) tzv. dýchacím řetězcem (elektrontransportním systémem). Dýchací řetězec je terminální fází aerobního katabolizmu. Nachází se nejen v buňkách rostlin a živočichů, ale též v buňkách aerobních bakterií. Oxidoreduktázami katalyzovaný přenos elektronů z onoru (NADH+H+, resp. FADH2) na akceptor (molekula kyslíku) je realizován jako vícestupňový proces ve směru zvyšujícího se redoxního potenciálu, přičemž rozdíl mezi hodnotou potenciálu na začátku řetězce a na jeho konci je přibližně 1,0 V. Na tomto přenosu elektronů se podílejí transmembránové komplexy : FeS proteiny (= Komplex I a III), sukcinátdehydrogenáza (= Komplex II; katalyzuje oxidaci sukcinátu a přenos elektronů na ubichinon; redoxní potenciál sukcinátdehydrogenáza/ubichinon je blízký nule, takže se uvolňuje jen nepatrné množství energie) a cytochromy (Komplex III a IV), propojené mobilními přenašeči: ubichinonem (= koenzymem Q) mezi komplexy I – III a cytochromem c (mezi komplexy III – IV). Každá z těchto složek elektrontransportního systému se při průchodu elektronů redukuje složkou předchozí a zároveň redukuje složku následující, čímž se reoxiduje. Většinu energie mitochondrie zajišťují buňkám právě oxidací NADH+H+ na NAD. SCHÉMA ELEKTRONTRANSPORTNÍHO SYSTÉMU
125
Průchod elektronů systémem oxidoreduktáz na vnitřní mitochondriální membráně doprovází transmembránový transport protonů z vnitřního do intermembránového prostoru dotovaný Gibbsovou energií, uvolněnou při průchodu elektronů tímto elektrontransportním systémem. Při přenosu dvou elektronů z NADH+H+ respiračním řetězcem na molekulu kyslíku to činí asi deset protonů. Na vnitřní membráně tak vzniká elektrochemický protonový gradient projevující se zároveň jako gradient pH (nižší hodnotou pH v intermembránovém prostoru oproti vnitřnímu prostoru mitochondrie) a jako membránový (elektrický) potenciál. Protonmotivní síla tohoto gradientu je využita při návratu protonů do vnitřního prostoru (matrix) vnitřní mitochondriální membrány, gradient tedy může konat práci.
SCHÉMA TRANSPORTU ELEKTRONŮ OXIDAČNÍ FOSFORYLACE
V RESPIRAČNÍM
ŘETĚZCI
A
Transport elektronů v respiračním řetězci je spojen se současně probíhajícím procesem označovaným jako oxidační fosforylace. Při vyrovnávání protonového gradientu se část energie protonmotorické síly využívá k fosforylaci ADP na ATP, část k transmembránovému selektivnímu transportu některých metabolitů. Při oxidační fosforylaci jsou molekulárním kyslíkem oxidovány substráty (sacharidy a mastné kyseliny) až na oxid uhličitý a vodu. Energie, která se při tom uvolní, je za účasti F0F1 ATP-syntázy, lokalizované v těsném sousedství dýchacího řetězce, využita k fosforylaci ADP na vzniku ATP jako hlavního donora energie v buňce. Komponenta F0 je transmembránový protein, fungující jako protonový kanál, jímž procházejí protony z vnější strany vnitřní membrány na stranu vnitřní. Vlastní katalytickou aktivitu fosforylace ADP na ATP vykazuje složka F1. Ke komplexu ATP syntázy náleží též speciální proteinový přenašeč (resp. přenašečový systém) zprostředkující transport ADP a ATP mezi cytoplazmou a mitochondriální matrix. K syntéze jedné molekuly ATP se takto využívá energie uvolněná při transportu tří protonů z vnější strany vnitřní mitochondriální membrány do matrix. 126
SCHÉMA F0F1 ATP-SYNTÁZY A JEJÍ FUNKCE
Z uvedeného je zřejmé, že transport elektronů v dýchacím řetězci, redukce kyslíku spojená s produkcí vody a syntéza ATP oxidační fosforylací jsou procesy spřažené. Celkem na transport každého páru elektronů připadá vznik tří molekul ATP; z toho lze odvodit, že při úplné oxidaci jedné molekuly glukózy (včetně glykolýzy) může být syntetizováno 36 molekul ATP. Respirační řetězec a oxidační fosforylace jsou tedy vzájemně propojené složky aerobní respirace; změny v jedné složce se úměrně odrazí ve změnách druhé složky. Gradient protonů, který zde plní roli integrátoru těchto procesů, má obecnější význam. Lze ho považovat, podobně jako membránové gradienty i jiných iontů (např. sodných, draselných), za součást obecného principu vzájemné transformovatelnosti volné energie, na kterém jsou založeny energetické procesy v buňce. V mitochondriální matrix jsou obsaženy enzymy účastnící se významných biochemických drah, mezi něž patří citrátový cyklus, β- oxidace mastných kyselin a oxidace pyruvátu. Hlavním zdrojem pyruvátu je glykolýza. Glykolýza probíhá v cytosolu a pyruvát je jejím produktem. Do mitochondriální matrix se pyruvát dostává za účasti přenašečového systému, lokalizovaného ve vnitřní membráně. V matrix je mechanizmem oxidační dekarboxylace za účasti pyruvátdehydrogenázy a koenzymu NAD+ přeměněn na acetylkoenym A (acetylCoA) a oxid uhličitý. Tato ireverzibilní reakce propojuje metabolizmus sacharidů s metabolizmem lipidů. Acetylkoenzym A se pak může zapojit do citrátového cyklu.
127
Citrátový cyklus (synonyma: Krebsův cyklus, cyklus trikarboxylových kyselin) je všeobecně rozšířen u aerobních organizmů, u nichž je lokalizován v mitochondriální matrix. Začíná kondezací acetylkoenzymu A a oxalacetátu za produkce citrátu a koenzymu A (CoA-SH). V dalším stupni citrátového cyklu dochází k izomeraci citrátu na izocitrát. Izocitrát je dekarboxylován na 2-oxoglutarát, přičemž se uvolní molekula CO2 a redukuje se NAD+ na NADH + H+. Oxoglutarát z citrátového cyklu může být též využit k biosyntéze glutamátu a naopak, v případě potřeby může být glutamát zdrojem oxoglutarátu pro citrátový cyklus. Dekarboxylací 2-oxoglutarátu se uvolňuje další molekula CO2 a současně dochází k aktivaci dekarboxylovaného 2-oxoglutarátu koenzymem A na sukcinylkoenzym A a redukci další molekuly NAD+ na NADH + H+. V dalším kroku citrátového cyklu se mění sukcinylkoenzym A na sukcinát za současné obnovy koenzymu A a využití uvolněné energie k fosforylaci GDP na GTP. Sukcinylkoenzym A může též z citrátového cyklu vystoupit a být využit v biosyntetických procesech vedoucích k tvorbě porfyrinů. V citrátovém cyklu je sukcinát redukován na fumarát, přičemž akceptorem vodíku je v tomto úseku cyklu FAD, který přechází na FADH2. Podle potřeby může být citrátový cyklus suplementován fumarátem pocházejícím z močovinového cyklu. Fumarát je konvertován na malát a ten na oxalacetát za současné redukce NAD+ na NADH + H+. Regenerovaná molekula oxalacetátu může být pak opakovaně zapojena do další otočky citrátového cyklu. V případě, že jsou jednotlivé intermediáty citrátového cyklu utilizovány mimo tento cyklus, může být v buňce zajištěn přísun oxalacetátu z jiných zdrojů, např. karboxylací pyruvátu. Celkovou bilanci citrátového cyklu představuje: produkce jedné molekuly GTP, tří párů atomů vodíku ve formě tří molekul NADH + H+, jednoho páru atomů vodíku ve formě jedné molekuly FADH2, dvou molekul CO2 a redukce acetylkoenzymu A na koenzym A uplatňující se v cyklu též jako aktivátor (2-oxoglutarát → → sukcinylkoenzym A). Uvolněné atomy vodíku se jako NADH + H+ a FADH2 zapojují do respiračního řetězce, kde mohou být využity k produkci celkem 11 molekul ATP (9 molekul ATP za účasti tří molekul NADH + H+, dvě molekuly ATP za účasti molekuly FADH2). Protože GTP je ekvivalentní ATP, můžeme říci, že celková energetická bilance jedné otočky citrátového cyklu odpovídá 12 molekulám ATP. Z toho je zřejmé, že citrátový cyklus představuje velmi účinný mechanizmus uvolnění značného množství utilizovatelné energie. Kromě toho, jak již bylo naznačeno, mohou být intermediáty citrátového cyklu využity jako substráty v řadě jiných biochemických procesů (biosyntéza sacharidů, pyrimidinů, purinů, některých aminokyselin) a rovněž do citrátového cyklu mohou vstupovat produkty (resp. intermediáty) z jiných biochemických procesů (katabolizmus sacharidů, mastných kyselin, některých aminokyselin). Citrátový cyklus je tedy typickým amfibolickým dějem a kruciálním bodem v intermediárním metabolizmu. Variantou citrátového cyklu je tzv. glyoxalátový cyklus. Začíná a pokračuje až do stadia izocitrátu stejně jako citrátový cyklus, avšak molekula izocitrátu je následně štěpena na molekulu sukcinátu a glyoxalátu. Sukcinát může být dále využit jako substrát pro biosyntézu sacharidů. Glyoxalát reakcí s acetylkoenzymem A poskytuje malát za uvolnění (regenerace) koenzymu A. Malát může být dále konvertován (stejně jako v citrátovém cyklu) na oxalacetát. Glyoxalátový cyklus se vyskytuje v buňkách těch organizmů (nebo jejich částí), které utilizují jako hlavní zdroj uhlíku vyšší karboxylové (mastné) kyseliny a n-alkany (např. metanogenní bakterie, klíčící semena rostlin). Jejich odbouráním vznikají dvouhlíkaté fragmenty, které nemohou být využity pro biosyntézu sacharidů přímo. Jsou avšak tímto cyklem převedeny na sukcinát, který jako čtyřuhlíkatá organická sloučenina už může být zapojen do biosyntézy sacharidů. Glyoxalátovým cyklem se tak u organizmů s uvedeným typem metabolizmu řeší nedostatek tří- a čtyřuhlíkatých sloučenin vhodných pro glykogenezi. Glyoxalátový cyklus lze proto charakterizovat jako cyklus biosyntetických procesů.
128
SCHÉMA CITRÁTOVÉHO CYKLU
129
Matrix mitochondrií je rovněž místem degradace mastných kyselin procesem označovaným jako β – oxidace mastných kyselin. Nejprve je molekula mastné kyseliny aktivována převedením na acylkoenzym enzymaticky katalyzovanou reakcí s koenzymem A a za spotřeby dvou molekul ATP jako donora potřebné energie (protože ATP je hydrolyzováno až na AMP). Poté následuje oxidace na uhlíku β, probíhající ve třech krocích: dehydrogenace, při které se FAD jako akceptor vodíku redukuje na FADH2, hydratace a druhá dehydrogenace, při které je akceptorem vodíku NAD+ redukující se na NADH + H+; produktem těchto reakcí je β-oxoacylkoenzym A. Ten podléhá tiolytickému štěpení, při kterém se uvolní acetylkoenzym A jako dvouuhlíkatý fragment degradovaného řetězce mastné kyseliny a současně se na zbývající část řetězce mastné kyseliny napojí další molekula koenzymu A. Kromě počáteční aktivace mastné kyseliny na acylkoenzym A (ta se realizuje při β – oxidaci pouze jedenkrát a trvá po celou dobu degradace řetězce molekuly mastné kyseliny) se ostatní procesy cyklicky opakují tak dlouho, dokud není celý řetězec rozložen na dvouuhlíkaté fragmenty (acetylkoenzym A); tento cyklus se označuje jako Lynenova spirála. Při jedné otáčce Lynenovy spirály se získá jedna molekula acetylkoenzymu A, jedna molekula FADH2 a jedna molekula NADH + H+. Tyto redukované koenzymy jsou využity v respiračním řetězci, kde participují na tvorbě celkem pěti molekul ATP (dvě prostřednictvím FADH2, tři prostřednictvím NADH + H+). Včlenění acetylkoenzymu A, vznikajícího při β – oxidaci mastných kyselin, do citrátového cyklu povede k produkci dalších 12 molekul ATP. Na základě těchto údajů můžeme snadno vypočítat teoretickou hodnotu energetické bilance odbourání jedné molekuly určité konkrétní mastné kyseliny; nezapomeňme odečíst dvě molekuly ATP, které se spotřebují při počáteční aktivační reakci. Jestliže n je počet atomů uhlíku v řetězci molekuly mastné kyseliny, potom počet cyklů (otoček Lynenovy spirály) bude L = n/2 – 1 a počet uvolněných molekul acetylkoenzymů A (resp. acetylů) je A = n/2 a celkový zisk energie degradace jednoho řetězce mastné kyseliny bude E = 5(n/2 – 1) + 12(n/2) – 2. Vzhledem k tomu, že mitochondrie jsou místem realizace procesů aerobní respirace (a s ní spojené oxidační fosforylace), citrátového cyklu a β – oxidace mastných kyselin, tedy procesů velmi významných a efektivních z hlediska energetického metabolizmu, je pochopitelné, proč jsou označovány jako energetické centrum buňky. CELKOVÉ SCHÉMA ÚČASTI MITOCHONDRIÍ V BUNĚČNÉM METABOLIZMU
130
SPŘAŽENÍ HLAVNÍCH METABOLICKÝCH PROCESŮ V BUŇCE
Mitochondrie obsahují vlastní DNA (mtDNA), tzv. mitochondriální chromozom (genofor) prokaryotického typu (tedy bez spojení DNA s histony). V každé mitochondrii se zpravidla nachází větší počet krátkých (řádově 104 – 105 bp) kružnicových molekul mtDNA, představujících malý podíl (řádově jednotky procent) z celkového obsahu DNA v buňce. Jednotlivé molekuly mtDNA jsou v matrix zpravidla spojeny s vnitřní membránou (podobně jako bakteriální chromozom s cytoplazmatickou membránou). Mitochondriální DNA nese několik genů, které kódují některé specificky mitochondriální proteiny nebo jejich části, např. geny pro všechny tRNA, pro rRNA, cytochrom b, podjednotky ATPsyntázy, podjednotky cytochromoxidázy a další. Mitochondrie disponují vlastním proteosyntetickým aparátem. Ribozomy jsou prokaryotického typu (70S nebo přibližně 70S), rovněž iniciační aminokyselinou je N-formylmetionin (jako u bakterií). Jsou známy některé odchylky od univerzálního 131
genetického kódu, ke kterým dochází při expresi genetické informace v mitochondriích; například terminační kodon UGA může být čten jako kodon pro tryptofan, kodon AUA jako kodon pro metionin (namísto pro izoleucin). Je však zajímavé, zejména z evolučního hlediska, že odchylky od univerzálního kódu nejsou známy ze studií transkripce a translace genetické informace v mitochondriích rostlin. Rovněž je zajímavé, že některé mitochondriální geny (např. u kvasinek) obsahují introny, což je u recentních organizmů jev typický pro eukaryota, nikoli pro prokaryota. V těchto souvislostech je zřejmě možno uvažovat o složitých interakčních vztazích, které v průběhu evoluce jednotlivých skupin eukaryotických organizmů rezultovaly v ustavení specifické rovnováhy mezi genomem mitochondrií (a podobně chloroplastů) a jaderným genomem na bázi principu komplementarity a asymetrie. Lze si představit, že souběžně s evolucí jaderného genomu eukaryot koevolvoval genom mitochondrií a tím objasnit určitou variabilitu ve struktuře a funkcích mitochondriálního genomu jako důsledek divergence (kromě jiných možných explikací, např. hypotézou o opakovaném vzniku – tedy vícezdrojovém původu – mitochondrií). Mitochondrie se reprodukují dělením, čímž je zajištěna rovnoměrnost a kontinuita transmise jejich genetického materiálu. Nejedná se však o náhodnou distribuci mitochondriálních chromozomů (na rozdíl od distribuce jaderných chromozómů v průběhu mitózy), protože jednotlivé chromozomy jsou připojeny k vnitřní membráně mitochondrií a jsou tedy distribuovány v závislosti na tom, ve kterém místě se tato membrána zaškrtí a poté rozdělí vnitřní prostor mitochondrie. Mitochondrie tedy patří k těm membránovým organelám, které nevznikají de novo. Dělení mitochondrií se může uskutečnit v kterékoli fázi buněčného cyklu, relativně nezávisle (semiautonomně) na dělení celé buňky. Semiautonomie při dělení (ale i při jiných dějích) mitochondrií spočívá především v tom, že vlastní proteosyntézou produkují pouze menší část proteinů, které potřebují, kdežto většina z nich je kódována jadernými geny a syntetizována na cytoplazmatických ribozomech (např. DNA-polymerázy, RNA-polymerázy, některé enzymy katalyzující reakce intramitochondriálně lokalizovaných biochemických dějů). Cytoplazmatické proteiny, určené pro mitochondrie, jsou k nim přepravovány podle specifické signální sekvence o délce několika desítek aminokyselin na N-konci polypeptidového řetězce, která je rozpoznávána receptory mitochondriální membrány. Molekuly proteinů mohou být vzhledem k jejich velikosti a některým fyzikálně chemickým vlastnostem translokovány do mitochondrií jen v určité konformaci, kterou zajišťují chaperony (chaperon Hsp70). Translokace proteinových molekul se realizuje za využití energie elektrochemického gradientu vnitřní membrány. Chaperon, který navodil odpovídající konformaci proteinu před jeho translokací dovnitř mitochondrie, se odpojuje od tohoto proteinu za využití energie uvolněné hydrolýzou ATP. V mitochondriální matrix je pak adekvátní konformace proteinu zajištěna dalším chaperonem (Hsp60). Nejen proteiny, ale i některé další součásti mitochondrií jsou syntetizovány v cytoplazmě a transportovány k nim (např. membránové lipidy jsou syntetizovány v hladkém endoplazmatickém retikulu a k mitochondriím přepravovány patrně prostřednictvím tzv. proteinů přepravujících fosfolipidy).
132
X. PLASTIDY, FOTOSYNTÉZA A FOTORESPIRACE
X.1. PLASTIDY Plastidy jsou specifické semiautonomní organely rostlinných buněk. Podle obsahu barviv a funkce je můžeme klasifikovat do tří základních skupin: 1. BEZBARVÉ PLASTIDY - LEUKOPLASTY Jsou to plastidy, ve kterých se deponují (resp. i tvoří) zásobní látky: především polysacharid škrob (tzv. amyloplasty), některé lipidy (tzv. oleoplasty) a proteiny (tzv. proteoplasty). Leukoplasty jsou proto hojné zejména v zásobních orgánech rostlin (kořeny, plody); kromě této lokalizace se nacházejí též v buňkách čepičky vzrostného vrcholu kořene. 2. ZBARVENÉ PLASTIDY NEFOTOSYNTETIZUJÍCÍ - CHROMOPLASTY Jsou to plastidy, které obsahují lipofilní barviva, tzv. lipochromy, ke kterým náleží karotenoidy: červené karoteny a žluté xantofyly. Akumulace těchto barviv a jejich vzájemný poměr podmiňují zbarvení květů, plodů, případně dalších částí rostlin (např. kořen u mrkve). V chloroplastech se karotenoidy uplatňují jako doplňková barvibva při fotosyntéze. 3. ZBARVENÉ PLASTIDY FOTOSYNTETIZUJÍCÍ - CHLOROPLASTY Jsou to plastidy, které obsahují především lipofilní barvivo (lipochrom) chlorofyl, přesněji řečeno, některé z jeho molekulárních typů, a v menším množství další barviva ze skupiny karotenoidů. Chloroplasty jsou membránové organely rostlinných buněk specializované na uskutečňování fotosyntézy. V každém chloroplastu jsou přítomny tři membrány: vnější obalová, vnitřní obalová a membrána tylakoidů. V souladu s endosymbiotickou hypotézou původu chloroplastů v eukaryotických buňkách se vnější obalová membrána odvozuje od membránových útvarů prapůvodní hostitelské eukaryotické buňky (resp.buněk), které obklopily, uzavřely a tak oddělily od ostatního intracelulárního prostředí fototrofní prokaryotický (cyanobakteriální ?) organizmus jako svého permanentního endosymbionta. Vnitřní obalová membrána a membrány tylakoidů jsou považovány za membrány prokaryotického původu. Ve vnitřní membráně jsou zabudovány integrální proteiny, které se významně podílejí na regulaci transportu různých nízkomolekulárních látek a též proteinů syntetizovaných v cytoplazmě, avšak určených pro chloroplasty. Tylakoidy jsou uspořádány do útvarů nazývaných grana. Membrány tylakoidů mladého chloroplastu vznikají jako deriváty vnitřní obalové membrány, se kterou však později už nejsou v přímém kontaktu. Membrány tylakoidů obsahují některé lipidy, které nejsou obvyklé u jiných buněčných membrán (např. u membrány cytoplazmatické); z celkového množství lipidů zde na fosfolipidy připadá jen asi 10%, největší podíl (kolem 80%) zaujímají nepolární mono- a digalaktozyldiacylglyceroly, zbytek (asi 10%) sulfolipidy (sulfochinovosyldiacylglyceroly). Acylové řetězce těchto typů lipidů obsahují velký počet nenasycených vazeb a tím se podílejí na tekutější konzistenci membrán. Součástí tylakoidních membrán jsou, mimo jiné, komplexy proteinů, nezbytných pro průběh tzv. primární (světelné) fáze fotosyntézy: fotosystém I s příslušným LHC-I (light harvesting complex), fotosystém II s příslušným LHC-II, cytochromy (b, f) a ATPsyntáza. Tylakoidní membrány jsou obklopeny tekutým prostředím, stromatem, ve kterém jsou obsaženy enzymy nutné pro tzv. sekundární (temnotní) fázi fotosyntézy, tedy pro zapojení oxidu uhličitého do Calvinova cyklu, jehož prostřednictvím vstupuje do biochemických dějů, kterými je postupně konvertován na molekuly organických sloučenin (sacharidů). 133
CHLOROPLAST
Ve stromatu chloroplastu se nachází též chloroplastová DNA (ctDNA) prokaryotického typu. Strukturní geny, nesené ctDNA, obsahují genetickou informaci o primární struktuře některých proteinů specifických pro chloroplasty. Tyto geny se exprimují v chloroplastech prostřednictvím vlastního proteosyntetického aparátu prokaryotického typu (ribozomy 70S). Ostatní chloroplastové proteiny jsou kódovány jadernými strukturními geny, které se transkribují v buněčném jádru, translatují v cytoplazmě a produkty translace se přepravují do chloroplastu. V lumen chloroplastu, ohraničeném tylakoidními membránami, jsou lokalizovány četné váčky, většinou vzájemně propojené. Některé z nich patrně plní funkci transportních váčků při přepravě látek z vnitřní obalové membrány do membrán tylakoidů. Transportní funkci mezi vnitřní obalovou membránou a membránami tylakoidů plní též retikulum, které v tomto prostoru chloroplastů vytváří relativně stabilní strukturu.
X.2. FOTOSYNTÉZA Obecně je možné fotosyntézu vymezit jako systém procesů, kterými je světelná energie transformována v energii chemických vazeb. Z hlediska chemického se jedná o přeměnu (redukci) oxidu uhličitého na organickou sloučeninu (monosacharid); taková přeměna je celkově dějem silně endergonickým, pro který je donorem energie sluneční záření, absorbované buněčnými fotoreceptory, a redukčním činidlem vodík, uvolňovaný z anorganické látky. Světelná energie je absorbována asimilačními pigmenty: chlorofyly (a, b, u baktérií bakteriochlorofyly a, b, c, d, e, g; lipofilní barviva ), karotenoidy (β-karoten, xantofyly) a fykobiliny (červený fykoerytrin, modrý fykocyanin a alofykocyanin). Fotosyntetizovat mohou pouze buňky rostlin a některých prokaryotických organizmů (sinice, zelené a purpurové bakterie).
134
SCHÉMA MOLEKULY CHLOROFYLU
V přírodě se vyskytují dva základní typy fotosyntézy: anoxygenní a oxygenní. ANOXYGENNÍ fotosyntézu uskutečňují fotosyntetizující gramnegativní bakterie, které se řadí do řádu Rhodospirillales se třemi čeleděmi: Rhodospirillaceae (purpurové nesirné bakterie), Chromatiaceae (purpurové sirné bakterie) a Chlorobiaceae (zelené sirné bakterie). Bakteryochlorofyl anoxygenních fototrofních bakterií je lokalizován buď na intracytoplazmatických membránách odvozených od cytoplazmatické membrány (Rhodospirillaceae, Chromatiaceae), v chlorozomech (váčky obalené jednoduchou lipidovou membránou a připojené k cytoplazmatické membráně; Chlorobiaceae), nebo v cytoplazmatické membráně (bakterie s chlorofylem g, např. Heliobacterium). Tyto bakterie (stejně jako prochlorofyta) neobsahují fotosyntetické pigmenty typu fykobilinů. Donorem vodíku jsou jiné anorganické látky než voda (např. H2S) a žádným z vedlejších produktů oxidace není kyslík; všechny fotosyntetické procesy probíhají za anaerobních podmínek. Zástupci čeledi Rhodospirillaceae (např. Rhodospirillum, Rhodomicrobium, Rhodopseudomonas) obsahují bakteriochlorofyl a nebo b a některé karotenoidy (spiriloxantiny, ketokarotenoidy sferoidenonového typu, rodopinoly). I když druhy bakterií, řazené do této čeledi, jsou převážně fotoorganotrofní, mohou asimilovat CO2 za využití některých organických látek jako zdroje elektronů (pyruvát, acetát, fumarát, sukcinát apod.). Zástupci čeledi Chromatiaceae (např. Chromatium, Thiocystis, Thiosarcina, Thiospirillum, Thiocapsa) jsou většinou mixotrofní (tj. fototrofní i fotoorganotrofní). Při fototrofii využívají jako donor elektronů (vodíku) k redukci CO2 sirovodík nebo síru, některé druhy i molekulární vodík, při fotoorganotrofii využívají jako zdroj elektronů k asimilaci CO2 některé jednoduché organické látky (např. pyruvát, acetát). Konečným oxidačním produktem sirovodíku je síran. Purpurové sirné bakterie obsahují bakteriochlorofyl a nebo b a některé karotenoidy (spiriloxantiny, okenony, rodopinoly). 135
Zástupci čeledi Chlorobiaceae (např. Chlorobium, Chloropseudomonas, Pelodiction, Prosthecochloris) jsou většinou mixotrofní. Při fotolitotrofních reakcích využívají k redukci CO2 jako donor elektronů sirovodík nebo síru, při fotoorganotrofních reakcích využívají jako zdroj elektronů při asimilaci CO2 některé organické látky (pyruvát, acetát). Zelené sirné bakterie obsahují bakteriochlorofyl c nebo d a nepatrné množství bakteriochlorofylu a, některé druhy též bakteriochlorofyl e. Bakteriochlorofyly jsou uloženy v tzv. chlorobiových váčcích. Z karotenoidů obsahují chlorobakteny. Bakteriochlorofyly jsou klasifikovány podle odlišností ve stavbě molekuly, týkajících se jednotlivých substituentů na různých místech molekuly a vazby mezi C3 – C4 druhého pyrolového jádra. Zároveň se podle týchž znaků liší všechny bakteriochlorofyly od chlorofylu a nebo b rostlin. Strukturní odlišnosti ve stavbě jednotlivých typů bakteriochlorofylů mají za následek posuny v rozsahu vlnových délek, při kterých absorbují světlo a diference hodnot vlnových délek absorpčních maxim, charakteristických pro jednotlivé typy chlorofylů. Obecně platí, že bakteriochlorofyly absorbují světelné záření ve dvou oblastech spektra: fialové (λ ~ 400 nm) a červené až infračervené (λ ~ 600 – 800 nm). SCHÉMA ABSORPCE SVĚTELNÉ ENERGIE ASIMILAČNÍMI PIGMENTY
136
OXYGENNÍ fotosyntézu uskutečňují sinice a rostliny. K redukci CO2 je vždy využíván vodík uvolněný při fotolýze vody a vedlejším produktem je kyslík. Oxygenní fotosyntéza je hlavním zdrojem kyslíku v atmosféře. V podstatě veškerý atmosférický kyslík pochází z činnosti fotosyntetizujících organizmů. Fotosyntéza měla zásadní význam v evoluci, neboť zvyšující se podíl kyslíku v biosféře působil jako silný selekční faktor ve prospěch vývoje aerobních organizmů.
OBECNÉ SCHÉMA OXYGENNÍ FOTOSYNTÉZY
Mezi oxygenní prokaryotické fotoautotrofy jsou patří Prochlorophyta, která obsahují chlorofyl a i chlorofyl b (nikoli fykobiliny), fixovaný k intracelulárnímu systému tylakoidních membrán, a Cyanobacteria, která obsahují fotosyntetické pigmenty (chlorofyl b, karotenoidy, fykobiliny ve formě fykobiliproteinů, tj. fykobilinů vázaných na specifické bílkoviny) v chlorozomech a fykobilizomech, navázaných na cytoplazmatický lamelární membránový systém. Fykobiliny jsou v buňkách prokaryotických oxygenních fototrofů sdruženy s chlorofyly, k jejichž reakčním centrům směrují energii slunečního záření, absorbovanou v modré oblasti spektra. Fotosyntéza probíhá ve dvou fázích: primární (světelné) a sekundární (temnotní), přičemž každá v jiné části chloroplastu. U eukaryot se reakce světelné fáze uskutečňují na membránách tylakoidů, fáze temnotní ve stromatu chloroplastů. 137
A. Primární (světelná) fáze probíhá na světle a uskutečňuje se prostřednictvím fotosyntetického aparátu. Fotosyntetický aparát sestává z fotoreceptorů (tj. pigmentů absorbujících světelné záření – chlorofyl a, chlorofyl b, karotenoidy), fotosyntetického reakčního centra (tvořeného u rostlin jednou molekulou nebo několika molekulami chlorofylu a a transformujícího energii světelnou na energii excitovaných elektronů) a soustavy oxidoreduktáz (transformujících energii excitovaných elektronů na energii chemických vazeb). Ve světelné fázi se tedy realizuje fotochemická přeměna energie slunečního záření na energii chemických vazeb. V průběhu tohoto procesu se světelná energie, absorbovaná chloroplastovými fotoreceptory (pigmenty), transformuje prostřednictvím fotosyntetického reakčního centra na energii elektrickou (energii excitovaných elektronů), která se účinkem soustavy oxidoreduktáz utilizuje při syntéze ATP a NADPH + H+. Děje světelné fáze fotosyntézy lze schematicky rozdělit do čtyř etap: (1) absorpce slunečního záření fotoreceptorem a excitace elektronů fotoreceptoru (2) fotolýza vody: H2O → 2H+ + 2e + 1/2O2 ↓ (3) fotoredukce NADP+: NADP+ + 2H+ + 2e → NADPH + H+ Protony (2H+) v této reakci pocházejí z fotolýzy vody, z níž byly uvolněny po proběhlých procesech uvedených v bodě (1). protonový (4) fotofosforylace: ADP + Pi ──────────> ATP + H2O gradient Elektrony uvolněné v uvedených dějích jednak redukují NADP+ na NADPH + H+, jednak vytvářejí eklektrochemický potenciál, jehož energie se využívá k transportu protonů (H+) ze stromatu chloroplastu do tylakoidů. Obdobně se uvolněné protony podílejí jednak na redukci NADP+ na NADPH + H+, jednak jsou donory energie k syntéze ATP z ADP; tato energie se uvolňuje při toku protonů po koncentračním spádu (usnadněnou difuzí) z tylakoidů zpět do stromatu chloroplastu. Na průběhu světelné fáze fotosyntézy participují dva fotosystémy: fotosystém I (PS I) a fotosystém II (PS II) kooperující v sériovém uspořádání. Fotosystém I je komplex sestávající z určitého početu bílkovinných molekul, spojených řádově se stovkou molekul chlorofylu a. Většina z takto vázaných molekul chlorofylu a tvoří část fotosystému označovanou jako anténa (LHC I) a zpravidla pouze jedna molekula je součástí tzv. reakčního centra (P700). /Index 700 u písmene P udává vlnovou délku absorpčního maxima/. Molekuly chlorofylu antén absorbují světelnou energii a přenášejí ji ve formě energie excitovaných elektronů do reakčního centra, v němž je využita k excitaci elektronu molekuly chlorofylu. Každá jednotka fotosystému I obsahuje ještě řádově desítky molekul karotenoidů, několik molekul lipidů, FeS proteinů a fyllochinonů. Fotosystém II je komplex sestávající z molekul různých proteinů, spojených s větším počtem molekul chlorofylu a, z nichž opět obvykle pouze jedna je součástí reakčního centra (P680), kdežto ostatní jsou spolu s přítomnými molekulami karotenoidů součástí antény (LHC II). Fotosystém II obsahuje ještě molekuly plastochinonu. S každým fotosystémem je tedy spojena činnost odpovídajícího světlosběrného komplexu LHC-I, resp. LHC-II (1ight harvesting complex), přičemž každý z nich se podílí svými fotosyntetickými pigmenty především na nasměrování světelné energie k reakčnímu centru fotosystému. Poznamenejme, že molekuly chlorofylu jako takové nemohou absorbovanou
138
světelnou energii převést na energii využitelnou buňkou; toho jsou schopny pouze ve spojení s vhodnými proteiny nacházejícími se na membráně tylakoidů.
OBECNÉ SCHÉMA FOTOSYSTÉMU
V primární (světelné) fázi fotosyntézy je nejprve fotosyntetickými pigmenty antén obou fotosystémů absorbováno světelné kvantum. Absorbovaná energie světelného záření je převedena do reakčního centra P680 fotosystému II a do reakčního centra P700 fotosystému I. Molekula každého reakčního centra je schopna přijmout energii fotonu (E = hν, h = Planckova konstanta, ν = kmitočet světla) a přejít do excitovaného stavu. Z takto aktivovaného reakčního centra P680 fotosystému II je uvolněn elektron a přenesen nakonec až na plastochinon (E ~ 0,00V); elektronegativita P680 postačuje k tomu, aby byly uvolněny elektrony z molekuly vody (fotolýza; E ~ +1,8V). Tyto elektrony jsou přepraveny k systému oxidoreduktáz (transelektronáz), kde jsou převedeny přes plastochinon (PQ) ke komplexu cytochromů b6/f, který zprostředkuje jejich přechod na plastocyanin fotosystému I; tímto způsobem jsou oba fotosystémy funkčně propojeny. Energie uvolněná při přechodu plastochinon – komplex cytochromů b6/f – plastocyanin se utilizuje v chemiosmotických procesech, při nichž se převodem protonů ze stromatu chloroplastu do tylakoidů vytvoří elektrochemický gradient, který se využije ke generování ATP. Aktivace P700 ve fotosystému I umožní převod elektronů z komplexu cytochromů b6/f přes plastocyanin (PC, E ~ +0,4V) na ferredoxin (Fd, E ~ -0,5V). V tomto místě mohou být elektrony využity k redukci NADP+ na NADPH + H+. 139
SCHÉMA ABSORPCE SVĚTELNÉ CHLOROFYLU
ENERGIE
A
EXCITACE
MOLEKULY
Popsaný proces přenosu elektronů je doprovázen syntézou ATP za účasti ATPsyntázy, označovaný jako necyklická fosforylace. Energie, která se uvolní při překonání gradientu mezi PII a PI, je využita komplexem cytochromů b6/f k aktivnímu transportu protonů ze stromatu dovnitř tylakoidů. V důsledku toho se vytvoří elektrochemický gradient. Při jeho vyrovnání putují protony po spádu z tylakoidů do stromatu přes komplex ATPsyntázy. A právě energie, která se při tomto zpětném transportu protonů uvolní, se využije (podobně jako v mitochondriích) k syntéze ATP. Syntéza ATP se tedy v tomto případě realizuje na principu chemiosmózy. Při necyklické fosforylaci je energie excitovaných elektronů fotosystémů deponována do NADPH + H+, který se v sekundární (temnotní) fázi fotosyntézy uplatní jako redukční činidlo při redukci CO2. Excitované elektrony se tedy nevracejí zpět do molekuly chlorofylu, ale využívají se k redukci NADP+ ; k regeneraci molekuly chlorofylu slouží elektrony uvolněné při oxidaci jiné látky. Tok elektronů při necyklické fosforylaci je oxidoredukční proces, představující přenos 2H+ + 2e z redukovaného donoru na oxidovaný akceptor. Kromě necyklické fosforylace probíhá cyklická fosforylace. V tomto případě po absorpci fotonů dochází k uvolnění excitovaných elektronů z molekuly reakčního centra, elektrony projdou soustavou transelektronáz o zvyšujícím se redoxním potenciálu a posléze se vrátí do základního stavu v molekule reakčního centra. Při přechodu excitovaných elektronů do základního stavu se část uvolněné energie využije pro současně probíhající syntézu ATP při uplatnění chemiosmotického principu (analogicky jako v případě necyklické fosforylace). Protože transport elektronů začíná i končí v téže molekule chlorofylu, hovoří se o cyklické fosforylaci.
140
SCHÉMA PROCESŮ PŘI PRIMÁRNÍ (SVÉTELNÉ) FÁZI FOTOSYNTÉZY
Při fotosyntéze oba fotosystémy interagují. Fotosystém II (resp. jím indukovaný tok elektronů) se podílí na fotolýze vody, přenosu elektronů transelektronázovým systémem a vytváří gradient protonů, využitelný při syntéze ATP. Fotosystém II je regenerován elektrony uvolněnými fotolýzou vody. Tok elektronů, zprostředkovaný fotosystémem I, se využije při tvorbě NADPH + H+ a při tzv. zkratové cestě ATP. Fotosystém I je regenerován elektrony fotosystému II po uvolnění jejich energie. Jako zkratová cesta syntézy ATP se označuje syntéza ATP v zásadě shodná s cyklickou fosforylací. Rozdíl spočívá v tom, že je zajišťována pouze fotosystémem I (tj. bez jeho kooperace s fotosystémem II); proto nedochází ani k tvorbě NADPH + H+. Fotosyntetizující bakterie jsou vybaveny pouze fotosystémem I (PI), což vysvětluje jejich neschopnost využít molekul vody jako zdroje elektronů a tím i anoxygenní typ jimi realizované fotosyntézy. Fotosyntetický aparát sinic obsahuje oba fotosystémy (PI i PII) a jako asimilační pigmenty chlorofyl a a chlorofyl b (stejně jako eukaryotické rostlinné buňky); proto je fotosyntéza těchto prokaryotických organizmů oxygenní a v hlavních rysech shodná s fotosyntézou rostlin. V souladu s tím se v rámci endosymbiotické teorie původu chloroplastů a mitochondrii předpokládá, že předchůdcem chloroplastů byla původně samostatně žijící sinice. Některé rozdíly mezi chloroplasty a mitochondriemi svědčí pro to, že předchůdcem mitochondrií byl samostatně žijící mikroorganizmus blízký skupině dnešních α-proteobakterií (riketsií).
141
SCHÉMA SPŘAŽENÍ FOTOSYSTÉMU I (PS I) A FOTOSYSTÉMU II (PS II)
B. Sekundární (temnotní) fáze fotosyntézy se realizuje paralelně se světelnou fází fotosyntézy (případně i mimo ni) ve stromatu chloroplastů. V sérii reakcí, ve kterých je redukován oxid uhličitý na molekuly organických látek (sacharidů), se využívá energie a redukčních látek, syntetizovaných v průběhu světelné fáze (ATP, NADPH+H+). Základní mechanizmus, který se při tom uplatňuje, představuje tzv. Calvinův cyklus. Tento cyklus začíná fixací CO2, která se uskutečňuje reakcí oxidu uhličitého s ribulóza-1,5-bisfosfátem za katalýzy ribulóza-1,5-bisfosfátkarboxylázou-oxigenázou (RubisCO); vznikne nestabilní šestiuhlíkatá sloučenina, jejíž molekula se rozpadá na dvě molekuly 3-fosfoglycerátu představující aktivovaný CO2. V dalším stupni cyklu je 3-fosfoglycerát redukován na glyceraldehyd – 3 – fosfát. Ze dvou molekul glyceraldehydfosfátu se syntetizuje molekula hexózy (glukózy) za utilizace ATP a NADPH+H+. V poslední fázi Calvinova cyklu je regenerován ribulóza-1,5-bisfosfát (akceptor CO2) procesy, odpovídajícími obrácenému chodu regenerační fáze pentózového cyklu. V souladu se stechiometrickými koeficienty zjednodušené sumární rovnice fotosyntézy (6CO2 + 6H2O −−> C6H12O6 + 6O2) vznikne v Calvinově cyklu ze šesti molekul CO2 dvanáct tříuhlíkatých molekul (3-fosfoglycerát, glyceraldehyd-3-fosfát), z nichž pouze dvě jsou využity k syntéze hexózy (glukózy) a zbývajících deset molekul (pět hexóz) se spotřebuje na regeneraci šesti molekul pentózy ribulóza-1,5-bisfosfátu. Vzniklá molekula hexózy (glukózy) může být v buňce dále využita k syntéze tranzitních a zásobních polysacharidů (škrob, celulóza), k syntéze disacharidů (sacharóza), nebo je podrobena glykolýze, jejíž produkty (pyruvát a jeho dekarboxylací vzniklý acetylkoenzym A) mohou být zapojeny do celé řady metabolických procesů. Z nich je pro autotrofní organizmy 142
charakteristická syntéza všech základních aminokyselin z anorganického zdroje dusíku (případně i síry), pyruvátu, glykolátu a některých metabolitů cyklických biochemických procesů. Jednotlivé aminokyseliny pak mohou být konvertovány na další biologicky aktivní organické dusíkaté sloučeniny. Autotrofní metabolizmus umožňuje fototrofním organizmům syntetizovat z anorganických zdrojů veškeré jejich strukturní a funkční komponenty.
SCHÉMA CALVINOVA CYKLU
Kromě Calvinova cyklu existuje u některých druhů rostlin (kukuřice, proso, cukrová třtina) ještě jiná cesta utilizace oxidu uhličitého, tzv. Hatchův – Slackův cyklus. Akceptorem CO2 je v tomto cyklu fosfoenolpyruvát, který za katalýzy fosfoenolpyruvátkarboxylázy (PEPC) a spotřeby energie, poskytované ATP, vede k tvorbě malátu. Malát může být dále utilizován v buňkách, ve kterých byl syntetizován, nebo je transportován do jiných buněk a v nich dekarboxylován. Dekarboxylací uvolněný CO2 je zapojen do Calvinova cyklu a regenerovaný pyruvát může být transportován zpět a zapojen do nového Hatchova-Slackova cyklu.
143
Podle prvního produktu fotosyntézy se klasifikují rostliny do dvou skupin: C3 – rostliny, kde je tímto produktem 3-fosfoglycerát, a C4-rostliny, kde jím je malát. V C4 rostlinách jsou prostorově separovány děje Calvinova cyklu od dějů HatchovaSlackova cyklu. Buňky mezofylu, lokalizované blízko povrchu listů, neobsahují RubisCO a proto nemohou zapojit přijatý CO2 do Calvinova cyklu. Přijatý CO2 je v těchto buňkách konvertován v Hatchově-Slackově cyklu na malát (případně jinou čtyřuhlíkatou sloučeninu), který je transportován přes plazmodezmy do hlouběji uložených buněk pochev cévních svazků, kde je dekarboxylován. Tyto buňky obsahují RubisCO a proto za jeho katalytického účinku může být uvolněný CO2 zapojen do Calvinova cyklu. Regenerovaný pyruvát může být transportován zpět do buněk mezofylu a po fosforylaci na fosfoenolpyruvát využit v dalším Hatchově-Slackově cyklu.
SCHÉMA FOTOSYNTETICKÝCH PROCESŮ U C4 ROSTLIN
Kromě C3 a C4 rostlin existují ještě tzv. CAM rostliny (crassulacean acid metabolism), které představují jakousi přechodnou skupinu. V CAM rostlinách jsou časově separovány děje Calvinova cyklu od dějů Hatchova-Slackova cyklu. Taková separace rozdílných mechanizmů utilizace CO2 je formou ekologické adaptace některých druhů tropických rostlin stanovišť s vysokou intenzitou slunečního světla, vysokou denní teplotou a nízkou relativní vlhkostí (především z čeledí Crassulaceae, Cactaceae a Bromeliaceae). Tyto rostliny přijímají CO2 ze vzduchu hlavně večer a v noci, kdy mají otevřené průduchy (přes den mívají průduchy zavřené jako fyziologickou ochranu před nadměrnými ztrátami vody transpirací a zároveň před nadměrnou difuzí atmosférického kyslíku dovnitř rostliny). V buňkách je CO2 redukován v Hatchově-Slackově cyklu reakcí s fosfoenolpyruvátem přes oxalacetát na malát. Malát se v noci akumuluje v centrální vakuole. Ráno se z centrální vakuoly uvolňuje, dekarboxyluje a uvolněný CO2 se v týchž buňkách redukuje prostřednictvím Calvinova cyklu.
144
POROVNÁNÍ FOTOSYNTETICKÝCH PROCESŮ U C4 A CAM ROSTLIN
X.3. FOTORESPIRACE RubisCO vykazuje jednak karboxylázovou katalytickou aktivitu při reakci CO2 s ribulóza-1,5-bisfosfátem, jednak oxygenázovou aktivitu při oxidaxi ribulóza-1,5-bisfosfátu kyslíkem. Poměr mezi oběma těmito katalytickými aktivitami odráží poměr koncentrací CO2 a O2 v daném prostředí. Je-li koncentrace CO2 vyšší než koncentrace O2, převažuje karboxylázová aktivita nad oxygenázovou a naopak, je-li koncentrace CO2 nižší než koncentrace O2, převažuje oxygenázová aktivita RubisCO nad jeho aktivitou dekarboxylázovou. S touto dvojí úlohou RubisCO souvisí jev, označovaný jako fotorespirace. 145
Při fotorespiraci RubisCO katalyzuje oxidaci ribulóza-1,5-bisfosfátu kyslíkem za vzniku nestabilního meziproduktu, který se štěpí na molekulu 3-fosfoglycerátu a na molekulu 2-fosfoglykolátu. 3-fosfoglycerát se může zapojit do Calvinova cyklu. Glykolát se dostává do peroxizomů (glyoxizomů), kde je oxidován za katalytického účinku glykolátoxidázy na glyoxylát, který je z velké části metabolizován na CO2. Menší podíl glyoxylátu se může (v mitochondriích) stát substrátem pro biosyntézu glycinu a serinu (za uvolnění CO2); reakcemi, zahrnujícími též fosforylaci (zdroj ATP) a redukci (za využití NADPH+H+) serinu může být recyklován 3-fosfoglycerát. Fotorespiraci nelze považovat za variantu normální respirace nebo ji za ni zaměňovat. Fotorespirace je katabolický proces, který se na rozdíl od respirace realizuje výhradně na světle, nevede k syntéze ATP, ani NADPH+H+ a je závislý na dostupnosti kyslíku (nikoli na dostupnosti ATP); při fotorespiraci se projevuje inhibiční účinek kyslíku na fotosyntézu. Z tohoto hlediska lze vznik C4 rostlin považovat za evoluční mechanizmus suprese fotorespirace.
X.4. FOTOSYNTÉZA A RESPIRACE Z hlediska energetické bilance (nikoli z hlediska reakčních mechanizmů) lze fotosyntézu a buněčnou respiraci považovat za dva procesy, probíhající v opačných směrech. hν, chlorofyl 6CO2 + 6H2O <−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−> C6H12O6 + 6O2 Respirace je proces exergonický, při kterém se oxidací 1 molu glukózy uvolní 686 kcal energie ( ∆G0 = - 686 kcal); tato hodnota představuje rozdíl mezi energií potřebnou k rozštěpení vazeb reaktantů (glukóza, kyslík) a energií uvolněnou při tvorbě vazeb produktů (oxid uhličitý, voda). Fotosyntéza je proces silně endergonický; fotosyntetická produkce 1 molu glukózy vyžaduje dodání 686 kcal energie (∆G0 = + 686 kcal). Celkové porovnání základních charakteristik mezi fotosyntézou a respirací je uvedeno v následující tabulce:
lokalizace reaktanty produkty metabolický proces probíhá
fotosyntéza buňky s chloroplasty (fotosyntet. pigmenty) CO2 + H2O C6H12O6 + O2 anabolický (produkce biomasy) pouze na světle
146
respirace jakékoli buňky C6H12O6 + O2 CO2 + H2O katabolický (spotřeba biomasy) na světle i ve tmě
Komentář:
XI. BUNĚČNÁ STĚNA Buněčná stěna se vyskytuje jako povrchový útvar u bakterií, rostlin a hub. BUNĚČNÁ STĚNA PROKARYOT Základem buněčné stěny prokaryot je peptidoglykanová kostra. Specifické strukturní odlišnosti bakteriální buněčné stěny existují mezi bakteriemi Gram-pozitivními (G+) a Gram-negativními (G+). Obecně plní buněčná stěna funkce ochranné (mechanická opora, ochrana před mechanickým poškozením, ochrana před osmotickou lýzí, ochrana před účinkem imunitního systému hostitel). BUNĚČNÁ STĚNA HUB Buněčná stěna se nevyskytuje u všech druhů hub. Pokud je vytvořena, obsahuje chitin nebo celulózu. Obdobně jako buněčné stěny prokaryot a rostlin plní zejména ochrannou funkci. BUNĚČNÁ STĚNA ROSTLIN Buněčná stěna rostlin obsahuje lineární molekuly celulózy navzájem propojené vodíkovými vazbami; tím uspořádáním vznikají poměrně dlouhá, pevná vlákna, která se nacházejí v prostředí několika dalších polymerních látek, zejména pektinů a ligninu. Buněčná stěna tak zajišťuje pevnost buněk a v určitém rozsahu podmiňuje jejich tvar. Rovněž omezuje pronikání vody do buněk v hypotonickém prostředí; v důsledku toho vzniká vnitřní tlak rostlinných pletiv, tzv. turgor . Zajišťuje pevnost buněk a v určitém rozsahu podmiňuje jejich tvar. U rostlin se rozlišuje jednak primární a sekundární buněčná. Primární buněčná stěna přiléhá ke střední lamele, která spojuje stěny sousedních buněk. Primární buněčná stěna je perforovaná, přičemž v místech otvorů se nacházejí plazmodezmy zprostředkující styk (propojení) mezi sousedními buňkami. Kromě toho je významným znakem primární buněčné stěny značná pružnost a schopnost plošně se zvětšovat přikládáním mikrofibril celulózy, což vede k prodlužování buněk při růstu; proto je primární stěna typická pro parenchymatická a meristematická pletiva. Pro buňky mechanických a vodivých pletiv (např. sklerenchym, kolenchym, xylém) je charakteristická sekundární buněčná stěna, která bývá zpravidla značně silnější než primární stěna. Sekundární buněčná stěna vzniká tzv. tloustnutím, tj. přikládáním nových vrstev lignifikované celulózy; tak vzniká poměrně rigidní útvar, který mechanicky zpevňuje příslušné rostlinné pletivo. Tloustnutí může být omezeno pouze na některá místa buněčné stěny, což má za následek její nestejnoměrnou tloušťku; ztenčená místa se označují jako tečky a procházejí jimi plazmodezmy. Mohutný rozvoj sekundární buněčné stěny může vést k odumření protoplastu. Bližší údaje k tématu buněčných stěn jsou uveny v podkapitole Fylogeneze a klasifikace organizmů
147
BUNĚČNÁ STĚNA ROSTLIN
148
XII. VAKUOLY Vakuoly jsou vnitřní prostory buněk ohraničené od okolního prostředí jednoduchou, selektivně permeabilní membránou zvanou tonoplast. 1. VAKUOLY V BUŇKÁCH ROSTLIN Mladé rostlinné buňky většinou obsahují objemově menší vakuoly, které zpravidla postupně splývají v jednu rozměrnou centrální vakuolu. Obsah vakuol, tzv. buněčná šťáva, představuje vodný roztok širokého spektra anorganických i organických látek rozpustných ve vodě. Patří mezi ně četné intermediáty buněčného metabolizmu, produkty sekundárního metabolizmu (např. alkaloidy, třísloviny, některá barviva – ve vodě rozpusné antokyany náležející k tzv. hydrochromům) a látky zásobní (např. některé polysacharidy a lipidy). S tím souvisí i různé funkce, které vakuoly plní; mezi hlavní je možno zařadit deponování některých produktů metabolizmu (např. bílkovin v semenech), odpadních látek a sekundárních metabolitů (např. alkaloidů), nebo udržování buněčného turgoru, který je pro život rostliny velmi důležitý (při snížení turgoru, např. vlivem hypertonického prostředí, dochází k plazmolýze: voda difunduje z buněk do vnějšího prostředí, cytoplazmatická membrána se odlučuje od buněčné stěny a rostlina uvadá). 2. VAKUOLY V BUŇKÁCH PROTISTŮ V buňkách mnohých protistů se nacházejí zpravidla funkčně modifikované vakuoly. Jedná se jednak o tzv. potravní vakuoly, které se podílejí na zpracování (trávení) přijaté potravy a v buňce existují pouze dočasně, jednak o tzv. pulzující vakuoly, které se u sladkovodních protistů významně podílejí na regulaci stálosti vnitřního prostředí tím, že v nich akumulovanou vodu podle potřeby vypuzují do vnějšího prostředí a tím udržují osmotický tlak v rozsahu přijatelných hodnot. 3. VAKUOLY V BUŇKÁCH ŽIVOČICHŮ V řadě typů živočišných buněk je přítomnost vakuol normálním jevem (např. tukem vyplněné vakuoly tukových buněk, vakuoly obsahující trávicí enzymy v některých buňkách trávicího ústrojí, vakuoly buněk mléčné žlázy akumulující kapénky mléka, kožní pigmentové buňky akumulující pigment melanin apod.). Za zvláštní případ specializovaných vakuol lze označit synaptické váčky neuronů obsahující neuromediátory. V mnoha jiných případech však může být přítomnost vakuol v živočišných buňkách projevem probíhajících cytopatologických procesů.
149
VAKUOLA ROSTLINNÉ BUŇKY
150
XIII. EXTRACELULÁRNÍ TEKUTINA (MATRIX) Většina buněk je uvnitř mnohobuněčných organizmů obklopena prostředím o specifickém složení, které se označuje jako extracelulární tekutina nebo extracelulární matrix. Obecně lze konstatovat, že v extracelulární matrix se nacházejí určité komponenty, společné pro velké skupiny organizmů. U rostlin je to celulóza, u členovců a hub chitin, u obratlovců komplexní směs sacharidů a proteinů (případně minerálních látek v kostech). Extracelulární matrix má pro normální existenci organizmu (a jeho orgánů) značný význam, přestože mu v učebnicích často nebývá věnována adekvátní pozornost. Především se uplatňuje jako prostředí propojení a komunikace mezi buňkami mnohobuněčných organizmů, participuje na zachování stabilního tvaru tkání, na přísunu živin a jiných látek do buňky, na vylučování produktů metabolizmu buněk (organizmu), na informačním toku v organizmu a na některých obraných mechanizmech organizmu.
SCHÉMA EXTRACELULÁRNÍ MATRIX ŽIVOČIŠNÉ BUŇKY
151
Pro ilustraci zde uvedeme pouze několik poznámek, týkajících se extracelulární matrix obratlovců. Velké množství extracelulární matrix obklopuje zejména buňky pojivové tkáně, které její složky samy produkují (chondroblasty v případě chrupavek, osteoblasty v případě kostí). V extracelulární matrix se vyskytují majoritně glykózaminoglykany, proteoglykany, kolageny, elastiny a různé adhezivní molekuly (např. laminin, fibronektin). Makromolekuly proteoglykanů jsou tvořeny dlouhými nevětvenými řetězci, sestávajícími ze základních disacharidových jednotek, v nichž alespoň jeden z monosacharidů příslušného disacharidu je aminocukr - N-acetylglukózamin, N-acetylgalaktózamin. Tyto aminocukry bývají často sulfatovány. Přítomnost sulfátových a karboxylových skupin v molekulách proteoglykanů (resp. glakózaminoglykanů) vede k poměrně silnému negativnímu náboji (chovají se jako anionty), což se projevuje jejich afinitou ke kationtům (zejm. Na+ jako extracelulárnímu iontu). Přitahování osmoticky aktivních kationtů anionty proteoglykanů vede k pronikání molekul vody do extracelulární matrix, botnání a určitému tkáňovému (buněčnému) turgoru. Mezi hlavní zástupce proteoglykanů extracelulární matrix patří chondroitinsulfát, heparansiulfát, keratansulfát, kyselina hyaluronová či syndekan-1 (který je, na rozdíl od ostatních jmenovaných proteoglykanů, ukotven v cytoplazmatické membráně jako integrální protein, na který se navazují chemokiny; v případě poškození buněk se komplexy syndekanu-1 a chemokinů uvolňují a difundují okolním prostředím, přičemž přítomné chemokiny atrahují neutrofily a v místě poškození se následně rozvíjí zánětlivá reakce). Ke skupině glykoproteinů náleží kolageny hojně zastoupené v kostech, šlachách a vazivu, lamininy v bazální lamině epitelů nebo fibronektin, který propojuje buňky s extracelulární matrix. Je známo, že in vitro se normální buňky obratlovců většinou mohou dělit a růst, jestliže jsou uchyceny k nějakému vhodnému pevnému podkladu; obdobně je tomu in vivo, kde jsou prostřednictvím vnější části integrinů (transmembránové glykoproteiny) napojeny k určité komponentě extracelulární matrix (kolageny, lamininy, fibronektin) a vnitřní částí integrinů napojeny na cytoskelet (aktinová filamenta). Proteiny elastiny, obsažené ve vazivu, zajišťují dostatečnou pružnost například cévám a kůži. Hlavní extracelulární minerální látkou kostí je fosforečnan vápenatý.
152
XIV. BUNĚČNÉ JÁDRO A JADÉRKO 1. BUNĚČNÉ JÁDRO (NUCLEUS) Buněčné jádro je relativně velkou organelou vyskytující se ve všech eukaryotických buňkách (alespoň po určité období jejich existence), která obsahuje genetickou informaci, organizovanou ve formě chromozomů. Od ostatních buněčných kompartmentů je odděleno jaderným obalem. Jaderný obal tvoří dvě membrány, vnější a vnitřní. Vnější membrána je propojena s membránami endoplazmatického retikula. Vnitřní membrána je stabilizována soustavou intermediárních filament složených z proteinů, označovaných jako laminy. Soubor všech typů laminů vytváří těsně pod vnitřní membránou tenkou fibrózní vrstvičku. Lamin B se váže na integrální proteiny vnitřní membrány, na lamin A a lamin C se za účasti dalších proteinů napojují interfázní chromozomy specifickými deoxyribonukleotidovými sekvencemi. Prostor mezi vnější a vnitřní jadernou membránou se nazývá perinukleární prostor. Na mnoha místech jaderného obalu fúzuje vnější membrána s vnitřní membránou za vzniku pórů, jimiž buněčné jádro (nukleoplazma) komunikuje s cytoplazmou. V každém z těchto pórů se nachází větší počet proteinů, tzv. nukleoporinů, jejichž soubor se označuje jako proteinový komplex jaderných pórů (NPC = nuclear pore complex). Vytváří se tak kanál, jímž může být transportován příslušný buněčný materiál z buněčného jádra do cytoplazmy a naopak. Jedná se o formu aktivního transportu vyžadujícího dodání energie z vhodného zdroje a přítomnost molekul, které fungují jako přenašeči specifičtí pro transport pouze určitých látek. Z buněčného jádra jsou exportovány podjednotky ribozomů (obsahující rRNA a příslušné ribozomální proteiny), mRNA, tRNA a translační faktory. Exportované molekuly RNA i proteinů jsou opatřeny charakteristickou sekvencí pro jaderný export NES (= nuclear export sequence), která je nutná pro spojení těchto molekul se specifickým přenašečem. Do buněčného jádra jsou importovány především různé typy proteinů, které byly syntetizovány v cytoplazmě (cytosolu), např. histony, transkripční faktory, faktory podílející se na sestřihu hnRNA a proteiny, které jsou stavebními složkami ribozomů. Proteiny, které jsou do buněčného jádra importovány z cytoplazmy, obsahují charakteristickou sekvenci aminokyselin, označovanou jako sekvence odpovědná za jadernou lokalizaci NLS (= nuclear localization sequence). Pouze látky (molekuly) s NLS mohou projít póry jaderné membrány dovnitř buněčného jádra. Buněčné jádro obsahuje chromozomy. Každý chromozom sestává z jedné molekuly DNA, na kterou je navázán komplex bílkovin, především histonů. Takovýto nukleohistonový komplex se označuje jako chromatin. Struktura chromatinu prodělává v průběhu buněčného cyklu dynamické změny. Dekondenzovaný chromatin (tzv. euchromatin) je geneticky aktivní, tzn. že DNA, kterou obsahuje, může být replikována a/nebo transkribována. Takový chromatin se zjišťuje zejména v interfázi. Kondenzovaný chromatin (tzv. heterochromatin) je naopak geneticky neaktivní a vyskytuje se v dalších stadiích buněčného cyklu. V některých částech chromozomů (např. oblasti centromer a telomer) se však heterochromatin nachází trvale v kondenzovaném stavu a označuje se jako konstitutivní heterochromatin. Ostatní heterochromatinové úseky chromozomů existují pouze přechodně a označují se jako fakultativní heterochromatin. Fakultativní heterochromatin může přecházet v euchromatin a naopak. Tyto změny zpravidla souvisejí se zapínáním a vypínáním specifických genových oblastí při buněčných diferenciačních procesech. Z výše uvedeného je patrné, že buněčné jádro lze označit za integrační centrum buňky s nepostradatelnými informačními a řídícími funkcemi.
153
BUNĚČNÉ JÁDRO
154
2. BUNĚČNÉ JADÉRKO (NUCLEOLUS) V interfázi jsou v buněčném jádru někdy patrné granulární struktury, které nejsou ohraničené žádnou membránou. Tyto struktury, zvané jadérka, jsou smyčky silně dekondenzovaného chromatinu, obsahujícího úsek DNA (tzv. rDNA), který kóduje rRNA. Přepisem genů pro rRNA se v jadérku syntetizuje pre-rRNA, jejíž posttranslační úpravou, která se uskutečňuje rovněž v jadérku, vznikají jednotlivé typy rRNA. (Připomeňme, že některé molekuly rRNA se v jadérku nesyntetizují). Zde se rRNA rovněž spojuje se specifickými proteiny, které byly syntetizovány v cytoplazmě a dopraveny do jádra z drsného endoplazmatického retikula; vznikají tak ribonukleoproteinové podjednotky ribozomů, které jsou z nukleolu transportovány přes póry jaderné membrány zpět do cytoplazmy, kde mohou asociovat v ribozomy. Připomeňme, že některé rRNA se v jadérku nesyntetizují. Na začátku mitózy již jadérka nejsou patrná a objevují se opět až v telofázi. Jadérka se vyskytují na určitém místě pouze některých chromozómů (např. u člověka jsou to chromozomy č. 13,14,15,21,22), kde jejich tvorbu řídí tzv. organizátor jadérka (syn. nukleolární organizátor, nucleolar organizator); .
155
XV. DRÁŽDIVOST A NERVOVÁ SIGNALIZACE Dráždivost je jednou ze základních vlastností živých systémů. Mezi dráždivé struktury patří především buňky nervové, smyslové a svalové. Tyto buňky jsou schopny na adekvátní podnět (signál, stimul) vyvinout odpověď obecně označovanou jako podráždění a projevující se změnou membránového potenciálu (depolarizace). Některé jiné podněty naopak mohou mít tlumivé účinky a projevit se jako tlumivé synaptické potenciály (hyperpolarizace, inhibice akčních potenciálů). Pozn.: Pokud dochází k depolarizaci na větším počtu synapsí současně, mohou se navzájem sčítat; takový jev se označuje jako prostorová sumace. Protože jednotlivé synaptické potenciály vyhasínají relativně dlouhou dobu (desítky milisekund), může opakování podnětů v dostatečně rychlém sledu vést k sumaci účinků jednotlivých podnětů a vést k celkové větší depolarizaci; takový jev se označuje jako časová sumace. Nervová signalizace se týká především přenosu specifického signálu mezi buňkami (a to na kratší i větší vzdálenost), na kterém participují především cytoplazmatické membrány nervových buněk. Na typické nervové buňce lze v tomto smyslu rozlišit tři úseky: vstupní, tvořený dendrity a případně tělem neuronu, vodivý, tvořený axonem (neuritem) a výstupní, tvořený nervovým zakončením. Do vstupního úseku neuronu jsou přiváděny zpravidla četné signály z více oblastí dané nervové dráhy a jsou v něm integrovány. Obecně platí, že určitý chemický signál je cytoplazmatickou membránou vstupní části neuronu transformován a projevuje se jako synaptický potenciál, tedy jako elektrická změna na membráně. Ve vodivém úseku neuronu při adekvátním podnětu vznikají a dále se šíří akční potenciály jako projev charakteristický pro cytoplazmatickou membránu tohoto úseku neuronu. Pro vznik akčního potenciálu (vzruchu) je nutné, aby intenzita podnětu dosáhla prahové nebo nadprahové hodnoty; v obou případech však akční potenciál dosáhne stejné maximální hodnoty (depolarizace membrány), což se někdy označuje jako odpověď „vše nebo nic“. Vznik akčního potenciálu je výsledkem součinnosti sodíkových a draslíkových (napěťově řízených) kanálů. Procesy, které se při tom uskutečňují je možné shrnout do několika bodů: (1) jakmile se depolarizace membrány rozšíří ze vstupního úseku neuronu na iniciální segment axonu, dojde k počátečnímu otevření Na+-kanálů a počátečnímu toku sodných iontů dovnitř neuronu (2) tokem sodných iontů dovnitř neuronu se zvětší depolarizace membrány, což znovu vyvolá otevření dalších Na+-kanálů, tím se dále zvětší depolarizace a tak dále tyto procesy mohutní, že je dosaženo maximální hodnoty akčního potenciálu (cca + 20 mV). Tedy za depolarizaci odpovídá tok sodných iontů. V průběhu depolarizace cytoplazmatické membrány se několikanásobně zvětší její permeabilita pro sodné ionty oproti permeabilitě pro draselné ionty. (3) když se hodnota depolarizace blíží maximu, tok sodných iontů dovnitř neuronu rychle ustane v důsledku inaktivace Na+-kanálů. Souběžně se otevírají K+-kanály (depolarizací) a draselné ionty se přesouvají z neuronu do extracelulárního prostředí (4) dochází k repolarizaci membrány a po menší hyperpolarizaci (< -70 mV) se obnovuje klidový potenciál (cca –70 mV). V průběhu repolarizace se K+-kanály uzavírají. Ve výstupním úseku neuronu (na nervovém zakončení) se elektrický signál transformuje na signál chemický, který se manifestuje uvolněním neuromediátoru z tzv. synaptických váčků do synaptické štěrbiny exocytózou. Exocytóza synaptických váčků je indukována vápenatými ionty, které pronikají do cytosolu při otevření napěťově řízených Ca2+-kanálů, ke kterému dochází, jakmile akční potenciál postoupí do nervového zakončení. Na spuštění exocytózy se podílejí některé proteiny: membránový protein synaptických váčků synaptotagmin v nepřítomnosti 156
vápenatých iontů inhibuje možnou interakci mezi integrálním proteinem synaptických váčků synaptobrevinem a membránovým proteinem v oblasti nervového zakončení syntaxinem; patrně inaktivací synaptotagminu uvolněnými vápenatými ionty jsou navozeny podmínky pro interakci synaptobrevinu se syntaxinem a zahájení exocytózy synaptických váčků. Uvolnění neuromediátoru představuje jeden z významných mechanizmů regulované sekrece, která není podmíněna enzymaticky, protože přenos podráždění na synapsi trvá velmi krátkou dobu (přibližně 1 msec). Je vhodné dodat, že neuromediátor uvolňovaný ve výstupním úseku (na nervovém zakončení) nemusí být týž, jako neuromediátor přítomný ve vstupním úseku neuronu. Pozn. 1: V malých množstvích se neuromediátor uvolňuje i na nepodrážděném nervovém zakončení a proto je možné na postsynaptické membráně registrovat tzv. miniaturní potenciály (přibližně jeden za sekundu o amplitudě asi 1 mV), přičemž zřejmě každý z těchto potenciálů je odpovědí na exocytózu jednoho synaptického váčku. Úměrně postupné depolarizaci cytoplazmatické membrány nervového zakončení se zvyšuje četnost těchto potenciálů. Pozn. 2: V rámci recyklace buněčných membrán jsou membrány exocytovaných synaptických váčků, které se dočasně dostávají do cytoplazmatické membrány, endocytovány a postupně se znovu stanou součástí nových synaptických váčků s příslušným neuromediátorem, který byl do nich vpraven prostřednictvím aktivního transportu. Pozn. 3: Procesy exocytózy synaptických váčků mohou být ovlivněny některými jedy. Například botulotoxin, produkovaný Clostridium botulinum, má specifickou afinitu k synaptobrevinu, který hydrolyzuje. Následkem této hydrolýzy je zablokování sekrece neuromediátoru, projevující se na makroskopické úrovni paralýzou svalů.
NEUROMEDIÁTORY (NEUROTRANSMITERY) Neuromediátory (neboli neurotransmitery) jsou ligandy, navazující se na extracelulární část membránových receptorů. Těmito receptory jsou struktury chemicky řízených iontových kanálů. Některé neuromediátory působí přímo, jiné nepřímo, např. prostřednictvím G-proteinů. Některé látky mají vysokou afinitu k receptorům pro neuromediátory a mohou s nimi kompetovat. Například kurare (alkaloid tubokurarin) obsazuje receptory pro acetylcholin; jejich znepřístupnění pro acetylcholin se projeví znecitlivěním až ochrnutím. Adrenalin, noradrenalin a dopamin jsou deriváty aminokyseliny tyrozin. Noradrenalin je mediátorem typickým pro sympatický nervový systém. Serotonin – je schopen zpětné resorpce do nervových zakončení. Dobu působení serotoninu na receptory je možné prodloužit působením chemických látek zpomalujících jeho resorpci; na tomto mechanizmu je založen účinek některých antidepresiv. Acetylcholin – je přítomen na parasympatických nervových zakončeních. Je hydrolyzován acetylcholinesterázou, navázanou na postsynaptické membráně. Jestliže je tento enzym inhibován (např. sarinem, insekticidem proti dětským vším Difusilem), dojde k akumulaci acetylcholinu a k zablokování synapse. GABA – receptory pro GABA mohou být ovlivněny látkami, které potencují účinnost tohoto neuromediátoru na tlumivých synapsích; tímto mechanizmem působí řada léků s tlumivými účinky (např. barbituráty, benzodiazepiny – diazepam, oxazepam, rohypnol). 157
NEUROMODIFIKÁTORY Za neuromodifikátory považujeme látky, které nějakým způsobem modifikují neurofyziologické děje. Neuromodifikátory přenosu podráždění na synapsích ovlivňují děje ve vstupních a výstupních úsecích neuronů. Mezi ně patří: (1) Endorfiny – jsou to peptidy, jejichž působení v mozku se projevuje potlačením vnímání bolesti. Podobně působí morfin a některé jeho deriváty (tzv. látky morfinového typu), které mají afinitu k receptorům specifickým pro endorfiny. (2) Cholecystokinin – je to proteohormon vylučovaný buňkami střevní stěny se stimulačními účinky na sekreci pankreatu. Vyskytuje se též v mozku, kde ovlivňuje pocity hladu a sytosti. (3) Oxid dusnatý – je to doposud známý jediný anorganický tkáňový hormon, který vzniká v endotelu cév oxidací argininu po podráždění acetylcholinem, případně i jiným způsobem. Pozn.: Oxid dusnatý může vznikat též z nitroglycerinu. Účinnou látkou, která navozuje uvolnění stahu srdečních cév při některých kardiovaskulárních onemocněních (např. angina pectoris) není nitroglycerin, který se za tímto účelem podává, ale právě NO. NO jako nízkomolekulární nepolární sloučenina difunduje do okolní cévní svaloviny, v níž navozuje myorelaxační účinky (váže se na atom železa a aktivuje guanylylcyklázu, která produkuje jako účinnou látku cGTP). Oxid dusnatý se vyskytuje též v mozku, kde se uvažuje o jeho roli v paměťových procesech a to zejména v souvislosti s možným přenosem signálů z postsynaptického neuronu do presynaptických zakončení (tedy ve směru opačném oproti směru šíření podráždění po neuronu), ve kterém by plnil funkci přenašeče.
158
XVI. BUNĚČNÝ CYKLUS Buněčný cyklus eukaryotických buněk lze definovat jako sled dějů, které se uskutečňují mezi dvěma mitózami. Za počátek buněčného cyklu se považuje moment vzniku nové buňky mitotickým dělením a za jeho konec moment dokončení mitotického dělení této buňky. Celý buněčný cyklus se zpravidla rozděluje na dílčí úseky. Jimi jsou dvě fáze: interfáze (neboli I-fáze) a mitotická fáze (neboli M-fáze). Interfáze se dále rozděluje do tří fází: G1-fáze (neboli presyntetická fáze), S-fáze (neboli syntetická fáze) a G2-fáze (neboli postsyntetická fáze). Mitotická fáze se rozděluje na tzv. karyokinezi a cytokinezi. V rámci karyokineze se vymezují další čtyři fáze: profáze, metafáze, anafáze, telofáze. Každá z uvedených fází buněčného cyklu se vyznačuje pro ni charakteristickými ději. Průchod buňky jednotlivými fázemi buněčného cyklu je kontrolován specifickými cytoplazmatickými proteiny. Mezi nimi hlavní roli sehrávají cykliny a cyklin-dependentní kinázy (Cdk).
SCHÉMA BUNĚČNÉHO CYKLU
XVI.1. INTERFÁZE G1 – fáze V této fázi interfáze se rozvíjejí syntetické procesy zahrnující především syntézu ribonukleových kyselin a proteinů. V důsledku toho se zvyšuje hmotnost buňky a buňka roste, resp. prochází první fází růstu poté, co vznikla jako produkt předcházejícího mitotického dělení 159
mateřské buňky. V G1-fázi dochází též k tzv. neprogramované syntéze DNA, která souvisí s probíhajícími mechanizmy reparace poškození DNA (genových mutací, chromozomálních zlomů) a je při nich využívána. S-fáze V S-fázi dochází k tzv. programované syntéze DNA, tedy k replikaci jaderné DNA. Současně se syntetizují histony jako složky nukleohistonového komplexu chromozomů, neboť s replikací jaderné DNA dochází souběžně k replikaci chromozomů. Na konci S-fáze jsou chromozomové sady zdvojeny; jednotlivé chromozomy jsou dvouchromatidové, jednotlivé chromatidy jsou spojeny centromerou. Poznamenejme, že za normálních okolností nastává replikace jaderné DNA a chromozomů pouze v S-fázi, kdežto mimojaderná DNA (mitochondriální a chloroplastová) se může syntetizovat nezávisle na replikaci jaderné DNA ve všech fázích buněčného cyklu, nejen v S-fázi. G2 – fáze V této postsyntetické fázi se transkribuje genetická informace uložená v jaderné DNA, dochází k další syntéze proteinů, různých buněčných struktur a dalších látek. Hmotnost buňky se dále zvyšuje a buňka pokračuje v růstu (resp. prochází druhou fází růstu). V průběhu interfáze dochází též k replikaci (zdvojení) centrozomu. V interfázi se nacházejí tzv. kontrolní body nebo v buňkách některých druhů organizmů (popř. stadií jejich ontogenetického vývoje) pouze jeden kontrolní bod. G0 – fáze V mnohobuněčných organizmech neprocházejí všechny buňky mitotickými cykly. Některé z nich se dostávají do tzv. klidového stadia, ve kterém se nedělí, ale zachovávají si všechny základní životní aktivity. Buněčný cyklus klidových buněk je přerušen pravděpodobně v G1 – fázi; lze se domnívat, že buňky, které se dostávají do G0 – fáze, neprošly kontrolním bodem v G1 – fázi. Poměr mezi cyklujícími a necyklujícími buňkami je v organizmu jako celku regulován a jeho zachování je nezbytné pro udržení integrity organizmu.
XVI.2. II. MITÓZA A. KARYOKINEZE Profáze V profázi chromozomy postupně kondenzují a začíná se tvořit mitotický aparát buňky. Základem mitotického aparátu jsou mikrotubuly, jejichž organizačním centrem (MTOC) jsou centrozomy. Část syntetizovaných mikrotubulů se od místa nukleace šíří radiálně (tzv. astrální mikrotubuly) a tvoří útvar označovaný jako astrosféra, část směřuje k protilehlému centriolu (tzv. polární mikrotubuly) a stává se základem dělicího vřeténka. Na rozhraní mezi profází a metafází dochází jednak k destrukci jaderného obalu, jednak k formování kinetochoru v oblasti centromery každého chromozomu. Kinetochor je proteinový komplex (s molekulovým motorem typu dyneinu), na který se napojují mikrotubuly dělicího vřeténka (tzv. kinetochorové mikrotubuly).
160
Metafáze V metafázi se chromozomy přesouvají do ekvatoriální roviny kolmé na osu dělicího vřeténka. Při tom jsou jednotlivé chromatidy každého chromozomu napojeny kinetochorovými mikrotubuly k opačnému pólu dělicího vřeténka a tak je zajištěn přesný rozchod obou sad chromozomů do jednotlivých buněk, které vzniknou rozdělením buňky mateřské.
Anafáze Anafáze začíná rozdělením obou chromatid, které byly dosud v rámci jednotlivých chromozomů spojeny centromerou. Separované chromatidy se rozcházejí k opačným pólům dělicího vřeténka. Tento pohyb chromatid zprostředkovává molekulový motor typu dyneinu tím, že posouvá kinetochor i s chromatidou po kinetochorových mikrotubulech; současně již nepotřebné úseky kinetochorových mikrotubulů na plus-konci depolymerizují. Souběžně 161
s rozestupováním chromatid k pólům dělicího vřeténka se tyto póly od sebe vzdalují. Toto vzdalování se pólů dělicího vřeténka je umožněno prodlužováním mikrotubulů vřeténka polymerací na plus konci polárních mikrotubulů a vzájemným posunem mikrotubulů, vycházejících z opačných pólů vřeténka, prostřednictvím molekulového motoru typu kinezinu.
Telofáze V telofázi zanikají kinetochorové mikrotubuly, chromozomy dekondenzují, znovu se vytváří jaderný obal a rekonstruuje nukleolus.
162
B. CYTOKINEZE Existují určité rozdíly v průběhu cytokineze v rostlinných a živočišných buňkách. V buňkách rostlinných přetrvávají v ekvatoriální rovině mikrotubuly dělicího vřeténka. K těmto mikrotubulům jsou dopraveny váčky odvozené od membrán Golgiho aparátu, které obsahují stavební komponenty pro syntézu mezibuněčné přehrádky. Splýváním těchto váčků vzniká základ mezibuněčné přehrádky (tzv. fragmoplast), který se postupně rozšiřuje centrifugálně k buněčné stěně. Mitóza rostlinných buněk se odlišuje od mitózy živočišných buněk též tím, že poloha fragmoplastu je determinována již v G2-fázi interfáze lokalizací tzv. preprofázního svazku mikrotubulů asociovaného s vnitřní stranou cytoplazmatické membrány. V živočišných buňkách vzniká ze svazku antiparalelně uspořádaných mikrofilament, asociovaných s vnitřní stranou cytoplazmatické membrány, kontraktilní prstenec, který iniciuje zaškrcování buňky. Vlákna tohoto prstence se účinkem cytoplazmatického myozinu II posouvají centripetálně přibližně v místě ekvatoriální roviny a tím se zaškrcování buňky prohlubuje až v konečném stadiu dospěje k oddělení obou buněk. Obě buňky tak obsahují přibližně stejný objem cytoplazmy a přibližně stejný počet náhodně distribuovaných organel původní mateřské buňky. SCHÉMA CYTOKINEZE U ŽIVOČIŠNÉ A ROSTLINNÉ BUŇKY
Schématicky popsaný obecný model mitózy je značně rozšířený, avšak nikoli jediný. U různých taxonomických skupin nebo i v rámci různě diferencovaných tkání se zjišťují menší či větší odchylky od tohoto modelu (např. výskyt endomitóz, vznik plazmodií, syncytií, asymetrické buněčné přehrádky). 163
XVI.3. REGULACE BUNĚČNÉHO CYKLU Průběh buněčného cyklu je jako časoprostorově uspořádaný sled intracelulárních dějů řízen. V určitých fázích buněčného cyklu se nachází jeden nebo více kontrolních bodů. V buňkách savců se hlavní kontrolní bod nachází v G1-fázi interfáze a rozhoduje o zahájení buněčného cyklu. Projde-li buňka tímto kontrolním bodem, dostává se přes S-fázi do G2-fáze, v níž se nachází druhý kontrolní bod, který rozhoduje o zahájení mitózy. Projde-li buňka tímto kontrolním bodem, může se uskutečnit karyokineze. Vzhledem k tomu, že některé vícejaderné buňky vznikají jako následek absence cytokineze, je zřejmé, že existuje i kontrolní bod, který rozhoduje o zahájení cytokineze. Hlavní regulace buněčného cyklu se realizuje na chemické úrovni. Základní roli v těchto procesech sehrávají: (1) cykliny: cyklin G1-fáze (cyklin D), cykliny S-fáze (cyklin A a E), mitotické cykliny (cyklin A a B) (2) cyklin-dependentní kinázy (Cdk): kináza dependentní na cyklin G1-fáze (Cdk4), kináza dependentní na cykliny S-fáze (Cdk2), kináza dependentní na mitotické cykliny (Cdk1) (3) cyklozom (= komplex podporující anafázi = APC/C) Cykliny jsou evolučně velmi konzervativní proteiny. U mnohobuněčných organizmů je jich známo pět. Syntetizují se a též degradují v průběhu celého cyklu, avšak s různou a pro jednotlivé typy cyklinů charakteristickou dynamikou. (Například cyklin A se začíná syntetizovat od počátku G1-fáze, v jejím průběhu se jeho množství v buňce významně zvyšuje a na konci této fáze prudce klesá. Ve fázi G2 se začíná syntetizovat cyklin B, jeho množství se postupně zvyšuje, syntetizuje se i v průběhu mitózy, avšak v jejím závěru se jeho množství prudce snižuje. Obdobně by bylo možné pokračovat i dalšími cykliny.) Je patrné, že se jedná o zákonité, řízené procesy. Syntéza cyklinů zřejmě odráží procesy regulace exprese genů pro cykliny na úrovni transkripce. Degradace cyklinů se uskutečňuje prostřednictvím ubikvitinového systému. V tomto systému je protein určený k degradaci rozpoznán enzymovým komplexem, který přenáší ubikvitin. Enzymový komplex se naváže na molekulu takového proteinu, ubikvitin se připojí k lyzinovým zbytkům v jeho molekule a poté se enzymový komplex od proteinu uvolní; celý tento proces se realizuje za využití energie uvolněné hydrolýzou ATP. Ubikvitinem označený protein se v cytoplazmě stává substrátem pro proteazomy (komplex proteáz), které jej za využití energie, uvolněné hydrolýzou ATP, rozštěpí na oligopeptidy. Cyklin-dependentní kinázy nevykazují v průběhu buněčného cyklu tak výraznou dynamiku jako cykliny; jejich hladina je víceméně konstantí, avšak enzymatická aktivita je závislá na přítomnosti a množství cyklinů. Cykliny vytvářejí komplexy s tzv. cyklin-dependentními kinázami (komplex Cdk – cyklin) a tím je aktivují. Aktivované Cdk mohou fosforylovat buď cílové proteiny, anebo další proteinkinázy, které jsou potom schopny fosforylovat jiný protein. Cílové proteiny se liší podle toho, který cyklin se podílí na vytvoření komplexu s Cdk. Například cyklin B se považuje za protein rozhodující o zahájení mitózy. Jestliže vytvoří komplex s proteinkinázou pro něho specifickou, mohou být fosforylovány histony, laminy a některé další proteiny; tyto fosforylace mohou následně být příčinou kondenzace chromozomů, degradace jaderného obalu a dalších změn, typických pro přechod buňky z interfáce do mitotické fáze. Intenzivní degradace cyklinu B před ukončením mitózy má za následek pokles komplexů Cdk-cyklin, jinými slovy inaktivaci proteinkináz specifických pro cyklin B. Tím se vytvářejí podmínky pro defosforylaci předtím cyklin-dependentními kinázami fosforylovaných proteinů fosfatázami (histonů, laminů a dalších); následky těchto defosforylací se mohou manifestovat na cytologické úrovni jako dekondezace chromozomů, obnova jaderného obalu a další jevy.
164
Cyklozom (neboli komplex podporující anafázi, APC/C) je proteinový komplex, který spouští děje vedoucí k destrukci kohezinů (tj. proteinů, které v jednotlivých chromozomech spojují sesterské chromatidy). V důsledku toho se sesterské chromatidy mohou od sebe separovat a přesouvat se k opačným pólům dělicího vřeténka. Komplex APC/C se též podílí na degradaci mitotického cyklinu B. Působení cyklinů, Cdk a komplexu APC/C v průběhu buněčného cyklu lze shrnout do několika bodů: (1) V G1 – fázi se zvyšuje hladina cyklinů G1 – fáze. G1 - cykliny se váží ke specifickým cyklin-dependentním kinázám a aktivují je. Aktivace těchto kináz je signálem pro přípravu buňky na replikaci chromozomů (DNA). (2) Cyklin A (cyklin S-fáze) se navazuje na Cdk 2, zvyšuje se hladina faktoru podporujícího S-fázi, který se dostává do buněčného jádra a zahajuje se replikace DNA. (3) S pokračováním replikace DNA dochází k degradaci cyklinu E a počíná se zvyšovat hladina mitotických cyklinů (zejména pak v G2 – fázi). (4) Vytváří se komplex mitotických cyklinů se specifickými Cdk za vzniku tzv. faktoru podporujícího M-fázi (MPF). Tento komplex iniciuje kondenzaci chromozomů, destrukci jaderného obalu a tvorbu dělicího vřeténka. Zahajuje se tedy mitóza (M-fáze) a pokračuje do metafáze. (5) Faktor podporující M-fázi (MPF) aktivuje komplex APC/C. Aktivací tohoto komplexu je umožněna separace sesterských chromatid a dokončení mitózy. APC/C se dále podílí na degradaci cyklinu B tím, že ho napojuje na ubikvitin. Komplex APC/C ovlivňuje rovněž spuštění syntézy cyklinů G1 – fáze následujícího buněčného cyklu a degradaci gemininu (tj. proteinu, který zamezuje opakované replikaci DNA v období ještě před zahájením mitózy a který se tak podílí na jednom z mechanizmů zajišťujících rovnoměrnou distribuci genetické informace do produktů buněčného dělení). Další významnou skupinou chemických látek, které participují na regulaci buněčného dělení, jsou růstové faktory. Jedná se vesměs o peptidy a proteiny s nízkou relativní molární hmotností vyznačující se zpravidla mitogenní aktivitou, tj. schopností indukovat přechod buněk klidových (v G0-fázi) do mitoticky aktivních prostřednictvím příslušných chemických signálů. Existují však též některé růstové faktory, které působí opačně, tj. mitoticky aktivní (cyklující) buňky převádějí v buňky klidové (do G0-fáze). Růstové faktory vykazují různý stupeň specifity. Některé jsou vysoce specifické a působí pouze v mezích jednoho typu buněk (například Interleukin-2 stimuluje proliferaci aktivovaných T-lymfocytů), jiné jsou méně specifické a působí na více typů buněk (např. destičkový faktor PDGF stimuluje proliferaci buněk pojivové tkáně, epidermální růstový faktor EGF stimuluje různé typy buněk v embryogenezi). Mitotická aktivita buněk je též regulována některými hormony. U rostlin jsou to např. auxiny, gibbereliny a cytokininy, u živočichů například růstový hormon a steroidní hormony. Mitotickou aktivitu buněk ovlivňují i fyzikální faktory. Z kultivace buněk in vitro je známo, že se buňky stanou mitoticky aktivními až po adhezi na určitý pevný substrát. Proliferací normálních buněk se vytvoří pouze monovrstva; buňky nepřerůstají, jejich mitotická aktivita ustává, jakmile dojde k vzájemnému kontaktu buněk. Tento jev se označuje jako kontaktní inhibice. Odlišně se v tomto ohledu chovají buňky, které prošly maligní transformací: jsou schopné dělit se i bez předchozí adheze k pevnému substrátu a růst ve více vrstvách (ztráta kontaktní inhibice). Regulace mitotické aktivity v určité buněčné populaci může být též pozitivně či negativně regulována prostřednictvím signálů přenášených mezi buňkami při intercelulárních interakcích. V těchto procesech se může uplatnit metabolická kooperace buněk. Každá buňka disponuje několika mechanizmy, které jí umožní přerušit buněčný cyklus v případě výskytu nějaké závažné poruchy. Přerušení buněčného cyklu a další děje, které s tím 165
souvisejí, závisí na kontrolních bodech (mechanizmech) buněčného cyklu. Jeden z nich je zacílený na kontrolu úplnosti průběhu S-fáze: buňka nepostoupí z S-fáze do další fáze buněčného cyklu, dokud se nedosyntetizuje DNA zpožďujícího se řetězce v posledním Okazakiho fragmentu; za objekt kontroly lze v tomto případě označit Okazakiho fragmenty. Jiné jsou zaměřeny na kontrolu poškození DNA v jednotlivých fázích interfáze (v G1- fázi, v S-fázi a v G2-fázi): místa poškození DNA jsou – pokud je to možné – před postupem buňky do další fáze buněčného cyklu reparována. Další významnou skupinu představuje kontrola dělicího vřeténka: detekce poruchy napojení vláken dělicího vřeténka ke kinetochorům rezultuje v zablokování buněčného cyklu v metafázi, detekce aberantního uspořádání vláken samotného dělicího vřeténka vede k zablokování cytokineze. V případě, že jsou poruchy ireparabilní, může být navozena apoptóza. Na činnosti všech kontrolních bodů v buňce se podílejí četné proteiny. Je proto zřejmé, že některé z mutací strukturních genů kódujících tyto proteiny jsou příčinou syntézy mutantních nefunkčních nebo dysfunkčních proteinů. V důsledku toho může dojít k selhání některého kontrolního mechanizmu, příslušný typ poškození není odhalen a poškozená buňka může prostupovat jednotlivými fázemi buněčného cyklu a dělením přenášet vlastní poškození do dalších buněčných generací. Některé z těchto nerozpoznaných poškození mohou vést k poruchám buněčného dělení (např. nondisjunkce, multipolární mitóza) a umožnit maligní transformaci buňky. Jako příklad proteinů participujících na kontrolních procesech v buňce lze uvést protein p53. Normálně funkční protein p53 je jednak jedním z činitelů rozpoznávajících poškozenou DNA a blokujících v případě zjištěného poškození buňku v G1 – fázi, jednak sehrává významnou roli při navození apoptózy. Existují však mutace, které vedou k nefunkčnímu proteinu p53. Buňky nesoucí ve svém genomu takový mutantní gen v homozygotním stavu nejsou schopny detegovat příslušný typ poškození DNA, buněčný cyklus není zablokován, poškození není reparováno a buňka se může dále dělit i jako buňka nádorová. Gen pro protein p53 je proto považován za tumorsuprimující gen. O významu proteinu p53 svědčí četné nálezy jeho mutovaných forem v tumorech.
XVI.4. MEIÓZA Meióza je typem buněčného dělení buněk sexuálně se reprodukujících eukaryot, při kterém dochází k tvorbě gamet (u živočichů) nebo spor (u hub a rostlin) s redukovaným (obecně polovičním) počtem chromozomů oproti buňkám somatickým. To znamená, že diploidní (2n) organizmus (resp. jeho část) produkuje haploidní (1n) gamety. Meióza představuje mechanizmus, kterým je zajištěna jednak nezávislá segregace jednotlivých chromozomů (genů) do gamet nebo spor, jednak rekombinace genů, lokalizovaných na homologických úsecích nesesterských chromatid, prostřednictvím crossing-overu. Splynutím dvou haploidních gamet (resp. jejich jader) při oplození vzniká diploidní zygota, jejíž proliferací a diferenciací se vyvíjí nový jedinec. Meióza je tedy též mechanizmem, který z generace na generaci zajišťuje zachování konstatní velikosti genomu; s tím souvisí přítomnost haploidní a diploidní fáze v životním cyklu každého jednotlivého sexuálně se rozmnožujícího organizmu a pravidelné střídání těchto fází při vertikálním přenosu genetické informace z generaci na generaci. Při segregaci chromozomů do gamet vzniká teoreticky 2n různých kombinací samčích a samičích chromozomů v gametách (n = počet párů chromozomů v diploidní buňce). Nesmírná variabilita genomů, která vyplývá pouze z uplatnění principu segregace a volné kombinovatelnosti vloh při gametogenezi, je dále ještě rozšířena rekombinačním procesem. Proto lze meiózu považovat rovněž za významný mechanizmus diverzifikace genomů bez účasti mutačního 166
procesu. Z evolučního hlediska je meióza účinným prostředkem, participujícím na etablování a rozvoji druhové biodiverzity a adaptability sexuálních organizmů. Ve fylogenetickém vývoji je zjevná tendence redukovat haploidní fázi v ontogenezi. U rostlin jsou produktem meiózy haploidní spory, které lze označit za počáteční stadium gametofytu (pohlavní generace). Gametofyt produkuje mitoticky haploidní gamety (izogamety, anizogamety – spermatozoid, spermatická buňka, oosféra) jejichž splynutím vzniká zygota jako základ sporofytu (nepohlavní generace). Na sporofytu diferencují sporangia, ve kterých meioticky vznikají spory. Gametofyt a sporofyt představují dvě cyklicky se střídající generace; toto střídání generací se označuje jako rodozměna (metageneze). Poměr gametofytu ku sporofytu progresivně klesá od vývojově starších stélkatých rostlin k vývojově mladším cévnatým rostlinám (např. u mechů gametofyt tvoří kauloid, fyloidy a rizoidy, sporofyt štět s tobolkou, u semenných rostlin je gametofyt součástí sporofytu a je omezen na určitou jeho část – zárodečný vak obsahující oosféru nebo více oosfér, a pylová zrna obsahující buňky spermatické anebo spermatozoidy).
SCHÉMA MEIÓZY
167
SCHÉMA MEIOTICKÉ REKOMBINACE
Meióza sestává ze dvou po sobě následujících buněčných dělení: prvního heterotypického (neboli redukčního) a druhého homeotypického (neboli ekvačního) dělení, přičemž k vlastní redukci počtu chromozomů dochází při heterotypickém dělení. Po dokončeném heterotypickém dělení nenásleduje interfáze, ale produkty tohoto dělení přecházejí přímo, resp. po určitém časovém intervalu (označovaném jako interkineze) do homeotypického dělení, které svým průběhem odpovídá průběhu mitózy a je mechanizmem rovnoměrného rozdělení chromozomů za vzniku čtyř haploidních buněk jako primárního produktu meiózy jedné výchozí diploidní somatické buňky. Odlišný průběh gametogeneze u samčího a samičího pohlaví rezultuje v rozdílné konečné produkty meiózy. U živočichů vznikají čtyři spermie jako produkty 168
spermiogeneze, nebo jedno vajíčko a dvě či tři posléze zanikající pólové buňky (pólocyty) jako produkty oogeneze; tři pólocyty se objevují tehdy, jestliže pólocyt I, vznikající jako jeden z produktů heterotypického dělení, projde i homeotypickým dělením a rozdělí se. U semenných rostlin redukčním dělením mikrosporocytu vznikají čtyři mikrospory; každá mikrospora se může dále mitoticky dělit za vzniku jedné větší buňky vegetativní a jedné menší buňky generativní. Další mitotické dělení buňky generativní vede k vytvoření dvou buněk spermatických. Redukčním dělením megasporocytu vznikají nejdříve čtyři haploidní megaspory; tři z nich zpravidla zanikají, ze čtvrté se vyvíjí zárodečný vak: třemi po sobě následujícími mitotickými děleními této jedné haploidní buňky vznikne jedna haploidní oosféra + dvě haploidní synergidy + 3 haploidní antipody + 1 diploidní buňka centrální (splynutím dvou haploidních jader). U živočichů při oplození splývá jádro vajíčka s jádrem spermie za vzniku diploidní zygoty. U semenných rostlin existuje dvojí oplození, při němž jádro jedné spermatické buňky splývá s jádrem oosféry za vzniku zygoty a jádro druhé spermatické buňky splývá s jádrem centrální buňky zárodečného vaku za vzniku triploidního endospermu. V obou děleních, označovaných též jako meióza I a meióza II, lze vyčlenit určité charakteristické fáze: PROFÁZE I, tedy profáze heterotypického dělení, je první fází meiózy. Na rozdíl od mitotické profáze je v průběhu profáze I zachován jaderný obal i jadérko. Profáze I se rozděluje na pět stadií: leptoten, zygoten, pachyten, diploten a diakineze. V předcházející S-fázi interfáze byly chromozomy již zreplikovány, takže do profáze vstupují jako páry homologických chromozomů neboli diády. Chromozomy diád jsou dvouchromatidové, přičemž sesterské chromatidy každého z nich jsou spojeny specifickými proteiny, tzv. koheziny. V průběhu profáze se každá diáda spáruje s homologickou diádou za vzniku teterády (neboli bivalentu). Nesesterské chromatidy udržuje v tetrádě v těsné blízkosti tzv. synaptonemální komplex, který se začíná vytvářet v zygotenu a dokončuje se v pachytenu; jedná se o komplex proteinů, v němž jsou koheziny zastoupeny. V tetrádě se nesesterské chromatidy na některých místech vzájemně překřižují a vytvářejí tzv. chiazmata. V průběhu zygotenu může dojít v místech chiazmat ke zlomům řetězců DNA a posléze k rekombinaci, tj. k výměně homologických úseků DNA (chromozomů) mezi nesesterskými chromatidami mechanizmem označovaným jako crossing-over. V pachytenu pokračuje rekombinační proces. V diplotenu rekombinace již neprobíhá, začíná se rozrušovat synaptonemální komplex, dochází k terminalizaci chiazmat (tj. k jejich migraci ze středních částí chromozomů k oběma koncům) a relaxaci chromatid. V diakinezi je patrná další kondenzace chromatinu. U některých organizmů této pokračující kondenzaci může předcházet krátké období dekondenzace a dočasné transkripce některých oblastí na chromozomech. METAFÁZE I následuje po profázi I. Tetrády se přemisťují do ekvatoriální roviny. Současně se mikrotubuly vláken dělicího vřeténka připojují ke kinetochorům jednotlivých párů homologických chromozomů (diády), náhodně orientovaných svými centromerami k jednomu či druhému pólu buňky. Tím jsou vytvořeny předpoklady pro náhodnou segregaci chromozomů do gamet (spor). Posléze se jednotlivé diády začnou prostřednictvím vláken dělicího vřeténka pohybovat tak, že každá z diád určité tetrády je tažena k opačnému pólu buňky. V metafázi se ještě udržuje spojení mezi diádami tetrád pomocí chiazmat a spojení sesterských chromatid koheziny. V metafázi I tedy nedochází k rozdělení centromer, ani chromatid (na rozdíl od mitózy) a proto se v anafázi k pólům buňky rozcházejí dvouchromatidové chromozomy. ANAFÁZE I je charakteristická pokračujícím posunem párů homologických chromozomů k opačným pólům buňky za současné degradace kohezinových spojů mezi sesterskými chromatidami a uvolnění spojů diád v místech chiazmat. 169
TELOFÁZE I je posledním stadiem profáze. Na konci telofáze jsou již rozestoupeny jednotlivé páry homologických chromozomů na opačných pólech a částečně despiralizovány. Po telofázi následuje cytokineze, jejímž produktem jsou dvě buňky obsahující haploidní počet dvouchromatidových chromozomů.
MEIÓZA II probíhá obdobně jako mitóza. V průběhu jednotlivých fází homeotypického dělení dochází k oddělení sesterských chromatid, podélnému rozdělení centromer a k rovnoměrnému rozestoupení vzniklých jednotlivých jednochromatidových chromozomů k opačným pólům buňky za účasti vláken dělicího vřeténka. Po cytokinezi v obou buňkách, které vznikly jako produkt meiózy I a prošly všemi fázemi meiózy II, jsou konečným výsledkem meiózy čtyři haploidní buňky.
XVI.5. AMITÓZA Amitóza není v přírodě příliš rozšířený způsob buněčného dělení. Vyskytuje se např. u některých prvoků. Bývá omezena na vysoce specializované buňky (leukocyty, epiteliální buňky močového měchýře) a patologické stavy (některé karcinomy, leukemické buňky, buňky v tkáňových kulturách, buňky po aplikaci radioaktivního záření). Při amitóze se buněčné jádro zaškrtí a rozdělí na dvě části, aniž by došlo k vytvoření dělicího vřeténka a kondenzaci chromozómů. Amitotická karyokineze může, ale nemusí být následována cytokinezí. Pokud následuje cytokineze, mohou vznikat buňky s nestejnou genetickou výbavou. V posledních letech určité výzkumy prokazují, že v některých případech i při amitóze se chromatin reprodukuje a rovnoměrně (nebo téměř rovnoměrně) distribuuje do nově vznikajících buněk, čímž je garantována kontinuita přenosu genů i jejich rovnoměrné (nebo téměř rovnoměrné) rozdělení do amitoticky vzniklých buněk.
170
XVII. BUNĚČNÉ DĚLENÍ A PŘENOS GENETICKÉ INFORMACE Přirozený přenos genetické informace je vázán na buněčné dělení. Buněčným dělením je zprostředkován přenos genetické informace jak z generace na generaci (tzv. vertikální přenos), tak v rámci generace (tzv. horizontální přenos).
XVII.1. PRINCIP SEGREGACE A KOMBINACE Chromozomy, obsažené v jádrech diploidních buněk, lze uspořádat do homologických párů. U sexuálně se reprodukujících organizmů pochází jeden člen z každého páru od jednoho rodiče (matky, maternální chromozom) a druhý člen od druhého rodiče (otce, paternální chromozom). Jednotlivé páry jsou tvořeny homologickými chromozomy; homologické chromozomy jsou nositeli stejných genů, které však mohou být zastoupeny na maternálním a paternálním chromozómu odlišnými formami (alelami) genů. Předpokládejme existenci jednoho strukturního genu vyskytujícího se ve dvou formách, představovaných alelovým párem A,a, kde A je dominantní alela, a je recesivní alela. Jestliže jeden z rodičů bude dominantní homozygot (AA), bude produkovat gamety nesoucí pouze dominantrní alelu A uvažovaného genu. Jestliže druhý rodič bude recesivní homozygot (aa), bude produkovat gamety nesoucí pouze recesivní alelu a uvažovaného genu. Meióza povede tedy u každého z těchto rodičů k tvorbě gamet pouze jedné genotypové kategorie: buď s alelou dominantní (A) nebo recesivní (a). Proto genotyp všech potomků, vzniklých křížením rodičů o genotypech AA x aa, bude stejný: Aa. Popsané děje jsou schematicky uvedeny v následující tabulce:
genotyp rodiče genotyp rodičovských gamet
AA
aa
A
a
genotyp potomků
Aa
Uvedené procesy je možné též popsat prostřednictvím počtu pravděpodobnosti. Protože dominantní homozygot (AA) obsahuje pouze dominantní alely uvažovaného genu, potom pravděpodobnost vzniku gamet s dominantní alelou PdA = 1 a pravděpodobnost vzniku gamety s recesívní alelou Pda = 0; u recesivního homozygota (aa), který nese pouze recesivní alely uvažovaného genu, tomu bude právě naopak: PrA = 0, Pra = 1. Kombinací gamet těchto rodičů tedy mohou vzniknout pouze heterozygoti, neboť pravděpodobnost vzniku heterozygota je za daných podmínek rovna jedné ( PhAa = PdA x Pra = 1), kdežto pravděpodobnost vzniku kteréhokoli homozygota je rovna nule (PdA x PrA = 1 x 0 = 0, Pda x Pra = 0 x 1 = 0).
171
Hybridi první filiální generace F1, budou tvořit gamety dvou genotypových kategorií: jednu polovinu s alelou dominantní (A), druhou polovinu s alelou recesivní (a). Jestliže se uskuteční křížení mezi heterozygoty Aa (nebo dojde k jejich samooplození), může se při vzniku zygoty kterákoli gameta jednoho jedince spojit s kteroukoli gametou jedince opačného pohlaví. Tedy samičí gameta nesoucí alelu dominantní se může spojit se samčí gametou nesoucí alelu dominantní nebo alelu recesivní, stejně jako se samičí gameta nesoucí alelu recesivní může spojit se samčí gametou nesoucí alelu dominantní nebo recesivní; obdobně samčí gameta nesoucí dominantní alelu se může spojit se samičí gametou nesoucí alelu dominantní nebo recesivní a samčí gameta nesoucí recesivní alelu se může spojit se samičí gametou nesoucí alelu dominantní nebo recesivní. Při vzniku zygoty se tedy uplatňuje náhodné spojování gamet (vloh). V našem případě se v generaci potomků, pocházejících ze vzájemného křížení heterozygotů (nebo z jejich samooplození), vyskytnou jedinci tří různých genotypů: dominantní homozygoti (AA), heterozygoti (Aa) a recesivní homozygoti (aa) v poměru 1AA : 2Aa : 1aa, což lze obecně vyjádřit jako (A + a)n , kde n = počet alelových párů. Schematicky jsou tyto procesy znázorněny v následující tabulce: genotyp gamet heterozygotů Aa
A
a
A
genotypy potomků AA Aa
a
Aa
aa
K popisu těchto procesů lze rovněž využít počtu pravděpodobnosti. Jestliže u diploidního heterozygota (Aa) určitý pár homologických autozomů sestává z jednoho chromozomu nesoucího alelu dominantnní (A) a z jednoho chromozomu nesoucího alelu recesivní (a) uvažovaného genu, potom relativní četnost alely dominantní je stejná jako relativní četnost alely recesivní, tj. 0,5. Odtud plyne, že u heterozygota je pravděpodobnost vzniku haploidní gamety nesoucí dominantní alelu rovna pravděpodobnosti vzniku haploidní gamety nesoucí recesivní alelu, tedy PhA = Pha = 0,5. Při náhodném spojení těchto dvou typů gamet platí: (1) pravděpodobnost vzniku dominantního homozygota je rovna součinu pravděpodobností výskytu gamet s dominantní alelou, čili PAA = PhA x PhA = 0,5 x 0,5 = 0,25 (2) pravděpodobnost vzniku recesivního homozygota je rovna součinu pravděpodobností výskytu gamet s recesivní alelou, čili Paa = Pha x Pha = 0,5 x 0,5 = 0,25 (3) pravděpodobnost vzniku heterozygota je rovna součinu pravděpodobností výskytu gamet s dominantní alelou u jednoho pohlaví a gamet s recesivní alelou u druhého pohlaví a vice versa, čili PAa = 2 x (PhA x Pha) = 2 x 0,5 x 0,5 = 0,5 Pravděpodobnost vzniku kteréhokoli z těchto tří různých genotypů je PAA+Aa+aa = PAA + PAa + Paa = 0,25 + 0,50 + 0,25 = 1,00. Je-li tedy tato pravděpodobnost rovna jedné, znamená to zároveň, že žádný jiný genotyp (než tři uvedené) při dodržení daných podmínek nemůže vzniknout, neboli pravděpodobnost vzniku jakéhokoli jiného genotypu je za těchto podmínek rovna nule. genotyp gamet
172
Za úplné dominance platí, že fenotyp dominantního homozygota je shodný s fenotypem heterozygota. Z tohoto důvodu bude fenotyp jedinců první filiální generace (heterozygotů) shodný s fenotypem dominantně homozygotního rodiče. V generaci F2 jsou zastoupeny tři genotypové třídy: dominantní homozygoti, heterozygoti a recesivní homozygoti v poměru 1AA : 2Aa : 1 aa; poměr jednotlivých genotypových tříd se nazývá genotypový štěpný poměr. Fenotypové třídy v generaci F2 se však vyskytnou v našem případě pouze dvě a to v poměru 3A- : 1aa, protože třídy dominantních homozygotů a heterozygotů (v poměru 1AA : 2Aa) není možné bez použití speciálních metod genetické analýzy od sebe odlišit na základě fenotypu; poměr jednotlivých fenotypových tříd se nazývá fenotypový štěpný poměr. Ke stanovení genotypu konkrétního jedince s dominantním fenotypem je nutné provést genetickou analýzu. Jednou z metod genetické analýzy je tzv. zpětné křížení (B1, back cross); při něm se testovaný jedinec (v našem případě dominantní homozygot nebo heterozygot) kříží s prokazatelně homozygotním jedincem. Použití dominantního homozygota ve zpětném křížení je irelevantní pro určení genotypu testovaného individua vykazujícího dominantní fenotyp, neboť všichni potomci takového křížení budou fenotypově uniformní. Za předpokladu, že testovaný jedinec je dominantní homozygot, potom tímto zpětným křížením získáme potomstvo složené pouze ze samých dominantních homozygotů: AA x AA → AA. Za předpokladu, že testovaný jedinec je heterozygot, získáme potomstvo sestávající z jedné poloviny z dominantních homozygotů a z jedné poloviny z heterozygotů: Aa x AA → AA + Aa v poměru 1 : 1. Rozhodnout o genotypu testovaného jedince s fenotypem dominantního homozygota může pouze tzv. analytické zpětné křížení, při kterém je testovaný jedinec křížen s recesivním homozygotem. Je-li testovaný jedinec dominantní homozygot, bude potomstvo tohoto křížení fenotypově uniformní, sestávající ze samých heterozygotů: AA x aa → Aa. Jestliže však testovaný jedinec bude heterozygot, potom v potomstvu analytického zpětného křížení budou zastoupeni z jedné poloviny heterozygoti (s fenotypem dominantních homozygotů) a z jedné poloviny recesivní homozygoti se svým vlastním fenotypem (odlišným od fenotypu dominantních homozygotů a heterozygotů): Aa x aa → Aa + aa v poměru 1:1. Předpokládejme nyní existenci dvou alelových párů (A, a; B, b) genů lokalizovaných na dvou různých párech homologických autozomů, přičemž alely A, B jsou úplně dominantní nad alelami a, b. V souladu s uvedeným principem segregace a kombinace vzniknou při křížení dvojnásobně homozygotních rodičů AABB x aabb potomci v první filiální generaci F1 s genotypem AaBa a budou tudíž uniformní, fenotypově shodní s dominantně homozygotním rodičem AABB. Jedinci generace F1 jsou heterozygotní v obou genech a proto se označují jako dihybridi. Při meiotickém dělení bude každý dihybrid tvořit čtyři typy gamet s genotypy AB, Ab, aB, a ab v poměru 1 : 1 : 1 : 1. Při křížení jedinců generace F1 navzájem (nebo jejich samooplozením) vzniknou v generaci F2 4 fenotypové třídy a 9 genotypových tříd. Výsledky křížení do generace F2 v případě dihybridizmu jsou schematicky uvedeny v níže uvedené tabulce. Jednotlivé genotypy, vyskytující se v generaci F2 v případě dihybridizmu, jsou zastoupeny v poměru 1AABB : 2 AABb : 1aaBB : 2 AaBB : 4AaBb : 2 Aabb : : 1aaBB : 2 aaBb : 1aabb, což vyjadřuje genotypový štěpný poměr. Obecně lze genotypový štěpný poměr u polyhybridizmu vypočítat podle vzorce: (1 : 2 : 1)n , kde n = počet alelových párů. Při úplné dominanci se budou jedinci všech genotypů, v nichž je obsažena alespoň jedna dominantní alela od každého alelového páru (A-B-), fenotypově jevit jako dominantní homozygoti v obou alelových párech. Jedinci, v jejichž genotypu je obsažena alespoň jedna dominantní alela jednoho alelového páru a dvě recesivní alely druhého alelového páru (A-bb nebo aaB-), se budou fenotypově projevovat jako dominantní homozygoti ve znaku, pro který obsahují dominantní alelu a jako recesivní homozygoti ve znaku, pro který obsahují obě alely recesivní. Jedinci, jejichž genotyp je v obou genech tvořen pouze recesivními alelami, bude vykazovat fenotyp dvojnásobně recesívního homozygota. Tedy jedinci s genotypem AABB, 173
AABb, AaBB, AaBb budou mít fenotyp shodný s fenotypem dvojnásobně dominantně homozygotního rodiče parentální generace, jedinci AAbb a Aabb budou mít dominantní fenotyp ve znaku „A“ a recesivní fenotyp ve znaku „B“, jedinci genotypu aaBB a aaBb budou mít naopak recesivní fenotyp znaku „A“ a dominantní fenotyp znaku „B“ a konečně jedinci genotypu aabb budou mít fenotyp shodný s dvojnásobně recesivně homozygotním rodičem parentální generace. Sumujeme-li v potomstvu dihybrida relativní podíly jednotlivých genotypových tříd se stejným fenotypovým projevem, dostaneme fenotypový štěpný poměr 9A-B- : 3 A-bb : 3 aaB- : 1 aabb, tzn. 9/16 jedinců s dominantním fenotypem v obou znacích, 3/16 jedinců s dominantním fenotypem ve znaku „A“ a recesivním fenotypem ve znaku „B“, 3/16 jedinců s resesivním fenotypem ve znaku „A“ a dominantním fenotypem ve znaku „B“ a 1/16 jedinců s fenotypem recesivním v obou znacích. Schéma křížení do generace F2 v případě dihybridizmu: genotypy gamet dihybridů AaBb
AB
Ab
aB
ab
genotypy potomků AB
AABB
AABb
AaBB
AaBb
Ab
AABb
AAbb
AaBb
Aabb
aB
AaBB
AaBb
aaBB
aaBb
ab
AaBb
Aabb
aaBb
aabb
V generaci F2 se objevily dvě nové fenotypové třídy (A-bb, aaB-), které se nevyskytovaly v žádné z předchozích generací (parentální a F1). Jedinci v těchto třídách, kteří mají genotyp AAbb a aaBB, se označují jako šlechtitelské novinky. Jejich dalším křížením intra se (tj. AAbb x AAbb, resp. aaBB x aaBB) nebo jinou vhodnou metodou lze od šlechtitelských novinek odvodit čisté linie. Charakteristickým znakem čistých linií je především to, že v důsledku homozygotnosti nedochází k vyštěpování (segregaci) nežádoucích genotypů; tím je zaručena konstantnost znaků charakteristických pro danou čistou linii. Podle počtu zúčastněných alelových párů (resp. genů) rozlišujeme různé stupně hybridizmu: monohybridizmus vzniká za účasti jednoho alelového páru (monohybrid je např. Aa), dihybridizmus za účasti dvou alelových párů (dihybrid je např. AaBb), trihybridizmus za účasti tří alelových párů (trihybrid je např. AaBbCc) a tak dále až po polyhybridizmus, jehož se účastní obecně větší počet alelových párů. Je však třeba zdůraznit, že výše odvozené principy segregace a volné kombinovatelnosti alel (vloh) předpokládají lokalizaci každého alelového páru na jiném páru homologických chromozomů (autozomů).
174
Výsledky, které byly odvozeny pro monohybridizmus a dihybridizmus, můžeme snadno rozšířit i na vyšší stupně hybridizmu (viz následující tabulka): znak počet druhů gamet hybrida
obecný vzorec 2n
počet druhů zygot
3n
počet šlechtitelských novinek
2n – 2
genotypový štěpný poměr
(1 : 2 : 1)n
fenotypový štěpný poměr při úplné dominanci
(3 : 1)n
počet homozygotních zygot
2n
počet heterozygotních zygot
4n – 2n
n = počet zúčastněných alelových párů
Uplatnění principu segregace a kombinace vloh v základních genetických procesech bylo potvrzeno v experimentech J. G. Mendela (1822 – 1884) s hrachem setým (Pisum sativum), jejichž výsledky byly publikovány r. 1866 v článku Pokusy s rostlinnými hybridy. Mezi znaky, jejichž dědičnost Mendel u hrachu studoval, byly zjištěny následující vztahy: - kulatý tvar semene je dominantní nad hranatým tvarem semene, - žluté zbarvení děloh je dominantní nad zeleným, - tmavé zbarvení testy je dominantní nad světlým zbarvením, - jednoduše klenutý tvar zralých lusků je dominantní nad zaškrceným tvarem, - zelené zbarvení nezralého lusku je dominantní nad žlutým, - úžlabní postavení květů je dominantní nad vrcholovým postavením květů, - vysoký stonek je dominantní nad krátkým stonkem.
175
XVII.2. REKOMBINACE A VAZBA GENŮ Výše popsané mechanizmy segregace a volné kombinovatelnosti genů (vloh) platí pouze za předpokladu, že se příslušné geny nacházejí na různých párech homologických chromozomů. Geny, které jsou lokalizovány na tomtéž páru homologických chromozomů, mají tendenci dědit se jako jeden celek. Říkáme, že geny, které jsou lokalizovány na stejném chromozomu jsou geny vázané a dohromady tvoří jednu vazbovou skupinu. Počet vazbových skupin je v diploidní buňce obecně dán počtem párů homologických chromozomů. Geny stejné vazbové skupiny tedy nemohou segregovat a kombinovat se volně, tzn. nezávisle na sobě. To však neznamená, že jejich uskupení na tom kterém chromozomu je absolutně neměnné. V průběhu meiózy mohou v místech chiazmat vznikat zlomy na molekule DNA a určité oblasti nesesterských chromatid se mohou v místech těchto zlomů mechanizmem crossing-overu vyměnit. V důsledku takové výměny částí nesesterských chromatid se u heterozygota změní původní zastoupení alel na jednotlivých chromozomech uvažovaného chromozomového páru. Takovýto jev se označuje jako rekombinace a jedinec, který vznikl v důsledku rekombinace jako rekombinant. K rekombinaci mezi dvěma (či více) geny ve vazbě dochází s určitou pravděpodobností P < 1 a proto i četnost rekombinovaných gamet (resp. rekombinantů) odpovídá této pravděpodobnosti. Jinými slovy, rekombinací se může měnit pořadí jednotlivých forem genů (alel) na chromozomu, avšak pouze s pravděpodobností P < 1, přičemž hodnota této pravděpodobnosti je přímo úměrná vzdálenosti genů na chromozomu. Tedy, čím větší je vzdálenost mezi dvěma uvažovanými geny na chromozomu, tím větší je pravděpodobnost vzniku crossing-overu mezi mimi a tím i rekombinovaných chromozomů, gamet a rekombinantů. Na stanovení pravděpodobnosti vzniku crossing-overu mezi dvěma geny ve vazbě je založeno stanovení tzv. síly vazby: vazba genů je tím silnější, čím menší je pravděpodobnost vzniku crossing-overu mezi dvěma geny na chromozomu, jinými slovy - vazba genů je tím silnější, čím kratší je vzdálenost mezi uvažovanými geny na chromozomu. Základní jednotkou síly vazby u eukaryot je jeden centimorgan (cM), který je definován jako četnost rekombinantů (rekombinovaných gamet) rovnající se jednomu procentu z celkového počtu jedinců hodnoceného souboru. Síla vazby se stanovuje spolehlivě na základě výsledků analytického zpětného křížení vypočtením tzv. Morganova čísla (p):
suma rekombinovaných gamet p = --------------------------------------------suma všech gamet
Méně spolehlivé výsledky lze získat na základě vyhodnocení štěpných poměrů při dostatečně velkém, reprezentativním souboru jedinců v generaci F2.
176
Problematiku vazby genů budeme konkrétně demonstrovat na příkladu dvou genů téže vazbové skupiny, přičemž každý z nich je tvořen jedním alelovým párem (A, a; B, b) a mezi alelami uvnitř každého alelového páru existuje vztah úplné dominance (viz též schéma uvedené níže). Pro zdůraznění, že lokusy genů leží na stejném páru homologických chromozomů, provádíme symbolický zápis genotypů v podobě zlomku, v němž jsou v čitateli uvedeny alely lokalizované na jednom a ve jmenovateli na druhém chromozomu příslušného páru homologických chromozomů. Křížením dominantního homozygota v obou znacích s recesivním homozygotem v obou znacích (AB/AB x ab/ab) v rodičovské generaci se v generaci F1 objeví dihybridi (AB/ab), jejichž jeden chromozom příslušného páru homologických chromozomů ponese obě dominantní alely (AB) a druhý chromozom téhož páru homologických chromozomů ponese obě recesivní alely (ab). Za předpokladu, že by neexistovala žádná možnost výměny genetického materiálu mezi nesesterskými chromatidami, tvořil by takový dihybrid pouze dvě třídy gamet: AB a ab. Ve skutečnosti však i dihybrid s geny ve vazbě (AB/ab) tvoří obvykle čtyři typy gamet (AB, Ab, aB, ab), avšak v jiném poměru než 1 : 1 : 1 : 1 (jak je tomu u volně kombinovatelných genů, tj. náležejících k různým vazbovým skupinám). Jejich vznik při gametogenezi je výsledkem rekombinace, uskutečněné prostřednictvím crossing-overu v průběhu profáze prvního (redukčního) meiotického dělení. Dihybrid generace F1 (AB/ab) bude produkovat nerekombinované gamety genotypů AB a ab v poměru 1 : 1 a gamety rekombinované genotypů Ab a aB rovněž v poměru 1 : 1, avšak četnost všech nerekombinovaných gamet bude vyšší než četnost všech rekombinovaných gamet, tj. Σ(AB + ab) > Σ(Ab + aB), přičemž tento rozdíl v četnostech nerekombinovaných a rekombinovaných gamet odráží sílu vazby. V generaci F2 budou zastoupeny všechny genotypové i fenotypové kategorie jako v případě dihybridizmu s volně kombinovatelnými alelami (chromozomy), avšak v pozměněných poměrech. Při analytickém zpětném křížení získáme jedince čtyř fenotypových kategorií odpovídající čtyřem genotypovým kategoriím (AB/ab, Ab/ab, aB/ab, ab/ab) v poměru teoreticky shodném s poměrem produkovaných rekombinovaných a nerekombinovaných gamet. Dihybrida s dominantním fenotypem v obou znacích lze v generaci F1 získat též jako potomka rodičů, z nichž jeden je dominantní homozygot ve znaku „A“ a recesivní homozygot ve znaku „B“ (Ab/Ab), druhý je recesivní homozygot ve znaku „A“ a dominantní homozygot ve znaku „B“ (aB/aB). Genotyp dihybrida v generaci F1 nyní zapíšeme ve formě Ab/aB, protože rozložení alel A, a, B, b na jednotlivých chromozomech příslušného páru homologických chromozomů je u něho jiné, než u dihybrida dříve uvažovaného (AB/ab). Toto odlišné uspořádání alel na jednotlivých chromozomech příslušného páru homologických chromozomů se projeví při produkci gamet dihybrida Ab/aB: genotypy nerekombinovaných gamet budou Ab a aB, kdežto genotypy rekombinovaných gamet budou AB a ab. Četnost jednotlivých kategorií nerekombinovaných gamet bude 1 : 1, právě tak jako četnost jednotlivých kategorií rekombinovaných gamet, avšak – stejně jako v předchozím případu – celková četnost gamet nerekombinovaných bude vyšší než celková četnost gamet rekombinovaných, tedy: Σ(Ab + aB) > Σ(AB + ab). Podle uspořádání alel v rámci jedné vazbové skupiny (tj. jednoho páru homologických chromozomů) se rozlišují dvě vazbové fáze: cis (dříve coupling) a trans (dříve repulsion). Jestliže u jednoho z rodičů jsou na obou chromozomech zastoupeny pouze dominantní alely (AB/AB) a u druhého pouze recesivní alely (ab/ab) dvou genů ve vazbě, jedná se o vazbovou fázi cis. Jestliže u jednoho z rodičů jsou na jednom chromozomu zastoupeny dominantní alely jednoho a recesivní alely druhého ze dvou genů ve vazbě (Ab/Ab) a u druhého je tomu naopak (aB/aB), jedná se o vazbovou fázi trans.
177
Schéma křížení při vazbě genů: Genotypy rekombinovaných gamet a genotypy rekombinantů jsou psány tučně.
P:
AB/AB
F1:
četnosti zygot B1:
AB
aB
ab
a2
a3
a4
a1 = a4, a2 = a3 a1 + a4 > a2 + a3
pcis = (a2 + a3) / a1 + a2 + a3 + a4)
Ab/Ab
F1:
četnosti zygot B1:
Ab
a1
P:
B1:
(vazbová fáze cis)
AB/ab : Ab/ab : aB/ab : ab/ab
Morganovo číslo:
gamety dihybrida
ab/ab
AB/ab
gamety dihybrida B1:
x
x
aB/aB
(vazbová fáze trans)
Ab/aB AB
Ab
aB
ab
AB/ab : Ab/ab : aB/ab : ab/ab
a1
Morganovo číslo:
a2
a3
a4
a1 = a4, a2 = a3 a 1 + a4 < a2 + a3
ptrans = (a1 + a4) / a1+ a2 + a3 + a4)
Výsledky studia vazby genů potvrdily lineární uspořádání genů na chromozomech a jsou využívány pro konstrukci genetických map. Genetické mapy udávají pořadí genů a vzdálenost mezi nimi, vyjádřenou v jednotkách síly vazby (cM), na jednotlivých chromozomech daného biologického druhu. Kromě map genetických, konstruovaných na základě analýzy vazbových skupin, existují ještě mapy cytologické (resp. cytogenetické), ve kterých je možné za použití vhodných cytologických (resp. cytogenetických metod) lokalizovat a případně vizualizovat na jednotlivých chromozomech lokusy genů, a mapy fyzikální (sekvenční, restrikční), ve kterých je uvedena primární struktura DNA (resp. RNA u RNA-virů) jednotlivých genů. Mezi všemi třemi druhy map musí existovat soulad, tedy vzájemná převoditelnost.
178
Každý chromozom představuje množinu lineárně uspořádaných genů. Teoreticky mezi jakýmikoli dvěma sousedními geny (resp. lokusy) může při meiotickém dělení vzniknout crossing-over a uskutečnit se výměna příslušných úseků nesesterských chromatid. Podle počtu takovýchto výměn v rámci jednoho páru homologických chromozomů rozlišujeme několik typů crossing-overů: jednoduchý, dvojitý, trojitý atd., obecně vícenásobný. Pravděpodovnost výskytu dvojitého crossing-overu mezi třemi geny (A, B, C) je teoreticky rovna součinu pravděpodobností vzniku jednoduchého crossing-overu mezi geny „A“ a „B“ a jednoduchého crossing-overu mezi geny „B“ a „C“, tedy PA-B-C = PA-B x PB-C. Obdobné vztahy platí pro další vícenásobné crossing-overy. Pravděpodobnostní vztahy pro jednotlivé typy crossing-overů se využívají v základní metodě genetického mapování založeného na vazbě genů, kterou je tzv. tříbodový test. Při provedení tříbodového testu se sledují současně vazbové vztahy mezi třemi různými geny. Provedení tříbodového testu budeme demonstrovat na modelovém příkladu. Trihybrid generace F1 (ABC/abc) byl zpětně křížen do generace B1 s jedincem genotypu abc/abc a byli získáni potomci fenotypových kategorií v četnostech, uvedených v následujícím schématu tříbodového testu: B1: ABC/abc x abc/abc typ a poloha crossing-overu žádný
gamety v F1
fenotyp v B1
ABC
standard
počet jedinců v B1 400
[%]
80 jeden jednoduchý mezi „A“ a „B“ jeden jednoduchý mezi „B“ a „C“ jeden dvojitý mezi „A“ a „B“ a „B a „C
abc Abc
abc bc
aBC ABc
a
abC AbC
ab b
aBc
a
400 70 14
c
70 26 5,2 26 4 0,8
c
4
Hodnoty relativních četnosti rekombinantů produkovaných v důsledku vzniku jednoduchých crossing-overů (14% a 5,2%) je třeba upravit ještě o hodnotu relativních četností rekombinantů produkovaných v důsledku vzniku dvojitého crossing-overu (0,8%). Korigované hodnoty potom budou 14% + 0,8% = 14,8% pro sílu vazby mezi geny „A“ – „B“ a 5,2% + 0,8% = 6% pro sílu vazby mezi geny „B“ – „C“. Z uvedeného příkladu tříbodového testu vyplývají následující závěry: (1) gen „B“ leží mezi geny „A“ a „C“ (2) síla vazby mezi geny „A“ – „B“ je 14,8 cM, síla vazby mezi geny „B“ - „C“ je 6 cM (3) vzdálenost mezi geny „A“ – „B“ je přibližně 2,5-krát větší než vzdálenost mezi geny „B“ – „C“ Přesnost genetického mapování prováděného na základě vazby genů může být ovlivněna interferencí. Interferencí rozumíme jev, při kterém vznik jednoho crossing-overu snižuje nebo naopak zvyšuje pravděpodobnost vzniku druhého (resp. dalšího) crossing-overu. V případě pozitivní interference je nalezená četost dvojitých (resp. dalších vícenásobných) crossing-overů 179
nižší než teoreticky očekávaná. V případě negativní interference je naopak nalezená četnost dvojitých (resp. dalších vícenásobných) crossing-overů vyšší než teoreticky očekávaná. Poměr mezi nalezenou četností dvojitých (vícenásobných) crossing-overů a jejich teoreticky očekávanou četností se označuje jako koeficient koincidence. Vzhledem ke skutečnosti, že k rekombinaci dochází v profázi prvního meiotického dělení, kdy každý chromozóm sestává z jedné dvojice chromatid, může dvojitý (obecně vícenásobný) crossing – over zasahovat tyto chromatidy v různých kombinacích. Z tohoto hlediska rozlišujeme tři typy dvojitých crossing – overů: reciproký, který zasahuje pouze dvě ze čtyř nesesterských chromatid, komplementární, při kterém jeden crossing – over zasahuje jednu a druhý crossing-over druhou dvojici nesesterských chromatid, a diagonální, při kterém crossingover zasahuje pouze tři chromatidy a to tak, že na jedné chromatidě se vymění dva chromatidové úseky, kdežto na dvou dalších chromatidách se vymění pouze po jednom chromatidovém úseku. Dosud jsme předpokládali, že v důsledku párování homologických chromozomů dojde ke crossing – overu přesně na rozhraní dvou sousedních genů a tudíž následně k reciprokým výměnám alel. V přírodě se však vyskytují určité odchylky od zcela přesného párování homologických chromozomů, které rezultují ve vznik inekválního crossing-overu, při kterém dochází k nereciproké výměně alel. Důsledkem inekválního crossing-overu je duplikace určité oblasti na jedné a delece téže oblasti na druhé z rekombinovaných chromatid, což vede k produkci gamet s nestejným obsahem genetické informace. Duplikace genetického materiálu se významně uplatnily v biologické evoluci (zejména jako prostředky navození a fixace strukturně-funkčních změn v genomu). Při analýze genomů mnoha druhů organizmů se často vyskytují geny s velmi podobnou sekvencí deoxyribonukleotidů; předpokládá se, že tyto geny, někdy označované jako paralogní geny, vznikly opakovanými duplikacemi ancestrálního genu. Takové duplikace mohou být výhodné jak z hlediska jedince, který je jejich nositelem, tak z hlediska evolučního. Například při poškození jednoho z duplikovaných genů může být jeho funkce zajišťována druhým (duplikovaným) genem. V delším časovém intervalu od vzniku duplikace je možné, aby druhý gen nabyl nové funkce, která se může uplatnit při adaptivní evoluci. Konečně odlišné změny, vznikající v duplikovaných (obecně multiplikovaných) genech a přenášené z generace na generaci v různých skupinách potomků, mohou vést prostřednictvím postzygotického izolačního mechanizmu k vytvoření reprodukční bariéry mezi těmito skupinami potomků; jejich další oddělený vývoj ve smyslu nemožnosti vzájemného křížení (migrace genů) mezi příslušníky obou (případně více) skupin, poskytujícího fertilní potomky, může dospět až k evolvování dvou (případně více) samostatných druhů. Mapování bakteriálních chromozomů je možné provádět na základě konjugace, transdukce a transformace. Konjugace je proces (obdobný sexuálnímu), při kterém se prostřednictvím tzv. konjugativního pilusu realizuje výměna genetického materiálu mezi dvěma bakteriálními buňkami po jejich předchozím kontaktu. Konjugace je možná mezi kmeny některých druhů baktérií, které obsahují tzv. fertilitní faktor typu epizomu (kmeny F+) a kmeny, které tento faktor neobsahují ( Fֿ ). Zpravidla se přenese pouze část chromozomu donorové buňky, neboť dojde dříve či později k jeho zlomu. Z recipientní buňky tak vzniká merozygota, která obsahuje celý vlastní chromozom a přenesenou část chromozomu donorové buňky. Přenesená část chromozomu donorové buňky může rekombinovat s homologickou oblastí chromozomu recipientní buňky za vzniku transkonjugantů, které lze použitím vhodného selekčního systému detegovat. Četnost transkonjugantů je mírou síly vazby. Protože je přenos chromozomu z donorové buňky do buňky recipientní polarizován a uskutečňuje se konstantní rychlostí, je četnost přenosu jednotlivých genů lokalizovaných na chromozomu donorové buňky funkcí jejich vzdálenosti od počátku chromozomu (místo ori). Série transkonjugantů, selektovaných po přerušení konjugace v jednotlivých časových intervalech, odráží pořadí genů a vzdálenost 180
mezi nimi na chromozomu v závislosti na délce trvání konjugace. Při mapování bakteriálního chromozomu na základě konjugace se z těchto důvodů udává síla vazby v minutách, nikoli v centimorganech. Transdukce je proces přenosu genetického materiálu z donorové buňky do buňky recipientní zprostředkovaný transdukujícím fágem (obecně virem). Transdukující fágové částice obsahují fragment bakteriálního chromozomu (případně plazmid) donorové buňky, který může být při transdukci včleněn mechanizmem crossing-overu do chromozomu recipientní bakteriální buňky; recipientní buňka, která rekombinací s transdukujícím fágem přijala do svého chromozomu fragment chromozomu donorové bakteriální buňky, se označuje jako rekombinantní transdukant. Pro genetické mapování bakteriálního chromozomu je použitelná transdukce produkující rekombinantní transdukanty. Při nespecifické transdukci se vazba mezi dvěma geny stanovuje na základě tzv. kotransdukce, čímž se rozumí začlenění dvou těsně vázaných genů, přenesených týmž transdukujícím fágem, do chromozomu recipientní buňky. Přenášejí-li se tedy s vysokou četností jedním transdukujícím fágem do stejné recipientní buňky dva geny, lze je považovat za geny, mezi nimiž je silná vazba. Při mapování bakteriálního chromozomu na základě nespecifické transdukce se používá: (1) tzv. dvoubodové křížení. Předpokládejme existenci tří genů „A“, „B“, „C“. Jestliže gen „A“ bude kontransdukovat s genem „B“, gen „B“ bude kontransdukovat s genem „C“ a gen „C“ bude kontransdukovat s genem „A“, lze stanovit pořadí genů na chromozomu „A“ – „B“ – „C“. Vzdálenost mezi těmito geny je dána relativní četností příslušných kontransdukcí. (2) tzv. tříbodové křížení, jehož princip je shodný s výše uvedeným tříbodovým testem. Transformace je přenos izolované (samotné) DNA z donorové buňky do buňky recipientní. Přenesená DNA může rekombinovat s chromozomem recipientní buňky za vzniku rekombinantního transformanta. Dva geny, které se přenesou jednou transformující molekulou DNA do recipientní buňky zároveň, se považují za geny ve vazbě. Četnost transformantů je lineární funkcí koncentrace DNA použité k transformaci. Z tohoto důvodu se při použití transformace vazba genů blíže charakterizuje na základě relativních četností transformantů zjištěných po inkubaci kompetentních recipientních bakteriálních buněk s transformující DNA, aplikovanou v různých koncentracích tvořících koncentrační řadu. Geny (lokusy) rekombinantních transformantů, kteří se vyskytnou ve vyšších četnostech i při použití transformující DNA v nižších koncentracích, jsou vzdálenější než geny transformantů, kteří se vyskytnou v nižších četnostech a při použití transformující DNA ve vyšších koncentracích. Rekombinace je možná i u bakteriofágů (virů). Dokazují to pokusy s mutantními fágy (viry). Například při směsné infekci bakteriální kultury dvěma typy mutantních fágů, z nichž genotyp jednoho typu je např. a+b¯ a druhého a¯ b+, se vyskytnou též fágové částice s nemutantním (standardním) fenotypem (genotyp a+b+) a dvojnásobně mutantním fenotypem (genotyp a¯ b¯ ). Tuto skutečnost můžeme interpretovat jako důsledek rekombinace mezi oběma mutantními fágy (viry). Poznatky z oblasti studia vazby genů a rekombinace se uplatňují v poslední době při genových manipulacích, založených na technologiích využívajících rekombinantní DNA.
181
XVIII. GENETICKÁ INFORMACE XVIII.1. GENETICKÁ INFORMACE A GENETICKÝ KÓD Termínem genetická informace se rozumí informace o primární struktuře proteinů, o primární struktuře tRNA a rRNA (obecně funkčních RNA), o vazbě specifických proteinů k molekule DNA (resp. RNA) a v případě RNA-organizmů též o primární struktuře DNA, determinovaná sekvencí deoxyribonukleotidů v DNA (resp. ribonukleotidů v RNA u RNA-organizmů). Mezi významné vlastnosti genetické informace patří vysoká stabilita, vysoký stupeň specifičnosti v rámci druhu, schopnost téměř bezchybné autoreprodukce (replikace) a přenosu směrem vertikálním (z generace na generaci) i horizontálním (např. při konjugaci, transdukci, transformaci). Tyto vlastnosti jsou nezbytné pro zachování evolvovaných struktur a funkcí uspořádaných otevřených systémů, jakými organizmy na jakékoli úrovni fylogenetického vývoje jsou. Zároveň však existuje možnost změny nukleotidové sekvence (mutabilita) v molekulách nukleových kyselin, rezultující v adekvátní změnu genetické informace (mutace). Mutabilita v nejobecnější rovině reprezentuje další základní vlastnost DNA, jejímž prostřednictvím vzniká nový materiál pro biologickou evoluci. Genetickou informaci lze charakterizovat jako vnitřně rozpornou, protikladnou: na jedné straně se projevuje jako konzervativní tím, že se reprodukuje, přenáší a exprimuje v nezměněné podobě (smyslu), na straně druhé se projevuje jako progresívní tím, že může být pozměněna následkem změny struktury jejího materiálního substrátu (DNA, resp. RNA) a ve změněné podobě, není-li tato ve svých důsledcích letální, následně zakonzervována. Je třeba podotknout, že ve způsobu řešení této dialektické rozpornosti genetické informace v interakci s faktory prostředí (environmentu) spočívají základní zákonitosti vývoje ve smyslu fylogenetickém i ontogenetickém. Uvědomění si a pochopení nerozlučitelnosti momentu konzervativního a progresívního při jejich současně relativní protikladnosti v případě genetické informace (resp. struktury nukleových kyselin) je východiskem pro pochopení vzájemnosti (vzájemné podmíněnosti a souvislosti) dědičnosti a proměnlivocti organizmů. V polydeoxyribonukleotidových řetězcích DNA je jedinou reálnou variabilní komponentou jejich struktury pořadí (sekvence) deoxyribonukleotidů (zkráceně bází); jednotky deoxyribózafosfátové kostry jsou uniformní. Z definice genetické informace vyplývá, že soubor variant o určitém počtu nukleotidů determinuje soubor dvaceti (příp. jednadvaceti) standarních aminokyselin zabudovávaných při proteosyntéze do polypeptidových řetězců proteinů. K jednoznačnému určení každé ze souboru standardních aminokyselin není postačující jedna báze nebo dvojice bází DNA. Za vyhovující lze přijmout až předpoklad, že každá ze souboru standardních aminokyselin je determinována trojicí bází; v tomto případě je počet variací s opakováním Vk(n) = 43 = 64. Tak lze dospět k závěru, který byl experimentálně potvrzen, že genetický kód je tripletový, to znamená, že je sestaven z třínukleotidových sekvenčních jednotek (z nichž každá determinuje určitou aminokyselinu, anebo plní jinou funkci). Vzhledem k tomu, že počet možných variací tripletů ze čtyř různých bází je 64, jsou některé aminokyseliny kódovány jednou variantou tripletu, jiné více variantami tripletů a některé varianty tripletů nekódují žádnou aminokyselinu. Skutečnost, že některé varianty tripletů mohou kódovat stejný druh aminokyseliny a současně některé varianty tripletů nekódují žádnou aminokyselinu, se označuje jako degenerace genetického kódu a proto je genetický kód označován jako degenerovaný. Genetická informace se exprimuje prostřednictvím transkripce (přepisu) a translace (překladu). Transkripcí strukturních genů vzniká jako konečný produkt mRNA, jejíž sekvence ribonukleotidů je komplementární k sekvenci deoxyribonukleotidů řetězce DNA, který plnil funkci templátu (matrice). Triplety mRNA jsou označovány jako kodony. O kodonech mRNA, 182
které determinují aminokyseliny v polypeptidovém řetězci říkáme, že mají smysl, kdežto o kodonech, které nekódují žádnou aminokyselinu, říkáme, že jsou nesmyslné nebo beze smyslu (nonsens); nesmyslné kodony signalizují začátek syntézy polypeptidového řetězce (iniciační kodon AUG) nebo její konec (terminační kodony UAA, UAG, UGA). Genetický kód (tvořený celkem 64 kodony) tedy můžeme definovat jako systém pravidel, podle nichž jednotlivé kodony mRNA určují řazení aminokyselin do polypeptidu. Kodony nesmyslné lze z hlediska jejich funkce rozdělit do dvou skupin, z nichž jednu představují kodony terminační (UAA, UAG, UGA) a druhou představuje jeden kodon iniciační (AUG). Zde je však třeba poznamenat, že některé z těchto kodonů jsou bifunkční; jedná se o iniciační kodon AUG, který jednak signalizuje začátek syntézy polypeptidového řetězce, jednak kóduje aminokyselinu metionin, a o terminační kodon UGA, který jednak signalizuje ukončení syntézy polypeptidového řetězce, jednak může kódovat aminokyselinu selenocystein. Odlišné kodony se stejným smyslem jsou kodony synonymní a jak je patrné z tabulky standardního genetického kódu, je jich většina. Z nich ty, které se liší pouze ribonukleotidem ve třetí pozici, vytvářejí tzv. kodonovou rodinu. Smysl jednotlivých kodonů je ve všech organizmech shodný (až na nečetné výjimky týkající se především odchylek v mitochondriálním genetickém kódu). Genetický kód (či přesněji standardní genetický kód, uvedený v tabulce) lze tudíž považovat za univerzální. Shrneme-li výše uvedené informace, můžeme konstatovat tři charakteristické znaky genetického kódu: je tripletový, degenerovaný a univerzální. Standardní genetický kód je přehledně uveden v následující tabulce:
první ribonukleotid druhý nukleotid kodonu třetí ribonukleotid kodonu U C A G kodonu Phe Ser Tyr Cys U U Phe Ser Tyr Cys C Leu Ser term. term. A (SeCys) Leu Ser term. Trp G
C
A
G
Leu Leu Leu Leu
Pro Pro Pro Pro
His His Gln Gln
Arg Arg Arg Arg
U C A G
Ile Ile Ile inic. Met
Thr Thr Thr Thr
Asn Asn Lys Lys
Ser Ser Arg Arg
U C A G
Val Val Val Val
Ala Ala Ala Ala
Asp Asp Glu Glu
Gly Gly Gly Gly
U C A G
183
Při translaci (překladu genetické informace) se s jednotlivými kodony, jejichž pořadí v molekule mRNA determinuje pořadí aminokyselin v konkrétním polypeptidovém řetězci, dočasně komplementárně spojují příslušné druhy tRNA takzvanými antikodony, tj. triplety lokalizovanými v jejich antikodonovém rameni. Každá tRNA, která se účastní procesu translace na ribozomu, má na svém akceptorovém rameni navázánu molekulu aminokyseliny odpovídající danému kodonu. Lineárním řazením jednotlivých molekul tRNA (s navázanými aminokyselinami) komplementárně k sekvenci ribonukleotidů mRNA jsou při translaci vytvořeny na ribozomu podmínky pro vznik peptidové vazby mezi karboxylovou skupinou jedné aminokyseliny a aminoskupinou sousední (následující) aminokyseliny. Vzájemným uspořádáním molekul mRNA, tRNA s navázanými aminokyselinami a specifických oblastí ribozomů je umožněna translace - základní mechanizmus proteosyntézy.
XVIII.2. KONCEPCE GENU Genetická informace je strukturně a funkčně diferencovaná. Její základní jednotkou je gen. Gen lze definovat jako určitý úsek molekuly DNA (resp. RNA u RNA-virů), který obsahuje informaci o primární struktuře určitého polypeptidu (proteinu), tRNA, rRNA, nebo o vazbě specifických molekul proteinů k molekule DNA. Geny, které kódují primární strukturu nějakého polypeptidu jako produktu translace, se označují jako geny strukturní. Geny, které kódují primární strukturu funkčních tRNA a rRNA, tedy molekul RNA, které nejsou translatovány, se označují jako geny pro funkční RNA. Geny, které obsahují informaci nutnou pro rozpoznání specifickým proteinem, jsou označovány jako geny (nebo oblasti) regulační. Expresí genetické informace strukturních genů a genů pro funkční RNA vznikají určité vlastní produkty těchto genů (polypeptidy), kdežto expresí regulačních genů žádný vlastní produkt nevzniká. Vzhledem k tomu, že nukleotidy v řetězcích DNA (resp. RNA) jsou uspořádány lineárně, jsou též jednotlivé geny řazeny lineárně. Pořadí genů je, nebereme-li v úvahu mutační změny, konstantní a specifické pro každý druh. Jak víme, DNA jako nositelka genetické informace interaguje v eukaryotických buňkách s dalšími buněčnými komponentami. Mohou tak vznikat složitější struktury, které obsahují DNA s lineárně seřazenými geny; takové struktury se nazývají genofory. Genoforem RNA-virů je pouze vlastní RNA, genoforem DNA-virů nebo prokaryotické buňky je pouze vlastní DNA. V těchto případech se zpravidla jedná o jednu kružnicovou molekulu DNA, která je u virů obklopena kapsidem a u prokaryot lokalizovaná volně v prostředí cytoplazmy, neboť buněčné jádro v morfologickém slova smyslu se v buňkách těchto organizmů nevyskytuje; útvar jemu odpovídající se označuje jako nukleoid a sám genofor jako bakteriální (resp. prokaryotický) chromozom. Typickým genoforem eukaryotických buněk je chromozom, který představuje nukleohistonový komplex, lokalizovaný v morfologicky vyvinutém buněčném jádru. Každé jádro eukaryotické buňky obsahuje (za normálního stavu) konstantní počet morfologicky specificky individualizovaných chromozomů; to znamená, že celková genetická informace je v buněčném jádru rozdělena – a to zcela striktně – do několika (minimálně dvou) částí, reprezentovaných jednotlivými chromozomy.
184
STRUKTURA CHROMOZOMU
V eukaryotických buňkách je genetická informace lokalizována nejen v buněčném jádru, ale též v dalších organelách: v mitochondriích buněk rostlin, hub i živočichů a v chloroplastech buněk rostlin. Ani u bakterií není jediným genoforem veškeré genetické informace bakteriální chromozom; kromě něho může být v cytoplazmě bakteriální buňky přítomn jedna nebo několik kružnicových molekul vytvářejících útvary, označované jako plazmidy. Společnou vlastností plazmidové, chloroplastové a mitochondriální DNA je relativní nezávislost (autonomie) na buněčném jádru, resp. nukleoidu. Soubor veškeré genetické informace (všech genů) v buňce nebo ve virové částici se označuje jako genom. V eukaryotických buňkách je jeho převážná část umístěna v buněčném jádru a reprezentuje tzv. jaderný genom. Výrazně menší část genomu je umístěna jednak v mitochondriích a reprezentuje mitochondriální genom, jednak u rostlin ještě v chloroplastech, kde reprezentuje chloroplastový genom. Mitochondriální a chloroplastový genom bývají někdy označovány jako mimojaderný, extranukleární nebo cytoplazmatický genom. Analogicky u baktérií tvoří hlavní část genomu bakteriální chromozom (resp. nukleoid), kdežto menší část genomu tvoří plazmidová DNA. Mezi jednotlivými složkami genomu buňky existují vzájemné vztahy při současném zachování jejich relativní samostatnosti (autonomie). Genom buňky jako celek je tedy vnitřně strukturovaný, diferencovaný a organizovaný. Počet kopií jaderných genoforů v buňce vyjadřuje stupeň ploidie. Ve virových částicích a v prokaryotických (bakteriálních) buňkách funkci genoforu plní zpravidla pouze jedna molekula DNA (příp. RNA u RNA-virů); takové organizmy označujeme jako haploidní. Eukaryotické 185
somatické buňky obsahují větší počet chromozomů v párovém uspořádání; takové buňky označujeme jako diploidní. Eukaryotické gametické buňky (gamety), vznikající jako produkt redukčního dělení (meiózy), obsahují poloviční počet chromozomů buněk somatických (diplodních), tj. po jednom členu od každého páru homologických chromozomů, a označujeme je jako haploidní. Každý jednotlivý genofor je charakterizován určitou uspořádanou množinou genů, která se označuje jako vazbová skupina. Genofory (chromozomy) se shodnými vazbovými skupinami jsou nazývány homologické, genofory (chromozomy) s odlišnými vazbovými skupinami se nazývají nehomologické. Homologické chromozomy v eukaryotických diplodních (somatických) buňkách vytvářejí homologické páry, tj. páry chromozomů se shodnou sadou genů uspořádaných ve shodném pořadí a shodně umístěných. U gonochoristů se vyskytují tzv. pohlavní chromozomy neboli gonozomy (též heterochromozomy či sex-chromozomy), přičemž dvojice (pár) homologických chromozomů primárně determinuje vznik jednoho pohlaví a dvojice nehomologických (resp. částečně homologických) pár primárně determinuje vznik opačného pohlaví. Kromě gonozomů se v diploidních buňkách vyskytují všechny ostatní chromozomy důsledně jako páry homologických chromozomů. Počet vazbových skupin v diploidní eukaryotické buňce je obecně roven počtu párů homologických chromozomů; výjimku představují ty případy, kde je heterogametické pohlaví chromozomálně determinováno nehomologickými (resp. částečně homologickými) gonozomy. Místo, na kterém je daný gen na chromozomu lokalizován, se nazývá lokus. Zpravidla se každý gen může vyskytovat alespoň ve dvou formách, které označujeme jako alely (existují též geny pouze s jednou alelou, nebo alespoň další dosud není známa). Protože gen představuje určitý úsek molekuly DNA (resp. RNA u RNA-virů), je zřejmé, že jednotlivé alely se v tomto úseku liší sekvencí nukleotidů (tedy primární strukturou). Alely, které vedou k syntéze příslušného genového produktu bývají označovány jako alely dominantní, alely, které jsou v tomto smyslu neaktivní, bývají označovány jako alely recesívní. Alely dominantní se podle dohody obvykle značí velkými písmeny (např. A, B), alely recesívní malými písmeny (např. a, b). Alely, které jsou v přírodních populacích zastoupeny nejvíce (obvykle alely dominantní), jsou považovány za alely standardní (též divoké) a podle konvence bývají označovány samostatnými písmeny nebo skupinami písmen s křížkem (plus) v exponentu (např. a+, his+). V řadě případů existuje více forem téhož genu, tedy více alel než jenom dvě. Takovéto molekulární varianty genu mohou vytvářet alelové série, avšak je třeba připomenout, že v diploidní buňce se vyskytují pouze dvě určité alely z příslušné alelové série.
XVIII.3. REPLIKACE DNA Mezi základní genetické procesy v buňce patří replikace, transkripce a translace genetické informace. Replikace je procesem kopírování (množení) DNA (případně RNA u některých RNA-virů), transkripce (přepis) a translace (překlad) jsou procesy exprese (vyjádření) genetické informace. Replikace DNA je proces zdvojení DNA obsažené v buněčném genomu (resp. v jeho jednotlivých součástech). Je hlavním mechanismem, který ve vazbě na buněčné dělení zabezpečuje v přírodě téměř dokonale přesnou distribuci genetického materiálu (DNA) mezi buňkami jak z hlediska kvantitativního (druhově konstantní množství DNA v genomu), tak kvalitativního (kopie DNA podle matrice). Vzhledem k odlišnostem mezi různými typy genoforů i obecně mezi buňkami prokaryotickými a eukaryotickými existují jim odpovídající odlišnosti v procesu replikace DNA. Nicméně replikace jako jeden ze základních intracelulárních genetických procesů vykazuje jisté obecně platné znaky: 186
1. začíná v replikonu vždy od počátku (místo ori) za vytvoření replikační vidlice. Jako replikon se označuje molekula DNA nebo její část, která obsahuje počátek (tj. nukleotidovou sekvenci, na kterou se váží specifické proteiny umožňující zahájit replikaci a řídit celý její průběh). 2. uskutečňuje se podle matričního řetězce (templátu) enzymaticky katalyzovanou polymerací deoxyribonukleotidů ve směru 5´→ 3´ na základě komplementarity bází. Mechanizmus, vyžívající matrice (templátu), umožňuje biosyntézu identické kopie DNA a vytváří tak základní předpoklad pro následný přenos nezměněné DNA (genetické informace) do nově vznikajících buněk při buněčném dělení. 3. je semidiskontinuální v případě dsDNA, neboť jeden řetězec (tzv. vedoucí) je syntetizován kontinuálně, kdežto druhý (tzv. opožďující se) je syntetizován diskontinuálně v Okazakiho fragmentech. 4. je semikonzervativní, to znamená, že každá zreplikovaná dsDNA sestává z jednoho řetězce pocházejícího z původní molekuly dsDNA a z jednoho řetězce nově syntetizovaného (pro jehož syntézu byl matricí právě onen původní řetězec). 5. představuje vícestupňový proces (iniciace, elongace, terminace) enzymaticky katalyzovaný (polymerázy, nukleázy, ligázy). Iniciace replikace zahrnuje procesy, kterými se replikace zahajuje (rozpoznání místa ori replikačními proteiny, lokální denaturace v oblasti místa ori, rozvolnění a despiralizace řetězců DNA, vytvoření replikační vidlice). Elongace je fází následující po iniciaci, v níž se polymerací syntetizuje nový polynukleotidový řetězec komplementární k matričnímu řetězci a to postupným připojováním jednotlivých deoxyribonukleotid-5´-fosfátů svým 5´- koncem k 3´- konci nascentního řetězce za katalytické tvorby fosfodiesterové vazby. Terminace je závěrečnou fází replikace DNA a představuje soubor procesů, kterými se na specifickém místě ukončuje replikace. Nový řetězec (resp. jeho úseky) DNA je při replikaci syntetizován za katalytického účinku DNA-polymeráz, avšak zahájena může být tato syntéza pouze v přítomnosti krátkého oligoribonukleotidu (RNA-primer) nebo oligodeoxyribonukleotidu (DNA-primer). U prokaryot jsou známy tři druhy DNA-polymeráz. Jednou z nich je DNA-polymeráza I, která vyžaduje DNA-primer k zahájení syntézy nového řetězce DNA; kromě polymerázové aktivity disponuje též exonukleázovou aktivitou ve směru 3´→ 5´i 5´→ 3´. DNA-polymeráza II rovněž disponuje exonukleázovou aktivitou ve směru 3´→ 5´i 5´→ 3´. DNA-polymeráza III je heterooligomer složený z několika podjednotek, které plní významné a relativně samostatné funkce. Tři podjednotky tvoří katalytické jádro; dvě katalytická jádra se mohou spojit za vzniku dimeru DNA-polymerázy III (též označován PolIII*), charakteristického zvýšenou procesivitou (ve srovnání se základním uspořádáním katalytického jádra DNA-polymerázy III). Dalším nezbytným enzymem pro úspěšnou replikaci DNA je ligáza, která katalyzuje vytvoření fosfodiesterové vazby mezi 5´- a 3´- koncem polynukleotidových řetězců nebo jejich fragmentů (Okazakiho fragmenty). Do procesu replikace DNA zasahují i některé další enzymy (např. gyráza) a bílkovinné faktory, které zde nejsou blíže zmiňovány, nicméně plní své specifické funkce.
187
XVIII.3.1 REPLIKACE PROKARYOTICKÉHO CHROMOZOMU Prokaryotický (bakteriální) chromozom je tvořen jednou kružnicovou molekulou dsDNA s místem ori a má tedy vlastnosti replikonu. Specifické replikační proteiny při iniciaci replikace rozpoznávají místo ori a v aktivovaném stavu se k němu navazují; v důsledku této vazby (a dalších interakcí, zejm. mezi přítomnými proteiny) dochází k lokální denaturaci bakteriálního chromozomu, k rozrušení vodíkových vazeb mezi komplementárními bázemi a tím k rozvolnění polydeoxyribonukleotidových řetězců molekuly DNA v místě ori. Následně se do oblasti počátku replikace na takto uvolněné řetězce DNA naváží z obou stran molekuly helikázy, v jejichž přítomnosti se začne řetězec DNA despiralizovat ve směru 5´→ 3´ za vzniku replikační vidlice. Vznikající jednořetězcové úseky v replikačních vidlicích jsou udržovány v linearizovaném stavu účinkem tzv. SSB-proteinů. Další děje spadají již do fáze elongace. Replikační vidlice se pohybuje obousměrně od místa ori za katalytického účinku helikázy a účinku SSB-proteinů. Úměrně s postupem replikační vidlice se za katalytického účinku primázy a v součinnosti s helikázou začíná v počátečním místě replikace syntetizovat primer pro vedoucí řetězec; protože se vedoucí řetězec syntetizuje kontinuálně, stačí pro jeho kompletní syntézu pouze jeden primer. Naproti tomu syntéza opožďujícího se řetězce DNA je možná jen za tvorby většího počtu primerů (v každém Okazakiho fragmentu jednoho), katalyzované komplexem sestávajícím minimálně z primázy a helikázy a označovaným jako primozom. Jakmile je ten který primer k dispozici, účinkem DNA-polymerázy III se k jeho 3´- konci napojí dNTP komplementární k matričnímu řetězci za vytvoření fosfodiesterové vazby a uvolnění pyrofosfátu. Postupně se takto nasyntetizuje vedoucí řetězec kontinuálně (počínaje primerem), kdežto opožďující se řetězec se syntetizuje diskontinuálně. RNA-primery jsou poté odstraněny účinkem exonukleázové aktivity DNApolymerázy I od 5´- konce a zároveň polymerázovou aktivitou této DNA-polymerázy je katalyzována syntéza fragmentů deoxyribonukleotidových řetězců v místech uvolněných po primerech; takto dosyntetizované fragmenty deoxyribonukleotidových řetězců jsou se sousedními úseky DNA spojeny účinkem katalytické aktivity ligázy. Replikace celého chromozomu končí na specifických sekvencích označovaných jako terminátory, na něž se váže specifický protein (tzv. Tus-protein), který inhibuje aktivitu helikázy a tím znemožňuje další tvorbu (resp. posun) replikační vidlice.
XVIII.3.2. REPLIKACE CHROMOZOMOVÉ DNA EUKARYOT Replikace DNA eukaryot se vyznačuje stejnými obecnými znaky jako replikace DNA prokaryot: je semikonzervativní, semidiskontinuální, uskutečňuje se ve směru 5´→ 3´ a celý proces replikace lze rozdělit do tří fází: iniciace, elongace a replikace. Významné odlišnosti replikace eukaryot nicméně existují. Především je třeba uvést, že replikace jaderné DNA se realizuje pouze v S-fázi interfáze buněčného cyklu. Další odlišností je skutečnost, že zreplikovaná DNA v průběhu buněčného dělení (mitózy nebo meiózy) se distribuuje v podobě jednotlivých chromozómů do nově konstituovaných buněčných jader a po uskutečněné cytokinezi jejich prostřednictvím do nově vzniklých („dceřinných“) buněk. DNA každého chromozomu je celým souborem lineárně uspořádaných replikonů, z nichž každý má vlastní počátek (místo ori). V průběhu S-fáze se replikace DNA realizuje v každém dílčím časovém intervalu na několika replikonech současně a v určitém časovém sledu kompletně v rozsahu celého jaderného genomu, přičemž za normálních podmínek je každý replikon zreplikován pouze jedenkrát. Obecně platí, že euchromatinové oblasti chromozomů
188
bývají replikovány v časnějších obdobích S-fáze, kdežto heterochromatinové úseky v obdobích pozdnějších. Na replikaci vedoucího a opožďujícího se řetězce eukaryotické jaderné (chromozomové) DNA participují odlišné typy DNA-polymeráz. DNA-polymeráza α katalyzuje syntézu oligodeoxyribonukleotidů opožďujícího se řetězce v Okazakiho fragmentech. DNA-polymeráza δ katalyzuje syntézu vedoucího řetězce a dokončuje syntézu opožďujícího se řetězce. V eukaryotických buňkách existuje možnost reparace chyb vzniklých při replikaci; v tomto procesu se uplatňuje DNA-polymeráza β katalytickou aktivitou při syntéze oligonukleotidů v reparovaných úsecích DNA.
SCHÉMA REPLIKACE CHROMOZOMOVÉ DNA EUKARYOT
Iniciace replikace na příslušných replikonech chromozomové DNA eukaryot zahrnuje rozpoznání místa ori na replikonech specifickými proteiny, jejich navázání do této oblasti a lokální despiralizaci dsDNA účinkem helikázové aktivity těchto proteinů; končí vytvořením replikační vidlice, která se v následujícím průběhu replikace pohybuje oběma směry. Ve fázi elongace jsou prostřednictvím komplexu DNA-polymerázy α a primázy (komplex polα/prim) nasyntetizovány RNA-primery pro tvorbu Okazakiho fragmentů a části polydeoxyribonukleotidových řetězců těchto fragmentů. Následně je komplex polα/prim uvolněn specifickým proteinem (RFC protein), jenž zároveň umožňuje navázání DNA-polymerázy δ, která dosyntetizuje polydeoxyribonukleotidové řetězce v Okazakiho fragmentech včetně oblastí primerů, které byly již předtím účinkem ribonukleázy odstraněny. Vedoucí řetězec je syntetizován kontinuálně v celém replikonu za katalytického působení DNA-polymerázy α, přičemž pouze oblast na původním místě primeru je dodatečně dosyntetizována za katalýzy DNA-polymerázy δ. Na spojení nově syntetizovaných řetězců DNA (resp. jejich úseků) se podílí ligáza tím, že katalyzuje tvorbu fosfodiesterových vazeb. Zakončení (terminace) replikace lineárních molekul dsDNA v chromozomech eukaryot se účastní telomeráza, která katalyzuje zvláštní syntézu telomerních konců chromozomů. 189
Telomeráza je ribonukleoprotein, jehož RNA plní úlohu matrice, podle níž jsou za katalytického účinku proteinové části enzymu k primeru syntetizovány telomerní repetice. Poměrně složitým způsobem je 3´- konec řetězce DNA účinkem telomerázy prodloužen, komplementárně k prodlouženému úseku jsou syntetizovány další Okazakiho fragmenty, posléze jsou jejich primery odstraněny a uvolněná místa dosyntetizována komplementárními deoxyribonukleotidy za přítomnosti DNA-polymerázy δ. Tím je též umožněno dokončení replikace lineární dsDNA na původním (neprodlouženém) 3´- konci matričního řetězce pro syntézu opožďujícího se řetězce, neboť na takovém konci po odstranění primeru by nebyl k dispozici žádný deoxyribonukleotid, ke kterému by mohly být za katalýzy DNA-polymerázy postupně připojeny deoxyribonukleotidy, jimiž by se zaplnilo uvolněné místo po primeru.
XVIII.4. TRANSKRIPCE Zakódovaná genetická informace se v buňce musí adekvátními mechanismy dešifrovat a exprimovat. Realizace genetické informace v buňce je možná především prostřednictvím transkripce (přepisu) a translace (překladu) genetické informace. Transkripcí rozumíme enzymaticky katalyzovaný a autoregulovaný proces, při kterém se genetická informace, obsažená ve formě lineárně uspořádané sekvence deoxyribonukleotidů v určitém úseku DNA, přepíše do komplementární lineárně uspořádané sekvence ribonukleotidů, označované jako mediátorová RNA (mRNA), resp. primární transkript (hnRNA, pre-mRNA). Transkribována může být též informace z RNA do RNA (u některých RNA-virů) a z RNA do DNA (u RNA-virů za přítomnosti reverzní transkriptázy čili revertázy, která je schopna na matričním řetězci RNA katalyzovat syntézu komplementárního polydeoxyribonukleotidového řetězce). Genetická informace se však přepisuje po určitých úsecích molekuly DNA. Přepisované úseky DNA (eukaryot, prokaryot i DNA-virů), na kterých jsou lokalizovány strukturní geny nebo geny pro funkční RNA, se označují jako transkripční jednotky. Každá transkripční jednotka se vyznačuje určitým obecně platným uspořádáním. Na jejím začátku se nachází tzv. startovací nukleotid, což je deoxyribonukleotid, od něhož začíná přepisování celé transkripční jednotky; podle konvence je startovací nukleotid označován číslem +1. Jedna transkripční jednotka může obsahovat jeden přepisovaný gen (transkripční jednotka monogenní či monocistronní), anebo více přepisovaných genů (transkripční jednotka multigenní či polycistronní). Transkripční jednotka je zakončena regulační oblastí zvanou terminátor, která následuje za posledním genem transkripční jednotky, je její součástí a tudíž se přepisuje. Při přepisu genetické informace strukturního genu eukaryotická DNA se nejprve syntetizuje tzv. primární transkript (hnRNA), což představuje jednu molekulu polyribonukleotidového řetězce komplementárního k přepisovanému matričnímu řetězci DNA v rozsahu jedné transkripční jednotky. Primární transkript může být následně podroben různým posttranskripčním úpravám, jejichž výsledkem je finální molekula mRNA. Před startovacím nukleotidem (tj. vlevo od +1) se nachází regulační oblast, která se nepřepisuje. Touto regulační oblastí je tzv. promotor, jenž tvoří úsek polydeoxyribonukleotidového řetězce DNA, který rozpoznávají a na který se váží proteiny nezbytné pro zahájení transkripce. Transkripční jednotka bez promotoru (resp. s promotorem poškozeným) nemůže být transkribována. Funkční transkripční jednotka sestávající z promotoru, startovacího nukleotidu, přepisovaných genů a terminátoru se označuje jako neoperonová transkripční jednotka. U prokaryot se kromě ní vyskytují transkripční jednotky jiného typu, tzv. operony. Nesou ještě další regulační oblast mezi promotorem a startovacím nukleotidem, zvanou operátor. 190
Funkční význam operátoru spočívá v regulaci transkrice: naváže-li se na operátor určitý protein, tzv. represor, následně se zastaví transkripce; naopak, je-li represor z operátoru uvolněn, může být transkripce zahájena nebo obnovena. Operon tedy sestává z promotoru, operátoru, starovacího nukleotidu, přepisovaných genů a terminátoru. Transkripční jednotky neoperonové jsou řízeny pouze promotorem, kdežto operony promotorem i operátorem. SCHÉMA TRANSKRIPČNÍ JEDNOTKY A TRANSKRIPCE
V buňkách eukaryot se některé transkripční jednotky navzájem přesahují. Následkem toho se potom mohou v genomu vyskytovat kromě transkripčních jednotek nepřesahujících transkripční jednotky se stejným začátkem a různými konci, s různým začátkem a stejnými konci, nebo s různými začátky i různými konci. Proces polymerace ribonukleotidů při vzniku primárního transkriptu v průběhu transkripce katalyzuje RNA-polymeráza. U prokaryot existuje pouze jeden druh RNA-polymerázy, která rozpoznává promotory všech transkripčních jednotek. Naopak u eukaryot jsou známy tři druhy RNA-polymeráz: RNA-polymeráza I katalyzuje syntézu pre-rRNA v buněčném jadérku (kde se vyskytuje), RNA-polymeráza II katalyzuje syntézu primárního transkriptu (hnRNA) a 191
některých malých molekul rRNA v buněčném jádru a RNA-polymeráza III katalyzuje syntézu pre-tRNA, 5S-rRNA a některých malých RNA v jádru. Na rozdíl od ssDNA, kde se může transkribovat pouze jeden přítomný polydeoxyribonukleotidový řetězec, je v případech dsDNA již možnost volby. V buňkách se zpravidla v určitém časovém okamžiku přepisuje jen jeden z obou řetězců dsDNA; plní matriční funkci a označuje se jako řetězec negativní (nekódující, antikódující, transkribující se). Druhý řetězec, který neplní matriční funkci, se označuje jako řetězec pozitivní (kódující, netranskribující se). Z uvedeného však nevyplývá, že by vždy celý jeden řetězec dsDNA musel být buď negativní nebo pozitivní; běžné jsou případy, kdy určité úseky jednoho řetězce dsDNA jsou transkribovány a řetězec v tomto úseku funguje jako řetězec negativní, kdežto jiné úseky téhož řetězce dsDNA nejsou transkribovány a řetězec v tomto úseku funguje jako řetězec pozitivní. Uspořádání (rozložení) takovéto mozaiky negativních a pozitivních úseků mezi řetězci dsDNA nemusí být konstantní, ale u mnohobuněčných organizmů může vykazovat jistou variabilitu jednak mezi jednotlivými tkáněmi či orgány (případně i v jejich rámci), jednak v průběhu ontogenetického vývoje v souvislosti s procesy diferenciačními, při nichž dochází ke změnám ve složení spektra využívaných (exprimovaných) genů. Geny přepisované do funkčních ribonukleových kyselin se přepisují buď do primární struktury prekurzorů jednotlivých typů rRNA, označovaných jako pre-rRNA nebo do primární struktury prekurzorů jednotlivých typů tRNA, označovaných jako pre-tRNA. Dodejme, že geny pro některé eukaryotické rRNA (5,8S-rRNA, 18S-rRNA, 28S-rRNA) jsou lokalizovány v DNA jadérka, ve kterém jsou též přepisovány do pre-rRNA, pro jiné nikoli (např. gen pro 5S-rRNA je lokalizován v buněčném jádru a přepisuje se přímo do primární struktury molekuly 5S-rRNA). Posttranskripčními úpravami z těchto prekurzorů vznikají finální produkty, tedy jednotlivé typy rRNA a tRNA. Produkty transkripce genů pro funkční RNA se nepřekládají, ale přímo plní své biologické funkce. Proces transkripce se realizuje v buněčném jádru a produkty transkripce jsou z jádra transportovány do cytoplazmy, kde jsou buď dále upravovány, nebo přímo plní příslušné funkce. Přes výrazná specifika transkripce u prokaryot a eukaryot (resp. transkripce virového genomu) lze uvést některé její obecné znaky. Transkripce in vivo se uskutečňuje na matrici, kterou je řetězec DNA (v případě dsDNA negativní řetězec) v rozsahu transkripční jednotky řízené vlastním promotorem (případně též operátorem); v jejím průběhu je za účasti RNA-polymerázy, prekurzorů ribonukleotidů a řady regulačních transkripčních faktorů syntetizován ve směru 5´ → 3´ polyribonukleotidový řetězec komplementární k matričnímu řetězci. V celém procesu transkripce lze vymezit tři fáze: iniciaci, elongaci, terminaci.
XVIII.4.1. TRANSKRIPCE V PROKARYOTICKÉ BUŇCE Na promotoru prokaryotických organizmů se nacházejí dvě sekvence: Pribnowův box s konvenční sestavou 5´ TATAAT 3´ v blízkosti nukleotidu -10 a sekvence s konvenční sestavou 5´ TTGACAT 3´. Jedna z podjednotek prokaryotické RNA-polymerázy (σ, dříve též označovaná jako faktor sigma) umožňuje navázání celé molekuly polymerázy na specifické místo na promotoru za vzniku tzv. binárního komplexu (enzym RNA-polymeráza + oblast promotoru). V tomto komplexu RNA-polymeráza mění svou konformaci a zaujímá polohu, z níž může začít transkribovat transkripční jednotku právě od startovacího nukleotidu +1. Zároveň dochází na promotoru k fyzikálně-chemickým změnám, které vedou k lokálnímu rozvinutí DNA v obasti Pribnowova boxu. V závěru fáze iniciace translace se za katalýzy RNA-polymerázy první diribonukleotid; tak vznikne ternární komplex nasyntetizuje na 5´-konci (RNA-polymeráza + promotor + první diribonukleotid). V nepřítomnosti podjednotky σ 192
nerozpozná RNA-polymeráza začátek transkripce; může svou katalytickou funkci plnit, avšak nahodile, z různých míst na molekule DNA. Dále transkripce pokračuje fází elongace RNA-řetězce. Po vytvoření krátkého oligoribonukleotidu se z molekuly RNA-polymerázy uvolní podjednotka σ a místo ní se na molekulu RNA- polymerázy naváže specifický protein (NusA - protein). RNA-polymeráza katalyzuje polymeraci ribonukleotidů po celý elongační proces s tímto proteinem. Při polymeraci se RNA-polymeráza posouvá po molekule DNA. Při tom v přední části molekuly RNA-polymerázy dochází k částečné despiralizaci, kdežto v její zadní části již k opětovné spiralizaci DNA; oblast s právě probíhající polymerizací je tudíž omezena pouze na dočasně despiralizovanou oblast dvoušroubovice mezi přední a zadní částí pohybující se RNA-polymerázy. Terminace transkripce nastává na terminátoru. Po přepisu terminátoru se pohyb RNA-polymerázy zastaví, z matričního řetězce se uvolní primární transkript, z molekuly DNA se uvolní molekula RNA-polymerázy, z molekluly RNA-polymerázy se uvolní specifický protein (NusA) a opět je nahrazen podjednotkou σ. Do terminace transkripce může dále zasahovat specifický protein, tzv. faktor ρ, který po vytvoření spoje mezi NusA a molekulou RNA-polymerázy katalyzuje proces uvolňování RNA-polymerázy a primárního transkriptu z matričního řetězce DNA. Prokaryotická transkripční jednotka strukturních genů je charakteristická tím, že mezi startovacím nukleotidem a prvním strukturním genem obsahuje úsek označovaný jako vedoucí sekvence. Součástí vedoucí sekvence je tzv. Shineova-Dalgarnova sekvence, tvořená na negativním řetězci DNA skupinou nukleotidů 5´TCCT 3´. Význam této tetradeoxyribonukleotidové sekvence spočívá v tom, že je přepisována do mRNA na 5´- konci jako 5´AGGA 3´ a mRNA se tímto tetranukleotidem následně při translaci komplementárně spojí se sekvencí 3´ UCCU 5´ na 3´- konci molekuly 16S rRNA, která je součástí menší podjednotky ribozomu (30S). Tímto způsobem se mRNA svým 5´- koncem může na ribozomu ukotvit. Molekuly mRNA, které tuto sekvenci obsahují, jsou translatovány. Primární transkripty genů pro funkční RNA (pre-rRNA, pre-tRNA) ji neobsahují a translatovány nejsou. Primární transkript jedné transkripční jednotky, zahrnující skupinu strukturních genů, sestává z transkribované vedoucí sekvence (která se nepřekládá), z transkriptů jednotlivých strukturních genů (které se překládají) navzájem oddělených iniciačním a terminačním kodonem a z přepisu terminátoru (který se nepřekládá). Prokaryotická mRNA se posttranskripčně neupravuje. Životnost mRNA je v prokaryotické buňce velmi omezená, protože je snadno a účinně atakována intracelulárními ribonukleázami a degradována ve směru 5´→ 3´. V prokaryotických buňkách je mRNA ihned translatována; translace určité molekuly mRNA bývá zahájena ještě před dokončením replikace. Transkripční jednotka pro rRNA se nejprve transkribuje jako jeden celek za vzniku pre-rRNA. Teprve následně se účinkem RNAázy z primárního transkriptu posttranskripčně vyštěpí finální molekuly 5S-rRNA, 16S-rRNA a 23S-rRNA. Analogická je situace v případě transkripce genů pro tRNA: primární transkript tvoří polycystronická pre-tRNA, která je následně enzymaticky štěpena na jednotlivé finální typy tRNA.
193
XVIII.4.2. TRANSKRIPCE V EUKARYOTICKÉ BUŇCE Genetický materiál může být v eukaryotické buňce rozložen až do tří organel: buněčného jádra, mitochondrií a chloroplastů. Specifika každého z těchto typů organel se odrážejí též ve zvláštnostech exprese jejich genomů, tedy ve zvláštnostech transkripce a translace genetické informace. Nejprve pojednáme o transkripci jaderné části genomu eukaryotické buňky. Při iniciaci transkripce eukaryot se uplatňují četné vysoce specifické regulační proteiny, označované souborně jako transkripční faktory. Některé z těchto faktorů jsou velmi frekventované a nezbytné pro zahájení transkripce; označují se proto jako transkripční faktory obecné a geny, na jejichž promotory se navazují, jako tzv. geny provozní, exprimované ve většině buněk (ne-li ve všech), neboť jsou pro jejich život nepostradatelné. Jiné transkripční faktory jsou omezeně distribuovány, vyskytují se pouze v některých diferencovaných buňkách nebo přechodně třeba pouze v určitém vývojovém stadiu jedince; označují se proto jako transkripční faktory speciální a uplatňují se zejména v diferenciačních procesech. Ve fázi iniciace se nejdříve na regulační oblasti promotoru nebo zesilovače naváže určitá skupina (kombinace) transkripčních faktorů a teprve na ni RNA-polymeráza, odpovídající příslušnému typu promotoru a způsobilá katalyzovat polymerační reakce při transkripci transkripční jednotky obsahující strukturní geny nebo geny pro funkční RNA. Mezi eukaryoty lze vymezit tři základní typy promotorů. Pro promotor, na který se při iniciaci napojuje RNA-polymeráza II, je charakteristický (kromě několika dalších boxů) tzv. TATA-box (neboli Hognessův box) s konvenční sestavou TATAAAA v úseku přibližně –26 až –34. Na tento box se váže TBP-protein (= TATA-box binding protein) a v důsledku této vazby dochází v oblasti TATA-boxu k lokální denaturaci. Na TBP-protein se mohou vázat některé další látky; z nich uvedeme alespoň tzv. TAF-faktory, které dohromady s TBP-proteinem tvoří transkripční faktor TFIID, včetně RNA-polymerázy II. Na promotoru, na který se při iniciaci napojuje RNA-polymeráza I, jenž katalyzuje polymeraci při přepisu transkripční jednotky obsahující geny pro 5,8S-rRNA, 18S-rRNA a 28S-rRNA, jsou dvě významnější oblasti: jedna těsně sousedí se startovacím nukleotidem a je pro uskutečnění transkripce nepostradatená (tzv. základní oblast), druhá se nachází v úseku přibližně mezi nukleotidy –100 až –200 a pouze modifikuje účinnost transkripce (tzv. regulační oblast). RNA-polymeráza III katalyzuje na transkripční jednotce polymeraci ribonukleotidů při syntéze polyribonukleotidových řetězců tří relativně odlišných skupin makromolekul: jednak je to pre-tRNA, jednak 5S-rRNA a jednak více či méně početná skupina malých RNA. S touto heterogenitou transkripčních produktů koresponduje existence dosud známých tří typů promotorů, na které se může navázat RNA-polymeráza III a katalyzovat příslušnou transkripci. Upozorníme na jejich zvláštnost: jsou lokalizovány uvnitř transkripčních jednotek. Při transkripci katalyzované RNA-polymerázou II se ve fázi iniciace na TATA-boxu zprvu vytvoří iniciační komplex sestávající z RNA-polymerázy II a souboru příslušných transkripčních faktorů. V důsledku probíhajících procesů, indukovaných tímto komplexem, dochází k lokální denaturaci DNA v blízkém okolí startovacího nukleotidu; RNA-polymeráza se v této fázi polohuje tak, že může zahájit katalýzu transkripce od místa +1 a aktivuje se fosforylací. Po aktivaci polymerázy začíná fáze elongace, při níž RNA-polymeráza II již bez transkripčních faktorů katalyzuje syntézu budoucího primárního transkriptu strukturních genů (hnRNA) ve směru 5´→ 3´. Terminace transkripce nastává na signalizační sekvenci AATAAA, označované jako tzv. polyadenylační signál, který signalizuje, že v krátké vzdálenosti za touto sekvencí (asi 10 až 30 nukleotidů) se syntetizovaný řetězec primárního transkriptu (hnRNA) rozštěpí a uvolní z molekuly DNA.
194
XVIII.4.3. TRANSKRIPCE MITOCHONDRIÁLNÍ A CHLOROPLASTOVÉ DNA Poznatky o transkripci mitochondriální a chloroplastové části genomu jsou dosud značně neúplné. Genofory v těchto buněčných organelách jsou tvořeny kružnicovými dvouřetězcovými molekulami DNA (podobně jako u bakterií), které nesou strukturní geny i geny pro funkční RNA. Geny mitochondrií i chloroplastů jsou rozmístěné ve více transkripčních jednotkách na obou řetězcích DNA. Mechanismus jejich transkripce je (zřejmě) obdobný jako u prokaryot; rovněž strukturou promotorů a některými vlastnostmi RNA-polymeráz jsou jim blízké. Podobnost organizace mitochondriálního a chloroplastového genomu v mnoha aspektech s organizací prokaryotického (bakteriálního) genomu byla ostatně východiskem pro formulování dnes poměrně široce akceptované endosymbiotické hypotézy.
XVIII.4.4. POSTTRANSKRIPČNÍ ÚPRAVY Posttranskripční úpravy jsou charakteristickým znakem transkripce eukaryot. Primární transkripty, vzniklé jako bezprostřední produkt transkripce, představují značně velké útvary, které jsou po ukončení transkripce podrobeny specifickým procesům, při nichž jsou upravovány do finální podoby: molekuly hnRNA na mRNA, molekuly pre-rRNA na rRNA, molekuly pretRNA na tRNA. Mezi základní posttranskripční úpravy patří: 1. Modifikace hnRNA Jednou z modifikací je tzv. čepička na 5´- konci (m7G) hnRNA. Je to specifická struktura, která vzniká na 5´- konci transkriptu bezprostředně po jeho uvolnění z templátu a jež obsahuje metylované báze, z nichž dvě jsou spojené 5´, 5´- glykozidickou vazbou (pro nukleové kyseliny neobvykou). Obecné schéma čepičky je možné vyjádřit ve tvaru: m7G5´ppp5´N1mpN2mp... Čepička je místem, na které se váží tzv. CBP- proteiny, které participují na procesu iniciace translace. Na opačném konci, tedy na 3´- konci, je hnRNA prodloužena o polyadenylovou sekvenci o délce přibližně 50 – 250 nukleotidů, jejíž syntézu katalyzuje poly(A)-polymeráza bez matrice. Jednou z funkcí poly(A) - konce může být ochrana 3´- konce mRNA před účinkem exonukleáz v průběhu jejího transportu do cytoplazmy.
2. Sestřih (splicing) Kromě jednoduchých strukturních genů, jejichž primární transkripty nejsou posttranskripčně upraveny sestřihem, existují geny složené, jejichž primární transkripty naopak jsou sestřihem posttranskripčně upraveny. Složený gen sestává z úseků označovaných jako introny a exony. Introny se z molekuly hnRNA vyštěpují; nestávají se tedy součástí definitivní mRNA a ani se netranslatují. Exony se po odstranění intronů spojují a vytvářejí definitivní molekulu mRNA, která může být translatována. Na sestřihu hnRNA participuje celá škála proteinů. V přirozených podmínkách se vyskytuje několik typů sestřihu. Posttranskripční úpravy pre-rRNA a pre-tRNA se vyznačují některými zvláštnostmi. Při sestřihu pre-rRNA jsou odstraněny introny; exony zůstávají (na rozdíl od sestřihu hnRNA) vzájemně nespojené jako samostatné molekuly RNA, z nichž většina se stává stavebními složkami ribozomů, ve kterých jsou udržovány ve specifickém prostorovém uspořádání působením ribozomálních proteinů, Takto se například z molekuly eukaryotické pre-rRNA vydělí finální molekuly 5,8S-rRNA, 18S-rRNA a 28S-rRNA.
195
Na sestřihu pre-tRNA, při němž jsou vyštěpeny introny, participuje endonukleáza a RNA-ligáza, tedy jiné enzymy, než na sestřihu hnRNA. Primární transkripty mtDNA (alespoň u savců) jsou posttranskripčně modifikovány na 3´- konci polyadenylací; na 5´- konci k modifikaci nedochází, tzn. že tam nevzniká čepička. 3. Samosestřih Samosestřih je forma sestřihu primárního transkriptu, který se realizuje autokatalyticky, v nepřítomnosti proteinů spliceozómu a enzymů katalyzujících sestřih hnRNA. Samosestřih je typický pro ribozym, což je molekula RNA, která katalyzuje štěpení a ligaci RNA-substrátů za nepřítomnosti proteinů. 4. Editace mitochondriální RNA Specifickým rysem tohoto typu posttranskripční úpravy (na rozdíl od předchozích tří uvedených) je, že se při ní mění původní obsah genetické informace. V důsledku toho primární struktura editované RNA není zcela komplementární k primární struktuře matričního řetězce transkribovaného příslušného strukturního genu.
SCHÉMA POSTTRANSKRIPČNÍCH ÚPRAV
196
XVIII.5. TRANSLACE Termínem translace se označuje proces překladu genetické informace z mRNA do primární struktury proteinů (tj. pořadí aminokyselin v polypeptidových řetězcích). Translace je druhým základním procesem exprese genetické informace. Můžeme shrnout: genetická informace strukturních genů DNA-organizmů, zakódovaná ve formě sekvence deoxyribonukleotidů DNA, je podle matričního řetězce DNA transkribována buď přímo do mRNA nebo do primárního transkriptu (pre-mRNA, hnRNA), jehož další posttranskripční úpravou vzniká mRNA jako finální produkt. Při translaci na ribozomu pak mRNA slouží jako matrice, k níž se na základě komplementarity bází přiřazují svými antikodony jednotlivé molekuly tRNA nesoucí na akceptorovém rameni aktivované aminokyseliny, které se navzájem spojují peptidovými vazbami za vzniku polypeptidových řetězců.
SCHÉMA STRUKTURY tRNA
Translace je velmi složitý, komplexní proces, k jehož realizaci je zapotřebí několika základních složek: mRNA, soubor tRNA, soubor standardních aminokyselin, ribozomy, zdroje energie, sada enzymů a (bílkovinných) faktorů participujících na iniciaci, elongaci a terminaci translace. Aminokyseliny, které se účastní proteosyntézy (translace), musejí být aktivované. Při aktivaci aminokyselin nejprve nastává reakce karboxylové skupiny určité aminokyseliny 197
s fosfátovou skupinou ATP, katalyzovaná enzymem aminoacyl-tRNA- syntetáza, za vzniku aminoacyladenylátu (aa~AMP) a uvolnění pyrofosfátu. Enzym (aa-tRNA-syntetáza) zůstává spojen s aa~AMP až do setkání s tRNA, specifickou pro tuto aa-tRNA-syntetázu; aa-tRNA-syntetáza v momentě setkání katalyzuje přenos aminokyseliny z aa~AMP na 3´- nebo 2´-konec adenozinfosfátu koncové skupiny ribonukleotidů CCA na 3´-konci akceptorového ramene tRNA za vzniku aminoacyl~tRNA (aa~tRNA) a AMP. Výsledkem aktivace aminokyselin je vznik makroergní vazby mezi aminokyselinou a tRNA, která se uplatňuje při následných translačních dějích.
SCHÉMA AKTIVACE AMINOKYSELIN
198
Ribozomy jsou buněčné supramolekulární struktury, na nichž probíhá proteosyntéza při translaci genetické informace. Jejich základní stavební složku tvoří různé druhy rRNA a řada specifických proteinů. Nacházejí se jednak v cytoplazmě buněk eukaryot i prokaryot, jednak v mitochondriích a chloroplastech eukaryot. Virové částice ribozomy neobsahují. RIBOZOM
Prokaryotické (bakteriální) cytoplazmatické ribozomy jsou složeny ze dvou podjednotek se sedimentačními konstantami 30S a 50S; kompletní ribozóm, vzniklý asociací obou těchto podjednotek, má sedimentační konstatntu 70S. Ribozomy prokaryotického typu se vyskytují též v mitochondriích a chloroplastech eukaryotických buněk. Tyto ribozomy kromě (přibližně) shodných sedimentačních konstant vykazují ještě řadu dalších shodných nebo podobných znaků (zároveň však též i řadu znaků odlišných) s cytoplazmatickými ribozomy prokaryot, což pozitivně koreluje s endosymbiotickou teorií o původu mitochondrií a chloroplastů. Na povrchu ribozomů jsou rozložena různá specifická vazebná místa. Při translaci se významně uplatňuje vazebné místo pro mRNA na podjednotce 30S, aminoacylové místo (A-místo) lokalizované z větší části na podjednotce 50S (je místem vstupu a navázání aminoacyl-tRNA), peptidylové místo (P-místo) lokalizované z větší části na podjednotce 50S (je místem navázání peptidyl-tRNA), výstupní místo pro deacylovanou tRNA (E-místo) na podjednotce 50S, peptidyltransferázové místo na podjednotce 50S, vazebná místa pro iniciační faktory a vazebná místa pro elongační faktory. Eukaryotické cytoplazmatické ribozomy jsou složeny z podjednotek o sedimentačních konstantách 40S a 60S, jejichž asociací vzniká kompletní ribozom o sedimentační konstantě 80S. Mohou se v cytoplazmě vyskytovat buď volně, nebo vázané na endoplazmatické retikulum (tzv. drsné endoplazmatické retikulum). Proces translace lze rozdělit do tří fází: iniciace, elongace, terminace. Výsledkem iniciačních procesů (za účasti iniciačních faktorů) je vznik tzv. iniciačního komplexu sestávajícího z ribozomu (70S, resp. 80S), mRNA a iniciační tRNA. Při elongaci se za účasti elongačních faktorů realizuje proteosyntéza téměř celého polypeptidového řetězce mechanizmem polykondenzace aminokyselin podle matrice, kterou je mRNA. Terminace zahrnuje děje související s ukončením translace (tj. s dokončením biosyntézy polypeptidového řetězce) za účasti terminačních faktorů.
199
XVIII.5.1. TRANSLACE V PROKARYOTICKÉ BUŇCE Při iniciaci se za účasti iniciačních faktorů prokaryotických buněk vytvoří iniciační komplex ribozomu, mRNA a iniciační tRNA pro formylmetionin (fMet~tRNAfMet), přičemž iniciační kodon mRNA obsadí místo P a k tomuto kodonu se komplementárně naváže antiokodon fMet~tRNAfMet . Elongace translace u prokaryot, která probíhá za účasti elongačních faktorů, zahrnuje procesy vedoucí k navázání další aa~tRNA do aminoacylového místa A na ribozomu 70S. Po komplementárním spárování bází kodonu mRNA s antikodonem aa~tRNA v místě A se účinkem peptidyltransferázy vytvoří peptidová vazba mezi karboxylovou skupinou první aminokyseliny (obecně aminokyseliny, kterou přenáší aa~tRNA nacházející se v místě P) a aminoskupinou následující aminokyseliny (obecně aminokyseliny, kterou přenáší aa~tRNA nacházející se v místě A). Dále následuje translokace ribozomu o tři nukleotidy (tedy o jeden kodon) směrem k 3´- konci mRNA. Tímto posunem aa~tRNA, která předtím byla na místě A, nyní zaujme místo P, a na místo A se dostane další kodon mRNA, k němuž bude již popsaným způsobem dotransportována a komplementárně připojena svým antikodonem příslušná aa~tRNA. Po vytvoření peptidové vazby mezi aminokyselinou aa~tRNA v místě P a aminokyselinou aa~tRNA v místě A dochází k deacylaci tRNA a tím k uvolnění aminokyseliny, kterou transportovala do syntetizovaného polypeptidového řetězce. Místo E je výstupním místem pro deacylovanou tRNA, ze kterého se uvolňuje z ribozomu a může znovu plnit svou funkci. Popsaný proces elongace se cyklicky opakuje počínaje druhou a konče poslední aminokyselinou syntetizovaného polypeptidového řetězce. Každá aktivovaná aminokyselina (resp. každá aa~tRNA), zapojená do proteosyntézy na ribozomu, musí projít místem A; výjimkou je fMet~tRNAfMet pro formylmetionin (obecně iniciační aa~tRNA), která je transportována přímo na místo P. Elongační děje jsou dotovány energií, uvolněnou hydrolýzou GTP. Terminace translace zahrnuje procesy související s ukončením syntézy polypeptidového řetězce na místě terminačního kodonu v přítomnosti tří terminačních faktorů (RF1, RF2, RF3), které rozpoznávají terminační kodony a ve vazbě na GTP se podílejí na uvolňování tRNA z C-konce polypeptidového řetězce. Součástí terminace je uvolnění nasyntetizovaného polypeptidového řetězce z ribozomu a následná disociace samotného ribozomu na své podjednotky 30S a 50S. Je-li k dispozici nově transkribovaná mRNA, může být zahájen celý proces translace znovu počínaje iniciací. TRANSLACE NA POLYRIBOZOMU
200
XVIII.5.2. TRANSLACE V EUKARYOTICKÉ BUŇCE Při iniciaci translace se za účasti příslušných iniciačních faktorů eukaryotických buněk a dotace energie uvolněné štěpení GTP a ATP vytvoří iniciační komplex ribozomu, mRNA a iniciační tRNA pro metionin (Met~tRNAMet), přičemž iniciační kodon mRNA obsadí místo P a k tomuto kodonu se komplementárně naváže antiokodon Met~tRNAMet . Elongace se realizuje za účasti eukaryotických elongačních faktorů, které plní obdobné funkce jako elongační faktory u prokaryot. Vlastní průběh elongace translace u eukaryot se zásadně neodlišuje od elongace u prokaryot. Terminace translace se uskutečňuje na terminačních kodonech (UAA, UAG, UGA) za účasti jediného terminačního faktoru RF (na rozdíl od tří terminačních faktorů u prokaryot), který rozpoznává terminační kodony. Za využití energie, vznikající hydrolytickým štěpením GTP vázaného na terminační faktor RF, dochází k uvolnění polypeptidového řetězce z ribozomu (včetně vzniklého komplexu GTP.RF).
OBECNÉ SCHÉMA INICIACE TRANSLACE
VIII.5.3. TRANSLACE V MITOCHONDRIÍCH A CHLOROPLASTECH Hodnoty sedimentačních konstant ribozomů mitochondrií a chloroplastů se pohybují kolem 70S (s podjednotkami přibližně 30S a 50S) a jsou tedy shodné s hodnotami sedimentačních konstant ribozomů prokaryot nebo jim jsou blízké. Rovněž translace na mitochondriálních a chloroplastových ribozomech probíhá obdobně jako u prokaryot, včetně řazení formylmetioninu jako iniciační aminokyseliny. Templátem pro translaci je mRNA transkribovaná z mtDNA, resp. ctDNA. Autonomie translace v mitochondriích není úplná, naopak, je v určitém rozsahu závislá na produktech cytoplazmatických dějů, především na některých, pro její realizaci nepostradatelných, proteinech (např. aa~tRNA-syntetázy, proteinové komponenty ribozomů, iniciační a elongační faktory). Charakteristickou zvláštností genetických procesů v mitochondriích je existence určitých odchylek od standardního genetického kódu a schopnost mitochondriálních tRNA tento pozměněný genetický kód číst. Autonomie v chloroplastech je omezená podobně jako u mitochondrií, avšak genetický kód je standardní. 201
OBECNÉ SCHÉMA ELONGACE TRANSLACE
OBECNÉ SCHÉMA TERMINACE TRANSLACE
202
CELKOVÉ SCHÉMA TRANSKRIPCE A TRANSLACE
203
SOUHRNNÉ SCHÉMA ZÁKLADNÍCH GENETICKÝCH PROCESŮ V PROKARYOTICKÉ A EUKARYOTICKÁ BUŇCE
XVIII.5.4. KOTRANSLAČNÍ A POSTTRANSLAČNÍ ÚPRAVY Kotranslační úpravy se uskutečňují v průběhu translace; jsou to tedy úpravy nascentního polypeptidového řetězce. Posttranslační úpravy se realizují až na dosyntetizovaném polypeptidovém řetězci, tedy až po dokončení jeho syntézy na ribozomu, a jejich výsledkem je vznik funkčního polypeptidového řetězce. Některé úpravy se mohou uplatňovat jak kotranslačně, tak posttranslačně. Kotranslační úpravou, charakteristickou pro prokaryota, mitochondrie a chloroplasty eukaryot, je deformylace formylmetioninu katalyzovaná deformylázou. 204
Obecně se vyskytující kotranslační úpravou u prokaryot i eukaryot je odštěpení N-koncové aminokyseliny nebo skupiny aminokyselin z některých syntetizovaných polypeptidových řetězců. Mezi kotranslační úpravy lze zařadit rovněž různé chemické modifikace polypeptidu jako je hydroxylace některých aminokyselin (lyzin, prolin), glykozylace za vzniku glykoproteinů nebo tvorba disulfidických vazeb, které participují (kromě jiných mechanismů) na utváření sekundární a terciární struktury. Tato skupina úprav se může realizovat též posttranslačně. Typicky posttranslačními úpravami je vyštěpení molekuly funkčního polypeptidu z některých primárních produktů translace, připojení prostetických skupin k polypeptidovým řetězcům, vytvoření kvarterní struktury molekul složených proteinů a formování supramolekulárních struktur. Exprese genetické informace je soubor složitých, časově a prostorově uspořádaných procesů. Je zřejmé, že se neomezuje pouze na transkripci a translaci v užším slova smyslu, tj. na vlastní přepis informace z matričního řetězce DNA do polyribonukleotidového řetězce primárního transkriptu na základě principu komplementarity a na vlastní proteosyntézu na ribozomech za vzniku primárního produktu translace (polypeptidového řetězce), ale zahrnuje též řadu dalších dějů, z nichž některé byly zmíněny, nezbytných pro biosyntézu biologicky aktivních, funkčních produktů strukturních genů.
XVIII.6. REGULACE GENOVÉ EXPRESE Genetická informace se exprimuje prostřednictvím transkripce a translace. V buňkách prokaryot i eukaryot jsou tyto procesy včetně posttranskripčních a posttranslačních úprav regulovány. Regulace genové exprese je nezbytná pro normální fungování genomu. Při regulaci transkripce se významně uplatňují regulační proteiny. Molekula regulačního proteinu obvykle obsahuje specifické vazebné místo, kterým se naváže na určitou regulační oblast DNA (např. na promotor), kde plní funkci regulátoru, tzn. účastní se regulace příslušného děje (např. transkripce). Regulační protein může po vazbě na specifickou regulační oblast DNA příslušný regulovaný proces stimulovat (např. navodí podmínky pro činnost RNA-polymerázy) nebo inhibovat (např. navodí podmínky, za kterých činnost RNA-polymerázy není možná); v prvním případě jsou regulační proteiny označovány jako pozitivní, ve druhém případě jako negativní. Mnohdy je regulační funkce regulačního proteinu podmíněna (nebo ovlivněna) navázáním efektoru na vazebné místo pro efektor, nacházející se na molekule regulačního proteinu. Následkem navázání efektoru na regulační protein může být konformační změna, která teprve buď umožní vazbu regulačního proteinu na specifickou regulační oblast DNA (např. promotor) a realizaci jeho regulační funkce, anebo naopak znemožní vazbu regulačního proteinu na specifickou regulační oblast DNA (např. na promotor) a realizaci jeho regulační funkce. V uvedených příkladech se jedná o alosterické efektory, které mohou být pozitivní, jestliže v důsledku konformačních změn po vazbě na regulační protein vedou k jeho navázání na příslušnou regulační oblast, anebo negativní, jestliže v důsledku konformačních změn po vazbě na regulační protein vedou k inhibici jeho vazby na příslušnou regulační oblast. Některé formy regulace genové exprese se realizují na úrovni operonu. V této souvislosti je významnou regulační oblastí operonu operátor. Za vhodných podmínek se na operátor váže represor, který je možno definovat jako negativní protein kódovaný regulačním genem. Následkem této vazby je změna prostorového uspořádání, která RNA-polymeráze znemožní buď napojit se na promotor, anebo se z promotoru posunout dále ke strukturním genům operonu; v obou případech se nerealizuje transkripce v rozsahu celého operonu, tj. všech jemu příslušejících strukturních genů. 205
S molekulami represorů mohou interagovat molekuly dalších dvou skupin látek s regulační funkcí: induktory a korepresory. Vazbou induktoru na represor se projeví alosterický efekt, jehož důsledkem je inaktivace represoru, tzn. neschopnost represoru navázat se na operátor; jestliže tedy vazba represoru na operátor rezultuje v zastavení transkripce operonu, potom vazba induktoru na represor rezultuje v uvolnění represoru z operátoru a obnovu transkripce. Je zřejmé, že induktor plní funkci negativního alosterického efektoru. Vazbou korepresoru na represor se v důsledku alosterického efektu aktivuje represor; to znamená, že represor nabyde konformace, v níž se může vázat na operátor a inhibovat transkripci operonu. V takovýchto případech je tedy represor sám o sobě neaktivní, nemůže se bez spojení s korepresorem navázat na operátor a reprimovat transkripci příslušného operonu. Z uvedeného je zřejmé, že existují dva základní typy represorů: (1) represory, které jsou aktivní samy o sobě a stávají se inaktivními reakcí s induktorem (jsou inaktivovatelné induktorem), (2) represory, které jsou samy o sobě inaktivní a stávají se aktivními až reakcí s korepresorem (jsou aktivovatelné korepresorem). V souvislosti s tím rozlišujeme jednak regulaci operonu negativní, při níž dochází k zastavení transkripce v důsledku navázání aktivního represoru na operátor, jednak regulaci operonu pozitivní, při níž dochází k transkripci v důsledku uvolnění inaktivního represoru z operátoru. Mezi rozšířené formy regulace genové exprese, založené na negativní regulaci operonu, patří enzymová indukce a enzymová represe. Enzymová indukce se týká pouze tzv. inducibilních enzymů, jejichž biosyntéza je závislá (na rozdíl od tzv. konstitutivních enzymů) na přítomnosti induktoru. Induktor je specifická látka (např. substrát), která vede k produkci určitého enzymu. Enzymová represe je založena na principu potlačení biosyntézy jednoho enzymu nebo více enzymů některým z metabolitů (zpravidla konečným produktem) biosyntetické dráhy, v níž se sám tento enzym (tyto enzymy) katalyticky uplatňuje (uplatňují). Represe v tomto případě odráží kvantitativní zastoupení příslušného metabolitu, který funguje jako korepresor. Zvýší-li se koncentrace korepresoru nad určitou hraniční mez, dochází k enzymové represi; sníží-li se koncentrace korepresoru v důsledku jeho intrabuněčné utilizace pod tuto hraniční mez, obnovuje se funkce příslušné biosyntetické dráhy. Formou regulace genové exprese, založenou na aktivní regulaci operonu, je katabolické represe. Při katabolické represi je určitým substrátem potlačena biosyntéza určitého enzymu i v přítomnosti induktoru. V mechanizmu katabolické represe se uplatňuje tzv. katabolický aktivační protein (CAP), který zvyšuje afinitu promotoru k RNA-polymeráze poté, co se jako součást komplexu s cAMP naváže v přítomnosti induktoru do oblasti promotoru. CAP v tomto procesu plní funkci pozitivního regulačního proteinu, cAMP pozitivního alosterického efektoru. Jiným způsobem regulace transkripce u prokaryot je atenuace. Uplatňuje se při ní tzv. atenuátor, což je specifická oblast vedoucí sekvence DNA, jejíž určitý úsek funguje jako předčasný terminátor transkripce některých operonů. Regulace exprese genů kódujících rRNA a tRNA u prokaryot je závislá na dostupnosti aminokyselin z vnějšího prostředí. Za podmínek, kdy je syntéza tRNA a rRNA pro nedostatek aminokyselin již zastavena, může syntéza mRNA ještě pokračovat; tento jev se označuje jako striktní regulace. U prokaryot se jako účinný způsob regulace genové exprese uplatňuje protismyslová RNA (= antisense RNA). Je to transkript RNA komplementární k jiné molekule (nebo k části molekuly) RNA, s níž se spojuje a tím inhibuje její funkci. V buňkách eukaryot existuje celá řada dalších způsobů regulace genové exprese. Uvedeme pouze některé z nich. Aktivátory iniciace transkripce umožňují zvýšit účinnost transkripce nad bazální hodnotu tím, že se váží se základními transkripčními faktory při iniciaci transkripce.
206
Pozitivně ovlivňují účinnost transkripce specifické regulační oblasti na DNA tzv. zesilovače transkripce. Zesilovač transkripce interaguje prostřednictvím transkripčních faktorů s promotorem, přičemž výsledkem této interakce je uvedení RNA-polymerázy do aktivního stavu, v němž může zahájit traskripci. Naopak negativně ovlivňují účinnost transkripce tzv. tlumiče transkripce; většinou rovněž působí prostřednicvím interakce s některými transkripčními faktory. V průběhu ontogenetického vývoje se uplatňuje specifická aktivace genů, která se v zásadě děje dvěma základními způsoby: buď je určitý gen v uvažované tkáni aktivován k transkripci biosyntézou specifického transkripčního faktoru v dané tkáni (a pro ni charakteristického), anebo je ve tkáni aktivován specifický transkripční faktor, který následně stimuluje transkripci v buňkách této tkáně. Alternativní sestřih probíhající v různých tkáních odlišně je mechanismem zajišťujícím variabilitu finálních produktů transkripce strukturních genů a konsekventně i produktů translace mezi jednotlivými tkáněmi v rámci diferencovaného mnohobuněčného organizmu. Je zřejmé, že na alternativním sestřihu participují tkáňově specifické transkripční faktory. Homeotické geny zahrnují zvláštní a velice složitou skupinu regulačních mechanismů, které se uplatňují při morfogenetických procesech v přesně časově uspořádaných a lokalizovaných posloupnostech. Expresi genetické informace ovlivňují četné hormony (např. steroidní), pro které existují intracelulární (cytoplazmatické nebo jaderné) receptory, fungující jako transkripční faktory. Po vazbě hormonu na takový receptor dochází k navázání komplexu receptor – hormon na hormonový responzivní element (HRE), lokalizovaný na promotoru, popř. zesilovači transkripce. Některé další hormony se navazují na receptory umístěné v cytoplazmatické membráně (např. inzulin, glukagon, FSH, ACTH, LH); vznik takové vazby vede k aktivaci G-proteinů a následné sérii reakcí zprostředkujících přenos signálu z receptoru prostřednictvím druhého přenašeče (posla) až na cílové molekuly, které se uplatňují v reakci buňky na signál indukovaný hormonem. Na ještě mnohem komplexnější úrovni je genová exprese ovlivněna regulací buněčného cyklu. Podobně můžeme do regulace genové exprese zahrnout procesy spojené s funkcemi imunitního systému (ať už se jedná o tzv. imunitu zprostředkovanou buňkami nebo o tzv. protilátkovou imunitu), procesy spojené s maligní transformací, aktivitami protoonkogenů a onkogenů.
XVIII.7. MUTAČNÍ PROCES (MUTAGENEZE) Mutabilita jako schopnost genetické informace podléhat relativně trvalým dědičným změnám, je jedním ze základních atributů genetické informace a podmiňuje samu existenci alternativních forem (alel) jednotlivých genů. Základním prvkem mutačního procesu je mutace. Mutace můžeme definovat jako relativně stálé změny genotypu nebo karyotypu, které nejsou podmíněny segregací nebo rekombinací. Mutace představují mechanizmus rozrůznění jednoho genotypu ve dva nebo více genotypů a poskytují primární hmotný substrát pro evoluci. Řada mutací vede ke vzniku nových znaků. Některé z nich se mohou příznivě uplatnit v evolučním procesu, nebo být prakticky využity (šlechtění, biotechnologie apod.). Velký počet mutací však vykazuje negativní, škodlivý účinek (například v podobě dědičných chorob). 207
Mutace můžeme klasifikovat podle různých hledisek: (1) podle způsobu vzniku: spontánní: vznikají působením nekontrolovatelných faktorů indukované: vznikají záměrným (kontrolovaným) působením mutagenů Mechanizmus vzniku spontánních a indukovaných mutací je stejný. Rozdíl spočívá pouze v tom, že v případě spontánních mutací není znám faktor (mutagen), který mutaci vyvolal, kdežto v případě indukovaných mutací je znám, protože se záměrně k indukci mutace použije určitý mutagen, nebo se ověřuje, zda určitý faktor či látka vykazuje mutagenní aktivitu. (2) podle změny smyslu: beze změny smyslu: nevede k záměně aminokyselin nebo jiné změně genového produktu. se změněným smyslem (missense): vede ke změně primární struktury genového produktu nebo ke změně funkce určité regulační oblasti genomu. beze smyslu (nonsens): vede ke vzniku terminačního kodonu a tím ke zkrácení příslušného polypeptidového řetězce. (3) podle posunu čtení genetického kódu: posunové (s posunem čtení genetického kódu, frameshift): od místa adice nebo delece baze dochází k posunu čtení genetického kódu. Jestliže v určitém místě polynukleotidového řetězce došlo k adici (deleci) jedné báze, může se správné čtení genetického kódu obnovit od místa, ve kterém dojde k deleci (adici) jedné báze. bez posunu čtení genetického kódu (čtecího rámce): jedná se o mutace typu substitucí, tj. mutací, při kterých je zaměněna jedna báze DNA (resp. RNA) jinou bází. (4) podle vzniku v ontogenezi: gametické: vznikají při gametogenezi a pokud nejsou letální, mohou být při pohlavním rozmnožování přeneseny z generace na generaci (vertikální přenos). somatické: vznikají v somatických buňkách a při pohlavním rozmnožování nejsou přenášeny z generace na generaci. Při vegetativním (nepohlavním) rozmnožování lze z klonu mutantních somatických buněk získat kompletně mutantního jedince, který v důsledku vlastního asexuálního rozmnožování dá vzniknout klonu identických mutantních jedinců. (5) podle projevu: makromutace: fenotypově se projevují na makroskoppické úrovni mikromutace: fenotypově nejsou makroskopicky patrné (6) podle směru vzniku vůči standardu: přímé: vedou k přeměně standardní alely (obvykle dominantní) na mutantní alelu (obvykle recesivní), jinými slovy od standardního (dříve divokého) genotypu (resp. fenotypu) k mutantnímu genotypu (resp. fenotypu). zpětné: vedou k přeměně mutantní alely na standardní alelu, jinými slovy od mutantního genotypu (resp. fenotypu) k standardnímu genotypu (resp. fenotypu). Totéž obdobně platí pro jednotlivé alely alelové série: každá z nich může zpětně mutovat za vzniku standardní alely, anebo té mutantní alely, z níž vznikla. Mutační rychlost zpětných mutací je výrazně nižší (obvykle o více řádů), než mutační rychlost přímých mutací. Je to pochopitelné, neboť pravděpodobnost vzniku pravé reverze, tj. zpětné mutace ve stejném místě téhož genu a přesně opačně (oproti přímé mutaci), je menší než pravděpodobnost vzniku jakékoli mutace v kterémkoli místě uvažovaného genu. (7) podle fenotypového projevu: dominantní: fenotypově se projevují u dominantních homozygotů a heterozygotů recesivní: fenotypově se projevují u recesivních homozygotů
208
(8) podle účinku na vitalitu: letální: neslučitelné se životem, relativní vitalita je rovna nule subletální: relativní vitalita je menší než 50% a vyšší než nula semiletální: relativní vitalita se pohybuje kolem 50% subvitální: relativní vitalita je vyšší než 50% a menší než 100% neutrální: relativní vitalita se významně neliší od standardu, tzn. že se pohybuje kolem 100% supravitální: relativní vitalita je vyšší než u standardu, tzn. že je vyšší než 100% (9) podle doby od vzniku do projevu mutace: bez zpoždění: mutace se projeví bezprostředně po jejím vzniku se zpožděním: mutace se neprojeví bezprostředně po jejím vzniku, ale se zpožděním (delayed effect, storage effect) (10) podle lokalizace v genomu: jaderné: mutace postihují eukaryotickou DNA (chromozomy) v buněčném jádru, resp. prokaryotický chromozom (nukleoid) mimojaderné (cytoplazmatické): mutace postihují DNA lokalizovánou mimo buněčné jádro, tj. v cytoplazmatických organelách eukaryot s vlastní DNA (mitochondrie, chloroplasty), resp. v plazmidech prokaryot. Mezi mimojaderné mutace tedy náleží mutace mitochondriální, chloroplastové a plasmidové DNA. Obecně jsou důsledky jaderné mutace pro mnohobuněčný organizmus výraznější (dalekosáhlejší), než důsledky mutací cytoplazmatických. Vyplývá to zejména z relativní autonomie mitochondrií a chloroplastů, jejich většího počtu v buňce a malého obsahu genetické informace, omezeného na několik genů. Případné negativní účinky mutace vzniklé např. v jedné mitochondrii mohou být překryty mnohonásobně větším počtem ostatních mitochondrií, které nejsou nositeli dané mutace. (11) podle typu nukleové kyseliny: mutace DNA: vznikají v molekule DNA zpravidla v interfázi buněčného cyklu, některé z nich jako neopravené chyby při replikaci DNA. Tyto mutace, pokud nejsou pro buňku letální, mohou být přenášeny jak horizontálně, tak vertikálně a tudíž perzistovat nebo se rozšiřovat v populaci. Představují též základní zdroj genetické variability. mutace RNA: zásadní význam mají pro RNA-organizmy, kde jsou zdrojem jejich genetické variability. U ostatních organizmů mají omezený až zanedbatelný význam pro jejich omezený účinek. Mutace v primární struktuře rRNA, způsobená mutací genu pro rRNA, může vést k anomální stavbě ribozomů a tím k narušení případně až selhání proteosyntézy. Podobně mutace v primární struktuře tRNA, způsobená mutací genu pro tRNA, může vést k anomální funkci či ztrátě funkce příslušné tRNA a tím k narušení translace. Mutace mRNA (resp. hnRNA) vznikají na úrovni transkripce a proto je jejich účinek v buňce velmi omezený, vázaný pouze na jednu molekulu mRNA (resp. hnRNA). Podobně mutace vznikající na úrovni translace jsou teoreticky omezeny pouze na jednu molekulu syntetizovaného polypeptidového řetězce. (12) podle úrovně organizace genomu, na které vznikají: genové (bodové): základní jednotkou pro posuzování těchto mutací je gen chromozomální (chromozomální aberace): základní jednotkou pro posuzování těchto mutací je chromozom genomové (polyploidie, aneuploidie): základní jednotkou pro posuzování těchto mutací je genom
209
XVIII.7.1. GENOVÉ MUTACE Základní tři mechanizmy vzniku genových mutací představují adice, delece a substituce nukleotidů nukleových kyselin. Adicí se rozumí včlenění další (nové) báze do polynukleotidového řetězce a delecí naopak eliminace (uvolnění) báze z polunukleotidového řetězce. Oba tyto mechanizmy vedou ke změně původního počtu nukleotidů v polynukleotidovém řetězci a tedy k posunovým (frameshift) mutacím: od místa adice nebo delece báze dochází k posunu čtení genetického kódu.
SCHÉMA VZNIKU GENOVÉ MUTACE TYPU ADICE NEBO DELECE A JEJÍ DŮSLEDKY
210
Substitucí se rozumí záměna určité báze v polynukleotidovém řetězci jinou bází. Mutace, která vznikne mechanizmem substituce, je omezena pouze na jeden triplet a může být typu mutace se změněným smyslem (missens), mutace beze smyslu (nonsens) nebo mutace beze změny smyslu. Z uvedeného je zřejmé, že mutace vzniklé mechanizmem adice nebo delece nukleotidu obecně postihují rozsáhlejší oblast genového produktu, než mutace vzniklé mechanizmem substituce nukleotidů.
SCHÉMA VZNIKU GENOVÉ MUTACE TYPU SUBSTITUCE A JEJÍ DŮSLEDKY
XVIII.7.2. CHROMOZOMÁLNÍ ABERACE Jako chromozomální aberace se označují strukturní změny jednotlivých chromozomů, které jsou detegovatelné cytogenetickými metodami. Chromozomální aberace vznikají zpravidla v interfázi buněčného cyklu: ty, které vznikají v presyntetické fázi interfáze, tj. v G1-fázi, se označují jako aberace chromozomové, ty, které vznikají v syntetické a postsyntetické fázi interfáze, tj. v S- a G2- fázi, se označují jako aberace chromatidové. Základní událostí při vzniku každé chromozomální aberace je přerušení (zlom) chromozomu. Místa přerušení (zlomů) se mohou opět spojit do původního stavu a v takovém případě hovoříme o restituci, 211
anebo do jiného než původního stavu a pak hovoříme o reparaci zlomů. Jestliže se zlomy nerestituují, konstituují se chromozomální aberace, které lze cytogenetickými metodami detegovat v metafázi nebo anafázi. Duplikace úseků chromozomů jsou významným faktorem a často se vyskytujícím jevem v evoluci chromozomů. Rozšířením (amplifikací) obsahu genetické informace se uplatňují jako zdroj genetické variability a mohou tak přispívat k rozrůznění (divergenci a diverzifikaci) genomů jednotlivých taxonomických skupin organizmů. Inverze v heterozygotním stavu, pokud nejsou pro své nositele letální, mají za následek potlačení crossing-overu. Inverze mají značný význam v evoluci, zejména jako jeden ze zdrojů divergence druhů. Charakteristickým rysem translokací je změna vazbových skupin genů lokalizovaných v úsecích chromozomů dotčených konkrétními translokacemi. Translokované geny jsou vřazeny do jiných vazbových skupin. Z evolučního hlediska se translokace uplatňují především jako významný mechanizmus uskutečňování změn vazbových skupin.
Celkově můžeme o chromozomálních aberacích říci, že: (1) je lze využít při genetickém mapování, při studiu působení genů v souvislosti se změnami jejich lokalizace na chromozomu, při objasňování intrachromozomálních genových interakcí či interchromozomálních vztahů v rámci genotypu jedince (2) mohou vést ke vzniku nových vazbových skupin, jsou mechanizmem přestaveb genotypu a karyotypu (3) se uplatňují při intraspecifické i interspecifické diferenciaci (např. jako forma genetické izolace) (4) studium chromozomálních aberací potvrzuje lineární diskrétnost chromozomů a vede k nutnosti systémového pojetí genomu.
XVIII.7.3. GENOMOVÉ MUTACE Mezi genomové mutace se řadí polyploidie a aneuploidie. Polyploidie (syn. euploidie, pravá polyploidie) je změna počtu celých haploidních (základních) sad chromozomů. Je-li polyploidní počet chromozomů lichým násobkem haploidního (základního) počtu chromozomů (3n, 5n,...), hovoříme o anortoploidii, je-li sudým násobkem haploidního (základního) počtu chromozomů (4n, 6n, 8n ...), hovoříme o ortoploidii. Polyploid s trojnásobným haploidním počtem chromozomů (3n) se nazývá triploid, se čtyřnásobným haploidním počtem (4n) chromozomů se nazývá tetraploid atd. Anortoploidie vede k tvorbě nesbalancovaných gamet (protože lichý počet chromozomů nelze rozdělit na dvě poloviny beze zbytku), a proto bývá většinou příčinou sterility nebo snížené fertility anortoploidů. Naproti tomu ortoploidie skýtá možnost tvorby sbalancovaných gamet a proto ortoploidi bývají fertilní, resp. míra sterility nebo snížené fertility ortoploiddů je menší než u anortoploidů, případně je důsledkem jiných příčin, než tvorby nesbalancovaných gamet. Aneuploidie (syn. heteroploidie, nepravá polyploidie) je změna počtu chromozomů, která není násobkem haploidního (základního) počtu chromozomů. Obsahuje-li karyotyp určitého jedince jeden chromozóm navíc (2n + 1), nazývá se trizomik, obsahuje-li dva chromozomy navíc (2n + 2), nazývá se tetrazomik atd. Obsahuje-li naopak o jeden chromozom méně (2n – 1), nazývá se monozomik, obsahuje-li o dva chromozomy méně, nazývá se nulizomik. Genomové mutace vznikají jako následek poruch karyokineze při meiotickém nebo mitotickém dělení. Z tohoto hlediska lze potom hovořit o genomových mutacích meiotických a mitotických, respektive gametických a zygotických či postzygotických (somatických). Obecným 212
mechanizmem jejich vzniku je nepravidelné rozestoupení chromozomů k pólům dělicího vřeténka v anafázi, karyokineze nenásledovaná cytokinezí, endomitóza a fúze jader (např. při somatické hybridizaci). S tím souvisí skutečnost, že i když se meiotická a mitotická polyploidie liší místem a mechanizmem vzniku, jejich genetické následky mohou být shodné. Důsledky polyploidie však jsou u různých taxonomických skupin organizmů rozdílné. Obecně lze konstatovat, že ortoploidie je vcelku běžným jevem u rostlin a hub a obvykle negativně neovlivňuje reprodukční zdatnost polyploidů; leckdy lze jejím prostřednictvím dosáhnout lepších užitkových vlastností a proto bývá polyploidie často využívána ve šlechtitelských programech. U živočichů však polyploidie vede většinou k letalitě nebo k vážným genetickým poškozením, spojeným se sníženou životaschopností. Relativně často se objevuje ve formě autopolyploidie u bezobratlých živočichů (u hermafroditů, v případech partenogeneze), výjimečně u obratlovců (např. axolotl, bourec morušový), avšak existence polyploidních jedinců ze třídy savci není známa. Vznik aneuploidie je podmíněn poruchou distribuce jednotlivých párů homologických chromozomů při meióze nebo mitóze; rozeznáváme tedy aneuploidii meiotickou a mitotickou. Nejčastěji vzniká tzv. nondisjunkcí, tj. nerozestoupením určitého páru chromozomů (v důsledku neuskutečněného podélného rozdělení centromery) a jejich nerovnoměrnou distribucí do buněk, produkovaných buněčným dělením. Životaschopnost aneuploidů je zpravidla silně redukována z důvodu dysbalance genomu (porušení genové rovnováhy).
XVIII.7.4. MUTAGENY Látky, které indukují mutace, se označují jako mutageny. Obvykle jsou klasifikovány do tří skupin: na mutageny fyzikální, chemické a biologické. Vznik mutace je výsledkem řady procesů, zahrnutých pod název mutageneze. Účinek mutagenu na exponovaný organizmus může být buď přímý nebo nepřímý. Pod označením přímý účinek mutagenu se rozumí bezprostřední vznik mutace v průběhu buněčného cyklu, ve kterém byl zasažen genetický materiál příslušné buňky (DNA, RNA) mutagenem; mutace tedy vznikne bez zpoždění. Při nepřímém účinku mutagenu dochází nejdříve ke vzniku premutačních změn, které mohou být dále restituovány, reparovány (jak již bylo uvedeno), nebo mohou přejít v mutaci; mutace vznikne se zpožděním (tzv. delayed effect, storage effect). Premutační změny představují kratší či delší dobu perzistující potenciální stavy, které mohou přejít v mutaci až po jednom či více buněčných cyklech. Premutační změny jsou následkem primární interakce mezi mutagenem a nukleovou kyselinou, resp. chromozomem (např. excitace atomů a molekul, ionizace, uvolnění radikálů, přesuny atomů) a na ni navazujících sekundárních reakcí (např. dimerizace nukleotidů, alkylace, defosforylace), které mohou vést (nejsou-li reparovány) k fixaci nastalých změn a vzniku mutace. Některé látky (tzv. premutageny) samy o sobě jako chemická individua v organizmu (buňce) nevykazují mutagenní aktivitu, avšak při jejich metabolizování mohou být přeměněny na mutageny (metabolická konverze). V takových případech rovněž dochází ke zpožděnému vzniku a projevu mutací. Při studiu mutageneze je nutno zohlednit úlohu různých buněčných reparačních mechanizmů, které mohou mutagenitu určité látky nebo faktoru významně modifikovat. Kromě toho mutagenní účinky určitého mutagenu závisejí rovněž na přítomnosti či nepřítomnosti látek (faktorů), které je mohou snižovat (tzv. antimutageny), nebo jinak ovlivňovat (synergidní efekt, kompetice). Mutační proces ovlivňuje kromě mutagenu a nukleových kyselin řada vnitřních a vnějších faktorů (typ tkáně, stupeň diferenciace, stadium ontogenetického vývoje, životní podmínky, aktuální fyziologický stav, složky environmentu, genetické pozadí apod.).
213
Mezi nejvýznamnější fyzikální mutageny patří ionizující a ultrafialové záření. Ultrafialové záření v rozsahu vlnových délek λ = 230 – 300 nm účinně reaguje s nukleovými kyselinami (zejména při vlnových délkách v blízkosti jejich absorpčního maxima) za vzniku dimerů tyminu nebo cytozinu jako produktů příslušných fotochemických reakcí. Ionizující záření indukuje především chromozomální zlomy (jednořetězové i dvouřetězcové) a různé další typy strukturních a numerických změn chromozomů, ale též genové mutace. Radiosenzitivita se zvyšuje v pořadí: nukleová kyselina → nukleotid → nukleozid → dusíkatá báze. Biologické účinky ionizujícího záření na živou hmotu jsou výsledkem celého řetězce procesů, které lze shrnout do skupin reakcí radiofyzikálních, radiochemických, biochemických a radiobiologických. V hrubých rysech lze k vyjádření mutačních účinků záření v závislosti na jeho dávce aplikovat zásahovou teorii (hits theory). V souladu s touto teorií je četnost genových mutací a jednozlomových chromozomálních aberací lineární funkcí dávky. Proto jakákoli dávka záření může indukovat mutaci; neexistuje žádná absolutně spolehlivá (bezriziková) dávka ozáření.
SCHÉMA VZNIKU A REPARACE TYMINOVÉHO DIMERU
214
Chemické mutageny (chemomutageny) představují velmi heterogenní skupinu chemických látek. Mechanizmus chemomutageneze je do jisté míry determinován složením a strukturou toho kterého mutagenu, respektive jeho příslušností k určité skupině látek s podobnými chemickými vlastnostmi. Pro analogy bází nukleových kyselin je typická indukce substitucí bází typu tranzice nebo transverze, přičemž první typ se obecně vyskytuje častěji. Například 5 - bromuracyl (5-BU) v enol-formě se může párovat třemi vodíkovými vazbami s guaninem a být příčinou substituce původního páru A – U (případně A - T) párem G – C. Obdobně se chovají i jiné halogenderiváty pyrimidinových bazí. Velmi rozsáhlá a významná skupina mutagenů se nachází mezi alkylačními látkami. Alkylační látky preferenčně působí v nukleofilních oblastech molekul nukleotidů; proto alkylace postihuje především atomy dusíku (alkylsulfáty) a kyslíku (N-nitrózosloučeniny). Alkylace těchto atomů má za následek nejčastěji substituci bází v řetězci nukleové kyseliny. Akridinová barviva se vyznačují schopností včlenit se do řetězce DNA (RNA). Protože mohou vytvářet páry s bázemi nukleových kyselin, mohou indukovat mutace typu adice. Polycyklické uhlovodíky lze chápat jako premutageny, jejichž metabolická aktivace se realizuje působením enzymů cytochromového systému P-450. Do této skupiny mutagenů spadají též tzv. polychlorované bifenyly (PCB). Jako premutageny označujeme látky, které mohou být konvertovány na mutageny až po metabolické aktivaci. Mezi nejznámnější premutageny a/nebo prekarcinogeny patří: benzo[a]pyren, obsažený např. ve výfukových plynech a cigaretovém kouři, AAF (= N-acetyl-2-aminofluoren) ze skupiny aromatických aminů (obsažen v některých insekticidech) a aflatoxiny (skupina mykotoxinů). N-metyl-N´-nitro-N-nitrózoguanidin, N-metyl-N-nitrózomočovina jsou v buňkách konvertovány na produkty, které alkylují báze nukleových kyselin. Sloučeniny, které obsahují v molekule dvě reakční skupiny (nebo i více reakčních skupin), jenž mohou atakovat nukleové kyseliny a indukovat mutace, se označují jako supermutageny. Obě jmenované látky k nim náleží. Pro chemomutageny lze stanovit spodní hranici mutagenity, tj. koncentraci chemické látky, od které se za daných podmínek projevuje jako mutagen (resp. karcinogen). Mezi biologické mutageny jsou řazeny retroviry a transdukující bakteriofágy. Jako retroviry jsou označovány RNA-viry s reverzní transkriptázou. Tyto viry po infekci hostitelské buňky reverzní transkripcí produkují DNA, která se za katalytické aktivity integrázy může integrovat do genomu (chromozomální DNA) hostitelské buňky a ve formě proviru se replikovat současně s replikující se hostitelskou DNA. Nepřesná excize proviru může vést ke vzniku mutace (např. typu delece) v hostiteli; po infekci nové hostitelské buňky retrovirem přenášejícím deletovaný úsek DNA původního hostitele a po jeho integraci do DNA tohoto nového hostitele může vzniknout nová mutace (např. typu adice). Retroviry mohou též transformovat hostiteslkou buňku. Je důležité rozlišovat mezi mutagenem, karcinogenem a teratogenem, resp. mezi mutagenezí, karcinogenezí a teratogenezí. Ne každý mutagen je karcinogenem, avšak patrně není znám karcinogen, který by nebyl mutagenem. Proto u látek s prokázanou karcinogenitou se předpokládá i jejich mutagenita. Karcinogeneze jako značně složitý vícestupňový proces, za jehož primární základ je považována mutace, vede k maligní transformaci buněk. Z hlediska genetického je podstatné, že změny v genetickém aparátu somatické buňky, indukované působením fyzikálního nebo chemického karcinogenu a vedoucí k rozvoji nádorového onemocnění, nejsou přenosné na potomky postiženého jedince a tudíž jimi není ohrožen gametový fond populace. Za určitých podmínek zevního prostředí se mohou
215
v karcinogenezi uplatnit zřejmě pouze některé gametické mutace ve smyslu predispozice jedince k nádorovému onemocnění. Teratogeny jsou látky, které zasahují do embryogenetických (morfogenetických) procesů a mohou vést ke vzniku vrozených vývojových vad (VVV). Jejich účinek lze označit za epigenetický a proto je třeba přesně odlišit vrozené vývojové vady jako nedědičné poruchy embryogeneze (morfogeneze) od dědičných chorob. Podkladem každé dědičné choroby je určitá konkrétní mutace, kdežto VVV se konstituují na negenetickém základu, tudíž nemají mutační podklad.
XVIII.8. TRANSPOZICE Jako transpozice se označuje přemístění úseku DNA z donorového místa do recipientního v mezích genomu jedné buňky, které není způsobeno mutací, meiotickou nebo mitotickou rekombinací. Transponovatelný úsek DNA se označuje jako transpozon. Transpozon může být postupně včleňován (transponován) na různá místa buněčného genomu. V důsledku toho mohou vznikat mutace, může docházet k alteracím normálního projevu genů ovlivněných transpozicí a ke změnám celkového obsahu DNA v genomu. Transpozony lze označit za vlastní mutageny, to znamená, že se v každém genomu, ve kterém se nacházejí, mohou chovat jako mutageny. Například včlenění transpozonu do exonu může vést k syntéze změněného genového produktu; včlenění transpozonu do intronu může mít za následek chybné (odlišné) posttranskripční úpravy, které též mohou vést k syntéze změněného genového produktu; mezera, vzniklá po excizi transpozonu, může být chybně reparována; transpozon v místě inzerce může vést ke vzniku inekválního crossing-overu při meióze a tak by bylo možné pokračovat dále. Současně lze připustit, že některé ze změn v genomech, vyvolaných transpozony, se mohly významně uplatnit v evolučním procesu. Existuje více typů transpozonů.
XVIII.9. REPARACE MUTAČNÍCH ZMĚN Různé mutageny mohou indukovat velmi rozmanité mutace genové, chromozomové či genomové. Jejich základem je buď chybné párování bází (jako následek substituce), nebo vznik mezery v rozsahu jednoho či více nukleotidů (např. jako následek adice bází, delece bází či přerušení replikace v oblasti výskytu pyrimidinového dimeru), nebo vznik zlomu jednoho řetězce DNA (single strand break) či obou řetězců dsDNA (double strand break), nebo porucha buněčného dělení (mitózy či meiózy). Prokaryotické i eukaryotické buňky disponují opravnými, enzymaticky katalyzovanými systémy reparace těchto poškození (chyb). Mezi základní reparační mechanizmy patří: fotoreaktivace, excizní reparace a tolerantní reparace. Fotoreaktivace je mechanizmem opravy poškození indukovaných UV zářením. Z hlediska reakčního mechanizmu se rozlišují tři typy fotoreaktivace: (1) fotoreaktivace přímá, při které fotolyáza, aktivovaná světlem o vlnové délce λ = 340 – 400 nm, katalyzuje štěpení tyminových dimerů. (2) fotoreaktivace senzitizovaná, která není závislá na fotolyáze
216
(3) fotoreaktivace nepřímá, která byla popsána u mutantů E. coli s inaktivní fotolyázou. Po ozáření těchto buněk UV světlem o vlnové délce kolem 330 nm dochází k inaktivaci molekul tRNA a z ní vyplývajícího dočasného zastavení růstu a dělení bakteriálních buněk. V tomto mezičase mohou být pyrimidinové dimery odstraněny excizní reparací ještě před zahájením nové replikace. Excizní reparace se může uskutečňovat také více různými mechanizmy a podle toho se klasifikuje do několika typů (bázová, korektorská, nukleotidová). Obecně můžeme procesy excizní reparace rozčlenit do čtyř fází. První, incize, představuje rozpoznání poškozeného místa na DNA N-glykozidázou nebo enzymem s nukleázovou aktivitou. Následuje excize, při které dochází k degradaci polynukleotidového řetězce vlivem exonukleáz, přičemž počet uvolněných nukleotidů závisí na typu indukovaného poškození. Třetí fází je polymerace (opravná syntéza) katalyzovaná polymerázami, kterou se zaplní mezera po nukleotidech uvolněných při excizi. Poslední fází je ligace, která představuje včlenění nově syntetizovaného úseku DNA do reparovaného řetězce DNA, katalyzované ligázou. Tolerantní reparace je typem reparace zlomů v DNA. Vlastní poškození řetězce DNA (zlomy) se neodstraňují formou opravné syntézy, ale při replikaci se opravují (zacelují) mezery v nově syntetizovaném řetězci odpovídající místům poškození replikovaného řetězce. Buňky jednotlivých typů tkání se vyznačují rozdílnou reparační kapacitou jak pro odlišné, tak pro podobné typy mutačního poškození. Tato kapacita se mění též v průběhu ontogenetického vývoje a proto ji lze považovat za jednu z hlavních příčin rozdílné senzitivity buněk v různých vývojových stadií jedince a nacházejících se na různých úrovních diferenciace a specializace.
217
XIX. ORGANIZMY A PROSTŘEDÍ Jednotlivé organizmy vstupují do vzájemných vztahů mezi sebou a jejich přírodním prostředím (= soubor všech podmínek, které umožňují organizmům žít, vyvíjet se a rozmnožovat), resp. životním prostředím (ve vztahu k člověku se tímto termínem označuje část světa, se kterou je člověk ve vzájemné interakci, tj. kterou používá, ovlivňuje a které se přizpůsobuje). Významně se tak v přírodě uplatňují nejen jako individua, ale též jako vyšší celky (populace, společenstva, ekosystémy apod.). Speciální biologickou vědou, zabývající se vztaky mezi organizmy a jejich prostředím, je ekologie. V této kapitole se seznámíme alespoň s některými ekologickými procesy a objasníme některé ekologické pojmy. Pomyslná část Země, kde se vyskytuje (i dočasně a náhodně) jakákoli forma života, se označuje jako biosféra. Zasahuje do atmosféry, pedosféry, litosféry a hydrosféry. Její horní atmosférická hranice se mění v závislosti na zeměpisné šířce (na pólech činí kolem 10 km, na rovníku kolem 18 km). Její spodní hranice v pedosféře (resp. litosféře) činí v závislosti na geologickém podkladu řádově stovky až tisíce metrů, avšak většina organizmů se vyskytuje v hloubkách mnohem menších (jednotky až desítky metrů). Spodní hranice v hydrosféře přesahuje 11 000 m (Mariánský příkop v Tichém oceánu). Pomyslná část Země, kde se vyskytuje život pravidelně a zákonitě, se označuje jako ekosféra. Její horní atmosférická hranice činí asi 8 km, její spodní hranice (v pedosféře, litosféře a hydrosféře) je přibližně rovna spodní hranici biosféry. Součástí biosféry je noosféra, tj. část Země, osídlená myslícími bytostmi (rod Homo), někdy též označovaná jako technosféra, tj. část Země, pozměněná výrobně-technickou (technologickou) činností člověka.
XIX.1. BIOMY, FYTO- A ZOOGEOGRAFICKÉ OBLASTI Biosféru lze rozdělit na menší oblasti, přičemž každá z nich se vyznačuje pro ni chrakteristickým komplexem abiotických a biotických faktorů. Takovéto menší oblasti biosféry se označují jako biomy. Rozlišuje se několik základních vodních a pevninských biomů. VODNÍ BIOMY (1) biom volného oceánu – je plošně nejrozsáhlejším biomem Země; zařazují se do něho moře hlubší než 200 m; v tomto biomu proto vedle vrstvy fotické existuje též vrstva afotická (oblast trvalé tmy); biologická produkce biomu volného oceánu, vztažená na jednotku objemu, je poměrně malá. (2) biom šelfových moří – zařazují se do něho moře do hloubky přibližně 200 m, tj. do hloubky, do které ještě mohou pronikat světelné paprsky (poznamenejme, že v závislosti na fyzikálních a chemických vlastnostech mořské vody proniká pouze 1% ze světla dopadajícího na hladinu moře do hloubky přibližně 100 – 150 m); biologická produkce biomu šelfových moří, vztažená na jednotku objemu, je poměrně vysoká. (3) biom sladkovodní – představuje souhrn všech sladkovodních nádrží (řek, potoků, jezer, rybníků, kaluží apod.) na Zemi; biologická produkce je relativně vysoká.
218
PEVNINSKÉ BIOMY (1) Hylaea – tropické deštné lesy; celoročně vlhké a teplé klima; významná klimatotvorná funkce v rozsahu celé planety; vysoce produktivní biom; velmi rychlá destrukce organické hmoty a s tím související nízký obsah humusu a zpravidla pouze několik centimetrů hluboká vrstva úrodné půdy (2) Skleraea – subtropické a tropické suché lesy a lesosavany; navazuje směrem k oběma pólům na biom hylaea; charakteristickým znakem tohoto biomu je střídání období dešťů a období sucha; rostlinný kryt tvoří převážně lesní formace. (3) Silvaea – biom opadavých a smíšených lesů mírného pásma; charkateristickým znakem v oblasti tohoto biomu je střídání ročních období a s tím související vystřídání vegetačního období obdobím klidu (při nízkých teplotách). (4) Tajga – biom severských a horských jehličnatých lesů; navazuje severně anebo ve vysokých nadmořských výškách na biom silvaea, na jižní polokouli chybí; rostlinný kryt tvoří především jehličnaté stromy; dlouhé období chladu souvisí s pomalým nebo stagnujícím rozkladem organické hmoty (rašeliniště). (5) Tundra – je to biom polární oblasti zahrnující i trvale zaledněná místa; velmi krátká vegetační doba; půda rozmrzá v létě (permafrost); vegetační kryt tvoří nejvíce mechorosty, lišejníky a nízké keřovité dřeviny; typickou adaptací živočichů tohoto biomu je migrace a hibernace. (6) Step – oblasti s nízkým úhrnem ročních srážek; vegetační kryt tvoří především byliny (zvláště traviny), dřeviny pouze při vodních tocích nebo na zavlažovaných místech či v přechodných oblastech (lesostepi); (7) Poušť – velmi nízké srážky (extrémně aridní biom), srážky jsou nárazové (jednou za více let) nebo (v polopuštích) častější (víceméně pravidelné), avšak velmi malé; nejmenší výskyt organizmů ze všech biomů (vysoce suchomilné rostliny snášející velké teplotní rozdíly mezi dnem a nocí). (8) Litoraea – trvale nebo dočasně zaplavené oblasti a tomu odpovídající vysoká vlhkost; rostlinný kryt tvoří převážně lesní formace a rostliny adaptované na anerobní podmínky (např. zaplavené louky), případně v přímořských oblastech na prostředí s vyšší salinitou a pravidelným střídáním výšky vodní hladiny v důsledku odlivu a přílivu; biologicky nejproduktivnější biom; zásadním způsobem ovlivňuje planetární koloběh vody a její kvalitu (kořenové čištění, filtrace) Rozdělení biosféry na jednotlivé biomy je primárně dáno horizontálním geografickým rozdělením abiotických faktorů. Podobné členění lze sledovat i ve směru vertikálním, takže abiotické podmínky v určité nadmořské výšce odpovídají abiotickým podmínkám v určité zeměpisné šířce (např. některé vysokohorské formace odpovídají biomu tundra apod.). Vertikálně členěné formace se označují jako orobiomy a jsou charakterizovány flórou a faunou odpovídajícího biomu. Podle druhového zastoupení rostlin se povrch Země rozděluje na šest základních fytogeografických oblastí: (1) oblast holarktická – Severní Amerika, Evropa, severní Afrika, větší část Asie (2) oblast paleotropická – většina Afriky, jižní a jihovýchodní Asie, Polynézie (3) oblast neotropická – Latinská Amerika a většina Jižní Ameriky (4) oblast kapská – malá jihoafrická oblast (5) oblast australská – Austrálie (6) oblast antarktická – Antarktida Základní oblasti jsou členěny na nižší jednotky: podoblasti, provincie, fytochoriony.
219
Šest základních zoogeografických oblastí bylo stanoveno na základě ryze geografického členění: (1) oblast palearktická – Eurasie a severní Afrika (2) oblast etiopská – ostatní části Afriky (3) oblast orientální – jižní Asie s přilehlými ostrovy (4) oblast australská – Austrálie, Nový Zéland, Nová Guinea s přilehlými ostrovy (5) oblast nearktická – Severní Amerika (6) oblast neotropická – Latinská Amerika s přilehlými ostrovy a Jižní Amerika Jako samostatné se uvádějí ještě další dvě oblasti: madagaskarská a antarktická. V rámci uvedených fytogeorafických a zoogeografických oblastí se vymezují areály jednotlivých biologických druhů v závislosti na dalších ekologických faktorech. Druhy, které se vyskytují ve všech oblastech na Zemi se označují jako druhy kosmopolitní. Naopak druhy, jejichž areál je omezen jen na malé území určité oblasti, se označují jako druhy endemické.
XIX.2. EKOLOGICKÉ FAKTORY Jako ekologické faktory se označují veškeré složky zevního prostředí organizmů. Rozdělují se do dvou základích skupin: (1) faktory abiotické - mezi ně náleží veškeré fyzikální a chemické složky prostředí (klimatické faktory, složení vody, druh podložní horniny atp.), které přímo ovlivňují život organizmů (2) faktory biotické – mezi ně patří veškeré vztahy (vlivy), vznikající při vzájemném působení organizmů. Podrobněji se klasifikují dále na vztahy inraspecifické (sexuální a asexuální) a interspecifické (např. trofické – potravní řetězce, interspecifická predace, vztah predátor – kořist aj.). Kromě tohoto základního dělení ekologických faktorů se vyskytují i další dělení, založená na dílčích klasifikačních kritériích. Faktory primárně periodické jsou způsobeny rotací Země kolem své osy a pohybem Země kolem Slunce (střídání dne a noci, ročních období, přílivu a odlivu apod). Tyto faktory působí trvale a u všech organizmů se vůči nim evolučně vyvinuly endogenní (geneticky podmíněné) adaptace (např. různé druhy endogenních biorytmů – např. cirkadiánní). Faktory sekundárně periodické jsou ve větší či menší míře závislé na faktorech primárně periodických. Přestože jsou od primárně periodických faktorů odvozené, jsou na ně organizmy též adaptovány. Kromě faktorů abiotických lze mezi ně zařadit i některé faktory biotické (například vztahy producent – konzument, hostitel – parazit, predátor – kořist). Tyto faktory působí zejména uvnitř areálů a ovliňují strukturu a hustoru populací. Faktory neperiodické působí náhle, mohou představovat katastrofické situace (např. požár, povodeň, epidemie). Je patrné, že organizmy na ně nejsou adaptovány a proto tyto faktory mohou způsobit významné změny ve struktuře postižených populací a mohou vést i ke změnám jejich rozšíření (areálu). Dlouhodobě působící faktory prostředí mohou představovat selekční tlak, v jehož důsledku jsou v populaci selektovány určité fenotypy, vhodné pro dané prostředí. Podle směru působení těchto faktorů jsou rozlišovány faktory morfoplastické, fyzioplastické a etoplastické.
220
Interakce mezi organizmy a prostředím jsou oboustranné. Organizmy na podmínky prostředí mohou odpovídat v zásadě trojím způsobem: (1) reakcí – jde o vytvoření bezprostřední odpovědi na určitý, zpravidla jednorázový podnět, dosahující alespoň prahové intenzity (reakce zprostředkovaná nervovou soustavou, indukce katalytické aktivity odpovídajících enzymů). (2) adaptací – jedná se obvykle o odpověď na déle trvající nebo opakované podněty (hormonální regulace, dlouhodobější fyziologické změny), která směřuje k udržení homeostázy organizmu. (3) deformací – jedná se o typ odpovědi na působení ekologických faktorů, která přesahuje rámec kompenzačních schopností organizmu, populace, společenstva či druhu a spěje k rozvoji patologických procesů, destrukci nebo k zániku. Přechody mezi jednotlivými typy odpovědí mohou být plynulé. Tuto skutečnost je možné dobře demonstrovat na příkladu stresu jako univerzálním, evolučně konzervovaném jevu, jehož molekulární (či buněčné) základy (ultrastrukturální změny buněčných membrán, cytoskeletu, proteosyntézy – aktivace syntézy tzv. stresových bílkovin apod.) jsou patrné nejen u eukaryotních, ale i prokaryotních organizmů. U stresové reakce (adaptačního syndromu) se vymezují tři stádia. První, stádium šoku (poplachová reakce), se rozvíjí bezprostředně po působení stresoru (tj. faktoru, schopného iniciovat adaptační proces). U člověka je toto stádium spojeno s prudkým zvýšením sekrece ACTH z hypofýzy, které vede k adekvátnímu zvýšení glukokortikoidů v kůře nadledvin, aktivací sympatiku, zvýšenou glykémií a rozvojem převážně katabolických dějů. Pro první stadium stresu je tedy charakteristická nespecifická odpověď (reakce). Druhým stádiem je stádium odolnosti, které směřuje k vytvoření specifické odpovědi (adaptace) na působení daného stresoru. Dochází k poklesu sekrece glukokortikoidů a k aktivaci anabolických procesů, kterými jsou nahrazovány látky spotřebované v katabolických procesech prvního stádia. Při tom se regulačně uplatňují některé další hormony, především růstový hormon, androgeny a mineralokortikoidy. Jako poslední se může vyvinout stádium vyčerpání a to tehdy, jestliže intenzita působení stresoru nebo doba jeho působení anebo synergidní účinek obojího přesahuje kompenzační možnosti organizmu. Stádium vyčerpání je možné stručně charakterizovat jako znovurozvinutí nespecifických odpovědí (zvýšená sekrece glukokortikoidů, převaha katabolických dějů) v širším rozsahu než v prvním stadiu, spějící k rozvoji pro organizmus nežádoucího (patologického) stavu, končícího v krajním případě smrtí (odpověď typu deformace). Adaptace jako jeden ze základních typů odpovědí organizmu na ekologické faktory zvyšují pravděpodobnost přežití za změněných environmentálních podmínek. Adaptace, vztahující se k jedinci (k ontogenezi), se označují jako adaptace individuální. Ontogenetická přizpůsobení se jedince danému životnímu prostředí představují adaptace rezistenční. Geneticky podmíněné a přírodním výběrem pozitivně selektované adaptace v mezích fylogeneze určitého taxonu se označují jako adaptace vývojové. Ovlivňují-li rozsah životaschopnosti populace nebo druhu ve změněném prostředí, označují se jako adaptace kapacitní. Je třeba zdůraznit, že základní determinantou adaptability (a konkrétní adaptace jako jejího projevu) v případě jedince je jeho genotyp (a tomu odpovídající fenotypový projev), v případě populace složení (struktura) jejího genofondu. Tento genetický rámec je nepřekročitelný a pro adaptační proces určující. Jeho rozšíření je možné jedině prostřednictvím pozitivně selektované mutace jako primární události podmiňující případnou změnu fitness, rozšíření genetické variability a diverzifikaci populací. Tyto skutečnosti zvýrazňují aktivní roli organizmů v adaptačním procesu. S ohledem na uvedené skutečnosti je možné ve vztahu k uplatněným mechanizmům v adaptačním procesu vymezit mezi organizmy dva základní typy: typ konformační, u kterého se vnitřní prostředí organizmu mění úměrně změnám zevního prostředí (např. změna tělesné teploty poikilotermních živočichů) a typ konformační, u kterého se využívají vlastní zpětnovazebné regulační mechanizmy organizmu k udržení homeostázy při 221
měnících se podmínkách zevního prostředí (např. stálá tělesná teplota u homoiotermních živočichů). S okruhem problematiky adaptací souvisí Shelfordův zákon minima: každý druh toleruje určité rozpětí libovolného faktoru a nejlépe v prostředí prospívá, působí-li vnější vlivy v rozsahu optimálních hodnot. Tolerance určitého faktoru organizmem (populací) je kvantitativní znak, který vykazuje normální distribuci. To znamená, že existuje jisté variační rozpětí (R) mezi minimální (xmin) a maximální (xmax) hodnotou intenzity faktoru (R = xmax – xmin), který je tolerován. V souladu se zákonem minima odpovídá optimum (vysoká zóna preference) průměrné hodnotě (xpr) intenzity příslušného faktoru a k oběma krajním bodům variačního rozpětí (tj. k hodnotám intenzity faktoru xmin a k xmax) se snižuje až k nule (tzv. pejus); to znamená, že faktor již nemůže být tolerován, jestliže hodnota jeho intenzity je menší než hodnota xmin, anebo větší než hodnota xmax. Hodnota xmin představuje tzv. dolní letální hranici, hodnota xmax horní letální hranici. Normální rozložení hodnot tolerance určitého faktoru organizmem (populací) skýtá možnost jejího detailního studia na základě provedení analýzy rozptylu. V ekologické terminologii je variační rozpětí tolerance faktoru označováno jako ekologická valence faktoru. Organizmy se vyznačují různou mírou tolerance jednotlivých ekologických faktorů, tedy různým rozsahem variačního rozpětí neboli různou ekologickou valencí. Druhy s tolerancí malého rozsahu hodnot intenzity určitého faktoru se označují jako druhy s úzkou ekologickou valencí (resp. tolerancí) neboli druhy stenovalentní, druhy s tolerancí velkého rozsahu hodnot intenzity určitého faktoru se označují jako druhy euryvalentní. Podle druhu příslušného faktoru, vůči kterému je sledována tolerance organizmu, můžeme hovořit o druhu stenotermním (toleruje změny teploty v úzkém rozpětí) nebo eurytermním (toleruje změny teploty v širokém rozpětí), podobně ve vztahu ke kyslíku o druhu steno- nebo euryoxybiontním, ve vztahu k potravě steno- nebo euryfágním atp. Ve vztahu k osidlovanému prostředí se rozlišují druhy stenoekní (osidlují jeden typ prostředí) a euryekní (osidlují různá prostředí) a ve vztahu ke stanovišti se rozlišují druhy stenotopní (obývají několik málo stanovišť nebo pouze jediné) a eurytopní (obývají více stanovišť). Některé ekologické faktory se mohou stát pro přežití jedince (populace, druhu) limitujícími. Jako limitující se mohou projevit faktory, které nabývají hodnot blízkých xmin nebo xmax, nebo pro druhy stenovalentní faktory, jejichž hodnoty varýrují v širokém diapazonu a naopak pro druhy euryvalentní faktory, jejichž hodnoty varýrují v úzkém diapazonu. Obecně lze limitující faktory považovat za významné činitele evolučně-diverzifikačního procesu, neboť mohou vyvíjet selekční tlak ve směru preference genotypů, schopných je v různé míře tolerovat. Mezi základní abiotické ekologické faktory patří především různé druhy záření (sluneční, ultrafialové, ionizující), elektromagnetické pole Země, gravitace, teplota, tlak (atmosférický, hydrostatický), zvuk a přítomnost kyslíku v prostředí. Adaptace vůči těmto základním ekologickým faktorům jsou jednak endogenní (rodové, druhové, geneticky podmíněné; jsou výsledkem evolučního procesu), jednak fyziologické a morfologické (individuální, nedědičné, avšak limitované konkrétním genotypem jedince). Univerzálně rozšířenou endogenní adaptací organizmů na planetární pohyby jsou biorytmy (ultradiánní, cirkadiánní, infradiánní, cirkaseptemdiánní, cirkavigintidiánní, lunární, cirkaanuální, infraanuální). Organizmy disponují vlastním pacemakerem, který lze chápat jako regulátor biologického času. Biologický čas je prostřednictvím různých typů synchronizátorů synchronizován s fyzikálním časem. V případě cirkadiánních rytmů je primárním synchronizátorem směna fotofáze a skotofáze v průběhu jedné otočky Země kolem vlastní osy. U savců se pacemaker nachází v suprachiazmatických jádrech, která jsou spojena se sítnicí (jako zdrojem synchronizujících podnětů z vnějšího prostřed) přímo (cestou retinohypotalamického traktu) i nepřímo (cestou genikulohypotalamického traktu). Informaci o fotoperiodě zprostředkuje hormon melatonin (je uvolňován do krevního oběhu ve skotofázi); transdukcí signálu, spuštěného jeho navázáním na specifické buněčné receptory, jsou iniciovány 222
biochemické reakce, charakteristické pro příslušnou fázi fotoperiody. Melatonin plní funkci takovéhoto zprostředkovatele u řady organizmů nacházejících se na různých úrovních fylogenetického stromu (některé jednobuněčné organizmy, rostliny, živočichové). Poznámka: kromě světla jako abiotického ekologického faktoru existuje též světlo biotického původu. Jedná se o tzv. bioluminiscenci, jejíž podstatou je přeměna chemické energie na světelnou. Při tom je luciferin dehydrogenázovou aktivitou luciferázy oxidován a v průběhu přenosu uvolněných protonů a elektronů dochází k vyzáření světelné energie; reakce probíhá za využití energie uvolněné štěpením ATP. Adaptace živočichů na teplotu evolvovaly dvěma hlavními směry: jeden vedl k organizmům poikilotermním, druhý k homoiotermním. Výrazným projevem adaptace poikilotermů na extrémně nízké teploty (pod bodem mrazu v arktických a antarktických oblastech) je přítomnost tzv. kryoproteinů, které interakcí s tvořícími se krystalky ledu vedou ke vzniku struktury, která nezpůsobuje mechanické poškození buněk. Adaptace na stálou teplotu homoiotermů ve velmi úzkém teplotním rozmezí kolem 35° C souvisí s minimální hodnotou specifického tepla vody (za normálních podmínek právě při 35° C) jako základního prostředí biochemických reakcí. Fyziologické adaptace na výraznější výkyvy teploty prostředí jsou u homoiotermů zprostředkovány specifickými receptory v kůži, cévách, vnitřních orgánech a CNS (hypotalamus – centrum termoregulace). Mohou se projevovat například jako mechanizmy izolační (např. vazokonstrikce, piloerekce), metabolické (zvýšení produkce tepla zvýšeným příjmem potravy, třesová a netřesová termogeneze) nebo hypotermní (zmenšení teplotního rozdílu mezi teplotou tělesnou a teplotou prostředí snížením teploty tělesné - např. hybernace). Mezi typické adaptace živočichů na vysoké teploty patří především zvýšená evaporace, estivace (krátkodobá, dlouhodobá – tzv. „letní spánek“ některých pouštních savců) a přesuny aktivity do částí dne, kdy je teplota nižší. U dosud prozkoumaných organizmů nebyl zjištěn žádný smyslový orgán specifický pro vnímání neviditelného záření (UV, ionizující záření). Fyziologické adaptace na záření jsou svým rozsahem velmi omezené (v porovnání s některými jinými adaptacemi vůči abiotickým ekologickým faktorům). UV i ionizující záření vykazují na organizmy mutagenní, karcinogenní nebo teratogenní účinek; jakákoli dávka může mít mutagenní efekt. Tolerance organizmů vůči záření záleží na straně biologického objektu zejména na fylogenetickém postavení druhu, ontogenetickém stadiu jedince, jeho momentálním fyziologickém (zdravotním) stavu a aktivitě (např. hibernující živočichové jsou tolerantnější než nehibernující), na straně podmínek ozáření zejména na dávce ozáření, způsobu ozáření (např. frakcionovaná aplikace bývá účinnější než jednorázová expozice stejně velké dávky), době trvání expozice záření, na fyzikálně-chemických vlastnostech prostředí, ve kterém byl organizmus exponován a na dalších faktorech. Organizmy na Zemi evolvovaly za spolupůsobení různých druhů kosmického záření a přirozeného radioaktivního záření pocházejícího z geosféry. Možné negativní efekty UV záření (především krátkovlnného) na organizmy účinně omezuje tzv. ozónová vrstva (ve výškách cca 14 – 35 km nad zemským povrchem; její tloušťka se měří v Dobsonových jednotkách, přičemž 100 DJ = 1 mm) i sama atmosféra (redukuje pronikající UV přibližně o 25% na každých 1000 m výškového gradientu). Irreverzibilní a irreparabilní poškození atmosféry by patrně vedlo k dalekosáhlým změnám ekosystémů v celoplanetárním rozsahu. Rádiové vlny (λ < 0,3 mm) představují neionizující elektromagnetické vlnění antropogenního původu (radary, radiotelefony a jiné radiokomunikační prostředky). Popisovány jsou negativní fyzilogické účinky (zrak, pohlavní orgány) a nespecifické klinické příznaky (únava, nevolnost, bolest hlavy apod). Mutagenní, teratogenní nebo karcinogenní účinky nebyly spolehlivě prokázány. Zvuk je významným prostředkem intraspecifických i interspecifických interakcí živočichů (komunikace). Frekvenční rozsah vnímání zvuku je druhově specifický. U člověka činí přibližně 16 Hz – 20 kHz. Zvuk o nižší frekvenci se označuje jako infrazvuk (uplatňuje se např. 223
při komunikaci kytovců), o vyšší frekvenci jako ultrazvuk (uplatňuje se např. při orientaci a lovu netopýrů). Rovněž rozsah fyziologických adaptací na vysokou intenzitu a vysokou frekvenci zvuků je poměrně omezený. Dlouhodobé působení hluku vede u člověka nejen k irreparabilním destrukčním změnám buněk Cortiho orgánu s následným poškozením sluchu, ale i k řadě vegetativních reakcí (změny v kradiovaskulárním systému, poruchy gastrointestinálního traktu, změny svalového tonusu a další). Zatížení životního prostředí nadměrným hlukem je především antropogenního původu. Země se celkově chová jako záporně nabitý hmotný objekt, ovzduší jako kladně nabitý hmotný objekt. Kolem Země tedy existuje proměnlivé (v závislosti na klimatických a meteorologických podmínkách) elektrické pole, jehož působení na organizmy se označuje jako elektroklima. Některé skupiny organizmů jsou schopny registrovat elektromagnetické vlnění a využívají této schopnosti k navigaci (např. ptáci při migracích). Působením různých druhů záření dochází v atmosféře k ionizaci molekul plynů. V prostředí nezatíženém antropogenní činností vznikají především tzv. lehké ionty (průměr řádově 10-9 m), u nichž (zejména u aniontů) je popisován příznivý účinek na lidský organizmus (jeskyně, okolí vodopádů). V prostředí zatíženém antropogenní činností se naopak zvyšuje výskyt tzv. těžkých iontů (průměr řádově 10-7m), které působí na lidský organizmus nepříznivě (zvýšená tvorba hlenu, dysfunkce řasinkového epitelu respiračních cest, změny pH krve, frekvence dýchání a kvalita ventilace plic aj.). Gravitace je ekologickým faktorem, vyznačujícím se enormní konstantností. Je proto zřejmé, že gravitace působila a působí permanentně jako morfoplastický i fyzioplastický faktor, k němuž jsou všechny organizmy velmi dobře adaptovány (tvar těla, struktura opěrně pohybového aparátu, proporcionalita orgánových soustav apod.). Evoluční adaptace na působení gravitace jsou známy jako pozitivní geotropizmus (směr růstu kořene po směru působení gravitačních sil) a negativní geotropizmus (antigravitační směr růstu stonku). Organizmy jsou schopny rovněž určitých fyziologických adaptací na krátkodobé a rozsahem omezené přetížení i stav beztíže. Adaptace na přítomnost kyslíku v prostředí patří evolučně k adaptacím velmi starobylým a odrážejí změny ve složení zemské atmosféry. V současné době mezi hlavní producenty atmosférického kyslíku (a udržovatele jeho konstantní hodnoty) patří fytoplankton moří a biom hylaea. S ohledem na přítomnost kyslíku, jeho množství a formu, ve které se nachází, evolvovaly jako dvě krajní skupiny obligátně anaerobní organizmy a obligátně aerobní organizmy. Mezi těmito krajními skupinami existují skupiny přechodné (fakultativní anaerobové, mikroaerofilové, aerotolerantní anaerobové – blíže viz kapitola Metabolizmus). Obecně je možné konstatovat, že v suchozemských a mořských ekosystémech je obsah kyslíku téměř konstantní a proto druhy obývající tato prostředí jsou zpravidla stenooxybiontní; totéž přibližně platí o velmi rychle tekoucích sladkých vodách. Naproti tomu obsah kyslíku ve stojatých sladkých vodách může významně varýrovat a proto jsou tato prostředí osidlována zpravidla organizmy euryoxybiontními. Geneticky determinované jsou též druhové adaptace na atmosférický tlak kyslíku. Při mořské hladině činí cca 101 kPa, se zvyšující se nadmořskou výškou klesá na každých 1000 m přibližně o 12% při zachování konstatního relativního zastoupení jednotlivých složek vzduchu, avšak s úměrným poklesem parciálního tlaku jednotlivých plynů. Tlak vodních par klesá na každých 1000 m přibližně o 25% a proto úměrně s nadmořskou výškou se zvyšují ztráty vody odpařováním z povrchu těla a sliznic dýchacího ústrojí. Fyziologické adaptace na život ve vyšších nadmořských výškách se týkají především mechanizmů zamezujících vzniku hypoxie a dehydratace, anebo alespoň mírnících jejich rozvinutí. Tyto adaptace mohou být ovšem dostatečně účinné pouze do určité nadmořské výšky (u člověka je to asi do 5000m n. m.). Pro aerobní organizmy se v této souvislosti jako hranice života udává výška 7000 m n. m.
224
XIX.3. BIOLOGIE POPULACÍ A SPOLEČENSTEV XIX.3.1. KLASIFIKACE POPULACÍ Základní pojem biologie populací, tedy pojem „populace“, je různě definován a vymezován. V každém případě je třeba zdůraznit, že pojem populace se vztahuje vždy k určitému biologickému druhu. Populace může být vymezena jako soubor (společenství) jedinců téhož druhu, žijících na určitém místě, v určitém čase, zahrnující všechna vývojová stadia a podílející se na společném genovém (gametovém) fondu, kterým se odlišují od ostatních populací téhož druhu. Soubor všech populací určitého druhu se označuje jako metapopulace a celkový jimi obývaný prostor jako areál rozšíření druhu. Uvnitř populací i mezi populacemi se utvářejí intraspecifické vztahy, které představují jednu skupinu biotických faktorů (vedle vztahů interspecifických), jejichž studiem se zabývá především demekologie (neboli ekologie populací). Vztahy intraspecifické jsou neoddělitelné od vztahů, které se vytvářejí mezi populacemi a jejich prostředím. Populace se klasifikují podle různých hledisek a charakterizují podle různých kritérií. V následujícím textu jsou uvedeny zkladní charakteristiky populací a používané klasifikační přístupy. Podle způsobu rozmnožování můžeme rozlišovat populace asexuální (= poplace druhů, rozmnožujících se některým ze způsobů nepohlavního rozmnožování) a populace sexuální (= populace druhů rozmnožujících se některým ze způsobů pohlavního rozmnožování). Podle způsobu oplození mohou být poplace autogamní (= populace, v nichž každý jedinec produkuje samčí i samičí gamety, které při oplození navzájem splývají uvnitř téhož jedince; typickým příkladem jsou populace samosprašných rostlin) a populace allogamní (= populace, složené buď z jedinců odděleného samčího pohlaví, produkující pouze samčí gamety, a samičího pohlaví, produkující pouze samičí gamety, anebo jedinců, kteří produkují samčí i samičí gamety, avšak k oplození určitého jedince je nutná komplementární gameta jiného jedince; typickými příklady allogamních populací jsou populace cizosprašných rostlin a populace založené na volném páření). Mezním případem allogamní populace je populace panmiktická, pro kterou v rámci gametového fondu platí stejná pravděpodobnost spojení kterékoli gamety jednoho pohlaví s kteroukoli gametou opačného pohlaví. Mezi populacemi čistě autogamními a čistě allogamními existují určité přechodné typy (např. populace některých druhů hmyzu se střídáním pohlavní a nepohlavní generace). Podle velikosti se populace klasifikují na velké, středně velké a malé. Velilost populace však nelze spolehlivě určit pouze počtem jejích členů, ale reprezentativností vzorku genů, které se stávají genofondem populace. Efektivní velikost populace je dána počtem reprodukceschopných a do genového fondu populace přispívajících jedinců. Většina přírodních populací je středně velkých. Populace velké, osidlující rozsáhlá území a oblasti navzájem izolované, znemožňující nebo výrazně omezující migraci, mají tendenci vytvářet subpopulace (démy) v důsledku tzv. náhodného genového posunu (neboli genetického driftu). Genetická struktura subpopulací se liší od genetické struktury původní, velké výchozí populace, ze které jsou odvozeny. Taková divergence genofondu zpravidla koresponduje se vznikem geneticky determinovaných adaptací subpopulace na specifické lokální podmínky jí osidlované části areálu. Souvisí rovněž s divergentními procesy na úrovni nižší než druh (vznik odrůdy, rasy, linie, formy – např. průmyslový melanizmus) a může mít i účinek speciační. Mezi základní charakteristiky každé populace patří: (1) početnost (= absolutní počet jedinců tvořících danou populaci) (2) hustota hrubá (= početnost dané populace, vztažená na jednotku prostoru nebo plochy) a ekologická (= početnost dané populace, vztažená pouze na tu část prostoru nebo plochy, 225
(3)
(4)
(5) (6)
(7)
(8)
která je danou populací fyzicky obývána). Hustota populace je jedním z významných faktorů ovlivňujících vývoj populace; tuto skutečnost vyjadřuje tzv. Alleeho princip: pro přežití populace je důležitá její přiměřená hustota, odpovídající daným podmínkám prostředí, které jsou té které populaci k dispozici. natalita a mortalita (= počet narozených, resp. uhynulých jedinců v dané populaci za jednotku času). Je-li poměr natalita / mortalita = 1, hovoříme o populaci stabilní, je-li tento poměr větší než 1, hovoříme o populaci rostoucí a je-li menší než 1, hovoříme o populaci vymírající. migrace (= přemísťování jedinců mezi populacemi). Migrace sestává ze dvou složek: emigrace (= přemístění určitého počtu jedinců z referenční donorové populace do recipientní populace či do více recipientních populací) a imigrace (= přemístění určitého počtu jedinců z donorové populace či z více donorových populací do referenční recipientní populace). Migrace ovlivňuje složení genového fondu jednotlivých populací (resp. subpopulací) a tím i jejich stabilitu. Migrace jsou též možným faktorem změny velikosti areálu rozšíření druhu jak ve smyslu jeho zmenšení (např. přesun jedinců monofágního nebo stenofágního druhu z míst vymizení hlavního potravního zdroje na jiné místo), tak ve smyslu jeho rozšíření (osídlení ekologické niky; invaze jako hromadné migrace na dosud neosídlená území) nebo obnovení (reintrodukce, resp. repatriace na místa dřívějšího výskytu). oscilace (= průběžné, pravidelné kolísání hustoty populace v průběhu jedné generace, respektive v průběhu jednoho roku) fluktuace (= kolísání hustoty populace v průběhu několika let odrážející změny v poměru natalita/mortalita, způsobené vlivem dlouhodobě působícího komplexu ekologických faktorů. Fluktuace jsou typické pro tzv. gradační druhy (např. hraboš polní). Ve vývoji populací těchto druhů lze rozpoznat několik fází: fázi latence (charakterizovanou počáteční nízkou hustotou populace), fázi progradace (charakterizovanou pomalým zvyšováním hustoty populace), fázi progrese (s typickým prudkým nárůstem populace a tudíž i progresivním zvyšováním její hustoty) přecházející do gradačního vrcholu, ve kterém hustota populace kulminuje, a fázi retrogradace (charakterizovanou velmi rychlým poklesem početního stavu a tím i hustoty populace na úroveň odpovídající počáteční fázi latence). Fluktuace mohou vyjadřovat například vývoj vztahů mezi populací predátora a populací kořisti. poměr pohlaví (= poměr celkového počtu jedinců jednoho pohlaví ku celkovému počtu jedinců opačného pohlaví, stanovovaný v různých stadiích ontogenetického vývoje). Primární poměr pohlaví představuje poměr pohlaví v době vzniku zygot (resp. v časných stadiích jejich vývinu) a za normálních podmínek je 1 : 1, protože odráží příslušný typ genetické determinace pohlaví. Sekundární poměr pohlaví se stanovuje v době narození potomků; jeho odchylka od poměru 1 : 1 je projevem prenatální mortality, která obvykle výrazněji postihuje embrya a féty samčího pohlaví. Terciární poměr pohlaví se stanovuje v postnatálním období života v době dosažení dospěloti (resp. reprodukční zralosti). Změny tohoto poměru od hodnoty 1 : 1 (resp. od zjištěné hodnoty sekundárního poměru pohlaví) jsou projevem působení jak vnitřních (endogenních) faktorů, tak vnějších (exogenních) faktorů, např. infekční agens, predační tlak, zoosociální kanibalizmus apod.. věková struktura (= rozložení relativních četností jednotlivých věkových skupin v dané populaci). Primárně závisí na životním cyklu jednotlivých druhů (např. rostliny jednoleté, dvouleté, vytrvalé; u živočichů rozmnožování v průběhu roku plynulé nebo sezónní). Sekundárně je ovlivněna jak vnitřními (genetickými) faktory (např. snížená vitalita, snížená fertilita), tak vnějšími faktory biotickými (určitými interakcemi sociálně organizovaných živočišných druhů) i abiotickými (klimatickými, potravními apod.).
226
Již z tohoto krátkého, stručného přehledu typů populací a jejich základních charakteristik zcela jasně vyplývá, že každá populace je velmi složitý, dynamický, vyvíjející se supraoorganizmální biologický útvar s vlastními specifiky a zákony, neredukovatelný na prostý aritmetický součet jedinců.
XIX.3.2. INTRASPECIFICKÉ VZTAHY Vztahy intraspecifické (též homotypické či mezidruhové) jsou vztahy mezi jedinci téhož druhu. Většina těchto vztahů je geneticky determinována, faktory prostředí mají zpravidla pouze modifikující účinek. Základní dva druhy těchto vztahů představují vztahy sexuální (neboli reprodukční) a vztahy asexuální (neboli mimoreprodukční), které vedou k vytváření určitých skupin. Hlavní typy sexuálních skupin jsou: (1) rodičovský pár (= dočasně nebo trvale společně žijící partnerský pár, vytvořený na základě realizace potřeby reprodukce) (2) rodina (= skupina tvořená rodiči a jejich potomky, anebo alespoň jedním rodičem a jeho jedním potomkem). Rodina může být dvougenerační i vícegenerační, úzká (pouze rodiče a jejich potomci) nebo široká (rodiče, jejich potomci a jiní příbuzní) (3) sourozenecká skupina (= skupina sourozenců stejně starých, společně žijících často již bez rodičů). Sourozenecké skupiny jsou typické pro řadu zástupců hmyzu, kdy se nová generace líhne z nakladených vajíček v nepřítomnosti rodičů a určitou dobu žije (popřípadě se i páří) společně. (4) příbuzenský svazek (= skupina, složená z jedinců více generací společně žijících a reprodukujících se) (5) reprodukční kolonie (= mnohočetná skupina jedinců společně žijících nebo pouze shromážděných na určitém místě, kde realizují potřebu reprodukce). Typickými reprodukčními koloniemi jsou hnízdní kolonie ptáků. (6) zoosociální kolonie (= mnohočetná, vnitřně funkčně a/nebo morfologicky diferencovaná, reprodukující se skupina). Klasickým příkladem živočichů, kteří vytvářejí vysoce organizované zoosociální kolonie, jsou včely (královna, dělnice, trubci; samice diploidní, samci haploidní), mravenci a termiti. Hlavní typy asexuálních skupin jsou: (1) kormus (= soubor jedinců navzájem spojených, tvořících celek v podobě kolonie). Členové kormusu mohou být částečně funkčně a/nebo morfologicky diferencováni. Typickým příkladem jsou koráli, jejichž kolonie (kormusy) mohou vytvářet rozsáhlé útesy. (2) agregace (= skupiny jedinců, vzniklé náhodně obvykle působením některého ekologického faktoru, např. větru nebo vodního proudu) (3) konglobace (= náhodně vzniklá skupina jedinců, shromážděná na určitém místě v důsledku uspokojení určité biologické potřeby). Příkladem konglobace může být shromáždění lesní zvěře u krmelce, nočních motýlů kolem lampy apod. (4) lovící skupina (= skupina živočichů, motivovaná společným vyhledáváním a získáváním potravy). Příkladem lovící skupiny může být smečka vlků, skupina lovících okounů nebo kormoránů. (5) potulná anebo tažná skupina (= skupina jedinců migrujících z vnitřních i vnějších příčin). Typickou tažnou skupinou jsou tažní ptáci, přelétávající sarančata, potulnou skupinou nomádní pouštní kopytníci.
227
(6) klidová skupina (= skupina jedinců, shromážděných na určitém místě, kde realizují fyziologickou potřebu spánku nebo jiné formy odpočinku). Příkladem může být shromaždiště netopýrů nebo ptáků nocujících na určitém stromu apod.). (7) přezimující skupina (= skupina jedinců, shromážděná na určitém místě k přezimování). Příkladem mohou být hibernující skupiny syslů, zimní kolonie netopýrů, hromadná zimoviště komárů, obojživelníků a dalších živočichů. Na základě vztahů mezi populacemi biologických druhů a jejich prostředím se rozvíjejí určité typy populačních strategií živočichů a rostlin. Jedním ze základních typů u živočichů jsou tzv. r - stratégové, pro které je charakteristická krátkověkost, malé rozměry, velký repropdukční potenciál a časný nástup pohlavní dospělosti. r strategie má pozitivní efekt pro druhy obývající prostředí s často a výrazně se měnícími životními podmínkami. Druhý základní typ strategie představují tzv. K - stratégové, pro které je naopak charakteristická většinou dlouhověkost, větší tělesné rozměry, nízký reprodukční potenciál a pozdější nástup pohlavní dospělosti. U rostlin jednu skupinu tvoří tzv. S - stratégové, které představují rostliny odolné vůči permanentně nebo dlouhodobě působícímu stresu, způsobeného negativními vlivy vnějších faktorů. Další skupinu představují tzv. R - stratégové, do níž se řadí druhy rostlin, které snášení nízkou hustotu populace. To je jedna z příčin, proč se populace těchto druhů objevují v iniciálních stadiích sukcese. Konečně třetí významnou skupinu tvoří tzv. C - stratégové, kteří se objevují v závěrečném stadiu sukcese a představují populace druhů rostlin, které jsou dobře adaptované na dané prostředí (zapojené do daného společenstva), schopné úspěšně konkurovat jiným druhům a reprodukovat se v prostředí bez výrazných výkyvů životních podmínek. Uvedené typy strategií živočišných a rostlinných druhů představují jakési idealizované formy. V přírodních podmínkách se vyskytují různé přechodné typy s akcentovanými těmi či oněmi prvky určitého typu strategie.
XIX.3.3. INTERSPECIFICKÉ VZTAHY Interspecifické (též heterotypické či mezidruhové) vztahy jsou především předmětem studia synekologie. Tyto vztahy překračují rámec populace. Mohou postihovat vztahy jak mezi jednotlivci různých druhů, tak mezi populacemi nebo částmi populací různých druhů, vytvářejících společenstva. Většina těchto vztahů je geneticky determinována, faktory prostředí mají zpravidla pouze modifikující účinek. Každý biologický druh zaplňuje určitou ekologickou niku. Ekologická nika představuje soubor podmínek a faktorů daného prostředí, které umožňují existenci určitého druhu v tomto prostředí a jeho zapojení do příslušného ekosystému. Různé druhy téhož ekosystému (biotopu) vstupují do vzájemných interakcí a vztahů. Hlavní typy interspecifických vztahů zahrnují: (1) neutralizmus (= situace, kdy populace různých druhů mezi sebou interagují, avšak vzájemně se pozitivně ani negativně neovlivňují, mohou existovat samostatně, nezávisle na sobě, tedy koexistovat). (2) protokooperace (= velmi volné vzájemné vztahy, obvykle dočasné, které mohou být přerušeny bez zjevného negativního dopadu na populace, které protokooperovaly) (3) aliance (= příležitostné a dočasné spojení populací různých druhů nebo jejich některých členů, které spojuje společná potřeba). Příkladem mohou být smíšená, vícedruhová stáda jako prostředek zvýšené ochrany před predátory.
228
(4) komenzalizmus (= vzájemný vztah mezi různými druhy, který je prospěšný pro komenzála a současně neutrální vůči druhému účastníkovi). Příkladem může být vztah predátora a mrchožrouta (např. šakal – sup). (5) parekie (= vztah založený na aktivním vyhledávání jednoho druhu jiným druhem, skýtajícího ochranu). Příkladem mohou být synantropně žijící ptáci. (6) epekie (= vztah, při kterém partner jednoho druhu trvale nebo dlouhodobě osidluje povrch partnera jiného druhu, ale neparazituje na něm). Příkladem epekií mohou být různé druhy epifytů a epizoí. (7) entekie (= vztah, při kterém partner jednoho druhu trvale nebo dlouhodobě žije uvnitř partnera jiného druhu, ale neparazituje v něm). (8) synekie (= trvalé soužití živočichů ve společných příbytcích). Příkladem může být hnízdění vrabců ve skulinách hnízd čápů, nebo osídlení mravenišť myrmekofilními druhy hmyzu. (9) forézie (= vztah, ve kterém partner jednoho druhu aktivně vyhledává partnera jiného druhu, kterého používá jako transportního prostředku). (10) mutualizmus (= vztah, který představuje trvalou a oboustranně nepostradatelnou vazbu pro život zúčastněných partnerů). Příkladem může být vztah mezi některými mikroorganizmy, obývajícími bachor přežvýkavců, a přežvýkavci, kteří by bez jejich přítomnosti nebyli schopni trávit celulózu. (11) amenzalizmus (= vztah, při kterém partner jednoho druhu, tzv. inhibitor, produkuje metabolity s retardačním, inhibičním až letálním účinkem na partnera jiného druhu, tzv. amenzála). Příkladem může být vztah mezi mikroorganizmem produkujícím určité antibiotikum a organizmem vůči tomuto antibiotiku vnímavým (např. jiným mikroorganizmem). (12) kompetice (= vztah mezi dvěma nebo více druhy, založený na soutěžení, resp. konkurenci týkající se uspokojení určité biologické potřeby). (13) predace (= vztah mezi predátorem a kořistí, ve kterém se partner jednoho druhu stane potravou pro partnera jiného druhu). (14) parazitizmus (= vztah, ve kterém partner jednoho druhu slouží jako hostitel pro partnera jiného druhu, tj. parazita, který hostitele potravně vuyžívá až do jeho usmrcení).
XIX.3.4. KLASIFIKACE SPOLEČENSTEV (BIOCENÓZ) Pojem společenstvo (biocenóza nebo jen cenóza) označuje druhově heterogenní soubory organizmů, které v přírodě vytvářejí vzájemně propojené, svébytné systémy projevující se charakteristickými znaky, specifickými pro tuto úroveň supraorganizmání organizace živé hmoty (stabilita zajišťovaná především autoregulačními a homeostatickými mechanizmy podílejícími se na udržení dynamické rovnováhy, relativní nezávislost na vyšších i nižších úrovních organizace živých systémů, adaptabilita vůči měnícím se životním podmínkám, autoregulace na principu zpětných vazeb, autoreprodukce a vývoj biocenózy). Společenstva jsou předmětem studia synekologie (biocenologie). Každé společenstvo obývá určité prostředí (tj. biotop), vyznačující se jistým souborem životních podmínek, označovaných jako cenotop. Uvnitř biocenózy se formují vztahy mezi jejími členy jednak přímé (tzv. korelace), jednak nepřímé, zprostředkované přes dalšího člena nebo další členy (tzv. interrelace). Podobné biotopy jsou osidlovány strukturně i funkčně podobnými společenstvy (tzv. izocenózy). Izocenózy rozdílných geografických lokalizací se mohou lišit druhovým složením, avšak obsahují druhy, které v nich plní stejné nebo velmi podobné ekologické funkce; jedná se o tzv. ekvivalentní druhy, neboli ekologické vikarianty. Úloha všech druhů v biocenóze není rovnocenná; druhy, bez kterých by určitý typ biocenózy nemohl dlouhodobě existovat a fungovat, se označují jako druhy klíčové (jejich význam 229
pro strukturu biocenózy je vyšší, než by odpovídalo kvantitativnímu zastoupení jejich členů v biocenóze) a dominanty (jejich význam pro strukturu biocenózy je úměrný jejich kvantitativnímu zastoupení v biocenóze). Biocenózy lze klasifikovat podle různých klasifikačních kritérií. Podle původu se rozlišují biocenózy primární neboli přirozené, neovlivněné (nebo ovlivněné v zanedbatelné míře) antropogenními vlivy, a biocenózy sekundární, které se zformovaly anebo se formují na místech zaniklých původních (primárních) biocenóz. Podle stupně stability se biocenózy dělí na ustálené, jejichž druhové složení je konstantní po dlouhou dobu, avšak do určité míry závislé na podmínkách prostředí (ustálená biocenóza nezávislá nebo závislá) a biocenózy proměnlivé, které nejsou druhově ustálené. Některé změny v druhovém složení biocenózy se opakují cyklicky (tzv. cyklobiocenózy), jiné představují zákonitý, uspořádaný, dlouhodobý vývojový proces (tzv. sukcese) procházející jednotlivými sukcesními stadii a dospívající buď k vytvoření ustálené biocenózy ve stavu dynamické rovnováhy s přírodním prostředím (tzv. klimax), anebo k zániku biocenózy. Proměnlivé biocenózy je možné ještě dále podrozdělit: dílčí biocenózy představují subsystémy základní biocenózy, na kterou jsou nadále v určité míře vázány; ekotony jsou specifické biocenózy v místech styku dvou či více různých základních biocenóz; smíšené biocenózy, které jsou v rámci biotopu diferencované podle existujících mikropodmínek. Podle organizmů obývajících určitý biotop můžeme rozeznávat biocenózy rostlin (fytocenózy) a živočichů (zoocenózy), které lze dále podrozdělit podle taxonomického hlediska (např. bryocenóza, herpetocenóza). Biocenózy jsou supraorganizmální útvary, které jsou zpravidla diferencovány vertikálně i horizontálně. Při vertikální stratifikaci se vyčleňují jednotlivé etáže (biostrata) s charakteristickou strukturou příslušné dílčí biocenózy (tzv. stratocenóza). Při horizontálním členění biotopu biocenózy lze vymezit místa s vysokou hustotou organizmů většiny druhů dané biocenózy (tzv. choriotopy neboli biochoria a choriocenózy) a místa, osidlovaná pouze omezeným souborem některých druhů dané biocenózy (tzv. merotopy a merocenózy), případně pouze jedním druhem či několika druhy, specificky adaptovanými na speciální podmínky určitého typ prostředí (tzv. synuzie). Jednotlivé biocenózy se charakterizují podle celé řady dílčích znaků. Mezi hlavní patří druhové spektrum, hustota druhů, hustota organizmů, biomasa (= hmotnost všech organizmů biocenózy na jednotku plochy nebo prostoru), konstance (= prostorová nebo časová stálost druhového složení biocenózy), dominance (= početní nebo hmotnostní podíl jedinců jednotlivých druhů na složení biocenózy), ekvitabilita (= četnostní zastoupení jednotlivých druhů v biocenóze) a frekvence (= pravidelnost výskytu jedinců určitého druhu, vyjádřená ve formě jejich relativní četnosti v dílčích vzorcích biocenózy). Struktura biocenózy se zpravidla hodnotí podle zasoupení jednotlivých trofických úrovní a vzájemných vztahů mezi organizmy v nich zapojenými. Jednotlivé trofické úrovně jsou v biocenózách (ekosystémech) sekvenčně uspořádány v tzv. potravní řetězce, jejichž prostřednictvím se uskutečňuje koloběh látek a tok energie a informací na supraorganizmální úrovni organizace biologických systémů. První (základní) trofická úroveň je obsazena primárními producenty; jsou to autotrofní organizmy, schopné metabolicky přeměňovat anorganické substráty v organické sloučeniny, ze kterých podle potřeby uvolňují energii nutnou pro životní procesy vlastní i všech dalších organizmů, nacházejících se na kterékoli vyšší trofické úrovni. Mezi primární producenty patří všechny fotosyntetizující a chemoautotrofní organizmy. Druhá trofická úroveň je obsazena konzumenty; jsou to heterotrofní organizmy, které využívají produktů producentů, respektive konzumují producenty. Tím získávají již hotové organické látky, které podle potřeby dále metabolizují a využívají jako energetické zdroje. Konzumenti se dále dělí do několika řádů: konzumenti I. řádu (K1, býložravci), konzumenti druhého řádu (K2, masožravci či všežravci) a případně dalších vyšších řádů (K3,K4, masožravci), přičemž vždy konzumenti nižšího řádu jsou potravou konzumentů vyššího řádu. Na 230
základě existujících trofických vztahů mezi producenty a konzumenty je možné sestavit tzv. trofickou (potravní) pyramidu, v níž směrem od základny k vrcholu se kladou vrstvy: anorganické látky → autotrofové (fotosyntetizující organizmy)→ konzumenti prvního řádu (býložravci) → konzumenti druhého řádu (všežravci, příp. masožravci) → konzumenti třetího řádu (masožravci). V trofické pyramidě se odráží nejen sekvence základních trofických úrovní, ale též skutečnost, že každá vyšší vrstva pyramidy produkuje méně biomasy a tudíž s každou vrstvou pyramidy dochází k poklesu celkové biomasy. Jak již bylo uvedeno, organizmy každé nižší trofické úrovně se stávají pro organizmy vyšší trofické úrovně potravou a tedy i zdrojem energie. Celým trofickým řetězcem můžeme sledovat tok energie, přičemž na každé trofické úrovni platí následující obecné schéma: organizmus část energie odebrané z nižší trofické úrovně přijme potravou a část ponechá (např. kosti); část přijaté energie se může metabolicky využít (tzv. metabolizovatelná energie), část je jí uvolněna mimo organizmus (např. ve formě feces); metabolizovatelná energie se utilizuje při metabolických procesech (tzv. metabolizovaná energie) na zajištění jednotlivých životních dějů (růst organizmu, regenerace tkání, reprodukce), nebo se deponuje v podobě energetických rezerv (škrob, glykogen apod.). V přírodě se vyskytuje více typů trofických řetězců (např. detritový, který je vázán na neživou biomasu nebo pastevně-kořistnický, který je vázán na živou biomasu), přičemž jsou všechny vzájemně přímo nebo zprostředkovaně propojené a tvoří trofickou síť. Trofická síť představuje esenciální mechanizmus etablování a perzistence vyváženého, autoregulovatelného, homeostatického ekosystému (s řadou fungujících zpětnovazebných okruhů) jako celku i jeho jednotlivých subsystémů (biocenóz, populací). Trofická síť reflektuje základní typy výživy a potravní spektra. Autotrofové syntetizují potřebné organické látky z látek anorganických. Hlavním procesem, jehož prostřednictvím se tyto syntézy uskutečňují, je fotosyntéza. Heterotrofové nejsou schopny syntetizovat potřebné organické látky z anorganických a proto je musí přijímat potravou již v hotovém stavu, tj. jako produkty autotrofů. Mixotrofové kombinují autotrofii s heterotrofií v závislosti na výživových podmínkách konkrétního prostředí. Podle přijímané potravy můžeme heterotrofy klasifikovat do několika skupin. Fytofágové se živí výhradně rostlinnou potravou, přičemž herbivora (býložravci) přijímají části rostlin nebo celé rostliny, kdežto fytoparazité přijímají produkty rostlinných organizmů uvnitř hostitelských rostlin, nebo na jejich povrchu (sání). Zoofágové se živí výhradně živočišnou potravou, přičemž karnivora (masožravci) jako predátoři přijímají zpravidla živočichy (nebo jejich části) nacházející se na některé z nižších trofických úrovní, kdežto zooparazité přijímají produkty živočišných organizmů uvnitř hostitelů (endoparazité) nebo na jejich povrchu (ektoparazité). Kanibalové požírají jedince vlastního druhu; hovoří se též o tzv. vnitrodruhové predaci. Nekrofágové se živí nerozkládajícími se (nebo jen částečně) neživými organizmy. Na rozdíl od nich se saprofágové živí rozkládajícími se neživými organizmy, přičemž stadium rozkladu již zpravidla dosahuje vyššího stupně a proto je lze zařadit mezi tzv. destruenty (neboli dekompozitory). Symbiontofágové využívají jiné organizmy pro vlastní výživu buď jako jeden z jejích zdrojů (ektosymbionti) nebo prostředků (endosymbionti), přičemž je možné ustanovený vztah mezi jeho oběma zúčastněnými členy považovat za oboustranně prospěšný (např. mikroflóra v bachoru přežvýkavců umožňující jim trávit celulózu). Kvalitativní stránku složení potravy charakterizuje potravní spektrum určitého druhu. Monofágové jsou specializovaní pouze na jeden druh potravy, oligofágové na několik velmi blízkých druhů potravy. Monofágové a oligofágové představují dohromady druhy stenofágní. Druhy se širokým (málo specializovaným) potravním spektrem mají druhy euryfágní, jejichž krajním projevem je pantofágie (omnivorie), tedy všežravost v širokém slova smyslu. U některých druhů živočichů dochází ke střídání druhu potravy (potravního spektra) v průběhu ontogeneze (např. larvy komárů se živí vodními mikroorganizmy, dospělé samice sají krev homoiotermních obratlovců, samci sají rostlinné šťávy). 231
XIX.3.5. EKOSYSTÉMY Termínem ekosystém se označuje ekologický systém složený z biocenózy (= soubor populací všech druhů, zastoupených v daném ekosystému) a ekotopu (= prostředí biocenózy bez biotických faktorů), resp. biotopu (= prostředí biocenózy včetně biotických faktorů). Ekosystémy jsou mají stejné atributy jako ostatní biologické systémy. Globálním ekosystémem je biosféra, která zahrnuje veškeré organizmy (tzv. biota) a prostor, který tyto organizmy obývají; je tedy ekosystémem největším. Na nižších úrovních rozlišujeme například vodní ekosystém nebo půdní ekosystém a na ještě nižších úrovních např. ekosystém lesa, ekosystém sladkovodní nádrže, ekosystém jílovitých půd atd. Přitom každý ekosystém je charakteristický vlastní strukturou a funkcemi, které lze v obecné rovině popsat v termínech toku energie, látek a informací. Základní prvky struktury ekosystému tvoří producenti, tedy organizmy, které produkují organické látky z látek anorganických, konzumenti, kteří spotřebovávají organické látky primárně syntetizované producenty a destruenti (neboli dekompozitoři či reducenti), kteří rozkládají organické látky neživých organizmů až na látky anorganické procesy, které se souhrnně označují jako mineralizace. Tok energie v ekosystémech je jednosměrný. Jak již bylo uvedeno na jiných místech, je základním zdrojem energie pro veškeré biologické procesy (tedy i pro procesy v ekosystémech) Slunce. Na horní okraj atmosféry dopadá konstantní kvantum sluneční energie, vyjádřené solární konstantou (1367 Wm-2). Z tohoto záření (po částečném odrazu a absorpci při průchodu atmosférou) na povrch Země proniká asi 47%, většinou krátkovlnného. Část sluneční energie, která pronikla na Zemi (asi 45%), je zachycena a využita při biosyntetických dějích živými systémy. Jedná se o tzv. fotosynteticky využitelné záření v rozsahu vlnových délek přibližně 380 – 720 nm, označované jako PHAR (photosynthetic active radiation), které je absorbováno asimilačním aparátem fotosyntetizujících organizmů. Při tom dochází k transformaci světelné (elektromagnetické) energie v energii chemickou, která může být živými systémy relativně dlouhodobě akumulována, translokována a utilizována, než je jimi opět v nějaké adekvátní formě uvolněna do prostředí. Chemická energie, vázaná v organických látkách, prostupuje v této formě potravními řetězci, jimiž jsou jednotlivé živé systémy vzájemně propojeny. Přestup chemicky vázané energie z jedné trofické úrovně potravního řetězce do následující je vždy současně doprovázen jednak transformací této formy energie v jinou (mechanická, elektrická, světelná, tepelná), jednak přesunem určitého jejího podílu do detritového potravního řetězce (feces, odumřelé části organizmů nebo celé odumřelé organizmy). Žádná transformace energie se nemůže realizovat bez určitých ztrát ve formě tepla. V souvislosti s touto skutečností je obsah energie ve sledu životních dějů v každém následujícím ději nižší, než v ději předcházejícím. Z toho vyplývá, že s každou další trofickou úrovní ve směru producenti → konzumenti I. řádu → konzumenti II. řádu → konzumenti dalšího vyššího řádu → destruenti klesá energetický obsah a celková biomasa. Vzhledem k tomu, že sluneční záření se šíří rychlostí světla, kdežto všechny ostatní formy energie se šíří menší rychlostí, je možné na transformace sluneční (světelné) energie, uskutečňované živými systémy, vcelku nahlížet jako na specifický způsob zbrzdění toku energie. Z biofyzikálního hlediska živé systémy tedy fungují jako transformátory energie, které absorbovanou a transformovanou energii využívají v koloběhu látek. Živé systémy na kterékoli úrovni organizace jsou médii, kterými je energie absorbována, protéká jimi, je jimi zpomalována, transformována a akumulována, avšak v žádném případě jimi není tvořena.
232
Tok látek ekosystémy vyplývá z pohybu jako atributu hmoty. Celkové množství hmoty na Zemi (v jejích nesčetných formách) je víceméně konstantní, avšak zapojené do permanentně probíhajícího koloběhu látek (resp. koloběhu či toku hmoty). Koloběh látek se realizuje na různých úrovních organizace hmoty (fyzikální, chemické, biologické, společenské) a je strukturován i v rámci každé z těchto základních úrovní. V ekologii se zpravidla rozlišují následující cykly koloběhu látek: (1) biochemické – jednotlivé biochemické cykly představují koloběh látek živými systémy a jejich výměnu s okolím; vyznačují se relativně vysokou rychlostí. (2) biogeochemické - navazují na biochemické cykly a zahrnují navíc uvolňování některých látek při horotvorných a sedimentačních procesech a při procesech zvětrávání (fyzikálního, chemického i biologického); z uvedeného je zřejmé, že biogeochemické cykly jsou výrazně pomalejší, než cykly biochemické. (3) geochemické – tyto cykly zahrnují tektonickou fázi geologického látkového cyklu; jsou z těchto tří cyklů koloběhu látek nejpomalejší a také trvají nejdéle. Kritérii pro uvedenou klasifikaci cyklů koloběhu látek jsou procesy a fáze, kterými sledovaná látka prochází. Tato klasifikace odráží globální (planetární) látkový cyklus, ve kterém je na nižší úrovni vymezován cyklus geologický sestávající ze dvou dílčích cyklů (tektonického a sedimentárního) a zahrnující jednotlivé geologické jevy (orogeneze, sedimentace, tektonika, vulkanizmus atd.), cyklus hydrologický představující koloběh vody a odvíjející se primárně od nerovnoměrného rozložení sluneční energie v celoplanetárním měřítku a od základních pohybů Země (srážky, mořské a vzdušné proudy, slapové jevy a další) a cyklus biochemický, který se odvíjí od procesů fotosyntetických, respiračních, trofických a výměny látek mezi živými systémy a jejich okolím. Koloběh látek si přiblížíme na stručné charakteristice koloběhu základních biogenních prvků (C, O, N, P, S) a vody. KOLOBĚH UHLÍKU Uhlík je univerzálně se vyskytujícím prvkem ve všech živých systémech (o životě v podmínkách Země se v této souvislosti hovoří též jako o uhlíkové formě života, tedy o životě, založeném v zásadě na organických sloučeninách uhlíku). V litosféře se nachází většina uhlíku uloženého zejména v sedimentech a fosilních palivech V hydrosféře a atmosféře se vyskytuje především ve formě sloučenin anorganických (CO2 a hydrogenuhličitanové anionty představují aktivní formy koloběhu uhlíku), méně často organických. V ustálených ekosystémech je množství uhlíku, uvolněného mineralizací, rovno množství uhlíku, které je spotřebováno primárními producenty a inkorporováno do produkované biomasy. Globální koloběh uhlíku odráží proporcionalitu fotosyntézy a respirace (biochemický cyklus); proto i v rámci dílčích ekosystémů má pro koloběh uhlíku základní význam poměr mezi atmosférickým molekulárním oxidem uhličitým a oxidem uhličitým, rozpuštěným ve vodě (hydrogenuhličitanové ionty). Do hydrosféry se atmosférický CO2 dostává jednak difúzí na vodní hladině, jednak je do nístrháván při srážkových jevech. Do atmosféry je doplňován respirací organizmů, při vulkanických dějích a hlavně uvolňováním ze zvětralých hornin obsahujících uhličitany. Biogeochemický cyklus uhlíku zahrnuje přesun části biomasy do sedimentů, z nichž se uvolňuje při zvětrávacích procesech. Děje spadající do geochemického cyklu uhlíku představují vznik uhličitanu vápenatého (CaCO3), jeho přesun do sedimentů (vápenec), vznik vápencových pohoří a zpětné uvolnění uhlíku při jejich zvětrávání v některé z jeho aktivních forem oběhu. Oxid uhličitý je fotosynteticky fixován a zabudován ve formě organických sloučenin do biomasy producentů. Prostřednictvím potravních řetězců pak uhlík především ve formě organických sloučenin (a z části ve formě hydrogenuhličitanových iontů) prostupuje jednotlivými trofickými úrovněmi, přičemž je na každé z nich současně v určitém množství uvolněn do prostředí (např. jako CO2 při dýchání). Uhynulé organizmy jsou rozkládány 233
některými skupinami heterotrofů (destruenti), přičemž část rozkládaného organizmu se stává součástí těla a metabolitů destruentů, část se mineralizuje aerobními nebo anaerobními procesy na CO2 (a další produkt podle typu destruujícího organizmu a podmínek destrukce – voda, vodík, metan, acetát apod.). Protože je uhlík prvkem přítomným ve všech živých systémech, je jeho koloběh propojen s koloběhy dalších prvků. Především je třeba si uvědomit, že štěpením chemických vazeb mezi atomy uhlíku a jiných prvků (např. C-H, C-OH) se uvolňuje energie využitelná, mimo jiné, též destruenty. Dekompozice odumřelých organizmů, způsobená destruenty, vede k uvolnění jednotlivých prvků (kyslík, dusík, fosfor, síra, vodík a jiné) z organických sloučenin; uvolněné prvky procházejí mineralizačními procesy a poté v mineralizované formě mohou být reutilizovány rostlinami a některými mikroorganizmy. Tímto způsobem destruenti podporují koloběh prvků. Jestliže však se v prostředí destruentů nachází málo živin, destruenti je využívají preferenčně pro výstavbu vlastní biomasy (imobilizují je) a tím zpomalují koloběh prvků a mohou vést k jeho stagnaci. KOLOBĚH DUSÍKU Hlavním zdrojem dusíku (převážně ve formě N2) je troposféra, v níž je ho obsaženo asi 78%. V hydrosféře a litosféře je tento prvek zastoupen v nepatrném množství (kolem 0,002%). Je proto pochopitelné, že na koloběhu dusíku se budou nejvíce podílet organizmy v rámci biogeochemického cyklu, kdežto podíl geochemického cyklu je téměř zanedbatelný. Dusík jako prvek obsažený v aminokyselinách, proteinech, nukleových kyselinách a řadě dalších biologicky významných látek, je pro jakýkoli živý systém nepostradatelný. Biochemický cyklus dusíku zahrnuje vyájemně vybalancované procesy fixace vzdušného (molekulárního) dusíku do organických látek i procesy denitrifikace. V aktivním koloběhu se dusík vyskytuje ve formě N2, oxidů dusíku a amoniaku. Mikroorganizmy mohou využívat dusík v anorganické i organické formě a vylučovat jako konečné produkty (zplodiny) metabolizmu dusíku amoniak a dusičnany (ionty –NO3¯ ). Mikroorganizmy, které disponují nitrogenázou (např. Rhizobium, Frankia, sinice), mohou anaerobní nebo aerobní cestou fixovat molekulární (vzdušný) dusík, konvertovat ho na amoniové ionty (-NH4+) a tyto ionty utilizovat při syntéze aminokyselin. Některé jiné mikroorganizmy mohou utilizovat amoniové ionty (resp. amoniak) jako donory protonů a elektronů při procesech autotrofní nitrifikace; při ní vznikají jako produkty nejprve dusitany (-NO2¯ , Nitrosomonas), které jsou dále oxidovány na dusičnany (ionty –NO3¯ , Nitrobacter). Jiné skupiny mikroorganizmů mohou dusičnanové ionty využívat jako akceptory elektronů (pocházejících z některých organických látek) a postupně je redukovat v procesech denitrifikace: NO3¯ → NO2¯ → NO → N2O → N2 , nebo nitrátové respirace: NO3¯ → NO2¯ → NH4+ → aminokyseliny. Nitrifikace a denitrifikace jsou dva opačně orientované soubory biochemických procesů, které nejvíce participují na koloběhu dusíku mezi atmosférou a biotickou komponentou ekosystémů. Specifickým rysem mikroorganizmů je jejich schopnost vylučovat enzymy do prostředí. Některé z těchto extracelulárních enzymů (proteázy, chitinázy, pektinázy) hydrolyzují makromolekulární organické látky (které nemohou proniknout do buňky mikroorganizmu) na látky jednodušší (které již dovnitř buněk mikroorganizmů proniknout mohou) jako jsou aminokyseliny a případně amoniové ionty; takovýto způsob produkce iontů -NH4+ se označuje jako amonizace. Amoniové ionty pak mohou být využity v mnoha dějích (např. nitrifikace, asimilace rostlinami). V některých případech vede amonizace k produkci amoniaku (např. v zásaditých půdách) a jeho uvolnění do prostředí; hovoříme o tzv. volatilizaci. Rostliny mohou přijímat dusík ve formě anorganické (nejčastěji jako NO3¯ , NH4+) i organické (např. močovina). Živočichové utilizují dusík obsažený v organických látkách; jako konečné produkty metabolizmu dusíku vylučují amoniak (resp. ionty NH4+), močovinu nebo kyselinu močovou.
234
Můžeme shrnout, že při koloběhu dusíku dochází k přeměně dusíkatých organických látek na dusíkaté anorganické látky (mineralizace), jejich částečnému zabudování do biomasy (imobilizace) a využití v intermediárním metabolizmu (oxidace nebo redukce dusíkatých látek, případně elementárního dusíku). Vzhledem k tomu, že se dusík může v ekosystémech vyskytovat a být utilizován jak ve stavu elektroneutrálním (N2, NH3, močovina), tak ve stavu kationtů (NH4+) i aniontů (NO2¯ , NO3¯ ), je jeho koloběh ovlivnitelný hodnotou pH prostředí. Koloběh dusíku je spjat s koloběhem dalších prvků, zejména uhlíku a fosforu, s nimiž je obsažen v biomakromolekulách (nukleové kyseliny, aminokyseliny, proteiny) a některých dalších biologicky aktivních látkách (např. NTP). Dusík je v některých ekosystémech (např. v terestrických fytocenózách) poměrně často zjišťován jako limitující prvek. KOLOBĚH KYSLÍKU Kyslík se ve formě elementární nebo ve formě nesmírného množství anorganických i organických sloučenin vyskytuje v atmosféře, hydrosféře i litosféře. Na jeho koloběhu se proto významně podílejí všechny tři základní cykly: biochemický, biogeochemický i geochemický. V atmosféře je obsaženo asi 21% kyslíku, což je výsledek především jeho dlouhodobé akumulace jako původně odpadního produktu organizmů s evolvujícím oxygenním typem fotosyntézy. Lze tedy téměř veškerý atmosférický kyslík považovat za kyslík biogenního původu. Za důsledek fotosyntetické aktivity organizmů je možné považovat vznik ozónové vrstvy ve stratosféře. Ochranná funkce této vrstvy působila jako abiotický selekční faktor ve prospěch rozvoje (evolvování) aerobního metabolizmu, ve kterém se jako základ životních dějů energeticky uplatňují spřažené oxidačně-redukční reakce. Vzhledem k vyrovnanému poměru mezi fotosyntézou a respirací (aerobním metabolizmem) je obsah kyslíku v atmosféře konstantní. Na této konstantnosti obsahu kyslíku v atmosféře je v globálním (celoplanetárním) měřítku závislá stabilita recentních ekosystémů. Narušení ustavené dynamické rovnováhy a proporcionality mezi jednotlivými elementy, obsaženými v atmosféře, by mohlo rezultovat v radikální změny (restrukturace) celé biosféry. Za hlavní rizikový faktor potenciálního i faktického narušení této rovnováhy lze označit znečištění či jiné zatížení atmosféry (ale i hydrosféry a litosféry) vyplývající z antropogenních činností. Proto péče o životní a přírodní prostředí je úkolem technologickým, ekonomickým, politickým, kulturním i etickým zásadního významu, týkajícím se celosvětové populace druhu Homo sapiens; životní prostředí je jedním z tzv. globálních problémů lidstva. KOLOBĚH FOSFORU Na koloběhu fosforu se podílejí všechny základní cykly koloběhu látek, avšak celkově obíhá relativně malé množství tohoto prvku (v porovnání s jinými, např. uhlíkem nebo kyslíkem). Hlavní zdroje fosforu představují různá geologická ložiska. Z biologického hlediska plní významnou funkci primárního zdroje fosforu apatit, z něhož se zvětráváním uvolňuje ve formě anorganických sloučenin, především fosforečnanů. Nerozpustné sloučeniny fosforu (např. fosforečnan hlinitý v kyselých půdách nebo fosforečnan vápenatý v zásaditých půdách) mohou být převáděny do rozpustné formy účinkem některých mikroorganizů a rostlin, které do svého okolí vylučují vhodné látky (organické kyseliny, oxid uhličitý a jiné). Fosfor je přijímán rostlinami a mikroorganizmy v podobě fosforečnanových iontů z roztoku. Jimi je částečně zabudováván do molekul syntetizovaných organických látek (např. NTP, fosfolipidy), částečně je imobilizován jako součást jejich těl (např. struktury, mineralizované fosforečnany). Živočichové přijímají fosfor jako součást potravy. Organické sloučeniny obsahující fosfor jsou mineralizovány dekompozitními mikroorganizmy; kromě toho se při dekompozici uhynulých organizmů část fosforu vrací do koloběhu a část do sedimentů.
235
Fosfor je pro organizmy nezastupitelným biogenním prvkem (součást biomembrán, nukleových kyselin, makroergních sloučenin atd.), primárně pocházejícím z neobnovitelných zdrojů.
KOLOBĚH SÍRY V litosféře se síra vyskytuje především ve formě síranů a sirníků (pyrit, sádrovec, různé typy sedimentů), v hydrosféře většinou ve formě síranů a podobně i v atmosféře, kde se nachází též ve formě oxidů síry. V rámci biogeochemického cyklu je síra mikroorganizmy uvolňována z organické hmoty sedimentů jako sirovodík do vodního prostředí a do atmosféry. Baktérie s anoxygenní fotosyntézou využívají sirovodík jako donor vodíku pro redukci oxidu uhličitého a přitom ho oxidují (tzv. fotosyntetická oxidace), většinou na elementární síru (Chromatiaceae, Chlorobiaceae). Skupiny mikroorganizmů, které mohou sirovodík oxidovat na elementární síru, se tak podílejí na tvorbě nalezišť síry biogenního původu. Síra může být následně různými cestami a přes rozličné meziprodukty oxidována až na sírany. Za anaerobních podmínek takové oxidační procesy mohou probíhat jen tehdy, je-li k dispozici místo kyslíku jiný vhodný akceptor elektronů; bývá jím některý dusičnan (resp. anionty NO3¯ ) a proto je v těchto případech oxidace redukovaných forem síry (anaerobní respirací) spřažena s denitrifikací (např. u rodu Thiobacillus). Síranové a siřičitanové anionty se z atmosféry dostávají společně se srážkami zpět do vody a do půdy, kde jsou přijímány a utilizovány autotrofními organizmy, resp. se dostávají opět do sedimentů. Síranové a siřičitanové anionty, přijaté autotrofy, mohou být aerobními nebo anaerobními asimilačními procesy redukovány a využity k syntéze sirných aminokyselin (metionin, cystein, selenocystein). Prostřednictvím potravních řetězců se síra dostává do vyšších trofických úrovní. Mineralizace organické hmoty (tedy přeměna oganických sirných sloučenin na anorganické) je realizována příslušnými mikroorganizmy, disponujícími sulfatázami. Mikroorganizmy též imobilizují sloučeniny síry asimilací aniontů –SO42¯ . Za anaerobních podmínek mohou být sírany konvertovány v procesech disimilativní redukce na S2¯ , při kterých plní funkci akceptorů elektronůesulfovibrio, Desulfomaculum). Podobně může být elementární síra redukována v respiračních procesech (Desulfuromonas). KOLOBĚH VODY V hydrologickém cyklu se rozlišuje tzv. velký (neboli otevřený) a malý (neboli uzavřený) koloběh vody. Koloběh vody jako celek ovlivňuje klimatické procesy a cirkulaci živin v ekosystémech. Ve velkém koloběhu vody se voda odpařuje z hladiny oceánů a jako vodní pára je prouděním vzduchu zanášena nad pevninu, na jejíž povrch spadá ve formě deště nebo sněhu. Část vody, spadlé na zemský povrch, se odpaří zpět do atmosféry, část jí stéká po povrchu a část se vsakuje do povrchových a spodních vod, jejichž prostřednictvím se nakonec znovu dostane do oceánů. Na malém oběhu vody se podílí zejména rostlinstvo tím, že zadržuje část vodních srážek. Určitý podíl z této zadržené vody se uplatní jako fyziologické prostředí pro uskutečnění biochemických reakcí rostlin a určitý podíl se uvolní do prostředí (ovzduší, půda). Zadržená voda se přes potravní řetězce dostává do těl heterotrofů, v nichž rovněž z části plní funkci základního prostředí pro průběh biochemických reakcí a z části se uvolní do prostředí (respirací, transpirací, exkrementy). Snad i z výše uvedených stručných poznámek lze vyvodit, že jednotlivé životní děje jsou vzájemně propojeny nejen v rámci buňky, tkáně, orgánu nebo organizmu, ale též na úrovních vyšších, tj. na úrovni populace, biocenózy, ekosystému i celé biosféry. A nejen biosféry. Život jako jev sui generis nelze oddělit od procesů geologického vývoje Země a v nejobecnější rovině od vývoje vesmíru jako určitého celku. Podle některých hypotéz je možné na vznik života, jeho vývoj (evoluci) i zánik nazírat jako na zákonitost vývoje (evoluce) vesmíru. 236
XX. BIOLOGICKÁ EVOLUCE Biologická evoluce je jedním ze svébytných druhů evoluce hmoty (vesmíru). Je charakteristická kumulací relativně stálých dědičných změn genofondu (primárně mutací a na ně navazujících rekombinací), které jsou reprodukovány (přenášeny z generace na generaci prostřednictvím různých forem rozmnožování organizmů), pozitivně selektovány přírodním výběrem a projevují se v populacích postupně se měnícími znaky (vlastnostmi). Takové změny genofondu mohou být časoprostorově unikátní (irrekurentní) i opakovatelné (rekurrentní), vratné (reverzibilní) i nevratné (irreverzibilní). Biologické systémy jsou hierarchicky uspořádané. V souladu s tím se obvykle při studiu evoluce vymezují tři základní úrovně: mikroevoluce, speciace a makroevoluce. Mikroevoluce zahrnuje geneticky determinované a transmisibilní změny v rámci populací jednotlivých biologických druhů. Speciace představuje souhrn geneticky determinovaných změn, které směřují k divergenci jednotlivých vývojových linií, rezultující ve vznik nového druhu. Pod pojmem makroevoluce se obvykle rozumí vznik monofyletických vývojových linií zahrnujících více druhů, tedy taxonů vyšších než druh, spojený zpravidla s rozsáhlými změnami biodiverzity (proměny stávajících a formování nových biot). Každá z uvedených úrovní evoluce projevuje určitou autonomii ve vztahu k ostatním úrovním zejména pokud se týká vlastních mechanizmů evoluce. To umožňuje studovat evoluční proces specifickými prostředky a metodami na úrovni molekulární, buněčné, organizmální, populační i biocenotické, přičemž zpravidla výsledky, získané na nižších úrovních, jsou konkrétnější, jednoznačnější, méně hypotetické a méně sporné. Základním předpokladem biologické evoluce je genetická variabilita (diverzita) uvnitř populací i mezi nimi, jejímž zdrojem je pozitivně selektovaná mutace jako primární událost, mající za následek rozrůznění (diferenciaci) genotypů a fungující u sexuálně se reprodukujících organizmů jako podklad pro další rozšíření variability rekombinačním procesem. Každý genotyp (resp. fenotyp) existuje v určitém prostředí. Prostředí může působit selekčním tlakem buď ve prospěch daného genotypu, tzn. že ho zvýhodňuje oproti ostatním genotypům, nebo v jeho neprospěch, tzn. že ho znevýhodňuje oproti ostatním (resp. alespoň některým jiným) genotypům. Selekční tlak lze vyjádřit selekčním koeficientem, který může nabývat relativních hodnot v uzavřeném intervalu <0; 1>. Jestliže nabyde krajní hodnotu 1, je příslušný genotyp eliminován; jestliže nabyde krajní hodnoty 0, potom to znamená, že prostředí nepůsobí žádným selekčním tlakem, neboli působí neutrálně. Je třeba zdůraznit, že hodnocení selekčního tlaku prostředí jako pozitivní, neutrální nebo negativní je relativní a vždy vyjadřuje vztah mezi určitým typem prostředí a určitým genotypem; tedy se změnou prostředí (resp. některých jeho složek) se může změnit i jeho účinek. Například mutace pro rezistenci vůči streptomycinu neznamená pro baktérii rostoucí v prostředí bez tohoto antibiotika žádnou výhodu ve srovnání s baktériemi, které takovou mutaci nenesou, prostředí vůči ní nepůsobí žádným selekčním tlakem (selekční koeficient s = 0; neutrální selekce). Jestliže se však do prostředí, ve kterém baktérie rostou, dostane streptomycin, projeví se mutace pro rezistenci vůči tomuto antibiotiku jako výhodná, neboť přežijí pouze ty baktérie, které tuto mutaci nesou (pozitivní selekce), ostatní zahynou. Z uvedeného vyplývá, že ve vztahu mezi organizmem (resp. jeho genotypem) a prostředím je primární, určující struktura genotypu, nikoli prostředí. Představy o určující roli prostředí v adaptivních evolučních procesech nebyly nikdy potvrzeny (i když dosud přetrvávají); spontánní mutace sice mohou vznikat jako náhodné jevy v důsledku působení nekontrolovatelných faktorů prostředí na genetický aparát, avšak nikoli ve smyslu navození takových změn, které by představovaly přímou adaptaci organizmu na tyto faktory prostředí. Obecným kritériem úspěšnosti genotypu je reprodukční zdatnost (fitness) jeho nositele, 237
vyjádřená prostřednictvím adaptivní hodnoty (w), která je definována jako součin relativní vitality (v; v ∈<0;1> ) a relativní fertility (f; f ∈<0;1>): w = v · f . Zároveň mezi adaptivní hodnotou a selekčním koeficientem platí vztah: w = 1 – s . Selekční účinek prostředí je podkladem pro přírodní výběr (selekci) jako základní mechanizmus evoluce, v jehož důsledku se reprodukují pouze genotypy dostatečně geneticky adaptované na dané prostředí. Přírodní výběr je v podstatě selekcí na maximální reprodukční zdatnost. Proto evolučně úspěšné mohou být pouze ty taxony (druhy), jejichž populace jsou dostatečně geneticky variabilní. Tuto skutečnost vyjadřuje tzv. Fisherův fundamentální teorém přírodní selekce: čím větší je genetická variabilita, na niž může působit selekce směrem k vyšší fitness, tím větší je pokrok ve fitness. Fisher zároveň matematicky zdůvodnil a dokázal, že rychlost pokroku ve fitness v kterékoli fázi procesu přírodní selekce je rovna genetické varianci v dané fázi. Bezprostředním objektem působení přírodního výběru je fenotyp, který je však vnějším projevem (odrazem) genotypu. Protože selektované genotypy se mohou evolučně uplatnit pouze tehdy, jestliže se reprodukují, je zřejmé, že základním médiem, ve kterém lze sledovat evoluční změny (evoluční proces), je populace (alespoň pokud jde o mikroevoluci a speciaci). Evoluční proces odráží mnohé aspekty konkrétních populací zkoumaných druhů (např. velikost populace v genetickém smyslu, generační doba, poměr natality a mortality, početnost potomků, způsob reprodukce – populace nepohlavně se rozmnožujících organizmů, populace panmiktická, populace autogamní, populace s asortativním pářením, populace založené na pravidelných systémech inbrídinku atd.). V evoluci, stejně jako v kterýchkoli jiných biologických procesech, není obsažen žádný účel, cíl, ani smysl. Evoluci je možné považovat za náhodný proces, uskutečňující se na základě objekt - objektových interakcí (vztahů). V evoluci lze pouze vysledovat určité vývojové tendence, odvíjející se po pomyslné vývojové spirále převážně ve směru progresivním (tj. od jednoduššího ke složitějšímu, od nižšího stupně uspořádanosti k vyššímu stupni uspořádanosti živých systémů), avšak v menší (spíše epizodické) míře též směrem opačným, regresivním. Celkový „historický“ vývoj organizmů od společného předka (progenota) se označuje jako fylogeneze. Při objasňování fylogenetických vztahů a konstruování fylogenetického stromu se využívá celého souboru relevantních poznatků, aspektů a přístupů: anageneze (evoluce různých změn – etologických, ekologických, molekulárních, funkčních, strukturních aj.), stazigeneze (tj. poznatků o relativní konstantnosti hlavních znaků organizmů), kladogeneze (štěpení vývojových linií, vznik nových a extinkce již evolvovaných samostatných vývojových linií) a syngeneze (konvergence existujících samostatných vývojových linií v nový celek). Na základě dosaženého stupně vědeckého poznání lze pojímat vznik života jako výsledek zákonitého, spontánního procesu, navazujícího na předchozí evoluční vývoj na Zemi (především na chemickou evoluci) a dospívajícího k nové kvalitě ve vývoji hmoty. Předpokládá se, že vznik života byl vázán na existenci makromolekul, schopných autoreprodukce a enzymové katalýzy. Obě tyto vlastnosti jsou známy u ribonukleových kyselin (RNA) a proto se právě RNA považují za makromolekuly, na jejichž základě se pravděpodobně mohl konstituovat život. RNA dnešních RNA-virů je schopna replikace. Podobně je možná replikace RNA in vitro podle polyribonukleotidového řetězce jako matrice (v určitém omezeném rozsahu i bez příslušných enzymů). Katalytická aktivita RNA se uplatňuje při expresi genetické informace (např. některé molekuly RNA katalyzují sestřih pre-mRNA nebo pre-rRNA či vznik peptidové vazby v průběhu proteosyntézy na ribozómech). Podle RNA se může syntetizovat i DNA (např. reverzní transkripcí u retrovirů a retrotranspozónů). Jestliže tedy existují velmi těsné vazby mezi RNA, DNA a proteiny (replikace, transkripce, translace) u recentních organizmů, nelze je vyloučit ani ve fázi chemické evoluce předcházející vznik života a v časných etapách jeho vývoje. Pro vznik i nejprimitivnějšího živého systému musela mít zásadní význam existence „biomembrány“. V neživých (uzavřených) systémech se za vhodných podmínek mohou tvořit 238
membranózní útvary typu lipidové dvojvrstvy. Lze zřejmě připustit existenci podobných membrán ještě před vznikem života a jejich další (dosud neuspokojivě objasněný) vývoj směrem k semipermeabilním biomembránám, jejichž základ tvoří fosfolipidová dvojvrstva. Koevoluce nukleových kyselin, bílkovin a membránových struktur na bázi lipidů (resp. fosfolipidů) patrně dospěla v určité fázi chemické evoluce k bodu, ve kterém tyto komponenty mohly integrovat v jeden nový, uspořádaný celek, oddělený od okolního prostředí (fosfo)lipidovou (semipermeabilní) membránou a uvnitř uzavírající RNA (případně DNA). Nejspíše od okamžiku vzniku takového útvaru mohla být započata vlastní biologická evoluce. Načrtnutý hypotetický scénář podporuje existence recentních nebuněčných organizmů (viry, viroidy, virusoidy a v jistém ohledu též priony) a nekompartmentalizovaných prokaryotních buněk (baktérie). Pravděpodobně teprve později docházelo k vnitřnímu členění, tj. k formování intracelulárních, vzájemně propojených strukturně-funkčních komparmentů, které nakonec dospělo k vytvoření eukaryotní buňky. Po vzniku buněk, schopných samostatné existence, tedy jednobuněčných organizmů, pokračovala biologická evoluce směrem k vícebuněčným a mnohobuněčným, strukturně a funkčně diferencovaným organizmům. Takovéto obecné schéma evoluce živých systémů je ve shodě s jejich navzájem velmi podobným chemickým složením i shodným nebo velmi podobným průběhem základních životních dějů (replikace DNA, transkripce, translace, proteosyntéza, genetický kód apod.). Při aplikaci principu materiální jednoty světa na biologickou evoluci je proto možné připustit hypotézu, že všechny organizmy na Zemi mají společný původ, neboli jsou odvoditelné od společného předka (progenota), od kterého postupně divergovaly jednotlivé, dnes známé domény (eubaktérie, archebaktérie, eukaryota). K nejrozsáhlejší divergenci, k jakémusi mohutnému rozevření pomyslných evolučních nůžek, došlo patrně ve velmi časných stadiích vývoje života. Pro tuto domněnku svědčí skutečnost, že určité skupiny jednobuněčných organizmů jsou od sebe značně evolučně vzdáleny (např. některá eukaryota neobsahují mitochondrie, jiné obsahují chloroplasty nepříbuzné chloroplastům recentních rostlin). S tím pravděpodobně souvisí schopnost využívat různých zdrojů energie, vznik hlavních typů metabolizmu a různých způsobů výživy (metabolizmus anaerobní – metabolizmus aerobní, fototrofie – chemotrofie, autotrofie – heterotrofie apod.). Evoluce živých systémů však není sledem lineárně řazených vývojových změn. Vedle divergence určitých skupin organizmů se uplatňovaly též procesy konvergentní, jejichž předpokladem byla a je všeobecná vzájemná příbuznost organizmů. Propojením různorodých (leckdy i protichůdně působících) evolučních mechanizmů se etablovala složitá síť interakcí jak mezi organizmy navzájem, tak mezi nimi a vnějším prostředím, která je patrná zejména uvnitř jednotlivých ekosystémů i mezi nimi v rámci biosféry jako globálního ekosystému. Přestože evoluční teorie je dosud značně neúplná a souběžně s novými poznatky nejen biologických věd se permanentně vyvíjí (a tedy doznává větších či menších proměn), ve svém celku představuje nejucelenější a nejadekvátnější teorii vzniku a vývoje živých systémů na Zemi, vycházející striktně z vědeckého poznání. Teorie biologické evoluce umožňuje explikovat vznik a vývoj života (v jeho různých formách) jako speciální případ vývoje (autoorganizace) hmoty v rámci obecné teorie evoluce. Podrobně bude problematika evoluce probírána v dalších kurzech (evoluční biologie, vznik a evoluce vesmíru, historický vývoj organizmů).
239
ZÁKLADNÍ DOPORUČENÁ LITERATURA Alberts, B. a kol.: Základy buněčné biologie. Espero Publishing, Ústí nad Labem, 1988 Nečas, O. A kol.: Obecná biologie. H+H Jinočany 2000 Mader, S. S.: Biology. Wm. C. Brown Publishers, 1990. Rajchard, J., Kindlmann, P., Balounová, Z.: Ekologie. KOPP, České Budějovice 2002 Rosypal, S. a kol.: Nový přehled biologie. Scientia, Praha 2003
INTERNETOVÉ MATERIÁLY
http://io.uwinnipeg.ca/~simmons/ www.zdravcentra.cz/cps/rde/xchg/zc/xsl/3141_1387.html www.nlk.cz/nlkcz/infozdroj/detail.php?odvetvi_id2=11&odvetvi2=BIO ... botanika.bf.jcu.cz/suspa/ekologie/index.html
www.vfu.cz/2900/ustavy/2110/vybrkapitbf.htm
240
OBSAH Úvodní poznámka – 2 I. I.1. I.2. I.3. I.4. I.5. I.6.
I.7. I.8. I.9. I.10.
I.11.
II. II.1.
II.2.
OBECNÉ VLASTNOSTI BIOLOGICKÝCH SYSTÉMŮ - 3 Biologický systém jako otevřený systém - 3 Biologický systém jako hmotný systém – 5 Biologický systém jako energetický systém – 6 Biologický systém jako informační systém – 6 Princip hierarchie v živých systémech – 7 Autoreprodukce – 7 Nepohlavní rozmnožování Pohlavní rozmnožování Autoregulace – 9 Metabolizmus – 11 Růst – 16 Pohyb – 17 Améboidní pohyb Pohyb kinocilií (bičíků a řasinek) Pohyb příčně pruhovaného svalstva Vývoj – 22 Diferenciace buněk Stárnutíé buněk Apoptóza Nekróza Fylogeneze a klasifikace organizmů OBECNÁ BIOLOGIE BUŇKY – 33 Chemické složení buňky – prvky a anorganické látky - 33 Prvky a anorganické látky kromě vody Voda Organické látky – 35 Mastné kyseliny Lipidy Izoprenoidy Terpeny Sacharidy Aminokyseliny Peptidy Bílkoviny (Proteiny) Dusíkaté báze, nukleozidy a nukleotidy
241
III. III.1.
III.2.
INFORMAČNÍ BIOMAKROMOLEKULY – 70 Klasifikace a funkce bílkovin – 70 Enzymy a koenzymy Rozpoznávací funkce bílkovin Mechanochemické funkce bílkovin Obranné funkce bílkovin Nukleové kyseliny – 80 Kyselina deoxyribonukleová – DNA Kyseliny ribonukleové
IV. IV.1. IV.2. IV.3. IV.4. IV.5.
BUNĚČNÉ MEMBRÁNY A MEMBRÁNOVÉ STRUKTURY - 91 Cytoplazmatická membrána – 94 Endoplazmatické retikulum – 95 Golgiho aparát (komplex) – 98 Peroxizomy – 99 Lyzozomy - 99
V. V.1. V.2. V.3.
CYTOSKELET – 101 Mikrotubuly - 101 Mikrofilamenta – 102 Intermediární filamenta - 102
VI. VI.1. VI.2. VI.3. VI.4. VI.5.
BUNĚČNÝ TRANSPORT – 104 Volná difuze – 105 Iontové kanály a usnadněná difuze – 105 Přenašečový transport – 107 Translokace skupin – 110 Přeprava membrán – 110
VII. VII.1. VII.2. VII.3.
BUNĚČNÉ RECEPTORY – 114 Membránové receptory – 114 Intracelulární receptory – 116 Receptory pro antigeny – 117
VIII. VIII.1. VIII.2. VIII.3. VIII.4. VIII.5.
INTERCELULÁRNÍ SPOJE – 121 Těsnícíc spoje – 121 Vodivé spoje – 121 Adhezní spoje – 121 Dezmozomy – 122 Plazmodezmy – 122
242
IX.
MITOCHONDRIE - 124
X. X.1. X.2. X.3. X.4.
CHLOROPLASTY, FOTOSYNTÉZA A FOTORESPIRACE – 133 Plastidy - 133 Fotosyntéza – 134 Fotorespirace – 145 Fotosyntéza a respirace – 146
XI.
BUNĚČNÁ STĚNA - 147
XII.
VAKUOLY - 149
XIII.
EXTRACELULÁRNÍ TEKUTINA (MATRIX) - 151
XIV. BUNĚČNÉ JÁDRO A JADÉRKO – 153 XIV.1. Buněčné jádro (nucleus) – 153 XIV.2. Buněčné jadérko (nucleolus) – 155 XV.
DRÁŽDIVOST A NERVOVÁ SIGNALIZACE - 156
XVI. BUNĚČNÝ CYKLUS – 159 XVI.1. Interfáze - 159 XVI.2. Mitóza – 160 XVI.3. Regulace buněčného cyklu – 164 XVI.4. Meióza – 166 XVI.5. Amitóza – 170 XVII. BUNĚČNÉ DĚLENÍ A PŘENOS GENETICKÉ INFORMACE - 171 XVII.1. Princip segregace a kombinace – 171 XVII.2. Rekombinace a vazba genů – 176 XVIII. GENETICKÁ INFORMACE – 182 XVIII.1. Genetická informace a genetický kód – 182 XVIII.2. Koncepce genu – 184 XVIII.3. Replikace DNA – 186 Replikace prokaryotického chromozomu Replikace chromozomové DNA eukaryot XVIII.4. Transkripce – 190 Transkripce v prokaryotické buňce Transkripce v eukaryotické buňce Transkripce mitochondriální a chloroplastové DNA Posttranskripční úpravy 243
XVIII.5. Translace – 197 Translace v prokaryotické buňkce Translace v eukaryotické buňce Translace v mitochondriích a chloroplastech Kotranslační a posttranslační úpravy XVIII.6. Regulace genové exprese – 205 XVIII.7. Mutační proces (mutageneze) – 207 Genové mutace Chromozomální aberace Genomové mutace Mutageny XVIII.8. Transpozice – 216 XVIII.9. Reparace mutačních změn – 216 XIX. ORGANIZMY A PROSTŘEDÍ – 218 XIX.1. Biomy, fyto- a zoogeografické oblasti – 218 XIX.2. Ekologické faktory – 220 XIX.3. Biologie populací a společenstev – 225 Klasifikace populací Intraspecifické vztahy Interspecifické vztahy Klasifikace společenstev (biocenóz) Ekosystémy XX.
BIOLOGICKÁ EVOLUCE – 237 ZÁKLADNÍ DOPORUČENÁ LITERATURA – 240 INTERNETOVÉ MATERIÁLY - 240
244
