UNIVERSITAS MERCU BUANA YOGYAKARTA TEKNOLOGI FERMENTASI DAN ENZIM
BAB X PENGUNDUHAN DAN PEMURNIAN PRODUK Untuk produk dengan biaya besar perlupemilihan proses yang tepat dan efisien Hal yang perlu diperhatikan dalam pemilihan proses pengunduhan dan pemurnian produk: 1. Lokasi produk yang diinginkan ( Intraseluler/ekstra seluler) 2. Proses fermentasi yang dilaksanakan (kultur padat/cair) 3. Karakteristik fisiko-khemis produk 4. Kosentrasi produk dalam cairan fermentasi ( biasanya rendah ) 5. Kandungan substransi lain dalam cairan 6. Bentuk produk yang diinginkan (padat, cair, atau Kristal) 7. Kemurnian produk 8. Nilai ekonomis produk
Pengunduhan dan pemurnian tidak lepas dari proses sebelumnya mengacu pada kemudahan pengunduhan dan pemurnian produk fermentasi antara lain : 1. Seleksi mikroorganisme Pilih yang bersifat flokulan untuk memudahkan pemisahan sel dari cairannya
2. Modifikasi kondisi fermentasi untuk mengurangi metabolit yang tidak diinginkan 3. Ketepatan waktu pengunduhan 4. Pengendalian pH dan suhu setelah pengunduhan 5. Penambahan flokulan/immobile 6. Penggunaan enzim perusak dinding sel
SEPARASI MEKANIS 1. Pengapungan Merupakan cara pemisahan yang didasarkan perbedaan aktifitas permukaan dari suatu substansi ( yang berupa mikrooorganisme, makromolekul, spt protein, atau koloidal ) yang secara selektif diadsorbsi atau ditarik kepermukaan olejh gelembung-gelembung yang diintroduksikan dari bagian bawah. Substansi yang dipisahkan akan mengumpul di permukaan dan kemudian dipisahkan melalui over flow. Pemisahan dapat dilakukan dengan bantuan surfaktan ( mis asam lemak, amina atau senyawa ammonium ) Variable yang berperanan : • pH • Kecepatan Udara • Kosentrasi surfaktan • Ratio surfaktan : substansi yang di apungkan
Pemisahan B.coli dengan konsentrasi awal 7,2 x 108 sel/ml menggunakan asam laurat stearilmina atau toktilamina mengahsilkan pemisahan 90% dalam waktu 10 menit
2. Presipitasi Digunakan penambahan senyawa yang mampu membentuk senyawa kompleks atau garam tidak larut a. Isolasi teramisin digunakan senyawa ammonium rantai panjang untuk proses presipitasi yang dilanjutkan dengan filtrasi b. Polimer dengan BM tinggi (dekstran dan polietilen glikol ) digunakan untuk presipitasi protein c. Salting out protein digunakan untuk memperoleh fraksi protein dengan menggunakan agensia ammonium dan sodium sulfat d. Solvent organic (methanol, etanol, aseton) sering digunakan untuk presipitasi dekstran
3. Sedimentasi Merupakan cara pemisahan berdasarkan gaya gravitasi . Berlaku hokum STOKE yang menyatakan bahwa kecepatan sedimentasi partikel yang tersuspensi dalam cairan yang bersifat Newtonian adalah proporsional dengan kuadrat diameter partikel.
V D g Pp Pf µ
= Kecepatan sedimentasi (m/dt) = diameter partikel mikroorganisme (m) = gaya gravitasi (m/dt2) = densitas parikel mikroorganisme (kg/m3) = densitas liquid (kg/m3) = viskositas liquid Apabila partikel tersuspensi dalam larutan dengan viskositas tinggi, maka gerakan partikel turun kebawah akan diimbangi dengan gerakan liquid ke atas
4. Sentrifugasi Pemisahan yang didasarkan oleh adanya perbedaan bobot jenis masing-masing komponen oleh adanya gaya sentrifugal Pemisahan dengan sentrifugal dilakukan bila : 1. Perbedaan bobot jenis masing-masing komponen tidak jauh berbeda 2. Pemisahan sulit dilakukan dengan cara penyaringan 3. Sel mikroorganisme atau padatan tersespensi harus bebas dari filter aids 4. Diperlukan pemisahan secara kontinyu dengan tujuan untuk memperoleh standard higienis yang tinggi
5. Filtrasi / penyaringan Merupakan cara pemisahan partikel dari cairannya menggunakan medium porous Hal-hal yang harus diperhatikan : a. Viskositas dan denditas filtrate b. Sifat partikel (bentuk, ukuran, karakteristik, dan distribusi ukuran ) c. Rasio solid : liquid d. System produksi (batch / continue ) e. Skala produksi f. Kondisi aseptis /non aseptis g. Tekanan yang perlu diperhatikan
Proses filtrasi dapat berlangsung bila ada force yang dikenakan pada system yang berupa perbedaan tekanan inlet dan outlet Pada prinsipnya ada 3 cara : 1. Berdasarakan gaya gravitasi 2. Pengisapan ( filtrasi vakum ) 3. Penekanan ( filtrasi tekan ) Resistensi dapat terjadi selam proses filtrasi oleh filter dan cake yang terbentuk. Pembentukan cake semakin akan menyebabkan penurunan kecepatan filtrasi.
Untuk memperbaiki proses filtrasi dapat ditambahkan filter aids untuk mencegah penyubatan filter. Filter Aids yang umum di gunakan adalah Kieselghur (tanah diatomae) Cara penggunaan filter aids: a. Dibuat lapis tipis filter aids sebelum dilakukan filtrasi b. Filter aids dicampur pada cairan yang akan di filtrasi
Disprupsi (Penghancuran Sel)
Dilakukan untuk mengeluarkan isi sel mikroorganisme. Metode yang digunakan harus menjamin tidak menyebabkan kerusakan (denaturasi) substansi dan tidak menyebabkan terjadinya reaksi yang merugikan (mis hidrolisa ) Metode disrupsi sel : 1. Metode fisiko mekanis : liquid shear, solid shear, abrasive agitasi, freeze thawing. 2. Metode khemis : penggunaan detergen, shock osmosa, perlakuan alkali dan enzim.
1. Liquid shear
Digunakan homogenizer bertekanan tinggi hingga 550 kg/cm2 pada suspense yeast 60 % dilakukan pendinginan sampai 0,40c untuk mengurangin terjadinya kehilangan aktifitas enzim oleh panas yang di hasilkan selama homogenisasi
2. Solid shear
Ekstraksi mikroorganisme beku (-250c) bertekanan melalui orifice. Pengahancuran sel terjadi akibat kombinasi liquid shear melalui orifice dan adanya Kristal-kristal es.
3. Abrasive agitasi Pengahancuran sel secara mekanis dengan menggunakan disintegrator. Suhu dapat mencapai 350C, perlu diperhatikan aktifitas enzim yang dihasilkan. 4. Freeze thawing Pembekuan dan pencairan pada sel yang menyebabkan penghancuran sel. Proses berjalan lambat dan hanya terbatas substansi seluler saja. Enzim β –galaktosidase dapat dipisahkan dari sel S. cerevisae dengan cara sampel uyeast beku dibiarkan 10 jam pada 50C selama pencarian. Proses dilakukan paling sedikit 5 kali.
5. Penggunaan detergen
Detergen akan merusak lipoprotein sel membrane mikroorganisme sehingga komponen entraselullar keluar. Senyawa yang digunakan : ammonium, sodium lauri, sulfat tween. Detergen dapat menyebabkan protein mengalami denaturasi sehingga perlu dilakukan pemisahan lebih dulu sebelum dilakukan pemurnian lebih lanjut. Disuspensikan dengan buffer pH6, tambahkan 1 % sodium kholat campuran diaduk selama 1 jam sehingga sebagian besar enzim larut.
6. Shock osmotic
Diakibatkan oleh perubahan mendadak konsentrasi garam sehingga menyebabkan pengahancuran sel. Cara ini dapat diterapkan pada ektraksi enzim lusifarase dari photobacterium fischeri
7. perlakuan dengan alkali Dapat digunakan untuk hidrolisa dinding sel mikroorganisme yang toleran terhadap pH 11,5 12,0 selama 20-30 menit. Cara ini digunakan untukn isolasi enzim aspariginase. 8. Perlakuan dengan enzim
Enzim mempunya kemampuan menghidrolisa ikatan dalam sel mikroorganisme. Enzim yang dimaksud mis lisosim dan ekstrak enzim dari leukosit, enzim dari Streptomices, Micromonospora, Penicilium, Tricoderma. Metode relatif sederhana tetapi perlu biaya tinggi dan relative suliit dalam proses pemurniannya.
SEPARASI SYSTEM KESEIMBANGAN 1. Ekstraksi liquid-liquid Merupakan pemisahan komponen dari campurannya dengan solvent yang melarutkan komponen tersebut. Diisyaratkan agar dapat diperoleh produk terekstrak yang berkadar tinggi dalam solvent yang kecil. Sebelum dilakukan ekstraksi dalam skala besar perlu diketahui lebih dulu solibilitas karakteristik produk skala kecil menggunakan berbagai solvent. Pedoman yang digunakan like dissolved like (dalam artian polaritas molekul ) Solvent dari senyawa non polar adalah liquid dengan polaritas rendah atau nol, sebaliknya solvent untuk senyawa polar ada liquid dengan polaritas tinggi. Konstanta dielektrik merupakan ukuran derajat polarisasi dari senyawa. Jika nilai ini deiketahui maka kemungkinan untuk meramalkan seuatu senyawa polar atau non polar.
2. Destilasi Merupakan pemisahan komponen dari campurannya yang didasarkan atas perbedaan titik didih masing-masing komponen.v Tahapan proses destilasi : 1. Evaporasi campuran 2. Pemisahan vapor liquid dalam kolom sehingga terpisahkan komponen dengan titik didih rendah dari komponen dengan titik didih tinggi. 3. Kondensasi uap untuk memperoleh destilat.
PURIFIKASI / PEMURNIAN Pemurnian dapat dilakukan dengan cara : 1. Khromatografi adsorbs 2. Ion exchange 3. Filtrasi gel 4. Afinitas
1. Khromatografi Adsorbsi Melibatkan pengikatan solu pada fase-fase solid oleh ikatan vander wals. Kolom yang digunakan berisi adsorben (karbon aktif, alumunium oksida, alumunium hidroksida, magnesium oksida, silica gel) dan resin makroporous. Dihidroksi streptomisin dapat diekstraksi dari cairannya menggunakan kolom charcoal, kemudian dielusi dengan asam hidroklorit metanolat untuk selanjutnya dimurnikan. Karbon aktif digunakan untuk menghilangkan pigmen atau menjernihkan cairan fermentasi. Resin digunakan untuk memurnikan cephalosporin, desferioksamin, dan parametason.
2. Ion Exchange Merupakan cara pemurnian dengan perubahan ion yang reversible antara fase liquid dengan fase solid yang tidak diikuti dengan perubahan radikal dalam struktur solid. Dikenal ion exchange resing yang mempunyai komponen utama divinil stiren kopolimer yang mengikat grup reaktif, sehingga memberikan sifat kationik atau anionic exchange. Resin kationik umumnya mengandung asam sulfonat asam karboksilat atau asam fosfat. Resin anionic mengandung amina, ammonium. Dalam pemurnian streptomisin, cairan fermentasi dilewatkan keresin kation seperti amberlite IRC-50. Antibiotic ini akan diadsorbsi kan ke kolom
3. Filtrasi Gel
Merupakan proses filtrasi dengan solute BM tinggi akan bertahan pada filter yang mempunyai pori-pori sangat lembut, sedang solvent dan solute dengan BM rendah akan lolos tersedia membrane dengan BM 500 – 500.000, sehingga dimungkinkan untuk melakukkan pemisahan makromolekul seperti protein, enzim, hormone.
4. Afinitas Teknik pemisahan ini sangat potensial untuk berbagai tujuan karena dapat memisahkan dan memurnikan molekul biologis. Teknik ini didasarkan pada fungsi dan struktur kimia suatu senyawa biologis. Teknik ini tergantung dari interaksi antara senyawa biologis dan pasangannya seperti enzim, substrat, inhibitor, antigen, antibody. Molekul yang akan dimurnikan secara spesifik diadsorbsi oleh ligan yang diimobilisasi pada metik. Ligan dapat terikat pada matriks secara adsorbs atau khemis.
KRISTALISASI Kristalisasi merupakan cara pemisahan yang banyak digunakan dalam produksi asam organic dan asam amino. Pada produksi asam sitrat, cairan fermentasi ditambahkan kalsium hidroksida dengan tujuan presipitasi Ca-sitrat. Kristal Ca-sitrat kemudian difiltrasi dan direaksikan dengan sulfat tak larut sehingga akan dibebaskan asam sitrat kembali. Larutan asam sitrat kemudian dikristalisai
PENGERINGAN
Pengeringan merupakan cara pemisahan system solid-luquid dengan cara menguapkan liquidnya (atau airnya) . pengeringan dapat dilakukan dengan cara spray drier untuk material biologis sehingga produk yang diperoleh tidak mengalami kerusakan. Bila material yang dikeringkan bersifat stabil terhadap pemanasn, digunakan pengeringan dengan drum drier yang mempunyai efisiensi tinggi.
Keuntungan yang diperoleh dangan pengeringan : Mengehemat ongkos transport. 2. Material yang diperoleh mudah ditangani dan dikemas. 3. Tidak memerlukan fasilitas penyimpanan khusus. 1.
