ÚSTAV ANALYTICKÉ CHEMIE

ÚSTAV ANALYTICKÉ CHEMIE

Ramanova a infračervená spektrometrie vzorků v pevné fázi pracovní text pro Podzemní výukové středisko JOSEF

Pavel Matějka a Marcela Dendisová

2010

-1-

ÚVOD Ramanova spektrometrie – princip Ramanova spektrometrie je jednou z metod vibrační molekulové spektroskopie, která byla pojmenována po indickém fyzikovi Čandrašékharu Venkatau Ramanovi (Nobelova cena 1930). Profesor Raman společně s K. S. Krišnanem popsali v roce 1928 jev neelastického optického rozptylu, který je základem metody. Jedná se o metodu vhodnou pro identifikaci látek, při určování jejich složení a struktury. Používá se při analýze pevných látek (krystalické i amorfní materiály, kovy, polovodiče, polymery atp.), kapalin (čisté látky, roztoky vodné i nevodné), dále též při analýze povrchů (např. sorbenty, elektrody, senzory) či při analýze biologických systémů (od biomolekul až po organismy) a v omezené míře i při analýze plynů. Své uplatnění Ramanova spektroskopie nachází od mineralogie a geochemie, přes chemický a farmaceutický průmysl až po biologii a lékařství. Podstatou Ramanova rozptylu je zářivý proces, který celkově probíhá mezi dvěma stacionárními vibračními stavy molekuly, jejichž energie jsou E1 a E2, vyvolaný interakcí s fotonem dopadajícího záření o frekvenci ν0 > | E2 - E1 | / h, kde h je Planckova konstanta, a provázený rozptýleným („vyzářeným―) fotonem záření o frekvenci νR (viz Obr. 1), při čemž směrová orientace rozptýleného záření je odlišná od záření dopadajícího. Tento rozptylový efekt si lze zjednodušeně představit jako současnou absorpci fotonu budícího záření molekulou, kdy molekula přechází na virtuální energetickou hladinu, a emisi sekundárního fotonu, za splnění podmínky zachování energie: h νR = h ν0 ± (E2 - E1)

(1)

Existuje několik možností takto uskutečněného přechodu podle polohy virtuální energetické hladiny vůči vlastním stavům molekuly (např. normální a resonanční Ramanův jev). Ramanův jev je možno popsat korektně pomocí kvantové teorie, jeho základy je však možno vystihnout i v klasickém přiblížení. V klasickém přiblížení platí pro molekulu interagující se zářením, že v molekule je indukován dipólový moment p :

p   E cos 2 π ν 0 t  

1  q E  cos 2 π ν 0  ν vib  t   cos 2 π ν 0  ν vib  t  2 q

(2)

kde ν0 je frekvence budícího záření, νvib je vibrační frekvence, E je vektor intenzity elektrického pole dopadajícího záření, q jsou vnitřní souřadnice molekuly a α je polarizovatelnost molekuly (polarizibilita, tj. míra „obtížnosti―, s níž se vychylují negativní náboje elektrickým polem). Z rovnice (2) vyplývá, že molekula emituje záření jednak s nezměněnou frekvencí (ν0 - Rayleighův rozptyl ) a dále pak záření s odlišnými frekvencemi (ν0 + νvib ) a (ν0 - νvib ), které se souhrnně nazývají Ramanův

-2-

rozptyl, při čemž nižší frekvence (ν0 - νvib) odpovídá Stokesovu rozptylu, zatímco vyšší frekvence (ν0 + νvib) náleží anti-Stokesovu rozptylu. Z rovnice je též zřejmé, že pro vznik Ramanovy linie je nutné, aby při daném vibračním pohybu docházelo ke změně polarizovatelnosti, tedy aby

 0 q

(3)

Pokud by změna polarizovatelnosti během vibračního pohybu byla nulová, zůstal by v rovnici (2) nenulový pouze člen pro Rayleighův rozptyl. Rovnice (3) se označuje za základní výběrové pravidlo pro Ramanovu spektrometrii, které je principielně odlišné od pozorování vibračního modu v infračervené spektrometrii, kde touto základní podmínkou je změna dipólového momentu během příslušného vibračního pohybu. Pokud je daný vibrační mód aktivní v Ramanově spektru, bude pro něj obecně možné pozorovat dvě spektrální linie, a to symetricky rozložené kolem linie Rayleighova rozptylu – ve Stokesově oblasti (νR = ν0 - νvib) a v anti-Stokesově oblasti (νR = ν0 +νvib). V řadě praktických případů jsou však měřena spektra pouze v oblasti Stokesova rozptylu, a to s ohledem na nutnost odfiltrovat Rayleighův rozptyl, jehož intenzita je zhruba 105-1012-krát vyšší než intenzita běžných Ramanových linií.

Obr. 1 Schéma přechodů odpovídajících rozptylovému ději Ramanův a Rayleighův rozptyl při excitaci ve viditelné a blízké infračervené oblasti ↑ - značí excitaci, ↓ - značí emisi fotonu

Infračervená spektrometrie – princip Infračervená spektrometrie je spektrální metoda založená na schopnosti látky pohlcovat záření o vlnových délkách () 800 nm až cca 1mm. Jedná se o absorpci elektromagnetického vlnění, jež označujeme jako záření infračervené (IČ), a které je vymezeno hodnotami vlnočtů

-3-

( ~ = 1/) 12 500 - 10 cm-1. Dále, podle vžité konvence, je ještě dělíme na záření oblasti blízké, střední a daleké IČ s mezemi: 1000

25

2,5

0,8

λ , µm daleká střední blízká ——————————————————————————————— -1 ν~~ , cm

10 mikrovlnná

400

4000

infračervená

12500 viditelná

Měli bychom si zapamatovat především vymezení střední infračervené oblasti (4000 400 cm-1), která má největší význam pro identifikaci a určování chemické struktury látek. Při absorpci infračerveného záření molekulami měřené látky dochází ke zvýšení jejich vibrační (v plynné fázi také rotační) energie. Infračervená absorpční spektra tak poskytují informace o vibračních frekvencích (pohybech) molekuly, které jsou pro ni charakteristické, a proto lze spekter využít při zmíněné identifikaci látek a určování jejich struktury. Vibrační pohyb je v nejjednodušším případě pohyb dvouatomové molekuly AB, jež je možné přibližně popsat modelem harmonického oscilátoru (viz např. W.J.Moore: Fyzikální chemie, str. 574. SNTL, Praha 1979). Předpokládá se přitom, že oba atomy molekuly na sebe působí ve směru vazby silou, která je přímo úměrná odchylce délky vazby od rovnovážné hodnoty. Konstanta této úměrnosti K se nazývá silová konstanta. V klasické mechanice se ukazuje, že taková soustava vykonává vibrační pohyb, při kterém se délka vazby periodicky mění s jedinou frekvencí ν , určenou vztahem:

  1 / 2   

K /  

(4)

kde tzv. redukovaná hmotnost µ je určena hmotností obou atomů mA a mB podle vztahu 1/µ = 1/mA + 1/mB . Podle kvantové mechaniky mají stacionární stavy harmonického oscilátoru s vibračním kvantovým číslem υ energie E(υ) určené vztahem:

E   h   1 / 2

(5)

kde υ = 0, 1, 2, ... Za normální teploty je většina molekul v základním (vibračním) stavu, tj. υ = 0. Při absorpci elektromagnetického záření molekuly přecházejí do hladin s vyššími vibračními kvantovými čísly. U harmonického oscilátoru jsou dovolené pouze ty přechody, při kterých dochází ke změnám vibračního kvantového čísla o jednotku. Tak je tomu u fundamentálního přechodu 1 ← 0 (nejdříve podle konvence píšeme horní hladinu, pak hladinu dolní, šipka vyznačuje absorpci záření). Frekvence záření, které je pohlceno při tomto přechodu, musí splňovat Planckovu podmínku, a je proto rovna frekvenci vibrace -4-

harmonického oscilátoru ν. Ve spektru se tento přechod objeví při vlnočtu ~   / c . Harmonický oscilátor bude absorbovat záření o stejné frekvenci i při tzv. horkých přechodech (υ + 1 ← υ, kde υ ≥ 1), které vycházejí z tepelně excitovaných vibračních hladin. Rovnovážný počet molekul na těchto hladinách vyplývá z Boltzmannova zákona. Pro počet molekul N1 a N0 ve stavech s kvantovým číslem υ = 1 a υ = 0 platí:

N1 / N 0  exp  E / kT 

(6)

kde ΔE je rozdíl energií obou hladin. Např. pro molekulu absorbující při fundamentálním přechodu záření o vlnočtu 1000 cm-1 je při 20°C N1/N0 = 0,01, tzn. necelé jedno procento všech molekul je v excitovaném stavu o υ = 1. Je tedy zřejmé, že za běžných podmínek budou nejčetnější přechody 1 ← 0, takže jen mizivá část molekul se bude podílet na vzniku horkých přechodů. Obsazení vyšších vibračních hladin roste jednak s klesajícím vlnočtem (při 200 cm-1 a teplotě 20°C obsadí již téměř 40% molekul hladinu o υ = 1), jednak s rostoucí teplotou (horké přechody se projeví ve spektrech tavenin). Model harmonického oscilátoru je pouze hrubým přiblížením pro pohyb reálné dvouatomové molekuly, která se ve skutečnosti chová jako anharmonický oscilátor. Energetické hladiny anharmonického oscilátoru jsou přibližně určeny vztahem: 2 E   / hc  ~  1 / 2  xe   1 / 2

(7)

kde xe je tzv. konstanta anharmonicity, jejíž hodnota pro jednoduché vazby leží obvykle v mezích 0,01 až 0,05. Tento model vystihuje skutečnost, že diference mezi sousedními energetickými hladinami nejsou konstantní, ale s rostoucím vibračním kvantovým číslem se zmenšují. U anharmonického oscilátoru jsou proto horké přechody posunuty proti přechodům fundamentálním směrem k nižším energiím (nižším vlnočtům). V důsledku anharmonicity se ve spektru projevují také tzv. svrchní tóny („overtony“), odpovídající přechodům, při kterých se kvantové vibrační číslo mění o více než 1. Jejich vlnočet je blízký, avšak vždy menší než celistvý násobek vlnočtu fundamentálního. Obr. 2 naznačuje všechny přechody až do stavu υ = 3, které budeme u anharmonického oscilátoru pozorovat, a též idealizované absorpční spektrum. Absorpce elektromagnetického záření je důsledkem jeho interakce s oscilujícím dipólem. Intenzita, s jakou se ve spektru projeví vibrace dvouatomové molekuly, proto závisí na změně dipólového momentu molekuly při prodloužení, resp. zkrácení délky vazby. Závisí tedy na velikosti derivace dµ / dr (µ je dipólový moment vazby, r je délka vazby). Tato derivace je nenulová např. u molekuly chlorovodíku (v důsledku asymetrie molekuly), a proto bude HCl absorbovat IČ-záření. Naproti tomu molekula kyslíku v důsledku symetrie dipólový moment nemá, ani ho nezíská při změně délky vazby, a IČ-záření proto neabsorbuje.

-5-

Obr. 2 Znázornění vibračních přechodů a čárové schéma vibračního spektra dvouatomové molekuly (~ = 1000 cm-1, xe = 0,02)

Na N atomovou molekulu lze v prvním přiblížení pohlížet jako na soubor více nezávislých anharmonických oscilátorů, z nichž každý kmitá s odlišnou frekvencí (pokud nejde o vibrace označované jako degenerované). Počet těchto tzv. normálních vibrací je stejný jako počet vibračních stupňů volnosti dané molekuly, tedy 3N-6 (pro lineární molekulu 3N-5). Při každé z 3N-6 normálních vibrací se v obecném smyslu mění periodicky souřadnice všech atomů molekuly. Souřadnice, která popisuje pohyb molekuly při normální vibraci, se nazývá normální souřadnice a je lineární kombinací souřadnic všech atomů molekuly. Míra absorpce infračerveného záření je podobně jako u dvouatomové molekuly určena derivací dipólového momentu molekuly podle normální souřadnice. U symetrických molekul se proto může stát, že některá vibrace není v IČ-spektru aktivní, tj. neprojeví se ve spektru odpovídajícím absorpčním pásem. Maximální počet fundamentálních přechodů, které se mohou ve spektru projevit pro N atomovou molekulu, je 3N-6. Protože chování reálných molekul je složitější než popisuje model harmonických oscilátorů, mohou se ve spektru objevit podobně jako u dvouatomové molekuly horké přechody a svrchní tóny. Navíc se může současně změnit vibrační kvantové číslo několika z 3N-6 normálních vibrací. Takové přechody se nazývají přechody kombinační a jim odpovídající vlnočet je přibližně roven součtu vlnočtů přechodů jednotlivých normálních vibrací, které jsou při něm excitovány. Amplitudy výchylek jednotlivých atomů molekuly jsou pro jednotlivé normální vibrace různé, často můžeme vibrační pohyb molekuly při normální vibraci lokalizovat na určitou funkční skupinu nebo vazbu. Takové vibrace skupiny nebo vazby jsou pak ovlivňovány pouze v malé míře ostatními atomy v molekule. Proto se poloha absorpčních pásů a jejich intenzita, kterými se funkční skupina (resp. vazba, část skeletu molekuly) projeví v infračerveném spektru, příliš neliší podle toho, je-li tato funkční skupina vázána v různých molekulách. Tato skutečnost umožnila na základě empirických zkušeností sestavit tabulky vlnočtů (frekvencí) charakteristických vibrací důležitých skupin a vazeb. Tyto tabulky se používají pro identifikační účely, především u organických látek. Podle toho, která souřadnice -6-

se nejvíce uplatňuje v normálních vibracích, rozeznáváme jejich různé typy. Mění-li se během vibračního pohybu především délka vazby, hovoříme o vibraci valenční, při změně úhlů se jedná o vibraci deformační, kmitá-li některý atom mimo rovinu ostatních atomů, jedná se o vibraci mimorovinnou.

Interpretace Ramanových a IČ spekter, knihovny spekter Chemik se často spokojuje s kvalitativní analýzou spektra a hledá odpověď na otázku, které funkční skupiny jsou v molekule zkoumané organické látky obsaženy či o jakou sloučeninu se jedná. V případě anorganických látek jsou často identifikovány jednotlivé ionty (např. dusičnany, sírany, či uhličitany). Tuto úlohu má usnadněnu znalostí původu vzorku či jeho dalších vlastností. Jak již bylo řečeno, Ramanova spektra stejně jako infračervená spektra poskytují informace o vibračních (a příp. rotačních) pohybech polyatomických částic (molekul, krystalů atd.). Frekvence normálních vibračních módů závisí na hmotnostech zúčastněných atomů, na síle vazeb mezi nimi a jejich vzájemném geometrickém uspořádání, tj. na základních parametrech popisujících strukturu molekuly. Obecně vzato, identifikační možnosti Ramanovy spektrometrie jsou srovnatelné s potenciálem infračervené spektrometrie a obě metody se navzájem doplňují, a to především u molekul se středem symetrie. Je třeba zdůraznit, že vibrační frekvence molekul jsou nezávislé na tom, zda je studujeme infračervenou nebo Ramanovou spektroskopií, avšak intenzity spektrálních linií budou pro obě spektroskopické techniky zřetelně odlišné. V Ramanově spektru je intenzita pásů úměrná druhé mocnině změny polarizovatelnosti během vibračního pohybu (δα/δq)2, zatímco v infračerveném spektru je úměrná druhé mocnině změny dipólového momentu. Přiřazení pásů jednotlivým vibračním modům se tak provádí u Ramanových spekter podobně, jak je obvyklé při interpretaci absorpčních spekter ve střední infračervené oblasti. Kombinované tabulky charakteristických vibračních frekvencí funkčních skupin obsahují pro danou funkční skupinu společný údaj o poloze pásu (vlnočtu, cm-1) a zvlášť údaje o intenzitě pásu v infračerveném a v Ramanově spektru. Zatímco v infračervených spektrech jsou intenzivní pásy pro vibrace s výraznou změnou dipólového momentu (vibrace polárních skupin, např. –OH, -C=O, -NO2), intenzity pásů v Ramanových spektrech souvisejí se změnou polarizovatelnosti (intenzivnější pásy jsou pro symetrické vibrace a vibrace ve fázi než pro vibrace antisymetrické a v protifázi, obzvláště intenzivní jsou pásy vícenásobných symetrických vazeb – např. -C≡C-, -C=C-, -N=N-). Vzhled infračervených a Ramanových spekter je tak silně ovlivněn symetrií molekul (buněk krystalu) a symetrií jednotlivých vibračních pohybů. Pro molekuly s nízkou symetrií (charakterizované pouze prvkem symetrie „identita―) jsou pásy všech vibrací pozorovatelné v obou typech spekter, ovšem s odlišnou intenzitou. Pro molekuly s vysokou symetrií se stávají spektrum infračervené a Ramanovo navzájem doplňkovými (komplementárními). Např. pro molekuly se středem symetrie platí princip alternativního zákazu, tj. pásy vibrací patrné v Ramanově spektru jsou zakázány v infračerveném spektru a naopak; plně (totálně) symetrické vibrace jsou aktivní v Ramanově spektru a v infračerveném spektru jsou inaktivní.

-7-

Na rozdíl od infračervených spekter lze v Ramanových spektrech velmi snadno identifikovat i řadu symetricky substituovaných skupin, symetrických skeletů molekul, resp. symetrických iontů. Například symetricky substituovaná trojná vazba se obvykle projevuje velmi silným Ramanovým pásem valenční C≡C vibrace v oblasti cca 2260 až 2160 cm-1. Je tak možné ji jednoznačně odlišit od nesymetricky substituované C≡C vazby (cca 2180 až 2100 cm-1), případně lze identifikovat více trojných vazeb v jedné molekule. Dále se v Ramanových spektrech výrazně projevuje dvojná C=C vazba svojí valenční vibrací v oblasti cca 1690 – 1630 cm-1 pro nekonjugované alkeny, resp. v oblasti 1660 – 1580 cm-1 pro konjugované alkeny. Naopak pouze slabými pásy se projevují C=O vazby, ať již v ketonech, esterech, amidech atd. Kombinací Ramanovy a infračervené spektroskopie lze pak jednoznačně přiřadit konkrétní pásy v oblasti 1750 – 1580 cm-1 (ať již vibracím C=O nebo C=C) nebo identifikovat odlišný původ pásu. Na rozdíl od infračervené spektroskopie lze pomocí Ramanovy spektroskopie úspěšně charakterizovat technicky významné prvkové materiály, např. uhlíkové materiály (grafitické vrstvy, saze, přírodní i umělé diamanty atp.) a křemíkové materiály (elektronika). Dále pak lze studovat anorganické materiály obsahující těžké prvky, např. korozní oxidické, /di/sulfidické vrstvy pro slitiny těžkých kovů (koroze materiálů v přírodním nebo výrobním prostředí). Při studiu polypeptidů a proteinů je významná možnost sledovat symetrické valenční S-S vibrace disulfidických můstků (např. rovnováha cystin – cystein, resp. vznik jiných lépe rozpustných disulfidů s cysteinem pro léčbu cystinurie). Z hlediska kvalitativní informace je možné srovnávat měřená spektra (ať již infračervená či Ramanova) čistých látek s odpovídajícími knihovnami spekter, a tak provádět identifikaci látek. Vibrační spektrum je pro identifikaci výborným „otiskem palce―, zejména je-li při porovnávání změřených a databázových dat dodržena podmínka, že příslušná spektra byla získána pro stejný fyzikální stav látky a korespondující metodikou (např. stejnou reflexní technikou v případě infračervených spekter, resp. při stejné excitační vlnové délce v případě spekter Ramanových). Ve srovnání s infračerveným spektrem bývá Ramanovo spektrum často jednodušší, přehlednější a s užšími spektrálními pásy. V komerčně využívaných systémech jsou implementovány například knihovny spekter hořlavých látek, výbušnin, návykových látek, farmaceuticky důležitých chemikálií či spektra různých minerálů. V řadě případů je možné pomocí sofistikovaných algoritmů identifikovat více složek vedle sebe, aniž je nutné dělit složité směsi. Různě rozsáhlé databáze spekter (až desítky tisíc spekter) jsou dostupné komerčně, avšak často je vhodné vytvářet jednoúčelové knihovny spekter zpracováním vlastních naměřených dat. Často se spektra třídí, klasifikují a porovnávají s využitím chemometrických metod. Ramanova i infračervená spektra se dále využívají i pro kvantitativní analýzu. Metody vibrační spektroskopie se v poslední době uplatňují i při analýzách životního prostředí či v bioanalytických aplikacích. Samotné měření spekter je poměrně rychlé1, a především v případě Ramanovy spektroskopie často nedestruktivní a nevyžadující mnohdy žádnou speciální úpravu vzorku. Minimalizuje se tak spotřeba chemikálií, jednorázově použitelných 1

K záznamu jednoho spektra někdy stačí i méně než jedna minuta, většinou se však data akumulují několik minut pro zlepšení poměru signál/šum.

-8-

analytických setů, a tím i generování životní prostředí zatěžujících odpadů. Ramanovou spektroskopií lze měřit vzorky i ve skleněných a některých dalších transparentních obalech. Voda se projevuje jen slabými pásy, a proto lze snáze než v případě infračervené spektrometrie analyzovat i vodné roztoky. Navíc, optické materiály používané v Ramanově spektroskopii nejsou citlivé na vlhkost. Mnohem pracnější a časově výrazně náročnější než samotné měření spekter je mnohdy následné zpracování a vyhodnocování naměřených dat. Vibrační spektrum tak má z hlediska kvalitativní analýzy látek dvě významné vlastnosti: 1/ Ve svých detailech je charakteristické pro jednotlivé látky natolik, že prakticky neexistují dvě sloučeniny, které by měly zcela shodná infračervená a Ramanova spektra. Pomocí vibračního spektra můžeme identifikovat danou látku při využití odpovídajících knihoven spekter. 2/ Na druhé straně se jednotlivé funkční skupiny/strukturní jednotky projevují ve spektru podobně, a tak lze rozborem vibračního spektra zjistit přítomnost jistých funkčních skupin/typů skeletu v molekule a též vyloučit výskyt jiných funkčních skupin. Pro nalezení funkčních skupin v molekule potřebujeme tabulky vlnočtů/frekvencí charakteristických vibrací (např. Tabulka I – v příloze). V tabulkách jsou pro každou funkční skupinu na základě empirické zkušenosti uvedeny intervaly vlnočtů, ve kterých se daná funkční skupina musí projevit spektrálním pásem, a dále též relativní intenzita příslušného absorpčního pásu. Šířka intervalu vlnočtů je závislá na ovlivnění vibrace dané funkční skupiny zbytkem molekuly. Některé skupiny jsou charakterizovány několika absorpčními pásy, jiné pásem jediným. Má-li být daná funkční skupina v molekule prokázána, musí být nalezeny všechny absorpční pásy, které ji charakterizují, a měly by korespondovat i intenzity jednotlivých absorpčních pásů (v případě intenzit je nutno respektovat poměr intenzit, jejich absolutní hodnota je totiž závislá na zastoupení skupin v molekule). Naopak z nepřítomnosti pásů v určitých oblastech lze přítomnost některých funkčních skupin nebo vazeb vyloučit.

Ramanův spektrometr a techniky měření Ramanových spekter Pro Ramanovu spektrometrii se používají jak disperzní spektrometry, tak spektrometry s Fourierovou transformací (FT). Hlavními součástmi spektrometru jsou: zdroj excitujícího záření (laser), vzorkovací prostor (komora), sběrná optika, disperzní prvek (disperzní spektrometry) / interferometr (FT spektrometry), detektor. Pro Ramanovu spektrometrii lze využít jako zdroje záření různé typy laserů, které pokrývají viditelnou (VIS) oblast, blízkou infračervenou (NIR) oblast, případně i ultrafialovou (UV) oblast. U jednoduchých spektrometrů je k dispozici jeden laser, obvykle pevnolátkový či diodový, pracující v kontinuálním nebo kvasikontinuálním režimu. U vědeckých systémů jsou připraveny optické cesty pro několik laserů, umožňujících přizpůsobit vlnovou délku excitace řešené problematice. Výhodou excitace v UV-VIS oblasti je vyšší intenzita rozptylu (intenzita rozptylu klesá se čtvrtou mocninou vlnové délky

-9-

excitujícího záření), naopak zásadní nevýhodou jsou rizika velmi intenzivní fluorescence nebo nežádoucích fotochemických reakcí. Tato rizika jsou dána polohou virtuální hladiny v oblasti elektronově excitovaných hladin (Obr. 1). Právě potlačení rizika nežádoucích fotochemických a fotofyzikálních procesů je hlavní výhodou excitace Ramanova jevu v NIR oblasti, kdy virtuální hladina je pod úrovní elektronově excitovaných stavů (Obr. 1). NIR excitace však vzhledem k nižší intenzitě rozptylu vyžaduje systémy o vysoké světelnosti a vysoce citlivé (chlazené) detektory. Tok záření Ramanova rozptylu obecně též roste se zvyšujícím se tokem excitujícího laserového záření, to znamená se zvyšujícím se výkonem laseru („laser power―). Výkon laseru je však limitován riziky ohřevu vzorku, jeho rozkladu, příp. riziky dalších nežádoucích fotochemických a fotofyzikálních procesů. Výkon laseru lze obvykle softwarově nastavit a přizpůsobit jeho hodnotu vlastnostem vzorku, požadavkům na rychlost analýzy a na hodnotu poměru signál/šum. Ramanova spektra se nejčastěji měří se vzorky umístěnými v uzavřené vzorkové komoře. Komora je obvykle uzpůsobena pro měření vzorků v různých skleněných vzorkovnicích (ampulích, vialkách, kyvetách pro UV-VIS spektrometrii či kyvetách pro NMR spektrometrii). Takto lze snadno měřit kapaliny či práškové vzorky v celkovém objemu několika stovek mikrolitrů. Kromě toho existuje řada různých speciálních držáků, například pro makroskopické měření pevných (kusových) vzorků, pro proměřování tenkovrstvých chromatogramů, či pro proměřování vzorků na kapkovacích destičkách. Důležitým aspektem umístění vzorku v kyvetovém prostoru je též možnost jeho přesného polohování vůči excitujícímu paprsku a sběrné optice rozptýleného záření. Přístroje jsou často vybaveny x-y-z polohovacím zařízením, ať již s manuálním ovládáním či s krokovými motory s řízením pomocí joysticku, tlačítek či ovládacího softwaru. Zásadní je především vzdálenost vzorku od sběrné optiky, tak aby rozptýlené záření bylo optimálně soustředěno buď na vstupní štěrbinu dispersního Ramanova spektrometru, či na vstupní aperturu Ramanova spektrometru s Fourierovou transformací, případně do sběrného optického vlákna. Mikrospektrometrické měření, kdy je Ramanův spektrometr propojen s optickým mikroskopem, resp. vzorkovací prostor je nahrazen optickým mikroskopem, se využívá především v případě analýzy povrchů včetně jejich spektrálního mapování. Vedle uvedených postupů, kdy je vzorek umístěn v držáku přístroje, se Ramanova spektra měří in situ, většinou s využitím vláknové optiky s různými typy sond, které mohou být umístěny například přímo v chemickém či biotechnologickém výrobním reaktoru. Pro terénní in situ měření se využívají kompaktní přenosné spektrometry napájené akumulátory. Přes malý rozměr spektrometrů (cca 20 x 10 x 4 cm) (Obr. 3) obsahují všechny klíčové části: diodový laser, kyvetový prostor, spektrograf s fixní disperzní mřížkou, CCD detektor a výkonný počítač. Tyto spektrometry obvykle zahrnují interní databáze spekter řady anorganických i organických látek, které umožňují na místě (v terénu) identifikovat látky příp. i analyzovat složení jednoduchých směsí, složených z několika (cca pěti) složek, jejichž obsah je vyšší než asi 2 % celkové hmotnosti materiálu. Uvedené spektrometry jsou chráněny vnějším obalem před riziky nárazu, pádu, vlhkosti apod. Obsluha je zjednodušena natolik, aby přístroj mohl být využit při zásahu hasičů, policie či armádních jednotek. Naměřená data lze

-10-

dodatečně exportovat do nezávislého počítače pomocí standardní miniSD paměťové karty a podrobně vyhodnocovat a interpretovat pomocí běžného spektroskopického softwaru.

Obr. 3 In situ měření s přenosným spektrometrem First Defender RM (Ahura Scientific)

Z rozptýleného záření je třeba nejprve odfiltrovat Rayleighův rozptyl. Tím pro běžné přístroje dochází ke ztrátě informace v oblasti Ramanových posuvů ± 100 cm-1 okolo polohy excitační linie (excitační linii odpovídá Ramanův posuv 0 cm-1). Kvalitnější přístroje obvykle umožňují měřit spektra blíže k excitační linii a to až k hodnotě pouhých 10 cm-1. Pro potlačení Rayleighova rozptylu se běžně používají holografické filtry nebo jednoduché premonochromátory. Pro zpracování a detekci rozptýleného záření se v současné době obvykle využívají dva výše uvedené typy konstrukce Ramanova spektrometru. Při excitaci Ramanova efektu ve VIS (příp. UV, NIR) oblasti je užíván dispersní přístroj s mřížkovým spektrografem a „plošným― (víceprvkovým – mnohakanálovým) CCD detektorem. Při registraci Ramanova rozptylu v blízké infračervené oblasti (NIR) je často využíván interferometr a vysoce citlivý jednokanálový detektor. Pro získání vlastního spektra se zaznamenaný interferogram převádí Fourierovou transformací (FT), takže se přístroj označuje jako FT Ramanův spektrometr. Jako optický materiál lze v uvedených oblastech (UV-VIS-NIR) využít kvalitní křemenné sklo, takže se při konstrukci Ramanových spektrometrů často uplatňuje křemenná vláknová optika. V analytické laboratoři jsou instalovány dva disperzní Ramanovy spektrometry Dimension-P2 Raman (Lambda Solutions, USA) s příslušenstvím pro měření kapalných a pevných vzorků. K excitaci Ramanova rozptylu jsou využity termoelektricky chlazené diodové lasery, poskytující záření o vlnové délce 785 nm. Vzorkovací nástavce jsou umístěny mimo tělo přístroje a excitující záření je na vzorek fokusováno pomocí měřicí hlavice spojené s přístrojem optickými vlákny, kdy jedno vlákno vede excitující záření a druhé slouží k přenosu vzorkem rozptýleného záření. Rayleighův rozptyl je odfiltrován tak, že rozsah přístroje je již od cca 40 cm-1 do 3000 cm-1 ve Stokesově oblasti. Rozsah je pevně určen, protože přístroj neobsahuje žádné pohyblivé prvky, disperzní mřížka i mnohokanálových termoelektricky chlazený detektor jsou fixovány ve výrobcem nastavených polohách.

-11-

Infračervený spektrometr a techniky měření infračervených spekter vzorků v pevné fázi (KBr tablety, technika zeslabeného úplného odrazu - ATR, a technika difusní reflexe - DRIFT) Infračervený spektrometr je přístroj umožňující měřit optické vlastnosti vzorků v závislosti na vlnočtu (případně vlnové délce, nebo frekvenci) v oblasti infračerveného záření. V této úloze se seznámíte s měřením na infračerveném spektrometru s Fourierovou transformací (FTIR spektrometr). V laboratoři jsou k dispozici FTIR spektrometry NEXUS 670 a AVATAR 320. Zjednodušené schéma FTIR spektrometru AVATAR 320 (Nicolet) je uvedeno na Obr. 4. Zdrojem záření (1) je v FTIR spektrometru, stejně jako v dispersním přístroji, keramická tyčinka, která při zahřátí nad 1000oC emituje spojité záření v infračervené oblasti. Kyvetový prostor (5) je konstruován na průchod jednoho paprsku, tj. nejprve se měří bez vzorku jednopaprskové spektrum pozadí, a poté se po vložení vzorku změří jeho jednopaprskové spektrum. Přístroj pak na základě obou jednopaprskových spekter spočítá spektrum vzorku v požadované veličině (transmitance, absorbance, reflektance atp.). Kromě držáku kyvet (6) mohou být v kyvetovém prostoru umístěny speciální nástavce pro měření reflexních spekter (ATR – jednoodrazové či víceodrazové, DRIFT – difúzní reflexe, příp. spekulární reflexe). Obr. 4 Schéma infračerveného spektrometru s Fourierovou transformací AVATAR 320 1 – zdroj infračerveného záření Ever-Glo; 2 – pevné zrcadlo fokusující záření do interferometru; 3 – interferometr s pevným KBr děličem paprsků; 4 – zrcadlo fokusující záření do kyvetového prostoru; 5 – kyvetový prostor; 6 – držák vzorku; 7 – zrcadlo fokusující záření na detektor; 8 – detektor; 9 – sušidlo; 10 – indikátor vlhkosti; 11 laser; 12 – napájení laseru; 13 – elektronické moduly Infračervený paprsek je naznačen plnou čarou.

-12-

Kyvety mají okénka z materiálu propustného pro infračervené záření, nejčastěji z halogenidů alkalických kovů. V laboratoři jsou používána okénka z NaCl resp. KBr, která jsou propustná pro záření v rozsahu vlnočtů 50 000 - 650 cm-1 resp. 50 000 – 450 cm-1. Limitující hranicí při měření IČ-spekter je nepropustnost těchto okének v oblasti pod 650 cm-1 pro okénka z NaCl, resp. pod 450 cm-1 pro okénka z KBr. Na rozdíl od monochromátoru dispersního přístroje obsahuje FTIR spektrometr interferometr (3), jehož hlavními součástmi jsou dělič paprsků, pohyblivé a pevné zrcadlo (Obr. 4). Pro střední infračervenou oblast se používá jako dělič paprsků polopropustné zrcadlo, které je vyrobeno depozicí tenké germaniové vrstvy na prvku z bromidu draselného. Optické prvky z KBr vyžadují zvláštní ochranu před vzdušnou vlhkostí. Úroveň vlhkosti uvnitř přístroje je indikována barevným terčíkem (10) viditelným po otevření víka kyvetového prostoru (5). Standardně je užíván DTGS detektor (8), pracující za laboratorní teploty. Dražší přístroje jsou vybaveny citlivějším MCT detektorem, který vyžaduje chlazení kapalným dusíkem.

Obr. 5 Interferometr v FTIR spektrometru

Funkce přístroje Svazek paprsků vycházející ze zdroje (1) je fokusován zrcadlem (2) do interferometru (3), kde je interferenčně modulován. Ačkoli konkrétní konstrukce interferometru je odlišná podle typu a výrobce přístroje (návrh konstrukce je často předmětem patentové ochrany), lze princip funkce interferometru přehledně vysvětlit pro interferometr Michelsonova typu (Obr. 5). Záření ze zdroje dopadá pod úhlem 45o na polopropustný dělič paprsků, kterým s 50 %-ní propustností projde paprsek na pohyblivé zrcadlo. Zbylá část vstupního záření je odražena směrem k pevnému zrcadlu. Paprsky se od obou rovinných, vzájemně kolmých zrcadel, zpětně odrážejí a na děliči paprsků se podle aktuální polohy pohyblivého zrcadla, buď konstruktivně, či destruktivně rekombinují, tj. dochází k interferenci. Rekombinovaný paprsek je pak pomocí zrcadla (4) odražen do kyvetového prostoru (5) a odrazem na zrcadle (7) je fokusován na detektor (8). Signál na detektoru je snímán v závislosti na pohybu zrcadla v interferometru od + do - (Obr. 5). Rychlost pohybu zrcadla je proto přizpůsobena časové -13-

odezvě detektoru, závislé na typu použitého detektoru (DTGS, MCT atp.) Pro polychromatické záření je signál na detektoru součtem všech konstruktivních nebo negativních interferencí každé frekvence, jež se integruje se všemi ostatními frekvencemi – tzv. multiplexní interferogram. Každý zaznamenaný interferogram tak obsahuje veškeré spektrální informace. Z jednoho pohybu zrcadla je získán jeden interferogram, který se Fourierovou transformací převádí na spektrum odpovídající jednomu scanu. Pro provedení Fourierovy transformace je třeba zvolit typ apodizační funkce (běžně se používá funkce Happ-Genzelova) a tzv. zero-filling faktor (pro běžná měření se nastavuje nulový). (Vysvětlení těchto pojmů lze nalézt v literatuře zabývající se teorií interferometrie a Fourierovou transformací.) Pohyb zrcadla v interferometru se pravidelně opakuje s frekvencí danou typem detektoru. S opakovaným pohybem zrcadla jsou zaznamenávány další interferogramy. Navolený počet scanů určuje počet nasnímaných interferogramů, z nichž je pak spočítán průměrný interferogram, který se Fourierovou transformací převede na výsledné jednopaprskové spektrum. Techniky měření vzorků v pevné fázi Klasickou technikou měření látek v pevné fázi (práškových, jemně krystalických) je využití samonosných tablet tvořených matricí KBr. Odvážené malé množství zkoumané látky (běžně 0,3 – 0,8 mg) se smísí s cca 230 – 250 mg KBr a pečlivě rozetře v achátové misce, nebo rozdrtí a zhomogenizuje ve vibračním mlýnku. Připravená směs se převede do lisovacího přípravku, kde se uzavřená směs nejprve evakuuje (zbavuje vzduchu např. membránovou vývěvou) a následně se pomocí hydraulického lisu vylisuje čirá tableta. Tableta se bezprostředně po přípravě měří v držáku tablet, který nahradí v kyvetovém prostoru držák kapalinových kyvet. Tablety poměrně rychle „stárnou―, sorbují vzdušnou vlhkost, „mléčně― se zakalují, což vede k deformacím základní linie v důsledku rozptylu světla a zároveň se zvyšují spektrální projevy vody, které se v případě některých látek mohou překrývat s pásy sledovaných analytů. Příprava tablet je poměrně pracná a pro dosažení kvalitních spekter bez artefaktů je třeba experimentální zručnost a zkušenost. Moderní rychlou technikou měření práškových materiálů je technika difusní reflexe (DRIFT). Tato technika minimalizuje operace potřebné k přípravě vzorku, nicméně v běžných podmínkách neumožňuje spolehlivou kvantitativní analýzu. Technika spočívá v reflexně-absorpčním ději na vrstvě práškového, resp. porézního vzorku. Sledováno je odrážené záření v širokém prostorovém úhlu, v němž se projeví zeslabenou intenzitou záření těch vlnových délek (energií, frekvencí, vlnočtů), které je vzorkem absorbováno. Intenzita a průběh signálu je významně ovlivněn velikostí částic práškového vzorku, resp. porozitou materiálu, tvarem částic, jejich „zhutněním― v měřicím kalíšku, krystalinitou materiálu a dalšími obtížně reprodukovatelnými parametry, takže naměřená spektra je možno využít pro identifikační účely, pro srovnání s odpovídajícími knihovnami spekter resp. pro základní strukturní informace, nikoli však pro kvantitativní vyhodnocování. Další technikou využívanou i v kompaktních přenosných přístrojích je technika zeslabené úplné reflexe (ATR), která poskytuje opakovatelnější spektra, než je tomu v případě DRIFT, nicméně vyžaduje dokonalý kontakt vzorku s krystalem, aniž dojde

-14-

k mechanickému či chemickému poškození povrchu krystalu. Vzhledem k této skutečnosti i vzhledem k různým hodnotám indexu lomu zkoumaných vzorků je třeba volit vhodný materiál ATR krystalu. V běžných laboratorních podmínkách se využívá levný, vodě-odolný nicméně chemicky málo odolný krystal ZnSe. Dalšími dostupnými, často užívanými krystaly jsou Si, nebo Ge. Mimořádné mechanické i optické vlastnosti vykazuje diamantový krystal, který je však významně dražší než ostatní zmiňované materiály. Diamantový krystal je využíván u kompaktních přenosných FTIR spektrometrů, užívaných i armádními, policejními či hasičskými jednotkami, kde je vyžadována mimořádná odolnost přístroje při měření v terénu. Kontakt práškového vzorku s krystalem je třeba zajistit buď mechanicky pomocí přítlačného systému, nebo lze využít „triku―, kdy je látka vyloučena ve formě tenké vrstvy (odparku) přímo na povrchu krystalu po odpaření vhodného těkavého rozpouštědla.

-15-

Laboratorní práce – Analýza pevných vzorků 1) Ramanovou spektroskopií 2) Infračervenou spektrometrií

ÚKOLY 1) Ramanova spektroskopie A) Analýza přírodního geologického (anorganického) vzorku 1) Optimalizujte podmínky pro měření pevného vzorku ve formě kusového materiálu, případně prášku ve vialce resp. in situ s přístrojem FirstDefender RM. 2) S vhodným nastavením přístrojových parametrů proměřte spektra zadaných vzorků. 3) Spektra opatřete popisem píků, porovnejte je s databází spekter a následně proveďte přiřazení klíčových pásů B) Analýza pevného organického vzorku 1) Optimalizujte podmínky pro měření pevného vzorku umístěného v kalíšku, ve vialce resp. v originálním průsvitném (skleněném či polymerním) obalu. 2) S vhodným nastavením přístrojových parametrů proměřte spektra zadaných vzorků. 3) Spektra opatřete popisem píků, porovnejte je s databází spekter a proveďte přiřazení klíčových pásů 2) Infračervená spektrometrie A) Analýza pevného vzorku technikou KBr tablet 1) Připravte tabletu ze samotného KBr, vyzkoušejte si jednotlivé kroky její přípravy a ověřte „spektrální čistotu― použitého KBr. 2) Připravte KBr tablety ze zadaných anorganických i organických látek, proměřte je, spektra kompenzujte pomocí referenční tablety ze samotného KBr a opatřete je popisem pásů. 3) Spektra porovnejte s databází spekter a proveďte přiřazení klíčových pásů. B) Analýza pevného vzorku technikou ATR 1) Změřte ATR spektra zadaných vzorků jejich mechanickým přitlačením k ATR krystalu. 2) Změřte ATR spektra zadaných vzorků vytvořením povrchového filmu (odparku po odpaření vhodně vybraného rozpouštědla, kterým byl zakápnut vzorek). 3) Spektra porovnejte s databází spekter, proveďte přiřazení klíčových pásů a identifikaci materiálu.

-16-

C) Analýza pevného vzorku technikou DRIFT 1) Změřte DRIFT spektra zadaných vzorků prostým umístěním vzorku v držáku DRIFT nástavce. 2) Změřte DRIFT spektra zadaných vzorků po jejich rozetření v achátové misce 3) Změřte DRIFT spektra zadaných vzorků po jejich naředění KBr a následném rozetření a homogenizaci v achátové misce. 4) Spektra porovnejte s databází spekter, proveďte přiřazení klíčových pásů a identifikaci materiálu.

Měření Ramanových spekter Ramanova spektra budete měřit buď na stolních spektrometrech Dimension P2 v prostředí softwaru RamanSoft (Lambda Solutions, USA) nebo pomocí přenosného kompaktního spektrometru Fisrt Defender RM. Základní přípravu přístroje a počítače k měření a výběr vhodného výchozího nastavení parametrů přenecháte vyučujícímu, který Vás seznámí s obsluhou příslušného spektrometru a softwaru. Ramanův spektrometr Dimension-P2 je disperzní spektrometr, který je kromě zapnutí a vypnutí kolébkovým vypínačem (Obr. 6) a spínání napájení laseru pomocí klíče (Obr. 7) řízen výhradně prostřednictvím softwaru RamanSoft. K vlastnímu tělu spektrometru je vláknovou optikou připojena měřicí hlavice, která je buď fixována v univerzálním držáku pro vialky a kyvety (Obr. 10), nebo k tělu x-y-z polohovacího zařízení (Obr. 11).

hlavní vypínač napájení USB konektor komunikace s PC

Obr. 6 Pohled na zadní stěnu spektrometru Dimension-P2

-17-

indikace závěrky laseru

vstup a výstup vláknové optiky vypínač laseru

Obr. 7 Pohled na přední stěnu spektrometru Dimension-P2

Obr. 8 Schéma čelního panelu spektrometru First Defender RM

Přenosný spektrometr Fisrt Defender RM se ovládá pomocí tlačítek na čelním panelu spektrometru (Obr. 8), který dále zahrnuje displej a kyvetový prostor pod plastovým krytem. -18-

Přístroj se zapíná standardně označeným tlačítkem pro zapnutí a vypnutí přístroje. Po inicializaci řídicího softwaru spektrometru je třeba před měřením odemknout laser stisknutím tlačítka se symbolem klíčku a zadáním bezpečnostního kódu, který vám sdělí vyučující. Před měřením si zkontrolujte stav nabití baterie v levém horním rohu displeje (Obr. 9). Pokud by byla baterie slabá, požádejte vyučujícího o její výměnu. Vybráním zvýrazněné položky „Scan― přejdete do nabídky pro měření vzorků. Vzorky mohou být umístěny ve vialce ve vnitřním kyvetovém prostoru nebo se ke zkoumanému materiálu přiblíží externím měřicí port (Obr. 8).

Obr. 9 Základní obrazovka („Home“) spektrometru First Defender RM

A) Analýza přírodního geologického (anorganického) vzorku Univerzální držák spektrometru Dimension P2 (Obr. 10) obsahuje dvě měřicí komory, a to jednu určenou pro kyvety o čtvercovém průřezu (10 x 10 mm) a druhou vhodnou pro vialky s kruhovým průřezem 9 mm. V případě měření vzorků ve vialkách vložíte víčkem uzavřenou vialku s připraveným vzorkem do otvoru o kruhovém průřezu a měřicí komoru uzavřete víčkem univerzálního držáku. (S nastavením polohy měřicí sondy nemanipulujte, sonda je předjustována, aby záření bylo fokusováno do vialky, nikoli na její stěnu.) V případě proměřování pevných vzorků umístěných na stolku x-y-z polohovacího zařízení (Obr. 11) pouze položíte zadaný vzorek do středové části stolku, tak aby se nacházel pod optickou hlavicí měřicí sondy. Optimalizaci polohy vzorku budete provádět v režimu kontinuálního zaznamenávání spekter po nastavení základních parametrů měření v programu RamanSoft. Při manipulaci nesmí dojít k dotyku měřicí hlavice se vzorkem.

-19-

univerzální držák pro vialky a kyvety

měřicí hlavice

Obr. 10 Měřicí sonda umístěná v univerzálním držáku vzorků

Obr. 11 Měřicí sonda fixovaná k x-y-z polohovacímu zařízení

-20-

Spektrometr First Defender RM umožňuje měřit ve dvou pozicích vzorku. V případě měření vzorků ve skleněných vialkách vložíte víčkem uzavřenou vialku s připraveným vzorkem do otvoru o kruhovém průřezu umístěném v horní části čelního panelu (Obr. 8). V případě jiných typů vzorků a měření v terénu (např. v prostorách Podzemního výukového centra Josef) umístěte zkoumaný materiál do blízkosti externího měřicího portu (Obr. 8). Pokud se jedná o vzorky bez obalu či terénní měření, je vhodné použít fokusační nástavec, kdy ohnisko laserového paprsku je méně jak 6 mm od jeho vnější hrany (Obr. 12 a) a přístroj může pracovat v dotykovém režimu. V případě vzorků v průsvitných (skleněných) tlustostěnných nádobách je žádoucí sundat fokusační nástavec a fokusovat tak paprsek do vzdálenosti cca 18 mm od hrany přístroje (Obr. 12 b).

Obr. 12 Poloha ohniska pro externí měřicí port a) při použití fokusačního nástavce, b) bez nástavce

Obr. 13 Nabídka nastavení měření „Scan Settings“

-21-

Kromě optimalizace polohy vzorku vůči spektrometru je třeba v nabídce „Scan Settings― (Obr. 13) zobrazené po stisknutí položky „Scan― (viz Obr. 9) zvolit počáteční hodnotu výkonu laseru. Nastavení je možné ve třech stupních „low―, „medium― a „high―. Z hlediska předběžné opatrnosti je vhodné začít s nízkým výkonem laseru a případně v rámci optimalizace podmínek měření zkusit výkon postupně zvyšovat. Po tomto nastavení lze spustit vlastní měření stisknutím tlačítka SCAN (Obr. 8). Zapnutí laseru je indikováno kontrolkou umístěnou v horní části spektrometru vedle vnitřního kyvetového prostoru (Obr. 14). Po dobu svitu kontrolky je třeba dbát, aby laserový paprsek nemohl zasáhnout oko dalších osob ve vzdálenosti menší než cca 50 cm od hrany přístroje. Ve větší vzdálenosti je již riziko poškození minimální vzhledem k výrazné defokusaci laserového záření. Samotné měření spektra je bezprostředně provázeno jeho srovnáním s knihovnou spekter, což buď vede k identifikaci čisté (dominantně zastoupené) látky (zeleně zvýrazněný „Positive Match―) nebo k identifikaci několika hlavních složek směsi (modře zvýrazněné „Mixture―), v některých případech pak systém oznámí, že nalezl pouze podobnou látku (žlutě zvýrazněné „Similar item―), nebo nebylo možné spolehlivě analyzovat spektrum (červeně zvýrazněné „No Match―) a je nabídnuta možnost zobrazit spektrum. U následně zobrazeného spektra (např. Obr. 15) je třeba prohlédnout, jaká je celková úroveň signálu (např. zda nedošlo k saturaci detektoru), jaká je úroveň Ramanových pásů vůči fluorescenčnímu nebo tepelnému pozadí případně jaká je úroveň šumu vůči pozadí. Pokud změna výkonu laseru nevede ke zřetelnému zlepšení snímané spektrální informace je možné přístroj (po dohodě s vyučujícím) přepnout do manuálního režimu expozice.

Obr. 14 Varovná kontrolka svíticího laseru umístěná v horní části spektrometru

Naměřená data jsou ukládána do paměti přístroje v rámci zvolené „Session―, která se zobrazovala v nabídce „Scan Settings― (Obr. 13). Všechna spektra v dané „Session― je možné exportovat na vloženou paměťovou miniSD kartu, což je operace, kterou přenechte vyučujícímu. Data lze exportovat jako obrázky (.jpg), jako SPC soubory (.spc) podporované

-22-

běžným spektroskopickým softwarem a jako ASCII data – textové soubory (.txt) použitelné pro import do jiných softwarových nástrojů (např. Excel nebo Origin).

a)

b)

Obr. 15 Příklad naměřených spekter a) spektrum překryté fluorescencí, b) přijatelné spektrum (patrný pouze mírně zvýšený šum)

B) Analýza pevného organického vzorku V případě měření vzorku v originálním obalu (např. léčiva v blistru či lékovkách nebo práškové materiály v prachovnicích či zatavených plastových sáčcích) využijete k měření přístroj First Defender RM a budete postupovat obdobně jako v případě měření anorganických materiálů (viz výše). V případě ostatních laboratorních vzorků po jejich umístění do vzorkovacího zařízení přístroje Dimension P2 (univerzální držák nebo x-y-z polohovací zařízení - podle povahy -23-

materiálu) nastavíte v softwaru RamanSoft (Obr. 16) základní podmínky měření vzorku: výkon laseru, dobu akumulace (integrace), počet opakovaných akumulací, popis vzorku a název souboru (Obr. 17). Nejprve v hlavní nabídkové liště otevřete rozbalovací nabídku „System― a zvolíte nejprve položku „Laser Setting― s podpoložkou „Power Adjustment―, čímž otevřete dialogové okno „Laser Power Adjustment―. Zde zadáte hodnotu výkon laseru (v rozmezí od 10 do 350 mW), a to buď dle doporučení vyučujícího, nebo dle výsledků předchozích měření. Zadání potvrdíte tlačítkem „OK―. Opět kliknete na nabídku „System― a dále pak na položku „CCD Configuration―, čímž otevřete dialogové okno „CCD Camera Parameter Setup―. Zde zadáte hodnotu doby akumulace („New Integration Time―) jako číselný údaj v sekundách. Pro první orientační měření lze použít hodnot 1 či 2 s. Nastavení potvrdíte tlačítkem „OK―. Pro další nastavení rozbalíte nabídku „Acquisition― a kliknete na položku „Setup―. V okně „Acquisition Setup‖ v položce „Averaging – Frames Per Measurement― nastavíte minimálně hodnotu 2, své jméno uvedete v položce „Operator Name―, vyplníte položku „Sample Name― (název či číselné označení vzorku), „Sample Info― (totéž co v položce „Sample Name―) a zvolíte jednoznačný „File Prefix― (Obr. 17) (klíčová součást názvu souboru, ostatní součásti názvu souboru doplňuje software automaticky). Základní pravidla označování jednotlivých měření a pro tvorbu názvů souborů Vám budou sdělena při zahájení laboratorní práce.

rám pro měřené spektrum

přehled otevřených spekter

rám pro vyhodnocované spektrum

Obr. 16 Hlavní okno programu RamanSoft

Veškerá měřená data ukládejte do jednoho, vyučujícím určeného adresáře. Originální data pak zachováte v tomto adresáři. Pro další zpracování a vyhodnocování dat vytvoříte duplikáty spekter překopírováním do jiného (pracovního) adresáře. Z tohoto (pracovního) adresáře pak

-24-

budete data načítat při předepsaných úkolech, aby se tak snížilo riziko náhodného přepisu původních dat daty modifikovanými. Poté spustíte samotné měření spektra (nabídka „Acquisition – Acquire‖) a vyčkáte, až přístroj dokončí záznam spektrálních dat. POZOR! Při prvním spuštění měření spektra s aktuálně nastavenou integrační dobou se kromě měření vzorku snímají po stejnou dobu referenční data bez osvitu vzorku laserem (příslušná zaznamenaná odezva detektoru se pak odečítá od signálu získaného při laserové excitaci vzorku), takže celková doba záznamu spektra je dvojnásobná oproti zadaným údajům. Naměřené spektrum je automaticky uloženo pod názvem odvozeným z údajů zadaných před měřením v okně „Acquisition Setup―. Naměřené spektrum bez úprav („Raw Data―) se zobrazí v horní části hlavního okna, upravené či zpracované spektrum („Processed Data―) je uvedeno v dolní části hlavního okna programu (Obr. 16).

integrační čas

počet opakovaných záznamů

výkon laseru

Obr. 17 Nabídky a okna pro nastavení parametrů měření spekter

Možnosti operací se spektry jsou v rámci programu RamanSoft poměrně omezené, takže využijete i skutečnosti, že jsou měřená spektra ukládána ve třech různých formátech, což umožňuje další zpracování spekter i v jiných programech.

-25-

Vyhodnocování Ramanových spekter Základní popis píků (tabulku poloh maxim, resp. ramének pásů) získáte přímo v programu RamanSoft (Obr. 18). Spektra s označenými polohami pásů si vytisknete a použijete pro interpretaci spekter (přiřazení charakteristických pásů). Interpretaci spekter budete provádět na základě údajů uvedených v Tabulka I (viz příloha). Samotnou tabulku píků (Obr. 18) můžete uložit jako textový soubor (ASCII data) a otevřít v programu Excel, resp. přidat v tomto programu k ostatním zpracovávaným datům.

Obr. 18 Rám se spektrem s označenými polohami píků a okno s tabulkou píků

Další zpracování a vyhodnocování spekter (ať již změřených v Podzemní laboratoři Josef či na VŠCHT v Praze) budete provádět v programu Excel, kam načtete spektra automaticky ukládaná v ASCII formátu. V programu Excel jsou připravena makra pro zobrazení grafů spekter s potřebnými údaji i pro další vyhodnocování dat. Provedete zde jak vyhodnocení poměru signálu k šumu, tak i zjednodušené kvantitativní vyhodnocení založené na výpočtech ploch pásů. Konkrétní kroky zpracování a vyhodnocování dat konzultujte s vyučujícím.

Měření IČ spekter Použité přístroje a jejich zapojení do lokální počítačové sítě V laboratoři je instalován rutinní FTIR spektrometr AVATAR 320 (Nicolet, USA). Je to standardní jednopaprskový FTIR spektrometr pracující v rozsahu vlnočtů 4000 (7000) až 400 cm-1. Přístroj je ovládán přes počítač PC Pentium prostřednictvím softwaru OMNIC (Omnic E.S.P. nebo Omnic EZ). Pro optimální funkci zdroje, interferometru a laseru je přístroj trvale elektricky napájen, což je indikováno kontrolními LED diodami (Obr. 19). Dbejte proto na trvalé připojení síťové zástrčky. -26-

Obr. 19 Celkový pohled na přístroj se zvýrazněním polohy kontrolních LED diod

Počítače, ovládající dva FTIR spektrometry, jsou propojeny do lokální sítě Microsoft spolu s dalšími dvěma počítači. Počítače, sloužící k ovládání přístrojů, mají jména Avatar1 a Avatar4, zbylé počítače pak Avatar2 a Avatar3. K počítači Avatar2 je připojena sdílená laserová tiskárna Panasonic, která je přednastavena jako základní tiskárna pro všechny čtyři počítače. Příkazy k tisku se řadí do fronty, a proto je třeba trpělivě vyčkat vytištění zadaného úkolu.

-27-

Obsluha FTIR spektrometru 1. Spuštění počítače a start ovládacího softwaru Zapněte tlačítkem počítač, vyčkejte spuštění a přihlaste se dle pokynů vyučujícího. Poté dvojklikněte na ikonu zástupce OMNIC. Poté se objeví základní obrazovka softwaru (Obr. 20).

Obr. 20 Základní okno programu Omnic

Pod titulem „okna― je umístěno standardní rozrolovávací menu, obsahující veškeré operace pro měření spekter, jejich zpracování, uložení a tisk. Základní operace jsou rovněž spustitelné pomocí řádku ikon, který je umístěn pod tímto menu. Na jednotlivých ikonách (tlačítkách) jsou graficky znázorněny a krátce anglicky popsány operace, které se spustí po jednoduchém kliknutí. Ikona „Open“ slouží k otevření spektrálního souboru uloženého na disku. Ikona „Save“ se naopak používá pro uložení aktuálního spektra (zobrazeno červenou barvou). Kliknutím na ikonu „Print“ se otevře nabídka pro tisk daného spektrálního okna (POZOR – vytisknuta jsou pak VŠECHNA spektra zobrazená v daném okně a nelze již měnit vzhled vytištěné stránky). Ikona označená „Expt Set“(Experiment Setup) slouží k otevření okna s řadou záložek umožňujících nastavení parametrů měření. Pomocí ikony „Col Smp“ (Collect Sample) se spustí měření spektra vzorku, zatímco ikona „Col Bkg“ (Collect Background) slouží pro změření pozadí. Popis funkce dalších ikon je dostupný v kontextové nápovědě („helpu―).

-28-

2. Příprava přístroje pro měření Před nastavením parametrů měření je třeba připravit kyvetový prostor podle typu experimentu. Pokud budeme měřit spektra v kyvetě (v kapilární vrstvě), pak je třeba umístit do kyvetového prostoru základní desku s držákem kyvet. Před měřením reflexních ATR spekter je třeba vložit do kyvetového prostoru desku, na níž je upevněn ATR nástavec (MIRacle™). Způsob výměny základní desky, která je fixována v přístroji magnety, znázorňuje Obr. 21.

Obr. 21. Způsob uchopení základní desky

3. Nastavení parametrů měření Nastavení parametrů měření se provádí v záložkách okna, které se otevře po kliknutí na ikonu označenou textem „Expt Set“. Připravená nastavení jsou uložena v souborech zvaných experiment. Název aktuálního experimentu je zobrazen v řádku mezi řádkem rozrolovávácích menu a řádkem ikon (Obr. 20). Pro vaše měření budete používat dva předem připravené experimenty, jednak pro měření v kyvetě (tj. pro transmisní měření) použijete experiment nazvaný „Transmission―, jednak pro měření ATR technikou nastavíte experiment „MIRacle“. S obsahem jednotlivých záložek okna parametrů měření budete seznámeni při instruktáži před zahájením vlastní práce.

-29-

4. Měření spektra pozadí Před měřením spektra pozadí zkontrolujeme, zda v kyvetovém prostoru nebyla zapomenuta kyveta, vzorek polymerní folie, resp. při měření ATR technikou, zda povrch ATR krystalu je suchý a čistý. Pak klikneme na ikonu označenou textem „Col Bkg“ a potvrdíme, že je vše připraveno pro měření spektra pozadí. Během měření spektra pozadí lze na monitoru sledovat příslušné „průběžné― jednopaprskové spektrum a ve spodní části okna je vidět, kolik scanů z celkového požadovaného počtu bylo změřeno. Po ukončeném měření obvykle odmítneme přidání spektra pozadí do okna (spektrum je uloženo v paměti pro srovnávání s jednopaprskovými spektry následně měřených vzorků). 5. Vlastní měření spektra vzorku Do kyvetového prostoru vložíme kyvetu/držák s měřeným vzorkem. Pak provedeme orientační kontrolu, zda tloušťka vrstvy (popř. koncentrace roztoku) byla vhodně zvolena. Při správném nastavení softwarových parametrů (bylo zaškrtnuto použití „preview data collection―) toho docílíme kliknutím na ikonu „Col Smp“. Objeví se měřící okno, ve kterém se zobrazuje vždy právě změřené spektrum během jednoho scanu a scanování probíhá opakovaně bez akumulace. Jestliže spektrum neodpovídá požadavkům na něj kladeným (např. příliš vysoké či naopak nízké hodnoty transmitance, deformovaný tvar pásů, výskyt pásů předchozího vzorku svědčící o špatně vymyté kyvetě), lze měření pozastavit před vlastní akumulací dat. Pokud chceme spustit vlastní měření, klikneme na tlačítko „Start Collection“, čímž se zahájí akumulace příslušného počtu scanů. Po dokončeném měření přidáme spektrum do základního okna pro jeho další zpracování. 6. Zpracování naměřeného spektra a jeho tisk Bezprostředně po přidání naměřeného spektra do okna toto spektrum uložíme jako soubor na disk. Klikneme na ikonu „Save“, abychom zobrazili nabídku pro uložení spekter. Běžně budeme ukládat spektra s příponou .spa do adresáře a na disk specifikovaný vyučujícím. Kontrolu uložení spektra lze provést po kliknutí na ikonu „i“(info) (Obr. 20), zobrazenou vlevo od názvu změřeného spektra v řádku těsně nad plochou pro zobrazení spekter. Po kliknutí na uvedenou ikonu se zobrazí okno s textovými informacemi o změřeném spektru (parametry měření, historie prováděných operací, způsob uložení atp.). Pro tisk spekter je třeba kliknout na ikonu „Print“ a dále se řídit dle zobrazené nabídky předvoleb a dle pokynů vyučujícího asistenta. Pro manipulaci se spektry zobrazenými v okně slouží řádka zobrazená pod spektrálním oknem. V základním režimu je „stisknuta― ikona se šipkou (Obr. 20) – kurzorová šipka se volně pohybuje po okně, pokud se nalézá v části okna se zobrazenými spektry, pak s jejím pohybem je spojeno zobrazení hodnot X (vlnočet) a Y (transmitance, absorbance atp.) v řádku pod spektrem. Pokud chceme odečítat hodnoty transmitancí (absorbancí) a vlnočtů na aktivním spektru (zobrazeno červeně), pak je třeba kliknout na ikonu s kurzorovým křížem (třetí zleva – viz Obr. 20). Po kliknutí na ikonu s kurzorovým křížem je třeba kliknout na spektrum, aby se místo šipky zobrazil kurzorový kříž. Hodnoty odpovídající poloze kurzorového kříže jsou zobrazeny pod spektrem. Kurzorovým křížem lze pohybovat pomocí myši, případně pomocí směrových šipek

-30-

z klávesnice. Pokud chceme přiřazovat ke spektru textové popisy poloh maxim (minim) pásů, je třeba kliknout na ikonu označenou „T“. K roztahování, resp. zužování spektrální oblasti stejně jako k posuvu spektra v okně slouží šipky zobrazené vpravo od ikony „T“ (Obr. 20). Obdobně lze použít svislé čáry zobrazené na zmenšeném obrázku spektra v tomtéž řádku. Pokud budete potřebovat využít další funkce software, obraťte se na vyučujícího asistenta. 7. Ukončení práce s měřicím přístrojem i řídicím počítačem Po ukončení zpracování spekter v programu Omnic uzavřeme tento program. Přímo na počítači lze zpracovávat protokol (programy MS Word a MS Excel) a též konfrontovat interpretaci spekter s programem Omnic Interpretation Guide. Po ukončení práce počítač nevypínejte do pokynu asistenta, aby nedošlo k poruše při sdílení souborů a tiskárny mezi jednotlivými počítači v síti. 8. Analýza pevného vzorku technikou ATR Kromě měření v kyvetě/(držáku), umístěné(m) v kyvetovém prostoru tak, že vrstvou měřené látky prochází IČ-záření, lze měřit spektra týchž látek reflexní technikou ATR. Nejprve vyjměte základní desku s držákem kyvet (drží v kyvetovém prostoru na magnetech – Obr. 21) a místo ní vložte základní desku s ATR nástavcem (Obr. 22). Po správném usazení desky s ATR nástavcem v kyvetovém prostoru se objeví na monitoru počítače upozornění, že bylo vloženo jisté zařízení (accessory), pro které je třeba vybrat z rozrolovávací nabídky vhodný experiment. Zvolte dle pokynů vyučujícího experiment nazvaný „MIRacle―. POZOR! Výměnný blok vždy uchopte za základní desku, NIKDY jej NEBERTE za tělo ATR nástavce !!! (viz Obr. 21) Při uchopení za blok ATR nástavce hrozí jeho optické rozjustování, neboť v bloku nástavce jsou umístěny dva předjustované šrouby pro přesné nastavení dvou zrcadel. První zrcadlo odráží vstupní paprsek na krystal, na jehož plochu se umisťuje vzorek. Druhé pak směruje paprsek odražený od krystalu k detektoru přístroje. Taktéž krystal je přednastaven do optimální polohy. Případné dojustování nástavce provádějte pouze podle instrukcí vyučujícího asistenta a za jeho dozoru. Změřte spektrum pozadí se samotným ATR nástavcem. Poté naneste na krystal kopistou takové množství měřené látky, aby byla pokryta plocha krystalu. Buď pomocí kopisty, nebo přítlačného nástavce (Obr. 22) přimáčkněte vzorek ke krystalu. Změřte spektrum vzorku a uložte jej. Poté zakápněte vzorek několika mikrolitry vhodného těkavého rozpouštědla (methanol, aceton, chloroform atd.) a rozpouštědlo nechte odpařit za sledování spektrálních změn v režimu „preview data collection―. Pokud vymizely charakteristické pásy rozpouštědla, spusťte vlastní záznam spektra. Po jeho naměření a uložení zopakujte ještě jednou záznam spektra a opakovaně naměřená spektra porovnejte. Poté jemným vatovým tamponem navlhčeným v acetonu či chloroformu odstraňte tenký film vzorku z povrchu krystalu i okolní kovové plochy ATR nástavce. Na krystal pak nakápněte maximálně dvě kapky chloroformu či acetonu a odsajte jej vatičkou tak, aby pouze špička vaty se dotkla krystalu (jemná vata krystal neodře na rozdíl od násady). Nakápnutí rozpouštědla, lehké otření vatičkou a odpaření zbytku minimálně třikrát zopakujte, tak aby při spuštění „preview― po kliknutí na ikonu „Col Smp“ nebyly patrné žádné spektrální rysy

-31-

ani předchozího vzorku (nedostatečné propláchnutí rozpouštědlem) ani rozpouštědla (je třeba vyčkat úplného odpaření). Teprve poté lze přistoupit ke změření spektra dalšího vzorku.

Přítlačné zařízení

ATR krystal

Obr. 22 Nástavec s ATR krystalem a přítlačným zařízením

Po změření všech vzorků ATR technikou a po následném očištění krystalu opatrně vyjměte ATR nástavec z kyvetového prostoru (Obr. 21). Vložte do kyvetového prostoru zpět základní desku se základním držákem pro měření v transmisním modu. Na monitoru počítače se po vyjmutí ATR nástavce objeví upozornění, že zařízení (accessory) bylo odstraněno, a že je třeba zvolit vhodný experiment. Zvolte experiment s názvem „Default-Transmittance―. 9. Analýza pevného vzorku technikou DRIFT Spektra vzorků sypké povahy nebo s porézním povrchem je možné měřit technikou difusní reflexe. Nejprve je však třeba změřit spektrum pozadí, kdy do DRIFT nástavce (umístěného v kyvetovém prostoru přístroje) zasuňte držák s pozlaceným zrcátkem. Během záznamu pozadí můžete do druhého držáku vzorků („kalíšku―) pomocí nerezové kopisty umístit přiměřené množství vzorku, tak aby bylo zcela pokryto dno kalíšku a vzorek při tom nepřesahoval horní okraj kalíšku. Tato jednoduchá příprava vzorku mnohdy znamená, že zaznamenané spektrum („Collect Sample―) bude obsahovat řadu deformovaných pásů a úroveň šumu bude poměrně vysoká. Pro zlepšení kvality zaznamenávaného spektra často pomůže prosté rozetření vzorku v achátové misce před jeho převedením do měřicího kalíšku. Takže pro další měření rozetřete odpovídající množství vzorku v achátové třecí misce. Při nízké intenzitě difusně reflektovaného záření je vhodné vzorek „zředit― smísením a rozetřením s „neabsorbující matricí― – obvykle s bromidem draselným. Hmotnostní poměr -32-

vzorku vůči bromidu použitelný pro většinu vzorků se pohybuje v rozmezí 1:5 až 1:10. V uvedeném poměru proto v achátové misce zhomogenizujte vzorek a KBr, homogenní směsí pak naplňte měřicí kalíšek. Spektra zaznamená pro neupravený vzorek, pro jemně rozetřený vzorek a pro vzorek naředěný KBr vzájemně porovnejte, proveďte jejich srovnání s databází spekter a přiřaďte klíčové pásy.

Kalíšek Zlaté zrcátko

Prostor pro sypký vzorek

Obr. 23 DRIFT nástavec s držáky vzorků a referenčním zlatým zrcátkem

10. Analýza pevného vzorku v KBr tabletě Nejprve navažte cca 0,5 mg (0,3 – 0,8 mg) vzorku a převeďte je do achátové třecí misky. Pak navažte 230 – 250 mg KBr a přidejte jej do achátové třecí misky. Důkladně směs rozetřete a homogenizujte. Homogenizovanou směs převeďte do lisovacího přípravku a uzavřete ocelovým pístem. Poté alespoň dvě minuty evakuujte vnitřní prostor přípravku naplněný homogenizovanou směsí pomocí připojené membránové vývěvy. Následně za stále probíhající evakuace stlačte na hydraulickém lisu ocelový píst a tlak nechte za stálého odsávání vzduchu působit alespoň 2 minuty. V této době změřte spektrum pozadí a pak vyjměte pomocí speciálního přípravku vylisovanou tabletu a umístěte ji do držáku tablet. Držák (Obr. 24) i s tabletou pak zasuňte do kyvetového prostoru spektrometru a proveďte změření vzorku. Obdobným způsobem připravte a zanalyzujte i tabletu ze samotného KBr a případně proveďte odečet takto získaného referenčního spektra.

-33-

Obr. 24 Držák tablet

-34-

Interpretace spekter a j e j i c h d a l š í z p r a c o v á n í Vaším úkolem je určit u jednotlivých změřených vzorků, o jaké typy látek se jedná a jaké obsahují funkční skupiny. Na základě infračerveného spektra asi nezjistíte, že se jedná např. o toluen, ale měli byste ze spektra poznat, že se jedná o organickou látku, která obsahuje monosubstituované benzenové jádro, a že substituentem je skupina alkylová. Při interpretaci použijte charakteristických vlnočtů vibrací funkčních skupin (Tabulka I - v příloze) , grafické formy uvedené ve skriptech "Analytické tabulky" (J. Fogl, K. Volka, str. 156, SNTL, Praha 1985) a instalovaný program Omnic Interpretation Guide, jehož zástupce je na základní obrazovce (program je součástí programové skupiny OMNIC). Při vlastní analýze dodržujte tento postup: a) Odečtěte ze spektra polohu maxim významných absorpčních pásů a jejich relativní intenzitu. Popis uveďte do spektra a též uspořádejte do tabulky. b) Přiřaďte pozorované absorpční pásy jednotlivým funkčním skupinám. Začněte s nejvýraznějšími absorpčními pásy v oblasti 3700 - 2700 cm-1, pokuste se nejprve zjistit typ skeletu (aromatický, alifatický nasyc., nenasyc. atp.) a pak analyzovat možné substituenty. Nezapomeňte, že poloha absorpčních pásů některých skupin je závislá na přítomnosti ostatních funkčních skupin v molekule. Výsledky je proto vždy nutno konfrontovat. Je např. nevhodné uvažovat o přítomnosti aryl-ketonické skupiny z polohy absorpčního pásu valenční vibrace C=O, pokud jste neprokázali přítomnost aromátu na základě jeho absorpčních pásů. Prokázané přiřazení stručně zdůvodněte a zapište do tabulky vlnočtů pozorovaných absorpčních maxim. c) Častou chybou při málo pečlivé práci je nedokonalé vypláchnutí kyvety, omytí okének mezi jednotlivými vzorky, příp. nedostatečné očištění ATR krystalu. Výsledkem je pak spektrum směsi, které budete těžko interpretovat. Všímejte si proto, zda se vám silné absorpční pásy ve spektru předchozího vzorku neobjevují znovu jako slabší pásy ve spektrech následně měřených látek. V tomto případě je jediným možným řešením zopakovat příslušná měření. Pozn. Je třeba ještě jednou upozornit, že se nesnažíme přiřadit za každou cenu všechny pásy ve spektru. Především v oblasti tzv. „otisku palce― (cca pod 1300 cm-1) nalezneme pásy, které nelze přiřadit dílčím funkčním skupinám, ale jsou charakteristické pro molekulu jako celek. Tyto pásy lze využít pro identifikaci látek s využitím knihoven spekter.

-35-

Použitá a doporučená literatura 1. 2. 3.

4. 5.

B. Strauch: „Možnosti laserové Ramanovy spektrometrie“ v Nové směry v analytické chemie (J. Zýka, uspořadatel), kap. 8, (str. 171 – 203), svazek III, SNTL Praha 1988. Raman Spectroscopy – http://cctr.umkc.edu/www/w3/dept/physics/ramanderivation.html The Photonics Dictionary Raman effect – http://www.laurin.com/datacenter/dictionary/cd/dr/ramaeffe.htm Raman spectroscopy – http://www.laurin.com/datacenter/dictionary/cd/dr/ramaspec.htm P. Matějka: „Infračervená spektrometrie“ v Návody pro laboratorní cvičení z analytické chemie II (J. Krofta a kol.), VŠCHT Praha 1997 (vydání páté), 2001 (vydání šesté). P. Matějka: „Ramanova spektroskopie― v Návody pro laboratorní cvičení z analytické chemie III, (Matějka P. a kol.), VŠCHT Praha 2002, vydání první.

Přehled symbolů a zkratek E E I k v h p q T α ν ~

energie vektor intenzity elektrického pole intenzita Boltzmannova konstanta vibrační kvantové číslo Planckova konstanta vektor indukovaného dipólového momentu vnitřní souřadnice molekuly teplota polarizovatelnost frekvence vlnočet

CCD „Charge-Coupled-Device― – plošný, obrazový detektor FT Fourierova transformace FTIR infračervená (spektrometrie) s Fourierovou transformací, InfraRed) NIR blízká infračervená (oblast), (Near InfraRed) MIR střední infračervená (oblast) (Middle Infrared) UV ultrafialová (oblast), (UltraViolet) VIS viditelná (oblast), („VISible―) UPS záložní napájecí zdroj (Uninterrupted Power Supply)

-36-

(Fourier

Transform

PŘÍLOHA – INTERPRETACE RAMANOVÝCH SPEKTER Frekvence jednotlivých vibračních modů jsou nezávislé na tom, zda je sledujeme pomocí infračervené či Ramanovy spektrometrie. Odlišnosti v obou typech spekter jsou v intenzitách pásů, které souvisejí s odlišnými výběrovými pravidly pro tyto dva typy vibrační spektroskopie. V níže uvedené tabulce I je přehled vybraných pásů významných typů látek s údaji o relativních intenzitách v Ramanových spektrech. Při hledání v tabulce se předpokládá postup od vyšších vlnočtů k nižším. V rubrice "Další charakteristický pás" je uvedena oblast, ve které se musí vyskytovat spektrální pás (či více pásů) charakteristický pro danou funkční skupinu. V některých případech je odkaz na širší oblast, která je rozdělena na dílčí podoblasti například s ohledem na vliv okolních skupin, větvení skeletu apod. Pokud odkaz na další vlnočet (vlnočtový interval) uveden není, je tím seznam typických pásů významných pro charakterizaci dané funkční skupiny vyčerpán. V případech, kdy se v dané oblasti překrývají pásy více funkčních skupin, je samozřejmě nutné zkoumat všechny možnosti, které pro přiřazení přicházejí v úvahu. Je třeba zvažovat vzájemné překryvy pásů a brát v potaz zastoupení různých funkčních skupin v molekule. Jestliže je daná funkční skupina málo zastoupená v molekule, veškeré její pásy budou slabší vůči dominantnímu typu skeletu či převažujícímu typu funkční skupiny. Tabulka I byla sestavena na základě údajů převzatých z níže uvedených publikací. Při sestavování byl brán zřetel na významné typy funkčních skupin resp. hlavní typy skeletu organických molekul a řada detailních informací byla vynechána. Tato tabulka není určena pro detailní interpretaci Ramanových spekter, jejím účelem je shrnutí pouze základních charakteristik důležitých pro výuku principů Ramanovy spektroskopie, a to však nejen v rámci uvedené laboratorní úlohy. 1/ G. Socrates: Infrared and Raman Characteristic Group Frequencies, J.Wiley, Chichester Third Edition 2001. 2/ N. P. G. Roeges: A Guide to the Complete Interpretation of Infrared Spectra of Organic Structures, J.Wiley, Chichester 1993. 3/ Spectool for Windows 2.1, A Hypermedia Book for Structure Elucidation of Organic Compounds with Spectroscopic Methods, Chemical Concepts, Weinheim 1994.

-37-

Tabulka I Vlnočty charakteristických vibrací některých vazeb a skupin v Ramanových spektrech Vlnočet, cm 1

Intenzita

Přiřazení Funkční skupina

Další charakteristický pás

voda – v organickém rozpouštědle 3760-3580 vw-w νas(H2O) 3640-3500 w-m, br νs (H2O) 1640-1605 vw δ(H2O)

H2O H2O H2O

3640-3500 1640-1605 -

voda – krystalová, rozpouštědlo 3600-3100 m,br ν(OH) 1645-1600 v δ(H2O)

H2O H2O ,

1645-1615 -

alkoholy, fenoly 3670-3580 vw-w, 3600-3400

3600-3150

3200-2500 1440-1310 1400-1260 1260-1170 1215-1100 1150-1070 1090-1000 900-800 900-800 800-750

ν(OH) -OH, izolované 1420-1260 – bez vlivu vodíkových můstků, úzký vw ν(OH) -OH, intramol. H-vazba 1440-1300 – významný vliv intramolekulárních vodíkových můstků, vlnočet koncentračně nezávislý, širší než pro izolované –OH, užší než v případě intermolekulárních můstků vw-w,br ν(OH) -OH, pevné či kapal. l. 1440-1290 – významný vliv intermolekulárních vodíkových můstků , vlnočet s rostoucí koncentrací klesá w, br ν(OH) -OH, pevné či kapal. l . 1440-1290 - chelatovaná –OH skupina m-w δ(COH) terc.-OH, Ar-OH 1260-1100 (pozor na překryv pásů) m-w δ(COH) ROH, R2OH, (prim. a sek.) 1150-1000 m-w ν(CO) Ar-OH m-s ν(CO) R3C-OH, (terc.) 800-750 s-m ν(CO) R2CH-OH, (sekund.) 900-800 s-m ν(CO) R-OH, (primar.) 900-800 s-m ν(CCO) R-OH, (primar.) s ν(CCO) R-OH, (sekund.) s δ (CO) R3C-OH, (terc.) -

karboxylové kyseliny – nedisociovaná forma, izolované molekuly 3580-3500 vw ν(OH) -COOH, monomer neasociované molekuly 1800-1740 w-m ν(C=O) -COOH, monomerní 1380-1280 m-w δ(OH) -COOH, monomerní 1190-1075 w ν(CO) -COOH, monomerní forma -

1800-1740 1380-1280 1190-1075

karboxylové kyseliny – nedisociovaná forma, asociované molekuly 3200-2230 vw-w, br ν(OH) -COOH, dimerní, asoc. 1725-1700 vlnočet s rostoucí koncentrací klesá, intermol. H-vazba 1725-1700 w-m ν(C=O) -COOH, dimerní forma 1440-1395 1725-1700 – nasycené kys., 1710-1680 – nenasycené a Ar kys. 1440-1395 w-m δ(OH)+ ν(CO) -COOH, dimerní forma 1320-1210 1320-1210 v (m-s) ν(CO) -COOH, dimerní forma 970-875

-38-

dimerní forma, někdy dublet 970- 875 m,br γ(OH) -COOH, dimerní forma karboxylové kyseliny – disociovaná forma (anion), asociované molekuly 1655-1540 w νas(COO- ) -COO1440-1335 1440-1335 m-s νs(COO- ) -COOširší pás s raménky (dva až tří píky) aminy – primární 3550-3280 m-w νas(NH2) -NH2 vlnočet s rostoucí koncentrací klesá, intermol. H-vazba, širší pás v případě chemicky čisté látky v kondenzované fázi 3450-3160 vw-w νs(NH2) -NH2 vlnočet s rostoucí koncentrací klesá, intermol. H-vazba, širší pás v případě chemicky čisté látky v kondenzované fázi 1650-1580 w δ(NH2) -NH2 1360-1240 1295-1145 1240-1020 1120-1020

m-w m-w m-s m-w

aminy – sekundární 3500-3300 w 1580-1490 w 1360-1250 1280-1180 1190-1170 1145-1130 750- 700

m-w m-w m m-w w,br

ν(CN) ρ(NH2) ν(CN) ρ(NH2)

ArNH2 RNH2, často překryv pásů RNH2, často překryv pásů ArNH2, často překryv pásů

ν(NH) -NHδ(NH) -NH pro ArNH riziko překryvů ν(CN) Ar2NH, Ar-NH-R ν(CRN) Ar-NH-R νas(CNC) R2NH νs(CNC) R2NH ω(NH) -NH-

3450-3160 vliv menší než u –OH 1650-1580 vliv menší než u –OH Ar: 1360-1240 R : 1295-1145 1120-1020 1240-1020 1120-1020

1580-1490 R: 1190-1170 Ar:1360-1250 1280-1180 1145-1130 1145-1130 -

amidy - primární 3540-3320 m-w ν as(NH2) -CO-NH2 3420-3180 nižší vlnočet při vlivu H-vazby, širší pás v případě chemicky čisté látky v kondenzované fázi 3420-3180 m-w νs(NH2) -CO-NH2 1690-1640 nižší vlnočet při vlivu H-vazby, širší pás v případě chemicky čisté látky v kondenzované fázi 1690-1640 m-w ν(C=O) -CO-NH2, amid I 1640-1590 1640-1590 w-m δ(NH2) -CO-NH2, amid II 1420-1400 1420-1400 m ν(CN) -CO-NH2, amid III 1170-1130 1170-1130 vw ρ(NH2) -CO-NH2, nezřetelný 600-550 600- 550 m δ(N-C=O) -CO-NH2 amidy - sekundární 3460-3270 m-w ν(NH) -CO-NH-, trans širší pás v případě chemicky čisté látky v kondenzované fázi 3180-3140 m-w ν(NH) -CO-NH-, cis 3100-3070 vw svrchní tón -CO-NH-, trans od amid.p.II, velmi slabý, často nezřetelný 1700-1630 w-m ν (C=O) -CO-NH-, amid I 1570-1510 m-w δ(NH) -CO-NH-, amid II

-39-

1700-1665, 3100-3070 1700-1630 1700-1665 1570-1510 1305-1200

ν(CN) -CO-NH-, amid III, cis ν(CN) -CO-NH-, amid III, trans obvykle okolo 1260 cm-1 γ(NH) -NH-CO-, cis γ(NH) -NH-CO-, trans

820-780 770-620

ν(C=O) νas(C-N-C) δ(N-C=O)

-CO-N< -CO-N
870-700 620-570 -

alkyny (alkiny) – alkylacetylény 3340-3280 w-m ν(CH) 2150-2100 s-m ν(C≡C) 1020-905 w-m ν (C-C≡C) 370-220 w-m δ(-C≡C-H)

-C≡C-H -C≡C-H H-C≡C-C -C≡C-H

2150-2100 1020-905 370-220 -

1350-1310 1305-1200

s s

820-780 770- 620

m-s,br w,br

amidy - terciární 1670-1630 w-m 870-700 s 620-570 m

-

alkyny (alkiny) – dialkylacetylény 2260-2190 vs-s ν(C≡C) -C≡Cu symetrické molekuly vs někdy doprovázen pásem okolo 2310 cm-1 alkeny – vinyl a vinyliden deriváty (koncová dvojná vazba) 3120-3050 m ν as(CH2) >C=CH2 3050-2960 m ν s(CH2) >C=CH2 1685-1620 s ν(C=C) >C=CH2 1440-1360 m-s δ(CH2) >C=CH2 pozor na překryvy pásů 1320-1250 m-w δ(CH) >C=CH2 1180-1010 m δ (CH) >CH=CH2 980- 810 w γ(CH) >CH=CH2

3050-2960 1685-1620 1440-1360 1320-1250 1180-1010 980- 810 -

alkeny, cykloalkeny a jejich deriváty – (vnitřní dvojná vazba, dvojné vazby) 3060-2995 m ν(CH) =CHizolované: 1685-1620 konjugované: 1660-1580 1685-1620 s-vs ν(C=C) >C=C<,izolované 1440-1190 1660-1580 s-m ν(C=C) -C=C, konjugované 1440-1190 poloha pásu klesá se stupněm konjugace, konjugace s C=C, Ar, C=O 1440-1340 s-m ν(C=C) cyklické, více C=C vazeb vibrace nenasycených kruhů 1350-1340 w δ(CH) >C=CH-, trisub. 850-790 1350-1260 w-vw δ(CH) -HC=CH-, trans 1000- 910 1295-1190 s-m ρ(CH) -HC=CH-,cis 980- 880 1000- 910 m γ(CH) R-CH=CH-R, trans 630- 430 980- 880 m γ(CH) R-CH=CH-R, cis 730- 660 850- 790 w γ(CH) RR'>C=CH-R'' 730- 660 w γ(CH) R-CH=CH-R, cis 630- 430 w γ(CH) δ(CH) R-CH=CH-R, trans aromatické uhlovodíky 3105-3000 m-s

ν(CH)

Ar

1630-1590

-40-

několik pásů, počet klesá s růstem substituce jádra pro Ar-NO2 deriváty 1. maximum i nad 3105 1630-1590 m-s ν(C=C) Ar, obvykle 1600 1590-1575 1590-1575 v ν(C=C) Ar, 1525-1470 1525-1470 w ν(C=C) Ar, obvykle okolo 1490 1470-1425 1470-1425 w ν(C=C) Ar 1290- 990 interval závisí na typu subst., pro Ar, 1,2,4,5-tetrasubstit., penta- a hexasub.přímý odkaz do oblastí v celkovém intervalu 575- 385 1290-1130 m δ(CH) Ar, 1,4-disubstit. 880- 790 1270-1220 m δ(CH) Ar, 1,2,4-trisubstit. 680- 610 1190-1070 w δ(CH) Ar, 1,2,3,4-tetrasubstit. 585- 565 1170-1120 m δ(CH) Ar, 1,2,3,5-tetrasubstit. 580- 505 1150-1030 m-s δ(CH) Ar, 1,2,3-trisubstit. 670- 500 1140-1020 m-s δ(CH) Ar, 1,2-disubstit. 790-650 1050-990 m-vs δ(CH) Ar, monosubstit. 710-605 1025-990 vs δ(CH) Ar, 1,3-disubstit., 800-660 Ar, 1,3,5-trisubstit. 535-495 880- 790 s γ(CH) Ar, 1,4-disubstit. 800- 660 m-s γ(CH)γ(CC) Ar, 1,3-disubstit. 790- 650 s γ(CH)γ(CC) Ar, 1,2-disubstit. 590- 510 710- 605 m-w γ(CC),γ(CH)Ar, monosubstit. 680- 610 m-s γ(CC) Ar, 1,2,4-trisubstit. 670- 500 s γ(CC) Ar, 1,2,3-trisubstit. 590- 510 m-s γ(CC) Ar, 1,2-disubstit. 585- 565 s γ(CC) Ar, 1,2,3,4-tetrasubstit. 580- 505 v γ(CC) Ar, 1,2,3,5-tetrasubstit. 575- 545 s-vs γ(CC) Ar, pentasubstit. 535- 495 m-s γ(CC) Ar, 1,3,5-trisubstit. 280- 250 470- 420 s-m γ(CC) Ar, 1,2,4,5-tetrasubstit. 415- 385 s-m γ(CC) Ar, hexasubstit. 280- 250 m-s γ(CC) Ar, 1,3,5-trisubstit. alkany, alkylové řetězce 2995-2940 m 2955-2915 m 2895-2840 m-s 2880-2830 m-s 1480-1440 w-m

1470-1440

m

1450-1390

w

1445-1385

m

1395-1345

w-m

1385-1330

w-m

νas(CH3) -CH3 ν as(CH2) -CH2νs(CH3) -CH3 νs(CH2) -CH2δ(CH2) -(C)-CH2, -(O)-CH2(může se překrývat s pásem Ar, -CH3)

2895-2840 2880-2835 1470-1385 1480-1385 1305-1295 (odkaz platí pouze pro –(CH2)nn>2) δd(CH3) -(C)-CH3, -(O)-CH3 1395-1345 (může se překrývat s pásem Ar, -CH2-) δd(CH3) CH3-(C=O)-O-, CH3-N<, 1385-1300 CH3-(C=O)-C-, CH3-(S=O)-Cδ(CH2) - CH2-X, X:-(C=O)-, 785-720 -COOR, -C=C-, -C≡C-, Ar, -CN, NO2, Cl, Br δs(CH3) CH3-(C)-,CH3-(O)1255-1130 dublet typický pro rozvětvení (odkaz platí pouze pro dublet) δs(CH3) CH3-(C=O)-, CH3-(C=O)-O- -

-41-

1370-1310 1360-1320 1340-1300 1305-1295

w-m w w m

1255-1245 1225-1165 1175-1165 1150-1130 1100-1040 1020- 980 930- 925 955- 900 m 900-800 840- 790 785- 750 750- 735 735- 720 495-490 360- 270

m m w w m-s m-s m m-s m vw vw vw m m

δs(CH3) δ(CH) δs(CH3) δ(CH2)

CH3-(N<) -C-H, nasyc. CH3-(S=O)-C–(CH2)nn>2, intenzita roste s n ν(CC) -C(CH3)3 ν(CC) -C(CH3)3 ν(CC) -CH(CH3)2 -CH(CH3)2 ν(CCC) –(CH2)nν(CC) -C(CH3)3 -C(CH3)3 ν(CC), δ(CCH) -CH(CH3)2 skeletální –(CH2)nskeletální -CH(CH3)2 ρ(CH2) -CH2-CHx, x≠2 ρ(CH2) propyl, (CH2)n-(O)-, n>4 ρ(CH2) (CH2)n-(C)-, n>3 skeletální -CH(CH3)2 -C(CH3)3

1100-1040 1225-1165 1020- 980 1150-1130 955- 900 900-800 930- 925 360-270 840-790 750-720 495-490 -

aldehydy 2850-2800

w

2745-2650

s-m

1745-1650

w-m

1440-1325 975- 780

s-m m

ν(CH) -CHO 2745-2650 -1 někdy raménko pásu pod 2745 cm ν(CH) -CHO 1745-1650 efekt Fermiho resonance ν(C=O) -CHO 1440-1325 vyšší hodnota vlnočtu pro nasycené alifatické aldehydy hodnota vlnočtu se snižuje vlivem konjugace C=O vazby s C=C, Ar apod. v okolí δ(CH) -CHO 975-780 γ(CH) -CHO -

thioly 2600-2520 750- 570 410-200

s s v

ν(SH) ν(CS) δ(CS)

-SH -C-SH -C-SH

750-570 410-200 -

fosfiny 2460-2100 1150-965

m-w m-w

ν(PH) δ(PH)

-PH -PH

1150-965 -

isokyanáty 2295-2250 1460-1340 650-580

w s w

νas(N=C=O) -N=C=O, νs(N=C=O) -N=C=O δ(N=C=O) -N=C=O

nitrily 2270-2200

s

ν(C≡N) -C≡N velmi úzký pás

1460-1340 650-580 -

390-340 odkaz platí pouze pro alifatické nitrily

-42-

s

δ (C-C≡N) skeletální

thiokyanáty 2185-2135

m-s

1090-925

1090-925 700-670 660-610

m-s s s

ν(C≡N) -S-C≡N velmi úzký pás νs(S-C≡N) -S-C≡N νas(-C-S-C) -C-S-C≡N νs(-C-S-C) -C-S-C≡N

νas(N=C≡S) -N=C=S νs(N=C≡S) -N=C=S δs(N=C≡S) -N=C=S

1250-925 690-650 -

1370-1160 -

390-340 200-160

isothiokyanáty 2150-1990 m,br 1250-925 s 690-650 s

-C-C≡N -C-C≡N

200-160 -

700-670 660-610 -

β,γ- laktony 1840-1770 1370-1160

m-w w

ν(C=O) ν(CO)

β,γ-laktony β,γ-laktony

estery 1800-1750 1750-1720 1740-1705 1730-1705 1335-1250

m-w m-w m-w m-w m-s

ν(C=O) ν(C=O) ν(C=O) ν(C=O) νas(COC)

1330-1250 1300-1150

m-s m-s

νas(COC) νas(COC)

1200-1130 1200-1180 1165-1100 1160-1050 1150-1080 775- 620

w m-s w w w m

νs(COC) νas(COC) νs(COC) νs(COC) νs(COC) δ(OCO)

vinyl a fenylestery 1310-1250 nasycené estery 1300-1150 -CO-O-, α,β-nenas. estery 1335-1250 Ar-CO-O-R, estery aromátů 1330-1250 -CO-O-, α,β-nenas. estery, 1200-1130 pás širší než u ketonů Ar-CO-O-R, širší než u ketonů 1150-1080 R-CO-O-R, nasyc. 1160-1050 (obvykle širší než u ketonů) R-CO-O-R', α,β-nenasyc. HCOOR 1165-1050 HCOOR 775-620 R-CO-O-R', nasyc. Ar-CO-O-R HCOOR -

ketony 1750-1690 1705-1650 1325-1175

m m-w m-w

ν(C=O) ν(C=O) ν(CC)

1320-1280

m

1225-1075 1170-1095

m m-w

800-700 630-580

m-s s-m

R-CO-R,' nasycené ketony 1325-1175 ArCO-, α,β-nenas. ketony 1320-1280 R-CO-R' 1170-1095 (často obtížně rozpoznatelný) δ(C-CO-C) Ar-CO-Ar(-R), 1225-1075 obecně několik pásů ν(CArC) Ar-COνas(CC(=O)C) R-CO-R', 800-700 několik pásů při delších řetězcích νs(CC(=O)C) R-CO-R' 630-580 δ(CC(=O)C) R-CO-R' -

nitrosloučeniny

-43-

1570-1485 m-w νas(NO2) -NO2 1385-1315 1385-1315 s-vs νs(NO2) -NO2 1180-850 1180- 850 s-m ν(CN) -C-NO2 ------------------------------------------------------------------------------------------------

Poznámka:

(1)

Valenční vibrace νas(CH3) by měla být správně označena νd(CH3). Označení νas se však běžně používá, a bylo proto zachováno i v této tabulce.

Použité zkratky: Intenzita: vs - velmi silná, s - silná, m - střední, w - slabá, vw – velmi slabá, v proměnná, br - široký pás, sh - raménko (anglicky shoulder). Popis vibračních kmitů: ν - valenční, δ - deformační, γ - mimorovinný, ω - kývavý (anglicky wagging), ρ - kolébavý (angl. rocking), as - antisymetrický, s - symetrický, d degenerovaný, amid I - III - označení amidických pásů I - III, vystihující silné spřažení vibrací v amidech, komb.p. - kombinační pásy. R - alkyl, Ar - aryl.

-44-