UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK DAUN Premna oblongata Miq. DENGAN METODE DPPH DAN IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA KIMIA DARI FRAKSI TERAKTIF SKRIPSI

UNIVERSITAS INDONESIA

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK DAUN Premna oblongata Miq. DENGAN METODE DPPH DAN IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA KIMIA DARI FRAKSI TERAKTIF

SKRIPSI

ATIKA BENDRA 0806364441

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM PROGRAM STUDI EKSTENSI FARMASI DEPOK JULI 2012 i

Uji aktivitas..., Atika Bendra, FMIPA UI, 2012

UNIVERSITAS INDONESIA

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK DAUN Premna oblongata Miq. DENGAN METODE DPPH DAN IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA KIMIA DARI FRAKSI TERAKTIF

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

ATIKA BENDRA 0806364441

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM PROGRAM STUDI EKSTENSI FARMASI DEPOK JULI 2012 ii





KATA PENGANTAR

Alhamdulillahirabbil’alamin, puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunianya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Penulisan skripsi ini dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi pada Departemen Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia. Penulis menyadari bahwa tanpa bantuan, dukungan, dan bimbingan dari berbagai pihak, sangatlah sulit untuk menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada: (1)

Ibu Dr. Katrin, M.S. selaku pembimbing yang telah menyediakan waktu, pikiran, tenaga, dan ilmu untuk membimbing penulis selama proses penelitian hingga penyusunan skripsi ini.

(2)

Ibu Dr. Dra. Nelly Dhevita Leswara, M.Sc., Apt selaku pembimbing akademis yang telah membimbing saya selama mengikuti perkuliahan di Farmasi FMIPA UI.

(3)

Ibu Dra. Azizahwati, M.S., selaku ketua Program Ekstensi Departemen Farmasi FMIPA UI.

(4)

Ibu Prof. Dr. Yahdiana Harahap, Apt., M.S., selaku ketua Departemen Farmasi FMIPA UI.

(5)

Seluruh staf dan dewan pengajar Departemen Farmasi FMIPA UI atas bantuan dan bimbingannya selama mengikuti perkuliahan.

(6)

Papa, mama, dan adik tercinta, serta keluarga besar H. Muhammad Zen dan Mukhtar Jalal, yang selalu melimpahkan kasih sayang, dukungan, harapan, semangat dan do’a.

(7)

Teman-teman mahasiswa Program Sarjana Ekstensi, Reguler, dan Paralel Departemen Farmasi FMIPA UI atas bantuan dan kerjasamanya selama penyusunan skripsi ini.

(8)

Semua pihak yang tidak dapat disebutkan namanya satu persatu yang telah membantu dalam proses penelitian dan penyusunan skripsi ini. vi


Semoga Allah SWT membalas semua kebaikan mereka dengan balasan yang berlipat ganda. Akhir kata, saya berharap semoga skripsi ini membawa manfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan.

Penulis 2012

vii



ABSTRAK

Nama Program Studi Judul

: Atika Bendra : Ekstensi farmasi : Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Premna oblongata Miq. dengan Metode DPPH dan Identifikasi Golongan Senyawa Kimia Dari Fraksi Teraktif

Antioksidan adalah senyawa yang mampu menghilangkan dan menahan pembentukan radikal bebas dalam tubuh. Radikal bebas adalah molekul yang tidak stabil karena memiliki elektron yang tidak berpasangan dalam orbital luarnya sehingga sangat reaktif untuk mendapatkan pasangan elektron dengan mengikat sel-sel tubuh. Apabila hal tersebut terjadi secara terus menerus, ini dapat menyebabkan kerusakan dan kematian sel. Berdasarkan sumbernya antioksidan dibagi dua macam, yaitu antioksidan alami dan antioksidan sintetik. Antioksidan sintetik dikhawatirkan dapat memberi efek samping yang berbahaya bagi kesehatan manusia karena bersifat karsinogenik. Kekhawatiran akan adanya kemungkinan efek samping dari antioksidan sintetik menyebabkan antioksidan alami menjadi alternatif. Indonesia memiliki keanekaragaman tanaman yang dapat dimanfaatkan sebagai sumber antioksidan alami. Pada penelitian ini, dilakukan uji aktivitas antioksidan dari fraksi ekstrak daun cincau perdu (Premna oblongata Miq.). Pengujian dilakukan dengan metode 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH). Daun Premna oblongata Miq. diekstraksi dengan n-heksan, etil asetat, dan metanol. Ekstrak yang memiliki aktivitas antioksidan tertinggi difraksinasi dengan kromotografi kolom dipercepat. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak yang paling aktif adalah ekstrak metanol dengan nilai IC50 sebesar 20.01 µg/ml. Selanjutnya ekstrak teraktif difraksinasi dengan kromotografi kolom dipercepat, dan didapatkan 6 fraksi gabungan. Hasil penggabungan fraksi masing-masing diuji aktifitas antioksidannya, dan diperoleh fraksi 5 sebagai fraksi teraktif dengan nilai IC50 sebesar 23.51 µg/ml. Golongan senyawa pada fraksi teraktif adalah flavonoid, glikon, saponin, dan tanin.

Kata Kunci xv + 63 halaman Daftar Acuan

: DPPH., Premna oblongata Miq., Cincau perdu : 14 gambar; 5 tabel; 13 lampiran : 31 ( 1958-2011)

ix


ABSTRACT

Name Study Program Title

: Atika Bendra : Ekstensi farmasi : Antioxidant Activity Test of Extract of Premna oblongata Miq. Leaf with the DPPH method and Identification of Chemical Compounds Type of the most active Faction

Antioxidants are compounds which can remove and resist free radical formation in the body. Free radical are unstable molecules which is caused by its unpaired free electron in the outer electron orbital which make it reactively bind body cells to gain the electron pair. if this continuously happens, the cells will be damaged and can cause death cells. For its sources, antioxidants are categorized as natural and synthetic antioxidants. Synthetic antioxidants’s carcinogenicity is faired to give harmful side effects to human healthy, which causes natural antioxidants become chosen alternative as antioxidant sources. Indonesia has many kinds of plants which can be used as antioxidant sources. This study is focused on antioxidant activity of Cincau Perdu leaves extract (Premna oblongata Miq.) by 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) assay. Premna oblongata Miq. leaves is extracted using n-hexane, ethyl acetate and methanol. The IC50 value of ethanol extract as the most active fraction was 20.01 µg/mL. The extract which had the highest antioxidant activity were fractinated by accelerated column chromatography and were earned 6 combination factions. The antioxidant activity of combination fractions were tested by DPPH assay and known having 5 active fractions whose the lowest IC50 value was 23.51 µg/mL. The compounds of the active fractions were flavonoid, glikon, saponin and tanin.

Keywords xv + 63 pages Refference

: DPPH., Premna oblongata Miq., Cincau Perdu : 14 pictures; 5 table; 13 attachments : 31 ( 1958-2011)

x


DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ..................................................................................... ii SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIARISME ................................... iii HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ......................................... iv HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................ v KATA PENGANTAR .................................................................................... vi HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ............... viii ABSTRAK……………. ................................................................................. ix ABSTRACT……….. ...................................................................................... x DAFTAR ISI………………………………………………………………... xi DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xiii DAFTAR TABEL ......................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. xv BAB 1. PENDAHULUAN ............................................................................ 1.1. Latar Belakang .................................................................................... 1.2. Tujuan Penelitian ................................................................................ 1.3. Manfaat Penelitian ..............................................................................

1 1 3 3

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA.................................................................... 2.1. Premna oblongata Miq. .................................................................... 2.2. Simplisia ........................................................................................... 2.3. Ekstrak .............................................................................................. 2.4. Ekstraksi ............................................................................................ 2.5. Kromotografi..................................................................................... 2.6. Kromotografi Lapis tipis ................................................................... 2.7. Kromotografi Kolom ........................................................................ 2.8. Kromotografi Cair Vakum ................................................................ 2.9. Antioksidan ....................................................................................... 2.10. Uji Aktivitas Antioksidan .................................................................

4 4 5 5 5 8 8 8 9 10 11

BAB 3. 3.1. 3.2. 3.3. 3.4.

14 14 14 14 15

METODE PENELITIAN ................................................................ Lokasi dan Waktu Penelitan ............................................................. Alat ................................................................................................... Bahan ................................................................................................ Cara Kerja .........................................................................................

xi


BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 4.1 Penyiapan Simplisia .......................................................................... 4.2 Ekstraksi ............................................................................................ 4.3 Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak .................................................... 4.4 Pemisahan Ekstrak ............................................................................ 4.5 Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Aktif ............................................. 4.6 Penapisan Fitokimia Fraksi Teraktif .................................................

23 23 24 24 25 26 27

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................ 5.1 Kesimpulan ...................................................................................... 5.2 Saran ...............................................................................................

30 30 30

DAFTAR ACUAN ........................................................................................

31

xii


DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Gambar 2.2 Gambar 3.1 Gambar 3.2 Gambar 4.1 Gambar 4.2 Gambar 4.3 Gambar 4.4 Gambar 4.5 Gambar 4.6 Gambar 4.7 Gambar 4.8 Gambar 4.9 Gambar 4.10

Premna oblongata Miq. ........................................................... 33 Reaksi antioksidan dengan radikal DPPH…………………... 12 Penguap vakum putar (Rotary evaporator Buchi) ................... 34 Spektrofotometer UV-Vis ......................................................... 34 Ekstrak Hasil Ekstraksi ............................................................ 35 Hasil Uji Kualitatif Fraksi Ekstrak Gabungan ......................... 36 Spektrum serapan larutan DPPH .............................................. 37 Identifikasi golongan senyawa alkaloid fraksi 5 ...................... 38 Identifikasi golongan senyawa flavonoid fraksi 5 ................... 39 Identifikasi golongan senyawa glikon fraksi 5 ........................ 40 Identifikasi golongan senyawa antrakinon fraksi 5 .................. 41 Identifikasi golongan senyawa saponin fraksi 5....................... 42 Identifikasi golongan senyawa tanin fraksi 5 ........................... 43 Identifikasi golongan senyawa terpen fraksi 5 ......................... 44

xiii


DAFTAR TABEL

Tabel 4.1 Data Rendemen Ekstrak Daun Premna Oblongata Miq................... 45 Tabel 4.2 Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Premna Oblongata Miq .................................................................................................... 46 Tabel 4.3 Berat Fraksi Ekstrak Hasil Fraksinasi Kolom Dipercepat ............. 47 Tabel 4.4 Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi-Fraksi Ekstrak Metanol Premna Oblongata Miq. ................................................................ 48 Tabel 4.5. Identifikasi golongan kimia fraksi teraktif ..................................... 50

xiv


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Lampiran 2. Lampiran 3. Lampiran 4. Lampiran 5. Lampiran 6. Lampiran 7. Lampiran 8. Lampiran 9. Lampiran 10. Lampiran 11. Lampiran 12. Lampiran 13.

Hasil determinasi sampel Premna oblongata Miq. .................. 51 Skema ekstraksi dan fraksinasi sampel Premna oblongata Miq .......................................................................................... 52 Kurva hubungan konsentrasi kuersetin dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH ................................. 53 Kurva hubungan konsentrasi ekstrak heksan dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH ................................. 54 Kurva hubungan konsentrasi ekstrak etil asetat dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH ................................. 55 Kurva hubungan konsentrasi ekstrak metanol dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH ................................. 56 Kurva hubungan konsentrasi fraksi gabungan 1 dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH ................................. 57 Kurva hubungan konsentrasi fraksi gabungan 2 dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH ................................. 58 Kurva hubungan konsentrasi fraksi gabungan 3 dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH ................................. 59 Kurva hubungan konsentrasi fraksi gabungan 4 dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH ................................. 60 Kurva hubungan konsentrasi fraksi gabungan 5 dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH ................................. 61 Kurva hubungan konsentrasi fraksi gabungan 6 dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH ................................. 62 Sertifikat Analisis DPPH .......................................................... 63

xv


1

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1

Latar Belakang Akhir-akhir ini dunia kesehatan banyak membahas tentang radikal bebas

dan antioksidan. Hal ini terjadi karena sebagian besar penyakit diawali oleh adanya reaksi oksidasi yang berlebihan didalam tubuh. Reaksi oksidasi dapat terjadi setiap saat. Reaksi ini mencetuskan terbentuknya radikal bebas yang sangat aktif, yang dapat merusak struktur dan fungsi sel. Radikal bebas adalah suatu senyawa atom atau molekul yang mengandung satu atau lebih elektron tidak berpasangan. Adanya elektron yang tidak berpasangan menyebabkan senyawa tersebut sangat reaktif mencari pasangan, dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada disekitarnya. Radikal bebas sangat berbahaya dikarenakan tingginya reaktivitasnya yang mengakibatkan terbentuknya senyawa radikal baru. Bila senyawa radikal baru tersebut bertemu dengan molekul lain, maka akan terbentuk radikal baru lagi dan seterusnya hingga terjadi reaksi berantai. Radikal bebas dapat mengganggu integritas sel dan dapat bereaksi dengan komponen-komponen sel, baik komponen struktural meliputi molekul-molekul penyusun membran maupun komponen fungsional meliputi protein, enzim-enzim, dan DNA (Hidajat, 2005). Radikal bebas dapat dijumpai pada lingkungan, beberapa logam misalnya besi dan tembaga, asap rokok, polusi udara, obat, bahan beracun, makanan dalam kemasan, bahan aditif, dan sinar ultraviolet matahari yang menyebabkan radiasi. Reaktifitas radikal bebas itu dapat dihambat oleh sistem antioksidan yang merupakan bagian dari sistem kekebalan tubuh (Winarsi, 2007). Antioksidan adalah molekul yang mampu menghambat oksidasi molekul yang dapat menghasilkan radikal bebas (Rajnarayana, Ajitha, Gopireddy, dan Giriprasad, 2011). Antioksidan telah secara luas digunakan untuk melindungi makanan dari degradasi oksidatif. Berdasarkan sumbernya antioksidan dibagi dua macam, yaitu antioksidan alami dan antioksidan sintetik (buatan). Antioksidan Universitas Indonesia


2

sintetik yang paling sering digunakan adalah Propil Galat (PG), Butylated Hydroxyanisole

(BHA),

Butylated

Hydroxytoluene

(BHT)

dan

Tert-

butylhydroquinone (TBHQ). Antioksidan sintetik ini dikhawatirkan dapat memberi efek samping yang berbahaya bagi kesehatan manusia karena bersifat karsinogenik. Berbagai studi mengenai BHA dan BHT menunjukkan bahwa komponen ini dapat menimbulkan tumor pada hewan percobaan pada penggunakan dalam jangka panjang (Andarwulan, Wijaya, dan Cahyono, 1996). Kekhawatiran akan adanya kemungkinan efek samping dari antioksidan sintetik menyebabkan antioksidan alami menjadi alternatif. Antioksidan alami mampu melindungi tubuh terhadap kerusakan yang disebabkan senyawa oksigen reaktif, menghambat terjadinya penyakit degeneratif serta mampu menghambat peroksidasi lipid pada makanan (Sunarni, 2005). Antioksidan alami perlu dikembangkan untuk memperoleh antioksidan yang lebih aman dikonsumsi. Di Indonesia terdapat empat jenis tanaman cincau, yaitu cincau hijau (Cyclea barbata), Cincau Perdu (Premna oblongata Miq.), cincau minyak (Stephania hermandifolia), dan cincau hitam (Mesona palustris). Cincau yang banyak dimanfaatkan oleh masyarakat adalah cincau hijau, cincau perdu, dan cincau hitam (Pitojo dan Sumiati, 2005). Berdasarkan yang telah ada, diketahui bahwa tanaman cincau hijau (Cyclea barbata) mengandung alkaloid 0,98% dan fenol total 2,21%. Alkaloid bisbenzilisokuinolin dari akar cincau hijau mempunyai aktifitas sitotoksik, sangat potensial sebagai kemoprotektif serta bersifat sebagai antioksidan (Zakaria, 1996). Penelitian lainnya menunjukkan bahwa daun cincau perdu (Premna oblongata Miq.) memiliki kandungan klorofil tertinggi dibandingkan pegagan (Centella asitica), daun katuk (Saurpus androgynus Merr), dan daun murbei (Morus alba L) (Nurdin, Kusharto, Tanziha, dan Januwati, 2009). Pada penelitian ini, dilakukan uji aktivitas antioksidan ekstrak dan fraksi Premna oblongata Miq. serta identifikasi golongan senyawa kimia dari fraksi teraktif.

Aktivitas

antioksidan

Premna

oblongata

Miq.

diuji

dengan

menggunakan metode DPPH (1,1-Difenil-2-pikrilhidrazil). Metode DPPH memberikan informasi reaktivitas senyawa yang diuji dengan suatu radikal stabil.

Universitas Indonesia


3

DPPH memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 517 nm dengan warna ungu gelap (Molyneux, 2004). Penelitian ini diharapkan dapat menambah pengetahuan baru mengenai cincau perdu (Premna oblongata Miq.) sebagai sumber antioksidan alami yang baru, dan memberi nilai tambah bagi cincau perdu yang telah banyak dikonsumsi masyarakat sebagai bahan pangan.

1.2

Tujuan Penelitian

a.

Mengetahui aktivitas antioksidan ekstrak daun Premna oblongata Miq.

b.

Mengetahui golongan senyawa kimia dari fraksi paling aktif daun Premna oblongata Miq.

1.3

Manfaat Penelitian Hasil uji aktivitas antioksidan pada Premna oblongata Miq. diharapkan

dapat menambah informasi dan mendukung penggunaan Premna oblongata Miq. sebagai antioksidan.



4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1

Premna oblongata Miq.

2.1.1 Klasifikasi (Backer dan Brink, 1965) Tumbuhan Premna oblongata Miq. secara taksonomi memiliki klasifikasi ilmiah sebagai berikut : Kerajaan

: Plantae

Divisi

: Spermatophyta

Subdivisi

: Angiospermae

Kelas

: Magnoliopsida

Bangsa

: Lamiales

Suku

: Verbenaceae

Marga

: Premna

Jenis

: Premna oblongata Miq.

Sinonim

: Premna oblongifolia Merr.

2.1.2 Morfologi Tanaman cincau perdu ( Premna oblongata Miq.) adalah tanaman asli Indonesia dan mempunyai nama lain diantaranya Camcao, Juju, Kepleng (Jawa), Camcauh, dan Tahulu (Sunda). Tumbuhan ini berkembang subur di dataran rendah sampai daerah dengan ketinggian 800 meter diatas permukaan laut. Tanaman ini tumbuh menyebar di daerah Jawa Barat (sekitar Gunung Salak, Batujajar, Ciampea, dan Ciomas), Jawa Tengah (Gunung Ungaran, Gunung Ijen), Sulawesi, Bali, Lombok, dan Sumbawa. Tanaman cincau sering ditemukan tumbuh sebagai tanaman liar, tetapi ada juga yang sengaja dibudidayakan di pekarangan rumah. Batang Premna oblongata Miq. tidak menjalar atau merambat seperti Cyclea barbata, melainkan tegak seperti batang tanaman pada umumnya. Daun berbentuk bulat telur, panjang daun lebih dari 1,5 kali lebarnya dengan tulang daun agak besar (Backer dan Brink, 1965). Daun Premna oblongata Miq. secara tradisional dimanfaatkan sebagai pembuat makanan sejenis agar-agar yang banyak Universitas Indonesia


5

dijual sebagai bahan pengisi minuman es cincau yang berkhasiat sebagai penyejuk perut, menurunkan panas dan menanggulangi gangguan pencernaan (Pitojo, 2008). Gambar 2.1.

2.2

Simplisia (Departeman Kesehatan RI, 1995) Simplisia adalah bahan alamiah yang dipergunakan sebagai obat yang

belum mengalami pengolahan apapun juga dan kecuali dinyatakan lain, berupa bahan yang telah dikeringkan. Simplisia dibedakan menjadi tiga, yaitu simplisia nabati, simplisia hewani, dan simplisia pelikan (mineral). Simplisia nabati adalah simplisia yang berupa tanaman utuh, bagian tanaman atau eksudat tanaman. Simplisia hewani adalah simplisia yang dapat berupa hewan utuh atau zat-zat berguna yang dihasilkan oleh hewan dan belum berupa bahan kimia murni, misalnya minyak ikan dan madu. Simplisia pelikan atau mineral adalah simplisia berupa bahan pelikan atau mineral yang belum diolah atau telah diolah dengan cara sederhana dan belum berupa bahan kimia murni, contoh serbuk seng dan serbuk tembaga.

2.3

Ekstrak (Farmakope Indonesia, 1995) Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat

aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan. Sebagian besar ekstrak dibuat dengan mengekstraksi bahan baku obat secara perkolasi. Seluruh perkolat biasanya dipekatkan dengan cara destilasi dengan pengurangan tekanan, agar bahan utama obat sesedikit mungkin terkena panas.

2.4.

Ekstraksi (Parameter Standar, 2000) Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut

sehingga terpisah dari bahan yang tidak terlarut dengan pelarut cair. Simplisia yang diekstraksi mengandung berbagai senyawa aktif yang dapat larut dan



6

senyawa aktif yang tidak dapat larut seperti serat, karbohidrat, protein, dan lainlain. Untuk mengekstraksi bahan alam, terdapat sejumlah metode menggunakan pelarut organik atau pelarut yang mengandung air yang dapat diterapkan. Pada ekstraksi cair-padat bahan tanaman mengalami kontak dengan pelarut. Proses keseluruhannya bersifat dinamis dan dapat disederhanakan kedalam beberapa tahap. Pada tahap pertama misalnya pelarut harus berdifusi kedalam sel, pada tahap selanjutnya pelarut harus dapat melarutkan metabolit tanaman dan akhirnya harus berdifusi keluar sel meningkatkan jumlah metabolit yang terekstraksi. Beberapa metode yang sering digunakan dalam ekstraksi bahan alam antara lain : 2.4.1 Cara Dingin a.

Maserasi Merupakan metode yang sederhana, tetapi masih digunakan secara luas.

Prosedurnya dilakukan dengan merendam bahan tanaman (simplisia) dalam pelarut yang sesuai dalam wadah tertutup pada suhu kamar. Metode ini sesuai baik untuk ekstraksi pendahuluan maupun untuk jumlah besar. Pengadukan sesekali ataupun secara konstan (dengan menggunakan alat pengocok mekanik untuk menjamin kehomogenan) dapat meningkatkan kecepatan ekstraksi. Proses ekstraksi dapat dihentikan ketika tercapai keseimbangan antara konsentrasi metabolit dalam ekstrak dan dalam bahan tanaman. Setelah ekstraksi, residu bahan tanaman (maserat), harus dipisahkan dari pelarut. Hal ini melibatkan proses pemisahan kasar dengan cara dekantasi, biasanya diikuti dengan tahap penyaringan. Sentrifugasi mungkin diperlukan jika serbuk terlalu halus untuk disaring. Untuk memastikan ekstraksi yang menyeluruh, umumnya dilakukan maserasi pendahuluan, yang diikuti pemisahan dan penambahan pelarut baru (fresh solvent) ke maserat. Hal ini bisa dilakukan secara periodik dengan semua filtrat dikumpulkan. Kelebihan maserasi adalah peralatan yang digunakan sederhana, dan efektif untuk senyawa-senyawa yang tidak tahan panas karena dilakukan pada temperatur kamar, sehingga tidak menyebabkan degradasi senyawa-senyawa yang tidak tahan panas. Kelemahan dari maserasi adalah prosesnya memakan waktu yang cukup lama dan dapat berlangsung beberapa jam sampai beberapa minggu. Universitas Indonesia


7

Ekstraksi secara menyeluruh juga dapat menghabiskan sejumlah besar volume pelarut dan dapat berpotensi hilangnya metabolit. Selain itu, beberapa senyawa tidak terekstraksi secara efisien jika kurang terlarut dalam temperatur kamar. b.

Perkolasi Pada perkolasi, serbuk tanaman direndam dalam pelarut pada sebuah alat

perkolator. Perkolasi cukup sesuai baik untuk ekstraksi pendahuluan maupun dalan jumlah besar. Seperti pada maserasi, untuk mengekstrak secara menyeluruh dilakukan dengan penambahan pelarut yang baru (fresh solvent) dan semua ekstrak dikumpulkan. Untuk meyakinkan perkolasi sudah sempurna, perkolat dapat diuji adanya metabolit dengan reagen spesifik. 2.4.2 Cara Panas a.

Soxhlet Soxhlet adalah ekstraksi dengan menggunakan pelarut yang selalu baru

yang umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi secara kontinu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik. b.

Refluks Ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya selama waktu

tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Kekurangan yang utama dari metode ini adalah terdegradasinya komponen yang tidak tahan panas. c.

Digesti Adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu) pada temperatur

yang lebih tinggi dari temperatur ruangan (kamar), yaitu secara umum dilakukan pada temperatur 400-500C. d.

Infusa Infusa adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas air

(bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih), temperatur terukur (960980C) selama waktu tertentu (15-20 menit). e.

Dekok Dekok adalah infusa pada waktu yang lebih lama dan temperatur sampai

titik didih air. Universitas Indonesia


8

g.

Fraksinasi Fraksinasi merupakan prosedur pemisahan yang bertujuan memisahkan

golongan utama kandungan yang satu dari golongan utama yang lain. Pemisahan jumlah dan jenis senyawa menjadi fraksi yang berbeda yang tergantung pada jenis simplisia. Senyawa-senyawa yang bersifat polar akan masuk ke pelarut polar, begitu pula senyawa yang bersifat non polar akan masuk ke pelarut non polar (Harborne, 1987).

2.5

Kromatografi Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas

perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut di antara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas). Fase gerak membawa zat terlarut melalui media hingga terpisah dari zat terlarut lainnya, yang terelusi lebih awal atau lebih akhir. Bila fase diam berupa zat padat yang aktif, maka teknik ini disebut kromatografi penjerapan (adsorption chromatography), sementara bila berupa zat cair, maka disebut dengan kromatografi pembagian (partition chromatoghraphy) (Harmita, 2006).

2.6

Kromatografi Lapis Tipis Kromatografi lapis tipis adalah suatu metode pemisahan fitokimia yang

didasarkan atas penjerapan, partisi atau gabungannya. Metode ini digunakan untuk pemisahan senyawa secara cepat dengan menggunakan zat penjerap berupa serbuk halus yang dilapiskan serba rata pada lempeng kaca (Harmita, 2006; Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1979).

2.7

Kromatografi Kolom (Departeman Kesehatan Republik Indonesia, 1979)

2.7.1

Kromotografi Kolom Adsorbsi Pada kromotografi kolom adsorpsi, zat penjerap dalam keadaan kering

atau sebagai bubur, dimampatkan ke dalam tabung kromatografi kaca atau kuarsa dengan ukuran tertentu dan mempunyai lubang pengalir keluar dengan ukuran tertentu. Zat yang akan diuji dilarutkan dalam sejumlah kecil pelarut kemudian Universitas Indonesia


9

dituangkan ke dalam kolom dan dibiarkan mengalir ke dalam zat penjerap. Zat berkhasiat diadsorpsi dari larutan secara sempurna oleh bahan penjerap berupa pita sempit pada puncak kolom. Dengan penambahan pelarut lebih lanjut melalui kolom, dengan atau tanpa tekanan udara, masing-masing zat bergerak turun dalam kolom dengan kecepatan tertentu, sehingga terjadi pemisahan dan diperoleh kromatogram. Kecepatan bergerak zat dipengaruhi oleh sejumlah variabel, misalnya daya adsorpsi zat penjerap, ukuran partikel dan luas permukaan, sifat dan polaritas pelarut, tekanan yang digunakan dan suhu sistem kromatografi. 2.7.2

Kromatografi Kolom Partisi Pada kromatografi partisi, zat yang dipisahkan terbagi antara dua cairan

yang tidak saling bercampur. Salah satu cairan, yaitu fase diam, umumnya diadsorpsikan pada penyangga padat, karena itu mempunyai area permukaan yang sangat luas terhadap pelarut yang mengalir atau fase gerak. Hal ini menyebabkan diperolehnya pemisahan yang baik yang tidak dapat dicapai dengan cara penyarian cairan-cairan yang biasa. Kromatografi partisi dilakukan dengan cara yang serupa dengan kromatografi adsorbsi, yaitu campuran yang telah dilarutkan dalarn sedikit pelarut, ditambahkan pada permukaan kolom dan elusi dilakukan dengan pelarut yang mengalir.

2.8

Kromatografi Cair Vakum (Kromatografi Kolom Dipercepat) Kromatografi cair-vakum merupakan kromatografi kolom yang dikemas

kering biasanya dengan penjerap kromatografi lapis tipis 10-4 µg pada kondisi vakum, fase gerak digerakkan dengan kondisi vakum sehingga prosesnya berlangsung cepat. Kolom kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan maksimum. Setelah diperoleh kerapatan yang maksimum, kemudian vakum dihentikan dan pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan kedalam permukaan penjerap lalu divakum lagi. Alat yang digunakan terdiri dari corong G-3, sumbat karet, pengisap yang dihubungkan dengan pompa vakum serta wadah penampung fraksi. Walaupun KCV memerlukan jumlah sampel yang lebih banyak dari pada kromatografi lapis tipis (KLT), KCV tetap ekonomis dalam sisi biaya (Johnson, 1991). Universitas Indonesia


10

Salah satu cara pemisahan kromatografi cair vakum adalah kromatografi kolom yang dipercepat dan bekerja pada kondisi vakum. Alat yang digunakan terdiri dari corong G-3, sumbat karet, pengisap yang dihubungkan dengan pompa vakum serta wadah penampung fraksi. Corong G-3 diisi adsorben sampai setinggi 2,5cm, kemudian diketuk-ketuk dengan batang pengaduk, dilarutkan dalam pelarut organik yang cocok, kemudian ke dalam larutan ekstrak tersebut ditambahkan adsorben dengan bobot sama dengan bobot ekstrak. Campuran ini digerus sampai homogen, dikeringkan dan dimasukkan ke dalam corong G-3 kemudian diratakan. Permukaan lapisan adsorben ditutup dengan kertas saring. Elusi diawali dengan pelarut non polar dilanjutkan dengan kombinasi pelarut dengan polaritas meningkat. Jumlah pelarut yang digunakan setiap kali elusi adalah sebagai berikut untuk bobot ekstrak sampai lima gram diperlukan 25 ml pelarut, untuk 10-30 g ekstrak diperlukan 50 ml pelarut. Dalam hal ini, diameter corong dipilih sedemikian rupa sehingga lapisan ekstrak dipermukaan kolom setipis mungkin dan rata. Masing-masing pelarut dituangkan ke permukaan kolom kemudian dihisapkan pompa vakum. Ekstrak ditampung dalam wadah terpisah sehingga menghasilkan sejumlah fraksi (Soediro, 1986).

2.9

Antioksidan Antioksidan adalah senyawa yang mampu menghilangkan, membersihkan,

dan menahan pembentukan oksigen reaktif atau radikal bebas dalam tubuh. Radikal bebas adalah atom atau molekul yang tidak stabil karena memiliki elektron yang tidak berpasangan dalam orbital luarnya sehingga sangat reaktif untuk mendapatkan pasangan elektron dengan mengikat sel-sel tubuh. Apabila hal tersebut terjadi secara terus menerus dapat menyebabkan kerusakan dan kematian sel (Lautan, 1997). Antioksidan ditujukan untuk mencegah dan mengobati penyakit seperti aterosklerosis, stroke, diabetes, alzheimer, dan kanker (Aqil, Ahmad dan Mehmood, 2006). Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (elektron donor) atau reduktan. Senyawa ini memiliki berat molekul yang kecil, tetapi mampu mengaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi dengan cara mencegah terbentuknya



11

radikal. Antioksidan juga merupakan senyawa yang dapat menghambat reaksi oksidasi dengan mengikat radikal bebas dan molekul yang reaktif. Berdasarkan sumbernya antioksidan dibagi dalam dua kelompok yaitu antioksidan alami (antioksidan hasil ekstraksi bahan alami) dan antioksidan sintetik (antioksidan yang diperoleh dari hasil sintesa reaksi kimia). Sedangkan berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan digolongkan menjadi tiga kelompok, yaitu antioksidan primer, sekunder, dan tersier. Antioksidan primer disebut juga sebagai antioksidan enzimatis. Antioksidan primer meliputi enzim superoksida dismutase, katalase, dan glutation peroksidase. Enzim-enzim ini menghambat pembentukan radikal bebas dengan cara memutus reaksi berantai (polimerisasi), dan mengubahnya menjadi produk yang lebih stabil. Antioksidan kelompok ini disebut juga chain-breakingantioxidant (Winarsi, 2007). Antioksidan sekunder disebut juga antioksidan eksogenus atau nonenzimatis. Cara kerja sistem antioksidan non-enzimatis yaitu dengan cara memotong reaksi oksidasi berantai dari radikal bebas. Akibatnya radikal bebas tidak bereaksi dengan komponen seluler. Contoh antioksidan sekunder ialah vitamin E, vitamin C, flavonoid, asam urat, bilirubin, dan albumin (Lampe, 1999). Antioksidan tersier contohnya enzim DNA-repair dan metionin sulfoksida reduktase yang berperan dalam perbaikan biomolekul yang dirusak oleh radikal bebas. Kerusakan DNA yang terinduksi senyawa radikal bebas dicirikan oleh rusaknya single dan double stand, baik gugus basa maupun non-basa. Perbaikan kerusakan basa dalam DNA yang diinduksi senyawa oksigen reaktif terjadi melalui perbaikan jalur eksisi basa. Pada umumnya, eksisi basa terjadi dengan cara memusnahkan basa yang rusak, yang dilakukan oleh DNA glikosilase (Winarsi, 2007).

2.10

Uji Aktivitas Antioksidan Beberapa metode uji untuk menentukan aktivitas antioksidan antara lain:

2.10.1 Uji DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) DPPH merupakan radikal bebas yang stabil pada suhu kamar dan sering digunakan untuk menilai aktivitas antioksidan beberapa senyawa atau eksrtak Universitas Indonesia


12

bahan alam. Interaksi antioksidan dengan DPPH baik secara transfer elektron atau radikal hidrogen pada DPPH akan menetralkan karakter radikal bebas dari DPPH. Prinsip uji DPPH adalah penghilangan warna untuk mengukur kapasitas antioksidan yang langsung menjangkau radikal DPPH dengan pemantauan absorbansi pada panjang gelombang 517 nm menggunakan spektrofotometer. Radikal DPPH dengan nitrogen organik terpusat adalah radikal bebas stabil dengan warna ungu gelap yang ketika direduksi menjadi bentuk nonradikal oleh antioksidan menjadi warna kuning (Yu, 2008).

+ R‐H

+ R•

1,1-Difenil-2-pikrilhidrazil

1,1-Difenil-2-pikrilhidrazin

(radikal bebas)

(nonradikal)

Gambar 2.2 Reaksi antioksidan dengan radikal DPPH [Sumber : Molineux, 2004] 2.10.2 Uji ABTS Prinsip uji ABTS adalah penghilangan warna kation ABTS untuk mengukur kapasitas antioksidan yang langsung bereaksi dengan radikal kation ABTS. ABTS adalah suatu radikal dengan pusat nitrogen yang mempunyai karakteristik warna biru-hijau, yang bila tereduksi oleh antioksidan akan berubah menjadi bentuk nonradikal, dari berwarna menjadi tidak berwarna. Kemampuan aktivitas antioksidan secara spektrofotometer pada panjang gelombang 734. Hasilnya dibandingkan dengan standar yakni senyawa trolox (Yu, 2008). 2.10.3 Uji Penghambatan Radikal Superoksida Uji ini mengukur kemampuan antioksidan menggunakan medan molekular nitroblue tetrazolium (NBT), dalam meredam radikal superoksida yang dihasilkan sistem enzimatik hipoxantin-xantin oksidase (HPX-XOD). NBT memiliki warna kuning yang melalui reduksi oleh radikal superoksida membentuk formazan yang berwarna biru, dan terukur

pada panjang gelombang 560 nm dengan Universitas Indonesia


13

spektrofotometer. Kemampuan ekstrak untuk penghambatan warna hingga 50% diukur dalam EC50 (Yu, 2008). 2.10.4 Uji Kapasitas Serapan Radikal Oksigen atau Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) Uji ini dilakukan dengan menggunakan trolox (analog vitamin E) sebagai standar untuk menentukan trolox ekuivalen (TE). Nilai ORAC kemudian dihitung dari TE dan dinyatakan sebagai satuan atau nilai ORAC. Semakin tinggi nilai ORAC, semakin besar kekuatan nilai antioksidannya. Uji ini berdasarkan pembentukan radikal bebas menggunakan AAPH (2,2-azobis-2-amido propane dihydrochloride) dan pengukuran dari fluoresensi dengan adanya penghambat radikal. Penelitian terbaru telah melaporkan assay ORAC dengan otomatisasi. Pada uji ini β-phycoerythrin (β-PE) digunakan sebagai target radikal bebas, AAPH sebagai penghasil radikal peroksil dan trolox sebagai kontrol standar. Setelah penambahan AAPH ke larutan uji, fluoresensi direkam dan aktivitas antioksidan dinyatakan sebagai trolox ekuivalen (TE) (Bank dan Lenoble, 2002). 2.10.5 Uji Kapasitas Penghambatan Radikal Hidroksil atau Hydroxyl Radical Scavenging Capacity (HOSC). Pada metode HOSC, radikal hidroksi yang terbentuk oleh oksidasi dibuat bereaksi dengan dimetil sulfoksida (DMSO) untuk menghasilkan formaldehid. Formaldehid membentuk warna kuning intensif dengan pereaksi nash (ammonium asetat 2 M). Intensitas dari warna kuning yang terbentuk diukur pada panjang gelombang 412 nm dengan spektrofotometer. Trolox dijadikan sebagai standar di mana hasil dinyatakan sebagai ekuivalen mikromol trolox per unit sampel (Yu, 2008).



14

BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1

Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian Fitokimia Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia Depok, selama kurang lebih lima bulan, dari bulan Januari hingga Mei 2012.

3.2

Alat Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah blender, peralatan maserasi

(IKA Labortechnik KS501D), cawan penguap, penguap vakum putar (rotary evaporator Buchi) (Gambar 3.1), kolom kromatografi vakum, labu erlenmeyer, tabung reaksi, vial, botol, labu takar, gelas ukur, penampung berbagai ukuran, pipet volume,

pipet mikro (Eppendorf), pipet tetes (Pyrex), corong Buchner

(Jangkar), spektrofotometer UV-VIS (Gambar 3.2), kuvet, plat tetes, gelas arloji, rak tabung reaksi, batang pengaduk, spatel, sendok tanduk, timbangan analitik (ACIS), bejana kromatografi, kertas saring, peralatan kolom kromatografi vakum, vortex-mixer (VM-2000), inkubator 37˚C (Memmert) dan lemari pendingin.

3.3

Bahan

3.3.1 Bahan Uji Bahan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun cincau perdu (Premna oblongata Miq.) yang diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (BALITTRO) dan dideterminasi di Herbarium Bogorinese (LIPI), Cibinong. 3.3.2

Bahan Kimia Bahan kimia yang digunakan pada penelitian ini adalah n-heksan, etil

asetat, dan metanol teknis yang telah didestilasi; metanol p.a; lempeng KLT; butanol; asam asetat; aqua; H2SO4 10 % sebagai penampak noda pada KLT; silika gel (70-230 mesh, E. Merck 1.07734); asam klorida p.a (Merck); asam sulfat p.a Universitas Indonesia


15

(Merck); benzene p.a (Merck); asam asetat anhidrat; asam borat; asam oksalat; besi (III) klorida; etanol 96 %; natrium hidroksida; serbuk magnesium; serbuk seng; gelatin; natrium klorida; Mayer LP; Dragendorff LP; Bouchardat LP; Molisch LP; DPPH (Sigma-Aldrich). Bahan pembanding adalah Kuersetin (Sigma-Aldrich).

3.4

Cara Kerja

3.4.1

Penyiapan bahan Tanaman yang digunakan adalah daun Premna oblongata Miq.. Sebanyak

10 kg Premna oblongata Miq. yang diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat dikeringkan selama kurang lebih 5 hari dan diserbukkan dengan mesin penggiling (blender) sehingga menghasilkan 1 kg serbuk simplisia. 3.4.2

Pembuatan ekstrak Maserasi dilakukan pada serbuk simplisia menggunakan pelarut dengan

kepolaran yang meningkat mulai dari n-heksan, etil asetat dan metanol. Maserasi dilakukan sampai filtrat terlihat hampir tidak berwarna (dilakukan pengulangan maserasi sampai lima kali) lalu filtrat yang diperoleh dikumpulkan dan dievaporasi dengan rotary evaporator (pada suhu 50oC) sehingga diperoleh ekstrak n-heksan kental yang masih dapat dituang, lalu ekstrak dikeringkan pada suhu kamar. Ekstrak yang diperoleh kemudian ditimbang. Ampas yang sudah dikeringkan, dimaserasi berturut-turut dengan pelarut etil asetat dan metanol. Dengan prosedur dan perlakuan yang sama akan diperoleh ekstrak etil asetat dan metanol. Proses maserasi menggunakan kurang lebih 5 liter pelarut dengan pengocokan selama 6 jam dan didiamkan selama 18 jam setelah pengocokan. 3.4.3

Uji Pendahuluan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Secara KLT Masing-masing 50 mg ekstrak dilarutkan dalam metanol 50 ml. Masing-

masing ekstrak tersebut ditotolkan pada lempeng silika gel 60 F254 yang telah dielusi dengan fase gerak tertentu, sebanyak 5 µl pada titik awal penotolan. Penotolan dilakukan secara terpisah dengan jarak lebih kurang 1,5 cm antara zat yang diperiksa. Untuk menentukan bercak yang mempunyai aktivitas antioksidan, Universitas Indonesia


16

pereaksi semprot yang digunakan adalah larutan DPPH konsentrasi 100 µg/ml. Semprot lempeng yang yang telah ditotolkan dengan larutan DPPH, lalu diamkan beberapa saat. Senyawa aktif penangkal radikal bebas akan menunjukkan bercak berwarna kuning pucat dengan latar belakang ungu (Isnindar, Setyowati, dan Wahyuono). 3.4.4

Uji aktivitas antioksidan ekstrak Sejumlah masing-masing ekstrak dari daun Premna oblongata Miq.

(ekstrak n-heksan, etil asetat, dan metanol) dilarutkan dalam metanol p.a dengan konsentrasi 1000 µg/mL sebagai larutan induk kemudian dibuat dalam berbagai konsentrasi (1; 5; 10; 25; 50; dan 100 µg/mL) untuk masing-masing ekstrak yang diperoleh, selanjutnya dimasukkan ke dalam tabung reaksi, dalam tiap tabung reaksi ditambahkan 1,0 mL larutan DPPH dalam 2,0 mL metanol kemudian diinkubasi pada suhu 370C selama 30 menit selanjutnya serapan diukur pada panjang gelombang 517 nm. Sebagai pembanding digunakan kuersetin (konsentrasi 1; 2; 3; 4; 5; dan 6 µg/mL). Nilai IC50 dihitung masing-masing dengan menggunakan rumus persamaan regresi (Blois, 1958). 3.4.4.1 Optimasi Panjang Gelombang DPPH Larutan DPPH yang akan digunakan dibuat dengan cara menimbang seksama lebih kurang 10 mg DPPH ditimbang dan dilarutkan dengan metanol p.a dalam labu ukur 100,0 ml dan dicukupkan dengan metanol p.a hingga tanda batas, kocok sampai homogen sehingga didapat larutan DPPH 100 µg/ml. Larutan DPPH disimpan dalam wadah yang

dilindungi dari cahaya dengan cara

melapisinya dengan kertas aluminium. Untuk setiap pengujian, larutan DPPH harus dibuat baru. Larutan ini ditentukan spektrum serapannya menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 200 nm hingga 800 nm serta ditentukan panjang gelombang optimumnya. 3.4.4.2 Pembuatan Larutan Blanko Pembuatan larutan blanko dilakukan dengan cara memipet 1,0 ml metanol p.a dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 1,0 ml larutan DPPH Universitas Indonesia


17

100 μg/ml, lalu ditambahkan 2,0 ml metanol dikocok hingga homogen dan diinkubasi pada suhu 370C selama 30 menit. 3.4.4.3 Pembuatan Larutan Kuersetin Sebagai Pembanding a) Pembuatan larutan induk kuersetin konsentrasi 200 µg/mL Sejumlah 10 mg kuersetin ditimbang dan dilarutkan dengan metanol p.a dalam labu ukur 50,0 ml dan dicukupkan dengan metanol p.a hingga tanda batas, dikocok sampai homogen sehingga didapat larutan induk kuersetin 200 µg/ml. b) Pembuatan larutan kuersetin konsentrasi 1; 2; 3; 4; 5; dan 6 µg/mL Dipipet 0,025; 0,05; 0,075; 0,1; 0,125; dan 0,15 mL larutan induk kuersetin masing-masing kedalam 6 labu ukur 5 mL. Pada masing-masing labu ukur dicukupkan volumenya dengan metanol p.a sampai tanda batas. Selanjutnya dipipet 1,0 mL masing-masing ke dalam 6 tabung reaksi. Pada masing-masing tabung ditambah dengan 1,0 mL DPPH kemudian ditambahkan lagi 2,0 mL metanol p.a dikocok hingga homogen kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit. Serapan dari larutan tersebut diukur pada panjang gelombang 517 nm. 3.4.4.4 Pengukuran Serapan Sampel a) Pembuatan larutan induk sampel konsentrasi 1000 µg/mL Sebanyak 25 mg ekstrak ditimbang dan dilarutkan dalam 25,0 mL metanol p.a, dicukupkan hingga tanda batas kemudian dikocok dan dilarutkan hingga homogen. b) Pembuatan larutan seri bahan uji konsentrasi 1; 5; 10; 25; 50; dan 100 µg/mL Dipipet 0,005; 0,025; 0,05; 0,125; 0,25; dan 0,5 mL larutan induk kuersetin masing-masing kedalam 6 labu ukur 5 mL. Pada masing-masing labu ukur dicukupkan volumenya dengan metanol p.a sampai tanda batas. Selanjutnya dipipet 1,0 mL masing-masing ke dalam 6 tabung reaksi. Pada masing-masing tabung ditambah dengan 1,0 mL DPPH kemudian ditambahkan lagi 2,0 mL metanol p.a dikocok hingga homogen kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit. Serapan dari larutan tersebut diukur pada panjang gelombang 517 nm. Universitas Indonesia


18

3.4.4.5 Penghitungann p radikal DPPH D dari masing-m masing Persentase innhibisi (IC50 5 ) terhadap konsentrassi larutan saampel dapatt dihitung dengan rumuus:

Setelah didappatkan perssentase inhiibisi dari masing-mas m sing konsen ntrasi, dilanjutkaan dengan penghitunga p an secara reg gresi linier menggunakkan persam maan y dimana x adalah konnsentrasi (µ µg/mL) dan y adalah prresentase inhibisi (%). Aktivvitas antiokksidan dinyaatakan deng gan Inhibition Concenttration 50% % atau IC50 yaitu konsentrassi sampel yaang dapat meredam m raddikal DPPH H sebanyak 50%. Nilai IC500 didapatkann dari nilai x setelah mengganti m y dengan 50. 3.4.5 Penapisan Fitookimia Paada ekstrak dan fraksii yang dipeeroleh idenntifikasi golongan sen nyawa kimia denngan beberrapa pereakksi kimia antara lainn untuk peereaksi alkaloid, flavonoid,, glikosida, antrakuinonn, saponin, tannin t dan terpen. t 3.4.5.1 Ideentifikasi allkaloid 1. Beberaapa miligraam ekstrak kental k dilarrutkan dalam m 10 ml caampuran aqu uades dan assam kloridaa 2 N (9:1), kemudiaan dipanaskkan selama 2 menit dii atas penanggas air. Sellanjutnya didinginkan d dan disarinng. Filtrat yyang didap patkan digunaakan sebaggai larutan percobaan yang selaanjutnya dillakukan seebagai berikuut: a) Laarutan percoobaan diam mbil 1 ml keemudian dittambahkan 2 tetes perreaksi Maayer LP, haasil positif dengan d terbeentuknya enndapan putihh. b) Laarutan percoobaan diam mbil 1 ml keemudian dittambahkan 2 tetes perreaksi Boouchardat LP, hasil possitif dengan terbentuknyya endapann coklat hitam.

Unive ersitas Indo onesia


19

c) Larutan percobaan diambil 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorf LP, hasil positif dengan terbentuknya endapan jingga coklat. (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995). 2. Penapisan dengan menggunakan KLT dan penampak noda Dragendorf LP. Fraksi teraktif yang telah dilarutkan dengan pelarutnya ditotolkan pada lempeng KLT. Selanjutnya dielusi dengan eluen BAW (Butanol, Acetic acid, Water) 4:1:5 yang diambil lapisan atasnya. Selanjutnya disemprot menggunakan

penampak

noda

Dragendorf

LP.

Hasil

positif

akan

menunjukkan warna jingga-coklat (Wagner, Bladt, dan Zgainski, 1984). 3.4.5.2 Identifikasi flavonoid 1. Sebanyak 0,5 gram ekstrak ditambahkan 10 ml metanol dan 5 ml petroleum eter, dikocok dan didiamkan. Diambil lapisan metanol, diuapkan pada suhu 40˚C. Sisa larutan ditambahkan 5 ml etil asetat P, disaring, selanjutnya dilakukan sebagai berikut: a) Larutan uji diambil 1 ml, diuapkan, lalu sisanya dilarutkan dalam 1-2 ml etanol (95%), kemudian ditambahkan 0,5 gram serbuk seng P dan 2 ml asam klorida 2 N dan didiamkan selama 1 menit. Kemudian ditambahkan 10 tetes asam klorida P, jika dalam waktu 2 sampai 5 menit terjadi warna merah intensif, menunjukkan adanya flavonoid (glikosida-3-flavonol). b) Larutan uji diambil 1 ml, diuapkan, lalu sisanya dilarutkan dalam 1 ml etanol (95%), kemudian ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium P dan 10 tetes asam klorida P. Jika terjadi warna merah jingga sampai merah ungu menunjukkan adanya flavonoid. Jika warna kuning jingga menunjukkan adanya flavon, kalkon, dan auron. c) Larutan uji diambil 1 ml, diuapkan, lalu sisanya dibasahkan dengan aseton, kemudian ditambahkan sedikit serbuk halus asam borat P dan serbuk halus asam oksalat P, dipanaskan hati-hati di atas penangas air. Sisa yang didapatkan dicampur dengan 10 ml dietil eter P. Diamati dengan sinar ultraviolet 366 nm, larutan berfluoresensi kuning intensif menunjukkan adanya flavonoid (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995).



20

2. Penapisan dengan menggunakan KLT dan penampak noda AlCl3. Fraksi teraktif yang telah dilarutkan dengan pelarutnya ditotolkan pada lempeng KLT. Selanjutnya dielusi dengan eluen BAW (Butanol, Acetic acid, Water) 4:1:5 yang diambil lapisan atasnya. Selanjutnya disemprot menggunakan penampak noda AlCl3. Hasil positif akan menunjukkan warna kuning pada sinar UV dengan panjang gelombang 366 nm (Wagner, Bladt, dan Zgainski, 1984). 3.4.5.3 Identifikasi glikon Ekstrak yang diuji ditambahkan 15 ml asam klorida 10 % LP, direfluks selama 10 menit, dinginkan kemudian disaring. Filtrat yang diperoleh disari sebanyak tiga kali masing-masing dengan 5 ml eter P. Lapisan eter dipisahkan dan dikumpulkan. Kumpulan sari ditambahkan natrium sulfat anhidrat P, disaring dan diuapkan pada suhu tidak lebih dari 500C, kemudian ditambahkan dengan 2 ml metanol dan diuapkan. Hasil penguapan dilarutkan dengan 1 ml aquades dan 8 tetes Mollisch LP. Kemudian tambahkan dengan hati-hati 1 ml asam sulfat P. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas cairan (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995). 3.4.5.4 Identifikasi antrakinon 1. Ekstrak yang diperoleh ditambahkan 5 ml asam sulfat 2N, panaskan sebentar, dinginkan. Tambahkan 10 ml benzen P, kocok, diamkan. Pisahkan lapisan benzen, saring. Kocok lapisan benzen dengan 1 sampai 2 natrium hidroksida 2N, diamkan, lapisan air berwarna merah intensif dan lapisan benzene tidak berwarna. 2. Penapisan dengan menggunakan KLT dan penampak noda KOH. Fraksi teraktif yang telah dilarutkan dengan pelarutnya ditotolkan pada lempeng KLT. Selanjutnya dielusi dengan eluen BAW (Butanol, Acetic acid, Water) 4:1:5 yang diambil lapisan atasnya. Selanjutnya disemprot menggunakan penampak noda KOH. Hasil positif akan menunjukkan warna merah pada cahaya tampak atau flourosensi kuning di bawah sinar UV dengan panjang gelombang 366 nm (Wagner, Bladt, dan Zgainski, 1984) Universitas Indonesia


21

3.4.5.5 Identifikasi saponin 1. Sebanyak 0,5 gram ekstrak ditambahkan 10 mL aquadest panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya buih yang stabil selama tidak kurang dari 10 menit setinggi 1-10 cm dan pada penambahan 1 tetes asam klorida 2 N buih tidak hilang (Departemen Kesehatan RI, 1995). 2. Penapisan dengan menggunakan KLT dan penampak noda anisaldehid-asam sulfat. Fraksi teraktif yang telah dilarutkan dengan pelarutnya ditotolkan pada lempeng KLT. Selanjutnya dielusi dengan eluen BAW (Butanol, Acetic acid, Water) 4:1:5 yang diambil lapisan atasnya. Selanjutnya disemprot menggunakan penampak noda larutan anisaldehid-asam sulfat. Hasil positif akan menunjukkan warna biru, biru-ungu, atau kekuningan pada cahaya tampak setelah dipanaskan pada suhu 100˚C selama 5-10 menit (Wagner, Bladt, dan Zgainski, 1984). 3.4.5.6 Identifikasi tanin 1. Beberapa miligram ekstrak kental dilarutkan dalam 5 ml air suling panas dan diaduk. Setelah dingin disentrifugasi dan bagian cairan didekantasi dan diberi larutan natrium klorida 10%, kemudian disaring. Filtrat sebanyak masingmasing 1 ml dikerjakan sebagai berikut: a. Filtrat ditambahkan ditambahkan 2 tetes larutan besi (III) klorida 1%, hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna hijau violet. b. Filtrat ditambahkan ditambahkan 3 ml larutan gelatin 10%, hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya endapan putih. c. Filtrat ditambahkan ditambahkan 3 ml larutan natrium klorida-gelatin (larutan gelatin 1% dalam larutan natrium klorida 10%), hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya endapan (Farnsworth, 1966). 2. Identifikasi tanin untuk fraksi dilakukan dengan menggunakan KLT, dengan eluen butanol-asam asetat glasial-aquades (40:10:50) dan menggunakan penyemprot larutan FeCl3 10%. Hasil positif akan menunjukkan warna hijaukehitaman (Wagner, Bladt, dan Zgainski, 1984).



22

3.4.5.7 Identifikasi Terpen 1. 1 mg ekstrak kental dilarutkan dalam 5 mL eter kemudian diuapkan di dalam cawan penguap. Ke dalam residu ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrat, kemudian 1 tetes asam sulfat pekat akan terbentuk warna merah-hijau atau violet-biru (Farnsworth, 1966). 2. Identifikasi terpenoid/sterol untuk fraksi dilakukan dengan menggunakan KLT, dengan eluen benzen-etil asetat (90:10) dan menggunakan penyemprot anisaldehid-asam sulfat. Hasil positif akan menunjukkan warna biru kuat, hijau, merah, atau coklat pada cahaya tampak setelah dipanaskan pada suhu 100˚C selama 5-10 menit 3.4.6

Pemisahan Ekstrak Aktif Ekstrak yang memiliki aktivitas antioksidan paling kuat dilanjutkan

dengan pemisahan menggunakan kromatografi kolom. Selanjutnya dilakukan uji aktivitas antioksidan, sehingga didapatkan fraksi yang memiliki aktivitas antioksidan teraktif. Fase diam yang digunakan adalah silika gel 60 H Merck dan fase gerak yang digunakan adalah kombinasi beberapa pelarut terdistalasi.



23

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1

Penyiapan Simplisia Bagian tanaman yang digunakan adalah daun Premna oblongata Miq.

yang diperoleh dari kebun Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (BALITTRO) Bogor, Cimanggu, dan telah dideterminasi di Herbarium Bogoriense (LIPI), Cibinong, Bogor. Hasil determinasi dapat dilihat pada Lampiran 1. Pada penelitian ini digunakan simplisia berupa daun Premna oblongata Miq. yang dipetik pada usia enam bulan setelah penanaman. Sebanyak 10 kg daun Premna oblongata Miq. selanjutnya dilakukan proses sortasi, pencucian, perajangan, pengeringan, penghalusan dan penyaringan sehingga diperoleh 1 kg serbuk kering daun Premna oblongata Miq. Sortasi dan pencucian bertujuan untuk memisahkan kotoran-kotoran atau bahan-bahan asing lainnya yang menempel pada tanaman dengan menggunakan air bersih. Daun selanjutnya dirajang untuk mempermudah proses pengeringan. Pengeringan dilakukan bertujuan untuk mengurangi kadar air sehingga simplisia yang diperoleh tidak mudah rusak oleh adanya pertumbuhan jamur dan dapat disimpan dalam waktu yang lebih lama. Pengeringan dilakukan di tempat terbuka, pada tampah yang ditutupi oleh kain hitam dan terlindung dari sinar matahari secara langsung. Pengeringan dilakukan dari jam 07.00 pagi sampai jam 12.00 siang. Setelah dilakukan pengeringan, rajangan digiling dan diayak dengan ayakan 40 mesh agar derajat kehalusan serbuk simplisia seragam. Penghalusan dan penyaringan ditujukan untuk memperoleh serbuk yang homogen dan untuk mempermudah proses penarikan zat aktif pada saat ekstraksi. Serbuk yang telah kering selanjutnya disimpan dalam wadah bersih, kering dan terlindung dari cahaya untuk mencegah kerusakan dan mutu simplisia tetap terjaga. Setelah

didapatkan

serbuk

simplisia,

dilakukan

maserasi

untuk

mendapatkan ekstrak n-heksan, etil asetat dan methanol. Setelah itu dilakukan penapisan fitokimia dan uji antioksidan dengan metode DPPH. Ekstrak dengan Universitas Indonesia


24

antioksidan terbesar difraksinasi untuk mendapatkan fraksi-fraksi. Pada fraksifraksi yang didapat dilakukan uji aktivitas antioksidan untuk mendapatkan fraksi aktif. Setelah itu dilakukan pemeriksaan kandungan kimia untuk mengetahui golongan senyawa dari fraksi yang teraktif.

4.2

Ekstraksi Serbuk kering daun Premna oblongata Miq diekstraksi dengan metode

maserasi dengan pelarut yang kepolarannya meningkat yaitu n-heksan, etil asetat, dan metanol. Dipilih metode ini karena menggunakan peralatan sederhana sehingga sangat mudah dilakukan dan metode maserasi tidak merusak kandungan senyawa kimia tanaman yang tidak tahan panas. Sebanyak kurang lebih 1 kg Serbuk kering daun Premna oblongata Miq. dimaserasi dengan pelarut dengan kepolaran meningkat mulai dari n-heksan, etil asetat dan selanjutnya metanol sebanyak 5 kali untuk memperoleh filtrat dari masing-masing ekstrak yang masih dapat dituang. Dipilih pelarut dengan kepolaran meningkat dimaksudkan untuk memisahkan senyawa metabolit sekunder berdasarkan kepolarannya, sehingga diharapkan memudahkan penapisan fitokimia. Filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan penguap putar vakum pada suhu lebih kurang 500C kemudian diuapkan diatas waterbath pada suhu <500C sehingga diperoleh ekstrak kental n-heksan, etil asetat, dan metanol. Masingmasing ekstrak ditimbang dan dihitung rendemennya terhadap berat simplisia awal. Dari hasil ekstraksi diperoleh ekstrak yang berwarna hijau pekat (Gambar 4.1). Ekstrak Premna oblongata Miq. yang diperoleh dari 1 kg (1000 g) simplisia adalah seberat 20,55 g yang setara dengan 2.05% untuk ekstrak heksan, 23,75 g yang setara dengan 2.37% untuk ekstrak etil asetat, dan 140,48 g yang setara dengan 14.04% untuk ekstrak metanol. Hasil selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 4.1.

4.3

Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Pada masing-masing ekstrak kental yang diperoleh, dilakukan pengujian

aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode DPPH menggunakan spektrofotometer uv-vis. DPPH adalah senyawa radikal bebas berwarna ungu. Universitas Indonesia


25

Apabila DPPH direaksikan dengan senyawa peredam radikal bebas misalnya flavonoid, intensitas warna ungu akan berkurang dan bila senyawa peredam radikal bebas yang bereaksi jumlahnya besar, maka DPPH dapat berubah warna menjadi kuning. Metode DPPH memberikan informasi reaktivitas senyawa yang diuji dengan suatu radikal stabil. DPPH memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 517 nm dengan warna violet gelap. Penangkap radikal bebas menyebabkan elektron menjadi berpasangan yang kemudian menyebabkan penghilangan warna yang sebanding dengan jumlah elektron yang diambil (Sunarni, 2005). Pengujian aktivitas antioksidan ekstrak didahului dengan uji kualitatif menggunakan kertas kromatografi dan pereaksi semprot DPPH. Hal ini bertujuan untuk memperkirakan ekstrak mana yang memiliki aktivitas antioksidan. Larutan sampel dari tiap ekstrak dan larutan standar kuersetin dengan konsentrasi 1000 µg/ml ditotolkan pada kertas kromatografi, kemudian disemprot dengan larutan DPPH dengan konsentrasi 100 µg/ml. Selanjutnya dilakukan uji aktivitas antioksidan secara kuantitatif dengan menggunakan spektrofotometer uv-vis. Hasil uji aktivitas antioksidan menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun Premna oblongata Miq. memiliki memiliki aktivitas antioksidan paling kuat. Hal ini ditunjukkan dengan nilai IC50 ekstrak methanol yakni 20,01 µg/mL, diikuti dengan estrak etil asetat 63.17 µg/mL, dan ekstrak heksan 68.93µg/mL. Oleh sebab itu, ekstrak metanol dipilih untuk dilakukan pemisahan lebih lanjut karena IC50 paling rendah dibanding ekstrak metanol dan n-heksan yaitu 20,01 µg/mL. Kuersetin yang digunakan sebagai pembanding memiliki IC50 1,565 µg/mL. Data dapat dilihat pada Tabel 4.2.

4.4

Pemisahan Ekstrak Pemisahan ekstrak dilakukan pada ekstrak yang memiliki aktivitas

antioksidan terkuat

yakni metanol dengan IC50 20,01 µg/mL. Pemisahan

dilakukan terhadap 25 g ekstrak metanol menggunakan kromatografi kolom dipercepat yang menggunakan bantuan vakum untuk menggerakkan eluen. Metode kromatografi kolom dipercepat digunakan karena lebih efisien dalam pemisahan dibandingkan kromatografi kolom gravitasi. Kromatografi kolom Universitas Indonesia


26

dipercepat pertama kali diperkenalkan oleh para ilmuwan dari Australia untuk mengatasi lamanya waktu yang dibutuhkan untuk pemisahan menggunakan kolom kromatografi klasik. Pada dasarnya metode ini adalah kromatografi lapis tipis preparatif yang berbentuk kolom. Aliran fase gerak dalam metode ini diaktifkan dengan bantuan kondisi vakum. Pada pemisahan ekstrak ini digunakan campuran pelarut n-heksan-etil asetat sebagai fase gerak dengan perbandingan 200:0, 180:20, 160:40, 140:60, 120:80, 100:100, 80:120, 60:140, 40:160, 20:180, 0:200, dan campuran etil asetatmetanol dengan perbandingan 200:0, 180:20, 170:30, 160:40, 150:50, 140:60, 120:80, 100:100, 80:120, 60:140, 40:160, 20:180, 0:200. Setiap 200 mL eluat ditampung sehingga diperoleh 21 fraksi lalu dilanjutkan dengan kromatografi lapis tipis (KLT). Dari 21 fraksi hasil pemisahan dengan kromotografi kolom dipercepat, diperoleh 6 fraksi gabungan yang memiliki pola kromatogram sama. Fraksi 4 menjadi fraksi 1, fraksi 5 menjadi fraksi 2, fraksi 6-7 digabung menjadi fraksi 3, fraksi 8-13 digabung menjadi fraksi 4, fraksi 14-18 digabung menjadi fraksi 5, fraksi 19-21 digabung menjadi fraksi 6. Berat masing-masing fraksi dapat dilihat pada Tabel 4.3.

4.5

Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Aktif Sama halnya dengan pengujian aktivitas antioksidan pada ekstrak,

pengujian aktivitas antioksidan pada fraksi juga didahului dengan uji kualitatif menggunakan kertas kromatografi dan pereaksi semprot DPPH. Masing-masing hasil penggabungan fraksi dan larutan standar kuersetin dengan konsentrasi 1000 µg/ml

ditotolkan pada kertas kromatografi. Selanjutnya kertas kromatografi

disemprot dengan larutan DPPH konsentrasi 100 µg/ml. Hasil uji kualitatif ini menunjukkan keenam fraksi menimbulkan bercak berwarna kuning dengan latar belakang ungu dengan intensitas yang berbeda. Fraksi 5 menunjukkan intensitas perubahan warna dari ungu menjadi kuning paling mirip dengan blanko kuersetin (Gambar 4.2.). Dengan metode yang sama pada pengujian ekstrak yakni metode DPPH menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 517 nm, masing-masing fraksi tersebut dilakukan uji aktivitas antioksidan dan diperoleh Universitas Indonesia


27

fraksi 5 yang memiliki aktivitas antioksidan paling aktif dengan nilai IC50 sebesar 23.51 µg/mL. Data dapat dilihat pada table 4.4.

4.6

Penapisan Fitokimia Fraksi Teraktif Pada fraksi teraktif yaitu fraksi ke 5 dilakukan identifikasi golongan

senyawa kimia dengan dengan pereaksi kimia dan kromatografi lapis tipis. Prosedur identifikasi golongan senyawa kimia dengan pereaksi kimia pada fraksi teraktif sama dengan identifikasi golongan senyawa kimia dengan pereaksi kimia pada ekstrak. Dari hasil identifikasi golongan senyawa kimia dengan pereaksi kimia pada fraksi didapatkan hasil positif pada senyawa flavonoid, glikosida, tanin dan saponin. Identifikasi golongan senyawa kimia fraksi dengan kromatografi lapis tipis dilakukan menggunakan kontrol positif tanaman pembanding yang sudah terbukti memiliki kandungan senyawa kimia Alkaloid, terpenoid, flavonoid, tannin, saponin dan antrakuinon. Identifikasi senyawa kimia menggunakan eluen BAW (Butanol, Acetic acid, Water) dengan alasan setelah dicoba berbagai macam kombinasi eluen, eluen ini yang memberikan pemisahan paling baik pada fraksi 5. 4.6.1 Identifikasi alkaloid Identifikasi alkaloid dilakukan dengan beberapa uji (Gambar 4.4), yaitu : a) Uji Mayer LP, tidak memberikan hasil positif dengan tidak terbentuknya endapan putih. b) Uji Bouchardat LP, tidak memberikan hasil positif dengan tidak terbentuknya endapan coklat hitam. c) Uji Dragendorf LP, tidak memberikan hasil positif dengan tidak terbentuknya endapan jingga coklat. d) Penapisan menggunakan KLT dengan penampak noda Dragendorf LP tidak memberikan hasil positif karena tidak terbentuknya bercak jingga-coklat yang dibandingkan dengan standar piperin.



28

4.6.2 Identifikasi flavonoid Identifikasi flavonoid dilakukan dengan beberapa uji (Gambar 4.5), yaitu : a) Larutan uji yang ditambahkan serbuk seng dan asam klorida encer memberikan hasil positif dengan terbentuknya warna merah intensif. b) Larutan uji yang ditambahkan serbuk magnesium dan asam klorida pekat memberikan hasil positif dengan terbentuknya warna kuning. c) Larutan uji yang ditambahkan asam borat dan asam oksalat memberikan hasil positif dengan adanya fluoresensi kuning intensif. d) Penapisan menggunakan KLT dengan penampak noda AlCl3 memberikan hasil positif karena terbentuknya bercak berfluoresensi kuning yang dibandingkan dengan standar kuersetin. 4.6.3

Identifikasi glikon Ekstrak yang ditambahkan asam klorida, disari dengan eter, ditambahkan

natrium sulfat anhidrat P, uapkan, ditambahkan metanol, uapkan, larutkan dengan aquades dan Mollisch LP, dan ditambahkan asam sulfat memberikan hasil positif dengan terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas cairan (Gambar 4.6). 4.6.4

Identifikasi antrakinon Identifikasi antrakinon dilakukan dengan beberapa uji (Gambar 4.7), yaitu:

a) Ekstrak yang ditambahkan asam sulfat, ditambahkan benzene, lapisan benzen dikocok dengan natrium hidroksida tidak memberikan hasil positif dengan tidak terbentuknya lapisan air berwarna merah intensif dan lapisan benzene yang tidak berwarna. b) Penapisan menggunakan KLT dengan penampak noda KOH memberikan hasil negatif karena tidak terbentuknya bercak merah yang dibandingkan dengan standar Rhei radix.



29

4.6.5 Identifikasi saponin Identifikasi saponin dilakukan dengan beberapa uji (Gambar 4.8), yaitu : a) Ekstrak yang ditambahkan aquadest panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik memberikan hasil positif dengan terbentuknya buih yang stabil selama tidak kurang dari 10 menit setinggi 1-10 cm dan pada penambahan 1 tetes asam klorida 2 N buih tidak hilang. b) Penapisan menggunakan KLT dengan penampak noda anisaldehid-asam sulfat memberikan hasil positif dengan terbentuknya bercak warna ungu yang dibandingkan dengan standar Liquiritiae radix. 4.6.6 Identifikasi tanin Identifikasi tanin dilakukan dengan beberapa uji (Gambar 4.9), yaitu : a) Larutan uji yang ditambahkan larutan besi (III) klorida, memberikan hasil positif dengan terbentuknya warna hijau. b) Penapisan menggunakan KLT dengan penampak noda FeCl3 memberikan hasil positif dengan terbentuknya bercak warna hijau-kehitaman yang dibandingkan dengan standar Psidii folium. 4.6.7

Identifikasi Terpen Identifikasi terpen dilakukan dengan beberapa uji (Gambar 4.10), yaitu :

a) Larutan uji yang ditambahkan asam asetat anhidrat, dan asam sulfat pekat tidak memberikan hasil positif dengan tidak terbentuknya warna merah-hijau atau violet-biru. b) Penapisan menggunakan KLT dengan penampak noda anisaldehid-asam sulfat tidak memberikan hasil positif dengan tidak terbentuknya bercak warna biru yang dibandingkan dengan standar Caryophili Flos. Hasil penapisan selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 4.5.



30

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN

5.1

Kesimpulan Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan sebagai

berikut : a. Hasil uji antioksidan dari ketiga ekstrak yang diuji menunjukkan ekstrak metanol memiliki aktivitas antioksidan tertinggi dengan IC50 20.01 µg/mL, diikuti oleh ekstrak etil asetat dengan IC50 63.17 µg/mL, dan ekstrak heksan dengan IC50 68.93 µg/mL. b. Fraksi yang memiliki aktivitas antioksidan terbesar adalah fraksi 5 dengan nilai IC50 sebesar 23.51 µg/mL, yang mengandung senyawa golongan flavonoid, glikon, tannin, dan saponin.

5.2

Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menemukan senyawa-

senyawa murni dari daun Premna oblongata Miq. dengan metode uji antioksidan lainnya.



31

DAFTAR ACUAN

Andarwaulan, N., Wijaya, H., dan Cahyono, D.T. (1996). Aktivitas Antioksidan dari Daun Sirih (Piper betle L). Teknologi dan Industri Pangan VII, 2930. Arulpriya, P., Lalitha, P., dan Hemalatha, S. (2010). in vitro Antioxidant Testing of The Extracts Of Samanea saman (Jacq.)Merr. Der Chemica Sinica, (2), 73-79. Aqil, F., Ahmad, I., dan Mehmood, Z. (2006). Antioxidant and Free Radical Scavenging Properties of Twelve Traditionally Used Indian Medicinal Plants. Turk J Biol, 177-183. Bank, G., dan Lenoble, R. (2002). Oxygen Radical Absorbency Capacity, Standardizing the Way We Look at Antioxidants. Nutraceutical World September, 42-45. Backer, C.A., dan Brink., R.C.B.V.D. (1965). Flora of Java Vol II. 602-603. N.V.P. Noordhoff-Groningen-The Netherlands. Blois, M.S. (1958). Antioxidant Determinations By The Use Of A Stable Free Radical Nature, 181, 1199- 1200. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (1995). Farmakope Indonesia edisi IV. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. (1995). Materia Medika Indonesia Jilid VI. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Direktorat Pengawasan Obat Tradisional. (2000). Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat Cetakan Pertama. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Evans, W.C. (2002). Trease and Evans Pharmacognosy 15th Ed. London: W.B. Saunders. Farnsworth, N.R. (1966). Biological and Phytochemical Screening of Plants. Journal of Pharmaceutical Sciences 55 (3), 226-276. Harborne, J.B. (1987). Metode Fitokimia, Penuntun Cara Modern Mengekstraksi Tumbuhan (Kosasih Padmawinata & Iwang Soediro, Penerjemah.). Bandung: Penerbit ITB. Harmita. (2006). Buku Ajar Analisis Fisikokimia. Depok : Departemen Farmasi FMIPA Universitas Indonesia. Hidajat, B. (2005). Penggunaan Antioksidan pada Anak. Kapita Selekta Ilmu Kesehatan Anak. Universitas Indonesia


32

Isnindar., Setyowat, E.P., dan Wahyuono, S. (2011). Aktivitas Antioksidan Daun Kesemek (Diospyros kaki L.F) Dengan Metode DPPH (2,2-DifenilPikrilhidrazin). Majalah Obat tradisional. Johnson, E. (1991). Dasar Kromatografi Cair. Bandung : Penerbit ITB. Lampe, J.W. (1999). Health Effects of Vegetables and Fruit: Assesing Mechanisms of Action in Human Experimental Studies. The American Jurnal of Clinical Nutrition. Lautan, J. (1997). Radikal Bebas Pada Eritrosit dan Leukosit, Cermin Dunia Kedokteran. (116), 49-52. Molineux, P. (2004). The Use of The Stable Free Radical Diphenyl Picrylhydrazil (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity. Songklankarin J. Sci. Technol., 26 (2), 211-219. Nurdin., Kusharto, C.M., Tanziha, I., dan Januwati, M. (2009). Kandungan Klorofil Berbagai Jenis Daun Tanaman dan Cu-Turunan Klorofil Serta Karakteristik Fisiko-Kimianya. Jurnal Gizi dan Pengan. Pitojo, S. (2008). Khasiat Cincau Perdu. Yogyakarta: Kanisius. Pitojo, S., dan Sumiati. (2005). Cincau: Cara Pembuatan dan Variasi Olahan. Agromedia Pustaka, Jakarta. Rahman, A., et all. In vitro antibacterial properties of essential oil and organic extracts of Premna integrifolia Linn. Arabian Journal of Chemistry. Rajnarayana, K., Ajitha M., Gopireddy G., dan Giriprasad, V. (2011). Comperative Antioxidant Potential Of Some Fruits And Vegetabkesusing DPPH Method. International Journal Of Pharmacy & Technology. Soediro, I., dkk (1986). Kromatografi Cepat Sebagai Cara Fraksinasi Ekstrak Tanaman. Acta Pharmaceutica Indonesia. Sutamihardja, R.T.M., Citroreksoko, P.S., Ossia, F., dan S.E. Wardoyo. (2006). Isolasi dan Identifikasi Senyawa Fenol Dari Daun Salam (Syzgium polanthum, Wight Walpers) Sebagai Senyawa Antibakteri. Jurnal Nusa Kimia, 6 (1), 48-60. Sunarni, T. (2005). Aktivitas Antioksidan Penangkap Radikal Bebas Beberapa kecambah Dari Biji Tanaman Familia Papilionaceae. Jurnal Farmasi Indonesia 2, (2),53-61. Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur, G., dan Kaur, H. (2011). Phytochemical screening and extraction : A review. International Pharmaceutical Sciencia, 1(1), 98-106. Winarsi, H. (2007). Antioksidan Alami dan Radikal Bebas. Yogyakarta: Kanisius.



33

Wagner, H., Blandt, S., dan Zgalnski. (1984). Plant Drug Analysis. New York : Springer-Verlag, 7-304. Yu, L. (2008). Wheat Antioxidants. United States Of America: Wiley. Yadav, D., Tiwari, N., dan Gupta, M.M. (2010). Diterpenoids from Premna integrifolia. Phytochem. Lett. 3, 143–147. Zakaria, F.R. (1996). Sintesis Senyawa Radikal dan Elektrofil Dalam Oleh Komponen Pangan : Reaksi Biomolekuler, Dampak Terhadap Kesehatan dan Penangkalan. Prosiding Seminar. Bogor: Pusat Studi Pangan dan Gizi IPB.



GAMBAR


33

Gambar 2.1 Premna oblongata Miq. [Sumber : Koleksi Penulis]


34

Gambar 3.1 Penguap vakum putar (Rotary evaporator Buchi)

Gambar 3.2 Spektrofotometer UV-Vis


35

(a)

(b)

(c) Keterangan : a. Ekstrak heksan b. Ekstrak etil asetat c. Ekstrak metanol

Gambar 4.1 Ekstrak Hasil Ekstraksi


36

Kuersetin I

II

III

IV

V

VI

(a)

Kuersetin I

II

III

IV

V

VI

(b)

Keterangan: a. Fraksi I hingga fraksi VI serta kuersetin sebelum disemprot DPPH b. Fraksi I hingga fraksi VI serta kuersetin sesudah disemprot DPPH

Gambar 4.2 Hasil Uji Kualitatif Fraksi Ekstrak Gabungan


37

Keterangan : Serapan Blanko DPPH = 0.6237

Gambar 4.3 Spektrum serapan larutan DPPH


38

(A)

(B)

(C)

(a) (b) (D)

Keterangan: A. Identifikasi menggunakan pereaksi kimia Mayer LP B. Identifikasi menggunakan pereaksi kimia Bouchardat C. Identifikasi menggunakan pereaksi kimia Dragendorf LP D. Identifikasi menggunakan KLT, (a) sampel, (b) standar

Gambar 4.4 Identifikasi golongan senyawa alkaloid fraksi 5


39

(A)

(B)

(C)

(a) (b) (D)

Keterangan: A. Identifikasi dengan penambahan serbuk seng dan asam klorida encer B. Identifikasi dengan penambahan serbuk magnesium dan asam klorida pekat C. Identifikasi dengan penambahan asam borat dan asam oksalat D. Identifikasi menggunakan KLT, (a) sampel, (b) standar

Gambar 4.5 Identifikasi golongan senyawa flavonoid fraksi 5


40

Gambar 4.6 Identifikasi golongan senyawa glikon fraksi 5


41

(A)

(a) (b) (B)

Keterangan: A. Identifikasi dengan penambahan asam sulfat, benzene, dan lapisan benzen dikocok dengan natrium hidroksida B. Identifikasi menggunakan KLT, (a) sampel, (b) standar

Gambar 4.7. Identifikasi golongan senyawa antrakinon fraksi 5


42

(A)

(a) (b) (B)

Keterangan: A. Identifikasi dengan penambahan aquadest panas, dinginkan, kemudian kocok kuat-kuat selama 10 detik B. Identifikasi menggunakan KLT, (a) sampel, (b) standar

Gambar 4.8 Identifikasi golongan senyawa saponin fraksi 5


43

(A)

(a) (b) (B)

Keterangan: A. Identifikasi dengan penambahan larutan besi (III) klorida B. Identifikasi menggunakan KLT, (a) sampel, (b) standar

Gambar 4.9 Identifikasi golongan senyawa tanin fraksi 5


44

(a) (b) Keterangan: A. Identifikasi dengan penambahan asam asetat anhidrat, dan asam sulfat pekat B. Identifikasi menggunakan KLT, (a) sampel, (b) standar

Gambar 4.10 Identifikasi golongan senyawa terpen fraksi 5


TABEL


45

Tabel 4.1 Data Rendemen Ekstrak Daun Premna Oblongata Miq. No.

Ekstrak

Bobot Ekstrak

Rendemen

(g)

Esktrak (%)

1.

Ekstrak Heksan

20,55

2.05

2.

Ekstrak Etil Asetat

23,75

2.37

3.

Ekstrak Metanol

140,48

14.04


46

Tabel 4.2 Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Premna Oblongata Miq. Absorbansi Sampel

Kuersetin

Ekstrak Heksan

Ekstrak Etil Asetat

Ekstrak Metanol

Konsentrasi (μg/ml) 1 2 3 4 5 6 1 5 10 25 50 100 5 10 25 50 100

Sampel Blanko uji 0.647 0.626 0.541 0.675 0.535 0.432 0.307 0.575 0.551 0.539 0.675 0.522 0.51 0.49 0.629 0.612 0.589 0.673 0.578 0.514

1 5 10 25 50 100

0.595 0.584 0.574 0.517 0.432 0.272

0.673

% Inhibisi 3.86 6.98 19.61 20.51 34.91 54.38 14.56 16.03 18.12 20.22 24.21 27.19 6.5 9.06 12.48 15.9 23.62 11.58 13.22 14.71 23.17 35.8 59.58


Persamaan linier

IC50 (μg/ml)

y = 38.54x 10.35 R² = 0.920

1.565

y = 0.4911x + 16.147 R² = 0.9134

68.93

y = 0.679x + 7.053 R² = 0.978

63.17

y = 1.963x + 10.71 R² = 0.9992

20.01

47

Tabel 4.3 Berat Fraksi Ekstrak Hasil Fraksinasi Kolom Dipercepat No.

Fraksi Ekstrak

Berat Fraksi (mg)

1.

Fraksi I

242.6

2.

Fraksi II

526

3.

Fraksi III

773.6

4.

Fraksi IV

1500.1

5.

Fraksi V

4640.9

6.

Fraksi VI

2819


48

Tabel 4.4. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi-Fraksi Ekstrak Metanol Premna Oblongata Miq. Absorbansi Sampel

Fraksi 1

Fraksi 2

Fraksi 3

Fraksi 4

Fraksi 5

Konsentrasi (μg/ml) 100 150 200 250 300 350 100 150 200 250 300 350 100 150 200 250 300 350 10 25 50 75 90 100 10 25 50 75 90 100

Sampel Blanko uji 0.5168 0.5113 0.4974 0.6237 0.4956 0.491 0.4789 0.5447 0.5312 0.5193 0.6237 0.5116 0.4988 0.464 0.5364 0.5341 0.5255 0.6237 0.5221 0.5164 0.4978 0.5785 0.5669 0.5062 0.6237 0.462 0.4227 0.4102 0.5647 0.5546 0.457 0.6237 0.3789 0.3041 0.3025

% Inhibisi 17.13 18.01 20.25 20.53 21.27 23.21 12.66 14.82 16.73 17.97 20.02 25.6 13.99 14.36 15.74 16.28 17.2 20.18 7.24 9.1 18.83 25.92 32.22 34.23 9.45 11.07 26.72 39.29 51.24 51.49


Persamaan linier

IC50 (μg/ml)

y = 0.0925x + 14.865 R² = 0.9572

379.83

y = 0.1864x + 7.483 R² = 0.9305

228.09

y = 0.0915x + 11.148 R² = 0.9047

424.61

y = 1.2663x + 2.7891 R² = 0.9916

37.28

y = 2.066x + 1.4145 R² = 0.9811

23.51

49

Absorbansi Sampel

Konsentrasi (μg/ml)

Fraksi 6

10 25 50 75 90 100

Sampel Blanko uji 0.5929 0.5577 0.4719 0.6237 0.4651 0.4385 0.4192

% Inhibisi

Persamaan linier

IC50 (μg/ml)

4.93 10.58 16.13 25.42 29.69 32.78

y = 1.2271x + 2.026 R² = 0.996

39.09


50

Tabel 4.5. Identifikasi golongan kimia fraksi teraktif

Kandungan Kimia

Pereaksi Kimia

Hasil

Mayer

-

Dragendorf

-

Bouchardat

-

FeCl3

+

Gelatin 10 %

-

NaCl-gelatin

-

Serbuk Zn + HCl 2N + HCL pekat P

+

serbuk Mg + HCl pekat P

+

Serbuk as. Borat + serbuk as.oksalat

+ -

Saponin

Asam asetat anhidrat + H2SO4 p (2:1) Air panas

+

Glikon

Molish LP

+

Antrakuinon

Benzen P + NH4OH

-

Alkaloid

Tanin

Flavonoid Terpen


LAMPIRAN


51

Lampiran 1. Hasil determinasi sampel Premna oblongata Miq.


52

Lampiran 2. Skema ekstraksi dan fraksinasi sampel Premna oblongata Miq. ± 10 Kg Daun basah Premna

oblongata Miq. Disortasi, dikeringkan selama ± 5 hari Dirajang, dihaluskan dengan blender dan disaring ± 1 kg serbuk kering daun

Premna oblongata Miq. Maserasi dengan n-heksan. Saring, Evaporasi, Uapkan diatas waterbath suhu <500C Ekstrak n-heksan

Residu

Maserasi dengan etil asetat Saring, Evaporasi Uapkan diatas waterbath suhu <500C

Ekstrak etil asetat

Residu

Maserasi dengan metanol Saring, Evaporasi Uapkan diatas waterbath Penapisan Fitokimia dan Uji aktivitas antioksidan metode DPPH

Ekstrak metanol

Residu

Ekstrak dengan aktivitas antioksidan terbesar

Fraksinasi Fraksi-fraksi

Uji aktivitas antioksidan Fraksi aktif

Pemeriksaan kandungan kimia

Golongan senyawa dari fraksi yang teraktif


53

Lampiran 3. Kurva hubungan konsentrasi kuersetin dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH 60 50

% Inhibisi

40 30 20

y = 38,54x ‐ 10,35 R² = 0,920

10 0 ‐10

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

Konsentrasi Dalam Tabung µg/mL


1,2

1,4

1,6

54

Lampiran 4. Kurva hubungan konsentrasi ekstrak heksan dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH 30 25

% Inhibisi

20 15 10 y = 0,491x + 16,14 R² = 0,913

5 0 0

5

10

15

20



25

30

55

Lampiran 5. Kurva hubungan konsentrasi ekstrak etil asetat dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH 30 25

% Inhibisi

20 15 10 y = 0,679x + 7,053 R² = 0,978

5 0 0

5

10

15

20



25

30

56

Lampiran 6. Kurva hubungan konsentrasi ekstrak metanol dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH 70 60

% Inhibisi

50 40 30 20 y = 1,963x + 10,71 R² = 0,999

10 0 0

5

10

15

20



25

30

57

Lampiran 7. Kurva hubungan konsentrasi fraksi gabungan 1 dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH 25

% Inhibisi

20 15 10 y = 0,092x + 14,86 R² = 0,957

5 0 0

20

40

60



80

100

58

Lampiran 8. Kurva hubungan konsentrasi fraksi gabungan 2 dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH 30 25

% Inhibisi

20 15 10 y = 0,186x + 7,483 R² = 0,930

5 0 0

20

40

60



80

100

59

Lampiran 9. Kurva hubungan konsentrasi fraksi gabungan 3 dalam berbagai konsentrasi dengan % peredaman DPPH 25

% Inhibisi

20 15 10 y = 0,091x + 11,14 R² = 0,904

5 0 0

20

40

60



80

100

60


%^ Inhibisi

30 25 20 15 y = 1,266x + 2,789 R² = 0,991

10 5 0 0

5

10

15

20

Konsentras Dalam Tabung µg/mL


25

30

61


% Inhibisi

40 30 20 y = 2,066x + 1,414 R² = 0,981

10 0 0

5

10

15

20



25

30

62


% Inhibisi

25 20 15 10 y = 1,227x + 2,026 R² = 0,996

5 0 0

5

10

15

20



25

30

63

Lampiran 13. Sertifikat Analisis DPPH


UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK DAUN Premna oblongata Miq. DENGAN METODE DPPH DAN IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA KIMIA DARI FRAKSI TERAKTIF SKRIPSI

Recommend Documents