UJI KINERJA SPEKTROFOTOMETER ULTRAVIOLET-TAMPAK BERKAS GANDA TERHADAP PENGUKURAN AMBROKSOL HCl PADA TABLET EKSPEKTORAN
ACEP SUDARMAN
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
ABSTRAK ACEP SUDARMAN. Uji Kinerja Spektrofotometer Ultraviolet-Tampak Berkas Ganda Terhadap Pengukuran Ambroksol HCl pada Tablet Ekspektoran. Dibimbing oleh PURWANTININGSIH SUGITA dan MUJI HARJA. Uji kinerja spektrofotometer ultraviolet-tampak (UV-Vis) berkas ganda terhadap pengukuran ambroksol HCl pada tablet ekspektoran meliputi 2 tahap pengujian. Tahap pertama meliputi uji akurasi panjang gelombang, deviasi serapan, resolusi, derau, kerataan baseline, stabilitas sinar, akurasi fotometri, dan linearitas instrumen. Tahap kedua ialah validasi metode, meliputi penentuan kadar sebenarnya ambroksol HCl pada tablet ekspektoran, uji linearitas, limit deteksi, limit kuantitasi, akurasi, dan presisi. Hasil uji kinerja instrumen menunjukkan deviasi panjang gelombang < 0.6 nm sesuai dengan standar NIST-SRM 2034; tidak ada deviasi serapan sinyal karena absorbans pada panjang gelombang cutoff > 2.000 (standar European Pharmacopeia); resolusi 1.8 nm; derau < 0.0001 (standar ASTM); kerataan baseline baik dengan fluktuasi sinyal < 0.002; stabilitas sinyal baik dengan serapan kuvet < 0.00200; akurasi fotometri baik karena absorbans terukur tidak berbeda nyata dari absorbans teoretis (standar NIST-SRM 1935), dan nilai regresi > 0.9970 yang disyaratkan oleh ICH. Hasil uji validasi metode menunjukkan regresi linear 0.9981, limit deteksi 0.0028 mg/mL, limit kuantitasi 0.00836 mg/mL, akurasi 101.01– 101.24% dengan batas akurasi menurut ICH 98–102%, simpangan baku uji keterulangan 0.06% dan uji ketertiruan 0.23%, masih memenuhi syarat ketelitian AOAC maksimum 1%. Berdasarkan hasil tersebut, spektrofotometer UV-Vis berkas ganda masih layak digunakan untuk melakukan analisis ambroksol HCl dalam sediaan tablet ekspektoran. ABSTRACT ACEP SUDARMAN. Performance Test of Double Beam Ultraviolet-Visible Spectrophotometer on Ambroxol HCl's Measurements in Expectorant Tablet. Supervised by PURWANTININGSIH SUGITA and MUJI HARJA. Performance test of double beam ultraviolet-visible (UV-Vis) spectrophotometer on ambroxol HCl’s measurement in expectorant tablet included two steps. The first test included wavelength accuracy, stray light, resolution, noise, baseline flatness, light stability, photometric accuracy, and linearity tests of the instrument. The second test was validation method, including determination of the actual content of ambroxol HCL in expectorant tablet, linearity, limit of detection, limit of quantitation, accuracy, and precision tests. The results of instrument performance test showed deviation of wavelength accuration < 0.6 nm, fulfilling the NIST-SRM 2034 standard; no stray light because the absorbance in cutoff wavelength > 2.000 (European Pharmacopeia standard); good baseline flatness with signal fluctuation < 0.002; resolution 1.8 nm; noise < 0.0001 (ASTM Standard); good signal stability with cuvette absorbance < 0.00200; good photometric accuracy because measured absorbance showed not significant difference from the theoretical value (NIST-SRM 1935 Standard), and regression value > 0.9970, eligible with ICH qualification. The results of the method validation tests showed linear regression of 0.9981, limit of detection 0.0028 mg/mL, limit of quantitation 0.00836 mg/mL, accuracy 101.01–101.24% fulfilling the ICH recommendation 98–102%, standard deviation of repeatability test 0.06% and 0.23% for reproducibility test, still qualified the AOAC criteria of 1%. Based on the above result, double beam UV-Vis spectrophotometer can still be used for ambroxol HCl analysis in expectorant tablet preparation.
UJI KINERJA SPEKTROFOTOMETER ULTRAVIOLET-TAMPAK BERKAS GANDA TERHADAP PENGUKURAN AMBROKSOL HCl PADA TABLET EKSPEKTORAN
ACEP SUDARMAN
Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
Judul Skripsi Nama NIM
: Uji Kinerja Spektrofotometer Ultraviolet-Tampak Berkas Ganda Terhadap Pengukuran Ambroksol HCl pada Tablet Ekspektoran : Acep Sudarman : G44076029
Disetujui Pembimbing I
Pembimbing II
Prof Dr Purwantiningsih Sugita, MS NIP 196312171988032002
Muji Harja S Farm, Apt NIP 198202022010011019
Diketahui Ketua Departemen Kimia
Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS NIP 9501227 197603 2 002
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis haturkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga skripsi ini berhasil diselesaikan. Penelitian ini berjudul Uji Kinerja Spektrofotometer Ultraviolet-Tampak Berkas Ganda Terhadap Pengukuran Ambroksol HCl pada Tablet Ekspektoran yang dilaksanakan pada bulan Juni 2009 hingga Januari 2010 di PT Guardian Pharmatama Tangerang, Banten. Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof Dr Ir Purwantiningsih Sugita MS dan Muji Harja S Farm, Apt selaku pembimbing yang telah banyak memberikan bantuannya. Terima kasih juga kepada Dra Anni M Wulandari Apt selaku Kepala Pabrik, Dra Rita Luthviana Apt selaku manajer QC, Dian Oktaviani SSi dan Rini Prihatini SSi atas kerja sama dan bantuannya hingga penelitian ini dapat terselesaikan. Semoga tulisan ini bermanfaat bagi semua pihak yang membutuhkan.
Bogor, Maret 2012 Acep Sudarman
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 20 Maret 1985 dari ayah Acip Anda dan ibu Epon Kartika. Penulis merupakan putra pertama dari dua bersaudara. Tahun 1999 penulis lulus dari SMA Negeri 4 Bogor. Penulis kemudian melanjutkan sekolah di Institut Pertanian Bogor pada Program Studi Diploma 3 Analisis Kimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Penulis kemudian bekerja di salah satu pabrik farmasi di tangerang, yaitu PT Guardian Pharmatama sebagai Inspektur Quality Control yang bertugas sebagai pengawas proses produksi. Pada tahun 2007 penulis kembali diterima di Institut Pertanian Bogor pada Program Sarjana Kimia Penyelenggaraan Khusus, Departemen Kimia, FMIPA IPB.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ............................................................................................................ vii DAFTAR GAMBAR ....................................................................................................... vii DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................................... vii PENDAHULUAN ........................................................................................................... 1 TINJAUAN PUSTAKA Ambroksol HCl...................................................................................................... Spektrofotometer UV-Vis Berkas Ganda .............................................................. Uji Kinerja Spektrofotometer UV-Vis Berkas Ganda ........................................... Validasi Metode Penetapan Kadar Ambroksol HCl pada Tablet Ekspektoran .....
1 2 3 5
BAHAN DAN METODE ................................................................................................ 6 Alat dan Bahan ...................................................................................................... Metode Penelitian .................................................................................................. Uji Kinerja Spektrofotometer ................................................................................ Validasi Metode .....................................................................................................
6 7 7 7
HASIL DAN PEMBAHASAN........................................................................................ 8 Hasil Uji Kinerja Spektrofotometer ....................................................................... 8 Hasil Validasi Metode ........................................................................................... 10 SIMPULAN DAN SARAN ............................................................................................. 12 Simpulan ................................................................................................................ 12 Saran ...................................................................................................................... 12 DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................................... 12 LAMPIRAN ..................................................................................................................... 13
vi
DAFTAR TABEL
Halaman 1 Syarat nilai panjang gelombang ................................................................................. 7 2 Pengukuran akurasi fotometri .................................................................................... 7 3 Hasil pengukuran presisi ............................................................................................ 12
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Struktur ambroksol HCl .............................................................................................
2
2 Skema spektrofotometer UV-Vis berkas ganda .........................................................
2
3 Spektrum serapan holmium oksida padat dan cair ....................................................
3
4 Spektrum resolusi spektrofotometer UV-Vis.............................................................
4
5 Spektrum holmium oksida .........................................................................................
8
6 Spektrum serapan KCl dan NaI .................................................................................
8
7 Spektrum hubungan waktu dengan absorbans saat pengujian derau .........................
9
8 Spektrum serapan baseline ........................................................................................
9
9 Spektrum hubungan waktu dengan absorbans saat pengujian stabilitas sinyal ......... 10 10 Spektrum ambroksol HCl .......................................................................................... 11
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Akurasi panjang gelombang ...................................................................................... 14 2 Deviasi serapan sinyal larutan KCl ........................................................................... 15 3 Deviasi serapan sinyal larutan NaI ............................................................................ 15 4 Resolusi...................................................................................................................... 16 5 Derau.......................................................................................................................... 17 6 Kerataan baseline ....................................................................................................... 18 7 Stabilitas sinyal .......................................................................................................... 21 8 Akurasi fotometri ....................................................................................................... 22 9 Linearitas ................................................................................................................... 23 10 Kadar ambroksol HCl pada standar sekunder ............................................................ 24 11 Linearitas metode penentuan kadar ambroksol HCl .................................................. 25 12 Hasil penentuan parameter statistika kurva standar ambroksol HCl.......................... 26 13 Limit deteksi dan limit kuantisasi .............................................................................. 26 14 Perolehan kembali metode pengukuran kadar ambroksol HCl .................................. 27
vii
1
PENDAHULUAN Obat adalah sediaan atau paduan yang siap digunakan untuk mengetahui atau menyelidiki secara fisiologi atau patologi dalam rangka penetapan diagnosis, pencegahan, penyembuhan, pemulihan, peningkatan kesehatan, dan kontrasepsi (Peraturan Menteri Kesehatan No. 917/Menkes/Per/X/1993). Sementara menurut Ansel (1985), obat merupakan zat yang digunakan untuk diagnosis, mengurangi rasa sakit, serta mengobati atau mencegah penyakit pada manusia atau hewan. Secara umum, obat dibagi menjadi 4 golongan. (1) Obat bebas biasanya berupa suplemen, vitamin, obat gosok, beberapa analgesik, antipiretik, dan antasida. (2) Obat bebas terbatas meliputi obat batuk, influenza, penghilang rasa sakit, penurun panas, antiseptik, dan obat tetes mata. Obat jenis ini hanya dapat dibeli di apotek dan toko obat berizin. (3) Obat keras contohnya obat jantung, hipertensi, hormon, dan beberapa antibiotik. Obat ini diperoleh hanya dengan resep dokter dan dapat dibeli di apotek. (4) Golongan psikotropika, diawasi dengan ketat oleh Badan Pengawasan Obat dan Makanan dan hanya dapat dibeli dengan resep dokter asli. Obat batuk banyak ditemui di pasaran. Berdasarkan jenis batuknya, ada 2 jenis, yaitu ekspektoran dan antitusif. Ekspektoran digunakan untuk penderita batuk berdahak (batuk disertai cairan kental yang disebabkan masuknya zat asing melalui tenggorokan). Obat ini dapat meringankan pernapasan, sesak napas, dan terutama serangan asma hebat yang dapat mematikan jika sumbatan lendir sedemikian kentalnya sehingga tidak dapat dikeluarkan (Tjay & Rahardja 2002). Contoh zat aktif yang digunakan adalah ambroksol HCl, amonium klorida, dan gliseril guaiakol. Antitusif digunakan pada penderita batuk kering, yaitu batuk yang tidak disertai cairan (lendir). Obat ini bekerja dengan menekan rangsangan batuk agar tidak berkepanjangan, biasanya menggunakan zat-zat pereda seperti kodein atau noskapin. Ambroksol HCl adalah zat aktif yang banyak ditemui pada obat batuk ekspektoran. Zat ini dapat digunakan dalam sediaan obat cair berupa sirup ataupun sediaan padat berupa tablet untuk dewasa. Jumlah zat tersebut dalam sediaan cair lebih kurang 15 mg/5 mL, dalam sediaan padat sekitar 30 mg/180 mg tablet. Kecilnya jumlah ini mengharuskan pengawasan yang ketat pada proses pembuatannya untuk menjamin mutu
obat yang dihasilkan, yaitu kesesuaian jumlah zat dalam sediaan obat dengan spesifikasi kadar bahan aktifnya. Metode pengujian kimia yang akurat diperlukan agar data yang dihasilkan mendekati nilai sebenarnya. Metode analisis kuantitatif yang baik harus memenuhi beberapa parameter, antara lain teliti, tepat, dapat-ulang, linearitas tinggi, dan limit deteksi-kuantitasi memenuhi syarat. Faktor pendukung sahihnya sebuah metode antara lain analis, instrumen analisis, pereaksi, dan faktor lingkungan. Suatu metode analisis tidak mungkin baik jika faktor-faktor tadi tidak mendukung. Faktor yang cukup penting adalah instrumen analisis. Semakin sering dipakai kinerja alat akan semakin menurun, menyebabkan hasil pengukuran tidak dapat dipercaya. Uji berkala kinerja suatu instrumen analisis diperlukan untuk menghindari galat instrumen. Parameter uji kinerja ini beragam, bergantung pada parameter yang diukur oleh instrumen. Penentuan jumlah ambroksol HCl pada sediaan obat dapat dilakukan menggunakan metode spektrofotometri ultraviolet-tampak (UV-Vis). Metode ini lazim digunakan oleh berbagai pabrik farmasi sebagai standar operasional penentuan ambroksol pada sediaan obat. Prosedur yang mudah dan hasil yang baik menjadi pertimbangannya. Tujuan penelitian ini adalah menentukan kinerja spektrofotometer UV-Vis berkas ganda terhadap pengukuran kadar ambroksol HCl dalam tablet ekspektoran. Tahap pertama ialah pengujian kinerja spektrofotometer dan tahap kedua adalah verifikasi metode pengukuran. Diharapkan hasil penelitian ini dapat menentukan baik-tidaknya kinerja alat.
TINJAUAN PUSTAKA Ambroksol HCl Ambroksol HCl adalah metabolit aktif dari bromheksin dengan rumus struktur 4-(2amino-3,5-dibromobenzilamina)sikloheksanol hidroklorida (Gambar 1). Zat ini banyak ditemukan pada obat batuk ekspektoran sebagai agen sektetolitik yang berfungsi menurunkan viskositas mukus melalui pemutusan serat-serat mukopolisakarida sehingga lendir mudah dikeluarkan lewat bantuan batuk (Tjay & Rahardja 2002). Ambroksol HCl berbentuk kristal putih atau kekuningan, kandungannya dalam bentuk murni 99–101%. Ambroksol HCl larut dalam alkohol, sedikit larut dalam air, dan tidak larut
2 OH Br
H N H NH2
+
menjadi 2 sinar menggunakan cermin berbentuk V; sinar pertama dilewatkan pada blangko, lainnya dilewatkan pada sampel (Underwood & Day 1980) (Gambar 2).
Cl ‐
Br Gambar 1 Struktur ambroksol HCl.
dalam metilena klorida. Nilai pH 4.5–6.0 dan kadar air 0.5%. Bahan pengotor berupa logam berat (maksimum 20 ppm) dan senyawa sulfat (maksimum 0.1%) di dalam 1 g serbuk. Untuk pengujian secara kualitatif, dapat digunakan metode spektrofotometri inframerah dengan cara membandingkan puncak serapan dengan standar. Metode lain adalah kromatografi lapis tipis (KLT) dengan pelarut metanol dan fase gerak campuran amonia:1-propanol:etil asetat:heksana (1:10:20:70 v/v/v/v). Noda kromatogram diamati menggunakan sinar UV 254 nm (British Pharmacopeia 2007). Penentuan kadar ambroksol HCl dapat dilakukan menggunakan titrasi potensiometri, spektrofotometer UV-Vis, atau kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC). Metode titrasi potensiometri mengukur beda potensial sel yang dihasilkan dari reaksi elektrokimia ambroksol HCl dan NaOH. Jumlah ambroksol HCl pada sampel sebanding dengan jumlah NaOH yang digunakan untuk menghasilkan perubahan potensial yang signifikan. Metode spektrofotometri UV-Vis didasarkan atas besarnya radiasi yang diserap pada panjang gelombang tertentu, yang berbanding lurus dengan jumlah ambroksol HCl pada sampel. Sementara untuk HPLC, penentuan didasarkan pada pemisahan ambroksol HCl berdasarkan kepolarannya di antara fase diam dan fase gerak (British Pharmacopeia 2007). Spektrofotometer UV-Vis Berkas Ganda Spektrofotometer banyak digunakan dalam analisis kimia, baik makanan, obat, maupun pertambangan. Analisisnya mudah, cepat, dan cukup akurat. Beberapa instrumen spektrofotometer yang lazim digunakan antara lain spektrofotometer UV-Vis, inframerah, serapan atom dan massa. Berdasarkan sistem optiknya, ada 2 jenis spektrofotometer UV-Vis, yaitu single beam (berkas tunggal) dan double beam (berkas ganda). Perbedaannya adalah perlakuan terhadap sinar radiasi: pada berkas tunggal, radiasi langsung dilewatkan pada sampel, sedangkan pada berkas ganda, radiasi dipecah
Gambar 2 Skema spektrofotometer UV-Vis berkas ganda. Prinsip kerja spektrofotometer UV-Vis ialah interaksi sinar ultraviolet atau tampak dengan molekul sampel. Energi cahaya akan mengeksitasi elektron terluar molekul ke orbital lebih tinggi. Pada kondisi ini, elektron tidak stabil dan dapat melepas energi untuk kembali ke tingkat dasar, dengan disertai emisi cahaya. Besarnya penyerapan cahaya sebanding dengan jumlah molekul, sesuai dengan hukum Lambert-Beer: A=εBC Keterangan: A = serapan ε = absorptivitas molar B = tebal tempat komponen C = konsentrasi komponen (Underwood & Day 1980). Agar hukum Lambert‐Beer berlaku, larutan harus encer; analat tidak boleh terdisosiasi, berasosiasi, atau bereaksi dengan pelarut; radiasi cahaya harus monokromatis (mempunyai 1 macam panjang gelombang), dan larutan tidak boleh keruh (bebas partikel koloid) (Hendayana 1994). Sumber sinar pada spektrofotometer UVVis berdasarkan panjang gelombang terbagi menjadi 2, yaitu lampu deuterium dan tungsten. Lampu deuterium menghasilkan sinar 160–500 nm. Lampu tungsten digunakan di daerah sinar tampak 350–2500 nm, dihasilkan oleh senyawa astiri WI2 yang terbentuk ketika sejumlah kecil iodin yang menyublim bereaksi dengan gas tungsten (Currell 2000). Sumber radiasi dikatakan ideal jika memancarkan spektrum radiasi yang kontinu, intensitasnya tinggi, dan stabil pada semua panjang gelombang. Monokromator berfungsi menghasilkan sinar dengan 1 panjang gelombang. Monokromator terdiri atas beberapa bagian: celah masuk (slit), filter, prisma, kisi, dan celah keluar (Underwood & Day 1980). Kuvet (tempat analit) harus transparan agar sinar dapat berinteraksi dengan analit
3 tanpa berkurang intensitasnya. Kuvet dibentuk dari kaca kuarsa dan kaca silika. Kuvet dari kaca silika banyak dipakai karena dapat digunakan pada panjang gelombang 350–2000 nm (Currell 2000). Detektor berisi katode dan anode fotoemisi yang akan memancarkan elektron ketika dikenai elektron lain. Radiasi foton yang memasuki tabung detektor menyentuh katode dan mengemisikan sebagian elektron. Elektron ini kemudian masuk ke dalam diode pertama, kembali tereksitasi dan berpindah ke diode kedua. Demikian selanjutnya hingga pada akhirnya, di anode terkumpul 106–107 elektron. Elektron ini akan diperkuat oleh penguat sinyal dan arus yang keluar setara dengan konsentrasi analit. Dikenal 2 jenis detektor, yaitu detektor foton dan detektor panas. Sel photovoltaic, phototube, tabung fotopengganda, semikonduktor, dan diode silikon merupakan detektor foton, sedangkan detektor panas termokupel dan bolometer bisa digunakan pada pengukuran radiasi inframerah. Detektor yang sering digunakan adalah rangkaian fotodiode, sebuah detektor foton multikanal yang mampu mengukur sampel pada beberapa panjang gelombang sekaligus secara kontinu (Currell 2000). Kolimator adalah bagian khusus pada spektrofotometer UV-Vis berkas ganda. Fungsinya memecah sinar dari sumber menjadi 2 untuk diteruskan pada jalur masingmasing. Jalur pertama melalui larutan blangko, dan jalur kedua melewati larutan sampel.
deuterium, lampu merkuri, filter holmium oksida, atau larutan holmium oksida dalam HClO4. Sementara BP (British Pharmacopeia) dan EP (European Pharmacopeia) tidak menggunakan filter holmium oksida atau larutan holmium oksida dalam HClO4 (Chan et al. 2004). Holmium(III) oksida (Ho2O3) merupakan senyawa yang bersifat paramagnetik kuat dan menyerap sinar pada rentang panjang gelombang UV maupun tampak (200–900 nm). Holmium oksida tidak larut dalam air, tetapi larut dalam larutan asam (asam perklorat). Larutan dibuat dengan mencampurkan 10% asam perklorat dengan kemurnian 99.99% pada holmium oksida padat hingga konsentrasinya 2, 4, dan 6%. Untuk filter padat, holmium oksida yang digunakan memiliki kemurnian 70–72% dengan ukuran partikel 2 µm (Weidner 1986). Menurut Hellma Corp, perbedaan penggunaan filter holmium oksida padat dan dalam larutan HClO4 ialah pada puncak serapan yang dihasilkan. Filter cair menghasilkan lebih banyak puncak gelombang (Gambar 3).
(a) Uji Kinerja Spektrofotometer UV-Vis Berkas Ganda Akurasi Panjang Gelombang Deviasi panjang gelombang dapat menyebabkan galat yang signifikan pada hasil pengukuran secara kualitatif atau kuantitatif. Sinyal khas absorbans sampel menjadi tidak representatif. Selain itu, sensitivitas dan akurasi hasil pengukuran berkurang karena terjadi pergeseran panjang gelombang maksimum (Chan et al. 2004). Akurasi panjang gelombang pada spektrofotometer UV-Vis berkas ganda dipengaruhi oleh monokromator. Pergeseran kisi monokromator yang tidak sesuai menyebabkan panjang gelombang yang dihasilkan berbeda dari nilai teoretisnya (Currell 2000). Pada panduan standar seperti USP (United States Pharmacopeia) dan JP (Japanese Pharmacopeia), akurasi panjang gelombang dapat diukur menggunakan standar lampu
(b) Gambar 3 Spektrum serapan holmium oksida padat (a) dan cair (b). Deviasi Serapan Sinyal Deviasi serapan sinyal menyebabkan galat pada hasil pengukuran, terjadi karena sinar lain ikut terukur sebagai serapan sinyal sampel oleh detektor. Serapan ini bisa berupa sinar di luar panjang gelombang pengukuran, faktor lingkungan, yaitu suhu, waktu pengukuran, atau faktor komponen instrumen (Chan et al. 2004).
4 Larutan sampel yang lazim digunakan untuk pengukuran ini adalah KCl, NaI, dan NaNO2, pada panjang gelombang berturutturut 200, 220, dan 340 nm. Ketiga larutan ini mampu menyerap seluruh sinar secara akurat hingga panjang gelombang serapan maksimumnya (cutoff) dan meneruskan seluruh sinar radiasi setelah itu. Nilai kemiringannya baik sehingga deviasi serapan sinyal pada cutoff dapat diketahui (Chan et al. 2004). Semakin kecil panjang gelombang sinar, energi foton yang dimiliki semakin besar; hal ini berbanding lurus dengan sensitivitasnya. Pada panjang gelombang 200 nm, sensitivitas cukup besar sehingga deviasi sangat kecil menghasilkan galat pengukuran cukup tinggi. Batas simpangan maksimum pada panjang gelombang 220 nm sebesar 0.1% akan memberikan galat pengukuran sebesar 0.5%. Di atas 300 nm, sensitivitas cukup rendah (Swarbrick 2007). Resolusi Resolusi ialah ukuran kemampuan spektrofotometer UV-Vis mendeteksi pita serapan pada setiap panjang gelombang. Semakin tinggi resolusi, pengukuran akan semakin akurat. Resolusi dapat ditunjukkan oleh keruncingan spektrum serapan: semakin runcing, resolusi yang dihasilkan semakin tinggi (Chan et al. 2004). Pengaruh resdusi akan terlihat jelas pada pengukuran 2 puncak serapan yang berdekatan. Resolusi yang baik menghasilkan pemisahan sempurna 2 puncak (Gambar 4). Keterangan lebar celah: A : 1 nm B : 5 nm C : 10 nm D : 20 nm E : 50 nm
Gambar 4
Spektrum resolusi spektrofotometer UV-Vis.
Resolusi spektrofotometer UV-Vis berkas ganda dipengaruhi oleh kinerja monokromator dan detektor. Monokromator yang baik mampu menghasilkan intensitas sinar monokromatis yang stabil sehingga interaksi antara
sinar dan sampel memiliki tingkat akurasi yang tinggi. Hanya sisa serapan sinar blangko dan analit pada panjang gelombang tertentu yang diteruskan ke detektor. Resolusi spektrofotometer UV-Vis berkas ganda dapat ditentukan dengan membandingkan nilai teoretis dengan hasil pengukuran. Nilai yang dapat diterima adalah 2.0 pada panjang gelombang 266–269 nm. Pengukuran nisbah ini dapat dilakukan dengan larutan toluena 0.02% (UV grade). Cara lain ialah menggunakan nilai akurasi panjang gelombang maksimum, dari dasar puncak hingga setengah puncak serapannya (Chan et al. 2004). Noise (Derau) Derau pada spektrofotometer UV-Vis dihasilkan dari sumber sinar dan komponen elektroniknya. Derau berpengaruh terhadap akurasi hasil pengukuran. Pengaruh sumber sinar terlihat pada absorbans rendah, sedangkan pengaruh komponen elektronik terlihat pada absorbans tinggi. Nilai derau yang tinggi juga akan memengaruhi presisi dan menurunkan limit deteksi. Sinyal juga menjadi kurang sensitif (Chan et al. 2004). Faktor penyebab munculnya derau antara lain adalah kalor dari komponen elektronik seperti detektor. Elektron yang ada di dalamnya memiliki energi kinetik yang menghasilkan kalor dan dapat menciptakan beban listrik acak sehingga sinyal yang dihasilkan beragam. Aliran listrik juga dapat menyebabkan derau. Perbedaan beban muatan yang dibawa oleh masing-masing elektron dalam aliran listrik menyebabkan fluktuasi aliran listrik dan berakibat munculnya derau (Currell 2000). Kerataan Baseline Derau menggambarkan kemampuan spektrofotometer UV-Vis untuk membedakan antara sinyal yang dihasilkan sampel dan pengganggu (instrumen atau lingkungan) pada panjang gelombang tertentu, sedangkan baseline merupakan nilai derau dalam suatu rentang panjang gelombang pengukuran. Baseline biasanya digunakan sebagai nilai nol (zero point) dalam pengukuran secara kuantitatif. Saat ini, banyak instrumen spektrofotometer UV-Vis memiliki 2 sumber sinar, yaitu deuterium untuk pengukuran daerah UV dan tungsten untuk daerah tampak. Perbedaan intensitas radiasi dari sumber sinar menyebabkan perbedaan pembacaan detektor. Kerataan baseline memperlihatkan kemampu-
5 an instrumen menormalisasi intensitas radiasi sumber sinar pada berbagai panjang gelombang (Chan et al. 2004). Pada sistem berkas ganda, adanya 2 sumber sinar atau pemisah sumber sinar dapat menyebabkan ketidakseragaman sinar yang dihasilkan saat perubahan panjang gelombang. Oleh karena itu, absorbans 0.0000 pada perubahan panjang gelombang tidak mudah dihasilkan (Currell 2000). Stabilitas Sinyal Intensitas sinyal yang dihasilkan oleh sumber sinar dalam spektrofotometer harus stabil. Variasi intensitas sumber sinar dan komponen elektronik pada instrumen spektrofotometer UV-Vis dipengaruhi oleh usia lampu serta fluktuasi suhu dan panjang gelombang pengukuran. Variasi ini dapat menyebabkan galat positif atau negatif. Akurasi pengukuran akan berkurang karena penyerapan sinar oleh sampel tidak merata (Chan et al. 2004). Metode pengukuran stabilitas sinyal ialah dengan mengukur serapan sinyal yang dihasilkan dalam selang waktu tertentu pada panjang gelombang analisis. Akurasi Fotometri Spektrofotometer UV-Vis mengukur jumlah analit, dengan cara membandingkan sinyal analit dengan sinyal standar pada konsentrasi yang sama, pada waktu dan dengan instrumen yang sama. Reproduksi sumber sinar yang linear (akurasi fotometri) berperan penting terhadap akurasi koefisien ekstingsi yang akan digunakan untuk mencirikan analit serta memastikan transmitans atau absorbans merupakan sinyal dari analit atau standar. Akurasi fotometri dapat diukur dengan menggunakan pereaksi yang memiliki beberapa puncak panjang gelombang, antara lain kalium dikromat (K2Cr2O7). Pereaksi ini memiliki puncak panjang gelombang pada 235, 257, 313, dan 350 nm (Chan et al. 2004). Linearitas Respons linear absorbans terhadap konsentrasi sangat diperlukan pada sistem spektrofotometer UV-Vis. Batas bawah dan batas atas pengukuran akan memengaruhi respons instrumen dan dapat menimbulkan ketidakpercayaan terhadap sinyal yang dihasilkan (Currell 2000). Pengujian linearitas spektrofotometer UV-Vis bertujuan menentukan hubungan linear antara konsentrasi dan sinyal instrumen
pada serapan normal, deviasi serapan sinyal pada absorbans maksimum, dan pengaruh derau pada absorbans minimum. Untuk pengukuran rutin yang melibatkan sampel dan standar, akurasi terlihat dari presisi dan linearitas pengukuran (Chan et al. 2004), yang dapat ditentukan dengan membuat kurva kalibrasi dari beberapa konsentrasi larutan standar. Kurva tersebut akan menghasilkan persamaan garis y = a + bx dan nilai regresi (r). Nilai regresi inilah yang menunjukkan linearitas suatu analisis. Penetapan dilakukan dengan 5 konsentrasi berbeda dan nilai regresi yang memenuhi syarat adalah lebih besar atau sama dengan 0.99770 (ICH 1995, diacu dalam Chan et al. 2004). Validasi Metode Penetapan Kadar Ambroksol HCl pada Tablet Ekspektoran Suatu analisis kimia bertujuan mengetahui komposisi atau jumlah zat dalam sampel. Data hasil uji diharapkan mendekati nilai sebenarnya dengan galat sekecil-kecilnya. Untuk itu, diperlukan validasi terhadap metode yang digunakan. Menurut good manufacturing practices, validasi adalah pembuktian bahwa prosedur, proses, alat, bahan, aktivitas, atau sistem yang dilakukan menghasilkan nilai yang dapat dipercaya (GMP 2003; diacu dalam Huber 2007). Validasi metode analisis bertujuan memastikan kesesuaian metode tersebut dengan peruntukannya. Selain itu, tingkat kepercayaan hasil uji dari metode maupun dari instrumen yang digunakan dapat diperkirakan. Validasi harus dilakukan ketika ada perubahan kondisi analisis atau perubahan metode dari metode standar. Beberapa manfaat validasi adalah dapat mengevaluasi kinerja suatu metode; menjamin prosedur, keakuratan, dan kedapatulangan analisis; serta mampu mengurangi risiko deviasi (Wulandari 2007). Proses validasi secara umum mencakup metode dan alat yang digunakan (Nugroho 2006). Parameter yang diuji meliputi sensitivitas, ketelitian dan ketepatan, linearitas, limit deteksi dan limit kuantitasi, juga ketangguhan metode. Akurasi (Ketepatan) Akurasi adalah kedekatan hasil percobaan dengan nilai sebenarnya. Secara matematis, nilai akurasi sangat dipengaruhi oleh nilai galat sistematik. Sebagai pembanding, dapat digunakan metode baku yang sudah diketahui nilai ketidakpastiannya atau hasil pengukuran
6 dengan standar primer. Secara umum, nilai akurasi 80%–120% dapat diterima untuk kemurnian analit 100% (AOAC 1998). Akurasi dapat ditentukan dengan 2 cara, yaitu metode simulasi (spiked-placebo recovery) dan metode penambahan standar. Dalam metode simulasi, sejumlah analit murni (standar) ditambahkan ke dalam sampel plasebo, biasanya 80–120% dari perkiraan kadar analit dalam sampel. Campuran lalu dianalisis dengan metode yang akan divalidasi dan hasilnya dibandingkan dengan kadar standar yang ditambahkan (kadar sebenarnya). Bila tidak mungkin membuat sampel plasebo karena matriksnya tidak diketahui seperti obat-obatan paten, atau karena analit berupa senyawa endogen, misalnya metabolit sekunder pada kultur kalus, maka dapat dipakai metode penambahan standar. Sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit ditambahkan dan dianalisis kembali. Selisih kedua hasil analisis dibandingkan dengan kadar sebenarnya. Namun, metode ini tidak dapat digunakan jika penambahan analit dapat mengganggu pengukuran, misalnya menghabiskan pereaksi atau mengubah pH atau kapasitas bufer (Riyadi 2009). Presisi Presisi merupakan ukuran kesamaan hasil dari tiap ulangan ketika suatu metode diterapkan berulang kali pada berbagai pencuplikan dari contoh yang homogen. Nilai perolehan kembali dapat ditentukan dari simpangan baku relatif (RSD). Nilai RSD akan meningkat saat konsentrasi menurun. Batas ketelitian menurut AOAC adalah sangat teliti (<1%), teliti (1–2%), sedang (2–5%), dan tidak teliti (2–5%) (AOAC 1998). Terdapat 2 parameter penentuan presisi, yaitu keterulangan (repeatability) dan ketertiruan (reproducibility). Keterulangan adalah kesamaan hasil jika suatu metode dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi sama dalam selang waktu yang pendek. Keterulangan dinilai dengan melakukan penetapan terpisah lengkap terhadap sampel-sampel identik terpisah dari kelompok yang sama. Ketertiruan adalah kesamaan hasil ketika suatu metode dikerjakan pada kondisi yang berbeda, misalnya penimbangan, pelarut, peralatan, dan pereaksi, atau dengan analis yang berbeda (British Pharmacopeia 2007). Linearitas Linearitas adalah kemampuan metode analisis memberikan respons secara langsung sesuai dengan konsentrasi analit dalam contoh
pada kisaran konsentrasi tertentu (AOAC 1998). Linearitas biasanya diperoleh dari persamaan garis lurus dengan metode kuadrat terkecil antara respons analit dan konsentrasi. Fungsi regresi linear berupa y = a + bx dengan nilai r > 0.99770 (ICH 1995, diacu dalam Chan et al 2004). Nilai a (intersep) menyatakan pengaruh matriks. Semakin besar nilainya, semakin besar pengaruh matriks terhadap pengukuran sampel. Nilai b (kemiringan) menunjukkan sensitivitas suatu metode, yaitu pengaruh perubahan konsentrasi terhadap sinyal yang dihasilkan. Semakin besar nilainya, semakin besar sensitivitas suatu metode (Chan et al. 2004). Limit Deteksi (LD) dan Limit Kuantitasi (LK) Limit deteksi adalah konsentrasi analit terendah di dalam sampel yang dapat dideteksi, tetapi tidak harus terkuantisasi pada kondisi percobaan yang ditetapkan. Secara umum, respons analit terhadap derau adalah 3:1 (AOAC 1998). Limit kuantitasi adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat diukur secara tepat dan teliti (respons analit terhadap derau sebesar 10:1) (AOAC 1998). Limit kuantitasi berhubungan dengan presisi dan akurasi. Jika nilai limit kuantitasi menurun, maka nilai presisi dan akurasi pun akan menurun. Limit deteksi dan limit kuantitasi dapat dihitung dari simpangan baku intersep dan rerata kemiringan kurva standar. Rumusnya ialah sebagai berikut: …. (1) …. (2) Keterangan : LD = limit deteksi (mg/mL) LK = limit kuantitasi (mg/mL) Sa = simpangan baku intersep (n = 6) b = rerata kemiringan
BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan antara lain spektrofotometer UV-Vis berkas ganda Shimadzu UV-1601PC, pengaduk ultrasonik, dan neraca mikroanalitik. Bahan-bahan yang digunakan adalah isopropanol p.a, HCl 0.1 N, H2SO4 0.005 M, tablet ekspektoran, standar ambroksol HCl, larutan KCl, NaI, H2SO4, K2Cr2O7, kertas Whatman No 1, dan filter Ho2O3 cair.
7 Metode Penelitian Penelitian terdiri atas uji kinerja spektrofotometer UV-Vis berkas ganda dan validasi metode pengukuran kadar ambroksol HCl pada tablet ekspektoran. Uji kinerja meliputi pengukuran akurasi panjang gelombang, deviasi serapan sinyal, resolusi, derau, kerataan baseline, stabilitas sinyal, akurasi fotometri, dan linearitas. Sementara validasi metode mencakup uji akurasi, presisi, linearitas, serta limit deteksi dan kuantitasi. Uji Kinerja Spektrofotometer Akurasi Panjang Gelombang Filter holmium oksida dimasukkan ke dalam wadah sampel kemudian diukur dengan kecepatan rendah. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 200 hingga 680 nm. Deviasi Serapan Sinyal Larutan 1.2 g KCl dan 1.0 g NaI masingmasing dalam 100 mL air diukur. Digunakan berbagai panjang gelombang seperti ditunjukkan pada Tabel 1. Tabel 1 Syarat nilai panjang gelombang Larutan λ (nm) λ maks (nm) 190–220 KCl (12g/L) 200 200–230 NaI (10g/L) 220 Resolusi Pengukuran dilakukan menggunakan filter holmium oksida cair pada panjang gelombang 480–490 nm dan 650–660 nm. Lebar pita setengah puncak tidak boleh melebihi 2 nm. Derau Serapan udara (kuvet tanpa sampel) diukur selama 10 menit pada panjang gelombang 500 nm. Simpangan serapan maksimum adalah 0.7. Kerataan Baseline Pengukuran baseline serupa dengan derau, tetapi dilakukan pada panjang gelombang 190–700 nm, dengan simpangan serapan tidak lebih dari + 0.002. Pengukuran dilakukan dengan kecepatan rendah. Stabilitas Sinyal Absorptivitas udara (tanpa sampel) diukur selama 60 menit pada panjang gelombang tertentu. Simpangan maksimum 0.0010. Akurasi Fotometri Sebanyak 60.06 mg K2Cr2O7 ditimbang dengan neraca mikroanalitik, dilarutkan dalam
H2SO4 0.005 M. Larutan diukur dengan panjang gelombang sesuai dengan Tabel 2. Tabel 2 Pengukuran akurasi fotometri Absorbans λ (nm) 235 0.748 257 0.865 313 0.292 350 0.640 Uji Linearitas K2Cr2O7 dilarutkan dalam H2SO4 0.005 M dengan konsentrasi 20, 40, 60, 80, dan 100 mg/L. Masing-masing diukur pada panjang gelombang 235, 257, 313, dan 350 nm. Validasi Metode Uji Pendahuluan (Penentuan Kadar Ambroksol HCl pada Standar Sekunder) Larutan standar primer yang telah diketahui konsentrasi dan ketidakpastiannya dibandingkan dengan standar sekunder yang digunakan sebagai bahan aktif saat proses pencetakan tablet ekspektoran. Standar primer dan sekunder ditimbang sebanyak 50 mg, masing-masing dilarutkan dalam 10 mL HCl 0.1 N dan isopropanol 50 mL pada labu ukur 100 mL. Larutan dikocok selama 1 jam menggunakan pengaduk ultrasonik lalu ditepatkan menggunakan larutan isopropanol hingga tanda tera. Larutan primer dipipet 3 mL ke dalam labu ukur 50 mL dan diencerkan lagi menggunakan isopropanol p.a hingga tanda tera. Kedua larutan diukur pada panjang gelombang maksimum dan dibandingkan konsentrasinya. Linearitas Standar sekunder ditimbang sebanyak 40, 45, 50, 55, dan 60 mg, masing-masing dilarutkan dalam HCl 0.1 N dan isopropanol 50 mL pada labu ukur 100 mL, dan ditepatkan menggunakan isopropanol hingga tanda tera. Larutan diukur pada panjang gelombang maksimum, sebanyak 3 kali ulangan. Limit Deteksi dan Limit Kuantitasi Limit deteksi (LD) dan limit kuantitasi (LK) dapat ditentukan dari kurva linearitas dengan menggunakan persamaan (1) dan (2). Akurasi Larutan standar sekunder disiapkan seperti pada uji pendahuluan. Larutan contoh disiapkan dari 350 mg granul tablet (diperoleh dengan menggerus 20 tablet ekspektoran
8 hingga homogen) dan diperlakukan sama seperti standar sekunder. Larutan contoh disaring menggunakan kertas saring Whatman no. 41. Sebanyak 6 mL filtrat dimasukkan masing-masing ke dalam 3 buah labu ukur 100 mL, ditambahkan larutan standar sekunder sebanyak 4, 6, dan 8 mL, kemudian diencerkan dengan isopropanol p.a. hingga tanda tera. Larutan standar sekunder dan ketiga larutan contoh kemudian diukur pada panjang gelombang maksimum. Presisi Larutan standar sekunder dan larutan contoh disiapkan seperti uji akurasi. Bedanya untuk larutan contoh, filtrat dipipet masingmasing sebanyak 6 mL ke dalam 6 labu ukur 100 mL dan diencerkan menggunakan isopropanol hingga tanda tera. Larutan standar sekunder dan keenam larutan contoh diukur pada panjang gelombang maksimum. Prosedur uji ketertiruan sama seperti uji keterulangan. Bedanya, 6 larutan contoh disiapkan dengan 6 kali penimbangan granul.
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Uji Kinerja Spektrofotometer Akurasi Panjang Gelombang Akurasi panjang gelombang ditentukan untuk mengetahui sejauh mana deviasi panjang gelombang maksimum untuk suatu sampel. Pengujian dilakukan dengan mengukur filter holmium oksida dalam wadah sampel (USP 2006). Hasil pengukuran berupa spektrum pada beberapa panjang gelombang. Selisih hasil dengan nilai teoretis menggunakan standar SRM 2034 pada suhu 25 + 5 oC tidak boleh lebih dari 0.6 nm. Pada penelitian ini, galat minimum didapatkan –0.01 pada 345.41 nm, sedangkan galat maksimum didapatkan pada 278.60 nm sebesar 0.50. Filter holmium oksida menghasilkan 13 puncak serapan antara 241 dan 640 nm, masing-masing memiliki nilai serapan yang khas dan berbeda (Gambar 5).
Hasil penelitian Weidner (1986), menunjukkan bahwa pergeseran serapan UVVis menjadi lebih besar dan kepekaan pengukuran pita serapan oleh instrumen menjadi menurun pada lebar celah yang semakin besar. Lebar celah yang digunakan pada penelitian ini adalah 1.5 nm dan akurat karena masih di bawah nilai maksimum deviasi yang ditentukan, yaitu 1.000 (Lampiran 4). Tingkat keterulangan pengujian akurasi panjang gelombang cukup baik karena simpangan maksimum untuk 3 kali pengulangan adalah 0.025. Deviasi Serapan Sinyal Deviasi serapan sinyal pada spektrofotometer UV-Vis berkas ganda diperoleh dengan mengukur spektrum sampel yang memiliki nilai cutoff yang khas. Sinar yang berlebih akan menyebabkan pelebaran puncak panjang gelombang sehingga menurunkan absorbans pada panjang gelombang serapan maksimum dan juga linearitas sinyal dari sumber radiasi. Sampel uji yang digunakan adalah KCl dan NaI. Larutan KCl memiliki nilai cutoff pada 200 nm sehingga pada panjang gelombang ini, akan muncul serapan maksimum. Hasil pengujian tidak menunjukkan deviasi serapan sinyal, karena absorbans pada 200 nm sebesar 2.419, sementara batas bawahnya 2.000 (Gambar 6a).
(a)
Gambar 6
Gambar 5 Spektrum holmium oksida.
(b) Spektrum serapan KCl (a) dan NaI (b).
Larutan NaI juga tidak memperlihatkan deviasi serapan sinyal dari sumber sinar, karena saat diukur pada panjang gelombang
9 cutoff-nya (220 nm), nilai absorbans 3.3375, lebih tinggi dari batas bawah 2.000 (Gambar 6b). Berdasarkan parameter ini, dapat disimpulkan bahwa sinyal yang dihasilkan instrumen masih baik. Data hasil pengamatan deviasi sinyal larutan KCl dan NaI selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 2 dan 3. Resolusi Kurang baiknya keterpisahan pita-pita serapan dapat menyebabkan ketidaktepatan hasil pengukuran, dan berakibat menurunnya nilai koefisien intrinsik dari pengukuran tersebut. Resolusi spektrofotometer UV-Vis ini dipengaruhi oleh kinerja celah dan daya pemisahan sinar polikromatis oleh monokromator (Chan et al. 2004). Energi total yang keluar dari celah monokromator pada panjang gelombang tertentu digambarkan sebagai fungsi segitiga. Lebar celah ditentukan dari setengah tinggi puncak energi, dan lebar panjang gelombang pada setengah tinggi puncak tersebut dinyatakan sebagai resolusi. Lampu deuterium memiliki puncak energi pada panjang gelombang antara 480 dan 490 nm serta antara 650 dan 660 nm. Semakin lebar pita puncak serapan, semakin rendah resolusi instrumen. Sebaliknya, semakin runcing berarti semakin tinggi resolusinya. Pada rentang 480–490 nm, puncak energi dihasilkan pada 486 nm, dengan resolusi 1.8 nm. Sementara pada kisaran 650–660 nm, puncak energi dari sumber sinar adalah 656 nm, juga dengan resolusi sebesar 1.8 nm (Lampiran 4). Nilai resolusi spektrofotometer ini tergolong baik karena masih di bawah batas maksimum yang dapat diterima, yaitu 2. Derau Derau (noise) merupakan salah satu parameter kinerja spektrofotometer UV-Vis berkas ganda. Pengujian dilakukan pada 500 nm, yaitu panjang gelombang yang memiliki energi emisi terendah dari lampu deuterium. Waktu pengukuran 10 menit setelah instrumen dinyalakan karena dianggap sebagai selang waktu yang sering lazim. Pada pengukuran absorbans rendah, pengaruh derau sangat tinggi dan dapat menyebabkan ketidakakuratan hasil pengukuran. Semakin lama waktu pengukuran, derau juga akan meningkat, akibat pengaruh komponen elektronik dan sumber sinar. Derau terjadi karena fluktuasi foton dari sumber sinyal yang terdeteksi oleh detektor. Pada absorbans tinggi, fluktuasi ini tidak terlihat, tetapi saat absorbans rendah, derau akan
terlihat sangat jelas dan dapat memengaruhi sinyal yang dihasilkan (Ando 1988). Selisih antara nilai derau minimum dan maksimum adalah 0.0005 (Gambar 7 dan Lampiran 5). Nilai ini cukup tinggi, tetapi tidak melebihi batas maksimum, yaitu 0.001. Jadi, derau dari instrumen tidak memengaruhi pengukuran analit dalam konsentrasi yang tinggi, tetapi sinyal hasil pengukuran memiliki bias 0.0005 dari sinyal analit sesungguhnya.
Gambar 7 Spektrum hubungan waktu dengan absorbans saat pengujian derau. Kerataan Baseline Kestabilan intensitas sinar tecermin dari kerataan garis dasar spektrum baseline. Kerataan baseline diuji dengan mengukur derau pada panjang gelombang 190 hingga 700 nm. Perubahan sumber sinar dari lampu deuterium ke tungsten akan menyebabkan perubahan intensitas cahaya. Dengan pengujian ini, kemampuan menstabilkan intensitas sinyal yang diberikan oleh kedua lampu tersebut akan dapat ditentukan (Chan et al. 2004). Fluktuasi sinyal yang terdeteksi dalam penelitian ini tidak melebihi 0.002. Fluktuasi terbesar terjadi pada panjang gelombang 380– 400 nm (Gambar 8), karena perubahan filter ultraviolet dan tampak yang digunakan (Ando 1988). Fluktuasi sinyal yang kecil (0.002) tidak cukup memengaruhi pengukuran analit pada konsentrasi tinggi, maka untuk keperluan analisis rutin, instrumen masih dapat dipergunakan. Hal ini juga berarti intensitas sinar dari sumber sinar dan juga kemampuan instrumen menormalisasi intensitas sinar yang datang dari 2 sumber sinar masih baik.
Gambar 8 Spektrum serapan baseline.
10 Stabilitas Sinyal Keterulangan dan keakuratan pengukuran sampel sangat dipengaruhi oleh kestabilan sinyal yang dihasilkan oleh suatu instrumen. Saat pengukuran, sinyal yang diterima sampel dan selanjutnya diteruskan untuk dibaca haruslah sinyal sampel saja, tanpa ada pengurangan atau penambahan sinyal karena faktor lingkungan atau instrumen (Chan et al. 2004). Stabilitas sinyal diuji menggunakan kuvet kosong pada panjang gelombang 240 nm selama 60 menit. Tujuannya menentukan ada tidaknya serapan selain analit pada rentang panjang gelombang pengukuran ambroksol HCl sehingga dapat diketahui pengaruh bias sinyal instrumen. Sejak menit pertama, tidak ada serapan selain dari sampel dan semakin besar dengan bertambah lamanya waktu pengukuran (Gambar 9). Nilai serapan terbesar adalah 0.00130 pada menit ke-53, dengan perubahan tingkat serapan rata-rata sebesar 0.00020. Pada menit ke-52, serapan naik hanya 0.00010 dan stabil hingga menit ke-60 pada angka 0.00130 (Lampiran 7).
Gambar 9 Spektrum hubungan waktu dengan absorbans saat pengujian stabilitas sinyal. Jika dilihat dari hasil ini, akan ada deviasi serapan sampel pada saat pengukuran. Namun, hasil ini masih memenuhi syarat karena nilai serapan maksimum (0.00130) masih di bawah batas maksimum (0.00200). Karena itu, stabilitas sinyal spektrofotometer UV-Vis berkas ganda Shimadzu UV-1601PC dapat dikatakan baik. Akurasi Fotometri Akurasi fotometri diukur untuk menentukan deviasi pembacaan serapan sampel pada panjang gelombang maksimum. Pengukuran dilakukan menggunakan pereaksi K2Cr2O7 yang memiliki beberapa puncak serapan, yaitu pada 235, 257, 313, dan 350 nm. Standar serapan pada masing-masing panjang gelombang tersebut telah diketahui (Tabel 2). Akurasi fotometri ditentukan
dengan membandingkan serapan terukur dengan nilai teoretis tersebut (Lampiran 8). Selisih serapan tertinggi diperoleh pada 350 nm, yaitu sebesar 0.0032, dan terendah pada 257 nm yaitu sebesar 0.0001. Perbedaan ini dapat disebabkan oleh faktor instrumen atau lingkungan. Pengujian lebih lanjut dengan uji t menghasilkan nilai t hitung lebih kecil daripada t teoretis. Karena itu, dapat disimpulkan bahwa perbedaan hasil pengukuran dengan nilai teoretis tidak signifikan dan masih dapat diterima. Jadi, keterulangan sinar radiasi masih baik. Uji Linearitas Seperti pada penentuan akurasi fotometri, larutan K2Cr2O7 digunakan sebagai analit, diukur pada 235, 257, 313, dan 350 nm. Konsentrasi analit yang diukur 20, 40, 60, 80, dan 100 ppm. Linearitas ditentukan sebagai nilai regresi (R2) dari kurva hubungan konsentrasi dengan serapan sampel. Nilai regresi berkisar antara 0.9989 pada 313 nm dan 0.9973 pada 257 nm (Lampiran 9). Hasil tersebut sudah memenuhi syarat yang ditetapkan ICH (1995), yaitu minimum 0.9970. Nilai intersep (a) pada panjang gelombang di atas 300 nm lebih kecil daripada di atas 200 nm. Hal ini menyatakan bahwa pengaruh matriks sampel tidak terlalu besar pada panjang gelombang lebih tinggi. Nilai kemiringan (b) menyatakan sensitivitas instrumen. Kemiringan garis yang kecil menunjukkan bahwa perubahan konsentrasi yang kecil tidak memengaruhi sinyal yang dihasilkan. Jadi, sensitivitas alat juga lebih baik pada panjang gelombang di atas 300 nm. Hasil Validasi Metode Uji Pendahuluan Pengujian dilakukan dengan membandingkan standar primer ambroksol HCl yang telah diketahui kadarnya dengan standar sekunder yang digunakan dalam pembuatan tablet espektoran untuk ditentukan kadarnya. Asam klorida digunakan untuk melarutkan ambroksol HCl, sedangkan isopropanol digunakan sebagai pengencer larutan ambroksol HCl. Sampel diaduk menggunakan pengaduk ultrasonik agar proses pelarutan ambroksol HCl berlangsung sempurna, dengan dibantu suhu. Penentuan kadar ini dimulai dengan menentukan panjang gelombang maksimum (λmaks) standar primer. Diperoleh λmaks maksimum 248 nm, berbeda 4 nm dari literatur, yaitu 244 nm (Wirbitzki et al. 2002) (Gambar 10).
11
Gambar 10 Spektrum ambroksol HCl Kadar standar sekunder ambroksol HCl berkisar 100.04 hingga 100.86% dengan ratarata 100.32% (Lampiran 10). Nilai ini digunakan untuk menentukan kadar ambroksol HCl pada sampel tablet ekspektoran untuk validasi metode. Linearitas Linearitas ditentukan dengan membuat kurva hubungan antara absorbans dan konsentrasi standar. Pengujian dilakukan 6 kali ulangan dengan konsentrasi larutan 0.0241, 0.0270, 0.0302, 0.0331, dan 0.0360 mg/mL. Dihasilkan 6 persamaan regresi dengan nilai koefisien korelasi 0.9970–0.9994 (Lampiran 11), memenuhi syarat linearitas yang ditetapkan ICH (1995), yaitu lebih tinggi dari 0.9970. Persamaan regresi linear untuk kurva standar rerata adalah y = 55.2160x – 0.7849 (Lampiran 11). Nilai intersep (a) dan batas galatnya (tSa) pada selang kepercayaan 95% sebesar 0.7849 + 0.1089 (Lampiran 12). Nilai intersep yang cukup besar menunjukkan bahwa terdapat gangguan matriks pada pengukuran analit dalam sampel. Nilai kemiringan (b) dan batas galatnya (tSb) adalah 55.2160 + 3.5957 (Lampiran 12). Rentang nilai ini sangat besar sehingga instrumen dikatakan memiliki sensitivitas yang kurang baik. Limit Deteksi dan Limit Kuantitasi Limit deteksi (LD) dan limit kuantitasi (LK) dapat ditentukan dari persamaan regresi linear hasil penentuan linearitas, dengan menggunakan persamaan (1) dan (2). Limit deteksi merupakan konsentrasi terendah yang dapat membedakan antara sinyal blangko dan analit. Dalam penelitian ini, diperoleh LD sebesar 0.0028 mg/mL, berarti pada konsentrasi di bawah itu, instrumen tidak dapat membedakan secara nyata sinyal blangko dan analit.
Limit kuantitasi (LK) merupakan konsentrasi terendah yang terukur oleh metode dengan ketelitian dan ketepatan yang baik. Dalam penelitian ini, LK adalah 0.00836 mg/mL. Konsentrasi analit yang lebih rendah akan menghasilkan sinyal yang kurang baik sehingga hasil pengukuran tidak akurat. Perhitungan LD dan LK diberikan di Lampiran 13. Akurasi Akurasi metode pengukuran kadar ambroksol HCl diukur menggunakan metode penambahan standar dan dinyatakan dengan persen perolehan kembali. Perolehan kembali merupakan jumlah standar yang dapat diperoleh kembali setelah ditambahkan ke dalam sampel. Perolehan kembali dapat menunjukkan galat sistematik dari metode analisis yang digunakan, di antaranya adalah saat pengambilan sampel, proses preparasi, kurva kalibrasi yang tidak linear, dan instrumen yang digunakan. Akurasi metode ditentukan dengan menambahkan 1.2, 1.8, dan 2.4 mg standar ambroksol HCl pada sampel tablet ekspektoran yang berisi 30 mg ambroksol HCl. Nilai perolehan kembali yang didapat antara 101.01% dan 101.24% (Lampiran 14). Menurut ICH (1995), nilai ini berada pada kisaran akurasi yang baik, yaitu 98–102%. Jadi, metode penentuan kadar ambroksol HCl ini cukup akurat. Presisi Galat pengukuran yang disebabkan oleh analis, instrumen, atau lingkungan dapat ditentukan dengan melakukan uji presisi (ketelitian). Ada 2 jenis pengujian, yaitu uji keterulangan dan ketertiruan. Keterulangan diuji dengan mengulangi pengukuran sampel yang sama sebanyak 6 kali ulangan selama 5 hari. Tujuannya ialah mengetahui galat acak yang dilakukan oleh operator pada tahap penyiapan larutan, penyaringan, atau saat pengukuran analit, atau galat acak dari instrumen dan kondisi lingkungan pengukuran pada hari yang berlainan. Hasil pengukuran menunjukkan konsentrasi ambroksol HCl berkisar antara 30.00 dan 30.06 mg dengan nilai RSD 0.02–0.09% (Tabel 6). RSD yang dihasilkan jauh lebih kecil dari 2%, maka dapat disimpulkan bahwa galat acak tidak memengaruhi hasil analisis.
12
Hari ke1 2 3 4 5
Tabel 3 Hasil pengukuran presisi Uji Keterulangan Uji ketertiruan Amb HCl SBR Amb HCl SBR (mg) (%) (mg) (%) 30.03 0.09 30.02 0.14 30.06 0.08 29.86 0.32 30.03 0.02 30.17 0.19 30.01 0.07 29.86 0.32 30.00 0.06 29.97 0.21
Parameter presisi ketertiruan dilakukan untuk mengetahui galat acak dalam proses penimbangan sampel. Pengujian juga dilakukan selama 5 hari dengan 6 ulangan setiap harinya. Konsentrasi ambroksol HCl yang dihasilkan berkisar antara 29.86 dan 30.17 mg dengan SBR 0.14–0.32%. Nilai SBR maksimum (0.32%) jauh di bawah batas simpangan maksimum, 2%. Karena itu, dapat disimpulkan bahwa galat acak dari penimbangan dan instrumen juga tidak memengaruhi hasil pengukuran.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Kinerja spektrofotometer UV-Vis berkas ganda untuk pengukuran kadar ambroksol HCl masih baik. Demikian pula metode yang digunakan untuk pengukuran kadar ambroksol HCl, karena semua parameter uji validasi masih dalam kisaran penerimaan data yang baik. Saran Untuk uji kinerja instrumen analisis, digunakan reagen yang terkalibrasi sehingga hasil uji kinerja lebih sahih dibandingkan dengan reagen untuk preparasi analit.
DAFTAR PUSTAKA Ando D. 1988. Analytical Instrumentation Performance Characteristics And Quality. New Jersey: J Wiley. Ansel CH. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi. UI Pr. [AOAC] Association of Official Analytical Chemists. 1998. AOAC Perr – Verified Methods Program. Arlington: AOAC International. British Pharmacopeia. 2007. Ambroxol Hydrochloride. South Lamberth: System Simulation. Chan C et al. 2004. Analytical Method Validation and Instrument Performance Verification. New Jersey: J Wiley.
Currell G. 2000. Analytical Instrumentation Performance Characteristics and Quality. New Jersey: J Wiley. Departemen Kesehatan. 1993 Peraturan Menteri Kesehatan Nomor 917/Menkes/Per/X/1993 tentang Wajib Daftar Obat Jadi. Jakarta Hendayana, S. 1994. Kimia Analitik Instrumen. Semarang: IKIP Semarang Pr. Huber L. 2007. Validation and Qualification in Analytical Laboratories. Ed-2. New York: Informa Healthcare. [ICH] International Conference on Harmonization. 1995. Validation of Analytical Procedures: Methodology Q2B [terhubung berkala]. www.ich.org [01 Jan 2010] Riyadi W. 2009. Validasi Metode Analisis [terhubung berkala]. www.chem-is-try.org [01 Jan 2010] Satiadarma K et al. 2004. Azas Pengembangan Prosedur Analisis. Surabaya: Universitas Airlangga. Swarbrick J. 2007. Encyclopedia of Pharmaceutical Technology. Ed ke-3. New York: Informa Healthcare. Tjay TH, Rahardja K. 2002. Obat-obat Penting: Khasiat, Penggunaan, dan Efekefek Sampingnya. Ed ke-4. Jakarta: Elex Media Komputindo. Underwood AL, Day. 1980. Analisis Kimia Kuantitatif. Ed ke-4. Soendoro et al., penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Quantitative Analysis. 4th Edition. Weidner, RV. 1986. A Wavelength Standard for the Near Infrared Based on the Reflectance. Maryland: NIST. Journal of Research of the National Bureu of Standards. Wulandari N. 2007. Validasi metode spektrofotometri derivatif ultraviolet untuk penentuan respirin dalam tablet obat [skripsi]. Bogor. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Institut Pertanian Bogor
13
LAMPIRAN
14 Lampiran 1 Akurasi panjang gelombang Ulangan 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Pengukuran (nm) 241.40 241.37 241.42 250.20 250.23 250.19 278.60 278.58 278.63 287.80 287.77 287.82 333.60 333.57 333.59 345.40 345.42 345.41 385.80 385.78 385.81 416.50 416.48 416.50 451.10 451.12 451.12 467.70 467.67 467.71 485.10 485.12 485.13 536.61 536.60 536.62 640.50 640.48 640.49
Rerata (nm) 241.40
250.21
278.60
287.80
333.59
345.41
385.80
416.49
451.11
467.69
485.12
536.61
640.49
Galat (nm) 0.28 0.25 0.3 0.17 0.20 0.16 0.5 0.48 0.53 0.28 0.25 0.3 0.13 0.10 0.12 -0.02 0.00 -0.01 0 -0.02 0.01 -0.07 -0.09 -0.07 -0.22 -0.20 -0.2 -0.2 -0.23 -0.19 -0.15 -0.13 -0.12 -0.26 -0.26 -0.24 -0.29 -0.31 -0.3
Rerata (nm)
Teoretis (nm)
Simpangan
0.28
241.12
0.025
0.18
250.03
0.021
0.50
278.10
0.025
0.28
287.52
0.025
0.12
333.47
0.015
-0.01
345.42
0.010
0.00
385.80
0.015
-0.08
416.57
0.012
-0.21
451.32
0.012
-0.21
467.90
0.021
-0.13
485.25
0.015
-0.25
536.86
0.012
-0.30
640.79
0.010
15 Lampiran 2 Deviasi serapan sinyal larutan KCl λ (nm) 245.0 244.0 243.0 242.0 241.0 240.0 239.0 238.0 237.0 236.0 235.0 234.0 233.0 232.0 231.0 230.0
Absorbans -0.3079 -0.2096 -0.1115 -0.1138 -0.2624 -0.4189 -0.3218 -0.1484 -0.2800 0.1879 0.3552 0.9240 0.9930 0.9620 -0.0648 0.0120
λ (nm) 213.0 212.0 211.0 210.0 209.0 208.0 207.0 206.0 205.0 204.0 203.0 202.0 201.0 200.0 199.9 199.8
Absorbans 1.3290 1.3464 1.3604 1.3690 1.3724 1.3728 1.3680 1.3627 1.3578 1.3567 1.3678 1.3961 1.4581 2.4190 2.3139 2.3273
λ (nm) 229.0 228.0 227.0 226.0 225.0 224.0 223.0 222.0 221.0 220.0 219.0 218.0 217.0 216.0 215.0 214.0
Absorbans 0.9941 0.9832 0.9763 0.9774 0.9858 0.9993 1.0210 1.0471 1.0776 1.1122 1.1466 1.1818 1.2164 1.2494 1.2783 1.3048
λ (nm) 199.7 199.6 199.5 199.4 199.3 199.2 199.1 199.0 198.0 197.0 196.0 195.0 194.0 193.0 192.0 191.0
Absorbans 2.3424 2.3588 2.3745 2.3925 2.4096 2.4287 2.4475 2.4682 2.7229 3.0684 3.4456 3.6707 3.6709 3.5833 3.4859 3.3288
Lampiran 3 Deviasi serapan sinyal larutan NaI λ (nm) 245.0 244.0 243.0 242.0 241.0 240.0 239.0 238.0 237.0 236.0 235.0 234.0 233.0 232.0
Absorbans 3.5022 3.5242 3.5398 3.5682 3.5022 3.5618 3.5242 3.5461 3.5682 3.6058 3.5839 3.5902 3.6058 3.5461
λ (nm) 220.7 220.6 220.5 220.4 220.3 220.2 220.1 220.0 219.0 218.0 217.0 216.0 215.0 214.0
Absorbans 3.3459 3.3616 3.3496 3.3496 3.3496 3.3651 3.3375 3.3375 3.3027 3.3616 3.3219 3.2687 3.2566 3.2603
λ (nm) 231.0 230.0 229.0 228.0 227.0 226.0 225.0 224.0 223.0 222.0 221.0 220.9 220.8
Absorbans 3.6058 3.5242 3.5461 3.5839 3.5242 3.5022 3.5178 3.5242 3.5618 3.3993 3.3424 3.3424 3.3580
λ (nm) 213.0 212.0 211.0 210.0 209.0 208.0 207.0 206.0 205.0 204.0 203.0 202.0 201.0
Absorbans 3.2090 3.2743 3.2111 3.2111 3.1991 3.1602 3.1282 3.0970 3.0907 3.0486 3.0197 2.9769 2.9297
16 Lampiran 4 Resolusi
1.8 nm
a. Spektrum serapan energi pada panjang gelombang 480–490 nm
1.8 nm
b. Spektrum serapan energi pada panjang gelombang 650–660 nm
17 Lampiran 5 Derau Waktu (detik) 10 20 30 40 50 60 70 71 80 90 90 100 110 120 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 260 270 280 290
Absorbans 0.0002 0.0002 0.0002 0.0002 0.0002 0.0002 0.0002 0.0002 0.0002 0.0002 0.0002 0.0002 0.0004 0.0004 0.0004 0.0004 0.0004 0.0004 0.0004 0.0004 0.0004 0.0004 0.0004 0.0004 0.0005 0.0005 0.0005 0.0005 0.0005 0.0005 0.0005
Waktu (detik) 300 320 330 340 350 360 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600
Absorbans 0.0005 0.0005 0.0005 0.0005 0.0005 0.0005 0.0005 0.0006 0.0006 0.0006 0.0006 0.0006 0.0006 0.0006 0.0006 0.0006 0.0006 0.0006 0.0006 0.0007 0.0007 0.0007 0.0007 0.0007 0.0007 0.0007 0.0007 0.0007 0.0007 0.0007 0.0007
18 Lampiran 6 Kerataan baseline λ (nm)
Abs
λ (nm)
Abs
λ (nm)
Abs
λ (nm)
Abs
190 191 192
0.00055 0.00055 0.00075
231 232 233
0.00033 0.00045 0.00035
272 273 274
0.00045 0.0004 0.00033
313 314 315
0.00077 0.00057 0.00033
193 194 195 196 197
0.00055 0.00065 0.00055 0.00035 0.00025
234 235 236 237 238
0.00033 0.00033 0.00033 0.00033 0.00033
275 276 277 278 279
0.0004 0.00045 0.00045 0.00045 0.00045
316 317 318 319 320
0.00047 0.00067 0.00077 0.00067 0.00047
198 199 200 201 202
0.00019 0.00018 0.00018 0.00018 0.00018
239 240 241 242 243
0.00033 0.00033 0.00033 0.00033 0.00033
280 281 282 283 284
0.00045 0.0004 0.00033 0.0004 0.00045
321 322 323 324 325
0.00042 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042
203 204 205 206 207
0.00018 0.00018 0.00018 0.00029 0.00033
244 245 246 247 248
0.00043 0.00035 0.00033 0.00033 0.00033
285 286 287 288 289
0.0004 0.00033 0.0004 0.00048 0.0004
326 327 328 329 330
0.00047 0.00057 0.00057 0.00057 0.00047
208 209 210 211
0.00033 0.00033 0.00033 0.00033
249 250 251 252
0.00033 0.00039 0.00045 0.00045
290 291 292 293
0.00038 0.00033 0.0004 0.00047
331 332 333 334
0.00042 0.00042 0.00042 0.00049
212 213 214 215 216
0.00033 0.00033 0.00033 0.00033 0.00033
253 254 255 256 257
0.00045 0.00045 0.00045 0.00045 0.00045
294 295 296 297 298
0.0004 0.00047 0.00057 0.00067 0.00047
335 336 337 338 339
0.00069 0.00084 0.00069 0.00084 0.00069
217 218 219 220 221
0.00033 0.00033 0.00033 0.00033 0.00033
258 259 260 261 262
0.00045 0.00037 0.00033 0.00037 0.00045
299 300 301 302 303
0.0004 0.00033 0.0004 0.00042 0.00043
340 341 342 343 344
0.00084 0.00069 0.00084 0.00069 0.00059
222 223 224 225 226
0.00033 0.00033 0.00033 0.00033 0.00033
263 264 265 266 267
0.00037 0.00033 0.00033 0.00033 0.00033
304 305 306 307 308
0.00047 0.00067 0.00057 0.00067 0.00057
345 346 347 348 349
0.00062 0.00065 0.00067 0.0007 0.00084
227 228 229 230
0.00033 0.00033 0.00033 0.00033
268 269 270 271
0.00039 0.00045 0.00045 0.00045
309 310 311 312
0.00067 0.00057 0.00047 0.00033
350 351 352 353
0.00062 0.0007 0.00084 0.00062
19 lanjutan Lampiran 6 Abs λ (nm)
λ (nm)
Abs
λ (nm)
Abs
λ (nm)
Abs
354
0.00084
395
0.00078
436
0.00053
477
0.00053
355 356 357 358 359
0.00074 0.00064 0.00063 0.00062 0.00057
396 397 398 399 400
0.00078 0.00078 0.00088 0.0012 0.00088
437 438 439 440 441
0.00045 0.00053 0.00045 0.00053 0.00045
478 479 480 481 482
0.00042 0.00053 0.00045 0.00045 0.00045
360 361 362 363
0.00042 0.0004 0.00057 0.00057
401 402 403 404
0.00078 0.00078 0.00078 0.00078
442 443 444 445
0.00053 0.00056 0.00059 0.00059
483 484 485 486
0.00045 0.00045 0.00045 0.00045
364 365 366 367 368
0.00057 0.00057 0.00067 0.00063 0.00053
405 406 407 408 409
0.00078 0.00078 0.00078 0.00078 0.00078
446 447 448 449 450
0.00059 0.00059 0.00059 0.00073 0.00059
487 488 489 490 491
0.00045 0.00045 0.00045 0.00045 0.00045
369 370 371 372 373
0.0004 0.0004 0.0004 0.00063 0.00053
410 411 412 413 414
0.00078 0.00078 0.00078 0.00078 0.00078
451 452 453 454 455
0.00059 0.00059 0.00059 0.00054 0.00044
492 493 494 495 496
0.00045 0.00042 0.00035 0.00042 0.00045
374 375 376 377 378
0.00051 0.00047 0.00051 0.00053 0.00058
415 416 417 418 419
0.00072 0.00072 0.00078 0.00072 0.00062
456 457 458 459 460
0.00044 0.00044 0.00044 0.00044 0.00057
497 498 499 500 501
0.00065 0.00045 0.00035 0.00035 0.00035
379 380 381 382 383
0.00067 0.00058 0.00053 0.00047 0.00058
420 421 422 423 424
0.00059 0.00078 0.00059 0.00062 0.00059
461 462 463 464 465
0.00059 0.00059 0.00059 0.00059 0.00057
502 503 504 505 506
0.00035 0.00032 0.00022 0.00022 0.00032
384 385 386 387
0.00047 0.00047 0.00058 -0.00015
425 426 427 428
0.00055 0.00055 0.00049 0.00045
466 467 468 469
0.00049 0.00042 0.00049 0.00057
507 508 509 510
0.00035 0.00032 0.00022 0.00021
388 389 390 391 392
-0.00075 0.00047 0.00078 0.00078 0.00078
429 430 431 432 433
0.00045 0.00049 0.00055 0.00065 0.00075
470 471 472 473 474
0.00049 0.00042 0.00042 0.00042 0.00042
511 512 513 514 515
0.00021 0.00021 0.00021 0.00024 0.00034
393 394
0.00078 0.00078
434 435
0.00065 0.00055
475 476
0.00053 0.00042
516 517
0.00024 0.0002
20 lanjutan Lampiran 6 Abs λ (nm)
λ (nm)
Abs
λ (nm)
Abs
λ (nm)
Abs
518
0.0002
559
-0.00009
600
-0.00032
641
-0.00055
519 520 521 522 523
0.0002 0.0002 0.00024 0.00034 0.00024
560 561 562 563 564
-0.00009 -0.00012 -0.00022 -0.00012 -0.00012
601 602 603 604 605
-0.00032 -0.00032 -0.00032 -0.00022 -0.00022
642 643 644 645 646
-0.00055 -0.00043 -0.00055 -0.00055 -0.00039
524 525 526 527
0.0002 0.0002 0.0002 0.00018
565 566 567 568
-0.00012 -0.00012 -0.00012 -0.00012
606 607 608 609
-0.00022 -0.00022 -0.00028 -0.00032
647 648 649 650
-0.00033 -0.00031 -0.00031 -0.00031
528 529 530 531 532
0.00012 0.0001 0.00018 -0.00025 -0.00015
569 570 571 572 573
-0.00022 -0.00022 -0.00022 -0.00022 -0.00022
610 611 612 613 614
-0.00028 -0.00022 -0.00022 -0.00022 -0.00022
651 652 653 654 655
-0.00031 -0.00031 -0.00031 -0.00031 -0.00031
533 534 535 536 537
0.00018 -0.00007 0.00018 -0.00007 -0.00007
574 575 576 577 578
-0.00022 -0.00022 -0.00022 -0.00022 -0.00022
615 616 617 618 619
-0.00022 -0.00022 -0.00022 -0.00022 -0.00022
656 657 658 659 660
-0.00031 -0.00031 -0.00021 -0.00031 -0.00031
538 539 540 541 542
-0.00007 0.00018 -0.00012 0.00008 -0.00009
579 580 581 582 583
-0.0001 -0.00012 -0.00022 -0.00022 -0.00022
620 621 622 623 624
-0.00022 -0.00022 -0.00022 -0.00022 -0.00022
661 662 663 664 665
-0.00021 -0.00021 -0.00021 -0.00021 -0.00021
543 544 545 546 547
-0.00009 -0.00009 -0.00009 -0.00009 -0.00009
584 585 586 587 588
-0.00022 -0.00022 -0.00022 -0.00022 -0.00022
625 626 627 628 629
-0.00022 -0.00022 -0.00022 -0.00022 -0.00022
666 667 668 669 670
-0.00021 -0.00021 -0.00021 -0.00021 -0.00021
548 549 550 551
-0.00009 -0.00009 -0.00009 -0.00009
589 590 591 592
-0.00022 -0.00022 -0.00012 -0.00022
630 631 632 633
-0.00022 -0.00022 -0.00022 -0.00022
671 672 673 674
-0.00011 -0.00021 -0.00011 -0.00011
552 553 554 555 556
-0.00009 -0.00009 -0.00012 -0.00019 -0.00012
593 594 595 596 597
-0.00022 -0.00022 -0.00022 -0.00022 -0.00032
634 635 636 637 638
-0.00022 -0.00022 -0.00028 -0.00033 -0.00043
675 676 677 678 679
-0.00011 -0.00011 -0.00011 -0.00011 -0.00011
557 558
-0.00009 -0.00009
598 599
-0.00032 -0.00032
639 640
-0.00053 -0.00043
680 681
-0.0002 -0.0002
21 lanjutan Lampiran 6 Abs λ (nm)
λ (nm)
Abs
λ (nm)
Abs
λ (nm)
Abs
682
-0.0002
687
-0.00032
692
-0.00032
697
-0.00022
683 684 685 686
-0.0002 -0.0002 -0.0002 -0.00022
688 689 690 691
-0.00032 -0.00032 -0.00032 -0.00032
693 694 695 696
-0.00022 -0.00032 -0.00032 -0.00022
698 699 700
-0.00022 -0.00022 -0.00022
Lampiran 7 Stabilitas sinyal Waktu (menit) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Absorbans 0.00020 0.00020 0.00020 0.00040 0.00040 0.00040 0.00040 0.00050 0.00050 0.00060 0.00060 0.00060 0.00060 0.00060 0.00060 0.00080 0.00080 0.00080 0.00080 0.00080 0.00080 0.00080 0.00080 0.00100 0.00100 0.00100 0.00100 0.00100 0.00100 0.0010
Waktu (menit) 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
Absorbans 0.00100 0.00100 0.00120 0.00120 0.00120 0.00120 0.00120 0.00120 0.00120 0.00120 0.00120 0.00120 0.00120 0.00120 0.00120 0.00120 0.00120 0.00120 0.00120 0.00120 0.00120 0.00120 0.00130 0.00130 0.00130 0.00130 0.00130 0.00130 0.00130 0.00130
22 Lampiran 8 Akurasi fotometri Abs Pengukuran 0.6462 0.6413 0.6422 0.2941 0.2933 0.2941 0.8646 0.8640 0.8661 0.7467 0.7470 0.7473
λ (nm) 350
313
257
235
Rerata
s
Abs Teoretis
Uji t
0.6432
0.0026
0.6400
diterima
0.2938
0.0005
0.2920
diterima
0.8649
0.0011
0.8650
diterima
0.7470
0.0003
0.7480
diterima
Contoh perhitungan: S=
=0.0026
thitung : thitung : thitung : 2.13 ttabel(n = 3, a = 0.05) = 4.3027 thitung < ttabel, sehingga nilai hasil pengukuran tidak berbeda signifikan dengan nilai teoretis.
Spektrum larutan K2Cr2O7
23 Lampiran 9 Linearitas λ(nm)
350
313
257
235
[K2Cr2O7] (mg/L) 20 40 60 80 100 20 40 60 80 100 20 40 60 80 100 20 40 60 80 100
Absorbans 0.2080 0.4032 0.5854 0.7509 0.9193 0.0945 0.1662 0.2455 0.3257 0.4122 0.2814 0.5541 0.7506 0.9780 1.2418 0.2437 0.4501 0.6371 0.8429 1.0869
r
Persamaan regresi linear
0.9988
y = 0.0089x + 0.0423
0.9989
y = 0.0040x + 0.0104
0.9973
y = 0.0118x + 0.0528
0.9978
y = 0.0104x + 0.0284
24 Lampiran 10 Kadar ambroksol HCl pada standar sekunder Bobot (mg) 31
Konsentrasi (mg/mL) 0.0305
31
0.0310
30
0.0303
30
0.0304
31
0.0309
30
0.0304
31
0.0305
Standar
Absorbans
Primer Sekunder Sekunder Sekunder Sekunder Sekunder Sekunder Sekunder Sekunder Sekunder Sekunder Sekunder Sekunder Sekunder Sekunder Sekunder Sekunder Sekunder Sekunder
0.8792 0.8956 0.8953 0.8953 0.8749 0.8741 0.8744 0.8778 0.8776 0.8786 0.8985 0.8978 0.8988 0.8766 0.8767 0.8766 0.8838 0.8841 0.8831
Kadar ambroksol HCl (%) 100.22 100.19 100.19 100.17 100.08 100.11 100.17 100.15 100.26 100.87 100.79 100.91 100.03 100.04 100.03 100.52 100.56 100.44 Rerata
Rerata (%)
100.20
100.12
100.19
100.86
100.04
100.51 100.32
Contoh perhitungan: Kadar Ambroksol HCl = Kadar Ambroksol HCl =
100 100
Kadar Ambroksol HCl = 100.20%
25 Lampiran 11 Linearitas metode pengentuan kadar ambroksol HCl Ulangan
1
2
3
4
5
6
Konsentrasi (mg/mL) 0.02412 0.02700 0.03018 0.03306 0.03600 0.02436 0.02718 0.03012 0.03324 0.03606 0.02424 0.02706 0.03036 0.03312 0.03618 0.02400 0.02730 0.03012 0.03300 0.03642 0.02442 0.02718 0.03024 0.03312 0.03606 0.02412 0.02730 0.03006 0.03336 0.03618
Bobot (mg) 40 45 50 55 60 41 45 50 55 60 40 45 51 55 60 40 46 50 55 61 41 45 50 55 60 40 46 50 56 60
Absorbans 0.5496 0.677 0.8868 1.0264 1.2049 0.5569 0.6989 0.8651 1.0486 1.1957 0.5537 0.6929 0.9068 1.0299 1.2029 0.5436 0.70829 0.8847 1.0244 1.2056 0.5575 0.7008 0.8847 1.0244 1.2056 0.5488 0.6928 0.8829 1.0501 1.2034 Rerata
Persamaan regresi
r
y = 54.3880x - 0.7705
0.9970
y = 55.9370x - 0.8158
0.9994
y = 56.6871x - 0.7739
0.9976
y = 53.6706x - 0.7458
0.9988
y = 55.4496x - 0.8002
0.9989
y = 55.1635x - 0.8031
0.9970
y = 55.2160x - 0.7849
0.9981
26 Lampiran 12 Hasil penentuan parameter statistika kurva standar ambroksol HCl xi
(xi-X)
(xi-X)2
x i2
0.0240 0.0270 0.0300 0.0330 0.0360
-0.0060 -0.0030 0.0000 0.0030 0.0060
3.6x10-5 9.0x10-6 0.0000 9.0x10-6 3.6x10-5
5.8x10-4 7.3x10-4 9.0x10-4 10.9x10-4 13.0x10-4
yi
Y
0.5517 0.6918 0.8885 1.0340 1.2030
0.5403 0.7059 0.8716 1.0372 1.2029
(yi-Y)
(yi-Y)2
0.0114 -0.0142 0.0169 -0.0033 0.0001
0.0001 0.0002 0.00029 1.1x10-5 1.6x10-8
Persamaan regresi rerata : y = 55.2160x - 0.7849 Σxi2 = 0.00459 Σ(yi-Y)2 = 0.000627 Σ(xi-X)2 = 9x10-5 Simpangan baku regresi (Sr) = S = Simpangan baku intersep (Sa) = S = Sr Simpangan baku kemiringan (Sb)
= 0.0144 = 0.0462 = 1.5236
Selang kepercayaan intersep untuk a = 0.05 dan derajat bebas = 7 (ttabel = 2.36) ialah: a + tSa = 0.7849 + (2.36)(0.0462)
= 0.7849 + 0.1089
Selang kepercayaan kemiringan garis untuk a = 0.05 dan derajat bebas = 7 (ttabel = 2.36) yaitu: b + tSb = 55.2160 + (2.36)( 1.5236)
= 55.2160 + 3.5957
Lampiran 13 Penentuan Limit Deteksi dan Limit Kuantisasi
LD = 0.0028 mg/L
LK = 0.0084 mg/L
Keterangan di persamaan (1) dan (2) Lampiran 14 Perolehan kembali metode pengukuran kadar ambroksol HCl
27 Standar ambroksol HCl (mg) Ditambahkan Terukur Ditemukan
Perolehan kembali (%)
1.2000
31.0376
1.2129
101.07
1.2000 1.2000 1.8000
31.0387 31.0342 31.6394
1.2140 1.2095 1.8147
101.17 100.79 100.82
1.8000 1.8000 2.4000
31.6456 31.6456 32.2474
1.8209 1.8209 2.4227
101.16 101.16 100.95
2.4000 2.4000
32.2567 32.2593
2.4320 2.4346
101.33 101.44
Rerata (%)
Batas Galat
SBR (%)
101.0 1
0.0049
0.0020
101.0 5
0.0049
0.0020
101.2 4
0.0065
0.0026
Contoh perhitungan untuk jumlah standar yang ditambahkan: Perolehan kembali (%) = 100% (%) =
100%
(%) = 101.07% Keterangan: a = konsentrasi contoh + konsentrasi standar yang terukur b = konsentrasi contoh c = konsentrasi standar teoretis yang ditambahkan Simpangan baku (SB) =
= 0.0020 mg
Simpangan baku relatif (%) = =
100% 100%
= 0.0020 mg Batas galat
=
= = 0.0049 mg
