UNIVERSITAS MERCU BUANA YOGYAKARTA Teknologi Fermentasi dan Enzim
PENGHAMBATAN REVERSIBLE 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Penghambatan kompetitif Penghambatan unkompetitif Penghambatan non-kompetitif Penghambatan campuran Penghambatan substrat Penghambatan alosterik
1. Penghambatan Kompetitif Inhibitor Kompetitif merupakan suatu senyawa yang berikatan dengan enzim bebas, sehingga menghambat pengikat substrat dengan enzim Dapat berupa turunan substrat yang sebenernya atau produknya, senyawa yang mempunyai struktur kimia mirip dengan substratnya
Ex: Asam melonat inhibitor kompetitif asam suksinat Enzim suksinat dehydrogenase, dalam reaksi dehydrogenasi asam suksinat menjadi asam fumarat
Asam melonat mempunyai 2 gugus karboksil seperti halnya asam suksinat dan dapat mengisi sisi pengikatan suksinat pada enzim. Namum reaksi selanjutnya melibatkan pembentukan ikatan ganda dank arena asam melonat tidak sperti assam suksinat, hanya mempunyai satu atom karbon diantara gugus karboksi maka reaksi selanjutnya tidak dapat berlangsung. Ada beberapa model penghambatan kompetitif
Pengaruh dari penghambatan kompetitif tergantung dari : 1. Konsentrasi Inhibitor 2. Konsentrasi Substrat 3. Afinitas relatif substrat dan penghambat pada enzim
Pada konsentrasi substrat rendah, Inhibitor dengan mudah bersaing dengan substrat untuk berikatanh pada sisi pengikat enzim dan derajat penghambatnya besar.
Pada konsentrasi substrat tinggi efek penghambatnya dapat diabaikan. Jadi pada penghambatan kompetitif, efek penghambatnya dapat dikurangi atau bahkan diabaikan dengan meningkatkan konsentrasi substrat.
2. Penghambatan Unkompetitif Inhibitor unkompetitif adalah senyawa yang hanya berikatan dengan kompleks enzim-substratbdan membentuk kompleks enzim-substrat-inhibitor yang tidak aktif Inhibitor tidak berikatan dengan enzim bebas
Pengikatan substrat pada enzim dapat menyebabkan perubahan konformasi pada enzim sebagai terbentuk sisi pengikaan inhibnitor atau inhibitor dapat berikatan langsung substrat yang terikat pada enzim Jadi inhibitor tidak bersaing dengan subtract untuk berikatan pada sisi pengikatan yang sama sehingga pengaruh inhibitor un kompetitif tidak dapat dikurangi dengan menaikkan konsentrasi substrat.
3. Pengahambatan non-kompetitif Inhibitor non-kompetitif adalah senyawa yang dapat berikatan dengan kompleks enzimsubstratatau enzim bebas membentuk kompleks enzim-substrat-inhibbitor atau enzim inhibitor. Substrat dapat berikatan dengan enzim bebas atau enzim yang telah berikatan dengan inhibitor Jadi substrat dan inhibitor berikatan dengan enzim secara acak tidak tergantung satu dengan yang lain Kompleks enzim-substrat-inhibitor yang terbentuk bersifat inaktif.
4. Penghambatan campuran Ada 2 proses pengikatan inhibitor pada enzim : 1. Inhibitor berikatan dengan enzim 2. Inhibitor berikatan dengan enzim-substrat
Dapat bersifat kompetitif, unkompetitif atau non-kompetitif.
5. Pengahambatan substrat. Konsentrasi substrat yang tinggi dapat menghambat pembentukan produk
6. Penghambatan alosterik Memegang peranan penting dalam regulasi metabolik, ex: jalur biosintesa A B C D E Pembentukkan produk yang tidak perlu yaitu kelebihan produk E dapat dicegah dan penyediaan A dapat dijaga dengan penghambatan umpan balik
Produk E bertindak sebagai inhibitor alosterik pada enzim dibagian awal jalur, misal : enzim produk produk E menghambat reaksi perubahan A menjadi B. Inhibitor alosterik adalah inhibitor yang berikatan dengan enzim pada sisi yang jauh dari sisi pengikatan substrat. Penghambatan alosterik, inhibitor mempengaruhi perubahan konformasi yang mungkin dapat merubah karakteristik pengikatan enzim untuk substrat atau karakteristik reaksi berikutnya.
EKSTRAKSI / ISOLASI dan PURIFIKASI ENZIM Mengeluarkan enzim dari sumbernya Perlu dilakukan : memberi manfaat besar dibidang industry, pangan maupun kesehatan. Ilmiah, namun mengandung unsur seni Dasar-dasar pemisahan protein : sifat-sifat protein, meliputi : ukuran atau BM, bentuk, muatan, hirofobisitas, kelarutan, fungsi. Cara isolasi tergantung : sumber enzim
Karakteristik hasil yang diinginkan Karakteristik hasil tergantung : kondisi proses isolasi (pH, suhu, kuat ionik) Kualitas enzim yang dihasilkan ditentukan oleh : aktivitas, stabilitas, tingkat kemurnian, spesifikasi. Kemampuan mengisolasi ditunjukkan dengan : yield (recovery), fold
Yang perlu diketahui atau dilakukan : Letak enzim pada sumber enzim Tentukan tahap-tahap pemurnian yang akan dilakukan ------------ ditentukan oleh tujuan pemurnian : Kemurnian enzim yang diinginkan Jumlah enzim yang diperoleh Aktivitas enzim Yield Pertimbangan ekonomi
Enzim yang larut dalam sitoplasma (berada dalam cairan sel )
Sangat mudah diekstrak Di dalam jaringan tanaman, mikroorganisme Dari tanaman : tergantung tipe sumber enzim Dari tepung biji-bijian : Campur dengan media cair (aseton), diaduk
Dari bag tanaman yang bersifat lunak : Memotong kecil-kecil, dipers, disaring dengan kain saring
Dari daun dan biji-bijian : Digiling, dihomogenisasi atau diblender
Dari mikroorganisme : dengan pengeringan atau mekanik Pengeringan : suhu ruangan, 300C beberapa hari dinding sel permeable bias dengan kering beku. ( lyophilization/freeze-drying)
Enzim yang membran
terikat
dengan
Dipisahkan dari membrane dengan detergen yang memiliki rantai lipophilic, yang akan berikatan dengn enzim pada permukaan hidrofobiknya. Detergen : sodium deoxycholate Triton (polyethyleneglycol) ionic)(umum: triton x-100)
(non
Mekanisme detergen 1. Melepas ikatan membrane 2. Menggantikan kedudukan membrane dengan gugus alifatik atau aromatic dari bagian lipophilic detergen
Ekstraksi Enzim dari tanaman : dengan buffer untuk mempertahankan pH sekitar 7,5 dan kuat ionic 0,1-0,5 M
--------- Fungsi : melindungi enzim terhadap penurunan pH akibat pecahnya sel yang memberikan kondisi asam Kuat ionic untuk stabilitas enzim Macam-macam buffer , ex: buffer tris, glisin, fosfat, (fosfat mampu menstabilkan kebanyakan enzim ) Setelah enzim di ekstrak, homogenate disentrifuge ( mengedap : polisakarida, mengapung: Lemak, supernatant jernih: Enzim)
Tahap selanjutnya : memisahkan enzim dari mono- dan oligo-sakarida, nukleotida, asam-asam amino bebas, sisa-sisa protein protein non enzim --------- dengan mengatur pH hingga TIE enzim Dengan garam ammonium sulfat (mudah larut dalam air ) (presipitasi) ------- Dasar pemikiran : globulin tidak larut dalam larut garam encer Kelarutan globulin turun apabila konsentrasi garam turun, dan sebaliknya. Salting in : terjadinya kenaikan kelarutan protein akibat naiknya konsentrasi garam (pada konsentrasi rendah )
Dialisa : untuk menghilangkan sisa garam melepas partikel larut dengan BM rendah yang tidak dikehendaki, dengan masuknya buffer ke dalam dialisat. Tahap selanjutnya : kromatografi atau elektroforesa. ---------- .untuk purifikasi .mengetahui tingkat kemurnian enzim .mengetahui BM enzim
PEMANFAATAN ENZIM DALAM INDUSTRY PANGAN Amilase – roti tawar Enzim alami kurang terdapat dalam terigu dan tpung lain , untu memperbaiki sifat fungsional adonan roti Digunakan : amylase dari gandum dan barley Gabungan amylase dan protease dari kapang Enzim dari bakteri Tepung terigu : gula hanya 0,5% ( tidak cukup untuk fermentasi sukrosa yagn kuat, yang menghasilkan adonan yang baik dan vol roti yang besa
• -------- penambahan gula akan difermentasi terlalu cepat, sehingga nilai gizi dan gas hilang • -------- α amylase : menjaga konstantanya pembentukan maltose ( senyawa yang akan di gunakan oleh ragi untuk membentuk gas karbondioksida dan etanol (dr Asp oryzae ) • --------β amylase (dalam terigu ): membantu pemecahan padai jadi maltosa
Enzim proeolitik : untuk mempersingkat waktu pengadukan (pengulenan ) adonan (manual 1 jam, mesin 10-15menit, dengan enzim Prot < 10 menit) --------- modifikasi tepung terigu (hard wheat ) (port 12,5%, k.a 12% ), ditambahkan air 60 liter, enz prot 2 tablet Fermex MT, diaduk 1 jam suhu 110 0F perlahan, bubur kmdn di homogenisasi, dikeringkan dengan spray dryer . Enzim proteolitik akan berhasil bila dicampuri enzim amylase dan memberikan pewarnaan baik Enzim proteolitik : papain, fisin, bromelin Fermex MT, Rhozyme A-4 : camp enzim proteolitik dan amylase (dipasaran)
