Uji Efektivitas Pengawet (AET) dalam Sediaan Obat Marlia Singgih Wibowo Sekolah Farmasi ITB Februari 2014
Apa itu AET? • Mengacu pada USP Chapter <51>, the Antimicrobial Effectiveness Test (AET) adalah uji untuk membuktikan effectiveness dari suatu sistem preservative dalam suatu produk • Produk di inokulasi dengan mikroorganisme spesifik dgn jumlah diketahui. Uji tersebut membandingkan jumlah mikroorganisme dalam bahan kontrol terhadap sample selama periode 28 hari.
Apa itu preservatives? • Antimicrobial preservatives adalah senyawa yang ditambahkan ke dalam non‐sterile dosage forms untuk melindungi nya dari pertumbuhan microorganisme atau dari mikroorganisme yang masuk ke dalam prosuk selama atau setelah proses manufacturing. • Dalam hal sediaan steril dikemas dalam wadah dosis ganda, antimicrobial preservatives berfungsi untuk menghambat pertumbuhan mikroorganisme yang mungkin masuk ke dalam produk selama proses penggunaan pengambilan berulang. Contoh antimicrobial preservatives misalnya alkohol, formaldehid dan iodine.
Mengapa harus menambah pengawet dalam sediaan obat? • For Non‐sterile Dosage Forms To protect from microbiological growth or from microorganisms that are introduced during or subsequent to the manufacturing process.* • For Sterile Dosage Forms For products packaged in multi‐dose containers, to inhibit growth of microorganisms that might be introduced from repeatedly withdrawing doses.* *USP Chapter <51>
Beberapa jenis pengawet • Benzoic acid and garam nya • Sorbic acid and garam nya • Parabens
Antimicrobial Effectiveness Test • AET di beberapa kompendial dikenal dengan istilah : 1. Antimicrobial Effectiveness Test (USP) 2. Efficacy of Antimicrobial Preservation (EP) 3. Preservation Effectiveness Test (JP) • Mikroorganisme uji : bakteri, kapang, khamir • Product requirements : biasanya 20‐100mL
AET bedasarkan Farmakope • Not truly harmonized around the world • USP Chapter <51> “Antimicrobial Effectiveness Test” while EP Chapter 5.1.3 “Efficacy of Antimicrobial Preservation” • Testing to confirm that the preservatives added in a formulation will work as expected over time. • Used during formulation development and in stability programs.
Prosedur Dasar • Gunakan mikroorganisme specific ATCC (atau sumber lain yg sah) : – Escherichia coli (required for USP, recommended for oral products for EP) – Pseudomonas aeruginosa – Staphylococcus aureus – Candida albicans – Aspergillus brasiliensis
Additional/tambahan Organisme • Zygosaccharomyces rouxii (EP) untuk produk dengan kadar gula tinggi • Atau isolat2 dari lingkungan • menurut EP: “…designated microorganisms are supplemented, where appropriate, by other strains or species that may represent likely contaminants to the preparation.” • Untuk sediaan parenteral, mungkin dapat dimasukkan mikroorganisme nosocomial infections.
Examples : • Resistant organism in cosmetic formulation : Bacillus • Nosocomial Organisms : Serratia marscens, Candida albicans, Streptococcus, Staphylococcus aureus
Catergory of product (USP)
Test Microorganisms • Menurut USP <51>, 5 mikroorganisme indikator digunakan untuk uji preservative system dalam suatu produk. • Tiga dari lima USP indicator organisms : Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa, and Staphylococcus aureus, uji untuk pertumbuhan bakteri. • Candida albicans sebagai representative utk yeast, sedangkan Aspergillus niger adalah kapang
• Mikroorganisme tersebut adalah dari koleksi ATCC dan harus disiapkan sesuai prosedur USP untuk menjamin viabilitasnya . (mikroorganisme lain dapat digunakan sesuai kebutuhan nya) • Suatu produk di inokulasi (sengaja di kontaminasi) dengan sejumlah mikroorganisme antara 1 x 105 (100,000) to 1 x 106 (1,000,000) colony forming units (CFU) per mL produk. • Pada rentang yg bervariasi, tgt category, produk diuji ntuk menetapkan kemampuannya mengontrol reproduksi atau membunuh mikroorganisme.
Product criteria • A logarithmic reduction is evaluated at each test interval required for the category. By test definition, any growth over the allotted amount for any of the indicated microorganisms renders the preservative in the product not effective. • Jadi hal penting adalah : Pengurangan jumlah logaritmik
Garis besar prosedur • Untuk setiap mikroorganisme uji ditempatkan pada wadah terpisah, termasuk juga kontrol positif dan kontrol negatif. • Sampel yang akan diuji di tempatkan pada wadah steril dan terlindung dari cahaya. • PASTIKAN inokulum mikroorganisme uji yang disiapkan telah diketahui dengan pasti jumlah koloni nya (CFU/mL) yaitu antara 105 ‐ 106 cfu/mL • Biakan mikroorganisme harus disiapkan segar/baru (freshly prepared)
• Lakukan uji rekoveri (perolehan kembali) untuk menjamin jumlah mikroba yang diinokulasikan ke dalam produk/sampel. • Untuk EP, perlu dilakukan recovery jam ke 0 • Simpan /inkubasi sampel uji pada suhu 22.5±2.5ºC selama waktu yg telah ditetapkan untuk masing2 kategori . • Saat pengamatan pada selang waktu yang ditentukan, ambil sejumlah volume sampel, lalu lakukan TPC.
• Tentukan log 10 dari konsentrasi mikroorganisme yang tertinggal dalam sampel dan bandingkan hasilnya untuk setiap jenis mikroorganisme dengan menggunakan tabel. • Setiap produk memiliki persyaratan masing‐ masing. • Tidak boleh ada penambahan lebih besar dari 0.5 log 10 perhitungan nya.
Kapan Validasi? • Saat pertama kali suatu produk diuji untuk Antimicrobial Effectiveness, perlu dilakukan validasi untuk menjamin formula yang diuji dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme. • Full validation harus dilakukan dalam 3 (three) pekerjaan independent , dan setiap pekerjaan harus menunjukkan recovery pertumbuhan mikroorganisme pada inokulum dan kontrol tidak berbeda kurang dari 70% (not less than 70% of the growth inoculum versus the control)
Kapan harus re‐validasi? Revalidasi perlu dilakukan jika ada perubahan formula produk, atau proses produksi, atau perubahan pada pengemasan.
• Jika produk dalam bentuk cair, volume yg diperlukan tidak kurang dari 20 mL • Jika bentuk granular atau powder diperlukan 20 grams. • Validasi untuk produk tersebut memerlukan tambahan 100 mL atau grams.
• Uji di bawah kondisi normal memerlukan waktu uji selama 7 minggu mulai dari persiapan mikroorganisme sampai uji selesai.
Validasi untuk produk yang di inaktivasi • Harus dapat membuktikan inaktivasi pengawet dengan menunjukkan adanya pertumbuhan mikroorganisme dgn adanya pengawet. (bukti bhw inaktivasi berhasil) • Inaktivasi dpt dilakukan dengan cara • menggunakan neutralizers • Pengenceran /Dilution • Untuk sediaan Parenteral, dpt menggunakan Bacteriostasis/Fungistasis
Hal hal berikut harus dinyatakan • Neutralizer Efficacy – utk membuktikan The neutralizer effectiveness • Neutralizer Toxicity – tidak boleh toxic thp microorganisms. • The challenge cfu harus tidak boleh kurang dari 70% viable count.
The neutralizer (inactivating agent) harus memenuhi kriteria berikut : • Tidak memberikan efek inhibisi terhadap mikroorganisme • Harus benar‐benar menghilangan aktivitas pengawet • Jika inaktivasi terjadi, pastikan bahwa produk akhir nya tidak toksik thp mikroorganisme.
Sumber Variabilitas • Sumber mikroorganisme • ATCC • Berbagai sumber lain / collections • Pertumbuhan dan cara panen • Asal biakan : Liquid vs agar cultures • Komposisi buffers • Komposisi neutralizers • Cara perhitungan Plate counting • Konversi /Mathematical transformations
Jika uji ini dilakukan oleh Lab lain (sub contract) maka pastikan bahwa lab tersebut : • memiliki knowledge ttg bgm melaksanakan uji tsb • memahami bhw uji ini tidak mudah • harus selalu update thp perubahan pada kompendia • harus siap dan selalu punya kontrol thp proses uji • selalu mendokumentasikan setiap uji secara lengkap
Finish
