UJI IMUNOSTIMULAN EKSTRAK AIR β-GLUKAN JAMUR TIRAM PUTIH (Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm) BERDASARKAN JUMLAH LIMFOSIT T DAN LIMFOSIT TOTAL MENCIT IMMUNOSTIMULANT ASSAY OF WATER SOLUBLE Β-GLUCAN EXTRACT WHITE OYSTER MUSHROOMS (PLEUROTUS OSTREATUS (JACQ.) P. KUMM) BASED ON THE NUMBER OF T LYMPHOCYTE AND TOTAL LYMPHOCYTE Malihatur Rosyidah, Priyo Wahyudi dan Ani Pahriyani Fakultas Farmasi dan Sains Universitas Muhammadiyah Prof. Dr. Hamka
Abstract White oyster musrooms (WOM) (Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm) is well known as high nutrient edible mushroom. It contained β-glucan that has immunomodulator activity. Research aimed at knowing immunostimulant activity of water soluble β-glucans extract of WOM on specific cellular immune system based on the number of T lymphocyte and total lymphocyte. This research used white male BALB/c mice divided into 6 groups with 4 mice each group. Group 1 was normal control group. Group II was negative control group. Group III was positive control group were given Imboost. Group IV, V, and VI was dose group were given water soluble β-glucans extract of WOM dose of 100 mg/kg, 200 mg/kg, and 400 mg/kg body weight. The immunostimulant were given orally for 12 days, which at day 8th mice were induced by 1% sheep red blood cells (SRBC) intraperitoneally. Blood samples were collected retro-orbitally at day 13rd for counting the number of T lymphocyte (rosette cell) and total lymphocyte. By oneway ANOVA showed that the number of T lymphocyte and total lymphocyte of all group have significant differences (p<0,15). The LSD result showed that water soluble β-glucans extract of WOM has immunostimulatory activity on the specific cellular immune system at dose of 400 mg/kg body weight based on the number of T lymphocyte and total lymphocyte. Keywords : White oyster mushrooms, β-glucan, immunostimulant Abstrak Jamur tiram putih merupakan jamur pangan bergizi tinggi. Senyawa β-glukan yang terkandung dalam jamur tiram putih memiliki aktivitas sebagai imunomodulator. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas ekstrak air β-glukan jamur tiram putih sebagai imunostimulan terhadap sistem imun spesifik selular berdasarkan jumlah sel limfosit T dan limfosit total. Penelitian ini menggunakan mencit putih BALB/c jantan dibagi 6 kelompok perlakuan, masingmasing terdiri dari 4 ekor mencit. Kelompok I (kontrol normal), kelompok II (kontrol negatif), kelompok III (kontrol positif) diberi imboost, kelompok IV, V, dan VI (kelompok dosis) diberi ekstrak air β-glukan jamur tiram putih dosis 100 mg/kg BB, 200 mg/kg BB, dan 400 mg/kg BB. Sediaan imunostimulan diberikan per oral selama 12 hari, pada hari ke-8 mencit diinduksi 1% SDMD 0,2 ml/20 g
BB intraperitoneal, kemudian dilakukan pengambilan darah mata pada hari ke-13 untuk pemeriksaan jumlah limfosit T (sel roset) menggunakan haemocytometer dan limfosit total menggunakan hematology analyzer. Uji ANOVA satu arah terhadap data jumlah sel limfosit T dan limfosit total menunjukkan adanya perbedaan bermakna antar kelompok uji (p<0,15). Hasil LSD menunjukkan bahwa ekstrak air β-glukan jamur tiram putih mempunyai efek imunostimulan sistem imun spesifik selular pada dosis 400 mg/kg BB sebanding dengan kelompok positif berdasarkan jumlah limfosit T dan limfosit total. Kata kunci : jamur tiram putih, β-glukan, imunostimulan
PENDAHULUAN
Jamur tiram putih (Pleurotus ostreatus) merupakan jamur kayu yang mudah dibudidayakan dan termasuk jamur pangan potensial dengan nilai gizi tinggi. Pleurotus ostreatus mengandung protein, karbohidrat, asam amino, vitamin B1, B2, B3, B5, B7, vitamin C dan mineral (Widyastuti, N, 2003). Senyawa β-glukan merupakan polisakarida yang secara alami terdapat pada padi-padian, ragi, bakteri, alga, dan jamur. Beta-glukan memiliki kemampuan sebagai antibakteri, antivirus, dan imunomodulator untuk pencegahan dan pengobatan penyakit pada manusia (Hozova, B, 2004). Hasil isolasi β-glukan dari jamur tiram putih disebut pleuran dengan struktur komponen aktifnya β-1,3-glukan (Chan, G.F.C, 2009). Aktivitas imunomodulator yang berbeda dari β-glukan ditentukan oleh kelarutan, ukuran molekul serta bentuk dan banyaknya cabang (Sarangi, I, 2006). Saat ini, penelitian mengenai terapi penyakit-penyakit terkait sistem imun terus dikembangkan, baik terhadap sistem imun nonspesifik maupun sistem imun spesifik. Sistem imun spesifik mampu mengenali benda asing dan
membedakannya dari sel jaringan sendiri. Sel limfosit merupakan sel yang berperan utama dalam sistem imun spesifik, sel T pada imunitas selular dan sel B pada imunitas humoral (Bratawidjaja, K.G, 2009). Ekstrak air β-glukan jamur tiram putih telah dilaporkan memiliki aktivitas imunomodulator terhadap sistem imun nonspesifik dengan peningkatan aktivitas dan kapasitas sel makrofag secara in vitro pada konsentrasi 100 ppm (Ramdhani, M.C, 2009) dan peningkatan nilai bersihan karbon secara in vivo pada dosis 200 mg/kg BB (Elvayanti, M, 2011). Pemeriksaan jumlah limfosit merupakan salah satu cara yang dapat menjelaskan bioaktivitas imunomodulasi terhadap sistem imun spesifik. Kuantitas limfosit T mampu menjelaskan fungsi limfosit sebagai imunitas selular untuk melawan patogen seperti virus dan keganasan (Jawetz, 2007). METODOLOGI PENELITIAN
Bahan Jamur tiram putih kering (Pleurotus ostreatus), mencit putih jantan galur BALB/c dengan bobot badan 25 – 35 g, sel darah merah domba (SDMD), sirup Combantrin, sirup Amoxicillin, sirup Imboost,
etanol 80%, NaOH 0,2 M, congo red 2x10-4 M, larutan steril NaCl 0,9%, eter, ficoll-hypaque, media RPMI1640 dan akuades. Alat
Blender, refrigerator, sentrifuge, Spektrofotometer Uv-Vis, moisture analyzer, inkubator, timbangan dan kandang hewan uji, sonde, timbangan analitik, alat suntik steril, pipa kapiler, tabung EDTA, tabung heparin, eppendorf, haemocytometer, mikroskop, hematology analyzer Beckman Coulter Ac.T diff, erlenmeyer, gelas beker. Prosedur 1. Ekstraksi β-glukan larut air dari jamur tiram putih Sebanyak 960 g serbuk kering jamur tiram putih diekstraksi dengan air sebanyak 9 kali volume (8640 ml), kemudian dididihkan selama 3 jam. Filtrat hasil ekstraksi disaring dan diukur. Ditambahkan etanol 80% sebanyak 3 kali volume filtrat, kemudian didiamkan pada suhu 4 o C selama 24 jam, residu larutan disentrifugasi pada 4000 rpm selama 20 menit. Endapan yang diperoleh dikeringdinginkan (freeze dry) (Chihara,G, 1970). Dilakukan pemeriksaan mutu ekstrak yang meliputi pemeriksaan organoleptis, kadar air, perhitungan rendemen dan identifikasi kualitatif dengan spektrofotometer uV-Vis menggunakan metode congo red. 2. Uji imunostimulator a. Rancangan penelitian Mencit dibagi menjadi 6 kelompok perlakuan, ditentukan berdasarkan rumus federer, sehingga jumlah mencit tiap kelompok
sebanyak 4 ekor (Hanafiah, K.A, 1993). Tabel I. Kelompok Uji Kelompok Normal Negatif Positif
Dosis I
Dosis II
Dosis III
Perlakuan Aquadest Aquadest dan diinduksi SDMD imboost (0,039 ml/ 20 g BB) dan dinduksi SDMD Ekstrak air β-glukan dosis 100 mg/kg BB dan diinduksi SDMD Ekstrak air β-glukan dosis 200 mg/kg BB dan diinduksi SDMD Ekstrak air β-glukan dosis 400 mg/kg BB dan diinduksi SDMD
b. Perlakuan hewan uji Hewan uji ditimbang satu persatu. Tiap kelompok perlakuan diberi sediaan uji sehari sekali selama 12 hari secara per oral. Pada hari ke-8, mencit diinduksi dengan 1% SDMD 0,2 ml/ 20 g BB secara intraperitoneal kemudian dilakukan pengambilan darah mata pada hari ke-13. c. Penghitungan populasi sel limfosit T Sejumlah 1 ml darah mencit dituang ke dalam tabung heparin, selanjutnya diencerkan dengan larutan NaCl 0,9% (1:1). Sampel uji dilapiskan di atas 2 ml Ficoll Hypaque dalam tabung sentrifus, disentrifugasi pada 4000 rpm selama 10 menit. Lapisan “buffy-coat” diambil dengan pipet dan dicuci 1 kali dengan NaCl 0,9% secara sentrifugasi pada 1000 rpm selama 10 menit, kemudian diresuspensi dengan media RPMI-1640 dan SDMD 1%
dengan perbandingan volume sama (1:1:1), kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit dan disimpan pada suhu 4 oC selama 1 jam. Dihitung jumlah sel roset yang terbentuk dengan haemocytometer (sel limfosit T/ml darah) (Hay, F.C, 2002). Sel T/ml=
x 104
d. Penentuan populasi sel limfosit total Sejumlah 0,5 ml darah mencit dituang ke dalam tabung EDTA, selanjutnya diuji menggunakan hematology analyzer (sel limfosit total/ml darah). HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstrak kering β-glukan larut air dari jamur tiram putih yang diperoleh memiliki bau khas, rasa agak pahit dan warna coklat serta memiliki kadar air sebesar 7,78%. Hasil identifikasi secara kualitatif dengan metode congo red menggunakan spektrofotometer Uv-Vis terhadap βglukan ekstrak air jamur tiram putih
memberikan serapan pada panjang gelombang 494,00 nm. Jumlah limfosit T dihitung berdasarkan jumlah sel roset yang terbentuk yaitu sel limfosit T yang dikelilingi oleh SDMD. Sel limfosit T memiliki reseptor untuk sel darah merah domba yang akan membentuk roset bila kedua sel dicampur (Bratawidjaja, K.G, 2009). SDMD berperan sebagai antigen eksogen non-mikroba yang akan merangsang sistem imun untuk melakukan sistem pertahanan tubuh (Watson, R, 2002). Pengambilan darah dilakukan pada hari ke-5 setelah induksi untuk memperoleh sel limfosit dalam jumlah tertinggi (Bratawidjaja, K.G, 2009). Berikut adalah grafik hasil uji aktivitas imunostimulan sistem imun spesifik berdasarkan perhitungan jumlah sel limfosit T (Gambar.1). Pada penentuan jumlah sel limfosit T, menunjukkan bahwa dengan adanya peningkatan dosis maka jumlah limfosit T juga semakin meningkat. Jumlah limfosit T tertinggi terdapat pada dosis III yaitu 400 mg/kg BB.
Gambar 1. Grafik batang rata-rata jumlah limfosit T mencit pada hari ke-13
Tabel II. Anova satu arah terhadap data jumlah limfosit T Sumber Ragam Kelompok Uji Galat Total
Jumlah Kuadrat 2,129 0,385 2,513
Derajat Bebas
Kuadrat Tengah 0,426 0,021
5 18 23
Hasil ANAVA satu arah dengan taraf kepercayaan 85% atau α = 0,15 terhadap data jumlah limfosit T menunjukkan adanya perbedaan yang bermakna antar kelompok perlakuan (p<0,15). Analisis dilanjutkan dengan uji BNT atau LSD. Hasil uji lanjutan LSD terhadap data jumlah sel limfosit T diketahui bahwa kontrol normal berbeda bermakna dengan seluruh perlakuan, kontrol negatif tidak berbeda bermakna dengan dosis I dan dosis II, Kontrol positif tidak berbeda bermakna dengan dosis III (21,50 x 103 sel/ml darah). Sehingga dari analisa menunjukkan bahwa dosis III
F hitung 19,923
Sig. 0,000
merupakan dosis yang paling efektif dalam meningkatkan limfosit T yang sebanding dengan kontrol positif (22,25 x 103 sel/ml darah), sementara dosis I dan dosis II tidak memberikan efek karena sebanding dengan kontrol negatif (11,50 x 103 sel/ml darah). Pengukuran limfosit total dilakukan dengan menggunakan hematology analyzer berdasarkan ukuran sel yang melewati suatu celah detektor. Gambar.2 berikut memperlihatkan adanya peningkatan jumlah limfosit total pada dosis I dan II yang kemudian menurun pada dosis III.
Gambar 2. Grafik batang rata-rata jumlah limfosit total mencit pada hari ke-13 Tabel III. Anova satu arah terhadap data jumlah limfosit Total Sumber Ragam Kelompok Uji Galat Total
Jumlah Kuadrat 1,132 0,097 1,228
Derajat Bebas
Kuadrat Tengah 5 18 23
0,226 0,005
F hitung 42,163
Sig. 0,000
Hasil analisis variansi satu arah dengan taraf kepercayaan 85% atau α = 0,15 terhadap data jumlah limfosit total menunjukkan adanya perbedaan yang bermakna antar kelompok perlakuan (p<0,15). Analisis dilanjutkan dengan uji BNT atau LSD. Hasil uji LSD terhadap data jumlah sel limfosit total diketahui bahwa kontrol normal berbeda bermakna dengan semua kelompok perlakuan, kontrol negatif berbeda bermakna dengan semua kelompok perlakuan, kontrol positif tidak berbeda bermakna dengan dosis III, sementara dosis I dan dosis III berbeda bermakna dengan kontrol positif. Sehingga dari hasil analisa dapat dinyatakan bahwa dosis III (400 mg/kg BB) merupakan dosis yang efektif dalam meningkatkan jumlah limfosit total sebesar 4,90 x 106 sel/ml darah karena sebanding dengan kontrol positif (4,57 x 106 sel/ml darah). Mekanisme imunostimulan senyawa β-glukan yang masuk ke dalam tubuh dimulai dengan pengikatan β-glukan pada reseptor komplemen CR3 membran makrofag untuk selanjutnya difragmentasi oleh sel melalui ikatan dengan Mayor Histocompatibility Complex (MHC) membentuk Antigen Prensenting Cell (APC) (Sarangi, I., 2006 dan Radji, M, 2010). Glukan yang terikat akan mengaktivasi makrofag dan sel akan memproduksi beberapa sitokin untuk menginduksi respon imun spesifik (Rop, O, 2009). Interleukin I yang diproduksi oleh APC akan merangsang sel Th pada sistem imun spesifik. Kemudian sel Th akan memproduksi interleukin 2 yang
akan merangsang sel Tc (sel T sitotoksik) dan sel B. Sel Tc akan berikatan dengan sel normal yang terinfeksi antigen intraselular seperti; bakteri, virus, jamur, parasit dan keganasan untuk kemudian melisiskannya dengan perforin yaitu sitokin yang dapat membuat lubanglubang kecil pada membran sel sasaran (Bratawidjaja, K.G, 2009). Pemberian imunostimulator dimaksudkan untuk mempersiapkan sistem imun dalam menghadapi antigen yang masuk setelah induksi. Berdasarkan hasil penelitian ini terbukti bahwa ekstrak β-glukan larut air dari jamur tiram putih (Pleurotus ostreatus) mempunyai efek sebagai imunostimulator sistem imun spesifik selular. Dosis 400 mg/kg BB merupakan dosis yang paling efektif sebagai imunostimulan sistem imun spesifik selular yang sebanding dengan kontrol positif dengan jumlah sel limfosit T dan limfosit total pada hari ke-13 masing-masing sebesar 21,50x103 sel/ml darah sebesar 4,90 x106 sel/ml darah. KESIMPULAN Ekstrak air β-glukan jamur tiram putih (Pleurotus ostreatus) mempunyai efek sebagai imunostimulator sistem imun spesifik selular pada dosis 400 mg/kg BB berdasarkan jumlah limfosit T dan limfosit total pada mencit. DAFTAR PUSTAKA Baratawidjaja, K. G., dan I. Rengganis. 2009. Imunologi Dasar. Edisi 9. FKUI, Jakarta. Hal. 40, 95, 98, 112 - 133, 151, 524, 671, 674 Chan, G.F.C., W.K. Chan., dan D.M.Y. Sze2. 2009. Review The Effect of β-glucan on
Human Immune and cancer cells. Dalam : Jurnal of Hematology&Oncology. Vol 2, No.25. BioMed Central, Hongkong. Hal. 1 - 11 Chihara, G., J. Hamuro, Y.Y. Maeda, dan F. Fukuoka. 1970. Fraction and purification of the polysaccharides with marked antitumor activity, especially lentinan, from Lentinus edodes (Berk) Sing (an Edible Mushroom). Dalam Jurnal : National cancer Research Institute Vol 30, Japan. Hal. 2779 Elvayanti, M. 2011. Uji Efek Imunostimulator β-Glukan Larut Air dari Jamur Tiram Putih (Pleurotus ostreatus) Melalui Pengukuran Kliren Karbon pada Darah Mencit. Skripsi. Fakultas MIPA UHAMKA, Jakarta. Hanafiah, K.A. 1993. Rancangan Percobaan Teori dan Aplikasi. Edisi 2, cetakan 2. Citra Niaga Rajawali, Jakarta. Hal. 6 – 7 Hay, F.C. 2002. Practical Imunology fourth edition. Blackwell Science, London. Hal 243eberendu Hozova, B., L. Kuniak, dan B. Kelemenova. 2004. Application of β-D-Glucans Isolated from Mushrooms Pleurotus ostreatus (Pleuran) and Lentinus edodes (Lentinan) for Increasing the Bioactivity of Yoghurts. Dalam : jurnal Czech J. Food Sci Vol.22, No.6. Faculty of Chemical and food Technology Slovak University of Technology, Slovak Republic. Hal.204 - 214
Jawetz, Melnick, dan Adelberg’s. 2007. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi 23. Buku Kedokteran EGC, Jakarta. Hal. 121, 140 Radji, M. 2010. Imunologi dan Virologi. Cetakan pertama. PT. ISFI Penerbitan, Jakarta. Hal. 1 2, 4 - 5, 23, 25, 34, 36 - 37 Ramdhani, M.C. 2009. Uji Aktivitas Imunomodulator Polisakarida dari Jamur Tiram Putih (Pleurotus ostreatus (Jacq.) P.kumm) Melalui Aktivitas dan Kapasitas Fagositosis Sel Makrofag Peritonium Mencit Secara In Vitro. Skripsi. Fakultas MIPA UHAMKA, Jakarta. Rop, O., J. Mlcek dan T. Jurikova. 2009. Beta-glucans in Higher Fungi and Their Health Effect. Dalam : Article Nutrition Reviews. Vol. 67, No. 11. International Life Sciences Institute, Slovak Republic. Hal. 624 – 631. Sarangi, I., D. Ghosh, S.K. Bhutia, S.K. Mallick, dan T.K. Maiti. 2006. Anti-tumor and Immunomodulating Effects of Pleurotus ostreatus Myceliaderived Proteoglycans. Dalam : Jurnal International Imunopharmacology. Vol 6. Departement of Biotechnology Indian Institute of Technology, India. Hal. 1288 Watson, R. 2002. Anatomi dan Fisiologi untuk perawat edisi 10. Buku Kedokteran ECG, Jakarta. Hal 234 - 235 Widyastuti, N., H. Isnawan., Donowati, Jamil, dan Uswindraningsih. 2003. Teknologi Bioproses
Pembibitan dan Produksi Jamur Tiram untuk Peningkatan Nilai Tambah Pertanian. Dalam: Jurnal Sains dan Teknologi Vol. II. BPPT, Jakarta. Hal. 123
